UN ENFOQUE DE TRATAMIENTO PREVIO LIGNINOLÍTICO INTEGRAL DE LA BIOTECNOLOGÍA

VERDE LIGNOCELULOSICA PARA PRODUCIR BIOETANOL

Cuál fue el problema del artículo

En el presente estudio, hemos desarrollado un novedoso método de pretratamiento enzimas
ligninolíticos a base de paja de trigo lignocelulósica para despolimerizar la lignina y exponer los
polímeros de celulosa para producir bioetanol. Se han realizado esfuerzos de investigación
considerables para mejorar la hidrólisis de materiales lignocelulósicos. El presente estudio implicó
el uso de enzimas ligninolíticas producidos a partir de Ganoderma lucidum para la deslignificación
de la paja de trigo, seguido de sacarificación utilizando celulasas extracto obtenido de T.
harzianum, y, finalmente, la producción de bioetanol utilizando S. cerevisiae

Porque era importante solucionar ese problema planteado

Que hicieron
Para la producción máxima de etanol, se optimizaron diferentes parámetros físicos y nutricionales
como pH, temperatura, nivel de sustrato y tamaños de inóculo. En condiciones óptimas de
producción de etanol de 33,5 g / L se obtuvo a partir de biomasa residual tratada ligninolítico (paja
de trigo).

Como lo hicieron
La paja de trigo fue pre-tratado con enzimas ligninolíticos extracto producido de Ganoderma
lucidum en condiciones óptimas de fermentación en estado sólido. La biomasa pre-tratado se
sometió adicionalmente a la hidrólisis enzimática por las celulasas

En condiciones óptimas para la sacarificación enzimática, 10% de la biomasa pretratada se

hidrolizó completamente y se convierte a 72.5 y 2.4 g / L de glucosa y xilosa, respectivamente

A que llegaron
Para que sirvió
INTRODUCCIÓN

La producción y utilización del bioetanol ha atraído la atención de todo el mundo como una
estrategia para reducir el calentamiento global y la mejora de las crisis energéticas mundiales. El
etanol puede ser producido por la fermentación de los azúcares a partir de residuos
agroindustriales / materiales sin embargo los materiales de alimentación deberían derivarse de las
partes no comestibles de los cultivos alimentarios. Un método potencial para el bajo costo de
producción por fermentación de etanol es utilizar materiales lignocelulósicos tales como residuos
agrícolas (por ejemplo, madera, paja, alfalfa, interruptor de hierba, bagazo de caña de azúcar), ya
que contienen hidratos de carbono que deben ser primero convertidas en azúcares simples
(glucosa) y luego se fermenta en etano. Para obtener azúcares fermentables en el pretratamiento
etapa de hidrólisis es un paso esencial. La producción de etanol a partir de paja de trigo
comprende las siguientes etapas principales: la lignina se descomponen, la hidrólisis de la celulosa
y la hemicelulosa, la fermentación de azúcar, la recuperación y purificación del etanol para cumplir
con las especificaciones de los combustibles (OJO QUE AQUÍ SE ESTA HACIENDO ENFASIS EN EL
MATERIAL LIGNOCELULOSICO PARA SER USADO EN FERMENTACIONES).

El pre-tratamiento se ha considerado como uno de los pasos más caros en el proceso de

lignocelulosa en etanol conversión y puede contribuir a tanto como 30% del coste total. Un
tratamiento previo eficaz tiene por objeto reducir el tamaño de partículas de biomasa, lo que
minimiza la pérdida de los dos hexosas y pentosas, maximizando eliminación de lignina, y la
reducción del coste global del proceso. Los recientes avances en la caracterización de las enzimas
implicadas en la degradación ligninolíticos de lignina han dado un nuevo impulso a la investigación
en esta área que ahora se ha convertido en susceptibles a la explotación biotecnológica. Bio-
deslignificación es útil en el tratamiento previo y reemplaza los pretratamientos químicos que
incluyen tratamiento mecánico con ácido, álcali, y de explosión de vapor.

Trichoderma harzianum es uno de los productores más eficientes de celulasa que se están
estudiando para la producción de enzimas degradantes de celulosa a partir de diversos materiales
de desechos agroindustriales y sus derivados. La hidrólisis enzimática de la celulosa se lleva a cabo
por las celulasas enzima que hidroliza celulosa.

Hay tres clases de enzimas que actúan sinérgicamente en la hidrólisis de la celulosa:

endoglucanasas, exoglucanasas y beta-glucosidasas. Las endoglucanasas atacan las regiones
amorfas de la celulosa romper enlaces internos, beta-1,4-glucosídicos y proporcionar extremos de
la cadena por la acción de exoglucanasas. Los exoglucanasas, actúan sobre los extremos
reductores y no reductores, de cadenas de celulosa para liberar celobiosa principalmente soluble.
Por último, las glucosidasas hidrolizan la celobiosa en glucosa soluble. Entonces, este hidrolizado
se fermenta hacia etanol usando levadura convencional.

DATO INTERESANTE: La producción comercial de bio-etanol a partir de hidrolizados

lignocelulósicos por la levadura requiere cepas que pueden fermentar tanto hexosa y pentosa,
presente en el hidrolizado. La cepa también debe tener suficiente capacidad de tolerancia frente a
los inhibidores / contaminantes presentes en los hidrolizados. Saccharomyces cerevisiae es un
cultivo modelo para la producción de bio-etanol, que también tiene la capacidad de crecer en
condiciones nutricionales leves. El oxígeno puede ser suministrado a través de la adición al medio
de algunos productos químicos como el peróxido de hidrógeno de urea, que también contribuye a
la reducción de los contaminantes bacterianos.
El presente estudio implicó el uso de enzimas ligninolíticas producidos a partir de Ganoderma
lucidum para la deslignificación de la paja de trigo, seguido de sacarificación utilizando celulasas
extracto obtenido de T. harzianum, y, finalmente, la producción de bioetanol utilizando S.
cerevisiae.

METODOLOGIA
Producción y extracción de enzimas ligninolíticas.

Una cepa de hongo blanco puro pudrición Ganoderma lucidum se obtuvo de la colección de
cultivos de hongos del Laboratorio de Biotecnología Industrial, Departamento de Química y
Bioquímica de la Universidad de Agricultura, Faisalabad, Pakistán, que se utilizó para producir
extracto enzimático ligninolítico en fermentación en estado sólido pre-optimizado. Las condiciones
óptimas fueron: humedad, 50%; sustrato, 5 g; pH, 5,5; temperatura, 30 ◦ C; fuente de carbono, 2%
de fructosa; fuente de nitrógeno, 0,02% de extracto de levadura; Relación C: N, 25: 1; suspensión
de esporas fúngicas, 5 ml y el período de tiempo de fermentación, 4 días (Iqbal y Asgher, 2013b).
(REVISAR ESTA REFERENCIA). Después estipulado período de tiempo de fermentación, se añadió
100 ml de agua destilada a la biomasa fermentada y se mantuvo en posición agitación continua a
120 rpm durante 30 min seguido de la filtración y los filtrados se centrifugaron a 3000 g durante 5
min. El sobrenadante se ensayó para determinar (LIP), (MNP) y las actividades de lacasa, mientras
que, los residuos sólidos se utilizaron para analizar con fines de deslignificación.

Ensayos con enzimas ligninolíticas.

La actividad de la peroxidasa de lignina (LIP) de los sobrenadantes se determinó siguiendo la

oxidación dependiente de H2O2 de alcohol veratrílico a Verat-aldehído en 25 ◦ C usando un
espectrofotómetro UV-vis como se describió anteriormente (Iqbal et al., 2011). La actividad de la
peroxidasa de manganeso (MNP) de los sobrenadantes, mediante la adopción de la metodología
como se ha descrito anteriormente (Asgher e Iqbal, 2011). La actividad de la lacasa de los
sobrenadantes se determinó por el método de oxidación de 2,2-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-
sulfonato) ABTS como se describe anteriormente (Asgher et al., 2012a, b).

Producción y extracción del complejo de celulasa

Una paja de trigo pretratada se utilizó como sustrato para la producción de enzimas de celulasa
complejos, por T. harzianum en condiciones de fermentación pre-optimizado estado líquido. Para
la producción de celulasas, el hongo se cultivó en 500 ml, matraz Erlenmeyer que contiene 5 g de
paja de trigo en 100 ml esterilizado medio de Vogel en 28 ◦ C (Ahmed et al., 2009) (BUSCAR LA
COMPOSICION DE ESTE MEDIO). Después de cinco días de fermentación del cultivo sigue siendo el
contenido del matraz se filtró y el filtrado se utilizó como extracto crudo de celulasa con el
propósito de análisis de la actividad y estudios adicionales.

Celulasa enzimas de ensayos.

Endo 1,4-beta-glucanasas se ensayó usando CMC como sustrato y 3,5 ácido dinitrosalisylic (DNS)
como reactivo de acoplamiento por el método de Gadgil et al. (1995). Exo 1,4-beta-glucanasa se
ensayó de acuerdo con el método de Deshpande et al. (1984), utilizando 1% salicina como sustrato
de la reacción con DNS como reactivo de acoplamiento. Actividad de beta-glucosidasa fue
determinada por el método de Gielkens et al. (1999). actividad de xilanasa se midió de acuerdo
con el ácido dinitrosalicílico (DNS) método de Bailey et al. (1992), utilizando 1% Birchwood xilano
(Sigma, EE.UU.) como sustrato de reacción con DNS como reactivo de acoplamiento.

Pre-tratamiento (deslignificación) con extracto de enzimas ligninolíticos.

La paja de trigo fue tratado previamente con diferentes volúmenes de enzimas ligninoytic extraen
del suelo nacional, con fines de deslignificación. El extracto de enzima que contiene (LIP), (MNP) y
lacasa se aplicó sobre 30 g de sustrato en diferente, dosis, en combinación con tampón de
malonato de sodio 0,5 mM de pH 4,5 (Tabla 1), inicialmente durante 48 horas a 35 ◦ C para
despolimerizar la barrera de lignina con el fin de acceder al componente celulósico del sustrato. El
porcentaje de lignina se calculó antes y después del tratamiento enzimas ligninolítico con el fin de
determinar la eficiencia de la enzima y el porcentaje de eliminación de lignina del sustrato.

Determinación de la lignina y el porcentaje de deslignificación.

Enzimas no tratadas, así como ligninolíticas tratados paja de trigo Se analizó el contenido de
lignina y el porcentaje de deslignificación por el método de Johnson et al. (1961), con
modificaciones menores. La muestra se disolvió en 10 ml de 25% (w / v) de bromuro de acetilo en
ácido acético glacial redestilado ≥99% por calentamiento a 70 ◦ C ± 3 ◦ C en un baño de agua
durante 30 min. La muestra se almacenó en un tubo especial digestor con un tapón de vidrio
dentada. Después de 30 min la muestra disuelta se transfirió a un aforado de 200 ml matraz que
contiene 5 ml de una mezcla de ácido acético y sosa cáustica en 1: 1 de relación. Sustancias
interferentes se separaron por adición 0,2 g de clorhidrato de hidroxilamina. La muestra se diluyó
a 15 ml de volumen con ácido acético 99%, y la absorbancia se leyó a 280 nm. El contenido de
lignina de las muestras tratadas y no tratadas se calculó utilizando el factor estándar calculada a
partir de la curva estándar de lignina construido siguiendo el mismo protocolo.

Sacarificación de biomasa deslignificada por el extracto de celulasa.

La sacarificación de la paja de trigo deslignificada se llevó a cabo con la ayuda de extracto de

celulasa cruda producida a partir de T. harzianum en condiciones óptimas de crecimiento.
Erlenmeyer matraz (500 ml) que contenía 20 g deslignificada residuo se mezcló con 30 ml de
extracto de celulasa y el volumen se completó hasta 200 marca ml con tampón citrato 0,1 M de pH
4,8 seguido por la incubación a 37 ◦ C en un agitador orbital a 150 rpm durante 24 h de tiempo de
reacción.

Determinación de celulosa.

El contenido de celulosa de la biomasa tratada de celulasa se determinó por el método de David

(1969), con modificaciones menores para investigar el grado de hidrólisis de la celulosa en el
sustrato deslignificada pre-tratada. La biomasa deslignificada se homogeneizó antes y después de
tratamiento con celulasa en un mezclador en guerra y se centrifugó durante 5 min a 3.000 x g.
Para el sedimento, añadió 3,0 ml acético / nítrico reactivo y se mezcló bien el mezclador Vortex.
Con una canica en la parte superior para reducir la evaporación y crear una acción de reflujo, se
incubaron los tubos en baño de agua hirviendo durante 30 minutos. Los contenidos se
centrifugaron durante 5 min a 5000 × g después de la incubación y el sobrenadante se decantó y
10 ml 67% de H2 SO4 (v / v) se añadió al residuo, se mezclaron bien en mezclador Vortex y se
dejaron reposar durante 1 h. Diluido al 1-100 ml con agua destilada y se centrifuga si estaba
presente ningún precipitado o turbidez. Colocado 1,0 ml de esta dilución en unos 150 mm × 18
mm tornillo tubo de cultivo de tipo tapa y añadieron 4,0 ml de agua destilada en el mismo. Los
tubos se enfrió en hielo picado y 10 ml de reactivo de antrona fría se añadió por capas con una
pipeta y se mezcló bien el mezclador Vortex. Un mármol se colocó en la parte superior de cada
uno y coloca los tubos en un baño de agua hirviendo durante 16 minutos y se enfrió en baño de
hielo durante 2-3 minutos. Tubo se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 5 a 10 min y
se midió la absorbancia en espectrofotómetro a 620 nm contra el blanco de reactivo.

Determinación de glucosa y xilosa

La estimación de la glucosa se llevó a cabo por el método de Gadgil et al. (1995). Mientras que, el
rendimiento de xilosa a partir de la conversión hemicelulosas se calculó como sigue:

Donde XS es la cantidad de xilosa presente en la muestra de paja seca y XH es la cantidad de xilosa

(g) presente en la fase acuosa de la muestra después del tratamiento previo.

Protocolo de producción de etanol.

Un cultivo puro de S. cerevisiae se obtuvo de Shakar Ganj Sugar Mills (Pvt) Limited, Jhang,
Pakistán. Medio de inóculo, con la composición de los contenidos fueron: dextrosa, 6%; peptona,
0,5% y extracto de levadura, 0,5%, se preparó en 500 ml de matraz con un volumen de trabajo de
100 ml. El medio se esterilizó a 121 ◦ C (15 lb / in2) durante 15 min seguido de la adición de S.
cerevisiae al medio y el matraz se incubó a 37 ◦ C en una posición de agitación con 120 rpm
durante 18 h como se describió anteriormente (Asgher et al., 2013).
Dos conjuntos diferentes de triplicado Erlenmeyer matraces (500 ml), que contiene 5 g / 100 ml,
de hidrolizados tratados con celulasa se inoculó (5 ml de levadura inóculo) y se fermentan durante
72 h en una temperatura controlada (37 ◦ C) agitando incubadora (150 rpm). Después de 72 h de
tiempo de fermentación, la matraces de ambos conjuntos se filtraron, y seguido por la
centrifugación a 3000xg para obtener sobrenadantes claros que se analizaron para la
concentración de etanol por el sistema de HPLC.

Análisis de etanol por HPLC.

Un sistema de HPLC se utilizó para estimar las concentraciones de etanol en las muestras
fermentadas, de acuerdo con la metodología como se describió previamente (Asgher et al., 2013).
Se utilizó el sistema Shimadzu HPLC, que consiste en una bomba isocrática, vacío desgasificador,
inyector automático, de columna y detector de índice de refracción. La columna utilizada fue una
columna Fermentación Monitor (150 mm x 7,8 mm, 5 m) (BioRad). 5 mM acuoso H2 SO4 se utilizó
como fase móvil a una 0,8 ml / min velocidad de flujo con una temperatura de columna de 60 ◦ C.
En comparación con la muestra en bruto se usó una muestra estándar de etanol para la
estimación de producto en las muestras para todos los análisis HPLC.
Optimización de los parámetros de fermentación para la producción de etanol

Los parámetros de la fermentación incluido el tiempo de fermentación, pH hidrolizado,

temperatura, nivel de sustratos y tamaños inóculo fueron optimizados con el fin de lograr la
máxima producción de etanol. Estrategia de optimización clásica se adoptó es decir, mediante la
variación de una variable a la vez y mantener los factores previamente optimizados a nivel óptimo
que también apoyan a favor de eliminar la prueba de control adicional.

Optimización de tiempo de fermentación

En matraces de 500 ml, conteniendo cada uno 10 gramos de hidrolizados pre-tratados de

suspensión de paja de trigo se ajusta a pH 5,5, esterilizado inicial, y se fermenta para diferentes
períodos de fermentación, es decir, 24, 48, 72, 96 y 120 h en una temperatura controlada (37 ◦ C)
agitando incubadora (150 rpm). Triplicado matraces se recogieron después de cada tiempo de
fermentación 24 h y se analizaron para la concentración de bio-etanol.

Optimización de pH

El pH de los medios de fermentación a base de paja de trigo contiene 10 gramos pre-tratados de

hidrolizados de paja de trigo se ajustó a varios niveles (pH 3, 4, 5, 6 y 7) utilizando M HCl / NaOH),
inoculadas con cultivo de levadura fresca y se deja fermentar para tiempo de fermentación óptima
(72 h).

Optimización de la temperatura

Para optimizar la producción de bio-etanol en condiciones óptimas de temperatura para el mejor

crecimiento producido de S. cerevisiae los matraces por triplicado que contenían 10 gramos de
hidrolizados se sometieron a la fermentación de etanol durante 72 h bajo diferentes temperaturas
que van de 20 a 45 ◦ C.

La optimización del nivel de sustrato.

Diferentes niveles de hidrolizados es decir, se utilizaron 5, 10, 15 y 20 g / 100 ml (paja de trigo pre-
tratado enzimáticamente) para investigar el efecto del nivel de sustrato en la producción de bio-
etanol. Los matraces por triplicado se inocularon con levadura (5 ml de inóculo) y se sometieron a
la fermentación para el tiempo óptimo.

Optimización de tamaño levadura inóculo.

Matraces por triplicado que contienen suspensión de paja de trigo pre-tratada se inocularon con
diferentes volúmenes de inóculo de levadura (1-5 mL) y se procesaron durante 72 horas a 35 ◦ C
en condiciones óptimas para determinar el nivel de inóculo óptimo que da el mejor la producción
de etanol por S. cerevisiae.

Análisis Estadístico

Todos los datos experimentales se llevó a cabo por triplicado y se presentan como media ± error
estándar (SE). El análisis estadístico se realizó mediante análisis de varianza (ANOVA) utilizando el
software estadístico STATISTICA versión 8.1 (Stat Soft Inc, Tulsa, OK, EE.UU.) y los valores de
probabilidad (p ≤ 0,05) fueron consideradas como una diferencia estadísticamente significativa.
Los medios y los errores estándar de medios (media ± DE) se calcularon para cada tratamiento y
los valores de “SE” se han mostrado como barras de error en Y-figuras.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Producción lignolitica de G. lucidum.

Una gran magnitud de un enzimas ligninolíticos indígenas incluyendo (LIP), (MNP) y lacasa se
recuperó a través del estado sólido bio-procesamiento de la paja de trigo sin tratar por el blanco
cepa pudrición por hongos Ganoderma lucidum bajo ciertas condiciones fijas de cultivo de
fermentación previamente optimizados (humedad, 50%; sustrato, 5 g; pH, 5,5; temperatura, 30 ◦
C; fuente de carbono, fructosa 2%; fuente de nitrógeno, 0,02% de extracto de levadura; relación C:
N, 25: 1; suspensión de esporas fúngicas, 5 ml y fermentación período de tiempo, 4 días) (Iqbal y
Asgher, 2013b). G. lucidum fue cultivado en un medio de estado sólido basado paja de trigo para
la producción de extracto de ligninolítico en un entorno inerte esterilizado. El extracto de enzima
contenía 532 ± 4,2 U / ml, 882 ± 13,3 U / ml y 340 ± 6,4 U / ml de (LIP), (MNP) y lacasa,
respectivamente.

La producción de celulasa por T. Harzianum

La producción de celulasa de T. harzianum se llevó a cabo en condiciones de crecimiento pre-

optimizado como se ha descrito anteriormente (Ahmed et al., 2009). El hongo producido beta-1,4
endoglucanasa, 53,5 ± 1,24 U / ml; beta-1,4 exoglucanasa, 41,3 ± 1,31 U / ml; beta-1,4 glucosidasa,
46,8 ± 1,43 U / ml; y xilanasa 39 ± 2,2 U / ml, respectivamente. El extracto de enzima se utilizó
para la sacarificación de la enzimáticamente (ligninolítico; (LIP), MnP y lacasa) de paja de trigo pre-
tratada.

Deslignificación, sacarificación y fermentación

El pretratamiento con extracto ligninolítico

A triplicado conjunto de matraces experimentales que contienen volúmenes conocidos del

extracto ligninolítico se utilizaron para la deslignificación enzimática de paja de trigo. Se determinó
la extensión de la deslignificación (%), hidrólisis de la celulosa (%) y azúcares (glucosa y xilosa)
liberado (g / L).

Una reducción en el contenido de lignina de la paja de trigo fue registrada después del
tratamiento con el extracto de ligninolítico con una deslignificación máximo de 39,6% con el nivel
de dosis de 25 ml de extracto ligninolítico (Tabla 2). La biomasa pre-tratado se sometió
adicionalmente a la hidrólisis enzimática por las celulasas sin procesar en bruto (beta-1,4
endoglucanasa, 53,5 ± 1,24 U / ml; beta-1,4 exoglucanasa, 41,3 ± 1,31 U / ml; beta-1, 4
glucosidasa, 46,8 ± 1,43 U / ml; y xilanasa 39 ± 2,2 U / ml) producida por T. harzaianum, la celulosa
se convierte en glucosa y la celulosa contenido reducido (88,3% celulolisis) con liberación
concomitante de 72,5 y 2,4 g / L de glucosa y xilosa, respectivamente.

La glucosa y xilosa rendimientos máximos se redujeron de 72,5 y 2,4 g / L a 19,2 y 1,2 g / L,

respectivamente después de la exposición inicial a la S. cerevisiae. Esta reducción fue debido a la
actividad potencial de la S. cerevisiae (consumo y conversión) con la producción máxima de etanol
de 22,6 g / L (Tabla 2). De acuerdo con la Taniguchi et al. (2005), paja de arroz tratada previamente
con el extracto de ligninolítico Pleorotus ostreatus durante 6 días, la pérdida de peso total y el
grado de Klason lignina degradado eran 25% y 41%, respectivamente. Anteriormente, Adsul et al.
(2005) también habían utilizado los residuos agroindustriales (bagazo muestras lignocelulósicos)
para fines de deslignificación por las enzimas de celulasa y xilanasa.

La conversión de celulosa obtenida después de 72 h se encontraba en el mismo rango que los

reportados anteriormente para otras materias primas (García-Aparicio et al., 2011). En
comparación con las técnicas de tratamiento se informó anteriormente, el tratamiento basado
ligninolítico actualmente investigado causó la conversión de elogio de la celulosa en glucosa y
xilosa en condiciones de procesamiento suaves y respetuosos del medio ambiente, que son más
seguros y estables que las diversas técnicas de pretratamiento alcalinos, ácidos u otros .

Optimización de los parámetros de fermentación para la producción de etanol

Para mejorar aún más la solidez de S. cerevisiae, algunas variables nutricionales y parámetros
críticos de fermentación se optimizaron clásicamente con el objetivo de conseguir la máxima
producción de etanol. De manera óptima deslignificada residuos de paja de trigo obtenidos
después del pre-tratamiento con extracto de ligninolítico seguido por el tratamiento de celulasas
complejos fueron seleccionados como mejores hidrolizados para la producción de bioetanol en la
sacarificación y fermentación secuencial (SSF).

Optimización de período de tiempo de fermentación

A fin de facilitar las células de S. cerevisiae crecen después de la inoculación, los azúcares
residuales (glucosa y xilosa) tienen que estar presentes en el medio de alimentación (azúcar que
contiene hidrolizado). Por lo tanto, para descifrar esta condición óptima, el inóculo recién
preparada de S. cerevisiae se inoculó inmediatamente después del segundo tratamiento con
celulasas seguido de incubación en un agitador de temperatura controlada para diferentes
períodos de tiempo (como se mencionó anteriormente en la Sección 2).
Se observó que cuando se añadió S. cerevisiae inóculo en el medio de alimentación de la
concentración bio-etanol se aumentó desde 22,6 hasta 24,2 g / L en la fase de crecimiento
exponencial tardía de S. cerevisiae (48 h periodo de fermentación) y se mantuvo la mayor
producción en la fase de crecimiento estacionario (72 h periodo de fermentación) (. Figura 1).
Después de la fermentación periodo estipulado de tiempo (72 h de fermentación) la concentración
de etanol fue de 24,2 g / L, y los que en otros tiempos estaban por debajo de 22,6 g / L. Por lo
tanto, para maximizar la producción de etanol en el cultivo, se determinó 72 h de tiempo de
fermentación. En un estudio anterior, Ballesteros et al. (1991) han identificado e informó de la
cepa de S. cerevisiae que tenía una productividad óptima de etanol a 37 ◦ C en 70 h de tiempo de
fermentación, mientras que, Ko et al. (2009) observó un rendimiento máximo de etanol después
de 96 h de fermentación. S. cerevisiae, Candida tropicalis y su co-cultivo se han reportado para
producir la concentración máxima de etanol de 27, 23, 21 g / L (w / v), respectivamente usando
200 g / L (w / v) Corbs de maíz seco después de 96 h de fermentación (Latif y Rajoka, 2001). En
contraste con esto, hemos mejorado el entorno de procesamiento y optimizado el medio de
fermentación para la producción práctica de etanol y se obtuvieron 24,2 g / L después de 72 h de
fermentación en el matraz de cultivo usando 10 g hidrolizados pre-tratadas.

Optimización de la fermentación el pH del medio

10 gramos pre-tratadas de hidrolizados se inocularon (5 ml de inóculo S. cerevisiae recién
preparada) y se sometieron a fermentación (150 rpm) a pH variable para el tiempo de
fermentación óptima (72 h). El rendimiento máximo de 25,5 g / L de etanol se obtuvo de los
cultivos fermentados que tienen pH 5, pero los que a pH por debajo de 5, el rendimiento de etanol
fue inferior a 24,2 g / L, como se muestra en la Figura 2. Esto es debido al hecho de que las
proteínas funcionan en un entorno que refleja el pH en este rango y también debido a que el pH
bajo favorece la producción de ácido en lugar de alcohol (Togarepi et al., 2012). Si el pH se elimina
del modelo usando la optimización de la hidrólisis enzimática que afecta a las variables de
respuesta (Vásquez et al., 2007). En otro estudio, Ozmihci y Kargi (2007) investigaron la velocidad
y el grado de productividad de etanol hasta 15 g / L a un valor inicial de pH de 5 y potencial redox
(ORP) de -250 mV.

Optimización de la temperatura de incubación

La máxima concentración de etanol en las culturas de 30 ◦ C y 35 ◦ C fueron 26,2 y 28,7 g / L,

respectivamente, pero, los de menos de 30 y mayores de 35 ◦ C estaban debajo de 26,2 g / L como
se muestra en la Figura 3. Esta drástica reducción de la producción de etanol puede ser la hipótesis
de que a temperaturas más altas, es decir, 40 y 45 ◦ C la S. cerevisiae no podían crecer como
mayor y menor concentración de azúcares reductores y etanol, respectivamente, en los cultivos a
estas temperaturas indicando claramente la muerte elevado fase de S. cerevisiae. Estos resultados
indican que la temperatura óptima para la producción de etanol es de 35 ◦ C, que fue seguido por
todo el trabajo analítico adicional. En un estudio reciente Manikandan y Viruthagiri (2010)
utilizado Aspergillus niger y la levadura S. cerevisiae en una fermentación de co-cultivo y el mejor
rendimiento de etanol observado a 30 ◦ C. En línea con nuestros hallazgos, Ballesteros et al. (1991)
utilizaron 27 especies diferentes de S. cerevisiae y observó que 37 ◦ C era un ambiente térmico
óptimo para la producción de etanol por todas las cepas.

Optimización de la concentración de sustrato

La concentración de sustrato es uno de los principales factores que afectan el rendimiento y la

velocidad inicial de la hidrólisis enzimática de la celulosa y la fermentación. Se obtuvo un máximo
de 30,1 g de producción / L de etanol utilizando concentración óptima de paja de trigo tratada
enzimáticamente (Figura 4). Para cierta medida una óptimos niveles de sustrato normalmente
resulta en un aumento de la producción de azúcar que posteriormente mejorado el rendimiento
de etanol. Sin embargo, altas concentraciones de sustrato puede causar la inhibición de sustrato,
que forma sostenible reduce la tasa de fermentación (Xin et al., 2010). Muchos de los informes
publicados previamente han demostrado que la alta concentración de sustrato generalmente
causada disminución de rendimiento de la hidrólisis debido a la inhibición del producto, y el grado
de inhibición del sustrato depende de la relación del sustrato total de enzima total de carga (Wang
et al., 2011; Xin et al., 2010).

Optimización de tamaño inóculos

La densidad de inóculo de levadura es un parámetro muy importante hacia la explotación

industrial de la fermentación microbiana y la productividad de etanol. La producción máxima de
etanol de 33,5 g / L se observó en los matraces de fermentación que recibieron 5 ml de inóculo de
levadura usando sustrato tratado ligninolítico además con un consumo completo de la glucosa
disponible (Figura 5). El análisis estadístico reveló un efecto significativo de la variación de tamaño
del inóculo en la producción de etanol como todos los medios de tratamiento mostraron
diferencia significativa. Una fuerte interacción entre la concentración de azúcar y el tamaño del
inóculo en cultivos de alta densidad celular puede conducir a aumentos en los niveles de
rendimiento de etanol (Laluce et al., 2009). Levadura (S. cerevisiae) el tamaño del inóculo tiene un
efecto significativo para la producción de etanol (Turhan et al., 2010) y no hay diferencia
significativa entre los diferentes niveles de tamaño del inóculo de 3% en términos de consumo de
azúcar y la tasa de producción de etanol.

Conclusiones
En el presente estudio, se utilizó paja de trigo tratada enzimáticamente para la producción de
etanol seguido de la optimización de los nutrientes críticos y variables de proceso. La presente
investigación también revela que la paja de trigo es una materia prima abundante agroindustrial
con un bajo valor comercial que se puede utilizar para la enzima en el sitio y la producción de
bioetanol para hacer frente a las crisis de energía modernos. Por otro lado, pese a la amplia
disponibilidad de materiales lignocelulósicos en particular paja de trigo en Pakistán, se han hecho
muy pocos intentos sobre su posible utilización, probablemente debido a la falta de diseño de la
investigación exhaustiva e ingeniería de procesos. Durante los últimos años, hemos demostrado
una mejora considerable en muchos procesos relacionados con la biotecnología lignocelulosa y
provocó estudios en profundidad de los materiales lignocelulósicos, microorganismos ligninolíticos
y sus enzimas (Iqbal et al, 2011; Asgher e Iqbal, 2011, 2013; Asgher et al., 2012a, b, 2013; Iqbal y
Asgher, 2013A, b). En resumen, los resultados obtenidos después de la cromatografía líquida de
alta resolución (HPLC) lo que sugiere un tratamiento previo ligninolítico como una herramienta
prometedora en comparación con los preexistentes pre-tratamientos aplicados para producir
etanol a partir de diversos materiales lignocelulósicos base (Tabla 3). Enzimas ligninolíticos más
eficientes se pueden desarrollar utilizando aproximación molecular avanzada que pueden ser los
catalizadores futuros amistosos económicos y ambientales para la deslignificación de biomasa y la
producción de etanol.