PARED CELULAR

La mayor parte de las Bacterias posee una pared celular rígida rodeando
al protoplasto. Las excepciones son los micoplasmas (dentro del
dominio Bacteria) y algunas arqueas, como Thermoplasma.

En el microscopio electrónico se puede observar como una capa en

íntimo contacto con la membrana citoplásmica, con un espesor que
oscila entre 10 y 80 nm (según especies) -frente a los 8 nm de la
membrana celular- , y con una estructura más o menos compleja, según
los tipos bacterianos.
a) Las paredes celulares más frecuentes en Bacterias
siguen dos modelos alternativos que, como
veremos comparten un componente común: paredes
de tipo Gram-positivo o de tipo Gram-negativo.

b) Unas pocas Bacterias (como las del gén.

Planctomyces) poseen paredes a base de proteínas.

c) Las Arqueas poseen paredes diferentes a las de

Bacterias y se pueden agrupar en diversos tipos.
 FUNCIONES
1) Gran rigidez, que contrarresta las fuerzas osmóticas a que está
sometido el protoplasto (aguanta presiones de unas 5 a 15
atmósferas). Esta rigidez depende de:

a) el grado de entrecruzamiento;

b) el hecho de que el enlace ß(1 4) es muy compacto. La

alternancia regular entre anillos piranósicos de NAG y
de NAM genera uno de los polisacáridos más estables
desde el punto de vista termodinámico, que recuerda en su
“estilo” a
la quitina y a la celulosa;

c) la alternancia en el tetrapéptido, de aminoácidos en

configuraciones D y L supone una factor adicional que
confiere aún más fuerza estructural, y además permite que
todas las cadenas laterales de estos aminoácidos se
dispongan hacia el mismo lado, facilitando la formación de
puentes de H.
2) Pero, al mismo tiempo, la estructura permite una
notable flexibilidad. Ello colabora, junto con su
rigidez, a soportar variaciones amplias de la tensión
osmótica del protoplasto.

3) Condiciona la forma celular. Aunque la química del

PG, por sí misma, no determina la forma, es su
disposición espacial la responsable principal de esta
forma.
 PAREDES DE LAS BACTERIAS
Consisten en un esqueleto macromolecular rígido,
llamado peptidoglucano (= mucopéptido o mureína), que
en Gram-positivas se encuentra inmerso en una matriz
aniónica de polímeros azucarados; y en Gram-negativas
está rodeada por una membrana externa, e inmersa en
un espacio periplásmico.
 Hans Christian Gram
• 1882 desarrolló la tinción Gram
• Principio:
• Retención diferencial del cristal violeta durante
el tratamiento con un decolante (solvente
orgánico- etanol).
Figure: 04-04a-01

Caption:
The Gram stain. (a) Steps in the Gram stain procedure.
Figure: 04-04a-02

Caption:
The Gram stain. (a) Steps in the Gram stain procedure.
 1 min Cristal Violeta

Lavar Cristal Violeta

Tinte cristal violeta (es un tinte cationico)

 Iodo 30 sec

Lavar Iodo
 Decolorante -Etoh

Etanol y acetona
Safranina 1 min

Lavar Safranina
Resumen de cambios de color
Resultado
 Aspectos importantes de la
tinción gram
• Pasos críticos
• Preparación del Frotis
• Decolorización
• Organismos Gram variable
• Tiempo de crecimiento del cultivo

Execeso en cualquiera de los pasos puede resultar en un falso positivo

Cultivos con mas de 24 horas pierden la capacidad de retener el tinte de cristal violeta
 Excessive Decolorization
It is clear that the decolorization step is the one most likely to cause
problems in the gram stain. The particular concerns in this step are listed
below (reviewed in McClelland 2001)

• Excessive heat during fixation.

Heat fixing the cells, when done to excess, alters the cell morphology and
makes the cells more easily decolorized.

• Low concentration of crystal violet.

Concentrations of crystal violet up to 2% can be used successfully,
however low concentrations result in stained cells that are easily
decolorized. The standard 0.3% solution is good, if decolorization does
not generally exceed 10 seconds.

• Excessive washing between steps

The crystal violet stain is susceptible to wash-out with water (but not the
crystal violet-iodine complex). Do not use more than a 5 second water
rinse at any stage of the procedure.
Insufficient iodine exposure
The amount of the mordant available is important to the formation of the
crystal violet - iodine complex. The lower the concentration, the easier to
decolorize (0.33% - 1% commonly used). Also, QC of the reagent is
important as exposure to air and elevated temperatures hasten the loss of
Gram’s iodine from solution. A closed bottle (0.33% starting concentration) at
room temperature will lose >50% of available iodine in 30 days, an open
bottle >90%. Loss of 60% iodine results in erratic results.

Prolonged decolorization
95% ethanol decolorizes more slowly, and may be recommended for
inexperienced technicians while experienced workers can use the acetone-
alcohol mix. Skill is needed to gauge when decolorization is complete.

Excessive counterstaining
As the counterstain is also a basic dye, it is possible to replace the crystal
violet—iodine complex in gram- positive cells with an over-exposure to the
counterstain. The counterstain should not be left on the slide for more than
30 seconds.
Gram Variable
 Verificación de la tinción gram
Prueba KOH

The KOH String Test is done using a drop of 3% potassium hydroxide on a

glass slide. A visible loopful of cells from a single, well-isolated colony
is mixed into the drop. If the mixture becomes viscous within 60
seconds of mixing (KOH-positive) then the colony is considered gram-
negative. The reaction depends on the lysis of the gram-negative cell
in the dilute alkali solution releasing cellular DNA to turn the
suspension viscous. This method has been shown effective for food
microorganisms (Powers 1995), and for Bacillus spp (Carlone et al
1983, Gregersen 1978), although it may be problematic for some
anaerobes (Carlone et al 1983, but also see Halebian et al 1981).

This test has the advantage of simplicity, and it can be performed on older
cultures. False negative results can occur in the test by using too little
inoculum or too much KOH (DNA-induced viscosity not noticeable).
False positive results can occur from too heavy an inoculum (the
solution will appear to gel, but not string), or inoculation with mucoid
colonies. This can serve as a valuable adjunct to the tradition gram
Stringing DNA
 Aminopeptidase Test
L-alanine aminopeptidase is an enzyme localized in the bacterial cell
wall which cleaves the amino acid L-alanine from various peptides.
Significant activity is found almost only in Gram-negative
microorganisms, all Gram-positive or Gram-variable microorganisms
so far studied display no or very weak activity (Cerny 1976, Carlone et
al. 1983). To perform the test, the reagent is used to make a
suspension (with the bacteria). Aminopeptidase activity of the
bacteria causes the release of 4-nitroaniline from the reagent,
turning the suspension yellow. The test is especially useful for non-
fermenters and gram-variable organisms, and is a one step test with
several suppliers of kits. Results of the test are available in 5 minutes.

In the test strips the substrate L-alanine-4-

nitroanilide is split by L-alanine aminopeptidase
into L-alanine and 4-nitroaniline. The latter
compound causes the bacterial suspension to
turn yellow, this is regarded as evidence for the
presence of L-alanine aminopeptidase
 Fluorescent Stains
A popular combination of fluorescent stains for use in gram staining
(particularly for flow-cytometry) involves the use of the fluorescent nucleic
acid binding dyes hexidium iodide (HI) and SYTO 13. HI penetrates gram-
positive but not gram-negative organisms, but SYTO 13 penetrates both.
When the dyes were used together in a single step, gram-negative
organisms are green fluorescent by SYTO 13 while gram-positive
organisms are red-orange fluorescent by HI which overpowers the green of
SYTO 13 (Mason et al 1998). There are commercial kits available for this
procedure, which requires a fluorescent microscope or a flow cytometer.

Sizemore et al (1990) developed a different approach to fluorescent

labeling of cells. Fluorescence-labeled wheat germ agglutinin binds
specifically to N-acetylglucosamine in the outer peptidoglycan layer of
gram-positive bacteria. The peptidoglycan layer of gram-negative bacteria
is covered by a membrane and is not labeled by the lectin. A variant of this
method has also been used to “gram stain” microorganisms in milk for
direct measurement by flow cytometry.
 LAL-based Assay
Charles River Laboratories has just released a product to be used with
their PTS instrument – the PTS Gram ID (Farmer 2005). This
methodology makes use of the same reaction used for the chromogenic
LAL test.

Gram-negative organisms, with bacterial endotoxin, initiate the LAL

coagulase cascade which results in activation of the proclotting enzyme, a
protease. In the LAL test, this enzyme cleaves a peptide from the
horseshoe crab coagulen, resulting in a clot. It can also cleave a peptide
from a synthetic substrate, yielding a chromophore (p-nitroaniline)
which is yellow and can be measured photometrically at 385 nm
(Iwanaga 1987).

Gram-positive organisms, lacking endotoxin, do not trigger the color

change in this method, while gram-negative organisms do trigger it.
Results are available within 10 minutes.
 EL PEPTIDOGLUCANO: COMPOSICIÓN QUÍMICA Y
ESTRUCTURA

En las bacterias Gram-positivas el peptidoglucano

representa el componente mayoritario de la pared
celular (50-80% en peso), mientras que en Gram-
negativas supone sólo del 1 al 10%.
Figure 4.45 Cell envelope
structure
COMPOSICIÓN QUÍMICA Y ESTRUCTURA BÁSICAS DEL
PEPTIDOGLUCANO
COMPOSICIÓN QUÍMICA Y ESTRUCTURA BÁSICAS DEL
PEPTIDOGLUCANO
Pared Gram Positivo
Peptidoglucano de una bacteria
gram positiva
 Entrecruzamiento de
tetrapéptidos

Figure: 04-31a-c

Caption:
Manner in which the peptide and glycan units are connected in formation of the peptidoglycan sheet. (a) No interbridge in gram-
negative Bacteria. (b) Glycine interbridge in Staphylococcus aureus (gram-positive). (c) Overall structure of peptidoglycan. The
diagram depicts several ribbons of peptidoglycan cross-linked to one another. To visualize an entire single layer of peptidoglycan,
imagine these cross-linked ribbons extending around a cylinder or sphere representing the cell as shown. G, N-acetylglucosamine;
M, N-acetylmuramic acid.
Tetrapéptido (entrecruzamiento)
Efecto de la penicilina
sobre el
entrecruzamiento de
los Tetrapéptidos
Funciones: captación de magnesio, anclaje de la pared a la membrana,
barrera de permeabilidad, son importantes antígenos de superficie con
capacidad inmunogénica.
Pared Gram Negativo
Figure 4.49 Outer membrane
Polysaccharide of LPS
The Pyrogen-Test is done in two parts: the Pre- or Shamtest and the main
test. According to the European pharmacopoeia, the pre test is 1 to 3 days
befor the main test. A pyrogen-free isotonic sodium chloride (10 ml/kg KG)
is injected and the temperature is measured. Is there no differences less
then 0,6°C, the rabbits are used for the main test. For the main test, 3
animals will be injected after 90 minutes with the sample. Then, the
temperature is measured 3 hours. The sample is pyrogenfree, if the sum of
three animals temperature differences are less then 1.15°C
 Lymulus polyphemus

El reactivo LAL
La historia del descubrimiento del reactivo LAL comienza en 1956, cuando el
doctor Frederick B. Bang reporta la muerte por coagulación intravascular en el
cangrejo herradura americano Limulus polyphemus (fig. 1). Bang, junto a Jack
Levin, revela en 1964 que las endotoxinas son el vector causante de la
coagulación de la hemolinfa del Limulus. Cuatro años más tarde, estos
investigadores comprueban que los elementos responsables de la coagulación
inducida por endotoxinas son de naturaleza enzimática, y se encuentran dentro de
los amebocitos, único tipo de células presentes en la hemolinfa azul de los
cangrejos herraduras. El reactivo LAL es un extracto acuoso de los amebocitos,
compuesto por una cascada de enzimas serino proteasas tipo tripsina capaz de
reaccionar frente a pequeñas cantidades de endotoxinas.
 GRAM____?_____

GRAM____?_____
 Bacterias peculiares
• Mycobacterium- cubierta de ácido micólico

• Mycoplasma- ausencia de pared celular

• Formas L- pérdida de pared

• Esferoplastos y Protoplastos
Mycobacterium
Mycobacterium
Mycoplasmas
 Protoplastos – Esferoplastos- Formas L

Son células tratadas con lisozima o penicilina en un medio

isotónico, por lo que han perdido su pared celular pero se
evitó que se hinchen y estallen. De las células Gram(+) se
obtienen protoplastos, en cambio de las Gram(-) se obtienen
esferoplastos (retienen partes de la pared celular).

Los protoplastos carecen de mesosomas.

Si son capaces de crecer y dividirse se denominan formas L.

Algunas bacterias producen formas L espontáneamente
(resistentes a los antibióticos que afectan la pared).
Efecto de la penicilina a concentraciones subletales
ACCION DE LA LISOZIMA
PROTOPLASTOS VS ESFEROPLASTOS
Formas L
Formas L de Mycobacterium
 TABLA 4-1. Comparación de algunas características de bacterias gram-positivas y gram-negativas.
Carácteristicas Gram-positivas Gran-negativas
Tinción de Gram Retienen el cristal violeta y se tiñen Se decoloran y toman el
de morado colorante de contraste
(safranina), tiñéndose de rosa.
Capa de péptido Gruesa (varias capas) Delgada (una capa).
glucano
Contenido en Virtualmente ninguna Alta
lipopolisacáridos (LPS)
Contenido en lípidos y Bajo (las bacterias ácido-alcohol Alto (debido a la presencia de
lipoproteína resistentes tienen lípidos unidos al membrana externa).
péptido glucano)
Acidos teicoicos Presentes en muchas de ellas Ausentes.
Espacio periplásmico Ausente Presente.
Membrana externa Ausente Presente.
Estructura de los 2 anillos en el cuerpo basal 4 anillos en el cuerpo basal.
flagelos
Producción de toxinas Principalmente exotoxinas Principalmente endotoxinas.
Resistencia a la rotura Alta Baja.
física
Sensibilidad de la pared Alta Baja (requiere un tratamiento
celular a la lisozima previo para desestabilizar la
membrana externa).
 Carácteristicas Gram-positivas Gran-negativas

Sensibilidad a penicilina Marcada Mucho menos marcada.

y sulfamidas
Sensibilidad a Mucho menos marcada Marcada.
estreptomicina,
cloranfenicol y
tetraciclinas
Inhibición por Marcada Mucho menos marcada.
colorantes básicos
Sensibilidad a Marcada Mucho menos marcada.
detergentes aniónicos
Resistencia a la azida Marcada Mucho menos marcada
sódica
Resistencia a la Alta Baja.
desecación
PARED CELULAR DE LAS ARQUEAS
•Aunque las Arqueas pueden comportarse como
Gram positivas o como Gram negativas, no se
suele aludir a esto en este dominio de procariotas,
ya que sus paredes tienen poco que ver con las de
Bacterias.

•Exceptuando el género Thermoplasma, carente

de pared celular, las demás arqueas poseen, por
encima de la membrana citoplásmica, algún tipo
de estructura con funciones de pared celular.
 Capas S
En muchos casos las funciones de pared celular son
ejercidas simplemente por una capa S paracristalina a
base de disposición regular de subunidades idénticas
de una proteína o glucoproteína (por ejemplo:
Methanococcus, Methanogenium).
En ciertas arqueas de ambientes extremos, esta capa
S está estabilizada por factores de esos ambientes: En
el halófilo obligado Halobacterium las subunidades de
glucoproteína se estabilizan por altas concentraciones
de ión Na+. En el termoacidófilo Sulfolobus la
estabilidad la confieren los bajísimos pH.
En Methanospirillum y en Methanothrix varias células,
cada una con su capa S, se encuentran englobadas por
una vaina común, a base de proteínas y carbohidratos,
con una estructura a base de anillos paralelos.
En Methanosarcina y Halococcus la capa S se encuentra
rodeada de metanocondroitina, un polímero a base de
N-acetil-galactosamina, glucurónico, glucosa y manosa.
(Esta metanocondroitina es similar al condroitín sulfato
presente en tejido conjuntivo de animales).
Pseudomureina Capa S
Capa S
 Pseudomureina
Finalmente, los miembros del orden Methanobacteriales
poseen una pared de pseudomureína, un extraño
peptidoglucano no basado en NAM. Consiste en un
esqueleto de unidades repetitivas de NAG unidas por
enlace ß(13) con N-acetil-talosaminourónico (NAT, un
azúcar exclusivo de estos organismos). El grupo -NH2 del
NAT va unido a su vez con un tetrapéptido, pero en éste
sólo participan aminoácidos de la serie L. Al igual que
en la mureína de las Bacterias, las diversas cadenas se
unen entre sí por enlaces peptídicos entre el aminoácido
terminal (4) de un tetrapéptido y el diaminoácido (3) de
otra cadena.
 N-acetil-talosaminourónico

Figure: 04-34

Caption:
Pseudopeptidoglycan and S-layers. (a) Structure of pseudopeptidoglycan, the cell wall polymer of Methanobacterium species. Note
the resemblance to the structure of peptidoglycan shown in Figure 4.30, especially the peptide cross-links, in this case between
N-acetyltalosaminuronic acid (NAT) residues instead of muramic acid residues. NAG, N-Acetylglucosamine.