Guia de Practicas

FACULTAD DE MEDICINA Y CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESIONAL DE TECNOLOGÍA MÉDICA
GUÍA DE PRÁCTICAS DEL CURSO DE

BIOQUÍMICA CLÍNICA II
Sedes Hospitalarias:
Hospital Edgardo Rebagliati Martins
Hospital de Apoyo María Auxiliadora
Docente responsable: Mg. Ítalo Moisés Saldaña O.

Índice
Introducción
Semana Práctica
1
Presentación del profesor de la sede práctica respectiva, normas de
bioseguridad en el laboratorio clínico. Cálculo de la actividad enzimática
2
Determinación de las enzimas: Deshidrogenasa Láctica y Transaminasas
(AST/ALT).
3
Determinación de las enzimas: Fosfatasa Alcalina y Gamma
glutamitransferasa.
4
PRIMERA EVALUACIÓN PRÁCTICA
Determinación de las enzimas: Amilasa y Lipasa.
5
Determinación de enzimas y proteínas para evaluar lesión cardiaca.
6 Estudio físico, químico y celular de los líquidos serosos.
7 Estudio físico, químico y celular del líquido cefalorraquídeo.
8
Estudio físico, químico y celular del líquido articular.
9
EVALUACIÓN PARCIAL TEÓRICA
10
Estudio físico del líquido seminal: determinación del volumen de eyaculado,
licuefacción, consistencia, apariencia y pH.
11
Estudio celular del líquido seminal, motilidad, vitalidad, recuento y morfología
espermática.
12
Determinación de los principales marcadores tumorales en el laboratorio clínico
13
SEGUNDA EVALUACIÓN PRÁCTICA

Determinación de sodio/potasio/cloro. Método Ión Selectivo
14
Procesamiento de muestras arteriales y su interpretación.
15
Herramientas estadísticas básicas para el control de calidad.
16
Elaboración de gráficos de control e interpretación
17
EVALUACIÓN FINAL TEÓRICA
Introducción:
La Bioquímica Clínica es una disciplina que aplica los principios básicos de la
Bioquímica al estudio de la enfermedad humana y emplea los métodos químicos y
bioquímicos de laboratorio para el diagnóstico, el control del tratamiento, la
prevención y la investigación de las enfermedades.
La función del laboratorio de Bioquímica Clínica es realizar análisis, tanto

cualitativos como cuantitativos, en sangre y líquidos biológicos. Para que los
resultados de dichos análisis sean útiles en el diagnóstico, tratamiento y
seguimiento de una enfermedad, éstos deberán realizarse bajo un estricto control
de calidad logrando niveles óptimos de precisión y exactitud, características
deseables en cualquier resultado de diagnóstico.
Los objetivos de las prácticas del curso Bioquímica Clínica II son:
1. Que el alumno sea capaz de realizar el análisis de productos biológicos

incluyendo una adecuada manipulación de los especímenes, desde la toma
y/o recepción de muestras hasta la entrega de resultados.
2. Que el alumno adquiera una formación y preparación en Bioquímica que

le permita afrontar los retos que encontrará en su vida profesional, ante el
creciente número de técnicas que continuamente se están desarrollando
para la detección y cuantificación de metabolitos de interés en la medicina
moderna.
3. Que el alumno realice los procedimientos correctos tanto en forma

manual como automatizada.
4. Que el alumno adquiera los elementos formativos que le permitan

desarrollar una actitud y pensamientos críticos, y de independencia en el
trabajo.
Este proceso de enseñanza incluye: planeación, selección, elaboración y

ejecución analítica, evaluación y resolución de problemas con la metodología
empleada, aplicación e interpretación de los datos obtenidos con las alteraciones
que se presentan en el organismo en los diferentes cuadros patológicos.
El curso de la asignatura práctica de Bioquímica Clínica están diseñadas con el

propósito que los alumnos dispongan de un conjunto de habilidades que les
permitan la aplicación flexible de las técnicas manuales y además utilicen equipos
semiautomatizados como automatizados, que con más frecuencia se emplean en
las actividades propias del ámbito profesional.
Normas generales de seguridad e higiene
1. El uso de mandil es obligatorio.
2. Antes de empezar el trabajo en el laboratorio tienes que familiarizarte con los

elementos de seguridad disponibles.
3. Es necesario localizar las salidas principales y de emergencia por si se diese el

caso de una evacuación por fuego o por cualquier otro incidente, así como
conocer la localización exacta de extintores.
4. Es obligatorio usar gafas de seguridad siempre que se esté en el laboratorio.
5. No usar lentes de contacto en el laboratorio, ya que en caso de accidente las

salpicaduras de productos químicos o sus vapores pueden pasar detrás de las
lentes y provocar lesiones en los ojos antes de poder retirar las lentes. En estos
casos es recomendable el uso de gafas graduadas o de gafas de seguridad
cerradas.
6. Si un producto químico te salpica los ojos, utiliza inmediatamente una ducha de

ojos y lava completamente el ojo afectado durante 15 minutos sin interrupción.
Actúa siempre con urgencia, en menos de 10 segundos. No dirijas una corriente
de alta presión de agua de un grifo directamente al ojo porque podrías lesionarlo.
Informa al encargado del laboratorio de lo que ha sucedido y si es necesario pide
asistencia médica.
7. El uso de bata (preferentemente de algodón) es obligatorio, ya que por mucho

cuidado que se tenga al trabajar, las salpicaduras de productos químicos son
inevitables.
8. Así mismo se recomienda llevar zapatos cerrados y no sandalias.
9. No comer ni beber en el laboratorio, ya que hay la posibilidad de que los

alimentos o bebidas se hayan contaminado con productos químicos.
10. Los recipientes del laboratorio nunca deben utilizarse para el consumo y
conservación de alimentos y bebidas; tampoco las neveras u otras instalaciones
destinadas al empleo en los laboratorios
11. Lavarse siempre las manos después de hacer cualquier análisis y antes de
salir del laboratorio.
12. Procure quitarse el mandil hasta que salga del laboratorio.
13. Está prohibido fumar en el laboratorio por razones higiénicas y de seguridad.

14. No inhales, pruebes o huelas productos químicos si no estás debidamente
informado.
15. Cerrar herméticamente los frascos de productos químicos después de

utilizarlos.
16. Para pipetear los líquidos utilice siempre una bombilla pipeteadora, no
absorber directamente con la boca.
17. Cuando caliente tubos de ensaye hágalo siempre en la parte superior del
líquido y con agitación suave, nunca por el fondo del tubo, y debe estar inclinado y
no apuntar hacia ninguna persona.
18. No deben transportarse innecesariamente los reactivos de un sitio para otro

del laboratorio. Si tuviese que hacerlo, tenga cuidado con las botellas, las cuales
deben ser siempre transportadas cogiéndolas por el fondo, nunca por la boca de la
botella.
19. El área de trabajo tiene que mantenerse siempre limpia y ordenada, sin libros,
abrigos, bolsas, productos químicos vertidos.
20. La conducta en el laboratorio debe ser seria, sin bromas, sin correr, jugar,
empujar, gritar, etc.
21. No se puede hacer ningún experimento no autorizado.

Primeros auxilios en caso de accidente
1. Fuego en el laboratorio
Si el fuego es pequeño y localizado, retira los productos y material inflamable que

haya a su alrededor. Apágalo utilizando el extintor adecuado. No utilices nunca
agua para apagar un fuego provocado por la inflamación de un disolvente.
Si no puedes controlar el fuego, avisa a la persona responsable, acciona la alarma

de fuego y evacua el laboratorio con calma.
Si te quemas la ropa, pide ayuda, échate a tierra y rueda sobre ti mismo para
apagar las llamas. No corras ni intentes llegar a una ducha de seguridad si no es
que está muy cerca. No utilices nunca un extintor sobre una persona.
2. Quemaduras
Lava la zona afectada con agua fría durante 10-15 minutos. Si es extensa, utiliza
las duchas de seguridad y pide asistencia médica inmediata.
No utilices pomadas o cremas grasosas en quemaduras graves.
3. Cortes
Es necesario lavarlos bien con agua y después aplicar un apósito adecuado. Si

son grandes y no paran de sangrar pide asistencia médica inmediata.
4. Derramamiento de productos químicos sobre la piel
Todo producto químico derramado sobre la piel tiene que ser lavado
inmediatamente con agua corriente durante 10-15 minutos. Si la ropa se ha
contaminado, retírala rápidamente.
5. Corrosión en los ojos
Lava los dos ojos con abundante agua corriente durante 15 minutos como mínimo.
Es necesario mantener el ojo abierto y separar los párpados para facilitar el
lavado.
Pide asistencia médica inmediata, por pequeña que parezca la lesión .

6. En caso de ingestión de productos
No provoques el vómito si el producto ingerido es corrosivo.
Diluye el corrosivo donante bebiendo abundante cantidad de agua.
Pide asistencia médica inmediata.
7. En caso de inhalación de productos
Lleva inmediatamente a la persona afectada a un sitio con aire fresco.
Pide asistencia médica inmediata.
Recuerda:
Familiarízate con los elementos de seguridad del laboratorio.
Respeta escrupulosamente las normas de seguridad e higiene del laboratorio.
Sigue las instrucciones del profesor antes de realizar un experimento. En caso de

duda, pregunta.
Mantén la calma en caso de accidente o emergencia.

Unidad I: Enzimología clínica
PRÁCTICA N° 1
Cálculo de la Actividad enzimática
Materiales Equipos
Papel milimetrado Espectrofotómetro
Regla
Lápiz
Cronómetro
Tubos de ensayo
Objetivos:
Determinar la actividad enzimática de la enzima alanino amino transferasa (/ALAT)
Introducción
En la mayoría de los procedimientos enzimáticos las velocidades de reacción no

son constantes con el tiempo. Mediante la observación de la variación de
absorbancia para un producto o sustrato a una longitud de onda específica, se
puede monitorear la reacción. Inicialmente, hay un período con muy poca
variación de absorbancia por unidad de tiempo cuando los reactivos son
mezclados y alcanzan el equilibrio cinético y térmico (fase de retraso), luego una
fase lineal donde el cambio de absorbancia por unidad de tiempo es constante, y
finalmente una fase de agotamiento del sustrato con pequeños cambios de
absorbancia por unidad de tiempo.
Los ensayos enzimáticos deben ser realizados durante la fase lineal de cambios
de absorbancia, donde se puede determinar una cantidad constante de actividad
por período de tiempo). Por consiguiente, las mediciones no comienzan al tiempo
cero sino después que la fase de retraso ha ocurrido. Las mediciones pueden
llevarse a cabo a cualquier tiempo durante la fase lineal y pueden continuar hasta
la fase de agotamiento del sustrato.
Si la actividad enzimática es demasiado elevada, el consumo de sustrato
ocurrirá antes que las mediciones hayan sido completadas. En lugar de variar el
tiempo de lectura, la forma más común de manejar estas muestras con elevada
actividad es diluir a la mitad a una tercera parte con solución fisiológica o agua.
Uno de los métodos más convenientes para medir la actividad enzimática está
basado en la medida de la absorbancia ya sea de los productos o de los sustratos.
Existen algunos sistemas enzimáticos que involucran la conversión de NAD+ a su
forma reducida NADH+, o viceversa. La forma reducida tiene mayor absorbancia
a 340 nm que la oxidada, por lo que las reacciones que interconvierten una y otra
forma pueden ser monitoreadas por la medición de la variación de absorbancia a
esta longitud de onda. La diferencia entre los espectros de absorbancia de los
compuestos oxidados y reducidos es mostrada en la Fig.
Las enzimas generalmente son medidas teniendo en cuenta sus propiedades
catalíticas o inmunoquímicas. Los dos métodos más comúnmente empleados
basados en las propiedades catalíticas, son el método de un punto a tiempo fijo,
algunas veces llamado de punto final, y los ensayos a tiempo fijo de múltiples
puntos, llamado método cinético.
Los ensayos de punto final son usados todavía en algunos casos, pero en general
se emplean períodos más cortos. En estos ensayos, una reacción es iniciada e
incubada a una temperatura constante a un tiempo fijo, por ejemplo 30 minutos.
La reacción entonces es detenida, normalmente por la adición de otro reactivo, y
se mide la cantidad de producto. En este tipo de ensayos, se asume que se
genera una cantidad constante de producto a lo largo del período del ensayo
completo.
Si la velocidad de reacción es seguida de manera continua o utilizando varios

puntos, en función del tiempo, el ensayo se denomina ensayo cinético.
Usualmente el tiempo de reacción es corto, es decir de unos pocos segundos a
unos pocos minutos, y existe poco peligro de degradación enzimática. El término
ensayo cinético es también usado para describir reacciones que forman
cantidades crecientes de producto con el tiempo; las reacciones pueden ser
monitoreadas como ensayos de punto final de un punto o ensayos de múltiples
puntos (monitoreo continuo). Aunque la terminología de este método cinético no
es estrictamente correcta, los ensayos de múltiples puntos o continuos son
superiores a los de un solo punto, ya que es más fácil demostrar una linealidad
aproximada de la reacción sobre el período entero de medición.
En 1961 la Comisión de Enzimas recomendó la adopción de una unidad

internacional (UI) de actividad enzimática. La UI fue definida como la cantidad de
enzima que podía convertir 1 micromol de sustrato por minuto bajo condiciones
estándares.
1 UI = 1 micromol/minuto
Para obtener el valor definitivo de actividad enzimática aplicamos la siguiente
fórmula:
Donde:
·ε es el coeficiente de extinción molar de aquel compuesto cuya absorbancia

estamos siguiendo en el espectrofotómetro.
· l es el espesor de la cubeta
· Vf es el volumen total de reacción
· Vi es el volumen de muestra en el ensayo
Procedimiento
Algunas reacciones enzimáticas de interés, como las de la alanina

aminotransferasa (ALAT) y aspartato aminotransferasa (ASAT) no tienen sustratos
ni forman productos que puedan ser monitoreados directamente. Uno debe
acoplar la reacción enzimática inicial a una segunda reacción enzimática
indicadora que, por ejemplo, incluya la conversión NAD+/NADH para hacer un
ensayo conveniente. La reacción enzimática de la ASAT puede ser acoplada con
la reacción de la malato deshidrogenasa (MD; EC 1.1.1.37).
ASAT
L-Aspartato + α-Cetoglutarato L-Glutamato + Oxaloacetato
MD
Oxaloacetato + NADH + H+ L-Malato + NAD+
Para calcular la actividad de dicha enzima se procederá a lo siguiente
1. Precalantar el reactivo de trabajo y el instrumento a la temperatura de reacción
2. Pipetear en una cubeta
Muestra 100 uL
Reactivo de trabajo 3mL
3. Mezclar e insertar la cubeta en el fotómetro. Poner el cronometro en marcha
4. A los tres minutos anotar la absorbancia inicial y efectuar nuevas lecturas cada
minuto durante tres minutos
Tiempo Absorbancias
5. Graficar en un papel milimetrado absorbancias vs tiempo

6. Calcular la variación de absorbancia por minuto (ΔA/min)
Calculos:
Resultado:
7. Con los datos anteriores y la fórmula propuesta calcular la actividad de la

enzima ASAT, asumiendo que a 340 nm, el NADH tiene un coeficiente de
absorción molar de:
ε= 6.22 x L · mmol-1· cm-1
Cálculos:
Resultado:
Ejercicio:
Si para medir la actividad enzimática de la ASAT en una muestra de suero, se
realizo una dilución previa de 1/10, obteniéndose las siguientes lecturas de
absorbancia
Tiempo Absorbancias
3 minutos 0.300
4 min 0.294
5 minutos 0.286
6 minutos 0.282
Realizar todos los procedimientos anteriores y calcule la actividad de la

enzima en mención
Variación de absorbancia por minuto (ΔA/min)
Cálculos:
Resultado:
Calculo la actividad de la enzima ASAT
Cálculos:
Resultado:
Conclusiones:
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Unidad II: Enzimas de función: Hepática, pancreática y
Cardiaca
PRÁCTICA N°2
Práctica Enzimas de función hepática
Determinación de las enzimas: Transaminasas (AST/ALT) y

Deshidrogenasa Láctica.
Determinación de la ASPARTATO AMINOTRANSFERASA GOT

(AST)
1. INTRODUCIÓN
Aspartato aminotransferasa y alanino aminotransferasa
Las transaminasas ASAT y ALAT catalizan la conversión de aspartato y alanina a

oxaloacetato y piruvato respectivamente. En el hígado se encuentran los niveles
más altos de ALAT, mientras que la ASAT se encuentra presente en el corazón,
músculo esquelético e hígado en cantidades similares. La actividad en el suero de
tanto la ASAT como la ALAT aumenta rápidamente durante el comienzo de la
ictericia viral y permanece elevada por 1 a 2 semanas. En las hepatitis tóxicas
también se elevan la ALAT y la ASAT, pero la LDH se eleva mucho más como
resultado de la necrosis celular hepática. En los pacientes con hepatitis crónica
activa también se observan aumentos en la ASAT y ALAT.
La necrosis hepática aguda se acompaña por incrementos significativos en las

actividades tanto la ALAT y la ASAT. El aumento en la actividad de la ALAT es
generalmente mayor que el incremento en la actividad de la ASAT. En la cirrosis
del hígado las actividades de las transaminasas séricas generalmente no se
elevan por encima de 300 U/L, sin importar la causa de la enfermedad cirrótica.
Las elevaciones en las ALAT y ASAT séricas observadas en el síndrome de Reye,

son atribuibles directamente al daño hepático, y el incremento en la ALAT es
generalmente mayor que el incremento en la ASAT. También se incrementa la
actividad de las transaminasas en la actividad neoplásica.
En el diagnóstico de la enfermedad del hígado, la medición de los niveles séricos

de ASAT y ALAT es valiosa. Sin embargo, la mejor manera de usar estos análisis
es junto con otros análisis de enzimas como la LDH y la creatina cinasa, y con
otras mediciones de la función renal y hepática como la urea sanguínea, la
creatinina, el amoníaco y la bilirrubina. Esto es importante cuando se establece el
diagnóstico puesto que la ALAT y la ASAT están presentes en otros tejidos
además del hígado y la actividad sérica de estas enzimas puede reflejar una
enfermedad orgánica en tejidos distintos al hígado. Las actividades séricas de la
ALAT y la ASAT se elevan en el infarto del miocardio, infarto renal, distrofia
muscular progresiva y otro gran número de enfermedades que solamente afectan
al hígado de una manera secundaria, como la enfermedad de Gaucher, la
enfermedad de Niemann-Pick, la mononucleosis infecciosa, la leucemia
mielocítica, la cetoacidosis diabética y el hipertiroidismo.
2. Objetivos
 Aplicar el manejo adecuado de la técnica para la determinación de la

aspartato aminotransferasa en una muestra biológica.
 Establecer los valores de referencia de la enzima AST y comparar con el

valor de nuestra muestra problema a analizar.
 Definir cuales son las principales patologías que se presentan si tenemos

valores altos o bajos de AST en una muestra biológica.
3. Fundamento del método
Se mide la actividad de la aspartato aminotransferasa mediante un método

cinético enzimático. En la reacción, la aspartato aminotransferasa cataliza la
transaminación reversible de L-aspartato y α-cetoglutarato a oxaloacetato y
Lglutamato.
Luego, el oxaloacetato se reduce a malato en presencia de malato

deshidrogenasa (MDH), con la oxidación concurrente de α dinucleótido de
nicotinamida adenina reducida (NADH) a dinucleótido de nicotinamida adenina
(NAD).
Esquema de la reacción química

4. Preparación
4.1 Muestra clínica

Suero o plasma heparinizado.
4.2 Material y reactivos
Material necesario
5 tubos de ensaye de 13 X100mm.
1 Micropipetas de 1.0 mL.
1 Micropipeta de 200uL.
Puntas para micropipeta.
Gradilla
Equipo
Fotómetro termostable a 37ºC con filtro de 340 nm.
Centrífuga
Cronómetro
Composición del reactivo
Reactivo 1 Tampón TRIS pH 7.8, 80 mmol/L

Tampón L-Aspartato 200 mmol/L
Reactivo 2 NADH 0.18 mmol/L

Comprimido LDH 800 U/L
MDH 600 U/L
α-cetoglutarato 12 mmol/L
Preparación y estabilidad
El monoreactivo es estable 72 horas a 18-25ºC ó 21 días a 2-8ºC.
5. Procedimiento
5.1 Técnica
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25/30/37ºC
Longitud de onda: ………………… 340 nm Hg334 nm Hg 365 nm
Cubeta: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……1 cm paso de luz.
Lectura frente al agua destilada.
Macrotest Semimicrotest
Reactivo al uso 2.0 mL 1.0 mL
Muestra 200 μL 100 μL
Mezclar, esperar 1 minuto. Anotar la lectura y poner en marcha el cronómetro.
Repetir la lectura a 1, 2 y 3 minutos.
Calcular el valor medio de los incrementos de extinción por minuto (Δ E/min)
6. Resultados
6.1 Cálculos
340 nm ΔE/min x 1750= U/L
6.2 Linealidad
Si la ΔE/min a 340 nm ó 334 nm es superior a 0.150 ó bien a 365 nm es superior a
0.080, la muestra deberá diluirse a1:10 con solución salina 0.9%. Deberá tenerse
en cuenta esta dilución al hacer el cálculo.
Límite de Seguridad Biológica

25ºC / 30ºC / 37ºC
Hombres hasta 19 U/L 26 U/L 38 U/L
Mujeres hasta 16 U/L 22 U/L 31 U/L
Observaciones
La hemólisis interfiere en la determinación.
Determinación de la ALANINA AMINOTRANSFERASA (GPT) ALT
1. Introducción
Los valores de alanina aminotransferasa se utilizan en el diagnóstico y tratamiento

de ciertas enfermedades hepáticas (p. ej., hepatitis viral y cirrosis) y cardíacas.
2. Objetivos

alanina aminotransferasa en una muestra biológica
 Establecer los valores de referencia de la enzima ALT y comparar con el


valores altos o bajos de ALT en una muestra biológica
Se mide la alanina aminotransferasa con un método cinético. En la reacción, la

alanina aminotransferasa cataliza la transaminación reversible de un grupo amino
de la L-alanina al α-cetoglutarato con formación de piruvato y L-glutamato. Luego
el piruvato se reduce a lactato en presencia de lactato deshidrogenasa (LDH) con
la oxidación concurrente de alfa-dinucleótido de nicotinamida adenina reducido
(NADH) a dinucleótido de nicotinamida adenina (NAD).
La oxidación de NADH a NAD es directamente proporcional a la actividad de GPT .
4. Preparación
4.1 muestra clínica

Suero o plasma heparinizado.
4.2 Material y reactivo
Material necesario

Gradilla
Equipo
Fotómetro termostatable a 37ºC con filtro de 340 nm.
Cronómetro
Centrífuga
Reactivo 1 Tampón TRIS pH 7.8, 100 mmol/L

Tampón L-Alanina 500 mmol/L
Reactivo 2 NADH 0.18 mmol/L

Comprimidos LDH 1200 U/L
α-cetoglutarato 15 mmol/L
5. Procedimiento
5.1Técnica
Temperatura:.......................... 25/30/37ºC
Longitud de onda:.....................340 nm Hg334 nm. Hg 365nm
Cubeta:....................................1 cm. paso de luz.
Lectura frente al agua destilada.
Macrotest Semimicrotest
Mezclar, esperar 1 minuto. Anotar la lectura y poner en el cronómetro. Repetir la
lectura a 1, 2 y 3 minutos.
Calcular el valor medio de los incrementos de extinción por minuto (Δ E/min)
6. RESULTADOS
6.1 Cálculos
6.2 Linealidad
Si la ΔE/min a 340 nm ó 334 nm es superior a 0.150 ó bien a 365 nm es superior

a0.080, la muestra deberá diluirse en proporción de 1:10 con una solución
salina0.9%. Deberá tenerse en cuenta esta dilución al hacer el cálculo.
6.3 Límite de Seguridad Biológica
25ºC 30ºC 37ºC

Hombres hasta 22 U/L 29 U/L 40 U/L
Mujeres hasta 18 U/L 22 U/L 32 U/L
7. Observaciones
La hemólisis interfiere en el test.
8. Conclusiones
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Determinación de LACTATO DESHIDROGENASA (LDH)
1. Introducción
Cuando solamente está implicado un órgano específico, como el hígado, la

medición del la LDH total puede ser útil. La LDH se incrementa con las hepatitis
virales o tóxicas, en la obstrucción biliar extrahepática, en la necrosis aguda del
hígado y en la cirrosis del hígado. Sin embrago, en condiciones en las que puedan
estar implicadas varios órganos, la medición del LDH total es menos útil que la
medición de las isoenzimas de la LDH. Las isoenzimas LDH5 y LDH4 son las
responsables de la actividad primaria del hígado, mientras que las isoenzimas
LDH1 y LDH2 son las responsables por la actividad predominante de la LDH en el
corazón y el riñón. Puesto que los glóbulos rojos también contienen mucha LDH1,
se debe evitar el análisis de muestras de suero bemolizadas. En las condiciones
hepáticas, la electroforesis de la LDH muestra que la elevación en la LDH total se
debe a la liberación de LDH4 y LDH5 al suero.
La mayor actividad de la LDH se presenta en el riñón y el corazón, y la menor en

el pulmón y el suero. La LDH se localiza en el citoplasma celular y es por tanto
liberada al suero cuando las células se dañan o necrosan.
Los valores de lactato deshidrogenasa se utilizan en el diagnóstico y tratamiento

de enfermedades hepáticas tales como la hepatitis viral aguda, la cirrosis y el
carcinoma hepático metastásico, también en enfermedades cardíacas como el
infarto del miocardio, y tumores de pulmón o de riñón.
2. Objetivos
 Aplicar el manejo adecuado de la técnica para la determinación de la lactato

deshidrogenasa en una muestra biológica.
 Establecer los valores de referencia de la enzima LDH y comparar con el


valores altos o bajos de LDH en una muestra biológica.
El reactivo LDH se utiliza para medir la actividad de la lactato deshidrogenasa con

un método cinético enzimático. En la reacción, la LDH cataliza la oxidación
reversible de L-lactato a piruvato con la reducción concurrente de dinucleótido de
nicotinamida adenina (NAD) a dinucleótido de nicotinamida adenina reducido
(NADH).
La deshidrogenasa láctica está presente en muchos tejidos. La LDH cataliza la

interconversión de piruvato y lactato:
Esquema de la reaccion quimica
La oxidación de NADH a NAD+ acompañada por una disminución de absorbancia

a 340 nm es directamente proporcional a la actividad de LDH.
4. Preparación

Suero.
Material necesario

Gradilla
Equipo
Pipetas de 2 mL y 200 μL
Fotómetro termostatable a 37ºC con filtro de 340 nm.
Cronómetro
Reactivo 1 Tris pH.7.5, 50 mmol/L

Tampón Piruvato 0.6 mmol/L
Reactivo 2
Comprimidos NADH 0.18 mmol/L
El reactivo de trabajo es estable 5 días a 2-8ºC ó 24 horas a temperatura
ambiente.
La muestra puede ser conservada 48 horas a 2-8º C.
5. Procedimiento
5.1 Técnica
Longitud de onda: . . . 340 nm o 334 ó 365 nm
Temperatura: . . . . . . . 25/30/37ºC
Cubeta: . . . . . . . . . . . .1 cm paso de luz.
Lectura: . . . . . . . . . . . . frente aire o agua destilada
25 ºC /30ºC /37ºC
Mezclar y esperar 1 minuto.
Verter la mezcla en la cubeta, leer la extinción y poner en marcha el cronómetro
Repetir la lectura a 1,2 y 3 minutos después.
Calcular (ΔE/min)
6. RESULTADOS
6.1 Cálculo
A 25 y 30ºC
340 nm (ΔE/min) x 4925 = U/L
334 nm (ΔE/min) x 5020 = U/L
365 nm (ΔE/min) x 9120 = U/L
A 37ºC
340 nm (ΔE/min) x 9690 = U/L
334 nm (ΔE/min) x 9880 = U/L
365 nm (ΔE/min) x 17950 = U/L
6.2 Linealidad
Si el ΔE/min a 340 nm es superior a 0.150 ó bien si a 365 nm es superior a 0.080,
repetir la prueba diluyendo la muestra a 1:10 con solución salina 0.9%.

25ºC 30ºC 37ºC
120-240 U/L 160-320 U/L 230-460 U/L
7. Conclusiones:
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PRÁCTICA N°3
Práctica Enzimas de función hepática
Determinación de las enzimas: Fosfatasa Alcalina y Gamma

glutamitransferasa.
Determinación de FOSFATASA ALCALINA
1. introducción
La fosfatasa alcalina se encuentra ampliamente distribuida en los del cuerpo

humano. Su fuente de importancia clínica incluye hígado, hueso, placenta,
intestino, bazo y riñon. Aunque se desconoce su función biológica precisa,
aparentemente participa en el transporte de membrana, ya que está unida a la
membrana celular. En el hígado, la actividad de la ALP se localiza en la membrana
celular que une el borde sinoidal de las células del párenquima a los canáliculos
biliares. En los huesos la actividad de la ALP se localiza en la menbrana celular
que une el borde sinoidal de las células del parénquima a los canalículos. En los
huesos, su actividad se confina a los osteoblastos. El aumento de actividad de
fosfatasa alcalina en suero se observa en diversas afecciones; sin embargo, su
significado clínico se relaciona principalmente con la detección de enfermedades
óseas y hepáticas. La actividad de la ALP es útil para el diagnóstico diferencial de
enfermedades hepáticas. La fosfatasa alcalina suele elevarse más en caso de
afecciones de los conductos biliares, que en las que se produce principalmente la
lesión hepatocelular. Por lo tanto en la enfermedad hepática coléstática u
obstrucción hepatobiliar, la ALP suele incrementarse hasta10 o 15 veces más que
los valores normales, pero en general sólo se observan leves elevaciones de 2 a 3
veces los valores normales en afecciones hepatocelulares como hepatitis.
Además, la síntesis de esta enzima se estimula por la colestasis.
Otras afecciones hepáticas que también incrementan la actividad de la fosfatasa

alcalina son: la mononucleosis infecciosa, la colangiolitis, la cirrosis total,
carcinoma hepatocelular primario y carcinoma hepático metastático secundario,
también incrementan la actividad de la fosfatasa alcalina.
La ALP también se sintetiza en las células osteoblásticas, en donde se produce la

formación de hueso. Por tanto, en afecciones óseas con incremento de actividad
osteoblástica, en general los niveles de fosfatasa alcalina se elevan.
En algunas afecciones que incluyen hipotiroidismo, escorbuto, hipofosfatemia,
Kwashiorkor (niño rojo), cratinismo y anemia grave, se observa reducción de la
actividad de fosfatasa alcalina.
Es muy complicada la interpretación de la medición de la fosfatasa alcalina sérica,

debido a que la actividad de la enzima puede aumentar en ausencia de
enfermedad hepática. También se incrementa la actividad de la fosfatasa alcalina
sérica durante la pubertad debido al crecimiento acelerado de los huesos y,
durante el tercer trimestre del embarazo debido a la liberación de la fosfatasa
alcalina por la placenta
2. Objetivos
 Demostrar el manejo adecuado de la técnica para la determinación de la

enzima fosfatasa alcalina ALP en una muestra biológica
 Establecer los valores normales de referencia de la actividades de esta

enzima y comparar con el valor de nuestra muestra problema a analizar.
 Definir cuáles son las principales patologías que se presentan si tenemos

valores altos o bajos de estas enzimas en una muestra biológica.
Se mide la actividad de la fosfatasa alcalina con un método cinético que utiliza un

tampón de 2-amino-2-metil-1-propanol (AMP). En la reacción, la fosfatasa alcalina
cataliza la hidrólisis del sustrato incoloro éster de fosfato orgánico, el
pnitrofenilfosfato, a un producto de color amarillo (p-nitrofenol y fosfato). Esta
reacción ocurre a un pH alcalino de 10.3.
4. Preparación

Suero, plasma heparinizado.
La actividad del enzima debe ser determinada rápidamente o bien separar el suero
de los hematíes.
La pérdida de la actividad enzimática es menor de un 10% entre 2 a 3 días a 15-

25ºC o durante 1 mes a -20ºC.
Material necesario
1 Micropipeta de 50uL.
Gradilla
Equipo
Centrífuga
Reactivo 1 Tampón dietanolamina (DEA) pH 10,4 1 mmol/L

Tampón Cloruro de magnesio 0.5 mmol/L
Reactivo 2 p-nitrofenilfosfato pNPP) 10 mmol/L

Comprimidos/polvo
5. Procedimiento
5.1Técnica
Longitud de onda. . . . . . . . . . . . . . . . . . 405 nm

Temperatura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25/30/37ºC
Cubeta. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 cm paso de luz
Lectura. . . . . . . . . . . . . . . frente a agua destilada
Macro-test Semimicro-test
Mezclar y anotar la extinción. Poner en marcha el cronómetro.
Calcular el valor medio = ΔE/min
6. RESULTADOS
Cálculo
ΔE/min x 3300 = U/L
Linealidad
Si el ΔE/min, es superior a 0.250 se repetirá la determinación diluyendo la muestra

a 1:10 con solución salina 0.9%.
25ºC / 30ºC / 37ºC

Niños < 400 U/L < 480 U/L < 645 U/L
Adultos 60-170 U/L 73-207 U/L 98-279 U/L
Conclusiones:
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Determinación de GAMMA GLUTAMIL TRANSFERASA Ɣ– GT
1. INTRODUCCIÓN
La GGT (Ɣ-GT) es una enzima localizada en la membrana que juega un papel

importante en el metabolismo del glutatión y en la reabsorción de los aminoácidos
del filtrado glomerular y de la luz intestinal. El glutatión (Ɣ-glutamilcisteinilglicina)
en presencia de la GGT y un aminoácido o péptido transfiere el glutamato al
aminoácido formando un enlace péptido en el ácido Ɣ- carboxílico, formando, por
consiguiente, cisteinilglicina y el péptido Ɣ-glutamil correspondiente.
Aunque la mayor actividad de la GGT se presenta en el tejido renal, la elevación

de la GGT generalmente es un indicador de la enfermedad hepática. La GGT
sérica se eleva antes que las otras enzimas hepáticas en enfermedades como la
colecistitis aguda, la pancreatitis aguda, la necrosis hepática aguda y subaguda, y
neoplasias de sitios múltiples que cursan con metástasis hepáticas. Puesto que la
GGT es una enzima microsomal hepática, la ingestión crónica de alcohol o drogas
como los barbitúricos, los antidepresivos tricíclicos y los anticonvulsivantes
inducen la producción de enzimas microsomales. Estas elevaciones inducidas por
drogas preceden cualquier otro cambio en las enzimas del hígado y si se
suspende la ingestión de la droga en ese momento, los cambios del hígado son
generalmente reversibles. La GGT permite la diferenciación de otras
enfermedades hepáticas en las cuales por sus condiciones se eleva la fosfatasa
alcalina sérica, puesto que los niveles de GGT son normales en la enfermedad de
Paget, el raquitismo y la osteomalacia y en los niños y mujeres embarazadas sin
enfermedad hepática. Asimismo, puesto que la próstata tiene una actividad
significativa de GGT, la actividad sérica es mayor en hombres sanos que en
mujeres. La mayor utilidad de la GGT està en el diagnóstico de colestasis
causadas por la ingestión crónica de alcohol o drogas, colestasis mecánicas o
virales, metástasis hepáticas, desórdenes óseos con elevaciones de la fosfatasa
alcalina, pero en los que la GGT es normal y desórdenes de músculo esquelético
en los cuales la transaminasa ASAT está elevada pero la GGT está normal.
2. Objetivos
 Demostrar el manejo adecuado de la técnica para la determinación de la

gama glutamiltrasferasa en una muestra biológica
.
 Establecer los valores de referencia de la enzima GGT y comparar con el
valores altos o bajos de GGT en una muestra biológica.
3. FUNDAMENTO DEL MÉTODO
Se mide la actividad de la γ-glutamil transferasa mediante un método cinético

enzimático. En la reacción, la γ-glutamil transferasa cataliza la transferencia de un
grupo gamma-glutamil desde el sustrato incoloro gamma-glutamil-p-nitroanilina, al
aceptor, glicilglicina, y genera un producto coloreado, la p-nitroanilina.
4. PREPARACIÓN
4.1 MUESTRA CLINICA
Solamente utilizar suero. No utilizar plasma.

La γ-GT es estable en el suero 8 horas a 15-25ºC, 3 días a 2-8ºC y un mes
congelado a -20ºC.
4 MATERIAL Y REACTIVOS
Material necesario

Gradilla
Equipo
Centrífuga
Reactivo 1 Sol. Tampón TRIS pH 8.25 100 mmol/L

Reactivo 2 Glicilglicina 100 mmol/L
Comprimidos/ L-γ-glutamil-3-carboxi-
Polvo p-nitroanilida 3 mmol/L
La estabilidad del monoreactivo es de 21 días a 2-8ºC o 5 días a temperatura
ambiente.
5. Procedimiento
5.1 Técnica
Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . .. 405 nm
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . 25/30/37ºC
Cubeta: . . . . . . . . . . . . . . . . ……..1 cm. paso de luz.
Lectura: . . . . . . . . . . . . . . ………..frente aire o agua destilada
Macro-test Semimicro-test
Suero 200 μL 100 μL
Mezclar, esperar 1 minuto. Anotar la lectura y poner en marcha el cronómetro.
Calcular el valor medio de los incrementos de extinción por minuto. (ΔE/min)
6. Resultados
Cálculo
A 405 nm
ΔE/min x 1190 = (U/L)
Linealidad
El método es lineal hasta actividades de 250 U/L. Para valores superiores, se
diluirá la muestra a 1:10 con solución salina 0.9%.

25ºC 30ºC 37ºC
Mujeres 4-18 U/L 5-25 U/L 7-32 U/L
Hombres 6-28 U/L 8-38 U/L 11-50 U/L
Notas
La hemólisis interfiere en el test.
Conclusiones:
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PRÁCTICA N°4
Determinación de las enzimas: Amilasa y Lipasa.
Determinación de Amilasa
1. Introducción
El páncreas puede ser la “glándula maestra” del cuerpo si se consideran los

graves trastornos digestivos y metabólicos que aparecen cuando se pierden sus
funciones exocrinas y endocrinas. El principal trastorno al que conduce la pérdida
de la función endocrina es la diabetes mellitus, que cuenta con mayor morbilidad y
mortalidad que todas las otras enfermedades pancreáticas juntas. Las pruebas de
laboratorio importantes a este respecto, son la determinación de glucosa en
sangre, fructosamina y hemoglobina A1c con objeto de conocer el control
glucémico a corto y largo plazo. La pérdida de la función exocrina es común en la
fibrosis quística y en algunos sujetos con ataques repetidos de pancreatitis
generalmente causados por el abuso crónico del alcohol. El páncreas tiene una
gran reserva y la pérdida de la función produce síntomas sólo después de que85%
de las células acinares se ha perdido. Existen algunas pruebas de función
pancreática que junto con la de grasa en materia fecal son las más importantes.
Las pruebas en suero, como la tripsina, son las menos sensibles y menos
específicas a pesar de ser las más fáciles de realizar.
La pancreatitis aguda es una de las principales emergencias médicas; el

alcoholismo y las enfermedades del tracto biliar son las causas predominantes,
aunque sólo tenemos algunas evidencias conjeturales de cómo se inicia una
pancreatitis. Los cambios observados en las enzimas pancreáticas como amilasa
y lipasa pueden ser de moderados a intensos, desafortunadamente sólo es posible
obtener una estimación gruesa de la gravedad del padecimiento con los estudios
de laboratorio. La pancreatitis crónica generalmente es la secuela de múltiples
brotes de la enfermedad aguda y los resultados de laboratorio normalmente no
son muy útiles para el diagnóstico. El adenocarcinoma de páncreas, la forma
común de la enfermedad maligna, es funesta para casi todos los pacientes debido
a la naturaleza invasiva del cáncer y su progresión rápida y silenciosa. No existen
pruebas adecuadas de escrutinio para el cáncer pancreático y la muerte se
presenta típicamente de seis meses a un año del diagnóstico. Las neoplasias de
los islotes de Langerhans son un reto bioquímico para su diagnóstico. Excepto los
gastrinomas que producen el síndrome de Zollinger-Ellison, la mayoría de estos
tumores no son malignos pero pueden poner en peligro la vida debido a la
liberación no controlada de factores endocrinos y la estimulación a sus órganos
blancos. Para establecer el diagnóstico se requiere realizar pruebas que
determinen las hormonas normalmente producidas en las células del islote de
Langerhans y otros factores.
La amilasa alfa (AMS) es una metaloenzima que requiere calcio y pertenece a la

clase de hidrolasas. La reacción enzimática que cataliza la amilasa alfa es la
hidrólisis aleatoria de enlaces glicosídicos alfa-1,4 internos del almidón, glucógeno
y otros polímeros de la glucosa. Los productos de digestión de la amilasa, que es
una mólecula de almidón lineal que contiene sólo enlaces alfa 1,4, son maltosa,
maltotrinosa y otras dextrinas.
Las principales fuentes tisulares de esta enzima son las glándulas salivales y las
células acinares del páncreas. La actividad de amilasa alfa no es específica para
estos tejidos, ya que también se encuentra en el epitelio intestinal, trompas de
Falopio, mucosa del cuello uterino, endometrio y tejido del seno durante la
lactancia. La principal función de la amilasa alfa se debe a la fracción pancreática,
que ayuda a la digestión del almidón, glucógeno y sus productos de
descomposición en el intestino delgado. La AMS de la saliva inicia la digestión de
almidón en la cavidad oral, pero su acción termina con rapidez a consecuencia del
pH ácido del jugo gástrico durante la deglución. Durante años los niveles de α-
amilasa en suero nos han evidenciado la necesidad de su determinación para el
diagnóstico de pancreatitis aguda. Las primeras técnicas estaban basadas en los
cambios de la absorción máxima del complejo entre el almidón y el yodo, ya que la
α-amilasa degrada al almidón. Otros métodos están basados en la producción de
p-nitrofenol a partir de sustratos oligosacáridos específicos con grupos
bloqueantes en el azúcar terminal. Estos métodos utilizan una variedad de
enzimas para hidrolizar la corta cadena de oligosacáridos para producir p-
nitrofenol.
Estas enzimas contienen una actividad residual de α-amilasa que reducen

significativamente la estabilidad del reactivo. El método que presentamos no utiliza
enzimas, evitando así este problema de estabilidad. Se han desarrollado ensayos
de apareamiento enzimático que permiten condiciones de hidrólisis más
controladas y congruentes, y que también pueden adaptarse a instrumentos
automatizados.
2. Objetivos

amilasa en una muestra biológica
 Establecer los valores de referencia de la enzima AMY y comparar con el


valores altos o bajos de AMY en una muestra biológica.
Se mide la actividad de la amilasa con un método cinético enzimático. En la

reacción, la amilasa cataliza la hidrólisis del sustrato definido (maltotetraosa) a
maltosa. La velocidad de formación de maltosa se mide mediante el uso de tres
reacciones relacionadas que catalizadas por la maltosa fosforilasa (MP), la b-
fosfoglucomutasa (PGM), y la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH), dan
como resultado la producción de b-dinucleótido de nicotinamida adenina reducido
(NADH) a partir de b-dinucleótido de nicotinamida adenina (NAD).
La cantidad de CNP formado puede ser detectado espectrofotométricamente a

405 nm dando una medida directa de la actividad de la α-amilasa de la muestra.
La reacción no está inhibida por factores endógenos.
4. preparación
4.1 muestras clínicas
Suero, plasma heparinizado u orina. Otros anticoagulantes como el citrato o EDTA

no son recomendables. Una vez efectuada la extracción, centrifugar y separar el
suero lo antes posible. La α-amilasa es estable en la muestra durante una semana
a temperatura ambiente (20-25°C) y varios meses cuando la muestra se guarda
bien tapada y refrigerada a 2-8°C.

Material necesario
1 Micropipeta de 1.0 mL.
1 Micropipeta de 20mL.
1 Micropipeta de 200 mL
Gradilla
Pipeta de 2 mL
Equipo
Cronómetro

MES tampón pH 6.0, 100 mmol/L
2-Cl-4-Nitrofenil-α-D-maltotriosido (CNPG3) 2.25 mmol/L
Cloruro de sodio 350 mmol/L
Acetato de calcio 6 mmol/L
Tiocianato de potasio 900 mmol/L
Azida de Sodio 0.095%
El reactivo está listo para su utilización.

Si el frasco no se ha abierto y se ha guardado a 2-8 °C, el reactivo será estable
hasta la fecha de caducidad. Una vez abierto el reactivo será estable 60 días
siempre y cuando se tape inmediatamente después de su uso diario y se guarde a
2-8°C.
5. Procedimiento
5.1 Técnica
Longitud de onda. . . . . . . . . 405 nm

Temperatura. . . . . . . . . . . ..37°C
Cubeta. . . . . . . ………… 1 cm de paso de luz
Cero frente a agua destilada
Reactivo 1.0 mL
Muestra o control 20 μL
Orina 10 μL
Mezclar y leer.
Medir el incremento de la absortividad por minuto durante 1, 2 y 3 minutos ΔA/min
6. Resultados
6.1 Cálculo
Calcular la actividad de la α-amilasa de la muestra usando el siguiente factor:
Suero, plasma
Actividad (U/L)= ΔA/min x 3954
Orina
Actividad (U/L)= ΔA/min x 7908
Unidades SI: U/L X 0.01667= μkat/L
6.2 Linealidad
Este método es lineal hasta 2000 U/L. Si la muestra es superior, debe diluirse la
muestra con solución salina 1:2 y repetir el ensayo, multiplicando el resultado por
2.
Suero, plasma < 90 U/L
Orina <450 U/L

Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios intervalos de
referencia dependiendo de la localización.
Notas:
Debido al contenido en α-amilasa de la saliva y el sudor, para reducir la posibilidad

de contaminación, no pipetear el reactivo con la boca, ni tener en contacto la
muestra y el reactivo con la piel. No se deben procesar muestras hemolizadas.
Contiene tiocianato de potasio. Evitar su inhalación o contacto del reactivo con la
piel y los ojos. Si ocurre lavar la piel y los ojos con abundante agua y consultar al
médico.
Determinación de Lipasa
1. Introducción
La lipasa (LPS) es una enzima que pertenece a las hidrolasas, hidroliza los
ésteres de glicerol de triglicéridos de ácidos grasos de cadena larga. La lipasa
hidroliza preferencialmente los enlaces estéricos de los carbonos 1 y 3 de la
molécula de triglicéridos y produce dos moléculas de ácido graso y una molécula
de 2-monoglicérido Se observa actividad de lipasa en páncreas mucosa intestinal,
estómago, leucocitos y tejido adiposo. Sin embargo, sólo la lipasa pancréatica
tiene significado clínico; su principal función consiste en hidrolizar los triglicéridos
de la dieta que han sido emulsificados por ácidos biliares y ayudan así a la
absorción de grasas en el intestino delgado. Como la lipasa se produce
principalmente las células acinares del páncreas, su utilidad clínica se relaciona
casi de manera exclusiva con el diagnóstico de laboratorio de pancreatitis aguda.
Otras afecciones en las cuales se incrementa la actividad de lipasa incluyen
intoxicación aguda con alcohol y traumatismos accidentales o quirúrgicos del
abdomen.
2. Objetivos
 Aplicar el manejo adecuado de la técnica para la determinación de la lipasa
en una muestra biológica.
 Establecer los valores de referencia de la enzima LPS y comparar con el
valores altos o bajos de LPS en una muestra biológica
La lipasa pancreática en presencia de colipasa, desoxicolato, además de iones

calcio, hidroliza el sustrato 1-2-O-dilauryl-rac-glycerol-3-glutárico acido-(6' -
metilresorufina)-ester, según la secuencia de las siguientes reacciones: 1-2-O-
dilauryl-rac-glycero-3-glutárico ácido-(6' -metilresorufina)-ester>1-2-O-dilauril-rac-
glycerol + glutáricoacido-6'-metilresorufina ester (no estable) > ácido glutárico +
Metilresorufina
4. Preparación

Suero fresco no hemolizado o plasma.
Material necesario
1 Micropipeta de 1.0 mL.
1 Micropipeta de 10mL.
Gradilla
Equipo:
Cronómetro
Contenido del reactivo
Reactivo 1 Tampón TRIS pH: 8.4, 40 mmol/L

Colipasa 40 000 U/L
Desoxicolato 1.8 mmol/L
Estabilizante
Reactivo 2 Tartrato pH: 4.0, 1.6 mmol/L

Sustrato 0.24 mmol/L
Cloruro de calcio 0.1 mmol/L
Detergente
Estándar Lipasa
R.1 y R.2, ambos reactivos están listos para su uso. Agitar suavemente el R.2
antes de su uso. Estándar: reconstituir el vial con 1 mL de agua bidestilada. La
estabilidad es de 10 días a 2-8 ºC ó 3 meses congelado a -20ºC. Se recomienda
congelar alícuotas.
5. Procedimiento
5.1 Técnica
Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . . 580 nm

Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . 37ºC
Cubeta: . . . . . . . . . . . . . . . . 1 cm paso de luz
Blanco Estándar Muestra
Agua destilada 10 μL
Estándar 10 μL
Muestra 10 μL
R.1 1.0 mL
R.2 100 μL
Mezclar e incubar 1 minuto a 37ºC.
Efectuar una lectura inicial al primer minuto y repetir lecturas después de 1 y los 2
minutos siguientes.
Calcular el incremento de extinción (ΔE/min) del blanco, estándar y muestra.
6. Resultados
6.1 Cálculo
Restar a las lecturas (ΔE/min) efectuadas del estándar y muestras, el incremento

del blanco (ΔE/min).
ΔE/min muestra/ ΔE/min estándar x actividad estándar = U/L Lipasa
6.2 Linealidad
El método es lineal hasta actividades de: 250 U/L

U/L metilresorufin a 37ºC : < 30 U/L
7. Notas:
La actividad de la lipasa en U/L metilresorufin a 37ºC, puede ser convertida en U/L

turbidimétrico a 37ºC con trioleína como sustrato, multiplicando el resultado por
6.2.
A fin de evitar contaminaciones se recomienda no utilizar las cubetas y utensilios

que se hayan usado para la determinación de triglicéridos.
8. Conclusiones:
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PRÁCTICA N°5
Determinación de enzimas y proteínas para evaluar lesión

cardiaca.
1. Introducción
El metabolismo altamente anaeróbico del corazón le permite usar como

combustible muchos substratos normalmente presentes en el plasma, y la
absorción cardíaca de la mayoría de estos substratos es proporcional a su
concentración arterial una vez que ciertos niveles son excedidos. En términos
generales, el corazón usa los ácidos grasos libres como su combustible
predominante. También consume importantes cantidades de glucosa y lactato, así
como cantidades más pequeñas de piruvato, cuerpos cetónicos y aminoácidos.
La mayor parte de la energía para la función cardíaca se obtiene de la

descomposición de metabolitos a través del ciclo del ácido cítrico y la fosforilación
oxidativa. Estas vías enzimáticas se encuentran principalmente en las
mitocondrias, representando aproximadamente un 35% del volumen total del
músculo cardíaco.
Enzimas en las células miocárdicas
Varias enzimas encontradas en el tejido miocárdico son clínicamente importantes

debido a que su liberación en el torrente sanguíneo puede estar relacionada con el
daño y la muerte de las células miocárdicas.
Creatina cinasa (CK)
La enzima responsable de la regeneración del ATP es la creatina cinasa.Tiene un

peso molecular de 85,000 daltons y existe en diversas formas isoenzimáticas. La
creatina cinasa (CK) es un dímero, compuesto de las dos subunidades M
(músculo) y B (cerebro). Las tres isoenzimas formadas a partir de estas
subunidades se encuentran en el “citosol”. Estas isoenzimas se abrevian como
MM, MB, y BB. Si comparamos la actividad de la enzima en varios tejidos, el
músculo esquelético tiene por mucho la mayor actividad, poseyendo unas 50,000
veces la concentración de la CK sérica. La isoenzima esquelética predominante es
la isoenzima MM, con sólo trazas de las isoenzimas MB y BB en la mayoría de las
fibras musculares. El componente MB, sin embargo, está incrementado en ciertos
trastornos musculares, particularmente en la distrofia muscular tipo Duchenne y en
la polimiositis. La actividad de CK del músculo esquelético medida en unidades
internacionales es aproximadamente de 2000 U/g, comparada con la actividad del
músculo cardíaco de 500 U/g. En suero normal, por lo menos el 95% de la CK
presente es del tipo MM que probablemente se deba principalmente a fugas del
músculo esquelético, particularmente durante la actividad física. Debido a esto, la
actividad de la CK sérica en personas activas saludables muestra una distribución
asimétrica inclinada hacia valores más altos. Además, los valores son más bajos
en las mujeres que en los hombres y son más bajos en la mañana que en la
noche. Los valores tienden a ser más bajos en pacientes hospitalizados,
posiblemente debido a que el reposo en cama reduce la cantidad de enzimas
liberadas del músculo.
Isoformas de Creatina cinasa
Las isoenzimas CK-MM y CK-MB en suero pueden ser fraccionadas en subtipos o

“isoformas” mediante técnicas de alta resolución, tales como electroforesis de alto
voltaje o enfoque isoeléctrico. Las isoformas de CK-MM y CK-MB se forman en la
sangre mediante la ruptura enzimática irreversible del aminoácido del COOH
terminal, un residuo de lisina, de la subunidad M o de las subunidades de las
isoenzimas del tejido. Para la CK-MM, esta ruptura involucra la remoción sucesiva
de los residuos terminales de lisina de cada subunidad M, dando lugar a tres
isoformas llamadas MM3 (forma tisular, o Mlisina Mlisina), MM2 (o MlisinaM), y
MM1 (o MM). La CK-MB, que tiene una sola subunidad M, consiste de dos
isoformas en la circulación, la llamada MB2 (forma de tejido, o MlisinaB), y MB1 (o
MB). Es de notar que la secuencia amino terminal de la subunidad B de la CK es
similar al de la subunidad M, sin embargo, la ruptura de la lisina terminal de la
subunidad B de la CC-MB permanece controversial.
Lactato deshidrogenasa
La lactato deshidrogenasa (LDH) es una enzima tisular ubicua que cataliza la

reducción de piruvato a lactato usando nicotinamida adenina dinucleótido (NAD).
La LDH de un peso molecular de aproximadamente 140,000 daltons y es un
tetrámero compuesto de cuatro subunidades con peso molecular de 35,000
daltons cada una. Las subunidades, que son de dos tipos, H (corazón) y M
(músculo), se combinan para formar las cinco isoenzimas de LDH. La principal
isoenzima (HHHH) tiene una actividad máxima en presencia de bajas
concentraciones de piruvato, pero se inhibe por exceso de piruvato. Por contraste,
la principal isoenzima muscular (MMMM) exhibe actividad máxima en presencia de
una mayor concentración de piruvato y se inhibe menos por exceso de piruvato. El
corazón metaboliza los ácidos grasos y los carbohidratos a una velocidad
aproximadamente constante con oxidación completa del piruvato a través del ciclo
de Krebs del ácido cítrico. Por lo tanto, el corazón tiene una baja concentración
tisular de piruvato y lactato y rápidamente convierte el lactato del plasma en
piruvato. Por contraste, el músculo, con rápidas demandas de incrementos de
energía durante el ejercicio, tiene que contender con rápidos incrementos en
piruvato y lactato de tejido causados por el metabolismo anaeróbico.
La LDH se encuentra en el citosol de todas las células humanas y por lo tanto

tendría poca especificidad para el diagnóstico a no ser por el hecho de que las
isoenzimas están presentes en diferentes proporciones en cada tejido. El corazón
y los eritrocitos contienen principalmente LDH1 y LDH2, mientras que el músculo
esquelético y el hígado contienen LDH5 y en menor grado LDH4. El suero normal
contiene principalmente LDH2, con menores cantidades de LDH1 y de las otras
isoenzimas. Si las enzimas son liberadas del tejido cardíaco al suero, a menudo
vemos un cambio en la proporción de LDH1 a LDH2. La vida media de la LDH es
diferente para cada isoenzima; la isoenzima 1 (HHHH), tiene una vida media de
aproximadamente 100 horas, mientras que la isoenzima 5 (MMMM) tiene una vida media de
sólo 10 horas. La importancia de esto es evidente en la discusión de la liberación
de las enzimas durante el infarto al miocardio.
Aspartato aminotransferasa
La aspartato aminotransferasa (ASAT) cataliza la transferencia de un grupo amino

entre el ácido aspártico y el piruvato para formar oxaloacetato (alfa cetoglutarato) y
alanina. Esta enzima ubicua es esencial en el metabolismo intermedio y permite
que los aminoácidos ácido aspártico y ácido glutámico se degraden en el ciclo de
Krebs. La enzima existe en dos formas estructuralmente diferentes; una se
encuentra principalmente en el citoplasma y la otra en las mitocondrias. La forma
citosólica es la que se encuentra en el suero. Su vida media en el suero es
probablemente de alrededor de 20 horas. El hígado tiene la mayor actividad
enzimática, con aproximadamente 85 U/g de tejido, mientras que el corazón
posee75 U/g y el músculo esquelético cerca de 50 U/g.
Proteínas contráctiles
Los marcadores bioquímicos más comúnmente usados para lesión del miocardio
están involucrados con el metabolismo de las células, son solubles y están
localizados en el compartimento citosólico de las células. Debido a estas
propiedades, una gran proporción de estos marcadores citosólicos son liberados
rápidamente en la circulación después de una lesión celular. Por contraste, la
naturaleza y función de las proteínas estructurales determina que sean solubles;
por consiguiente una proporción relativamente pequeña está libre en el citosol y
disponible para su rápida liberación poco después de una lesión celular. A esta
pequeña proporción disponible para liberación se le denomina el “reservorio
citosólico”.
A pesar de la desventaja teórica de su insolubilidad, se ha generado bastante

interés en las siguientes proteínas estructurales: troponina I, troponina T, y las
cadenas ligeras de miosina. La base de este interés clínico surge de la
identificación y purificación de formas cardíacas de estas proteínas con alta
especificidad tisular, que se discuten adelante con mayor detalle, han permitido el
desarrollo de ensayos inmunológicos para la determinación de lesiones
miocárdicas.
Miosina, actina y troponina
Las proteínas miosina y actina forman la mayor parte del aparato contráctil de las
células musculares. Juntas constituyen el 80% de la proteína de las células
musculares. Las proteínas reguladoras troponina y tropomiosina, en asociación
con la actina polimerizada, forma los filamentos delgados del sarcómero. La
troponina consiste de un complejo de tres subunidades: troponina C, troponina I, y
troponina T.
Troponina T (TnT)
La proteína troponina T, de 37 kilodaltons, tiene un reservorio citosólico que

constituye cerca del 6% de su concentración intracelular total. A pesar de
encontrarse tanto en el tejido esquelético como en el corazón, la TnT está siendo
usada exitosamente como un marcador para la enfermedad cardíaca isquémica
debido a que un subtipo encontrado en el tejido miocárdico tiene una homología
de solamente 60% con la forma del músculo esquelético. Se han desarrollado
anticuerpos altamente específicos que discriminan entre los subtipos de los
músculos cardíacos y esqueléticos.
Troponina I (TnI)
Al igual que la TnT, la TnI es parte integrante del aparato contráctil estructural
tanto del músculo esquelético como del miocárdico. Se cree que el reservorio
citosólico de TnI es el mismo que el de TnT, esto es, cerca del 6% de la
concentración total de TnI de las células. La TnI, con un peso molecular de 21
kilodaltons, es ligeramente más pequeña que la TnT. El subtipo cardíaco de la TnI
tiene varias regiones de aminoácidos que difieren substancialmente de la forma
del músculo esquelético. Estas regiones sirven como base para los
inmunoensayos cardíacos específicos.
Cadenas ligeras de Miosina (CLMs)
La miosina es una molécula de filamentos largos (540 kD) compuesta por seis
cadenas de péptidos, dos de las cuales son pesadas (230 kD) y cuatro son ligeras
(CLMs), con pesos moleculares en el rango de 26 kD. Las CLMs están formadas
por dos componentes, la cadena ligera de miosina-1 y la cadena ligera de miosina-
2, que juntas constituyen el filamento grueso del aparato contráctil en el músculo
esquelético y miocárdico. Las CLMs de fuentes cardíacas y no cardíacas pueden
ser diferenciadas usando anticuerpos específicos para CLMs cardíacas. Debe
notarse que el reservorio citosólico para las CLMs es de 0.5% de la cantidad total
de células, y solamente cerca del 10% del reservorio citosólico para TnT o TnI.
Determinación de la Creatincinasa (CK)
1. Introducción
Se encuentra más abundancia de CK en el músculo esquelético. Las otras fuentes

en que se encuentra, por orden de mayor a menor actividad, son: cerebro, recto,
estómago, vejiga, colon, útero, próstata, intestino delgado y riñón. Se detectan
cantidades despreciables en hígado, placenta y tejido tiroideo. La CK se eleva
principalmente cuando hay afecciones o enfermedades que afectan el tejido
músculo esquelético, el miocardio o el cerebro. Se observan notables incrementos
de CK total en infarto agudo al miocardio, en afecciones del músculo esquelético y
después de un choque o colapso circulatorio. En general la CK se eleva en infarto
agudo al miocardio y es de gran utilidad clínica para detectarlo. La CK total
comienza a incrementarse después de 15 horas de ocurrir un infarto agudo al
miocardio. La actividad máxima se observa a las 24 horas y regresa a la
normalidad a los 3 días. La miocarditis también provoca actividad notablemente
alta de CK durante la fase inflamatoria de la afección.
La CK se eleva además en diversas enfermedades o lesiones del músculo

esquelético.
Los valores de creatincinasa y sus isoenzimas se utilizan en el diagnóstico y

tratamiento de los infartos de miocardio y de miopatías como la distrofia muscular
progresiva tipo Duchenne.
La creatincinasa (CK) es una enzima del citoplasma y la mitocondria que cataliza

tanto la formación de ATP como la fosforilación reversible de creatinina, con el
ATP como grupo donador de fosfato. La CK requiere activadores metálicos,
particularmente Mg2++, para que la enzima alcance toda su actividad catalítica.
La actividad de CK es de particular importancia en el tejido muscular, en donde

cataliza la síntesis de fosfato de creatinina, una molécula que almacena enlaces
de alta energía. Para efectuar una contracción muscular se utiliza el grupo fosfato
para formar ATP a fin de proporcionar de inmediato energía a los músculos.
Hay diversos métodos analíticos para determinar la actividad de CK ya sea

mediante la reacción hacia la derecha (creatinina fosfato de creatinina) o la
reacción inversa. Estos métodos son análisis de punto final o cinético, en los que
se emplean técnicas de espectrofotometría, fluorescencia o bioluminiscencia. El
método de referencia para el análisis de CK es el de Oliver y Rosalki, un análisis
cinético en el que se emplea la secuencia de reacción “inv
2. Objetivos

Creatin cinasa
 Establecer los valores de referencia de la enzima CK y comparar con el


valores altos o bajos de CK.
3. Fundamento de la metodología
Se mide la actividad de la creatincinasa mediante un método cinético enzimático.
En la reacción, la creatincinasa cataliza la transferencia de un grupo fosfato del

sustrato fosfato de creatina al difosfato de adenosina (ADP). La subsiguiente
formación de trifosfato de adenosina (ATP) se mide mediante el uso de dos
reacciones asociadas, catalizadas por la hexocinasa (HK) y la glucosa-6- fosfato
deshidrogenasa (G6PDH), lo que produce dinucleótido de nicotinamida adenina
reducida (NADH) a partir del dinucleótido de nicotinamida adenina (NAD). El
ensayo (CK) contiene el activador monotioglicerol.
4. Preparación
Suero, plasma heparinizado ó con EDTA.

Material necesario
 Pipetas de 2 mL y 200 μL
 Fotómetro termostable a 37ºC con filtro de 340 nm.
 Cronómetro
Contenido del reactivo
Reactivo 1
Imidazol pH 6.7, 100 mmol/L
Tampón Glucosa 20 mmol/L
Acetato Magnesio 10 mmol/L
EDTA 2 mmol/L
Reactivo 2
ADP 2 mmol/L
Comprimidos AMP 5 mmol/L
Diadenosin-5-P 10 mmol/L
NADP+ 2 mmol/L
Hexoquinasa (HK) 2500 U/L
G-6-PDH 1500 U/L
N-acetilcisteina 20 mmol/L
Creatin-fosfato 30 mmol/L
La estabilidad del monoreactivo es de 5 días a 2-8ºC ó 24 horas a temperatura

ambiente.
La actividad de la CK en suero disminuye un 10% al cabo de un día a 2-6ºC ó 1

hora a 15-25ºC.
5. Procedimiento
5.1 Técnica
Longitud de onda. . . . . …… . 340 nm ,334 nm, 365 nm

Temperatura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25/30/37ºC
Cubeta. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 cm paso de luz
Lectura. . . . . . . . . . . . . . frente a agua dest.
Reactivo al uso 2.5 mL
Muestra 100 μL
Mezclar e incubar 2 minutos.
Verter la solución a la cubeta, leer la extinción y poner en marcha el cronómetro.
Repetir la lectura a 1,2 y 3 minutos. Calcular ΔE/min.
6. Resultados
6.1 Cálculo
A 25/30ºC
340 nm ΔE/min x 4127 = U/L
334 nm ΔE/min x 4207 = U/L
365 nm ΔE/min x 7429 = U/L
A 37ºC
340 nm ΔE/min x 8095 = U/L
334 nm ΔE/min x 8260 = U/L
365 nm ΔE/min x 14751 = U/L
6.2 Linealidad
A 334 nm y 340 nm hasta ΔE/min de 0.250
A 365 nm hasta ΔE/min de 0.140
Para valores superiores, se diluirá la muestra a 1:10 con solución salina 0.9%

25ºC 30ºC 37ºC
Hombres 10-80 U/L 15-130 U/L 24-195 U/L
Mujeres 10-70 U/L 15-110 U/L 24-170 U/L
7. Notas
La hemólisis interfiere en la prueba a concentraciones superiores a 200 mg/dL de
hemoglobina.
8. Conclusiones:
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UNIDAD N° III: Líquidos Corporales y espermatograma.
Los exudados y trasudados son líquidos biológicos extravasculares de origen
natural, adquieren importancia clínica cuando sus características fisicoquímicas y
microscópicas se modifican como respuesta a alteraciones traumáticas,
inflamatorias, infecciosas, degenerativas, hemorrágicas o neoplásicas.
El análisis de estos líquidos consiste básicamente 3 exámenes que son:
1. Examen físico
2. Examen químico
3. Examen microscópico
En el área de bioquímica clínica solo revisaremos los tres primeros exámenes

debido a que los dos últimos se revisan ampliamente en otras experiencias
educativas correlacionadas.
Métodos generales de obtención de muestras.
Se obtienen por punción quirúrgica, en condición de asepsia, con técnicas que

varían según la ubicación del líquido. Conviene recoger una porción en 3 tubos o
recipientes estériles que contengan uno de ellos citrato de sodio para evitar una
probable coagulación (útil para el examen físico e inmunológico), el segundo tubo
con medio enriquecido de cultivo para transporte (bacteriológico) y el tercero con
solución salina (químico y microscópico). Las técnicas de obtención de la muestra
varían de acuerdo a la zona o cavidad en que se requiera el estudio.
PRÁCTICA No.6
Estudio físico, químico y celular de los líquidos serosos.
Análisis del líquido pleural
1. Introducción
El acumulo o incremento del líquido pleural se denomina derrame pleural. Cuando

éste existe, en cantidad apreciable, en general está indicado su estudio, en el
laboratorio.
En condiciones normales, el espacio pleural contiene de 1 a 10ml de fluido. Se

considera patológico un volumen de líquido pleural que pueda ser detectado
radiológicamente.
La obtención del espécimen para su estudio se realiza por toracocentesis con

aspiración del líquido mediante una jeringa heparinizada y separación inmediata
en diferentes tubos para:
 recuento celular
 estudio bioquímico
 microbiológico
 anatomopatológico
Clásicamente los derrames pleurales se clasifican como trasudados o como

exudados.
Los trasudados son consecuencia de un aumento de la presión microvascular o de

la disminución de la presión oncótica de la sangre o de la combinación de ambos:
- las proteínas son inferiores a la mitad de los valores hallados en suero,

clásicamente menos de 3 g/dl.
- la glucosa no está disminuida
- la LDH no está aumentada

- recuento de leucocitos por debajo de 1000/mm3
- colesterol inferior a una cuarta parte del valor sérico.
Los exudados son consecuencia de un aumento de la permeabilidad de la
superficie pleural en general por inflamación de diversa causa.
2. Objetivo:
Realizar todas las pruebas que comprenden el estudio del líquido pleural
3.- Procedimiento
3.1 Examen macroscópico
Aspecto
Su aspecto normal suele ser ambarino claro o con una leve turbidez asociada al
grado de contenido celular o de triglicéridos. Diversas situaciones clínicas
modifican este aspecto habitual de modo que pueden orientar al profesional del
laboratorio hacia la causa del derrame y aunque no se considera un buen método
diagnóstico, en algunos casos puede ser útil
Color
El líquido puede ser de color amarillento transparente, turbio por su contenido
elevado de células, hemático por la presencia de hematíes o quiloso por aumento
de grasas en forma de triglicéridos.
Si el líquido es hemorrágico se debe realizar un hematocrito para descartar la

existencia de un hemotorax. Si la presencia de sangre es debida a la
toracocentesis, el grado de coloración durante la aspiración no será uniforme,
observándose un aclaramiento progresivo durante la obtención del líquido.
Turbidez
Puede ser debida a un aumento de la concentración celular o lipídica. El examen
del sobrenadante tras la centrifugación permite su diferenciación.
3.2 Examen microscópico
Concentración de eritrocitos
Se realiza en cámara hematocitométrica (Neubauer, Burker o Thoma) o en
contador hematológico automático en función de la concentración de eritrocitos y
el límite de detección del instrumento.
Si el líquido es hemorrágico se debe medir su hematocrito. Si éste es superior al

50% del hematocrito de sangre periférica es diagnóstico de hemotorax. Un líquido
hemorrágico sugiere la presencia de una neoplasia, un traumatismo o una
embolización pulmonar.
Recuento de leucocitos
Debe realizarse cuando la concentración es superior a 0.25 x 106 leucocitos / ml

mediante examen microscópico de las extensiones celulares teñidas por los
métodos de May-Grunwald-Giemsa , Wright o Türk.
En líquidos con menos de 2 x 106 leucocitos / ml es útil concentrar las células

antes de la tinción por medio de centrifugación a 28-30 g, decantación del
sobrenadante y posterior resuspensión del botón celular, o por citocentrifugación
Predominio de neutrófilos
Es el componente celular de respuesta inflamatoria aguda e indica inflamación

aguda de la pleura.
Los neutrófilos tienen como factor quimiotáctico a la interleukina 8 (IL8) que se

correlaciona con el número de neutrófilos por lo que la IL8 está elevado en los
empiemas.
Los neutrófilos predominan en neumonías, pancreatitis, embolismo pulmonar,

absceso subfrénico, tuberculosis en estadios precoces, LES, Dasbestósico, Dp
maligno en fase inicial.
Predominio de eosinófilos
Porcentajes superiores al 10% de eosinófilos pueden ser debidos a la presencia

de aire o sangre en el espacio pleural (otras causas menos frecuentes son la
asbestosis, las reacciones a fármacos, las enfermedades parasitarias (hidatidosis,
amebiasis o ascaridiasis.
Además se puede observar eosinofilia en el síndrome de Churg Strauss y en la

enfermedad de Hodgkin.
Predominio de linfocitos
Si hay más del 50 % en LP hay que sospechar tuberculosis o enfermedad maligna

y se debe valorar la realización de biopsia pleural para llegar al diagnóstico.
Otras causas son: linfomas, pleuritis reumatoideacrónica y sarcoidosis.

La separación en linfocitos T y B es poco útil. Aproximadamente el 70% son
linfocitos T, el 10% son linfocitos B.
3.3 Análisis bioquímico

El estudio bioquímico puede ser muy amplio pero en general es suficiente la
valoración de pH, proteínas, glucosa, urea, amilasa, LDH y colesterol. Cuando se
presume un quilotórax es conveniente medir los triglicéridos.
Concentración de glucosa: es determinante en el diagnóstico diferencial de los

derrames pleurales exudativos.
Cuando la glucosa es menor de 60 mg/dl sugiere DP paraneumónico, tuberculosis,

neoplasia o artritis reumatoide. Los valores bajos de glucosa se deben al consumo
excesivo por parte del metabolismo celular o bacteriano.
En los derrames paraneumónicos complicados valores de glucopleura inferiores a

40 mg/dl son indicación de drenaje.
En neoplasias, la glucosa baja indica gran número de células neoplásicas y mayor

probabilidad de obtener citología positiva.
En la artritis reumatoide la glucopleura baja se debe a un bloqueo el paso de la

misma desde la sangre al espacio pleural.
Proteínas: Están más altas en exudados que en trasudados y sirven como criterio
para separarlos; sin embargo no son útiles para el diagnóstico diferencial de los
exudados.
El aspecto electroforético es similar al del suero excepto que tiene la albúmina un

poco más alta. Las relaciones de IgG, IgA e IgM pleura / suero siempre es inferior
a 1.
LDH: Indica el grado de inflamación de la pleura. No sirve para el diagnóstico

diferencial. Cuando se hacen toracocentesis repetidas y la LDH aumenta, indica
que el grado de inflamación aumenta y si disminuye es que mejora. La separación
de las isoenzimas puede servir algunas veces. La LDH4 y la LDH5 están elevadas
en los derrames pleurales malignos.
Concentración de α-amilasa: En los exudados es útil porque cuando está por

encima de los niveles séricos indica enfermedad pancreática, rotura esofágica o
neoplasia. En la enfermedad pancreática la amilasa está más elevada que en
suero. En el 10% de las neoplasias puede estar moderada o mínimamente
elevada en comparación con las elevaciones de la pancreatitis o de la ruptura
esofágica.
La amilasa en la ruptura esofágica es salivar, por eso a veces es útil la

determinación de isoenzimas para el diagnóstico diferencial.
Recientemente, se ha descrito elevación de la amilasa en los derrames pleurales

de los heroinómanos.
Triglicéridos: se han mostrado útiles en el diagnóstico de quilotórax.

Valores inferiores a 50 mg/dL lo descartan y cuando oscila entre 50-110 mg/dL es
preciso recurrir a la demostración de quilomicrones mediante estudio
electroforético, ya que su presencia es sinónimo de quilotórax.
Medición del pH: es de utilidad en el diagnóstico diferencial de exudados. El pH

del líquido pleural de un individuo adulto normal es de 7.64. Hay que medir el pH y
la PaCO2 en sangre para descartar acidosis sanguínea. Si el pH es < 7.2 es
indicativo de alguna de las siguientes patologías: derrame paraneumónico
complicado, rotura esofágica, artritis reumatoide, tuberculosis pleural, neoplasia
pleural, hemotorax, acidosis sistémica, lupus eritematoso sistémico.
En caso de derrame paraneumónico pH < 7.0 es indicación de drenaje con tubo

de toracotomía. En trasudados el pH es habitualmente mayor que el pH arterial.
Creatinina: La elevación de creatinina en líquido pleural puede ser útil en el

diagnóstico de urinotórax (acumulación de orina en el espacio pleural asociada a
uropatía obstructiva). El diagnóstico se confirma cuando el cociente de creatinina
de líquido pleural/suero es mayor o igual a uno.
Acido hialurónico: Su elevación en líquido pleural por encima de 100 mg/L es

muy sugestiva de mesotelioma, aunque algunos derrames benignos han mostrado
niveles altos del mismo.
ADA: Esta enzima es necesaria para la diferenciación de las células linfoides e
interviene en la maduración de los monocitos-macrófagos.
La determinación de ADA es útil en el diagnóstico de la tuberculosis. Se ha

observado que valores por encima de 45 tienen una sensibilidad del 97%.
También se ha encontrado elevada en empiemas, linfomas, leucemias,

mesoteliomas y derrames malignos.
4. Conclusiones:
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Análisis del líquido ascítico
1.- Introducción
El líquido ascítico, también denominado peritoneal, es un fluido que se acumula en

la cavidad peritoneal normalmente debido a la existencia de cirrosis hepática y con
menor frecuencia secundaria a patologías malignas.
La cavidad peritoneal contiene los órganos abdominales y las membranas serosas

que a recubren se denominan peritoneo y son las más extensas del organismos.
Existen dos membranas: El peritoneo parietal, que recubre la cavidad abdominal
pélvica, y el peritoneo visceral, que recubre los órganos abdominales. Estas dos
membranas serosas conforman una capa de tejido conectivo que e presenta
numerosos capilares y vasos linfáticos y que está cubierta por un epitelio con una
capa superficial de células mesoteliales.
Por lo general, la cavidad peritoneal contiene unos 50 ml de líquido claro, color

pajizo, que facilita la lubricación de las membranas, Su existencia depende de un
proceso dinámico continuo de formación y reabsorción continuas.
La acumulación de líquido patológico se produce cuando hay un aumento de la

producción o una disminución de la reabsorción. Y se produce lo que es conocido
como ascitis, que no es otra cosa que Acumulación de líquido libre, producido por
ultrafiltración del plasma, en el interior de la cavidad peritoneal. La causa más
frecuente es la cirrosis hepática.
El líquido se acumula cuando:

• Aumenta la permeabilidad capilar
• Aumenta la presión hidrostática
• Disminuye la presión coloidosmótica
• Se obstruye el drenaje linfático
Obtención y transporte de la muestra
La obtención de la muestra se obtiene por paracentesis abdominal. Es un

procesamiento invasivo que debe ser realizado por un médico en condiciones
estériles, e implica la introducción de un catéter o una aguja en la cavidad
peritoneal para extraer líquido con fines diagnósticos y terapéuticos. El lugar de
elección para practicar la punción suele ser el cuadrante inferior izquierdo del
abdomen y el volumen de líquido acumulado y el grosor de la pared abdominal
determinarán la posición del paciente durante la punción. A pesar de que la
mayoría de los pacientes puede presentar alteraciones de los tiempos de
coagulación.
Exudado y trasudado
EXUDADO: Líquidos inflamatorios (aumento de la permeabilidad capilar)

PT> 25-30 g/L
TRASUDADO: Líquido no inflamatorio que se origina por factores sistémicos que

afectan a la formación o reabsorción del líquido PT< 25-30 g/L
2. Objetivo
Realizar todas las pruebas que comprenden el estudio del líquido ascitico
3. Procedimiento
Examen macroscópico
En general un líquido ascítico no patológico es transparente. Un aspecto turbio o

purulento indica la presencia de abundantes leucocito. Los líquidos con recuentos
de leucocitos inferiores a 1000/mm3 suelen ser claros. Por encima de 50000/mm3
se observa un líquido de aspecto purulento.
Una elevada concentración de triglicéridos da al líquido un aspecto opalescente-

lechoso.
Si la patología implica contaminación biliar del líquido puede observarse una

coloración verdosa. La pancreatitis aguda y la colecistitis también pueden producir
un color oscuro pigmentado por el efecto de las enzimas pancreáticas sobre los
hematíes.
Si hay restos de alimentos con o sin una coloración verdosa indica la existencia de
una perforación del tracto gastrointestinal.
Recuentos superiores a 20000 hematíes/mm3 nos presentarán un líquido de color

rojo. Un aspecto sanguinolento puede deberse a un traumatismo abdominal, a un
carcinoma hepatocelular, a una carcinomatosis peritoneal o a una punción
traumática.
Examen microscópico
Hematíes
– Sugiere acontecimiento traumático, proceso maligno...
– Debe conocerse si se deben a parecentesis traumática
– Contaje se realiza en cámara y, si estimamos que es superior al límite de
detección del contador automático podrá ser analizado en el mismo Leucocitos
.Recuento de leucocitos > 250/mm3 (S=85%, E= 93%) y neutrófilos >50%:

diagnóstico de presunción de peritonitis bacteriana espontánea
– Cuando la concentración de eosinófilos es superior a 100/mm3: ascitis

eosinofílica
– Concentración aumentada de linfocitos (>200 mm3): peritonitis crónica,

p.tuberculosa y carcinomatosis peritoneal.
Neutrófilos
Como los procedimientos microbiológicos son lentos y presentan muchos falsos
negativos, su cuantificación se hace esencial en las peritonitis bacterianas
espontáneas que complican la cirrosis, caracterizada por no presentar una fuente
primaria de infección. Normalmente, en ausencia de infección, los leucocitos no
superan los 300/μl y predominan los linfocitos, siendo la proporción de
polimorfonucleares inferior al 25 %. Si se supera este porcentaje se considera que
existe infección, aunque hay casos en que aun así el líquido se mantiene estéril.
Más específica es la cantidad de neutrófilos, que es superior a los 250/μl en los
procesos sépticos, dato definitivo si se acompaña de clínica. No obstante, los
casos con más de 250/μl pero sin síntomas (ascitis neutrofílica) han de
considerarse también como peritonitis bacteriana y se deben tratar como tales.
Células mesoteliales
Pueden aumentar sobre todo en procesos extraperitoneales como en la
insuficiencia cardiaca congestiva o el síndrome nefrótico.
Análisis bioquímico
Gradiente de albúmina
SAAG= Calbs - Calblias
Estudio Inicial
Si SCCA ≥ 11 g/l → Hipertensión portal (90%) Gradiente de albúmina alto. Causa
más frecuente: cirrosis
Si SCCA ≤ 11 g/l → Descarta Hipertensión portal (90%) Gradiente de albúmina

bajo. Causa más frecuente: carcinoma peritoneal.
SGGA puede estar falsamente elevado:

Ascitis quilosa (los lípidos interfieren con la prueba de la albúmina)
El SAAG puede ser útil para predecir la respuesta terapéutica
Pacientes con H. portal → Responden a la restricción de sodio
Pacientes sin H. portal → Refractarios a la terapia diurética.
Proteínas
El líquido peritoneal normal es pobre en proteínas (< 2 g/dl). El contenido en
proteínas del líquido ascítico es un criterio fundamental a la hora de clasificarlo
como trasudado o exudado. La prueba cualitativa de Rivalta es poco exacta y
siempre se debe realizar una determinación bioquímica.
Los trasudados se deben a la salida de líquido desde los sinusoides hepáticos y

los capilares intestinales al espacio peritoneal, por lo tanto son ultrafiltrados del
plasma y su contenido en proteínas suele ser relativamente bajo (< 3 g/dl en el 80
% de los casos).
Los exudados se producen por exudación de líquido por el propio peritoneo y su

contenido en proteínas suele superar los 3 g/dl, aunque no de forma obligada. Por
lo tanto, es necesario disponer de un criterio más discriminativo entre trasudado y
exudado.
El gradiente plasma-ascitis de albúmina es un criterio más discriminativo. Un

gradiente superior a 1,1 g/dl es indicativo de trasudado, especialmente de ascitis
cirrótica, mientras que si está por debajo de este límite indica exudado.
Sin embargo, en los trasudados secundarios a síndrome de Budd-Chiari, el

gradiente puede ser inferior a 1,1 g/dl debido a que el líquido ascítico es más rico
en proteínas que en la cirrosis.
Enzimas
Colinesterasa. Desciende en los trastornos hepáticos, pues es en el hígado
donde se sintetiza, llegando a un nivel inferior a 600 U.I. /l y se incrementa en la
tuberculosis o en caso de neoplasias.
Lactato-deshidrogenasa (LDH). Como en el derrame pleural, se halla elevada en
los exudados ascíticos (>200 U.I. /l) de la misma manera que la razón líquido
ascítico/suero es superior a 0,6. Se eleva en derrames neoplásicos y de forma
leve en los inflamatorios. Sus cinco isoenzimas aumentan en la ascitis maligna,
siendo la LDH-2 la de mayor especificidad diagnóstica.
Fosfatasa alcalina. Se observa en derrames asociados a cáncer ovárico. Amilasa

y lipasa. La elevación de ambas es consecuencia segura de la presencia de un
proceso pancreático (pancreatitis, tumores y traumatismos).El incremento aislado
de la primera sugiere otros procesos extrapancreáticos, fundamentalmente
tumorales (neoplasias ginecológicas, quiste ovárico, carcinoma pulmonar, etc.).
Adenosín-desaminasa (ADA). Es útil para el diagnóstico de peritonitis

tuberculosa, en la que aumenta por encima de 43 UI.
Densidad. Es paralela a la concentración proteica en todos los casos citados,

presentando los trasudados valores inferiores a 1,016.
pH
El pH del liquido peritoneal del sujeto sano es superior a 7.35, tal como también
sucede en los derrames hemáticos y en el exudado de la cirrosis hepática. Por
otro lado, tanto en las peritonitis espontáneas (p.e. cirrosis), como en las
secundarias, se produce un descenso de estos valores, lo que parece deberse al
aumento del metabolismo anaerobio. Asimismo están disminuidos en la
carcinomatosis peritoneal y en la peritonitis tuberculosa. Otro parámetro de interés
es el gradiente del pH entre la sangre arterial y el líquido ascítico, que adquiere
valor diagnóstico cuando es superior a 0,10.
Lípidos
Su incremento ocasiona la ascitis quilosa, que es secundaria a obstrucción
linfática de cualquier etiología, que en la actualidad suele ser un linfoma. Tienen
una alta concentración en triglicéridos y baja en colesterol.
Lactato
Suele ser inferior a 25 mg/dl y se eleva en las mismas situaciones en las que
desciende el pH. También es útil el gradiente sangre/ascitis cuando supera los 15
mg/dl.
Bilirrubina
Es el mejor marcador de la presencia de líquido biliar en la cavidad peritoneal.
Debido a la presencia de bilirrubina conjugada en la bilis puede ser válida tanto la
medición de bilirrubina total como directa. Una concentración superior a 6 mg/dl, o
mayor a la presente en suero, sugiere la presencia de bilis o bien una perforación
de intestino proximal.
Glucosa
En el líquido ascítico de la cirrosis no complicada la concentración de glucosa es
similar a la del suero. En infecciones bacterianas puede haber valores disminuidos
de la proporción de glucosa en liquido/suero.
Triglicéridos
Se debe realizar cuando encontramos un líquido opalescente o con
aspecto lechoso. Nos ayuda al diagnóstico de ascitis quilosa que puede estar
causada por bloqueo linfático secundario a tumores (linfomas) o traumatismos
Creatinina
Su medición se considera un test de sensibilidad y especificidad elevadas para
demostrar la existencia de orina.
Fosfatasa alcalina
Pueden encontrarse valores muy elevados en caso de infarto intestinal y puede
ayudar a diferenciar una PBe de una peritonitis secundaria a una perforación
intestinal.
4. conclusiones:
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PRÁCTICA No.7
Análisis de líquido cefalorraquídeo
Los problemas neurológicos son relativamente frecuentes, ya sea de tipo

infeccioso, metabólico, traumático, degenerativo, hemorrágico o por invasión
tumoral. Es por ello que en el estudio del líquido cerebroespinal tiene gran valor
como medio diagnóstico directo o indirecto en muchos padecimientos del sistema
nervioso central, sobre todo cuando son realizados adecuadamente y los
resultados son interpretados en relación con las manifestaciones clínicas. Por otra
parte su estudio tiene un valor adicional en la evaluación del tratamiento y su
pronóstico.
En esta unidad se incluyen las pruebas de laboratorio más utilizadas en el estudio

del LCR, omitiéndose lo relativo al examen microbiológico e inmunológico que no
se revisan en esta experiencia educativa, ya que se consideran ampliamente en
sus respectivas experiencias.
El análisis del líquido cerebroespinal incluyen las siguientes determinaciones:
I. Examen Físico
a) Volumen
b) Presión
c) Color
d) Aspecto
e) Coagulación
2. Examen químico
a) Glucosa
b) Proteínas globulinas
c) Enzimas
3. Examen microscópico
a) Recuento celular total
b) Recuento diferencial
Análisis de líquido cefalorraquídeo I
Examen físico
b) color
c) aspecto
d) coagulación
E) densidad y pH
Material, equipo e instrumentación:
 Tabos de ensayo 13 x 100

 pipetas
 Papel indicador de pH
a) Color
El líquido cefalorraquídeo normal es claro, incoloro e inodoro. Las diferentes

coloraciones que puede tener son producidas por alteraciones patológicas excepto
cuando la coloración es debida a la presencia de sangre como resultado de una
punción traumática, esto se corrobora por ausencia de hemólisis al centrifugarse el
líquido, la presencia de esta es evidencia de hemorragia meníngea evidente.
A veces puede aparecer una coloración amarilla que se denomina xantocromía

(puede aparecer un rosa pálido o un naranja pálido). Muchas veces esta
xantocromía va acompañada de coagulación espontánea poco después de la
recolección. Las causas posibles de la xantocromía son:
1. Proteínas que sobrepasen los 100mg/100ml.

2. Punción traumática con lisis de eritrocitos.
3. Bilirrubina.
4. Por contaminación de mertiolato que se empleó para la desinfección de la piel.
5. Hemorragia intracerebral o subaracnoidea.
6. Carotenemia o metahemoglobinemia.
7. Oxihemoglobinemia.
8. Presencia de tumores en las últimas vértebras lumbares.
b) Aspecto
El aspecto del líquido cefalorraquídeo es transparente. Aparece el enturbiamiento
como resultado de elevadas densidad de población de elementos celulares o por
la presencia de contaminación bacteriana. La turbiedad del líquido puede variar
desde una ligera opalescencia típica de la meningitis tuberculosa, hasta un
aspecto más o menos purulento como en algunos casos de meningitis piógena.
En el reporte del resultado se anota si el líquido es transparente o turbio. Esta
turbidez se valora de 1 a 3 cruces.
c) Coagulación
Normalmente el líquido cefalorraquídeo carece de coagulación. Esta puede ocurrir

debido a una punción traumática o atribuirse a un nivel muy elevado de proteína
asociado con meningitis tuberculosa.
La detección de fibrina se manifiesta por la presencia de un retículo. En la
meningitis tuberculosa puede aparecer formada dicha película. En la meningitis
purulenta puede aparecer coágulos poco después de obtenida la muestra,
mientras que en la meningitis tuberculosa la coagulación es tardía.
d) Densidad y pH
El LCR es semejante en su composición al plasma, con un contenido mayor de

agua y una densidad de 1.007, lo que hace de su contenido de moléculas en
general sea ligeramente inferior al plasma. Carece casi totalmente de células,
tiene pocas proteínas y abundantes cloruros.
Solo en eventos patológicos se altera la cantidad de solutos en el LCR como en

alteraciones de la barrera hematoencefálica, inflamaciones de meninges,
rompimiento de vasos sanguíneos, entre otros.
El pH del LCR es 7.40 – 7.50 se determina con el potenciómetro o en su defecto

con papel pH.
Examen químico
a) determinación de glucosa
b) determinación cualitativa y cuantitativa de proteínas
Material, equipo e instrumentación

 tubos de ensaye de 13 x100 mm
 pipetas
 Centrifuga clínicas
 Baño María precalentado a 37oC
 Espectrofotómetro - celdillas
a) Determinación cuantitativa de glucosa.
La cuantificación de glucosa en LCR se hace igual que en las técnicas descritas

para suero y/o sangre completa. La glucosa en el LCR existe en cantidades muy
bajas comparada con la concentración de glucosa sanguínea (aproximadamente
20% menos).
Técnica
Revisar la técnica disponible.
Valores de referencia
En adultos la cantidad normal de glucosa varia de 50 a 75 mg/100 ml de líquido
cefalorraquídeo, en los niños hasta los 10 años es de 70 a 90 mg/100ml.
Interpretación clínica
El aumento de glucosa en líquido cefalorraquídeo se conoce como
hiperglucorraquia, se encuentra en todos los procesos hiperglucémicos, una ligera
hiperglucorraquia puede observarse en encefalitis epidémica y en la poliomielitis.
Cuando hay meningitis bacteriana, tuberculosa, micótica o carcinomatosa, la
concentración de glucosa suele estar disminuida (hipoglucorrquia), en el
mecanismo de producción de la hipoglucorrquia puede intervenir la intensa
actividad metabólica de las células en rápido crecimiento (neoplásicas y
microorganismos), la fagocitosis y trastornos de la glucosa.
b) Determinación de proteínas totales
El estudio de las proteínas del LCR es muy útil, se cuantifican a partir de 1 ml de

LCR, si las cifras son bajas, son insuficientes para el equilibrio ácido-básico del
LCR, por tanto como mecanismo compensatorio para los cationes se elevan los
cloruros. Las determinaciones de proteínas individuales como albúmina se hace
por métodos enzimáticos preferentemente y para globulinas se recomienda por
inmunodifusión radial o turbidimetría por las cantidades tan bajas que se
cuantifican. Los métodos presentados aquí para globulinas son de interés por su
facilidad operativa.
Técnica
Revisar la técnica disponible.
En recién nacidos hasta con un mes de vida se consideran normales valores de
hasta 100 mg/100ml; edades posteriores pueden ser normales concentraciones
que oscilan entre 20 a 44 mg/100ml. La cantidad de albúmina es de 15 a 30 mg%
y la de globulinas de 4 a 9 mg%, no detectadas por las técnicas habituales .
c). determinación de globulinas por la reacción de Pandy.
Fundamento
Las globulinas representadas principalmente por la fracción de Inmunoglobulinas,

en una solución saturada de fenol acuosa precipitan, produciendo una turbidez
visible microscópicamente.
Reactivo.
1. Solución saturada de fenol
Técnica.
1. En un tubo de ensaye se coloca 1 ml de reactivo y se agrega una gota de LCR.

2. Si el líquido es normal no aparece turbidez
3. Si la turbidez es marcada o aparece enturbiamiento débil, marcado o lechoso se
establecen los 3 grados de positividad correspondiente a +, ++, +++ en ese orden.
4. Esta reacción puede hacerse en vidrios de reloj, facilitándose la lectura sobre un

fondo negro.
Negativo
Los aumentos de proteínas de líquido cefalorraquídeo se presenta en cualquier

enfermedad inflamatoria aguda o crónica, enfermedades degenerativas (esclerosis
múltiple), alteraciones de la barrera hemato-encefálica y en muchos casos de
tumores cerebrales. El incremento suele ser leve, moderado y elevado de acuerdo
a la evolución del padecimiento.
Un aumento notable se da en los casos de compresión medular con obstrucción
total acompañado de coagulación masiva y xantocrómica (síndrome de Froin) y
por lo general cifras bajas de elementos celulares.
La meningitis aguda presenta elevación de las proteínas acompañada de

pleocitosis proporcional. En la meningitis crónica, principalmente las sifilíticas se
observan aumentos moderados de proteínas.
Puede observarse un ascenso ligero de la proteinorraquia con aumento

desproporcionado de elementos celulares en algunos procesos inflamatorios
agudos no infecciosos. Cuando las globulinas son positivas se revela que el
proceso paso a ser crónico. El índice de suero/LCR es útil para valorar daño en
barrera y síntesis local. Los siguientes padecimientos son considerados
afectaciones de barrera.
LCR/ suero < 160:
 Meningitis viral (neutrófilos y células mononucleares)

 Estados iniciales de meningitis bacterianas
 Accidentes de padecimientos no vasculares, inflamatorios polineuropatías
 Enfermedades degenerativas (esclerosis lateral amiotrópica, tumores

cerebrales malignos y benignos
 Hernia de disco vertebral

Análisis de líquido cefalorraquídeo II
Examen microscópico
a) Recuento total de células
b) Recuento diferencial con preparaciones teñidas
a) Recuento total de células
La celularidad se efectúa por el conteo total y diferencial de la muestra obtenida de

LCR, normalmente se encuentras de 0 a 5 células /mm3, elevándole en cualquier
proceso inflamatorio.
Es recomendable practicarlo dentro de una o dos horas de obtenido el LCR, ya

que los elementos celulares sufren modificaciones importantes. El recuento celular
debe efectuarse en forma minuciosa cuando el número de células esta levemente
o moderadamente elevados. Proporciona un dato diagnóstico diferencial de los
casos de meningitis tuberculosa, poliomielitis aguda, sífilis del SNC y encefalitis
letal. y se clasifica como sigue:
Leve de 5 a 50 células /mm3

Moderada de 50 a 200 células /mm3
Grave más de 200 células /mm3
Reactivos
1. líquido de dilución cristal violeta

 Laminas portaobjetos
 laminas cubreobjetos
 cámara de Neubauer
 Tubos de ensayo
 Pipetas
Técnica “A”
1. Se realiza una previa dilución del LCR con el liquido de dilución 1/10
2. Se carga la cámara de Neubauer y se esperan unos 5 minutos, para que

sedimenten las células y se efectúa el recuento.
3. Se cuentan todas las células contenidas en 9 cuadros grandes del número de
células se divide entre 9 y se multiplica por 100 para obtener el valor
correspondiente a un mm3.
Técnica “B”
1. Se homogeniza muy bien el LCR y se carga la cámara de Neubauer y se

esperan unos 5 minutos, para que sedimenten las células y se efectúa el recuento.
2. Se cuentan todas las células contenidas en 4 cuadros grandes (divididos en 16

cuadros pequeños) del número de células se divide entre 4 y se multiplica por 10
para obtener el valor correspondiente a un mm3.
Valores de referencia.
De 0 a 5 células / mm3.
Se denomina pleocitosis al número elevado de células el LCR, es común

encontrar cifras elevadas en las enfermedades neurológicas.
Un incremento de 10 a 100 células /mm3 se encuentran en casos de meningitis
tuberculosa, poliomielitis, neurosÍfilis, tumores cerebrales y medulares, etc. Se
observa un predominio de linfocitos.
Una pleocitosis de 100 a 500 células o mas /mm 3 es frecuente observarla en las
formas de meningitis con predominio de polimorfonuclerares.
b) Recuento diferencial con preparaciones teñidas
REACTIVOS
 .colorante para tinción de Wright
a) Preparación de la muestra
La muestra de LCR se centrifuga durante 10 minutos por 2500 rpm, no conviene

centrifugar a mayor velocidad por el riesgo de hemólisis. El Líquido sobrenadante
se separa cuidadosamente y es el que se emplea para las determinaciones
químicas, mientras que el sedimento se emplea para las preparaciones a teñir.
Técnica
1) Depositar una pequeña gota de material a estudiar sobre el portaobjeto limpio y

seco.
2) Hacer un extendido delgado tipo hematológico o bacteriológico.
3) Dejar secar a temperatura ambiente. Y teñir con la técnica de de Wright para
efectuar la diferenciación celular.
4)Una vez seca la preparación examínela al microscopio con objetivo inmersión,

cuente de 100 a 500 células (leucocitos) distinguiéndolos.
Valores de referencia.
Generalmente solo ser encuentra linfocitos y células epiteliales.
Interpretación clínica.
Una pleocitosis menor de 300 células / mm3 suele ser linfocitaria y una pleocitosis
mayor o excesiva generalmente existe predominio de granulocitos neutrófilos.
Cuando predomina linfocitos (linfocitosis) se trata de procesos subagudos o

crónicos, como meningitis tuberculosa, reacciones agudas no bacterianas,
neurosÍfilis, etc.
Predomina una neutrofilia en los procesos sépticos agudos atribuido a

meningococos, estreptococos, neumococos, entre otros procesos.
La aparición de Eosinófilos tiene valor significativo en el diagnóstico de

cisticercosis cerebral.
PRÁCTICA No.8
Análisis del líquido articular
1. Introducción
El estudio de este líquido tiene gran importancia en la valoración de la artritis, junto

con la exploración física y el estudio radiológico. Es especialmente importante en
las artritis monoarticulares, en las que tiene que establecerse el diagnóstico
diferencial entre el origen infeccioso y otras posibles causas.
El líquido sinovial es un ultrafiltrado del plasma qu ese acumula en las cavidades

articulares al que las células sinoviales del tipo B le agregan mucopolisacáridos
que contienen hialuronato, lo que le confiere una viscosidad característica. La
membrana sinovial es el tejido que recibe las vainas de los tendones, las bolsas y
las articulaciones diartradas excepto en su superficie articular.
Sus funciones principales son aportar nutrientes al cartílago articular, lubrificar la

cavidad articular y favorecer la excreción de sustancias de desecho.
En condiciones normales su cantidad es muy escasa. Los trastornos de la

membrana sinovial, la alteración en los elementos de sostén articular y la
presencia de cuerpos extraños pueden producir la acumulación de grandes
cantidades de líquido sinovial en las articulaciones.
El método de obtención del líquido sinovial es llamado artrocentesis, normalmente

la cantidad de líquido que contiene la articulación es reducido, entre 1 ml y 2 ml,
por lo que su obtención puede ser dificultosa. En algunas situaciones se pueden
acumularse en la articulación grandes cantidades de líquido sinovial, con lo cual la
toma puede realizarse fácilmente por aspiración.
2. Objetivo
Realizar todas las pruebas que comprenden el estudio del líquido sinovial
3. Procedimiento
Forma de realizar el examen
Se necesita una muestra de líquido sinovial para este examen. Este líquido
normalmente es espeso, de color claro o amarillo pálido, y se encuentra en
pequeñas cantidades en las articulaciones, en las bursas (sacos llenos de líquido
en las articulaciones) y en las vainas de los tendones.
Después de limpiar el área, el médico introducirá una aguja estéril a través de la

piel dentro del espacio articular. Una vez que la aguja esté en la articulación, se
extraerá el líquido a través de ésta hacia una jeringa estéril.
La muestra de líquido se envía al laboratorio. El técnico del laboratorio:

· Analizará el color y la claridad de la muestra.
· La colocará bajo un microscopio, hará el conteo del número de glóbulos rojos y
blancos, y luego buscará cristales (en caso de gota) o bacterias.
· Medirá la glucosa, las proteínas, el ácido úrico y la deshidrogenasa láctica (DHL).
· Hará un cultivo del líquido para ver si hay proliferación de alguna bacteria.
En el estudio del líquido sinovial, debería incluirse, un estudio bioquímico, un

estudio microbiológico que incluya tinción de Gram, y cultivo en medio aerobios y
anaerobios, recuento celular, y en la mayoría de los casos investigación de
microcristales. Si se sospecha un proceso tumoral será necesario un estudio
citológico.
Se debe evitar usar anticoagulantes en la toma de la muestra sobre todo si se va

ha hacer estudio de cristales por que el uso del mismo puede dar lugar a
artefactos que se puedan confundir. El líquido sinovial tiene una baja
concentración de fibrinógeno. Se debe evitar el contacto de la muestra con
soluciones que contengan ácido acético, ya que pueden provocar la precipitación
del ácido hialurónico.
Manipulación y transporte
Una vez obtenida la muestra, debe transportarse al laboratorio a la mayor
brevedad posible para evitar la degeneración celular. Si existe demora en el
transporte es necesario conservar la muestra refrigerada a una temperatura entre
2º y 8º C para reducir el metabolismo celular, e excepción de aquellas muestras
destinadas al estudio microbiológico, que deben transportarse a temperatura
ambiente.
Análisis macroscópico
El análisis del líquido sinovial debe comenzar en el mismo momento de la toma de
la muestra, ya que su observación macroscópica puede aportar una información
de gran valor, que permite orientar su clasificación en uno de los cuatro grupos
etiológicos con interés en el diagnóstico: no inflamatorio, inflamatorio, infeccioso y
hemorrágico.
Un líquido sinovial no patológico ha de ser incoloro y transparente, la presencia de

turbidez se debe asociar a un incremento de su celularidad. Muy a menudo puede
tener un color amarillento pálido que suele deberse a la diapédeis de algunos
eritrocitos e incluso puede estar asociada a un pequeño traumatismo.
Los líquidos que proceden de derrames no inflamatorios suelen contener un

número bajo de células y su aspecto es transparente. La presencia de turbidez se
asocia a un incremento en el número de leucocitos o hematíes, que se debe
confirmar mediante un estudio microscópico. La turbidez suele ser característica
de los derrames inflamatorios, que suelen ser menos claros y más amarillentos
según el número de leucocitos presentes en el líquido. Si el derrame es de origen
infeccioso hay gran inflamación articular y el líquido se vuelve opaco, turbio y a
menudo purulento con tonalidades que van del verde al marrón.
Si el aspecto del líquido es hemorrágico se puede deber a una hemartrosis o ser

consecuencial del traumatismo asociado a la toma de muestra, con lo cual tras el
centrifugado el sobrenadante será claro mientras que en el caso primero no habrá
cambio alguno.
Con frecuencia podemos observar presencia de restos celulares, cristales de

diferente naturaleza, fibrina o coágulos de restos celulares degenerativos que
hacen que cambie el color o la turbidez.
La viscosidad del líquido sinovial refleja el grado de polimerización del ácido

hialurónico y es una característica de los derrames no inflamatorios, si el derrame
es inflamatorio la viscosidad del líquido esta disminuida debido a la acción de la
hialuronidasa presente en los neutrófilos.
Estudio microscópico
Es una parte fundamental del estudio del líquido junto con el análisis
microbiológico. Este deberá incluir un recuento celular total y diferencial, así como
la investigación de la presencia de cristales.
- Recuento celular total:
Constituye el rasgo más importante del examen citológico del líquido sinovial ya
que refleja el grado de inflamación articular. Se debe realizar lo antes posible tras
su extracción para evitar la degeneración celular, y en caso de que el estudio
microscópico no se pueda hacer dentro de las primeras 24 horas, las muestras
deberán ser conservadas en el frigorífico con ácido etilendiaminotetraacético
(EDTA).
El recuento se hace en cámara de recuento con el aumento de x40. El frotis se

debe teñir con Papanicolaou, May Grünwald-Giemsa o panóptico y ofrecen una
buena observación de la morfología celular. Si contiene gran cantidad de hematíes
que dificulten el recuento, se usará una solución salina para provocar la lisis de los
mismos.
Por lo general se considera que los recuentos celulares superiores a 1000 células
/ul están asociados a alteraciones inflamatorias y los recuentos inferiores a
200células/ul representan bajo grado de inflamación articular, como ocurre en la
osteoartritis. En la artritis reumatoide se observan recuentos celulares de entre
2000 y 75000 células/ul, y en recuentos superiores a 50.000 células/ul son
indicativos de infección articular.
- Recuento diferencial:
Para este recuento debe usarse la tinción de May Grünwald-Giemsa. En el líquido
sinovial se observan los mismos elementos celulares que en la sangre, aunque en
diferentes proporciones y con morfología variable en función de la intensidad de la
respuesta inflamatoria articular.
La eosinofilia se puede dar en casos de artropatías asociadas a reacciones

alérgicas, enfermedades parasitarias y carcinomas metastásicos, pero
generalmente es infrecuente.
Se observa monocitosis en artritis asociadas a infecciones virales, y de forma

menos infrecuente, en los procesos inflamatorios crónicos. Aportan un aspecto de
células espumosas, como se observa en infecciones con micobacterias atípicas.
Las células sinoviales tienen gran tamaño y un núcleo redondeado que ocupa
hasta el 50% del citoplasma, y que puede aparecer vacuolado homogéneo y sin
gránulos.
- Cristales:
La presencia de cristales en el líquido sinovial es de gran importancia para el
diagnostico de las artropatías, pero su identificación no es fácil, ya que requiere un
equipamiento adecuado.
El análisis de los cristales debe hacerse en una muestra fresca que mantenga la
integridad celular, sobre todo en el caso de los cristales de pirofosfato cálcico que
a menudo se localizan en el interior de las células.
Es necesario el uso de un microscopio de luz polarizada con un compensador rojo

de primer orden.
Los tipos de cristales que podemos encontrar en una muestra de líquido sinovial
son:
a. Cristales de urato monosódico. Suele tener forma de agujas o bastones de 3

a 5 micras de largo.
b. Cristales de pirofosfato cálcico. Tienen forma de bastones o romboides,

pueden ser polimorfos, y aparecer como cuadrados, pequeñas esferas
puntiformes.
c. Cristales de hidroxiapatita y otros cristales de fosfatos básicos y brusita.

Adoptan formas de pequeñas esferulas pero pueden presentarse como
fragmentos irregulares y masas amorfas de gran tamaño. Los cristales de brusita
tienen forma de rectángulos o romboides y tienen birrefrigencia positiva
d. Cristales de oxalato cálcico. Pueden tener forma de sobre de carta.
e. Cristales de colesterol. Tendrán diversas formas de rectángulos, bastones,

agujas rectas o curvas. Los más característicos son los que aparecen como
láminas rectangulares o cuadrados con una muesca en uno de sus ángulos,
pudiendo medir 100 micras.
f. Cristales de esteroides. Son frecuentes y generalmente secundarios a

infiltraciones con esteroides antiinflamatorios. Pueden adoptar diferentes formas y
su birrefrigencia es intensa con elongación positiva y negativa. Persisten en el
líquido sinovial varios meses después de la infiltración.
Valores bioquímicos y otros valores
Generalmente el estudio bioquímico del liquido sinovial suele tener poco interés ya
que con la excepción de la determinación de la glucosa.
Para el estudio bioquímico se utiliza el sobrenadante, obtenido tras la

centrifugación del líquido previamente tratado con hialuronidasa.
Glucosa
La interpretación adecuada de los valores de glucosa en el líquido sinovial
requiere una comparación con los niveles en suero, obteniendo de forma ideal,
tras 8 horas de ayuno para permitir el equilibrio de la glucosa a través de la
membrana sinovial.
El nivel de glucosa en el líquido sinovial es similar al de la glucemia en los

procesos no inflamatorios y está disminuido en los inflamatorios infecciosos.
Si los valores son inferiores a la mitad indican artritis séptica.
Proteínas
El aumento de las proteínas totales es un reflejo del aumento de la permeabilidad
vascular, por lo que no reviste mayor interés clínico.
Lactato
Niveles de lactato superiores a 15mmol/l suelen asociarse con artritis séptica.
Niveles inferiores no descartan infección.
pH
Ha de ser inferior a 7,4 en los líquidos sinoviales.
Lactato deshidrogenasa
Aumenta en los inflamatorios e infecciosos y refleja el infiltrado leucocitario.
Colesterol
Aumentado en la artritis reumatoide crónica.
4. Conclusiones.
__________________________________________________________________
PRÁCTICA No.9
Estudio físico del líquido seminal: determinación del volumen de

eyaculado, licuefacción, consistencia, apariencia y pH.
Siendo la esterilidad un problema médico frecuente y de alta repercusión en la

vida de una pareja, es importante la aportación del laboratorio clínico en la
investigación de la causa que la origina para poder establecer conductas
terapéuticas.
Es conveniente mencionar que los términos esterilidad e infertilidad para muchos

autores significan lo mismo, incapacidad de producir un fruto. Pero empleando un
criterio más amplio se considera una pareja estéril cuando después de un año de
haber dejado de usar anticonceptivos la mujer y de tener relaciones sexuales
conyugales normales, no hay embarazo. Sin embargo, cuando hay embarazo pero
aborta en forma repetida y cuando se logra un hijo, pero después tiene abortos
repetidos o no llega a embarazarse a esta pareja se le considera infértil.
Inicialmente el laboratorio se limitaba a estudiar el semen directamente para

averiguar alteraciones cualitativas y cuantitativas de espermatozoides, sin
embargo actualmente se considera que la esterilidad es un problema de la pareja
por lo que se han elaborado procedimientos para estudiar al mismo semen pero
en medio ambiente vaginal tratando de investigar si existen causas locales (pH,
infecciones, etc.) que dificulten el paso de los espermas a través del canal
cervical.
Otras aplicaciones importantes del estudio del semen es en el campo de medicina

legal, en los problemas específicos de exclusión de paternidad alegando
esterilidad, en los casos de violación o estupro alegada o sospechada,
demostrando la ausencia o presencia de líquido seminal en materiales biológicos y
otros materiales diversos. Finalmente otro interés del examen es, en el control de
natalidad utilizándose para comprobar la eficiencia de una vasectomía. En esta
unidad se describen procedimientos de laboratorio utilizados más frecuentemente
para estudiar al líquido seminal.
El estudio del semen consta de tres tipos de exámenes que son el físico, químico
y microscópico, estos a su vez incluyen las siguientes determinaciones:
I. EXAMEN FÍSICO
a) Volumen
b) Color
c) Aspecto
d) Viscosidad y licuefacción
e) pH
II. EXAMEN MICROSCÓPICO

a) Recuento
b) Motilidad
c) Vitalidad
d) Morfología
III. EXAMEN QUÍMICO

a) Capacidad fecundante
b) Fosfatasa ácida
c) Fructosa
.
Obtención de la muestra
Para asegurar una mejor calidad del semen es conveniente que el paciente se
someta a un régimen de abstinencia sexual que comprenda por lo menos 4 días
antes de la prueba. La muestra debe depositarse de preferencia en recipientes de
vidrio de boca ancha, de color ámbar, perfectamente limpios, los recipientes
también pueden ser los contenedores habituales de plástico. El frasco que recibirá
la muestra deberá estar a temperatura corporal en el momento de la eyaculación,
a fin de no afectar la vitalidad-movilidad de los espermatozoides. Si la muestra se
obtiene fuera del laboratorio debe ser trasladada inmediatamente a éste,
procurando mantenerla lo más cerca del cuerpo para que la temperatura no
disminuya. El frasco que contenga la muestra debe rotularse de la siguiente
manera: Si durante el transporte o la manipulación de la muestra parte de ella se
pierde (por eyaculación incompleta, derrame, etc.) una muestra así no es
representativa por tanto no es útil para el análisis.
- Nombre del paciente

- Fecha
- Hora de eyaculación
- Días de abstinencia sexual.
La EspermatobioscopÍa directa tiene como objetivo investigar si la calidad y la cantidad de
líquido seminal son las adecuadas para lograr la fertilización.
Examen físico
A) Volumen
B) Color
C) Aspecto
D) Viscosidad y licuefacción
E) pH
rial para la prueba
 tubos de ensaye de 13 x100 mm

 pipeta lineal de 10 ml (1/10)
 pipeta Pasteur con bulbo
 Varilla de vidrio
 aplicadores de madera
 portaobjetos
 papel indicador de pH
 gradilla
Instrumentación
No necesaria
a) Volumen
El volumen varía ampliamente de 1.0 a 1.6 ml aproximadamente. La mayor parte

de líquido seminal está constituido por la secreción de vesículas seminales y la
prostática y una menor proporción de secreciones de las glándulas bulbo
uretrales.
La determinación del volumen se hace ocupando una probeta o pipeta graduada

de 10 ml. Cuando la cantidad de líquido seminal es muy escasa se reporta como
menos de 0.5 ml o unas pocas gotas.
Se han considerado infértiles aquellos sémenes con volúmenes menores de 1.5
ml, aunque las pruebas de morfología y motilidad se encuentran normales.
También caen dentro de esta consideración aquellos, sémenes con volúmenes

elevados cuyo número de espermatozoides esté debajo de los 60 millones por ml.
Que es el caso más común en los matrimonios estériles.
b) Color
Generalmente el líquido seminal es de color blanco grisáceo a blanco amarillento.

Un color amarillo puede observarse en la abstinencia sexual prolongada y amarillo
intenso en los casos que hay pus (piospermia). Generalmente no hay relación
entre la cantidad de leucocitos y la intensidad del color amarillo del semen.
Un color café-rojizo se debe a sangre hemolizada como se observa en casos de

vesiculitis seminal y protática. Un color rojo se debe a la presencia de sangre
(hemospermia) que se encuentra en prostatitis y traumatismos. Un color verdoso
puede deberse a infección por pseudomonas.
c) Aspecto
El líquido seminal recién emitido tiene un aspecto heterogéneo (8) ya que se

encuentra en forma de coagulo, muy viscosos y opaco, después de transcurrida la
licuación se hace homogéneo. La turbiedad se relaciona con la densidad de la
población celular por lo que depende del número de los espermatozoos, los
leucocitos, los eritrocitos y algunos microorganismos.
d) Viscosidad y licuefacción
La secreción espermática recién eyaculada exhibe una gran viscosidad, seguida

de una licuefacción que se completa entre 15 y 30 minutos adquiriendo un aspecto
homogéneo.
La viscosidad tiene cierta importancia sobre todo cuando los espermatozoides

presentan vitalidad y movilidad inferior a lo normal. La determinación de la
viscosidad es muy sencilla y consiste en agitar fuertemente el esperma contenido
en le frasco con una varilla de vidrio, se retira la varilla suavemente calculando al
levantarla la longitud del filamento formado.
Otro procedimiento consiste en colocar una gota de semen (homogeneizado y
después de la completa licuefacción) sobre un portaobjetos y ayudándonos con un
palillo proseguir en la forma ya descrita. Se considera normal una viscosidad de 2
a 5 mm. La licuación depende de las fibrinolisinas potente presentes en
condiciones normales. La viscosidad disminuida se presenta generalmente en
sémenes con muy pocos espermatozoides. La viscosidad aumentada puede
interferir en la movilidad de los espermatozoides y suele observarse en prostatitis
crónica y vesiculitis seminal.
e) pH
El esperma recién emitido tiene un pH ligeramente alcalino que varía de 7.3 a 7.5 ,
esta determinación se hace lo más pronto posible debido a que en contacto con en
el medio ambiente el semen se va alcalinizando pudiendo llegar hasta un pH de 8.
Examen químico
a) Capacidad fecundante
b) Fosfatasa ácida
c) Fructosa
a) Determinación de la capacidad fecundante.
Fundamento
Los espermatozoides consumen oxígeno y producen sustancias oxidadas que

disminuyen el potencial oxido-reducción hasta valores negativos. El grado de
variación de dicho potencial dependerá del número de espermatozoides y la
intensidad del metabolismo de los mismos. La variación se mide añadiendo un
indicador como el azul de metileno que en estado reducido es azul y al oxidarse se
vuelve incoloro.
Reactivos:
 solución de azul de metileno 0.01%
 tubo de ensaye de 13 x 100 mm

 pipetas lineales de 1 ml
 tubos capilares de 3 x 200 mm
 plastilina
 gradilla
 Estufa a 37oC
Técnica:
1.En un tubo de ensayo se coloca volúmenes iguales de esperma y azul de

metileno (por ejemplo 1 ml de colorante y 1 ml de esperma), el cual deberá estar
completamente licuado hasta con una hora de emitido, mezclar.
2. Se utilizan 2 tubos capilares, en uno de ellos se coloca la mezcla anterior

(problema) y en el otro que se usa como testigo se carga con solución de
colorante.
3. Se sellan con plastilina los extremos de los tubos y se colocan en la estufa a

37 º C. Se anota la hora y se hacen observaciones cada 5 minutos hasta
determinar el momento en que comienza la decoloración.
4. Se anota este tiempo y se continúan las observaciones hasta que se complete

la decoloración total. Se informa el tiempo del comienzo de la decoloración y el
tiempo de la decoloración total.
Valores de referencia:
Cuando la fertilidad es óptima la decoloración se produce en 15 a 30 minutos y

cuando es moderada de 60 minutos aproximadamente.
b) Determinación de fosfatasa acida
Revise la técnica disponible y ajústela a las condiciones de determinación, o bien

emplee el método tradicional que a continuación se describe.
La fosfatasa ácida del líquido seminal es de origen prostático casi exclusivo se

halla en concentraciones muy altas comparado con la concentración de fosfatasa
ácida sérica, por ello es necesario efectuar diluciones convenientes antes de
realizar la determinación. La determinación de esta enzima se realiza por los
métodos habituales empleados para las muestras séricas. Es común emplear el
método de Bessey & Lowry Broock que se basa en la hidrólisis del p-
nitrofenilfosfato catalizada por la enzima fosfatasa ácida liberando p-nitrofenol, que
en un medio alcalino se transforma en p- nitrofenolato de sodio que es un ión
amarillo cuya intensidad es proporcional a la actividad de la enzima presente en la
muestra
Reactivos:
 solución tamponada de ácido cítrico-citrato de sodio
 sustrato tamponado: p-nitrofenilfosfato NaOH 0.02 N
 solución estándar de p-nitrofenol
 solución de calibración de p-nitrofenol

 gradilla
 plastilina
 Baño maría a 37oC
 Espectrofotómetro
Técnica:
1. Diluir el esperma 1:100 y 1:1000 con solución salina isotónica

2. En 3 tubos de ensayo marcados como blanco, problema 1 (%) y problema 2
(%o), agregar 1 ml de sustrato tamponado. Llevar a baño de agua a 37oC por 3
minutos.
3. Agregar a los problemas 0.2 ml de dilución del esperma respectivamente.
Incubar a 37º C durante 30 minutos.
4. Retirar del baño y agregar a cada tubo 10 ml de NaOH al 0.02 N. En este
momento agregar 0.2 ml de la dilución del semen al tubo blanco. Mezclar por
inversión los tubos.
5. Leer la absorbancia llevando a cero con el blanco 400 nm.
6. Interpolar en la curva de calibración.
7. Multiplicar por el factor de dilución (1000).
De 55 000 a 137 500 mUI / ml
Curva de calibración.
1. En 5 tubos de ensaye marcados respectivamente como T1, T2, T3, T4 , T5 ,

depositar 1 ml de sustrato tamponado a cada tubo.
2. Incubar a 37 º C durante 5 minutos. Agregar a cada tubo 0.2 ml de las
soluciones de calibración de p-nitrofenol respectivas
3. Incubar durante 30 minutos a 37 º C.
4. Retirar y agregar inmediatamente 10 ml de NaOH 0.02 N, mezclar por inversión
los tubos.
5. Leer en absorbancia a 400 nm, ajustando a cero con el blanco de reactivos.
6. Graficar en papel semilogarítmico. Colocando en las abcisas las
concentraciones de los testigos en mU/I y en el eje de las ordenadas las
densidades ópticas.
Cálculos:
Para convertir las concentraciones de los testigos en mUI/ml, recordar que

micromol /litro es igual 1 UI/ litro.
c) Determinación de fructosa.
Fundamento:
Está basado en el calentamiento de la fructosa en presencia de HCL resorcinol

(Reactivo de Seliwanoff) produce el oxi-metil-furfural que con la resorcina produce
un compuesto de color rojo cuya intensidad es proporcional a la concentración de
este carbohidrato en la muestra de líquido seminal.
Reactivos:
 solución de resorcina al 0.1 %

 solución clorhídrica al 30 %
 solución madre de fructosa al 1 %
 solución testigo de fructosa

 gradilla
 Baño maría a 80oC
 Espectrofotómetro
Técnica
1. Se diluye el esperma 1: 10 y 1: 100 en solución salina isotónica..
2. En unos tubos marcados como problema se colocan 2 ml de la dilución de
esperma. En otro tubo marcado como blanco se colocan 2 ml de agua y a otros 3
tubos marcados con T1, T2, T3, colocar 2 ml de cada dilución testigo.
3. A cada tubo se agregan 2 ml de solución de resorcina y 6 ml de solución
clorhídrica. Se agitan.
4. Colocar todos los tubos en baño de agua a 80 º C durante 8 minutos. Se retiran
los tubos y enfriarlos.
5. Leer a 520 nm ajustando a 0 de absorbancia con el blanco.
6. Graficar en papel milimétrico las lecturas obtenidas de los testigos.
7. Interpolar la lectura del problema en la gráfica obtenida
Preparación del desproteinizado del semen
Reactivos
1.-Solución de NaOH 0.1 M (50 ml)
2.- Solución de Sulfato de Zinc 1.8% (p/v) (50 ml)
 Diluya el semen 1:50 con agua destilada, agregando 0.l ml de semen a 4.9
ml de agua destilada
 Coloque l ml de semen diluido en un tubo de 13 x 100 mm.
 Agregue 0.3ml de sulfato de Zinc y mezcla.
 Agregue 0.2 ml de NaOH y mezcle perfectamente.
 Deje en reposo 15 minutos y centrifugue a 3400 rpm por 10 minutos.
 Separe cuidadosamente el sobrenadante para realizar la cuantificación de

fructosa.
Valor de referencia
De 200 a 400 mg/100 ml

Considere factible la desproteinización del semen para que la turbidez natural de
esta muestra no interfiera en los resultados colorimétricos.
PRÁCTICA No. 10
Estudio celular del líquido seminal, motilidad, vitalidad, recuento
y morfología espermática.
El examen microscópico del liquido seminal comprende:

a) Recuento
b) Motilidad
c) Vitalidad
d) Morfología
a) Movilidad
 portaobjetos
 cubreobjetos
 pipetas Pasteur
 gradilla
 Microscopio binocular
Técnica
1. Después de que la licuefacción se ha completado se coloca una gota de semen

entre portaobjetos y cubreobjetos. Previendo mezclar la muestra por inversión
antes de tomar la gota de muestra.
2. Utilizando el objetivo seco fuerte de microscopio se cuenta por separado el

número de espermatozoides: inmóviles o acinéticos; con motilidad in situ y con
movilidad de progresión (la que puede ser rápida o lenta), presentes en diez
campos (aproximadamente 200 espermatozoides como mínimo).
3. Se informa en por ciento el promedio de espermatozoides en cada una de las

cuatro categorías mencionadas.(MPR, MPL, MI, Inmóviles)
4. Además de observar la motilidad de los espermatozoides se busca la presencia

de leucocitos, eritrocitos, células epiteliales, piocitos, cristales, parásitos y hongos.
Normalmente después de las 2 horas de eyaculación un 60 a 70 % de
espermatozoides muestran movilidad progresiva rápida. De 6 a 8 horas la
movilidad es de un 25 a 40 %. Las formas móviles disminuyen alrededor del 5 %
por hora después de la cuarta hora de la recogida.
Con respecto a la presencia de otros elementos formes, hallados en el semen se

considera dentro de lo normal el hallazgo de varios cristales y células epiteliales;
no es común encontrar eritrocitos, valores de leucocitos hasta 4.7 por 10 6 ml de
eyaculado.
Cuando la motilidad es elevada pero está reducida a espermatozoides móviles in

situ o con movimientos progresivos lentos, no existiendo espermatozoides con
movimientos progresivos rápidos, el semen no tiene la capacidad fecundante y se
habla de una astenozoospermia absoluta a valores menores del 30 %.
b) Valoración de la morfología del espermatozoide
i) Técnica de tinción de Schaudin

ii) Técnica de tinción de Wright
i) Técnica de tinción de Schaudin
Las formas normales y anormales del espermatozoide se determinan en

extensiones teñidas, mediante recuentos diferenciales.
Reactivos
 solución de Shaudin (solución acuosa de bicloruro de mercurio)
 alcohol al 50 %
 solución de tintura de iodo
 solución acuosa de eosina al 5 %.
 solución acuosa de hcl
 hematoxilina
 solución de ácido acético glacial
 agua destilada.
 cajas Coplin
 portaobjetos
 aplicadores de madera
 pipetas Pasteur
 gradillas
 pinzas para tinción
Técnica:
1. Las extensiones se preparan en portaobjetos limpios de modo idéntico a la

sangre. La mejor tinción para un detalle morfológico mejor es el método de
Papanicolaou, otro también satisfactorio es el que a continuación se describe.
2. Se hacen frotis delgados sobre portaobjetos. La mejor manera de prepararlos

es seguir la técnica de suspensiones bacterianas utilizando un palillo en lugar de
una asa de platino. Los frotis preparados por la técnica de las extensiones
sanguíneas no son muy recomendables.
3. Fijar con un solución de Shaudin sumergiendo un minuto en la solución de

bicloruro de mercurio. Secar.
4. Sumergir durante medio minuto en alcohol al 50 % . secar
5. Sumergir durante medio minuto en un solución de iodo, lavar con agua

corriente.
6. El frotis se colorea sumergiéndolo medio minuto en una solución acuosa de

eosina al 5 %, secar y sumergir un minuto en una solución de HCl, lavar con agua
destilada. Sumergir durante dos y medio minutos en hematoxilina.
7. Secar y sumergir las preparaciones en una solución de ácido acético glacial en

dos tiempos de 15 segundos. Lavar con agua destilada, entre los tiempos, secar y
observar al microscopio.
8. Se cuentan de 100 a 200 espermatozoides que con este método se colorean el

núcleo azulado y el citoplasma rojizo. Se establece el porcentaje de formas
anormales con respecto al tamaño, forma y disposición nuclear.
Normalmente no deben encontrase anomalías morfológicas (doble cabeza ,

macrocefalia, microcefalia, cabeza periforme, cabeza amorfa, cuerpo o cola
defectuosa, etc. ) en más del 25 % del total de los espermatozoides. Más del 25 %
de espermatozoides anormales tiene importancia en relación con la esterilidad.
c) Recuento de espermatozoides
Prueba de Macomber y Sauders
Fundamento
La cuantificación de espermatozoides se obtiene de la misma forma como se hace

para los leucocitos. El líquido de Macomber y Sauder contiene bicarbonato de
sodio que impide la acción del moco, fluidificándolo y permitiendo una mejor
visualización de los espermas y el formol los inmoviliza.
REACTIVOS
1. Líquido de Macomber y Sauders
 pipetas
 tubos de ensaye de 12 x 75 mm
 gradilla
Técnica:
1. Antes de cargar la pipeta de cuenta glóbulos, la muestra debe homogeneizarse

perfectamente puesto que en el semen hay espermatozoides móviles e inmóviles,
sedimentando en el frasco estos últimos. La homogeneización debe hacerse por
rotación cuidadosa evitando la formación de espuma. Cuando los sémenes son
muy viscosos es necesario rotar mucho la muestra para homogeneizar lo mejor
posible y cargar 2 pipetas Thoma promediando los resultados.
2. Con un pipeta para glóbulos blancos se aspira semen hasta la marca de 0.5 y
luego el líquido de dilución hasta la marca de 11 (dilución 1:20), si el número de
espermatozoides es muy bajo, conviene aspirar semen hasta la marca de 1 de la
pipeta (dilución 1:10 ).
3. Se agita vigorosamente la pipeta hasta que el líquido en la porción ámpula sea

homogéneo.
4. Se desechan las 3 primeras gotas y se carga la cámara cuenta glóbulos.

5. Se cuentan los espermatozoides en 4 mm cuadrados. Para el cálculo se
multiplica por dilución y por corrección de la profundidad de la cámara (10) para
obtener la cifra por mm3 y finalmente por 1000 para obtener la cifra por mililitro.
60 por 106 o más por mililitro a 150 a 200 x 106 en la eyaculación completa. La
mínima normal es de 40 x 106 /ml. Se ha encontrado que las cuentas bajas de
espermatozoides se relacionan frecuentemente con la subfertilidad y a veces con
la infertilidad del hombre
d) prueba de vitalidad de los espermatozoides inmóviles
i) Prueba de hurgo y di Paola
Fundamento:
Se basa en la propiedad de la eosina de colorear únicamente las células muertas

y no las vivas. Debido a que los espermatozoides muertos pierden la capacidad de
controlar la selectividad de su membrana.
Reactivos
1. Reactivo de eosina al 0.5 %.
 pipetas
 tubos de ensaye de 12 x 75 mm
 gradilla
Técnica
1. En un portaobjetos se colocan volúmenes iguales de semen y reactivo (puede

ser desde 30 μІ ó hasta una gota, se mezclan y se deposita un cubreobjetos. La
observación microscópica se hace dentro de las dos primeras horas de recogido el
semen.
2. Una vez mezclado el semen con el reactivo, se esperan 5 minutos y se observa

al microscopio.
3. Se cuentan 200 elementos , teniendo en cuenta las tres categorías siguientes:

a) Espermatozoides muertos coloreados
b) Espermatozoides vivos inmóviles no coloreados
c) espermatozoides vivos móviles no coloreados
4. Reportando diferencias de vitalidad cinética y estática.
A los 30 minutos de eyaculación es normal encontrar el 80 % de espermatozoides

móviles y el 20 % de inmóviles, de los cuales el 16 % son coloreados (muertos) y
el resto (4 %) son no coloreados o sea vivos inmóviles
El aumento de espermatozoides vivos con movimientos in situ y de

espermatozoides muertos está relacionado con la subfertilidad masculina. Ya que
los espermatozoides tienen que atravesar el moco cervical a los pocos minutos de
la eyaculación, y si hay un aumento de los espermatozoides muertos e inmóviles
vivos en esta prueba, el número de espermatozoides móviles al atravesar el moco
cervical va a disminuir por el pH bajo de las secreciones vaginales.
Unidad VI: Marcadores tumorales
Las diferencias entre la célula normal y la neoplásica pueden ser utilizadas para el
diagnóstico del cáncer, especialmente en etapas precoces de la enfermedad.
Estas diferencias, desde el punto de vista morfológico y estructural, han sido
empleadas clásicamente para establecer el diagnóstico de neoplasia. Más
recientemente se ha podido demostrar que dichas diferencias van acompañadas
por cambios bioquímicos, inmunológicos y genéticos, algunos de los cuales
pueden ser detectados a nivel periférico.
La detección de estos cambios es uno de los fines primordiales de la investigación

oncológica. Los avances en estos campos han dado lugar a lo que hoy se conoce,
genéricamente, como marcadores tumorales.
El término marcador tumoral, desde el punto de vista clásico del laboratorio clínico,
se aplica a toda sustancia producida por las células tumorales o por el “huésped”,
cuya presencia puede ser detectada en el suero u otros líquidos biológicos, y que
es susceptible de utilizarse en la detección precoz, diagnóstico, pronóstico,
diagnóstico precoz de recidivas o control evolutivo del tumor. Por tanto, los
marcadores tumorales se comportan como indicadores, o señales a distancia de la
presencia de una neoplasia. Desgraciadamente estos marcadores no son
específicos de las neoplasias, pudiendo encontrarse concentraciones apreciables
en gran número de situaciones fisiológicas o patológicas no tumorales. Por este
motivo, es importante destacar que los cambios que se deben apreciar en un
determinado marcador tumoral son fundamentalmente cuantitativos, es decir, la
señal de alarma aparece cuando existen incrementos anormales en las
concentraciones del mismo.
Esta definición afecta únicamente a los marcadores tumorales circulantes (a los

que se refiere este primer documento), ya que a nivel tisular y sin expresión
periférica, existen una serie de marcadores que son igualmente útiles para el
estudio y caracterización de los tumores malignos.
PRÁCTICA No 11
Determinación de la hormona GONADOTROPINA CORIÓNICA

HUMANA (HCG)
1. Introducción
La gonadotropina coriónica humana (HCG), también conocida como β- HCG, es

una glicoproteína compuesta por dos subunidades α y β. Al contrario que la
subunidad α, la β es inmunológicamente diferente a otras hormonas como LH,
FSH o TSH, otorgándole esta especificidad, su utilidad como marcador tumoral. La
subunidad β de la HCG tiene un 82% de similitud con dichas hormonas
hipofisarias, y es la responsable de sus propiedades biológicas.
Sus niveles suelen estar elevados en pacientes con tumores de células germinales
de origen gonadal y extragonadal y en enfermedad trofoblástica gestacional,
aunque también en neoplasias epiteliales malignas como el carcinoma de mama,
pulmón, vejiga y tumores gastrointestinales. Son elevados también en algunas
personas con tumores de las células germinales mediastinales (cáncer en el
mediastino, en la parte media del pecho), que tienen su origen a partir de las
mismas células que los tumores de las células germinales en testículos y ovarios.
Los niveles de HCG son útiles para diagnosticar estas afecciones y pueden ser
observadas durante el tratamiento para comprobar su efectividad. También es útil
en detectar la recurrencia de cáncer una vez que ha terminado el tratamiento.
El 20-60% de los varones con tumores de células germinales, presenten un

aumento de HCG en suero, esto ocurre sobre todo en el coriocarcinoma y en
menor proporción en el carcinoma embrionario y en tumores mixtos con
sincitiotrofoblasto. En un 10-15% de los pacientes diagnosticados de seminoma,
también se eleva la HCG en el momento del diagnóstico, sin que ello implique un
peor pronóstico con respecto a los que padecen un seminoma no secretor de HCG
cuando se compara estadio a estadio.
2. Objetivo:
Determinar los niveles de la hormona gonadotrofina corionica en muestras

sanguíneas, mediante el uso de un equipo automatizado
3. Material, equipo e instrumentación:
 Equipo automatizado
 Muestras sanguíneas
4. Técnica:
Los alumnos seguirán las recomendaciones del tutor de prácticas para la
preparación de las muestras y el manejo correcto del equipo
5. Valores de referencia:
Los alumnos determinaran con ayuda el tutor de prácticas los niveles de β – HCG
de diferentes muestras
6. Conclusiones:
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Unidad V: Gasometría y Electrolitos.
El mantenimiento de la concentración de hidrogeniones en niveles lo más
constantes posibles es una condición de mayor importancia para la buena
conservación de la vitalidad celular. Al avanzar la evolución biológica fue
limitándose más y más la zona óptima de la concentración de hidrogeniones
necesaria para el desarrollo de los procesos bioquímicos. En el ser humano esa
concentración es de unos 80 mmol/l a nivel intracelular. Teniendo en cuenta que
en las formas superiores de vida mucho es mayor el peligro de intoxicación por H+
que el existente por OH- parece significativo que los valores de referencia
plasmáticos y del compartimiento extracelular en general sean menores que los
del espacio intracelular. A nivel sanguíneo, la concentración normal de
hidrogeniones oscila entre 35 y 42 mmol/l, equivalente a un valor de pH sanguíneo
de 7.38 a 7.45. La concentración de hidrogeniones en sangre proporciona una
información útil acerca de la situación a nivel intracelular, por lo que la
determinación del pH es absolutamente indispensable en aquellos enfermos en los
cuales se desea un examen exacto de su equilibrio ácido-base.
La determinación que se revisará en el laboratorio es la cuantificación de
bicarbonato sérico.
Obtención de muestras sanguíneas para exámenes del equilibrio ácido-

básico y gases sanguíneos
1. obtención de muestra sanguínea.
a) sangre arterial.
Indudablemente los resultados más exactos se obtienen mediante la extracción de

sangre arterial a partir de las arterias braquial, radial o femoral, los resultados algo
diferentes se obtienen por punción de la arteria yugular. La extracción sanguínea
se ejecutará en condiciones anaerobias.
2. Jeringas o recipientes de extracción.
a. Jeringas de plástico desechables.
Estarán perfectamente selladas, el calibre de la aguja puede variar de 20, 21 x 32

ó 38 mm, sin embargo pueden emplearse calibres desde 19 hasta 25, sin producir
modificación en la calidad de la muestra. Para eliminar espacios vacíos se utilizará
una solución de 1000 unidades de heparina sódica que ocupará el espacio entre la
aguja y la jeringa.
b. Sistemas anaerobios.
Consisten en tubos al vacío heparinizados, sin embargo debe tenerse presente

que deben llenarse totalmente dado que de lo contrario se produce una caída de
pCO2 y un ascenso de pH.
c. Capilares heparinizados.
El tamaño de los capilares se ajusta a los requerimientos del equipo automatizado

empleado.
3. Conservación de muestras
La muestra empleada para determinaciones de gases sanguíneos ha de ser

procesada inmediatamente, de lo contrario deberá conservarse en refrigeración
hasta por 20 minutos, tomando en cuenta que los valores pueden variar hasta en
un 10%.
PRÁCTICA No. 12
Determinación de sodio/potasio/cloro. Método Ión
Selectivo
INTRODUCCIÓN
SODIO: La prueba del sodio sérico es una medida del catión principal
(electrolítico, carga positiva) en el espacio vascular, componente del líquido
extracelular. Deberá considerarse una medida proporcional, la proporción entre
sodio y agua, más que una medición directa del sodio corporal total. El sistema
amortiguador del bicarbonato de sodio es uno de los principales controles renales
de las concentraciones de iones hidrógeno, que convierten al sodio en un catión
importante para la conservación del equilibrio acidobásico corporal y también para
la distribución del agua corporal. La hipernatremia significa un exceso de sodio en
la sangre, esto se advierte cuando hay vómito profuso, succión nasogástrica,
enfermedades infecciosas como traqueobronquitis, diarrea acuosa profusa,
diabetes insípida, aldosteronismo primario, ingestión inadecuada de agua libre,
alimentos con alto contenido de solutos. La hiponatremia significa una deficiencia
sanguínea de sodio o una depleción de sal, que por lo general indica un aumento
excesivo de agua respecto a la elevación del sodio; esto sucede en: diarrea o
vómito donde se pierde más sodio que agua, drenado de fístulas intestinales, uso
prolongado de diuréticos, enfermedad de Addison, insuficiencia renal crónica con
acidosis, retención anormal de agua, ingestión excesiva de agua y restitución
inadecuada de sal.
POTASIO: El potasio es el catión principal del líquido intracelular. Un desequilibrio

en el nivel de potasio tiene un efecto directo sobre la irritabilidad muscular, la
función miocardiaca y la respiración. La hiperpotasemia se define como una
concentración plasmática mayor de 5.5 mEq/L. Con una función renal adecuada
es virtualmente imposible permanecer en un estado de hiperpotasemia pues el
potasio es excretado con suma facilidad por el riñón. Por tanto, un incremento
significativo de potasio se encuentra principalmente en casos de insuficiencia renal
grave con azotemia; también podría haber aumento con una administración
desmedida de potasio si hay excreción urinaria inadecuada, con el uso excesivo
de diuréticos antagonistas de la aldosterona. La hipopotasemia se define como
una concentración sérica menor de 3.5 mEq/L. Los síndromes de deficiencia de
potasio son bastante comunes. Si esta deficiencia es grave, se producen cambios
funcionales y estructurales renales en el riñón, los cuales perpetúan el
desequilibrio hidroelectrolítico y acidobásico. Se tiene disminución de potasio en:
estados diarreicos, perdidas abundantes de líquidos gastrointestinales, diuresis
masiva, pacientes postoperatorios con pérdidas múltiples de potasio, pacientes
después de tratamiento de cetoacidosis diabética, respuesta a la tensión, falta de
ingestión adecuada de potasio, síndrome de malabsorción donde el intestino no es
capaz de absorber nutrientes.
CLORO: El cloro, el principal anión extracelular, ejerce un efecto directo sobre la

presión osmótica, la distribución del agua y el equilibrio entre aniones y cationes.
Los niveles bajos de cloro son causados por pielonefritis crónica, crisis del
síndrome de Addison, acidosis metabólica y vómito prolongado. Se observan
niveles altos de cloro en la deshidratación, insuficiencia cardiaca congestiva,
hiperparatiroidismo y el tratamiento prolongado a base de cloro o la ingestión
repetida de dicha sustancia
OBJETIVOS: Determinar la concentración en una muestra biológica de sodio /

potasio / cloro utilizando el método de ión selectivo. Destacar la importancia de
los iones sodio, potasio y cloro en el metabolismo humano y su relación con
diversas patologías.
FUNDAMENTO DEL MÉTODO: El método para determinar sodio / potasio / cloro

basado en el ion selectivo, utiliza como elemento sensor del ion Cl- plata/cloruro
de plata o sulfuro de plata y la medición de Na+ / K+ emplea membranas de
intercambio iónico de vidrio para el sodio y membranas de intercambio iónico
liquidas que incorporan valiomicina para el potasio. Hay dos formas generales
para medir la potenciometría por electrodo ión selectivo (ISE) en muestras
clínicas, la “directa” y la “indirecta”. Los sistemas potenciométricos directos miden
la actividad del ión en una muestra sin diluir, mientras que los sistemas ISE
indirectos miden la actividad del ión en una muestra prediluida..
PREPARACIÓN
MUESTRA CLÍNICA: Sangre entera o plasma. La muestra debe recolectarse
en ayuno. La muestra debe recolectarse en tubo colector de sangre con
heparina de litio. Si se trata de sangre entera la muestra debe mezclarse
mediante inversión y rotación del tubo. Para plasma se mezcla mediante
inversión y se centrifuga el espécimen dentro de una hora a partir de la
recolección. La sangre entera debe analizarse antes de transcurrida una hora a
partir de su recolección; después de este período de tiempo, se podría obtener
niveles falsamente elevados de potasio. No enfriar ni refrigerar las muestras. El
plasma debe analizarse dentro de un periodo de 4 horas a partir de su extracción.
Es necesario dejar que las muestras refrigeradas alcancen la temperatura
ambiente de la habitación y que sean centrifugadas antes del análisis. Nota: No
agitar los tubos Se recomienda utilizar material de plástico de un solo uso para
evitar contaminaciones. La muestra es inaceptable si: a) Si el suero se obtiene
turbio. b) Si la identificación es inadecuada. c) Si el tubo de recolección no es el
adecuado. d) Cuando se haya excedido el tiempo máximo de análisis permisible.
REACTIVOS: Se utilizan los reactivos para el analizador de ión selectivo.
Dependiendo del modelo.
EQUIPO: El alumno debe consultar el manual del analizador de ión selectivo para
utilizarlo correctamente siguiendo paso a paso las instrucciones de operación.
PROCEDIMIENTO
DESARROLLO DE LA PRÁCTICA:
1. Encender el analizador.
2. Seguir los pasos que va indicando el analizador primero una calibración a 2
puntos que se efectúa después de instalar o cambiar sensores, módulo de
reactivos u otros componentes y posterior el análisis de la muestra.
VALORES DE REFERENCIA: El intervalo de referencia para el cloruro en suero

o plasma es de 98 a 107 mmol/L o mEq/L. Sodio 135 - 145 mmol/L ó mEq/L.
Potasio 3.6 - 5.0 mmol/L ó mEq/L. Cloruro 98 mmol/L o mEq/L
Nota: Estos intervalos fueron obtenidos utilizando métodos indirectos. Cuando se

miden por métodos directos estos intervalos serán algo mayores que cuando se
miden mediante técnicas indirectas. Los valores de potasio plasmático pueden ser
de 0.1 a 0.2 mmol/L ó mEq/L menores que los correspondientes valores séricos.
PRÁCTICA No. 13
Procesamiento de muestras arteriales y su interpretación.
Fundamento del Gasómetro.
El electrodo de vidrio sensible al pH es el más eficaz de los medios disponibles

para efectuar mediciones concernientes a la actividad de iones hidrógeno
expresado como pH. El principio que rige la función del electrodo se basa en el
desarrollo de un potencial eléctrico sobre una membrana de vidrio sensible. Este
potencial es igual a la diferencia de pH existente entre dos soluciones separadas
por una membrana semipermeable.
Todos los electrodos de vidrio para mediciones de pH son muy semejantes desde
el punto de vista de construcción. Una solución de la que se conoce su valor
constante de pH, está en contacto con la superficie de la membrana de vidrio
sensible al pH, mientras que la solución cuyo valor de pH se desconoce está en
contacto con la otra membrana externa.
Entre las dos superficies de la membrana de vidrio se desarrolla una diferencia de

potencial eléctrico que es proporcional a la diferencia de pH existente entre las dos
soluciones. Puesto que una de las soluciones tiene un valor de pH constante, el
potencial que desarrolla representa el valor de la otra.
Para medir este potencial se introduce un conductor -electrodo- en la solución con

pH constante y otro electrodo en la solución con pH desconocido. Las dos
terminales o electrodos se conectan al indicador de pH que es en realidad un
medidor de minivoltios calibrado en unidades de pH. El electrodo introducido en La
solución de pH constante es un alambre de plata.
El electrodo externo o de referencia suele ser de tipo de Calomel (mercurio/

cloruro de mercurio), su función es generar un potencial de referencia constante
contra el cual se pueda comparar variaciones en potencial en la membrana de
vidrio del pH.
El electrodo de referencia se debe mantener protegido de contaminación por las

muestras, para lo cual es colocado en un depósito por separado que se sumerge
en la solución con pH desconocido. Dicha solución entre en contacto con el
electrodo únicamente a través de una separador de cerámica porosa en la punta
del depósito que permite el paso de una corriente pero evitando al mismo tiempo,
que se mezclen las soluciones.
 Gasómetro
 Jeringas al vacio heparinizadas
 Guantes de látex
Técnica:
Los alumnos seguirán las recomendaciones del tutor de prácticas para el manejo
correcto del gasómetro
Los alumnos determinaran con ayuda el tutor de prácticas las clases de

alteraciones ácido – básico de las muestras procesadas
Unidad VI: El control de calidad en el laboratorio
Clínico.
El laboratorio clínico es un servicio médico indispensable, cuya importancia ha ido

creciendo y desarrollándose a lo largo de los años hasta ocupar un lugar central
en la medicina.
La meta fundamental de los laboratorios clínicos es proporcionar datos confiables

acerca de la composición de muestras obtenidas de pacientes, de tal forma que
puedan contribuir al diagnóstico, tratamiento y seguimiento de diversas
enfermedades. La obtención de datos verdaderamente confiables, requiere de la
rigurosa aplicación de diferentes técnicas de control de calidad, teniendo siempre
presente que el mejor sistema de control es el que permite prevenir, identificar y
corregir los errores. Cuando no se dedica la atención suficiente a la calidad, se
pueden presentar deficiencias serias.
Un laboratorio clínico debe tener como uno de sus propósitos principales, la

producción de datos analíticos de alta calidad por medio del uso de mediciones
analíticas que sean precisas, exactas y adecuadas para tal fin; conduciendo esto a
resultados confiables. Para concretar este propósito se hace necesario la
utilización de programas de control de calidad interno y externo, entre otros
elementos, se debe recordar que se puede tener buena o mala calidad en todo
tipo de sistemas analíticos ya sean éstos manuales o automatizados, por lo que se
debe tener mucho cuidado en ambos casos.
La meta de un sistema de control de calidad deberá ser que: “La variación en las
determinaciones que se llevan a cabo en el laboratorio sea lo suficientemente
pequeña para que no se afecte la utilidad“.
La realización de cualquier procedimiento analítico puede estar amenazada por

cometer un sin número de errores, algunos de los cuales pueden llegar a tener
consecuencias realmente serias.
Actualmente, frente a la demanda creciente de los usuarios del laboratorio clínico

(médicos y pacientes) y como resultado del avance científico y tecnológico, se
requiere controlar la operación total, incluyendo las etapas pre-analítica, analítica y
post-analítica.
PRÁCTICA No. 14
Herramientas estadísticas básicas para el control de calidad.
El Control de Calidad en el laboratorio clínico es un sistema diseñado para

incrementar la probabilidad de que cada resultado reportado por el laboratorio sea
válido y pueda ser utilizado con confianza por el médico para tomar una decisión
diagnóstica o terapéutica. Los procedimientos de Control de Calidad (CC)
funcionan detectando los errores analíticos, idealmente cualquier error
suficientemente grande para invalidar la utilidad médica de los resultados de
laboratorio debe ser detectado. En la práctica, muchos procedimientos de CC
operan introduciendo controles (materiales de muestras bien caracterizadas por
ensayos previos) al proceso de ensayo del laboratorio y comparando los
resultados de la prueba con el rango de valores esperado derivado del ensayo
previo.
El rango esperado de los valores para un control es calculado usando estadísticas

relativamente sencillas. Estas estadísticas incluyen:
• Media
• Desviación estándar (s)
• Coeficiente de variación (CV)
Media:
La media se define como el promedio aritmético de un conjunto de datos. Se

expresa como:
Donde:
xi = cada dato
n = Número de datos en el conjunto
La media describe la “tendencia central” de un conjunto de datos. En el laboratorio

clínico, la media identifica el “valor objetivo” de un conjunto de datos, usualmente
de un control o de datos de un paciente.
Desviación estándar
La desviación estándar (S) cuantifica el grado de dispersión de los puntos de los

datos cerca de la media y es usada para establecer los límites en los que es
determinada la aceptabilidad del resultado del control. Los datos de control de
calidad muestran con frecuencia una distribución “normal” o Gaussiana alrededor
de la media. En una distribución Gaussiana:
• 68.3% de los valores están dentro ± 1.0 desviación estándar de la media
• 95.5% de los valores están dentro ± 2.0 desviaciones estándar de la media
• 99.7% de los valores están dentro ± 3.0 desviaciones estándar de la media
La desviación estándar es cuantificada usando la siguiente fórmula:
Coeficiente de Variación
El coeficiente de variación (CV) es una medida de variabilidad. El CV de un

método o instrumento es expresado como porcentaje y es calculado como:
CV(%) = (Desviación estándar (s) ÷ Media)(100)
El CV es útil para comparaciones de precisión a diferentes concentraciones como

los materiales similares usados y los CV sean determinados bajo condiciones
similares. Esta estadística es comúnmente usada para comparar especificaciones
del fabricante, resultados de investigación y reportes de Control de Calidad entre
grupos análogos. También puede usarse como una parte del sistema interno de
calidad cuando se hace una prueba de precisión de muestra de paciente, que se
presenta posteriormente.
Objetivo:
 Analizar estadísticamente los resultados obtenidos de dos materiales de

control comercial, para establecer el grado de precisión y exactitud.
Procedimiento:
Para el caso de nuestra práctica realizaremos el cálculo de la precisión y exactitud

de la enzima creatin kinasa (CK)
Deben realizarse aproximadamente 20 análisis para obtener la media la

desviación estándar y el coeficiente de variación en los dos niveles del control
comercial. Han de aplicarse estrictamente todas las medidas preventivas
necesarias. Algunas son:
 Usar el mismo aparato para todas las determinaciones.

 Usar reactivos recién preparados y verificados.
 Realizar los análisis sobre un material homogéneo y estable.
 Verificar las lecturas del instrumento y los cálculos.
 Realizar los análisis en el menor intervalo de tiempo posible.
 Controlar cuidadosamente la temperatura y el tiempo.
 Evitar cambios bruscos en las condiciones ambientales; luz, temperatura,
humedad.
 Asegurarse de que todos los reactivos están correctamente mezclados.
 Utilizar personal experimentado.
Conclusiones:
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
PRÁCTICA No. 15
Práctica: Elaboración de gráficos de control e interpretación
En esta práctica realizaremos los cálculos iniciales para configurar una carta de
control, construir la carta de control Levey-Jennings la cual es ampliamente
utilizada en los laboratorios, trazar los datos del control, e interpretar los
resultados.
Objetivo:
Disponer de gráficos para el control de calidad interno y así determinar si el

procedimiento de medición está bajo o fuera de control.
Utilizar las reglas o multirreglas de Westgard para aceptar o rechazar una corrida
analítica.
Materiales, reactivos y equipos
MATERIALES
• No aplica.
REACTIVOS
• Material control interno de dos niveles (normal y patológico).
EQUIPOS
• Depende del analito cuantificable.
Desarrollo
La gráfica se realiza para cada analito y nivel de control. Necesita un mínimo de

20 datos, para fijar los límites de alerta (precaución) media + 2 s y límite de control
media + 3 s.
Con los 20 datos obtenidos del control de calidad interno, calcular la media (x),
desviación estándar (s) y coeficiente de variación (CV). Los datos y cálculos
obtenidos se muestran en el ejemplo para colesterol del Anexo 1 y la gráfica de
Levey-Jennings en el Anexo 2.
Graficar a partir del dato 21, la frecuencia está dada por el número de corridas
analíticas o de días.
Para aceptar o rechazar los puntos de cada nivel de control se utilizan las reglas
de Westgard.
Las reglas de Westgard a utilizar en el control de calidad interno y que son válidas
para 2 niveles de control, son las siguientes:
La regla 13S se viola cuando el control sobrepasa el límite de ± 3s. Es una regla de
rechazo. (Anexo 3)
Regla 22S: El error relativo en dos controles es superior a ± 2s. Puede tratarse de
los 2 materiales incluidos en una misma serie o de un solo material que viola la
regla en dos series consecutivas. Es una regla de rechazo. (Anexo 4)
La regla R4S se viola cuando la diferencia entre dos controles excede 4s o un solo
material control viola la regla en 2 series consecutivas. Es una regla de rechazo.
(Anexo 5)
La regla 41S se viola cuando 4 mediciones consecutivas del control exceden la

media más1s o 4 mediciones consecutivas del control exceden la media menos
1s. Es una regla de rechazo. (Anexo 6)
La regla 10X se viola cuando 10 mediciones consecutivas de un control caen a un

solo lado de la media o con 2 controles en 5 mediciones consecutivas. Es una
regla de rechazo. (Anexo 7)
Interpretación multirreglas de Westgard
Los datos del control interno deben ser ingresados y almacenados en Registros
manuales
o informáticos (siendo mejor los informáticos) para su posterior análisis.
Los límites de aceptación del control permiten la interpretación de los datos y

aplicación
de las reglas o multirreglas de Westgard, tal como se muestra en la tabla Nº 1.
(Anexo 8)
Anexo Nº 1. Ejemplo de construcción de Carta Control o Levey-Jennings
Anexo 3
Anexo 4
Anexo 5
Anexo 6
Anexo 7
Anexo 8
Bibliografía
1. TERRÉS Speziale Arturo M; Clínica y Laboratorio: Ciencia y Tecnología; 2ª ed;

ed. Graphimedic S.A. de C.V; México 2002.
2. PRESIDENCIA DE LA REPÚBLICA; CGEA, Guía técnica para la elaboración de

manuales de procedimientos; Colección guías técnicas, serie organización y
métodos núm. 9.
3. México, Secretaría de Salud, Norma Oficial Mexicana NOM-166-SSA1-1997,

para la organización y funcionamiento de los laboratorios clínicos, Diario Oficial de
la federación, año 2000. Internet: http://www.salud.gob.mx/
4. El gerenciamiento del laboratorio de análisis clínicos con la visión de la

calidad total. Internet: http://www.sarda.org.ar/Revista%20sard%c3%A1/2002/28-
33.pdf
5. ANDERSON, Shauna C, Susan Cockayne; Química Clínica; 1ª ed; trad. Ma.

Teresa Aguilar; ed. Interamericana-McGraw-Hill; México, 1995.
6. KAPLAN, A. Lawrence, Amadeo J. Pesce; Química Clínica Teoría, análisis y

correlación; 3ª ed; trad. Tania Carreón Valencia; ed. Javier Ortega Ceseña; México
1996.
7. GONZÁLEZ Buitrago J.M., Arilla Ferreriro E., Rodríguez-Segada M., Sanchez

Pozo A; Bioquímica Clínica; 1ª ed; ed. McGraw-Hill; México, 1998.
8. MORÁN Villatoro Luis; Obtención de muestras sanguíneas de Calidad analítica;

1ª ed; ed. Médica Panamericana S.A. de C.V; México D.F. 2001.
9. BECTON, DICKINSON DIAGNOSTICS; BD Vacutainer Oder of Draw for

Multiple Tube Collections. Internet: www.bd.com/vacutainer.
10. A.A. Madrid, C.S.C.;Laboratorio Clínico, Manual de Flebotomía. Internet:

www.ilustrados.com/documentos/manualflebotomia.doc
11. Norma-Oficial Mexicana Nom-087-ECOL-SSA1-2002 Protección Ambiental-

Salud ambiental-Residuos peligrosos biológico-Infecciosos-Clasificación y
especificaciones de manejo.
Internet:http://www.salud.gob.m/unidades/cdi/nom/087ecolssa.html
12. WHITEHEAD T.P.; Manual, Principios de Control de Calidad (Lab/76.1);

Organización Mundial de la Salud; Química Clínica 1984.
13. TRESELER Kathleen Morrison; Laboratorio clínico y pruebas de diagnóstico;

3ª ed; trad. Dr. Jorge Mérigo; ed. El manual moderno; México, D.F, 1998.
14. AYRES H. Gilbert; Análisis Químico Cuantitativo;2ª ed;ed. Harla S.A de C.V.;
México 1970.
15. FLASCHKA H.A.; Química Analítica Cuantitativa; 9ª.ed; trad. Antonio Eroles
Gómez; ed. Continental S.A. de C.V; México 1984.
16. GRAW Allan, Cowan Robert A; Bioquímica Clínica; 2a. ed; ed.
A.Hamabata;México D.F. 2003
.
17. BAYER; Manual de usuario Rapidchem 744/754.
18. GRAFF Sister Laurine; Análisis de Orina, Atlas a color; 1ª ed; trad. Pablo
Rubén Koval; ed. Médica Panamericana S.A; México 1983.
19 ALTHOF Klinder Heintz; Sedimento Urinario; 6ª.ed; ed. Médica Panamericana;

México 2003.

Guia de Practicas

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FACULTAD DE MEDICINA Y CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE TECNOLOGÍA MÉDICA

GUÍA DE PRÁCTICAS DEL CURSO DE

Docente responsable: Mg. Ítalo Moisés Saldaña O.

6 Estudio físico, químico y celular de los líquidos serosos.

7 Estudio físico, químico y celular del líquido cefalorraquídeo.

SEGUNDA EVALUACIÓN PRÁCTICA

La función del laboratorio de Bioquímica Clínica es realizar análisis, tanto

Los objetivos de las prácticas del curso Bioquímica Clínica II son:

1. Que el alumno sea capaz de realizar el análisis de productos biológicos

2. Que el alumno adquiera una formación y preparación en Bioquímica que

3. Que el alumno realice los procedimientos correctos tanto en forma

4. Que el alumno adquiera los elementos formativos que le permitan

Este proceso de enseñanza incluye: planeación, selección, elaboración y

El curso de la asignatura práctica de Bioquímica Clínica están diseñadas con el

2. Antes de empezar el trabajo en el laboratorio tienes que familiarizarte con los

3. Es necesario localizar las salidas principales y de emergencia por si se diese el

4. Es obligatorio usar gafas de seguridad siempre que se esté en el laboratorio.

5. No usar lentes de contacto en el laboratorio, ya que en caso de accidente las

6. Si un producto químico te salpica los ojos, utiliza inmediatamente una ducha de

7. El uso de bata (preferentemente de algodón) es obligatorio, ya que por mucho

8. Así mismo se recomienda llevar zapatos cerrados y no sandalias.

9. No comer ni beber en el laboratorio, ya que hay la posibilidad de que los

12. Procure quitarse el mandil hasta que salga del laboratorio.

13. Está prohibido fumar en el laboratorio por razones higiénicas y de seguridad.

15. Cerrar herméticamente los frascos de productos químicos después de

18. No deben transportarse innecesariamente los reactivos de un sitio para otro

21. No se puede hacer ningún experimento no autorizado.

Si el fuego es pequeño y localizado, retira los productos y material inflamable que

Si no puedes controlar el fuego, avisa a la persona responsable, acciona la alarma

No utilices pomadas o cremas grasosas en quemaduras graves.

Es necesario lavarlos bien con agua y después aplicar un apósito adecuado. Si

4. Derramamiento de productos químicos sobre la piel

5. Corrosión en los ojos

Pide asistencia médica inmediata, por pequeña que parezca la lesión .

No provoques el vómito si el producto ingerido es corrosivo.

Diluye el corrosivo donante bebiendo abundante cantidad de agua.

Pide asistencia médica inmediata.

7. En caso de inhalación de productos

Lleva inmediatamente a la persona afectada a un sitio con aire fresco.

Pide asistencia médica inmediata.

Familiarízate con los elementos de seguridad del laboratorio.

Respeta escrupulosamente las normas de seguridad e higiene del laboratorio.

Sigue las instrucciones del profesor antes de realizar un experimento. En caso de

Mantén la calma en caso de accidente o emergencia.

Cálculo de la Actividad enzimática

Papel milimetrado Espectrofotómetro

Determinar la actividad enzimática de la enzima alanino amino transferasa (/ALAT)

En la mayoría de los procedimientos enzimáticos las velocidades de reacción no

Si la velocidad de reacción es seguida de manera continua o utilizando varios

En 1961 la Comisión de Enzimas recomendó la adopción de una unidad

·ε es el coeficiente de extinción molar de aquel compuesto cuya absorbancia

· Vf es el volumen total de reacción

· Vi es el volumen de muestra en el ensayo

Algunas reacciones enzimáticas de interés, como las de la alanina

L-Aspartato + α-Cetoglutarato L-Glutamato + Oxaloacetato

Oxaloacetato + NADH + H+ L-Malato + NAD+

Para calcular la actividad de dicha enzima se procederá a lo siguiente

1. Precalantar el reactivo de trabajo y el instrumento a la temperatura de reacción

2. Pipetear en una cubeta

3. Mezclar e insertar la cubeta en el fotómetro. Poner el cronometro en marcha

5. Graficar en un papel milimetrado absorbancias vs tiempo

7. Con los datos anteriores y la fórmula propuesta calcular la actividad de la

Realizar todos los procedimientos anteriores y calcule la actividad de la