QUERATINASAS

Resumen

Actualmente las proteasas alcalinas son ampliamente utilizadas en la industria del cuero, en
distintas formulaciones de detergentes, también en el proceso de recuperación de plata, y en la
producción de hidrolizados de proteínas. Comúnmente, todas estas proteasas se obtienen de
fuentes microbianas que crecen en sustrato relativamente caros. Muchos estudios demuestran
que cerca del 40% del costo de producción de estas enzimas está relacionada con la composición
del medio de cultivo. Para reducir el costo de producción es importante la búsqueda de
microorganismos capaces de crecer y de producir suficiente cantidad de la enzima usando
sustratos baratos. En este sentido desechos de naturaleza queratínica tienen un enorme potencial
para ser utilizacos como sustrato para la producción de un grupo de enzimas proteolíticas llamado
queratinasas, las cuales presentan la capacidad de hidrolizar la queratina, proteína sumamente
resistente a la degradación por su estructura y por la presencia en su molécula de puentes
disulfuro. En el presente trabajo de tesis seis cepas de hongos no patógenos aislados de suelos
alcalinos de la provincia de Buenos Aires, Argentina, (Acremonium murorum, Aspergillus sidowii,
Cladosporium cladosporioides, Neurospora tetrasperma, Purpureocillium lilacinum (ex
Paecilomyces lilacinus) y Westerdikella dispersa) fueron evaluados de acuerdo a su capacidad de
producir enzimas queratinolíticas. Entre estas cepas, P. lilacinum resultó ser el hongo con mayor
producción de actividad proteolítica y queratinolítica, tanto en fermentación en sustrato solido
como en sumergido, siendo seleccionado para continuar con este trabajo. Se establecieron las
condiciones óptimas de cultivo para la producción enzimática utilizando diseños experimentales y
la metodología de superficie de respuesta. Las condiciones óptimas fueron: 7,10 g/l de glucosa;
0.0065 mg/l de CaCl2 y pH inicial de 5.60; en estas condiciones de cultivo, el rendimiento máximo
para la producción de queratinasas predijo por el modelo fue de 26,7 U azo/ml. La validación del
modelo demostró que, tanto el polinomio como las correspondientes superficies de respuesta
obtenidas describen adecuadamente la influencia de la concentración de glucosa, de calcio y el pH
inicial en la producción de queratinasas. Luego de la optimización del medio de cultivo se procedió
a la purificación de la enzima, las etapas involucradas en la purificación fueron la precipitación con
sulfato de amonio y distintas técnicas cromatográficas de intercambio iónico y permeación en gel,
con un factor de purificación de 19.8 veces y una actividad específica de 1430 U/mg de proteína. El
peso molecular de la enzima, determinado por SDS-PAGE, fue de 37 kDa. La queratinasa
extracelular de P. lilacinum se caracteriza por su apreciable estabilidad en un amplio intervalo de
pH (4.0 a 9.0), y hasta 65°C. La inhibición que presenta frente a PMSF (98,2% de la inhibición)
sugiere su naturaleza serínica. La enzima es activa y estable en presencia de solventes orgánicos
tales como dimetilsulfóxido, metanol, e isopropanol; ciertos tensioactivos como Triton X-100,
dodecilsulfato de sodio, y Tween 85, y agentes oxidante como el peróxido de hidrógeno. Sus
parámetros cinéticos de inactivación térmica fueron estimados bajo diferentes condiciones y fue
posible observar cómo afectan calcio, el glicerol y el propilenglicol a la estabilidad térmica de la
enzima. Se investigó la inmovilización covalente de la queratinasa pura sobre un soporte de
quitosán, optimizando la concentración de los agentes entrecruzantes glutaraldehído y genipina,
así como también el tiempo de activación. La enzima inmovilizada presentó mayor estabilidad
frente a pH y temperaturas extremas en comparación con la enzima libre, además retiene 61.37 %
de la actividad enzimática inicial después de cinco ciclos de hidrolisis. Se estudiaron las potenciales
aplicaciones biotecnológicas del extracto enzimático, entre ellas se estudió por su compatibilidad y
estabilidad frente a detergentes comerciales (7 mg/ml) como Ariel y Skip, observándose que éste
retiene más de 70 % de su actividad proteolítica inicial después de 1 h de incubación a 40ºC. La
simulación de lavado reveló que el extracto era capaz de eliminar eficazmente las manchas de
sangre. Se estudió también la posibilidad de utilizar este extracto enzimático en la recuperación de
plata a partir de placas radiográficas usadas. En dosis de enzima de 6,9 U azoc/ml y a 60ºC, la
eliminación completa de la capa de gelatina con la liberación completa de las partículas de plata se
alcanzó en 6 min a pH 9.0. Por último, P. lilacinum además de producir enzimas queratinolíticas
con la producción de paralela de amonio, mostró la capacidad producir sideróforos y ácido
indolacético (IAA) al crecer con residuo pelo como sustrato en presencia de Trp y baja
concentración de hierro. Se realizaron ensayos a nivel de invernadero con plantas de tomate,
encontrándose que, en términos de peso seco, el hidrolizado mostró un efecto similar al del
fertilizante de referencia. Además, el hidrolizado demostró poseer actividad antifúngica contra
varios patógenos de las plantas. Estos resultados indican el potencial biotecnológico tanto del
extracto enzimático como el de la enzima pura de P. lilacinum siendo interesante además la
capacidad del hongo de producir esta enzima utilizando un como sustrato un residuo de valor
nulo, con lo cual sería de esperar que su costo de producción resulte relativamente bajo.

Información de la Tesis

Director: Cavalitto, Sebastián Fernando

Fecha de exposición: 13 de diciembre de 2013

Institucion de Desarrollo: Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales

(CINDEFI)

Grado alcanzado: Doctor en Ciencias Exactas, área Química

Institución otorgante: Facultad de Ciencias Exactas

Información general

Idioma del documento: Español

Institución de origen: Facultad de Ciencias Exactas

Extensión: 360 p.

Materias: Ciencias Exactas ; Química

Descriptores: Hidrólisis; Hongos; Enzimas; Glucosa

Palabras clave: queratinasas fúngicas; residuo pelo; Purpureocillium lilacinum; diseños estadísticos

http://sedici.unlp.edu.ar/handle/10915/32430