Universidad

Miguel Hernández
Dpto. de Bioquímica y Biología Molecular
Facultad de Medicina


Prácticas de Bioquímica I

Práctica 1: La Bioquímica en Internet ‐ Biomoléculas en 3D

Práctica 2: Introducción al Laboratorio de Bioquímica
Práctica 3: Actividades enzimáticas. Colinesterasa del suero





Apellidos..................................................................
Nombre....................................................................
Nº expediente.........................................................

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 NORMAS GENERALES PARA LA REALIZACIÓN Y EVALUACION DE LAS PRÁCTICAS DE
BIOQUIMICA

Normas generales. Introducción a las sesiones prácticas.

Consideraciones previas. En cada laboratorio es necesario prever que cualquier incidente que pueda afectar al
funcionamiento de la Universidad, tenga una incidencia nula o mínima sobre las personas, las instalaciones y/o
la continuidad de las actividades. La organización del laboratorio debe permitir la correcta gestión de la
prevención del riesgo, imbuida en los propios procedimientos de trabajo, prácticas y actividades.

Cualquier persona que realice sus actividades en el laboratorio debe conocer:
Reglamento de funcionamiento del laboratorio.
Riesgos para la seguridad y la salud de los productos químicos existentes.
Riesgo biológico de los agentes biológico empleados.
Manual de Autoprotección de emergencias de la UMH.
Itinerarios y salidas de emergencia generales y particulares.
Localización y señalización de lavaojos y/o duchas de seguridad, extintores (su funcionamiento y
adecuación) e interruptores de suministro eléctrico.
Localización de los botiquines.
Riesgos para el medio ambiente de los productos químicos existentes.
En esta introducción se pretende que el alumno tome contacto con el laboratorio, para lo cual se le indicarán las
normas generales de comportamiento en el mismo, las reglas de seguridad que hay que observar, las normas
específicas en caso de accidente, así como las normas generales para la realización de las prácticas de la
asignatura.

Normas generales del laboratorio

1. El alumno tiene la obligación de leer y estudiar con anticipación las experiencias a realizar en el laboratorio.
El fundamento teórico, si lo desconoce, deberá buscarlo en los libros adecuados.
2. A la hora señalada para el comienzo de las prácticas el alumno deberá estar en el lugar correspondiente y en
su puesto. Será obligatorio usar una bata blanca. No disponer de la bata blanca implica no poder realizar la
práctica de ese día.
3. Durante el horario de prácticas no se podrá salir del laboratorio sin permiso del profesor.
4. Está prohibido realizar pruebas diferentes a las indicadas en este cuaderno de prácticas. El alumno se ceñirá
escrupulosamente al mismo.
5. Se valorará la actitud y el comportamiento general que cada alumno adopte durante la realización de las
prácticas, aspecto éste determinante de la nota final.

Reglas de seguridad
Cuando se trabaja en el laboratorio, tanto de prácticas como de investigación, uno se puede exponer a una serie
de sustancias cuya característica más importante, desde el punto de vista de la seguridad, es su toxicidad y
peligrosidad. Una actitud de vigilancia y atención es imprescindible en todo momento, aunque no se esté
haciendo nada. Pensar y actuar de forma segura es parte integral de la educación química. No debe realizarse
ningún experimento antes de estar seguro de que se comprende bien lo que se va a hacer, y tras dar respuesta a
estas dos preguntas: ¿Qué es lo peor que puede pasar? ¿Cómo lo puedo solucionar? Preguntar a los profesores,
en caso de duda, es una buena costumbre. Para evitar accidentes e incidentes desagradables es necesario el
extremar las precauciones. El seguimiento estricto de las siguientes normas evitará al máximo la posibilidad de
accidentes en el laboratorio.

1. En primer lugar mantener en todo momento las batas y los vestidos abrochados (protección frente a
salpicaduras y derrames).
2. No llevar pulseras, colgantes o mangas anchas que puedan engancharse en los montajes. Deberán lavarse las
manos antes y después de entrar y salir del laboratorio y siempre que hubiera contacto con algún producto
químico.
3. Se evitará llevar pantalón corto, faldas cortas, sandalias, zapatos abiertos, etc., por razones de protección de
la piel.

2
4. En el laboratorio está prohibido comer, beber o fumar. No se debe encender ninguna llama ni mechero en el
laboratorio.
5. No conectar aparatos eléctricos sin asegurarse de que no hay peligro de vapores de disolventes próximos. No
colocar jamás productos inflamables cerca de fuentes de calor. Muchas sustancias orgánicas inflamables
originan vapores más densos que el aire, capaces de desplazarse distancias considerables por encima de la
mesa de laboratorio.
6. Se tomarán las precauciones necesarias al trabajar con ácidos, bases o sustancias peligrosas para evitar
accidentes. Si se utilizan sustancias en forma de polvo fino, se deberá de utilizar mascarilla
fundamentalmente en el momento de la pesada para evitar su inhalación. Como norma general, para
pipetear disoluciones o sustancias nocivas líquidas o en caso de duda, se utilizará una propipeta. Los
disolventes orgánicos no se verterán por las pilas, sino que se almacenarán en los recipientes dispuestos
para tal fin. Los ácidos y bases concentrados se neutralizarán, y la disolución salina resultante se verterá con
los grifos abiertos.
7. Una norma general para la preparación de disoluciones de ácidos fuertes es que siempre se adicionará el
ácido sobre el agua o disolución acuosa, al fin de evitar la proyección de esta última como consecuencia del
calentamiento brusco al mezclarse ambas disoluciones. Si fuera necesario calentar el contenido de un tubo
de ensayo a la llama, se hará con el tubo algo inclinado, agitando suavemente y con la boca del tubo dirigida
hacia un lugar en que no haya ninguna persona.
8. Evitar el contacto físico con disolventes orgánicos. No respirar vapores de disolvente. (Ver apartado sobre
"riesgos asociados a los disolventes"). Cuando se utilicen sustancias volátiles (disolventes orgánicos como el
cloroformo, éter, etc.) se manipularán en la campana de gases utilizando, si es necesario, una mascarilla.
9. Las gafas de protección son obligatorias cuando el profesor así lo indique. No usar nunca lentes de contacto
(los vapores orgánicos podrían dañarlas; por otro lado, los reactivos cáusticos no pueden ser eliminados del
ojo si las lentillas están puestas). Fíjate dónde están situados los baños lavadores de ojos.
10. Usar guantes protectores cuando el profesor lo indique. En caso de contacto de productos corrosivos o
irritantes ver indicaciones más abajo.
11. El material del laboratorio ha de estar siempre limpio y seco, sin restos de sustancias anteriores. Los
residuos se tratarán de la siguiente forma:
A) Material de cristal roto, papeles y otros. Se tirará en los recipientes destinados especialmente
a este fin.
B) Productos químicos tóxicos. Se tirarán en contenedores especiales para este fin. No tires
directamente al fregadero los productos especialmente tóxicos.
C) Sustancias líquidas o disoluciones. Los que puedan verterse al fregadero, se diluirán
previamente, sobre todo si se trata de ácidos y de bases. No tires al fregadero productos o residuos
sólidos que puedan atascarlas. En estos casos deposita los residuos en recipientes adecuados.
En el caso que se genere un derrame de residuos peligrosos durante la realización de la práctica, el papel que
se utilice para su recogida también será depositado en el contenedor establecido para ese grupo de residuos
peligrosos. En caso de duda, preguntar a algún responsable cómo proceder.
12. Una norma general que se añade a las citadas y que contribuye a la seguridad en el laboratorio es la del rigor
y orden en el laboratorio. Con ello queremos resaltar que en todo momento se ha de mantener una limpieza
y orden adecuados en el laboratorio.
13. Ante cualquier duda o si se produce algún accidente, avisar rápidamente al profesor.

Normas de actuación
Orden y limpieza. El orden es fundamental para evitar accidentes. Mantener el área de trabajo ordenada, sin
libros, abrigos, bolsas, exceso de botes de productos químicos y cosas innecesarias o inútiles. Mantener las mesas
siempre limpias. Se tienen que limpiar inmediatamente todos los productos químicos derramados. Limpiar
siempre perfectamente el material y aparatos después de su uso.
Responsabilidad. Trabajar sin prisas, pensando en cada momento lo que estás haciendo, y con el material y
reactivos ordenados. No se debe gastar bromas, correr, etc. en el laboratorio. No realizar un experimento no
autorizado. Un comportamiento irresponsable puede ser motivo de accidentes no deseados y comportar la
expulsión inmediata del laboratorio.
Atención a lo desconocido. No utilizar ni limpiar ningún recipiente de reactivos que no lleve etiqueta.
Entregadlo inmediatamente al profesor. No sustituir nunca, sin autorización previa del profesor, un producto
químico por otro en un experimento. No utilizar un equipo o aparato sin conocer perfectamente su
funcionamiento. No usar una pipeta directamente con la boca, sino a través de un sistema de aspiración.

3
Manipulación del vidrio. No forzar un tubo de vidrio, ya que, en caso de ruptura, los cortes pueden ser graves
No usar nunca equipo de vidrio que esté agrietado o roto. Depositar el material de vidrio roto en un contenedor
para vidrio, no en una papelera.
Manipulación de productos químicos.
‐ Los productos químicos pueden ser peligrosos por sus propiedades tóxicas, corrosivas, inflamables o
explosivas. Muchos reactivos, particularmente los disolventes orgánicos, arden en presencia de una llama.
Transporte de reactivos. No transportar innecesariamente los reactivos de un sitio a otro del laboratorio. Las
botellas se transportan siempre cogiéndolas por el fondo, nunca del tapón.

Actuaciones en caso de accidente
1. En caso de accidente, avisar inmediatamente al profesor. En caso de gravedad llamar al 112, o al
teléfono de la universidad 8665 (966658665 para llamada externa). No llevar a cabo actuaciones
inseguras; si se realizan primeros auxilios, hay que estar seguro/a de no empeorar el estado del accidentado
(protección) y asegurarse uno mismo de no sufrir riesgo (autoprotección).
2. Fuego en el laboratorio. Evacuad el laboratorio, de acuerdo con las indicaciones del profesor y la
señalización existente en el mismo. Si el fuego es pequeño y localizado, apagadlo utilizando un extintor
adecuado, arena, o cubriendo el fuego con un recipiente de tamaño adecuado que lo sofoque. Retirad los
productos químicos inflamables que estén próximos fuego. No utilizar nunca agua para extinguir un fuego
provocado por la inflamación de un disolvente. En caso de que el fuego sea importante, accionar el pulsador
de alarma
3. Fuego en la ropa. Si se incendia la ropa, pedir ayuda inmediatamente. Tumbarse en el suelo y rodar sobre ti
mismo para apagar las llamas. No correr (al hacerlo se aviva el fuego) ni intentar llegar a la ducha de
seguridad si no está muy cerca. Ayudad a alguien que se esté quemando. Cubridle con una manta anti fuego,
conducidle hasta la ducha de seguridad, si está cerca, o hacedle rodar por el suelo. No utilizar nunca un
extintor sobre una persona. Una vez apagado el fuego, mantener a la persona tendida, procurando que no
coja frío y proporcionarle los primeros auxilios hasta la llegada de la asistencia médica.
4. Quemaduras. Las pequeñas quemaduras producidas por material caliente, baños, placas o mantas
calefactoras, etc., se trataran lavando la zona afectada con agua fría durante 10‐15 minutos. Desinfectar (por
ej. con yodo) y cubrir con gasas. No aplicar ungüentos o sustancias (pasta de dientes, lejía, etc.) ni punciones
o retirar las ampollas si aparecen. Las quemaduras más graves requieren atención médica inmediata.
5. Cortes. Los cortes producidos por la rotura de material de cristal son un riesgo común en el laboratorio. Se
deben lavar bien, con abundante agua corriente, durante 10 minutos como mínimo. Si son pequeños y dejan
de sangrar en poco tiempo, lavadlos con agua y jabón, aplicar un antiséptico y taparlos con una venda o
apósito adecuados. Si son grandes o muy profundos y no paran de sangrar, solicitar asistencia médica
inmediata. No retirar ni manipular un posible cuerpo extraño enclavado.
6. Actuación en caso de inhalación de productos químicos. Conducir inmediatamente a la persona afectada
a un sitio con aire fresco. Requerir asistencia médica inmediata. Al primer síntoma de dificultad respiratoria
debe iniciarse la respiración artificial boca a boca. Identificar, si es posible, el gas causante, usar la máscara
adecuada y si no la hay, aguantar la respiración mientras se extingue el vapor (abriendo ventanas, usando
campanas, etc.). Tratar de no exponerse en cualquier caso.
7. Actuación en caso de ingestión de productos químicos. Antes de cualquier actuación concreta pedir
asistencia médica. Si el paciente está inconsciente, ponerlo tumbado, con la cabeza de lado. Taparlo con una
manta para que no tenga frío. No dejarlo sólo. No darle líquidos, ni provocar el vómito.
8. Derrame o proyección de productos químicos sobre la piel. Los productos químicos que se hayan
vertido sobre la piel han de ser lavados inmediatamente con agua corriente abundante, como mínimo
durante 15 minutos. En el caso de productos corrosivos, además de lo anterior, también se retirará o cortará
lo más rápidamente posible la ropa, evitando salpicaduras a otras partes del cuerpo. Las duchas de
seguridad instaladas en los laboratorios serán utilizadas en aquellos casos en que la zona afectada del
cuerpo sea grande y no sea suficiente el lavado en un fregadero. Es necesario sacar toda la ropa contaminada
a la persona afectada lo antes posible mientras esté bajo la ducha. Recuerda que la rapidez en el lavado es
muy importante para reducir la gravedad y la extensión de la herida. Proporcionar primeros auxilios hasta la
llegada de asistencia médica a la persona afectada. Avisar a tu profesor. Si un producto químico entra en
contacto con tus ojos, el tiempo es esencial, sobre todo si el producto es corrosivo (actuad en menos de 10
segundos). Cuanto antes se lave el ojo, menos grave será el daño producido. Lava los dos ojos con agua
corriente abundante durante 15 minutos como mínimo en una ducha de ojos, y, si no hay, con un frasco para
lavar los ojos. Es necesario mantener los ojos abiertos con la ayuda de los dedos para facilitar el lavado
debajo de los párpados. Es necesario recibir asistencia médica, por pequeña que parezca la lesión. Cuidado:
no usar demasiada potencia de chorro de agua, para evitar lesiones al ojo.

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Normas generales para la realización de las prácticas
1 Antes de comenzar la práctica deberá revisar que dispone de todo el material y productos necesarios para la
misma, y que se encuentra todo limpio y en orden. Se notificará al profesor cualquier anomalía. Al finalizar la
práctica dejará todo el material perfectamente limpio y ordenado, avisando al profesor de haber terminado
antes de abandonar el laboratorio.
2 Las pipetas deben estar bien limpias y secas antes de ser utilizadas. Pipetear siempre con la propipeta
adecuada. No pipetear entre varias personas.
3 Todos los frascos, botellas, etc., han de estar correctamente etiquetados y cerrados, evitando que se
confundan los tapones. Los recipientes donde se almacenan sustancias y disoluciones se deben marcar
adecuadamente utilizando rotuladores, lápices de cera o etiquetas. En cada caso se indicará la sustancia de
que se trata y su concentración, así como la fecha de preparación.
4 Se deben de anotar en el cuaderno de prácticas las disoluciones preparadas y su concentración, así como el
volumen preparado de cada una.
5 Todos los frascos y botellas que contienen los reactivos preparados deberán situarse en el fondo de la
bancada o mesa de trabajo, evitando dejarlos en los bordes.
6 Cada alumno (con independencia de que haya formado parte de un grupo de varias personas) deberá
presentar un informe de resultados de cada práctica en la forma indicada por el profesor.
7 Ante cualquier duda preguntar al profesor de prácticas.
8 Se recuerda que para APROBAR la asignatura es necesario superar las prácticas. Las prácticas son
obligatorias y la no asistencia a las mismas, salvo causa de fuerza mayor, implica la necesidad de superarlas
en una PRUEBA TEÓRICA Y/O PRÁCTICA, DE ACUERDO CON LAS DIRECTRICES DE LA ASIGNATURA.

Riesgos asociados a los disolventes
Es esencial recordar que la mayoría de los disolventes orgánicos son inflamables, y arden si están expuestos a
una llama. Además, muchos son tóxicos o carcinógenos. Por ejemplo, muchos disolventes clorocarbonados, si se
acumulan en el organismo, causan un deterioro del hígado similar a la cirrosis originada por uso excesivo de
etanol. El cloroformo y el éter son anestésicos, causando somnolencia y náuseas. En otras palabras, los
disolventes orgánicos son tan peligrosos como los compuestos químicos corrosivos (p. ej. el ácido sulfúrico). A
continuación se citan algunos ejemplos:

• Ácido acético glacial: es suficientemente corrosivo para causar quemaduras. Sus vapores pueden irritar los
ojos y los conductos nasales.
• Acetona: no es muy tóxica comparada con otros disolventes. Sin embargo es MUY inflamable.
• Benceno: se absorbe fácilmente a través de la piel, y puede afectar a la médula ósea y provocar leucemia.
Está considerado como agente carcinógeno y afecta al hígado y los riñones. Además es muy inflamable.
• Diclorometano: no es inflamable y no está considerado como carcinógeno. Si se ingiere puede deteriorar el
hígado, y sus vapores pueden originar somnolencia y náuseas.
• Etanol: es un conocido agente tóxico y es extremadamente inflamable.
• Éter etílico: es extremadamente inflamable y puede originar explosiones (presencia de peróxidos). No es
particularmente tóxico, pero en grandes concentraciones puede originar somnolencia y náuseas.
• Hexano, pentano, éter de petróleo: pueden irritar el tracto respiratorio y la piel. También pueden actuar
como tóxico y depresivos del sistema nervioso central. Son altamente inflamables.
• Metanol: más tóxico que el etanol, provoca por ingestión ceguera y muerte. Es muy inflamable.
• Tolueno: no está considerado como agente carcinógeno, pero es tan tóxico como el benceno. Puede actuar
como anestésico, y afectar al sistema nervioso central.

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He leído y entiendo las Normas de Seguridad y los Riesgos Asociados al laboratorio
Nombre:_________________________ Apellidos: _____________________________
Curso Académico:_________________ Grado:________________________________

Firma:

PRÁCTICA 1: La Bioquímica en Internet ‐ Biomoléculas en 3D.

Prof. responsable: Luis Miguel Gutiérrez Pérez (luisguti@umh.es)

INTRODUCCIÓN

Es evidente para cualquier estudiante que se acerque con curiosidad a las nuevas tecnologías
de la información, que se están abriendo un buen número de posibilidades en apoyo del
estudio y comprensión de la bioquímica. Es por ello que esta práctica esta dedicada a conocer
y manejar estos nuevos recursos. La Internet (WWW o simplemente Web) es ante todo una
fuente inmensa de todo cuanto el ser humano piensa que merece ser enseñado (sea o no
honesto, esto hay que advertirlo), y por ello existen una variedad casi incatalogable de
información en relación con la bioquímica. En principio podríamos dividir estas fuentes en
cuanto su interés en nuestro campo en cuatro tipos:

A. Direcciones con interés para localizar información sobre cualquier aspecto de la Bioquímica
y Biología molecular. Éstas serían la base de partida para localizar otras direcciones
específicas. Sería el caso de las direcciones URL(Universal Resource Locator):
http://www.cellbio.com o http://www.ncbi.nlm.nih.gov . Todas ellas organizan la búsqueda
de direcciones (links) en secciones como: Enseñanza de Bioquímica y Biología Molecular,
Protocolos experimentales, bases de datos, fuentes de programas, revistas especializadas etc.

B. Direcciones de bases de datos con relevancia en investigación y docencia en Bioquímica y
Biología Molecular. Éstas pueden ser de especial utilidad para la utilización de recursos
didácticos complejos como la representación de biomoléculas en 3‐D o la utilización de
recursos de investigación como la búsqueda o alineamiento de secuencias o de los valores de
separación de proteínas en 2D‐PAGE. Estas fuentes se especificarán en más detalle con
posterioridad. A este tipo de direcciones pertenecen por ejemplo la dirección:
http://www.rcsb.org/pdb/ .

C. Direcciones de interés específico en aspectos de investigación. Sería el caso de direcciones
que proveen de protocolos experimentales, o de foros de discusión sobre temas específicos de
un campo de investigación o incluso las pertenecientes a revistas especializadas. Ejemplos de
este tipo serían las direcciones: http://www.protocol‐online.net , o
http://bioinformatics.weizmann.ac.il/

D. Finalmente se podrán encontrar direcciones cuyo interés principal sea el de la educación en
campos biológicos o bioquímicos. Un ejemplo de este tipo sería http://esg‐
www.mit.edu:8001/esgbio.

Dado que este seminario tiene por objeto el mostrar la utilidad de estas fuentes de
información en el apoyo de la docencia e investigación se centrará en un aspecto concreto

7
como es las posibilidades de la representación y manipulación de moléculas biológicas en 3
dimensiones.

2. BASES DE DATOS DE ESTRUCTURAS DE BIOMOLÉCULAS ACCESIBLES EN INTERNET.

En los últimos años junto a los tradicionales bancos de estructura primaria de proteínas y de
secuencia de nucleótidos han aparecido los bancos de estructura tridimensional de
biomoléculas. Tanto en la docencia en bioquímica donde la visualización y manipulación de
una molécula en tres dimensiones permite la mejor comprensión de relaciones estructurales
como en investigación donde las relaciones estructura‐función están siendo la clave para el
mejor entendimiento del diseño molecular, la existencia de extensos bancos de estructura
espacial de biomoléculas (especialmente de proteínas) son un apoyo inestimable para el
bioquímico. La estructura de las proteínas puede almacenarse en archivos de coordenadas
espaciales de sus átomos constituyentes, siendo el más extendido el tipo de archivo protein
data base (nombre.pdb o nombre.ent). Estos archivos pueden obtenerse de diferentes fuentes
siendo los bancos más importantes los correspondientes al Protein Data Bank en EE.UU.
(http://www.rcsb.org/pdb/ ) y a la Swiss 3D Image Collection (http://expasy.hcuge.ch ) en
Suiza.

En estos bancos de estructura se pueden hacer uso de sistemas de búsqueda muy versátiles
que incluyen la posibilidad de incluir campos de nombres completos o parciales, familias de
proteínas, organismos, técnicas experimentales de obtención de estructura, referencias
bibliográficas (autores etc.), e incluso fórmulas o la clasificación de la Comisión de Enzimas.
Mientras que el Protein Data Bank constituye un banco muy completo de archivos pdb (Hay
unas 20.000 estructuras), el banco de la Colección Suiza de biomoléculas se especializa en la
directa visualización de las proteínas en su página Web. con imágenes de tipo GIF y por ello se
limita a unas 5000 imágenes. Además de estas fuentes principales existen otros bancos para
la localización de archivos pdb que representan moléculas sencillas como el agua en sus
diferentes formas, glúcidos, lípidos, aminoácidos, nucleótidos, fármacos etc.
(http://www.nyu.edu/pages/mathmol/library). Una vez descargado a través de Internet los
archivos deseados deberemos de disponer de los programas adecuados para su visualización
y manipulación.


3. PROGRAMAS PARA LA VISUALIZACIÓN DE BIOMOLÉCULAS EN 3D.

Existen una gran diversidad de programas para la representación tridimensional de
biomoléculas, sin embargo pocos de ellos han sido aceptados como standard de uso (aceptan
archivos *.pdb) y desde luego muchos menos han sido desarrollados altruistamente para el
uso y disfrute libre de la comunidad científica. Entre los últimos 10 años se desarrollaron
estos programas para utilizar en un PC dotado del sistema operativo Windows y cabe citar el
programa pionero Rasmol desarrollado por Robert Sayle de la Universidad de Edimburgo (se
puede obtener http://www.umass.edu/microbio/rasmol , o sus programas gemelos Protein
Explorer o Chemscape Chime (http://www.mdli.com), este último desarrollado para ser
incorporado en navegadores Internet (Netscape y Explorer) y el programa SwissPDB Viewer
desarrollado por Nicolas Guex de la empresa Glaxo‐Wellcome
(http://www.expasy.ch/spdbv/mainpage.htm ) para PC y Apple Mackintosh. Centraré mi
interés inicialmente en el primero de éstos, mucho más extendido en uso y con menos
requisitos a la hora de poder utilizarlo (el programa Swiss PDB Viewer requiere

8
Quickdraw3D, obtenible de Apple en su dirección web: http://www.apple.com pero el
tamaño de este programa de unas 8 MB hace más difícil su obtención).

Hoy en día se utilizan versiones integradas derivadas de Rasmol como Jmol, estas están
integradas en el navegador y presentan de forma más intuitiva todas las capacidades de los
programas originales.


4. UTILIZACIÓN DE JMOL PARA EL ESTUDIO DE UNA PROTEINA MODELO.

Primero necesitaremos una proteína que sea un modelo interesante para estudiar las
capacidades de dichos programas nosotros propondremos el estudio de la estructura
tridimensional de Hemoglobina.
Primero entre en la página del banco de datos de estructuras del Protein Databank
(http://www.rcsb.org/pdb/), y haga una búsqueda de las estructuras almacenadas sobre
dicha proteína. Se consciente de la variabilidad de formas almacenadas y sus diferencias.
Una vez elegida una molécula es el momento de comprender las diferentes opciones de
representación estructural (átomos, esqueleto, cartoons etc), de color o incluso las
posibilidades de representación de las superficies.
El siguiente aspecto del programa será analizar las partes fundamentales de la estructura
relacionadas con la función de la proteína para ello utilizaremos otras opciones como Ligands
o Ligands and pocket.
También se aprenderá a la utilización de estos programas para la determinación de
dimensiones moleculares y distancias entre átomos, para ello se os propondrá dimensional
algunas de las proteínas de interés en metabolismo con dimensiones mas extremas.


5. EXTENSION DE LOS PROGRAMAS AL ESTUDIO DE OTRAS BIOMOLECULAS.

Hasta ahora hemos mostrado el empleo de la visualización 3D a proteínas pero es muy
sencillo importar archivos estructurales de otras moléculas de interés biológico. Para ello se
puede partir de bases de datos conocidos como la indicada
http://www.nyu.edu/pages/mathmol/library, o simplemente utilizar una búsqueda de
Internet de carácter generalizado (empleando el tipo de molécula a buscar y el tipo de archivo
pdb como guía en la búsqueda).

Realizaremos la búsqueda de un archivo estructural del ADN y realizaremos un estudio de sus
características dimensionales fundamentales como las dimensiones de los surcos mayor y
menor o las distancias entre bases emparejadas.


6. REALIZACION DE GRAFICOS DE MOLECULAS EN ALTA CALIDAD

Existen programas que aunque sean menos intuitivos permiten posibilidades de análisis y
representación de biomoléculas muy interesantes. Este es el caso del programa
SwissPDBViewer (http://www.expasy.org/spdbv/), que constituye una herramienta de
investigación para el estudio de distancias moleculares y de parámetros estructurales. La
capacidad de este programa reside en la selección de un aminoácido para explorar su entorno
ver Figura 1), y más aún para incluso mutar diversos residuos para posteriormente entender
como dichas mutaciones afectan a la estructura de la proteína. El programa permite así mismo
9
una diversidad de cálculos que incluyen la realización de diagramas de Ramachandran, tal
como se muestra en la misma Figura 1.

Figura 1. Copia de pantalla de la ejecución del

programa SWISS-3D PDBVIEWER. Se muestra la
capacidad de éste para la observación de las
relaciones entre aminoácidos en una región concreta
del complejo protéico de fusión vesicular (SNARE
complex), formado por 4 cadenas pertenecientes a 3
proteínas (sintaxina, SNAP-25 y sinaptobrevina). En el
recuadro se observa el diagrama de Ramachandran de
éstas.

La combinación de este programa con el

representador tridimensional (renderización
3D) denominado Povray
(Http://www.povray.org), permite la
representación de moléculas en el sistema
gráfico de más calidad de cuantos se han
mencionado en este trabajo, la viveza de
luces y texturas obtenida con dichos
programas puede ser observada en la Figura 2,
representando dos moléculas
simultáneamente.
En la práctica realizaremos algunas
representaciones de alta calidad con
moléculas de interés biológico como
fármacos, aminoácidos, proteínas, ácidos
grasos, etc.

Figura 2. Moléculas de glúcido y ácido graso

tratadas por Swiss 3D Viewer y representadas por
Povray, incorporando fuentes de luz y texturas.

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CUESTIONES‐INFORME PRÁCTICA Nº1

NOMBRE Y APELLIDOS............................................................................................
Nº MATRICULA..............................................................................................................
FECHA DE LA PRÁCTICA...........................................................................................
GRUPO...............................................................................................................................

1.¿Las bases de datos manejadas poseen únicamente proteínas o estructuras de
otras sustancias?, indique que otros tipos de moléculas se pueden encontrar.





2.Utilizando la hemoglobina como molécula ejemplo, que número de estructuras
son accesibles para su estudio estructural. Indique el porqué de dicha
variabilidad.




3.Utilizando las funciones de medición indique:

Tamaño aproximado de la hemoglobina. Ancho x largo x profundidad


De una de las cadenas que la forman.


Distancias entre el átomo de Fe del grupo Hemo y los aminoácidos más cercanos de
la cadena de globina y el O mas cercano transportado.

4. Busque dos proteínas de relevancia en el estudio del metabolismo con las
dimensiones mas extremas y determine su tamaño tal como hizo con la
hemoglobina.

Proteína más grande;

Proteína más pequeña;


4.Obtener un archivo pdb representativo de la estructura del ADN y realizar las
mediciones que caracterizan dicha estructura.




5. Localice los archivos de estructura y represente en alta calidad las moléculas que
le indique el profesor, salvando los archivos gráficos obtenidos.

11


12


PRÁCTICA 2: Introducción a las prácticas de laboratorio.
Disoluciones tampones, medición de pH y actividad enzimática


Prof. responsable: Manuel Criado Herrero (manuel.criado@umh.es)

OBJETIVOS GENERALES

En esta práctica se pretende que el alumno tome contacto con el laboratorio de
bioquímica. Se indicarán al alumno unas normas generales de realización y de seguridad. Se le
describirá el material de laboratorio y se hará especial hincapié en la importancia del correcto
uso de las unidades de masa, volumen y concentración, así como del cuidado, correcta
utilización y limpieza del material utilizado. Especial hincapié se hará en el manejo de las
distintas clases de pipetas. Adicionalmente se les enseñará a manejar el colorímetro.
Una vez establecidas las nociones básicas de manejo de materiales se procederá a la
preparación de disoluciones tampón y la medición del pH de las mismas mediante el pH‐
metro. En la segunda parte de la práctica, y con el fin de continuar ejercitando lo aprendido en
cuanto a pipeteo de líquidos y manejo del colorímetro, se realizará la determinación de la
fosfatasa alcalina en una muestra problema a partir de la elaboración de un patrón de
concentraciones conocidas. Una vez terminada la práctica se procederá a evaluar
individualmente la misma mediante la realización de un cuestionario que incluya resultados y
cuestiones sobre la práctica realizada. Finalmente, la limpieza del puesto de trabajo así como
del material utilizado será tenida en cuenta en dicha evaluación.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

El alumno al finalizar la práctica deberá ser capaz de:
1. Conocer las normas de seguridad de un laboratorio.
2. Distinguir entre los distintos materiales utilizados en el laboratorio.
3. Utilizar correctamente las unidades de masa, volumen y concentración.
4. Medir un volumen determinado con el menor error posible.
5. Preparar una disolución tampón y medir su pH
6. Aprender el funcionamiento y la utilización de un colorímetro.
7. Deducir una actividad enzimática a partir de una recta patrón
8. Aprender y llevar a la práctica las normas de limpieza del material de un laboratorio.

INTRODUCCIÓN
PRIMERA PARTE
La medida de líquidos es una de las operaciones mas comunes en el laboratorio de
Bioquímica. El uso de probetas y matraces aforados es frecuente en el laboratorio de química.
Además de estos, las pipetas graduadas y micropipetas automáticas son usadas a menudo en

13
el laboratorio de bioquímica. En esta práctica ejercitaremos su uso para preparar una solución
tampón.

Para manipular líquidos con las pipetas graduadas usaremos un dispositivo
denominado Pipetus y que esencialmente es una pequeña bomba que permite aspirar líquido
seleccionando un determinado volumen y posteriormente depositarlo donde sea necesario.

Pipetus Pipetas graduadas de distintos volúmenes

Para aspirar líquido introducimos la Para depositar el líquido apoyamos la

punta de la pipeta en el mismo y apre‐ punta de la pipeta en la pared del tubo
tamos el botón superior (flecha ne‐ y apretamos el botón inferior (flecha
gra) hasta alcanzar el volumen desea‐ blanca) hasta evacuar todo el líquido
do. Si fuera necesario enrasaríamos o alcanzar un determinado volumen.
con el botón inferior.

14
 Para manipular pequeños volúmenes usaremos las micropipetas automáticas (véase el
esquema abajo)

Rueda para
fijar el volumen

Punta

Eyector de puntas

(A) (B) (C)

Para pipetear con micropipetas automáticas fijaremos primero el volumen deseado

con la rueda y colocaremos una punta. A continuación realizaremos lo indicado en las figuras
de arriba como sigue (ver página siguiente):

15
(A) Con el dedo pulgar presionando el extremo del émbolo y bajado hasta el primer tope
introduciremos la punta de plástico en el líquido a extraer

(B) Levantaremos lentamente el pulgar para que el líquido ascienda por la punta

(C) Apoyaremos la punta en la pared del recipiente donde queramos verter el líquido y
presionaremos el pulgar de nuevo sobre el extremo del émbolo hasta que todo el líquido haya
sido evacuado

Con el fin de practicar el uso de pipetas y micropipetas prepararemos varias soluciones

tampón y mediremos su pH, actividades estas también muy útiles y frecuentes en el
laboratorio de bioquímica.

Las soluciones tampón están formadas, en general, por mezclas binarias de un ácido o
base débiles con la correspondiente sal generada con base o ácido fuertes. Por ejemplo, ácido
acético (ácido débil) + acetato sódico (sal de este ácido con una base fuerte). O también
hidróxido amónico (base débil) + cloruro amónico (sal de esta base con un ácido fuerte). Su
utilidad radica en que mantienen la concentración de H+ prácticamente invariable en las
disoluciones en las que están presentes, lo que resulta de gran importancia tanto en el
laboratorio de bioquímica como en los fluidos presentes en los seres vivos.

Por tanto, en nuestro práctica cada grupo utilizará dos componentes que mezclados en
distintas proporciones darán lugar a distintos pHs que se medirán con el pH‐metro.
Obviamente, el rango de pH obtenido dependerá de la pareja de componentes usada.

En cuanto al pH‐metro consiste básicamente en un electrodo sensible a la

concentración de H+ y un voltímetro capaz de detectar una fuerza electromotriz.

Electrodo
+

Voltímetro
Vidrio semipermeable a H
Electrodo 

Calibrado para 
medición de pH

El vidrio del electrodo actúa de membrana semipermeable a los H+. Cuando se

introduzca en una disolución se producirá un movimiento de H+ según la diferencia de
concentración entre la disolución y el interior del electrodo. Esto producirá una corriente
eléctrica detectada por el voltímetro y traducida en valor de pH, al haberse calibrado
previamente el pH‐metro con una disolución de pH conocido.

16
SEGUNDA PARTE

En esta parte de la práctica continuaremos ejercitando el uso de micropipetas y

determinaremos una actividad enzimática, lo que dará oportunidad de usar otro aparato
esencial del laboratorio de bioquímica como es el espectrofotómetro, en nuestro caso una
versión básica (colorímetro) ya que mediremos en la zona visible del espectro.

Como enzima se ha elegido la fosfatasa alcalina, que está implicada en el transporte de

metabolitos a través de las membranas celulares. Esta enzima hidroliza ésteres fosfóricos a
pH básico liberando fosfato inorgánico. Está presente en casi todos los tejidos, sobre todo en
hígado, riñón, intestino y hueso. La alteración de su concentración en suero puede orientar
sobre el estado de un determinado tejido. Así por ejemplo, un aumento en los niveles de
fosfatasa alcalina puede indicar abuso en el consumo de alcohol, anemia, cáncer (huesos,
próstata, etc.) y otras enfermedades hepáticas, renales, etc. Por el contrario, niveles bajos
pueden indicar cretinismo y déficit de vitamina C. Por otro lado, la concentración de fosfatasa
alcalina es dependiente de la edad, siendo bastante más alta durante la infancia.

La determinación de fosfatasa alcalina se basa en la siguiente reacción:

   Fosfatasa   

p‐nitrofenol (pNP)
p‐nitrofenilfosfato (pNPP)   
Condiciones    
Alcalinas 


Muestra problema
p‐nitrofenolato
(amarillo A410)  

De manera que si elaboramos
una recta patrón con diferentes
concentraciones de pNP sere‐
mos capaces de determinar la  A410
concentración de fosfatasa al‐
calina de una muestra proble‐
ma a partir de la absorbancia
observada como resultado de
la acción de la enzima sobre
el sustrato pNPP
U/L

p‐nitrofenol (pNP)
17
MATERIALES y REACTIVOS
Guión de prácticas
Pipetus
Pipetas graduadas de 5 y 10 ml
Micropipetas automáticas de 0,1 y 1 ml
pH‐metro
Tubos de 50 ml
Un conjunto de dos disoluciones para preparar solución tampón
Frasco lavador
Vaso de precipitados
Tubos de ensayo
Cajas de puntas amarillas (0,1 ml) y azules (1 ml)
Vortex
Colorímetro
Soluciones de manitol, MgCl2, p‐nitrofenol (pNP), p‐nitrofenilfosfato (pNPP), NaOH y
tampón carbonato
Solución problema de fosfatasa alcalina
Gradilla
Baño de agua a 30oC
Ordenador e impresora

PROCEDIMIENTO PRIMERA PARTE: Preparación de disoluciones tampón
De acuerdo con lo indicado en la introducción sobre la naturaleza de los tampones se
suministrará a cada grupo un conjunto de dos componentes (A/B, C/D o E/F) que
debidamente mezclados deberían producir una disolución tampón con un pH determinado.

1. Numerar del 1 al 4 cuatro tubos de 50 ml suministrados




1 2 3
    4






2. Utilizando las pipetas y micropipetas adecuadas (según se indica a continuación) pipetear
en los tubos del paso 1 las siguientes cantidades (en ml) dependiendo del grupo de
componentes de la disolución tampón que se han suministrado.

Tubo A(ml) B(ml) Tubo C(ml) D(ml) Tubo E(ml) F(ml)
1 19.84 0.16 1 16.06 3.94 1 17.6 2.4
2 17.78 2.22 2 11 9 2 12.42 7.58
3 8.26 11.74 3 7.48 12.52 3 9.88 10.12
4 0.74 19.26 4 1.66 18.34 4 8.05 11.95
18
Ejemplo 1: si queremos pipetear 17.78 ml deberíamos pipetear 10 y 7 ml con la pipeta de 10
ml. Luego pipetear 780 l con la micropipeta de 1 ml.

Ejemplo 2: si queremos pipetear 9.88 ml deberíamos pipetear 9 ml con la pipeta de 10 ml.
Luego pipetear 800 l con la micropipeta de 1 ml y 80 l con la micropipeta de 100 l.

En suma, usar las pipetas de 5 y 10 ml para cantidades enteras de ml y las micropipetas para
cantidades menores de 1 ml (micropipeta de 1000 l) y 0,1 ml (micropipeta de 100 l).

3. Cerrar cada tubo con su correspondiente tapón y mezclar suavemente volteando el tubo
unas cuantas veces.

4. Proceder a la medida del pH de cada uno de los tubos, para lo cual:

Se enjuagará el electrodo con un chorro de agua destilada de un frasco lavador

Se secará el electrodo con un papel. No frotar, solo secar el líquido que pueda quedar adherido
al electrodo.

19
Se introducirá el electrodo en cada tubo de 50 ml del paso 2 sumergiéndose aprox. unos 2‐3
cm en la disolución cuyo pH se quiere medir.











2-3 cm




Se esperará hasta obtener un valor estable y se anotará con bolígrafo (NO lápiz) en la tabla
de resultados del final de la práctica indicando qué pareja de componentes se ha usado para
hacer el tampón. Este proceso (enjuagar, secar e introducir el electrodo) se repetirá para cada
uno de los tubos cuyo pH se vaya a medir.

Atención: los electrodos son frágiles. Importante manejarlos con cuidado, evitando un
golpe con las paredes de los tubos o con cualquier otra superficie. Una vez se ha secado
con un papel el electrodo, este debe sumergirse inmediatamente en líquido, ya sea la
disolución a medir o la de almacenaje si ya no se va a usar más. Nunca dejar que se
seque.

PROCEDIMIENTO SEGUNDA PARTE: Determinación de la actividad fosfata‐
sa alcalina en una muestra problema
1. Preparar 7 tubos, marcarlos como se indica y pipetear
B 1 2 3 4 5 M
el volumen de cada disolución en l indicado en la tabla
de abajo. Mezclar en el agitador vortex.
Cuidado: Añadir la muestra de enzima (tubo M) en úl‐
timo lugar, después de añadido todo lo demás, mez‐
clar y rápidamente pasar al paso 2.


Tubo Tampón Manitol MgCl2 pNP pNPP Muestra
Carbonato (producto) (sustrato) (enzima)
B 800 100 100 - - -
1 775 100 100 25 - -
2 750 100 100 50 - -
3 725 100 100 75 - -
4 700 100 100 100 - -
5 650 100 100 150 - -
M 650 100 100 - 100 50
20
2. Incubar los tubos durante 15 min a 30oC en baño de agua.

3. Sacar los tubos del baño y detener la reacción añadiendo a cada tubo 1 ml de 3N NaOH.
Mezclar con vortex.
Cuidado: Manipular la disolución de NaOH con precaución ya que es caústica y puede
dañar la piel y la ropa.

4. Medir la absorbancia a 410 nm de cada uno de los tubos del paso 3 en un colorímetro.
Antes de proceder ajustar el blanco (tecla R) con el tubo B. Anotar cada una de las medidas
con un bolígrafo (No lápiz) en la hoja de resultados del final.

5. Utilizando los ordenadores del laboratorio que ya estarán preparados, representar
gráficamente la concentración de p‐nitrofenol (pNP) en abcisas frente a la absorbancia
medida en ordenadas (tubos 1 a 5). Ajustar a una recta. A partir de la recta deducir la
concentración de fosfatasa alcalina de la muestra problema basándose en la absorbancia
medida en el tubo M.

6. Imprimir la gráfica con sus correspondientes datos para entregarla al final de la práctica al
profesor. Cada alumno deberá imprimir su hoja

PROCEDIMIENTO FINAL.
Síganse los pasos tal y como se detallan, sin omitir nada:

1. Limpiar todo y dejarlo como se encontró al principio. Para ello:
 Verter los líquidos de los tubos en el bidón correspondiente
 Enjuagar los tubos con agua del grifo y después con agua destilada. No usar detergente.
Asegurarse de su limpieza y dejarlos escurriendo boca abajo
 Enjuagar pipetas y cualquier otro material que se haya usado de la misma forma que en
el punto anterior
 Dejar todo ordenado sobre la mesada

2. Enseñar al profesor el puesto de trabajo y pedirle la hoja de cuestiones. Resolverlas

3. Entregar al profesor:
 La hoja de resultados del final de la práctica con los datos anotados en las dos partes de
la práctica
 La hoja impresa a partir de los cálculos hechos en el ordenador
 La hoja de cuestiones resueltas

(El nombre del alumno debe ir escrito en todas las hojas)







21


22
HOJA DE RESULTADOS DE LA PRÁCTICA 2 BIOQUÍMICA I MEDICINA

NOMBRE
GRUPO DE PRÁCTICAS
PUESTO DE TRABAJO
FECHA DE LA PRÁCTICA



PARTE 1

Componentes ((indicar ccon u
un ccírculo)
A/B C/D E/F
Tubo nº pH medido
1
2
3
4


PARTE 2

Tubo Medida de Concentración
A410 (U/l)
1 25
2 50
3 75
4 100
5 150
M ¿?

23


24


PRÁCTICA 3: CINÉTICA ENZIMÁTICA: Colinesterasa del suero.

Prof. Responsable: Javier Saez Valero (j.saez@umh.es)

INTRODUCCIÓN
En los vertebrados existen dos tipos de colinesterasas, enzimas que hidrolizan preferentemente los
ésteres de colina, la acetilcolinesterasa (AChE) y la butirilcolinesterasa (BuChE). Son codificadas
por genes distintos, y se distinguen por la preferencia de sustrato (acetilcolina y butirilcolina), sus
características cinéticas, y el efecto de inhibidores: iso-OMPA (tetraisopropil pirofosforamida),
inhibe preferente BuChE, y BW (dibromuro de 1,5 bis (4-alildimetilamoniofenil) pentan-3-ona)
inhibe AChE.

La AChE es una enzima vital, por su papel en la hidrólisis de la acetilcolina liberada en las sinapsis
colinérgicas, aunque posiblemente desempeña otras funciones, ya que está presente en tejidos no
colinérgicos. La función de la BuChE no ha sido aún totalmente establecida y no se conoce sustrato
biológico específico, aunque también puede cumplir un papel en la hidrólisis de acetilcolina.

Para el ensayo de AChE y BuChE en el

laboratorio, usamos tio-análogos de sus sustratos
específicos (que no biológicos), en una reacción
conocida como método de Ellman (*).

*A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase

activity. Biochem Pharmacol. 1961;7:88-95

En el ensayo, la reacción se produce en

presencia de DTNB (ácido ditiobis-
nitrobenzoico), el cuál reacciona con la tiocolina
que se libera. Apreciamos el curso de la reacción
por el incremento de color, que nos indicará el
incremento de producto con el tiempo.
El aumento de color lo medimos en un
colorímetro a una longitud de onda de 410 nm
(determinaremos el incremento de
absorbancia/unidad de tiempo).

25
OBJETIVOS
En esta práctica el alumno realizará la medición del curso temporal de una reacción enzimática y
determinará los parámetros cinéticos de constante de Michaelis (KM) y velocidad máxima (Vmax).
Como fuente de enzima se utilizará la butirilcolinesterasa (abreviada BuChE), también llamada
colinesterasa plasmática.
El alumno habrá de ser capaz de:
 Medir actividades enzimáticas por técnicas colorimétricas
 Representar gráficamente el curso temporal de la reacción y valorar la linearidad del proceso
 Calcular actividades enzimáticas, expresando el resultado en unidades de actividad
enzimática
 Observar una cinética michaeliana y representar la curva de velocidad frente a concentración
de sustrato
 Determinar las constantes cinéticas por la representación de Lineweaver-Burk

MATERIALES y REACTIVOS
 Colorímetro
 Tubos de ensayo y gradilla; micropipetas y pipetas de 5 y 10 ml, y diversos frascos
 Material biológico: suero (contiene la enzima BuChE)
 Butiriltiocolina (BuTCh) 6 mM en agua
 Tampón fosfato 0.1M pH 7,4
 Ácido 5,5’-ditiobis nitrobenzoico (DTNB), 0.9 mM, en tampón fosfato 0.1M pH 7,4
 El alumno traerá: cronómetro, calculadora y regla para las gráficas.

26
MÉTODO Ensayo de actividad enzimática
El alumno va a observar: 1) La formación de producto con el tiempo.
2) El efecto de la concentración de sustrato.

Preparación de disolución diluida de suero (enzima)

El tubo de ensayo etiquetado "enzima" (distinto a todos los demás de la gradilla), contiene 1 ml de
suero y 9 ml de tampón fosfato pH 7.4.
Tener en cuenta que es una disolución 1:10 para realizar los cálculos del factor “f” (ver más
adelante; ya que al pipetear 1ml, tomamos sólo 0.1 ml suero). Recordar mezclar bien cada vez que
pipeteis.

Procedimiento:
1) Disponer de tubos de ensayo pequeños utilizables en el colorímetro.
Etiquételos del 1 al 6 (más un tubo para el cero o blanco).

2) A continuación, prepare los tubos 1 al 6 de acuerdo con el protocolo del esquema siguiente.

Esquema protocolo ensayo actividad enzimática

B 1 2 3 4 5 6
Sustrato 6mM NO 0,05 0,1 0,2 0,4 0,5 1,0
Agua (ml) 2 0,95 0,9 0,8 0,6 0,5 0,0
DTNB (ml) 1 1 1 1 1 1 1
No añadir el enzima hasta el momento de la medida
Enzima (ml) NO 1 1 1 1 1 1
Volumen total:          3 ml              3 ml             3 ml              3 ml              3 ml             3 ml             3 ml 

Para ello:
 Añadir el volumen de sustrato (butiril-tiocolina o BuTCh) y de agua indicado para completar.

 Añadir 1 ml de disolución de DTNB (agitar y esperar 2 minutos hasta primera medida).

27
3) Antes de la primera medida de actividad, usar el tubo “blanco” que contiene sólo 2 ml de agua y
1 ml de DTNB (volumen total 3 ml), y usarla para hacer el ‘autocero’ del colorímetro.

4) Ahora va a añadir la enzima. Tenga en cuenta que una vez añadida la enzima ya ha
empezado la reacción enzima-sustrato. Tenga a mano: la disolución de enzima, un trocito de
parafilm, una pipeta de 1 ml y un reloj o cronómetro con el que pueda medir segundos. Debe
terminar la reacción en un tubo para añadir la enzima al siguiente.

El procedimiento es el siguiente:
 Añadir 1 ml de enzima,
 mezclar dándole la vuelta tapando el tubo con parafilm,
 poner en marcha el cronómetro,
 inmediatamente después introducir el tubo en el colorímetro,
 cada 20 segundos, durante 2 minutos, anote el valor de absorbancia (a 410 nm).

Entre las medidas de los distintos tubos, si otro compañero está esperando, cede el uso del
colorímetro.

* En general es preferible iniciar la reacción añadiendo el sustrato, pero en esta práctica conviene
dispararla con la enzima. Ello nos lleva a despreciar el valor de hidrólisis espontánea. Un
inconveniente del método es la interferencia que producen los grupos tioles libres presentes en las
proteínas de la muestra, los cuales al reaccionar también con el DTNB pueden alterar la medida
enzimática. Ello se evita, en parte, incubando las muestras con el DTNB, antes de añadir el sustrato,
hasta que los grupos tioles se valoren convenientemente. La adición de inhibidores es necesaria si la
muestra puede contener AChE y BuChE, si sólo una de ellas está presente, como es el caso, se
pueden omitir.

28
CÁLCULOS DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Una Unidad Internacional de actividad enzimática (UI o U) es la cantidad de enzima que transforma
1 μmol de sustrato por minuto (unidad de tiempo) en las condiciones de ensayo (1 U= 1 mol/min)
Partimos de la Ley de Lambert-Beer, ya que la relación absorbancia / concentración sigue dicha
Ley de Lambert-Beer:
Absorbancia = ×C×L
Siendo:
 = coeficiente de extinción molar del cromóforo (litro / mol×cm)
C = concentración molar de producto formado (moles / litro)
L = longitud del paso óptico (para la cubeta de medida usada: 1 cm)

Por tanto podemos despejar la concentración del producto, y el resto de parámetros los conocemos:
C = Abs / (×L)
En nuestra reacción colorimétrica: 1,36×104 (moles / litro) y L = 1 (cm).
Así, para calcular la actividad enzimática usaremos el valor del incremento de absorbancia (Abs)
frente al tiempo (aparición de producto coloreado).
Dicho de otro modo, debemos calcular la aparición de producto (o desaparición de sustrato) por
tiempo. En la ecuación de Lambert-Beer dividimos entre tiempo… C/ t = (Abs/ t) / (×L)
Y ya tendremos estimación de la actividad enzimática.

Para los cálculos del Abs lo primero se representa la absorbancia de cada tubo, en los tiempos
sucesivos, frente al tiempo, y comprobamos si la misma es más o menos lineal.
*para los cálculos debe usarse sólo su tramo lineal
La pendiente de la recta de Abs frente a tiempo nos proporcionaría el dato del incremento de
absorbancia (Abs) frente al tiempo (Abs /seg o min), ya que en y = m×x + n;
y la pendiente o m = y / x, en este caso y=Abs y x= tiempo.

Para facilitar los cálculos sin la necesidad de obtener el valor numérico de la pendiente también
podemos directamente calcular el Abs por min yendo a valores obtenidos experimentalmente que
se ajusten mejor a la recta [por ej. calcular la diferencia de Absorbancia entre los segundos 0 y 60
seg, o 20 y 80 seg, o 40 y 100 seg, etc. (siempre 1 min)].

Así, si sustituimos este dato (Abs / min) en la ecuación: C/ t = (Abs/ t) / (×L),
obtendremos el valor de actividad enzimática: C/min (moles / Litro×min).

Obviamente debemos considerar los volúmenes de muestra (y totales) que usamos. Así, en realidad
para calcular la actividad enzimática por ml, empleamos la expresión:

Actividad en U/ml (µmol / min×ml) = [(Abs/min)×103×Vt] / [1,36×104×1×Vm]

Donde Vt es el volumen total en la cubeta, y Vm el volumen de muestra (enzima).
103 es un factor de conversión [resultante de pasar de moles a μmoles (103), y de litros a ml (103]
Para simplificar los cálculos, conviene calcular un factor “f” tal que:
Actividad en U/ml (µmol×min-1×ml-1) = (Abs/min) ×f

Calculad dicho factor f para nuestros ensayos. Así pues, debe comprobar la linealidad de Abs
gráficamente, calcular el Abs/min y multiplicar este valor por el factor “f” para obtener la
actividad (velocidad de reacción) en mol/min /ml suero
29
30
RESULTADOS
*Entregar al Profesor esta hoja de manera individual junto a las de cálculo después de la práctica y
antes de abandonar el laboratorio

CUESTIONES PRÁCTICA

NOMBRE Y APELLIDOS:
Nº MATRICULA: DNI:
GRUPO (al que pertenece): nº puesto: FECHA DE LA PRÁCTICA:

1.1. ¿Por qué es mejor usar butiriltiocolina que acetiltiocolina para medir la actividad de
butirilcolinesterasa?

1.2. ¿Y por qué usar butiriltiocolina y no butirilcolina en este ensayo (método de Ellman)?

1.3. ¿Por qué prescindimos de inhibidores de colinesterasas para el ensayo de la butirilcolinesterasa

en el suero de pollo?

2.1. En la práctica, y para realizar el ajuste manual en la gráfica de velocidad frente a [sustrato],
asumimos que se cumple la ecuación de Michaelis – Menten, ¿a qué tipo de curva ajustamos dicha
representación? ¿qué representa la KM en dicha gráfica?

2.2. ¿De qué grafica es más exacto realizar los cálculos de KM y Vmáx?
(según gráfica representada más adelante)

3.- En las hojas siguientes deberá incluir los siguientes cálculos:

- Las tablas de Abs y las gráficas de absorbancia frente a tiempo
- Tabla con valores de Abs/min, v, 1/v, [S], 1/ [S] para cada tubo
- Gráfica de v frente a S y gráfica de 1/v frente a 1/S (realizadas con el ordenador)
- Valor obtenido de KM y Vmáx (con unidades)

A continuación se recogen los DATOS y CÁLCULOS

(entregar sólo una copia por pareja de prácticas)

31
REGISTRO DE LOS DATOS EXPERIMENTALES
Comprobar la linealidad del incremento de Absorbancia y calcular el ∆Abs/min para al menos 2
intervalos de 1 min, usar el valor promedio como ∆Abs/min de cada tubo

TUBO 1
T (sg) Abs410
0
20
40
60
80
100
120

TUBO 2
T (sg) Abs410
0
20
40
60
80
100
120

TUBO 3
T (sg) Abs410
0
20
40
60
80
100
120

32
(continuación)
TUBO 4
T (sg) Abs410
0
20
40
60
80
100
120

TUBO 5
T (sg) Abs410
0
20
40
60
80
100
120

TUBO 6
T (sg) Abs410
0
20
40
60
80
100
120

33
Calculad la actividad enzimática en U/ml suero (mol/min×mL de suero)
Con el cálculo del factor “f” es inmediato el cálculo de la actividad (v0, velocidad de reacción)

Actividad en U/ml (µmol×min-1×ml-1) = (Abs/min) ×f

INDIQUE SU VALOR f=

Realizar ahora el cálculo para cada tubo ([S0]):

TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 TUBO 5 TUBO 6

Abs/min
V(µmol×min-1×ml-1)
S (µM)
*Para conocer la concentración de sustrato final en cada uno de los tubos, debe aplicar la fórmula de
que los equivalentes iniciales y finales de sustrato.
Vi × Si = Vf × Sf

Por ejemplo, para el tubo 1: 0.05ml × 6mM = 3ml × S1 → (S1 = 0.1 mM)

B 1 2 3 4 5 6
Sustrato 6mM NO 0,05 0,1 0,2 0,4 0,5 1,0
Agua (ml) 2 0,95 0,9 0,8 0,6 0,5 0,0
DTNB (ml) 1 1 1 1 1 1 1
Enzima (ml) NO 1 1 1 1 1 1
Volumen total: 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml

De la misma forma anterior, halle las concentraciones S2 hasta S6, y expresarlas en valores µM.

Contamos pues con 6 pares de valores, v0, [S0],

(uno por cada tubo) para la representación de Michaelis–Menten:

v0 frente a [S0]

Representación de la Ecuación de Michaelis-Menten

La representación se realizará en los ordenadores del laboratorio, bajo las indicaciones del profesor
responsable. Una vez representados los puntos se realizará un “ajuste manual” a una hipérbola
rectangular. Téngase en cuenta la dificultad del ajuste al representar tan sólo 6 puntos; por ello el
cálculo de la Vmax ni la KM se realizará en la gráfica de dobles inversos.

34
En la práctica no suelen calcularse la Vmax ni la KM a partir de la curva de saturación, es poco
preciso, por lo que usamos la representación de Lineweaber-Burk o de dobles inversos, por lo que
primero calculamos 1/v y 1/[S] de la tabla anterior

TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 TUBO 5 TUBO 6

1/V
1/S

Con estos 6 pares de valores, 1/v0, 1/[S0], (uno por cada tubo)
realizamos la representación de dobles inversos calculando
los valores de Vmax y KM por los puntos de intersección con los ejes

De nuevo recurrimos al uso del ordenador para la representación de la gráfica y en este caso
también para el ajuste de la recta y los puntos de corte con los ejes de donde obtendremos los
valores de la Vmax y la KM (puntos de corte. Indicar dichos valores con sus unidades
correspondientes.

35