Lima EvandroAntoniode D

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
EVANDRO ANTONIO DE LIMA
Prospecção, clonagem, produção, purificação e caracterização de

enzimas do sistema lignocelulolítico de Bacillus licheniformis
CBMAI 1609
Campinas – SP
2015
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EVANDRO ANTONIO DE LIMA
Prospecção, clonagem, produção, purificação e caracterização de

enzimas do sistema lignocelulolítico de Bacillus licheniformis
CBMAI 1609
Tese apresentada à Faculdade de Engenharia de

Alimentos da Universidade Estadual de Campinas
como parte dos requisitos exigidos para a
obtenção do título de Doutor em Ciência de
Alimentos
Orientadora: Profa. Dra. Hélia Harumi Sato

Coorientador: Dr. Roberto Ruller
Este exemplar corresponde à versão final da tese

defendida pelo aluno Evandro Antônio de Lima e
orientada pela Profa. Dra. Hélia Harumi Sato
Campinas – SP
2015
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BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Hélia Harumi Sato – DCA/FEA/UNICAMP

Orientadora
Prof. Dr. André Ricardo de Lima Damásio – IB/UNICAMP

Membro titular
Dra. Carla Botelho Machado – CTBE/CNPEM

Membro titular
Profa. Dra. Rosana Goldbeck – DEA/FEA/UNICAMP

Membro titular
Prof. Dr. Severino Matias de Alencar – ESALQ/USP

Membro titular
Prof. Dr. Juliano Lemos Bicas – DCA/FEA/UNICAMP

Membro suplente
Profa. Dra. Luciana Fransciso Fleuri – IBB/UNESP

Membro suplente
Profa. Dra. Marta Cristina Teixeira Duarte – CPQBA/UNICAMP

Membro suplente
A Ata da Defesa, com as respectivas assinaturas dos membros da Comissão

Examinadora, encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
5
AGRADECIMENTOS
A Deus por me amparar e dar forças, paciência e esperança para enfrentar os

desafios encontrados ao longo do doutorado.
Aos meus pais (Euflausino e Edna), meus irmãos (Elaine e Everson), meus
cunhados (Luciano e Elisangela) e sobrinhos (Maria Júlia, João Guilherme e Enzo)
pelo apoio familiar, incentivo e formação pessoal.
À professora Hélia, pela sua atenção, generosidade, por estar sempre disponível
para ajudar no que fosse preciso e por ser um exemplo de pessoa e de profissional
que um dia eu espero ser.
Ao Roberto Ruller, pela oportunidade de poder trabalhar em um grande centro de
pesquisa, pela amizade e por ter contribuído para o meu desenvolvimento
profissional e pensamento científico.
Aos membros da banca examinadora por terem aceito o convite e também pelas
sugestões, correções e atenção dedicadas ao aperfeiçoamento desse trabalho.
A todos do CTBE (alunos, funcionários e pesquisadores), pela amizade, por terem
contribuído para o meu crescimento profissional e também pelos momentos de
descontração. Em especial aos amigos Aline Tieppo, Ana Paula, André, Camila,
Cristiane, Daniela, Douglas, Felipe, João Paulo, Lívia, Fernanda Buchli, Fernanda
Mandelli, Gustavo, Júnio, Letícia, Lúcia, Marcelo, Mariane, Rebeca, Renato, Rodrigo,
Rosana, Thabata, Thamy e Thiago. Gostaria de agradecer também os amigos da
Ilha 2, Amanda, Beto, Carla, Fernanda e Zaira, pelo companheirismo, ajuda nos
experimentos, conversas e por tornarem o ambiente de trabalho mais agradável.
A todos do Laboratório de Bioquímica de Alimentos da FEA, em especial, para os
amigos Beatriz, Camilo, Danielle, Fabiano, Fabíola, Fernanda, Isabela, Joelise, José
Valdo, Haroldo, Marcela, Paula, Ricardo, Ruann, Valquíria e Viviane, pela amizade,
ajuda, conhecimento compartilhado e pelas festinhas de confraternização do Lab.
À professora Maria de Lourdes Polizeli pelo fornecimento de amostras de
subprodutos agroindustriais, assim como a Dra. Sindélia de Freitas e a Aline Tavares
pela ajuda nos ensaios para o escalonamento da fermentação.
Aos colegas de república pelo companheirismo ao longo desses anos.
Ao CTBE, CNPEM e a UNICAMP por tornarem possível a realização deste trabalho.
À CAPES pela bolsa de estudos concedida.
A todos que de uma forma ou outra contribuíram na elaboração deste trabalho.
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RESUMO
As celulases, hemicelulases, pectinases e lacases são um importante

grupo de enzimas que são produzidas comercialmente e que apresentam diversas
aplicações industriais. A utilização dessas enzimas em processos para conversão de
materiais lignocelulósicos em biocombustíveis e outros produtos de alto valor
agregado tem recebido grande notoriedade nas pesquisas científicas. Nesse
contexto, o presente estudo teve como objetivos realizar a prospecção, clonagem,
produção, purificação e caracterização de enzimas lignocelulolíticas a partir de um
isolado do gênero Bacillus. Inicialmente foi realizada uma avaliação do potencial
produtor de celulases, pectinases e xilanases de 107 isolados de Bacillus sp. obtidos
a partir de amostras de sucos de frutas pasteurizadas. Nessa etapa do trabalho, 20
isolados mostraram-se capazes de produzir as 3 enzimas e foram identificados como
linhagens de B. licheniformis e B. subtilis. O isolado com melhor potencial
hemicelulolítico foi selecionado para as etapas seguintes desse trabalho e
depositado como B. licheniformis CBMAI 1609. Posteriormente, foram realizados
vários experimentos visando otimizar e aumentar a escala de produção de xilanase.
Esses experimentos possibilitaram o uso de subprodutos agroindustriais como
substratos indutores para a produção de xilanase, sendo os melhores resultados
observados com uma combinação de bagaço de laranja e farelo de soja. Além disso,
foi possível com esses experimentos aumentar a produção da enzima cerca de 61,6
vezes em relação aos resultados iniciais (de 0,3 U/mL para 18,5 U/mL), reduzir o
tempo de fermentação e os custos de obtenção da enzima (de R$ 368,53 para R$
0,21 para cada 1.000 U de xilanase) e ainda produzir simultaneamente outras
hidrolases glicosídicas. O sistema xilanolítico produzido por esse micro-organismo
foi caracterizado e apresentou altos níveis de atividade em condições neutras à
alcalinas e em temperaturas próximas a 50 ºC. Um estudo para purificar as
hidrolases glicosídicas produzidas pelo micro-organismo foi executado e revelou a
presença de um complexo multienzimático com mais de 1.300 kDa, composto por
pelo menos 10 subunidades proteicas e que hidrolisava principalmente substratos
hemicelulósicos. Foi ainda realizado o isolamento e a clonagem de genes que
codificavam as enzimas arabinanase, α-L-arabinofuranosidase, endoglucanase,
galactanase, lacase e ramnogalacturonase no micro-organsimo selecionado. Neste
trabaho é relatada a expressão heteróloga, a purificação e a caracterização de duas
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endoglucanases, uma galactanase e uma lacase. A caracterização das

endoglucanases e da galactanase indicou que essas enzimas apresentavam pH
ótimo de atividade próximo da neutralidade, eram estáveis em temperaturas abaixo
de 50 ºC após 1 hora de tratamento térmico, mantinham mais de 70% de atividade
residual após 24 horas de incubação na faixa de pH entre 4,0 a 8,0 e exibiam boa
eficiência catalítica. A lacase exibiu atividade ótima em temperaturas entre 55 e
60 ºC e em pH 4,0. Essa enzima também mostrou baixa estabilidade após
incubação prévia em valores de pH abaixo de 5,0 e apresentou eficiência catalítica
similar a outras lacases. A suplementação de um coquetel enzimático comercial com
a galactanase foi também avaliada e revelou que a adição dessa enzima
proporcionava uma melhora de aproximadamente 25% no rendimento da hidrólise
de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado.
8
ABSTRACT
Cellulases, hemicellulases, pectinases and laccases are an important

group of enzymes which are produced commercially and have various industrial
applications. The use of these enzymes in the conversion of plant biomass into
biofuels and other value added products has received great notoriety in scientific
research. In this context, the present study aimed to carry out the screening, cloning,
production, purification and characterization of the lignocellulolytic enzymes from an
isolate of Bacillus genus. Initially, the screening for potential producer of cellulases,
pectinases and xylanases was performed from 107 isolates of Bacillus sp. obtained
from pasteurized fruit juices samples. At this stage, 20 isolates were able to produce
the three enzymes and have been identified as B. licheniformis and B. subtilis strains.
The isolated with the best hemicellulolytic potential was selected for the next steps of
this work and deposited as B. licheniformis CBMAI 1609. Subsequently, tests were
performed to optimize the production of xylanase and to expand the scale of enzyme
production. These experiments demonstrated that agricultural by-products could be
used as substrate to induce the xylanase production. The best results were obtained
combaining orange pomace and soybean meal. A 61.6-fold increase in enzyme
activity compared to the initial results (0.3 U/mL to 18.5 U/mL) as well the reduction in
costs to obtain the enzyme (from R$ 368.53 to R$ 0.21 per 1,000 U of xylanase) and
fermentation time were also observed. The optimization of the fermentation process
also allowed the simultaneous production of other glycoside hydrolases by the
microorganism. The xylanolytic system produced by this microorganism showed
higher levels of activity in neutral to alkaline conditions and at temperatures around
50 °C. The purification of the glycoside hydrolases produced by the microorganism
revealed a multienzyme complex superior to 1,300 kDa. It is composed of at least 10
proteins which are involved mainly in the hydrolysis of hemicelluloses. The isolation
and cloning genes that encode the enzymes arabinanase, α-L-arabinofuranosidase,
endoglucanase, galactanase, laccase e rhamnogalacturonase in B. licheniformis
CBMAI 1609 also was performed. In this work two endoglucanases, a galactanase
and a laccase were expressed in heterologous system, purified and characterized.
The endoglucanases and the galactanase showed optimal activity close to neutrality
and stability at temperatures below 50 °C after 1 hour of heat treatment. These
enzymes kept over 70 % of residual activity after incubation for 24 hours in the pH
9
range 4.0 to 8.0 and also exhibited good catalytic efficiency. The laccase showed
optimal activity between 55 and 60 °C and pH 4.0. This enzyme also exhibited low
stability after previous incubation at pH values below 5.0 and had similar catalytic
efficiency to other laccases. The effect of commercial enzyme cocktail
supplementation with galactanase was also evaluated. The supplementation led to
an improvement of approximately 25 % in the hydrolysis yield of pretreated
sugarcane bagasse.
10
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Esquema simplificado de uma biorrefinaria para reaproveitamento da

biomassa lignocelulósica ........................................................................................... 42
Figura 2 – Rotas tecnológicas para a produção de bioetanol ................................... 45
Figura 3 – Estrutura da celulose e sítios de ação das celulases .............................. 50
Figura 4 – Estrutura da xilana e sítios de ação de algumas hemicelulases ............. 51
Figura 5 - Estrutura do xiloglucano e os sítios de ação de algumas enzimas
envolvidas na degradação deste polissacarídeo ....................................................... 52
Figura 6 – Estrutura do ramnogalacturano tipo I (a) e do homogalacturano (b) e os
sítios de ação de algumas enzimas envolvidas na degradação destes
polissacarídeos ......................................................................................................... 54
Figura 7 – Estrutura da lignina e mecanismo de atuação das enzimas
ligninolíticas..... .......................................................................................................... 55
Figura 8 – Representação esquemática simplificada da organização do celulossomo
de Clostridium thermocellum e da sua interação com a parede celular microbiana .. 60
Figura 9 - Halos de crescimento das colônias e de degradação dos substratos
durante a avaliação qualitativa com os substratos carboximetilcelulose (a, b), pectina
(c, d) e xilana (e, f) a 37 e 45 ºC .............................................................................. 113
Figura 10 – Cinética de produção de endoglucanase pelos 20 isolados de Bacillus
sp. durante fermentação submersa utilizando CMC como fonte de carbono .......... 118
Figura 11 – Cinética de produção de poligalacturonase pelos 20 isolados de Bacillus
sp. durante fermentação submersa utilizando pectina cítrica como fonte de
carbono ................................................................................................................... 120
Figura 12 – Cinética de produção de xilanase pelos 20 isolados de Bacillus sp.
durante fermentação submersa utilizando xilana de madeira faia como fonte de
carbono ................................................................................................................... 123
Figura 13 - Cinéticas de produção de xilanase pelos isolados BH19, BH47, BH54,
BH60 e BH93 durante fermentação submersa em meio de cultura contendo farelo de
trigo ......................................................................................................................... 131
Figura 14 – Eletroforese em gel de agarose do produto da amplificação do gene
RNAr 16S para os 20 isolados de Bacillus sp. selecionados para avaliação quanto à
produção de hidrolases glicosídicas por fermentação submersa ............................ 133
11
Figura 15 – Árvore filogenética baseada no método neighbor-joining usando

sequências do gene RNAr 16S de isolados do gênero Bacillus .............................. 135
Figura 16 – Perfis de restrição gerados na digestão dos produtos da amplificação da
região intergênica 16S-23S do gene RNAr de isolados do gênero Bacillus com as
enzimas de restrição CfoI (a), HaeIII (b), RsaI (c) e AluI (d).................................... 140
Figura 17 – Árvore filogenética baseada nos dados dos perfis de restrição da região
intergênica 16S-23S do gene RNAr de isolados do gênero Bacillus com as enzimas
de restrição CfoI, HaeIII, RsaI e AluI ....................................................................... 141
Figura 18– Efeitos de diferentes fontes de carbono sobre a produção de xilanase
por B. licheniformis CBMAI 1609............................................................................. 146
Figura 19 – Efeitos de diferentes fontes de nitrogênio sobre a produção de xilanase
por B. licheniformis CBMAI 1609............................................................................. 149
Figura 20 - Efeitos de diferentes sais minerais e aditivos sobre a produção de
xilanase por B. licheniformis CBMAI 1609 .............................................................. 151
Figura 21 – Superfícies de resposta e curvas de contorno da interação entre caseína
e bagaço de laranja (a), caseína e farelo de soja (b) e bagaço de laranja e farelo de
soja (c) na produção de xilanase por B. licheniformis CBMAI 1609 ........................ 162
Figura 22 – Superfície de resposta e curva de contorno da interação entre agitação
e temperatura na produção de xilanase por B. licheniformis CBMAI 1609 ............. 168
Figura 23 – Influência da quantidade de inóculo (a) e do pH inicial do meio de
cultura (b) na produção de xilanase por B. licheniformis CBMAI 1609.................... 169
Figura 24 – Cinética de fermentação e de produção de xilanase por B. licheniformis
CBMAI 1609 em meio de cultura e condições otimizadas de cultivo ...................... 172
Figura 25 – Cinética de produção de xilanase por B. licheniformis CBMAI 1609 em
meio de cultura otimizado em reator de bancada.................................................... 175
Figura 26 – Comparação da produtividade de xilanase por B. licheniformis CBMAI
1609 nas diferentes etapas realizadas neste estudo .............................................. 177
Figura 27 – Avaliação da presença de diferentes hidrolases glicosídicas nos
sobrenadantes de cultivo de B. licheniformis CBMAI 1609 e de B. licheniformis ATCC
14580 após 48 horas de cultivo a 37 ºC e 250 rpm em frascos agitados contendo o
meio de cultura otimizado ....................................................................................... 181
Figura 28 – Efeito do pH (a) e da temperatura (b) na atividade enzimática do sistema
xilanolítico de B. licheniformis CBMAI 1609 ............................................................ 185
12
Figura 29 – Efeito do pH (a) e da temperatura (b) na estabilidade enzimática do

sistema xilanolítico de B. licheniformis CBMAI 1609 ............................................... 187
Figura 30 – Cromatograma da purificação das hidrolases glicosídicas presentes no
extrato enzimático bruto de B. licheniformis CBMAI 1609 em coluna de troca
aniônica DEAE Sepharose Fast Flow ..................................................................... 192
Figura 31 – Cromatograma da purificação das hidrolases glicosídicas presentes no
extrato enzimático bruto de B. licheniformis CBMAI 1609 em coluna de exclusão
molecular Superdex 200 10/300 GL e análise eletroforética por SDS-PAGE das
proteínas do pico S1 ............................................................................................... 194
Figura 32 - Cromatograma da eluição de padrões com massa molecular conhecida
na coluna Superdex 200 10/300 GL ........................................................................ 194
Figura 33 – Cromatograma da purificação da preparação enzimática concentrada
com 60 % de sulfato de amônio de B. licheniformis CBMAI 1609 em coluna de troca
aniônica Q Sepharose Fast Flow (a) e análise eletroforética dos picos de eluição das
proteínas por gel nativo (b)...................................................................................... 199
Figura 34 – Ensaios de atividade enzimática de xilanase, endoglucanase,
xiloglucanase, liquenase, mananase e galactanase com as amostras dos picos
obtidos na purificação em coluna de troca aniônica Q Sepharose Fast Flow ......... 200
Figura 35 – Cromatograma da purificação da preparação enzimática concentrada
aniônica DEAE Sepharose Fast Flow (a) e análise eletroforética dos picos de eluição
das proteínas por gel nativo (b) ............................................................................... 201
Figura 36 – Ensaios de atividade enzimática de xilanase, endoglucanase,
xiloglucanase, liquenase, mananase e galactanase com as amostras dos picos
obtidos na purificação em coluna de troca aniônica DEAE Sepharose Fast Flow .. 202
Figura 37 – Purificação da preparação enzimática concentrada com 60 % de sulfato
de amônio de B. licheniformis CBMAI 1609 em coluna de troca catiônica CM
Sepharose Fast Flow .............................................................................................. 203
Figura 38 – Cromatograma da purificação em coluna de exclusão molecular
Superdex 200 10/300 GL das proteínas do pico D1 da etapa cromatográfica em
coluna de troca aniônica DEAE Sepharose e análise eletroforética por gel nativo da
amostra de proteínas eluídas na cromatografia em coluna de exclusão
molecular ................................................................................................................. 205
13
Figura 39 – Análise eletroforética por SDS-PAGE das amostras dos picos de eluição
das proteínas obtidos nas purificações em colunas de troca aniônica DEAE
Sepharose Fast Flow e de exclusão molecular Superdex 200 10/300 GL .............. 211
Figura 40 – Análises de zimografia do complexo multienzimático de B. licheniformis
CBMAI 1609 presente nas amostras do pico de eluição de proteínas D1 da
purificação em coluna de troca aniônica DEAE Sepharose Fast Flow antes e depois
da etapa cromatográfica de exclusão molecular na coluna Superdex 200 10/300
GL ........................................................................................................................... 214
Figura 41 – Painel de substratos para as amostras obtidas durante os passos da
purificação do complexo multienzimático produzido por B. licheniformis CBMAI
1609 ........................................................................................................................ 218
Figura 42 – Eletroforese em gel de agarose para avaliação do perfil de digestão do
DNA genômico da linhagem B. licheniformis CBMAI 1609 com a enzima de restrição
Sal3AI ...................................................................................................................... 220
Figura 43 - Eletroforese em gel de agarose da amostra de DNA genômico de B.
licheniformis CBMAI 1609 obtida ao final da etapa de digestão.............................. 221
Figura 44 – Esquema ilustrativo do vetor pUC19 ................................................... 222
Figura 45 - Eletroforese em gel de agarose para avaliação da digestão do DNA
plasmidial de 12 colônias brancas da biblioteca genômica de B. licheniformis CBMAI
1609 com as enzimas de restrição EcoRI e HindIII ................................................. 223
Figura 46 - Eletroforese em gel de agarose para avaliação do perfil de digestão do
DNA plasmidial dos 5 clones positivos na triagem funcional da biblioteca genômica
de B. licheniformis CBMAI 1609 com as enzimas de restrição EcoRI e HindIII. ..... 224
Figura 47 – Confirmação da atividade enzimática dos 5 clones da biblioteca
genômica de B. licheniformis CBMAI 1609 que apresentaram halos de degradação
ao redor das colônias na triagem funcional com os substratos carboximetilcelulose,
pectina e xilana ....................................................................................................... 225
Figura 48 – Análise de domínios conservados para uma das ORFs encontradas no
inserto de DNA do clone D12 através da ferramenta Conserved Domains ............ 227
Figura 49 - Análise de domínios conservados para a ORF1 (a) e ORF2 (b)
encontradas no inserto de DNA do clone K3 através da ferramenta Conserved
Domains .................................................................................................................. 228
Figura 50 – Eletroforese em gel de agarose dos produtos das amplificações por
PCR dos genes BlGAl e BlXeg de B. licheniformis CBMAI 1609 ............................ 231
14
Figura 51 - Esquema ilustrativo do vetor pET-28a(+) ............................................. 232

Figura 52 - Análise de domínios conservados para os genes BlAra (a), BlAbf (b),
BlCel (c), BlRhg (d) e BlLac (e) da linhagem B. licheniformis ATCC 14580 através da
ferramenta Conserved Domains.............................................................................. 235
Figura 53 – Eletroforese em gel de agarose dos produtos das amplificações por
PCR dos genes BlAra, BlAbf, BlCel, BlRhg e BlLac a partir do DNA genômico da
linhagem B. licheniformis CBMAI 1609 ................................................................... 236
Figura 54 – Alinhamento das sequências de aminoácidos preditas para as
galactanases de B. licheniformis CBMAI 1609 e B. licheniformis ATCC 14580 através
da ferramenta ClustalW ........................................................................................... 239
Figura 55 – Géis de eletroforese SDS-PAGE para avaliação da expressão da
galactanase codificada pelo gene BlGal de B. licheniformis CBMAI1609 nas
linhagens E. coli BL21(DE3), BL21(DE3)pRare2, Rosetta-gami 2(DE3) e Artic
Express (DE3) ......................................................................................................... 240
Figura 56 – Cromatograma da purificação da galactanase recombinante de B.
licheniformis CBMAI 1609 em coluna de troca aniônica Source 15Q 4.6/100 PE (a) e
gel de eletroforese SDS-PAGE com os passos da expressão e purificação da enzima
(b) ............................................................................................................................ 242
Figura 57 – Efeito do pH (a) e da temperatura (b) na atividade enzimática da
galactanase recombinante de B. licheniformis CBMAI 1609 ................................... 244
Figura 58 – Efeito do pH (a) e da temperatura (b) na estabilidade da galactanase
recombinante de B. licheniformis CBMAI 1609 ....................................................... 245
Figura 59 – Efeito da concentração do substrato galactana de batata na atividade da
galactanase recombinante de B. licheniformis CBMAI1609 .................................... 249
Figura 60 – Eletroforese capilar dos produtos de hidrólise do substrato galactana de
batata pela galactanase recombinante de B. licheniformis CBMAI 1609 ................ 252
Figura 61 – Espectro de dicroísmo circular no UV-distante em pH 7,4 a 20 ºC (a) e
curva de desnaturação térmica (b) da galactanase recombinante de B. licheniformis
CBMAI 1609 ............................................................................................................ 253
Figura 62 – Alinhamento das sequências de aminoácidos preditas para a enzima
codificada pelo gene BlXeg de B. licheniformis CBMAI 1609 e para a
endoglucanase/xiloglucanase de B. licheniformis ATCC 14580.............................. 255
endoglucanase GH12 codificada pelo gene BlXeg de B. licheniformis CBMAI1609
15
nas linhagens E. coli BL21(DE3), BL21(DE3)pRare2, Rosetta-gami 2(DE3) e Artic

Express (DE3) ......................................................................................................... 257
Figura 64 – Cromatograma da purificação da endoglucanase GH12 recombinante de
B. licheniformis CBMAI 1609 em coluna de afinidade His-Trap Fast Flow com íons
níquel imobilizados (a) e gel de eletroforese SDS-PAGE com os passos da
expressão e purificação da enzima (b) .................................................................... 258
Figura 65 - Painel de substratos para avaliação da especificidade da endoglucanase
GH12 recombinante de B. licheniformis CBMAI 1609 ............................................. 259
Figura 66 – Efeito do pH (a) e da temperatura (b) na atividade enzimática da
endoglucanase GH12 recombinante de B. licheniformis CBMAI 1609.................... 262
Figura 67 - Efeito do pH (a) e da temperatura (b) na estabilidade enzimática da
Figura 68 – Efeito da concentração dos substratos xiloglucano de tamarindo (a) e β-
glucano de cevada na atividade da endoglucanase GH12 recombinante de B.
licheniformis CBMAI 1609 ....................................................................................... 266
Figura 69 – Eletroforese capilar dos produtos de hidrólise do substrato xiloglucano
de tamarindo pela endoglucanase GH12 recombinante de B. licheniformis CBMAI
1609 ........................................................................................................................ 268
Figura 70 - Eletroforese capilar dos produtos de hidrólise do substrato β-glucano de
cevada pela endoglucanase GH12 recombinante de B. licheniformis CBMAI
1609 ........................................................................................................................ 269
Figura 71 – Espectro de dicroísmo circular no UV-distante em pH 7,4 a 20 ºC (a) e
curva de desnaturação térmica (b) da endoglucanase GH12 recombinante de B.
Figura 72 - Alinhamento das sequências de aminoácidos preditas para a enzima
codificada pelo gene BlCel de B. licheniformis CBMAI 1609 e para a endoglucanase
CelB de B. licheniformis ATCC 14580. .................................................................... 272
endoglucanase GH5 codificada pelo gene BlCel de B. licheniformis CBMAI 1609 nas
Express (DE3) (a) e testes de atividade enzimática com os substratos CMC e β-
glucano e os sobrenadantes do processo de lise celular (b) ................................... 274
Figura 74 – Cromatograma da purificação da endoglucanase codificada pelo gene
BlCel de B. licheniformis CBMAI 1609 em coluna de afinidade His-Trap Fast Flow
16
com íons níquel imobilizados (a) e gel de eletroforese SDS-PAGE com os passos da
purificação da enzima (b) ........................................................................................ 275
Figura 75 - Painel de substratos para avaliação da especificidade da endoglucanase
GH5 recombinante de B. licheniformis CBMAI 1609 ............................................... 276
Figura 76 - Efeito do pH (a) e da temperatura (b) na atividade enzimática da
endoglucanase GH5 recombinante de B. licheniformis CBMAI 1609 sobre o
substrato xiloglucano de tamarindo ......................................................................... 277
Figura 77 - Efeito do pH (a) e da temperatura (b) na atividade enzimática da
substrato β-glucano de cevada ............................................................................... 278
endoglucanase GH5 recombinante de B. licheniformis CBMAI 1609 utilizando o
Figura 79 – Efeito da concentração dos substratos xiloglucano de tamarindo (a) e β-
glucano de cevada na atividade da endoglucanase GH5 recombinante de B.
Figura 80 - Eletroforese capilar dos produtos de hidrólise do substrato xiloglucano
de tamarindo pela endoglucanase GH5 recombinante de B. licheniformis CBMAI
1609 ........................................................................................................................ 284
Figura 81 - Eletroforese capilar dos produtos de hidrólise do substrato β-glucano de
cevada pela endoglucanase GH5 recombinante de B. licheniformis CBMAI 1609 . 285
Figura 82 - Espectro de dicroísmo circular no UV-distante em pH 7,4 a 20 ºC (a) e
curva de desnaturação térmica obtida por DSC (b) para a endoglucanase GH5
Figura 83 - Alinhamento das sequências de aminoácidos preditas para as lacases
de B. licheniformis CBMAI 1609 e B. licheniformis ATCC 14580 através da
ferramenta ClustalW ................................................................................................ 289
Figura 84 – Géis de eletroforese SDS-PAGE para avaliação da expressão da lacase
codificada pelo gene BlLac de B. licheniformis CBMAI1609 nas linhagens E. coli
BL21(DE3), BL21(DE3)pRare2 e Rosetta-gami 2(DE3) (a) e testes de atividade
enzimática de lacase com os sobrenadantes do processo de lise celular (b) ......... 291
Figura 85 – Cromatograma da purificação da lacase CotA recombinante de B.
licheniformis CBMAI 1609 em coluna de afinidade His-Trap Fast Flow com íons
17
níquel imobilizados (a) e gel de eletroforese SDS-PAGE com os passos de

expressão e purificação da lacase (b) ..................................................................... 292
Figura 86 – Efeito do pH (a) e da temperatura (b) na atividade enzimática da lacase
lacase recombinante de B. licheniformis CBMAI 1609 ............................................ 294
Figura 88 - Efeito da concentração do substrato ABTS na atividade da lacase
recombinante de B. licheniformis CBMAI1609 ........................................................ 298
Figura 89 - Espectro de dicroísmo circular no UV-distante em pH 7,4 a 20 ºC para a
Figura 90 – Efeito da suplementação de um coquetel enzimático comercial com a
enzima galactanase de B. licheniformis CBMAI 1609 ............................................. 349
Figura 91 - Alinhamento das sequências de aminoácidos preditas para as α-L-
arabinofuranosidases de B. licheniformis CBMAI 1609, B. licheniformis ATCC 14580
e B. subtilis subsp. subtilis 168 através da ferramenta ClustalW ............................ 354
Figura 92 – Géis de eletroforese SDS-PAGE para avaliação da expressão da α-L-
arabinofuranosidase codificada pelo gene BlAbf de B. licheniformis CBMAI1609 nas
Express (a) e testes de atividade enzimática de α-L-arabinofuranosidase com os
substratos arabinana linear e arabinana desramificada (b) ..................................... 356
Figura 93 – Cromatograma da purificação da α-L-arabinofuranosidase recombinante
de B. licheniformis CBMAI 1609 em coluna de afinidade His-Trap Fast Flow com íons
níquel imobilizados (a) e gel de eletroforese SDS-PAGE com as amostras dos picos
de eluição das proteínas nessa coluna cromatográfica (b) ..................................... 357
18
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Produção das principais culturas agrícolas brasileiras e dos subprodutos

gerados durante o processamento na agroindústria brasileira no ano de 2009 ........ 37
Tabela 2 – Composição lignocelulósica de alguns subprodutos agroindustriais ...... 38
Tabela 3 – Exemplos de métodos de pré-tratamento da biomassa lignocelulósica e
suas principais características................................................................................... 47
Tabela 4 – Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a amplificação dos genes
de enzimas lignocelulolíticas avaliados neste trabalho ............................................. 97
Tabela 5 - Índices enzimáticos (IE) de alguns isolados de Bacillus sp. durante a
avaliação qualitativa em carboximetilcelulose, pectina e xilana .............................. 115
Tabela 6 – Atividades enzimáticas máximas de endoglucanase, poligalacturonase e
xilanase e teor proteico observados durante os cultivos dos 20 isolados de Bacillus
sp. em meio de cultura líquido contendo carboximetilcelulose, pectina ou xilana ... 126
Tabela 7 – Atividades das hidrolases glicosídicas avaliadas e teor de proteínas
solúveis totais observados durante os cultivos dos isolados BH19, BH47, BH54,
BH60 e BH93 em meio de cultura mínimo contendo farelo de trigo após 24 horas de
fermentação ............................................................................................................ 128
Tabela 8 – Características morfológicas, fisiológicas e bioquímicas dos isolados
Bacillus sp. BH19 e BH27 ....................................................................................... 137
Tabela 9 – Composição dos subprodutos agroindustriais utilizados neste estudo de
acordo com dados disponíveis na literatura ............................................................ 145
Tabela 10 – Matriz do delineamento fatorial fracionado 26-2 com os valores
codificados e reais para as variáveis estudadas e atividade de xilanase obtida após
72 horas de cultivo da linhagem B. licheniformis CBMAI 1609 ............................... 153
Tabela 11 – Estimativa dos efeitos das variáveis independentes sobre a produção
de xilanase por B. licheniformis CBMAI 1609 no delineamento fatorial fracionado
26-2 ........................................................................................................................... 155
Tabela 12 – Matriz do delineamento composto central rotacional 23 do meio de
cultura com os valores codificados e reais (em parênteses) para as variáveis
estudadas e resultados de atividade enzimática de xilanase obtidos após 72 horas
de cultivo da linhagem B. licheniformis CBMAI 1609 e previstos pelo modelo
matemático .............................................................................................................. 156
19
Tabela 13 – Resultados do coeficiente de regressão, desvio padrão, teste t-Student

e p-valor do DCCR para otimização dos componentes do meio de cultura para
produção de xilanase por B. licheniformis CBMAI 1609 .......................................... 158
Tabela 14 – Análise de variância (ANOVA) para a atividade de xilanase do DCCR 23
para otimização do meio de cultura para fermentação de B. licheniformis CBMAI
1609 ........................................................................................................................ 159
Tabela 15 - Matriz do delineamento composto central rotacional 22 dos parâmetros
de fermentação com os valores codificados e reais (em parênteses) para as
variáveis estudadas e resultados de atividade enzimática de xilanase obtidos após
48 horas de cultivo da linhagem B. licheniformis CBMAI 1609 e previstos pelo
modelo matemático ................................................................................................. 165
Tabela 16 – Resultados do coeficiente de regressão, desvio padrão, teste t-Student
e p-valor do DCCR para otimização dos parâmetros de cultivo para produção de
xilanase pela linhagem B. licheniformis CBMAI 1609 ............................................. 166
Tabela 17 – Análise de variância (ANOVA) para a atividade de xilanase do DCCR 22
para otimização dos parâmetros agitação e temperatura para cultivo da linhagem B.
Tabela 18 – Efeito de íons metálicos e de compostos quelantes na atividade
enzimática do sistema xilanolítico de B. licheniformis CBMAI 1609 ........................ 190
Tabela 19 – Concentração do sobrenadante de cultivo de B. licheniformis CBMAI
1609 por precipitação fracionada com sulfato de amônio ....................................... 196
Tabela 20 – Purificação do complexo multienzimático de B. licheniformis CBMAI
1609 por precipitação fracionada com sulfato de amônio e cromatografia em colunas
de troca aniônica DEAE Sepharose e de exclusão molecular Superdex 200 ......... 206
Tabela 21 – Efeito de íons metálicos e de compostos quelantes na atividade da
galactanase recombinante de B. licheniformis CBMAI 1609 ................................... 248
Tabela 23 – Parâmetros cinéticos estimados para a endoglucanase GH12
Tabela 24 - Efeito de íons metálicos e de compostos quelantes na atividade da
20
Tabela 25 – Parâmetros cinéticos estimados para a endoglucanase GH5

21
SUMÁRIO
RESUMO..................................................................................................................... 6
ABSTRACT ................................................................................................................. 8
LISTA DE ILUSTRAÇÕES ........................................................................................ 10
LISTA DE TABELAS ................................................................................................. 18
SUMÁRIO.................................................................................................................. 21
1. INTRODUÇÃO GERAL ......................................................................................... 29
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................. 33
2.1. Resumo ........................................................................................................... 33
2.2. Introdução ....................................................................................................... 33
2.3. Geração e composição dos subprodutos agroindustriais ................................ 35
2.4. Reaproveitamento dos subprodutos agroindustriais em biorrefinarias ............ 40
2.5. Reaproveitamento dos subprodutos agroindustriais para a produção do
bioetanol de segunda geração ............................................................................... 44
2.6. Biotecnologia enzimática no reaproveitamento de subprodutos
agroindustriais ........................................................................................................ 49
2.6.1. Classificação das enzimas lignocelulolíticas ............................................. 49
2.6.2. Enzimas envolvidas na degradação da celulose ...................................... 50
2.6.3. Enzimas envolvidas na degradação das hemiceluloses ........................... 50
2.6.4. Enzimas envolvidas na degradação da pectina ........................................ 52
2.6.5. Enzimas envolvidas na degradação da lignina ......................................... 54
2.6.6. Componentes acessórios na degradação dos materiais lignocelulósicos 55
2.6.7. Produção das enzimas lignocelulolíticas microbianas .............................. 56
2.6.7.1. Produção de complexos multienzimáticos celulolíticos e
hemicelulolíticos .............................................................................................. 58
2.6.8. Atuais perspectivas nos estudos de enzimas lignocelulolíticas para a
conversão de subprodutos agroindustriais ......................................................... 61
2.7. Aplicações biotecnológicas das enzimas lignocelulolíticas ............................. 64
2.8. Conclusões ...................................................................................................... 67
3. MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 68
3.1. Etapa experimental 1 - “Avaliação do potencial biotecnológico para produção
de hidrolases glicosídicas e caracterização taxonômica de isolados de Bacillus
sp.” ......................................................................................................................... 68
22
3.1.1. Micro-organismos utilizados e manutenção .............................................. 68

3.1.2. Determinações analíticas.......................................................................... 68
3.1.2.1. Determinações de atividade enzimática ............................................. 68
3.1.2.2. Determinação do teor de proteínas solúveis totais ............................. 69
3.1.3. Avaliação do potencial biotecnológico dos isolados de Bacillus sp. para
produção de hidrolases glicosídicas ................................................................... 70
3.1.3.1. Seleção de micro-organismos produtores de celulase, pectinase e
xilanase através de testes em placas de Petri................................................. 70
3.1.3.2. Seleção de micro-organismos produtores de hidrolases glicosídicas
por fermentação submersa .............................................................................. 70
3.1.3.2.1. Seleção de micro-organismos produtores de endoglucanase,
poligalacturonase e xilanase em meio de cultura líquido contendo substratos
comerciais .................................................................................................... 70
3.1.3.2.2. Seleção de micro-organismos produtores de hidrolases
glicosídicas em meio de cultura líquido contendo farelo de trigo ................. 71
3.1.4. Caracterização taxonômica e avaliação da diversidade genética dos
isolados de Bacillus sp. ...................................................................................... 71
3.1.4.1. Extração do DNA genômico ............................................................... 71
3.1.4.2. Caracterização taxonômica dos isolados de Bacillus sp. baseado na
sequência do gene RNAr 16S ......................................................................... 73
3.1.4.3. Caracterização taxonômica dos isolados de Bacillus sp. baseada nas
características morfológicas e fisiológicas ....................................................... 74
3.1.4.4. Análise da diversidade genética dos isolados de Bacillus sp. por
ARDRA. ........................................................................................................... 74
3.2. Etapa experimental 2 – “Otimização da produção de hemicelulases por B.
licheniformis CBMAI 1609 utilizando subprodutos agroindustriais” ........................ 76
3.2.1. Micro-organismos utilizados ..................................................................... 76
3.2.2. Preparo do inóculo e produção da enzima ............................................... 76
3.2.3. Determinações analíticas.......................................................................... 76
3.2.3.1. Determinação das atividades enzimáticas.......................................... 77
3.2.3.2. Determinação dos açúcares redutores solúveis ................................. 77
3.2.3.3. Determinação do crescimento microbiano .......................................... 77
3.2.4. Efeitos de fontes de carbono, nitrogênio, sais minerais e aditivos na
fermentação de B. licheniformis CBMAI 1609 e produção de xilanase .............. 78
23
3.2.5. Identificação dos componentes do meio de cultura significativos para

fermentação de B. licheniformis CBMAI 1609 e produção de xilanase usando
delineamento fatorial fracionado ......................................................................... 79
3.2.6. Otimização das concentrações dos componentes do meio de cultura
significativos para fermentação de B. licheniformis CBMAI 1609 e produção de
xilanase usando delineamento composto central rotacional ............................... 79
3.2.7. Otimização dos parâmetros temperatura e agitação para fermentação de
B. licheniformis CBMAI 1609 e produção de xilanase usando delineamento
composto central rotacional ................................................................................ 80
3.2.8. Influência da quantidade de inóculo e do pH inicial do meio de cultura para
fermentação de B. licheniformis CBMAI 1609 e produção de xilanase .............. 81
3.2.9. Estudo da cinética de fermentação de B. licheniformis CBMAI 1609 e de
produção de xilanase .......................................................................................... 82
3.2.10. Ensaio de ampliação da escala de fermentação de B. licheniformis
CBMAI 1609 e produção de xilanase ................................................................. 82
3.2.11. Avaliação da produção simultânea de diferentes hidrolases glicosídicas
durante a fermentação de B. licheniformis CBMAI 1609 e B. licheniformis ATCC
14580 .................................................................................................................. 83
3.3. Etapa experimental 3 – “Caracterização do sistema xilanolítico de B.
licheniformis CBMAI 1609 e isolamento de um complexo multienzimático do tipo
xilanossomo” .......................................................................................................... 83
3.3.1. Produção das enzimas ............................................................................. 83
3.3.2. Caracterização bioquímica do sistema xilanolítico de B.
licheniformis CBMAI 1609................................................................................... 84
3.3.2.1. Efeito do pH e da temperatura na atividade enzimática ..................... 84
3.3.2.2. Efeito do pH e da temperatura na estabilidade enzimática................. 84
3.3.2.3. Efeito de íons metálicos e de compostos quelantes na atividade
enzimática ....................................................................................................... 85
3.3.3. Purificação das hidrolases glicosídicas produzidas por B. licheniformis
CBMAI 1609 ....................................................................................................... 85
3.3.3.1. Purificação das hidrolases glicosídicas de B. licheniformis CBMAI
1609 utilizando coluna cromatográfica de troca aniônica DEAE Sepharose
Fast Flow ......................................................................................................... 85
24
3.3.3.2. Purificação das hidrolases glicosídicas de B. licheniformis CBMAI

1609 utilizando coluna cromatográfica de exclusão molecular Superdex 200
10/300 GL ........................................................................................................ 86
3.3.4. Isolamento do complexo multienzimático produzido pela linhagem B.
3.3.4.1. Concentração do extrato enzimático bruto de B. licheniformis CBMAI
1609................................................................................................................. 87
3.3.4.2. Purificação cromatográfica do complexo multienzimático de B.
licheniformis CBMAI 1609 utilizando colunas cromatográficas de troca
iônica...... ......................................................................................................... 88
3.3.4.3. Purificação do complexo multienzimático de B. licheniformis CBMAI
1609 utilizando coluna cromatográfica de exclusão molecular ........................ 89
3.4.5. Análises eletroforéticas ............................................................................. 89
3.4.5.1. SDS-PAGE e Native-PAGE ................................................................ 89
3.4.5.2. Zimogramas ........................................................................................ 90
3.4. Etapa experimental 4 – “Expressão, purificação e caracterização de enzimas
lignocelulolíticas obtidas a partir de genes isolados da linhagem B. licheniformis
CBMAI 1609” .......................................................................................................... 91
3.4.1. Prospecção de genes de enzimas lignocelulolíticas da linhagem B.
3.4.1.1. Prospecção de genes de enzimas lignocelulolíticas da linhagem B.
licheniformis CBMAI 1609 através de uma biblioteca genômica ..................... 91
3.4.1.1.1. Obtenção do DNA genômico ........................................................ 92
3.4.1.1.2. Digestão do DNA genômico ......................................................... 92
3.4.1.1.3. Ligação dos insertos de DNA genômico digerido ao vetor pUC19
..................................................................................................................... 93
3.4.1.1.4. Transformação bacteriana por eletroporação............................... 93
3.4.1.1.5. Confirmação da transformação bacteriana e estocagem dos
clones positivos ............................................................................................ 94
3.4.1.1.6. Triagem funcional da biblioteca genômica ................................... 95
5.3.1.1.7. Confirmação dos insertos de DNA nos clones positivos da
biblioteca genômica...................................................................................... 95
3.4.1.2. Prospecção in silico de genes homólogos de enzimas lignocelulolíticas
da linhagem de B. licheniformis ATCC 14580 ................................................. 96
25
3.4.2. Amplificação dos genes das enzimas lignocelulolíticas avaliadas e

clonagem em vetor de alta cópia ........................................................................ 98
3.4.3. Subclonagem dos genes das enzimas lignocelulolíticas no vetor de
expressão pET-28a(+) ...................................................................................... 100
3.4.4. Expressão das enzimas lignocelulolíticas recombinantes ...................... 101
3.4.5. Purificação das enzimas lignocelulolíticas recombinantes...................... 104
3.4.6. Determinações das atividades enzimáticas ............................................ 105
3.4.7. Determinação do teor de proteínas solúveis totais ................................. 106
3.4.8. Caracterização das enzimas lignocelulolíticas recombinantes ............... 106
3.4.8.1. Avaliação da especificidade enzimática ........................................... 106
3.4.8.2. Efeito do pH e da temperatura na atividade e estabilidade
enzimática..... ................................................................................................ 107
enzimática ..................................................................................................... 107
3.4.8.4. Determinação de parâmetros cinéticos ............................................ 107
3.4.8.5. Eletroforese capilar de oligossacarídeos .......................................... 108
3.4.8.6. Caracterização biofísica ................................................................... 108
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................... 111
4.1. Etapa experimental 1 - “Avaliação do potencial biotecnológico para produção
de hidrolases glicosídicas e caracterização taxonômica de isolados de Bacillus
sp.” ....................................................................................................................... 111
4.1.1. Avaliação do potencial biotecnológico dos isolados de Bacillus sp. para
produção de hidrolases glicosídicas ................................................................. 111
4.1.1.1. Seleção de micro-organismos produtores de celulase, pectinase e
xilanase através de testes em placas de Petri............................................... 111
4.1.1.2. Seleção de micro-organismos produtores de hidrolases glicosídicas
por fermentação submersa ............................................................................ 117
4.1.1.2.1. Seleção de micro-organismos produtores de endoglucanase,
poligalacturonase e xilanase em meio de cultura líquido contendo substratos
comerciais .................................................................................................. 117
4.1.1.2.2 Seleção de micro-organismos produtores de hidrolases
glicosídicas em meio de cultura líquido contendo farelo de trigo ............... 127
isolados de Bacillus sp. .................................................................................... 132
26
4.1.2.1. Caracterização taxonômica dos isolados de Bacillus sp. baseado na

sequência do gene RNAr 16S ....................................................................... 132
4.1.2.2. Análise da diversidade genética dos isolados de Bacillus sp. por
ARDRA ......................................................................................................... 138
4.2. Etapa experimental 2 - “Otimização da produção de hemicelulases por B.
licheniformis CBMAI 1609 utilizando subprodutos agroindustriais” ...................... 144
fermentação de B. licheniformis CBMAI 1609 e produção de xilanase ............ 144
4.2.2. Identificação dos componentes do meio de cultura significativos para
fermentação de B. licheniformis CBMAI 1609 e produção de xilanase usando
delineamento fatorial fracionado ....................................................................... 152
4.2.3. Otimização das concentrações dos componentes do meio de cultura
significativos para fermentação de B. licheniformis CBMAI 1609 e produção de
xilanase usando delineamento composto central rotacional ............................. 155
4.2.4. Otimização dos parâmetros temperatura e agitação para fermentação de
B. licheniformis CBMAI 1609 e produção de xilanase usando delineamento
composto central rotacional .............................................................................. 164
4.2.5. Influência da quantidade de inóculo e do pH inicial do meio de cultura
para fermentação de B. licheniformis CBMAI 1609 e produção de xilanase .... 168
4.2.6. Estudo da cinética de fermentação de B. licheniformis CBMAI 1609 e de
produção de xilanase ........................................................................................ 171
4.2.7. Ensaio de ampliação da escala de fermentação de B. licheniformis CBMAI
1609 e produção de xilanase ............................................................................ 174
4.2.8. Comparação dos custos dos meios de cultura utilizados para produção de
xilanase............................................................................................................. 178
4.2.9. Avaliação da produção simultânea de diferentes hidrolases glicosídicas
durante a fermentação de B. licheniformis CBMAI 1609 e B. licheniformis ATCC
14580 ................................................................................................................ 180
4.3. Etapa experimental 3 - “Caracterização do sistema xilanolítico de B.
licheniformis CBMAI 1609 e isolamento de um complexo multienzimático do tipo
xilanossomo” ........................................................................................................ 184
4.3.1. Caracterização bioquímica do sistema xilanolítico de B. licheniformis
CBMAI 1609 ..................................................................................................... 184
27
4.3.1.1. Efeito do pH e da temperatura na atividade enzimática do sistema

xilanolítico de B. licheniformis CBMAI 1609 .................................................. 184
4.3.1.2. Efeito do pH e da temperatura na estabilidade enzimática do sistema
xilanolítico de B. licheniformis CBMAI 1609 .................................................. 186
enzimática do sistema xilanolítico de B. licheniformis CBMAI 1609 .............. 188
4.3.2. Purificação das hidrolases glicosídicas produzidas por B. licheniformis
CBMAI 1609 ..................................................................................................... 191
4.3.3. Isolamento do complexo multienzimático produzido pela linhagem B.
licheniformis CBMAI 1609................................................................................. 195
4.3.3.1. Concentração do extrato enzimático bruto de B. licheniformis CBMAI
1609............................................................................................................... 195
licheniformis CBMAI 1609 utilizando colunas cromatográficas de troca
iônica..... ........................................................................................................ 198
4.3.3.3. Purificação do complexo multienzimático de B. licheniformis CBMAI
1609 utilizando coluna cromatográfica de exclusão molecular ...................... 204
4.3.3.4. Avaliação de algumas propriedades do complexo multienzimático de
B. licheniformis CBMAI 1609 ......................................................................... 210
4.4. Etapa experimental 4 - “Expressão, purificação e caracterização de enzimas
lignocelulolíticas obtidas a partir de genes isolados da linhagem B. licheniformis
CBMAI 1609” ........................................................................................................ 220
licheniformis CBMAI 1609 através de uma biblioteca genômica ...................... 220
4.4.2. Prospecção in silico de genes homólogos de enzimas lignocelulolíticas da
linhagem B. licheniformis ATCC 14580 ............................................................ 233
4.4.3. Expressão, purificação e caracterização da galactanase da família GH53
codificada pelo gene BlGal de B. licheniformis CBMAI 1609 ............................ 237
4.4.4. Expressão, purificação e caracterização da endoglucanase da família
GH12 codificada pelo gene BlXeg de B. licheniformis CBMAI 1609 ................. 253
4.4.5. Expressão, purificação e caracterização da endoglucanase da família GH5
codificada pelo gene BlCel de B. licheniformis CBMAI 1609 ............................ 270
4.4.6. Expressão, purificação e caracterização da lacase CotA codificada pelo
gene BlLac de B. licheniformis CBMAI 1609 .................................................... 286
28
5. CONCLUSÕES ................................................................................................... 300

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 302
7. APÊNDICES........................................................................................................ 348
7.1. Apêndice 1 – Sequência nucleotídica completa do gene RNAr 16S da
linhagem B. licheniformis CBMAI 1609 ................................................................ 348
7.2. Apêndice 2 – Estudo de aplicação da galactanase recombinante de B.
licheniformis CBMAI 1609 .................................................................................... 348
7.2.1. Referências Bibliográficas ...................................................................... 350
7.3. Apêndice 3 - Expressão e purificação da α-L-arabinofuranosidase da família
GH51 codificada pelo gene BlAbf de B. licheniformis CBMAI 1609 ..................... 351
7.3.1. Referências Bibliográficas ...................................................................... 358
8. ANEXOS ............................................................................................................. 360
8.1. Anexo 1 – Relatório da avaliação de biossegurança do projeto de pesquisa
pela Comissão de Biossegurança do Centro Nacional de Pesquisa em Energia e
Materiais (CNPEM) .............................................................................................. 360
8.2. Anexo 2 – Comprovante do depósito de pedido de patente para proteção do
meio de cultura e do processo de produção de hidrolases glicosídicas
apresentados nesta tese ...................................................................................... 361
29
1. INTRODUÇÃO GERAL
O Brasil destaca-se no cenário mundial por ser um dos principais países

de atividade agrícola e também pela grande quantidade de subprodutos gerada
anualmente pelo seu setor agroindustrial. Durante o ano de 2009, por exemplo, as
principais culturas agrícolas brasileiras (trigo, milho, cana-de-açúcar, arroz, laranja e
mandioca) ocuparam juntas uma área de aproximadamente 28,8 milhões de
hectares e geraram 597 milhões de toneladas de subprodutos (Ferreira-Leitão et al.,
2010). Esses subprodutos agroindustriais representam um valor negativo na
economia das operações agrícolas, pelo fato de ainda conterem muitas substâncias
reutilizáveis de alto valor que acabam sendo desperdiçadas e também por provocar
efeitos adversos sobre o meio ambiente no decorrer da sua disposição final
(Menezes, 2007).
Os subprodutos agroindustriais são constituídos majoritariamente de
material lignocelulósico, ou seja, sua estrutura tem como principais constituintes a
celulose, a hemicelulose e a lignina. Além desses três componentes principais, os
subprodutos agroindustriais também podem conter amido, pectina e proteínas, o que
os caracteriza como materiais extremamente heterogêneos e que podem ser
utilizados através de tecnologias adequadas para conversão em produtos comerciais
ou como matérias-primas para processos secundários (Bon; Ferrara; Corvo, 2008;
Howard et al., 2003).
Nos últimos anos, um grande esforço tem sido feito para promover o
reaproveitamento dos subprodutos agroindustriais, lixos municipais e recursos
florestais em processos de conversão, visando reduzir a atual dependência da
sociedade da indústria petroquímica, bem como, agregar valor às cadeias produtivas
e reduzir possíveis impactos ambientais do acúmulo destes na natureza
(Alexandrino et al., 2007; Laufenberg; Kunz; Nystroem, 2003; Maity, 2015).
Dentre os vários bioprocessos que têm sido desenvolvidos para utilização
dos subprodutos agroindustriais, destaca-se a bioconversão desses materiais em
biorrefinarias, através de uma etapa inicial de pré-tratamento utilizando, por
exemplo, ácidos e a subsequente hidrólise dos polissacarídeos restantes por ação
de enzimas (principalmente por celulases, hemicelulases e pectinases), para a
obtenção de licor açucarado contendo hexoses e pentoses, que em etapas
seguintes podem ser utilizadas como blocos construtores para a produção de uma
30
imensa gama de moléculas, como biocombustíveis, precursores de produtos

químicos, ácidos orgânicos, pigmentos, antibióticos, biopolímeros, entre outros
(Castro, 2006; Howard et al., 2003; Pereira Júnior, 2010). Contudo, esse processo
de reaproveitamento dos resíduos agroindustriais ainda não possui viabilidade
econômica, pois esbarra, principalmente, nos altos custos de produção das enzimas
usadas e na necessidade de obtenção de biocatalisadores mais eficientes e com
maior estabilidade catalítica (Baneerjee; Scott-Craig; Walton, 2010; Liu et al., 2013a;
Limayem; Ricke, 2012).
Recentemente, o interesse na pesquisa de enzimas lignocelulolíticas tem
aumentado consideravelmente não só pela sua possível utilização em processos de
sacarificação de materiais lignocelulósicos, mas também pelas suas potenciais
aplicações para a melhora da digestibilidade de rações animais, no
biobranqueamento da polpa de papel e em processos nas indústrias têxtil e de
alimentos. Novas enzimas lignocelulolíticas estão sendo ativamente pesquisadas
através do isolamento de micro-organismos produtores e da prospecção de genes
que codificam estas enzimas em diferentes micro-organismos e em metagenomas.
Destaca-se também neste cenário, a realização de estudos para a redução dos
custos de produção das enzimas, o desenvolvimento de enzimas com características
melhoradas e a otimização das formulações enzimáticas utilizadas (Baneerjee;
Scott-Craig; Walton, 2010; Koivula et al., 2012; Liu et al., 2013; Mohanram et al.,
2013).
A prospecção de enzimas lignocelulolíticas a partir de bactérias
pertencentes ao gênero Bacillus tem despertado a atenção, pois estes micro-
organismos habitam diferentes nichos ambientais e participam da ciclagem de
nutrientes na natureza, são extensivamente usados em fermentações industriais
para produção de enzimas e antibióticos, secretam a maioria das suas enzimas no
meio de cultura, não são exigentes nutricionalmente, possuem curto tempo de
geração, são industrialmente seguras (GRAS), apresentam no genoma genes para
várias hidrolases glicosídicas e as enzimas produzidas possuem características
diferenciadas em comparação àquelas de origem fúngica (Maki; Leung; Qin, 2009;
Van Dyk et al., 2009; Zhang; Zhang, 2010).
Diante deste cenário, este trabalho teve como objetivos principais
prospectar, clonar, produzir, purificar e caracterizar enzimas lignocelulolíticas
visando a sua utilização em biorrefinarias e também nas indústrias de alimentos,
31
rações animal e de papel e celulose. Os objetivos específicos desta tese foram:

avaliar o potencial produtor de hidrolases glicosídicas de 107 isolados de Bacillus sp.
provindos de amostras de sucos de frutas submetidos à pasteurização; caracterizar
taxonomicamente alguns dos isolados com potencial para produção dessas
enzimas; otimizar as condições de fermentação do isolado microbiano que se
destacou quanto à produção de hemicelulases nos testes iniciais; efetuar a
caracterização bioquímica do sistema xilanolítico presente no sobrenadante do meio
de cultura do micro-organismo selecionado e executar estudos para purificação das
hidrolases glicosídicas produzidas; realizar a prospecção e clonagem de genes que
codificam enzimas lignocelulolíticas no micro-organismo selecionado e por fim
realizar expressão heteróloga, purificação e caracterização de algumas dessas
enzimas clonadas.
Inicialmente, essa tese apresenta uma revisão bibliográfica que aborda o
panorama geral do reaproveitamento de subprodutos agroindustriais no contexto de
biorrefinarias, assim como a utilização da catálise enzimática neste processo e os
desafios para a implementação comercial desta tecnologia. Também são
apresentadas informações sobre a composição da biomassa lignocelulósica, a
produção das enzimas lignocelulolíticas e algumas das potenciais aplicações dessas
enzimas em diferentes segmentos industriais.
A parte experimental dessa tese foi dividida em 4 etapas e sua estrutura
foi organizada de forma a dar ênfase aos objetivos específicos propostos e
resultados obtidos.
A etapa experimental 1, “Avaliação do potencial biotecnológico para
produção de hidrolases glicosídicas e caracterização taxonômica de isolados de
Bacillus sp.”, descreve a triagem dos 107 isolados de Bacillus sp. quanto ao
potencial para produção de celulases, hemicelulases e pectinases por testes
qualitativos e quantitativos. Também é relatada nesta etapa a identificação
taxonômica e a avaliação da diversidade genética pela técnica de ARDRA de 20
isolados que exibiram potencial para produzir as três enzimas.
Na etapa experimental 2, “Otimização da produção de hemicelulases por
Bacillus licheniformis CBMAI 1609 utilizando subprodutos agroindustriais”, são
apresentados os estudos realizados para a otimização do meio de cultura e das
condições de cultivo para produção de xilanase pelo isolado selecionado com
melhor potencial hemicelulolítico. Esse etapa descreve ainda a cinética de
32
crescimento e de produção da enzima, a avaliação da produção simultânea de

outras hidrolases glicosídicas pelo micro-organismo, o escalonamento da produção
da enzima em reator de bancada e a estimativa dos custos de produção de xilanase
usando o meio de cultura otimizado.
Na etapa experimental 3, “Caracterização do sistema xilanolítico de
Bacillus licheniformis CBMAI 1609 e isolamento de um complexo multienzimático do
tipo xilanossomo”, é relatada a caracterização bioquímica parcial do sistema
xilanolítico presente no sobrenadante do meio de cultura fermentado pelo isolado
selecionado e o estudo realizado para a purificação das enzimas presentes no
sobrenadante de cultivo, que acabou resultando no isolamento de um complexo
multienzimático do tipo xilanossomo. Essa etapa ainda descreve algumas das
análises realizadas na tentativa de caracterizar este complexo multienzimático
quanto a sua composição.
A etapa experimental 4, “Expressão, purificação e caracterização de
enzimas lignocelulolíticas obtidas a partir de genes isolados da linhagem Bacillus
licheniformis CBMAI 1609”, descreve a prospecção e clonagem de genes que
codificam enzimas envolvidas na hidrólise da biomassa lignocelulósica através da
construção de uma biblioteca genômica e triagem funcional dos clones e pela
estratégia de prospecção in silico de genes homólogos. Essa etapa relata ainda a
expressão heteróloga, purificação e caracterização de 4 enzimas lignocelulolíticas
recombinantes.
O apêndice 1 desta tese apresenta a sequência nucleotídica do gene
RNAr 16S do micro-organismo B. licheniformis CBMAI 1609. No apêndice 2 é
apresentado um teste realizado para avaliar o potencial de aplicação da enzima
galactanase de B. licheniformis CBMAI 1609 na suplementação de um coquetel
enzimático comercial para a hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar. No apêndice 3
é apresentado o estudo realizado na tentativa de expressar e purificar uma α-L-
arabinofuranosidase clonada na etapa experimental 4.
33
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Resumo
A comercialização de produtos oriundos de biocatálise deve crescer

substancialmente no mundo todo nas próximas décadas, como uma alternativa aos
atuais produtos baseados em tecnologias petroquímicas e também como uma
consequência para preservação do meio ambiente. A biomassa lignocelulósica é
uma das poucas matérias-primas que tem potencial para atender aos desafios de
uma economia sustentável. Neste contexto, surgem as biorrefinarias, onde a
biomassa lignocelulósica pode ser processada utilizando ferramentas e
procedimentos biotecnológicos para a produção de energia e de vários outros
compostos industrialmente relevantes. O reaproveitamento da biomassa
lignocelulósica nas biorrefinarias é uma tecnologia inovadora e promissora, mas que
ainda exibe algumas dificuldades que precisam ser superadas para a sua aplicação
em larga escala. Um passo essencial neste processo de conversão da biomassa
lignocelulósica é a despolimerização dos constituintes desse material. O processo de
degradação por via enzimática têm atraído considerável interesse devido à sua
especificidade, rendimento e condições mais suaves de operação. A hidrólise
enzimática completa dos materiais lignocelulósicos depende da ação sinérgica de
várias atividades catalíticas distintas, incluindo principalmente hidrolases glicosídicas
e algumas oxidases. Esta revisão procura apresentar um panorama geral do
reaproveitamento de subprodutos agroindustriais no contexto das biorrefinarias,
assim como a utilização da catálise enzimática neste processo e os desafios para a
implementação comercial desta tecnologia. Também são apresentados os
constituintes da biomassa lignocelulósica, as enzimas que podem ser utilizadas para
sua degradação e outras possíveis aplicações biotecnológicas destas enzimas.
2.2. Introdução
No século XX, uma grande ênfase foi dada para as pesquisas que
buscavam o desenvolvimento de produtos e energia baseados no petróleo, carvão e
gás natural, pois essas matérias-primas eram disponíveis em grande quantidade,
baratas e atendiam facilmente a demanda da população (Naik et al., 2010).
34
Atualmente, mais de 80 % da energia e 90 % dos compostos orgânicos usados no

mundo são derivados desses recursos fósseis (Maity, 2015). O petróleo é hoje a
matéria-prima básica utilizada para a fabricação de vários produtos consumidos
diariamente, como compostos químicos, farmacêuticos, alimentícios, plásticos,
pesticidas, fertilizantes, combustíveis, entre outros (Clark, 2011).
No entanto, os recursos fósseis estão tornando-se cada vez mais
limitados e caros por causa do esgotamento das reservas exploradas e pelo
aumento na demanda energética e de matéria-prima (Pereira Júnior; Gouto; Santa
Anna, 2008). Por estas razões e pela crescente preocupação mundial com as
mudanças climáticas, em decorrência do aumento dos níveis de emissão de gases
que causam o efeito estufa (CO2, CH4 e N2O), tem-se buscado cada vez mais o uso
de matérias-primas alternativas e renováveis para substituir a atual dependência da
indústria petroquímica (Cherubini; Stromman, 2011; Octave; Thomas, 2009; Santos;
Gómez; Buckeridge, 2011). Neste sentido, os Estados Unidos, por exemplo, criaram
um programa de investimento em pesquisas visando à produção de biocombustíveis
renováveis e esperam que o país seja capaz de reduzir em 30 % o seu consumo de
gasolina até 2030 (Adsul et al., 2011; Nanda et al., 2014). Empresas como a
DuPont, BASF SE, Dow Chemical, Royal DSM e Braskem também já estão
procurando usar matérias-primas renováveis no desenvolvimento de seus produtos
(Bomtempo, 2010). Estima-se que por volta de 2025, mais de 30 % das matérias-
primas da indústria química serão provenientes de fontes renováveis (Pervaiz;
Correa, 2009).
A biomassa lignocelulósica é a fonte de carbono renovável mais
abundante na natureza, correspondendo a aproximadamente 50 % de toda a
matéria orgânica terrestre (Van Dyk, 2009). O termo biomassa lignocelulósica é
utilizado para designar todo recurso renovável relacionado com a parede celular
vegetal, que é composta, principalmente, pela celulose, hemicelulose e lignina
(Nanda et al., 2014; Schlittler, 2012). Com o advento das tecnologias de conversão e
do conceito de biorrefinarias, a biomassa lignocelulósica tem sido considerada o
material mais suscetível para ser explorado na produção de energia e diversos
bioprodutos industrialmente revelantes (Adsul et al., 2011; Maity, 2015).
A utilização de materiais lignocelulósicos como matéria-prima é
extremamente promissora, pois esses são geralmente baratos e estão amplamente
distribuídos, sendo encontrados em grandes quantidades na forma de subprodutos
35
agroindustriais, recursos florestais, lixos municipais e outros materiais herbáceos

(Fernando et al., 2006). Atualmente, a biomassa lignocelulósica representa cerca de
10 % da demanda global de energia e é utilizada principalmente na alimentação
animal, como adubo e na geração de calor (Cherubini; Stromman, 2011). A
reutilização deste material renovável é importante ferramenta para a promoção da
economia agrícola, diminuição da emissão de gases que causam o efeito estufa e
para aumentar a segurança energética dos países (Zhang; Zhang, 2010).
A biotecnologia enzimática tem sido considerada uma poderosa
ferramenta para contribuir nesse processo de reutilização da biomassa
lignocelulósica. Como potenciais catalisadores industriais, as enzimas podem
fornecer alta especificidade e eficiência, baixo consumo de energia, água ou de
produtos químicos e redução na poluição ambiental (Rabelo, 2010; Sweeney; Xu,
2012). Uma ampla variedade de enzimas usadas no processamento da biomassa
lignocelulósica é atualmente comercializada e novas enzimas estão sendo
ativamente pesquisadas para este propósito, assim como a redução dos custos de
produção e a otimização das formulações enzimáticas utilizadas (Baneerjee; Scott-
Craig; Walton, 2010; Koivula et al., 2012).
Nessa perspectiva, a presente revisão reune alguns aspectos do
reaproveitamento da biomassa lignocelulósica para a compreensão da importância
do desenvolvimento desta tecnologia como uma forma de reduzir a atual
dependência de matérias-primas de origem fóssil e contribuir para o
desenvolvimento de uma economia sustentável. Este texto traz informações sobre a
geração e composição dos subprodutos agroindustriais, que é uma das principais
fontes de materiais lignocelulósicos disponíveis no Brasil, e também sobre
biorrefinarias, como uma alternativa para a utilização destes materiais. São ainda
relatadas algumas informações das enzimas envolvidas na degradação dos
componentes lignocelulósicos, as atuais perspectivas nos estudos dessas e suas
potenciais aplicações biotecnológicas.
2.3. Geração e composição dos subprodutos agroindustriais
O desenvolvimento sócio-econômico e a evolução dos hábitos de vida da

população têm conduzido ao uso indiscriminado dos recursos naturais e à geração
de grandes volumes de materiais residuais pelos diversos setores produtivos
36
(Garboza; Trindade, 2007). Os setores agroindustrial e de alimentos são hoje

aqueles que produzem as maiores quantidades de materiais lignocelulósicos
residuais (Pinto et al., 2005).
O termo subproduto agroindustrial é um termo de amplo significado que
se refere a qualquer material residual proveniente do processamento de algum
produto agrícola que ainda pode ser reaproveitado para outra finalidade. Embora o
uso desse termo possa trazer uma conotação negativa, estes materiais muitas vezes
apresentam-se como fontes nutricionais com qualidades excepcionais para serem
aproveitados na alimentação animal, além de servirem como insumo para a
fabricação de outros produtos e para a geração de energia (Forster-Carneiro et al.,
2013; Meneghetti; Domingues, 2008).
Estima-se que a produção mundial de subprodutos agroindustriais seja
em torno de 140 bilhões de toneladas por ano (Forster-Carneiro et al., 2013). Tais
materiais incluem, por exemplo, folhas, caules, sementes, palhas, bagaços, cascas,
sabugos, farelos, serragens, polpas e águas residuais (Maki; Leung; Qin, 2009).
O Brasil é um dos principais produtores e exportadores mundiais de
produtos agrícolas. Em 2010, por exemplo, o país foi responsável por 43 % da
produção mundial de cana-de-açúcar (Attard et al., 2015). A agricultura é
considerada um dos setores mais estratégicos para a consolidação da economia
brasileira, sendo o agronegócio responsável em 2013 por 22,5 % do PIB (produto
interno bruto) nacional, movimentando cerca de R$ 1,1 trilhão (Globo Rural, 2014).
Consequentemente, o Brasil também se destaca no cenário internacional como um
dos principais geradores de subprodutos agroindustriais, com uma produção
estimada em mais de 597 milhões de toneladas no ano de 2008 (Ferreira-Leitão et
al., 2010). A geração de subprodutos agroindustriais derivados da cana-de-açúcar,
soja e milho deverá aumentar no Brasil entre 25 e 30 % na safra 2019/2020 (Forster-
Carneiro et al., 2013). O bagaço da cana-de-açúcar é hoje o principal subproduto
agroindustrial produzido no país, sendo estimada uma geração de cerca de 270 Kg
de bagaço com 50 % de umidade (ou 135 Kg de material seco) para cada tonelada
de cana-de-açúcar processada nas usinas de açúcar e álcool (Attard et al., 2015).
Na Tabela 1 está resumida a produção das principais culturas agrícolas
brasileiras e dos seus respectivos subprodutos no ano de 2009. Os valores
apresentados para os subprodutos estão relacionados apenas a quantidade gerada
no processamento na agroindústria, não sendo considerados aqueles materiais
37
produzidos diretamente na agricultura que ficaram na própria área de produção. O

abandono de parte desses materiais nas lavouras pode chegar a até 50 % e é uma
prática agrícola comum, que tem como objetivo retornar certos nutrientes ao solo,
preservar a umidade, incrementar e preservar a microbiota associada e também
evitar a erosão do solo (Ferreira-Leitão et al., 2010; Schlittler, 2012).
Tabela 1 – Produção das principais culturas agrícolas brasileiras e dos subprodutos gerados
durante o processamento na agroindústria brasileira no ano de 2009
Produção
Produção Produção Fator Subprodutos
consumida
Cultura agrícola total colhida industrializada residual gerados
in natura
(106 t) (106 t) (%) (106 t)
(106 t)
Arroz 12,651 - 12,651 20 2,530
Cana-de-açúcar 671,394 - 671,394 30 201,418
Café 2,440 - 2,440 50 1,220
Feijão 3,486 - 3,486 53 1,847
Laranja 18,385 0,735 17,650 50 8,825
Milho 50,745 - 50,745 58 29,432
Soja 57,345 - 57,345 73 41,862
Trigo 5,055 - 5,055 60 3,033
Fonte: IPEA (2012)
Pelo fato de serem derivados de materiais vegetais, a composição dos

susbprodutos agroindustriais está diretamente relacionada com os constituintes da
parede celular vegetal. Desta forma, esses são basicamente compostos por
celulose, hemicelulose e lignina, que juntos formam uma complexa estrutura
cristalina, recalcitrante e insolúvel que dificulta o ataque de enzimas e micro-
organismos (Nanda et al, 2014). Também podem ser encontrados na composição
destes materiais, em menores proporções, pectina, amido, proteínas, resinas, ácidos
graxos, taninos e sais minerais, o que caracteriza esses materiais como
extremamente heterogêneos (Bon; Ferrara; Corvo, 2008; Maity, 2015). Na Tabela 2
estão apresentadas as composições de alguns subprodutos agroindustriais. A
composição destes materiais pode variar de acordo com a espécie vegetal de
origem, estágio de crescimento da planta, parte vegetal utilizada, localização
geográfica, condições e tempo de armazenamento do material (Scheufele, 2012).
38
Tabela 2 – Composição lignocelulósica de alguns subprodutos agroindustriais

Subproduto Celulose Hemicelulose Lignina
Referência
agroindustrial (%)* (%)* (%)*
Bagaço de cana-de-
43,1 25,2 22,9 Rocha et al., 2012
açúcar in natura
Mussatto; Roberto,
Bagaço de cevada 16,8 28,4 27,8
2006
Mamma; Kourtoglu;
Bagaço de laranja 16,2 13,8 1,0
Christakopoulos, 2008
Casca de arroz 36,1 19,7 19,4 Lee, 1997
Espiga de milho 45 35 15 Lee, 1997
Farelo de arroz 35,0 25,0 17,0 Graminha et al., 2008
Rodríguez-Zúñiga et
Farelo de soja 34,6 18,1 9,8
al., 2011
Farelo de trigo 10,5 – 14,8 35,5 – 39,2 8,3 – 12,5 Menon; Rao, 2012
Fibra de algodão 15 – 20 80 – 85 0 Howard et al., 2003
Palha de aveia 31 – 37 27 – 38 16 – 19 Sánchez, 2009
Palha de milho 35,1 – 39,5 20,7 – 24,6 11,0 – 19,1 Menon; Rao, 2012
* % (m/m) baseada em massa seca
A celulose é o principal componente desses materiais, podendo

representar entre 30 a 60 % dos constituintes. Ela é um homopolissacarídeo linear
constituído por até 15.000 unidades residuais de glicose unidas através de ligações
glicosídicas do tipo β-1,4. Estas cadeias individuais estabelecem ligações de
hidrogênio intra e intermoleculares e do tipo van der Waals intermoleculares
resultando na formação de fibrilas, uma estrutura altamente ordenada que associa-
se formando as fibras de celulose. As fibrilas apresentam regiões com elevado grau
de cristalinidade, nas quais as cadeias de glucana estão firmemente ligadas em
paralelo, e regiões com menor grau de ordenação, chamadas de regiões amorfas.
Estas características conferem à celulose elevada resistência à hidrólise e
insolubilidade em água (Hendriks; Zeeman, 2009; Mathews; Pawlak; Grunden, 2015;
Walker; Wilson, 1991).
A hemicelulose é o segundo constituinte polissacarídico mais abundante
nos subprodutos agroindustriais, podendo representar entre 20 a 40 % dos
constituintes. O termo hemicelulose refere-se a vários heteropolissacarídeos com
estruturas lineares e/ou ramificadas, que são formados por pentoses (xilose e
arabinose), hexoses (glicose, manose e galactose), ácidos urônicos (ácido 4-O-
metilglucurônico, ácido glucurônico e ácido galacturônico) e grupamentos acetila
(Castro; Pereira Júnior, 2010; Howard et al., 2003). As variedades de ligações e de
39
ramificações assim como a presença de diferentes unidades monoméricas

contribuem para a complexidade da estrutura hemicelulósica e suas variadas
conformações. Diferentemente da celulose, a fração hemicelulósica não contém
regiões cristalinas, o que a torna mais suscetível à hidrólise (Maity, 2015). A
hemicelulose é responsável pela ligação entre a lignina e as fibras de celulose e por
conferir maior rigidez ao material lignocelulósico (Hendriks; Zeeman, 2009). Dentre
as várias hemiceluloses existentes a xilana é a mais comumente encontrada na
natureza. Essa hemicelulose é formada por uma cadeia principal de unidades de
xilose unidas por ligações do tipo β-1,4, podendo conter como substituintes nas
ramificações o ácido glucurônico e seu éter 4-O-metil, arabinose, ácido ferúlico e/ou
p-coumárico e grupos acetil (Collins; Gerday; Feller, 2005; Dhiman; Sharma; Battan,
2008). O teor e a composição das xilanas podem diferir significativamente entre as
espécies vegetais, sendo as gramíneas, como a cana-de-açúcar, constituídas
principalmente por arabinoxilanas (Manju; Chadha, 2011).
Outra hemicelulose comumente encontrada na natureza é o xiloglucano.
Esse polissacarídeo é encontrado na parede vegetal primária das plantas
superiores, podendo representar cerca de 20 - 25 % da massa seca de
dicotiledôneas, 10 % em gimnospermas e entre 2 - 5 % em algumas gramíneas (Pol;
Menon; Rao, 2012). Os xiloglucanos também são comumente encontrados como
polissacarídeos de reserva em sementes de algumas espécies vegetais como o
jatobá e o tamarindo (Eklöf, 2011). Assim como a celulose, os xiloglucanos são
constituídos por uma cadeia principal de resíduos de glicose unidos entre si por
ligações glicosídicas do tipo β-1,4. No entanto, os xiloglucanos se distinguem da
celulose por apresentarem até 75 % dos resíduos de glicose ramificados com
resíduos de xilose por ligações do tipo α-1,6. Dependendo do tecido e da espécie
vegetal, estes resíduos de xilose podem estar unidos com resíduos de galactose ou
arabinose por ligações do tipo β-1,2 ou α-1,2, respectivamente. Além disso, uma
parte dos resíduos de galactose pode ser encontrada ligada com resíduos de fucose
através de ligações do tipo α-1,2 (Eklöf, 2011). Acredita-se que a maioria dos
xiloglucanos conhecidos é formada por blocos repetitivos contendo 4 glicoses, 3
xiloses, 0, 1 ou 2 resíduos de galactose, um dos quais pode ainda estar ligado com
resíduos de fucose (Silva, 2001).
Além das xilanas e do xiloglucano, outras hemiceluloses frequentemente
encontradas na natureza são as mananas, que são polissacarídeos formados por
40
unidades de manose unidas por ligações β-1,4 e que em alguns casos podem
apresentar substituições na cadeia principal e ramificações laterais, e a β-1,3-1,4-
glucana (também chamada de liquenano e β-glucano), que é um polissacarídeo
formado por unidades de glicose unidas por ligações β-1,4 e β-1,3 (Scheller;
Ulvskov, 2010).
A lignina pode representar entre 15 a 25 % dos constuintes dos
subprodutos agroindustriais. Esta é uma macromolécula amorfa, de difícil
degradação, que apresenta uma estrutura não uniforme, altamente complexa e com
massa molecular elevada. Basicamente, a lignina é composta de 3 diferentes
unidades de fenilpropano (os alcoóis coniferílico, sinapílico e p-cumarílico), com
substituintes metoxila no anel aromático, unidas por diferentes ligações do tipo éter e
éster e que estabelecem ligações cruzadas entre si (Hendriks; Zeeman, 2009; Maity,
2015). A lignina é encontrada na parede celular secundária das plantas, onde
desempenha importantes papéis biológicos, como a redução da permeabilidade da
parede celular à água, participação nos mecanismos de defesa contra patógenos e
estresse oxidativo e também no auxilio do suporte estrutural (Hendriks; Zeeman,
2009). Assim como a hemicelulose, a composição da lignina também pode variar
entre os diversos grupos de plantas (Mathews; Paulak; Grunden, 2015).
A pectina é normalmente encontrada em pequenas proporções na maioria
dos subprodutos agroindustriais e muitas vezes acaba não recebendo muita
atenção. No entanto, ela pode representar até um terço da massa seca dos
constituintes da parede celular de algumas espécies vegetais (Lasheras, 2004). Os
polissacarídeos que formam a pectina (ramnogalacturano tipo I e II,
homogalacturano e xilogalacturano) consistem basicamente de uma cadeia de
resíduos de ácido galacturônico unidos por ligações do tipo α-1,4, os quais são
intensamente metilados, esterificados e intercalados com ramnose, arabinose,
fucose e galactose nas cadeias laterais (Lasheras, 2004; Caffall e Mohnen, 2009). A
pectina interage com íons cálcio formando uma matriz gelatinosa na parede celular
vegetal que confere sustentação a celulose e hemicelulose, assim como flexibilidade
à parede celular vegetal (Harholt; Suttangkakul; Scheller, 2010).
2.4. Reaproveitamento dos subprodutos agroindustriais em biorrefinarias

41
Os subprodutos gerados nas atividades agroindustriais podem ser

potencialmente impactantes ao meio ambiente caso não sejam devidamente
tratados. Os impactos ambientais associados a estes materiais decorrem da alta
geração em termos quantitativos, da lenta degradabilidade e da formação de
compostos que podem ser tóxicos ou de difícil degradação que poluem o solo e
fontes de água. Além disso, também há a possibilidade de poluição do ar pela
fumaça gerada durante a queima indevida destes materiais (IPEA, 2012;
Laufenberg; Kunz; Nystroem, 2003).
O reaproveitamento dos subprodutos agroindustriais e de outros materiais
lignocelulósicos pode levar a redução do volume anual a ser aterrado ou disposto de
forma inadequada, evitando assim o requerimento de novos aterros sanitários;
promove a agregação de valor aos produtos finais, uma vez que o tratamento,
transporte e a disposição final dos materiais residuais influenciam diretamente no
custo geral do processo; gera empregos e renda; reduz o conflito entre o uso da
terra para a produção de alimentos e fontes de energia, bem como a dependência
dos materiais de origem fóssil e a emissão de gases poluentes (Hahn-Hägerdal et
al., 2006; IPEA, 2012; Nanda et al., 2014; Nunes et al., 2013).
Atualmente, os conceitos de minimização, recuperação e bioconversão de
subprodutos são cada vez mais difundidos e necessários para as cadeias
agroindustriais (Laufenberg; Kunz; Nystroem, 2003). Neste sentido, foi proposto no
final da década de 1990 o conceito de instalações industriais denominadas de
biorrefinarias, onde através de uma série de processos de elevada complexidade
técnica esses materiais poderiam ser reaproveitados (Alwani et al., 2014; Maity,
2015).
As biorrefinarias se assemelham a uma refinaria de petróleo, no entanto,
essas utilizam matérias-primas renováveis e materiais residuais, de maneira integral
e diversificada, para a produção, por rota química ou biotecnológica, de uma
variedade de substâncias e energia, com a mínima geração de resíduos e emissões
de gases poluentes (Bastos, 2007). Comparativamente, as biorrefinarias têm a
vantagem de poder produzir um conjunto maior de classes de produtos e contar com
uma gama mais ampla de matérias-primas do que as refinarias de petróleo. Devido à
essa heterogeneidade e a sazonalidade da produção das matérias-primas, as
biorrefinarias possuem a desvantagem de necessitar de um número bem maior de
tecnologias que permitam o armazenamento e processamento dos materiais
42
utilizados. Pelo fato do conceito de biorrefinarias ser relativamente novo, muitas

dessas tecnologias de conversão ainda se encontram em estágio de
desenvolvimento (Cherubini; Stromman, 2011).
As biomassas lignocelulósicas, como os subprodutos agroindustriais,
podem ser reaproveitadas nas biorrefinarias através da utilização de duas
plataformas de conversão, denominadas de plataformas termoquímica e bioquímica
(Octave; Thomas, 2009). Na Figura 1 é apresentado um esquema de uma
biorrefinaria para o reaproveitamento da biomassa lignocelulósica através dessas
duas plataformas e alguns dos produtos que podem ser obtidos.
Figura 1 – Esquema simplificado de uma biorrefinaria para reaproveitamento da biomassa

lignocelulósica
Fonte: Bomtempo (2010)
Na plataforma termoquímica, a biomassa lignocelulósica pode ser

convertida através dos processos termoquímicos de gaseificação ou pirólise. Na
gaseificação, o material é mantido em altas temperaturas (> 700 ºC) com uma
quantidade controlada de oxigênio para produzir gás de síntese (também chamado
de syngas), que é uma mistura gasosa rica em CO2, H2, CO e CH4, e que
posteriormente podem ser reagrupada nas moléculas funcionais desejadas. No
processo de pirólise, o material também é aquecido em altas temperaturas, mas na
43
ausência de oxigênio para produzir o bio-óleo. Esse após processos de

hidrodeoxigenação gera uma mistura de hidrocarbonetos semelhantes àqueles
derivados do petróleo bruto (Cherubini; Stromman, 2011).
A plataforma bioquímica é baseada na conversão dos açúcares extraídos
da biomassa lignocelulósica por meio de processos que podem ser químicos,
enzimáticos e/ou fermentativos, sem a completa degradação dos componentes
básicos da lignocelulose. Normalmente, essa plataforma envolve as etapas de pré-
tratamento, hidrólise dos polissacarídeos e a conversão propriamente dita através de
processos químicos ou fermentativos utilizando leveduras e/ou bactérias. Os
produtos gerados nesta plataforma incluem combustíveis (bioetanol,
hidrocarbonetos) e vários bioprodutos (proteínas, ácidos orgânicos, enzimas,
compostos de aromas, pigmentos, antibióticos, polióis, entre outros) (Cherubini;
Stromman, 2011; Coutinho, 2011, Pereira Júnior, 2010). A lignina liberada na etapa
de pré-tratamento desta plataforma pode também ser reaproveitada e convertida em
diferentes produtos através de processos químicos como, por exemplo, de
hidrogenólise para a produção de óleos ou de oxidação para a produção de fenóis e
vanilina (Pereira Júnior, 2010). Maiores informações das etapas de pré-tratamento e
hidrólise desta plataforma serão comentados nos tópicos 2.5 e 2.6 desta revisão.
Essas duas plataformas de conversão de materiais lignocelulósicos têm
como objetivos principais proporcionar a geração de blocos construtores, ou seja,
moléculas químicas básicas que podem ser utilizadas para a obtenção de uma
variedade de produtos (Schlittler, 2012). Na década passada, vários estudos foram
realizados por diferentes países visando encontrar moléculas provenientes dos
materiais lignocelulósicos que apresentassem potencial para serem produzidas em
grande volume, com baixo custo e que pudessem ser usadas como blocos
construtores (Coutinho, 2011). Em 2004, o Departamento de Energia Norte-
americano (DOE) revisou mais de 300 compostos e propôs uma lista com 12
potenciais blocos construtores que poderiam ser produzidos biologicamente ou
quimicamente a partir de açúcares (Fernando et al.; 2006). Esta lista foi revisada
recentemente e os seguintes blocos construtores foram propostos como
comercialmente importantes ao curto e longo prazo: bioetanol, furfural,
hidroximetilfurfural, ácido furano-2,5-dicarboxílico, glicerol, isopreno,
biohidrocarbonetos, ácido láctico, ácido succínico, ácido 3-hidroxipropiônico, ácido
levulínico, sorbitol e xilitol (Bozell; Petersenb, 2010).
44
Atualmente, já existem algumas empresas que utilizam o conceito de

biorrefinarias para a produção de alguns produtos de alto valor agregado a partir de
materiais renováveis e subprodutos agroindustriais. Um exemplo disso é a empresa
alemã Biowert, que utiliza uma espécie de gramínea para a produção de
flavorizantes, materiais plásticos e de isolamento, fertilizantes, ração animal e biogás
(Biowert, 2015). Outro exemplo é a empresa espanhola Citrotecno que utiliza
resíduos cítricos para a obtenção de bioetanol, ração animal e D-limoneno
(Citrotecno, 2015). Também estão em funcionamento em diferentes países algumas
biorrefinarias, desde a escala piloto/demonstrativa à escala industrial, voltadas
principalmente para a produção de bioenergia e biocombustíveis (Cunha, 2013).
Em setembro de 2014, entrou em operação no Brasil a primeira
biorrefinaria localizada no hemisfério sul que utiliza o bagaço da cana-de-açúcar
para a produção comercial do bioetanol de segunda geração. Essa biorrefinaria tem
a capacidade de produzir cerca de 82 milhões de litros de bioetanol por ano e
também utiliza a queima da lignina para gerar parte da energia consumida e a
vinhaça como fertilizante para as lavouras de cana-de-açúcar (GranBio, 2015). Em
julho de 2015, mais uma planta industrial, com capacidade de produção de 40
milhões de litros de bioetanol de segunda geração, começou a operar no Brasil. Até
2024 está prevista a inauguração de mais 7 biorrefinarias no país, que juntas devem
produzir mais de 1 bilhão de litros de biocombustível (Cruz, 2015).
2.5. Reaproveitamento dos subprodutos agroindustriais para a produção do

bioetanol de segunda geração
A crescente necessidade de ampliar de modo sustentável o uso de fontes

renováveis de energia para proporcionar maior segurança ao suprimento energético
e reduzir os impactos ambientais associados aos combustíveis fósseis, encontra no
bioetanol uma alternativa economicamente viável e com potencial de expansão para
atender a demanda mundial (BNDES; CGEE, 2008; Santos; Gómez; Buckeridge,
2011). A produção de bioetanol é efetuada convencionalmente em bases comerciais
por duas rotas tecnológicas. Uma delas utiliza matérias-primas açucaradas,
diretamente fermentescíveis, como a cana-de-açúcar e a beterraba açucareira,
enquanto a outra emprega matérias-primas amiláceas, como o milho, o trigo e a
mandioca, cujo amido deve ser convertido por hidrólise enzimática em açúcares
45
monoméricos antes da fermentação. Após a fermentação microbiana, é feita a

destilação para a recuperação do bioetanol, que neste caso é denominado de
bioetanol de 1ª geração (Bastos, 2007; BNDES; CGEE, 2008; Ogeda; Petri, 2010).
No processamento da cana-de-açúcar para extração do caldo de cana
utilizado na fermentação por leveduras para produção do bioetanol de 1ª geração,
geram-se grandes quantidades de bagaço de cana, que normalmente são utilizadas
para a produção de vapor e eletricidade nas usinas. Apesar desta aplicação, entre
10 e 15 % desse subproduto agroindustrial não possui uma destinação apropriada
tornando-se poluente (Castro, 2006). Utilizando o conhecimento tecnológico
disponível no momento, prevê-se que a utilização desse material possibilitaria um
aumento de 10 vezes na produção de bioetanol sem necessitar da expansão das
áreas já cultivadas (Bastos, 2007).
A obtenção do bioetanol a partir de materiais lignocelulósicos, também
denominado de bioetanol de 2ª geração, envolve basicamente uma etapa inicial de
pré-tratamento, uma etapa de hidrólise dos polissacarídeos para gerar
monossacarídeos e, em seguida, as etapas de fermentação e destilação como
realizado no processo convencional (Hahn-Hägerdal et al., 2006; Ogeda; Petri,
2010). Na Figura 2 é apresentado um esquema com as rotas tecnológicas
convencionais e em desenvolvimento para a produção de bioetanol.
Figura 2 – Rotas tecnológicas para a produção de bioetanol

Fonte: BNDES; CGEE (2008)
46
Conforme mencionado anteriormente, a produção do bioetanol de 2ª

geração já é um processo realizado industrialmente, mas a utilização efetiva dos
subprodutos agroindustriais e outros materiais lignocelulósicos neste processo ainda
esbarra em alguns obstáculos. Um desses fatores limitantes é a estrutura e
composição dos materiais lignocelulósicos. A associação celulose-hemicelulose-
lignina, a estrutura cristalina da celulose, o conteúdo de lignina e o tamanho das
partículas normalmente levam a processos de conversão lentos e com baixos
rendimentos (Castro; Pereira Júnior, 2010; Ogeda; Petri, 2010; Sun; Cheng, 2002).
Para superar essas dificuldades durante a bioconversão dos materiais
lignocelulósicos faz-se necessária uma etapa inicial de pré-tratamento. Essa etapa
visa alterar as características físicas (como por exemplo, porosidade, cristalinidade,
grau de polimerização e tamanho das partículas) e a composição química dos
materiais lignocelulósicos (conteúdo de lignina e hemicelulose) para torná-los mais
acessíveis às etapas posteriores de conversão (Hahn-Hägerdal et al., 2006;
Hendriks; Zeeman, 2009; Van Dyk; Plestchke, 2012).
Atualmente, há uma grande quantidade de processos de pré-tratamento
disponíveis. Estes podem ser físicos (moagem, aquecimento), químicos (ozonólise,
hidrólise ácida, hidrólise alcalina, deslignificação oxidativa, processo organosolv),
físico-químicos (explosão com vapor, explosão com amônia, explosão com CO2) e
biológicos (tratamento com fungos e algumas bactérias) (Ogeda; Petri, 2010; Sun;
Cheng, 2002). Na Tabela 3 estão apresentadas as principais características de
alguns desses métodos de pré-tratamento.
47
Tabela 3 – Exemplos de métodos de pré-tratamento da biomassa lignocelulósica e suas

principais características
Pré-tratamento Principais características

Moagem Aumenta a área superficial; reduz a cristalinidade da celulose; apresenta
mecânica alto consumo de energia
Técnica prática e simples; apresenta uma hidrólise efetiva da hemicelulose
com alto rendimento de açúcar; altera a estrutura da lignina; gera compostos
Hidrólise ácida
tóxicos; causa corrosão de equipamentos; requer passos posteriores de
recuperação
Remove a hemicelulose e lignina; aumenta a área superficial dos materiais;
Hidrólise alcalina processo demorado e caro; possui dificuldades na recuperação das bases e
dos sais formados
Dissolve a maior parte da hemicelulose; não forma compostos tóxicos e
Hidrotérmico inibidores; não é eficiente para todos os materiais lignocelulósicos; pode
degradar monossacarídeos
Provoca a degradação da hemicelulose e transformação da lignina; possui
Explosão a vapor bom custo-benefício; destrói parte da xilana; promove a quebra incompleta
da lignocelulose; pode gerar compostos inibidores
Hidrolisa a lignina e hemicelulose; necessidade de reciclagem do solvente
Organosolv orgânico; baixa recuperação de pentoses; forma compostos inibidores;
possui alto custo
Processo ambientalmente amigável; não utiliza compostos químicos; baixo
gasto de energia; condições operacionais brandas; baixa eficiência;
Biológico
possibilidade dos micro-organismos consumirem os polissacarídeos além da
lignina
Fonte: Limayem; Ricke (2012); Nanda et al. (2014)
Não existe um método de pré-tratamento universal, pois a escolha do

processo a ser utilizado pode variar de acordo com as características do material
lignocelulósico. Os métodos de pré-tratamentos mais comumente utilizados incluem
a hidrólise ácida, a hidrólise alcalina com hidróxido de cal e os processos
hidrotérmico, de explosão a vapor e de explosão da fibra com amônia (Lymayem;
Ricke, 2012; Santos et al., 2012a). É importante que o método de pré-tratamento
utilizado preserve a fração hemicelulósica do material, limite a formação de produtos
de degradação inibidores dos processos enzimáticos e fermentativos subsequentes,
possibilite o aproveitamento da lignina e tenha baixo custo e consumo energético
(Sun; Cheng, 2002).
Outro ponto crítico na produção do bioetanol de 2ª geração e de outros
bioprodutos na plataforma de conversão bioquímica é a etapa de hidrólise dos
polissacarídeos. Essa etapa é frequentemente realizada por duas rotas, através de
tratamento químico, utilizando-se ácidos diluídos e concentrados, ou pelo método
48
enzimático (Castro; Pereira Júnior, 2010). Alguns estudos recentes também têm
sugerido a utilização de líquidos iônicos, como por exemplo o cloreto de 1-butil-3-
metilimidazólio e o cloreto de 1-alil-3-(1-metil)imidazólio, como um método alternativo
para a hidrólise dos polissacarídeos (Ogeda; Petri, 2010).
A hidrólise enzimática completa do material lignocelulósico ocorre pela
ação sinérgica de um complexo sistema enzimático, composto por várias enzimas
celulolíticas, hemicelulolíticas, pectinolíticas e ligninolíticas e por algumas proteínas
acessórias (Sweeney; Xu, 2012). No tópico 2.6 são apresentadas e discutidas a
atuação das principais enzimas envolvidas neste processo.
O processo de hidrólise enzimática apresenta um grande potencial de
aplicação industrial e sua utilização tem sido preferível nos últimos anos. Isso se
deve pelo fato deste exibir alta especificidade, pela ausência de formação de
substâncias tóxicas (furfural, hidroximetilfurfural e derivados de lignina) aos micro-
organismos fermentadores, por utilizar condições mais brandas de processo e por
permitir a integração das etapas de hidrólise da biomassa com processos
fermentativos (Bastos, 2007; Bon; Ferrara; Corvo, 2008; Castro; Pereira Júnior,
2010; Ogeda; Petri, 2010). Contudo, essa tecnologia ainda não é um processo viável
do ponto de vista econômico, devido aos elevados custos de produção desses
biocatalisadores, a grande quantidade de enzimas requerida e a necessidade de
enzimas mais eficientes e estavéis para aumentar os rendimentos da conversão
(Banerjee; Scott-Craig; Walton, 2010).
Outro grande obstáculo na produção do bioetanol de 2ª geração é o fato
da levedura Saccharomyces cerevisiae, que é o micro-organismo mais utilizado nas
fermentações industriais para produção de álcool, não conseguir metabolizar
pentoses. Consequentemente, este processo acaba utilizando apenas 30 % do
potencial dos materiais lignocelulósicos. Com a possibilidade de fermentação das
pentoses pelos micro-organismos fermentadores estima-se que esse valor poderá
aumentar e chegar a quase 60 % (Goldbeck, 2012).
Na tentativa de superar essas dificuldades técnicas e melhorar os
rendimentos do processo de produção do bioetanol de 2ª geração e torná-lo mais
competitivo, vários estudos têm sido realizados por diferentes centros de pesquisa.
Estes estudos tem buscado o desenvolvimento de métodos de pré-tratamentos que
facilitem a disponibilização dos polissacarídeos e o acesso das enzimas, a criação
de coquéteis enzimáticos mais eficientes e baratos; o isolamento ou criação de
49
micro-organismos fermentadores robustos, mais tolerantes a inibidores e que sejam

capazes de fermentar todos os açúcares presentes no material hidrolisado com alto
rendimento; a ampliação dos processos de integração para reduzir os números de
etapas do processo e a demanda de energia; a flexibilização das plantas de
conversão para utilização de uma ampla gama de matérias-primas lignocelulósicas
(Hahn-Hägerdal et al., 2006; Quintero; Rincón; Cardona, 2011).
2.6. Biotecnologia enzimática no reaproveitamento de subprodutos

agroindustriais
2.6.1. Classificação das enzimas lignocelulolíticas

As várias enzimas envolvidas na degradação dos materiais
lignocelulósicos são comumente chamadas de enzimas lignocelulolíticas e têm sido
classificadas, pela Comissão de Enzimas da União Internacional de Bioquímica e
Biologia Molecular (IUBMB), de acordo com a principal reação catalisada nas
classes: hidrolases glicosídicas (EC 3.2.1), liases (4.2.2), esterases (EC 3.1.1),
peroxidases (1.11.1), carboidrato oxidases (EC 1.1.3), fenoloxidases (EC 1.10.3),
entre outras (Sweeney; Xu, 2012).
Desde a década de 1990, tem sido proposto que essas enzimas sejam
organizadas em famílias, baseadas na sua sequência de aminoácidos e homologia
estrutural. A classificação com base na estrutura gera melhores resultados do que
quando apenas classificada pela afinidade ao substrato, possibilitando um melhor
entendimento do modo de atuação das enzimas. Para isso foi criado um banco de
dados denominado de CAZy (Carbohydrate-Active Enzymes), que se encontra
disponível no site: <http://www.cazy.org/>. Atualmente neste banco de dados, as
enzimas e proteínas que participam da degradação ou modificação de
polissacarídeos estão divididas em: hidrolases glicosídicas (GHs), enzimas
responsáveis pela hidrólise e/ou rearranjo de ligações glicosídicas; transferases
glicosídicas (GTs), enzimas responsáveis pela formação de ligações glicosídicas;
polissacarídeo liases (PLs), enzimas que realizam a clivagem não-hidrolítica de
ligações glicosídicas; carboidrato esterases (CEs): que hidrolisam ésteres de
carboidratos; atividades auxiliares (AAs), enzimas redox que atuam em conjunto com
outras enzimas CAZy e módulos de ligação ao carboidrato (CBMs), proteínas que
promovem a adesão da enzima ao carboidrato. Dentro destes grupos, as proteínas
50
ainda se encontram divididas em várias famílias que compartilham a mesma

estrutura tridimensional e mecanismo catalítico, podendo em uma mesma família
haver enzimas com diferentes especificidades de substratos (Schneider, 2014;
Sweeney; Xu, 2012).
2.6.2. Enzimas envolvidas na degradação da celulose

A hidrólise efetiva da celulose em unidades de glicose é realizada pela
ação sinérgica de três grupos de enzimas: endo-β-1,4-glucanases, exo-β-1,4-
glucanases e β-1,4-glicosidases. As endo-β-1,4-glucanases (EC 3.2.1.4) iniciam a
hidrólise clivando de modo aleatório a cadeia de celulose nas regiões amorfas,
diminuindo seu grau de polimerização e, consequentemente, criando novas
extremidades de cadeia. As exo-β-1,4-glucanases, que incluem as celobiohidrolases
(EC 3.2.1.91), agem em sequência nas extremidades redutoras (celobiohidrolase II)
e não redutoras (celobiohidrolase I) liberando o dissacarídeo celobiose e em alguns
casos glicose. Finalmente, as β-1,4-glicosidases (EC 3.2.1.21) hidrolizam a
celobiose e algumas celodextrinas solúveis em glicose (Moreira; Milanezi; Ferreira
Filho, 2011). Na Figura 3 é apresentado um esquema dos sítios de atuação destas
enzimas sobre a celulose.
Figura 3 – Estrutura da celulose e sítios de ação das celulases

(CBH: celobiohidrolase; EGL: endo-β-1,4-glucanase; BGL: β-1,4-glicosidase). Fonte: Van den Brink;
Vries (2011)
2.6.3. Enzimas envolvidas na degradação das hemiceluloses

A degradação total das hemiceluloses necessita de uma série de enzimas
com diferentes especificidades devido à sua natureza heteropolissacarídica e grande
diversidade de resíduos nas cadeias laterais. O complexo enzimático responsável
pela hidrólise da xilana é composto principalmente pelas enzimas endo-β-1,4-
xilanase (também chamada de xilanase) e β-1,4-xilosidase, podendo ainda ter a
51
participação das enzimas desramificadoras dos grupos laterais ligados à cadeia

principal, como α-L-arabinofuranosidase, acetil xilana esterase; α-glucuronidase e
algumas esterases, como a ácido ferrúlico esterase (também chamada de feruloil
esterase) e ácido p-coumárico esterase (Moreira; Milanezi; Ferreira Filho, 2011).
As endo-β-1,4-xilanases (EC 3.2.1.8) provocam a hidrólise das ligações
internas do esqueleto de heteroxilana, resultando na diminuição do grau de
polimerização do substrato. As β-1,4-xilosidases (EC 3.2.1.37) hidrolisam os
xilooligossacarídeos formados e xilobiose em xilose, a partir das extremidades não
redutoras. As α-L-arabinofuranosidases (EC 3.2.1.55) promovem a remoção dos
resíduos de L-arabinose substituídos nas posições 2 e 3 das unidades de xilose. As
acetilanas esterases (EC 3.1.1.6) são enzimas que promovem a remoção de grupos
O-acetil a partir das posições 2 e 3 dos resíduos de xilose na acetil-xilana. As α-
glucuronidases (EC 3.2.1.131) hidrolisam as ligações α-1,2 entre os resíduos de
ácido glucurônico e unidades de xilose encontradas no glucuranoxilano. As
esterases, ácido ferrúlico esterase (EC 3.1.1.73) e ácido p-coumárico esterase (EC
3.1.1.-) clivam na xilana, respectivamente, as ligações éster entre os resíduos de
arabinose e ácido ferrúlico ou ácido p-coumárico (Polizeli et al., 2005). Na Figura 4 é
apresentado um esquema dos sítios de atuação destas enzimas sobre a xilana.
Figura 4 – Estrutura da xilana e sítios de ação de algumas hemicelulases

(XLN: endo-β-1,4-xilanase; AGU: α-glucuronidase; AXH: α-L-arabinofuranosidase; FAE: feruloil
esterase; AXE: acetilxilana esterase; BLX: β-1,4-xilosidase). Fonte: Van den Brink; Vries (2011)
No caso do xiloglucano, a hidrólise da sua cadeia principal pode ser

realizada por xiloglucanases (EC 3.2.1.151), que são um tipo de endo-β-1,4-
glucanase altamente específica para este polissacarídeo e praticamente inerte sobre
a celulose e β-glucanas, e também por algumas endo-β-1,4-glucanases microbianas,
devido à homologia desse polissacarídeo com a celulose. Estas duas enzimas
52
normalmente clivam o xiloglucano nas ligações β-1,4 da cadeia principal após os

resíduos de glicose não substituidos liberando oligossacarídeos. Posteriormente,
dependendo da constituição dos oligossacarídeos formados, a hidrólise completa
destes pode envolver a participação de α-1,2-L-fucosidases (EC 3.2.1.63) que
hidrolisam as ligações α-1,2 entre resíduos de fucose e galactose, β-galactosidases
(EC 3.2.1.23) que hidrolisam terminais não redutores de resíduos de galactose em
galactosídeos, α-xilosidases (EC 3.2.1.X) que hidrolisam as ligações α-1,6 entre
resíduos de xilose e glicose, e β-1,4-glicosidases. Na Figura 5 é apresentado um
esquema da estrutura do xiloglucano e os sítios de atuação de algumas enzimas
neste polissacarídeo.
Figura 5 - Estrutura do xiloglucano e os sítios de ação de algumas enzimas envolvidas na

degradação deste polissacarídeo
(XEG: xiloglucanase/endoglucanase; FUC: α-1,2-L-fucosidase; GAT: β-galactosidase; XYL: α-
xilosidase; BGL: β-1,4-glicosidase). Fonte: adaptado de Eklöf (2011)
As letras apresentadas no esquema referem-se a nomenclatura proposta por Fry et al. (1993) para
descrever a estrutura dos xiloglucanos e seus oligossacarídeos. Essa nomenclatura propõe que cada
glicose da cadeia principal que não possui ramificação seja denominada pela letra G e de acordo com
o último monossacarídeo a ela ligado é utilizado uma letra diferente (X para xilose, L para galactose,
S para arabinose e F para fucose).
2.6.4. Enzimas envolvidas na degradação da pectina

A degradação enzimática da pectina também é efetuada por um grupo de
várias enzimas, devido à heterogeneidade de componentes deste polissacarídeo. No
caso da degradação do componente homogalacturano (um polissacarídeo formado
por uma cadeia linear de resíduos de ácido galacturônico unidos por ligações do tipo
53
α-1,4 e que pode estar esterificado por metanol e ácido acético) as pectinases
podem ser distinguidas em dois grupos principais, pectinas esterases e pectinas
despolimerases. As pectinas despolimerases podem ainda ser subdivididas em
hidrolases e liases de acordo com o mecanismo de clivagem das ligações
glicosídicas. Entre as pectinas esterases destacam-se a pectina metil esterase (EC
3.1.1.11), que é responsável pela remoção de grupos metoxila da pectina
metoxilada, e a pectina acetil esterase, que é capaz de clivar grupos acetil de
resíduos de ácido galacturônico acetilados. Entre as pectinas despolimerizantes,
têm-se as poligalacturonases, que podem ser do tipo endoenzimas (EC 3.2.1.15) ou
exoenzimas (EC 3.2.1.67) e são responsáveis por hidrolisar ligações α-1,4 entre
resíduos de ácido galacturônico não esterificados, as pectinas liases (EC 4.2.2.10),
que clivam as ligações α-1,4 entre resíduos de ácido galacturônico esterificados, e
as pectato liases (EC 4.2.2.2) que clivam ligações α-1,4 entre resíduos de ácido
galacturônico não esterificados (Koivula et al., 2012; Van den Brink; Vries, 2011).
No caso da degradação do componente ramnogalacturano tipo I (que é
um polissacarídeo formado por uma cadeia principal de resíduos alternados de
ramnose e ácido galacturônico, unidos por ligações α-1,2 e α-1,4, e que contém
ramificações de cadeias galactose e arabinose ligadas aos resíduos de ramnose) a
degradação envolve várias endo e exoenzimas. Entre estas, destacam-se as
ramnogalacturano hidrolase (EC 3.2.1.-) e ramnogalacturano liase (EC 4.2.2.-) que
clivam as ligações α-1,2 entre os resíduos de ramnose e ácido galacturônico não
acetilados na cadeia principal. A degradação completa das cadeias laterais do
ramnogalacturano tipo I pode envolver a ação de endo e exogalactanases (enzimas
que hidrolisam as ligações β-1,4 entre resíduos de galactose), endo e
exoarabinanases (enzimas que hidrolisam as ligações α-1,5 entre resíduos de
arabinose), α-L-arabinofuranosidase, β-galactosidase e feruloil esterase (Koivula et
al., 2012; Van den Brink; Vries, 2011). Na Figura 6 é apresentado um esquema dos
sítios de atuação de algumas enzimas pectinolíticas sobre o homogalacturano e o
ramnogalacturano tipo I.
54
Figura 6 – Estrutura do ramnogalacturano tipo I (a) e do homogalacturano (b) e os sítios de

ação de algumas enzimas envolvidas na degradação destes polissacarídeos
(RGX: exoramnogalacturonase; RHG: endoramnogalacturonase; RGAE: ramnogalacturano acetil
esterase; RGL: ramnogalacturano liase; FAE: feruloil esterase; GAL: endogalactanase; LAC: β-
galactosidase; ABF: α-L-arabinofuranosidase; ABN: endoarabinanase; ABX: exoarabinanase; PGX:
exopoligalacturonase; PLY: pectato liase; PGA: endopoligalacturonase; PME: pectina metil esterase;
PEL: pectina liase). Fonte: Van den Brink; Vries (2011)
2.6.5. Enzimas envolvidas na degradação da lignina

Embora grande parte da lignina possa ser removida pelos métodos de
pré-tratamento, o conteúdo restante após essa etapa também pode ser degradado
enzimaticamente para melhorar o rendimento do processo de hidrólise dos
polissacarídeos. Ao contrário dos processos de degradação da celulose,
hemicelulose e pectina, que são baseados principalmente em reações enzimáticas
hidrolíticas, a degradação da lignina representa um processo oxidativo complexo e
inespecífico, que muitas vezes ocorre de forma indireta, orientado apenas pelas
diferenças entre os potenciais de oxirredução dos substratos e enzimas (Henn,
2009). Devido à sua estrutura altamente complexa, a lignina necessita de um
sistema diversificado de enzimas ligninolíticas, composto de enzimas redutoras e
enzimas produtoras de H2O2, que atuem em combinação, já que não é possível a
degradação total utilizando essas enzimas separadamente (Polaina; MacCabe,
2007). As principais enzimas envolvidas na degradação da lignina são as lacases
(EC 1.10.3.2), lignina peroxidases (EC 1.11.1.14) e manganês peroxidases (EC
1.11.1.13) (Henn, 2009; Howard et al., 2003).
55
As lacases são polifenoloxidases que contêm 4 átomos de cobre no seu

sítio ativo e que catalisam a redução de O2 para H2O, sem a formação de H2O2,
através da reação simultânea de oxidação dos substratos fenólicos, via transferência
de um elétron para formação de radicais fenoxilas (Leonowicz et al., 2001). As
lignina peroxidases e as manganês peroxidases são glicoproteínas portadoras de
um grupo prostético heme que exibem atividade dependente de H2O2. As lignina
peroxidases catalisam a oxidação de substratos aromáticos não fenólicos da
molécula de lignina, gerando radicais catiônicos que reagem espontaneamente com
nucleófilos e com o oxigênio molecular, despolimerizando a lignina e abrindo os
anéis aromáticos. Já as manganês peroxidases, com poucas exceções, não
desencadeiam transformações diretamente em seus substratos, sendo esta ação
desempenhada por complexos Mn3+-ácidos orgânicos, resultantes da oxidação do
Mn2+ pela enzima (Henn, 2009; Menezes, 2007). Na Figura 7 é apresentado um
esquema mostrando os mecanismos de oxidação de algumas enzimas ligninolíticas
sobre a lignina.
Figura 7 – Estrutura da lignina e mecanismo de atuação das enzimas ligninolíticas

(H: álcool p-coumarílico; G: álcool coniferílico; S: álcool sinapílico). Fonte: Sethi; Scharf (2013)
2.6.6. Componentes acessórios na degradação dos materiais

lignocelulósicos
A degradação enzimática dos materiais lignocelulósicos também pode
contar com a participação de proteínas acessórias, ou seja, componentes proteicos
56
que auxiliam na modificação dos substratos e/ou facilitam a ação enzimática das
enzimas lignocelulolíticas. Nesta classe estão incluídas as solelinas e expansinas,
que são proteínas que não tem atividade catalítica, mas que possuem a capacidade
de se ligar as microfibrilas de celulose e enfraquecer as ligações de hidrogênio da
celulose cristalina, facilitando assim o acesso das endoglucanases (Mohanram et al.,
2013; Moreira; Milanezi; Ferreira Filho, 2011). Tem sido descrito que as soleninas
podem aumentar a eficiência catalítica das celulases e também auxiliar na redução
do tempo de hidrólise (Baker et al., 2000). Além das soleninas e expansinas, alguns
estudos recentes tem demonstrado que a degradação da celulose e de algumas
hemiceluloses também pode contar com a participação das chamadas
monooxigenases líticas de polissacarídeos (LPMOs). Essas enzimas fazem parte de
uma classe de enzimas auxiliares dependentes de íons metálicos divalentes, como o
cobre, que catalisam a degradação dos polissacarídeos através de um mecanismo
oxidativo que também pode envolver a enzima celobiose desidrogenase para a
geração de doadores de elétrons (Agger et al., 2014; Dutta; Wu, 2014).
Algumas celulases e hemicelulases podem ainda apresentar domínios
não catalíticos ligados à estrutura proteica dos seus núcleos catalíticos. Estes
domínios não catalíticos são sequências contínuas de resíduos de aminoácidos com
um discreto dobramento que têm a função de ancorar ou direcionar os núcleos
catalíticos dessas enzimas para os substratos alvo, permitindo assim associar-se a
substratos insolúveis e aumentar a sua eficiência de degradação. Estes domínios
não catalíticos podem ser domínios (ou módulos) de ligação a carboidratos (também
conhecidos como CBMs), módulos tipo fibronectina-3, doquerinas, domínios tipo
imunoglobulina ou domínios funcionalmente desconhecidos do tipo X (Schneider,
2014; Sweeney; Xu, 2012).
2.6.7. Produção das enzimas lignocelulolíticas microbianas

As enzimas lignocelulolíticas podem ser obtidas a partir de uma grande
gama de organismos, incluindo bactérias, actinomicetos, fungos filamentosos,
basidiomicetos, leveduras, algas e alguns invertebrados (Henn, 2009; Jurutu; Wu,
2013; Sethi; Scharf, 2013; Singhania, 2011). Os fungos e as bactérias são as
principais fontes utilizadas na produção industrial destas enzimas, devido a grande
variedade de atividades catalíticas decorrentes das suas diversidades metabólicas e
também pelo fato destes poderem produzí-las através de processos fermentativos
57
em grande escala, com a regularidade necessária e a simplicidade dos

requerimentos nutricionais (Bon; Ferrara; Corvo, 2008).
Nas últimas décadas, maior ênfase tem sido dada aos fungos, pois estes
possuem a capacidade de produzir e secretar grandes quantidades de enzimas
diretamente no meio de cultura, o que facilita a sua posterior extração e purificação
(Kumar; Singh; Singh, 2008). Contudo, o isolamento e a caracterização de novas
enzimas lignocelulolíticas a partir de bactérias estão sendo amplamente explorados
nos últimos anos (Sadhu; Maiti, 2013). Há várias razões para explicar essa mudança
de enfoque nas linhas de pesquisas, como o fato das bactérias habitarem vários
nichos ambientais e industriais, por possuírem linhagens degradantes de material
lignocelulósico extremamente resistentes as condições de estresse ambiental
(temperatura, pH e concentrações de sais extremas), por normalmente
apresentarem uma taxa de crescimento superior à dos fungos e também pelas
enzimas bacterianas serem geralmente mais complexas (Maki; Leung; Qin, 2009).
Com relação às bactérias produtoras de enzimas lignocelulolíticas,
destacam-se aquelas pertencentes aos gêneros Clostridium, Streptomyces, Bacillus,
Pseudomonas, Cellulomonas e Thermomonospora (Maki; Leung; Qin, 2009;
Singhania, 2011). Dentre essas bactérias, as pertencentes aos gêneros Bacillus têm
sido amplamente relatadas quanto à produção de celulases, hemicelulases,
pectinases e lacases, devido ao alto rendimento na produção, pela maior
estabilidade dessas enzimas em temperatura elevada e em ampla faixa de pH do
que aquelas de origem fúngica e também pela possibilidade de produzirem essas
enzimas na forma de complexos multienzimáticos (Kiddinamoorthy et al., 2008; Maki;
Leung; Qin, 2009; Reiss; Hassen; Thony-Meyer, 2011; Van Dyk, 2009). Bataillon;
Nunes Cardinali e Duchiron (1998) ao caracterizarem uma xilanase de Bacillus sp.
SPS-0 verificaram que essa era ativa entre pH 6,0 e 9,0 e razoavelmente
termoestável, conservando 100 % da atividade inicial após 6 horas de incubação a
60°C. Em outro estudo, Bajaj e Manhas (2012) observaram que a xilanase de B.
licheniformis P11 (C) era estável em uma ampla faixa de pH (5,0 - 11,0) e
apresentava 64 % de atividade relativa em temperaturas entre 80 e 100 ºC.
As enzimas lignocelulolíticas microbianas podem ser produzidas através
de fermentação submersa e também por fermentação em estado sólido (Geetha;
Gunasekaran, 2010; Heck; Hertz; Ayub, 2002; Kamble; Jadhav, 2012; Nagar et al.,
2010). Contudo, a fermentação submersa tem sido o método mais utilizado para a
58
produção industrial dessas enzimas, devido às facilidades de operação (controle da

temperatura, pH, difusão e homogeneização dos nutrientes) e o melhor
acompanhamento do processo fermentativo (Manju; Chadha, 2011; Singhania,
2011).
A produção das hidrolases glicosídicas microbianas, como celulases e
xilanases, está diretamente associada ao crescimento do micro-organismo. A
expressão da maioria dessas enzimas é geralmente induzida pela presença de
mono e dissacarídeos no meio de cultura, podendo esta ser também finamente
controlada por mecanismos de ativação e repressão catabólica, com a glicose sendo
um dos principais compostos inibidores. Algumas poucas enzimas são expressas
constitutivamente com baixos níveis de produção e parecem atuar na formação dos
compostos indutores (Polizeli et al., 2005; Shallom; Shoham, 2003; Singhania,
2011).
Além disso, a produção destas enzimas microbianas pode ser altamente
influenciada por vários fatores, como as fontes de carbono e nitrogênio utilizadas, pH
do meio de cultura, disponibilidade de nutrientes, temperatura e agitação, idade e
quantidade do inóculo, entre outros fatores (Nagar et al., 2010; Sharma; Adhikari;
Satyanarayana, 2007; Sohail et al., 2009). A natureza e composição das fontes de
carbono usadas nos meios de cultura também exercem um papel crucial na
produção dessas enzimas, podendo determinar quais as enzimas que serão
expressas pelos micro-organismos (Manju; Chadha, 2011; Melo, 2010). Em um
estudo realizado por Siqueira et al. (2010) foi verificado que a produção das enzimas
xilanase, mananase, poligalacturonase, endoglucanase e exoglucanase pelos micro-
organismos Agaricus brasiliensis CS1, Pleurotus ostreatus H1 e Aspergillus flavus
era fortemente influenciada pelas fontes de carbono devido as diferenças nas
composições dos substratos utilizados.
2.6.7.1. Produção de complexos multienzimáticos celulolíticos e

hemicelulolíticos
A maioria dos micro-organismos, principalmente fungos e bactérias

aeróbios, são capazes de produzir e secretar individualmente na forma livre
celulases e hemicelulases para o meio extracelular, onde podem atuar de forma
sinérgica na degradação dos polissacarídeos. Por outro lado, alguns micro-
59
organismos anaeróbios apresentam uma estratégia diferente para produção destas

enzimas e para a hidrólise da celulose e hemicelulose. Nestes micro-organismos, as
celulases e hemicelulases são produzidas e organizadas na forma de um grande
complexo multienzimático extracelular chamado de celulossomo ou xilanossomo,
dependendo da atividade enzimática principal (Lynd et al., 2002; Phitsuwan et al.,
2012; Ratanakhanokchai et al., 2013; Shallom; Shoham, 2003).
Os complexos multienzimáticos do tipo celulossomo foram relatados pela
primeira vez no início da década de 1980 por Bayer, Kenig e Lamed (1983) e são
produzidos principalmente por micro-organismos do gênero Clostridium, mas
também têm sido identificados em bactérias anaeróbias dos gêneros Acetovibrio,
Bacteroides, Butyrivibrio, Ruminococcus e Tepidimicrobium e em alguns fungos
anaeróbios dos gêneros Neocallimastix, Orpinomyces e Piromyces
(Ratanakhanokchai et al., 2013; Van Dyk et al., 2009).
Os celulossomos encontrados em Clostridium thermocellum, Clostridium
cellulolyticum e Clostridium cellulovorans são os complexos multienzimáticos mais
bem estudados e caracterizados na literatura (Bayer et al.; 2004; Doi et al., 2003).
Nestes complexos multienzimáticos diferentes tipos de celulases e, em alguns
casos, também algumas hemicelulases estão reunidas sobre uma proteína estrutural
chamada de escafoldina, através de interações não covalentes altamente
específicas entre os módulos coesina existentes na superfície da proteína estrutural
e os módulos doquerina das subunidades catalíticas (Bayer et al., 2004; Hasunuma
et al., 2013). A proteína estrutural escafoldina, que normalmente possui alta massa
molecular e é altamente glicosilada, também pode apresentar um domínio de ligação
a carboidratos (CBM), que possibilita a ligação de todo o complexo multienzimático a
superfície da celulose facilitando desta forma a hidrólise do polissacarídeo (Fontes;
Gilbert, 2010; Schwarz, 2001). Normalmente, estes complexos multienzimáticos
estão ancorados pela extremidade carboxi terminal da proteína escafoldina à
superfície celular microbiana e dissociam-se da parede celular quando o micro-
organismo está no final da fase exponencial de crescimento (Phitsuwan et al., 2010;
Schwarz, 2001). Na Figura 8 é apresentado um esquema da organização do
celulossomo de C. thermocellum.
60
Figura 8 – Representação esquemática simplificada da organização do celulossomo de

Clostridium thermocellum e da sua interação com a parede celular microbiana
Fonte: adaptado de Ed Bayer’s Group (2015)
A produção de complexos multienzimáticos também tem sido relatada em

algumas bactérias anaeróbias facultativas e aeróbias pertencentes aos gêneros
Paenibacillus, Bacillus, Streptomyces e Sorangium, quando cultivadas em condições
de aerobiose (Jiang et al., 2004; Jones; Van Dyk; Pletschke, 2012; Phitsuwan et al.,
2012; Ratanakhanokchai et al., 2013). A estrutura dos complexos multienzimáticos
produzidos por estes micro-organismos ainda não foi elucidada em detalhes, mas
tem sido observado que a maioria destes contém atividade enzimática
predominantemente de xilanase do que de celulase e por isso esses tem sido
chamados de xilanossomos (Phitsuwan et al., 2012; Van Dyk et al., 2009).
Aparentemente, a produção das celulases e hemicelulases na forma de
complexos multienzimáticos traz uma série de vantagens para a efetiva hidrólise da
biomassa lignocelulósica em comparação com as enzimas produzidas na forma livre.
Estas vantagens incluem a otimização do sinergismo entre as subunidades das
enzimas com o aumento da eficiência de hidrólise e a limitação da adsorção não
produtiva das enzimas, pois as mesmas estão presentes em uma proporção correta
e espaçadas em uma configuração ótima. Além disso, os complexos
multienzimáticos apresentam flexibilidade para hidrólise de substratos heterogêneos
devido à presença de enzimas com diferentes especificidades e também pela
presença de apenas um domínio de ligação a carboidratos de baixa especificidade
na proteína estrutural que evita a competitividade de ligação das enzimas ao
substrato (Lynd et al., 2002; Maki; Leung; Qin, 2009; Schwarz, 2001).
61
Devido às vantagens dos complexos multienzimáticos para a hidrólise da

biomassa lignocelulósica em relação as enzimas na forma livre, vários trabalhos
recentes tem buscado o desenvolvimento de complexos multienzimáticos in vitro
assim como a modificação genética de leveduras para a expressão de pequenos
complexos multienzimáticos na sua parede celular (Arfi et al., 2014; Huang;
Anderson; Clubb, 2014; Hyeon et al., 2014; McClendon et al., 2012; Srikrishnan;
Chen; Da Silva, 2013).
A produção de complexos multienzimáticos por bactérias aeróbias e
anaeróbias facultativas apresenta um grande potencial para aplicação nos
processos de degradação da biomassa lignocelulósica e também para aplicação em
indústrias de alimentos e de ração animal, em comparação a produção destes
complexos por micro-organismos anaeróbios, pois os cultivos em anaerobiose
apresentam um alto custo, exibem dificuldade para manutenção e, além disso, os
micro-organismos anaeróbios apresentam uma baixa taxa de crescimento e baixo
rendimento na produção de enzimas (Jones; Van Dyk; Pletschke, 2012;
Ratanakhanokchai et al.; 2013).
2.6.8. Atuais perspectivas nos estudos de enzimas lignocelulolíticas para

a conversão de subprodutos agroindustriais
Como o processo de hidrólise enzimática de materiais lignocelulósicos em
biorrefinarias é ainda um processo caro, com baixos rendimentos e que necessita de
enzimas mais eficientes e com diferentes especificidades, tem sido realizado nos
últimos anos vários estudos para superar estes gargalos do processo. A seguir, são
comentadas algumas das estratégias que estão sendo abordadas nesta área.
Alguns trabalhos estão sendo realizados com o objetivo de isolar micro-
organismos produtores destas enzimas a partir de diferentes nichos ecológicos,
como por exemplo, pilhas de compostagem, ambientes industriais, solos de florestas
tropicais, intestino de cupins, nascentes de águas termais, entre outros (Akbalik,
2003; Banerjee et al., 2010; Ruegger; Tauk-Tornisielo, 2004; Sethi; Scharf, 2013).
Além disso, várias linhagens microbianas identificadas como produtoras de enzimas
lignocelulolíticas têm sido submetidas ao melhoramento genético por técnicas
convencionais e de mutagênese molecular ou a técnicas de clonagem e expressão
homóloga e heteróloga com o objetivo de melhorar a produção e secreção das
62
enzimas (Jurutu; Wu, 2013; Liu et al., 2013a; Maki; Leung; Qin, 2009; Sadhu et al.,
2014).
Na tentativa de reduzir os custos de produção, tem sido proposta a
utilização de subprodutos agroindustriais como fonte de carbono para a indução da
produção enzimática em substituição aos substratos comerciais, assim como a
realização de estudos de otimização das composições dos meios de cultura e das
condições de cultivo (Geetha; Gunasekaran, 2010; Haddar et al., 2012; Heck; Hertz;
Ayub, 2002; Kamble; Jadhav, 2012; Kumar; Satyanarayana, 2012; Nagar et al.,
2010).
Outra importante frente de pesquisa nesta área tem focado na
identificação de enzimas com características bioquímicas superiores, como por
exemplo, estabilidade em amplas faixas de temperatura e pH, maior eficiência
catalítica, especificidade para múltiplos substratos, maior tolerância a inibição pelos
produtos finais da hidrólise e também tolerância a inibição pelos produtos formados
na etapa de pré-tratamento. Neste caso, tem sido realizada a busca de genes de
enzimas lignocelulolíticas em genomas sequenciados, a construção e triagem
funcional de bibliotecas genômicas e metagenômicas e a avaliação de proteomas
(Alvarez, 2013; Buchli, 2014; Liu et al., 2013a; Mohanram et al., 2013; Sebastian et
al., 2013).
Na literatura há vários trabalhos que relatam a procura de enzimas
lignocelulolíticas com características especiais a partir de micro-organismos isolados
de diferentes ambientes através da construção de bibliotecas genômicas seguido da
triagem funcional dos clones utilizando diferentes substratos naturais e sintéticos.
Lima et al. (2005), por exemplo, identificaram a partir de uma biblioteca genômica da
linhagem de B. pumilus CL16 uma endo-β-1,4-glucanase da família GH9 com um
domínio de ligação a carboidratos tipo 3 (CBM3) que apresentava alta estabilidade
térmica e pH ótimo entre 5,0 e 8,0. Em outro estudo, Zhang et al. (2012) isolaram de
uma biblioteca genômica construída para a linhagem Bacillus sp. BG-CS10 uma
celulase com atividade de endoglucanase e glucomananase que se mostrou
termoestável e também halofílica.
Outra estratégia muito utilizada na busca de enzimas lignocelulolíticas
microbianas já conhecidas é o método de prospecção in silico. Este consiste no
desenho e síntese de oligonucleotídeos iniciadores baseados em sequências
gênicas disponíveis em bancos de dados públicos e na posterior utilização destes
63
para a amplificação de genes por reações de PCR. Lee et al. (2008) estudaram uma
xilanase termoestável de uma linhagem de B. licheniformis isolada de fontes termais
que foi amplificada por reação de PCR usando oligonucleotídeos iniciadores
desenhados a partir de varias sequências depositadas para xilanases do gênero
Bacillus. Em outro estudo, Mei et al. (2013) amplificaram o gene de uma pectinase
alcalina e termoestável de B. halodurans M29 utilizando oligonucleotídeos
iniciadores desenhados a partir de sequências gênicas de pectinases conhecidas de
outras linhagens microbianas.
Ainda com respeito à busca por enzimas lignocelulolíticas mais eficientes,
vários estudos também têm proposto o melhoramento dessas enzimas através da
engenharia de proteínas. Neste sentido, várias estratégias de biologia molecular têm
sido empregadas, como por exemplo, a mutagênese aleatória por PCR (error-prone
PCR), a recombinação gênica in vitro por embaralhamento de DNA (DNA shuffle), a
evolução dirigida de proteínas e a construção de enzimas quiméricas (Banerjee et
al., 2010; Mohanram et al., 2013; Silva, 2013).
Para aumentar os rendimentos dos processos de hidrólise enzimática,
otimizar os coquetéis enzimáticos utilizados e reduzir os custos destes, algumas
pesquisas recentes têm buscado o entendimento de quais enzimas e proteínas são
realmente importantes neste processo e os sinergismos existentes entre as
diferentes atividades catalíticas. Neste sentido, tem-se proposto o desenvolvimento
de coquetéis enzimáticos racionais assim como a suplementação dos coquetéis
fúngicos já existentes com atividades enzimáticas acessórias (Banerjee et al., 2010;
Bussamra; Freitas; Costa, 2015; Goldbeck et al., 2014; Liu et al., 2013a; Machado et
al., 2015; Van Dyk; Pletschke, 2012).
Dentre as enzimas acessórias que podem ser utilizadas na hidrólise da
lignocelulose destacam-se as arabinanases, α-L-arabinofuranosidases,
galactanases, pectinases, algumas liases e esterases, lacases e outras enzimas
oxidativas (Banerjee; Scott-Craig; Walton, 2010; Ekwe et al., 2013; Kudanga; Roes-
Hill, 2014; Van Dyk; Pletschke, 2012). Estas enzimas podem aumentar a eficiência
das hidrolases glicosídicas padrões (celulases e xilanases) através da promoção de
um modo alternativo para clivagem das ligações dos polissacarídeos ou pelo fato de
melhorarem a acessibilidade aos polissacarídeos (Banerjee; Scott-Craig; Walton,
2010; Mohanram et al., 2013).
64
2.7. Aplicações biotecnológicas das enzimas lignocelulolíticas
O mercado mundial de enzimas industriais apresentou em 2014 um

crescimento estimado em 6 % em comparação com o ano anterior, movimentando
cerca de US$ 3,47 bilhões. As vendas para o setor de bioenergia foram as que mais
contribuíram para esse crescimento (Novozymes, 2015). Estima-se que a
comercialização de enzimas continuará em expansão e que deva movimentar cerca
de US$ 7 bilhões em 2017 (Freedonia Group, 2014). Atualmente, as vendas de
enzimas de uma das principais empresas do mercado mundial estão distribuídas da
seguinte forma: 35 % são destinadas a fabricação de detergentes, 26 % para a
indústria de alimentos e bebidas, 18 % para o setor de bioenergia, 14 % são usadas
na agricultura e ração animal e 7 % em aplicações técnicas e farmacêuticas
(Novozymes, 2015).
Além da utilização em processos de conversão de materiais
lignocelulósicos, as enzimas lignocelulolíticas apresentam um grande potencial de
aplicação em vários outros segmentos industriais, como de alimentos, ração animal,
papel e celulose, têxtil e lavanderia, química e farmacêutica, assim como em
processos de biorremediação (Bon; Ferrara; Corvo, 2008; Manju; Chadha, 2011;
Singhania, 2011).
Na indústria de alimentos as hidrolases glicosídicas são aplicadas no
processamento de frutas e vegetais e na produção de vinhos e cervejas com os
objetivos de melhorar a maceração e clarificação dos sucos; reduzir a viscosidade;
aumentar a estabilidade do produto e o rendimento das etapas de extração e
filtração; promover uma maior recuperação de compostos de aromas, óleos
essenciais, vitaminas e sais minerais (Collins; Gerday; Feller, 2005; Kuhad; Gupta;
Singh, 2011; Polizeli et al., 2005). Em produtos de panificação, as hemicelulases
podem ser utilizadas para hidrolisar a hemicelulose presente na farinha de trigo,
auxiliando assim na redistribuição de água, na melhora da elasticidade, textura e
força da massa, o que facilita a manipulação e o aumento do volume dos pães
(Collins; Gerday; Feller, 2005; Dhiman; Sharma; Battan, 2008; Polizeli et al., 2005).
As xilanases e galactanases podem também ser aplicadas na área de alimentos
para a produção de xilooligosacarídeos e galactooligossacarídeos. Estes são
açúcares não convencionais, não calóricos e que não são metabolizados pelo
organismo, apresentam diversos efeitos benéficos à saúde, como por exemplo, a
65
prevenção da cárie dentária, a diminuição dos níveis séricos de colesterol total e de

lipídios e o estímulo do crescimento de bifidobactérias no trato digestivo (Michalak et
al., 2012; Samanta et al., 2015). As enzimas ligninolíticas, como a lacase, também
podem ser utilizadas em processos da indústria de alimentos para melhorar ou
modificar a cor e turbidez de alimentos e bebidas, na gelatinização de pectinas, na
determinação de ácido ascórbico e como sequestradores de oxigênio (Thakur et al.,
2012).
Em rações animais, a adição de hidrolases glicosídicas tem resultado na
diminuição do teor de polissacarídeos não-amiláceos, auxiliando desta forma na
redução da viscosidade do meio intestinal e melhorando a utilização de proteínas e
carboidratos pelos animais. Além disso, essas enzimas também promovem a
eliminação de compostos antinutricionais e o aumento da digestibilidade e do valor
nutritivo de silagem e cereais de difícil digestão para ruminantes (Castro, 2006;
Jurutu; Wu, 2014; Polizeli et al., 2005).
Nas indústrias têxteis, as xilanases e pectinases são aplicadas na
maceração enzimática de tecidos naturais como o linho, juta e rami, enquanto que
as celulases são utilizadas no biopolimento (desfibrilação de tecidos como o algodão
e a lã) e na bioestonagem de tecidos (amaciamento e desbotamento do brim)
(Castro, 2006; Collins; Gerday; Feller, 2005). As pectinases também podem ser
aplicadas na purga do algodão, uma etapa que consiste na remoção dos materiais
não celulósicos que constituem o algodão. A utilização dessas enzimas na indústria
têxtil traz uma série de benefícios, como a redução do tempo de tratamento, do
consumo de água e da utilização de composto químicos, aumenta a quantidade de
material que pode ser processado nos equipamentos, não causa perda excessiva de
resistência dos tecidos e promove a geração de efluentes sem a necessidade de
tratamentos complexos (Bon; Ferrara; Corvo, 2006; Castro, 2006). As lacases
também têm sido utilizadas na indústria têxtil para degradar os corantes sintéticos
presentes nos efluentes do processo de tingimento (Muthukumarasamy; Murugan,
2014; Santos, 2010).
As xilanases e celulases também podem ser utilizadas na indústria de
detergentes com os objetivos de melhorar a remoção de manchas de frutas e
vegetais, aumentar o brilho das cores e maciez de tecidos de algodão e,
principalmente, amenizar o desgaste dos tecidos, representado pela formação de
fiapos após sucessivas lavagens (Dhiman; Sharma; Battan, 2008; Jurutu; Wu, 2014).
66
A aplicação destas enzimas na formulação de detergentes também desempenha um

importante papel na redução de problemas ambientais ocasionados pela utilização
de amaciantes catiônicos (Castro, 2006).
Outra grande aplicação industrial das enzimas lignocelulolíticas,
principalmente das xilanases e das lacases, está na indústria de papel e celulose,
onde essas enzimas são utilizadas nos processos de deslignificação e
biobranqueamento da polpa, modificação das fibras e reciclagem de papel (Battan et
al., 2007; Polizeli et al., 2005; Thakur et al., 2012). A utilização de xilanases no pré-
tratamento da polpa kraft facilita as etapas subsequentes de branqueamento, diminui
a quantidade de reagentes químicos usados, melhora algumas propriedades físicas
da polpa (viscosidade, resistência à tração, fator de ruptura e de desgaste), aumenta
a dispersão das fibras do papel e a capacidade de retenção de água e economiza
energia (Collins; Gerday; Feller, 2005; Dhiman et al., 2008). Celulases e pectinases
também podem ser utilizadas na produção de papel para o polpamento da madeira,
remoção de tintas de impressão e modificação de propriedades das fibras de
celulose para a fabricação de papéis macios e biodegradáveis (Kaur et al., 2010;
Kuhad; Gupta; Singh, 2011; Singhania, 2011).
Na indústria farmacêutica as hemicelulases podem ser utilizadas em
formulações em combinação com outras enzimas, como as proteases e amilases,
como um suplemento alimentar ou como um auxiliar digestivo para problemas de má
digestão (Polizeli et al., 2005). Outras aplicações biomédicas incluem a utilização de
α-L-arabinofuranosidases e pectinases para a produção de compostos
antiglicêmicos e agentes anticancerígenos (Numan; Bhosle, 2006; Olano-Martin et
al., 2003). As lacases também podem ser aplicadas nesta área para a síntese de
compostos de uso médicos, como anestésicos, sedativos, anti-inflamatórios e
antibióticos (Thakur et al., 2012).
Outras potenciais aplicações das hidrolases glicosídicas incluem a
agricultura, onde podem ser utilizadas na produção de protoplastos de plantas para
obtenção de estirpes híbridas com propriedades desejáveis e no controle de
doenças vegetais através da degradação da parede celular de agentes patogênicos
(Kuhad; Gupta; Singh, 2011). As enzimas lignocelulolíticas, principalmente as
lacases, também possuem um grande potencial de aplicação em processos de
biorremediação, podendo ser utilizadas na detoxificação e degradação de
herbicidas, compostos policlorados e fenólicos (Muthukumarasamy; Murugan, 2014;
67
Santos, 2010; Thakur et al., 2012). As lacases podem ser ainda utilizadas em
reações de síntese para obtenção de flavonóides, corantes têxteis, pigmentos
cosméticos, aldeídos aromáticos e pesticidas, e na fabricação de biossensores para
ensaios imunobioquímicos visando à detecção de oxigênio, glicose, aminas
aromáticas e compostos fenólicos (Thakur et al., 2012).
2.8. Conclusões
As preocupações com uma possível crise dos setores energético e

industrial devido à depleção das reservas de petróleo, somadas com o aumento da
emissão de gases que causam o efeito estufa irão pressionar cada vez mais a
sociedade no século XXI para a busca por fontes renováveis de energia e matérias-
primas. Considerando que os subprodutos agroindustriais e outros materiais de
origem lignocelulósica são gerados anualmente e globalmente em grandes
quantidades, o reaproveitamento desses é sem dúvidas uma das mais promissoras
alternativas para superar a atual dependência do petróleo e também para o
desenvolvimento sócio-econômico e ambiental de países produtores desses
materiais em larga escala, como é o caso do Brasil. Contudo, como o processo de
reaproveitamento desses materiais em biorrefinarias é algo relativamente novo e
caro, muitas tecnologias ainda precisarão serem desenvolvidas assim como a
superação das atuais dificuldades técnicas para tornar este processo
economicamente viável. A comunidade científica tem se mobilizado nos últimos anos
para realização de pesquisas tanto nas áreas de pré-tratamento e hidrólise como na
de fermentação microbiana. Neste sentido, a busca por novas fontes microbianas
produtoras de enzimas, a otimização dos processos de produção, a avaliação e
melhoramento de características bioquímicas das enzimas, o entendimento dos
mecanismos de ação e seletividade destas enzimas e a formulação de novos
coquetéis enzimáticos para a hidrólise eficaz de diferentes materiais lignocelulósicos
serão imprescindíveis. Esse aumento no interesse por enzimas lignocelulolíticas
também beneficiará outros segmentos industriais, pois essas enzimas possuem um
amplo potencial de aplicação, que ainda é pouco explorado devido às características
das atuais enzimas comercializadas e o preço desses biocatalisadores.
68
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Etapa experimental 1 - “Avaliação do potencial biotecnológico para

produção de hidrolases glicosídicas e caracterização taxonômica de
isolados de Bacillus sp.”
3.1.1. Micro-organismos utilizados e manutenção

Nesta etapa experimental foram utilizados 107 isolados de Bacillus sp.
obtidos a partir de amostras de sucos de frutas submetidas à tratamento térmico e
fazem parte da coleção de culturas do Laboratório de Bioquímica de Alimentos da
Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas.
Também foram utilizadas 5 linhagens referência de Bacillus sp. (B. cereus ATCC
14579, B. licheniformis ATCC 14580, B. megaterium ATCC 14581, B. pumilus ATCC
7061 e B. subtilis ATCC 6051) provenientes da Coleção de Culturas Tropical da
Fundação André Tosello, Campinas - SP. Culturas estoque desses micro-
organismos foram cultivadas por 48 horas a 37 ºC em tubos inclinados com o meio
de cultura sólido Lúria-Bertani (LB) (0,5 % de extrato de levedura, 1 % de NaCl, 1 %
de triptona e 1,5 % de ágar bacteriológico (m/v)) e conservadas sob camada de
vaselina esterilizada a 4 ºC com repicagem a cada 4 meses de armazenamento. Os
micro-organismos também foram preservados na forma de criotubos a -80 ºC. Nesse
caso, estes foram cultivados em tubos cônicos tipo Falcon de 50 mL contendo 10 mL
de meio de cultura líquido LB por 24 horas a 37 ºC e 250 rpm. Alíquotas de 100 µL
dessas culturas foram transferidas assepticamente para criotubos contendo 100 µL
de meio LB com glicerol 40 % (v/v), previamente esterilizados.
3.1.2. Determinações analíticas
3.1.2.1. Determinações de atividade enzimática

As atividades enzimáticas de arabinanase, endoglucanase, galactanase,
β-1,3-1,4-glucanase (ou liquenase), mananase, poligalacturonase e xilanase foram
realizadas de acordo com Bailey, Biely e Poutanen (1992), com volumes adaptados
para microrreação como proposto por Squina et al. (2009). Os açúcares redutores
liberados nas reações enzimáticas foram quantificados pelo método do ácido 3,5-
dinitrosalicílico (DNS) (Miller, 1959).
69
As misturas reacionais contendo 50 µL de solução 0,5 % (m/v) do

substrato dissolvido em água, 30 µL de tampão fosfato 0,1 M, pH 6,0, e 20 µL de
extrato enzimático foram preparadas em microplacas para PCR de 96 poços e
tampadas com selo de silicone. Os substratos utilizados foram arabinana
desramificada (Megazyme), carboximetilcelulose (CMC – Sigma-Aldrich), galactana
de batata (Megazyme), β-glucano de cevada (Megazyme), manana (Megazyme),
pectina de frutas cítricas (Sigma-Aldrich) e xilana de madeira faia (xilana beechwood
– Sigma-Aldrich), respectivamente. As reações foram incubadas por 20 minutos a
50°C e paralisadas pela adição de 100 µL de solução de DNS. Em seguida, as
amostras foram incubadas a 99 ºC por 5 minutos e resfriadas em banho de gelo para
estabilização da coloração. Como reações controle, foram preparadas misturas
reacionais contendo os mesmos volumes anteriores de substrato e tampão que
também foram incubadas a 50 ºC por 20 minutos. Após a paralisação das reações
controle com a solução de DNS, foi adicionado 20 µL do extrato enzimático e
realizada a incubação a 99 ºC por 5 minutos. Alíquotas de 100 µL das amostras
reacionais foram transferidas para microplacas de leitura e as absorbâncias foram
mensuradas em espectrofotômetro (Infinite® 200 PRO – TECAN) a 540 nm. As
atividades enzimáticas foram calculadas usando uma curva de calibração preparada
com D-glicose ou D-xilose (Sigma-Aldrich) dependendo do substrato utilizado. Uma
unidade de atividade enzimática (U/mL) foi definida como 1 µmol de açúcares
redutores liberados por minuto por mL de enzima a 50 ºC nas condições de ensaio.
3.1.2.2. Determinação do teor de proteínas solúveis totais

A quantificação do teor de proteínas solúveis totais foi realizada utilizando
o kit Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories), que se baseia no método
colorimétrico de Bradford (Bradford, 1976). Foram pipetados em microplacas de 96
poços, 20 µL do reagente colorimétrico e 80 µL da amostra. Após homogeneização e
incubação a temperatura ambiente por 5 minutos foi realizada a leitura da
absorbância em espectrofotômetro a 595 nm. Os resultados foram relacionados com
uma curva de calibração preparada utilizando albumina sérica bovina (BSA) e
utilizados para a avaliação da atividade específica (número de unidades de atividade
enzimática por miligrama de proteína no sobrenadante de cultivo microbiano).
70
3.1.3. Avaliação do potencial biotecnológico dos isolados de Bacillus sp.

para produção de hidrolases glicosídicas
3.1.3.1. Seleção de micro-organismos produtores de celulase, pectinase

e xilanase através de testes em placas de Petri
Os 107 isolados de Bacillus sp. foram cultivados em placas de Petri
contendo meio de cultura mínimo sólido composto de 0,2 % de NaNO3, 0,1 % de
K2HPO4, 0,05 % de MgSO4, 0,05 % de KCl, 0,02 % de peptona, 1,5 % de ágar
bacteriológico e 0,5 % do substrato avaliado (carboximetilcelulose - CMC, xilana ou
pectina) (m/v), ajustado a pH 7,0 (Kasana et al., 2008). As placas foram incubadas a
37 e 45 ºC por até 16 horas, sendo em seguida coradas com solução do corante
vermelho Congo (5 mg/mL) por 30 minutos e descoradas com NaCl 1 M nas
mesmas condições. Posteriormente, as placas foram lavadas com solução de ácido
acético 0,1 M para melhorar a visualização dos halos de degradação. Os micro-
organismos produtores de celulases, xilanases e pectinases foram selecionados pela
observação de formação de halos ao redor das colônias e pela determinação do
índice enzimático (razão entre o diâmetro do halo de degradação em relação ao
diâmetro da colônia), conforme descrito por Hankin e Anagnostakis (1975). Os
experimentos foram realizados em duplicata.
3.1.3.2. Seleção de micro-organismos produtores de hidrolases

glicosídicas por fermentação submersa
3.1.3.2.1. Seleção de micro-organismos produtores de

endoglucanase, poligalacturonase e xilanase em meio de
cultura líquido contendo substratos comerciais
A partir dos resultados obtidos de formação de halos de hidrólise ao redor
das colônias e do índice enzimático, foram selecionadas alguns isolados de Bacillus
sp. para avaliação quantitativa quanto à capacidade de produzir endoglucanases,
poligalacturonases e xilanases extracelulares por fermentação submersa. O inóculo
foi preparado cultivando uma alçada de cada isolado microbiano selecionado em
tubos cônicos tipo Falcon de 50 mL contendo 10 mL de meio LB a 37°C, 250 rpm
durante 16 horas. Após este período, 2 % (v/v) do inóculo, com densidade óptica
(DO) a 600 nm de aproximadamente 0,7, foi transferido assepticamente para frascos
71
Erlenmeyer de 50 mL contendo 15 mL do meio de cultura mínimo líquido (0,2 % de

NaNO3, 0,1 % de K2HPO4, 0,05 % de MgSO4, 0,05 % de KCl, 0,02 % de peptona e
0,5 % do substrato avaliado (CMC, xilana ou pectina) (m/v), ajustado a pH 7,0).
Estes foram incubados a 37 ºC e 150 rpm por 3 dias. As atividades enzimáticas de
endoglucanase, xilanase e poligalacturonase foram acompanhadas periodicamente
a cada 24 horas de cultivo, sendo a análise realizada no sobrenadante do caldo
fermentado centrifugado a 10.000 x g por 10 minutos a 4°C. Também foi realizada a
determinação de proteínas totais nos sobrenadantes de cultivo, como descrito
anteriormente. Os experimentos foram realizados em triplicata. Análises estatísticas
de correlação linear entre os resultados obtidos nos testes de avaliação qualitativa e
nos testes de avaliação quantitativa foram realizadas com auxílio do programa
Statistica versão 7.0 (Statsoft).
3.1.3.2.2. Seleção de micro-organismos produtores de hidrolases

glicosídicas em meio de cultura líquido contendo farelo de
trigo
Os 5 isolados de Bacillus sp. com melhores resultados para produção de
xilanases na seleção em meio de cultura mínimo líquido com xilana foram
novamente cultivados, como descrito no item anterior, em meio de cultura líquido
contendo 0,5 % (m/v) de farelo de trigo como única fonte de carbono. As atividades
enzimáticas de arabinanase, galactanase, liquenase, mananase e xilanase e a
determinação de proteínas totais foram acompanhadas periodicamente, sendo a
análise realizada no sobrenadante do caldo fermentado centrifugado a 10.000 x g
por 10 minutos a 4°C. Os experimentos foram realizados em triplicata. Os resultados
obtidos para cada atividade enzimática foram submetidos à análise de variância
(ANOVA) sendo as médias comparadas pelo teste de Tukey ao nível de significância
de 5 % (p < 0,05) com o auxílio do programa Statistica versão 7.0 (Statsoft).

isolados de Bacillus sp.
3.1.4.1. Extração do DNA genômico

A extração do DNA genômico foi realizada como descrito por Neumann,
Pospiech e Schairer (1992) e Cheng e Jiang (2006), com algumas modificações. Os
72
20 isolados de Bacillus sp. selecionados para o teste quantitativo de produção de

hidrolases glicosídicas (item 3.1.3.2.1) e as 5 linhagens referência do gênero Bacillus
foram cultivadas em tubos tipo Falcon de 50 mL com 10 mL de meio de cultura LB
líquido a 37 ºC e 250 rpm durante 16 horas. Alíquotas de 2 mL de cada cultivo
microbiano foram coletadas em microtubos e submetidas a centrifugação a 14.000 x
g por 5 minutos a 4 ºC.
Após a remoção do sobrenadante, o precipitado de células foi
ressuspenso em 900 µL de solução tampão STE (NaCl 100 mM, tampão Tris-HCl 10
mM, pH 8,0, e EDTA 1 mM) contendo 2 % (m/v) de SDS, 40 µL de lisozima (12
mg/mL), 40 µL de proteinase K (12 mg/mL) e 20 µL de RNase (10 mg/mL) e
incubado a 50 ºC por 45 minutos para lise celular. Em seguida, foi adicionado 1 mL
de solução de fenol tamponado ao microtubo contendo as células lisadas e após
homogeneização foi realizada centrifugação a 14.000 x g por 5 minutos a 4 ºC. Uma
alíquota de 500 μL da fase superior aquosa foi coletada e transferida para outro
microtubo, onde foram adicionados 500 μL de clorofórmio. Após homogeneização e
centrifugação a 14.000 x g por 5 minutos a 4 ºC, 400 μL da fase superior aquosa
foram novamente coletados e transferidos para outro microtubo, onde foram
adicionados 40 μL de acetato de sódio 3 M e 1,2 mL de etanol gelado. Em seguida,
os microtubos foram incubados a -80 ºC por 30 minutos com posterior centrifugação
a 14.000 x g por 10 minutos a 4 ºC, para precipitação do DNA. Após descarte do
sobrenadante, o DNA genômico aderido na parede do tubo foi lavado com 500 µL de
etanol 70 %, centrifugado a 14.000 x g por 5 minutos a 4 ºC e deixado por 5 minutos
a temperatura ambiente em concentrador (Concentrator Plus SpeedVac® -
Eppendorf) para evaporar o etanol.
O DNA genômico obtido foi ressuspendido em 100 µL de tampão TE
(tampão Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, e EDTA 1 mM) e quantificado por
espectrofotometria (Nanodrop 2000c – Thermo Scientific) a 260 nm, onde também
foi avaliada a contaminação por proteínas baseado na relação dos comprimentos de
onda 260/280 nm. A integridade e pureza do DNA genômico extraído também foram
avaliadas por eletroforese em gel de agarose 1 % (m/v) em tampão TAE 1X (tampão
Tris-Acetato 40 mM, EDTA 1mM, pH 8,3), a 90 V por 1 hora. Os géis de agarose
foram corados com solução de brometo de etídio (0,25 µg/mL) por 20 minutos e
visualizados sob iluminação ultravioleta em fotodocumentador Gel Logic 6000Pro
(Carestream). As amostras foram estocadas a -20 ºC até a utilização.
73
3.1.4.2. Caracterização taxonômica dos isolados de Bacillus sp.

baseado na sequência do gene RNAr 16S
Após extração do DNA genômico dos 20 isolados avaliados foi realizada a
amplificação por PCR (reação em cadeia da polimerase) do gene RNAr 16S
utilizando o conjunto de oligonucleotídeos iniciadores p27f (5’
AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3’) e p1492r (5’ TACCTTGTTACGACTT 3’) (Lane,
1991). As reações continham 100 ng de DNA genômico, 1,5 U de Taq DNA
Polimerase (Thermo Scientific), 0,2 mM de dNTP mix, 10 pM de cada
oligonucleotídeo iniciador, tampão PCR 1X (tampão Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KCl 50
mM), 2 mM de MgCl2 e água Milli-Q estéril completando o volume final de 50 µL na
reação. As amplificações por PCR foram realizadas em termociclador Mastercycler
pro S (Eppendorf) usando um ciclo inicial de desnaturação a 94 ºC por 3 minutos,
seguido de 30 ciclos a 94 ºC por 40 segundos, 55 ºC por 40 segundos, 72 ºC por 2
minutos e um ciclo de extensão final a 72 ºC por 10 minutos.
A confirmação da amplificação do fragmento de interesse (com
aproximadamente 1.500 bp) foi realizada por eletroforese em gel de agarose 1 %
(m/v) em tampão TAE 1X a 90 V por 1 hora. Os géis foram posteriormente corados
com solução de brometo de etídio e visualizados sob luz ultravioleta em
fotodocumentador. A banda de interesse foi excisada do gel e purificada com o kit de
purificação Illustra™ GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification (GE Healthcare),
de acordo com as especificações do fabricante. O produto da reação de PCR
purificado foi submetido à reação de sequenciamento utilizando os oligonucleotídeos
iniciadores citados anteriormente e o oligonucleotídeo iniciador 907r (5’
CCGTCAATTCMTTTRAGTTT 3’) (Lane, 1991). As reações de sequenciamento
foram feitas com o reagente BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied
Biosystems) segundo as instruções do fabricante e analisadas no sequenciador
automático DNA ABI PRISM 377 Genetic Analyser (Applied Biosystems) do
Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol (CTBE/CNPEM).
As sequências obtidas foram analisadas no programa Geneious versão
6.1.5 (Biomatters) e comparadas com outras sequências depositadas nos bancos de
dados ezTaxon (disponível em http://www.ezbiocloud.net/eztaxon) e no GenBank do
NCBI (National Center for Biotechnology Information) através da ferramenta BLAST
N (disponível em http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). As sequências obtidas neste estudo e
74
outras selecionadas nos bancos de dados, com similaridade acima de 97 %, foram

alinhadas usando o programa CLUSTAL W (Larkin et al., 2007), sendo as
extremidades das sequências ajustadas para que todas apresentassem o mesmo
tamanho. A análise filogenética foi construída com o auxílio do programa MEGA
versão 6.0 (Tamura et al., 2013) usando o algoritmo neighbor-joining (Saitou; Nei,
1987) e o modelo de substituição de nucleotídeo Kimura 2-P (Kimura, 1980). A
estabilidade dos relacionamentos na árvore filogenética foi obtida usando
reamostragem (Bootstrap) com 1.000 repetições.

baseada nas características morfológicas e fisiológicas
A caracterização taxonômica dos isolados de Bacillus sp. por método
molecular, como descrito no item 3.1.4.2, foi validada através da análise comparativa
de características diferenciais de morfologia, fisiologia e metabolismo bioquímico dos
isolados utilizados neste estudo, com dados citados na literatura de referência
(Brenner et al., 2005ab; Holt et al., 1994; Koneman et al., 1997). Também foram
utilizados nesta validação os sistemas comerciais de testes rápidos API 50CHB e
Vitek 2 da BioMérieux para analisar as características bioquímicas dos isolados
quanto a utilização de carboidratos. Estas análises foram realizadas pelo laboratório
da Coleção de Culturas Tropical da Fundação André Tosello, Campinas-SP.
3.1.4.4. Análise da diversidade genética dos isolados de Bacillus sp.

por ARDRA
A avaliação da diversidade genética dos 20 isolados de Bacillus sp.
selecionados para o teste quantitativo e das 5 linhagens de referência de Bacillus sp.
(B. cereus ATCC 14579, B.licheniformis ATCC 14580, B. megaterium ATCC 14581,
B. pumilus ATCC 7061 e B. subtilis ATCC 6051) foi realizada através da técnica de
ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis), que neste trabalho
consistiu na análise de restrição da região intergênica entre as subunidades 16S-
23S do gene RNAr. Os procedimentos adotados nesta análise foram baseados na
metodologia descrita por Reis Junior, Reis e Teixeira (2006).
Inicialmente, foi realizada a amplificação por PCR da região intergênica
16S-23S do gene RNAr dos micro-organismos avaliados utilizando o conjunto de
oligonucleotídeos iniciadores p23S (5’ GGTTCTTTTCACCTTTCCCTC 3’)
75
(Honeycutt; Sobral; McClelland, 1995) e pHr (5’ TGCGGCTGGATCACCTCCTT 3’)

(Massol-Deya et al., 1995). As reações de PCR foram preparadas como descrito
anteriormente no item 3.1.4.2. e realizadas em termociclador Mastercycler pro S
(Eppendorf) utilizando um ciclo inicial de desnaturação a 94 ºC por 3 minutos,
seguido de 30 ciclos a 94 ºC por 40 segundos, 60 ºC por 40 segundos, 72 ºC por 2
minutos e um ciclo de extensão final a 72 ºC por 10 minutos. A confirmação das
amplificações foi realizada utilizando 10 μL de cada reação de PCR através de
eletroforese em gel de agarose 1 % (m/v) em tampão TAE 1X a 90 V por 1 hora. Os
géis foram posteriormente corados em solução de brometo de etídio e visualizados
sob luz ultravioleta em fotodocumentador.
Os produtos da amplificação por PCR da região intergênica 16S-23S do
RNAr foram digeridos em reações independentes de restrição enzimática utilizando
as enzimas de restrição HaeIII, AluI, RsaI (Fermentas Life Technologies) e CfoI
(Promega). Cada mistura reacional continha 3 U da enzima de restrição de
interesse, 1,5 µL de tampão de reação, 7 µL do produto de PCR e água Milli-Q
estéril completando o volume final de 15 µL de reação. As reações foram incubadas
por 2 horas a 37 ºC e inativadas por incubação a 80 ºC por 20 min. Os produtos da
digestão enzimática foram submetidos à separação por eletroforese em gel de
agarose 1,5 % (m/v) em tampão TAE 1X a 60V por 140 minutos e visualizados após
coloração com brometo de etídio em fotodocumentador sob luz ultravioleta.
Posteriormente, foi realizada a análise e comparação dos padrões de
clivagem gerados pelas quatro enzimas de restrição utilizando o programa
BioNumerics versão 7.0 (Applied Maths). Foi construída uma matriz binária a partir
dos dados obtidos da análise de todas as bandas, onde para cada posição de
migração foram atribuídos valores de 1 ou 0, indicando a presença ou ausência de
uma banda, respectivamente. Os padrões de migração gerados foram comparados e
suas semelhanças estimadas pelo coeficiente de Jaccard. Os isolados foram
agrupados usando o algoritmo UPGMA (Unweighted Pair Group Method with
Arithmetic Mean) (Sneath; Sokal, 1973) e representados graficamente por uma
árvore filogenética utilizando os programas FreeTree (Hampl; Pavlícek; Flegr, 2001)
e MEGA versão 6.0 (Tamura et al., 2013), com reamostragem (Bootstrap) de 1.000
repetições.
76
3.2. Etapa experimental 2 – “Otimização da produção de hemicelulases por

B. licheniformis CBMAI 1609 utilizando subprodutos agroindustriais”
3.2.1. Micro-organismos utilizados

Nesta etapa do trabalho foi utilizada a linhagem B. licheniformis CBMAI
1609, que foi o isolado de Bacillus sp. que apresentou os melhores resultados
quanto à produção de hemicelulases nos testes iniciais descritos no item 3.1.3.
Também foi utilizada nesta parte do trabalho a linhagem B. licheniformis ATCC
14580 proveniente da Coleção de Culturas Tropical da Fundação André Tosello,
Campinas - SP.
3.2.2. Preparo do inóculo e produção da enzima

O inóculo foi preparado cultivando uma alçada da cultura de B.
licheniformis CBMAI 1609 em frasco Erlenmeyer de 250 mL com 50 mL de meio de
cultura LB líquido a 37 ºC em agitador rotatório a 250 rpm por 8 horas. Após este
período, a massa celular foi recuperada por centrifugação a 5.000 x g por 10 minutos
a 4˚C. As células obtidas foram lavadas com 50 mL de solução salina estéril (0,8 %
de NaCl (m/v)) e novamente centrifugadas sob as mesmas condições anteriores. Em
seguida, o precipitado de células microbianas foi ressuspendido com solução salina
até densidade óptica (DO) igual 1,0 a 600 nm.
A produção da xilanase foi realizada inoculando 2 % (v/v) da suspensão
de células de B. licheniformis CBMAI 1609, preparada como descrito acima, em
frascos Erlenmeyer de 50 mL contendo 15 mL de meio de cultura mínimo composto
de 0,2 % de NaNO3, 0,1 % de K2HPO4, 0,05 % de MgSO4, 0,05 % de KCl, 0,02 % de
peptona e 1 % de xilana de madeira faia (m/v), pH 7,0 (Kasana et al., 2008). Os
frascos foram incubados em agitador rotatório a 200 rpm, 30 ºC, por até 90 horas.
Durante a fermentação, alíquotas do meio de cultura fermentado foram coletadas,
centrifugadas (10.000 x g, 4 ºC por 10 minutos) e o sobrenadante de cultivo foi
utilizado para determinação da atividade enzimática de xilanase.
3.2.3. Determinações analíticas

77
3.2.3.1. Determinação das atividades enzimáticas

As determinações de atividade enzimática foram realizadas como descrito
no item 3.1.2.1. Os substratos carboximetilcelulose (CMC), pectina de frutas cítricas
e xilana de madeira faia (Sigma-Aldrich) foram utilizados nas determinações de
atividades enzimáticas de endoglucanase, poligalacturonase e xilanase,
respectivamente. Para as atividades enzimáticas de arabinanase e α-L-
arabinofuranosidase foram utilizados os substratos arabinana linear, arabinana
desramificada e arabinana de beterraba sacarina (Megazyme). As atividades
enzimáticas de galactanase, laminarinase, liquenase, mananase e xiloglucanase
foram realizadas utilizando-se os substratos galactana de batata, laminarina, β-
glucano de cevada e liquenano, manana e xiloglucano de tamarindo (Megazyme),
respectivamente. A atividade de xilanase também foi avaliada utilizando-se o
substrato arabinoxilana de centeio (Megazyme).
3.2.3.2. Determinação dos açúcares redutores solúveis

A determinação dos açúcares redutores solúveis presentes no
sobrenadante de cultivo foi realizada pelo método de DNS, descrito por Miller (1959)
com volumes adaptados para microrreação. Alíquotas de 100 μL do sobrenadante
do meio de cultura e do reagente de DNS foram pipetadas em microplacas de 96
poços e após homogeneização foram incubadas por 5 minutos a 99 ºC. Em seguida,
as amostras foram resfriadas em banho de gelo para estabilização da coloração.
Alíquotas de 100 μL das amostras foram transferidas para microplacas de leitura e a
absorbância foi mensurada em espectrofotômetro (Infinite® 200 PRO – TECAN) a
540 nm. Os resultados obtidos foram relacionados com uma curva de calibração
preparada com D-glicose (Sigma-Aldrich).
3.2.3.3. Determinação do crescimento microbiano

O crescimento microbiano durante a fermentação foi estimado através do
número de células viáveis. Alíquotas do meio de cultura fermentado foram coletadas
em diferentes intervalos de tempo durante a fermentação e plaqueadas em três
diluições seriadas diferentes em placas de Petri contendo o meio de cultura ágar
nutriente (0,1 % de extrato de carne, 0,1 % de extrato de levedura, 0,5 % de
peptona, 0,5 % de NaCl e 1,5 % de ágar bacteriológico (m/v)). Após 24 horas de
incubação a 30 ºC foram realizadas as contagens do número de colônias, sendo
78
utilizada para os cálculos do número de células viáveis a diluição que apresentou

entre 30 a 250 colônias por placa.

fermentação de B. licheniformis CBMAI 1609 e produção de
xilanase
O efeito de diferentes fontes de carbono sobre a produção de xilanase por
B. licheniformis CBMAI 1609 foi avaliado através do cultivo do micro-organismo em
meio de cultura mínimo, como descrito no item 3.2.2, substituindo-se o substrato
comercial xilana de madeira faia por 1 % (m/v) dos seguintes subprodutos
agroindustriais: bagaço de cana-de-açúcar (in natura; tratado com explosão a vapor;
tratado com explosão a vapor e deslignificação alcalina), bagaço de cevada, bagaço
de laranja, farelo de arroz, farelo de soja, farelo de trigo, madeira de eucalipto, palha
de milho ou por combinações destes na proporção 1:1 (m/m).
No estudo do efeito das diferentes fontes de nitrogênio na produção da
enzima, o micro-organismo foi cultivado, como descrito anteriormente, em meio de
cultura composto de 0,1 % de K2HPO4, 0,05 % de MgSO4, 0,05 % de KCl, 1 % da
fonte de carbono ótima e 0,5 % da fonte de nitrogênio testada (m/v), pH 7,0. Foram
avaliadas como fontes de nitrogênio compostos inorgânicos (cloreto de amônio,
nitrato de amônio e sulfato de amônio), compostos orgânicos (caseína, extrato de
carne, extrato de levedura, peptona e triptona), subprodutos agroindustriais ricos em
nitrogênio (farinha de pena, milhocina e soja moída) e combinações destes na
proporção 1:1 (m/m).
Os subprodutos agroindustriais utilizados neste estudo foram adquiridos
no comércio local ou em indústrias da região de Campinas e Ribeirão Preto – SP e
também cedidos pelo Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol
(CTBE/CNPEM). Estes antes da utilização foram triturados em processador (Arno,
Optimix Plus) e submetidos à separação granulométrica utilizando peneiras para se
obter partículas com tamanho de até 2 mm.
Os efeitos de alguns sais minerais (CaCl2, NaCl, MnCl2, FeCl3, KH2PO4,
ZnSO4) e aditivos (PEG 6000, Tween 80 e azeite de oliva) sobre a produção de
xilanase foram investigados através do cultivo do micro-organismo, como descrito
anteriormente, em meio de cultura composto de 0,1 % de K2HPO4, 0,05 % de
MgSO4, 0,05 % de KCl, 1 % da fonte de carbono ótima e 0,5 % da fonte de
79
nitrogênio ótima (m/v), pH 7,0, adicionado de 0,1 % (m/v ou v/v) destes compostos
separadamente. Todos os experimentos foram realizados em triplicata e as
atividades enzimáticas de xilanase foram acompanhadas periodicamente a cada 24
horas até 90 horas de fermentação.
3.2.5. Identificação dos componentes do meio de cultura significativos

para fermentação de B. licheniformis CBMAI 1609 e produção de
xilanase usando delineamento fatorial fracionado
Um delineamento fatorial fracionado 26-2 foi utilizado para determinar os
efeitos dos componentes do meio de cultura (K2HPO4, MgSO4, KCl, bagaço de
laranja, caseína e farelo de soja) sobre a produção de xilanase por B. licheniformis
CBMAI 1609. Cada uma das variáveis independentes foi avaliada em três níveis, em
um nível alto (codificado por +1), um nível baixo (codificado por -1) e um nível basal
(codificado por 0). O programa Statistica versão 7.0 (Statsoft) foi usado para definir a
matriz do delineamento fatorial fracionado, que consistiu de 16 combinações mais 5
repetições no ponto central (ensaios realizados sob as condições de nível basal),
como apresentado na Tabela 10. Nesta tabela são também apresentados os valores
utilizados em cada nível de estudo para as variáveis avaliadas. As fermentações em
cada ensaio foram realizadas em duplicata sob as condições de cultivo descritas no
item 3.2.2, sendo a atividade enzimática de xilanase (variável dependente)
determinada após 24, 48 e 72 horas de cultivo. A média das atividades de xilanase
obtidas com 72 horas de fermentação foram utilizadas para análise estatística
realizada com o auxílio do programa Statistica versão 7.0 (Statsoft). As variáveis
independentes estatisticamente significativas com 90 % de confiança foram
consideradas influentes na produção de xilanase.
3.2.6. Otimização das concentrações dos componentes do meio de

cultura significativos para fermentação de B. licheniformis CBMAI
1609 e produção de xilanase usando delineamento composto
central rotacional
As concentrações dos componentes do meio de cultura que afetaram
significativamente a produção de xilanase pelo micro-organismo B. licheniformis
CBMAI 1609 foram otimizadas através de um delineamento composto central
rotacional (DCCR) para 3 variáveis (23). As variáveis foram estudadas em 5 níveis
80
diferentes e codificadas de acordo com a Equação 1. As variáveis e os níveis

estudados estão apresentados na Tabela 12.

Equação 1:
∆
(Onde, xi é a variável codificada, Xi é a variável natural, X0 é o valor da variável natural no ponto

central, e ∆Xi é a faixa de variação entre as variáveis)
O programa Statistica versão 7.0 (Statsoft) foi usado para definir a matriz
do DCCR, que consistiu de 14 combinações (8 pontos fatoriais e 6 pontos axiais)
mais 5 repetições na condição de ponto central, para estimar o erro experimental e
investigar a suscetibilidade do modelo proposto. As fermentações em cada ensaio
foram realizadas em duplicata sob as condições de cultivo descritas no item 3.2.2,
sendo a atividade enzimática de xilanase determinada após 24, 48 e 72 horas de
cultivo. Os resultados experimentais obtidos com 48 horas de fermentação foram
ajustados a uma função polinomial de segunda ordem e o teste t-Student foi
realizado para avaliar a significância estatística dos coeficientes de regressão. Os
coeficientes de regressão estatisticamente significativos a 95 % de confiança foram
utilizados para compor um modelo matemático capaz de prever a produção de
xilanase dentro das faixas estudadas para cada variável. A análise de variância
(ANOVA) foi realizada para avaliar a significância estatística do modelo matemático
gerado e o coeficiente de determinação (R2) foi calculado para verificar quanto da
variabilidade das respostas eram previstas pelo modelo. O modelo matemático
obtido foi posteriormente validado através do cultivo do micro-organismo em
triplicata no meio de cultura composto pela combinação das variáveis dentro de suas
faixas ótimas previstas no modelo.
3.2.7. Otimização dos parâmetros temperatura e agitação para

xilanase usando delineamento composto central rotacional
Um delineamento composto central rotacional (DCCR) para 2 variáveis
(22) foi realizado a fim de se otimizar os parâmetros temperatura e agitação que
influenciam a fermentação de B. licheniformis CBMAI 1609 e a produção de
xilanase. As variáveis foram avaliadas em 5 níveis diferentes e codificadas como
81
descrito anteriormente, de acordo com a Equação 1. Os níveis de estudo de cada

variável estão apresentados na Tabela 15. O programa Statistica versão 7.0
(Statsoft) foi usado para definir a matriz do DCCR que consistiu de 8 combinações (4
pontos fatoriais e 4 pontos axiais) mais 4 repetições no ponto central, como
apresentado na Tabela 15. As fermentações em cada ensaio foram realizadas em
duplicata utilizando o meio de cultura otimizado sob as condições de cultivo descritas
no item 3.2.2 e a atividade enzimática de xilanase foi determinada após 24, 48 e 72
horas de cultivo. Os resultados experimentais obtidos de atividade de xilanase com
48 horas de cultivo foram ajustados a uma função polinomial de segunda ordem e o
teste t-Student foi realizado para verificar a significância estatística dos coeficientes
de regressão a 90 % de confiança. A análise de variância (ANOVA) foi realizada
para avaliar a significância estatística do modelo matemático gerado e o coeficiente
de determinação (R2) foi calculado para verificar quanto da variabilidade das
respostas são previstas pelo modelo. A resposta do modelo foi expressa em termos
de variáveis codificadas, ignorando os termos estatisticamente não significativos. O
modelo matemático obtido foi posteriormente validado através do cultivo em triplicata
do micro-organismo utilizando o meio de cultura otimizado sob as condições ótimas
de agitação e temperatura previstas no modelo.
3.2.8. Influência da quantidade de inóculo e do pH inicial do meio de

cultura para fermentação de B. licheniformis CBMAI 1609 e
produção de xilanase
A influência da quantidade de inóculo e do pH inicial do meio de cultura
sobre a produção de xilanase foram avaliados de forma univariada. Para estudar a
influência da quantidade de inóculo frascos Erlenmeyer de 50 mL com 15 mL de
meio de cultura otimizado foram inoculados com, respectivamente, 1, 2, 3, 4 e 5 %
(v/v) de suspensão de células de B. licheniformis CBMAI 1609, preparada como
descrito anteriormente no item 3.2.2, e cultivados por 72 horas nas condições ótimas
de temperatura e agitação. A influência do pH inicial do meio de cultura foi estudada
ajustando o pH do meio de cultura otimizado com solução NaOH 2 M ou HCl 2 M
para os valores 5,0, 6,0, 7,0 e 8,0, respectivamente, antes de autoclavar. Os cultivos
também foram realizados por 72 horas utilizando-se a quantidade de inóculo e as
condições de temperatura e agitação ótimas. Todos estes experimentos foram
realizados em triplicata e os resultados obtidos foram submetidos à análise de
82
variância (ANOVA) sendo as médias comparadas pelo teste de Tukey ao nível de

significância de 5 % (p < 0,05) com o auxílio do programa Statistica versão 7.0
(Statsoft).
3.2.9. Estudo da cinética de fermentação de B. licheniformis CBMAI 1609

e de produção de xilanase
Para estudar a relação entre a produção de xilanase e o crescimento
microbiano foi realizado o cultivo do micro-organismo B. licheniformis CBMAI 1609
durante 96 horas em frascos Erlenmeyer de 50 mL contendo 15 mL de meio de
cultura otimizado nas condições ótimas de fermentação (temperatura, agitação,
inóculo e pH) determinadas neste trabalho. Em diferentes intervalos de tempo, o
conteúdo de 2 frascos Erlenmeyer foi utilizado para as determinações de atividade
enzimática de xilanase, teor de proteínas solúveis totais (realizado como descrito no
item 3.1.2.2), teor de açúcares redutores solúveis e crescimento microbiano. As
variações no pH do meio de cultura fermentado foram também mensuradas
utilizando potenciômetro Metrohm® 827 pH Lab (Metrohm), previamente calibrado.

CBMAI 1609 e produção de xilanase
Após a otimização do meio de cultura e das condições de fermentação
foram realizados ensaios de ampliação da escala de fermentação de B. licheniformis
CBMAI 1609 para produção de xilanase em frascos agitados de 250 mL com 50 mL
do meio de cultura otimizado, utilizando as mesmas condições ótimas de cultivo
definidas nos estudos realizados anteriormente, e em reator de bancada de 1,5 litros
(Bioflow 115, New Brunswick Scientific).
Nos ensaios de ampliação da escala de fermentação utilizando reator de
bancada, uma alíquota de 10 mL do inóculo (2 % v/v da suspensão de células
microbianas), preparado como descrito anteriormente, foi inoculada à cuba de
fermentação de 1,5 litros contendo 500 mL do meio de cultura otimizado estéril. A
temperatura durante a fermentação foi mantida em 37 ºC e o oxigênio dissolvido em
valores superiores a 30 % empregando controle automático de agitação e fluxo de
ar. A agitação e o fluxo de ar no início da fermentação foram mantidos em 250 rpm e
0,5 vvm (volume de ar/volume de meio de cultura/minuto) e aumentados
gradativamente a medida que o micro-organismo requeria oxigênio. O pH inicial do
83
meio de cultura foi ajustado para 7,0 antes de autoclavar e este não foi controlado
durante a fermentação. Foi realizada a adição de antiespumante (FluentCane 114,
Dow Chemical) ao meio de cultura à medida que houve a formação de espuma. A
atividade enzimática de xilanase foi acompanhada até 42 horas de fermentação,
sendo a análise realizada no sobrenadante do meio de cultura fermentado após
centrifugação a 10.000 x g por 10 minutos a 4 ºC. Este experimento foi realizado em
duplicata.
3.2.11. Avaliação da produção simultânea de diferentes hidrolases

glicosídicas durante a fermentação de B. licheniformis CBMAI 1609
e B. licheniformis ATCC 14580
Com o intuito de avaliar a capacidade de produção simultânea de
diferentes hidrolases glicosídicas e comparar os resultados de produção obtidos com
outra linhagem de B. licheniformis foram realizados cultivos em frascos Erlenmeyer
de 50 mL com 15 mL de meio de cultura otimizado e sob as condições ótimas de
fermentação (temperatura, agitação, inóculo e pH) utilizando as linhagens B.
licheniformis CBMAI 1609 e B. licheniformis ATCC 14580. Após 48 horas de cultivo o
meio de cultura fermentado foi centrifugado (10.000 x g, 4 ºC, 10 min) e o
sobrenadante de cultivo utilizado para as determinações do teor de proteínas
solúveis totais e das atividades enzimáticas em diferentes polissacarídeos como
descrito no item 3.2.3.1. Os experimentos foram realizados em triplicata.
3.3. Etapa experimental 3 – “Caracterização do sistema xilanolítico de B.

licheniformis CBMAI 1609 e isolamento de um complexo
multienzimático do tipo xilanossomo”
3.3.1. Produção das enzimas

A produção das enzimas pela linhagem B. licheniformis CBMAI 1609 foi
realizada através do cultivo de 2 % (v/v) da suspensão de células do micro-
organismo com densidade óptica igual a 1,0 a 600 nm, preparada como descrito
anteriormente item 3.2.2, em frascos Erlenmeyer de 50 mL contendo 15 mL do meio
de cultura otimizado (0,1 % de MgSO4, 0,1 % de KCl, 0,15 % de K2HPO4, 2,375 %
de caseína, 3 % de bagaço de laranja, 5,75 % de farelo de soja (m/v), pH 7,0). Após
60 horas de cultivo em agitador rotatório a 250 rpm e 37 ºC, o meio de cultura
84
fermentado foi centrifugado a 10.000 x g por 10 minutos a 4 ºC. O sobrenadante do

meio de cultura fermentado, denominado de extrato enzimático bruto, foi
armazenado a -20 ºC e utilizado como fonte de hidrolases glicosídicas nos
experimentos deste estudo.

licheniformis CBMAI 1609
3.3.2.1. Efeito do pH e da temperatura na atividade enzimática

O efeito do pH na atividade do sistema xilanolítico presente no extrato
enzimático bruto de B. licheniformis CBMAI 1609 foi estudado nas condições
padrões de ensaio para determinação da atividade enzimática de xilanase utilizando
o substrato xilana de madeira faia (item 3.1.2.1). A atividade enzimática foi avaliada
em valores de pH entre 2,6 e 10,0, usando tampões apropriados na concentração de
0,1 M (2,6 – 5,5, tampão citrato-fosfato; 6,0 – 8,0, tampão fosfato de sódio; 8,6 –
10,0, tampão glicina-NaOH). O efeito da temperatura na atividade enzimática do
sistema xilanolítico foi determinado utilizando-se o sistema de reação enzimática
descrito anteriormente com o tampão no pH ótimo de atividade e variando-se a
temperatura na faixa de 25 a 75 ºC. Todos os ensaios foram realizados em triplicata
utilizando de 0,3 a 0,4 μg de proteína nas reações enzimáticas.
3.3.2.2. Efeito do pH e da temperatura na estabilidade enzimática

O efeito do pH na estabilidade enzimática do sistema xilanolítico presente
no extrato enzimático bruto foi determinado usando os tampões descritos
anteriormente na faixa de pH de 2,6 a 10,0 e na concentração de 50 mM. O extrato
enzimático bruto foi pré-incubado nos diferentes valores de pH por 24 horas a 4°C
sem o substrato da reação enzimática. A atividade residual de xilanase das amostras
foi posteriormente mensurada nas condições ótimas de pH e temperatura. Os
resultados obtidos foram expressos na forma de atividade residual relativa,
considerando-se a atividade do extrato enzimático bruto sem tratamento e no pH
ótimo de atividade como 100 %.
O efeito da temperatura sobre a estabilidade do sistema xilanolítico foi
determinado através da pré-incubação do extrato enzimático bruto em tampão no pH
ótimo de atividade na faixa de temperatura entre 25 a 75°C por 120 minutos. Após o
85
tratamento térmico, as amostras foram imediatamente resfriadas em banho de gelo

por 5 minutos e, em seguida, foi determinada a atividade residual de xilanase das
amostras sob as condições ótimas de pH e temperatura. Os resultados obtidos
foram expressos na forma de atividade residual relativa, considerando-se a atividade
do extrato enzimático bruto sem tratamento térmico como 100 %.

enzimática
Os efeitos de diferentes íons metálicos (KCl, LiCl, NaCl, CaCl2, CoCl2,
NiCl2, MgCl2, MnCl2, FeCl3, CuSO4, ZnSO4) e de compostos quelantes (EDTA e
EGTA) na atividade enzimática do sistema xilanolítico de B. licheniformis CBMAI
1609 foram investigados através da pré-incubação do extrato enzimático bruto em
tampão 0,1 M no pH ótimo de atividade na presença destes compostos, nas
concentrações finais de 5 e 10 mM, por 60 minutos a 4 ºC. A atividade enzimática de
xilanase foi posteriormente determinada nas condições ótimas de reação. As
atividades relativas foram calculadas considerando-se que o sistema reacional sem
adição de nenhum composto apresentava a atividade enzimática de 100 %.
3.3.3. Purificação das hidrolases glicosídicas produzidas por B.

Com o intuito de caracterizar individualmente as hidrolases glicosídicas
presentes no extrato enzimático bruto do micro-organismo para posterior utilização
de forma eficiente em processos de hidrólise de biomassa lignocelulósica foram
iniciados os estudos para purificação cromatográfica das enzimas, como descrito a
seguir. Todos os passos cromatográficos foram realizados a temperatura ambiente
utilizando o equipamento ÄKTA purifier (GE Healthcare).
3.3.3.1. Purificação das hidrolases glicosídicas de B. licheniformis

CBMAI 1609 utilizando coluna cromatográfica de troca
aniônica DEAE Sepharose Fast Flow
Uma das estratégias avaliadas para purificação cromatográfica das
hidrolases glicosídicas produzidas por B. licheniformis CBMAI 1609 consistiu na
aplicação de 200 μL do extrato enzimático bruto, a um fluxo de injeção de 0,5
mL/min, na coluna de troca aniônica DEAE Sepharose Fast Flow do kit Hitrap IEX
86
Selection (GE Healthcare) previamente equilibrada com 10 vezes o volume da

coluna de tampão Tris-HCl 50 mM, pH 8,0. Após a aplicação da amostra, a coluna
foi lavada com 5 vezes o volume da coluna do mesmo tampão utilizado
anteriormente com fluxo de corrida de 1 mL/min. As proteínas adsorvidas foram
eluídas através de gradiente salino no tampão (0 a 1 M de NaCl) com 20 vezes o
volume da coluna. O curso de eluição das proteínas foi acompanhado pela medida
da absorbância a 280 nm (representada pela unidade mAU – miliunidades de
absorbância) e as frações coletadas nos picos de eluição das proteínas foram
analisadas quanto à atividade enzimática em diferentes substratos polissacarídicos.
As frações apresentando as atividades enzimáticas avaliadas foram reunidas,
dialisadas e concentradas por ultrafiltração em concentradores do tipo VivaSpin (GE
Healthcare) com membrana de retenção de 10 kDa a 4 ºC, conforme as instruções
do fabricante. Posteriormente, estas amostras foram avaliadas quanto ao teor de
proteínas solúveis totais (item 3.1.2.2) e também submetidas a análises
eletroforéticas por SDS-PAGE.
3.3.3.2. Purificação das hidrolases glicosídicas de B. licheniformis

CBMAI 1609 utilizando coluna cromatográfica de exclusão
molecular Superdex 200 10/300 GL
Outra estratégia utilizada para a purificação cromatográfica das hidrolases
glicosídicas produzidas pela linhagem B. licheniformis CBMAI 1609 consistiu na
aplicação direta de alíquotas de 500 μL do extrato enzimático bruto na coluna de
exclusão molecular Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare), previamente
equilibrada com tampão fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4, contendo 50 mM de NaCl.
As proteínas foram eluídas a um fluxo de corrida de 0,5 mL/min em 1,5 vezes o
volume da coluna utilizando o mesmo tampão. O curso de eluição das proteínas foi
acompanhado pela medida da absorbância a 280 nm e as frações coletadas nos
picos de eluição das proteínas foram analisadas quanto à atividade enzimática em
diferentes substratos polissacarídicos. As frações apresentando atividade enzimática
foram reunidas, concentradas por ultrafiltração em concentrador do tipo VivaSpin
(GE Healthcare) com membrana de retenção de 10 kDa. Estas amostras foram
avaliadas quanto ao teor de proteínas solúveis totais e também utilizadas em
análises eletroforéticas por SDS-PAGE.
87
3.3.4. Isolamento do complexo multienzimático produzido pela linhagem

B. licheniformis CBMAI 1609
A partir dos resultados obtidos nos testes de purificação das hidrolases
glicosídicas de B. licheniformis CBMAI 1609 foi investigada a possível presença de
um complexo multienzimático no extrato enzimático bruto. Os procedimentos
adotados para a purificação deste complexo multienzimático foram baseados nos
protocolos propostos por Van Dyk (2009). Estes envolveram a concentração do
extrato enzimático bruto (sobrenadante de cultivo) e posteriores etapas de
purificação em colunas cromatográficas de troca iônica e de exclusão molecular,
como descrito a seguir. Todos os passos foram realizados a temperatura ambiente,
exceto a etapa de concentração do extrato enzimático bruto, que foi realizada a 4 ºC.
3.3.4.1. Concentração do extrato enzimático bruto de B. licheniformis

CBMAI 1609
Visando a escolha do método mais adequado para a concentração do
extrato enzimático bruto de B. licheniformis CBMAI 1609, foram realizados testes de
concentração por ultrafiltração e por precipitação fracionada com sulfato de amônio
nas concentrações de 40, 60 e 80 % de saturação.
Na concentração do extrato enzimático bruto por ultrafiltração, uma
alíquota de 150 mL da amostra foi concentrada durante aproximadamente 20 horas
utilizando o sistema AMICON 8200 (Millipore) com membrana de retenção de 10
kDa, de acordo com as recomendações do fabricante. A atividade enzimática de
xilanase e a concentração de proteínas solúveis totais foram determinadas no final
do processo nas frações concentrada e filtrada, como descrito anteriormente.
Para a concentração por precipitação fracionada com sulfato de amônio,
uma alíquota de 250 mL do extrato enzimático bruto foi inicialmente saturada com
40 % de sulfato de amônio e após 4 horas de incubação a 4 ºC com leve agitação,
esta foi centrifugada a 10.000 x g por 15 minutos a 4 ºC. O sobrenadante obtido da
centrifugação foi saturado até 60 % com sulfato de amônio e o mesmo processo de
incubação e centrifugação foi repetido, como descrito acima. Ao sobrenadante
obtido dessa centrifugação, foi adicionado sulfato de amônio até 80 % de saturação
e após 16 horas de incubação a 4 ºC, este foi submetido à centrifugação nas
mesmas condições anteriores. As amostras precipitadas obtidas ao final de cada
centrifugação foram recolhidas, ressuspendidas em volume mínimo de tampão
88
fosfato de sódio de sódio 100 mM, pH 6,0, e dialisadas contra água destilada,
utilizando membranas de celulose regenerada com corte de 3.500 Da (Membra-Cel
SERVA Electrophoresis), durante 24 horas a 4 ºC para a remoção do sal. Ao término
do processo de diálise, as amostras foram congeladas e concentradas em liofilizador
(Liotop, L101) durante 36 horas. As amostras liofilizadas de cada etapa do processo
de precipitação fracionada, denominadas de preparações enzimáticas concentradas,
foram ressuspendidas em tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 6,0, na concentração
de 10 mg/mL e utilizadas para determinação da atividade enzimática de xilanase e
do teor de proteínas solúveis totais.

licheniformis CBMAI 1609 utilizando colunas cromatográficas
de troca iônica
Foram realizados testes iniciais utilizando colunas de troca aniônica
(DEAE Sepharose Fast Flow e Q Sepharose Fast Flow) e de troca catiônica (CM
Sepharose Fast Flow) do kit Hitrap IEX Selection (GE Healthcare), com o objetivo de
selecionar a resina mais adequada para a separação cromatográfica do complexo
multienzimático das demais proteínas presentes na preparação enzimática
concentrada. Os procedimentos adotados durante estas corridas cromatográficas
foram os mesmos descritos anteriormente no item 3.3.3.1. As colunas utilizadas
foram previamente equilibradas com 10 vezes o volume da coluna de tampão fosfato
de sódio 50 mM, pH 6,0, para a coluna catiônica ou com tampão Tris-HCl 50 mM, pH
8,0, para as colunas de troca aniônica. Em cada coluna foram aplicados 200 μL da
preparação enzimática concentrada por fracionamento com sulfato de amônio que
apresentou a maior atividade específica de xilanase ressuspendida na concentração
de 20 mg/mL. Durante as corridas cromatográficas, as colunas foram lavadas com 5
vezes o volume da coluna do mesmo tampão inicial e em seguida foi realizado o
gradiente salino no tampão (0 a 1 M de NaCl) utilizando 20 vezes o volume da
coluna. As frações coletadas nos picos de eluição das proteínas nas diferentes
colunas foram analisadas quanto à atividade enzimática em diferentes substratos
polissacarídicos. As frações apresentando as atividades enzimáticas avaliadas foram
reunidas, dialisadas e concentradas por ultrafiltração em concentradores do tipo
VivaSpin (GE Healthcare) com membrana de retenção de 10 kDa. Posteriormente,
89
estas amostras foram avaliadas quanto ao teor de proteínas solúveis totais e

submetidas a análises eletroforéticas por Native-PAGE.
3.3.4.3. Purificação do complexo multienzimático de B. licheniformis

molecular
Após a etapa de purificação na coluna de troca iônica que proporcionou a
melhor separação do complexo multienzimático, foi realizada uma etapa
cromatográfica em coluna de exclusão molecular para separação de possíveis
proteínas contaminantes ainda presentes na amostra. Nesta etapa cromatográfica foi
utilizada a amostra do pico de eluição de proteínas obtido na purificação em coluna
de troca iônica que apresentou alta massa molecular na eletroforese em gel nativo,
além de atividade enzimática de xilanase e de outras hidrolases glicosídicas e um
bom rendimento.
Alíquotas de 500 μL da amostra proveniente da purificação em coluna de
troca iônica foram aplicadas na coluna de exclusão molecular Superdex 200 10/300
GL (GE Healthcare), previamente equilibrada com tampão Tris-HCl 50 mM, pH 8,0.
As corridas cromatográficas foram realizadas nas mesmas condições descritas no
item 3.3.3.2. As frações coletadas nos picos de eluição das proteínas que
apresentavam atividade enzimática em diferentes substratos polissacarídicos foram
reunidas e concentradas por ultrafiltração em concentrador do tipo VivaSpin (GE
Healthcare) com membrana de retenção de 30 kDa. Estas amostras foram
posteriormente avaliadas quanto ao teor de proteínas solúveis totais e utilizadas em
análises eletroforéticas por SDS-PAGE e Native-PAGE.
3.4.5. Análises eletroforéticas
3.4.5.1. SDS-PAGE e Native-PAGE

Com o objetivo de se avaliar o grau de pureza das amostras concentradas
dos picos de eluição das proteínas durante os passos cromatográficos e também
para estimar a massa molecular das proteínas presentes nas amostras, foram
realizadas eletroforeses em gel de poliacrilamida sob condições não desnaturantes
(Native-PAGE ou gel nativo) e também em condições desnaturantes (SDS-PAGE).
90
As análises eletroforéticas por SDS-PAGE foram realizadas como

proposto por Laemmli (1970) utilizando géis de 12 % (m/v) de poliacrilamida para a
separação das proteínas. As amostras dos picos de proteínas foram diluídas no
tampão de amostra (tampão Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8, contendo glicerol, SDS,
β-mercaptoetanol e azul de bromofenol) e incubadas por 5 minutos a 99 ºC antes de
serem aplicadas nos géis. Foram aplicados aproximadamente 2 μg de proteína por
canaleta do gel. Também foi aplicado em uma das canaletas do gel 2,5 μL do
padrão de massa molecular de proteínas PageRuler Unstained Protein Ladder
(Thermo Scientific). A corrida para separação das proteínas foi realizada a 110 V por
aproximadamente 90 minutos. Os géis foram corados com nitrato de prata, como
proposto por Schägger (2006) e adaptado por The Rockefeller University (2014), e
posteriormente fotodocumentados.
As eletroforeses em gel nativo foram realizadas de acordo com Walker,
2002, utilizando géis de 7,5 % (m/v) de poliacrilamida para a separação das
proteínas. Ao contrário da eletroforese SDS-PAGE, não foi adicionado SDS no
preparo dos géis e dos tampões de corrida e de amostra. As amostras concentradas
dos picos de eluição de proteínas foram diluídas no tampão de amostra, sem a
adição de β-mercaptoetanol, e não foram submetidas a tratamento térmico antes da
aplicação nos géis. Foram aplicados aproximadamente 2 μg de proteína por
canaleta do gel nativo. A corrida para a separação das proteínas foi realizada a 100
V por aproximadamente 120 minutos dentro de câmara fria a 4 ºC para evitar a
desnaturação das proteínas. Após a corrida, os géis foram corados com nitrato de
prata e fotodocumentados.
3.4.5.2. Zimogramas
Visando identificar as bandas de proteínas separadas nos géis SDS-
PAGE do complexo multienzimático purificado que apresentavam atividade
enzimática para celulase, pectinase e xilanase, foram realizadas análises de
zimografia, como proposto por Van Dyk et al. (2009). Os géis de zimograma foram
preparados através da incorporação de 0,1 % (m/v) dos substratos CMC, pectina de
frutas cítricas ou xilana de madeira faia aos géis de separação de 12 % (m/v) de
poliacrilamida contendo SDS antes da sua polimerização. Foram aplicados em cada
canaleta do gel 2 μg de proteínas previamente diluídas em tampão de amostra
contendo SDS e β-mercaptoetanol e aquecidas por 5 minutos a 99 ºC. A corrida para
91
separação das proteínas foi realizada a 110 V por aproximadamente 90 minutos. Os

géis foram incubados com leve agitação por 1 hora em tampão fosfato de sódio 50
mM, pH 6,0, adicionado de 2 % (v/v) de Triton X-100, para a remoção do SDS e
renaturação das proteínas. Em seguida, estes foram submetidos a duas lavagens de
30 minutos cada em tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 6,0, visando a remoção de
resíduos dos detergentes. Os géis foram posteriormente incubados no mesmo
tampão anterior por 18 horas 37 ºC para a hidrólise dos substratos pelas enzimas.
Para a detecção das atividades enzimáticas, os géis foram corados com solução do
corante vermelho Congo (5 mg/mL) por 30 minutos e descorados com solução de
NaCl 1M nas mesmas condições. Os géis descorados foram lavados com solução
de ácido acético 0,1M, para melhorar a visualização das bandas e, posteriormente,
fotodocumentados. A atividade enzimática das bandas foi detectada como áreas
claras nos géis.
3.4. Etapa experimental 4 – “Expressão, purificação e caracterização de

enzimas lignocelulolíticas obtidas a partir de genes isolados da
linhagem B. licheniformis CBMAI 1609”

Duas estratégias foram utilizadas neste estudo para a prospecção de
genes de enzimas envolvidas na degradação de materiais lignocelulósicos a partir
do DNA genômico da linhagem B. licheniformis CBMAI 1609. Uma das estratégias
consistiu na construção de uma biblioteca genômica e triagem funcional dos clones
obtidos enquanto a outra estratégia foi baseada na prospecção in silico de genes
homólogos da linhagem B. licheniformis ATCC 14580 depositados em bancos de
dados.
3.4.1.1. Prospecção de genes de enzimas lignocelulolíticas da linhagem

B. licheniformis CBMAI 1609 através de uma biblioteca
genômica
Os procedimentos adotados para a construção da biblioteca genômica de
B. licheniformis CBMAI 1609 e a triagem funcional dos clones foram baseados no
trabalho realizado por Alvarez (2013).
92
3.4.1.1.1. Obtenção do DNA genômico

O DNA genômico da linhagem B. licheniformis CBMAI 1609 foi extraído a
partir de células do micro-organismo cultivadas por 18 horas em meio de cultura LB
líquido a 37 ºC e 250 rpm de agitação utilizando o kit FastDNA® SPIN for soil (MP
Biomedicals), conforme as instruções do fabricante. Em seguida, este foi
quantificado por espectrofotometria (Nanodrop 2000c – Thermo Scientific) a 260 nm
e analisado por eletroforese em gel de agarose 1 % (m/v) em tampão TAE 1X a 90 V
por 1 hora. Os géis de agarose foram corados em solução de brometo de etídio
(0,25 µg/mL) por 20 minutos e visualizados sob iluminação ultravioleta em
fotodocumentador Gel Logic 6000Pro (Carestream).
3.4.1.1.2. Digestão do DNA genômico

Após a extração, o DNA genômico foi parcialmente digerido com a enzima
de restrição Sau3AI, pelo fato desta clivar a sequência nucleotídica GATC, em média
a cada 256 pares de base. Inicialmente, foi realizada uma avaliação do tempo de
reação necessário para a obtenção de fragmentos de DNA com tamanho entre 1 a 4
kb, que correspondem a faixa de tamanho média dos genes que codificam as
hidrolases glicosídicas. As reações de digestão contendo 10 μL de DNA genômico
na concentração de 250 ng/μL, 5 μL do tampão NEBuffer 1 10X (New England
Biolabs), 0,1 U da enzima Sau3AI (New England Biolabs), 0,5 μL de BSA 100X (New
England Biolabs) e água milli-Q estéril até completar o volume final de 50 µL da
reação, foram incubadas a 37 ºC por até 120 minutos. Alíquotas de 10 μL foram
retiradas com 30, 60, 90 e 120 minutos de reação e submetidas à inativação térmica
por incubação a 65 ºC por 20 minutos. Os produtos da digestão foram separados por
eletroforese em gel de agarose 1 % (m/v) em tampão TAE 1X, a 90 V por 1 hora,
corados em solução de brometo de etídio e visualizados em fotodocumentador sob
luz UV. Após a determinação do tempo de reação ideal para a obtenção de
fragmentos de DNA na faixa de tamanho de interesse, uma nova reação de digestão
foi preparada utilizando o dobro dos componentes e adotando-se os mesmos
procedimentos descritos acima. Os fragmentos de DNA digerido de interesse foram
posteriormente excisados do gel de agarose, purificados utilizando o kit IllustraTM
GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification (GE Healthcare), de acordo com as
especificações do fabricante, e quantificados por espectrofotometria a 260 nm.
93
3.4.1.1.3. Ligação dos insertos de DNA genômico digerido ao vetor

pUC19
Os fragmentos do DNA genômico digerido e purificado foram
posteriormente ligados ao vetor pUC19 (Thermo Scientific), adquirido já na forma
linearizada com extremidades compatíveis para a ligação e desfosforilado, por ação
das enzimas BamHI e fosfatase alcalina. A reação de ligação dos insertos de DNA
genômico digerido ao vetor pUC19 foi preparada considerando a razão de
inserto:vetor de 3:1. A mistura de reação continha 1 µL do vetor pUC19
(concentração de 100 ng/μL), 10 µL do inserto de DNA genômico digerido
(concentração de 45 ng/µL), 1,5 µL do tampão DNA ligase 10X (New England
Biolabs), 1 µL da enzima T4 DNA ligase (New England Biolabs) e água milli-Q estéril
até completar o volume final de 15 µL. A reação de ligação foi incubada por 20 horas
a 8 ºC antes da sua utilização para transformação bacteriana.
3.4.1.1.4. Transformação bacteriana por eletroporação

O produto da reação de ligação ao vetor pUC19 foi utilizado para a
transformação de células eletrocompetentes da linhagem Escherichia coli SURE
(Agilent Technologies – Strategene Products) por eletroporação. Na transformação
bacteriana, 50 µL de células eletrocompetentes e 1 µL do produto da reação de
ligação foram transferidos para uma cubeta de eletroporação de 0,2 cm (BioRad)
previamente resfriada a -20 ºC e, posteriormente, submetidos a um choque elétrico
de 2,5 kV em eletroporador Eppendorf Multiporator (Eppendorf) durante
aproximadamente 5 milissegundos. Em seguida, as células foram ressuspendidas
em 1 mL de meio de cultura SOC (2 % de triptona, 0,5 % de extrato de levedura,
0,06 % de NaCl, 0,02 % de KCl, 0,19 % de MgCl2 e 0,36 % de glicose (m/v)),
transferidas para um microtubo de 2 mL estéril e incubadas a 37 ºC e 250 rpm por
90 minutos para recuperação das células. Após a incubação, as células microbianas
transformadas foram plaqueadas em placas de Petri contendo meio de cultura LB
sólido adicionado de 100 µg/mL de ampicilina, 0,5 mM de IPTG (isopropil-β-D-1-
tiogalactopiranosideo) e 80 µg/mL de X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-
galactosideo) e incubadas por 16 - 18 horas a 37 ºC.
94
3.4.1.1.5. Confirmação da transformação bacteriana e estocagem dos

clones positivos
Após o crescimento das colônias foi verificada a presença de colônias
azuis e brancas nas placas. Esta diferença na coloração das colônias deve-se ao
fato da inserção do fragmento de DNA ocorrer na região do gene lacZ do vetor
pUC19, que é responsável pela síntese da enzima β-galactosidase que hidrolisa o
substrato X-Gal, originando um produto de coloração azul. Desta forma, as colônias
brancas correspondiam aos clones que possuíam o inserto de DNA e apresentavam
o gene da β-galactosidase não funcional enquanto as colônias azuis correspondiam
aos clones sem o inserto de DNA.
Algumas colônias brancas foram coletadas aleatoriamente, inoculadas em
tubos tipo Falcon de 15 mL contendo 5 mL do meio de cultura LB líquido com 100
µg/mL de ampicilina e incubadas por 18 horas a 37 ºC e 250 rpm. As culturas
microbianas foram centrifugadas a 7.000 x g por 10 minutos a 4 ºC e os precipitados
de células tiveram o DNA plasmidial extraído utilizando o kit Wizard Plus SV
Minipreps DNA Purification System (Promega), conforme as instruções do fabricante.
Com o objetivo de confirmar a transformação e analisar o tamanho médio
dos insertos clonados, os plasmídeos extraídos foram submetidos à reação de dupla
digestão com as enzimas de restrição EcoRI e HindIII por 2 horas a 37 ºC. As
reações de digestão continham 2 μL do tampão NEBuffer 2 10X (New English
Biolabs), 0,2 μL de BSA 100X (New England Biolabs), 4 μL do DNA plasmidial na
concentração de aproximadamente 100 ng/μL, 0,5 μL da enzima EcoRI (New
England Biolabs), 0,5 μL da enzima HindIII (New England Biolabs) e água Milli-Q
estéril completando o volume final de 20 μL da reação. Os produtos das digestões
foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,2 % (m/v) e visualizados em
fotodocumentador após coloração com solução de brometo de etídio.
Depois da confirmação da clonagem, foi realizada a coleta e estocagem
dos clones. Para reduzir o tempo de seleção desta etapa, as colônias brancas foram
repicadas e inoculadas em placas de 384 poços contendo 50 μL do meio de cultura
LB líquido com 100 µg/mL de ampicilina com o auxílio do sistema automatizado e
robotizado Genetix QPix-2 Colony Picker and Imager (Genetix Corporation). As
placas foram incubadas a 37 ºC por 18 horas e, posteriormente, com o auxílio do
pipetador automático epMotion 5075 TMX Systems (Eppendorf) foi adicionado em
cada um dos poços da placa o mesmo volume de meio de cultura LB líquido
95
contendo ampicilina e 40 % (v/v) de glicerol estéril. Em seguida, essas placas com o

estoque dos clones foram armazenadas a -80 ºC até a sua utilização.
3.4.1.1.6. Triagem funcional da biblioteca genômica

Para a triagem funcional da biblioteca genômica, os clones estocados nas
placas de 384 poços foram repicados com o auxílio do robô QPIX-2 em placas do
tipo QTray (24,5 cm x 24,5 cm) contendo o meio de cultura LB sólido com 100 µg/mL
de ampicilina e 100 mM de IPTG. Após incubação em estufa por 16 - 18 horas a
37 ºC, as placas contendo os clones foram recobertas com o meio de cultura Top
ágar (0,5 % do substrato de interesse (CMC, pectina ou xilana), 0,1 % de NaCl e 1,5
% de ágar (m/v) dissolvidos em solução acetato de sódio 100 mM, pH 6,0) e
incubadas a 50 ºC por 8 horas. Em seguida, as placas foram coradas com solução
do corante vermelho Congo por 30 minutos e descoradas com NaCl 1 M. Os clones
positivos foram visualizados pela formação de halos de degradação do substrato ao
redor das colônias. Estes clones foram coletados das placas, inoculados em tubos
do tipo Falcon de 15 mL com 5 mL de meio líquido LB com 100 µg/mL de ampicilina
e cultivados por 18 horas a 37 ºC e 250 rpm. As culturas crescidas foram
centrifugadas a 7.000 x g por 15 minutos a 4 ºC, sendo a massa celular precipitada
utilizada para extração do DNA plasmidial utilizando kit comercial e o sobrenadante
do meio de cultura utilizado para confirmação da atividade enzimática com o
substrato usado na triagem dos clones.
5.3.1.1.7. Confirmação dos insertos de DNA nos clones positivos da

biblioteca genômica
Para a identificação do tamanho dos insertos de DNA nos clones positivos
foi realizada uma reação de dupla digestão com as enzimas de restrição EcoRI e
HindIII, como descrito no item 3.4.1.1.5, utilizando o DNA plasmidial extraído destes
clones. Os insertos de DNA dos clones positivos também foram sequenciados
utilizando os oligonucleotídeos iniciadores M13F (5’ GTAAAACGACGGCCAGT 3’) e
M13R (5’ GCGGATAACAATTTCACACAGG 3’), pois estes apresentam sequências
complementares que flanqueiam o sítio de múltipla clonagem do vetor pUC19. As
reações de sequenciamento foram preparadas com o reagente BigDye Terminator
Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) segundo as instruções do fabricante e,
posteriormente, foram sequenciadas no sequenciador automático DNA ABI PRISM
96
3500xL Genetic Analyser (Applied Biosystems) do Laboratório Nacional de Ciência e

Tecnologia do Bioetanol (CTBE/CNPEM). Os dados gerados pelo sequenciamento
foram analisados com auxílio do programa Geneious versão 6.1.5 (Biomatters) e as
sequências de nucleotídeos obtidas foram avaliadas quanto à presença de possíveis
fases abertas de leitura (OFRs) com o auxílio da ferramenta ORF Finder (disponível
em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi). Posteriormente, as sequências de
nucleotídeos e aminoácidos destas ORFs foram comparadas com sequências
depositadas nos bancos de dados do NCBI através das ferramentas Blastn e Blastp
(disponível em: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). As sequências de
aminoácidos também foram analisadas através da ferramenta Conserved Domains
(disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) para
identificação de possíveis domínios catalíticos conservados. As sequências de
nucleotídeos das ORFs identificadas como codificantes de enzimas lignocelulolíticas
serviram de referência para o desenho dos oligonucleotídeos iniciadores, que foram
utilizados nas amplificações dos genes de interesse por meio de reação de PCR.
3.4.1.2. Prospecção in silico de genes homólogos de enzimas

lignocelulolíticas da linhagem de B. licheniformis ATCC 14580
Na estratégia de prospecção in silico de genes homólogos, as sequências
nucleotídicas de alguns genes que codificam enzimas lignocelulolíticas na linhagem
B. licheniformis ATCC 14580, depositadas nos bancos de dados KEGG (Kyoto
Encyclopedia of Genes and Genomes) e GenBank do NCBI, serviram de base para
o desenho e síntese de oligonucleotídeos iniciadores que foram, posteriormente,
utilizados em reações de PCR tendo como molde o DNA genômico da linhagem B.
CBMAI 1609.
Foram escolhidos para serem avaliados através desta estratégia os genes
depositados como responsáveis pela codificação das enzimas arabinanase – BlAra
(Bl02653; WP011197792.1), α-L-arabinofuranosidase – BlAbf (Bl00345;
WP003184245.1), endoglucanase – BlCel (Bli01882; WP011197981.1), lacase –
BlLac (Bl01190; WP011197606.1) e ramnogalacturonase – BlRhg (Bli01379;
WP009328709.1). Os códigos para o acesso das sequências nucleotídicas destes
genes nos bancos de dados KEGG e GenBank estão apresentados entre
parênteses.
97
Inicialmente, as sequências de nucleotídeos depositadas nos bancos de

dados para estes 5 genes da linhagem B. licheniformis ATCC 14580 foram avaliadas
quanto à presença de sítios de atuação de enzimas de restrição através da análise
da região codificante de cada gene na plataforma NEBcutter versão 2.0 (disponível
em: http://nc2.neb.com/NEBcutter2/). Essas sequências nucleotídicas foram
traduzidas em sequências de aminoácidos com o auxílio da ferramenta Expasy
Translate Tool (disponível em: http://web.expasy.org/translate/) e, em seguida, foram
analisadas quanto à presença de peptídeos sinais através da ferramenta SignalP
versão 4.1 (disponível em: http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) e possíveis
domínios funcionais conservados através da ferramenta Conserved Domains.
Os oligonucleotídeos iniciadores utilizados nas duas estratégias de
prospecção de genes deste trabalho estão apresentados na Tabela 4 e foram
desenhados para conter a região complementar à sequência alvo do gene de
interesse sem peptídeo sinal, sítios de restrição para a posterior clonagem dos
produtos de PCR em vetor de expressão pET-28a(+) e pelo menos 2 nucleotídeos
anteriores a estes sítios para a ancoragem das enzimas de restrição.
Tabela 4 – Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a amplificação dos genes de

enzimas lignocelulolíticas avaliados neste trabalho
Genes Oligonucleotídeo forward (5’ – 3’) * Oligonucleotídeo reverse (5’ – 3’) *
TATCATATGGCTTTTTGGGATACAAAA
BlAra TAGGATCCCTAATACTTCGGCCA
GG
TATAGCTAGCATGACTGTACACAAAG
BlAbf TATAGAATTCTCATTGTTTC
CGA’
TATAGCTAGCATGGGAACCGTTCTTT TATAGGATCCTCAAGGCGTGATTTTC
BlCel
TAT ACCT
TATATCATATGAAAAACGTGGTGGCT ATAGGATCCTCAATTTTTGAATGGTG
BlGal
GTT T
TATAGCTAGCATGAAACTTGAAAAATT
BlLac TATAGAATTCTTATTGATGAC
CG
TATCATATGGGGAGAAAAGGACAGAC ATAGGATCCTCATCATTTCTCTTACAA
BlRhg
ATGC GGAACGGTA
TATGCTAGCGCTTCGTCATCAAACCC ATAGGATCCTCAGCGGACCGTTACGT
BlXeg
GTCG CCCA
* As regiões sublinhadas nos oligonucleotídeos iniciadores correspondem aos sítios das enzimas de
restrição utilizadas. Os oligonucleotídeos iniciadores para os genes BlGal e BlXeg foram desenhados
a partir das sequências nucleotídicas obtidas nas ORFs dos insertos de DNA dos clones positivos na
biblioteca genômica de B. licheniformis CBMAI 1609
98
3.4.2. Amplificação dos genes das enzimas lignocelulolíticas avaliadas e

clonagem em vetor de alta cópia
Os genes prospectados neste estudo foram amplificados por meio de
reações de PCR utilizando o DNA genômico da linhagem B. licheniformis CBMAI
como molde para os oligonucleotídeos iniciadores descritos na Tabela 4. As reações
de PCR foram realizadas em termociclador Mastercycler pro S (Eppendorf) e
continham 2 μL de DNA genômico na concentração de 50 ng/μL, 0,3 μL de Taq DNA
Polimerase 5 U/μL (Thermo Scientific), 1 μL de dNTP mix 10 mM (Thermo Scientific),
1 μL de cada oligonucleotídeo iniciador na concentração de 10 pmol/μL, 5 μL do
tampão de PCR 10X (Thermo Scientific), 4 μL de MgCl2 25 mM (Thermo Scientific) e
água Milli-Q estéril completando o volume final de reação de 50 μL.
As amplificações para os genes BlAra, BlGal e BlRhg foram realizadas
usando um ciclo inicial de desnaturação a 94 ºC por 3 minutos, seguido de 30 ciclos
a 94 ºC por 40 segundos, 55 ºC (temperatura de anelamento) por 40 segundos, 72
ºC por 2 minutos e um ciclo de extensão final a 72 ºC por 10 minutos. Para o gene
BlXeg foi utilizado o mesmo programa, porém a temperatura de anelamento foi
alterada para 60 ºC.
No caso dos genes BlAbf, BlCel e BlLac a amplificação foi realizada
através da técnica de PCR touch up, com o intuito de diminuir a diferença da
temperatura de anelamento entre os pares de oligonucleotídeos iniciadores e
contribuir para a redução de amplificações não específicas. Basicamente esta
técnica consistiu em dividir a amplificação em duas etapas, sendo que na primeira
etapa foram realizados 10 ciclos da reação de PCR utilizando temperaturas de
anelamento inferiores às temperaturas de anelamento calculadas para os
oligonucleotídeos iniciadores e ao final de cada ciclo desta etapa a temperatura de
anelamento foi aumentada 1 ºC. Na segunda etapa foi realizado um programa de
amplificação por PCR comum, com 30 ciclos e temperatura de anelamento fixa em
um valor. Desta forma, a amplificação destes 3 genes foi realizada utilizando um
ciclo inicial de desnaturação a 94 ºC por 3 minutos, seguido de 10 ciclos a 94 ºC por
40 segundos, anelamento a 45 ºC por 40 segundos (aumentando 1 ºC por ciclo, até
55 ºC) e 72 ºC por 2 minutos. Posteriormente, foram realizados 30 ciclos a 94 ºC por
40 segundos, 50 ºC por 40 segundos, 72 ºC por 2 minutos e um ciclo de extensão
final a 72 ºC por 10 minutos.
99
Os produtos das reações de PCR foram separados por eletroforese em

gel de agarose 1 % (m/v) em tampão TAE 1X a 90V por 1 hora, sendo visualizados
em fotodocumentador após corar com solução de brometo de etídio. Os fragmentos
amplificados com o tamanho esperado dos genes avaliados foram excisados do gel,
submetidos à purificação com o kit Illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification
(GE Healthcare) e quantificados por espectrofotometria a 260 nm.
Em seguida, os fragmentos de DNA purificados foram clonados no vetor
de alta cópia pJET 1.2/blunt utilizando o kit CloneJET PCR Cloning (Thermo
Scientific) conforme as instruções do fabricante. O produto da reação de ligação de
cada gene ao vetor pJET foi utilizado para a transformação de células cálcio
competentes de Escherichia coli DH5α através do protocolo de choque térmico.
Aproximadamente 20 μL da reação de ligação foram adicionados a 50 μL das
células competentes e incubados durante 30 minutos em banho de gelo.
Posteriormente, foi realizado o choque térmico através da incubação desta mistura a
42 ºC por 90 segundos, seguido de resfriamento em banho de gelo por 2 minutos.
As células transformadas foram ressuspendidas em 1 mL de meio de cultura SOC e
incubadas a 37 ºC e 250 rpm por 1 hora. Após a recuperação das células, estas
foram plaqueadas em placas de Petri contendo o meio LB sólido adicionado de 100
µg/mL de ampicilina e incubadas por 16 - 18 horas a 37 ºC.
As clonagens foram confirmadas através da realização de PCR de
colônia, usando os mesmos oligonucleotídeos iniciadores usados na amplificação
dos genes ou os oligonucleotídeos iniciadores específicos que flanqueiam o sítio de
clonagem deste vetor (pJET 1.2F - 5’ CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC 3’ e pJET
1.2R - 5’ AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG 3’). Neste procedimento, foram
selecionadas pelo menos 5 colônias de cada gene que tiveram um pequeno
fragmento da colônia coletado, diluído em 10 μL de água Milli-Q estéril e aquecido
por 5 minutos a 95 ºC para a lise das células e liberação do DNA. As reações de
PCR de colônia foram realizadas como descrito acima, porém utilizando 1 μL da
solução da colônia lisada como DNA molde. As reações de amplificação foram
comprovadas por eletroforese em gel de agarose 1 % (m/v).
Posteriormente, o restante da colônia de um clone positivo de cada gene,
que teve a confirmação de que seu DNA plasmidial possuía o fragmento de
interesse, foi inoculado em tubo do tipo Falcon de 15 mL com 5 mL de meio de
cultura LB líquido com 100 µg/mL de ampicilina e incubado a 37 ºC e 250 rpm por
100
16-18 horas. As culturas crescidas foram centrifugadas a 7.000 x g por 15 minutos a

4 ºC e a massa celular precipitada foi utilizada para extração do DNA plasmidial. Os
plasmídeos extraídos desses clones positivos foram quantificados e utilizados para a
subclonagem no vetor de expressão pET-28a(+) (Novagen).
3.4.3. Subclonagem dos genes das enzimas lignocelulolíticas no vetor de

expressão pET-28a(+)
Os plasmídeos extraídos dos clones positivos da clonagem no vetor pJET
e o vetor pET-28a(+) foram inicialmente submetidos à uma reação de dupla digestão
com enzimas de restrição adequadas para os sítios de restrição inseridos nas
extremidades dos genes clonados visando a liberação dos insertos de DNA
clonados no vetor pJET e obtenção de extremidades compatíveis para a ligação.
As reações de dupla digestão foram realizadas como descrito
anteriormente no item 3.4.1.1.5, com algumas modificações. Cada reação de
digestão continha aproximadamente 1 μg do vetor ou plasmídeo e o tampão
adequado para ótima ação das duas enzimas. No caso dos genes BlAra, BlGal e
BlRhg foram utilizadas as enzimas de restrição NdeI e BamHI (Thermo Scientific)
com o tampão Fast Digest (Thermo Scientific), enquanto para os genes BlAbf e
BlLac foram utilizadas as enzimas de restrição NheI e EcoRI (Thermo Scientific) e o
tampão Tango 1X (Thermo Scientific). Para os genes BlCel e BlXeg as reações
foram preparadas utilizando as enzimas de restrição NheI e BamHI (Thermo
Scientific) com o tampão Tango 1X (Thermo Scientific). Após incubação a 37 ºC por
2 horas, as reações de digestão foram paralisadas por inativação térmica a 65 ºC
por 20 minutos. No caso das reações de digestão do vetor pET-28a(+), após a
inativação térmica foi realizada a desfoforilação do vetor através da adição na
mistura reacional de 1 μL de fosfatase alcalina CIP (Calf Intestinal Phosphatase –
New England Biolabs) seguido de incubação por 1 hora a 37 ºC.
Os produtos das digestões foram separados por eletroforese em gel de
agarose 0,8 % (m/v) a 90 V por 90 minutos, visualizados em fotodocumentador e
excisados do gel. No caso do vetor pET-28a(+), foi extraído do gel o fragmento
correspondente a sua forma linear. Os fragmentos recuperados do gel de agarose
foram purificados com o kit Illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification (GE
Healthcare), quantificados por espectrofotometria a 260 nm e utilizados na reação de
ligação dos fragmentos digeridos ao vetor pET-28a(+) digerido e desfosforilado.
101
As reações de ligação ao vetor pET-28a(+) foram preparadas como

descrito anteriormente no item 3.4.1.1.3 considerando a razão inserto:vetor de 3:1.
Estas reações foram incubadas durante 16 - 18 horas à temperatura ambiente e
depois utilizadas na transformação de células cálcio competentes de E. coli DH5α
por choque térmico. Após a recuperação das células transformadas, estas foram
plaqueadas em placas de Petri contendo o meio LB sólido com 50 μg/mL de
canamicina e incubadas por 16 - 18 horas a 37 ºC.
As clonagens dos genes no vetor de expressão pET-28a(+) foram
confirmadas por reação de PCR de colônia, como descrito no item 3.4.2, utilizando
os oligonucleotídeos iniciadores específicos de cada gene. Após a confirmação das
clonagens, colônias dos clones positivos de cada gene avaliado foram cultivadas em
meio LB líquido com 50 μg/mL de canamicina para posterior extração do DNA
plasmidial por miniprep. Os plasmídeos extraídos foram sequenciados utilizando os
oligonucleotídeos iniciadores que flanqueiam o sítio de múltipla clonagem deste
vetor (T7 promoter 5’ TAATACGACTCACTATAGGG 3’ e T7 terminator 5’
CTAGTTATTGCTCAGCGGTG 3’), visando avaliar se as sequências clonadas
estavam corretas em comparação as sequências originais e confirmar as
construções do vetor pET-28a(+) com os insertos dos genes de interesse. As
sequências de nucleotídeos obtidas nos sequenciamentos também foram traduzidas
em sequências de aminoácidos com o auxílio da ferramenta Expasy Translate Tool
e, posteriormente, analisadas através da ferramenta ProtParam (disponível em:
http://web.expasy.org/protparam/) para a determinação teórica de alguns parâmetros
das proteínas expressas, tais como massa molecular, ponto isoelétrico teórico,
coeficiente de extinção molar, tempo de meia-vida, índice de instabilidade e
hidrofobicidade.
3.4.4. Expressão das enzimas lignocelulolíticas recombinantes

Após a confirmação das clonagens das construções dos insertos dos
genes avaliados no vetor pET-28a(+) em E. coli DH5α, os plasmídeos extraídos dos
clones positivos foram utilizados para a transformação por choque térmico de
linhagens competentes de E. coli utilizadas para a expressão de proteínas
recombinantes. Neste trabalho foram usadas as linhagens E. coli BL21(DE3), E. coli
BL21(DE3)pRare2, E. coli Rosetta-gami 2(DE3) e E. coli Artic Express (DE3). Após a
recuperação das células transformadas, estas foram plaqueadas em placas de Petri
102
contendo o meio LB sólido com os antibióticos específicos para seleção de cada

linhagem (E. coli BL21(DE3): 50 μg/mL de canamicina; E. coli BL21(DE3)pRare2: 50
μg/mL de canamicina e 34 μg/mL de cloranfenicol; E. coli Rosetta-gami 2(DE3): 50
μg/mL de canamicina, 34 μg/mL de cloranfenicol, 12,5 μg/mL de tetraciclina e 50
μg/mL de estreptomicina; E. coli Artic Express (DE3): 50 μg/mL de canamicina e 12
μg/mL de gentamicina) e incubadas a 37 ºC por 16 - 18 horas. Em seguida, foram
realizados testes de expressão para cada uma das enzimas estudadas, com o
objetivo de avaliar o nível de expressão e a solubilidade destas em diferentes
condições.
Os testes de expressão foram realizados inoculando-se colônias
resultantes das transformações em tubos Falcon de 50 mL contendo 10 mL de meio
LB líquido com os antibióticos específicos para cada linhagem de E. coli utilizada,
por 16-18 horas a 250 rpm e 37 ºC. No caso das linhagens de E. coli BL21(DE3),
BL21(DE3)pRare2 e Rosetta-gami 2(DE3), 1 % (v/v) destas culturas foi utilizado
como inóculo para os cultivos realizados em frascos Erlenmeyer de 250 mL
contendo 50 mL de meio LB líquido com 50 μg/mL de canamicina. Estes cultivos
foram incubados a 37 ºC, 250 rpm até atingir a densidade óptica (DO) a 600 nm de
0,6 e, posteriormente, aclimatados por cerca de 15 a 30 minutos nas condições de
cultivo utilizadas para a expressão destas linhagens (E. coli BL21(DE3): 37 ºC, 200
rpm; E. coli BL21(DE3)pRare2: 30 ºC, 200 rpm; E. coli Rosetta-gami 2(DE3): 37 ºC,
200 rpm). A indução da expressão das enzimas estudadas foi realizada pela adição
de IPTG na concentração final de 0,5 mM às culturas microbianas. A expressão das
enzimas utilizando estas 3 linhagens de E. coli foi avaliada ao longo de 4 horas de
indução.
No caso da linhagem E. coli Artic Express (DE3), os testes de expressão
foram realizados inoculando-se 1,5 % (v/v) do inóculo, preparado como descrito
acima, em frascos Erlenmeyer de 250 mL contendo 50 mL de meio LB líquido. Após
as 3 horas de cultivo a 30 ºC e 200 rpm, as culturas foram aclimatadas por 30
minutos a 12 ºC e 200 rpm e, em seguida, foi realizada a indução com IPTG na
concentração final de 1 mM. Estas culturas foram incubadas durante 20 horas nas
condições utilizadas durante a aclimatação para a expressão das enzimas.
Nos testes de expressão da enzima lacase (BlLac), foram avaliadas
apenas as linhagens de E. coli BL21(DE3), BL21(DE3)pRare2 e Rosetta-gami
2(DE3). Neste caso, quando as culturas atingiram a DO de 0,6 a 600 nm, estas
103
foram aclimatadas a 18 ºC e 180 rpm por 30 minutos e, em seguida, foi adicionado

IPTG e CuCl2 nas concentrações finais de 0,5 e 0,25 mM, respectivamente. As
culturas foram mantidas por 4 horas nas condições de aclimatação e depois por 20
horas a 18 ºC sob condições microaeróbias (sem agitação), como proposto por
Mohammadian et al. (2010).
Ao final do tempo de cultivo para expressão das enzimas avaliadas, as
culturas microbianas foram centrifugadas a 8.000 x g por 30 minutos a 4 ºC. A
massa de células precipitadas foi ressuspendida em tampão fosfato de sódio 20 mM,
pH 7,4, contendo 300 mM de NaCl, 5 mM de imidazol, na proporção de 5 mL de
tampão para cada 1 g de células. A esta suspensão de células microbianas foram
adicionados, na concentração final, 0,5 mg/mL de lisozima, 2 mM de benzamidina e
1 mM de PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonila) e, em seguida, esta mistura foi
incubada a temperatura ambiente sob leve agitação por 30 minutos para a lise
celular. As células microbianas também foram submetidas ao rompimento por
método físico usando sonicador (Sonics Vibracell) com amplitude de 30 % durante
10 segundos e intervalos de descanso de 40 segundos por 7 vezes. Em seguida, foi
realizada uma nova centrifugação a 8.000 x g por 30 minutos a 4 ºC para a
separação das células lisadas e do sobrenadante contendo as proteínas solúveis.
A expressão das enzimas foi analisada pela determinação da atividade
enzimática no sobrenadante das células lisadas utilizando os substratos específicos
para cada enzima e também por eletroforese SDS-PAGE em géis de separação de
12 % (m/v) de poliacrilamida, como proposto por Laemmli, 1970. Nos géis de SDS-
PAGE foram aplicadas as amostras das etapas do processo de expressão de cada
enzima nas diferentes linhagens de E. coli (precipitado de células com 0 h de
indução, precipitado de células ao final da indução, precipitado de células ao final da
indução lisadas e o sobrenadante da lise). A quantidade de amostra aplicada nos
géis para os precipitados de células foi normalizada pela DO das culturas, para que
a quantidade de proteínas presentes em cada hora de indução correspondesse a
uma mesma quantidade de células. A corrida eletroforética para separação das
proteínas foi realizada a 110 V por aproximadamente 90 minutos. Os géis foram
posteriormente corados com solução de Coomassie Brilhant Blue (PhastGel Blue
R350 – GE Healthcare) e descorados com solução de 10 % de ácido acético e 40 %
de etanol (v/v).
104
3.4.5. Purificação das enzimas lignocelulolíticas recombinantes

Após a escolha da melhor linhagem de E. coli para expressão de cada
uma das enzimas lignocelulolíticas avaliadas, foi realizada a expressão proteica em
frascos Erlenmeyer de 2 L contendo 500 mL de meio LB líquido, seguindo os
mesmos procedimentos e condições de cultivo utilizadas nos testes de expressão.
Ao final do período de cultivo para expressão das enzimas, as culturas microbianas
foram centrifugadas e o precipitado de células foram ressuspensos em tampão e
lisados como descrito anteriormente.
A purificação de cada uma das enzimas lignocelulolíticas recombinantes
foi inicialmente realizada por uma etapa cromatográfica de afinidade com metal
imobilizado em coluna His-Trap Fast Flow (GE Healthcare). A coluna cromatográfica
foi previamente equilibrada com 10 vezes o volume da coluna de tampão fosfato de
sódio 20 mM, pH 7,4, contendo 300 mM de NaCl e 5 mM de imidazol e, em seguida,
foi aplicado a um fluxo de injeção de 0,5 mL/min cerca de 20 mL do sobrenadante da
lise celular, previamente filtrado em membrana de 0,45 μm. Após a aplicação da
amostra, a coluna foi lavada com 6 vezes o volume da coluna do mesmo tampão
utilizado anteriormente com fluxo de corrida de 1 mL/min. As proteínas adsorvidas
foram eluídas através de gradiente de imidazol no tampão (5 a 500 mM de imidazol)
com 20 vezes o volume da coluna. O curso de eluição das proteínas foi
acompanhado pela medida da absorbância a 280 nm e as frações coletadas nos
picos de eluição das proteínas foram analisadas quanto à atividade enzimática. As
frações apresentando a atividade enzimática avaliada foram reunidas, dialisadas e
concentradas por ultrafiltração em concentradores do tipo VivaSpin (GE Healthcare)
com membrana de retenção de 10 kDa e também avaliadas quanto ao grau de
purificação por eletroforese SDS-PAGE.
Posteriormente, as amostras das frações reunidas e concentradas
contendo as enzimas recombinantes foram submetidas à purificação em coluna de
exclusão molecular visando à obtenção de proteínas com maior grau de pureza para
a caracterização bioquímica e biofísica. Esta etapa cromatográfica foi realizada
utilizando a coluna Superdex 75 10/300 GL ou a coluna Superdex 200 10/300 GL
(GE Healthcare), previamente equilibradas com tampão fosfato de sódio 20 mM, pH
7,4, contendo 50 mM de NaCl. Foram aplicados em cada corrida cromatográfica 500
μL de amostra e as proteínas foram eluídas a um fluxo de corrida de 0,5 mL/min em
1,5 vezes o volume da coluna utilizando o mesmo tampão. O curso de eluição das
105
proteínas foi acompanhado pela medida da absorbância a 280 nm e as frações

coletadas nos picos de eluição das proteínas foram analisadas quanto à atividade
enzimática. As frações coletadas apresentando a atividade enzimática de interesse
foram reunidas e concentradas por ultrafiltração. Estas amostras foram
posteriormente utilizadas para a estimativa do teor de proteínas e também em
análises eletroforéticas por SDS-PAGE para avaliar o grau de pureza.
No caso da purificação da enzima galactanase, foi realizada a etapa de
purificação em coluna de afinidade como descrito anteriormente e, em seguida,
alíquotas de 3 mL das frações reunidas com atividade de galactanase foram
aplicadas, com fluxo de 0,5 mL/min, na coluna de exclusão molecular Hiload 16/60
Superdex 200 pg (GE Healthcare), previamente equilibrada com tampão fosfato de
sódio 20 mM, pH 7,4, contendo 50 mM de NaCl. As proteínas foram eluídas a um
fluxo de corrida de 1 mL/min em 1,5 vezes o volume da coluna utilizando o mesmo
tampão. As frações coletadas nos picos de eluição das proteínas apresentando a
atividade de galactanase foram reunidas e concentradas por ultrafiltração.
Posteriormente, uma alíquota de 3 mL desta amostra proteica foi aplicada com fluxo
de 0,5 mL/min em coluna de troca aniônica Source 15Q 4.6/100 PE (GE Healthcare),
previamente equilibrada com tampão fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4, contendo 50
mM de NaCl. Após a injeção da amostra foi realizada a lavagem da coluna com 5
vezes o volume da coluna do mesmo tampão inicial a um fluxo de 1 mL/min, seguido
da aplicação de gradiente salino no tampão (50 mM a 1 M de NaCl) em 20 vezes o
volume da coluna. As frações coletadas nos picos de eluição das proteínas
apresentando atividade de galactanase foram reunidas, dialisadas e concentradas
por ultrafiltração. A amostra obtida foi avaliada quanto ao teor de proteínas e
também submetida à análise eletroforética por SDS-PAGE.
3.4.6. Determinações das atividades enzimáticas

As atividades enzimáticas das hidrolases glicosídicas avaliadas foram
realizadas utilizando-se os mesmos procedimentos descritos no item 3.1.2.1. Foram
utilizados, dependendo dos ensaios realizados, os substratos arabinana linear,
arabinana desramificada, arabinana de beterraba sacarina, Avicel, amido de batata,
arabinoxilana de arroz, β-glucano de cevada, carboximetilcelulose (CMC), galactana
de batata, galactomanana, laminarina, liquenano, manana, pectina de frutas cítricas,
xilana de madeira faia e xiloglucano de tamarindo (Megazyme e Sigma-Aldrich).
106
A atividade enzimática de lacase foi determinada através da reação de

oxidação do ABTS (ácido 2,2’-azinobis-(3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) como
descrita por Bourbonnais et al. (1997) com algumas adaptações. A mistura reacional
composta de 300 μL de tampão citrato-fosfato 50 mM, pH 5,0, 100 μL de solução
ABTS 1 mM (Sigma-Aldrich) e 500 μL de água destilada foi pré-incubada a 37 ºC por
5 minutos para estabilização da temperatura e, em seguida, foi adicionado 100 μL da
enzima. A reação foi incubada a 37 ºC por 2 minutos e, posteriormente, foi realizada
a leitura da absorbância em espectrofotômetro a 420 nm. A atividade enzimática foi
calculada considerando o aumento da absorbância em relação à reação controle
(sem adição da enzima) e o coeficiente de extinção molar do radical ABTS a 420 nm,
Ɛ = 36.000 M-1 cm-1. Uma unidade de atividade de lacase (U/mL) foi definida como a
quantidade de enzima capaz de oxidar 1 μmol de ABTS por minuto nas condições
de ensaio.
3.4.7. Determinação do teor de proteínas solúveis totais

As quantificações do teor proteico das enzimas purificadas foram
realizadas através da lei de Lambert-Beer (Equação 2), considerando-se os valores
da absorbância a 280 nm das amostras de enzimas purificadas e o coeficiente de
extinção molar teórico das enzimas recombinantes estimado previamente pela
ferramenta ProtParam.
Equação 2: A=Ɛ*b*c
(Onde, A equivale à absorbância a 280 nm; Ɛ refere-se ao coeficiente de extinção molar da enzima
em M-1 cm-1; b é o comprimento do caminho óptico que a luz atravessa na solução em centímetros; c
é a concentração molar da proteína)
3.4.8. Caracterização das enzimas lignocelulolíticas recombinantes
3.4.8.1. Avaliação da especificidade enzimática

A primeira etapa da caracterização bioquímica de cada hidrolase
glicosídica recombinante envolveu uma avaliação da especificidade enzimática
sobre substratos polissacarídicos presentes na parede celular vegetal. As reações
foram preparadas como nos ensaios para determinação da atividade enzimática e
107
incubadas entre 30 a 90 minutos a 50 ºC, dependendo da enzima avaliada.

Posteriormente, foi realizada a quantificação dos açúcares redutores liberados por
DNS. As atividades relativas foram calculadas considerando o substrato com maior
atividade enzimática como 100 %. Os ensaios foram realizados em triplicata.
3.4.8.2. Efeito do pH e da temperatura na atividade e estabilidade

enzimática
Os efeitos do pH e da temperatura na atividade e estabilidade enzimática
foram estudados como descrito anteriormente nos itens 3.3.2.1 e 3.3.2.2. Nas
avaliações do efeito do pH foi utilizado o tampão citrato-fosfato adicionado de glicina
com valores de pH entre 2,0 e 10,0. Na avaliação do efeito da temperatura sobre a
estabilidade enzimática o tempo de pré-incubação das enzimas em tampão no pH
ótimo de atividade foi reduzido para 60 minutos.

enzimática
Os efeitos de diferentes íons metálicos (KCl, LiCl, NaCl, CaCl2, CoCl2,
NiCl2, MgCl2, MnCl2, FeCl3, CuSO4, ZnSO4) e de compostos quelantes (EDTA e
EGTA) na atividade enzimática foram investigados como descrito anteriormente no
item 3.3.2.3. Nesta avaliação o tempo de pré-incubação da enzima na presença
destes compostos foi reduzido para 30 minutos.
3.4.8.4. Determinação de parâmetros cinéticos

Para a determinação dos parâmetros cinéticos Km, Vmax, Kcat e Kcat/Km de
cada enzima lignocelulolítica recombinante, ensaios de atividade enzimática foram
realizados sob as condições ótimas de pH e temperatura de cada enzima, porém
com variação na concentração do substrato utilizado, na faixa de 0,1 mg/mL a 10
mg/mL para os substratos polissacarídicos e de 0,5 μM a 500 μM para o substrato
ABTS. Os resultados obtidos foram ajustados a uma regressão não-linear segundo o
modelo de Michaelis-Menten e os parâmetros cinéticos (Km, Vmax e Kcat) foram
calculados com o auxílio do programa GraphPad Prism versão 6.0 (GraphPad
Software).
108
3.4.8.5. Eletroforese capilar de oligossacarídeos

A análise de eletroforese capilar de oligossacarídeos foi realizada com o
objetivo de avaliar os produtos formados pelas enzimas avaliadas durante a hidrólise
de substratos polissacarídicos na tentativa de identificar o seu modo de ação.
Reações de hidrólise semelhantes às utilizadas nos ensaios para determinação da
atividade enzimática foram preparadas e incubadas por diferentes períodos de
tempo (30 min, 2 e 18 horas), nas condições ótimas de pH e temperatura de cada
enzima. As reações de hidrólise foram paralisadas por aquecimento a 99 ºC por 5
minutos e, em seguida, os produtos de hidrólise foram marcados através de reação
de aminação redutiva com o fluoróforo APTS (ácido 1,3,6-trissulfônico-8-aminopireno
– Sigma-Aldrich), como descrito por Evangelista, Liu e Chen (1995). Os produtos
marcados foram analisados no sistema P/ACE MDQ (Beckman Coulter) com
detector de fluorescência induzida por laser, como descrito por Santos et al. (2011).
Um capilar de sílica fundida (TSP 050375, Polymicro Technologies) com diâmetro
interno de 50 µm e 31 m de comprimento foi usado como coluna de separação dos
oligossacarídeos. A corrida eletroforética foi realizada em tampão fosfato de sódio 40
mM, pH 2,5, nas condições de 15kV/70-100 µA no cátodo de entrada e em
temperatura controlada de 20 ºC. Os oligossacarídeos marcados com APTS foram
excitados a 488 nm e a emissão foi determinada a 520 nm. Para prevenir a
ocorrência de contaminações cruzadas, o capilar foi lavado entre as corridas com
solução de NaOH 1 M e, em seguida, pelo tampão de corrida. A identificação dos
produtos formados durante a hidrólise foi realizada por comparação dos tempos de
retenção de cada pico gerado nos eletroferogramas com os tempos de retenção dos
padrões de oligossacarídeos utilizados.
3.4.8.6. Caracterização biofísica

As enzimas lignocelulolíticas recombinantes purificadas neste estudo
também foram caracterizadas biofisicamente através de análises de dicroísmo
circular com o objetivo de avaliar a sua estrutura secundária. A técnica de dicroísmo
circular (CD) é uma ferramenta espectroscópica comumente utilizada na avaliação
de estruturas de moléculas opticamente ativas, onde são mensuradas diferenças na
absorção da luz circularmente polarizada à esquerda e à direita aplicada sobre a
molécula. Esta técnica é considerada um método rápido para a avaliação de
estruturas secundárias em proteínas, sendo bastante descrita a sua utilização na
109
avaliação do comportamento estrutural dessas moléculas frente diferentes

condições, como temperatura, pH e entre outros (Corrêa; Ramos, 2009; Franco
Cairo, 2012).
Os espectros de dicroísmo circular no UV-distante foram coletados em
espectropolarímetro Jasco 810 (Jasco International) equipado com uma unidade de
controle de temperatura Peltier na faixa de comprimentos de onda entre 190-260 nm
usando uma cubeta de quartzo de 0,1 cm a 20 ºC. A concentração das proteínas
utilizadas neste ensaio variou entre 0,05 mg/mL a 0,2 mg/mL em tampão fosfato de
sódio 20 mM, pH 7,4, contendo 50 mM de NaCl. Todas as medidas foram feitas pela
média de 8 acumulações coletadas e subtraídas pelo branco (amostra de tampão
fosfato de sódio 50 mM, pH 7,4, contendo 50 mM de NaCl). Os resultados foram
expressos na forma de elipticidade molar média ( ), 103 grau.cm2.dmol-1, através da
Equação 3:
∗ ∗
Equação 3:
∗ ∗
(Onde, é a elipticidade observada em grau, M é a massa molecular da proteína em Daltons, C é a

concentração da proteína em mg/mL, l é o caminho óptico em cm, n é o número de resíduos da
proteína e 100 é um fator de adequação das unidades)
A técnica de CD também foi utilizada para monitorar as mudanças na

estrutura secundária das enzimas estudadas durante o aquecimento da amostra e
estimar a temperatura de transição na fração desenovelada (Tm). O monitoramento
da desnaturação térmica foi realizado pela mensuração da elipticidade molar em um
comprimento de onda fixo (correspondente ao valor mínimo de elipticidade molar
observado a 20 ºC para cada enzima), através de 8 medições realizadas ao longo de
um gradiente de temperatura de 20 ºC a 90 ºC com intervalos de 2 ºC.
No caso da enzima expressa pelo gene BlCel a determinação da
temperatura de transição (Tm) foi realizada através da técnica de calorimetria
diferencial de varredura (DSC). Esta é uma técnica de análise térmica que regista o
fluxo de energia calorífica associada às transições em materiais e biomoléculas em
função da temperatura. Basicamente, a análise de DSC consiste em método de
variação entálpica, no qual a diferença no fornecimento de energia calorífica entre
uma substância e um material de referência é medida em função da temperatura,
110
enquanto ambas são submetidas a um mesmo programa de aquecimento ou

arrefecimento, rigorosamente controlado (Carvalho, 2012). Os experimentos de DSC
foram realizados utilizando o equipamento VP-DSC (Microcal - GE Healthcare) do
Laboratório Nacional de Biociências (LNBIO/CNPEM). As amostras de referência
(tampão fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4, contendo 50 mM de NaCl) e da proteína
(na concentração de 0,2 mg/mL em tampão fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4,
contendo 50 mM de NaCl) foram previamente filtradas e degaseificadas antes da
injeção nas células do equipamento. As medidas foram feitas ao longo de um
gradiente de temperatura de 20 a 90 ºC com elevação de 1 ºC por minuto e os
resultados obtidos foram subtraídos pelo valor da leitura utilizando apenas a amostra
de referência.
111
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Etapa experimental 1 - “Avaliação do potencial biotecnológico para

produção de hidrolases glicosídicas e caracterização taxonômica de
isolados de Bacillus sp.”
4.1.1. Avaliação do potencial biotecnológico dos isolados de Bacillus sp.

para produção de hidrolases glicosídicas
4.1.1.1. Seleção de micro-organismos produtores de celulase, pectinase

e xilanase através de testes em placas de Petri
Vários trabalhos recentes na literatura sobre isolamento e seleção de
bactérias produtoras de celulases, pectinases e xilanases ressaltam o potencial
biotecnológico do gênero Bacillus para produção destas enzimas (Das et al., 2011;
Kim et al., 2012; Maki et al., 2011; Moreno et al., 2012).
Neste sentido, foi realizada uma avaliação inicial qualitativa do potencial
de107 isolados do gênero Bacillus quanto à capacidade de produção de celulase,
pectinase e xilanase, através do cultivo desses em placas de Petri contendo meio de
cultura mínimo adicionado de carboximetilcelulose (CMC), pectina de frutas cítricas
ou xilana como única fonte de carbono e na observação da formação de halos de
degradação dos polissacarídeos ao redor das colônias após coloração com o
corante vermelho Congo. A presença de halos de degradação ao redor das colônias
após a coloração com o corante vermelho Congo pode ser utilizada como um
indicativo da capacidade de produção de hidrolases glicosídicas por isolados
microbianos, pois o corante permanece fortemente ligado apenas às regiões onde
há ligações glicosídicas intactas nestes polissacarídeos (Florencio; Couri; Farinas,
2012; Nagar; Mittal; Gupta, 2012).
Na Figura 9 são apresentados os resultados dessa avaliação preliminar
dos isolados realizada a 37 e 45 ºC, após 16 horas de incubação para os cultivos em
CMC e xilana e 8 horas de incubação para o cultivos em pectina. Essa redução no
tempo de cultivo no meio em pectina ocorreu devido a um grande crescimento das
colônias positivas após 16 horas de incubação, fato que impedia a visualização
correta dos halos de degradação de cada isolado. Os cultivos foram realizados
nessas duas temperaturas na tentativa de identificar aqueles isolados que tivessem
112
a capacidade de produzir as enzimas avaliadas em condições mesofílicas e

ligeiramente termofílicas. Nos cultivos realizados em CMC e xilana praticamente não
houve diferenças nos isolados produtores de endoglucanases e xilanases nas duas
temperaturas de cultivo. Observou-se nos cultivos em CMC que a maioria dos
isolados microbianos, cerca de 86 % (92 isolados a 37 ºC e 93 isolados a 45 ºC)
apresentou a formação de halos de degradação ao redor das colônias nas duas
condições avaliadas. Nos cultivos realizados em meio contendo xilana,
aproximadamente 21 % dos isolados apresentaram potencial para produção de
xilanase (22 isolados a 37 ºC e 23 isolados a 45 ºC).
Por outro lado, nos cultivos em pectina (Figuras 9c e 9d) foi constatado
um aumento no número de isolados capazes de hidrolisar o substrato quando
cultivados em temperatura mais alta, passando de 22,5 % (24 isolados) a 37 ºC
para 49,5 % (53 isolados) a 45 ºC. Este aumento no número de isolados positivos
nos cultivos em pectina possivelmente ocorreu devido ao aumento no metabolismo
microbiano decorrente da elevação da temperatura, indicando que a temperatura de
crescimento poderia ser mais elevada.
Ries e Macedo (2009) também observaram durante a seleção de
leveduras termoestáveis produtoras de fitase que algumas linhagens produziram a
enzima em menor tempo em temperaturas mais altas devido ao aumento do
metabolismo enquanto outras perderam a capacidade ou requereram mais tempo
para hidrolisar o substrato fitato de cálcio.
No estudo realizado por Akbalik (2003) sobre o potencial para degradação
de CMC, pectina e xilana de 116 micro-organismos alcalofílicos pertencentes ao
gênero Bacillus, foram encontrados 72 isolados com potencial pectinolítico, 18
isolados xilanolíticos e apenas 3 isolados celulolíticos, após 48 horas de incubação a
37 ºC. Em um estudo similar, Berić et al. (2009) realizaram a avaliação qualitativa
de 205 isolados do gênero Bacillus quanto a produção de xilanase e observaram
que 133 isolados apresentavam potencial xilanolítico após 24 horas de incubação a
25 ºC, 142 isolados a 37 ºC e apenas 1 isolado a 55 ºC. Em outro estudo, Soares,
Silva e Gomes (1999) avaliaram o potencial pectinolítico de 168 linhagens
bacterianas e detectaram, após 48 horas de incubação a 30 ºC, a formação de halos
de degradação do substrato ao redor de 102 linhagens, sendo que 30 % destas (50
linhagens) foram consideradas como boas produtoras de pectinase. Cinco destas
linhagens melhor produtoras de pectinase eram pertencentes ao gênero Bacillus.
113
37 ºC 45 ºC
Figura 9 - Halos de crescimento das colônias e de degradação dos substratos durante a

avaliação qualitativa com os substratos carboximetilcelulose (a, b), pectina (c, d) e xilana (e,
f) a 37 e 45 ºC
114
Outro parâmetro normalmente utilizado para se avaliar a capacidade de

produção de enzimas por micro-organismos em meio sólido é o chamado índice
enzimático (IE). O IE é um parâmetro semiquantitativo calculado a partir da razão
entre o diâmetro do halo de degradação do substrato em relação ao diâmetro da
colônia (Goldbeck et al., 2012; Hankin; Anagnostakis, 1975). A determinação do
índice enzimático é um parâmetro útil na avaliação preliminar de micro-organismos
devido ao seu baixo custo, facilidade de execução e rapidez para obtenção dos
resultados. Alguns autores recomendam um valor de IE superior a 2,0 para se
considerar um micro-organismo como produtor de enzimas (Florencio; Couri;
Farinas, 2012; Goldbeck et al., 2012; Lealem; Gashe, 1994).
Na Tabela 5 são apresentados os resultados de índice enzimático para
alguns dos isolados microbianos utilizados neste estudo em cada substrato e
temperatura avaliados.
Os valores de IE dos melhores isolados microbianos celulolíticos variaram
de 1,5 a 3,8, sendo observado para os isolados BH19, BH35, BH78 e BH104 valores
de IE superior a 3,0 nas duas condições avaliadas em CMC, fato que caracteriza
esses isolados como possíveis bons produtores de celulases. Para os isolados
microbianos pectinolíticos os valores de IE oscilaram entre 1,3 a 5,0, sendo
verificado para os isolados BH19, BH27, BH93 e BH104 os maiores valores de IE,
com destaque para o isolado BH27 com IE igual a 5,0 após 8 horas de cultivo a 45
ºC. Entre os isolados microbianos xilanolíticos os valores de IE variaram de 1,3 a
4,5, sendo observado para os isolados BH19, BH32, BH41, BH54 e BH60 valores de
IE superiores a 3,0 nas duas temperaturas utilizadas.
115
Tabela 5 - Índices enzimáticos (IE) de alguns isolados de Bacillus sp. durante a avaliação
qualitativa em carboximetilcelulose, pectina e xilana
Cultivo em
Cultivo em Pectina Cultivo em Xilana
Isolado Carboximetilcelulose
IE 37 ºC IE 45 ºC IE 37 ºC IE 45 ºC IE 37 ºC IE 45 ºC
BH2 * 2,8 2,0 2,3 2,0 2,1 2,4
BH12 3,7 1,8 ND 3,3 ND ND
BH18 3,3 2,2 ND 3,3 ND ND
BH19 * 3,8 3,8 2,7 4,0 3,6 3,4
BH23 2,6 3,4 ND 2,0 ND ND
BH24 * 2,2 2,3 2,3 2,0 2,2 3,0
BH26 * 2,8 2,8 2,0 2,0 2,2 3,3
BH27 * 2,8 3,0 3,8 5,0 2,0 2,7
BH28 * 2,2 2,3 2,0 2,0 2,8 3,4
BH32 * 3,3 2,8 2,3 2,3 3,0 3,5
BH34 3,3 2,2 ND 3,3 ND ND
BH35 * 3,5 3,8 2,0 2,5 3,5 3,0
BH40 1,7 2,0 2,0 2,0 ND 2,8
BH41 * 2,8 3,5 2,7 2,3 3,3 3,8
BH43 1,5 1,3 1,7 3,0 ND ND
BH45 2,8 3,4 ND ND ND ND
BH47 * 2,7 2,9 2,7 3,3 3,0 3,8
BH51 2,6 2,1 ND 3,3 ND ND
BH54 * 3,0 3,0 2,7 3,3 3,3 4,3
BH56 * 3,0 3,0 2,3 3,5 3,0 3,5
BH60 * 3,0 2,8 2,7 3,3 3,5 3,2
BH62 * 2,1 2,1 2,0 3,3 2,8 4,5
BH65 2,2 2,0 ND 2,7 ND ND
BH66 ND ND 1,7 1,7 1,5 1,8
BH73 2,0 ND ND 2,7 ND ND
BH78 3,2 3,6 ND 1,3 ND ND
BH79 3,0 2,7 ND 1,3 ND ND
BH83 2,3 2,0 ND 2,7 ND ND
BH85 2,3 3,0 ND 2,3 ND ND
BH87 * 2,8 3,0 1,7 2,7 2,8 3,8
BH88 * 3,0 2,8 2,3 3,0 3,0 4,3
BH89 2,4 3,0 ND 2,0 ND ND
BH90 ND ND 1,7 1,7 1,3 1,8
BH92 * 2,0 1,6 2,0 1,3 1,7 2,3
BH93 * 2,0 1,5 4,5 3,3 1,4 1,8
BH98 3,0 2,3 ND 2,0 ND ND
BH99 * 2,3 2,0 1,3 2,3 2,5 2,7
BH104 * 3,4 3,6 3,0 4,0 2,5 2,3
BH105 2,8 2,4 ND 3,0 ND ND
BH106 2,0 1,5 ND 3,0 ND ND
(ND: halos de hidrólise não detectados). Os desvios padrões das duplicatas dos índices enzimáticos
oscilaram entre 0,1 e 0,15. Os isolados microbianos assinalados com um asterisco apresentaram a
formação de halos de degradação do substrato em todas as condições avaliadas.
116
Na Figura 9 e na Tabela 5 é possível observar que entre os 107 isolados

de Bacillus sp. avaliados, apenas 20 destes apresentaram a formação de halos de
degradação ao redor das colônias e tiveram valores de índice enzimático próximo ou
superior a 2,0 em todos os substratos e temperaturas avaliadas, indicando o
possível potencial destes isolados para produção simultânea de celulases,
pectinases e xilanases. Desta forma, estes 20 isolados foram selecionados para uma
posterior avaliação quantitativa quanto à produção destas enzimas por fermentação
submersa.
Comparativamente, Han, Zheng e Xie (2004) ao realizarem a avaliação do
potencial produtor de xilanases de 81 isolados bacterianos alcalofílicos provenientes
de amostras de solo, sendo alguns pertencentes ao gênero Bacillus, observaram
que 60 isolados formaram halos de degradação ao redor das colônias após 72 horas
de cultivo a 37 ºC em meio de cultivo contendo hemicelulose de espiga de milho
como única fonte de carbono. Segundo os autores desse trabalho, 45,7 % dos
isolados tiveram IE superior a 1,5 e apenas 21,7 % tiveram IE maior que 2,0.
Em outro estudo similar de avaliação do potencial produtor de celulases,
Liang et al. (2014) utilizaram linhagens bacterianas aeróbicas isoladas de amostras
de solo e relataram valores de IE superiores aos obtidos neste estudo. Das 245
linhagens avaliadas pelos autores desse estudo, apenas 22 apresentaram a
formação de halos de degradação ao redor das colônias em meio contendo CMC
após 48 horas de incubação a 28 ºC, sendo que 3 destas linhagens foram
identificadas como pertencentes ao gênero Bacillus e apresentaram valores de IE de
6, 9,3 e 11,4. No estudo realizado por Uenojo e Pastore (2006) foram isolados e
avaliados pelo método em placa vários micro-organismos quanto à produção de
pectinases. Após 4 dias de crescimento a 30 ºC, os autores deste trabalho
observaram que dos 104 micro-organismos avaliados apenas 18 destes foram
considerados produtores de pectinase, sendo que os valores de IE encontrados para
estes isolados variaram de 1,1 a 4,3.
Agustini et al. (2012) realizaram o isolamento de micro-organismos a partir
de amostras coletadas em florestas tropicais das ilhas de Java e Sumatra e a
avaliação qualitativa destes para produção de celulases e xilanases. Dos 553 fungos
e bactérias testados através de cultivos em placas de Petri contendo CMC ou xilana
como fonte de carbono, foi verificada, após 24 horas de cultivo a 28 ºC, a formação
de halos de degradação ao redor de 304 isolados em CMC e de 323 isolados em
117
xilana. Os maiores IE para os micro-organismos celulolíticos após 48 horas de

cultivo variaram ente 2,0 e 3,36, enquanto que para os micro-organismos
xilanolíticos estes oscilaram entre 1,5 a 3,68, sendo o melhor IE em ambos os casos
obtidos por isolados bacterianos.
4.1.1.2. Seleção de micro-organismos produtores de hidrolases

glicosídicas por fermentação submersa
4.1.1.2.1. Seleção de micro-organismos produtores de

endoglucanase, poligalacturonase e xilanase em meio de
cultura líquido contendo substratos comerciais
As Figuras 10, 11 e 12 ilustram as cinéticas de produção de
endoglucanase, poligalacturonase e xilanase durante os cultivos em meio de cultura
mínimo líquido suplementado com 0,5 % (m/v) de CMC, pectina cítrica ou xilana,
respectivamente, pelos 20 isolados de Bacillus sp. previamente selecionados. Para
melhor visualização dos resultados, no final desta seção, na Tabela 6 são
apresentados os valores de máxima atividade enzimática observados entre os 20
isolados, os teores de proteínas solúveis totais e o tempo de fermentação em que
foram obtidos estes resultados.
Verificou-se nos cultivos em CMC diferenças na capacidade de produção
de endoglucanase entre os isolados, com atividades enzimáticas máximas oscilando
entre 0,02 e 0,37 U/mL (Figura 10). As maiores atividades enzimáticas de
endoglucanase foram obtidas com 62 horas de fermentação para a maioria dos
isolados. Foi verificado para os isolados BH27, BH47, BH56 e BH87 atividades
enzimáticas superiores a 0,2 U/mL, após 62 horas de fermentação, sendo o isolado
BH27 o que apresentou a maior atividade endoglucanásica (0,37 U/mL). O isolado
BH19, que teve o maior valor de IE nos ensaios em placas de Petri a 37 ºC,
apresentou desempenho regular no cultivo em meio líquido, com atividade
endoglucanásica máxima de 0,18 U/mL após 48 horas de fermentação.
Através da análise dos resultados apresentados nas Tabelas 5 e 6, foi
constatado que o perfil de produção de endoglucanase pelos isolados microbianos
nos cultivos em meio líquido foi diferente daquele observado nos cultivos em meio
sólido. Verificou-se por meio da determinação do coeficiente de correlação linear um
baixo valor para este índice (R = 0,256), indicando que não houve correlação entre
118
os resultados de índice enzimático e as atividades enzimáticas obtidas nos cultivos

líquidos. Quanto ao teor de proteínas solúveis totais nos cultivos em CMC, foram
observados baixos valores de proteínas, entre 0,004 e 0,020 mg/mL. O teor de
proteínas totais reflete as enzimas e outras proteínas extracelulares que foram
secretadas pelos micro-organismos durante a fermentação e foi utilizado neste
estudo principlamente como um indicativo da capacidade de crescimento de cada
micro-organismos e para uma rápida avaliação da atividade específica dos
sobrenadantes de cultivo de cada isolado microbiano.
Figura 10 – Cinética de produção de endoglucanase pelos 20 isolados de Bacillus sp.

durante fermentação submersa utilizando CMC como fonte de carbono
As atividades enzimáticas de endoglucanase obtidas para alguns dos

isolados foram próximas ou maiores àquelas relatadas em alguns trabalhos na
literatura para linhagens do gênero Bacillus quando cultivadas em meios de cultivo
contendo maiores concentrações de fonte de carbono e de nitrogênio e também em
condições otimizadas de produção. Comparativamente, Stathopoulou et al. (2012)
relataram para linhagens termofílicas de Geobacillus sp. e de Bacillus sp. atividades
entre 0,15 e 1,45 nKat/mL (aproximadamente 0,01 e 0,09 U/mL) entre o 3º e 5º dia
de fermentação a 60 ºC e 200 rpm de agitação em frascos Erlenmeyer de 100 mL
com 25 mL de meio de cultura (0,5 % de NaNO3, 0,1 % de KH2PO4, 0,2 % de
K2HPO4, 0,01 % de KCl, 0,05 % de MgSO4, 0,001 % de CaCl2, 0,002 % de FeSO4,
0,1 % de extrato de levedura, 2 % de CMC e 0,1 % de solução de elementos traços
119
(m/v ou v/v)). Kim et al. (2012) ao avaliarem a produção de endoglucanases por 4

linhagens de B. subtilis em frascos Erlenmeyer de 500 mL contendo 200 mL de
meio de cultura (1 % de CMC, 0,1 % de extrato de levedura, 0,25 % de (NH4)2SO4, e
solução de sais (m/v), pH 7,0) relataram atividades endoglucanásicas oscilando
entre 0,4 e 0,9 U/mL, após 72 horas a 28 ºC e 150 rpm de agitação.
Deka et al. (2011) obtiveram atividade endoglucanásica máxima de 0,07
U/mL para a linhagem B. subtilis AS3, após 36 horas de cultivo em frascos
Erlenmeyer de 250 mL contendo 50 mL de meio de cultura não otimizado (1 % de
CMC, 0,5 % de peptona, 0,5 % de extrato de levedura, 0,1 % de K2HPO4, 0,025 %
de MgSO4, 0,025 % de FeSO4, 0,05 % de MnCl2 (m/v), pH 7,0) a 37 ºC e 180 rpm.
Quando o micro-organismo foi cultivado no meio de cultura otimizado (1,8 % de
CMC, 0,8 % de peptona e 0,48 % extrato de levedura (m/v)) esses autores obtiveram
atividade endoglucanásica de 0,43 U/mL. Em outro estudo, Akhtar et al. (2015)
também otimizaram a produção de endoglucanase pela linhagem B. subtilis NA15 e
obtiveram atividade enzimática de 0,47 U/mL após 24 horas de fermentação a 37 ºC
e 120 rpm em meio de cultura otimizado (1,8 % de CMC, 0,5 % de peptona, 0,5 %
de extrato de levedura e 0,05 % de MnCl2 (m/v)).
Com relação à atividade específica, foi verificado no presente estudo
atividades de endoglucanase variando entre 1,4 e 37,4 U/mg de proteína, sendo
observado para os isolados BH2, BH28 e BH99 as menores atividades (3,14, 1,4,
2,89 U/mg, respectivamente) e para os isolados BH27, BH47, BH56 e BH 87 as
maiores atividades (37,4, 25,3, 25,2 e 21,6 U/mg, respectivamente).
Comparativamente, Sadhu et al. (2013) ao estudarem a produção de
endoglucanase por uma linhagem de Bacillus sp. observaram ao final da otimização
das condições de cultivo atividades máximas de endoglucanase próximas a 3 U/mg
de proteína, após 10 dias de fermentação a 37 ºC e 150 rpm de agitação em frascos
Erlenmeyer de 250 mL com 50 mL de meio de cultura composto por 1 % de CMC,
0,15 % de NH4Cl, 0,1 % de K2HPO4, 0,05 % de MgSO4, 0,01 % de NaCl (m/v), pH
7,0. As atividades específicas de endoglucanase obtidas para vários isolados no
presente trabalho também foram maiores do que a reportada por Sadhu et al. (2014)
para a linhagem Bacillus sp. MTCC10046. Segundo esses autores, a atividade
endoglucanásica máxima de 6,41 U/mg de proteína foi obtida após 8 dias de cultivo
do micro-organismo a 37 ºC e 180 rpm de agitação em frascos Erlenmeyer de 100
120
mL contendo 20 mL de meio de cultura (0,1 % de (NH4)2SO4, 0,1 % de K2HPO4,

0,05 % de MgSO4, traços de NaCl, 8 % de CMC e 1 % de lactose (m/v), pH 7,0).
Para os cultivos realizados em pectina cítrica, as maiores atividades
enzimáticas de poligalacturonase foram obtidas com até 48 horas de fermentação,
exceto para os isolados BH26, BH35, BH41 e BH54 que tiveram as atividades
máximas com 62 horas de fermentação (Figura 11). Embora se tenha verificado
visualmente um bom crescimento dos micro-organismos durante a fermentação no
meio de cultura com pectina, as atividades enzimáticas de poligalacturonase
detectadas foram baixas, entre 0,035 U/mL (BH35) e 0,122 U/mL (BH27). Apenas 4
isolados apresentaram atividades de poligalacturonase superiores a 0,1 U/mL,
sendo eles os isolados BH27 (0,122 U/mL), BH 32 (0,110 U/mL), BH88 (0,101 U/mL)
e BH93 (0,115 U/mL), todos com 24 horas de fermentação. Verificou-se também nos
cultivos realizados em pectina que não houve correlação entre os resultados de
índice enzimático e a produção de poligalacturonase em meio líquido, sendo obtido
neste caso um valor de índice de correlação linear de 0,407. Mesmo não havendo
correlação entre estes 2 dados, foi observado para os isolados com maior valor de
índice enzimático a 37 ºC (BH27, IE=3,8 e BH 93, IE=4,5) as maiores produções de
poligalacturonase em meio líquido. Os teores de proteínas totais observados nos
picos de máxima atividade enzimática de poligalacturonase oscilaram entre 0,012 e
0,040 mg/mL (Tabela 6).
Figura 11 – Cinética de produção de poligalacturonase pelos 20 isolados de Bacillus sp.

durante fermentação submersa utilizando pectina cítrica como fonte de carbono
121
As atividades de poligalacturonase obtidas neste trabalho foram menores

que as reportadas na literatura para outros micro-organismos do gênero Bacillus.
Contudo, deve-se ressaltar que existem diferenças nas condições de cultivo
utilizadas em comparação às descritas em outros trabalhos, que podem ter
influenciado na produção da enzima. Segundo Cordeiro e Martins (2009), a
produção de pectinases microbianas é fortemente influenciada pelas condições de
cultivo, em particular, pela composição do meio de cultura, tipo e concentração da
fonte de carbono utilizada, pH e temperatura. Outro fator que também pode
ocasionar diferenças durante a comparação dos resultados obtidos com a literatura
são as metodologias usadas para a determinação da atividade enzimática de
poligalacturonase. Em muitos trabalhos é utilizado como substrato da reação o ácido
poligalacturônico (um derivado da pectina obtido após um processo de
despolimerização parcial e demetilação) ou pectinas de outros tipos e com diferentes
graus de metoxilação.
No estudo realizado por Sharma e Satyanarayana (2006) foram obtidas
atividades de poligalacturonase de 0,62 U/mL após 48 horas de fermentação do
micro-organismo Bacillus pumilus dcsr1 em frascos Erlenmeyer de 250 mL contendo
50 mL de meio de cultura (0,5 % de pectina cítrica, 0,2 % de K2HPO4, 0,25 % de
MgSO4, 0,5 % de NaHPO4, 0,1 % de extrato de levedura, 0,179 % de caseína, 0,2 %
de solução de micronutrientes (m/v ou v/v), pH 8,0), a 40 ºC e 250 rpm de agitação.
Após a otimização das condições de fermentação, os autores deste trabalho
obtiveram atividades de poligalacturonase de 21 U/mL utilizando meio de cultura
otimizado (0,5 % de pectina, 0,5 % de K2HPO4, 0,5 % de NaHPO4, 0,25 % de
MgSO4, 0,1 % de extrato de levedura, 0,163 % de caseína, 0,2 % de solução de
micronutrientes (m/v ou v/v), pH 8,5).
Soares, Silva e Gomes (1999) ao avaliarem a produção de
poligalacturonase por 5 linhagens de Bacillus sp., que apresentaram alta atividade
pectinolítica durante os ensaios qualitativos, verificaram atividades enzimáticas entre
2,7 e 4 U/mL após 48 horas de fermentação em frascos Erlenmeyer de 125 mL com
25 mL de meio de cultura (1 % de pectina cítrica, 0,14 % de (NH4)2SO4, 0,6 % de
K2HPO4, 0,2 % de KH2PO4, 0,01 % de MgSO4 (m/v), pH 6,0) a 30 ºC e 150 rpm. Em
outro estudo similar, Jayani, Shukla e Gupta (2010) avaliaram o potencial de
isolados bacterianos obtidos de amostras de solo e de vegetais e relataram
atividades enzimáticas de poligalacturonase variando entre 4,4 e 6,2 U/mL após 72
122
horas de fermentação a 160 rpm e 30 ºC em frascos Erlenmeyer de 250 mL com 25

mL de meio de cultura (0,05 % de KCl, 0,1 % de MgSO4, 0,1 % de citrato de sódio,
0,1 % de ácido cítrico, 0,1 % de extrato de levedura, 0,1 % de caseína e 1 % de
pectina cítrica (m/v)). O isolado com melhores resultados foi identificado pelos
autores desse trabalho como B. sphaericus MTCC 7542.
Por outro lado, a produção de poligalacturonase observada no presente
estudo para alguns dos isolados de Bacillus sp. foi maior que a relatada por
Maldonado e Strasser de Saad (1998) para uma linhagem do fungo Aspergillus
niger. Essa linhagem apresentou a produção de 0,055 U/mL de poligalacturonase
após 48 horas de cultivo a 30 ºC e 300 rpm em meio de cultura composto por 1,5 %
de pectina, 0,2 % de sulfato de amônio (m/v) e solução de sais.
Em termos de atividade específica de poligalacturonase, os menores
valores de atividade enzimática no presente estudo foram constatados para os
isolados BH87 (1,46 U/mg), seguido pelos isolados BH35 e BH41 (ambos com 2
U/mg), enquanto os maiores valores foram observados para os isolados BH27 (5,3
U/mg), BH104 (6,58 U/mg), BH28 (6,73 U/mg) e BH32 (6,88 U/mg).
Comparativamente, Ouattara et al. (2008) estudaram a produção de enzimas
pectinolíticas por uma linhagem de Bacillus sp. isolada durante a fermentação de
cacau e relataram atividades de poligalacturonase de 1,03 U/mg de proteína no
sobrenadante de cultivo após 48 horas de fermentação a 30 ºC e 150 rpm de
agitação em frascos Erlenmeyer de 125 mL com 25 mL de meio de cultura (0,5 % de
pectina cítrica, 0,14 % de (NH4)2SO4, 0,6 % de K2HPO4, 0,20 % de KH2PO4 e 0,01 %
de MgSO4 (m/v), pH 6,0). Em outro estudo, Rehman, Qader e Aman (2012)
relataram para a linhagem B. licheniformis KIBGE IB-21 atividade de
poligalacturonase de 14 U/mg de proteína após 24 horas de cultivo sob agitação a
37 ºC em meio de cultura composto por 1 % de extrato de levedura e 0,25 % de
pectina (m/v), pH 7,2. Quando esse micro-organismo foi cultivado em meio de
cultura composto por 0,2 % de KH2PO4, 0,2 % de K2HPO4, 0,2 % de (NH4)2SO4, 0,3
% de extrato de levedura, 0,5 % de pectina (m/v), pH 7,0, sob as mesmas condições
anteriores, foi obtida atividade de poligalacturonase de 591 U/mg de proteína.
Como pode ser observado na Figura 12 e Tabela 6, durante os cultivos
realizados em xilana foi verificado que as maiores atividades xilanolíticas foram
obtidas após 24 horas de fermentação para a maioria dos isolados de Bacillus sp.,
exceto para os isolados BH35, BH62, BH87, BH88, BH92 e BH104 que tiveram as
123
maiores atividades após 48 horas e para os isolados BH24 e BH28 com atividade
máxima com 62 horas de cultivo. As atividades enzimáticas máximas de xilanase
oscilaram entre 0,057 U/mL (isolado BH99) e 0,389 U/mL (isolado BH54). Atividades
xilanolíticas superiores a 0,25 U/mL foram observadas para os isolados BH19 (0,270
U/mL), BH47 (0,305 U/mL), BH54 (0,389 U/mL), BH60 (0,382 U/mL) e BH93 (0,251
U/mL), todos com 24 horas de fermentação. Observou-se também para estes 5
isolados a diminuição da atividade enzimática após o pico de produção, que pode
ser devido a produção de proteases por estes isolados ou também devido à inibição
da enzima por produtos gerados durante a fermentação. Assim como nos cultivos
realizados em CMC e pectina, não foi observada correlação linear entre os
resultados de índice enzimático a 37 ºC e as atividades enzimáticas máximas
apresentadas pelos isolados nos cultivos em meio líquido. O valor do índice de
correlação linear neste caso foi de 0,453. Com relação ao teor de proteínas solúveis
totais no sobrenadante de cultivo, este parâmetro oscilou entre 0,012 (isolado BH92)
e 0,045 mg/mL (isolado BH54) nos picos de máxima produção enzimática (Tabela
6).
Figura 12 – Cinética de produção de xilanase pelos 20 isolados de Bacillus sp. durante

fermentação submersa utilizando xilana de madeira faia como fonte de carbono
A produção de xilanase obtida neste estudo para alguns isolados foram

maiores que as relatadas por Kinegam, Tanasupawat e Akaracharanya (2007), que
obtiveram atividades xilanolíticas entre 0,03 e 0,17 U/mL para micro-organismos
124
identificados como B. funiculus, B. niabensis e B. megaterium após 48 horas de

cultivo a 40 ºC e 200 rpm de agitação em frascos Erlenmeyer de 250 mL com 30 mL
de meio de cultura (1 % de xilana de espelta de aveia (oat spelt), 0,5 % de peptona,
0,1 % de extrato de levedura, 0,4 % de K2HPO4, 0,1 % de MgSO4, 0,02 % de KCl,
0,002 % de FeSO4 (m/v), pH 7,0). No estudo realizado por Stathopoulou et al. (2012)
foram obtidas atividades xilanolíticas de 4,03, 4,72 e 10,78 nKat/mL
(aproximadamente 0,241, 0,283 e 0,646 U/mL, respectivamente) para 3 isolados do
gênero Bacillus durante o 3º e 5º dia de fermentação a 60 ºC e 200 rpm de agitação
em frascos Erlenmeyer de 100 mL com 25 mL de meio de cultura contendo 2 % de
xilana de bétula (xilana birchwood).
Por outro lado, os resultados obtidos de produção de xilanase no presente
trabalho foram menores que aqueles obtidos por Pham et al. (1998), que relataram
atividades xilanolíticas de 24 nKat/mL (aproximadamente 1,44 U/mL) para as
linhagens B. polymyxa 6319T e B. polymyxa CECT 153 durante fermentação a 30 ºC
e 250 rpm em frascos de 500 mL contendo 100 mL de meio de cultura (0,075 % de
KH2PO4, 0,05 % de K2HPO4, 0,02 % de MgSO4, 0,5 % de xilana de bétula, 0,4 % de
extrato de levedura, 0,2 % de peptona, 0,2 % de (NH4)2SO4 e 0,1 % de solução de
elementos traços (m/v ou v/v), pH 7,0). Em outro estudo, Bajaj, Khajuria e Singh
(2012) obtiveram atividade de xilanase de 17,4 U/mL após 48 horas de cultivo a 200
rpm e 45 ºC da linhagem B. pumilus SS1 em frascos Erlenmeyer de 250 mL com
100 mL de meio de cultura (1 % de xilana de espelta de aveia, 0,5 % de KH2PO4, 0,5
% de (NH4)2SO4 (m/v) e solução de micronutrientes).
Com relação à atividade específica de xilanase, as menores atividades
foram obtidas no presente estudo para os isolados BH99 (2,28 U/mg) e BH28 (3
U/mg), enquanto para os isolados BH92 (13,83 U/mg), BH41 (15,50 U/mg) e BH35
(15,62 U/mg) foram registradas as maiores atividades.
Comparativamente, Tseng et al. (2002) obtiveram atividade específica de
xilanase de 1,75 U/mg de proteínas no sobrenadante de cultivo da bactéria
alcalofílica B. firmus, após 4 dias de cultivo em frascos agitados a 37 ºC utilizando
meio de cultura composto por 0,25 % de NaNO3, 0,1 % de extrato de levedura,
0,5 % de xilana de bétula (m/v) e sais, pH 10,5. Em outro estudo, Pason et al. (2006)
avaliaram a produção de xilanase por 6 linhagens pertencentes ao gênero Bacillus
em frascos agitados a 37 ºC e 200 rpm em meio de cultura composto por 0,5 %
xilana, 0,2 % NaNO3 (m/v) e solução de sais e observaram atividades xilanolíticas
125
entre 3,10 e 7,19 U/mg de proteína ao final da fase estacionária de cultivo. Duarte et
al. (1999) ao avaliarem a produção de xilanases alcalinas por bactérias isoladas de
amostras de solo, identificaram 4 isolados como sendo B. pumilus e verificaram que
estes apresentaram atividades enzimáticas de xilanase, em pH 10,0, entre 1,22 e
3,98 U/mL e atividades específicas entre 12,7 e 41,1 U/mg de proteínas, após 48
horas de cultivo a 45 ºC e 230 rpm em frascos Erlenmeyer de 50 mL contendo 7 mL
de meio de cultura (1 % de xilana de bétula, 0,1 % de peptona, 0,1 % de Tween 80,
0,14 % de (NH4)2SO4, 0,03 % de ureia (m/v) e sais, pH 10,0).
126
Tabela 6 – Atividades enzimáticas máximas de endoglucanase, poligalacturonase e xilanase

e teor proteico observados durante os cultivos dos 20 isolados de Bacillus sp. em meio de
cultura líquido contendo carboximetilcelulose, pectina ou xilana
Cultivo em
Cultivo em Pectina Cultivo em Xilana
Carboximetilcelulose
Atividade Teor Atividade Teor Atividade Teor
Tempo Tempo Tempo
Isolado máxima proteico máxima proteico máxima proteico
(h) (h) (h)
(U/mL) (mg/mL) (U/mL) (mg/mL) (U/mL) (mg/mL)
0,022 0,007 0,064 0,024 0,092 0,015

BH2 48 48 24
±0,004 ±0,001 ±0,006 ±0,002 ±0,005 ±0,001
0,185 0,017 0,088 0,022 0,270 0,040
BH19 48 24 24
±0,007 ±0,001 ±0,007 ±0,001 ±0,008 ±0,002
0,166 0,010 0,093 0,021 0,136 0,022
BH24 62 24 62
±0,040 ±0,002 ±0,011 ±0,001 ±0,009 ±0,002
0,047 0,004 0,098 0,036 0,118 0,013
BH26 62 62 24
±0,007 ±0,002 ±0,010 ±0,002 ±0,003 ±0,001
0,374 0,010 0,122 0,023 0,198 0,025
BH27 62 24 24
±0,015 ±0,001 ±0,008 ±0,001 ±0,007 ±0,004
0,028 0,020 0,101 0,015 0,066 0,022
BH28 24 24 62
±0,005 ±0,001 ±0,009 ±0,002 ±0,023 ±0,002
0,117 0,012 0,110 0,016 0,230 0,021
BH32 62 24 24
±0,019 ±0,004 ±0,007 ±0,002 ±0,008 ±0,001
0,078 0,005 0,076 0,038 0,203 0,013
BH35 62 62 48
±0,002 ±0,002 ±0,007 ±0,003 ±0,019 ±0,002
0,087 0,004 0,080 0,040 0,217 0,014
BH41 62 62 24
±0,006 ±0,001 ±0,003 ±0,004 ±0,019 ±0,002
0,304 0,012 0,057 0,017 0,305 0,036
BH47 62 48 24
±0,046 ±0,002 ±0,003 ±0,002 ±0,015 ±0,005
0,178 0,009 0,042 0,016 0,389 0,045
BH54 62 62 24
±0,046 ±0,001 ±0,005 ±0,002 ±0,008 ±0,001
0,252 0,010 0,076 0,036 0,161 0,027
BH56 62 48 24
±0,045 ±0,002 ±0,001 ±0,002 ±0,020 ±0,002
0,114 0,007 0,035 0,017 0,382 0,031
BH60 62 24 24
±0,036 ±0,002 ±0,008 ±0,001 ±0,035 ±0,003
0,061 0,018 0,064 0,017 0,170 0,038
BH62 62 24 48
±0,010 ±0,002 ±0,004 ±0,001 ±0,008 ±0,001
0,216 0,010 0,057 0,039 0,148 0,034
BH87 62 48 48
±0,045 ±0,001 ±0,005 ±0,008 ±0,012 ±0,004
0,194 0,016 0,101 0,025 0,199 0,032
BH88 24 24 48
±0,019 ±0,003 ±0,001 ±0,001 ±0,023 ±0,003
0,071 0,005 0,071 0,020 0,166 0,012
BH92 62 48 48
±0,007 ±0,002 ±0,010 ±0,001 ±0,017 ±0,002
0,032 0,008 0,115 0,030 0,251 0,030
BH93 62 24 24
±0,008 ±0,002 ±0,009 ±0,001 ±0,021 ±0,002
0,026 0,009 0,060 0,019 0,057 0,025
BH99 24 48 24
±0,009 ±0,001 ±0,004 ±0,002 ±0,029 ±0,002
0,044 0,010 0,079 0,012 0,152 0,017
BH104 62 24 48
±0,010 ±0,004 ±0,005 ±0,001 ±0,015 ±0,002
127
4.1.1.2.2 Seleção de micro-organismos produtores de hidrolases

glicosídicas em meio de cultura líquido contendo farelo de
trigo
Com o objetivo de avaliar e selecionar os isolados com a capacidade de
produção simultânea de várias hidrolases glicosídicas, principalmente de
hemicelulases, foram realizados novos cultivos em fermentação submersa sob as
mesmas condições anteriores, porém utilizando o meio mínimo suplementado com
0,5 % (m/v) de farelo de trigo como fonte de carbono para indução da produção das
enzimas. Para estes cultivos foram selecionados os cinco isolados de Bacillus sp.
que produziram as maiores quantidades de xilanases (BH19, BH47, BH54, BH60 e
BH93). Estes isolados também apresentaram bons resultados quanto à produção de
endoglucanases e poligalacturonases como observado anteriormente (Tabela 6).
O farelo de trigo é um subproduto gerado a partir da moagem do trigo,
que tem em sua composição (% com base em massa seca) 30 % celulose, 27 %
hemicelulose, 21 % lignina e 8 % cinzas (Gawande; Kamat, 1999). Este substrato foi
escolhido para esta etapa do trabalho por ser barato, facilmente disponível, por
possuir características nutricionais, como alto teor de xilanas e de proteínas, que
permitem o crescimento microbiano e a atividade metabólica e também por ser
frequentemente utilizado em fermentações microbianas para produção de amilases,
celulases, xilanases, pectinases e proteases (Ahlawat et al., 2009; Bajaj; Khajuria;
Singh, 2012; Castro; Sato, 2013; Deka et al., 2011; El-Helow; El-Gazaerly, 1996;
Meng et al., 2014). Além disso, o farelo de trigo, assim como outros subprodutos
agroindustriais, possui complexidade estrutural que pode induzir a produção
simultânea de várias enzimas microbianas e assim reduzir custos de produção.
El-Helow e El-Gazaerly (1996) relataram a produção simultânea de
amilase, mananase, liquenase e xilanase pela linhagem B. subtilis 168 quando
cultivada em meio de cultura contendo subprodutos agroindustriais como fonte de
carbono. Estes autores obtiveram bons resultados de produção dessas 4 enzimas
após 36 horas de cultivo a 37 ºC e 250 rpm de agitação em frascos Erlenmeyer de
250 mL com 25 mL de meio de cultura (2 % de farelo de trigo, 0,5 % de peptona,
0,25 % de extrato de levedura e 1 % de NaCl (m/v)).
Na Tabela 7 são apresentados os resultados obtidos para atividades
enzimáticas de arabinanase, galactanase, liquenase, mananase e xilanase e o teor
128
proteico do sobrenadante de cultivo após 24 horas de fermentação utilizando farelo

de trigo como fonte de carbono.
Tabela 7 – Atividades das hidrolases glicosídicas avaliadas e teor de proteínas solúveis

totais observados durante os cultivos dos isolados BH19, BH47, BH54, BH60 e BH93 em
meio de cultura mínimo contendo farelo de trigo após 24 horas de fermentação
Teor
Arabinanase Galactanase Liquenase Mananase Xilanase
Isolado proteico
(U/mL)* (U/mL)* (U/mL)* (U/mL)* (U/mL)*
(mg/mL)*
0,076 0,026 0,431 0,242 0,354 0,075
BH19
±0,014 a ±0,010 b ±0,018 a ±0,028 a ±0,017 a ±0,010 a
0,054 0,030 0,416 0,204 0,254 0,046
BH47
±0,007 b ±0,004 b ±0,018 ab ±0,015 ab ±0,016 c ±0,009 b
0,043 0,016 0,390 0,145 0,226 0,051
BH54
±0,016 b ±0,005 b ±0,032 ab ±0,031 b ±0,002 c ±0,003 b
0,046 0,049 0,361 0,212 0,310 0,052
BH60
±0,007 b ±0,011 a ±0,029 b ±0,029 a ±0,012 b ±0,002 b
0,103 0,024 0,020 0,036 0,060 0,044
BH93
±0,021 a ±0,002 b ±0,011 c ±0,006 c ±0,002 d ±0,005 b
* Os valores apresentados são as médias e desvios padrões de triplicatas. Valores seguidos de letras
diferentes diferem entre si pelo teste de Tukey a p < 0,05.
Com relação à produção de arabinanase, os resultados obtidos no

presente estudo variaram entre 0,04 U/mL (isolados BH54 e BH60) e 0,1 U/mL
(isolado BH93). Embora sejam encontrados vários trabalhos na literatura
descrevendo a clonagem, expressão, purificação e caracterização de arabinanases
de Bacillus sp., são encontrados poucos trabalhos que relatam o estudo de
produção desta enzima. Em um dos poucos trabalhos existentes, Takao, Akiyama e
Sakai (2002) isolaram e avaliaram vários micro-organismos de amostras de solo
quanto a produção de arabinanases. Os autores deste trabalho obtiveram atividades
enzimáticas entre 0,06 e 0,18 U/mL, sendo que um destes micro-organismos
identificado com B. thermodenitrificans apresentou atividade de 0,14 U/mL após 24
horas de cultivo a 60 ºC e 120 rpm de agitação em meio de cultura composto por 0,5
% de arabinogalactana de polpa de beterraba, 0,2 % de (NH4)2SO4, 0,6 % de
KH2PO4, 1,4 % de K2HPO4, 0,02 % de extrato de levedura (m/v), pH 7,0. Em outro
estudo, Seo et al. (2010) testaram 5.000 isolados microbianos através de testes em
placas de Petri para produção de arabinanase e encontraram 7 isolados microbianos
com potencial para produção da enzima, sendo que 4 destes isolados eram
pertencentes ao gênero Bacillus. Os autores deste trabalho avaliaram
129
posteriormente estes 4 isolados através de cultivos a 37 ºC por 3 dias em frascos

agitados contendo meio LB suplementado com 1 % de arabinana (m/v) e obtiveram
atividades de arabinanase de 0,411 U/mL para o isolado B. licheniformis KS12,
0,136 U/mL para B. arsenicus KS48, 0,071 U/mL para B. megaterium KS33 e 0,036
U/mL para B. amyloliquefaciens KS45.
Como observado na Tabela 7, a produção de galactanase no meio de
cultura contendo farelo de trigo pelos 5 isolados de Bacillus sp. avaliados foi baixa,
com valores de atividade oscilando entre 0,016 (BH54) e 0,049 U/mL (BH60). Na
literatura também são encontrados poucos trabalhos sobre a produção de
galactanases por bactérias, assim como trabalhos relatando a utilização de
subprodutos agroindustriais, como o farelo de trigo, na produção desta enzima. Em
um desses estudos, Araujo e Ward (1990) avaliaram 19 linhagens do gênero Bacillus
quanto à produção de mananases e galactanases e obtiveram atividades
enzimáticas de galactanase variando entre 0,1 e 0,5 U/mL após 24 horas de cultivo
a 45 ºC e 200 rpm de agitação em frascos Erlenmeyer de 250 mL com 80 mL de
meio de cultura contendo goma locusta como fonte de carbono (1 % de goma
locusta, 0,1 % de sólidos de maceração de milho, 0,1 % de extrato de levedura, 0,2
% de NaNO3, 0,2 % de KH2PO4, 0,03 % de CaCl2, 0,03 % de MgSO4, 20 % de
extrato de batata e 0,1 % de solução de elementos traços (m/v ou v/v)). Em outro
estudo, Tsumura et al. (1991a) relataram a produção de galactanase por dois
isolados do gênero Bacillus, identificados como S-2 e S-39, e obtiveram atividades
de 0,08 U/mL (isolado S-2) e 0,14 U/mL (isolado S-39) após 40 horas de cultivo a
37 ºC em frascos agitados contendo meio de cultura composto por 2 % de fibra de
soja, 0,5 % de extrato de levedura, 0,5 % de polipeptona, 0,5 % de NaCl, 0,1 % de
K2HPO4, 0,02 % de MgSO4, 1 % de Na2CO3 (m/v), pH 10,0.
Atividades enzimáticas de liquenase superiores a 0,4 U/mL foram
observadas para os isolados BH19 (0,431 U/mL) e BH47 (0,416 U/mL), enquanto o
menor valor foi obtido para o isolado BH93 (0,020 U/mL). Comparativamente, Deka
et al. (2011) relataram atividades máximas de liquenase semelhantes aos valores
observados no presente estudo (aproximadamente 0,4 U/mL) para a linhagem B.
subtilis AS3 após 12 horas de fermentação, a 37 ºC e 180 rpm de agitação,
utilizando o substrato comercial β-glucano de cevada no meio de cultura (1 % de β-
glucano de cevada, 0,5 % de peptona, 0,5 % de extrato de levedura, 0,1 % de
K2HPO4, 0,025 % de MgSO4, 0,025 % de FeSO4, 0,05 % de MnCl2 (m/v), pH 7,0).
130
Em outro trabalho, El-Helow e El-Ahawany (1999) observaram para uma linhagem

mutante de B. subtilis resistente a repressão catabólica por glicose atividades
enzimáticas de liquenase superiores a 80 U/mL, após 24 horas de fermentação a
37 ºC e 200 rpm em meio de cultura contendo 1 % de triptona, 1 % de extrato de
levedura, 1 % de farelo de trigo e 0,2 % de NaCl (m/v), pH 7,0).
Quanto à produção de mananase, as maiores atividades enzimáticas
foram observadas para os isolados BH19 (0,242 U/mL), BH47 (0,204 U/mL) e BH60
(0,212 U/mL). Khanongnuch et al. (1999) ao avaliarem o efeito de diferentes fontes
de carbono na produção de mananase pela linhagem B. subtilis 5H observaram que
o farelo de trigo não era o melhor substrato indutor para produção de mananase e
obtiveram após 24 horas de fermentação em frascos agitados contendo meio de
cultura composto por 1 % de farelo de trigo, 0,2 % de (NH4)2SO4, 0,2 % de extrato de
levedura (m/v) e sais minerais, pH 7,0, a produção de 0,8 U/mL de mananase.
Quando o micro-organismo foi cultivado no mesmo meio de cultura contendo goma
locusta (um substrato comercial com alto teor de galactomanana) foi observado
pelos autores a produção de 7,8 U/mL de mananase. Em outro estudo, Vijayalaxmi
et al. (2013) avaliaram a produção de mananase pela linhagem B. halodurans
PPKS-2 e obtiveram uma alta produção da enzima (95,6 U/mL) após 48 horas de
cultivo a 37 ºC e 200 rpm em frascos Erlenmeyer contendo meio de cultura
composto de sais minerais, 0,5 % de peptona e 1 % de farelo de trigo (m/v), pH 11.
Com relação à produção de xilanase nos cultivos utilizando farelo de trigo,
os melhores resultados foram obtidos para o isolado BH19, com atividade de 0,354
U/mL, seguido pelo isolado BH60 (0,310 U/mL) e a menor produção de xilanase foi
observada para o isolado BH93 (0,06 U/mL). Comparativamente, no estudo
realizado por Stathopoulou et al. (2012) foram obtidas atividades de xilanase de 3,22
e 9,66 nKat/mL (aproximadamente 0,19 e 0,58 U/mL) para duas linhagens de
Bacillus sp. quando cultivadas em meio de cultura mínimo contendo 2 % de farelo de
trigo (m/v) como fonte de carbono entre o 3º e o 5º dia de fermentação. Pham et al.
(1998), como descrito anteriormente, ao estudarem o efeito de diferentes fontes de
carbono na produção de xilanase por B. polymyxa CECT 153 observaram atividades
enzimáticas de aproximadamente 20 nKat/mL (1,2 U/mL) em meio de cultura
contendo 1 % de farelo de trigo (m/v) após 42 horas de incubação a 30 ºC e 250
rpm. Em outro estudo, Geetha e Gunasekaran (2010) obtiveram a maior produção
de xilanase (80 U/mL) pela linhagem B. pumilus B20 quando cultivada a 37 ºC sob
131
agitação por 36 horas em frascos Erlenmeyer de 250 mL com 50 mL de meio de

cultura composto por sais minerais, 0,3 % de peptona, 0,2 % de extrato de levedura
e 1 % de farelo de trigo (m/v), pH 7,5.
Na Figura 13 são apresentadas as cinéticas de produção de xilanase
pelos cinco isolados durante a fermentação submersa em meio de cultura contendo
farelo de trigo como fonte de carbono. Foi observado um pico de produção de
xilanase pelo isolado BH19 após 24 horas de fermentação e o declínio da atividade
com 72 horas, enquanto para o isolado BH60 foi observado o rápido declínio do pico
de atividade máxima após 48 horas de cultivo. Os isolados BH47 e BH54
apresentaram um perfil de produção de xilanase semelhante, com uma produção
inicial de enzima de aproximadamente 0,25 U/mL, que se manteve estável até 48
horas de cultivo e uma ligeira elevação na produção da enzima com 72 horas,
atingindo o mesmo valor obtido para o isolado BH19 neste período
(aproximadamente 0,28 U/mL). Para o isolado BH93 foi observada uma baixa
produção de xilanase que se manteve estável durante todo o período analisado.
Figura 13 - Cinéticas de produção de xilanase pelos isolados BH19, BH47, BH54, BH60 e
BH93 durante fermentação submersa em meio de cultura contendo farelo de trigo
Quanto ao teor proteico nos sobrenadantes de cultivo dos 5 isolados

microbianos avaliados em meio de cultura contendo farelo de trigo, apresentado na
Tabela 7, foi constatado que este foi maior em comparação aos resultados obtidos
anteriormente nos cultivos realizados em CMC, pectina e xilana (Tabela 6), sendo o
maior valor observado para o isolado BH19 (0,075 mg/mL) e o menor valor para o
isolado BH93 (0,044 mg/mL).
132
A partir dos resultados obtidos nos cultivos em farelo de trigo, pode-se

dizer que os isolados BH19, BH47, BH54 e BH60 apresentaram potencial para
serem utilizados em processos para a produção simultânea de hemicelulases
utilizando subprodutos agroindustriais. Embora as atividades enzimáticas analisadas
tenham sido menores do que as reportadas em alguns trabalhos na literatura, a
produção destas enzimas poderá ser melhorada a partir do estudo de otimização
das condições de fermentação de cada isolado. O isolado BH19 foi selecionado para
ser utilizado nas próximas etapas deste trabalho devido às características de rápido
crescimento observadas visualmente nas diferentes fontes de carbono testadas,
pelas maiores atividades enzimáticas e teor proteico no sobrenadante do meio de
cultura contendo farelo de trigo e pelos bons resultados obtidos para produção de
endoglucanase e poligalacturonase nos cultivos em CMC e pectina cítrica,
respectivamente.

isolados de Bacillus sp.

baseado na sequência do gene RNAr 16S
O uso de dados de sequências de nucleotídeos do gene RNAr 16S é
considerado uma das formas mais práticas e adequadas não só para identificação
de micro-organismos, mas também para estabelecer relações filogenéticas entre
estes, pois apresenta distribuição universal entre os organismos e regiões variáveis
entre as espécies (Case et al., 2007; Chandna; Mallik; Kuhad, 2013; Das et al.,
2014). Neste sentido, os 20 isolados de Bacillus sp. selecionados neste trabalho
para a avaliação quantitativa quanto ao potencial para produção de hidrolases
glicosídicas por fermentação submersa tiveram o gene RNAr 16S amplificado a partir
do DNA genômico, purificado e sequenciado visando a identificação e a
caracterização taxonômica destes.
Na Figura 14 é apresentada a análise eletroforética em gel de agarose
1 % (m/v) do produto da amplificação por PCR do gene RNAr 16S de cada isolado.
A amplificação deste gene com os oligonucleotídeos iniciadores p27f e p1492r gerou
fragmentos de aproximadamente 1.500 pb, que estão de acordo com a predição
teórica. Estes fragmentos após purificação, foram utilizados nas reações de
133
sequenciamento, onde foram obtidas sequências de nucleotídeos de boa qualidade

com tamanho de 1.409 pb. O alinhamento destas sequências com as sequências
depositadas nos bancos de dados ezTaxon e GenBank revelou alta identidade
(acima de 99 %), principalmente, com linhagens de B. subtilis, B. licheniformis, B.
sonorensis, B. tequilensis e B. aerius.
Figura 14 – Eletroforese em gel de agarose do produto da amplificação do gene RNAr 16S

para os 20 isolados de Bacillus sp. selecionados para avaliação quanto à produção de
hidrolases glicosídicas por fermentação submersa
(M: 1 kb Plus DNA Ladder (Invitrogen); 1: BH2; 2: BH19; 3: BH24; 4: BH26; 5: BH27; 6: BH28; 7:
BH32; 8: BH35; 9: BH41; 10: BH47; 11: BH54; 12: BH56; 13: BH60; 14: BH62; 15: BH87; 16: BH88;
17: BH92; 18: BH93; 19: BH99; 20: BH104)
As sequências do gene RNAr 16S de linhagens do gênero Bacillus

depositadas nos bancos de dados com similaridade acima de 97 % com as
sequências obtidas neste trabalho foram utilizadas para a construção da árvore
filogenética apresentada na Figura 15. Na árvore filogenética gerada a partir das
sequências do gene RNAr 16S foi observada a divisão dos isolados utilizados neste
estudo, com um valor de bootstrap de 91 %, em dois grandes grupos monofiléticos.
Estes dois grupos foram chamados de Bl e Bs. O grupo Bl foi composto por 17
isolados, 3 linhagens de B. licheniformis e pelas linhagens B. sonorensis e B. aerius.
O grupo Bs foi formado por 3 isolados (BH27, BH93 e BH104), por linhagens de B.
subtilis e várias linhagens estreitamente relacionadas, como B. amyloliquefaciens, B.
mojavensis, B. tequilensis, B. siamensis, entre outras.
A maioria dos isolados avaliados (15 isolados) apresentou sequências de
nucleotídeos similares e consequentemente alta proximidade evolutiva, não sendo
134
possível diferenciá-los como observado na árvore filogenética. Por outro lado, os

isolados BH19 e BH28 apresentaram uma pequena diferenciação dentre as
linhagens do grupo Bl. Segundo a literatura, as linhagens B. sonorensis e B. aerius
são muito próximas filogeneticamente de B. licheniformis, as sequências RNAr 16S
possuem acima de 99 % de similaridade, e a distinção destas 3 linhagens só é
possível através da análise de características fenotípicas e outras características
moleculares, como o sequenciamento de outros genes conservados do genoma
bacteriano (genes housekeeping), como por exemplo os genes gyrB (subunidade β
da DNA girasse) e rpoB (subunidade β da RNA polimerase) (Palmisano et al., 2001;
Shivaji et al., 2006). Diante da proximidade filogenética destas 3 linhagens e pelo
fato das sequências de nucleotídeos do gene RNAr 16S obtidas neste estudo
apresentarem alta identidade com sequências depositadas de B. licheniformis, os
isolados reunidos no grupo Bl foram então considerados como sendo possíveis
linhagens de B. licheniformis.
Os isolados BH27, BH93 e BH104 também exibiram alta proximidade
evolutiva entre si e pelo fato de terem apresentado maior identidade da sequência
do gene RNAr 16S com linhagens de B. subtilis e outras linhagens estreitamente
relacionadas, estes foram considerados como sendo possíveis linhagens de B.
subtilis. Assim, como acontece com B. licheniformis, as linhagens de B. subtilis
apresentam alta similaridade (acima de 98,9 %) da sequência do gene RNAr 16S
com B. amyloliquefaciens, B. mojavensis, B. atrophaeus, B. vallismortis, B.
tequilensis e B. siamensis e a confirmação da identificação destas linhagens ocorre
por associação com resultados de características fenotípicas e características
moleculares (Chun; Bae, 2000; Gatson et al., 2006; Wang et al. 2007). Estudos
taxonômicos recentes baseados em comparações das sequências do gene RNAr
16S e do espaço intergênico entre as subunidades 16S-23S do RNAr indicam que
as linhagens de B. licheniformis são também estreitamente relacionadas com B.
subtilis e B. amyloliquefaciens (Xu; Côté, 2003).
135
BH88
BH92
BH87
BH62
BH60
BH56
BH54
87
BH47
BH41
BH35
BH32
Grupo Bl
BH26
56
BH24
BH02
BH99
55 BH19
99 Bacillus sonorensis NBRC 101234 (AYTN01000016)
Bacillus licheniformis NBRC 12200 (NR113588)
Bacillus licheniformis ATCC14580 (AE017333)
69 Bacillus aerius 24K (AJ831843)
91 Bacillus licheniformis BCRC 11702 (NR116023)
BH28
Bacillus atrophaeus JCM9070 (AB021181)
Bacillus subtilis subsp. spizizenii NRRLB-23049 (CP002905)
58 Bacillus siamensis KCTC13613 (AJVF010043)
92
53 Bacillus vallismortis DV1-F-3 (JH600273)
Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42 (CP000560)
6660
68 Bacillus methylanotrophicus CBMB205 (EU194897)
Bacillus amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens DSM7 (FN597644)
96 Bacillus subtilis subsp. inaquosorum KCTC13429 (AMXN 01000021) Grupo Bs
Bacillus mojavensis RO-H-1 (JH600280)
Brevibacterium halotolerans DSM8802 (AM747812)
Bacillus tequilensis KCTC13622 (AYTO01000043)
Bacillus subtilis subsp. subtilis NCIB3610 (ABQL01000001)
BH27
BH93
62 BH104
98 Bacillus safensis FO-36b (ASJD01000027)
Bacillus pumilus ATCC7061 (ABRX01000007)
Bacillus stratosphericus 41KF2a (AJ831841)
99
97
Bacillus altitudinis 41KF2b (ASJC01000029)
98 Bacillus aerophilus 28K (AJ831844)
Bacillus xiamensis HYC-10 (AMSH0100014)
Bacillus acidicola 105-2 (AF547209)
Bacillus humi LGM22167 (AJ627210)
Bacillus circulans ATCC4513 (AY724690)
93 Bacillus megaterium IAM13418 (D16273)
Paenibacillus polymyxa ATCC842 (AFOX01000032)
0.01
Figura 15 – Árvore filogenética baseada no método neighbor-joining usando sequências do

gene RNAr 16S de isolados do gênero Bacillus
*A porcentagem de bootstrap após 1.000 simulações é mostrada ao lado dos ramos da árvore e a
sequência do gene 16S RNAr de Paenibacillus polymyxa foi usada como grupo de fora. Os números
de acesso das sequências utilizadas do GenBank do NCBI são apresentados entre parênteses.
136
Com o objetivo de validar os resultados da árvore filogenética baseada

nas sequências do gene RNAr 16S, foi realizada a caracterização taxonômica de 2
isolados utilizando dados de características fisiológicas e de metabolismo bioquímico
e também de testes rápidos comerciais de identificação (API 50CHB e Vitek 2 –
BioMérieux). Para esta caracterização foram selecionados os isolados BH19 e BH27
para representarem os demais isolados dos grupos Bl e Bs, respectivamente. Na
Tabela 8 são apresentados os resultados da análise de características de
morfologia, fisiologia e metabolismo bioquímico destes dois isolados.
Os dois isolados avaliados apresentaram características morfológicas
típicas que suportam seus alinhamentos com o gênero Bacillus, ou seja, são
bactérias Gram-positivas, em forma de bastonetes e formadoras de endósporos. Os
dados obtidos no sistema Vitek 2 para o isolado BH19 confirmaram, com 94 % de
probabilidade (valor acima do limite mínimo aceitável de 85 % deste teste), que este
isolado trata-se de uma linhagem de B. licheniformis. Este resultado também foi
suportado pela comparação das características fisiológicas e bioquímicas
apresentadas na Tabela 8 com dados da literatura de referência.
O isolado BH27 foi confirmado se tratar de uma linhagem de B. subtilis
através da comparação dos resultados obtidos nos testes bioquímicos e fisiológicos
com a literatura e também pelo teste comercial API 50CHB, que apresentou 98 % de
probabilidade para esta espécie, valor acima do limite mínimo aceitável de 80 %
deste teste para confirmar a identificação de um micro-organismo.
137
Tabela 8 – Características morfológicas, fisiológicas e bioquímicas dos isolados Bacillus sp.

BH19 e BH27
Resultados
Testes
BH19 BH27
Testes morfológicos
Cor creme creme
Forma irregular circular plana
Margem ondulada/irregular irregular
Superfície rugosa rugosa
Textura cremosa/mucoide cremosa
opaca (com zonas de
Brilho/opacidade opaca
brilho)
Forma bastonete bastonete
Gram positivo positivo
Arranjo isolados, em pares grupo, em pares
Presença esporos sim sim
Forma do esporo cilíndrico cilíndrico
subterminal (sem subterminal (sem
Posição na célula
intumescimento) intumescimento)
Testes bioquímicos e fisiológicos
Catalase + +
Oxidase + -
Indol - -
Motilidade + +
Redução de NO3 + +
Tríplice açúcar ferro (TSI) acidificação acidificação
Requerimento de O2 anaeróbio facultativo aeróbio
Metabolismo de glicose oxidativo e fermentativo oxidativo e fermentativo
Gelatina + +
Citrato NR +
Caseína + +
Amido + +
Voges-Proskauer (VP) + +
Ágar batata dextrose (PDA) NR rósea
Crescimento a 50 ºC NR +
Crescimento pH 8,0 NR +
Lisina + NR
Esculina + NR
Fenilalanina + NR
Propionato + NR
(NR: parâmetros não analisados)
138
Estudos mostram que linhagens de B. licheniformis e B. subtilis podem

ser capazes de sobreviver a condições extremas de temperatura, pH, secagem e ao
tratamento de pasteurização UHT e por isso são relatadas como sendo
contaminantes de alguns processos industriais na área de alimentos (De Clerck; De
Vos, 2004; Pirttijärvi; Anderson; Salkinoja-Salonen, 2000). A confirmação da
identidade de isolados deste estudo como sendo linhagens de B. licheniformis e B.
subtilis é interessante, pois estas bactérias são industrialmente importantes devido à
sua capacidade de secretar no meio de cultura grandes quantidades de enzimas,
como proteases, amilases, lipases, entre outras, e também por serem produtoras de
antibióticos, inseticidas e compostos importantes como ácido cítrico, inosina, ácido γ-
poliglutâmico, polihidroxibutirato e 2,3-butanediol (Li et al., 2013; Rey et al., 2004;
Zhang; Zhang, 2010). Linhagens de B. licheniformis e B. subtilis também apresentam
status GRAS (Generally Reconized As Safe) pela Food and Drug Administration
(FAD) (Schallmey; Singh; Ward, 2004), ou seja, são reconhecidamente seguras
para o homem e para os animais, assim como os insumos por elas produzidas. Nos
genomas de B. licheniformis e B. subtilis é relatada a presença de genes para várias
hidrolases glicosídicas, como α-L-arabinofuranosidase, arabinanase, β-glicosidase,
arabinogalactanase, endoglucanase, mananase, xilanase, pectato liase, pectina
metil esterase e amilase (Veith et al., 2004). Além disso, linhagens de B.
licheniformis e B. subtilis podem produzir enzimas utilizadas na degradação da
lignina presente na biomassa lignocelulósica, como as lacases (Furtado et al., 2013;
Lu et al. 2012).
4.1.2.2. Análise da diversidade genética dos isolados de Bacillus sp.

por ARDRA
A análise da sequência do gene RNAr 16S é a forma mais utilizada para a
diferenciação taxonômica de bactérias. No entanto, pelo fato desta sequência ser
altamente conservada, não é possível diferenciar espécies relacionadas em alguns
gêneros e também avaliar a diversidade intraespecífica de micro-organismos com
elevada similaridade genética (Porwal et al., 2009; Shaver et al., 2001).
Como foi observado na caracterização taxônomica baseada na sequência
do gene RNAr 16S que a maioria dos 20 isolados de Bacillus sp. selecionados para
avaliação quantitativa neste trabalho eram estreitamente próximos, foi realizada a
análise da diversidade genética destes através da técnica de ARDRA. A técnica de
139
ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) se baseia no princípio de

que os padrões de restrição enzimática e o grau de conservação dos sítios de
restrição do RNAr podem refletir padrões filogenéticos indicando a diversidade
microbiana (Reis Junior; Reis; Teixeira, 2006).
Os primeiros testes para avaliar a diversidade genética dos 20 isolados de
Bacillus sp. deste estudo através da técnica de ARDRA foram realizados utilizando o
produto da amplificação do gene RNAr 16S com os oligonucleotídeos iniciadores
p27f e p1492r e as enzimas de restrição XhoI, EcoRI e HindIII, porém não foram
observadas diferenças nos padrões de restrição enzimática dos isolados avaliados
com esta estratégia. Possivelmente isto ocorreu devido a alta similaridade das
sequências do gene RNAr 16S dos isolados e a natureza altamente conservada
deste gene. Então, para o estudo da diversidade intraespecífica neste trabalho foi
realizada a amplificação da chamada região intergênica entre as subunidades 16S-
23S do gene RNAr, também conhecida como região ITS, como sugerido em alguns
trabalhos na literatura para este tipo de análise (Araújo et al., 2010). Esta é uma
região que possui uma variabilidade muito maior na composição de bases como
também em tamanho, número de cópias e posição no genoma em comparação a
subunidade 16S do RNAr (Shaver et al., 2001).
A amplificação da região intergênica 16S-23S do RNAr com os
oligonucleotídeos iniciadores p23s e pHr resultou em 2 a 3 fragmentos dependendo
do micro-organimo avaliado com tamanho entre 800 e 1.000 pb. Reis Junior, Reis e
Teixeira (2006) também observaram a variação no tamanho e número de fragmentos
amplificados de acordo com o isolado avaliado quando realizaram a amplificação da
região intergênica 16S-23S para isolados de Azospirillum amazonense.
Na Figura 16 são apresentados os perfis de restrição dos 20 isolados de
Bacillus sp. e das 5 linhagens de referência do gênero Bacillus obtidos a partir da
digestão do produto da amplificação da região ITS com as enzimas de restrição CfoI,
HaeIII, RsaI e AluI. Foram observados diferentes perfis de bandeamento nos géis de
agarose após a clivagem do produto da amplificação da região ITS, sendo que estes
variaram tanto em número de fragmentos formados como em tamanho. Diferenças
nos perfis de restrição entre os 20 isolados avaliados nos testes quantitativos deste
estudo foram observadas principalmente quando se utilizou as enzimas de restrição
CfoI, RsaI e AluI, ao contrário da enzima HaeIII que apresentou o mesmo perfil de
bandas para quase todos os isolados.
140
Figura 16 – Perfis de restrição gerados na digestão dos produtos da amplificação da região

intergênica 16S-23S do gene RNAr de isolados do gênero Bacillus com as enzimas de
restrição CfoI (a), HaeIII (b), RsaI (c) e AluI (d)
(M: 1 kb Plus DNA Ladder (Invitrogen); 1: B. subtilis; 2: B. pumilus; 3: B. licheniformis; 4: BH19; 5:
BH27; 6: BH47; 7: BH54; 8: BH62; 9: B104; 10: BH2; 11: BH24; 12: BH26; 13: BH28; 14: BH32; 15:
BH35; 16: BH41; 17: BH56; 18: BH60; 19: BH87; 20: BH88; 21: BH92; 22: BH93; 23: BH99; 24: B.
cereus; 25: B. megaterium).
A partir da análise dos perfis de restrição dos micro-organismos avaliados

pela técnica de ARDRA, foi construída a árvore filogenética apresentada na Figura
17 para avaliar a similaridade destes. Foi verificada a existência de diversidade
genética entre a maioria dos 20 isolados de Bacillus sp. ao nível intraespecífico,
exceto para os isolados BH24 e BH32 que não apresentaram diferenciação entre si,
assim como os isolados BH87 e BH99. Ao contrário da árvore filogenética baseada
nas sequências do gene RNAr 16S, onde houve a divisão dos isolados em 2
grandes grupos e não foi possível diferenciar a maioria dos isolados, na árvore
filogenética baseada na técnica de ARDRA foi possível visualizar a heterogeneidade
existente entre os isolados e as linhagens de referência de Bacillus utilizadas e a
divisão destes em 6 grupos distintos.
141
Figura 17 – Árvore filogenética baseada nos dados dos perfis de restrição da região
intergênica 16S-23S do gene RNAr de isolados do gênero Bacillus com as enzimas de
restrição CfoI, HaeIII, RsaI e AluI
Como a árvore filogenética da Figura 17 foi baseada em outra região do

gene RNAr, distinta da região da subunidade 16S que foi utilizada para a construção
da árvore filogenética da Figura 15, foram observadas diferenças nos agrupamentos
entre os isolados microbianos e também com as linhagens de referência do gênero
Bacillus utilizadas nesta análise. Essas diferenças observadas no agrupamento dos
isolados com as linhagens de referência também podem ser decorrentes da alta
variabilidade da região ITS que muitas vezes não apresenta um mesmo padrão de
identidade entre linhagens pertencentes à uma mesma espécie, assim como foi
observado por Ruiz et al. (2000) ao avaliar a técnica de ARDRA utilizando a região
ITS para identificação de bactérias ácido acéticas isoladas de amostras de vinho.
Os isolados BH02, BH19, BH24, BH26, BH32, BH35, BH41, BH47, BH54
e BH62 identificados como possíveis linhagens de B. licheniformis foram reunidos
com esta linhagem de referência no Grupo 1, assim como o isolado BH27,
142
previamente identificado como uma linhagem de B. subtilis. Os isolados BH28,

BH56, BH60, BH87, BH88, BH92 e BH99, identificados como possíveis linhagens de
B. licheniformis, não apresentaram similaridade com nenhuma das linhagens de
referência e foram reunidos no Grupo 2. O isolado BH104, anteriormente identificado
como uma linhagem de B. subtilis, apresentou maior similaridade com a linhagem B.
pumilus nesta análise e ambas foram reunidas no Grupo 3. O Grupo 4 foi formado
apenas pelo isolado BH93, enquanto as linhagens referência B. megaterium e B.
cereus foram reunidas no grupo 5. A linhagem B. subtilis apresentou as maiores
diferenças nos perfis de restrição e ficou mais distante dos demais micro-
organismos, formando sozinha o Grupo 6.
Segundo Araújo et al. (2010), as informações contidas nos padrões
gerados na técnica de ARDRA são limitadas e podem gerar alguns agrupamentos
falso-positivos quando utilizada para identificação microbiana, por isso a técnica é
mais indicada como uma triagem para a verificação da proximidade entre espécies
relacionadas. Portanto, pode-se dizer que os resultados obtidos no presente estudo
para a análise de ARDRA da região ITS não são indicados para estabelecer
relações comparativas com os resultados baseados nas sequências do gene RNAr
16S como ocorre em muitos trabalhos que realizam esta técnica, pois aqui foi
utilizada outra região do gene RNAr e por isso foram observadas diferenças quanto
ao agrupamento com as linhagens referência do gênero utilizadas. As informações
obtidas pela técnica de ARDRA neste estudo não ajudaram a confirmar a identidade
dos isolados de Bacillus sp. avaliados, porém foram válidas para demonstrar a
existência de alta diversidade genética entre estes, assim como foi observado
previamente pelas diferenças nos potenciais para produção de hidrolases
glicosídicas durante as avalições qualitativas e quantitativas. Além disso, a técnica
de ARDRA se mostrou uma forma rápida e barata sem a necessidade de
sequenciamentos de genes para a avaliação do polimorfismo genético dos isolados
microbianos.
Comparativamente, Wahyudi, Prasojo e Mubarik (2010) avaliaram a
diversidade genética de 22 isolados de Bacillus sp. produtores de compostos
antifúngicos através da técnica de ARDRA utilizando o gene RNAr 16S amplificado
destes isolados para a análise e as enzimas de restrição HinfI, HaeIII e RsaI.
Baseado nos perfis de restrição os isolados foram discriminados em 8 grupos
distintos. Posteriormente, os autores realizaram a identificação baseado na
143
sequência do gene RNAr 16S de alguns isolados e encontraram que isolados de 3

grupos diferentes no ARDRA se tratavam de linhagens de Bacillus cereus e outros 2
isolados de grupos diferentes foram identificados como sendo linhagens de Bacillus
subtilis.
Em outro estudo, Yadav et al. (2011) realizaram a avaliação da
diversidade genética por ARDRA e a identificação de 49 isolados do gênero Bacillus
promotores do crescimento de plantas obtidos a partir de amostras de solos ácidos.
A avaliação dos perfis de restrição dos produtos da amplificação do gene RNAr 16S
com as enzimas de restrição AluI, HaeIII e MspI, revelou a existência de elevada
diversidade genética entre os isolados com a diferenciação destes em 9 grupos. Na
árvore filogenética construída a partir das sequências RNAr 16S de isolados
representativos de cada grupo de ARDRA foi observada a divisão destes em 5
grupos.
Chandna, Mallik e Kuhad (2013) realizaram a identificação taxonômica e a
diferenciação por ARDRA de 33 isolados microbianos utilizando o produto da
amplificação do gene RNAr 16S. A identificação taxonômica agrupou os isolados em
4 classes, sendo elas Bacillus, Actinobactérias, β-Proteobactérias e γ-
Proteobactérias. No caso da classe Bacillus foi observada a diferenciação dos
isolados em B. subtilis, B. pumilus, B. licheniformis, B. flexus, entre outros, e o
agrupamento das linhagens próximas. Quando foi feita a análise de ARDRA dos 33
isolados utilizando as enzimas de restrição HinfI, HpaII e MspI, estes foram divididos
em 11 grupos. Assim como neste trabalho, os autores também observaram
diferenças nos agrupamentos dos isolados quando compararam as relações
filogenéticas obtidas no sequenciamento do gene RNAr 16S com os resultados da
técnica de ARDRA. Alguns isolados de espécies diferentes foram reunidos em um
mesmo grupo ou foram observadas maiores distâncias evolutivas entre linhagens da
mesma espécie na árvore filogenética construída a partir dos resultados de ARDRA.
No entanto, segundo os autores a técnica de ARDRA também serviu como um
método rápido e de baixo custo para a diferenciação dos isolados.
144
4.2. Etapa experimental 2 - “Otimização da produção de hemicelulases por

B. licheniformis CBMAI 1609 utilizando subprodutos agroindustriais”
4.2.1. Efeitos de fontes de carbono, nitrogênio, sais minerais e aditivos

na fermentação de B. licheniformis CBMAI 1609 e produção de
xilanase
As fontes de carbono são um dos constituintes essenciais nos meios de
cultura microbianos, podendo influenciar no crescimento celular, no metabolismo e
na produção de enzimas (Nagar et al., 2012; Sharma, Adhikari; Satyanarayana,
2007). As xilanases microbianas são geralmente produzidas quando o micro-
organismo é cultivado em meio de cultura suplementado com xilana ou hidrolisados
de xilana como fonte de carbono (Haddar et al., 2012). Como o custo da xilana pura
comercial é alto e inviável para o uso em processos fermentativos industriais tem-se
buscado a utilização de fontes de carbono alternativas e mais baratas para a
produção de xilanases, como, por exemplo, os subprodutos agroindustriais (Geetha;
Gunasekaran, 2010; Haddar et al., 2012).
Neste sentido, foi avaliado o efeito de diferentes subprodutos
agroindustriais como fontes de carbono na produção de xilanase por Bacillus
licheniformis CBMAI 1609. Na Tabela 9 são apresentados os subprodutos
agroindustriais avaliados neste estudo e informações sobre suas composições, de
acordo com informações disponíveis na literatura. É possível observar na Tabela 9
que os subprodutos agroindustriais utilizados apresentam, normalmente, em sua
composição teores variáveis de celulose, hemicelulose e lignina que podem
influenciar de diferentes formas o crescimento microbiano e a produção enzimática
de xilanase. Os subprodutos agroindustriais derivados da cana-de-açúcar
apresentam em sua composição altos teores de celulose (acima de 40 %), assim
como a madeira de eucalipto, a palha de milho e o farelo de arroz. Os maiores
teores de hemicelulose estão presentes no farelo de trigo e bagaço de cevada.
Baixos teores de lignina são observados no bagaço de cana-de-açúcar tratado com
explosão a vapor e deslignificação alcalina, bagaço de laranja e farelo de soja.
145
Tabela 9 – Composição dos subprodutos agroindustriais utilizados neste estudo de acordo

com dados disponíveis na literatura
Subproduto Celulose Hemicelulose Lignina Cinzas
Referência
agroindustrial (%)* (%)* (%)* (%)*
Bagaço de cana-de- Rocha et al.,
43,1 25,2 22,9 2,8
açúcar in natura 2012
Bagaço de cana-de-
Rocha et al.,
açúcar tratado por 57,5 6,6 32,5 2,8
2012
explosão a vapor
Bagaço de cana-de-
açúcar tratado por
Rocha et al.,
explosão a vapor e 86,8 4,0 6,1 3,3
2012
deslignificação
alcalina
Mussatto;
Bagaço de cevada 16,8 28,4 27,8 4,6
Roberto, 2006
Mamma;
Kourtoglou;
Bagaço de laranja 16,2 13,8 1,0 1,7
Christakopoulos,
2008
Graminha et al.,
Farelo de arroz 35,0 25,0 17,0 ND
2008
Rodríguez-
Farelo de soja 34,6 18,1 9,8 ND Zúñiga et al.,
2011
Menon; Rao,
Farelo de trigo 10,5 – 14,8 35,5 – 39,2 8,3 – 12,5 ND
2012
Menon; Rao,
Madeira de eucalipto 45,0 – 51,0 11,0 – 18,0 29,0 ND
2012
Menon; Rao,
Palha de milho 35,1 – 39,5 20,7 – 24,6 11,0 – 19,1 ND
2012
(ND: valor não avaliado pelas fontes consultadas). * Os valores apresentados na tabela foram
baseados em % de massa seca
Na Figura 18 são apresentados os resultados de atividade enzimática de

xilanase observados nas diferentes fontes de carbono avaliadas na concentração de
1 % (m/v) após 48 horas de cultivo. No cultivo realizado em meio de cultura
contendo xilana de madeira faia, considerada como fonte de carbono controle, foi
obtida atividade enzimática de 0,3 U/mL. As combinações dos substratos bagaço de
laranja e farelo de soja assim como de farelo de soja e farelo de trigo favoreceram a
produção de xilanase pelo micro-organismo, sendo observado nestes cultivos
atividades enzimáticas de 0,63 U/mL e 0,55 U/mL, respectivamente. Como
observado na Tabela 9, estes substratos (bagaço de laranja, farelo de soja e farelo
de trigo) normalmente apresentam em sua composição baixo teor de lignina, que
pode ser uma barreira física para a utilização da celulose e hemicelulose pelo micro-
organismo. Quando se utilizou os subprodutos agroindustriais de forma individual, os
146
melhores resultados (0,46 U/mL) foram verificados com os farelos de soja e de trigo.
Nos cultivos realizados em meio de cultura contendo bagaço de cana-de-açúcar (in
natura ou submetido à pré-tratamentos) e madeira de eucalipto foi observado
visualmente o crescimento microbiano, porém foram obtidas baixas atividades
enzimáticas de xilanase. Uma possível explicação para a baixa produção de xilanase
observada nestes cultivos seria o baixo teor de hemicelulose e os altos teores de
lignina e celulose presentes nestes substratos (Tabela 9).
Figura 18– Efeitos de diferentes fontes de carbono sobre a produção de xilanase por B.
(XIL: xilana de madeira faia; BEX: bagaço de cana-de-açúcar tratado com explosão a vapor; BED:
bagaço de cana-de-açúcar tratado com explosão a vapor e deslignificação alcalina; BIN: bagaço de
cana-de-açúcar in natura; CEV: bagaço de cevada; LAR: bagaço de laranja; SOJ: farelo de soja; TRI:
farelo de trigo; EUC: madeira de eucalipto; MIL: palha de milho; SOJ+ARR: combinação farelo de
soja e farelo de arroz; SOJ+BEX: combinação farelo de soja e bagaço de cana-de-açúcar tratado
com explosão a vapor; SOJ+LAR: combinação farelo de soja e bagaço de laranja; SOJ+TRI:
combinação farelo de soja e farelo de trigo; TRI+BEX: combinação farelo de trigo e bagaço de cana-
de-açúcar tratado com explosão a vapor)
A combinação farelo de soja e bagaço de laranja foi escolhida para ser

utilizada como fonte de carbono nas demais etapas deste estudo, pois durante a
cinética de produção da enzima pelo micro-organismo foi observada a manutenção
da atividade de xilanase em aproximadamente 0,6 U/mL após 72 horas de cultivo no
meio de cultura contendo esta combinação enquanto para o meio de cultura
contendo a combinação farelo de soja e farelo de trigo foi observada uma queda da
147
atividade enzimática para 0,32 U/mL neste período, possivelmente pelo

esgotamento dos nutrientes e produção de proteases (dados não apresentados).
Além disso, estes dois subprodutos agroindustriais (farelo de soja e bagaço de
laranja) são gerados em grandes quantidades no país e possuem baixo valor de
comercialização, sendo empregados principalmente como constituintes de ração
animal.
Comparativamente, nos estudos realizados por Prakash et al. (2012)
sobre o efeito de diferentes fontes de carbono na produção de xilanase por B.
halodurans PPKS-2, também foi constatado um aumento na produção da enzima
quando utilizou-se 1 % (m/v) de subprodutos agroindustriais como fonte de carbono
em comparação aos resultados observados no meio de cultura controle que continha
0,2 % (m/v) de xilana comercial. Segundo esses autores as maiores atividades
enzimáticas foram alcançadas quando se utilizou palha de milho, bagaço de cana-
de-açúcar, melaço ou farelo de arroz. Em outro estudo, Bajaj e Manhas (2012)
verificaram que o micro-organismo B. licheniformis P11(C) foi capaz de produzir
xilanase em quantidades semelhantes aos resultados obtidos em meio de cultura
contendo xilana comercial com a utilização de 1 % (m/v) de farelo de trigo ou farelo
de arroz como fonte de carbono.
Sanghi et al. (2009), ao avaliarem os efeitos de diferentes fontes de
carbono na produção de xilanase por B. subtilis ASH também observaram o
aumento da produção da enzima quando utilizaram no meio de cultura 2 % (m/v) de
farelo ou palha de trigo em substituição ao conteúdo de xilana comercial. Em outro
estudo, Yasinok et al. (2010) relataram que o micro-organismo B. pumilus SB-M13
foi capaz de produzir xilanase utilizando como fonte de carbono 2 % (m/v) de palha
de milho, bagaço de algodão, farelo de trigo ou farelo de cevada. Outros trabalhos
na literatura também relatam bons resultados de produção de xilanase para
linhagens do gênero Bacillus com a utilização de hidrolisados de bagaço de cana-
de-açúcar e de grama, serragem de eucalipto, bagaço e cascas de laranja, farelo de
cevada, palha de sorgo e principalmente farelo e palha de trigo (Adhyaru; Bhatt;
Modi, 2014; Bocchini et al., 2005; Damiano et al., 2003; Haddar et al., 2012; Kappor;
Nair; Kuhad, 2008; Nagar et al., 2010; Sharma; Adhikari; Satyanarayana, 2007).
A natureza e o tipo da fonte de nitrogênio utilizada nos meios de cultura
também podem afetar em grande extensão o crescimento microbiano e a produção
de xilanase (Kapoor; Nair; Kuhad, 2008). Assim, no presente trabalho foi avaliada a
148
influência da adição de fontes de nitrogênio inorgânicas, orgânicas e de subprodutos

agroindustriais ricos em nitrogênio sobre a produção de xilanase por B. licheniformis
CBMAI 1609. Nestes experimentos foi utilizado o meio de cultura contendo como
fonte de carbono a combinação 1:1 (m/m) de bagaço de laranja e farelo soja. Os
resultados obtidos de produção de xilanase com as diferentes fontes de nitrogênio
após 48 horas de cultivo estão apresentados na Figura 19.
No meio de cultura controle que continha como fonte de nitrogênio 0,2 %
(m/v) de nitrato de sódio e 0,02 % (m/v) de peptona foi observada uma produção de
xilanase de aproximadamente 0,6 U/mL, após 48 horas de cultivo. A maior produção
enzimática de xilanase, aproximadamente 1,4 U/mL, foi obtida no meio de cultura
contendo caseína como fonte de nitrogênio, o que correspondeu a um aumento na
produção de xilanase de cerca de 125 % em comparação aos resultados obtidos no
meio de cultura controle. A segunda melhor fonte de nitrogênio foi a combinação
sulfato de amônio e farinha de pena que apresentou atividade de xilanase de 1,03
U/mL. Também foram observados ligeiros aumentos na produção da enzima quando
se utilizou como fontes de nitrogênio o extrato de carne, a soja moída e a
combinação sulfato de amônio e triptona. O pior resultado (0,3 U/mL) foi observado
com a utilização de farinha de pena, um subproduto de frigoríficos de aves. Esse
subproduto agroindustrial apresenta em sua constituição cerca de 92 % de proteínas
e também altas concentrações de aminoácidos essenciais (Lu; Haga; Satoh, 2014).
As demais fontes de nitrogênio avaliadas tiveram pouca influenciaram na produção
de xilanase pelo micro-organismo e apresentaram resultados similares aos obtidos
no meio de cultura controle (Figura 19).
Para os experimentos posteriores deste estudo foi escolhida como fonte
de nitrogênio a caseína, pois esta apresentou uma combinação balanceada e
acessível de aminoácidos, peptídeos e vitaminas que favoreceu a produção de
xilanase por B. licheniformis CBMAI 1609 e, além disso, esta possui um custo menor
em comparação as outras fontes de nitrogênio orgânicas e aparentemente não
estimulou a produção de proteases.
149
Figura 19 – Efeitos de diferentes fontes de nitrogênio sobre a produção de xilanase por B.

(CON: controle (0,2 % de nitrato de sódio e 0,02 % de peptona (m/v)); CLO: cloreto de amônio; NIT:
nitrato de amônio; SUL: sulfato de amônio; CAS: caseína; EXC: extrato de carne; EXL: extrato de
levedura; PEP: peptona; TRP: triptona; PEN: farinha de pena; MIC: milhocina; SOM: soja moída;
SUL+PEN: combinação sulfato de amônio e farinha de pena; SUL+TRP: combinação sulfato de
amônio e triptona; PEN+MIC: combinação farinha de pena e milhocina)
No estudo realizado por Bajaj e Manhas (2012) sobre o efeito de

diferentes fontes orgânicas de nitrogênio sobre a produção de xilanase por B.
licheniformis P11(C), foi obtida uma maior produção enzimática com a utilização de 1
% (m/v) de caseína, sendo que esta proporcionou um aumento de 28,6 % na
produção da enzima em relação ao meio de cultura controle contendo 1 % (m/v) de
nitrato de amônio. Em outro estudo, Yang, Zhuang e Jeffries (1995) também
observaram o aumento da produção de xilanase pela linhagem Bacillus sp. (V1-4),
após 48 horas de cultivo, quando utilizaram 1 % (m/v) de caseína ou farelo soja em
substituição a combinação 0,5 % (m/v) de extrato de levedura e 0,5 % (m/v) de
peptona.
Comparativamente, Subramaniyan, Sandhia e Prema (2001) avaliaram os
efeitos de diferentes fontes de nitrogênio na produção de xilanase por Bacillus SPP-
34 sem a presença de proteases e obtiveram os melhores resultados utilizando uma
combinação de 0,25 % (m/v) de peptona e 0,25 % (m/v) de extrato de levedura.
Segundo estes autores a combinação dessas duas fontes de nitrogênio libera NH4+,
que pode estimular o crescimento microbiano e ao mesmo tempo aumentar o
150
rendimento da produção de xilanase, pois este é também um inibidor natural de

proteases. Nos estudos realizados por Adhyaru, Bhatt e Modi (2014) sobre o efeito
de fontes de nitrogênio sobre a produção de xilanase por B. altitudinis DHN8 os
melhores resultados foram observados com a utilização de gelatina entre as fontes
orgânicas e com KNO3 entre as fontes inorgânicas.
Em outro estudo, Prakash et al. (2012) relataram que a maior produção
de xilanase por B. halodurans PPKS-2 foi obtida utilizando como fonte de nitrogênio
hidrolisado de penas. Segundo Battan et al. (2007), as fontes de nitrogênio
orgânicas apresentam um efeito estimulatório sobre a produção de xilanase por
micro-organismos do gênero Bacillus e vários trabalhos na literatura relatam
melhores resultados com a utilização de extrato de levedura, extrato de carne,
triptona, peptona e farinha de soja (Dhillon; Gupta; Khanna, 2000; Haddar et al.,
2012; Nagar et al., 2010; Pham et al., 1998; Sá-Pereira et al., 2002).
No presente estudo, também foi realizada uma avaliação do efeito da
adição de alguns sais minerais e aditivos ao meio de cultura para produção de
xilanase por B. licheniformis CBMAI 1609. Segundo a literatura alguns compostos e
íons metálicos podem afetar a síntese e excreção de enzimas no meio de cultura por
alterar a permeabilidade da membrana celular, por serem cofatores enzimáticos em
reações metabólicas e também por alterar o desempenho cinético da enzima quando
em solução, exercendo papéis de estabilizadores, de inibidores ou ativadores da
atividade enzimática ou melhorando a interação da enzima com o substrato (Kappor;
Nair; Kuhad, 2008; Sá-Pereira et al., 2002; Sepahy; Ghazi; Sepahy, 2011; Sharma;
Adhikari; Satyanarayana, 2007). Na Figura 20 são apresentados os resultados
obtidos de produção de xilanase por B. licheniformis CBMAI 1609, após 48 horas de
cultivo, quando foram adicionados ao meio de cultura alguns sais minerais e outros
compostos na concentração final de 0,1 % (m/v ou v/v).
Como observado na Figura 20, a produção de xilanase pelo micro-
organismo não foi afetada significativamente pelos sais minerais e aditivos na
concentração avaliada de 0,1 % (m/v ou v/v), exceto pela adição de sulfato de zinco
que inibiu fortemente a produção de enzima em comparação ao meio de cultura
controle (sem adição destes compostos). Desta forma, nenhum destes compostos foi
incorporado à composição do meio de cultura utilizado nas etapas seguintes deste
trabalho.
151
Figura 20 - Efeitos de diferentes sais minerais e aditivos sobre a produção de xilanase por
(CON: meio controle, composto de 0,1 % de K2HPO4, 0,05 % de MgSO4, 0,05 % de KCl, 0,5 % de
bagaço de laranja, 0,5 % de farelo de soja e 0,5 % de caseína (m/v))
Sanghi et al. (2009) avaliaram os efeitos da adição de 0,1 % (m/v) de

alguns íons minerais (NaCl, CaCl2, MgSO4, ZnSO4 e CuSO4) e aditivos (EDTA e
SDS) ao meio de cultura e também observaram que nenhum destes apresentou
efeito positivo sobre a produção enzimática por B. subtilis ASH. Os autores ainda
relataram a forte diminuição da atividade de xilanase com a utilização de ZnSO4,
CuSO4, EDTA e SDS em comparação a atividade enzimática obtida no meio de
cultura controle (sem adição destes compostos). Sepahy, Ghazi e Sepahy (2011), ao
avaliarem os efeitos de alguns aditivos ao meio de cultura para produção de xilanase
por B. mojavensis AG137, observaram que as adições individuais de KH2PO4,
Tween 80 e azeite de oliva proporcionaram aumentos na produção da enzima pelo
micro-organismo em relação ao meio de cultura controle, enquanto que a adição de
SDS, glicina e alguns monossacarídeos reduziu a atividade enzimática. Segundo
esses autores a adição de Tween 80 e de azeite de oliva auxilia na secreção da
enzima pelo micro-organismo para o meio de cultura pelo fato de aumentar
significativamente a permeabilidade da membrana celular.
Em outro estudo, Battan et al. (2007) observaram um aumento de duas
vezes na produção de xilanase por B. pumilus ASH ao adicionar ao meio de cultura
0,2 % (m/v) de azeite de oliva, no entanto, os autores também verificaram que houve
a inibição da produção da enzima com a adição de 0,2 % (m/v) de Tween 20, Tween
152
80, SDS, glicerol, EDTA e Triton X. Kappor, Nair e Kuhad (2008) também relataram
o aumento da produção de xilanase e do teor de proteínas solúveis presentes nos
sobrenadantes de cultivo da linhagem B. pumilus MK001 quando se adicionou de
forma individual ao meio de cultura 0,2 % (m/v ou v/v) de Tween ou polietilenoglicol
(PEG).
No estudo realizado por Sharma, Adhikari e Satyanarayana (2007) sobre
os efeitos de íons metálicos e aditivos na produção de xilanase por Geobacillus
thermoleovorans foi verificado que a adição do íon Mg2+ e de Tween 80 aumentou a
produção da enzima e que esta foi inibida quando se adicionou ao meio de cultura
os íons Cu2+ e Co2+, EDTA, SDS, glicina e Triton X-100. Pham et al. (1998)
relataram que a presença de KH2PO4 no meio de cultura teve uma influência positiva
sobre a produção de xilanase e que a retirada de MgSO4 e de elementos traços da
composição do meio de cultura não afetou os níveis de produção da enzima por B.
polymyxa CECT 153. De forma similar, Sá-Pereira et al. (2002) relataram que a
adição de 1 mM de MnCl2 diminuiu a produção de xilanase pela linhagem de B.
subtilis utilizada no estudo, enquanto a adição de BaCl2 e FeCl2 promoveu uma
melhora na produção da enzima em relação ao meio de cultura controle.
4.2.2. Identificação dos componentes do meio de cultura significativos

para fermentação de B. licheniformis CBMAI 1609 e produção de
xilanase usando delineamento fatorial fracionado
A ferramenta estatística de delineamento fatorial fracionado, assim como
a de delineamento Plackett-Burman, é uma das estratégias que podem ser utilizadas
para a avaliação prévia de variáveis e seleção daquelas consideradas influentes em
um processo para uma posterior determinação de suas faixas ótimas de uso por
delineamento composto central rotacional (DCCR) (Rodriguez; Iemma, 2005).
Neste sentido, um delineamento fatorial fracionado 26-2 foi realizado para
se avaliar a influência dos componentes do meio de cultura (K2HPO4, MgSO4, KCl,
caseína, bagaço de laranja e farelo de soja) sobre a produção de xilanase pelo
micro-organismo B. licheniformis CBMAI 1609. Na Tabela 10 é apresentada a matriz
deste delineamento experimental que consistiu de 16 combinações diferentes das 6
variáveis independentes avaliadas em dois níveis de concentração (nível -1 e +1) e
também de 5 repetições realizadas na condição de ponto central (nível 0). Nesta
Tabela são também apresentados os valores reais das variáveis utilizados em cada
153
nível de estudo e os resultados de atividade enzimática de xilanase observados

após 72 horas de cultivo a 30 ºC e 200 rpm de agitação.
Tabela 10 – Matriz do delineamento fatorial fracionado 26-2 com os valores codificados e

reais para as variáveis estudadas e atividade de xilanase obtida após 72 horas de cultivo da
linhagem B. licheniformis CBMAI 1609
Bagaço Farelo de Atividade

K2HPO4 MgSO4 KCl Caseína
Ensaios de laranja soja de xilanase
(%) (%) (%) (%)
(%) (%) (U/mL)
1 -1 (0,0) -1 (0,0) -1 (0,0) -1 (0,5) -1 (0,5) -1 (0,5) 1,075
2 1 (0,3) -1 (0,0) -1 (0,0) -1 (0,5) 1 (1,5) -1 (0,5) 2,698
3 -1 (0,0) 1 (0,2) -1 (0,0) -1 (0,5) 1 (1,5) 1 (2,5) 5,921
4 1 (0,3) 1 (0,2) -1 (0,0) -1 (0,5) -1 (0,5) 1 (2,5) 2,043
5 -1 (0,0) -1 (0,0) 1 (0,2) -1 (0,5) 1 (1,5) 1 (2,5) 4,570
6 1 (0,3) -1 (0,0) 1 (0,2) -1 (0,5) -1 (0,5) 1 (2,5) 2,876
7 -1 (0,0) 1 (0,2) 1 (0,2) -1 (0,5) -1 (0,5) -1 (0,5) 2,439
8 1 (0,3) 1 (0,2) 1 (0,2) -1 (0,5) 1 (1,5) -1 (0,5) 1,823
9 -1 (0,0) -1 (0,0) -1 (0,0) 1 (1,5) -1 (0,5) 1 (2,5) 4,173
10 1 (0,3) -1 (0,0) -1 (0,0) 1 (1,5) 1 (1,5) 1 (2,5) 6,165
11 -1 (0,0) 1 (0,2) -1 (0,0) 1 (1,5) 1 (1,5) -1 (0,5) 5,445
12 1 (0,3) 1 (0,2) -1 (0,0) 1 (1,5) -1 (0,5) -1 (0,5) 1,828
13 -1 (0,0) -1 (0,0) 1 (0,2) 1 (1,5) 1 (1,5) -1 (0,5) 3,912
14 1 (0,3) -1 (0,0) 1 (0,2) 1 (1,5) -1 (0,5) -1 (0,5) 2,062
15 -1 (0,0) 1 (0,2) 1 (0,2) 1 (1,5) -1 (0,5) 1 (2,5) 6,039
16 1 (0,3) 1 (0,2) 1 (0,2) 1 (1,5) 1 (1,5) 1 (2,5) 4,828
17 (C) 0 (0,15) 0 (0,1) 0 (0,1) 0 (1,0) 0 (1,0) 0 (1,5) 1,955
18 (C) 0 (0,15) 0 (0,1) 0 (0,1) 0 (1,0) 0 (1,0) 0 (1,5) 2,451
19 (C) 0 (0,15) 0 (0,1) 0 (0,1) 0 (1,0) 0 (1,0) 0 (1,5) 2,548
20 (C) 0 (0,15) 0 (0,1) 0 (0,1) 0 (1,0) 0 (1,0) 0 (1,5) 1,795
21 (C) 0 (0,15) 0 (0,1) 0 (0,1) 0 (1,0) 0 (1,0) 0 (1,5) 2,340
(-1, 0 e 1: valores codificados das variáveis estudadas em cada um dos níveis de estudo). Os valores
apresentados entre parênteses referem-se aos valores reais utilizados em cada nível de estudo das
variáveis.
Como pode ser observado na Tabela 10, a atividade de xilanase oscilou

entre 1,075 e 6,165 U/mL entre os diferentes ensaios realizados. Esta variação
reflete a importância da otimização dos componentes do meio de cultura para se
alcançar uma maior produção de enzima pelo micro-organismo. O menor valor de
atividade enzimática (~1 U/mL) foi obtido quando o micro-organismo foi cultivado na
154
condição do ensaio 1, onde o meio de cultura apresentava todas as variáveis no

nível mais baixo de estudo. As maiores atividades enzimáticas de xilanase (acima de
6 U/mL) foram verificadas no ensaio 10, condição onde as variáveis MgSO4 e KCl
estavam no nível mais baixo enquanto as demais variáveis estudadas estavam no
nível mais alto, e no ensaio 15, condição onde as variáveis K2HPO4 e bagaço de
laranja estavam no menor nível de estudo e as outras 4 variáveis se encontravam no
nível mais alto.
A Tabela 11 apresenta a análise dos efeitos das variáveis independentes
do delineamento fatorial fracionado 26-2 sobre a produção de xilanase ao nível de
confiança de 90 % (p < 0,1). De acordo com a análise dos resultados obtidos após
72 horas de cultivo, as variáveis MgSO4 e KCl não apresentaram influência
significativa sobre a produção de xilanase pelo micro-organismo dentro das faixas de
concentração estudadas. Estas duas variáveis poderiam ser excluídas da
formulação do meio de cultura já que o nível -1 utilizado neste estudo correspondia à
ausência destes sais. Contudo, como essas variáveis são micronutrientes
encontrados na composição de vários meios de cultura optou-se por mantê-las e
fixar suas concentrações em 0,1 % (m/v) nos estudos posteriores.
A variável K2HPO4 foi estatisticamente significativa e apresentou um efeito
negativo sobre a produção de xilanase na faixa de concentração utilizada. Esta
variável foi também mantida na composição do meio de cultura devido à importância
do fosfato inorgânico para o metabolismo microbiano e para a constituição de
biomoléculas como ácidos nucleicos e coenzimas, no entanto a sua concentração foi
fixada em 0,15 % (m/v), condição no nível 0, para os estudos posteriores. Também
foi verificado que a presença de K2HPO4 na composição do meio de cultura diminuía
a quantidade de base necessária para a correção do pH inicial do meio (dado não
apresentado). As variáveis caseína, bagaço de laranja e farelo de soja também
influenciaram significativamente e de forma positiva a produção de xilanase pelo
micro-organismo. A análise dos efeitos destas 3 variáveis indicou que aumentos nas
suas concentrações poderiam melhorar ainda mais a produção enzimática. Baseado
nestes resultados, as variáveis caseína, bagaço de laranja e farelo de soja foram
selecionadas para serem estudadas em um delineamento composto central
rotacional (DCCR) 23 utilizando faixas de concentração ainda mais amplas.
155
Tabela 11 – Estimativa dos efeitos das variáveis independentes sobre a produção de

xilanase por B. licheniformis CBMAI 1609 no delineamento fatorial fracionado 26-2
Efeito Desvio padrão t(14) p-valor
Média* 3,2850 0,2166 15,1660 0,0000

K2HPO4* -1,1564 0,4963 -2,3301 0,0352
MgSO4 0,3543 0,4963 0,7140 0,4869
KCl -0,0999 0,4963 -0,2014 0,8432
Caseína* 1,3757 0,4963 2,7719 0,0149
Bagaço de laranja* 1,6035 0,4963 3,2309 0,0060
Farelo de soja* 1,9165 0,4963 3,8616 0,0017
* Parâmetros estatisticamente significativos ao nível de confiança de 90 %
4.2.3. Otimização das concentrações dos componentes do meio de

cultura significativos para fermentação de B. licheniformis CBMAI
1609 e produção de xilanase usando delineamento composto
central rotacional
Na Tabela 12 é apresentada a matriz do delineamento composto central
rotacional 23 realizado para otimizar as concentrações de caseína, bagaço de laranja
e farelo de soja. Esse delineamento experimental consistiu de 14 combinações das 3
variáveis em 4 níveis de estudo e de 5 repetições realizadas na condição de ponto
central. Nesta Tabela são também apresentados os valores reais utilizados em cada
nível de estudo para as 3 variáveis, os resultados de atividade enzimática de
xilanase observados após 72 horas de cultivo a 30 ºC e 200 rpm de agitação e as
atividades enzimáticas de xilanase previstas pelo modelo matemático gerado após a
análise estatística.
Analisando-se os valores de atividade de xilanase obtidos após 72 horas
de cultivo do micro-organismo, verifica-se que a atividade enzimática variou de 2,683
U/mL até 7,594 U/mL. A menor produção de xilanase foi verificada no ensaio 1, onde
o meio de cultura apresentava as 3 variáveis avaliadas em baixas concentrações
(nível -1). Já as maiores atividades de xilanase, aproximadamente 7,5 U/mL, foram
observadas no ensaio 8, condição onde todas as variáveis estudadas estavam no
nível +1, e no ensaio 12, condição onde as variáveis caseína e farelo de soja
estavam no nível basal (nível 0) e a variável bagaço de laranja estava em seu maior
nível (+1,68). Os resultados obtidos de atividade enzimática sugerem que as
156
maiores produções de xilanase são obtidas quando se tem no meio de cultura uma
alta concentração de fonte de carbono.
Tabela 12 – Matriz do delineamento composto central rotacional 23 do meio de cultura com

os valores codificados e reais (em parênteses) para as variáveis estudadas e resultados de
atividade enzimática de xilanase obtidos após 72 horas de cultivo da linhagem B.
licheniformis CBMAI 1609 e previstos pelo modelo matemático
Atividade de xilanase
Bagaço de (U/mL)
Caseína Farelo de
Ensaios laranja
(%) soja (%) Atividade Atividade
(%)
observada prevista
1 -1 (1,25) -1 (1,0) -1 (2,0) 2,683 3,017
2 1 (2,75) -1 (1,0) -1 (2,0) 4,742 4,065
3 -1 (1,25) 1 (3,0) -1 (2,0) 5,329 5,263
4 1 (2,75) 1 (3,0) -1 (2,0) 6,140 6,311
5 -1 (1,25) -1 (1,0) 1 (5,0) 6,490 5,341
6 1 (2,75) -1 (1,0) 1 (5,0) 6,105 6,389
7 -1 (1,25) 1 (3,0) 1 (5,0) 6,104 6,043
8 1 (2,75) 1 (3,0) 1 (5,0) 7,448 7,091
9 -1,68 (0,74) 0 (2,0) 0 (3,5) 3,449 3,824
10 1,68 (3,26) 0 (2,0) 0 (3,5) 5,425 5,586
11 0 (2,0) -1,68 (0,32) 0 (3,5) 4,584 4,603
12 0 (2,0) 1,68 (3,68) 0 (3,5) 7,594 7,081
13 0 (2,0) 0 (2,0) -1,68 (0,98) 4,712 4,537
14 0 (2,0) 0 (2,0) 1,68 (6,02) 6,699 7,147
15 (C) 0 (2,0) 0 (2,0) 0 (3,5) 5,739 5,842
16 (C) 0 (2,0) 0 (2,0) 0 (3,5) 5,557 5,842
17 (C) 0 (2,0) 0 (2,0) 0 (3,5) 5,498 5,842
18 (C) 0 (2,0) 0 (2,0) 0 (3,5) 5,567 5,842
19 (C) 0 (2,0) 0 (2,0) 0 (3,5) 5,642 5,842
(-1,68, -1, 0, 1, 1,68: valores codificados das variáveis estudadas em cada um dos níveis de estudo).
Os valores apresentados entre parênteses referem-se aos valores reais utilizados em cada nível de
estudo das variáveis.
Através dos resultados obtidos experimentalmente, foi possível determinar

os valores dos coeficientes de regressão para atividade de xilanase, desvio padrão, t
e p-valor apresentados na Tabela 13. Os valores de t e p foram utilizados para se
avaliar quais as variáveis e suas interações que apresentavam efeito
estatisticamente significativo, acima de 95 % de confiança (p < 0,05), sobre a
157
produção de xilanase. O p-valor é usado para conferir a significância de cada

coeficiente de regressão e também indica a importância de cada variável ou de suas
interações na resposta do modelo matemático. Outro aspecto importante de se
ressaltar é o fato de que quanto menor o valor de p e maior a magnitude do valor de
t, maior será a significância do coeficiente de regressão e consequentemente a sua
importância na produção enzimática.
Como pode ser observado na Tabela 13, as variáveis quadráticas bagaço
de laranja e farelo de soja e as interações caseína com bagaço de laranja e caseína
com farelo de soja não foram estatisticamente significativas ao nível de confiança de
95 %. Estas variáveis foram excluídas do modelo matemático e adicionadas aos
resíduos na análise de variância (ANOVA). Por outro lado, as variáveis caseína
linear, caseína quadrática, bagaço de laranja linear, farelo de soja linear e a
interação bagaço de laranja com farelo de soja apresentaram efeitos
estatisticamente significativos sobre a produção enzimática e desta forma foram
utilizadas na construção do modelo matemático para predição da atividade de
xilanase (Equação 4). É possível observar também que as variáveis lineares bagaço
de laranja e farelo de soja apresentaram baixos p-valores (0,0002 e 0,0001,
respectivamente) e os maiores valores de t (5,89 e 6,20, respectivamente), indicando
desta forma que a produção de xilanase é altamente influenciada pelas variações
nas concentrações destas duas variáveis (Tabela 13).
158
Tabela 13 – Resultados do coeficiente de regressão, desvio padrão, teste t-Student e p-

valor do DCCR para otimização dos componentes do meio de cultura para produção de
xilanase por B. licheniformis CBMAI 1609
Coeficiente Desvio
t(9) p-valor
de regressão padrão
Média* 5,5917 0,2065 27,0808 0,0000
(1) Caseína (L)* 0,5238 0,1251 4,1876 0,0023
Caseína (Q)* -0,3623 0,1251 -2,8954 0,0177
(2) Bagaço de laranja (L)* 0,7368 0,1251 5,8904 0,0002
Bagaço de laranja (Q) 0,2219 0,1251 1,7735 0,1099
(3) Farelo de soja (L)* 0,7758 0,1251 6,2020 0,0002
Farelo de soja (Q) 0,0864 0,1251 0,6907 0,5072
1L x 2L 0,0601 0,1634 0,3675 0,7218
1L x 3L -0,2389 0,1634 -1,4618 0,1778
2L x 3L* -0,3858 0,1634 -2,3605 0,0426
(L: Parâmetro linear; Q: Parâmetro quadrático). * Parâmetros estatisticamente significativos ao nível
de confiança de 95 %
Equação 4:
Atividade de xilanase (U/mL) = 5,592 + 0,524*(CAS) – 0,362*(CAS)2 +
0,737*(LAR) + 0,776*(SOJ) – 0,386*(LAR*SOJ)
(Onde, CAS: caseína; LAR: bagaço de laranja; SOJ: farelo de soja)
Na Tabela 14 é apresentada a análise de variância (ANOVA) realizada

para verificar a adequação do modelo matemático, apresentado na Equação 4,
gerado a partir das variáveis significativas e codificadas. Para que um modelo seja
considerado estatisticamente significativo e possa ser utilizado para fins preditivos, o
valor de F calculado (Fcal) para verificar a significância da regressão deve ser maior
do que o valor tabelado (Ftab). Em contrapartida, o teste F calculado para verificar a
falta de ajuste do modelo deve apresentar um valor menor do que o valor tabelado.
Se as duas condições forem satisfeitas, o modelo é considerado bom. Outro
requisito usado para verificar a qualidade do modelo é o coeficiente de determinação
(R2). Quanto mais próximo o valor deste estiver de 100 %, melhor é o ajuste da reta
de regressão as respostas obtidas experimentalmente (Rabelo, 2010).
Como pode ser observado na Tabela 14, foi obtido um valor de R2 de 87,9
%, indicando que 12,1 % das variações das respostas obtidas de atividade de
159
xilanase não são explicadas pelo modelo matemático. Este valor de coeficiente de
determinação é considerado aceitável para processos biológicos e, portanto pode-se
concluir que o modelo obtido proporciona uma boa explicação da variação total das
respostas observadas.
A análise de variância (ANOVA), apresentada na Tabela 14, indicou que o
valor de F calculado da regressão (Fcal = 19,04) foi 6,2 vezes maior que o valor de F
tabelado (Ftab 0,05;5;13 = 3,03) e que a regressão foi estatisticamente significativa ao
nível de confiança de 95 % (p = 0,00001). O valor de F calculado da falta de ajuste
do modelo foi de 45,33, sendo este 7,5 vezes maior do que o valor de F tabelado
(Ftab 0,05;9;4 = 6,00). Verificou-se também que a falta de ajuste foi estatisticamente
significativa ao nível de 95 % de confiança (p = 0,001). Embora o modelo
matemático tenha apresentado uma evidência de falta de ajuste, não se rejeitou a
hipótese de que a equação da reta de regressão obtida fosse adequada para
descrever os dados, pois o erro puro observado foi muito pequeno (igual a 0,0075),
devido à baixa variação das respostas nos ensaios realizados na condição de ponto
central, e este acabou influenciando no valor elevado do F calculado para a falta de
ajuste em relação ao erro puro e no baixo p-valor observado. Desta forma, pode-se
concluir que o modelo matemático apresentado na Equação 4 foi válido e que pode
ser utilizado para prever as respostas de produção de xilanase pelo micro-organismo
com 72 horas de fermentação. Como apresentado na Tabela 12, as atividades de
xilanase previstas pelo modelo matemático tiveram boa correlação com as
atividades observadas experimentalmente, estando a grande maioria delas dentro
da margem de erro explicada pelo modelo.
Tabela 14 – Análise de variância (ANOVA) para a atividade de xilanase do DCCR 23 para

otimização do meio de cultura para fermentação de B. licheniformis CBMAI 1609
Fonte de Soma Graus de Média
Fcal p-valor
variação quadrática liberdade quadrática
Regressão 22,86 5 4,57
19,04 0,00001
Resíduos 3,12 13 0,24
Falta de ajuste 3,09 9 0,34
45,33 0,001
Erro puro 0,03 4 0,0075
Total 25,98 18
R2 = 87,9 %; Ftab 0,05;5;13 = 3,03; Ftab 0,05;9;4 = 6,00

160
Nas Figuras 21a, 21b e 21c são apresentadas as superfícies de resposta

e curvas de contorno geradas a partir do modelo matemático obtido. Estas figuras
ilustram os efeitos das variáveis caseína, bagaço de laranja e farelo de soja e de
suas interações sobre a produção de xilanase por B. licheniformis CBMAI 1609. Em
cada figura são apresentadas as variações das concentrações de duas variáveis
enquanto a terceira variável foi fixada na sua condição de nível basal (nível 0).
As Figuras 21a e 21b indicam que para a variável caseína baixas
atividades de xilanase foram obtidas quando se utilizou concentrações menores que
1,75 % (m/v). De acordo com estas figuras não foram observadas grandes
diferenças na produção de enzima quando se utilizou concentrações entre 2 e 3,2 %
(m/v) de caseína. Com relação as variáveis bagaço de laranja e farelo de soja, como
observado anteriormente na Tabela 12, a atividade enzimática foi fortemente
influenciada pelas concentrações destas variáveis no meio de cultura, sendo as
maiores produções (aproximadamente 7 U/mL) obtidas em altas concentrações.
Desta forma, pode-se considerar estas duas variáveis como sendo fatores limitantes
da produção de xilanase por B. licheniformis CBMAI 1609. As Figuras 21a e 21c
ilustram que as maiores atividades de xilanase foram obtidas em altas
concentrações de bagaço de laranja (acima de 3 % (m/v)) e que em concentrações
abaixo de 2 % (m/v) foram obtidas atividades enzimáticas menores que 4 U/mL. Já
para a variável farelo de soja, as maiores atividades enzimáticas de xilanase foram
obtidas quando se utilizou concentrações acima de 4 % (m/v) (Figuras 21b e 21c).
Com o objetivo de confirmar experimentalmente os resultados previstos
pelo modelo e validar a regressão obtida, foram realizados experimentos utilizando-
se duas composições de meio de cultura com as 3 variáveis estudadas dentro de
suas faixas de concentração consideradas ótimas. Um dos meios de cultura (meio A)
consistiu de 2 % de caseína, 2,5 % de bagaço de laranja, 4,25 % de farelo de soja,
0,1 % de MgSO4, 0,1 % de KCl e 0,15 % de K2HPO4 (m/v), pH 7,0. O outro meio de
cultura (meio B) consistiu de 2,375 % de caseína, 3 % de bagaço de laranja, 5,75 %
de farelo de soja, 0,1 % de MgSO4, 0,1 % de KCl e 0,15 % de K2HPO4 (m/v), pH 7,0.
Os cultivos foram realizados em triplicata como descrito anteriormente no item 3.2.2
e após 72 horas de cultivo o sobrenadante de cultivo foi utilizado para determinação
da atividade enzimática de xilanase. Para os meios A e B o modelo previa atividades
enzimáticas de xilanase de 6,50 U/mL e 7,32 U/mL, respectivamente. As atividades
enzimáticas observadas experimentalmente, após 72 horas de cultivo, para os
161
meiosde cultura A e B foram 6,74 U/mL (± 0,15) e 7,36 U/mL (± 0,09),

respectivamente. Os resultados obtidos nos ensaios de validação demonstraram a
adequação do modelo matemático aos resultados experimentais. Foi escolhida para
ser utilizada nos ensaios posteriores a composição do meio B, pois esta
proporcionou a maior atividade de xilanase e um melhor crescimento do micro-
organismo, que foi observado pela quantidade de massa celular obtida após a
centrifugação.
162
(a)
(b)
(c)
Figura 21 – Superfícies de resposta e curvas de contorno da interação entre caseína e
bagaço de laranja (a), caseína e farelo de soja (b) e bagaço de laranja e farelo de soja (c)
na produção de xilanase por B. licheniformis CBMAI 1609
163
Os resultados obtidos de atividade enzimática de xilanase neste estudo

foram similares aos reportados por Haddar et al. (2012) que também estudaram a
otimização da composição do meio de cultura e das condições de fermentação para
produção de xilanase por B. mojavensis A21 utilizando delineamentos
experimentais. Estes autores observaram que a fonte de carbono farelo de cevada
era a variável mais influente na produção enzimática, sendo a sua concentração
ótima definida como 1,866 % (m/v). Ao final deste estudo os autores conseguiram
atividades enzimáticas de 7,45 U/mL, que representaram um aumento de 6,83 vezes
na produção de xilanase em comparação aos resultados no meio de cultura inicial.
Kumar e Satyanarayana (2012) realizaram estudos de otimização do meio
de cultura e das condições de produção de xilanase por B. halodurans TSEV1
utilizando os delineamentos Plackett-Burman e DCCR e relataram um aumento de
7,25 vezes na produção de enzima sob as condições otimizadas, alcançando
atividades de xilanase de 58,5 U/mL após 48 horas de cultivo. Os autores também
observaram que a fonte de carbono, neste caso farelo de trigo, era uma das
variáveis que tinha forte influência sobre a produção de enzima, sendo as maiores
atividades de xilanase obtidas quando esta era utilizada na concentração de 3 %
(m/v). Em continuidade a este estudo, Kumar e Satyanarayana (2014) descreveram
a otimização de outro meio de cultura para produção de xilanase pela mesma
linhagem microbiana utilizando um extrato de farelo de trigo obtido após um pré-
tratamento alcalino em substituição ao farelo de trigo e melaço de cana-de-açúcar
como fontes de carbono. Os autores realizaram um delineamento experimental
DCCR para definir as concentrações ótimas do extrato solúvel alcalino de farelo de
trigo, cloreto de amônio e melaço de cana-de-açúcar no meio de cultura e obtiveram
ao final deste estudo um aumento de 4,6 vezes na produção de xilanase (passando
de 15 U/mL para 69 U/mL).
Em outro estudo, Geetha e Gunasekaran (2010) utilizaram delineamentos
fatoriais fracionados para avaliar a importância de cada constituinte do meio de
cultura sobre a produção de xilanase por B. pumilus B20 e observaram que a
diminuição das concentrações de MgSO4 e CaCl2 e aumentos nas concentrações de
K2HPO4, NaCl, peptona, extrato de levedura e farelo de trigo foram favoráveis para
produção de enzima, sendo verificado um aumento de 3,4 vezes na produção de
xilanase ao se utilizar o meio de cultura otimizado (0,2 % de K2HPO4, 0,03 % de
MgSO4, 0,001 % de CaCl2, 0,2 % de NaCl, 0,5 % de peptona, 0,4 % de extrato de
164
levedura e 5 % de farelo de trigo (m/v)) em relação ao meio de cultura inicial (0,1 %

de K2HPO4, 0,05 % de MgSO4, 0,015 % de CaCl2, 0,05 % de NaCl, 0,3 % de
peptona, 0,2 % de extrato de levedura e 1 % de farelo de trigo (m/v)).
4.2.4. Otimização dos parâmetros temperatura e agitação para

xilanase usando delineamento composto central rotacional
Um delineamento composto central rotacional (DCCR) 22 foi realizado
para se determinar as condições ótimas de agitação e temperatura visando a
máxima produção de xilanase por B. licheniformis CBMAI 1609. Na Tabela 15 é
apresentada a matriz deste delineamento experimental que consistiu de 8
combinações das 2 variáveis em 4 níveis de estudo e de 4 repetições realizadas na
condição de ponto central. Nesta tabela são também apresentados os valores reais
utilizados em cada nível de estudo para as 2 variáveis, os resultados de atividade de
xilanase observados após 48 horas de cultivo utilizando o meio de cultura otimizado
descrito no item anterior e a atividade enzimática de xilanase prevista pelo modelo
matemático gerado após a análise estatística.
Para este delineamento experimental foram utilizados os dados de
atividade enzimática observados com 48 horas de cultivo, pois foi constatado em
vários ensaios o deslocamento do pico de máxima atividade enzimática e a redução
deste com 72 horas de cultivo. Possivelmente isto ocorreu devido ao aumento do
metabolismo microbiano em temperatura e agitação mais elevadas. De acordo com
a Tabela 15, é possível observar que a produção de xilanase foi fortemente
influenciada pelas condições de cultivo utilizadas, sendo verificado atividades
enzimáticas oscilando de 0,140 U/mL a 7,909 U/mL. As menores produções de
xilanase, 0,140 U/mL e 0,560 U/mL, foram verificadas, respectivamente, no ensaio 5,
condição onde a variável temperatura estava no seu menor valor de estudo (nível -
1,41) e a agitação na condição basal (nível 0), e no ensaio1, condição onde as duas
variáveis avaliadas estavam no nível -1. Já as maiores atividades de xilanase, 7,514
U/mL e 7,909 U/mL, foram obtidas no ensaio 8, condição onde a temperatura estava
no nível basal (nível 0) e a agitação estava em seu valor de estudo mais alto (nível
+1,41), e no ensaio 4, condição onde as duas variáveis avaliadas estavam no nível
+1, respectivamente.
165
Tabela 15 - Matriz do delineamento composto central rotacional 22 dos parâmetros de

fermentação com os valores codificados e reais (em parênteses) para as variáveis
estudadas e resultados de atividade enzimática de xilanase obtidos após 48 horas de cultivo
da linhagem B. licheniformis CBMAI 1609 e previstos pelo modelo matemático
Atividade de xilanase
Temperatura Agitação (U/mL)
Ensaios
( ºC) (rpm) Atividade Atividade
observada prevista
1 -1 (23) -1 (150) 0,560 1,200
2 1 (37) -1 (150) 3,297 3,060
3 -1 (23) 1 (250) 1,042 1,920
4 1 (37) 1 (250) 7,909 7,900
5 -1,41 (21) 0 (200) 0,140 0,000
6 1,41 (39) 0 (200) 4,456 4,752
7 0 (30) -1,41 (130) 3,251 3,094
8 0 (30) 1,41 (270) 7,514 7,026
9 (C) 0 (30) 0 (200) 6,315 6,160
10 (C) 0 (30) 0 (200) 6,380 6,160
11 (C) 0 (30) 0 (200) 6,448 6,160
12 (C) 0 (30) 0 (200) 5,496 6,160
(-1,41, -1, 0, 1, 1,41: valores codificados das variáveis estudadas em cada um dos níveis de estudo).
Os valores apresentados entre parênteses referem-se aos valores reais utilizados em cada nível de
estudo das variáveis.
Na Tabela 16 são apresentados os valores dos coeficientes de regressão,

desvio padrão, t e p-valor, obtidos a partir da análise dos resultados experimentais
deste DCCR. Como pode ser verificado na Tabela 16, os termos lineares e
quadráticos das duas variáveis e a interação entre elas apresentaram efeitos
estatisticamente significativos ao nível de confiança de 90 % sobre a produção
enzimática. Desta forma nenhum dos termos foi excluído da construção do modelo
matemático para predição da atividade de xilanase (Equação 5). Observa-se pelos
valores de p e t apresentados na Tabela 16, assim como nos resultados obtidos
experimentalmente de produção enzimática (Tabela 15), que a temperatura é o
parâmetro de cultivo que apresenta maior influência sobre a produção de xilanase
pelo micro-organismo.
166
Tabela 16 – Resultados do coeficiente de regressão, desvio padrão, teste t-Student e p-

valor do DCCR para otimização dos parâmetros de cultivo para produção de xilanase pela
Coeficiente Desvio
t(6) p-valor
de regressão padrão
Média* 6,1597 0,3565 17,2783 0,0000
(1) Temperatura (L)* 1,9635 0,2521 7,7892 0,0002
Temperatura (Q)* -2,0903 0,2818 -7,4169 0,0003
(2) Agitação (L)* 1,3902 0,2521 5,5151 0,0015
Agitação (Q)* -0,5482 0,2818 -1,9451 0,0997
1L x 2L* 1,0323 0,3565 2,8957 0,0275
(L: Parâmetro linear; Q: Parâmetro quadrático). * Parâmetros estatisticamente significativos ao nível
de confiança de 90 %.
Equação 5:
Atividade de xilanase (U/mL) = 6,16 + 1,96*(TEMP) – 2,09*(TEMP)2 + 1,39*(AGIT) –
0,55*(AGIT)2 + 1,03*(TEMP*AGIT)
(Onde, TEMP: temperatura; AGIT: agitação)
Na Tabela 17 é apresentada a análise de variância (ANOVA) para

verificar a adequação do modelo matemático gerado a partir das variáveis
significativas e codificadas, representado na Equação 5. A ANOVA para este DCCR
indicou que o valor de F calculado da regressão (Fcal = 30,96) foi quase 10 vezes
maior que o valor de F tabelado (Ftab 0,10;5;6 = 3,11) e que a regressão foi
estatisticamente significativa ao nível de confiança de 90 % (p = 0,0003). O valor de
F calculado da falta de ajuste do modelo foi de 4,08, sendo este valor menor que o
valor de F tabelado (Ftab 0,10;3;3 = 5,39). Observou-se também que a falta de ajuste
deste modelo não foi estatisticamente significativa ao nível de confiança de 90 % (p
= 0,139). O valor obtido para o coeficiente de determinação (R2) indica que o modelo
matemático da Equação 5 pode explicar 96,2 % da variabilidade das respostas
obtidas e que somente 3,8 % da variação não é explicada por este. Desta forma o
modelo matemático gerado atendeu aos requisitos necessários, como explicado
anteriormente, para ser considerado válido estatisticamente e pode ser utilizado para
prever os efeitos das duas variáveis avaliadas na produção de xilanase pela
linhagem B. licheniformis CBMAI 1609 com 48 horas de cultivo.
167
Tabela 17 – Análise de variância (ANOVA) para a atividade de xilanase do DCCR 22 para

otimização dos parâmetros agitação e temperatura para cultivo da linhagem B. licheniformis
CBMAI 1609
Fonte de Soma Graus de Média
Fcal p-valor
variação quadrática liberdade quadrática
Regressão 78,65 5 15,73
30,96 0,0003
Resíduos 3,05 6 0,508
Falta de ajuste 2,45 3 0,816
4,08 0,139
Erro puro 0,60 3 0,20
Total 81,70 11
R2 = 96,2 %; Ftab 0,10;5;6 = 3,11; Ftab 0,10;3;3 = 5,39
O modelo matemático representado na Equação 5 foi utilizado para

construir a superfície de resposta e curva de contorno apresentadas na Figura 22.
Nesta Figura são apresentados os efeitos das variáveis agitação e temperatura
sobre a produção de xilanase pelo micro-organismo B. licheniformis CBMAI 1609.
Como pode ser observado na Figura 22 altas atividades de xilanase são obtidas
quando o micro-organismo é cultivado nos maiores níveis de agitação e temperatura,
sendo verificadas atividades entre 7 e 8 U/mL com agitação entre 225 e 270 rpm e
em temperaturas entre 30 e 39 ºC. Constatou-se também que quando o micro-
organismo é cultivado em temperaturas abaixo de 25 ºC, independentemente da
agitação utilizada, são obtidas atividades enzimáticas menores que 2 U/mL.
Possivelmente, a alta agitação requerida pelo micro-organismo é para suprir a
demanda de oxigênio e também para auxiliar na distribuição dos nutrientes do meio
de cultura durante a fermentação, pois o meio de cultura apresenta uma alta
viscosidade, principalmente no início da fermentação.
Com o objetivo de confirmar experimentalmente os resultados previstos
pelo modelo matemático e validar a regressão obtida, foi realizado o cultivo do
micro-organismo em triplicata no meio de cultura otimizado por 48 horas nas
condições de nível +1 para as variáveis agitação e temperatura (37 ºC e 250 rpm de
agitação). O modelo gerado previa uma atividade de xilanase de 7,9 U/mL para
estas condições e foi observado experimentalmente atividades de xilanase de 7,527
U/mL (± 0,33), que estão dentro da margem de variação explicada pelo modelo
confirmando a adequação deste para predizer a produção de enzima.
168
Figura 22 – Superfície de resposta e curva de contorno da interação entre agitação e

temperatura na produção de xilanase por B. licheniformis CBMAI 1609
Comparativamente, Bajaj e Manhas (2012) relataram a utilização das

condições de cultivo 37 ºC e 200 rpm de agitação para a produção de xilanase por
B. licheniformis P11(C). Sepahy, Ghazi e Sepahy (2011) também avaliaram o efeito
da temperatura e agitação sobre a produção de xilanase por B. mojavensis AG137 e
relataram que a máxima produção da enzima foi obtida quando o micro-organismo
era cultivado a 37 ºC e 200 rpm de agitação. Em outro estudo, Nagar et al. (2010)
observaram que as melhores condições de temperatura e agitação para produção
de xilanase por B. pumilus SV-85S foram 37 ºC e 150 rpm, respectivamente.
Sharma, Adhikari e Satyanarayana (2007) relataram que a máxima produção de
xilanase por Geobacillus thermoleovorans também ocorre com agitação de 250 rpm
e que acima deste valor é observada uma diminuição da atividade enzimática, sendo
obtida baixa produção quando se utilizou agitação de 350 rpm.
4.2.5. Influência da quantidade de inóculo e do pH inicial do meio de

cultura para fermentação de B. licheniformis CBMAI 1609 e
A concentração do inóculo e o pH inicial do meio de cultura também são
fatores que podem afetar a produção de enzimas e o crescimento microbiano
durante um processo fermentativo. Segundo Kappor, Nair e Kuhad (2008) e
169
Adhyaru, Bhatt e Modi (2014), altas concentrações de inóculo não são requeridas
em processos fermentativos industriais, pois podem levar ao rápido consumo dos
nutrientes e a um menor crescimento microbiano e, consequentemente, resultar em
uma menor produção de enzimas. Por isso, segundo estes autores é importante um
balanço entre a proliferação de biomassa microbiana e os nutrientes disponíveis no
meio de cultura para se alcançar a máxima produção de enzimas. O pH do meio de
cultura pode alterar profundamente a produção de enzimas, o transporte de vários
compostos através da membrana celular assim como o crescimento microbiano e a
estabilidade das enzimas produzidas (Kapoor; Nair; Kuhad, 2008; Rehman, Qader;
Aman, 2012). Neste sentido, foram realizados estudos univariáveis para se
determinar as melhores condições destes dois parâmetros na produção de xilanase
por B. licheniformis CBMAI 1609 e os resultados obtidos estão representados nas
Figuras 23a e 23b.
Figura 23 – Influência da quantidade de inóculo (a) e do pH inicial do meio de cultura (b) na

produção de xilanase por B. licheniformis CBMAI 1609
* Os valores apresentados são as médias e desvios padrões de triplicatas. Valores seguidos de letras
diferentes diferem entre si pelo teste de Tukey a p < 0,05.
Não foram constatadas diferenças estatisticamente significativas pelo

teste de Tukey, ao nível de confiança de 95 %, nas atividades enzimáticas de
xilanase obtidas com a quantidade de inóculo variando de 1 a 5 % (v/v), como pode
ser visualizado na Figura 23a. Desta forma, nos experimentos seguintes continuou-
se utilizando a quantidade de inóculo de 2 % (v/v), como nos ensaios anteriores.
170
Quanto a influência do pH inicial do meio de cultura sobre a produção de

xilanase por B. licheniformis CBMAI 1609, foram avaliados apenas os valores de pH
5,0, 6,0, 7,0 e 8,0. Não foram avaliados valores de pH mais alcalinos, pois foram
observadas grandes alterações nas características do meio de cultura quando o pH
foi ajustado para valores acima de 8,0. Neste caso, o meio de cultura adquiriu
aspecto pastoso à sólido e inviabilizou a sua utilização. Possivelmente, isto ocorreu
pela desnaturação e precipitação das proteínas da soja e da caseína. Conforme
apresentado na Figura 23b, os maiores valores de atividade de xilanase foram
obtidos quando se utilizou o meio de cultura com o pH inicial ajustado para 6,0 e 7,0,
não havendo diferença estatística entre estes. Para os cultivos realizados em pH 5,0
e 8,0 foi observada a redução da produção de xilanase pelo micro-organismo após
48 horas de cultivo nas condições ótimas. Desta forma, nos estudos posteriores para
produção de xilanase o pH inicial do meio de cultura foi ajustado para valores entre
6,0 e 7,0.
Nagar et al. (2010) também avaliaram os efeitos da quantidade de inóculo
e do pH inicial do meio de cultura na produção de xilanase por B. pumilus SV-85S e
observaram que a maior produção de enzimas foi obtida utilizando como inóculo 1 %
(v/v) de uma cultura de 18 horas de cultivo do micro-organismo, sendo verificado que
acima desta quantidade de inóculo houve uma diminuição na atividade enzimática.
Quanto a influência do pH inicial do meio de cultura, esses autores avaliaram valores
de pH entre 3,0 e 11,0 e relataram que a produção de xilanase ocorreu quando o
micro-organismo foi cultivado em pH entre 5,0 e 8,0, sendo a maior atividade
observada em pH 6,0.
Em outro estudo, Adhyaru, Bhatt e Modi (2014) relataram que a maior
produção de xilanase por B. altitudinis DHN8 ocorreu quando se utilizou meio de
cultura com o pH inicial ajustado para 7,0 e 1 % (v/v) de inóculo com 12 horas de
cultivo. Foi constatado também neste estudo que aumentos subsequentes na
quantidade de inóculo provocaram a redução na produção da enzima.
Sanghi et al. (2009) variaram entre 1 e 20 % (v/v) a quantidade de inóculo
utilizada na produção de xilanase por B. subtilis ASH e observaram que os melhores
resultados também foram alcançados com a utilização de 2 % (v/v) de inóculo.
Kumar e Satyanarayana (2012) ao realizarem a otimização da produção de xilanase
por B. halodurans TSEV1 por delineamentos experimentais, relataram que a
quantidade de inóculo foi uma das variáveis que estatisticamente influenciou a
171
atividade enzimática, sendo observado um aumento linear na produção enzimática

com o aumento da quantidade de inóculo até se atingir a concentração ótima de
3,25 % (v/v).
Comparativamente, existem na literatura vários trabalhos que relatam
maiores produções de xilanase por linhagens do gênero Bacillus quando estas são
cultivadas em meio de cultura com pH inicial alcalino. Bajaj, Khajuria e Singh (2012)
verificaram que a máxima produção de xilanase por B. pumilus SS1 foi obtida
quando este foi cultivado em meio de cultura com pH inicial neutro ou ligeiramente
alcalino e que a produção de enzima foi reduzida drasticamente em pH 10,0 e 11,0,
embora o micro-organismo tenha apresentado bom crescimento nestas condições
de pH. Em outro estudo, Bajaj e Manhas (2012) cultivaram a linhagem B.
licheniformis P11(C) em meio de cultura com pH inicial oscilando entre 6,0 e 12,5 e
obtiveram maior produção de enzima em pH 8,0 e 9,0.
4.2.6. Estudo da cinética de fermentação de B. licheniformis CBMAI 1609

e de produção de xilanase
A relação entre a produção de xilanase por B. licheniformis CBMAI 1609 e
o perfil de crescimento microbiano foi investigado através do cultivo do micro-
organismo em meio de cultura e condições otimizadas, como descrito anteriormente
neste trabalho. Os resultados obtidos de atividade de xilanase, crescimento
microbiano estimado pelo número de células viáveis, variação do pH do meio de
cultura e concentração de proteínas solúveis totais e de açúcares redutores solúveis
foram acompanhados periodicamente e estão ilustrados na Figura 24.
O micro-organismo B. licheniformis CBMAI 1609 apresentou um rápido
crescimento no início da fermentação, atingindo a fase estacionária de crescimento
após 16 horas de cultivo no meio de cultura otimizado. A fase estacionária durou até
aproximadamente 72 horas de cultivo, quando então ocorreu a diminuição do
número de células viáveis, provavelmente devido à escassez dos nutrientes.
Como pode ser observado na Figura 24, a produção de xilanase foi baixa
nas primeiras 16 horas de cultivo (aproximadamente 1,4 U/mL) e começou a
aumentar rapidamente após este período, atingindo o pico máximo de produção de
9,16 U/mL com 64 horas cultivo. A atividade enzimática começou a declinar com 72
horas de cultivo, provavelmente devido à ação de proteases intracelulares, pois
172
neste período as células começaram a entrar na fase de morte celular, e ao final das
96 horas de fermentação foi obtida atividade de xilanase de 4,4 U/mL.
Durante o cultivo do micro-organismo no meio de cultura otimizado foi
verificada a diminuição na concentração de açúcares redutores simultaneamente
com o aumento do crescimento celular nas primeiras 24 horas do processo
fermentativo, indicando que estes açúcares possivelmente estavam sendo
consumidos pelo micro-organismo como substrato para o crescimento. Observou-se
também que as maiores produções de xilanase coincidiram com as menores
concentrações de açúcares redutores (aproximadamente 0,12 mg/mL) e que estas
permaneceram sem grandes alterações até o final do cultivo microbiano.
Quanto a concentração de proteínas solúveis totais, observou-se que o
meio de cultura tinha no início da fermentação um alto teor de proteínas (23 mg/mL),
sendo que grande parte deste conteúdo foi utilizado pelo micro-organismo nas 24
primeiras horas de cultivo e diminuiu para cerca de 4 mg/mL. Verificou-se que o teor
de proteínas voltou a aumentar com o aumento da produção de xilanase e
permaneceu entre 5 e 6 mg/mL no restante da fermentação. Com relação ao pH do
meio de cultura, foi observado que este aumentou durante toda a fermentação,
passando de 6,2 no início do cultivo para 9,3 ao final das 96 horas de fermentação.
Figura 24 – Cinética de fermentação e de produção de xilanase por B. licheniformis CBMAI

1609 em meio de cultura e condições otimizadas de cultivo
173
Os resultados obtidos para a cinética de crescimento e produção de

xilanase pela linhagem B. licheniformis CBMAI 1609 foram diferentes daqueles
relatados por Bajaj e Manhas (2012) para a linhagem B. licheniformis P11(C)
cultivada em meio de cultura com xilana comercial. Neste estudo, os autores
constataram que a produção de xilanase era parcialmente associada ao
crescimento, sendo a máxima produção enzimática obtida com 72 horas de cultivo,
durante a fase exponencial de crescimento do micro-organismo, foi ainda observado
que a atividade enzimática permaneceu constante até 96 horas de cultivo, quando o
micro-organismo entrou na fase de morte celular.
Em outro estudo, Damiano et al. (2003) relataram que a produção de
xilanase por B. licheniformis 77-2, em meio de cultura contendo palha de milho como
fonte de carbono, aumentou rapidamente após 24 horas de cultivo atingindo o pico
de atividade máxima e de biomassa celular com 48 horas de cultivo. Os autores
também observaram que após 72 horas de cultivo a atividade enzimática e a
biomassa celular começaram a declinar.
Comparativamente, no estudo realizado por Van Dyk (2009) sobre a
cinética de crescimento e produção de xilanase pela linhagem de B. licheniformis
SVD1, em meio de cultura contendo xilana comercial, foi observado que a atividade
de xilanase no sobrenadante de cultivo atingiu um pico de produção entre 38 e 60
horas de fermentação e depois começou a diminuir lentamente. Foi também
verificado que o micro-organismo apresenta um perfil de crescimento diáuxico, com
dois picos de crescimento durante o período de cultivo, sendo um deles com
aproximadamente 40 horas de cultivo, seguido de uma redução e o segundo pico
com 90 horas de cultivo. O teor de açúcares redutores presentes no meio de cultura
apresentou um comportamento semelhante ao crescimento microbiano exibindo dois
picos de elevação. Neste estudo, foi também relatado que o pH variou drasticamente
durante a fermentação, ou seja, iníciou em pH 7,0, diminuiu para valores abaixo de
6,0 após 30 horas de cultivo e então aumentou para valores acima de pH 9,0 após
120 horas.
Bocchini et al. (2005) ao avaliarem a cinética de fermentação e produção
de xilanase por B. circulans D1 em meio de cultura com xilana comercial também
observaram a produção de xilanase durante a fase estacionária de crescimento do
micro-organismo, sendo o pico de máxima produção enzimática atingido com 48
174
horas de cultivo. Foi também observado neste estudo, que os açúcares presentes no
meio de cultura no início da fermentação foram consumidos pelo micro-organismo
para sustentar seu crescimento, sendo que a maior atividade de xilanase também
ocorreu nas menores concentrações de açúcar.

CBMAI 1609 e produção de xilanase
Foi também realizado neste trabalho uma avaliação de aumento da
escala de produção de xilanase por B. licheniformis CBMAI 1609 em frascos
Erlenmeyer de 250 mL contendo 50 mL de meio de cultura e em reator de bancada
de 1,5 litros contendo 500 mL de meio de cultura. Nestes ensaios foram utilizados o
meio de cultura e as condições otimizadas de cultivo determinadas anteriormente,
com exceção para os testes realizados em reator de bancada, onde a agitação
precisou ser ajustada durante a fermentação para manter o nível de oxigênio
dissolvido.
Nos cultivos realizados em frascos Erlenmeyer de 250 mL com 50 mL do
meio de cultura otimizado foram obtidas atividades de xilanase de 2,60 U/mL e 3,61
U/mL após 48 e 64 horas de cultivo, respectivamente. Estes valores foram menores
do que os obtidos anteriormente na fermentação do micro-organismo em frascos
Erlenmeyer de 50 mL (Figura 24). Uma das possíveis causas para o baixo
rendimento na produção de xilanase em frascos Erlenmeyer de 250 mL pode ter sido
a agitação que não foi suficiente para promover a dispersão dos nutrientes do meio
de cultura e a transferência de oxigênio necessária para o crescimento microbiano.
De acordo com Stanbury, Whitaker e Hall (2003) durante a ampliação da
escala de processos fermentativos alguns parâmetros ambientais de cultivo do
micro-organismo, tais como o pH, a disponibilidade dos nutrientes, a temperatura e
as concentrações de oxigênio e gás carbônico dissolvidos no meio de cultura,
podem sofrer alterações, dificultando o crescimento microbiano e promovendo uma
redução no rendimento do processo.
Kumar e Satyanarayana (2012) ao realizarem o estudo de ampliação da
escala de produção de xilanase por B. halodurans TSEV1 em reator de bancada de
7 litros contendo 4 litros de meio de cultura otimizado, também observaram uma
redução na produção de xilanase em comparação aos resultados obtidos em frascos
agitados. Segundo os autores, a diminuição na produção de xilanase com o
175
aumento do volume do processo pode ter ocorrido devido a dificuldade de

homogeneização das partículas de farelo de trigo utilizadas como fonte de carbono.
A Figura 25 ilustra a produção de xilanase por B. licheniformis CBMAI
1609 em reator de bancada de 1,5 litros com 500 mL do meio de cultura otimizado.
Como pode ser visualizado na Figura 25, o pico de máxima produção (18,5 U/mL) foi
obtido com 24 horas de fermentação. Foi também observado um aumento na
produção de xilanase, passando de aproximadamente 8 U/mL após 64 horas de
fermentação em frascos Erlenmeyer de 50 mL com 15 mL de meio de cultura para
18,5 U/mL após 24 horas de fermentação em reator de bancada de 1,5 litros com
500 mL de meio de cultura.
Foi constatado durante a fermentação em reator de bancada um alto
consumo de oxigênio pelo micro-organismo entre o período de 10 a 28 horas de
cultivo. Neste período da fermentação também ocorreu a formação de espuma,
devido a alta agitação (800 rpm) e aeração (1,5 vvm) utilizadas para manutenção da
taxa de oxigênio dissolvido em 30 % de saturação. Assim como nos cultivos em
frascos agitados, também foi verificada a alcalinização do meio de cultura durante o
cultivo do micro-organismo em reator de bancada. O pH do meio de cultura
aumentou de 6,5 no início da fermentação para pH 8,5 ao final das 45 horas de
cultivo.
Figura 25 – Cinética de produção de xilanase por B. licheniformis CBMAI 1609 em meio de

cultura otimizado em reator de bancada
A redução no período de cultivo observada para a máxima produção de

xilanase em reator de bancada pode ser atribuída a uma melhora da aeração e da
176
homogeneização dos nutrientes, assim como pela maior área superficial para
crescimento do micro-organismo. Segundo Humphrey (1998), normalmente, pode
ser observado um aumento no rendimento dos processos fermentativos nos cultivos
realizados em reatores, pois há um melhor controle dos parâmetros do processo em
comparação aos cultivos em frascos agitados.
Tagliari (1999) ao realizar um ensaio para o aumento da escala de
produção de xilanase por uma linhagem de B. pumilus também observou uma
melhora na produção de enzima. A produção de xilanase neste trabalho passou de
129 U/mL após 20 horas de cultivo em frascos Erlenmeyer de 50 mL com 12 mL de
meio de cultura otimizado, a 40 ºC e 230 rpm de agitação, para 173 U/mL com 10
horas de cultivo em reator de bancada de 2 litros contendo 1,5 litros de meio de
cultura otimizado, a 40 ºC e com nível de oxigênio dissolvido mantido em 50 % de
saturação.
Sharma, Adhikari e Satyanarayana (2007), ao realizarem um ensaio de
aumento da escala de produção de xilanase por Geobacillus thermoleovorans para
reator de 22 litros com 10 litros de meio de cultura otimizado, verificaram a
manutenção dos níveis de produção enzimática e a redução do tempo de cultivo
para a máxima produção em 30 horas (passando de 72 para 42 horas) quando
comparado aos resultados observados em frascos Erlenmeyer de 250 mL com 50
mL de meio de cultura.
Em outro estudo, Kapoor, Nair e Kuhad (2008) avaliaram a produção de
xilanase por B. pumilus MK001 através do cultivo em reator de 5 L contendo 2,5 L de
meio de cultura otimizado a 37 ºC, agitação entre 200 a 300 rpm, aeração de 0,5 a
2,0 vvm e pH controlado em 9,0. Os autores relataram um pequeno aumento na
produção de xilanase e a diminuição do tempo de cultivo para 32 horas em
comparação aos resultados alcançados previamente após 40 horas de cultivo em
frascos Erlenmeyer de 250 mL com 50 mL de meio de cultura a 37 ºC e 200 rpm de
agitação.
Kumar e Satyanarayana (2014), constataram um ligeiro acréscimo da
atividade de xilanase e a redução do tempo de fermentação de 48 horas para 36
horas de cultivo ao realizarem a ampliação da escala de produção de xilanase por B.
halodurans TSEV1 de frascos agitados para reator de bancada de 7 L com 4 L de
meio de cultura otimizado.
177
A produtividade, razão entre a atividade enzimática e o tempo de

fermentação, é um dos parâmetros geralmente utilizados para a avaliação e
comparação de processos fermentativos. Na Figura 26 é apresentada uma análise
dos resultados de produtividade obtidos durante as etapas deste estudo de
otimização da produção de xilanase por B. licheniformis CBMAI 1609.
A Figura 26 ilustra que no início deste trabalho a produtividade de
xilanase obtida nos cultivos em frascos Erlenmeyer de 50 mL com 15 mL de meio de
cultura contendo 1 % (m/v) de xilana comercial após 48 horas de cultivo a 30 ºC e
200 rpm era muito baixa, cerca de 0,006 U/mL/h. A realização dos estudos de
otimização do meio de cultura e dos parâmetros de cultivo possibilitou a obtenção de
atividades enzimáticas de xilanase superiores a 7,5 U/mL após 48 horas de cultivo a
37 ºC e 250 rpm e um aumento da produtividade para aproximadamente 0,155
U/mL/h. Com a ampliação da escala de cultivo para reator de bancada de 1,5 L com
500 mL de meio de cultura otimizado foi verificada a redução do tempo de cultivo do
micro-organismo para 24 horas, o aumento na produção de enzima para 18,5 U/mL
e consequentemente uma melhora nos valores de produtividade. A produtividade
nos cultivos em reator de bancada passou para 0,77 U/mL/h, o que representa um
aumento de aproximadamente 128,33 vezes em comparação aos valores iniciais
observados. Como os resultados obtidos nos ensaios em reator de bancada ainda
são preliminares, vale ressaltar que níveis mais elevados de atividade enzimática e
de produtividade poderão ser alcançados com a realização de estudos posteriores
de otimização das condições de cultivo em reator de bancada.
Figura 26 – Comparação da produtividade de xilanase por B. licheniformis CBMAI 1609 nas

diferentes etapas realizadas neste estudo
178
Comparativamente, a produtividade de xilanase alcançada neste trabalho

em reator de bancada foi maior que a obtida no estudo realizado por Sharma,
Adhikari e Satyanarayana (2007) utilizando Geobacillus thermoleovorans, onde os
autores obtiveram uma produtividade de aproximadamente 0,30 U/mL/h. No entanto,
a produtividade de xilanase obtida para B. licheniformis CBMAI 1609 foi menor do
que as relatadas por Kumar e Satyanarayana (2012 e 2014), onde os autores
relataram produtividades de 0,98 U/mL/h e 1,9 U/mL/h nos cultivos realizados em
reator com meios de cultura otimizados contendo farelo de trigo ou extrato alcalino
de farelo de trigo e melaço de cana-de-açúcar como fonte de carbono,
respectivamente. No estudo realizado por Tagliari (1999) também foi observado o
aumento da produtividade de xilanase com a ampliação da escala de produção
passando de 6,45 U/mL/h em frascos agitados de 50 mL para 17,33 U/mL/h em
reator de bancada de 2 L.
4.2.8. Comparação dos custos dos meios de cultura utilizados para

Com o intuito de se avaliar a viabilidade econômica do meio de cultura
otimizado proposto neste estudo, foi realizada uma estimativa dos custos da
produção de xilanase pelo micro-organismo B. licheniformis CBMAI 1609 e a
comparação com alguns trabalhos relatados na literatura para outras linhagens do
gênero Bacillus. Para esta comparação foram considerados os valores dos
reagentes utilizados na composição dos meios de cultura e as atividades de xilanase
obtidas quando os micro-organismos foram cultivados nestes meios de cultura.
O custo do litro do meio de cultura mínimo, composto de 0,2 % de NaNO3,
0,1 % de K2HPO4, 0,05 % de MgSO4, 0,05 % de KCl, 0,02 % de peptona e 1 % de
xilana de madeira faia (m/v), utilizado nos estudos iniciais deste trabalho para
produção de 0,3 U/mL de atividade de xilanase por B. licheniformis CBMAI 1609
após 48 horas de cultivo a 30 ºC e 200 rpm, foi estimado em R$ 110,56. Para
obtenção de 1.000 U de xilanase sob estas condições de cultivo, teria-se um custo
de R$ 368,53. Já para o meio de cultura otimizado desenvolvido neste estudo,
contendo 2,375 % de caseína, 3 % de bagaço de laranja, 5,75 % de farelo de soja,
0,1 % de MgSO4, 0,1 % de KCl e 0,15 % de K2HPO4 (m/v), onde se obteve
aproximadamente 8 U/mL após 48 horas de cultivo a 37 ºC e 250 rpm em frascos
179
agitados, foi estimado um valor de R$ 4,02 por litro de meio de cultura, neste caso, a
produção de 1.000 U de xilanase teria um custo de aproximadamente R$ 0,50.
Considerando-se os resultados de atividade de xilanase alcançados em reator de
bancada utilizando o meio de cultura otimizado com 24 horas de cultivo (18,5 U/mL),
teria-se um custo de aproximadamente R$ 0,21 para a produção enzimática de
1.000 U de xilanase.
Comparativamente, o custo do litro do meio de cultura descrito por
Damiano et al. (2003) para a produção de xilanase por B. licheniformis 77-2,
composto de 1 % de extrato de carne, 1 % de peptona, 1 % de NaCl, 0,1 % de
KH2PO4, 0,5 % de Na2CO3 e 2 % de xilana comercial (m/v), foi estimado em R$
229,10. Utilizando este meio de cultura, os autores obtiveram, após 48 horas de
fermentação a 50 ºC e 150 rpm, atividades enzimáticas de xilanase de 46,47 U/mL,
o que corresponderia a um custo de R$ 4,93 para a produção de 1.000 U de
xilanase. Ainda neste trabalho, os autores realizaram a substituição da xilana
comercial do meio de cultura por bagaço de laranja e obtiveram atividades
enzimáticas de xilanase de 30,24 U/mL, neste caso o litro do meio de cultura foi
estimado em R$ 8,51 e o custo de produção de 1.000 U de xilanase reduzido para
R$ 0,28.
O custo estimado do meio de cultura, composto por 0,5 % de peptona,
0,5 % de extrato de levedura, 0,1 % de K2HPO4, 0,02 % de MgSO4, 0,2 % de
Na2CO3 e 0,5 % de xilana (m/v), utilizado por Yang, Zhuang e Jeffries (1995) para a
produção de xilanase por Bacillus sp. (V1-4) foi de R$ 59,05 por litro. Com este meio
de cultura foi observado, após 72 horas de cultivo, atividades enzimáticas de
xilanase de 15 U/mL, assim teria-se um custo de R$ 3,93 para a obtenção de 1.000
U de xilanase. Neste estudo, os autores também realizaram a substituição da xilana
comercial por 3 % (m/v) de farelo de trigo e obtiveram, após o mesmo período de
cultivo, atividades de xilanase de 22 U/mL, desta forma o custo estimado do litro do
meio de cultura foi reduzido para R$ 3,91 e o custo para produção de 1.000 U de
xilanase seria de aproximadamente R$ 0,18.
Já o custo do litro do meio de cultura utilizado na produção de xilanase
por uma linhagem de B. pumilus descrito por Tagliari (1999), que possuía em sua
composição 3 % de xilana comercial, 0,6 % de peptona, 0,15 % de (NH4)2SO4 e 0,1
% de KH2PO4 (m/v), foi avaliado em R$ 333,12. Neste trabalho os autores obtiveram
uma alta produtividade de xilanase e uma atividade enzimática de 173,3 U/mL após
180
10 horas de cultivo a 40 ºC, sendo assim, o custo para obtenção de 1.000 U de

atividade enzimática seria de R$ 1,92.
O meio de cultura utilizado por Bocchini et al. (2002) para a produção de
xilanase por B. circulans D1 tendo em sua composição 1 % de extrato de carne, 1 %
de peptona, 1 % de NaCl, 0,1 % de KH2PO4, 0,5 % de Na2CO3 e 0,5 % de xilana
comercial (m/v), teve um custo estimado de R$ 63,65 por litro. Considerando-se que
neste estudo os autores obtiveram atividades de xilanase de 21,54 U/mL, após 48
horas de cultivo em frascos agitados a 45 ºC e 150 rpm, o custo da produção de
1.000 U de xilanase seria de aproximadamente R$ 2,95.
No caso do meio de cultura otimizado utilizado por Kumar e
Satyanarayana (2012) na produção de xilanase por B. halodurans TSEV1, composto
por 3 % de farelo de trigo, 0,14 % de KH2PO4, 0,2 % de triptona, 0,01 % de MgSO4 e
0,05 % de Tween-80 (m/v ou v/v), foi estimado um valor de aproximadamente R$
1,67 por litro de meio de cultura. Com a utilização deste meio de cultura os autores
obtiveram atividades de xilanase de 35 U/mL, após 36 horas de cultivo em reator de
bancada a 45 ºC, 200 rpm e 0,1 vvm de aeração, assim a produção de 1.000 U de
xilanase custaria cerca de R$ 0,05.
Com base nestes dados, é possível observar que os estudos realizados
para otimização da produção de xilanase por B. licheniformis CBMAI 1609 além de
proporcionarem o aumento da produção de xilanase, também permitiram a redução
dos custos de obtenção da enzima com utilização de subprodutos agroindustriais.
Embora a produção de xilanase alcançada neste trabalho seja menor do que a
relatada em alguns trabalhos na literatura utilizando outras linhagens do gênero
Bacillus, considerando-se os valores dos meios de cultura utilizados, o custo para
obtenção de xilanase alcançado foi melhor do que os valores estimados para alguns
destes trabalhos.
4.2.9. Avaliação da produção simultânea de diferentes hidrolases

glicosídicas durante a fermentação de B. licheniformis CBMAI 1609
e B. licheniformis ATCC 14580
O desenvolvimento de processos para a produção simultânea hidrolases
glicosídicas pode também ser uma alternativa para redução dos custos de produção
das enzimas (Robl et al., 2015). A produção simultânea de hidrolases glicosídicas
em um mesmo meio de cultura a partir de um mesmo isolado microbiano faz com
181
que o processo de produção enzimática seja viável e adequado para aplicação

industrial, pois reduz em grande medida os custos de produção em comparação com
a obtenção destas enzimas separadamente pelo mesmo micro-organismo ou por
micro-organismos diferentes (Kaur et al., 2010).
Na etapa experimental 1 foi relatado que o isolado microbiano utilizado
neste estudo apresentava potencial para produção de endoglucanase, pectinase,
xilanase e outras hidrolases glicosídicas. Neste sentido, foi avaliada a ocorrência de
produção simultânea pelo micro-organismo B. licheniformis CBMAI 1609 das
enzimas arabinanase, α-L-arabinofuranosidase, endoglucanase, galactanase,
laminarinase, liquenase, mananase, pectinase e xiloglucanase, quando este foi
cultivado no meio de cultura e condições otimizadas determinadas neste trabalho.
Para efeito de comparação foram também realizados cultivos em frascos agitados
sob as mesmas condições utilizando a linhagem B. licheniformis ATCC 14580. Os
resultados obtidos desta avaliação de produção simultânea de algumas hidrolases
glicosídicas, principalmente hemicelulases, por estes dois micro-organismos estão
apresentados na Figura 27.
Figura 27 – Avaliação da presença de diferentes hidrolases glicosídicas nos sobrenadantes

de cultivo de B. licheniformis CBMAI 1609 e de B. licheniformis ATCC 14580 após 48 horas
de cultivo a 37 ºC e 250 rpm em frascos agitados contendo o meio de cultura otimizado
182
Embora os dois micro-organismos tenham sido capazes de crescer no

meio de cultura sob as condições de cultivo utilizadas e tenham apresentado o
mesmo teor de proteínas solúveis totais no sobrenadante de 48 horas de cultivo
(cerca de 4,5 mg/mL), estes exibiram comportamentos diferentes com relação à
produção das enzimas avaliadas, como pode ser visualizado na Figura 27. No
sobrenadante de cultivo do micro-organismo B. licheniformis CBMAI 1609 foram
encontradas em quantidades variáveis todas as enzimas avaliadas, sendo detectada
uma maior atividade das enzimas arabinanase e α-L-arabinofuranosidase
(substratos arabinana linear, arabinana desramificada e arabinana de beterraba
sacarina), galactanase (substrato galactana), liquenase (substratos β-glucano e
liquenano), mananase (substrato manana) e xilanase (substratos xilana de madeira
faia e arabinoxilana de centeio). Para a linhagem B. licheniformis ATCC 14580 foram
observados baixos valores de atividade enzimática para a maioria das enzimas
avaliadas, exceto para as enzimas arabinanase, α-L-arabinofuranosidase e
galactanase. Observa-se ainda na Figura 27, que os sobrenadantes de cultivo dos
dois micro-organismos apresentaram baixas atividades enzimáticas de
endoglucanase (substrato carboximetilcelulose), laminarinase (substrato laminarina),
pectinase (substrato pectina) e xiloglucanase (substrato xiloglucano).
Comparativamente, os resultados obtidos de produção das enzimas
avaliadas pela linhagem B. licheniformis CBMAI 1609 foram melhores do que
aqueles observados por Robl et al. (2013), que avaliaram a capacidade de produção
de hemicelulases e outras hidrolases glicosídicas por isolados fúngicos,
pertencentes aos gêneros Aspergillus, Trichoderma, Alternaria, Annulohypoxylon e
Talaromyces, quando cultivados em meio de cultura contendo como fontes de
carbono farelo de soja e bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado por explosão a vapor
e deslignificação alcalina. Em continuidade a este trabalho, Robl et al. (2015)
estudaram a otimização da produção de pectinase e β-glicosidase pelo fungo
Annulohypoxylon stygium DR47 em meio de cultura contendo como fontes de
carbono sacarose, bagaço de laranja e farelo de soja e também observaram ao final
do estudo a presença de celulase, xilanase, xiloglucanase, β-xilosidase, α-L-
arabinofuranosidase, celobiohidrolase e β-galactosidase no sobrenadante de cultivo
do micro-organismo.
Em outro estudo, Mamma, Kourtoglou e Christakopoulos (2008) relataram
a produção simultânea das enzimas poligalacturonase, pectato liase,
183
endoglucanase, xilanase, β-glicosidase e invertase pelos fungos Fusarium

oxysporum F3, Aspergillus niger BTL, Neurospora crassa DSM 1129 e Penicillium
decumbens durante o cultivo em estado sólido, utilizando como substrato indutor
cascas de laranja.
Embora micro-organismos do gênero Bacillus sejam capazes de crescer e
produzir enzimas em meios de cultura contendo subprodutos agroindustriais, ainda
são encontrados poucos estudos que avaliaram a ocorrência de produção
simultânea de hidrolases glicosídicas. Em um destes trabalhos, Kaur et al. (2010)
relataram a produção simultânea de xilanase e pectinase por uma linhagem de B.
pumilus após 48 horas de cultivo a 37 ºC e 200 rpm de agitação em meio de cultura
contendo como fontes de carbono farelo de trigo e cascas de frutas cítricas. Em
outro estudo, El-Helow e El-Gazaerly (1996) relataram o potencial da linhagem B.
subtilis 168 em produzir amilase, mananase, liquenase e xilanase quando cultivada
em meios de cultura contendo como fontes de carbono farelo ou palha de trigo,
polpa de beterraba, espiga de milho ou casca de arroz.
184
4.3. Etapa experimental 3 - “Caracterização do sistema xilanolítico de B.

licheniformis CBMAI 1609 e isolamento de um complexo
multienzimático do tipo xilanossomo”

4.3.1.1. Efeito do pH e da temperatura na atividade enzimática do

sistema xilanolítico de B. licheniformis CBMAI 1609
As bactérias do gênero Bacillus são capazes de produzir uma grande
variedade de enzimas extracelulares, dentre as quais, as xilanases são uma das que
possuem grande importância industrial (Kumar; Satyanarayana, 2011). Na literatura
são encontrados relatos de linhagens de Bacillus sp. capazes de secretar no meio
de cultura múltiplas formas de xilanase que apresentam diferentes massas
moleculares e características bioquímicas distintas (Blanco et al., 1995; Breccia et
al., 1998; Damiano et al., 2006; Morales et al., 1993).
Conforme apresentado anteriormente na etapa experimental 2, foram
detectadas no extrato enzimático bruto da linhagem B. licheniformis CBMAI 1609
além da atividade enzimática de xilanase, as atividades de outras hemicelulases,
como arabinanase e α-L-arabinofuranosidase, que podem atuar de forma sinérgica
para a hidrólise de xilanas. Com o objetivo de explorar em trabalhos futuros a
utilização desse sistema xilanolítico produzido, foi realizada a determinação de
algumas das suas características bioquímicas.
Na Figura 28 são ilustrados os resultados dos efeitos do pH e da
temperatura na atividade do sistema xilanolítico de B. licheniformis CBMAI 1609. O
sistema xilanolítico apresentou atividade ótima (100 % da atividade relativa) em pH
6,0 e manteve mais de 60 % da atividade relativa quando na faixa de pH entre 5,0 e
7,5. Atividades relativas de xilanase abaixo de 20 % foram observadas em valores
de pH abaixo de 4,0 e acima de 8,0 (Figura 28a). Com relação ao efeito da
temperatura na atividade enzimática, foi observado que o sistema xilanolítico foi
ativo na faixa de temperatura entre 25 e 75 ºC, sendo constatado o aumento
progressivo da atividade enzimática até a faixa ótima de atividade, que foi entre 55 e
60 ºC. A atividade de xilanase foi inibida devido à desnaturação térmica em
185
temperaturas superiores a 60 ºC, sendo constatado menos de 20 % da atividade

enzimática a 75 ºC (Figura 28b).
Figura 28 – Efeito do pH (a) e da temperatura (b) na atividade enzimática do sistema

xilanolítico de B. licheniformis CBMAI 1609
Os resultados observados no presente trabalho para os efeitos do pH e

da temperatura na atividade enzimática do sistema xilanolítico de B. licheniformis
CBMAI 1609 estão de acordo com outros trabalhos existentes na literatura. Muitas
das xilanases produzidas por linhagens do gênero Bacillus apresentam atividade
ótima em valores de pH entre 5,0 e 7,0 e em temperaturas entre 40 e 60 ºC (Blanco
et al., 1995; Lee et al., 1997; Nagar et al., 2010; Morales et al., 1993; Prakash et al.,
2012; Sá-Pereira et al., 2003).
Comparativamente, Adhyaru, Bhatt e Modi (2014) relataram que a
atividade de xilanase presente no sobrenadante de cultivo de B. altitudinis DHN8 era
máxima em pH 7,0 e a 50 ºC. Os autores desse estudo também constataram
atividades relativas acima de 60 % em temperaturas entre 45 e 65 ºC e em valores
de pH na faixa de 5,0 a 10,0. Em outro estudo, Poorna e Prema (2006)
caracterizaram a atividade de xilanase do sobrenadante de cultivo de uma linhagem
de B. pumilus e relataram atividade ótima a 50 ºC e em pH 6,5. Essa xilanase
também apresentou mais de 80 % de atividade enzimática quando em valores de pH
entre 5,0 e 7,5 e menos de 40 % em temperaturas acima de 55 ºC.
Mittal, Nagar e Gupta (2013) verificaram que a xilanase de Bacillus sp.
SV-34S apresentava atividade ótima a 50 ºC, sendo esta rapidamente reduzida com
o aumento da temperatura. A atividade dessa xilanase foi máxima em pH 6,5 e, ao
186
contrário do observado no presente trabalho, a enzima ainda era ativa em pH

alcalino, mantendo 44 % da atividade enzimática em pH 10,0. Em outro estudo,
Kumar e Satyanarayana (2011) relataram que a xilanase de B. halodurans era ativa
em valores de pH entre 7,0 e 12,0 e na faixa de temperatura entre 30 a 100 ºC,
sendo a atividade ótima observada em pH 9,0 e a 80 ºC.
Os resultados do presente trabalho diferiram em comparação aos
relatados para outras linhagens de B. licheniformis. No estudo realizado por Bajaj e
Manhas (2012) foi verificado que as duas xilanases presentes no sobrenadante de
cultivo da linhagem B. licheniformis P11(C) apresentavam atividade ótima a 60 ºC e
em pH entre 8,0 e 9,0. Em outro estudo, Damiano et al. (2006) realizaram a
purificação e caracterização de duas xilanases da linhagem B. licheniformis 77-2 e
relataram que essas enzimas exibiram atividade ótima em temperaturas entre 70 e
75 ºC e ainda eram ativas a 90ºC. Umas dessas xilanases apresentou ainda
atividade máxima em pH 7,0 enquanto a outra exibiu uma ampla faixa de pH ótimo,
entre 7,0 e 11,0.
4.3.1.2. Efeito do pH e da temperatura na estabilidade enzimática do

Na Figura 29 são apresentados os resultados dos efeitos do pH e da
temperatura na estabilidade enzimática do sistema xilanolítico de B. licheniformis
CBMAI 1609. Os resultados obtidos para o pH de estabilidade indicam que o sistema
xilanolítico presente no extrato enzimático bruto manteve-se estável após 24 horas
de incubação em pH 6,0 a 4 ºC, sendo observado nesta condição a retenção de
cerca de 97 % da atividade enzimática de xilanase inicial. Foi também constatada a
manutenção de mais de 70 % da atividade enzimática inicial durante a incubação na
faixa de pH entre 4,0 e 8,0. O sistema xilanolítico ainda apresentou cerca de 50 %
de atividade residual em valores de pH alcalino (pH 9,0 e 10,0) e menos de 40 %
quando incubado em pH abaixo de 3,0 (Figura 29a).
Com relação à temperatura de estabilidade, foi verificado que o sistema
xilanolítico estudado manteve-se estável após 2 horas de incubação em pH 6,0 nas
temperaturas entre 25 e 45 ºC. Nestas condições foi observada a manutenção de 90
a 100 % da atividade enzimática inicial. Após o tratamento térmico na temperatura
de 50 ºC, o sistema xilanolítico apresentou 80% de atividade enzimática residual,
porém quando este foi incubado nas temperaturas da faixa ótima de atividade (55 e
187
60°C) foi constatada a manutenção de apenas 40 e 5 % da atividade xilanásica

inicial, respectivamente. Não foram verificadas atividades xilanásicas significativas
após a incubação por 2 horas em temperaturas superiores a 65 ºC (Figura 29b).
Figura 29 – Efeito do pH (a) e da temperatura (b) na estabilidade enzimática do sistema

xilanolítico de B. licheniformis CBMAI 1609
Os resultados observados na avaliação da estabilidade térmica e pH do

sistema xilanolítico de B. licheniformis CBMAI 1609 foram similares aos relatados
para algumas xilanases produzidas por outros micro-organismos do gênero Bacillus.
Lee et al. (1997), por exemplo, observaram que a xilanase de uma linhagem de
Bacillus sp. foi estável após 20 horas de incubação a 30 ºC, sendo também
constatada a manutenção de 39 e 24 % da atividade enzimática inicial após 30 e 5
minutos de incubação a 50 e 60 ºC, respectivamente. Quanto ao pH de estabilidade,
foi reportado por estes autores que essa xilanase apresentava mais de 70 % de
atividade residual após 20 horas de incubação a 30 ºC na faixa de pH entre 4,0 e
10,0. Em outro estudo, Subramaniyan (2012) relatou que a xilanase de B. pumilus
SSP-34 mostrou-se estável após 30 minutos de incubação em temperaturas abaixo
de 50ºC e que esta manteve menos de 40 % da sua atividade inicial a 55 ºC. Foi
verificado ainda que essa enzima também manteve-se estável na faixa de pH entre
4,5 e 9,0 após 2 horas de incubação.
Anuradha et al. (2007) avaliaram as características bioquímicas das
xilanases presentes no sobrenadante de cultivo de 3 isolados de Bacillus sp.,
provenientes de amostras de campos de plantação de cana-de-açúcar, e relataram
que essas enzimas foram estáveis na faixa de pH entre 7,0 e 11,0 após 24 horas de
188
incubação a 25 ºC e em temperaturas entre 30 e 50 ºC após 2 horas de incubação.

Kallel et al. (2015) verificaram que a xilanase de B. mojavensis UEB-FK foi estável
após 24 horas de incubação a 4 ºC na faixa de pH entre 2,0 e 9,0 e reteve-se entre
90 e 100 % da atividade enzimática inicial nestas condições. Quanto à estabilidade
térmica, foi observado que essa xilanase manteve, após 2 horas de incubação no pH
ótimo de atividade (pH 4,0), mais de 70 % da atividade enzimática inicial quando
incubada em temperaturas abaixo de 55 ºC e cerca de 43 % de atividade enzimática
residual após 1 hora de incubação a 70 ºC.
Por outro lado, os resultados dos efeitos do pH e da temperatura na
estabilidade enzimática do sistema xilanolítico de B. licheniformis CBMAI 1609 foram
diferentes do relatado por Bajaj e Manhas (2012) para as duas xilanases da
linhagem B. licheniformis P11(C). Segundo esses autores, as duas enzimas foram
estáveis após 1 hora de incubação em pH 9,0 na faixa de temperatura entre 40 e
100 ºC, sendo constatada a manutenção de 88 % da atividade inicial após 6 horas
de incubação a 60 ºC. Quanto ao pH de estabilidade, foi observado que as duas
xilanases apresentavam acima de 75 % da atividade enzimática residual, após 1
hora de incubação a 60 ºC, na faixa de pH entre 5,0 e 10,0, sendo verificada a
conservação de 90 % da atividade enzimática após 6 horas de incubação em pH 9,0
a 60 ºC.
Em outro estudo, Damiano et al. (2006) verificaram que as duas xilanases
produzidas pela linhagem B. licheniformis 77-2 foram estáveis na faixa de pH entre
6,0 e 11,0, com a manutenção de mais de 80 % da atividade inicial nestas
condições. Quanto à estabilidade térmica, foi observado que essas duas xilanases
eram estáveis a 40 ºC após 1 hora de incubação. Uma dessas enzimas apresentou
40 % de atividade enzimática inicial na faixa de temperatura entre 55 e 90 ºC
enquanto a outra reteve 85 % da atividade enzimática inicial até 65 ºC e cerca de 30
% na faixa de temperatura entre 75 e 90 ºC.

enzimática do sistema xilanolítico de B. licheniformis CBMAI
1609
Os íons metálicos podem estar envolvidos de diferentes maneiras na
atividade enzimática: podem aceitar ou doar elétrons para ativar eletrófilos ou
nucleófilos; podem atuar como eletrófilos; podem mascarar os efeitos de nucleófilos
189
para prevenir reações indesejadas; podem se ligar a enzima e ao substrato por meio
de ligações coordenadas e manter os grupos reativos na orientação tridimensional
requerida; podem simplesmente estabilizar a conformação cataliticamente ativa da
enzima (Palmer, 2007). Na Tabela 18 são apresentados os efeitos de diferentes íons
metálicos e dos compostos quelantes EDTA e EGTA na atividade enzimática do
sistema xilanolítico presente no extrato enzimático bruto da linhagem Bacillus
licheniformis CBMAI 1609.
Constatou-se que a atividade enzimática do sistema xilanolítico
apresentou uma tendência de inibição com a adição de ácido
etilenodiaminotetracético (EDTA), que é um conhecido composto complexante de
íons metálicos divalentes. Observou-se também uma pequena tendência de redução
(menos de 10 %) na atividade enzimática com a adição do composto EGTA (ácido
etilenoglicol-bis(2-aminoetileter)-N,N,N’,N’-tetracético), que é um quelante de íons
cálcio e também de íons divalentes. Como o efeito inibitório observado para os
compostos EDTA e EGTA foi menor que 40 %, pode-se considerar que o
requerimento de íons metálicos divalentes não é absoluto para a catálise enzimática
do sistema xilanolítico produzido por B. licheniformis CBMAI 1609.
A Tabela 18 ilustra que a atividade enzimática do sistema xilanolítico
apresentou um pequeno aumento na presença dos íons metálicos monovalentes K+,
Li+ e Na+, sendo verificado que a adição de 5 mM de KCl promoveu um aumento de
30 % na atividade enzimática em comparação ao controle. Foi também observada
uma tendência de ativação do sistema xilanolítico na presença dos íons metálicos
divalentes Ca2+, Mg2+ e Ni2+, sendo obtido um aumento de 85 % na atividade
enzimática com a adição de 5 mM de MgCl2.
Para os íons metálicos Co2+, Mn2+, Fe3+ foi verificada uma tendência de
inibição da atividade enzimática nas duas concentrações avaliadas, sendo
observadas atividades enzimáticas residuais de 75, 30 e 10 %, respectivamente, na
presença destes íons. Por outro lado, a atividade enzimática do sistema xilanolítico
de B. licheniformis CBMAI 1609 foi fortemente inibida pelos íons metálicos Cu2+ e
Zn2+ nas duas concentrações avaliadas. A inibição enzimática por estes dois íons,
que reagem preferencialmente com grupos tióis causando sua oxidação, sugere a
possível presença de resíduos de cisteína no sítio ativo do sistema xilanolítico
avaliado, assim como relatado para outras xilanases microbianas (Adhyaru; Bhatt;
Modi, 2014; Prakash et al., 2012; Saleem et al., 2012).
190
Tabela 18 – Efeito de íons metálicos e de compostos quelantes na atividade enzimática do

Composto Atividade enzimática relativa ( %)

(5 mM) 5 mM 10 mM
Controle 100 100
EDTA 71,3 ± 4,7 66,6 ± 2,1
EGTA 98,9 ± 5,8 91,3 ± 5,83
KCl 130,6 ± 2,1 117,5 ± 2,6
LiCl 112,2 ± 6,2 98,2 ± 1,79
NaCl 107,8 ± 3,9 107,6 ± 5,3
CaCl2 113,4 ± 7,6 133,1 ± 5,8
CoCl2 75,7 ± 6,6 73,2 ± 3,4
NiCl2 107,6 ± 4,9 117,7 ± 2,7
MgCl2 185,0 ± 3,3 149,8 ± 3,6
MnCl2 30,8 ± 3,8 34,3 ± 2,7
FeCl3 10,0 ± 1,9 7,8 ± 5,0
CuSO4 2,8 ± 1,4 0,0
ZnSO4 0,0 0,0
(Controle: atividade enzimática sem a adição de íons metálicos e de compostos quelantes)
Comparativamente, Bajaj e Manhas (2012) verificaram que a atividade

enzimática das xilanases de B. licheniformis P11(C) foi reduzida cerca de 50 % na
presença de 0,1 % (m/v) de EDTA e completamente inibida na presença de 10 mM
dos íons divalentes Cu2+, Pb2+ e Hg2+. Foi ainda observado pelos autores desse
trabalho a ativação da xilanase na presença dos íons metálicos K+, Fe2+, Mn2+, Co2+,
Mg2+ e Zn2+. Em outro estudo, Khasin, Alchanati e Shoham (1993) observaram que a
atividade enzimática da xilanase produzida por B. stearothermophilus T-6 não foi
afetada pela adição de EDTA na concentração de 1 mM e que esta foi ligeiramente
ativada na presença de íons monovalentes na concentração de 10 mM. Os autores
também observaram um efeito inibitório da enzima na presença dos íons Mn2+, Co2+,
Fe2+, Cu2+ e Zn2+ na concentração final de 1 mM. Kallel et al. (2015) observaram que
os íons Fe2+, Mg2+ e Ca2+ na concentração final de 5 mM apresentaram efeito
estimulatório sobre a atividade enzimática da xilanase de B. mojavensis UEB-FK,
enquanto a adição de EDTA, Zn2+, Mn2+ e Cu2+ promoveu a inibição enzimática.
191
No estudo realizado por Poorna e Prema (2006) foi observado um

aumento de quase 100 % da atividade de xilanase presente no sobrenadante de
cultivo de uma linhagem de B. pumilus na presença de 10 mM do íon Mn2+. Também
foi constatado neste estudo que os íons metálicos Mg2+, Na+, Ca2+, Zn2+, Co2+ e Fe2+
tiveram um pequeno efeito positivo na atividade de xilanase enquanto os íons
metálicos Cu2+ e Cr2+ e o agente quelante EDTA apresentaram um efeito inibitório na
atividade enzimática. Kumar e Satyanarayana (2011) relataram que a adição dos
íons metálicos Ni2+, Ca2+, Fe2+, Mn2+, K+, Co2+, Na+ e Zn2+, na concentração final de
5 mM, não apresentou nenhum efeito significativo sobre a atividade enzimática da
xilanase produzida por uma linhagem de B. halodurans. Foi ainda observado por
esses autores a inibição da xilanase na presença dos íons Cu2+ e Mg2+, assim como
na presença dos compostos quelantes EDTA e EGTA.
Em outro estudo, Blanco et al. (1995) verificaram que a atividade de uma
xilanase produzida pela linhagem Bacillus sp. BP-23 foi inibida por Fe3+ e Zn2+ na
concentração final de 10 mM, sendo observada a manutenção de 2 e 28 % da
atividade enzimática na presença destes compostos, respectivamente. Os íons Mn2+,
Co2+, Ni2+ e Cu2+ também exerceram um efeito inibitório sobre a atividade xilánasica,
enquanto que a adição do íon Mg2+ promoveu um aumento da atividade enzimática.
4.3.2. Purificação das hidrolases glicosídicas produzidas por B.

A primeira estratégia adotada para a purificação das hidrolases
glicosídicas produzidas pela linhagem B. licheniformis CBMAI 1609 consistiu na
aplicação direta do extrato enzimático bruto em coluna de troca aniônica DEAE
Sepharose Fast Flow equilibrada com tampão Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, e na
posterior eluição das proteínas através de gradiente salino no mesmo tampão. A
escolha desta coluna de troca iônica deve-se ao fato desta ser uma das colunas
mais utilizadas nos experimentos para a purificação de xilanases (Sá-Pereira et al.,
2003). Na Figura 30 está ilustrado o cromatograma da purificação do extrato
enzimático bruto de B. licheniformis CBMAI 1609 na coluna de troca aniônica DEAE
Sepharose Fast Flow.
A realização desta estratégia de purificação aparentemente permitiu a
separação das proteínas do extrato enzimático bruto em 4 diferentes picos de
eluição visualizados durante a corrida (picos P1, P2, P3 e P4). No entanto, foram
192
detectadas as atividades enzimáticas analisadas (xilanase, endoglucanase,

galactanase, mananase e arabinanase) em todos os picos de eluição das proteínas.
A análise por eletroforese SDS-PAGE das frações coletadas nos picos de eluição
das proteínas também revelou a presença de várias subunidades proteicas em todas
as amostras analisadas (dados não apresentados). Na tentativa de melhorar a
interação e a separação dessas proteínas utilizando esta coluna cromatográfica,
foram realizadas outras corridas utilizando tampões com pH variando entre 7,0 e 9,0,
contudo foram observados resultados semelhantes.
Figura 30 – Cromatograma da purificação das hidrolases glicosídicas presentes no extrato

enzimático bruto de B. licheniformis CBMAI 1609 em coluna de troca aniônica DEAE
Sepharose Fast Flow
Posteriormente, foi avaliada a estratégia de purificação do extrato

enzimático bruto em coluna de exclusão molecular Superdex 200 10/300 GL. Esta
coluna possui uma faixa ótima de separação de proteínas com massa molecular
entre 10 e 600 kDa e um limite de exclusão para proteínas acima de 1.300 kDa. As
corridas utilizando esta coluna foram realizadas utilizando tampão fosfato de sódio
20 mM, pH 7,4, contendo 50 mM de NaCl. Na Figura 31 são apresentados o
cromatograma da purificação do extrato enzimático bruto de B. licheniformis CBMAI
1609 na coluna de exclusão molecular Superdex 200 e a análise eletroforética por
SDS-PAGE de um dos picos de proteínas coletados durante esta corrida. A Figura
32 ilustra um cromatograma da eluição de padrões de massa molecular entre 1,3
kDa e 669 kDa na coluna Superdex 200 para visualização e comparação dos
193
volumes de eluição das proteínas. Este cromatograma foi obtido do manual de

instruções desta coluna (GE Healthcare, 2014).
Como pode ser observado na Figura 31, a tentativa de purificação do
extrato enzimático bruto diretamente em coluna de exclusão molecular Superdex
200 não permitiu uma clara separação das proteínas, sendo estas eluídas em dois
picos principais, denominados de S1 e S2. As proteínas referentes ao pico S1 foram
eluídas logo no início da corrida, na posição que seria correspondente ao volume
morto desta coluna, onde neste caso são eluídas as proteínas com massa molecular
acima de 1.300 kDa (Figura 32). Já as proteínas do pico S2 foram eluídas em uma
posição que correspondem a proteínas com massa molecular estimada abaixo de 70
kDa, como é caso da maioria das hidrolases glicosídicas. Observa-se também na
Figura 31 que o pico S2 apresentou-se como um pico largo e com um alto valor de
absorbância a 280 nm, porém a determinação do teor de proteínas solúveis totais
pelo método de Bradford revelou que este não diferia tanto em comparação ao pico
S1. Desta forma, os altos valores de absorbância a 280 nm verificados para as
frações do pico S2 podem ter sido em decorrência de pigmentos ou de outros
compostos presentes no extrato enzimático bruto que absorvem neste mesmo
comprimento de onda.
As atividades enzimáticas para xilanase, endoglucanase, galactanase,
mananase e arabinanase também foram avaliadas nas frações coletadas nos picos
S1 e S2 e foram novamente encontradas em ambos os picos. Como a maioria das
xilanases microbianas apresentam massa molecular abaixo de 100 kDa (Sá-Pereira
et al., 2003), foi realizada a análise da amostra das frações coletadas e reunidas do
pico S1 por eletroforese SDS-PAGE. Como pode ser visualizado na Figura 31, o gel
SDS-PAGE do pico S1 revelou que este era composto por várias proteínas, podendo
ser detectada a presença de ao menos 10 bandas de proteínas com massa
molecular entre 10 e 70 kDa.
194
Figura 31 – Cromatograma da purificação das hidrolases glicosídicas presentes no extrato

enzimático bruto de B. licheniformis CBMAI 1609 em coluna de exclusão molecular
Superdex 200 10/300 GL e análise eletroforética por SDS-PAGE das proteínas do pico S1
(M: marcador de massa molecular; S1: amostra de proteínas das frações reunidas do pico S1)
Figura 32 - Cromatograma da eluição de padrões com massa molecular conhecida na

coluna Superdex 200 10/300 GL
Fonte: GE Healthcare (2014)
Diante dos resultados obtidos nos testes realizados para purificação das
hidrolases glicosídicas presentes no extrato enzimático bruto e após uma breve
análise da literatura sobre o assunto (Jones; Van Dyk; Pletschke, 2012; Pason et al.,
2010; Tachaapaikoon et al., 2012b; Van Dyk et al., 2009), foi sugerido que o micro-
organismo B. licheniformis CBMAI 1609 poderia estar produzindo a maioria das suas
hidrolases glicosídicas na forma complexada, semelhante aos complexos
195
multienzimáticos do tipo celulossomo e xilanossomo produzidos por alguns micro-

organismos. Na tentativa de confirmar a possível presença de um complexo
multienzimático no extrato enzimático bruto deste micro-organismo e isolá-lo para
estudos posteriores foram realizados alguns experimentos de purificação
cromatográfica como descrito no item 3.3.4.
4.3.3. Isolamento do complexo multienzimático produzido pela linhagem

4.3.3.1. Concentração do extrato enzimático bruto de B. licheniformis

CBMAI 1609
A maioria dos protocolos de purificação de enzimas descritos na literatura
inicia-se com a concentração do sobrenadante de cultivo, com o intuito de reduzir o
volume a ser trabalhado e eliminar impurezas presentes na amostra. Desta forma, o
primeiro passo no estudo da purificação do complexo multienzimático produzido por
B. licheniformis CBMAI 1609 consistiu na busca de um método adequado de
concentração do extrato enzimático bruto que resultasse em uma pré-purificação
deste e facilitasse sua posterior separação pelos métodos cromatográficos.
Um dos métodos avaliados neste trabalho para a concentração do extrato
enzimático bruto foi a ultrafiltração com membrana de retenção de 10 kDa. Este
método não se mostrou adequado, pois foi verificado o constante entupimento da
membrana, que acabou ocasionando perdas de amostra e o aumento no tempo do
processo. Ao final de 18 horas, o volume de amostra retido pela membrana foi
reduzido em aproximadamente 4 vezes em relação ao volume inicial. A análise da
fração concentrada revelou uma baixa atividade específica de xilanase e um baixo
rendimento do processo. Também foi detectada a atividade enzimática de xilanase
na fração filtrada (dados não apresentados). As possíveis explicações para o
insucesso deste método foram as perdas de amostra observadas, a desnaturação
das proteínas durante o processo e também uma possível atividade de proteases no
extrato enzimático bruto.
Outro método de concentração avaliado foi a precipitação fracionada do
sobrenadante de cultivo com sulfato de amônio nas concentrações de 40, 60 e 80 %
de saturação, seguido de diálise e liofilização das amostras, como descrito no item
3.3.4.1. A escolha deste método deve-se ao fato de que o aumento gradual da
196
concentração de sulfato de amônio em uma mistura complexa de proteínas permite

a separação da proteína de interesse em relação as demais, pois cada proteína
apresenta diferenças quanto à concentração de sal necessária para sua precipitação
(Pessoa Júnior; Kilikian, 2005). Na Tabela 19 são apresentados os resultados
obtidos nos ensaios de concentração do extrato enzimático bruto de B. licheniformis
CBMAI 1609 por precipitação fracionada com sulfato de amônio.
Tabela 19 – Concentração do sobrenadante de cultivo de B. licheniformis CBMAI 1609 por

precipitação fracionada com sulfato de amônio
Atividade
Atividade
Volume Proteínas específica
de Fator de Recuperação
Amostras total totais de
xilanase purificação ( %)
(mL) (mg) xilanase
total (U)
(U/mg)
Extrato enzimático
250 1.322,50 792,5 1,669 1 100
bruto
Preparação 40 % * 198 439,56 401,94 1,094 0,65 33,23
Preparação 60 % * 29 351,48 69,31 5,071 3,03 26,57
Preparação 80 % * 31 22,32 47,74 0,468 0,28 1,68
Sobrenadante final
250 0,57 115 0,005 < 0,01 0,04
da precipitação
* Preparações enzimáticas concentradas por precipitação fracionada com sulfato de amônio nas
concentrações de 40, 60 e 80 % de saturação, respectivamente. Após o processo de diálise e
liofilização, essas amostras foram ressuspendidas em tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 6,0, na
concentração final de 10 mg/mL.
Como pode ser observado na Tabela 19, nas preparações enzimáticas

concentradas com 40 e 60 % de saturação com sulfato de amônio foram obtidas as
maiores atividades enzimáticas de xilanase e valores de recuperação de 33,2 e
26,5 %, respectivamente. Na preparação enzimática concentrada com 80 % de
sulfato de amônio e no sobrenadante final do processo foram observadas baixas
atividades de xilanase e rendimentos abaixo de 2 %.
Conforme mencionado anteriormente, um dos objetivos da realização dos
testes de concentração por precipitação fracionada era verificar se a atividade
enzimática do complexo multienzimático, neste caso acompanhada através da
atividade de xilanase, era mais expressiva em uma das preparações enzimáticas
concentradas por determinada saturação de sulfato de amônio. Embora as
197
preparações enzimáticas concentradas com 40 e 60 % de sulfato de amônio tenham

apresentado altas atividades enzimáticas de xilanase, o objetivo esperado foi
alcançado, pois a preparação enzimática concentrada com 40 % de sulfato de
amônio apresentou uma baixa atividade específica de xilanase (1,094 U/mg). Por
outro lado, como apresentado na Tabela 19, a preparação enzimática concentrada
com 60 % de saturação de sulfato de amônio exibiu um baixo teor de proteínas, que
resultou no aumento de aproximadamente 3 vezes da atividade específica de
xilanase desta amostra em relação aos valores observados no extrato enzimático
bruto (passando de 1,669 U/mg para 5,071 U/mg).
A partir dos resultados obtidos nos testes de concentração do extrato
enzimático bruto, pode-se concluir que ambos os métodos avaliados não tiveram
uma boa recuperação enzimática. No entanto, a precipitação fracionada com sulfato
de amônio, mesmo sendo um método demorado, com várias etapas e inviável em
grandes escalas, possibilitou a obtenção de uma preparação enzimática (preparação
enzimática concentrada com 60 % de sulfato de amônio) com uma quantidade
menor de impurezas para ser utilizada nos ensaios posteriores de purificação por
métodos cromatográficos.
No estudo da purificação do complexo multienzimático produzido pela
linhagem B. licheniformis SVD1, Van DyK (2009) também comparou os métodos de
concentração do sobrenadante de cultivo por ultrafiltração com membrana de
retenção de 10 kDa no sistema AMICON 8200 e o de precipitação por sulfato de
amônio com 80 % de saturação. Diferentemente dos resultados obtidos no presente
trabalho, foi observado que o melhor método para concentração do sobrenadante de
cultivo foi a ultrafiltração, que apresentou uma recuperação de 54 % da atividade de
xilanase inicial, enquanto a precipitação com sulfato de amônio teve uma
recuperação de 21 %.
Em outro estudo, Jones, Van Dyk e Pletschke (2012) utilizaram o método
de concentração do sobrenadante de cultivo por ultrafiltração com membrana de
retenção de 50 kDa em sistema Amicon 8200 como uma das etapas para purificação
do multienzimático hemicelulolítico de B. subtilis SJ01 e relataram que não houve o
aumento das atividades específicas ao final do processo de concentração e que as
taxas de recuperação foram de 24,5 e 27,1 % para as atividade de xilanase e
endoglucanase, respectivamente. O baixo rendimento observado neste trabalho
segundo os autores foi devido à remoção de xilanases e endoglucanases que
198
estavam presentes na amostra na forma livre e que foram recolhidas na fração

filtrada.
Na purificação do complexo multienzimático do tipo xilanossomo
produzido por Streptomyces olivaceoviridis E-86, Jiang et al. (2005) utilizaram o
método de precipitação fracionada com sulfato de amônio para concentrar o
sobrenadante de cultivo antes da etapa de purificação em colunas cromatográficas.
A maior atividade enzimática de xilanase foi encontrada na fração precipitada com
30 a 50 % de saturação com sulfato de amônio. O sobrenadante de cultivo neste
trabalho foi concentrado 3,1 vezes com a recuperação de 42,2 % da atividade inicial
de xilanase.

licheniformis CBMAI 1609 utilizando colunas cromatográficas
de troca iônica
Conforme mencionado no item 3.3.4.2 foi realizada inicialmente uma
avaliação de colunas de troca iônica com o objetivo de selecionar uma coluna que
proporcionasse uma melhor separação do possível complexo multienzimático
produzido por B. licheniformis CBMAI 1609 das demais proteínas presentes na
preparação enzimática concentrada com 60 % de sulfato de amônio. Foram
realizados testes usando as colunas de troca aniônica DEAE Sepharose Fast Flow e
Q Sepharose Fast Flow e a coluna de troca catiônica CM Sepharose Fast Flow, nas
condições descritas anteriormente.
A Figura 33 ilustra a purificação da preparação enzimática concentrada
aniônica Q Sepharose previamente equilibrada com tampão Tris-HCl 50 mM, pH 8,0.
Nesta figura também está apresentada a análise eletroforética por gel nativo das
frações reunidas e concentradas de cada um dos picos de eluição das proteínas
observados durante a corrida cromatográfica na coluna Q Sepharose.
Como pode ser visualizado na Figura 33, a preparação enzimática
concentrada com 60 % de sulfato de amônio foi separada em 5 picos de proteínas
na coluna Q Sepharose, sendo quatro destes picos eluídos durante o gradiente
salino. As frações correspondentes a estes 5 picos foram reunidas e denominadas
Q1, Q2, Q3, Q4 e Q5. As proteínas presentes na amostra injetada na coluna e nos
picos de eluição foram analisadas por eletroforese em condições não desnaturantes
199
(gel nativo) na tentativa de visualizar e diferenciar a amostra que continha o possível

complexo multienzimático das demais proteínas. Devido à alta massa molecular dos
complexos multienzimáticos, estes apresentam lenta migração durante a
eletroforese em gel nativo e são visualizados na porção superior do gel de
separação. Foi observada a presença de várias proteínas na amostra da preparação
enzimática concentrada com 60 % de sulfato de amônio, inclusive de proteínas com
alta massa molecular que migraram pouco no gel. A análise eletroforética em gel
nativo das amostras dos picos de eluição das proteínas revelou a separação do
possível complexo multienzimático das demais proteínas nos picos Q1 e Q2, este se
apresentou como uma banda única predominante no alto do gel nestas duas
amostras. Nos demais picos (Q3, Q4 e Q5) foi visualizada a presença de proteínas
de alta massa molecular e também de menor tamanho, possivelmente estas são
outras enzimas produzidas pelo micro-organismo na forma não complexada.
Figura 33 – Cromatograma da purificação da preparação enzimática concentrada com 60 %

de sulfato de amônio de B. licheniformis CBMAI 1609 em coluna de troca aniônica Q
Sepharose Fast Flow (a) e análise eletroforética dos picos de eluição das proteínas por gel
nativo (b)
(1:preparação enzimática concentrada com 60 % de sulfato de amônio; 2: amostra de proteínas do
pico Q1; 3: amostra de proteínas do pico Q2; 4: amostra de proteínas do pico Q3; 5: amostra de
proteínas do pico Q4; 6: amostra de proteínas do pico Q5)
Na Figura 34 são apresentados os resultados dos ensaios qualitativos de

atividade enzimática para xilanase, endoglucanase, xiloglucanase, liquenase,
200
mananase e galactanase utilizando as amostras dos picos da purificação na coluna

de troca aniônica Q Sepharose. As atividades enzimáticas foram realizadas como
descrito anteriormente, porém o tempo de incubação teve de ser aumentado para 3
horas devido ao baixo teor de proteínas nas amostras utilizadas. A ocorrência da
reação enzimática neste ensaio pode ser visualizada pelo aparecimento da
coloração alaranjada ou marrom, dependendo do nível de hidrólise do substrato,
após a determinação de açúcares redutores com DNS. Como pode ser observado
na Figura 34, foram constatadas atividades enzimáticas sobre os substratos xilana,
β-glucano e galactana em todos os picos. A atividade enzimática de mananase só
não foi observada no pico Q1. Não foram também observadas atividades
enzimáticas significativas, nas condições utilizadas de ensaio, para as enzimas
endoglucanase e xiloglucanase em nenhum dos picos obtidos nesta purificação.
Figura 34 – Ensaios de atividade enzimática de xilanase, endoglucanase, xiloglucanase,

liquenase, mananase e galactanase com as amostras dos picos obtidos na purificação em
coluna de troca aniônica Q Sepharose Fast Flow
(Q1: amostra de proteínas do pico Q1; Q2: amostra de proteínas do pico Q2; Q3: amostra de
proteínas do pico Q3; Q4: amostra de proteínas do pico Q4; Q5: amostra de proteínas do pico Q5)
Na Figura 35 é ilustrada a purificação da preparação enzimática

concentrada com 60 % de saturação por sulfato de amônio em coluna de troca
aniônica DEAE Sepharose previamente equilibrada com tampão Tris-HCl 50 mM, pH
8,0, e a análise por gel nativo das frações reunidas e concentradas de cada um dos
picos de proteínas obtidos.
Diferentemente da purificação na coluna de troca aniônica Q Sepharose,
foi observada na corrida cromatográfica utilizando a coluna DEAE Sepharose a
separação das proteínas presentes na preparação enzimática concentrada em 4
201
picos, denominados D1, D2, D3 e D4. A análise por gel nativo das frações coletadas
dos 4 picos de proteínas separados pela coluna DEAE Sepharose também revelou a
separação do possível complexo multienzimático das demais proteínas presentes na
amostra injetada na coluna, sendo este encontrado praticamente puro nos dois
primeiros picos de eluição das proteínas (picos D1 e D2). Foi também observado
que o possível complexo multienzimático de B. licheniformis CBMAI 1609 está
presente em maior concentração na amostra do pico D1. A análise das amostras dos
outros dois picos desta purificação (picos D3 e D4) por eletroforese em gel nativo
revelou a presença de várias bandas de proteínas de menor tamanho e também a
existência de bandas de proteínas com alta massa molecular.
Figura 35 – Cromatograma da purificação da preparação enzimática concentrada com 60 %

de sulfato de amônio de B. licheniformis CBMAI 1609 em coluna de troca aniônica DEAE
Sepharose Fast Flow (a) e análise eletroforética dos picos de eluição das proteínas por gel
nativo (b)
(1:preparação enzimática concentrada com 60 % de sulfato de amônio; 2: amostra de proteínas pico
D1; 3: amostra de proteínas pico D2; 4: amostra de proteínas pico D3; 5: amostra de proteínas pico
D4)
Assim como na purificação utilizando a coluna Q Sepharose, as amostras

obtidas nos picos de eluição das proteínas na purificação na coluna DEAE
Sepharose também foram analisadas quanto à atividade enzimática de xilanase,
endoglucanase, xiloglucanase, liquenase, mananase e galactanase. Os resultados
dos ensaios de atividade enzimática obtidos após 3 horas de reação estão ilustrados
202
na Figura 36. Foram detectadas as atividades enzimáticas de xilanase, liquenase,

mananase e galactanase em todos os 4 picos de eluição das proteínas na coluna
DEAE Sepharose. A atividade de xiloglucanase só não foi observada na amostra
referente ao pico D2. Com relação à atividade de endoglucanase, esta foi detectada
fracamente apenas na amostra do pico D1.
Figura 36 – Ensaios de atividade enzimática de xilanase, endoglucanase, xiloglucanase,

liquenase, mananase e galactanase com as amostras dos picos obtidos na purificação em
coluna de troca aniônica DEAE Sepharose Fast Flow
(Branco: reação enzimática controle, sem adição de enzima; D1: amostra de proteínas do pico D1;
D2: amostra de proteínas do pico D2; D3: amostra de proteínas do pico D3; D4: amostra de proteínas
do pico D4)
Na Figura 37 é apresentado o cromatograma da purificação da

preparação enzimática concentrada com 60 % de sulfato de amônio na coluna de
troca catiônica CM Sepharose Fast Flow previamente equilibrada com tampão
fosfato de sódio 50 mM, pH 6,0. A utilização desta coluna não se mostrou adequada
para a separação do possível complexo multienzimático das demais proteínas
presentes na preparação enzimática concentrada com 60 % de sulfato de amônio,
pois as proteínas foram eluídas em apenas dois picos, sendo um deles (o de maior
intensidade) eluído ainda durante a lavagem da coluna com o tampão e o outro (de
menor intensidade) durante o gradiente salino (com 17 % do gradiente). As amostras
correspondentes a estes dois picos de eluição das proteínas apresentaram todas as
atividades enzimáticas avaliadas com intensidades diferentes e também a presença
de várias bandas no gel nativo (dados não apresentados). Uma possível explicação
para esta aparente falta de interação das proteínas com a coluna de troca catiônica
CM Sepharose é que estas não se encontravam abaixo do seu ponto isoelétrico na
203
condição de pH utilizada e portanto, não estavam carregadas positivamente para

interagir com os grupos ligantes carboximetil da resina que apresentavam carga
negativa.
Figura 37 – Purificação da preparação enzimática concentrada com 60 % de sulfato de

amônio de B. licheniformis CBMAI 1609 em coluna de troca catiônica CM Sepharose Fast
Flow
Os resultados obtidos durante as purificações avaliando as três colunas

de troca iônica, demonstraram que o possível complexo multienzimático de B.
licheniformis CBMAI 1609 apresenta uma fraca capacidade de se ligar as colunas
avaliadas, pois este foi eluído durante a lavagem das colunas com tampão e em
baixas concentrações de sal durante a aplicação do gradiente salino. No entanto, a
utilização das colunas de troca aniônica DEAE Sepharose e Q Sepharose
visivelmente permitiu a separação desse possível complexo multienzimático das
demais proteínas existentes na preparação enzimática concentrada com 60 % de
sulfato de amônio. A partir dos resultados obtidos, a coluna DEAE Sepharose Fast
Flow foi selecionada para ser utilizada na purificação desse possível complexo
multienzimático, pois permitiu a separação deste das demais proteínas presentes na
amostra injetada na coluna e aparentemente favoreceu a sua eluição em uma maior
concentração em um único pico (pico D1).
204
4.3.3.3. Purificação do complexo multienzimático de B. licheniformis

molecular
O possível complexo multienzimático de B. licheniformis CBMAI 1609
presente na amostra de proteínas do pico D1 da cromatografia em coluna de troca
aniônica DEAE Sepharose foi posteriormente aplicado em coluna de exclusão
molecular Superdex 200 10/300 GL, para remoção de proteínas interferentes ainda
presentes na amostra e para confirmar a sua alta massa molecular. A Figura 38
ilustra essa etapa de purificação da amostra do pico D1 na coluna de exclusão
molecular previamente equilibrada com tampão Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, e a análise
eletroforética por gel nativo da proteína purificada.
Na etapa de purificação em coluna de exclusão molecular Superdex 200
foi observada a presença de um pico principal de proteínas, que foi eluído na
posição correspondente ao volume morto desta coluna de exclusão molecular
(Figura 32). O gel nativo das frações coletadas e reunidas deste pico de proteínas
revelou a presença de uma única banda na parte superior do gel, confirmando a
pureza e alta massa molecular da proteína presente nesta amostra. Também foi
observado durante este passo cromatográfico a eluição de um pequeno pico de
proteínas de baixa massa molecular.
A alta massa molecular da proteína purificada do pico D1 na
cromatografia de exclusão molecular, possivelmente superior a 1.300 kDa, e a
presença de mais de uma atividade enzimática nesta amostra são caraterísticas que
corroboram a hipótese da existência de um complexo multienzimático no
sobrenadante de cultivo de B. licheniformis CBMAI 1609. Desta forma, a estratégia
de purificação adotada permitiu alcançar o objetivo de investigar a presença desta
estrutura no sobrenadante de cultivo do micro-organismo e isolá-la das demais
proteínas. Estudos posteriores utilizando uma coluna de exclusão molecular com um
limite de exclusão maior são necessários para a correta estimativa da massa
molecular deste complexo multienzimático.
205
Figura 38 – Cromatograma da purificação em coluna de exclusão molecular Superdex 200

10/300 GL das proteínas do pico D1 da etapa cromatográfica em coluna de troca aniônica
DEAE Sepharose e análise eletroforética por gel nativo da amostra de proteínas eluídas na
cromatografia em coluna de exclusão molecular
Na Tabela 20 estão descritos os resultados do processo de purificação do

complexo multienzimático de B. licheniformis CBMAI 1609 envolvendo a precipitação
fracionada com sulfato de amônio a 60 % de saturação e as etapas cromatográficas
em colunas de troca aniônica DEAE Sepharose e de exclusão molecular Superdex
200 equilibradas com tampão Tris-HCl 50 mM, pH 8,0. Os resultados apresentados
nesta Tabela são baseados apenas na atividade enzimática de xilanase.
Observou-se que a atividade de xilanase do extrato enzimático bruto foi
concentrada 2,46 vezes com recuperação de 18 % da atividade inicial através da
precipitação fracionada com sulfato de amônio a 60 % de saturação. Estes
resultados diferiram um pouco daqueles valores obtidos anteriormente na Tabela 19,
possivelmente devido a variação da concentração de amostra utilizada, que neste
caso foi de 20 mg/mL. Verificou-se também que a atividade de xilanase foi maior no
pico D1 da purificação na coluna DEAE Sepharose, sendo esta purificada 3,57
vezes com recuperação de 2,8 % da atividade inicial. A etapa de purificação do pico
D1 em coluna de exclusão molecular permitiu o isolamento do possível complexo
multienzimático purificado, porém este processo aparentemente ocasionou uma
grande perda da atividade enzimática com recuperação de apenas 0,14 % da
atividade de xilanase inicial e com um fator de purificação de 1,23 vezes. Foi
206
também constatado que o complexo multienzimático purificado obtido no final do

processo apresentou atividade específica de xilanase de 2,07 U/mg.
Tabela 20 – Purificação do complexo multienzimático de B. licheniformis CBMAI 1609 por

precipitação fracionada com sulfato de amônio e cromatografia em colunas de troca aniônica
DEAE Sepharose e de exclusão molecular Superdex 200
Atividade
Proteínas Atividade
Etapa de Volume de Fator de Rendimento
totais específica
purificação (mL) xilanase purificação (%)
(mg) (U/mg)
total (U)
Extrato
enzimático 35 185,5 110,95 1,67 1 100
bruto
Preparação
2 33,8 8,2 4,12 2,46 18,22
60 % *
Pico D1 4 5,26 0,88 5,97 3,57 2,83
Pico D2 2,5 0,64 0,15 4,26 2,55 0,34
Pico D3 3 0,05 0,42 0,11 0,06 0,02
Pico D4 4,5 0,04 0,27 0,14 0,08 0,02
Pico D1
2,7 0,27 0,13 2,07 1,23 0,14
Superdex 200
* Preparação enzimática concentrada por precipitação fracionada com 60 % de sulfato de amônio

ressuspendida em tampão Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, na concentração de 20 mg/mL, após diálise e
liofilização
Segundo Van Dyk (2009), as informações obtidas no processo de

purificação de complexos multienzimáticos, como as apresentadas na Tabela 20,
precisam ser avaliadas sobre uma perspectiva diferente da tradicionalmente
utilizada, pois um grupo de enzimas acaba sendo purificado e não apenas uma
única proteína. Como durante o processo de purificação de complexos
multienzimáticos é avaliada a atividade de uma única enzima, que pode estar
presente na amostra inicial na forma complexada como na forma livre, é comum
nestes casos a obtenção de baixos rendimentos, pois durante os passos da
purificação as enzimas na forma livre são removidas e acabam causando uma
redução da atividade enzimática avaliada. A atividade específica e o fator de
purificação dos complexos multienzimáticos também podem ser baixos ao final do
207
processo de purificação, pois a atividade enzimática acaba sendo mensurada

considerando-se um grupo de proteínas (Jones, 2010; Van Dyk, 2009).
Além dos motivos apresentados anteriormente para os baixos
rendimentos observados neste trabalho, outros fatores podem ter contribuído para
as perdas de proteínas do complexo multienzimático e para uma aparente
desnaturação proteica, como a escala do processo de purificação cromatográfica,
que envolveu várias corridas nas duas colunas utilizadas, e a necessidade de etapas
de concentração das amostras entre os passos da purificação cromatográfica. Uma
melhora destes resultados poderá ser alcançada através de estudos futuros
envolvendo a otimização das condições de concentração do extrato enzimático
bruto, assim como do processo de purificação cromatográfica, visando à diminuição
do número de etapas e o aumento da recuperação final do complexo
multienzimático.
Comparativamente, no estudo da purificação do complexo multienzimático
produzido pela linhagem B. licheniformis SVD1, Van Dyk (2009) utilizou uma
estratégia semelhante à adotada neste trabalho. Após a concentração do
sobrenadante de cultivo por ultrafiltração utilizando membrana com retenção de 50
kDa foram realizadas etapas cromatográficas em colunas de troca aniônica
Toyopearl DEAE 650M e de exclusão molecular Sepharose 4B. Neste estudo
também foi observada a separação das proteínas do sobrenadante de cultivo
concentrado em 4 picos durante a etapa de purificação em coluna de troca aniônica
e a presença da atividade enzimática de xilanase em todos os picos, sendo a maior
atividade constatada no primeiro pico de eluição das proteínas. Os autores deste
trabalho também relataram que a etapa de purificação em coluna de exclusão
molecular da amostra do primeiro pico eluído na coluna de troca aniônica possibilitou
a separação do complexo multienzimático das demais proteínas de baixa massa
molecular. A análise dos demais picos da coluna de troca aniônica por cromatografia
de exclusão molecular revelou a presença de várias proteínas de baixa massa
molecular nestas amostras, possivelmente enzimas produzidas pelo micro-
organismo na forma livre. Com a utilização desta estratégia de purificação, o
complexo multienzimático de B. licheniformis SVD1 foi purificado cerca de 11,5
vezes com recuperação de 11 % da atividade inicial de xilanase e apresentou
atividade específica de xilanase de 0,78 U/mg de proteína. Neste trabalho, os
autores também avaliaram a purificação do sobrenadante de cultivo concentrado
208
diretamente em coluna de exclusão molecular e observaram que a utilização desta

estratégia de purificação possibilitou a recuperação de 50 % da atividade inicial de
xilanase no complexo multienzimático.
Jones, Van Dyk e Pletschke (2012) ao realizarem a purificação de duas
isoformas do complexo multienzimático hemicelulolítico produzido pela linhagem B.
subtilis SJ01, por ultrafiltração com membrana de retenção de 50 kDa e
cromatografia em coluna de exclusão molecular Sephacryl S-400, também
observaram um baixo fator de purificação ao final do processo (aproximadamente
1,5 para atividade de xilanase e 0,4 para a atividade de endoglucanase) e
recuperação de 10,6 e 3,1 % das atividades enzimáticas iniciais de xilanase e de
endoglucanase, respectivamente. Os dois complexos multienzimáticos purificados
apresentaram atividade específica de xilanase de 0,24 e 0,14 U/mg de proteína,
respectivamente.
Na purificação do xilanossomo produzido por Streptomyces olivaceoviridis
E-86, Jiang et al. (2005) obtiveram um fator de purificação de 6,4 vezes e
recuperação de 18,2 % da atividade de xilanase inicial utilizando a estratégia de
concentração do sobrenadante de cultivo por precipitação fracionada com sulfato de
amônio (30 - 50 % de saturação) seguido de um passo cromatográfico em coluna de
exclusão molecular Sephacryl S-300.
Na maioria dos métodos de purificação de complexos multienzimáticos
descritos na literatura, especialmente de celulossomos, a primeira etapa de
purificação cromatográfica é realizada explorando a afinidade destes complexos
multienzimáticos com substratos celulósicos insolúveis, devido a presença de
domínios de ligação a celulose na proteína estrutural escafoldina, principalmente o
domínio CBM3a. Nestes casos, o complexo multienzimático e outras enzimas na
forma livre produzidas pelo micro-organismo que também possuam domínios de
ligação à celulose são separados das demais proteínas do sobrenadante de cultivo
por ficarem aderidas ao substrato celulósico. Após a eluição das proteínas ligadas a
celulose com trietilamina ou solução tampão, é geralmente realizada uma etapa
cromatográfica em coluna de exclusão molecular para separação do complexo
multienzimático das enzimas livres (Bayer; Setter; Lamed, 1985; Beukes; Pletschke,
2006; Camargo, 2013; Ponpium; Ratanakhanokchai; Kyu, 2000; Tachaapaikoon et
al., 2012a; Tachaapaikoon et al., 2012b; Wang; Chen; Hseu, 2014).
209
Na literatura são encontrados poucos trabalhos que relatam a utilização

de etapas cromatográficas em colunas de troca iônica para a purificação de
complexos multienzimáticos. No entanto, alguns dos trabalhos que utilizaram este
passo cromatográfico relataram a separação de diferentes isoformas do complexo
multienzimático produzidas pelo mesmo micro-organismo.
Pason et al. (2010) estudaram a purificação de um complexo
multienzimático contendo várias xilanases e celulases produzido por Paenobacillus
curdlanolyticus B-6 e descreveram a separação de 5 isoformas desse complexo
multienzimático através de uma etapa de purificação em coluna de troca aniônica
Hiload 16/10 Q-Sepharose High Performance após as etapas de purificação por
cromatografia de afinidade com Avicel e em coluna de exclusão molecular Hiprep
26/60 Sephacryl S-300.
Kim e Kim (1993) ao realizarem a purificação de um complexo
multienzimático apresentando atividades de celulase e xilanase produzido por B.
circulans F-2 relataram a separação de duas isoformas desse complexo
multienzimático durante a etapa de purificação em coluna de troca aniônica DEAE
Toyopearl M650. Posteriormente, estas duas isoformas foram purificadas em coluna
de exclusão molecular HPLC TSK Gel Toyopearl HW-65S e apresentaram diferentes
massas moleculares, uma com 669 kDa e a outra com 443 kDa. Os estudos de
caracterização bioquímica realizados pelos autores confirmaram a existência das
duas isoformas e revelaram diferenças entre estas quanto à constituição e
propriedades catalíticas.
Em outro estudo, Han et al. (2005) avaliaram o efeito de diferentes fontes
de carbono na produção do celulossomo de Clostridium cellulovarans e observaram
a presença de diferentes isoformas desse complexo multienzimático ao realizarem a
separação cromatográfica em coluna de troca aniônica Resource Q de uma amostra
previamente purificada por precipitação com sulfato de amônio seguida dos passos
cromatográficos de afinidade com Avicel e em coluna de exclusão molecular HiLoad
26/60 Superdex 200. Segundo os autores deste trabalho, a presença de várias
isoformas de um complexo multienzimático pode ocorrer devido à quantidade das
várias enzimas que são induzidas pelos substratos utilizados e também pelas
diferentes interações entre os domínios coesina da proteína estrutural escafoldina e
os domínios doquerina das subunidades enzimáticas que compõem o complexo.
210
4.3.3.4. Avaliação de algumas propriedades do complexo

multienzimático de B. licheniformis CBMAI 1609
Na tentativa de proporcionar outras evidências da presença do complexo
multienzimático de B. licheniformis CBMAI 1609 e obter algumas informações de sua
composição foram realizadas análises eletroforéticas por SDS-PAGE e zimografia
utilizando as amostras obtidas durante os passos da purificação. Na Figura 39 é
apresentada a análise eletroforética por SDS-PAGE das amostras correspondentes
aos passos de purificação desse complexo multienzimático.
A análise da preparação enzimática concentrada com 60 % de sulfato de
amônio por SDS-PAGE revelou que esta amostra apresentava várias proteínas com
massa molecular entre 10 e 100 kDa (canaleta 1). É possível observar na Figura 39
(canaletas 2 e 3) que a proteína de alta massa molecular visualizada na eletroforese
em gel nativo nas amostras dos picos de eluição D1 e D2 da purificação na coluna
DEAE Sepharose (Figura 35) foram dissociadas em várias subunidades proteicas
com massa molecular entre 10 e 70 kDa nas condições da eletroforese SDS-PAGE.
Esta é mais uma evidência da presença de um complexo multienzimático no extrato
enzimático bruto deste micro-organismo. Na amostra do pico de eluição D1 (canaleta
2) foi detectada a presença de ao menos 15 proteínas, enquanto na amostra do pico
de eluição D2 foi observada a presença de ao menos 10 proteínas (canaleta 3).
Constatou-se também que os perfis das proteínas destes dois picos de eluição
apresentavam diferenças quanto à composição e intensidade das bandas de
proteínas no gel SDS-PAGE, desta forma, pode-se sugerir a possível presença de
duas isoformas do complexo multienzimático no sobrenadante de cultivo do micro-
organismo, assim como relatado em outros trabalhos descritos anteriormente no
item 4.3.3.3. No entanto, estudos posteriores, como a purificação cromatográfica da
amostra do pico D2 em coluna de exclusão molecular, precisam ser realizados para
confirmar a suposição da existência de diferentes isoformas do complexo
multienzimático de B. licheniformis CBMAI 1609.
Nas amostras correspondentes aos picos D3 e D4 da purificação em
coluna de troca aniônica (canaletas 4 e 5) foram visualizadas várias bandas no gel
SDS-PAGE assim como observado no gel nativo apresentado na Figura 35. As
proteínas presentes nessas duas amostras podem ser outras hidrolases glicosídicas
produzidas na forma livre pelo micro-organismo. Essas duas amostras também
apresentaram diferenças quanto à composição e intensidade das bandas
211
visualizadas no gel SDS-PAGE. Na canaleta 6 da Figura 39 é possível observar que

a amostra do pico D1 após o passo cromatográfico em coluna de exclusão
molecular, que corresponde ao complexo multienzimático purificado, apresentou ao
menos 10 proteínas no gel SDS-PAGE. Constatou-se que esta amostra exibiu uma
ligeira diferença quanto ao perfil de bandas no gel SDS-PAGE em comparação a
mesma amostra antes da cromatografia de exclusão molecular (canaleta 2), sendo
visualizada a ausência de algumas proteínas com massa molecular entre 10 e 25
kDa. Possivelmente estas subunidades proteicas podem ter se desligado do
complexo multienzimático e foram perdidas durante os passos de concentração e
purificação na coluna de exclusão molecular.
Figura 39 – Análise eletroforética por SDS-PAGE das amostras dos picos de eluição das
proteínas obtidos nas purificações em colunas de troca aniônica DEAE Sepharose Fast Flow
e de exclusão molecular Superdex 200 10/300 GL
(M: marcador de massa molecular; 1: preparação enzimática concentrada com 60 % de sulfato de
amônio; 2: amostra proteínas pico D1; 3: amostra proteínas pico D2; 4: amostra proteínas pico D3; 5:
amostra proteínas pico D4; 6: amostra proteínas pico D1 após cromatografia de exclusão molecular)
Segundo Ratanakhanokchai et al. (2013), os complexos multienzimáticos

produzidos por micro-organismos aeróbios normalmente são constituídos de 5 a 12
subunidades proteicas e podem apresentar massa molecular entre 468 kDa e 2.000
kDa. Já os complexos multienzimáticos de alguns micro-organismos anaeróbios
podem apresentar entre 600 e 2.100 kDa e serem formados por 10 a 15
subunidades proteicas. No caso dos complexos multienzimáticos do tipo
celulossomo de algumas espécies de Clostridium podem ser encontradas estruturas
212
ainda maiores, sendo estas compostas por até 50 subunidades proteicas (Schwarz,
2001).
A composição do complexo multienzimático purificado neste trabalho
aparentemente apresentou algumas similaridades com o complexo multienzimático
isolado por Van Dyk et al. (2010) a partir do sobrenadante de cultivo da linhagem B.
licheniformis SVD1 em meio de cultura contendo xilana como substrato indutor. Os
autores observaram que este complexo multienzimático apresentava massa
molecular de 2.000 kDa e a análise deste por SDS-PAGE revelou a presença de 17
proteínas com tamanho entre 19 e 79 kDa na sua constituição.
No estudo realizado por Jones, Van Dyk e Pletschke (2012) foi observado
que as duas isoformas do complexo multienzimático de B. subtilis SJ01 também
eram formadas por subunidades proteicas menores que 100 kDa, sendo a maior
isoforma desse complexo multienzimático, com 371 kDa, composta de 16 proteínas
enquanto a menor isoforma, com 267 kDa, era formada por 18 proteínas.
Comparativamente, Pason, Kyu e Ratanakhanokchai (2006) relataram
que uma das isoformas do complexo multienzimático produzido por Paenibacillus
curdlanolyticus B-6, quando este foi cultivado em meio de cultura contendo xilana,
apresentava massa molecular de 1.450 kDa e era composta por 8 subunidades
proteicas com massa molecular entre 48 e 224 kDa. Em outro estudo,
Tachaapaikoon et al. (2012b) constataram que o complexo multienzimático de
Paenibacillus sp. TW1 apresentava aproximadamente 1.950 kDa e era formado por
18 subunidades proteicas com massa molecular entre 17 e 271 kDa.
Por outro lado, o complexo multienzimático celulolítico isolado por Wang,
Chen e Hseu (2014) a partir do sobrenadante de cultivo do fungo anaeróbico
Neocallimastix patriciarum J11 apresentava massa molecular de 670 kDa e análise
por SDS-PAGE revelou que este era constituído por 12 proteínas com tamanho
entre 28 e 250 kDa. No estudo realizado por Ponpium, Ratanakhanokchai e Kyu
(2000), foi detectado que o complexo multienzimático do tipo celulossomo de
Bacteroides sp. P-1 apresentava massa molecular de aproximadamente 1.400 kDa
e era formado por 12 subunidades proteicas com massa molecular entre 49 e 209
kDa. Lamed, Setter e Bayer (1983) relataram que o complexo multienzimático do tipo
celulossomo produzido por Clostridium thermocellum possuía massa molecular
maior que 2.000 kDa e era composto de 14 proteínas que apresentavam massa
molecular entre 20 a 250 kDa.
213
Não foi observada na análise do gel SDS-PAGE para as amostras

correspondentes ao complexo multienzimático de B. licheniformis CBMAI 1609
(canaletas 2, 3 e 6 da Figura 39) a presença de proteínas de alta massa molecular
que poderiam corresponder a proteína estrutural escafoldina. Esta proteína é
considerada a base dos complexos multienzimáticos, pois serve como um suporte
para os domínios catalíticos das enzimas e também para domínios de ligação ao
substrato durante a formação dos complexos multienzimáticos, além disso, esta
também apresenta a função de ancorar os complexos multienzimáticos à parede
celular microbiana (Doi et al., 2003). Nos complexos multienzimáticos do tipo
celulossomo de linhagens do gênero Clostridium, que são os mais estudados até o
momento, estas proteínas têm como características o fato de serem normalmente
grandes e altamente glicosiladas (Bayer et al., 1998; Schwarz, 2001).
Como os estudos de complexos multienzimáticos produzidos por micro-
organismos do gênero Bacillus são recentes, ainda há pouca informação sobre o
mecanismo de formação e estrutura destes e se as características da proteína
estrutural escafoldina são as mesmas encontradas nos complexos multienzimáticos
de micro-organismos do gênero Clostridium (Jones, 2010; Phitsuwan et al., 2012;
Van Dyk, 2009).
Em um dos poucos trabalhos existentes na literatura sobre a estrutura de
complexos multienzimáticos produzidos por micro-organismos aeróbios,
Ratanakhanokchai et al. (2013), relataram o isolamento de uma proteína glicosilada
de 280 kDa a partir de uma das isoformas do complexo multienzimático de
Paenibacillus curdlanolyticus B-6. Esta proteína não apresentou homologia de
sequência com as proteínas depositadas em bancos de dados, mas exibiu atividade
de xilanase e celulase, capacidade de ligação a xilana e função de ancoragem a
célula microbiana. Segundo estes autores, a interação desta proteína com as
subunidades enzimáticas deve ocorrer possivelmente por um mecanismo diferente
da interação coesina e doquerina conhecida nos complexos multienzimáticos do tipo
celulossomo de micro-organismos anaeróbios, pois não foram observadas
sequências deste tipo nesta proteína e em uma das subunidades enzimáticas que
formavam este complexo multienzimático.
A realização de estudos posteriores como a análise proteômica da
amostra purificada do complexo multienzimático de B. licheniformis CBMAI 1609 e
análises de bioinformática utilizando sequências de genes deste micro-organismo,
214
poderão auxiliar na identificação da ocorrência de alguma proteína que apresenta a

função de escafoldina dentre os componentes do complexo multienzimático isolado
neste trabalho e revelar se este apresenta diferenças quanto a sua formação em
relação as características observadas nos complexos multienzimáticos do tipo
celulossomo de espécies do gênero Clostridium.
Análises de zimografia são normalmente realizadas nos estudos de
complexos multienzimáticos com o objetivo de identificar o número de subunidades
proteicas presentes que possuem atividade enzimática sobre um substrato
específico incorporado ao gel de poliacrilamida. No presente estudo esta análise
também foi realizada com a intenção de visualizar possíveis diferenças na
composição do complexo multienzimático presente nas amostras do pico D1 antes e
depois da purificação em coluna de exclusão molecular. Na Figura 40 são ilustrados
os zimogramas em CMC e xilana para o complexo multienzimático presente nas
amostras do pico D1.
Figura 40 – Análises de zimografia do complexo multienzimático de B. licheniformis CBMAI

1609 presente nas amostras do pico de eluição de proteínas D1 da purificação em coluna de
troca aniônica DEAE Sepharose Fast Flow antes e depois da etapa cromatográfica de
exclusão molecular na coluna Superdex 200 10/300 GL
(a: Zimograma realizado em xilana; b: Zimograma realizado em CMC; 1: amostra do pico D1 antes da
cromatografia de exclusão molecular; 2: amostra do pico D1 depois da cromatografia de exclusão
molecular)
Foi constatada a presença de duas xilanases e de uma endoglucanase

neste complexo multienzimático de B. licheniformis CBMAI 1609 (Figura 40). A
215
análise por SDS-PAGE (Figura 39) tinha revelado a perda de proteínas do complexo
multienzimático durante o passo de exclusão molecular, no entanto, não foram
observadas alterações nos perfis de presença de bandas ativas nas duas amostras
do complexo multienzimático nas análises de zimografia realizadas. O zimograma
em pectina também foi realizado e neste caso foi detectada a presença de uma
banda com atividade de pectinase nas duas amostras (dados não apresentados).
Comparativamente, Van Dyk et al. (2010) relataram a presença de duas
endoglucanases, sete xilanases, duas mananases e uma pectinase no complexo
multienzimático da linhagem B. licheniformis SVD1 através de análises de
zimografia. No estudo realizado por Kim e Kim (1993) foi constatado por meio de
zimogramas que a isoforma do complexo multienzimático de B. circulans com 669
kDa apresentava 5 celulases e 2 xilanases, já a isoforma com 443 kDa era composta
por 3 celulases e 4 xilanases.
No trabalho realizado por Jones, Van Dyk e Pletschke (2012), foi
verificado através de zimogramas em xilana que as duas isoformas do complexo
multienzimático de B. subtilis SJ01 apresentavam cinco xilanases com a mesma
massa molecular em sua composição. Esses autores também avaliaram a presença
de celulases através de zimogramas em CMC e Avicel, no entanto, não detectaram
nenhuma banda de proteína ativa sobre estes substratos.
Por outro lado, as análises de zimografia realizadas por Pason, Kyu e
Ratanakhanokchai (2006) e Waeonukul et al. (2009) revelaram que a maior isoforma
do complexo multienzimático produzido por Paenibacillus curdlanolyticus B-6 era
composta por 5 celulases e 7 xilanases, quando o micro-organismo era cultivado em
xilana. Porém, quando esse mesmo micro-organismo foi cultivado em meio de
cultura contendo Avicel constatou-se nesta isoforma do complexo multienzimático a
presença de 10 celulases e 11 xilanases. Em outro estudo, Phitsuwan et al. (2012)
relataram que o complexo multienzimático associado as células do micro-organismo
Tepidimicrobium xylanilyticum BT14 apresentava 4 xilanases e uma celulase em sua
composição.
O número de bandas ativas visualizadas nos zimogramas no presente
trabalho foi menor em comparação com alguns trabalhos na literatura sobre
complexos multienzimáticos e pode não representar o número real de proteínas com
atividade catalítica sobre os substratos avaliados. Este fato pode ter sido em
decorrência da baixa concentração de proteínas nas amostras que foram aplicadas
216
nos géis e também pela inativação das enzimas devido ao tempo de exposição à
alta temperatura na presença de SDS e β-mercaptoetanol para dissociação das
proteínas do complexo multienzimático. A realização de ensaios posteriores de
análise proteômica poderá revelar a existência de mais xilanases, celulases,
pectinases e outras enzimas na composição deste complexo multienzimático.
Foi realizado também no presente estudo um ensaio qualitativo de
especificidade enzimática com o objetivo de avaliar a capacidade de hidrólise de
diferentes substratos polissacarídicos e assim identificar as possíveis atividades
enzimáticas presentes no complexo multienzimático purificado de B. licheniformis
CBMAI 1609 e nas outras amostras proteicas obtidas durante os passos de
purificação. A Figura 41 ilustra o resultado desse teste de especificidade enzimática
com os diferentes substratos avaliados. Neste ensaio enzimático o tempo de reação
precisou ser alterado para 3 horas devido ao baixo teor de proteínas utilizado
(aproximadamente 0,05 μg de proteína para cada amostra).
A preparação enzimática concentrada com 60 % de sulfato de amônio foi
capaz de hidrolisar os substratos arabinana desramificada, arabinana de beterraba
sacarina, arabinoxilana, xilana, CMC, β-glucano, liquenano, manana, pectina,
xiloglucano e galactana, indicando a possível presença nesta amostra das atividades
enzimáticas de arabinanase, α-L-arabinofuranosidase, xilanase, endoglucanase,
liquenase, mananase, poligalacturonase, xiloglucanase e galactanase. Essa amostra
proteica só não foi capaz de hidrolisar o substrato laminarina, indicando a possível
ausência da atividade enzimática de laminarinase (β-1,3-glucanase). A atividade de
laminarinase também não foi observada em nenhuma das demais amostras
proteicas obtidas nos passos da purificação cromatográfica do complexo
multienzimático.
As amostras dos picos D1 e D2 da purificação em coluna de troca
aniônica DEAE Sepharose, que tinham apresentado no gel nativo apenas uma única
banda proteica de alta massa molecular, apresentaram basicamente todas as
atividades enzimáticas descritas anteriormente na preparação enzimática
concentrada com 60 % de sulfato de amônio. Essas duas amostras só diferiram
entre si pela ausência da atividade enzimática de mananase e pela aparente menor
atividade de poligalacturonase na amostra do pico D1. As amostras dos picos D3 e
D4 da purificação em coluna de troca aniônica DEAE Sepharose também
apresentaram semelhanças entre si quanto à presença das enzimas avaliadas,
217
essas duas amostras proteicas foram capazes de hidrolisar os substratos β-glucano,

liquenano, manana, xilana, arabinoxilana, galactana e, de forma mais fraca, os
substratos arabinana desramificada, arabinana de beterraba sacarina, pectina e
xiloglucano. Essas duas amostras (D3 e D4) não foram capazes de hidrolisar o
substrato CMC.
O complexo multienzimático do pico D1 após a cromatografia de exclusão
molecular foi capaz de hidrolisar um número menor de substratos em comparação
com a amostra antes da etapa cromatográfica em coluna de exclusão molecular.
Essa amostra proteica atuou apenas sobre os substratos β-glucano, liquenano,
xilana, arabinoxilana, arabinana desramificada e arabinana de beterraba sacarina,
indicando a possível presença das atividades enzimáticas de liquenase, xilanase, α-
L-arabinofuranosidase e arabinanase na composição do complexo multienzimático.
Esta redução no número de substratos que o complexo multienzimático
apresentou atividade enzimática pode ser em decorrência das perdas de proteínas
durante a etapa cromatográfica em coluna de exclusão molecular Superdex 200,
como visualizado anteriormente na análise por SDS-PAGE (Figura 39). Nas
condições de ensaio utilizadas para a realização deste painel de atividade
enzimática não foram detectadas a hidrólise dos substratos CMC (atividade de
endoglucanase) e pectina de frutas cítricas (atividade de poligalacturonase) na
amostra do complexo multienzimático após a etapa de purificação em coluna de
exclusão molecular como observado anteriormente nos zimogramas. Ensaios de
atividade enzimática para exoglucanase também foram realizados utilizando Avicel
como substrato, porém em nenhuma das amostras proteicas avaliadas foi detectada
a presença desta atividade enzimática. Diante desses resultados, pode-se
considerar que o complexo multienzimático purificado de B. licheniformis CBMAI
1609 apresenta em sua composição enzimas que conferem uma maior
especificidade para a hidrólise de substratos hemicelulósicos, assemelhando-se
desta forma aos complexos multienzimáticos comumente denominados de
xilanossomos.
218
Figura 41 – Painel de substratos para as amostras obtidas durante os passos da purificação

do complexo multienzimático produzido por B. licheniformis CBMAI 1609
(1: CMC; 2: β-glucano; 3: liquenano; 4: manana; 5: xilana; 6: arabinoxilana; 7: arabinana
desramificada; 8: arabinana de beterraba sacarina; 9: laminarina; 10: pectina de frutas cítricas; 11:
xiloglucano; 12: galactana)
Comparativamente, Jiang et al. (2005) constataram que o complexo

multienzimático do tipo xilanossomo de Streptomyces olivaceoviridis E-86 tinha
massa molecular de 1.200 kDa, apresentava 4 xilanases em sua composição e
também possuía alta especificidade para substratos hemicelulósicos. Este complexo
multienzimático exibiu alta atividade enzimática de α-L-arabinofuranosidase e β-
xilosidase, baixa atividade enzimática de liquenase, endoglucanase, celobiohidrolase
e β-glicosidase e a ausência das atividades enzimáticas de exoglucanase,
mananase e laminarinase.
No estudo realizado por Tachaapaikoon et al. (2012b), foi observado que
o complexo multienzimático de Paenibacillus sp. TW1 apresentava as atividades
enzimáticas de xilanase e endoglucanase e também de α-L-arabinofuranosidase,
endoglucanase, exoglucanase e celobiohidrolase. Este complexo multienzimático
também demonstrou alta atividade para a hidrólise de substratos lignocelulósicos
complexos e segundo os autores esta característica deve-se a combinação de
celulases e hemicelulases em sua composição. Em outro estudo, Phitsuwan et al.
(2010) relataram que o complexo multienzimático de Tepidimicrobium xylanilyticum
BT14 apresentava em sua composição além de xilanase e endoglucanase a
219
presença das enzimas β-xilosidase, β-glicosidase, celobiohidrolase, acetil xilana

esterase e arabinofuranosidase.
Jones Jones, Van Dyk e Pletschke (2012) ao avaliarem a capacidade das
duas isoformas do complexo multienzimático de B. subtilis SJ01 em degradar
substratos celulósicos e hemicelulósicos observaram que estas também
apresentavam maior eficiência na degradação de xilanas do que sobre substratos
celulósicos. No estudo realizada por Beukes e Pletschke (2006) foi verificado que o
complexo multienzimático produzido por uma linhagem de B. megaterium
apresentou alta atividade enzimática de exoglucanase e endoglucanase.
220
4.4. Etapa experimental 4 - “Expressão, purificação e caracterização de

enzimas lignocelulolíticas obtidas a partir de genes isolados da
linhagem B. licheniformis CBMAI 1609”

licheniformis CBMAI 1609 através de uma biblioteca genômica
Os primeiros procedimentos para a construção da biblioteca genômica de
B. licheniformis CBMAI 1609 em células de E. coli SURE envolveram a extração do
DNA genômico do micro-organismo e a determinação do tempo de digestão
enzimática necessário para a obtenção de fragmentos de DNA com tamanho entre 1
e 4 kb. Na Figura 42 é apresentado o resultado da extração do DNA genômico da
linhagem B. licheniformis CBMAI 1609 e o perfil de digestão deste com a enzima de
restrição Sau3AI ao longo do período de incubação de 120 minutos.
Figura 42 – Eletroforese em gel de agarose para avaliação do perfil de digestão do DNA

genômico da linhagem B. licheniformis CBMAI 1609 com a enzima de restrição Sal3AI
(M: 1 kb Plus DNA Ladder (Invitrogen); 1: amostra do DNA genômico extraído que não foi submetida
à reação de digestão enzimática; 2, 3, 4 e 5: produtos da digestão enzimática do DNA genômico após
30, 60, 90 e 120 minutos de reação, respectivamente)
Como pode ser visualizado na Figura 42, a extração do DNA genômico de

B. licheniformis CBMAI 1609 com o kit comercial FastDNA® SPIN for soil permitiu a
obtenção de uma amostra de DNA íntegra, com alta massa molecular, de boa
qualidade e em alta concentração (canaleta 1). Constatou-se também que uma
grande quantidade de fragmentos de DNA apresentando o tamanho de interesse foi
221
obtida entre 30 e 60 minutos de reação (canaletas 2 e 3). A incubação da reação de

digestão por períodos de tempo mais longos resultou na geração de fragmentos de
DNA com menor tamanho, principalmente abaixo de 1kb (canaletas 4 e 5).
Uma nova reação de digestão do DNA genômico do micro-organismo foi
então preparada utilizando o dobro do volume reacional anterior e incubada por 60
minutos a 37 ºC. O produto desta reação de digestão foi separado por eletroforese
em gel de agarose 1 % (m/v) e os fragmentos de DNA digerido com tamanho entre 1
a 4 kb foram excisados do gel e, em seguida, purificados. A Figura 43 apresenta a
corrida eletroforética em gel de agarose de uma alíquota da amostra de DNA obtida
após os passos de digestão com a enzima Sau3AI, excisão do gel e purificação.
Como pode ser observado na Figura 43, a etapa de digestão do DNA genômico de
B. licheniformis CBMAI 1609 foi bem sucedida e a amostra de DNA obtida pode
então ser utilizada na construção da biblioteca genômica com o vetor pUC19 em
células de E. coli SURE.
Figura 43 - Eletroforese em gel de agarose da amostra de DNA genômico de B.

licheniformis CBMAI 1609 obtida ao final da etapa de digestão
(M: 1 kb Plus DNA Ladder (Invitrogen); A: amostra de DNA após os passos de digestão com a enzima
Sau3AI, excisão do gel e purificação)
O vetor pUC19 foi escolhido para ser utilizado nesta etapa do trabalho
pelo fato de ser um dos vetores plasmidiais mais utilizados em clonagens e na
construção de bibliotecas genômicas microbianas. Este possui as vantagens de ser
relativamente pequeno (contém somente 2.686 pb), ser estavelmente mantido em
células de E. coli com um número relativamente elevado de cópias, permitir a
222
clonagem de insertos de DNA exógeno com até 10 kb de tamanho, possuir sítios

únicos de clivagem para múltiplas enzimas de restrição e poder ser facilmente
introduzido em células por transformação. Além disso, o vetor pUC19 possui um
gene que confere resistência à ampicilina e a inserção do DNA exógeno no seu sítio
de clonagem pode ser facilmente detectada pela seleção de colônias azul e branco
devido a presença do gene lacZ (Madigan et al., 2010). Na Figura 44 é apresentado
um esquema do vetor plasmidial pUC19 com os sítios de clivagem das enzimas de
restrição e o sítio de múltipla clonagem, indicado como MCS.
Figura 44 – Esquema ilustrativo do vetor pUC19

Fonte: SnapGene (2015a)
Na Figura 45 está apresentada a análise eletroforética em gel de agarose

dos produtos da dupla digestão com as enzimas de restrição EcoRi e HindIII do DNA
plasmidial de 12 colônias brancas obtidas após o cultivo das células transformadas
por eletroporação. Estas colônias correspondem possivelmente a clones que
receberam um inserto de DNA genômico da linhagem B. licheniformis CBMAI 1609 e
que apresentavam o gene da β-galactosidase truncado. Essa avaliação teve por
objetivo confirmar a transformação microbiana das células competentes de E. coli
SURE, caracterizar o tamanho médio dos insertos clonados e determinar a
qualidade e representatividade da biblioteca genômica construída.
223
A análise do perfil de digestão do DNA plasmidial desses 12 clones

avaliados demonstrou que todos eles continham o inserto do DNA genômico ligado
ao vetor pUC19, que corresponde a banda com o tamanho aproximado de 2,6 kb
indicada na Figura 45. Observou-se também a existência de certa diversidade de
tamanho nos produtos gerados na digestão dos plasmídeos dos clones avaliados,
demonstrando a variabilidade nos insertos gênicos clonados. A visualização de
várias bandas nos produtos das reações de digestão ocorre devido a existência de
possíveis sítios internos de restrição para as enzimas EcoRI e HindIII nos insertos
clonados. O tamanho médio dos insertos de DNA na biblioteca genômica foi
calculado em aproximadamente 3,3 kb, sendo constatado que estes variaram entre,
aproximadamente, 1 kb (clone 8) e 8,9 kb (clone 6).
Figura 45 - Eletroforese em gel de agarose para avaliação da digestão do DNA plasmidial

de 12 colônias brancas da biblioteca genômica de B. licheniformis CBMAI 1609 com as
enzimas de restrição EcoRI e HindIII
(M: 1 kb Plus DNA Ladder (Invitrogen); 1 - 12: produtos da reação de digestão enzimática do DNA
plasmidial dos 12 clones)
Após a confirmação da transformação microbiana e do êxito na

construção da biblioteca genômica, foram coletados e estocados a -80 ºC um total
de 6.528 clones (colônias brancas). Este número de clones representa uma
estimativa de cobertura da biblioteca genômica de aproximadamente 21,5 Mb, que é
cerca de 5 vezes maior que o tamanho do genoma da linhagem de B. licheniformis
ATCC 14580, sendo este determinado por Rey et al. (2004) em 4.222.336 bp.
224
Posteriormente, a biblioteca genômica construída foi submetida aos

experimentos de triagem funcional utilizando os substratos CMC, pectina de frutas
cítricas e xilana de madeira faia, conforme descrito no item 3.4.1.1.6. Essa avaliação
funcional resultou na visualização de 5 clones com formação de halo de degradação
do substrato ao redor da colônia, sendo 2 destes no substrato CMC (clones D12 e
M7), 2 em pectina (clones K3 e N18) e 1 em xilana (clone L18).
Estes 5 clones positivos também foram cultivados em meio de cultura LB
líquido e tiveram o seu DNA plasmidial extraído e digerido com as enzimas de
restrição EcoRI e HindIII para confirmar a presença dos insertos de DNA e
determinar o tamanho destes. A Figura 46 ilustra a análise eletroforética em gel de
agarose dos produtos das reações de digestão do DNA plasmidial destes 5 clones
positivos. Foi observado que todos os 5 clones apresentavam um inserto de DNA
clonado no vetor pUC19. A partir da análise dos fragmentos gerados nas reações de
digestão, foi estimado que os insertos de DNA presentes nos clones D12, M7, N18,
K3 e L18 tinham o tamanho aproximado de 1,4 kb, 5,5 kb, 5 kb, 8 kb e 4 kb,
respectivamente.
Figura 46 - Eletroforese em gel de agarose para avaliação do perfil de digestão do DNA

plasmidial dos 5 clones positivos na triagem funcional da biblioteca genômica de B.
licheniformis CBMAI 1609 com as enzimas de restrição EcoRI e HindIII.
(M: 1 kb Plus DNA Ladder (Invitrogen); 1: clone D12; 2: clone M7; 3: clone N18; 4: clone K3; 5: clone
L18)
As atividades enzimáticas dos 5 clones positivos observados na triagem

funcional foram confirmadas através de ensaios enzimáticos utilizando os substratos
225
em que estes apresentaram a formação de halos de degradação e os

sobrenadantes dos cultivos em meio de cultura LB líquido. Esses ensaios de
atividade enzimática foram realizados com o tempo de reação alterado para 1 hora.
A Figura 47 apresenta os resultados desta avaliação de atividade enzimática usando
os sobrenadantes de cultivo dos 5 clones positivos. Como pode ser observado na
Figura 47, apenas os clones D12 e K3 (colunas 1 e 4) foram confirmados com
relação à atividade enzimática esperada sobre os substratos CMC e pectina de
frutas cítricas, respectivamente. Possivelmente, os demais clones correspondiam a
clones falso-positivos, cujo aparecimento de halos ao redor das colônias pode ter
sido em decorrência de contaminações nas placas por causa da extensa
manipulação realizada.
Figura 47 – Confirmação da atividade enzimática dos 5 clones da biblioteca genômica de B.

licheniformis CBMAI 1609 que apresentaram halos de degradação ao redor das colônias na
triagem funcional com os substratos carboximetilcelulose, pectina e xilana
(A: branco da reação enzimática; B, C e D: triplicata das reações enzimáticas; 1: atividade clone D12
em carboximetilcelulose; 2: atividade clone M7 em CMC; 3: atividade clone N18 em pectina; 4:
atividade clone K3 em pectina; 5: atividade clone L18 em xilana)
Visando identificar os insertos de DNA clonados no vetor pUC19 dos 5

clones que apresentaram halos de degradação ao redor das colônias na triagem
funcional, foram realizados sequenciamentos utilizando os plasmídeos extraídos
destes clones e os oligonucleotídeos iniciadores M13F e M13R. As sequências de
nucleotídeos geradas pelo sequenciamento foram analisadas quanto à presença de
possíveis fases abertas de leitura (OFRs) e, posteriormente, as sequências de
aminoácidos destas ORFs foram comparadas com sequências depositadas no
banco de dados do NCBI para identificação da sua possível função.
226
Os sequenciamentos realizados para os clones M7, N18 e L18 com os

oligonucleotídeos iniciadores M13F e M13R não permitiram a obtenção das
sequências de nucleotídeos completas dos insertos de DNA clonados, pois estes
apresentavam tamanho superior a faixa de cobertura do sequenciamento, que foi de
aproximadamente 1.100 bp para cada extremidade do inserto. Mesmo assim, foi
realizada a avaliação da presença de possíveis ORFs nas sequências de
nucleotídeos geradas destes clones e a posterior comparação das sequências de
aminoácidos das ORFs encontradas com o banco de dados do NCBI através das
ferramentas Blastp e Conserved Domains. Foi constatado por meio destas análises
que as regiões sequenciadas dos insertos de DNA destes 3 clones não
apresentavam nenhuma identidade com enzimas envolvidas na degradação de
materiais lignocelulósicos, confirmando de certa forma que estes clones tratavam-se
de falso-positivos, como observado previamente nos testes de confirmação da
atividade enzimática (Figura 47). No clone M7 foi encontrada uma ORF que
codificava um polipeptídeo com um domínio conservado para uma proteína de
membrana envolvida na sinalização de carbono. Nas sequências nucleotídicas
obtidas para o clone N18 foram encontradas duas ORFs, uma delas codificava um
polipeptídeo que apresentava um domínio conservado para uma metiltransferase e a
outra para uma acetato quinase. No clone L18 também foram encontradas duas
ORFs, essas apresentavam domínios conservados para as enzimas cisteína
desulfurase e metiltransferase, respectivamente.
Por outro lado, no sequenciamento do inserto de DNA do clone D12, com
os oligonucleotídeos iniciadores M13F e M13R, foi possível a obtenção da
sequência de nucleotídeos completa do fragmento clonado. A análise dessa
sequência nucleotídica permitiu a identificação de uma ORF de 732 pb que
codificava um polipeptídeo com 243 aminoácidos. A sequência de aminoácidos
desse polipeptídeo apresentou alta identidade (99 %) com sequências depositadas
para endoglucanases e xiloglucanases de algumas linhagens de Bacillus sp.
(número de acesso no NCBI das sequências com maior identidade: WP025809706.1
e WP020452753.1). Na comparação da sequência de aminoácidos desta OFR com
o banco de dados Conserved Domains foi constatada a presença de um domínio
catalítico conservado para a família 12 das hidrolases glicosídicas (GH12), conforme
apresentado na Figura 48. A família GH12 compreende enzimas que apresentam
diferenças quanto à especificidade para o substrato, sendo encontrado neste grupo
227
enzimas com atividades de endo-β-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4), endo-β-1,3-1,4-

glucanase (EC 3.2.1.73), endo-β-1,4-glucanase xiloglucano específico (EC
3.2.1.151) e também de xiloglucano endo-transglicosilase (EC 2.4.1.207) (Sandgren;
Sulzenbacher, 2015). Testes de atividade enzimática realizados utilizando o
sobrenadante do cultivo do clone D12 também indicaram a atuação da enzima
expressa sobre o substrato xiloglucano de tamarindo, sugerindo desta forma que o
gene encontrado neste clone poderia codificar uma possível endoglucanase que
também apresentava atividade de xiloglucanase. Esse gene foi então denominado
de BlXeg.
Figura 48 – Análise de domínios conservados para uma das ORFs encontradas no inserto
de DNA do clone D12 através da ferramenta Conserved Domains
Assim como ocorreu para os clones M7, N18 e L18, o inserto de DNA do
clone K3 também não foi totalmente sequenciado utilizando os oligonucleotídeos
iniciadores M13F e M13R. No entanto, foram localizadas nas sequências de
nucleotídeos das extremidades do inserto gênico deste clone duas ORFs,
denominadas de ORF1 e ORF2. A ORF1 apresentou 956 nucleotídeos e foi predito
que a mesma codificava um polipeptídeo de 318 aminoácidos, que apresentava
99 % de identidade com sequências depositadas para a enzima β-galactosidase de
algumas linhagens do gênero Bacillus (número de acesso no NCBI das sequências
com maior identidade: WP023856854.1, WP026580391.1, KFM84596.1 e
WP020453573.1). Foi também constatado que a ORF1 apresentava domínios
conservados para a família 42 das hidrolases glicosídicas (GH42), como ilustrado na
Figura 49a. A atividade enzimática mais comum na família GH42 é a de β-
galactosidase (EC 3.2.1.23), mas também podem ser encontradas nesta família
enzimas com atividade de α-L-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) e β-D-fucosidase
(EC 3.2.1.38) (Moracci, 2015). Este gene foi então denominado de BlGat.
Quanto à ORF2, foi verificado que essa possuía 423 bp e codificava um
polipeptídeo de 140 aminoácidos. A comparação da sequência de aminoácidos
228
deste polipeptídeo com outras sequências depositadas no banco de dados do NCBI,

através da ferramenta Blastp, indicou 99 % de identidade com fragmentos de
sequências depositadas para a enzima galactanase de linhagens de Bacillus sp.,
cuja sequência completa de aminoácidos possuía 424 bp (número de acesso no
NCBI das sequências com maior identidade: WP026580390.1; WP023856855.1;
WP039073103.1 e AGN38579.1). Foi também verificado que a sequência de
aminoácidos da ORF2 apresentava um domínio conservado para a família 53 das
hidrolases glicosídicas (GH53), como demonstrado na Figura 49b. Nesta família das
hidrolases glicosídicas são encontradas apenas enzimas com atividade de endo-β-
1,4-galactanase (EC 3.2.1.89) (Lo Leggio, 2015). A atividade enzimática de
galactanase deste clone foi confirmada através de testes com o sobrenadante de
cultivo do clone K3 e o substrato galactana de batata. Por esta razão, esse gene
encontrado neste clone recebeu a designação de BlGal.
(a)
(b)
Figura 49 - Análise de domínios conservados para a ORF1 (a) e ORF2 (b) encontradas no
inserto de DNA do clone K3 através da ferramenta Conserved Domains
Os dois genes encontrados no inserto de DNA clonado no clone K3

possivelmente fazem parte de um conjunto de genes (também chamado de cluster
gênico) que codifica elementos envolvidos na utilização de galactanas pelo micro-
organismo B. licheniformis CBMAI 1609. No estudo realizado por Tabachnikov e
Shoham (2013) foi identificado e caracterizado um cluster gênico da linhagem
Geobacillus stearothermophilus T-6, denominado de gan-REFGBA, que era
composto por 6 genes. Este possuía cerca de 9,4 kb e era responsável por codificar
as enzimas β-galactosidase e endo-β-1,4-galactanase e outras proteínas envolvidas
no transporte e utilização de galactanas e arabinogalactanas. Segundo estes
229
autores, o micro-organismo secreta para o meio extracelular a enzima endo-β-1,4-

galactanase, esta hidrolisa os polissacarídeos galactana e arabinogalactana gerando
galactooligossacarídeos que são transportados para o espaço intracelular e
hidrolisados pela enzima β-galactosidase liberando galactose, que é então
metabolizada pelo micro-organismo.
Embora a estratégia adotada para a prospecção de genes da biblioteca
genômica de B. licheniformis CBMAI 1609 tenha resultado na observação de apenas
de 2 clones positivos e na identificação de 3 genes que codificam hidrolases
glicosídicas envolvidas na degradação dos polissacarídeos CMC e pectina, pode-se
dizer que o resultado obtido foi satisfatório e está de acordo com a literatura. A baixa
frequência de clones positivos e a consequente identificação de poucos genes de
enzimas lignocelulolíticas podem ter sido em decorrência da estratégia de triagem da
biblioteca genômica utilizada, pois esta depende de uma série de fatores que
incluem a necessidade da clonagem dos genes completos no vetor, a ocorrência da
transcrição de RNA mensageiro, a síntese proteica em quantidades suficientes para
que a atividade enzimática possa ser detectada, o correto enovelamento das
proteínas e a secreção destas para o meio extracelular (Alvarez, 2013).
Comparativamente, Liu et al. (2004) relataram a construção de uma
biblioteca genômica usando fragmentos do DNA genômico da linhagem B.
licheniformis GXN151, obtidos a partir da digestão com a enzima de restrição
Sau3AI. Os fragmentos de DNA com tamanho de 3 a 12 kb foram ligados ao vetor
pBluescript KS e transformados em células de E. coli JM109. Um total de 9.500
clones, apresentando insertos de DNA com tamanho médio de 4,6 kb, foram
avaliados funcionalmente em meio de cultura com CMC. Os autores deste trabalho
detectaram nesta avaliação 8 clones positivos, sendo confirmado nestes clones a
presença de 4 ORFs diferentes, que foram identificadas como sendo de celulases
das famílias GH5, GH9, GH12 e GH48.
Em outro estudo similar, Fu et al. (2010) construíram uma biblioteca
genômica para a linhagem Paenibacillus sp. BME-14 em E. coli DH10B utilizando o
vetor pUC18 e fragmentos de DNA genômico parcialmente digeridos com a enzima
de restrição EcoRI e com tamanho entre 4 e 9 kb. Os clones desta biblioteca
genômica foram submetidos à triagem funcional usando meio de cultura com CMC.
Os autores deste trabalho relataram a observação de apenas um clone positivo, este
possuía um inserto de DNA com tamanho de 5 kb e apresentava uma ORF completa
230
de 1.629 bp que codificava uma endoglucanase da família GH9 com 542

aminoácidos.
Nasser et al. (1993) realizaram a prospecção de genes de pectinases da
linhagem B. subtilis SO113 usando uma biblioteca genômica construída em E. coli
NM522 com fragmentos do DNA genômico do micro-organismo, parcialmente
digeridos com a enzima Sau3AI e com tamanho de 3 a 6 kb, ligados ao vetor pUC18.
Neste estudo, os autores realizaram a triagem funcional de 5.000 clones em meio de
cultura adicionado de ácido poligalacturônico e observaram a presença de 2 clones
com atividade pectinolítica, cujas ORFs foram identificadas como sendo de pectato
liases.
Em outro estudo, Bai et al. (2015) construíram uma biblioteca genômica
em células competentes de E. coli DH5α para a linhagem Bacillus sp. SN5 utilizando
fragmentos de DNA previamente digeridos com a enzima Sau3AI, com tamanho
entre 2 e 8 kb, e o vetor pUC18. Foram avaliados por triagem funcional no substrato
xilana 5.000 clones e foi observada a formação de halos de degradação do substrato
ao redor de 5 clones. O sequenciamento dos plasmídeos destes clones revelou que
todos eles continham uma ORF de 1.101 bp que codificava um polipeptídeo de 366
aminoácidos. Esta ORF apresentava 66 e 67 % de identidade com as xilanases de
Bacillus sp. 41M-1 e Paenibacillus campinasensis BL11, respectivamente. A
comparação da sequência de aminoácidos desta ORF com o banco de dados do
NCBI revelou que esta xilanase possuía um domínio conservado para as hidrolases
glicosídicas da família GH11 e também apresentava um domínio de ligação a
carboidratos (CBM) da família 36.
A partir das sequências de nucleotídeos geradas no presente trabalho e
daquelas depositadas no GenBank do NCBI que apresentaram alta identidade para
a ORF do clone D12 e ORF2 do clone K3, foram desenhados oligonucleotídeos
iniciadores visando a amplificação dos genes BlXeg e BlGal da linhagem B.
licheniformis CBMAI 1609. A amplificação do gene BlGat encontrado na ORF1 do
clone K3 não foi avaliada neste estudo e será objeto de estudo de trabalhos futuros.
Na Figura 50 são apresentados os produtos das amplificações por reação
de PCR, como descrito no item 3.4.2, utilizando os oligonucleotídeos iniciadores
desenhados para os genes BlGal e BlXeg e o DNA genômico da linhagem B.
licheniformis CBMAI 1609 como molde. Nas reações de PCR utilizando os
oligonucleotídeos iniciadores para o gene BlXeg foi verificada a amplificação de um
231
fragmento de DNA com o tamanho esperado para este gene sem o peptídeo sinal,
que era de 699 bp (canaletas 1 e 2). A amplificação do gene BlGal também foi
realizada com sucesso, sendo observada a presença de uma única banda no gel de
agarose com o tamanho próximo ao esperado de 1.275 bp (canaleta 4 e 5).
Figura 50 – Eletroforese em gel de agarose dos produtos das amplificações por PCR dos
genes BlGAl e BlXeg de B. licheniformis CBMAI 1609
(M: 1 kb Plus DNA Ladder (Invitrogen); 1 e 2: gene BlXeg; 3 e 4: gene BlGal)
Após a amplificação dos genes BlGal e BlXeg, as bandas no gel de

agarose correspondentes ao tamanho esperado em pares de base para cada gene
foram excisadas, purificadas e utilizadas para a clonagem no vetor plasmidial pJET.
As clonagens desses dois genes alvo no vetor pJET foram confirmadas por PCR de
colônia e um clone confirmado como positivo para cada gene teve o seu DNA
plasmidial extraído e digerido com enzimas de restrição, NdeI e BamHI para o gene
BlGal e NheI e BamHI para o gene BlXeg, com o objetivo de liberar os insertos
gênicos clonados. Esses insertos gênicos foram subclonados no vetor de expressão
pET-28a(+) previamente digerido com as mesmas enzimas de restrição e
desfosforilado, como descrito no item 3.4.3.
O vetor de expressão pET-28a(+) foi utilizado nesta etapa do trabalho,
pois possui um sítio de clonagem com várias opções de enzimas de restrição e um
gene de resistência a canamicina, que auxilia na seleção das células transformadas.
Este vetor também é capaz de inserir no fragmento clonado uma cauda de 6
histidinas (His-Tag), que facilita a posterior purificação das proteínas recombinantes.
Além disso, a expressão neste vetor é realizada utilizando o sistema da T7 RNA
232
polimerase controlada pelo promotor Lac, no qual um repressor ligado a este

promotor é desligado pela adição de IPTG. Assim, é possível controlar os níveis de
expressão proteica de forma a melhorar o rendimento de produção das proteínas de
interesse (Franco Cairo, 2012; Novagen, 2011). Na Figura 51 é apresentado um
esquema do vetor pET-28a(+) com os sítios das enzimas de restrição e o sítio de
múltipla clonagem (MCS).
Figura 51 - Esquema ilustrativo do vetor pET-28a(+)

Fonte: SnapGene (2015b)
As subclonagens dos genes BlXeg e BlGal no vetor pET-28a(+) foram

confirmadas por PCR de colônia e pelo sequenciamento dos insertos de DNA de
clones positivos dessa transformação. Os sequenciamentos indicaram que as
sequências nucleotídicas dos dois genes clonados estavam de acordo com as
sequências originais ou com aquelas depositadas no GenBank do NCBI e, além
disso, que os insertos gênicos foram corretamente inseridos na fase de leitura do
vetor. Posteriormente, as construções do vetor pET-28a(+) com os genes BlXeg e
BlGal de B. licheniformis CBMAI 1609 foram transformadas em células E. coli
apropriadas para a expressão de proteínas recombinantes. Os resultados dos testes
233
de expressão, purificação e caracterização das enzimas codificadas por estes genes

estão apresentados nos itens 4.4.3 e 4.4.4.
4.4.2. Prospecção in silico de genes homólogos de enzimas

lignocelulolíticas da linhagem B. licheniformis ATCC 14580
A estratégia de prospecção in silico de genes homólogos é comumente
utilizada para o isolamento de genes já conhecidos visando à sua clonagem para
realização de estudos funcionais (Sebastian et al., 2013). Diferentemente da
estratégia anterior de prospecção de genes, esta abordagem normalmente envolve
as etapas de pesquisa de sequências homólogas de nucleotídeos do gene de
interesse em bancos de dados, o alinhamento dessas sequências, a análise de
regiões conservadas entre as sequências pesquisadas, o desenho de
oligonucleotídeos iniciadores degenerados e por fim a amplificação do gene com os
oligonucleotídeos iniciadores desenhados (Malone et al., 2006).
No presente trabalho, esta abordagem foi utilizada para o estudo dos
genes depositados como codificantes das enzimas arabinanase (BlAra), α-L-
arabinofuranosidase (BlAbf), endoglucanase (BlCel), ramnogalacturonase (BlRhg) e
lacase (BlLac) na linhagem B. licheniformis ATCC 14580. Esses genes foram
amplificados a partir de reações de PCR utilizando o DNA genômico do micro-
organismo B. licheniformis CBMAI 1609 como molde e oligonucleotídeos iniciadores
desenhados para cada gene com base nas sequências nucleotídicas depositadas
em bancos de dados para a linhagem B. licheniformis ATCC 14580.
A escolha desses genes foi baseada nas atividades enzimáticas
identificadas anteriormente no sobrenadante de cultivo do micro-organismo B.
licheniformis CBMAI 1609 e em enzimas presentes no genoma da linhagem B.
licheniformis ATCC 14580 com potencial para aplicação na suplementação de
coquetéis enzimáticos utilizados na sacarificação de materiais lignocelulósicos e
também na indústria de alimentos.
Conforme relatado no item 3.4.1.2, as sequências nucleotídicas
depositadas dos 5 genes de B. licheniformis ATCC 14580 foram analisadas através
de ferramentas de bioinformática quanto a presença de possíveis sítios para
enzimas de restrição e também traduzidas em sequências de aminoácidos para a
análise de peptídeos sinais e domínios catalíticos conservados antes do desenho
dos oligonucleotídeos iniciadores. A seguir, são comentadas algumas dessas
234
características e na Figura 52 são apresentados os resultados das análises de

domínios proteicos conservados presentes nas sequências de aminoácidos destes
genes.
As análises realizadas para o gene BlAra revelaram que este apresentava
uma região para um possível peptídeo sinal que foi excluída da sequência de
nucleotídeos utilizada no desenho dos oligonucleotídeos iniciadores. Este gene sem
o peptídeo sinal tinha 876 pb e codificava uma proteína com 291 aminoácidos. Foi
também observado que esse gene apresentava um domínio conservado para a
família GH43 (Figura 52a). No caso do gene BlAbf não foi constatada a presença de
peptídeo sinal, sendo que esse gene apresentava 1.509 bp e foi predito que
codificava uma proteína de 502 aminoácidos. A análise de domínios conservados do
gene BlAbf revelou um domínio conservado para uma hidrolase glicosídica membro
da superfamília C-terminal das α-L-arabinofuranosidases C, o qual está associado
com a família GH51 (Figura 52b).
No gene BlCel também foi detectada a presença de um peptídeo sinal
que foi excluído da sequência de nucleotídeos utilizada no desenho dos
oligonucleotídeos iniciadores. Esse gene após a exclusão do peptídeo sinal possuía
1.626 pb e codificava uma proteína com 541 aminoácidos. A análise de domínios
conservados do gene BlCel indicou a presença de um domínio de ligação a
carboidratos da superfamília CBM X2 e também de um domínio catalítico para uma
celulase membro da superfamília das alfa-amilases, mais especificamente de uma
hidrolase da família GH5 (Figura 52c).
Na análise do gene BlRhg que possuía 1.887 bp, não foi observada a
presença de peptídeo sinal. Foi predito que este gene codificava uma proteína com
628 aminoácidos e apresentava um domínio conservado comum as polissacarídeo-
liases da família 11 (Figura 52d). O gene da lacase também não apresentou
peptídeo sinal em sua sequência e era composto por 1.542 pb. A proteína codificada
pelo gene BlLac apresentava 513 aminoácidos e tinha 3 domínios conservados para
cobre-oxidases do tipo CotA (Figura 52e).
235
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
Figura 52 - Análise de domínios conservados para os genes BlAra (a), BlAbf (b), BlCel (c),
BlRhg (d) e BlLac (e) da linhagem B. licheniformis ATCC 14580 através da ferramenta
Conserved Domains
Na Figura 53 são apresentados os produtos das amplificações por reação

de PCR dos genes BlAra, BlAbf, BlCel, BlRhg e BlLac da linhagem B. licheniformis
CBMAI 1609 utilizando os oligonucleotídeos iniciadores específicos que foram
desenhados a partir das sequências de genes homólogos da linhagem B.
licheniformis ATCC 14580. Foi verificado nas análises eletroforéticas que todos os 5
genes avaliados foram corretamente amplificados a partir do DNA genômico da
linhagem B. licheniformis CBMAI 1609, pois os produtos das amplificações foram
visualizados como uma única banda nos géis de agarose e essas bandas possuíam
o tamanho de pares de bases condizentes aos valores preditos para cada gene.
236
Figura 53 – Eletroforese em gel de agarose dos produtos das amplificações por PCR dos
genes BlAra, BlAbf, BlCel, BlRhg e BlLac a partir do DNA genômico da linhagem B.
(M: 1 kb Plus DNA Ladder (Invitrogen); 1: gene BlAra; 2: gene BlRhg; 3: gene BlCel; 4: gene BlLac; 5:
gene BlAbf)
Da mesma forma como foi realizado para os genes BlGal e BlXeg, os

produtos das amplificações dos genes BlAra, BlAbf, BlCel, BlRhg e BlLac foram
clonados no vetor pJET e, posteriormente, subclonados no vetor pET-28a(+). A
identidade dos insertos gênicos BlAra, BlAbf, BlCel, BlLac e BlRhg clonados no vetor
pET-28a(+) foi confirmada pela comparação entre as sequências nucleotídicas
geradas no sequenciamento dos plasmídeos de clones positivos e aquelas
depositadas no GenBank, através da ferramenta Blastn. Os sequenciamentos
também revelaram que esses genes estavam corretamente inseridos na fase de
leitura do vetor pET-28a(+).
Os plasmídeos contendo as construções dos genes BlAbf, BlCel e BlLac
no vetor pET-28a(+) foram transformados em outras linhagens de E. coli para a
realização dos testes de expressão e posteriores estudos de purificação e
caracterização das enzimas produzidas. Os resultados dos testes de expressão,
purificação e caracterização das enzimas endoglucanase e lacase codificadas pelos
genes BlCel e BlLac estão apresentados nos itens 4.4.5 e 4.4.6, respectivamente.
No apêndice 3 desta tese estão apresentados os resultados das tentativas de
expressão e purificação da α-L-arabinofuranosidase codificada pelo gene BlAbf.
Quanto ao gene BlRhg, foi verificado que a sua sequência de
nucleotídeos apresentava 93 % de identidade com a sequência de nucleotídeos
237
depositada para este gene da linhagem B. licheniformis ATCC 14580. Foi também
constatada a presença de várias mutações pontuais no gene BlRhg clonado. O
sequenciamento de outro clone positivo contendo a construção do gene BlRhg no
vetor pET-28a(+) foi realizado e este confirmou o resultado observado
anteriormente. Possivelmente, algumas dessas mutações podem ter sido inseridas
pela Taq DNA polimerase durante o processo de amplificação desse gene para a
clonagem. Essas mutações no gene BlRhg ocasionaram a geração de vários códons
que sinalizam o fim da síntese proteica (stop códons) no meio da sequência de
aminoácidos predita para a enzima codificada por este gene. Um teste para avaliar a
expressão da enzima ramnogalacturonase pelo gene BlRhg foi realizado utilizando
as linhagens E. coli BL21 e pRare2, mas como era previsto, não foi observada a
expressão proteica devido a presença dos stop códons no meio da sequência. A
caracterização desta enzima não foi conduzida no presente trabalho, pois são
necessários outros estudos para solucionar os problemas encontrados na clonagem
deste gene.
Os estudos para a expressão heteróloga, purificação e caracterização da
enzima arabinanase codificada pelo gene BlAra da linhagem B. licheniformis CBMAI
1609 também não foram realizados no presente trabalho, pois a sequência de
aminoácidos predita para esta enzima era muito similar a sequência de aminoácidos
predita para a arabinanase de B. licheniformis ATCC 14580, cujo estudo de
caracterização e aplicação já estava sendo conduzido pelo nosso grupo de pesquisa
(Machado et al., 2015).
4.4.3. Expressão, purificação e caracterização da galactanase da família

GH53 codificada pelo gene BlGal de B. licheniformis CBMAI 1609
A galactanase, também chamada de endo-β-1,4-galactanase (EC
3.2.1.89), é uma enzima que catalisa a hidrólise de ligações galactosídicas do tipo β-
1,4 em arabinogalactanas do tipo I e galactanas encontradas nas cadeias laterais de
componentes da pectina, mais especificamente da ramnogalacturana tipo I. Baseado
nas sequências de aminoácidos, essa hidrolase glicosídica tem sido classificada
pelo CAZy como pertencente à família GH53. Essa enzima pode ser produzida por
vários fungos e bactérias e apresenta diferenças quanto aos produtos obtidos na
hidrólise em função da sua fonte de obtenção (Ryteersgaard et al. 2004; Sakamoto;
Ishimaru, 2013). As galactanases apresentam um amplo campo de aplicação
238
biotecnológica, podendo ser utilizadas na degradação de resíduos lignocelulósicos

em biorrefinarias, na indústria de alimentos para a extração de óleos vegetais e
sucos de frutas, no processamento de vinhos e na produção de
galactooligossacarídeos, na indústria de detergentes, no segmento têxtil e de
celulose e na modificação de rações animais derivadas de soja (Bjornvad et al.,
2001; Michalak et al., 2012; Sakamoto; Ishimaru, 2013).
A atividade enzimática de galactanase foi previamente detectada no
sobrenadante de cultivo do micro-organismo B. licheniformis CBMAI 1609 durante o
cultivo no meio de cultura otimizado. No presente estudo, o gene BlGal que codifica
uma galactanase neste micro-organismo foi isolado a partir de uma biblioteca
genômica e clonado no vetor pET-28a(+). A comparação da sequência completa de
aminoácidos predita para a galactanase recombinante de B. licheniformis CBMAI
1609 com outras depositadas no banco de dados do NCBI, através da ferramenta
Blastp, indicou que esta apresentava 94 % de identidade com a galactanase de B.
licheniformis DSM13 = ATCC 14580 (número de acesso no NCBI: AAU25711.1).
Na Figura 54 é apresentado o alinhamento das sequências de
aminoácidos preditas para as galactanases das linhagens B. licheniformis CBMAI
1609 e ATCC 14580 através da ferramenta ClustalW. Estas duas galactanases
apresentaram vários aminoácidos conservados em suas estruturas primárias,
inclusive os dois resíduos de ácido glutâmico envolvidos no mecanismo de hidrólise
da enzima, localizados nas posições 190 e 288, e os três resíduos de triptofano
envolvidos na ligação do substrato, que estão localizados nas posições 140, 372 e
388, como proposto por Ryttersgaard et al. (2004). No entanto, verificou-se que a
galactanase clonada no presente estudo apresentava a substituição de 23
aminoácidos em sua sequência quando comparada com a galactanase de B.
licheniformis ATCC 14580.
239
Figura 54 – Alinhamento das sequências de aminoácidos preditas para as galactanases de

B. licheniformis CBMAI 1609 e B. licheniformis ATCC 14580 através da ferramenta ClustalW
* As setas indicam os aminoácidos envolvidos no mecanismo de hidrólise da enzima e aqueles
responsáveis pela ligação do substrato à enzima.
A análise da sequência de aminoácidos da galactanase recombinante de

B. licheniformis CBMAI 1609 através da ferramenta ProtParam revelou que a
proteína madura (proteína expressa com a cauda de 6 resíduos de histidina
inseridos pelo vetor pET-28(a) na porção N terminal) possuía 444 aminoácidos e
apresentava massa molecular e ponto isoelétrico teóricos estimados em 48,3 KDa e
6,4, respectivamente. Esse valor estimado para a massa molecular da galactanase
de B. licheniformis CBMAI 1609 foi similar ao valor relatado para outras
galactanases microbianas, como aquelas produzidas pelas linhagens B. subtilis
WT168, B. sp. S-2 e B. sp.S-39, que apresentavam massa molecular entre 36 e 40
KDa (Labavitch; Freeman; Albersheim, 1976; Tsumura et al., 1991b). A massa
molecular da galactanase deste trabalho também está próxima dos valores
observados para as galactanases fúngicas de Talaromyces stipitatus, Aspergillus
sojae e Aspergillus niger, que mostraram massa molecular iguais a 36,5, 39,7 e 43
KDa, respectivamente (Kimura; Yoshioka; Tajima, 1998; Larsen et al., 2015). Por
outro lado, a galactanase deste trabalho é menor do que as galactanases dos micro-
240
organismos termofílicos Geobacillus stearotermoplhilus T-6 e Thermotoga maritima,

que tiveram massa molecular estimada em 68 e 64 KDa, respectivamente
(Tabachnikov; Shoham, 2013; Yang et al., 2006).
A expressão heteróloga da galactanase de B. licheniformis CBMAI 1609,
codificada pelo gene BlGal clonado no vetor pET-28a(+), foi realizada utilizando as
linhagens de E. coli BL21(DE3), BL21(DE3)pRare2, Rosetta-gami 2(DE3) e Artic
Express (DE3) através da indução com IPTG sob as condições descritas no item
3.4.4. Na Figura 55 são apresentados os resultados dos testes de expressão da
enzima galactanase por estas 4 linhagens de E. coli.
Figura 55 – Géis de eletroforese SDS-PAGE para avaliação da expressão da galactanase

codificada pelo gene BlGal de B. licheniformis CBMAI1609 nas linhagens E. coli BL21(DE3),
BL21(DE3)pRare2, Rosetta-gami 2(DE3) e Artic Express (DE3)
(M: marcador de massa molecular; 1: proteínas obtidas das células antes da indução com IPTG; 2:
proteínas obtidas das células ao final do período de indução com IPTG - 4 horas para as linhagens
BL21(DE3), BL21(DE3)pRare2 e Rosseta-gami 2(DE3) e 20 horas para a linhagem Artic Express
(DE3); 3: proteínas insolúveis obtidas após o processo de lise celular; 4: proteínas solúveis presentes
no sobrenadante do processo de lise celular). As setas indicam as bandas correspondentes à
galactanase expressa.
A análise eletroforética por SDS-PAGE das amostras coletadas durante

os testes de expressão revelou que a galactanase recombinante de B. licheniformis
CBMAI 1609 foi expressa na fração citoplasmática das linhagens de E. coli sob as
condições utilizadas e apresentava massa molecular próxima ao valor teórico de
48,3 KDa. Como pode ser visualizado nas canaletas de número 2 dos géis da Figura
55, a enzima teve um alto nível de expressão com a utilização da linhagem E. coli
241
BL21(DE3)pRare2 e baixa expressão com as linhagens E. coli Rosetta-gami 2(DE3)

e Artic Express (DE3). Uma grande quantidade da enzima na forma solúvel foi
observada nos sobrenadantes do processo de lise celular das linhagens de E. coli
BL21(DE3) e BL21(DE3)pRare2 ao final de 4 horas de indução (canaletas 4 dos
géis). Testes de atividade enzimática utilizando o substrato galactana de batata
confirmaram a presença da enzima galactanase nos sobrenadantes da lise celular
de todas as linhagens utilizadas para expressão proteica.
Apesar de se ter observado que a linhagem E. coli BL21(DE3) apresentou
um alto teor da galactanase na forma solúvel, foi verificado pela leitura da densidade
óptica (DO) a 600 nm que a linhagem E. coli BL21(DE3)pRare2 apresentou o melhor
crescimento entre as linhagens testadas durante a indução e consequentemente
gerou uma maior quantidade de massa celular (dados não apresentados). Diante
dos resultados obtidos para a quantidade de enzima presente na fração solúvel e
massa celular gerada, pode-se dizer que os melhores resultados de expressão da
galactanase foram obtidos usando a linhagem E. coli BL21(DE3)pRare2 com
indução por IPTG durante 4 horas a 30 ºC e 200 rpm.
Uma nova expressão da galactanase foi realizada em maior escala
utilizando-se a linhagem E. coli BL21(DE3)pRare2 sob as mesmas condições
adotadas anteriormente. O precipitado celular obtido ao final das 4 horas de indução
com IPTG foi lisado e o sobrenadante desse processo foi submetido aos passos de
purificação cromatográfica visando à obtenção da enzima com o maior grau de
pureza possível para os ensaios de caracterização. Na Figura 56 é apresentado
cromatograma da etapa de purificação em coluna de troca aniônica e o gel de
eletroforese SDS-PAGE com a expressão da galactanase de B. licheniformis CBMAI
1609 em maior escala, assim como as etapas de purificação da enzima.
Verificou-se que a enzima galactanase foi novamente expressa em
grande quantidade ao final das 4 horas de indução pela linhagem E. coli
BL21(DE3)pRare2 e apresentou uma boa quantidade de proteína na fração solúvel
do processo de lise celular (canaletas 2 e 3 do gel). A primeira etapa para
purificação da enzima foi realizada em coluna de afinidade com íons níquel
imobilizados (coluna His-Trap Fast Flow). Ao contrário do que era esperado, foi
observado nesta etapa cromatográfica baixa afinidade da galactanase recombinante
pela resina, pois a maior parte da enzima foi eluída durante a lavagem da coluna
com o tampão e no início do gradiente com imidazol. As frações coletadas no
242
primeiro pico de eluição das proteínas durante o gradiente de imidazol apresentaram

atividade de galactanase e possuíam um alto teor de contaminantes, como pode ser
visualizado na canaleta 4 do gel. Estas frações foram reunidas, dialisadas e
aplicadas na coluna cromatográfica de exclusão molecular Hiload 16/60 Superdex
200, que permitiu a separação da enzima dos contaminantes que apresentavam
massa molecular abaixo de 25 KDa e acima de 100 KDa (canaleta 5 do gel). As
frações coletadas com atividade de galactanase na cromatografia de exclusão
molecular foram reunidas e submetidas a uma etapa de purificação em coluna de
troca aniônica Source 15Q 4.6/100 PE, que possibilitou a obtenção da galactanase
com alto grau de pureza para os ensaios de caracterização (canaleta 6 do gel).
Figura 56 – Cromatograma da purificação da galactanase recombinante de B. licheniformis

CBMAI 1609 em coluna de troca aniônica Source 15Q 4.6/100 PE (a) e gel de eletroforese
SDS-PAGE com os passos da expressão e purificação da enzima (b)
proteínas obtidas das células ao final de 4 horas de indução com IPTG; 3: proteínas solúveis
presentes no sobrenadante do processo de lise celular; 4: amostra das frações reunidas da
cromatografia de afinidade; 5: amostra das frações reunidas da cromatografia de exclusão molecular;
6: amostra das frações reunidas da cromatografia de troca aniônica). A seta indica o pico de eluição
de proteínas com atividade enzimática de galactanase.
A primeira característica bioquímica avaliada da galactanase

recombinante de B. licheniformis CBMAI 1609 foi a especifidade da enzima para os
substratos galactana de batata e pectina de frutas cítricas. Foi verificado que a
enzima apresentava alta especificidade para a hidrólise do substrato galactana de
243
batata, sendo detectada atividade enzimática de 127 U/mg de proteína na presença

deste substrato, enquanto que no substrato pectina de frutas cítrica foi observada
uma atividade enzimática cerca de 6 vezes menor (21 U/mg de proteína). Essa
maior especificidade da galactanase pelo substrato comercial galactana de batata
pode ser devido ao fato deste substrato ter em sua composição cerca de 88 % de
galactose enquanto que o substrato pectina de frutas cítricas possui um alto teor de
ácido galacturônico (>74 %). Outra razão para essa maior especificidade da enzima
pelo substrato galactana de batata é que durante a extração deste polissacarídeo há
uma etapa de pré-tratamento com α-L-arabinofuranosidases para a remoção das
ramificações laterais de resíduos de arabinose. Estas ramificações de arabinose
podem ocasionar a inibição da atividade enzimática de galactanase, pois dificultam o
acesso da enzima ao substrato impedindo a atuação nas cadeias de pectina e
galactanas, assim como foi observado por Yang et al. (2006) para a galactanase de
Thermotoga maritima.
Kimura, Yoshioka e Tajima (1998) ao caracterizarem a galactanase de
Aspergillus sojae observaram que essa enzima apresentava maior especificidade
para o substrato arabinogalactana de soja, que era um dos substratos avaliados que
possuía alta razão molar entre galactose e arabinose em sua composição. Os
autores deste trabalho também constataram que essa galactanase exibia cerca de
17, 16 e 10 % de atividade relativa sobre os substratos ácido poligalacturônico,
arabinana de polpa de beterraba e pectina de frutas cítricas, respectivamente.
A galactanase recombinante de B. licheniformis CBMAI 1609 também foi
caracterizada quanto aos efeitos do pH e da temperatura sobre a atividade e
estabilidade enzimática, como apresentado na Figura 57. Foi verificado que a
enzima apresentava acima de 90 % de atividade relativa na faixa de pH entre 6,5 e
8,0, sendo a máxima atividade observada no pH 7,0. A enzima ainda manteve 75 %
da sua atividade em valores de pH 6,0 e 9,0 e foi completamente inibida em valores
de pH abaixo de 5,0 e no pH 10,0 (Figura 57a). Quanto ao efeito da temperatura na
atividade enzimática foi observado que essa galactanase era ativa na faixa de
temperatura entre 20 e 45 ºC, sendo a atividade ótima registrada a 40 ºC. Foi
também constatado que a enzima era completamente inibida em temperaturas
superiores a 50 ºC (Figura 57b).
Os resultados observados para os efeitos do pH e da temperatura na
atividade da galactanase de B. licheniformis CBMAI 1609 estão de acordo com os
244
valores relatados para outras galactanases microbianas. As galactanases

caracterizadas normalmente apresentam atividade ótima em pH entre 4,0 e 7,5 e em
temperaturas entre 40 e 65 ºC (Michalak et al., 2012; Sakamoto; Ishimaru, 2013;
Tabachnikov; Shoham, 2013).
Bjornvad et al. (2001) ao caracterizarem a galactanase de B. licheniformis
ATCC 14580 relataram que as condições ótimas de atividade enzimática foram
observadas em pH 7,5 e a 50 ºC. No estudo realizado por Labavitch et al. (1976) foi
verificado que a galactanase de B. subtilis WT168 apresentava atividade máxima em
pH 6,0 e a 50 ºC, sendo a enzima inativada em valores de pH abaixo de 4,0 e acima
de 8,0 e em temperaturas acima de 60 ºC.
Figura 57 – Efeito do pH (a) e da temperatura (b) na atividade enzimática da galactanase

recombinante de B. licheniformis CBMAI 1609
Na Figura 58 são apresentados os efeitos do pH e da temperatura na

estabilidade da galactanase recombinante de B. licheniformis CBMAI 1609. A
galactanase estudada mostrou-se estável em um ampla faixa de pH, sendo
constatada a retenção de cerca de 70 % da sua atividade inicial após 24 horas de
incubação a 4 ºC na faixa de pH entre 4,0 e 10,0 (Figura 58a). Com respeito à
estabilidade térmica, foi observado que a enzima mantinha 100% da sua atividade
inicial após 1 hora de incubação em temperaturas entre 25 e 45 ºC no pH 7,0. Esta
enzima ainda reteve cerca de 70 % de atividade residual após o tratamento térmico
a 50 ºC por 1 hora e foi completamente inibida quando incubada em temperaturas
superiores a 55 ºC (Figura 58b).
245
Figura 58 – Efeito do pH (a) e da temperatura (b) na estabilidade da galactanase

Os resultados observados para o pH e temperatura de estabilidade da

galactanase de B. licheniformis CBMAI 1609 também estão de acordo com outros
trabalhos descritos na literatura. Comparativamente, Tsumura et al. (1991b) ao
caracterizarem as galactanases produzidas pelas linhagens Bacillus sp. S-2 e
Bacillus sp. S-39 também observaram que essas enzimas eram estáveis em uma
ampla faixa de pH após 15 horas de incubação a 20 ºC, sendo que esta variou entre
pH 7,0 e 12,0 para a linhagem S-2 e entre pH 5,0 e 12,0 para a linhagem S-39.
Quanto à estabilidade térmica dessas enzimas, os autores verificaram que a
galactanase da linhagem S-2 foi estável após 15 minutos de incubação em pH 4,0
até 45 ºC enquanto que a enzima da linhagem S-39 foi estável pelo mesmo período
de tempo até a temperatura de 60 ºC em pH 10,0.
No estudo realizado por Emi e Yamamoto (1972) foi verificado que as três
isoformas separadas durante a purificação da galactanase de B. subtilis var.
amylosacchariticus mantiveram cerca de 100 % da atividade inicial após 24 horas de
incubação a 30 ºC na faixa de pH entre 5,5 e 10,5. Essas três isoformas da enzima
foram estáveis após 15 minutos de incubação em pH 8,0 até a temperatura de 50 ºC
e foram praticamente inibidas após o tratamento térmico a 60 ºC. Em outro estudo,
Van de Vis et al. (1991) relataram que as galactanases produzidas por Aspergillus
niger e Aspergillus aculeatus mostraram-se estáveis após 90 minutos de incubação
a temperatura ambiente na faixa de pH entre 5,0 e 7,0. Foi também verificado que a
galactanase de A. niger mantinha 100 % de atividade residual após 90 minutos em
246
temperaturas abaixo de 60 ºC enquanto a galactanase de A. aculeatus mostrou-se

estável até a temperatura de 35 ºC.
A influência de alguns íons metálicos e dos compostos quelantes EDTA e
EGTA na atividade enzimática da galactanase recombinante de B. licheniformis
CBMAI 1609 também foi avaliada e os resultados obtidos estão apresentados na
Tabela 21. Foi constatado que a adição dos compostos EDTA e EGTA promoveu
uma redução de aproximadamente 25 % da atividade enzimática nas duas
concentrações testadas. Este resultado demonstra que a atividade catalítica da
galactanase de B. licheniformis CBMAI 1609 não é totalmente dependente de íons
metálicos divalentes. Uma tendência de ativação da galactanase de B. licheniformis
CBMAI 1609 foi significativamente observada na presença dos íons metálicos K+,
Li+, Na+, Co2+, Ni2+ e Mn2+. A atividade da enzima foi aumentada cerca de 40 % em
relação ao controle na presença dos íons Na+ e Ni2+ na concentração final de 5 mM.
Possivelmente estes íons metálicos que afetaram positivamente a atividade da
galactanase podem estar atuando de alguma forma na estabilização da estrutura
terciária da proteína. Quanto aos íons Ca2+ e Mg2+, não foi constatado um efeito
significativo destes sobre a atividade da enzima na concentração utilizada. Por outro
lado, foi verificado que a atividade da galactanase estudada foi fortemente inibida na
presença dos íons metálicos Fe3+, Cu2+ e Zn2+, sendo nestes casos observada a
redução de mais de 90 % da atividade enzimática em comparação ao controle.
Emi e Yamamoto (1972) relataram que as isoformas da galactanase de B.
subtilis var. amylosacchariticus mostraram-se mais termossensíveis e foram
completamente inativadas na presença do quelante EDTA. Outros trabalhos também
relatam que o EDTA geralmente não afeta a atividade das galactanases fúngicas,
mas que este promove a inibição e desestabilização das galactanases bacterianas
do gênero Bacillus. Isto ocorre devido ao fato das estruturas das galactanases de
micro-organismos do gênero Bacillus apresentarem duas longas alças nas posições
βα 7 e 8 que são estabilizadas por íons cálcio. Nas galactanases fúngicas estas
duas alças são menores e a sua estabilização é realizada por pontes dissulfeto
(Ryttersgaard et al., 2004; Sakamoto; Ishimaru, 2013; Torpenholt et al., 2011).
Diferentemente dos resultados obtidos no presente trabalho, Tsumura et
al. (1991b) constataram que as atividades enzimáticas das galactanases produzidas
pelas linhagens Bacillus sp. S-2 e Bacillus sp. S-39 não foram significativamente
247
afetadas pela presença de 2 mM de EDTA e de 1 mM dos íons metálicos Hg2+, Fe3+,

Cu2+, Mg2+, Mn2+ e Ca2+.
No estudo de caracterização da galactanase de Aspergillus sojae, Kimura,
Yoshioka e Tajima (1998) observaram uma redução de 25 a 90 % da atividade
enzimática na presença de EDTA e dos íons metálicos Mn2+, Fe3+, Zn2+, Mg2+, Ni2+,
Ca2+, Ba2+, Pb2+, Hg2+ e Ag2+ na concentração final 1 mM. Em outro estudo, Van de
Vis et al. (1991) relataram que a adição de EDTA e dos íons metálicos K+, Ba2+,
Ca2+, Co2+, Mg2+ e Mn2+, na concentração final de 1 mm, não apresentou nenhum
efeito significativo sobre as galactanases de Aspergillus niger e Aspergillus
aculeatus. No entanto, foi observado um efeito inibitório da atividade enzimática
dessas duas galactanases na presença dos íons Ag+, Ni2+, Zn2+ e Pb2+.
Michalak et al. (2012) também observaram uma redução da atividade
enzimática da galactanase de Emericella nidulans quando esta foi incubada na
presença de EDTA na concentração final de 10 mM. Os autores deste trabalho ainda
verificaram que a atividade da galactanase foi inibida apenas na presença de 1 mM
de AlCl3, enquanto que os compostos MnCl2, MgCl2, ZnCl2 e CaCl2 não
apresentaram nenhuma influência significativa sobre a atividade catalítica. Em
continuidade a este trabalho, Otten et al. (2013) avaliaram o efeito de íons zinco na
estrutura da galactanase de Emericella nidulans e relataram que 15 íons de zinco
podem se ligar a estrutura desta enzima. Segundo os autores, os íons de zinco não
possuem nenhum papel na atividade catalítica da enzima, mas estes podem
promover um ligeiro aumento na atividade enzimática, pois exercem um efeito
estabilizante sobre a estrutura da proteína e neutralizam a carga da superfície, o que
pode favorecer as interações com o substrato neutro.
248
Tabela 21 – Efeito de íons metálicos e de compostos quelantes na atividade da galactanase

Atividade enzimática
relativa ( %)
Compostos
Desvio
Média
padrão
Controle 100,00 2,55
EDTA (5 mM) 63,18 3,70
EDTA (10 mM) 77,74 3,71
EGTA (5 mM) 79,59 4,96
EGTA (10 mM) 74,00 4,77
KCl (5 mM) 126,00 6,92
LiCl (5 mM) 117,58 4,73
NaCl (5 mM) 139,42 7,57
CaCl2 (5 mM) 109,07 5,62
CoCl2 (5 mM) 129,26 7,09
NiCl2 (5 mM) 144,67 3,45
MgCl2 (5 mM) 101,04 5,53
MnCl2 (5 mM) 115,93 6,37
FeCl3 (5 mM) 2,66 2,79
CuSO4 (5 mM) 8,10 6,87
ZnSO4 (5 mM) 7,61 6,42
Na Figura 59 são apresentados os resultados da avaliação do efeito da

concentração de substrato sobre a atividade da galactanase recombinante de B.
licheniformis CBMAI 1609. Estes ensaios foram realizados sob as condições
reacionais ótimas (pH 7,0 e 40 ºC) usando o substrato galactana de batata em
concentrações variando entre 0,1 e 7 mg/mL e a enzima na concentração de 0,009
mg/mL.
Verificou-se que a galactanase de B. licheniformis CBMAI 1609
apresentava um perfil cinético que se ajustava ao modelo proposto por Michaelis-
Menten, sendo observado um coeficiente de correlação superior a 0,97 (Figura 59).
Com o auxílio do programa GraphPad foi estimado que essa galactanase
apresentava um Km de 2,3 mg/mL (± 0,18) e Vmax de 722,8 U/mg de proteína
(± 22,7). Os parâmetros cinéticos Kcat (constante catalítica) e Kcat/Km (constante de
especificidade) também foram determinados a partir dos dados experimentais e os
249
valores obtidos para estas duas constantes foram 555,8 s-1 (± 47,10) e 241,6 s-1 mg-1
mL (± 27,90), respectivamente.
Figura 59 – Efeito da concentração do substrato galactana de batata na atividade da

galactanase recombinante de B. licheniformis CBMAI1609
O valor de Km (constante de Michaelis) indica a concentração de substrato

na qual a velocidade da reação enzimática equivale à metade da sua velocidade
máxima. Na prática se uma enzima tiver um valor de Km pequeno, ela apresenta
uma elevada afinidade pelo substrato e, consequentemente, atinge o máximo de
eficiência catalítica em baixas concentrações de substrato (Voet; Voet, 2013). Foi
verificado que a galactanase de B. licheniformis CBMAI 1609 apresentava uma baixa
afinidade pelo substrato galactana de batata, pois o valor de Km dessa enzima foi
maior que o reportado para outras galactanases. Michalak et al. (2012) usando o
mesmo substrato para atividade enzimática, relataram que a galactanase de
Emericella nidulans apresentava um Km de 0,51 mg/mL e Vmax de 73,3 U/mg de
proteína. Em outro estudo, Tabachnikov e Shoham (2013) verificaram que a
galactanase de Geobacillus stearothermophilus T-6 exibia um Km de 0,2 mg/mL, sob
condições de ensaio semelhantes as utilizadas no presente estudo (40 ºC e pH 6,0).
O valor de Km observado para o substrato arabinogalactana de soja para as
galactanases produzidas por linhagens de B. subtilis e por Aspergillus sojae também
foram menores que o valor observado neste estudo, estes oscilaram entre 0,43 e
1,13 mg/mL (Emi; Yamamoto, 1972; Kimura; Yoshioka; Tajima, 1998).
A constante catalítica Kcat, também chamada de número de renovação,
representa o número de moléculas de substrato convertidas a produto por uma
250
molécula de enzima (ou sítio ativo) por unidade de tempo quando a enzima está
totalmente saturada pelo substrato (Voet; Voet, 2013). O valor estimado para este
parâmetro no presente estudo foi 2,3 vezes maior que o observado para a
galactanase de Geobacillus stearothermophilus T-6, que foi de 240 s-1 (Tabachnikov;
Shoham, 2013). Por outro lado, Braithwaite et al. (1997) relataram que os valores de
Kcat da galactanase de Pseudomonas fluorescens subsp. cellulosa nos substratos
galactana de tremoço-amarelo e azo-galactana foram 681 s-1 e 326 s-1,
respectivamente.
O parâmetro cinético Kcat/Km é considerado uma das melhores maneiras
de se comparar enzimas diferentes, pois relaciona a eficiência catalítica da enzima
com a sua afinidade pelo substrato. Consequentemente, quanto maior for esta
relação melhor é a atuação da enzima sobre um determinado substrato (Nelson;
Cox, 2014; Voet; Voet, 2013). Foi verificado que a galactanase de B. licheniformis
CBMAI 1609 apresentava uma eficiência catalítica (Kcat/Km) para hidrólise de
galactana de batata cerca de 5 vezes menor que a observada para a galactanase de
Geobacillus stearothermophilus T-6, cujo valor foi de 1.200 s-1 mg-1 mL
(Tabachnikov; Shoham, 2013). Não foram encontrados na literatura consultada
outros valores de Kcat/Km de galactanases para uma comparação mais detalhada da
eficiência catalítica da enzima estudada na hidrólise de galactanas.
Na tentativa de identificar os produtos formados e confirmar o modo de
ação da galactanase de B. licheniformis CBMAI 1609, foram realizadas análises de
eletroforese capilar utilizando amostras recolhidas durante a reação de hidrólise do
substrato galactana de batata. Na Figura 60 são apresentados os eletroferogramas
do padrão galactose e dos produtos formados durante a hidrólise do substrato
galactana de batata pela galactanase estudada ao longo de 16 horas de reação. No
início da hidrólise (tempo 0 h) foi identificado apenas o pico referente ao fluoróforo
APTS. Após 30 minutos de reação sob as condições ótimas de atividade enzimática
foi observado que a galactanase de B. licheniformis CBMAI 1609 possivelmente
atuava sobre as ligações glicosídicas internas da cadeia da galactana liberando
principalmente galactotetraose (G4) como produto de hidrólise. No decorrer do
tempo de hidrólise até o final do período de reação de 16 horas, foi verificada a
diminuição do pico de galactotetraose e a formação dos produtos galactotriose (G3),
galactobiose (G2) e galactose (G1). Aparentemente esta enzima tem como produtos
finais principalmente galactose e galactotriose. A identificação dos possíveis picos
251
de galactobiose, galactotriose e galactotetraose foi baseada na comparação com os

tempos de retenção dos padrões celobiose, celotriose e celotetraose (dados não
apresentados).
Os resultados obtidos nos ensaios de eletroforese capilar confirmam que
a enzima estudada apresenta um modo de ação do tipo endo, que catalisa a
hidrólise de ligações β-1,4-D-galactosil na galactana de batata com a liberação de
galactose e outros oligossacarídeos menores (G2, G3 e G4). Este perfil de atuação
da enzima foi semelhante ao observado para outras endo-β-1,4-galactanases de
linhagens de Bacillus sp. e se difere das galactanases de origem fúngicas que
formam galactose e galactobiose como produtos finais (Emi; Yamamoto, 1972;
Kimura; Yoshioka; Tajima, 1998; Sakamoto; Ishimaru, 2013).
Comparativamente, De Maria et al. (2013) ao avaliarem os produtos da
hidrólise do substrato galactana de tremoço-amarelo pela galactanase da linhagem
B. licheniformis ATCC 14580 observaram no início da reação a formação de
galactotetraose e outros oligômeros maiores. Após 24 horas de incubação foi
constatada por estes autores a formação de galactose, galactobiose e galactotriose
na razão molar de 1:0,4:0,9. Neste trabalho também foi avaliado os produtos
formados durante a hidrólise do mesmo substrato pela galactanase de Aspergillus
aculeatus e neste caso, foi verificado que esta enzima produzia inicialmente uma
mistura mais homogênea de oligômeros e no final do período de incubação foi
observada quase que exclusivamente a presença de galactose e galactobiose na
razão molar de 2:1.
Tabachnikov e Shoham (2013) ao caracterizarem a galactanase de
Geobacillus stearothermophilus T-6 também observaram o mesmo perfil de hidrólise
e produtos formados que o presente trabalho, após 17,5 horas de reação. Não foram
constatadas neste estudo alterações significativas nas quantidades dos produtos
formados (galactobiose e galactotriose) após 40 horas de reação. Segundo esses
autores, as galactanases de Geobacillus stearothermophilus e de B. licheniformis
ATCC 14580 atuam preferencialmente sobre galactanas de alta massa molecular e
não são capazes de hidrolisar de forma eficiente galactobiose e galactotriose em
galactose como as galactanases fúngicas. Uma das possíveis razões para estas
variações de preferência de substrato e grau de polimerização dos produtos
formados entre as galactanases bacterianas e fúngicas são as diferenças estruturais
252
e de tamanho que existem nas alças de ligação ao substrato, como foi observado
por Ryttersgaard et al. (2004).
Figura 60 – Eletroforese capilar dos produtos de hidrólise do substrato galactana de batata

pela galactanase recombinante de B. licheniformis CBMAI 1609
(APTS: ácido 1,3,6-trissulfônico-8-aminopireno; G1: galactose; G2: galactobiose; G3: galactotriose;
G4: galactotetraose)
Na Figura 61 são apresentados os resultados obtidos na caracterização

biofísica da galactanase de B. licheniformis CBMAI 1609, quanto ao perfil de
estrutura secundária da enzima e análise da desnaturação térmica realizada por
dicroísmo circular. O espectro de UV-distante obtido a 20 ºC e em pH 7,4 apresentou
um pico positivo com elipticidade molar máxima a 190 nm e um pico negativo com
menor valor de elipticidade molar próximo a 220 nm. Como proposto por Corrêa e
Ramos (2009), este tipo de espectro indica a predominância de estrutura secundária
do tipo α-hélice na enzima estudada (Figura 61a). Este dado está de acordo com o
predito pelo Protein Data Bank para a galactanase de B. licheniformis ATCC 14580,
que apresenta em sua estrutura secundária cerca de 37 % de α-hélice e 14 % de
folhas-β (Disponível em: http://www.rcsb.org/pdb/explore/remediatedSequence.do?
structureId=1R8L). O perfil do espectro de CD observado neste trabalho também foi
semelhante ao obtido para a galactanase de Pseudomonas fluorescens subsp.
cellulosa por Braithwaite et al. (1997).
A desnaturação térmica da estrutura secundária da galactanase de B.
licheniformis CBMAI 1609 foi estudada através do monitoramento da variação da
253
elipticidade molar a 220 nm durante gradiente térmico de 20 a 90 ºC. Foram

verificadas alterações significativas nos espectros de CD coletados em temperaturas
superiores a 40 ºC, indicando a desnaturação da galactanase. A partir da curva de
desnaturação térmica apresentada na Figura 61b foi possível calcular a temperatura
de transição (Tm), ou seja, a temperatura onde 50 % da enzima encontram-se na
forma enovelada ou na forma desenovelada. No caso da galactanase de B.
licheniformis CBMAI 1609 o valor estimado para a temperatura de transição foi de
52,9 ºC. Este resultado está de acordo com os dados observados anteriormente de
perda da atividade enzimática em temperaturas superiores a 50 ºC (Figura 57b).
Figura 61 – Espectro de dicroísmo circular no UV-distante em pH 7,4 a 20 ºC (a) e curva de

desnaturação térmica (b) da galactanase recombinante de B. licheniformis CBMAI 1609
4.4.4. Expressão, purificação e caracterização da endoglucanase da

família GH12 codificada pelo gene BlXeg de B. licheniformis CBMAI
1609
Atualmente, há um crescente interesse biotecnológico nos
polissacarídeos celulose, β-glucano e xiloglucano, assim como nas enzimas
endoglucanase e xiloglucanase, que são responsáveis pela modificação e
degradação destes polissacarídeos. A celulose, o β-glucano e o xiloglucano podem
ser utilizados na produção de agentes espessantes para alimentos, surfactantes,
biocompósitos para a enxertia de superfícies de celulose, géis termicamente
reversíveis para a administração de medicamentos, entre outras aplicações. As
endoglucanases e xiloglucanases tem sido utilizadas na clarificação de sucos de
frutas, produção de cervejas e vinhos, fabricação de papel, tratamento de tecidos e
254
rações animais, estudos de caracterização da parede celular vegetal e na hidrólise

de biomassas lignocelulósicas (Benko et al., 2008; Gloster et al., 2007; Ng et al.,
2009; Pol; Menon; Rao, 2012; Sinitsyna et al., 2010).
Conforme mencionado no item 4.4.1, o gene BlXeg foi isolado durante a
triagem funcional da biblioteca genômica da linhagem B. licheniformis CBMAI 1609
com o substrato CMC e identificado como codificante de uma endoglucanase da
família GH12 que aparentemente atuava sobre o substrato celulósico
carboximetilcelulose e também sobre o polissacarídeo hemicelulósico xiloglucano.
A sequência de aminoácidos predita para essa endoglucanase da
linhagem B. licheniformis CBMAI 1609 (sem a região que codificava um peptídeo
sinal) apresentou 99 % de identidade com outras endoglucanases anotadas no
genoma de várias linhagens de B. licheniformis, como nas linhagens 9945A, CPSM8
e SVD1 (números de acesso no NCBI: AGN37700.1, ETB71339.1 e BAL45508.1,
respectivamente) e 96 % de identidade com a sequência de aminoácidos da
endoglucanase/xiloglucanase cristalizada de B. licheniformis ATCC 14580 (número
de acesso no NCBI: 2JEMA). Foi verificado ainda que essa enzima tinha apenas
24 % de identidade com as xiloglucanases de Aspergillus aculeatus e Aspergilus
fumigatus (números de acesso no NCBI: 3VL8A e XP750222.1, respectivamente).
Na Figura 62 está ilustrada a comparação da sequência de aminoácidos
predita para a enzima codificada pelo gene BlXeg clonado no vetor pET-28a(+) com
a sequência de aminoácidos depositada para a endoglucanase/xiloglucanase
cristalizada de B. licheniformis ATCC 14580 através da ferramenta ClustalW. A
estrutura primária da enzima clonada neste estudo apresentou apenas 8
aminoácidos diferentes em relação a outra enzima. Essas diferenças foram
observadas nas posições 40 (serina por asparagina), 120 (ácido aspártico por
glicina), 152 (serina por asparagina), 164 (glicina por serina), 174 (isoleucina por
valina), 181 (serina por arginina), 186 (isoleucina por valina) e 198 (glutamina por
histidina). Entre os aminoácidos conservados estavam aqueles envolvidos no
mecanismo de hidrólise das enzimas da família GH12, ou seja, os dois resíduos de
ácido glutâmico do sítio ativo, localizados nas posições 126 (nucleófilo) e 214
(ácido/base). Também permaneciam conservados na enzima clonada os
aminoácidos envolvidos nos 6 sítios de ligação ao substrato como proposto por
Gloster et al. (2007), ou seja, serina (4), asparagina (22), valina (23), triptofano (24),
255
histidina (68), triptofano (69), ácido aspártico (108), triptofano (110), metionina (128),
glicina (137), triptofano (168) e fenilalanina (216).
Figura 62 – Alinhamento das sequências de aminoácidos preditas para a enzima codificada

pelo gene BlXeg de B. licheniformis CBMAI 1609 e para a endoglucanase/xiloglucanase de
B. licheniformis ATCC 14580.
* As setas indicam os aminoácidos envolvidos no mecanismo de hidrólise da enzima e em sítios de
ligação ao substrato
Comparativamente, Furtado et al. (2015) realizaram o alinhamento das

sequências de aminoácidos da endoglucanase/xiloglucanase de B. licheniformis
ATCC 14580 com a endoglucanase de A. niger e as xiloglucanases de A. aculeatus
e A. niveus e verificaram que a sequência de aminoácidos da enzima de B.
licheniformis apresentava várias substituições em comparação as outras 3 enzimas,
inclusive dos aminoácidos considerados importantes para a catálise enzimática,
assim como a deleção de alguns trechos da sequência da enzima bacteriana nas
enzimas fúngicas.
A análise da sequência de aminoácidos da enzima madura codificada
pelo gene BlXeg através da ferramenta Protparam indicou que esta possuía 255
aminoácidos e tinha massa molecular e ponto isoelétrico teóricos estimados em 28,5
KDa e 9,08, respectivamente. Esse valor de massa molecular da enzima está de
acordo com o valor previamente descrito na literatura para várias outras
endoglucanases e xiloglucanases microbianas da família GH12, que normalmente
apresentam massa molecular entre 23 e 36 KDa (Master et al., 2008; Pauly et al.,
256
1999; Sinitsyna et al., 2010; Song et al., 2013). Gloster et al. (2007) e Liu et al.
(2004), por exemplo, relataram que a endoglucanase/xiloglucanase de B.
licheniformis ATCC 14580 e uma endoglucanase da família GH12 de B. licheniformis
GXN151 apresentavam massas moleculares iguais a 26 e 29 KDa, respectivamente.
A expressão heteróloga da enzima codificada pelo gene BlXeg clonada no
vetor pET-28a(+) foi avaliada utilizando as linhagens E. coli BL21(DE3),
BL21(DE3)pRare2, Rosseta-gami-2(DE3) e Artic express (DE3) sob as condições
descritas no item 3.3.4. Os géis de eletroforese SDS-PAGE apresentados na Figura
63 ilustram os resultados desses testes de expressão.
Observou-se pelas análises eletroforéticas que a enzima de interesse foi
expressa no citoplasma das 4 linhagens de E. coli sob as condições de cultivo
utilizadas após a indução com IPTG. A massa molecular da proteína expressa foi
estimada, a partir da relação gráfica Rf (fator de retenção) x log da massa molecular
dos padrões de proteínas utilizados, em aproximadamente 27 KDa. Este valor de
massa molecular foi próximo ao valor predito pela ferramenta Protparam.
Foi verificado ainda um alto nível de expressão proteica quando foi
utilizada a linhagem E. coli BL21(DE3)pRare2, seguido pelas linhagens BL21(DE3) e
Artic Express (DE3) (canaletas 2 dos géis). Quantidades semelhantes da enzima na
forma solúvel foram observadas para as 4 linhagens ao final do período de indução
com IPTG (canaletas 4 dos géis). Testes de atividade enzimática com os substratos
CMC e xiloglucano de tamarindo foram realizados e confirmaram que a enzima
expressa estava ativa nos sobrenadantes do processo de lise celular das 4
linhagens utilizadas para a expressão proteica.
A densidade óptica a 600 nm das culturas microbianas também foi
acompanhada durante os cultivos e indicou que a linhagem E. coli
BL21(DE3)pRare2 teve o melhor crescimento e consequentemente gerou uma maior
quantidade de massa celular ao final da expressão (dados não apresentados). A
partir desses resultados, foi selecionada essa linhagem de E. coli para a expressão
da enzima em maior volume sob as mesmas condições utilizadas nos testes de
expressão. Uma possível explicação para os melhores resultados de expressão com
esta linhagem pode ser o fato de que o plasmídeo pRare2 dispõe de genes que
codificam RNAt para vários códons raros, com isso a expressão deixou de ser
limitada pelos códons especificamente utilizados pela E. coli (Alvarez, 2013).
257

endoglucanase GH12 codificada pelo gene BlXeg de B. licheniformis CBMAI1609 nas
linhagens E. coli BL21(DE3), BL21(DE3)pRare2, Rosetta-gami 2(DE3) e Artic Express (DE3)
(M: marcador de massa molecular; 1: proteínas obtidas das células antes da indução com
IPTG; 2: proteínas obtidas das células ao final do período de indução com IPTG - 4 horas
para as linhagens E. coli BL21(DE3), BL21(DE3)pRare2 e Rosseta-gami 2(DE3) e 20 horas
para a linhagem Artic Express (DE3); 3: proteínas insolúveis obtidas após o processo de lise
celular; 4: proteínas solúveis presentes no sobrenadante do processo de lise celular). As
setas indicam as bandas correspondentes à enzima expressa.
A Figura 64 ilustra o cromatograma da purificação da endoglucanase

GH12 de B. licheniformis CBMAI 1609 na coluna de afinidade His-Trap Fast Flow
com íons níquel imobilizados e também o gel da eletroforese SDS-PAGE com os
passos da expressão proteica em maior escala e os resultados obtidos nas etapas
de purificação cromatográfica.
A expressão dessa endoglucanase em maior escala (canaleta 2 do gel)
foi reduzida em comparação ao resultado obtido anteriormente nos testes de
expressão em frascos Erlenmeyer de 250 mL (Figura 63). No entanto, foi obtida uma
boa quantidade de proteína solúvel no sobrenadante do processo de lise celular
para ser utilizada nos ensaios de purificação (canaleta 3 do gel). O primeiro passo
para purificação dessa endoglucanase foi realizado em coluna de afinidade com íons
níquel imobilizados, onde foi constatado que a enzima apresentava uma alta
afinidade por esta resina devido a cauda de 6 resíduos de histidina inserida pelo
vetor pET-28a(+). A enzima foi eluída praticamente pura em um único pico durante a
realização do gradiente de imidazol, com cerca de 200 mM de imidazol (canaleta 4
258
do gel). Posteriormente, essas frações coletadas com atividade de endoglucanase

foram reunidas e submetidas a um passo cromatográfico em coluna de exclusão
molecular Superdex 75. A amostra injetada nessa coluna foi eluída em um único pico
durante a corrida cromatográfica, confirmando a elevada pureza da enzima para os
ensaios de caracterização, como apresentado pela eletroforese SDS-PAGE
(canaleta 5).
Figura 64 – Cromatograma da purificação da endoglucanase GH12 recombinante de B.

licheniformis CBMAI 1609 em coluna de afinidade His-Trap Fast Flow com íons níquel
imobilizados (a) e gel de eletroforese SDS-PAGE com os passos da expressão e purificação
da enzima (b)
proteínas obtidas das células ao final de 4 horas de indução com IPTG; 3: proteínas solúveis
presentes no sobrenadante do processo de lise celular; 4: amostra das frações reunidas da
cromatografia de afinidade com atividade de endoglucanase; 5: amostra das frações reunidas da
cromatografia de exclusão molecular). A seta indica o pico de eluição de proteínas com atividade
enzimática.
O primeiro ensaio realizado durante a caracterização bioquímica dessa

enzima consistiu na avaliação da especificidade enzimática para diferentes
substratos polissacarídicos, como apresentado na Figura 65. Neste ensaio os
açúcares redutores liberados pela enzima foram determinados após 1 hora de
reação em pH 6,0 a 50 ºC com os diferentes substratos na concentração de 0,5 %
(m/v). Os resultados obtidos foram normalizados considerando o maior valor de
atividade enzimática como 100 %.
259
Foi verificado que a enzima codificada pelo gene BlXeg apresentava alta
especificidade enzimática para os substratos xiloglucano de tamarindo e β-glucano
de cevada. Não foram constatadas diferenças estatísticas nos resultados obtidos
sobre estes dois substratos ao nível de significância de 5 %. O β-glucano de cevada
é um polissacarídeo estruturalmente similar à celulose, sendo formado por unidades
de glicose unidas por ligações glicosídicas do tipo β-1,4 e também β-1,3 na
proporção 2:1, e esse normalmente é hidrolisado por endoglucanases. Foi verificado
ainda que a enzima apresentou 50 e 6 % de atividade enzimática relativa sobre os
polissacarídeos liquenano e CMC, respectivamente. Essa menor atividade
enzimática observada sobre esses dois substratos pode ter sido em decorrência de
uma menor interação enzima-substrato por causa da maior proporção de ligações
glicosídicas β-1,3 em relação às ligações β-1,4 dos resíduos de glicose no liquenano
(2,3 - 2,7:1) e o grau de metilação da celulose no CMC. Para os demais substratos
avaliados foram verificadas atividades enzimáticas relativas abaixo de 1 % ou nulas.
O fato da enzima não ter atuado sobre o substrato laminarina indica que ela não é
capaz de hidrolisar ligações do tipo β-1,3 entre resíduos de glicose.
Figura 65 - Painel de substratos para avaliação da especificidade da endoglucanase GH12

Os resultados observados no presente estudo foram interessantes em

comparação aos relatados para outras endoglucanases da família GH12, pois estas
normalmente apresentam menor atividade sobre o xiloglucano em comparação ao β-
glucano. Segundo Araújo (2013), as enzimas ativas sobre o polissacarídeo
xiloglucano podem ser encontradas nas famílias GH5, 7, 12, 16, 44 e 74 do sistema
260
de classificação CAZy. No entanto, a atividade catalítica pouco específica sobre o

xiloglucano, como é o caso da endoglucanase do presente estudo, é encontrada
principalmente nas famílias GH5 e 12. A multiespecificidade dessa endoglucanase
pode ser explorada para o desenvolvimento de melhores coquetéis enzimáticos e
também para facilitar a engenharia de micro-organismos hospedeiros visando a
utilização destes no bioprocessamento de materiais lignocelulósicos.
Gloster et al. (2007) também avaliaram a especificidade da
endoglucanase/xiloglucanase GH12 da linhagem B. licheniformis ATCC 14580 para
diferentes polissacarídeos e observaram que essa enzima apresentava 100 % de
atividade relativa para o substrato xiloglucano de tamarindo, 39 % para CMC, 18 %
para glucomanana e 8 % para β-glucano de cevada. Comparativamente, foi relatado
que as xiloglucanases da família GH12 dos fungos Aspergillus aculeatus, Aspergillus
niger, Penicillium canescens e Penicillium verruculosum apresentavam 100 % de
atividade relativa para o substrato xiloglucano de tamarindo e menos de 1 % de
atividade relativa nos substratos celulósicos CMC, β-glucano e outros
polissacarídeos encontrados na parede celular vegetal (Master et al., 2008; Pauly et
al., 1999; Sinitsyna et al., 2010).
Em outro estudo, Dias (2013) verificou que a endoglucanase I de
Aspergillus terreus apresentava 100 % de atividade relativa no β-glucano, 45 % no
xiloglucano de tamarindo, 8,6 % em glucomanana e 1,4 % em CMC. Resultados
semelhantes aos obtidos no presente estudo foram verificados por Ariza et al. (2011)
para uma xiloglucanase da família GH44 de Paenibacillus polymyxa. Segundo os
autores desse trabalho, esta enzima apresentou 100 % de atividade relativa com
xiloglucano de tamarindo, 94 % com CMC, 86 % com β-glucano de cevada, 15 %
com arabinoxilana de trigo e 4 % com galactomanana de alfarroba.
Alguns estudos recentes têm buscado através do alinhamento de
sequências de aminoácidos, mutações sítio dirigidas e sobreposição de estruturas
terciárias, desvendar os fatores que determinam a especificidade das hidrolases
glicosídicas da família GH12 sobre os substratos celulósicos e o xiloglucano
(Damásio et al., 2014; Gloster et al., 2007; Master et al., 2008; Powlowski et al.,
2009). Ainda não há uma explicação completamente elucidada do motivo das
variações de especificidade destas enzimas, mas acredita-se que a inserção e
deleção de aminoácidos em alguns trechos das sequências das enzimas possam ser
261
um dos fatores que contribuam diretamente para as diferenças nas interações

enzima-substrato.
Os efeitos do pH e da temperatura na atividade da endoglucanase GH12
de B. licheniformis CBMAI 1609 foram avaliados utilizando o substrato xiloglucano
de tamarindo e os resultados obtidos estão ilustrados na Figura 66.
A enzima estudada mostrou-se ativa em pH entre 4,0 e 9,0, sendo
verificada atividade enzimática máxima quando em valores de pH oscilando entre
6,5 e 7,5 (Figura 66a). Quanto ao efeito da temperatura na atividade enzimática foi
observado que essa enzima apresentava por volta de 60 a 70 % de atividade relativa
quando em temperaturas entre 25 e 45 ºC. A 50 ºC foi observada uma espécie de
ativação da enzima com o aumento da atividade enzimática relativa para 90 %. A
temperatura ótima de atividade dessa enzima foi constatada a 55 ºC e aumentos
posteriores na temperatura provocaram a redução da atividade enzimática. Na
temperatura de 70 ºC foi verificado que a enzima apresentava cerca de 16 % da sua
atividade catalítica (Figura 66b).
Os resultados observados para os efeitos do pH na atividade enzimática
foram diferentes dos observados para algumas endoglucanases e xiloglucanases
fúngicas da família GH12, que normalmente são mais ativas em valores de pH
levemente ácidos. Dias (2013) observou que o pH ótimo de atividade da
endoglucanase de Aspergilllus terreus era 5,0 e que a enzima apresentava cerca de
30 e 10 % de atividade relativa quando em pH 7,0 e 8,0, respectivamente. Sinitsyna
et al. (2010) também relataram que as endoglucanases da família GH12 das
linhagens Penicillium canescens e Penicillium verruculosum apresentavam atividade
ótima em pH 4,0 e 4,6, respectivamente. Em outro estudo, Song et al. (2013)
descreveram que uma das xiloglucanases GH12 de Rhizomucor miehei foi mais
ativa em pH ácido, com a atividade máxima observada em pH 5,0, enquanto que a
outra xiloglucanase tinha pH ótimo de atividade em 6,0 e era ativa em uma ampla
faixa de pH, inclusive em valores levemente alcalinos.
Quanto aos efeitos da temperatura na atividade enzimática, os resultados
obtidos foram similares aos observados para outras endoglucanases e
xiloglucanases da família GH12. Damásio et al. (2012) relataram que a xiloglucanase
de A. niveus exibiu atividade ótima em pH 6,0 e a 60 ºC. Os autores deste trabalho
ainda relataram que esta enzima apresentava-se como um dímero em solução
quando a 20 ºC e que a 60 ºC prevalecia a forma monomérica que tornava a enzima
262
mais ativa. Em outro estudo, Master et al. (2008) verificaram que a xiloglucanase de
A. niger mostrava atividade ótima para degradação do xiloglucano de tamarindo na
faixa de temperatura entre 50 e 60 ºC. Os resultados obtidos no presente estudo
diferiam dos observados para as xiloglucanases de Rhizomucor miehei que tiveram
atividade máxima entre 60 e 65 ºC (Song et al., 2013). Por outro lado, a temperatura
ótima de atividade da xiloglucanase de B. licheniformis CBMAI 1609 foi mais elevada
do que o observado por Araújo (2013) para a xiloglucanase da família GH74 de
Xanthomonas campestris, a qual mostrou atividade máxima a 42 ºC.
Figura 66 – Efeito do pH (a) e da temperatura (b) na atividade enzimática da endoglucanase

GH12 recombinante de B. licheniformis CBMAI 1609
Os efeitos do pH e da temperatura na estabilidade enzimática da

endoglucanase GH12 de B. licheniformis CBMAI 1609 também foram avaliados
usando o substrato xiloglucano de tamarindo e os resultados obtidos estão
apresentados na Figura 67. Foi constatado que a enzima estudada mantinha mais
de 75 % da sua atividade inicial após 24 de incubação a 4 ºC em valores de pH entre
3,0 e 7,0. A enzima ainda reteve cerca de 40 e 60 % da sua atividade inicial após a
incubação por 24 horas em pH 2,0 e 9,0, respectivamente (Figura 67a). Quanto ao
efeito da temperatura na estabilidade enzimática, foi verificado que a enzima era
estável após 1 hora de incubação em pH 7,0 em temperaturas entre 25 e 55 ºC e
que essa era totalmente inibida após incubação em temperaturas superiores a 65 ºC
(Figura 67b). Foi ainda constatada a manutenção de cerca de 100 e 80 % da
atividade enzimática inicial após 6 horas de incubação em temperaturas abaixo de
50 e a 55 ºC, respectivamente (dados não apresentados).
263
Comparativamente, Pauly et al. (1999) verificaram que a xiloglucanase de

Aspergillus aculeatus era mais estável em pH entre 3,0 e 3,8 após 20 horas de
incubação em temperatura ambiente e que a sua estabilidade diminuía em pH
abaixo de 2,8 e acima de 5,0. Essa enzima também se mostrou estável após 2 horas
de incubação em temperaturas abaixo de 35 ºC, no entanto, foi observada a perda
de mais de 80 % da sua atividade inicial após 2 horas de incubação a 50 ºC. Song et
al. (2013) relataram que as duas xiloglucanases de Rhizomucor miehei mantiveram
cerca de 100 % de atividade residual após 30 minutos de incubação em
temperaturas abaixo 50 ºC e que estas foram fortemente inibidas após a incubação
pelo mesmo período em temperaturas superiores a 65 ºC. No estudo realizado por
Sinitsyna et al. (2010), foi verificado que as xiloglucanases de Penicillium canescens
e Penicillium verruculosum retinham 100 % da atividade inicial após 24 horas de
incubação a 40 e 50 ºC e que a atividade residual era reduzida para cerca de 50 %
após 1 hora de incubação a 60 ºC.

endoglucanase GH12 recombinante de B. licheniformis CBMAI 1609
Outro aspecto avaliado durante a caracterização da endoglucanase GH12

de B. licheniformis CBMAI 1609 foi o efeito de íons metálicos e dos compostos
EDTA e EGTA na atividade da enzima. Conforme apresentado na Tabela 22 a
atividade enzimática não foi influenciada pelos compostos quelantes EDTA e EGTA
na concentração final de 5 mM, indicando que a enzima é independente de íons
metálicos divalentes para a sua catálise. Uma tendência de inibição enzimática foi
verificada na presença dos íons K+, Mn2+, Fe3+ e Cu2+, sendo essa redução superior
264
a 90 % na presença desses dois últimos íons. Essa redução observada na presença

do íon K+ pode ser devido a alterações na força iônica da solução devido ao efeito
de salting out. A inativação provocada pelos íons metálicos Zn2+, Fe3+ e Cu2+ pode
ter sido em consequência da interação destes íons com grupos tióis de resíduos de
cisteínas importantes para o enovelamento da proteína, uma vez que não é relatada
a presença de cisteína no sítio ativo desta enzima. Foi ainda constatado um
aumento significativo da atividade enzimática quando foram adicionados os íons Li+,
Na+, Ni2+ e Mg2+ na concentração de 5 mM. No caso da adição do íon Ni2+ esse
aumento foi de aproximadamente 64 %. Verificou-se também que a adição desse íon
proporcionou uma ligeira melhora na estabilidade térmica da enzima quando esta foi
incubada a 60 ºC (dados não apresentados). Os demais íons avaliados não tiveram
influência significativa na atividade enzimática.
Comparativamente, Nazir et al. (2009) relataram que uma endoglucanase
GH12 de Aspergillus terreus com atividade sobre o xiloglucano de tamarindo foi
ativada na presença de 5 mM dos íons Na+, Cu2+, Mg2+ e Ca2+, sendo observado um
aumento superior a 20 % na presença do íon Cu2+. Segundo os autores desse
trabalho a enzima apresentou uma tendência de inibição quando foi incubada com
íons Fe2+, Mn2+, Zn2+ e K+ e também com o EDTA. No estudo realizado por Song et
al. (2013), foi verificado que as duas xiloglucanases GH12 de Rhyzomucor miehei
caracterizadas foram inibidas pelos íons Ag+, Zn2+, Cr2+, Hg2+, Fe3+, Cu2+ e Sn2+ na
concentração final de 1 mM. Foi ainda constatado que a atividade de uma dessas
xiloglucanases apresentou um aumento de 21 e 32 % na presença do íon Na+ e do
quelante EDTA, respectivamente, enquanto que a outra enzima foi ativada cerca de
11 % na presença do íon Mg2+.
Diferentemente do observado para a endoglucanase de B. licheniformis
CBMAI 1609, as xiloglucanases de Penicillium sp. apresentaram um aumento de 20
% na atividade enzimática quando na presença do íon Zn2+ e não foram afetadas
pelos íons Cu2+, Fe3+ e Mg2+ quando adicionados na concentração final de 1 mM
(Sinitsyna et al., 2010).
265

endoglucanase GH12 recombinante de B. licheniformis CBMAI 1609
Compostos relativa ( %)
(5 mM) Desvio
Média
padrão
EDTA 108,56 9,48
EGTA 92,79 9,11
KCl 86,03 3,87
LiCl 129,64 4,42
NaCl 118,88 5,07
CaCl2 101,85 3,38
CoCl2 95,10 7,78
NiCl2 164,74 4,77
MgCl2 133,73 6,18
MnCl2 43,22 1,09
FeCl3 2,08 1,50
CuSO4 8,49 3,27
ZnSO4 57,06 13,48
Os efeitos da concentração dos substratos xiloglucano de tamarindo e β-

glucano de cevada sobre a atividade enzimática também foram avaliados para a
determinação de alguns parâmetros cinéticos da enzima estudada. Para isso foram
realizados ensaios enzimáticos com concentrações variadas desses dois substratos,
entre 0,1 e 8 mg/mL, sob as condições ótimas de atividade enzimática (pH 7,0, 55 ºC
e enzima na concentração de 0,02 mg/mL). Na Figura 68 são apresentados os perfis
cinéticos obtidos a partir dos ajustes dos dados experimentais a uma regressão não-
linear pelo programa GraphPad. Os resultados obtidos indicaram que a
endoglucanase de B. licheniformis CBMAI 1609 apresentava um comportamento
cinético do tipo Michaeliano para os dois substratos, com um coeficiente de
correlação acima de 0,96.
266
Figura 68 – Efeito da concentração dos substratos xiloglucano de tamarindo (a) e β-glucano

de cevada na atividade da endoglucanase GH12 recombinante de B. licheniformis CBMAI
1609
Na Tabela 23 são apresentados os valores estimados para os parâmetros

cinéticos Km, Vmax, Kcat e Kcat/Km dessa endoglucanase GH12 nos substratos
xiloglucano e β-glucano. Como pode ser observado na Tabela 23, foram verificados
valores muito próximos para estes parâmetros cinéticos, indicando que a enzima
aparentemente possui a mesma eficiência catalítica para hidrolisar os dois
substratos e que esta não apresenta dificuldades em interagir com o xiloglucano
devido a suas ramificações.
Comparativamente, Damásio et al. (2014) relataram que a xiloglucanase
específica da família GH12 de A. clavatus apresentava no substrato xiloglucano de
tamarindo, em pH 5,5 e a 50 ºC, um Km de 2,38 mg/mL, Kcat de 36,3 s-1 e Kcat/Km de
15,3 s-1 mg-1 mL. A eficiência desta xiloglucanase foi semelhante à verificada para a
enzima de B. licheniformis CBMAI 1609. Os autores deste trabalho também
avaliaram os parâmetros cinéticos da endoglucanase de A. terreus nos substratos
xiloglucano de tamarindo e β-glucano e observaram que essa enzima apresentava
maior eficiência catalítica para a hidrólise do β-glucano. Foram obtidos os seguintes
valores para os parâmetros Km, Kcat e Kcat/Km para a endoglucanase de Aspergillus
terreus: 5,39 mg/mL, 77,1 s-1 e 14,3 s-1 mg-1 mL no substrato β-glucano e 4,74
mg/mL, 36,5 s-1 e 7,70 s-1 mg-1 mL no substrato xiloglucano.
Em outro estudo, Grishutin et al. (2004) também avaliaram os parâmetros
cinéticos das endoglucanases de Trichoderma reesei e Chrysosporium lucknowense
nos substratos xiloglucano de tamarindo e β-glucano, em pH 5,0 e a 50 ºC.
267
Diferentemente do constatado para a endoglucanase GH12 de B. licheniformis

CBMAI 1609, os autores desse trabalho relataram que as duas enzimas eram muito
mais eficientes na hidrólise do β-glucano. Foi observado que a endoglucanase de
Trichoderma reesei apresentava um Kcat/Km igual a 183 s-1 mg-1 mL no β-glucano e
1,25 s-1 mg-1 mL no xiloglucano, enquanto que a enzima de Chrysosporium
lucknowense teve no β-glucano um Kcat/Km de 319 s-1 mg-1 mL e no xiloglucano o
Kcat/Km foi igual a 1,66 s-1 mg-1 mL.
Verificou-se ainda que a enzima estudada no presente trabalho era mais
eficiente do que as duas xiloglucanases de Rhizomucor miehei caracterizadas por
Song et al. (2013) para a hidrólise do xiloglucano de tamarindo, estas enzimas
apresentaram um Km de 1,7 e 2,0 mg/mL e Kcat/Km de 2,48 e 0,46 s-1 mg-1 mL.
Tabela 23 – Parâmetros cinéticos estimados para a endoglucanase GH12 recombinante de

Km Vmax Kcat Kcat/Km
Substrato
(mg/mL) (U/mg) (s-1) (s-1 mg-1 mL)
Xiloglucano 2,89 ±0,24 94,78 ±4,15 39,19 ±3,65 13,56 ±1,69
β-glucano 2,34 ±0,19 60,73 ±2,34 28,88 ±2,53 12,31 ±1,47
Visando identificar o mecanismo de ação e os produtos formados durante

a hidrólise dos substratos xiloglucano de tamarindo e β-glucano de cevada pela
endoglucanase estudada, foram realizadas reações de hidrólise com estes dois
substratos nas condições ótimas de atuação enzimática. As amostras recolhidas em
diferentes tempos foram analisadas por eletroforese capilar e os resultados obtidos
estão apresentados nas Figuras 69 e 70.
Verificou-se que os produtos formados pela ação da endoglucanase de B.
licheniformis CBMAI 1609 sobre o xiloglucano de tamarindo foram o
heptassacarídeo XXXG, o octassacarídeo XXLG e o nonassacarídeo XLLG. Esses
produtos obtidos são os comumente observados durante a hidrólise deste substrato
por xiloglucanases. O xiloglucano de tamarindo é formado por blocos repetitivos
destes 3 oligossacarídeos, assim é possível dizer que essa endoglucanase estudada
atuou como uma endoenzima sobre as ligações glicosídicas β-1,4 da glicose não
ramificada da cadeia principal deste substrato e que as ramificações nos demais
resíduos de glicose aparentemente não impediram a ação enzimática, pois não
268
foram observadas alterações nos produtos formados após a incubação por períodos
de tempo mais longos (Figura 69). Resultados semelhantes aos observados neste
trabalho foram relatados para as xiloglucanases estudadas por Damásio et al.
(2012), Gloster et al. (2007), Grishutin et al. (2004), Master et al. (2008).
Figura 69 – Eletroforese capilar dos produtos de hidrólise do substrato xiloglucano de

tamarindo pela endoglucanase GH12 recombinante de B. licheniformis CBMAI 1609
(APTS: ácido 1,3,6-trissulfônico-8-aminopireno; XXXG: heptassacarídeo; XLXG: octassacarídeo;
XLLG: nonassacarídeo)
Quanto à hidrólise do substrato β-glucano de cevada foi verificado que a

enzima estudada atuava de forma semelhante a outras endoglucanases, como por
exemplo, a endoglucanase de A. terreus (Nazir et al., 2009; Damásio et al., 2014).
As endoglucanases hidrolisam as ligações glicosídicas do tipo β-1,4 entre os
resíduos de glicose formando oligossacarídeos variados que com o passar do tempo
da reação vão diminuindo de tamanho. Após 24 horas de reação com a
endoglucanase de B. licheniformis CBMAI 1609, os principais produtos formados na
hidrólise do β-glucano e detectados por eletroforese capilar foram celotriose (G3),
celotetraose (G4) e em menor proporção glicose (G1), celobiose (G2) e
celoheptaose (G7) (Figura 70).
269
Figura 70 - Eletroforese capilar dos produtos de hidrólise do substrato β-glucano de cevada

pela endoglucanase GH12 recombinante de B. licheniformis CBMAI 1609
(APTS: ácido 1,3,6-trissulfônico-8-aminopireno; G1: glicose; G2:celobiose; G3:celotriose; G4:
celotetraose; G5: celopentaose; G6: celohexaose; G7: celoheptaose; G8: celoctaose; G9:
celononaose; G10: celodecaose)
Na Figura 71 são ilustrados o perfil de estrutura secundária e a análise de

desnaturação térmica da endoglucanase GH12 de B. licheniformis CBMAI 1609
realizada através da técnica de dicroísmo circular. O espectro no UV-distante obtido
para essa enzima em pH 7,4 e a 20 ºC apresentou um pico positivo em 200 nm e
outro pico negativo em 215 nm (Figura 71a). Este perfil de espectro de CD é
tipicamente observado em proteínas que apresentam predominância de estruturas
secundárias do tipo folhas-β (Corrêa; Ramos 2009). A elevação observada no
espectro próximo a 230 nm pode estar associada à presença de resíduos de
aminoácidos aromáticos, especialmente triptofano, que estão estreitamente
próximos na estrutura terciária da proteína assim como foi relatado por Santos et al.
(2014). Este dado sobre o perfil de estrutura secundária da enzima está de acordo
com o alto conteúdo de folhas-β observado na estrutura da
endoglucanase/xiloglucanase cristalizada de B. licheniformis ATCC 14580. Além
disso, o espectro de CD obtido foi semelhante ao observado para outras
endoglucanases e xiloglucanases da família GH12, como previamente relatado por
Damásio et al. (2012) e Dias (2013).
270
A estabilidade térmica dessa endoglucanase GH12 de B. licheniformis

CBMAI 1609 no pH 7,4 foi avaliada pelo monitoramento da variação da elipticidade
molar a 215 nm durante a realização de gradiente de temperatura entre 20 e 100 ºC
(Figura 71b). Foi verificado que em temperaturas acima de 50 ºC a enzima começa
a perder a sua estrutura secundária em consequência da desnaturação térmica e
que a partir de 60 ºC a enzima encontra-se totalmente desenovelada. Foi ainda
determinado que a temperatura de transição (Tm) dessa enzima era de 55,9 ºC, o
que está de acordo com os dados experimentais de avaliação dos efeitos da
temperatura na atividade e estabilidade enzimática descritos previamente.
Figura 71 – Espectro de dicroísmo circular no UV-distante em pH 7,4 a 20 ºC (a) e curva de

desnaturação térmica (b) da endoglucanase GH12 recombinante de B. licheniformis CBMAI
1609
4.4.5. Expressão, purificação e caracterização da endoglucanase da

família GH5 codificada pelo gene BlCel de B. licheniformis CBMAI
1609
Conforme apresentado no item 4.4.2, foi realizada a amplificação e
clonagem do gene BlCel da linhagem B. licheniformis CBMAI 1609, predito como
codificante de uma endoglucanase da família GH5. De acordo com a classificação
do CAZy, a família 5 das hidrolases glicosídicas é composta por enzimas com uma
ampla faixa de atividades críticas para a desconstrução da biomassa lignocelulósica,
como endoglucanases, mananases, xilanases, galactanases, mananases, xilanases,
entre outras (Chen et al., 2012; Davies, 2015). Devido ao grande número de
substratos hidrolisados por esta família de hidrolases glicosídicas é sugerido que
271
algumas dessas enzimas possam exibir múltipla especificidade de atuação, como

por exemplo, serem capazes de hidrolisar glucanas e mananas (Chen et al., 2012).
Esta endoglucanase GH5 de B. licheniformis CBMAI 1609 também
apresentava na sua extremidade C-terminal um domínio de ligação a carboidratos
identificado como CBM X2. Esse tipo de CBM possui um formato de imunoglobulina
e é encontrado em algumas hidrolases glicosídicas e nas proteínas escafoldinas de
complexos multienzimáticos do tipo celulossomo (EMBL-EBI, 2014). Na literatura há
alguns relatos de endoglucanases com esta característica, como por exemplo, a
endoglucanase GH5 de Paenibacillus sp. KSM-N546 que também apresentava um
domínio de ligação a carboidratos CBM X2 e a endoglucanase GH5 de B. subtilis
que possuía um CBM da família 3 (Ogawa et al., 2009; Santos et al., 2012b)
A sequência de aminoácidos predita para a enzima codificada pelo gene
BlCel foi comparada com outras sequências depositadas no banco de dados do
NCBI através da ferramenta Blastp e apresentou alta identidade, entre 96 e 97 %,
com as sequências preditas para endoglucanases anotadas nos genomas das
linhagens B. licheniformis ATCC 14580, Bacillus sp. SB47 e B. licheniformis 9945A
(números de acesso no NCBI: AAU23417.1, WP026579727.1 e AGN36284.1,
respectivamente). Por lado, foi observada apenas 31 e 34 % de identidade com as
endoglucanases de B. haloduras (número de acesso no PDB: 4V2XA) e
Paenibacillus lautus PL236 (número de acesso no UniProt: P23550),
respectivamente.
Na Figura 72 é apresentada a comparação das sequências de
aminoácidos preditas para as enzimas codificadas pelo gene BlCel nas linhagens B.
licheniformis CBMAI 1609 e ATCC 14580. Verificou-se que estas duas sequências
diferiam em 24 aminoácidos, sendo estes localizados nas posições 16, 18, 22, 91,
97, 172, 193, 195, 198, 201, 285, 289, 319, 356, 357, 407, 408, 410, 411, 418, 424,
432, 485 e 509. Essas diferenças de aminoácidos observadas podem ser
importantes pelo fato de poderem ocasionar alterações nas propriedades
bioquímicas e eficiência catalítica das enzimas. Baseado nas informações
disponíveis para outras endoglucanases da família GH5 no site UniProt (disponível
em: http://www.uniprot.org/) e no alinhamento de algumas destas sequências (dados
não apresentados), foi constatado que os resíduos de ácido glutâmico que
possivelmente atuam como ácido/base e nucleófilo no sítio ativo estavam
conservados nas duas enzimas (aminoácidos localizados nas posições 167 e 276,
272
respectivamente). Resíduos de triptofano relatados por Alvarez et al. (2013b) e

Gloster et al. (2007) como responsáveis pela interação com o substrato em outras
hidrolases glicosídicas desta família também estavam conservados, entre estes
destacam-se os aminoácidos localizados nas posições 55 e 309.
Figura 72 - Alinhamento das sequências de aminoácidos preditas para a enzima codificada

pelo gene BlCel de B. licheniformis CBMAI 1609 e para a endoglucanase CelB de B.
licheniformis ATCC 14580.
* As setas indicam os aminoácidos envolvidos no mecanismo de hidrólise e resíduos de triptofano
conservados nas hidrolases glicosídicas da família GH5
A análise da sequência de aminoácidos da endoglucanase codificada pelo

gene BlCel de B. licheniformis CBMAI 1609 através da ferramenta ProtParam
indicou que a proteína madura expressa pelo vetor pET-28a(+) era composta por
564 aminoácidos e apresentava massa molecular e ponto isoelétrico teóricos
estimados em 63,8 KDa e 5,8, respectivamente. Comparativamente, Bischoff, Liu e
273
Hughes (2007) relataram uma endoglucanase da família GH5 com um CBM3 de B.

licheniformis B-41361 que apresentava massa molecular de 62 KDa. Em outro
estudo, Ogawa et al. (2009) relataram que uma endoglucanase GH5 de
Paenibacillus sp. KSM-N546 possuía massa molecular estimada em 61,3 KDa.
Na Figura 73 são apresentados os resultados dos testes de expressão da
endoglucanase codificada pelo gene BlCel de B. licheniformis CBMAI 1609 clonado
no vetor pET-28a(+) pelas linhagens de E. coli BL21(DE3), BL21(DE)pRare2,
Rosseta-gami 2(DE3) e Artic Express (DE3). Como pode ser observado nas
canaletas 2, 3 e 4 dos géis SDS-PAGE da Figura 73a, não foi constatada a presença
de bandas de proteínas com o tamanho esperado para esta enzima que indicassem
um alto nível de expressão proteica ao final dos períodos de indução utilizados.
Entretanto, testes de atividade enzimática, utilizando os sobrenadantes do processo
de lise das células induzidas e os substratos β-glucano de cevada e CMC, indicaram
que houve a expressão da enzima pelas linhagens de E. coli BL21(DE3),
BL21(DE3)pRare2 e Rosetta-gami 2(DE3) (Figura 73b). Uma maior atividade
enzimática foi observada no sobrenadante da linhagem E. coli BL21 (DE3)pRare2,
que também apresentou o maior crescimento ao final do período de indução (dados
não apresentados).
O baixo nível de expressão observado para esta enzima pode ter sido em
decorrência de características do gene clonado, como o teor de códons raros
existentes na sequência nucleotídica, instabilidades do RNA mensageiro, redução
da eficiência traducional e dificuldades no enovelamento da proteína.
Mesmo com o baixo nível de expressão obtido para esta enzima nas
condições utilizadas nos testes de expressão, foi realizada uma nova produção da
enzima em maior escala utilizando a linhagem E. coli BL21 (DE3)pRare2. Nesses
cultivos realizados em frascos Erlenmeyer de 2 L também não foi observada uma
superexpressão da enzima. Contudo, testes de atividade enzimática confirmaram
novamente a presença da endoglucanase no sobrenadante das células induzidas
que foram lisadas e a ausência no sobrenadante das células lisadas antes da
indução com IPTG (dados não apresentados).
274

endoglucanase GH5 codificada pelo gene BlCel de B. licheniformis CBMAI 1609 nas
linhagens E. coli BL21(DE3), BL21(DE3)pRare2, Rosetta-gami 2(DE3) e Artic Express (DE3)
(a) e testes de atividade enzimática com os substratos CMC e β-glucano e os
sobrenadantes do processo de lise celular (b)
(Figura 73a - M: marcador de massa molecular; 1: proteínas obtidas das células antes da
indução com IPTG; 2: proteínas obtidas das células ao final do período de indução com
IPTG - 4 horas para as linhagens E. coli BL21(DE3), BL21(DE3)pRare2 e Rosseta-gami
2(DE3) e 20 horas para a linhagem Artic Express (DE3); 3: proteínas insolúveis após o
processo de lise celular; 4: proteínas solúveis presentes no sobrenadante do processo de
lise celular; Figura 73b – A: Branco (controle negativo da reação enzimática); B e C:
duplicata das reações enzimáticas; 1, 2, 3 e 4: reações enzimáticas com os sobrenadantes
do processo de lise celular das linhagens E. coli BL21(DE3), BL21(DE3)pRare2, Rosetta-
gami 2(DE3) e Artic Express, respectivamente).
A endoglucanase GH5 recombinante expressa foi purificada até

homogeneidade eletroforética utilizando as colunas cromatográficas de afinidade
com íons níquel imobilizados e de exclusão molecular. Na Figura 74 está
apresentado o cromatograma da etapa de purificação proteica na coluna de
afinidade e o gel da eletroforese SDS-PAGE com os passos do processo de
275
purificação. Foi verificado que a enzima foi eluída praticamente pura da coluna de
afinidade em um único pico durante a realização do gradiente de imidazol no tampão
de corrida, com aproximadamente 150 mM de imidazol (canaleta 2 do gel). As
frações coletadas neste pico com atividade enzimática sobre os substratos β-
glucano e CMC foram utilizadas na etapa de purificação na coluna de exclusão
molecular, que permitiu a separação da proteína de interesse de alguns poucos
interferentes que havia na amostra e a obtenção desta com alto grau de pureza
(canaleta 3 do gel). Verificou-se também que a enzima recombinante purificada
apresentava massa molecular de aproximadamente 60 kDa, que é um valor próximo
do predito com o auxílio da ferramenta ProtParam.
Figura 74 – Cromatograma da purificação da endoglucanase codificada pelo gene BlCel de

B. licheniformis CBMAI 1609 em coluna de afinidade His-Trap Fast Flow com íons níquel
imobilizados (a) e gel de eletroforese SDS-PAGE com os passos da purificação da enzima
(b)
(M: marcador de massa molecular; 1: proteínas solúveis presentes no sobrenadante do processo de
lise celular; 2: amostra das frações reunidas da cromatografia de afinidade com atividade enzimática
sobre os substratos CMC e β-glucano; 3: amostra das frações reunidas da cromatografia de exclusão
molecular). A seta indica o pico de eluição de proteínas com atividade enzimática.
Na Figura 75 estão ilustrados os resultados observados para a análise de

especificidade enzimática dessa endoglucanase da família GH5 de B. licheniformis
CBMAI 1609 sobre diferentes polissacarídeos presentes na parede celular vegetal.
Ao contrário da endoglucanase GH12 estudada no item 4.4.4, a endoglucanase GH5
276
demonstrou uma leve preferência para atuação sobre o substrato xiloglucano

(atividade relativa de 100%) em relação ao β-glucano (atividade relativa de 84%). Foi
observado ainda que essa endoglucanase GH5 apresentava 41, 4 e 2 % de
atividade relativa sobre os substratos liquenano, CMC e xilana de madeira faia,
respectivamente.
Figura 75 - Painel de substratos para avaliação da especificidade da endoglucanase GH5

Comparativamente, nos estudos realizados por Gloster et al. (2007) e

Yaoi et al. (2005) foi verificado que as xiloglucanases da família GH5 de
Paenibacillus pabuli DSM 13330 e Paenibacillus sp. KM21 apresentavam atividade
apenas sobre o substrato xiloglucano de tamarindo e nenhuma atividade sobre
substratos celulósicos, como CMC, Avicel e β-glucano de cevada. Em outro estudo,
Liu et al. (2013b) relataram uma endoglucanase de Penicillium decumbens
pertencente a família GH5 e com domínios de ligação ao substrato CBM X2 e CBM1
que apresentava 100 % de atividade relativa no substrato glucomanana, 46 % em
xiloglucano de tamarindo, 43 % em CMC e 35 % em β-glucano de cevada.
Venditto et al. (2015) também relataram uma endoglucanase da família
GH5 proveniente de B. halodurans associada a um CBM da família 46 que era capaz
de hidrolisar os substratos β-glucano de cevada e xiloglucano de tamarindo.
Diferentemente do observado no presente estudo, Santos et al. (2012b) e Alvarez et
al. (2013a) relataram que endoglucanases da família GH5 provenientes de B. subtilis
168 e de metagenoma de solo de canavial eram capazes de hidrolisar os substratos
CMC, liquenano e β-glucano, mas não o xiloglucano.
277
A Figura 76 ilustra os resultados da análise da influência do pH e da

temperatura na atividade da endoglucanase GH5 estudada utilizando o substrato
xiloglucano de tamarindo. Verificou-se que essa enzima apresentava mais de 70 %
da sua atividade relativa na faixa de pH entre 5,5 e 9,0, sendo a máxima atividade
enzimática obtida em pH entre 6,5 e 7,5. A enzima foi completamente inibida em
valores de pH abaixo de 3,0 e ainda apresentou 53 % da sua atividade em pH 10,0
(Figura 76a). Com relação ao efeito da temperatura na atividade enzimática
constatou-se que essa enzima apresentava menos de 25 % da sua atividade relativa
em temperaturas abaixo de 45 ºC. A temperatura ótima de atividade dessa
xiloglucanase foi observada em temperaturas entre 65 e 70 ºC. Aumentos
posteriores na temperatura provocaram a inibição enzimática e a 85 ºC foi
observado apenas 20 % da atividade enzimática (Figura 76b). Esses resultados
diferiram um pouco em relação aos observados para a endoglucanase GH12.
Figura 76 - Efeito do pH (a) e da temperatura (b) na atividade enzimática da endoglucanase

GH5 recombinante de B. licheniformis CBMAI 1609 sobre o substrato xiloglucano de
tamarindo
Também foi realizado um estudo para se avaliar possíveis diferenças do

efeito do pH e da temperatura na atividade dessa endoglucanase quando se
utilizava outro substrato para determinação da atividade enzimática. Como pode ser
observado na Figura 77, foi detectado um perfil diferente de pH e temperatura ótima
de atividade enzimática quando se utilizou o β-glucano nas análises. Verificou-se
que a enzima apresentava atividade máxima de hidrólise do substrato β-glucano em
pH 4,5 e que esta exibia menos de 20 % de atividade relativa em pH superiores a
7,5, sendo praticamente inibida em pH 9,0 e 10,0 (Figura 77a). Quanto aos efeitos
278
da temperatura, constatou-se que a temperatura ótima de atividade da enzima no

substrato β-glucano era 50 ºC e que a 60 e 70 ºC a enzima exibia cerca de 30 e 5 %
de atividade relativa, respectivamente (Figura 77b).
Na literatura não foram encontrados trabalhos que tenham avaliado a
influência do pH e da temperatura na atividade enzimática de endoglucanases e
xiloglucanases em substratos diferentes como foi testado no presente estudo.
Supõe-se que as diferenças observadas no pH e temperatura ótima de atividade
dessa enzima nesses dois substratos possam ter sido em decorrência de mudanças
nas interações dos aminoácidos de subsítios de ligação ao substrato e também de
alterações conformacionais na estrutura da enzima. Estas suposições poderão ser
esclarecidas através da realização de estudos posteriores de caracterização
biofísica e estrutural dessa enzima.
Figura 77 - Efeito do pH (a) e da temperatura (b) na atividade enzimática da endoglucanase

GH5 recombinante de B. licheniformis CBMAI 1609 sobre o substrato β-glucano de cevada
Comparativamente, os resultados observados no presente estudo para

os efeitos do pH e da temperatura na atividade da endoglucanase GH5 foram
similares aos relatados para várias outras endoglucanases e xiloglucanases
microbianas da família GH5, com exceção da alta temperatura ótima de atividade da
enzima quando se utilizou o substrato xiloglucano. Venditto et al. (2015) relataram
que a endoglucanase de B. halodurans apresentava atividade ótima para a hidrólise
do substrato β-glucano em pH entre 7,0 e 7,5 e a 55 ºC. Em outro estudo, Yaoi et al.
(2005) descreveram que a atividade da xiloglucanase GH5 de Paenibacillus sp.
KM21 sobre o substrato xiloglucano de tamarindo era máxima na faixa de pH 5,5 a
279
6,5 e em temperaturas entre 50 e 55 ºC. Wong et al. (2010) relataram que uma
xiloglucanase GH5, obtida de uma biblioteca genômica construída a partir de
bactérias de rúmen bovino, apresentava atividade relativa aproximada de 70% para
a hidrólise do xiloglucano na faixa de pH entre 5,0 e 8,0 e em temperaturas entre 20
e 60 ºC, sendo a atividade ótima verificada entre 40 e 50°C e em pH 7,0.
A estabilidade da endoglucanase GH5 de B. licheniformis CBMAI 1609
em diferentes valores de pH e temperatura também foi avaliada e os resultados
obtidos estão representados na Figura 78. A atividade enzimática residual neste
caso foi determinada utilizando o substrato xiloglucano de tamarindo nas condições
ótimas de atuação da enzima sobre esse substrato. Quanto ao pH de estabilidade,
foi verificado que essa endoglucanase GH5 era estável em uma ampla faixa de pH,
de 4,0 a 10,0. Neste intervalo de pH foi observada a manutenção de mais de 75 %
da atividade enzimática inicial após 24 horas de incubação a 4 ºC. Constatou-se
também que a enzima foi instável após incubação em pH ácido (pH 2,0 e 3,0). Com
relação ao efeito da temperatura na estabilidade, foi observado que essa
endoglucanase reteve 100 % da sua atividade enzimática inicial após 1 hora de
incubação em pH 6,5 nas temperaturas entre 25 e 55 ºC. A enzima manteve 72 %
de atividade residual após tratamento térmico por 1 hora a 60 ºC e foi
completamente inibida quando incubada em temperaturas acima de 65 ºC.
Em comparação com os resultados obtidos para a endoglucanase GH12
(item 4.4.4), a endoglucanase GH5 mostrou-se mais estável quanto aos efeitos do
pH e da temperatura. Com relação a literatura, não foram observadas grandes
diferenças na estabilidade da enzima estudada em relação a outras endoglucanases
e xiloglucanases da família GH5. Venditto et al. (2015), por exemplo, verificaram que
a endoglucanase de B. halodurans foi estável após 30 minutos de incubação em
temperaturas abaixo de 50ºC e que a enzima era também inibida acima de 60 ºC.
Por outro lado, a xiloglucanase caracterizada por Wong et al. (2010) reteve mais de
90 % da sua atividade inicial após 16 horas de incubação a 25 ºC em valores de pH
entre 5,0 e 9,0 e após 10 minutos de incubação em temperaturas abaixo de 50 ºC.
Em outro estudo, Bischoff, Liu e Hughes (2007) relataram que uma
endoglucanase GH5 de B. licheniformis B-41361 reteve mais de 80 % da sua
atividade enzimática inicial após 1 hora de incubação a 55 ºC em valores de pH
entre 4,5 e 8,0. Esta enzima mostrou-se estável em temperaturas de até 55ºC após
1 hora de tratamento térmico e reteve somente 10 e 5 % da atividade inicial quando
280
incubada a 65 e 75 ºC, respectivamente. Yaoi et al. (2005) verificaram que a

xiloglucanase GH5 de Paenibacillus sp. KM2 mostrou-se estável na faixa de pH
entre 5,5 e 6,5, após 30 minutos de incubação a 45 ºC, e manteve mais de 90 % da
atividade após 10 minutos de incubação a 55 ºC. Em outro estudo, Liu et al. (2013b)
relataram que uma endoglucanase de Penicillium decumbens manteve 69 % da sua
atividade inicial após 5 horas de incubação a 50 ºC e cerca de 2 % de atividade
residual após 30 minutos de incubação a 60 ºC.

endoglucanase GH5 recombinante de B. licheniformis CBMAI 1609 utilizando o substrato
xiloglucano de tamarindo
A influência de íons metálicos e dos compostos quelantes EDTA e EGTA

na atividade da endoglucanase GH5 recombinante de B. licheniformis CBMAI 1609
sobre o polissacarídeo xiloglucano também foi avaliada e os resultados obtidos
estão apresentados na Tabela 24.
Diferentemente do observado para a endoglucanase GH12, foi verificada
uma tendência de inibição da endoglucanase GH5 na presença dos compostos
EDTA e EGTA, indicando uma possível dependência de algum íon metálico
divalente para a sua catálise. No entanto, nenhum dos íons testados apresentou um
efeito ativador sobre a enzima. Uma tendência de redução da atividade enzimática
também foi verificada na presença de alguns íons, como Na+, Ca2+, Ni2+, Mg2+ e
Mn2+. Por outro lado, houve uma forte inibição enzimática na presença dos íons
Fe3+, Cu2+ e Zn2+, sendo observada atividades enzimáticas residuais iguais a 0,4, 2,0
e 27,0 %, respectivamente, na presença destes 3 íons na concentração final de 5
mM.
281
Tabela 24 - Efeito de íons metálicos e de compostos quelantes na atividade da

endoglucanase GH5 recombinante de B. licheniformis CBMAI 1609 sobre o substrato
xiloglucano de tamarindo
(5 mM) Desvio
Média
padrão
EDTA 73,17 2,96
EGTA 62,65 3,97
KCl 87,42 3,79
LiCl 97,30 2,81
NaCl 79,79 1,72
CaCl2 78,85 4,82
CoCl2 87,40 5,11
NiCl2 79,36 1,66
MgCl2 72,51 1,95
MnCl2 51,50 5,84
FeCl3 0,44 0,51
CuSO4 2,07 0,81
ZnSO4 27,08 5,44
Na caracterização da endoglucanase GH5 de B. licheniformis B-41361,

Bischoff, Liu e Hughes (2007) verificaram aumentos de 27 e 20 % na atividade
enzimática quando na presença de EDTA e do íon divalente Mn2+ nas concentrações
finais de 10 e 5 mM, respectivamente. Foi constatado ainda por esses autores que
essa enzima era inibida na presença de 5 mM dos íons Ca2+, Cu2+ e Zn2+. Em outro
estudo, Ng et al. (2009) relataram que a endoglucanase GH5 de Geobacillus sp.
70PC53 também era fortemente inibida por íons Cu2+ e Zn2+ na concentração de
5 mM. Os autores desse trabalho verificaram que a atividade enzimática não sofreu
influência na presença de EDTA e dos íons Na+ e Mg2+, mas esta foi estimulada pela
adição dos íons Mn2+, Co2+ e Ca2+. No estudo realizado por Varrot, Schülein e
Davies (2000) foi verificado que uma endoglucanase GH5 de B. agaradhaerens
exibia dependência de íons Ca2+ para a estabilização da sua estrutura proteica.
Alguns parâmetros cinéticos dessa endoglucanase também foram
determinados a partir dos resultados obtidos em ensaios utilizando concentrações
282
variadas dos substratos β-glucano de cevada e xiloglucano de tamarindo e as

condições ótimas de atividade enzimática em cada substrato (pH 4,5, 50 ºC e
enzima na concentração de 0,011 mg/mL nas reações com o substrato β-glucano e
pH 6,5, 65 ºC e enzima na concentração de 0,008 mg/mL nas reações com o
substrato xiloglucano). Na Figura 79 e Tabela 25 são apresentados os resultados do
efeito da concentração dos substratos β-glucano e xiloglucano sobre a atividade da
endoglucanase GH5 de B. licheniformis CBMAI 1609 e os valores estimados para os
parâmetros cinéticos Km, Vmax, Kcat e Kcat/Km.
Verificou-se que esta enzima seguia um modelo de cinética do tipo
Michaelis-Menten, sendo verificado um coeficiente de correlação de
aproximadamente 0,94 (Figura 79). Foi também observado que a atividade
enzimática era inibida com o aumento da concentração do substrato acima de 4
mg/mL. Como pode ser observado na Tabela 25, a endoglucanase GH5 apresentou
uma afinidade similar para os dois substratos (Km igual a 1,2 mg/mL), no entanto os
parâmetros Vmax, Kcat e Kcat/Km indicam que a enzima tem uma eficiência de cerca de
2 vezes maior para a hidrólise do xiloglucano em relação ao β-glucano. Esses
resultados foram diferentes do observado para a endoglucanase GH12 descrita no
item 4.4.4 e indicam que a endoglucanase GH5 é mais eficiente na degradação dos
substratos β-glucano e xiloglucano, pois o seu Kcat/Km para esses dois substratos foi,
respectivamente, 6,2 e 11,9 vezes maior do que o observado anteriormente.
A endoglucanase GH5 estudada no presente trabalho também foi mais
eficiente do que a xiloglucanase GH5 de Paenibacillus sp. KM2, que apresentou um
Km de 2 mg/mL para o xiloglucano, Kcat de 1,27 s-1 e Kcat/Km de 6,35 s-1 mg-1 mL
(Yaoi et al., 2005). A xiloglucanase GH5 relatada por Wong et al. (2010) também
mostrou-se menos eficiente do que a endoglucanase GH5 de B. licheniformis CBMAI
1609. Segundo os autores desse trabalho o Km, Kcat e Kcat/Km dessa enzima, a 37 ºC
e pH 7,0 usando o substrato xiloglucano de tamarindo, foi 3,61 mg/mL, 1,23 s-1 e
0,34 s-1 mg-1 mL, respectivamente.
No estudo realizado por Venditto et al. (2015), foi constatado que a
endoglucanase de B. halodurans também apresentava valores de Km similares para
os substratos β-glucano e xiloglucano (aproximadamente 0,25 μM). No entanto,
diferentemente do observado no presente estudo essa enzima foi 5 vezes mais ativa
sobre o β-glucano do que sobre o xiloglucano. Segundo esses autores, uma das
possíveis razões para a preferência por este substrato poderia ser o domínio de
283
ligação a carboidratos, uma vez que a retirada deste diminuiu em 60 vezes a

degradação do β-glucano e não afetou a degradação do xiloglucano.
Figura 79 – Efeito da concentração dos substratos xiloglucano de tamarindo (a) e β-glucano

de cevada na atividade da endoglucanase GH5 recombinante de B. licheniformis CBMAI
1609
Tabela 25 – Parâmetros cinéticos estimados para a endoglucanase GH5 recombinante de

Km Vmax Kcat Kcat/Km
Substrato
(mg/mL) (U/mg) (s-1) (s-1 mg-1 mL)
Xiloglucano 1,20 ±0,18 188,0 ±13,50 193,9 ±32,38 161,05 ±36,23
β-glucano 1,29 ±0,40 92,22 ±3,50 98,25 ±9,24 75,81 ±9,63
Os produtos formados durante as reações de hidrólise dos substratos

xiloglucano de tamarindo e β-glucano de cevada pela endoglucanase GH5 estudada
também foram submetidos à análise por eletroforese capilar (Figuras 80 e 81). Assim
como foi observado para a endoglucanase GH12 no item 4.4.4, os produtos
visualizados na hidrólise do xiloglucano foram os comumente relatados na literatura
para as xiloglucanases, o heptassacarídeo XXXG, o octassacarídeo XXLG e o
nonassacarídeo XLLG (Gloster et al., 2007). Este resultado também indica que essa
enzima também atua como uma endoenzima sobre as ligações glicosídicas β-1,4 da
glicose não ramificada da cadeia principal do xiloglucano.
284
Figura 80 - Eletroforese capilar dos produtos de hidrólise do substrato xiloglucano de

tamarindo pela endoglucanase GH5 recombinante de B. licheniformis CBMAI 1609
(APTS: ácido 1,3,6-trissulfônico-8-aminopireno; XXXG: heptassacarídeo; XLXG: octassacarídeo;
XLLG: nonassacarídeo)
Na hidrólise do substrato β-glucano também foi observado um resultado

semelhante ao obtido anteriormente no item 5.4.4 e dentro do esperado para outras
endoglucanases GH5 (Bischoff; Liu; Hughes, 2007). A enzima também atuou como
uma endoenzima sobre as ligações glicosídicas β-1,4 desse substrato liberando
oligossacarídeos de tamanho variados, que com passar do tempo de reação foram
sendo hidrolisados e originaram como produtos finais da hidrólise, principalmente,
celotriose e celotetraose (Figura 81).
285
Figura 81 - Eletroforese capilar dos produtos de hidrólise do substrato β-glucano de cevada

pela endoglucanase GH5 recombinante de B. licheniformis CBMAI 1609
(APTS: ácido 1,3,6-trissulfônico-8-aminopireno; G1: glicose; G2:celobiose; G3:celotriose; G4:
celotetraose; G5: celopentaose; G6: celohexaose; G7: celoheptaose; G8: celoctaose; G9:
celononaose; G10: celodecaose)
A Figura 82 ilustra o espectro da estrutura secundária da endoglucanase

GH5 de B. licheniformis CBMAI 1609 obtido pela técnica de dicroísmo circular e a
análise de desnaturação térmica realizada através da técnica de calorimetria
diferencial de varredura (DSC). Verificou-se que o espectro no UV-distante obtido
para a enzima purificada em pH 7,4 e a 20 ºC apresentou um pico positivo com
maior valor de elipticidade molar em 190 nm e outro pico negativo com menor valor
em aproximadamente 218 nm (Figura 82a). Este perfil de espectro de CD foi
semelhante ao observado em proteínas que possuem uma predominância de
estruturas secundárias do tipo α-hélice (Corrêa; Ramos 2009). Este dado está de
acordo com o predito Protein Data Bank para a xiloglucanase GH5 de Paenibacillus
pabuli. Esta enzima apresentava em sua estrutura secundária cerca de 35 % de α-
hélice e 12 % de folhas-β (Disponível em: http://www.rcsb.org/pdb/explore/
remediatedSequence.do?structureId=2JEP). O resultado obtido também está em
conformidade com o predito para a endoglucanase da família GH5 de B. subtilis 168,
que possui em sua estrutura secundária um predomínio de α-hélice (37 %) em
relação ao conteúdo de folhas-β (17 %) (Disponível em: http://www.rcsb.org/pdb/
explore/remediatedSequence.do?structureId=3PZU).
286
O efeito da desnaturação térmica na estrutura secundária dessa enzima

foi avaliado por CD através do acompanhamento da variação da elipticidade molar a
218 nm durante o aquecimento da amostra entre 20 e 90 ºC. No entanto, a
qualidade dos resultados obtidos por esta técnica não foram bons e não foram
conclusivos. Por esta razão, a estabilidade térmica da endoglucanase GH5 de B.
licheniformis CBMAI 1609 em pH 7,4 foi investigada através do monitoramento da
variação do fluxo de calor por DSC. Como pode ser visualizado na Figura 82b, a
enzima apresentou uma desnaturação térmica que envolvia apenas um estado de
transição, sendo verificada uma temperatura de desnaturação térmica (Tm) de
aproximadamente 70 ºC. Este valor está de acordo com os dados experimentais
obtidos anteriormente na determinação de temperatura ótima da enzima no
substrato xiloglucano, que indicavam a perda da atividade enzimática em
temperaturas acima de 70 ºC (Figura 76b). A Tm verificada para esta enzima foi
superior ao observado para a endoglucanase GH12, que era de 55 ºC.
Figura 82 - Espectro de dicroísmo circular no UV-distante em pH 7,4 a 20 ºC (a) e curva de

desnaturação térmica obtida por DSC (b) para a endoglucanase GH5 recombinante de B.
4.4.6. Expressão, purificação e caracterização da lacase CotA codificada

pelo gene BlLac de B. licheniformis CBMAI 1609
As lacases (benzenediol:oxigênio oxidorredutase; EC 1.10.3.2) são
enzimas que pertencem a família das multicobre oxidases e que catalisam a
oxidação de uma ampla faixa de substratos aromáticos, incluindo fenóis, arilaminas,
anilinas e tióis, com a concomitante redução do oxigênio molecular à água
287
(Koschorreck; Schmid; Urlacher, 2008; Wang et al., 2015). O centro ativo das
lacases, geralmente, contém 4 íons de cobre, os quais com base na sua
coordenação e propriedades espectroscópicas são classificados em 3 tipos (T1, T2 e
T3). O cobre tipo 1 (T1) é um centro mononuclear onde ocorre a ligação e oxidação
do substrato. Este cobre confere à enzima a coloração azul, típica de proteínas
multicobre, que é resultante da intensa absorção eletrônica próxima a 610 nm
causada pela ligação covalente entre este íon de cobre e um resíduo de cisteína. O
cobre tipo 2 (T2) também é um centro mononuclear, porém não é detectável
espectrofotometricamente na região visível. O cobre tipo 3 (T3) é um centro
binuclear, onde dois íons de cobre estão ligados por uma ligação hidroxila, e que
apresenta fraca absorção próximo a 330 nm. Os íons de cobre T2 e T3 formam um
centro trinuclear, coordenados por resíduos de histidinas, onde o oxigênio se liga e é
reduzido à água (Claus, 2004; Furtado, 2009).
Esta enzima está amplamente distribuída entre plantas, insetos, fungos e
bactérias. Contudo, as lacases de origem bacteriana são ainda pouco estudadas e
usadas em processos industriais, pois o seu rendimento de produção e potencial
redox são menores do que os das lacases fúngicas (Lu et al., 2012). Contudo, as
lacases bacterianas possuem propriedades interessantes para aplicação industrial,
como alta termotolerância, manutenção de altos níveis de atividade em condições
neutras à alcalinas, independência de cofatores enzimáticos, são produzidas em
meios baratos e em menor tempo de cultivo e também podem ser facilmente
expressas de forma heteróloga e modificadas geneticamente (Loncar et al., 2013; Lu
et al., 2012; Reiss; Ihssen; Thony-Meyer, 2011).
A mais conhecida e estudada lacase bacteriana até hoje é a CotA de B.
subtilis, essa enzima é um componente da capa do endósporo bacteriano que
possui similaridades com outras multicobre oxidases e está associada com a
biossíntese de melanina e com a resistência do esporo à luz ultravioleta e ao
peróxido de hidrogênio (Guan et al., 2014b). No presente trabalho o gene de uma
lacase CotA em B. licheniformis CBMAI 1609 foi amplificado e clonado no vetor pET-
28a(+) para a realização de estudos de expressão heteróloga, purificação e
caracterização desta enzima.
A sequência de nucleotídeos do gene da lacase clonada de B.
licheniformis CBMAI 1609 apresentou 93 % de identidade com a sequência de
nucleotídeos depositada para a CotA de B. licheniformis ATCC 14580. A
288
comparação da sequência de aminoácidos predita para a lacase clonada com outras

presentes no banco de dados do NCBI, através da ferramenta Blastp, revelou que
esta exibia 99 % de identidade com as cobre oxidases de Bacillus sp. MSP5.4 e B.
licheniformis (números de acesso no NCBI: WP023855578.1 e WP 035337064.1,
respectivamente) e 66 % de identidade com a CotA de B. subtilis subsp. subtilis 168
(número de acesso no NCBI: P07788.4).
Na Figura 83 é apresentado o alinhamento das sequências de
aminoácidos preditas para as lacases das linhagens de B. licheniformis CBMAI 1609
e ATCC 14580 através da ferramenta ClustalW. Verificou-se que os 12 aminoácidos
que fazem parte do sítio catalítico da enzima clonada estavam conservados em
relação à estrutura primária da lacase de B. licheniformis ATCC 14580, assim como
foi proposto por Gunne et al. (2013). Estes aminoácidos são aqueles envolvidos na
ligação ao cobre T1 (metionina 501, cisteína 491, histidina 418 e histidina 496) e os
8 resíduos de histidina que compõem o centro trinuclear de cobre T2/T3 (os resíduos
de histidina localizados nas posições 103 e 421 fazem parte do sítio do cobre T2 e
aqueles localizados nas posições 105, 151, 153, 423, 490 e 492 estão ligados ao
sítio de cobre T3). Foi ainda observado que a sequência predita da lacase de B.
licheniformis CBMAI 1609 apresentou 24 aminoácidos diferentes em comparação
com a outra enzima.
Uma destas mutações, a mutação do aminoácido lisina (K) na posição
316 por asparagina (N), pode ter uma influência positiva na atividade catalítica da
lacase clonada, assim como foi observado por Koschorreck, Schmid e Urlacher
(2009). Estes autores testaram os efeitos de mutações randômicas e sítio dirigidas
na lacase CotA de B. licheniformis DSM 13 e observaram que essa alteração de
aminoácidos na posição 316 proporcionava um ligeiro aumento na velocidade de
conversão de ácido ferúlico e na eficiência da enzima na descoloração de corantes
em comparação com a enzima não mutada. Os autores deste trabalho também
verificaram que a substituição do aminoácido ácido aspártico por glicina na posição
500 proporcionou um aumento na expressão da enzima recombinante.
289
Figura 83 - Alinhamento das sequências de aminoácidos preditas para as lacases de B.

licheniformis CBMAI 1609 e B. licheniformis ATCC 14580 através da ferramenta ClustalW
* As setas indicam os aminoácidos ligados aos íons cobre do sítio catalítico da enzima, enquanto o
triângulo indica uma mutação na posição 316.
A análise da sequência de aminoácidos da lacase recombinante de B.

licheniformis CBMAI 1609, pela ferramenta ProtParam, revelou que essa possuía
536 aminoácidos e exibia massa molecular e ponto isoelétrico teóricos estimados em
61,6 KDa e 6,4, respectivamente. A massa molecular estimada para a lacase
clonada está de acordo com a literatura, que descreve lacases do gênero Bacillus e
também algumas lacases fúngicas com massa molecular entre 55 e 68 KDa (Furtado
et al., 2013; Koschorreck; Schmid; Urlacher, 2008; Wang et al., 2015; Zhang et al.,
2013).
A expressão heteróloga da lacase CotA estudada foi realizada utilizando-
se as linhagens E. coli BL21(DE3), BL21(DE3)pRare2 e Rosetta-gami 2(DE3) em
condições microaeróbias, com adição de CuCl2 e em baixa temperatura (18 ºC).
Este procedimento de expressão deve-se ao fato de que a presença de íons cobre é
importante para o correto enovelamento das lacases, especialmente do sítio
trinuclear de cobre, e também pelo fato de que nestas condições de baixa
290
concentração de oxigênio e baixa temperatura há uma melhora na incorporação dos

íons cobre pela enzima e na expressão proteica (Durao et al., 2008; Mohammadian
et al., 2010).
Na Figura 84a são apresentados os géis da eletroforese SDS-PAGE para
avaliação da expressão heteróloga da lacase de B. licheniformis CBMAI 1609 pelas
3 linhagens de E. coli utilizadas. A lacase recombinante foi expressa na fração
citoplasmática das 3 linhagens de E.coli sob as condições de cultivo utilizadas. A
massa molecular da proteína expressa foi estimada em aproximadamente 67 KDa,
através da relação gráfica Rf (fator de retenção) x log da massa molecular dos
padrões de proteínas utilizados na eletroforese. Este valor de massa molecular foi
próximo do valor predito teoricamente pela ferramenta ProtParam.
Um alto nível de expressão da lacase recombinante foi constatado com a
utilização da linhagem E. coli BL21(DE3)pRare2 (canaleta 2), no entanto a maior
parte da enzima expressa por esta linhagem ficou aderida ao precipitado de células
lisadas na forma insolúvel (canaleta 3). Não foram verificadas diferenças na
quantidade de enzima presente na forma solúvel nos sobrenadantes do processo de
lise celular das três linhagens usadas (canaletas 4 dos géis). Foi ainda observado
nos testes de expressão, através da leitura da densidade óptica a 600 nm, que a
linhagem E. coli BL21(DE3) apresentou o maior crescimento ao final do período de
indução (dados não apresentados).
Com o objetivo de verificar se as enzimas expressas estavam ativas,
foram realizados testes de atividade enzimática utilizando as amostras dos
sobrenadantes do processo de lise celular das 3 linhagens. Nestes testes o teor
proteico das amostras foi padronizado para evitar possíveis diferenças. Foi
observado que a lacase expressa pela linhagem de E. coli Rosetta-gami 2(DE3) não
estava ativa e que a enzima expressa pela linhagem BL21(DE3) apresentava maior
atividade enzimática do que a enzima obtida pela linhagem BL21(DE3)pRare2
(Figura 84b).
291
(a)
(b)
Figura 84 – Géis de eletroforese SDS-PAGE para avaliação da expressão da lacase
codificada pelo gene BlLac de B. licheniformis CBMAI1609 nas linhagens E. coli BL21(DE3),
BL21(DE3)pRare2 e Rosetta-gami 2(DE3) (a) e testes de atividade enzimática de lacase
com os sobrenadantes do processo de lise celular (b)
(Figura 84a - M: marcador de massa molecular; 1: proteínas obtidas das células antes da indução
com IPTG; 2: proteínas obtidas das células ao final do período de 20 horas de indução com IPTG 3:
proteínas insolúveis após o processo de lise celular; 4: proteínas solúveis presentes no sobrenadante
do processo de lise celular; Figura 84b - 5, 6 e 7: reações enzimáticas com os sobrenadantes do
processo de lise celular das linhagens E. coli BL21(DE3), BL21(DE3)pRare2, Rosetta-gami 2(DE3),
respectivamente; 8: Branco (controle negativo da reação enzimática)). As setas indicam as bandas
correspondentes a lacase expressa.
A partir dos resultados observados nos testes de expressão e de

atividade enzimática, foi selecionada a linhagem E. coli BL21(DE3) para a realização
da expressão desta lacase em maior escala. Vários trabalhos na literatura também
relatam a utilização desta linhagem de E. coli na expressão de lacases
recombinantes do gênero Bacillus (Koschorreck; Schmid; Urlacher, 2008; Loncar et
al., 2013; Mohammadian et al., 2010).
Na Figura 85 é apresentado o cromatograma da purificação da lacase
recombinante de B. licheniformis CBMAI 1609 em coluna de afinidade com íons
níquel imobilizados e o gel da eletroforese SDS-PAGE com os passos da expressão
em maior escala e da purificação da enzima. A lacase recombinante foi novamente
produzida em quantidade satisfatória ao final de 20 horas de indução pela linhagem
292
E. coli BL21(DE3) (canaleta 2 do gel). Essa enzima apresentou alta afinidade pela
resina e foi eluída da coluna cromatográfica durante a realização do gradiente de
imidazol (com aproximadamente 250 mM de imidazol) em um único pico e com alto
teor de pureza (canaleta 4 do gel). As frações coletadas neste pico com atividade
de lacase foram reunidas, dialisadas e utilizadas nos ensaios de caracterização
enzimática.
Figura 85 – Cromatograma da purificação da lacase CotA recombinante de B. licheniformis

CBMAI 1609 em coluna de afinidade His-Trap Fast Flow com íons níquel imobilizados (a) e
gel de eletroforese SDS-PAGE com os passos de expressão e purificação da lacase (b)
(M: marcador de massa molecular; 1: proteínas das células antes da indução com IPTG; 2: proteínas
das células ao final de 20 horas de indução com IPTG; 3: proteínas solúveis presentes no
sobrenadante do processo de lise celular; 4: amostra das frações reunidas da cromatografia de
afinidade com atividade de lacase). A seta indica o pico de eluição de proteínas que apresentou
atividade de lacase.
A lacase purificada foi inicialmente caracterizada quanto aos efeitos do pH

e da temperatura na atividade enzimática utilizando o substrato ABTS. Como pode
ser visualizado na Figura 86a, a enzima foi ativa na faixa de pH entre 3,0 e 6,5 e
apresentou máxima atividade de oxidação do ABTS em pH 4,0. Foi também
observado cerca de 30 % da atividade enzimática nos valores de pH 3,0 e 5,0.
Quanto aos efeitos da temperatura, foi verificado que a enzima apresentava mais de
80 % de atividade relativa quando incubada na faixa de temperatura entre 40 e
75 ºC, sendo a temperatura ótima observada entre 55 e 60 ºC. Essa lacase também
293
apresentou cerca de 40 e 35 % de atividade relativa quando incubada a 20 e 90 ºC,

respectivamente (Figura 86b).
Na literatura, é relatado que o pH ótimo de atuação das lacases apresenta
variações de acordo com o substrato utilizado. É comum observar, por exemplo, um
valor de pH ótimo mais ácido quando se utiliza o substrato ABTS e valores de pH
ótimo próximo a neutralidade à alcalino quando se utiliza os substratos
siringaldazina, 2,6-dimetoxifenol ou guaiacol. Os resultados obtidos para os efeitos
do pH e da temperatura na atividade enzimática de oxidação do substrato ABTS
pela lacase de B. licheniformis CBMAI 1609 foram semelhantes aos descritos na
literatura. Esta descreve que a maioria das lacases fúngicas e outras lacases CotA
normalmente apresentam atividade máxima de oxidação do ABTS em valores de pH
entre 3,0 e 5,5 e em temperaturas próximas a 50 ºC, sendo observado para algumas
lacases do gênero Bacillus temperaturas ótimas mais elevadas, que podem chegar a
85 ºC (Koschorreck; Schmid; Urlacher, 2008; Loncar et al., 2013; Ribeiro et al., 2011;
Sondhi et al., 2014; Thakur et al., 2012).
Comparativamente, Lu et al. (2012) relataram que a lacase de B.
licheniformis LS04 apresentava atividade máxima para oxidação do substrato ABTS
em pH 4,2 e a 60 ºC e atividades enzimáticas acima de 80 % na faixa de
temperatura entre 40 e 70 ºC. Por outro lado, Furtado et al. (2013) verificaram que a
lacase recombinante de B. subtilis subsp. subtilis 168 apresentava atividade ótima
sobre o ABTS em pH 4,5 e a 80 ºC.
Figura 86 – Efeito do pH (a) e da temperatura (b) na atividade enzimática da lacase

294
Na Figura 87 são apresentados os resultados da análise dos efeitos do

pH e da temperatura na estabilidade da lacase de B. licheniformis CBMAI 1609. Os
resultados obtidos para o pH de estabilidade indicam que essa lacase manteve mais
de 65 % da atividade enzimática inicial após 24 horas de incubação a 4 ºC na faixa
de pH entre 5,0 e 10,0, sendo observada a manutenção aproximadamente 90 % de
atividade residual em pH 5,5. Foi também constatado que a enzima apresentava
menos de 20 % de atividade residual após a incubação por 24 horas em pH abaixo
de 4,0 (Figura 87a). Com relação à temperatura de estabilidade, a lacase estudada
não mostrou-se estável termicamente nas condições avaliadas, pois houve uma forte
perda da atividade enzimática após 1 hora de incubação no tampão citrato-fosfato
pH 4,0 em temperaturas superiores a 20 ºC. Essa enzima exibiu aproximadamente
35 % da sua atividade inicial após a incubação em temperaturas entre 40 e 70 ºC e
somente 10 % de atividade residual após o tratamento térmico a 80 ºC em citrato-
fosfato pH 4,0 (Figura 87b).
Figura 87 - Efeito do pH (a) e da temperatura (b) na estabilidade enzimática da lacase

Os resultados observados para o efeito do pH na estabilidade da lacase

de B. licheniformis CBMAI 1609 estão de acordo com o que é relatado para várias
lacases bacterianas, ou seja, serem estáveis em condições neutras à levemente
alcalinas (Wang et al., 2015; Zhang et al., 2013). Comparativamente, Lu et al. (2012)
relataram que a lacase de B. licheniformis LS04 era instável após incubação a 30 ºC
por 24 horas em pH 3,0, retendo apenas 19,5 % da sua atividade inicial nesta
condição. Os autores desse trabalho também observaram que essa enzima
295
mantinha 123 e 102 % da sua atividade enzimática inicial quando incubada a 30 ºC

por 10 dias em pH 7,0 e 9,0, respectivamente. Em outro estudo, Guan et al. (2014a)
verificaram que a lacase de B. pumilus W3 mantinha 20 % da sua atividade inicial
após a incubação por 24 horas a 50 ºC em pH 3,0 e que a enzima era altamente
estável nos valores de pH 7,0 e 9,0 após 10 dias de incubação a 50 ºC.
Por outro lado, os resultados obtidos nos ensaios de estabilidade térmica
da lacase estudada foram diferentes dos relatados para a maioria das lacases CotA
do gênero Bacillus, que são conhecidas por apresentarem alta estabilidade térmica
em comparação as lacases fúngicas. Loncar et al. (2013) ao avaliarem a
estabilidade térmica das lacases de B. amyloliquefaciens 12B e do fungo Trametes
versicolor ATCC 42530 verificaram que a lacase bacteriana apresentava cerca de 70
e 50 % de atividade residual relativa após 1 hora de incubação a 65 e 80 ºC,
respectivamente, enquanto que a lacase fúngica foi completamente inibida após 15
minutos a 50 ºC. Segundo esses autores a maior estabilidade térmica das lacases
bacterianas pode ser explicada pelo maior número de interações hidrofóbicas entre
os seus 3 domínios de íons cobre e também pelo alto empacotamento do seu sítio
catalítico.
Mohammadian et al. (2010) relataram que a lacase de Bacillus sp. HR03
reteve 100 % da sua atividade inicial após 260 minutos de incubação a 70 ºC em pH
7,0. Em outro estudo, Furtado et al. (2013) verificaram que a lacase de B. subtilis
subsp. subtilis 168 manteve cerca de 46 % da sua atividade inicial após 150 minutos
de incubação a 80 ºC. Guan et al. (2014a) descreveram que a lacase de B. pumilus
W3 foi estável após tratamento térmico por 10 horas nas temperaturas de 60 e 70 ºC
e manteve cerca de 36 % da sua atividade inicial após 4 horas a 90 ºC.
Resultados semelhantes aos obtidos no presente estudo para a
estabilidade térmica da lacase foram também observados por Koschorreck, Schmid
e Urlacher (2008). Estes autores relataram que a lacase CotA de B. licheniformis
DSM 13 exibiu atividades residuais relativas de 43 e 8 %, após 1 hora de incubação
nas temperaturas de 70 e 80 ºC em tampão citrato-fosfato pH 4,0, respectivamente.
A baixa estabilidade térmica observada no presente estudo para a lacase
de B. licheniformis CBMAI 1609, pode ter sido em decorrência do pH do tampão em
que a enzima foi incubada durante a realização dos ensaios. Nessa avaliação da
estabilidade térmica, a enzima foi incubada no pH ótimo de atividade observado para
a oxidação do substrato ABTS (pH 4,0), no entanto, neste pH a enzima apresentou
296
apenas 20 % de atividade residual relativa após 24 horas de incubação a 4 ºC.

Alguns trabalhos na literatura relatam que o pH em que a enzima está incubada
pode influenciar na termoestabilidade, sendo observado para algumas lacases CotA
que os valores de pH mais ácidos tem uma influência negativa enquanto que os
valores de pH alcalinos aumentam a estabilidade térmica (Brander; Mikkelsen; Kepp,
2014; Reiss; Ihssen; Thony-Meyer, 2011; Wang et al., 2015).
Os efeitos dos compostos EDTA e EGTA e de alguns íons metálicos
sobre a atividade de oxidação do substrato ABTS pela lacase recombinante de B.
licheniformis CBMAI 1609 também foram analisados e os resultados obtidos estão
apresentados na Tabela 26. Foi observada a perda de quase 80 % da atividade
enzimática na presença dos compostos EDTA e EGTA na concentração final de 5
mM. A inibição por estes dois compostos demonstra o requerimento de algum íon
divalente para a catálise enzimática. No entanto, observou-se que todos os íons
avaliados influenciaram negativamente a atividade enzimática. A adição de 5 mM
dos íons K+, Li+, Na+, Ca2+, Ni2+, Mg2+ promoveu uma redução da atividade
enzimática de aproximadamente 25 %. Na presença dos íons Co2+ e Cu2+ foi
verificada uma diminuição de 90 e 66 % na atividade enzimática, respectivamente. A
atividade dessa lacase foi completamente inibida na presença de íons Fe3+.
Comparativamente, há na literatura alguns estudos sobre lacases
microbianas que são inibidas na presença de EDTA, assim como de lacases que
sofrem pouco efeito inibitório na presença de altas concentrações deste agente
quelante. Também há relatos de lacases que também são tolerantes a altas
concentrações de NaCl. No estudo realizado por Lu et al. (2012) foi observado que a
lacase de B. licheniformis LS04 manteve 95 e 88 % da sua atividade quando na
presença de EDTA nas concentrações finais de 25 e 50 mM, respectivamente. Os
autores desse trabalho também relataram que essa enzima ainda reteve 77 % da
sua atividade na presença de 1 M de NaCl.
Em outro estudo, Zhang et al. (2013) relataram que a lacase de B.
vallismortis fmb-103 foi inibida cerca de 85 e 50% na presença de 5 mM de EDTA e
0,5 M de NaCl. Neste mesmo estudo, os autores observaram que a atividade dessa
lacase era inibida cerca de 90 % na presença de íons Zn2+ e aumentada na
presença dos íons Ca2+, Cu2+, Mg2+ e Mn2+, sendo constatado um aumento de quase
60 % da atividade enzimática na presença de 5 mM de Cu2+.
297
No estudo realizado por Sondhi et al. (2014), foi observado que a

atividade da lacase de B. tequilensis SN4 também era afetada pela adição de EDTA,
sendo verificada uma atividade residual relativa de 27 % na presença de 5 mM deste
composto. Esta lacase foi parcialmente inibida (cerca de 25 a 30 %) pela adição de 5
mM dos íons Ca2+, Ni2+, Mg2+, Mn2+, Li+, Zn2+ e Al2+ e ativada aproximadamente 26 e
50 % na presença dos íons Cu2+ e Co2+, respectivamente. Foi também observado
que os íons Hg2+ e Fe2+ provocavam uma forte tendência de redução da atividade
enzimática, cerca de 75 e 60 %, respectivamente. Segundo os autores desse
trabalho a inibição provocada pelos Fe2+ é devido à interação deste íon metálico com
o sistema de transporte de elétrons da lacase.
Tabela 26 – Efeito de íons metálicos e de compostos quelantes na atividade da lacase

(5 mM) Desvio
Média
padrão
EDTA 17,81 2,11
EGTA 19,87 0,95
KCl 84,17 1,77
LiCl 78,51 4,95
NaCl 84,80 1,02
CaCl2 77,79 1,89
CoCl2 10,34 1,27
NiCl2 75,81 3,11
MgCl2 75,81 3,32
MnCl2 21,67 0,31
FeCl3 ND -
CuSO4 34,17 2,06
ZnSO4 77,34 4,63
(Controle: atividade enzimática sem a adição de íons metálicos e de compostos quelantes; ND:
atividade enzimática não detectada)
Alguns parâmetros cinéticos da lacase recombinante de B. licheniformis

CBMAI 1609 também foram determinados a partir dos resultados obtidos em ensaios
enzimáticos utilizando concentrações variadas do substrato ABTS (5 a 500 mM) e as
condições ótimas de atividade enzimática (pH 4,0, 60 ºC e enzima na concentração
de 0,008 mg/mL). Na Figura 88 são apresentados os resultados do efeito da
298
concentração do substrato ABTS na atividade da lacase. Verificou-se que essa

lacase seguia um modelo de cinética do tipo Michaelis-Menten, sendo verificado um
coeficiente de correlação de 0,95. A partir do ajuste dos dados obtidos a uma
regressão não-linear pelo programa GraphPad foi estimado que essa lacase
apresentava um Km de 185,6 μM (± 20,49) e Vmax de 14,57 U/mg de proteína
(± 0,71). Os valores estimados para os parâmetros constante catalítica (Kcat) e
constante de especificidade (Kcat/Km) desta enzima foram: 14,97 s-1 (± 1,80) e 0,08
s-1 μM-1 (± 0,01), respectivamente.
Figura 88 - Efeito da concentração do substrato ABTS na atividade da lacase recombinante

de B. licheniformis CBMAI1609
Comparativamente, a lacase de B. licheniformis CBMAI 1609 mostrou-se

mais eficiente do que a lacase de B. pumilus WH4, pois o resultado obtido para a
constante de especificidade (Kcat/Km) no presente estudo foi maior do que o valor
observado por Su et al. (2013), aproximadamente 0,004 s-1 μM-1. Esses autores
também relataram que essa enzima apresenta Km e Kcat de 35,24 μM e 0,16 s-1,
respectivamente, para o substrato ABTS quando analisada no pH 4,0 e em
temperatura ambiente. A lacase de B. licheniformis CBMAI 1609 também apresentou
parâmetros cinéticos semelhantes ao relatado por Wang et al. (2015) para a lacase
de B. subtilis LS02. Segundo esses autores, essa enzima apresentava um Km de
146,4 μM, Kcat igual a 14,4 s-1 e Kcat/Km estimado em 0,098 s-1 μM-1, quando em pH
4,0 a 30 ºC utilizando o substrato ABTS.
Por outro lado, a lacase clonada no presente trabalho apresentou-se
menos eficiente para a oxidação do substrato ABTS do que as lacases de B. subtilis
299
subsp. subtilis 168 e de Bacillus sp. HR03. A enzima de B. subtilis apresentou Km,
Kcat e Kcat/Km iguais a 30 μM, 5 s-1 e 0,167 s-1 μM-1, respectivamente (Furtado et al.,
2013). Segundo Mohammadian et al. (2010), o Km, Kcat e Kcat/Km da lacase de
Bacillus sp. HR03 foram estimados em 535 μM, 127 s-1 e 0,24 s-1 μM,
respectivamente, quando se utilizou ABTS como substrato.
Na Figura 89 é apresentado a análise de dicroísmo circular realizada para
avaliar o perfil de estrutura secundária da lacase de B. licheniformis CBMAI 1609. O
espectro de UV-distante da lacase purificada obtido a 20 ºC e em pH 7,4 apresentou
2 picos principais, um pico positivo com elipticidade molar máxima a 200 nm e um
pico negativo com menor valor de elipticidade molar próximo a 215 nm. Este tipo de
espectro é característico de proteínas ricas em estrutura secundária do tipo folha-β,
como proposto por Corrêa e Ramos (2009). Esta observação foi consistente com o
espectro de CD obtido por Furtado (2009) para a lacase de B. subtilis subsp. subtilis
168. O resultado obtido também está de acordo com proposto pelo Protein Data
Bank para a estrutura secundária da lacase de B. subtilis, esta enzima apresentou
cerca de 40 % de folhas-β e 8 % de α-hélice (Disponível em: http://www.rcsb.org/
pdb/explore/remediatedSequence.do?structureId=1GSK).
Também foi realizado neste estudo o monitoramento da elipticidade molar
a 215 nm durante gradiente térmico de 20 a 90 ºC, para a avaliação da
desnaturação térmica da estrutura secundária da lacase de B. licheniformis CBMAI
1609. No entanto, a qualidade dos dados obtidos não foi boa, por isso esse
resultado não foi conclusivo e não será apresentado nesta tese.
Figura 89 - Espectro de dicroísmo circular no UV-distante em pH 7,4 a 20 ºC para a lacase

300
5. CONCLUSÕES
A avaliação do potencial produtor de celulase, pectinase e xilanase dos

107 isolados de Bacillus sp. revelou que boa parte desses micro-organismos
possuíam potencial para a produção dessas enzimas. Dentre os 20 isolados pré-
selecionados para os ensaios de produção enzimática por fermentação submersa,
os isolados BH27, BH47, BH56 e BH87 se destacaram como produtores de
endoglucanase enquanto os isolados BH27, BH32, BH88 e BH93 apresentaram as
maiores atividades de poligalacturonase. Os isolados BH19, BH47, BH54 e BH60
exibiram os melhores resultados de produção de xilanase e também mostraram-se
capazes de produzir outras hidrolases glicosídicas quando cultivados em farelo de
trigo, o que é interessante para a redução dos custos de obtenção dessas enzimas.
A identificação taxônomica molecular e de polimorfismo genético dos 20 isolados de
Bacillus sp. pré-selecionados revelou que esses tratavam-se de linhagens de B.
licheniformis e de B. subtilis e que em nível intraespecífico esses apresentavam
elevada diversidade. O isolado BH19 foi identificado e depositado na Coleção
Brasileira de Micro-organismos de Ambiente e Indústria (CBMAI) pertencente ao
Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas da
Universidade Estadual de Campinas (CPQBA-UNICAMP) como B. licheniformis
CBMAI 1609. Este se destacou-se quanto à produção de hemicelulases e por isso
foi utilizado nas etapas posteriores desse trabalho.
O estudo da produção de xilanase pela linhagem B. licheniformis CBMAI
1609 por fermentação submersa mostrou que a utilização de subprodutos
agroindustriais, como a combinação de bagaço da laranja e farelo de soja, pode ser
uma alternativa em substituição a xilana comercial a fim de baixar o custo de
produção da enzima. Nos estudos de otimização da produção, as maiores atividades
xilanásicas foram observadas utilizando-se o meio de cultivo composto por 2,375 %
de caseína, 3 % de bagaço de laranja, 5,75 % de farelo de soja, 0,1 % de MgSO4,
0,1 % de KCl e 0,15 % de K2HPO4 (m/v)) e as condições de cultivo 37 ºC, 250 rpm,
pH inicial entre 6,0 e 7,0, quantidade de inóculo de 2 % (v/v) e 64 horas de
fermentação. O estudo inicial para escalonamento da fermentação em reator de
bancada demonstrou que é possível aumentar ainda mais a produção de xilanase,
reduzir o tempo de fermentação e, consequentemente, diminuir os custos de
produção da enzima. O cultivo do micro-organismo nas condições otimizadas
301
descritas acima permitiu que esse produzisse simultaneamente várias hidrolases

glicosídicas, o que foi interessante e torna esse processo ainda mais vantojoso.
A caracterização bioquímica do sistema xilanolítico produzido por B.
licheniformis CBMAI 1609 indicou que esse apresentava propriedades que são
desejáveis para utilização em alguns processos tecnológicos, como atividade ótima
e estabilidade em pH próximo a 6,0 e em temperaturas ao redor de 50 ºC e uma
tendência de ativação na presença de alguns íons metálicos. O estudo para
purificação das hidrolases glicosídicas presentes no sobrenadante de cultivo desse
micro-organismo revelou de forma inesperada que parte dessas enzimas eram
produzidas na forma de um grande complexo multienzimático que apresentava
principalmente atividades enzimáticas hemicelulásicas. O isolamento desse
complexo multienzimático foi um trabalho inicial que abre várias oportunidades de
estudos futuros com o intuito de elucidar mais características deste complexo, assim
como de estudos de aplicação tecnológica e de construção de complexos
multienzimáticos in vitro com características diferenciadas.
As estratégias de prospecção de genes da linhagem B. licheniformis
CBMAI 1609 permitiram isolar e clonar genes que codificavam enzimas com
atividade de endoglucanase, galactanase, arabinanase, arabinofuranosidase,
ramnogalacturonase e lacase. Os resultados observados na caracterização
bioquímica de duas endoglucanases, uma galactanase e uma lacase clonadas de B.
licheniformis CBMAI 1609 revelaram que essas enzimas poderiam atuar em
temperaturas por volta de 50 ºC, apresentavam boa estabilidade em diferentes
valores de pH e em temperaturas de até 50ºC e que também exibiam eficiência
catalítica comparável a de outras enzimas descritas na literatura. Diante dos
resultados observados neste trabalho pode-se sugerir a aplicação dessas 4 enzimas
caracterizadas na suplementação de formulações enzimáticas fúngicas visando à
bioconversão de biomassas lignocelulósicas, assim como em alguns processos da
indústria de alimentos, entre eles a clarificação de sucos de frutas e a produção de
cervejas e vinhos.
302
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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7. APÊNDICES
7.1. Apêndice 1 – Sequência nucleotídica completa do gene RNAr 16S da

AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACCGACGGGAGCTTGCTC
CCTTAGGTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGC
TAATACCGGATGCTTGATTGAACCGCATGGTTTAATTATAAAAGGTGGCTTTTAGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCG
CATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGA
CTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGC
CGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTT
GACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAA
TTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGA
AACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACC
AGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTG
GTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCAAACGCATTAAGCACTC
CGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTA
ATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCCCCTTCGGGGGCAG
AGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGAT
CTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATC
ATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGCAGAACAAAGGGCAGCGAAGCCGCGAGGCTAAGCCAA
TCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAG
CATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTG
AGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTA
7.2. Apêndice 2 – Estudo de aplicação da galactanase recombinante de B.

Com o objetivo de avaliar uma aplicação biotecnológica para a

galactanase codificada pelo gene BlGal de B. licheniformis CBMAI 1609 foi realizada
a suplementação do coquetel enzimático comercial Accellerase® 1500 (Genecor)
visando a hidrólise enzimática do bagaço de cana de cana-de-açúcar pré-tratado
com ácido acético e peróxido de hidrogênio. Esse bagaço de cana-de-açúcar pré-
tratado apresentava em sua composição (% em relação à massa seca total) 59,7 %
de celulose, 35,6 % de hemicelulose e 2,4 % de lignina (Bragatto, Segato e Squina,
2013).
As reações de hidrólise foram realizadas em microtubos de 1,5 mL
contendo 20 mg de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado, 2 μL da enzima
comercial, 100 μL da enzima galactanase purificada nas concentrações de 0,1, 0,4,
ou 1,2 μM e tampão citrato-fosfato 100 mM, pH 5,5, até completar o volume
349
reacional de 1 mL. Após incubação a 45 ºC sob agitação de 750 rpm por 24 horas,
as misturas reacionais foram centrifugadas a 10.000 x g por 10 minutos a
temperatura ambiente para a separação do sobrenadante da biomassa residual.
Esse sobrenadante foi utilizado na quantificação dos açúcares redutores liberados
através do método de DNS (Miller, 1959). Os resultados obtidos da leitura de
absorbância a 540 nm foram relacionados com uma curva de calibração preparada
com D-glicose. Reações controle contendo apenas a enzima comercial e outra sem
adição de nenhuma enzima também foram preparadas. Todos os ensaios foram
realizados em triplicata.
Na Figura 90 são apresentados os resultados da avaliação da
suplementação do coquetel enzimático comercial Accellerase® 1500 com a enzima
galactanase de B. licheniformis CBMAI 1609 para a hidrólise de bagaço de cana-de-
açúcar pré-tratado. O teor de pectina na parede celular da cana-de-açúcar é menor
que 10 % e esta pode ser encontrada ligada a compostos fenólicos da parede
celular e/ou lignina e também associada com a celulose (Souza et al., 2013). Mesmo
sendo possivelmente baixo o teor desse polissacarídeo no bagaço da cana-de-
açúcar foi verificado que a adição da galactanase proporcionou um aumento
estatisticamente significativo, ao nível de confiança de 95 %, na liberação de
açúcares redutores. Foi observada uma melhora de cerca de 25 % no rendimento da
hidrólise com a utilização dessa enzima.
Figura 90 – Efeito da suplementação de um coquetel enzimático comercial com a enzima

galactanase de B. licheniformis CBMAI 1609
(Acc: coquetel enzimático Accellerase® 1500; Gal: galactanase de B. licheniformis CBMAI 1609)
350
Comparativamente, Delabona et al. (2013) relataram que o extrato

enzimático bruto do fungo Trichoderma harzianum era deficiente em algumas
atividades catalíticas para a completa hidrólise de materiais lignocelulósicos,
incluindo as pectinases. Ao suplementarem esse extrato enzimático fúngico com
pectinase comercial (Pectinex XL – Novozymes) e uma α-L-arabinofuranosidase de
Bacillus sp. os autores desse trabalho observaram um aumento de 116 % no
rendimento da hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado.
Os resultados da suplementação do coquetel enzimático Accellerase®
1500 com a galactanase de B. licheniformis CBMAI 1609 sugerem que a sua adição
pode melhorar os rendimentos da hidrólise enzimática de materiais lignocelulósicos.
7.2.1. Referências Bibliográficas
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351
7.3. Apêndice 3 - Expressão e purificação da α-L-arabinofuranosidase da

família GH51 codificada pelo gene BlAbf de B. licheniformis CBMAI
1609
As α-L-arabinofuranosidases (EC 3.2.1.55) e as arabinanases (endo-1,5-

α-L-arabinanase, EC 3.2.1.99) são enzimas acessórias que participam da
degradação de hemiceluloses, tais como arabinoxilana, arabinogalactana e
arabinana (Saha, 2000). As arabinanases atuam como endoenzimas catalisando a
hidrólise de resíduos de arabinose unidos por ligações α-1,5-L-arabinofuranosídicas
na cadeia principal de arabinanas, enquanto que as α-L-arabinofuranosidases
operam como exoenzimas sobre terminais não redutores de arabinooligossacarídeos
e cadeias laterais de polissacarídeos que contenham resíduos de arabinose unidos
por ligações dos tipos α-1,2, α-1,3 e/ou α-1,5-L-arabinofuranosídicas (Inácio;
Correia; Sá-Nogueira, 2008; Saha, 2000).
Essas duas enzimas são produzidas por fungos, bactérias e plantas e
podem ser utilizadas no melhoramento de aromas de vinhos e qualidade de pães, na
clarificação de sucos de frutas, no aumento da digestibilidade de rações animais, no
tratamento da polpa de papel, na produção de compostos de importância médica,
como antiglicêmicos, anticarcinogênicos e antimetastáticos, e na suplementação de
coquetéis enzimáticos para produção de bioetanol e outros bioprodutos (Numan;
Bhosle, 2006; Saha, 2000; Seo et al., 2010).
Baseado nas similaridades das sequências de aminoácidos, as α-L-
arabinofuranosidases tem sido classificadas em 6 famílias de hidrolases glicosídicas
pelo sistema CAZy, sendo elas: GH2, GH3, GH43, GH51, GH54 e GH62 (disponível
em: http://www.cazy.org/). Vários estudos recentes têm descrito a clonagem e
caracterização de α-L-arabinofuranosidases microbianas pertencentes à família
GH51 (Amore et al., 2012; Hoffmam et al., 2013; Lee; Lee, 2014). Em um desses
trabalhos, Inácio, Correia e Sá-Nogueira (2008) avaliaram duas α-L-
arabinofuranosidases da família GH51 provenientes de linhagens de B. subtilis e
relataram que essas enzimas apresentavam diferentes especificidades enzimáticas
para substratos contendo arabinose e que possuíam uma organização hexamérica
com massa molecular superior a 250 KDa quando em solução. Também há relatos
na literatura de que a suplementação de coquetéis enzimáticos, contendo celulases
e xilanases, com α-L-arabinofuranosidases da família GH51 proporcionaram
352
aumentos significativos no rendimento de açúcares redutores liberados em hidrólises

de diferentes biomassas lignocelulósicas (Alvira et al., 2011; Delabona et al., 2013;
Gao et al., 2011).
Na literatura foi encontrado apenas um relatado de α-L-
arabinofuranosidase proveniente de linhagens de B. licheniformis. Neste estudo,
Nurcholis et al. (2012) relataram a clonagem e caracterização de duas α-L-
arabinofuranosidases, provenientes das linhagens B. subtilis DB104 e B.
licheniformis CW1. Segundo os autores deste trabalho, a α-L-arabinofuranosidase
de B. licheniformis CW1 apresentava estabilidade térmica superior ao observado
para outras α-L-arabinofuranosidases de micro-organismos mesofílicos, sendo
constatada a manutenção de mais de 75 % de atividade residual após 12 horas de
incubação nas condições ótimas de reação (60 ºC e pH 6,0).
Conforme apresentado anteriormente nesta tese, foi observada a
atividade enzimática de uma possível α-L-arabinofuranosidase no sobrenadante de
cultivo do micro-organismo B. licheniformis CBMAI 1609 durante o cultivo no meio de
cultura otimizado. No presente estudo, o gene BlAbf que codifica uma α-L-
arabinofuranosidase pertencente à família GH51 neste micro-organismo foi
amplificado, utilizando oligonucleotídeos iniciadores baseados na sequência
nucleotídica de uma α-L-arabinofuranosidase predita para a linhagem B.
licheniformis ATCC 14580, e clonado no vetor de expressão pET-28a(+).
A sequência de nucleotídeos do gene BlAbf apresentou alta identidade
(acima de 97 %) com sequências depositadas de genes que codificam α-L-
arabinofuranosidases da família GH51 em outras linhagens de B. licheniformis
(números de acesso no NCBI: CP005965.1, AB643523.1, CP010524.1 e
CP000002.3). Na comparação da sequência de aminoácidos predita para a α-L-
arabinofuranosidase de B. licheniformis CBMAI 1609 com outras depositadas no
banco de dados do NCBI, através da ferramenta Blastp, foi verificado que esta
enzima apresentava 99 % de identidade com a sequência prevista para a α-L-
arabinofuranosidase da linhagem B. licheniformis ATCC 14580. Constatou-se
também que esta enzima apresentava 76 e 75 % de identidade com as sequências
de aminoácidos das α-L-arabinofuranosidases de B. subtilis subsp. subtilis 168 e
Geobacillus stearothermophilus T6 (números de acesso no NCBI: P94531.2 e
IPZ3.A, respectivamente).
353
Na Figura 91 é apresentado o resultado do alinhamento das sequências

de aminoácidos preditas para as α-L-arabinofuranosidases das linhagens B.
licheniformis CBMAI 1609, B. licheniformis ATCC 14580 e B. subtilis subsp. subtilis
168 através da ferramenta ClustalW. Foi verificado que as estruturas primárias das
α-L-arabinofuranosidases das duas linhagens de B. licheniformis eram compostas
por 502 aminoácidos e que estas diferiam em apenas 5 aminoácidos. Essas
diferenças, representadas pelos triângulos na Figura 91, foram observadas nas
posições 19 (valina por isoleucina), 61 (arginina por serina), 85 (valina por
isoleucina), 201 (metionina por valina) e 265 (ácido aspártico por valina). Por outro
lado, foi verificado que a sequência da α-L-arabinofuranosidase de B. subtilis subsp.
subtilis 168 possuía 500 aminoácidos e que esta apresentava 126 aminoácidos
diferentes em comparação com a sequência da enzima clonada neste estudo.
Embora tenham sido observadas diferenças nas estruturas primárias
destas 3 enzimas, aminoácidos considerados importantes para a catálise enzimática
estavam conservados, conforme informações relatadas no site do UniProt
(disponível em: http://www.uniprot.org/uniprot/P94531). Entre esses aminoácidos
conservados estavam os dois resíduos de ácido glutâmico, localizados nas posições
175 e 294 da sequência clonada, que atuam no sítio ativo como doador/aceptor de
prótons e nucleófilo. Também permaneciam conservados aqueles aminoácidos que
fazem parte de sítios para o reconhecimento do substrato (resíduos de triptofano e
glutamina, localizados nas posições 298 e 351 da sequência clonada,
respectivamente) e de sítios de ligação do substrato (resíduos de ácido glutâmico,
asparagina e tirosina, localizados nas posições 29, 74 e 246 da sequência clonada,
respectivamente).
354
Figura 91 - Alinhamento das sequências de aminoácidos preditas para as α-L-

arabinofuranosidases de B. licheniformis CBMAI 1609, B. licheniformis ATCC 14580 e B.
subtilis subsp. subtilis 168 através da ferramenta ClustalW
* As setas indicam aminoácidos conservados considerados importantes para a atividade enzimática
enquanto que os triângulos indicam as mutações observadas entre as sequências de aminoácidos
das enzimas das linhagens B. licheniformis CBMAI 1609 e ATCC 14580.
A análise da sequência de aminoácidos da α-L-arabinofuranosidase de B.

licheniformis CBMAI 1609 pela ferramenta ProtParam indicou que a proteína madura
expressa era composta de 525 aminoácidos e apresentava massa molecular de 59,3
KDa e ponto isoelétrico teórico estimado em pH 6,0. A massa molecular calculada
para essa enzima está de acordo com o observado para duas α-L-
arabinofuranosidases da família GH51 de linhagens de B. subtilis, essas enzimas
possuíam massa molecular estimada em 57 e 58 KDa (Inácio; Correia; Sá-Nogueira,
355
2008). Este valor também condiz com o relatado por Pei e Shao (2008) para a α-L-
arabinofuranosidase de B. pumilus ARA, que exibiu massa molecular estimada em
56 KDa, e com o verificado por Lee e Lee (2014) para a α-L-arabinofuranosidase de
Paenibacillus sp. DG-22, que possuía massa molecular de 56,5 KDa.
A expressão da α-L-arabinofuranosidase recombinante de B. licheniformis
CBMAI 1609 foi avaliada, como descrito no item 3.4.4, utilizando as linhagens de E.
coli BL21(DE3), BL21(DE3)pRare2, Rosetta-gami 2(DE3) e Artic Express (DE3) e os
resultados obtidos estão apresentados na Figura 92.
Como pode ser visualizado nas canaletas de número 2 e 4 dos géis da
Figura 92a, não foi observado um alto nível de expressão da enzima sob as
condições utilizadas, pois não foi detectada a presença de bandas de proteínas com
o tamanho esperado para esta enzima após 4 horas de indução nas linhagens de E.
coli BL21(DE3), BL21(DE3)pRare2, Rosetta-gami 2(DE3) e após 20 horas de
indução para a linhagem E. coli Artic Express. No entanto, testes de atividade
enzimática utilizando os sobrenadantes do processo de lise celular e os substratos
arabinana de beterraba sacarina linear e desramificada confirmaram a expressão da
α-L-arabinofuranosidase pela linhagem E. coli BL21(DE3), como apresentado na
Figura 92b.
Comparativamente, Pei e Shao (2008) ao clonarem a α-L-
arabinofuranosidase de B. pumilus ARA também observaram uma baixa expressão
da enzima. Para obter uma maior expressão da enzima os autores promoveram
algumas mutações no gene clonado para otimizar os códons e reduzir estruturas
secundárias na região de iniciação de tradução do RNAm. Com esta estratégia os
autores conseguiram aumentar o nível de expressão da enzima em cerca de 225 %
em comparação ao gene não mutado.
356
Figura 92 – Géis de eletroforese SDS-PAGE para avaliação da expressão da α-L-

arabinofuranosidase codificada pelo gene BlAbf de B. licheniformis CBMAI1609 nas
linhagens E. coli BL21(DE3), BL21(DE3)pRare2, Rosetta-gami 2(DE3) e Artic Express (a) e
testes de atividade enzimática de α-L-arabinofuranosidase com os substratos arabinana
linear e arabinana desramificada (b)
(Figura 92a - M: marcador de massa molecular; 1: proteínas obtidas das células antes da indução
com IPTG; 2: proteínas obtidas das células ao final do período de indução com IPTG - 4 horas para
as linhagens E. coli BL21(DE3), BL21(DE3)pRare2 e Rosseta-gami 2(DE3) e 20 horas para a
linhagem Artic Express (DE3); 3: proteínas insolúveis após o processo de lise celular; 4: proteínas
solúveis presentes no sobrenadante do processo de lise celular; Figura 92b – A: Branco (controle
negativo da reação enzimática); B e C: duplicata das reações enzimáticas; 1, 2, 3 e 4: reações
enzimáticas com os sobrenadantes do processo de lise celular das linhagens E. coli BL21(DE3),
BL21(DE3)pRare2, Rosetta-gami 2(DE3) e Artic Express, respectivamente).
Visando a obtenção da α-L-arabinofuranosidase recombinante de B.

licheniformis CBMAI1609 para a realização dos ensaios de purificação e
caracterização, foi realizada a expressão da enzima em maior escala utilizando-se a
linhagem E. coli BL21(DE3) e as mesmas condições de cultivo e indução anteriores.
Novamente, não foi possível visualizar a expressão da proteína, após 4 horas de
indução com IPTG, através de análises eletroforéticas em gel de SDS-PAGE.
357
Contudo, testes de atividade enzimática indicaram a presença da enzima no

sobrenadante do processo de lise das células obtidas ao final de 4 horas de indução
(dados não apresentados). Essa amostra do sobrenadante da lise celular foi então
submetida à purificação cromatográfica em coluna de afinidade His-Trap Fast Flow
com íons níquel imobilizados. Na Figura 93, é apresentado o cromatograma desta
etapa de purificação e análise eletroforética por gel SDS-PAGE das amostras dos
picos de eluição das proteínas.
Durante a purificação cromatográfica na coluna de afinidade foi observada
a presença de 4 picos de eluição de proteínas, sendo 1 deles (pico P1) eluído
durante a lavagem da coluna com o tampão e os demais (P2, P3 e P4) eluídos
durante a aplicação do gradiente de imizadol no tampão. As amostras
correspondentes a esses 4 picos continham várias bandas de proteínas, como pode
ser visualizado na Figura 93. A atividade de α-L-arabinofuranosidase foi detectada
apenas nas frações coletadas no pico P1.
Figura 93 – Cromatograma da purificação da α-L-arabinofuranosidase recombinante de B.

licheniformis CBMAI 1609 em coluna de afinidade His-Trap Fast Flow com íons níquel
imobilizados (a) e gel de eletroforese SDS-PAGE com as amostras dos picos de eluição das
proteínas nessa coluna cromatográfica (b)
(M: marcador de massa molecular; 1: frações reunidas do pico P1; 2: frações reunidas do pico P2; 3:
frações reunidas do pico P3; 4: frações reunidas do pico P4).
Com o objetivo de separar a α-L-arabinofuranosidase clonada das demais

proteínas presentes nas frações coletadas do pico P1, foi realizada uma nova etapa
358
cromatográfica na coluna de troca aniônica Source 15Q 4.6/100/PE, sob as mesmas

condições descritas na purificação da enzima galactanase. Nessa etapa
cromatográfica foi observada a separação das proteínas em vários picos de eluição
durante a corrida. A atividade enzimática de arabinofuranosidase foi detectada
fracamente apenas nas frações coletadas no pico eluído durante a lavagem da
coluna com o tampão. Essas frações que continham a enzima de interesse foram
submetidas à análise eletroforética e outra vez foi constatada uma grande
quantidade de proteínas interferentes na amostra (dados não apresentados).
Diante do baixo rendimento da expressão proteica e do insucesso na
obtenção da enzima recombinante com alto grau de pureza, não foi realizado no
presente trabalho os ensaios de caracterização enzimática. Trabalhos futuros
deverão ser executados na tentativa de melhorar a expressão proteica visando à
obtenção de uma maior quantidade de enzima para a realização dos estudos de
purificação. Além disso, outras estratégias e condições de purificação cromatográfica
também deverão ser abordadas nos próximos estudos desta enzima.
7.3.1. Referências Bibliográficas
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arabinofuranosidase supplementation on the enzymatic hydrolysis of steam exploded
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G. C. Understanding the cellulolytic system of Trichoderma harzianum P49P11 and
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GOWDA, K.; BRUMM, P.; MEAD, D.; BALAN, V.; DALE, B. E. Hemicellulases and
359
auxiliary enzymes for improved conversion of lignocellulosic biomass to

monosaccharides. Biotechnology for Biofuels, v. 4, n. 5, 11p, 2011.
HOFFMAM, Z. B.; OLIVEIRA, L. C.; COTA, J.; ALVAREZ, T. M.; DIOGO, J. A.;
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NURCHOLIS, M.; NURHAYATI, N.; HELIANTI, I.; ULFAH, M.; WAHYUNTARI, B.;
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SEO, E. –S.; LIM, Y. –R.; KIM, Y. –S.; PARK, C. –S.; OH, D. –K. Characterization of
a recombinant endo-1,5-α-L-arabinanase from the isolated bacterium Bacillus
licheniformis. Biotechnology and Bioprocess Engineering, v. 15, p. 590-594,
2010.
360
8. ANEXOS
8.1. Anexo 1 – Relatório da avaliação de biossegurança do projeto de

pesquisa pela Comissão de Biossegurança do Centro Nacional de
Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM)
361
8.2. Anexo 2 – Comprovante do depósito de pedido de patente para

proteção do meio de cultura e do processo de produção de hidrolases
glicosídicas apresentados nesta tese

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1

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

EVANDRO ANTONIO DE LIMA

Prospecção, clonagem, produção, purificação e caracterização de

EVANDRO ANTONIO DE LIMA

Prospecção, clonagem, produção, purificação e caracterização de

Tese apresentada à Faculdade de Engenharia de

Orientadora: Profa. Dra. Hélia Harumi Sato

Este exemplar corresponde à versão final da tese

Profa. Dra. Hélia Harumi Sato – DCA/FEA/UNICAMP

Prof. Dr. André Ricardo de Lima Damásio – IB/UNICAMP

Dra. Carla Botelho Machado – CTBE/CNPEM

Profa. Dra. Rosana Goldbeck – DEA/FEA/UNICAMP

Prof. Dr. Severino Matias de Alencar – ESALQ/USP

Prof. Dr. Juliano Lemos Bicas – DCA/FEA/UNICAMP

Profa. Dra. Luciana Fransciso Fleuri – IBB/UNESP

Profa. Dra. Marta Cristina Teixeira Duarte – CPQBA/UNICAMP

A Ata da Defesa, com as respectivas assinaturas dos membros da Comissão

A Deus por me amparar e dar forças, paciência e esperança para enfrentar os

As celulases, hemicelulases, pectinases e lacases são um importante

endoglucanases, uma galactanase e uma lacase. A caracterização das

Cellulases, hemicellulases, pectinases and laccases are an important

Figura 1 – Esquema simplificado de uma biorrefinaria para reaproveitamento da

Figura 15 – Árvore filogenética baseada no método neighbor-joining usando

Figura 29 – Efeito do pH (a) e da temperatura (b) na estabilidade enzimática do

Figura 51 - Esquema ilustrativo do vetor pET-28a(+) ............................................. 232

nas linhagens E. coli BL21(DE3), BL21(DE3)pRare2, Rosetta-gami 2(DE3) e Artic

níquel imobilizados (a) e gel de eletroforese SDS-PAGE com os passos de

Tabela 1 – Produção das principais culturas agrícolas brasileiras e dos subprodutos

Tabela 13 – Resultados do coeficiente de regressão, desvio padrão, teste t-Student

Tabela 25 – Parâmetros cinéticos estimados para a endoglucanase GH5

3.1.1. Micro-organismos utilizados e manutenção .............................................. 68

3.2.5. Identificação dos componentes do meio de cultura significativos para

3.3.3.2. Purificação das hidrolases glicosídicas de B. licheniformis CBMAI

3.4.2. Amplificação dos genes das enzimas lignocelulolíticas avaliadas e

4.1.2.1. Caracterização taxonômica dos isolados de Bacillus sp. baseado na

4.3.1.1. Efeito do pH e da temperatura na atividade enzimática do sistema

5. CONCLUSÕES ................................................................................................... 300

O Brasil destaca-se no cenário mundial por ser um dos principais países

imensa gama de moléculas, como biocombustíveis, precursores de produtos

rações animal e de papel e celulose. Os objetivos específicos desta tese foram:

crescimento e de produção da enzima, a avaliação da produção simultânea de

A comercialização de produtos oriundos de biocatálise deve crescer

Atualmente, mais de 80 % da energia e 90 % dos compostos orgânicos usados no

agroindustriais, recursos florestais, lixos municipais e outros materiais herbáceos

2.3. Geração e composição dos subprodutos agroindustriais

O desenvolvimento sócio-econômico e a evolução dos hábitos de vida da

(Garboza; Trindade, 2007). Os setores agroindustrial e de alimentos são hoje

produzidos diretamente na agricultura que ficaram na própria área de produção. O

Fonte: IPEA (2012)

Pelo fato de serem derivados de materiais vegetais, a composição dos

Tabela 2 – Composição lignocelulósica de alguns subprodutos agroindustriais

* % (m/m) baseada em massa seca

A celulose é o principal componente desses materiais, podendo

ramificações assim como a presença de diferentes unidades monoméricas

2.4. Reaproveitamento dos subprodutos agroindustriais em biorrefinarias

Os subprodutos gerados nas atividades agroindustriais podem ser

utilizados. Pelo fato do conceito de biorrefinarias ser relativamente novo, muitas

Figura 1 – Esquema simplificado de uma biorrefinaria para reaproveitamento da biomassa

Na plataforma termoquímica, a biomassa lignocelulósica pode ser

ausência de oxigênio para produzir o bio-óleo. Esse após processos de

Atualmente, já existem algumas empresas que utilizam o conceito de

2.5. Reaproveitamento dos subprodutos agroindustriais para a produção do

A crescente necessidade de ampliar de modo sustentável o uso de fontes