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Campinas – SP
2015
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Campinas – SP
2015
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BANCA EXAMINADORA
AGRADECIMENTOS
RESUMO
ABSTRACT
range 4.0 to 8.0 and also exhibited good catalytic efficiency. The laccase showed
optimal activity between 55 and 60 °C and pH 4.0. This enzyme also exhibited low
stability after previous incubation at pH values below 5.0 and had similar catalytic
efficiency to other laccases. The effect of commercial enzyme cocktail
supplementation with galactanase was also evaluated. The supplementation led to
an improvement of approximately 25 % in the hydrolysis yield of pretreated
sugarcane bagasse.
10
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 39 – Análise eletroforética por SDS-PAGE das amostras dos picos de eluição
das proteínas obtidos nas purificações em colunas de troca aniônica DEAE
Sepharose Fast Flow e de exclusão molecular Superdex 200 10/300 GL .............. 211
Figura 40 – Análises de zimografia do complexo multienzimático de B. licheniformis
CBMAI 1609 presente nas amostras do pico de eluição de proteínas D1 da
purificação em coluna de troca aniônica DEAE Sepharose Fast Flow antes e depois
da etapa cromatográfica de exclusão molecular na coluna Superdex 200 10/300
GL ........................................................................................................................... 214
Figura 41 – Painel de substratos para as amostras obtidas durante os passos da
purificação do complexo multienzimático produzido por B. licheniformis CBMAI
1609 ........................................................................................................................ 218
Figura 42 – Eletroforese em gel de agarose para avaliação do perfil de digestão do
DNA genômico da linhagem B. licheniformis CBMAI 1609 com a enzima de restrição
Sal3AI ...................................................................................................................... 220
Figura 43 - Eletroforese em gel de agarose da amostra de DNA genômico de B.
licheniformis CBMAI 1609 obtida ao final da etapa de digestão.............................. 221
Figura 44 – Esquema ilustrativo do vetor pUC19 ................................................... 222
Figura 45 - Eletroforese em gel de agarose para avaliação da digestão do DNA
plasmidial de 12 colônias brancas da biblioteca genômica de B. licheniformis CBMAI
1609 com as enzimas de restrição EcoRI e HindIII ................................................. 223
Figura 46 - Eletroforese em gel de agarose para avaliação do perfil de digestão do
DNA plasmidial dos 5 clones positivos na triagem funcional da biblioteca genômica
de B. licheniformis CBMAI 1609 com as enzimas de restrição EcoRI e HindIII. ..... 224
Figura 47 – Confirmação da atividade enzimática dos 5 clones da biblioteca
genômica de B. licheniformis CBMAI 1609 que apresentaram halos de degradação
ao redor das colônias na triagem funcional com os substratos carboximetilcelulose,
pectina e xilana ....................................................................................................... 225
Figura 48 – Análise de domínios conservados para uma das ORFs encontradas no
inserto de DNA do clone D12 através da ferramenta Conserved Domains ............ 227
Figura 49 - Análise de domínios conservados para a ORF1 (a) e ORF2 (b)
encontradas no inserto de DNA do clone K3 através da ferramenta Conserved
Domains .................................................................................................................. 228
Figura 50 – Eletroforese em gel de agarose dos produtos das amplificações por
PCR dos genes BlGAl e BlXeg de B. licheniformis CBMAI 1609 ............................ 231
14
com íons níquel imobilizados (a) e gel de eletroforese SDS-PAGE com os passos da
purificação da enzima (b) ........................................................................................ 275
Figura 75 - Painel de substratos para avaliação da especificidade da endoglucanase
GH5 recombinante de B. licheniformis CBMAI 1609 ............................................... 276
Figura 76 - Efeito do pH (a) e da temperatura (b) na atividade enzimática da
endoglucanase GH5 recombinante de B. licheniformis CBMAI 1609 sobre o
substrato xiloglucano de tamarindo ......................................................................... 277
Figura 77 - Efeito do pH (a) e da temperatura (b) na atividade enzimática da
endoglucanase GH5 recombinante de B. licheniformis CBMAI 1609 sobre o
substrato β-glucano de cevada ............................................................................... 278
Figura 78 - Efeito do pH (a) e da temperatura (b) na estabilidade enzimática da
endoglucanase GH5 recombinante de B. licheniformis CBMAI 1609 utilizando o
substrato xiloglucano de tamarindo ......................................................................... 280
Figura 79 – Efeito da concentração dos substratos xiloglucano de tamarindo (a) e β-
glucano de cevada na atividade da endoglucanase GH5 recombinante de B.
licheniformis CBMAI 1609 ....................................................................................... 283
Figura 80 - Eletroforese capilar dos produtos de hidrólise do substrato xiloglucano
de tamarindo pela endoglucanase GH5 recombinante de B. licheniformis CBMAI
1609 ........................................................................................................................ 284
Figura 81 - Eletroforese capilar dos produtos de hidrólise do substrato β-glucano de
cevada pela endoglucanase GH5 recombinante de B. licheniformis CBMAI 1609 . 285
Figura 82 - Espectro de dicroísmo circular no UV-distante em pH 7,4 a 20 ºC (a) e
curva de desnaturação térmica obtida por DSC (b) para a endoglucanase GH5
recombinante de B. licheniformis CBMAI 1609 ....................................................... 286
Figura 83 - Alinhamento das sequências de aminoácidos preditas para as lacases
de B. licheniformis CBMAI 1609 e B. licheniformis ATCC 14580 através da
ferramenta ClustalW ................................................................................................ 289
Figura 84 – Géis de eletroforese SDS-PAGE para avaliação da expressão da lacase
codificada pelo gene BlLac de B. licheniformis CBMAI1609 nas linhagens E. coli
BL21(DE3), BL21(DE3)pRare2 e Rosetta-gami 2(DE3) (a) e testes de atividade
enzimática de lacase com os sobrenadantes do processo de lise celular (b) ......... 291
Figura 85 – Cromatograma da purificação da lacase CotA recombinante de B.
licheniformis CBMAI 1609 em coluna de afinidade His-Trap Fast Flow com íons
17
LISTA DE TABELAS
SUMÁRIO
RESUMO..................................................................................................................... 6
ABSTRACT ................................................................................................................. 8
LISTA DE ILUSTRAÇÕES ........................................................................................ 10
LISTA DE TABELAS ................................................................................................. 18
SUMÁRIO.................................................................................................................. 21
1. INTRODUÇÃO GERAL ......................................................................................... 29
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................. 33
2.1. Resumo ........................................................................................................... 33
2.2. Introdução ....................................................................................................... 33
2.3. Geração e composição dos subprodutos agroindustriais ................................ 35
2.4. Reaproveitamento dos subprodutos agroindustriais em biorrefinarias ............ 40
2.5. Reaproveitamento dos subprodutos agroindustriais para a produção do
bioetanol de segunda geração ............................................................................... 44
2.6. Biotecnologia enzimática no reaproveitamento de subprodutos
agroindustriais ........................................................................................................ 49
2.6.1. Classificação das enzimas lignocelulolíticas ............................................. 49
2.6.2. Enzimas envolvidas na degradação da celulose ...................................... 50
2.6.3. Enzimas envolvidas na degradação das hemiceluloses ........................... 50
2.6.4. Enzimas envolvidas na degradação da pectina ........................................ 52
2.6.5. Enzimas envolvidas na degradação da lignina ......................................... 54
2.6.6. Componentes acessórios na degradação dos materiais lignocelulósicos 55
2.6.7. Produção das enzimas lignocelulolíticas microbianas .............................. 56
2.6.7.1. Produção de complexos multienzimáticos celulolíticos e
hemicelulolíticos .............................................................................................. 58
2.6.8. Atuais perspectivas nos estudos de enzimas lignocelulolíticas para a
conversão de subprodutos agroindustriais ......................................................... 61
2.7. Aplicações biotecnológicas das enzimas lignocelulolíticas ............................. 64
2.8. Conclusões ...................................................................................................... 67
3. MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 68
3.1. Etapa experimental 1 - “Avaliação do potencial biotecnológico para produção
de hidrolases glicosídicas e caracterização taxonômica de isolados de Bacillus
sp.” ......................................................................................................................... 68
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1. INTRODUÇÃO GERAL
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Resumo
2.2. Introdução
No século XX, uma grande ênfase foi dada para as pesquisas que
buscavam o desenvolvimento de produtos e energia baseados no petróleo, carvão e
gás natural, pois essas matérias-primas eram disponíveis em grande quantidade,
baratas e atendiam facilmente a demanda da população (Naik et al., 2010).
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Tabela 1 – Produção das principais culturas agrícolas brasileiras e dos subprodutos gerados
durante o processamento na agroindústria brasileira no ano de 2009
Produção
Produção Produção Fator Subprodutos
consumida
Cultura agrícola total colhida industrializada residual gerados
in natura
(106 t) (106 t) (%) (106 t)
(106 t)
Arroz 12,651 - 12,651 20 2,530
Cana-de-açúcar 671,394 - 671,394 30 201,418
Café 2,440 - 2,440 50 1,220
Feijão 3,486 - 3,486 53 1,847
Laranja 18,385 0,735 17,650 50 8,825
Milho 50,745 - 50,745 58 29,432
Soja 57,345 - 57,345 73 41,862
Trigo 5,055 - 5,055 60 3,033
unidades de manose unidas por ligações β-1,4 e que em alguns casos podem
apresentar substituições na cadeia principal e ramificações laterais, e a β-1,3-1,4-
glucana (também chamada de liquenano e β-glucano), que é um polissacarídeo
formado por unidades de glicose unidas por ligações β-1,4 e β-1,3 (Scheller;
Ulvskov, 2010).
A lignina pode representar entre 15 a 25 % dos constuintes dos
subprodutos agroindustriais. Esta é uma macromolécula amorfa, de difícil
degradação, que apresenta uma estrutura não uniforme, altamente complexa e com
massa molecular elevada. Basicamente, a lignina é composta de 3 diferentes
unidades de fenilpropano (os alcoóis coniferílico, sinapílico e p-cumarílico), com
substituintes metoxila no anel aromático, unidas por diferentes ligações do tipo éter e
éster e que estabelecem ligações cruzadas entre si (Hendriks; Zeeman, 2009; Maity,
2015). A lignina é encontrada na parede celular secundária das plantas, onde
desempenha importantes papéis biológicos, como a redução da permeabilidade da
parede celular à água, participação nos mecanismos de defesa contra patógenos e
estresse oxidativo e também no auxilio do suporte estrutural (Hendriks; Zeeman,
2009). Assim como a hemicelulose, a composição da lignina também pode variar
entre os diversos grupos de plantas (Mathews; Paulak; Grunden, 2015).
A pectina é normalmente encontrada em pequenas proporções na maioria
dos subprodutos agroindustriais e muitas vezes acaba não recebendo muita
atenção. No entanto, ela pode representar até um terço da massa seca dos
constituintes da parede celular de algumas espécies vegetais (Lasheras, 2004). Os
polissacarídeos que formam a pectina (ramnogalacturano tipo I e II,
homogalacturano e xilogalacturano) consistem basicamente de uma cadeia de
resíduos de ácido galacturônico unidos por ligações do tipo α-1,4, os quais são
intensamente metilados, esterificados e intercalados com ramnose, arabinose,
fucose e galactose nas cadeias laterais (Lasheras, 2004; Caffall e Mohnen, 2009). A
pectina interage com íons cálcio formando uma matriz gelatinosa na parede celular
vegetal que confere sustentação a celulose e hemicelulose, assim como flexibilidade
à parede celular vegetal (Harholt; Suttangkakul; Scheller, 2010).
enzimático (Castro; Pereira Júnior, 2010). Alguns estudos recentes também têm
sugerido a utilização de líquidos iônicos, como por exemplo o cloreto de 1-butil-3-
metilimidazólio e o cloreto de 1-alil-3-(1-metil)imidazólio, como um método alternativo
para a hidrólise dos polissacarídeos (Ogeda; Petri, 2010).
A hidrólise enzimática completa do material lignocelulósico ocorre pela
ação sinérgica de um complexo sistema enzimático, composto por várias enzimas
celulolíticas, hemicelulolíticas, pectinolíticas e ligninolíticas e por algumas proteínas
acessórias (Sweeney; Xu, 2012). No tópico 2.6 são apresentadas e discutidas a
atuação das principais enzimas envolvidas neste processo.
O processo de hidrólise enzimática apresenta um grande potencial de
aplicação industrial e sua utilização tem sido preferível nos últimos anos. Isso se
deve pelo fato deste exibir alta especificidade, pela ausência de formação de
substâncias tóxicas (furfural, hidroximetilfurfural e derivados de lignina) aos micro-
organismos fermentadores, por utilizar condições mais brandas de processo e por
permitir a integração das etapas de hidrólise da biomassa com processos
fermentativos (Bastos, 2007; Bon; Ferrara; Corvo, 2008; Castro; Pereira Júnior,
2010; Ogeda; Petri, 2010). Contudo, essa tecnologia ainda não é um processo viável
do ponto de vista econômico, devido aos elevados custos de produção desses
biocatalisadores, a grande quantidade de enzimas requerida e a necessidade de
enzimas mais eficientes e estavéis para aumentar os rendimentos da conversão
(Banerjee; Scott-Craig; Walton, 2010).
Outro grande obstáculo na produção do bioetanol de 2ª geração é o fato
da levedura Saccharomyces cerevisiae, que é o micro-organismo mais utilizado nas
fermentações industriais para produção de álcool, não conseguir metabolizar
pentoses. Consequentemente, este processo acaba utilizando apenas 30 % do
potencial dos materiais lignocelulósicos. Com a possibilidade de fermentação das
pentoses pelos micro-organismos fermentadores estima-se que esse valor poderá
aumentar e chegar a quase 60 % (Goldbeck, 2012).
Na tentativa de superar essas dificuldades técnicas e melhorar os
rendimentos do processo de produção do bioetanol de 2ª geração e torná-lo mais
competitivo, vários estudos têm sido realizados por diferentes centros de pesquisa.
Estes estudos tem buscado o desenvolvimento de métodos de pré-tratamentos que
facilitem a disponibilização dos polissacarídeos e o acesso das enzimas, a criação
de coquéteis enzimáticos mais eficientes e baratos; o isolamento ou criação de
49
α-1,4 e que pode estar esterificado por metanol e ácido acético) as pectinases
podem ser distinguidas em dois grupos principais, pectinas esterases e pectinas
despolimerases. As pectinas despolimerases podem ainda ser subdivididas em
hidrolases e liases de acordo com o mecanismo de clivagem das ligações
glicosídicas. Entre as pectinas esterases destacam-se a pectina metil esterase (EC
3.1.1.11), que é responsável pela remoção de grupos metoxila da pectina
metoxilada, e a pectina acetil esterase, que é capaz de clivar grupos acetil de
resíduos de ácido galacturônico acetilados. Entre as pectinas despolimerizantes,
têm-se as poligalacturonases, que podem ser do tipo endoenzimas (EC 3.2.1.15) ou
exoenzimas (EC 3.2.1.67) e são responsáveis por hidrolisar ligações α-1,4 entre
resíduos de ácido galacturônico não esterificados, as pectinas liases (EC 4.2.2.10),
que clivam as ligações α-1,4 entre resíduos de ácido galacturônico esterificados, e
as pectato liases (EC 4.2.2.2) que clivam ligações α-1,4 entre resíduos de ácido
galacturônico não esterificados (Koivula et al., 2012; Van den Brink; Vries, 2011).
No caso da degradação do componente ramnogalacturano tipo I (que é
um polissacarídeo formado por uma cadeia principal de resíduos alternados de
ramnose e ácido galacturônico, unidos por ligações α-1,2 e α-1,4, e que contém
ramificações de cadeias galactose e arabinose ligadas aos resíduos de ramnose) a
degradação envolve várias endo e exoenzimas. Entre estas, destacam-se as
ramnogalacturano hidrolase (EC 3.2.1.-) e ramnogalacturano liase (EC 4.2.2.-) que
clivam as ligações α-1,2 entre os resíduos de ramnose e ácido galacturônico não
acetilados na cadeia principal. A degradação completa das cadeias laterais do
ramnogalacturano tipo I pode envolver a ação de endo e exogalactanases (enzimas
que hidrolisam as ligações β-1,4 entre resíduos de galactose), endo e
exoarabinanases (enzimas que hidrolisam as ligações α-1,5 entre resíduos de
arabinose), α-L-arabinofuranosidase, β-galactosidase e feruloil esterase (Koivula et
al., 2012; Van den Brink; Vries, 2011). Na Figura 6 é apresentado um esquema dos
sítios de atuação de algumas enzimas pectinolíticas sobre o homogalacturano e o
ramnogalacturano tipo I.
54
que auxiliam na modificação dos substratos e/ou facilitam a ação enzimática das
enzimas lignocelulolíticas. Nesta classe estão incluídas as solelinas e expansinas,
que são proteínas que não tem atividade catalítica, mas que possuem a capacidade
de se ligar as microfibrilas de celulose e enfraquecer as ligações de hidrogênio da
celulose cristalina, facilitando assim o acesso das endoglucanases (Mohanram et al.,
2013; Moreira; Milanezi; Ferreira Filho, 2011). Tem sido descrito que as soleninas
podem aumentar a eficiência catalítica das celulases e também auxiliar na redução
do tempo de hidrólise (Baker et al., 2000). Além das soleninas e expansinas, alguns
estudos recentes tem demonstrado que a degradação da celulose e de algumas
hemiceluloses também pode contar com a participação das chamadas
monooxigenases líticas de polissacarídeos (LPMOs). Essas enzimas fazem parte de
uma classe de enzimas auxiliares dependentes de íons metálicos divalentes, como o
cobre, que catalisam a degradação dos polissacarídeos através de um mecanismo
oxidativo que também pode envolver a enzima celobiose desidrogenase para a
geração de doadores de elétrons (Agger et al., 2014; Dutta; Wu, 2014).
Algumas celulases e hemicelulases podem ainda apresentar domínios
não catalíticos ligados à estrutura proteica dos seus núcleos catalíticos. Estes
domínios não catalíticos são sequências contínuas de resíduos de aminoácidos com
um discreto dobramento que têm a função de ancorar ou direcionar os núcleos
catalíticos dessas enzimas para os substratos alvo, permitindo assim associar-se a
substratos insolúveis e aumentar a sua eficiência de degradação. Estes domínios
não catalíticos podem ser domínios (ou módulos) de ligação a carboidratos (também
conhecidos como CBMs), módulos tipo fibronectina-3, doquerinas, domínios tipo
imunoglobulina ou domínios funcionalmente desconhecidos do tipo X (Schneider,
2014; Sweeney; Xu, 2012).
enzimas (Jurutu; Wu, 2013; Liu et al., 2013a; Maki; Leung; Qin, 2009; Sadhu et al.,
2014).
Na tentativa de reduzir os custos de produção, tem sido proposta a
utilização de subprodutos agroindustriais como fonte de carbono para a indução da
produção enzimática em substituição aos substratos comerciais, assim como a
realização de estudos de otimização das composições dos meios de cultura e das
condições de cultivo (Geetha; Gunasekaran, 2010; Haddar et al., 2012; Heck; Hertz;
Ayub, 2002; Kamble; Jadhav, 2012; Kumar; Satyanarayana, 2012; Nagar et al.,
2010).
Outra importante frente de pesquisa nesta área tem focado na
identificação de enzimas com características bioquímicas superiores, como por
exemplo, estabilidade em amplas faixas de temperatura e pH, maior eficiência
catalítica, especificidade para múltiplos substratos, maior tolerância a inibição pelos
produtos finais da hidrólise e também tolerância a inibição pelos produtos formados
na etapa de pré-tratamento. Neste caso, tem sido realizada a busca de genes de
enzimas lignocelulolíticas em genomas sequenciados, a construção e triagem
funcional de bibliotecas genômicas e metagenômicas e a avaliação de proteomas
(Alvarez, 2013; Buchli, 2014; Liu et al., 2013a; Mohanram et al., 2013; Sebastian et
al., 2013).
Na literatura há vários trabalhos que relatam a procura de enzimas
lignocelulolíticas com características especiais a partir de micro-organismos isolados
de diferentes ambientes através da construção de bibliotecas genômicas seguido da
triagem funcional dos clones utilizando diferentes substratos naturais e sintéticos.
Lima et al. (2005), por exemplo, identificaram a partir de uma biblioteca genômica da
linhagem de B. pumilus CL16 uma endo-β-1,4-glucanase da família GH9 com um
domínio de ligação a carboidratos tipo 3 (CBM3) que apresentava alta estabilidade
térmica e pH ótimo entre 5,0 e 8,0. Em outro estudo, Zhang et al. (2012) isolaram de
uma biblioteca genômica construída para a linhagem Bacillus sp. BG-CS10 uma
celulase com atividade de endoglucanase e glucomananase que se mostrou
termoestável e também halofílica.
Outra estratégia muito utilizada na busca de enzimas lignocelulolíticas
microbianas já conhecidas é o método de prospecção in silico. Este consiste no
desenho e síntese de oligonucleotídeos iniciadores baseados em sequências
gênicas disponíveis em bancos de dados públicos e na posterior utilização destes
63
para a amplificação de genes por reações de PCR. Lee et al. (2008) estudaram uma
xilanase termoestável de uma linhagem de B. licheniformis isolada de fontes termais
que foi amplificada por reação de PCR usando oligonucleotídeos iniciadores
desenhados a partir de varias sequências depositadas para xilanases do gênero
Bacillus. Em outro estudo, Mei et al. (2013) amplificaram o gene de uma pectinase
alcalina e termoestável de B. halodurans M29 utilizando oligonucleotídeos
iniciadores desenhados a partir de sequências gênicas de pectinases conhecidas de
outras linhagens microbianas.
Ainda com respeito à busca por enzimas lignocelulolíticas mais eficientes,
vários estudos também têm proposto o melhoramento dessas enzimas através da
engenharia de proteínas. Neste sentido, várias estratégias de biologia molecular têm
sido empregadas, como por exemplo, a mutagênese aleatória por PCR (error-prone
PCR), a recombinação gênica in vitro por embaralhamento de DNA (DNA shuffle), a
evolução dirigida de proteínas e a construção de enzimas quiméricas (Banerjee et
al., 2010; Mohanram et al., 2013; Silva, 2013).
Para aumentar os rendimentos dos processos de hidrólise enzimática,
otimizar os coquetéis enzimáticos utilizados e reduzir os custos destes, algumas
pesquisas recentes têm buscado o entendimento de quais enzimas e proteínas são
realmente importantes neste processo e os sinergismos existentes entre as
diferentes atividades catalíticas. Neste sentido, tem-se proposto o desenvolvimento
de coquetéis enzimáticos racionais assim como a suplementação dos coquetéis
fúngicos já existentes com atividades enzimáticas acessórias (Banerjee et al., 2010;
Bussamra; Freitas; Costa, 2015; Goldbeck et al., 2014; Liu et al., 2013a; Machado et
al., 2015; Van Dyk; Pletschke, 2012).
Dentre as enzimas acessórias que podem ser utilizadas na hidrólise da
lignocelulose destacam-se as arabinanases, α-L-arabinofuranosidases,
galactanases, pectinases, algumas liases e esterases, lacases e outras enzimas
oxidativas (Banerjee; Scott-Craig; Walton, 2010; Ekwe et al., 2013; Kudanga; Roes-
Hill, 2014; Van Dyk; Pletschke, 2012). Estas enzimas podem aumentar a eficiência
das hidrolases glicosídicas padrões (celulases e xilanases) através da promoção de
um modo alternativo para clivagem das ligações dos polissacarídeos ou pelo fato de
melhorarem a acessibilidade aos polissacarídeos (Banerjee; Scott-Craig; Walton,
2010; Mohanram et al., 2013).
64
Santos, 2010; Thakur et al., 2012). As lacases podem ser ainda utilizadas em
reações de síntese para obtenção de flavonóides, corantes têxteis, pigmentos
cosméticos, aldeídos aromáticos e pesticidas, e na fabricação de biossensores para
ensaios imunobioquímicos visando à detecção de oxigênio, glicose, aminas
aromáticas e compostos fenólicos (Thakur et al., 2012).
2.8. Conclusões
3. MATERIAL E MÉTODOS
nitrogênio ótima (m/v), pH 7,0, adicionado de 0,1 % (m/v ou v/v) destes compostos
separadamente. Todos os experimentos foram realizados em triplicata e as
atividades enzimáticas de xilanase foram acompanhadas periodicamente a cada 24
horas até 90 horas de fermentação.
Equação 1:
∆
O programa Statistica versão 7.0 (Statsoft) foi usado para definir a matriz
do DCCR, que consistiu de 14 combinações (8 pontos fatoriais e 6 pontos axiais)
mais 5 repetições na condição de ponto central, para estimar o erro experimental e
investigar a suscetibilidade do modelo proposto. As fermentações em cada ensaio
foram realizadas em duplicata sob as condições de cultivo descritas no item 3.2.2,
sendo a atividade enzimática de xilanase determinada após 24, 48 e 72 horas de
cultivo. Os resultados experimentais obtidos com 48 horas de fermentação foram
ajustados a uma função polinomial de segunda ordem e o teste t-Student foi
realizado para avaliar a significância estatística dos coeficientes de regressão. Os
coeficientes de regressão estatisticamente significativos a 95 % de confiança foram
utilizados para compor um modelo matemático capaz de prever a produção de
xilanase dentro das faixas estudadas para cada variável. A análise de variância
(ANOVA) foi realizada para avaliar a significância estatística do modelo matemático
gerado e o coeficiente de determinação (R2) foi calculado para verificar quanto da
variabilidade das respostas eram previstas pelo modelo. O modelo matemático
obtido foi posteriormente validado através do cultivo do micro-organismo em
triplicata no meio de cultura composto pela combinação das variáveis dentro de suas
faixas ótimas previstas no modelo.
meio de cultura foi ajustado para 7,0 antes de autoclavar e este não foi controlado
durante a fermentação. Foi realizada a adição de antiespumante (FluentCane 114,
Dow Chemical) ao meio de cultura à medida que houve a formação de espuma. A
atividade enzimática de xilanase foi acompanhada até 42 horas de fermentação,
sendo a análise realizada no sobrenadante do meio de cultura fermentado após
centrifugação a 10.000 x g por 10 minutos a 4 ºC. Este experimento foi realizado em
duplicata.
fosfato de sódio de sódio 100 mM, pH 6,0, e dialisadas contra água destilada,
utilizando membranas de celulose regenerada com corte de 3.500 Da (Membra-Cel
SERVA Electrophoresis), durante 24 horas a 4 ºC para a remoção do sal. Ao término
do processo de diálise, as amostras foram congeladas e concentradas em liofilizador
(Liotop, L101) durante 36 horas. As amostras liofilizadas de cada etapa do processo
de precipitação fracionada, denominadas de preparações enzimáticas concentradas,
foram ressuspendidas em tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 6,0, na concentração
de 10 mg/mL e utilizadas para determinação da atividade enzimática de xilanase e
do teor de proteínas solúveis totais.
3.4.5.2. Zimogramas
Visando identificar as bandas de proteínas separadas nos géis SDS-
PAGE do complexo multienzimático purificado que apresentavam atividade
enzimática para celulase, pectinase e xilanase, foram realizadas análises de
zimografia, como proposto por Van Dyk et al. (2009). Os géis de zimograma foram
preparados através da incorporação de 0,1 % (m/v) dos substratos CMC, pectina de
frutas cítricas ou xilana de madeira faia aos géis de separação de 12 % (m/v) de
poliacrilamida contendo SDS antes da sua polimerização. Foram aplicados em cada
canaleta do gel 2 μg de proteínas previamente diluídas em tampão de amostra
contendo SDS e β-mercaptoetanol e aquecidas por 5 minutos a 99 ºC. A corrida para
91
TATCATATGGCTTTTTGGGATACAAAA
BlAra TAGGATCCCTAATACTTCGGCCA
GG
TATAGCTAGCATGACTGTACACAAAG
BlAbf TATAGAATTCTCATTGTTTC
CGA’
TATAGCTAGCATGGGAACCGTTCTTT TATAGGATCCTCAAGGCGTGATTTTC
BlCel
TAT ACCT
TATATCATATGAAAAACGTGGTGGCT ATAGGATCCTCAATTTTTGAATGGTG
BlGal
GTT T
TATAGCTAGCATGAAACTTGAAAAATT
BlLac TATAGAATTCTTATTGATGAC
CG
TATCATATGGGGAGAAAAGGACAGAC ATAGGATCCTCATCATTTCTCTTACAA
BlRhg
ATGC GGAACGGTA
TATGCTAGCGCTTCGTCATCAAACCC ATAGGATCCTCAGCGGACCGTTACGT
BlXeg
GTCG CCCA
* As regiões sublinhadas nos oligonucleotídeos iniciadores correspondem aos sítios das enzimas de
restrição utilizadas. Os oligonucleotídeos iniciadores para os genes BlGal e BlXeg foram desenhados
a partir das sequências nucleotídicas obtidas nas ORFs dos insertos de DNA dos clones positivos na
biblioteca genômica de B. licheniformis CBMAI 1609
98
Equação 2: A=Ɛ*b*c
(Onde, A equivale à absorbância a 280 nm; Ɛ refere-se ao coeficiente de extinção molar da enzima
em M-1 cm-1; b é o comprimento do caminho óptico que a luz atravessa na solução em centímetros; c
é a concentração molar da proteína)
∗ ∗
Equação 3:
∗ ∗
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
37 ºC 45 ºC
Tabela 5 - Índices enzimáticos (IE) de alguns isolados de Bacillus sp. durante a avaliação
qualitativa em carboximetilcelulose, pectina e xilana
Cultivo em
Cultivo em Pectina Cultivo em Xilana
Isolado Carboximetilcelulose
IE 37 ºC IE 45 ºC IE 37 ºC IE 45 ºC IE 37 ºC IE 45 ºC
BH2 * 2,8 2,0 2,3 2,0 2,1 2,4
BH12 3,7 1,8 ND 3,3 ND ND
BH18 3,3 2,2 ND 3,3 ND ND
BH19 * 3,8 3,8 2,7 4,0 3,6 3,4
BH23 2,6 3,4 ND 2,0 ND ND
BH24 * 2,2 2,3 2,3 2,0 2,2 3,0
BH26 * 2,8 2,8 2,0 2,0 2,2 3,3
BH27 * 2,8 3,0 3,8 5,0 2,0 2,7
BH28 * 2,2 2,3 2,0 2,0 2,8 3,4
BH32 * 3,3 2,8 2,3 2,3 3,0 3,5
BH34 3,3 2,2 ND 3,3 ND ND
BH35 * 3,5 3,8 2,0 2,5 3,5 3,0
BH40 1,7 2,0 2,0 2,0 ND 2,8
BH41 * 2,8 3,5 2,7 2,3 3,3 3,8
BH43 1,5 1,3 1,7 3,0 ND ND
BH45 2,8 3,4 ND ND ND ND
BH47 * 2,7 2,9 2,7 3,3 3,0 3,8
BH48 3,0 2,3 ND ND ND ND
BH51 2,6 2,1 ND 3,3 ND ND
BH54 * 3,0 3,0 2,7 3,3 3,3 4,3
BH56 * 3,0 3,0 2,3 3,5 3,0 3,5
BH60 * 3,0 2,8 2,7 3,3 3,5 3,2
BH62 * 2,1 2,1 2,0 3,3 2,8 4,5
BH65 2,2 2,0 ND 2,7 ND ND
BH66 ND ND 1,7 1,7 1,5 1,8
BH73 2,0 ND ND 2,7 ND ND
BH74 2,8 2,8 ND ND ND ND
BH76 3,0 2,4 ND ND ND ND
BH77 3,0 2,4 ND ND ND ND
BH78 3,2 3,6 ND 1,3 ND ND
BH79 3,0 2,7 ND 1,3 ND ND
BH83 2,3 2,0 ND 2,7 ND ND
BH85 2,3 3,0 ND 2,3 ND ND
BH87 * 2,8 3,0 1,7 2,7 2,8 3,8
BH88 * 3,0 2,8 2,3 3,0 3,0 4,3
BH89 2,4 3,0 ND 2,0 ND ND
BH90 ND ND 1,7 1,7 1,3 1,8
BH92 * 2,0 1,6 2,0 1,3 1,7 2,3
BH93 * 2,0 1,5 4,5 3,3 1,4 1,8
BH98 3,0 2,3 ND 2,0 ND ND
BH99 * 2,3 2,0 1,3 2,3 2,5 2,7
BH100 3,0 2,8 ND ND ND ND
BH104 * 3,4 3,6 3,0 4,0 2,5 2,3
BH105 2,8 2,4 ND 3,0 ND ND
BH106 2,0 1,5 ND 3,0 ND ND
BH107 3,0 2,4 ND ND ND ND
(ND: halos de hidrólise não detectados). Os desvios padrões das duplicatas dos índices enzimáticos
oscilaram entre 0,1 e 0,15. Os isolados microbianos assinalados com um asterisco apresentaram a
formação de halos de degradação do substrato em todas as condições avaliadas.
116
maiores atividades após 48 horas e para os isolados BH24 e BH28 com atividade
máxima com 62 horas de cultivo. As atividades enzimáticas máximas de xilanase
oscilaram entre 0,057 U/mL (isolado BH99) e 0,389 U/mL (isolado BH54). Atividades
xilanolíticas superiores a 0,25 U/mL foram observadas para os isolados BH19 (0,270
U/mL), BH47 (0,305 U/mL), BH54 (0,389 U/mL), BH60 (0,382 U/mL) e BH93 (0,251
U/mL), todos com 24 horas de fermentação. Observou-se também para estes 5
isolados a diminuição da atividade enzimática após o pico de produção, que pode
ser devido a produção de proteases por estes isolados ou também devido à inibição
da enzima por produtos gerados durante a fermentação. Assim como nos cultivos
realizados em CMC e pectina, não foi observada correlação linear entre os
resultados de índice enzimático a 37 ºC e as atividades enzimáticas máximas
apresentadas pelos isolados nos cultivos em meio líquido. O valor do índice de
correlação linear neste caso foi de 0,453. Com relação ao teor de proteínas solúveis
totais no sobrenadante de cultivo, este parâmetro oscilou entre 0,012 (isolado BH92)
e 0,045 mg/mL (isolado BH54) nos picos de máxima produção enzimática (Tabela
6).
entre 3,10 e 7,19 U/mg de proteína ao final da fase estacionária de cultivo. Duarte et
al. (1999) ao avaliarem a produção de xilanases alcalinas por bactérias isoladas de
amostras de solo, identificaram 4 isolados como sendo B. pumilus e verificaram que
estes apresentaram atividades enzimáticas de xilanase, em pH 10,0, entre 1,22 e
3,98 U/mL e atividades específicas entre 12,7 e 41,1 U/mg de proteínas, após 48
horas de cultivo a 45 ºC e 230 rpm em frascos Erlenmeyer de 50 mL contendo 7 mL
de meio de cultura (1 % de xilana de bétula, 0,1 % de peptona, 0,1 % de Tween 80,
0,14 % de (NH4)2SO4, 0,03 % de ureia (m/v) e sais, pH 10,0).
126
* Os valores apresentados são as médias e desvios padrões de triplicatas. Valores seguidos de letras
diferentes diferem entre si pelo teste de Tukey a p < 0,05.
Figura 13 - Cinéticas de produção de xilanase pelos isolados BH19, BH47, BH54, BH60 e
BH93 durante fermentação submersa em meio de cultura contendo farelo de trigo
BH88
BH92
BH87
BH62
BH60
BH56
BH54
87
BH47
BH41
BH35
BH32
Grupo Bl
BH26
56
BH24
BH02
BH99
55 BH19
99 Bacillus sonorensis NBRC 101234 (AYTN01000016)
Bacillus licheniformis NBRC 12200 (NR113588)
Bacillus licheniformis ATCC14580 (AE017333)
69 Bacillus aerius 24K (AJ831843)
91 Bacillus licheniformis BCRC 11702 (NR116023)
BH28
Bacillus atrophaeus JCM9070 (AB021181)
Bacillus subtilis subsp. spizizenii NRRLB-23049 (CP002905)
58 Bacillus siamensis KCTC13613 (AJVF010043)
92
53 Bacillus vallismortis DV1-F-3 (JH600273)
Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42 (CP000560)
6660
68 Bacillus methylanotrophicus CBMB205 (EU194897)
Bacillus amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens DSM7 (FN597644)
96 Bacillus subtilis subsp. inaquosorum KCTC13429 (AMXN 01000021) Grupo Bs
Bacillus mojavensis RO-H-1 (JH600280)
Brevibacterium halotolerans DSM8802 (AM747812)
Bacillus tequilensis KCTC13622 (AYTO01000043)
Bacillus subtilis subsp. subtilis NCIB3610 (ABQL01000001)
BH27
BH93
62 BH104
98 Bacillus safensis FO-36b (ASJD01000027)
Bacillus pumilus ATCC7061 (ABRX01000007)
Bacillus stratosphericus 41KF2a (AJ831841)
99
97
Bacillus altitudinis 41KF2b (ASJC01000029)
98 Bacillus aerophilus 28K (AJ831844)
Bacillus xiamensis HYC-10 (AMSH0100014)
Bacillus acidicola 105-2 (AF547209)
Bacillus humi LGM22167 (AJ627210)
Bacillus circulans ATCC4513 (AY724690)
93 Bacillus megaterium IAM13418 (D16273)
Paenibacillus polymyxa ATCC842 (AFOX01000032)
0.01
Figura 17 – Árvore filogenética baseada nos dados dos perfis de restrição da região
intergênica 16S-23S do gene RNAr de isolados do gênero Bacillus com as enzimas de
restrição CfoI, HaeIII, RsaI e AluI
melhores resultados (0,46 U/mL) foram verificados com os farelos de soja e de trigo.
Nos cultivos realizados em meio de cultura contendo bagaço de cana-de-açúcar (in
natura ou submetido à pré-tratamentos) e madeira de eucalipto foi observado
visualmente o crescimento microbiano, porém foram obtidas baixas atividades
enzimáticas de xilanase. Uma possível explicação para a baixa produção de xilanase
observada nestes cultivos seria o baixo teor de hemicelulose e os altos teores de
lignina e celulose presentes nestes substratos (Tabela 9).
Figura 18– Efeitos de diferentes fontes de carbono sobre a produção de xilanase por B.
licheniformis CBMAI 1609
(XIL: xilana de madeira faia; BEX: bagaço de cana-de-açúcar tratado com explosão a vapor; BED:
bagaço de cana-de-açúcar tratado com explosão a vapor e deslignificação alcalina; BIN: bagaço de
cana-de-açúcar in natura; CEV: bagaço de cevada; LAR: bagaço de laranja; SOJ: farelo de soja; TRI:
farelo de trigo; EUC: madeira de eucalipto; MIL: palha de milho; SOJ+ARR: combinação farelo de
soja e farelo de arroz; SOJ+BEX: combinação farelo de soja e bagaço de cana-de-açúcar tratado
com explosão a vapor; SOJ+LAR: combinação farelo de soja e bagaço de laranja; SOJ+TRI:
combinação farelo de soja e farelo de trigo; TRI+BEX: combinação farelo de trigo e bagaço de cana-
de-açúcar tratado com explosão a vapor)
Figura 20 - Efeitos de diferentes sais minerais e aditivos sobre a produção de xilanase por
B. licheniformis CBMAI 1609
(CON: meio controle, composto de 0,1 % de K2HPO4, 0,05 % de MgSO4, 0,05 % de KCl, 0,5 % de
bagaço de laranja, 0,5 % de farelo de soja e 0,5 % de caseína (m/v))
80, SDS, glicerol, EDTA e Triton X. Kappor, Nair e Kuhad (2008) também relataram
o aumento da produção de xilanase e do teor de proteínas solúveis presentes nos
sobrenadantes de cultivo da linhagem B. pumilus MK001 quando se adicionou de
forma individual ao meio de cultura 0,2 % (m/v ou v/v) de Tween ou polietilenoglicol
(PEG).
No estudo realizado por Sharma, Adhikari e Satyanarayana (2007) sobre
os efeitos de íons metálicos e aditivos na produção de xilanase por Geobacillus
thermoleovorans foi verificado que a adição do íon Mg2+ e de Tween 80 aumentou a
produção da enzima e que esta foi inibida quando se adicionou ao meio de cultura
os íons Cu2+ e Co2+, EDTA, SDS, glicina e Triton X-100. Pham et al. (1998)
relataram que a presença de KH2PO4 no meio de cultura teve uma influência positiva
sobre a produção de xilanase e que a retirada de MgSO4 e de elementos traços da
composição do meio de cultura não afetou os níveis de produção da enzima por B.
polymyxa CECT 153. De forma similar, Sá-Pereira et al. (2002) relataram que a
adição de 1 mM de MnCl2 diminuiu a produção de xilanase pela linhagem de B.
subtilis utilizada no estudo, enquanto a adição de BaCl2 e FeCl2 promoveu uma
melhora na produção da enzima em relação ao meio de cultura controle.
(-1, 0 e 1: valores codificados das variáveis estudadas em cada um dos níveis de estudo). Os valores
apresentados entre parênteses referem-se aos valores reais utilizados em cada nível de estudo das
variáveis.
maiores produções de xilanase são obtidas quando se tem no meio de cultura uma
alta concentração de fonte de carbono.
(-1,68, -1, 0, 1, 1,68: valores codificados das variáveis estudadas em cada um dos níveis de estudo).
Os valores apresentados entre parênteses referem-se aos valores reais utilizados em cada nível de
estudo das variáveis.
Equação 4:
Atividade de xilanase (U/mL) = 5,592 + 0,524*(CAS) – 0,362*(CAS)2 +
0,737*(LAR) + 0,776*(SOJ) – 0,386*(LAR*SOJ)
xilanase não são explicadas pelo modelo matemático. Este valor de coeficiente de
determinação é considerado aceitável para processos biológicos e, portanto pode-se
concluir que o modelo obtido proporciona uma boa explicação da variação total das
respostas observadas.
A análise de variância (ANOVA), apresentada na Tabela 14, indicou que o
valor de F calculado da regressão (Fcal = 19,04) foi 6,2 vezes maior que o valor de F
tabelado (Ftab 0,05;5;13 = 3,03) e que a regressão foi estatisticamente significativa ao
nível de confiança de 95 % (p = 0,00001). O valor de F calculado da falta de ajuste
do modelo foi de 45,33, sendo este 7,5 vezes maior do que o valor de F tabelado
(Ftab 0,05;9;4 = 6,00). Verificou-se também que a falta de ajuste foi estatisticamente
significativa ao nível de 95 % de confiança (p = 0,001). Embora o modelo
matemático tenha apresentado uma evidência de falta de ajuste, não se rejeitou a
hipótese de que a equação da reta de regressão obtida fosse adequada para
descrever os dados, pois o erro puro observado foi muito pequeno (igual a 0,0075),
devido à baixa variação das respostas nos ensaios realizados na condição de ponto
central, e este acabou influenciando no valor elevado do F calculado para a falta de
ajuste em relação ao erro puro e no baixo p-valor observado. Desta forma, pode-se
concluir que o modelo matemático apresentado na Equação 4 foi válido e que pode
ser utilizado para prever as respostas de produção de xilanase pelo micro-organismo
com 72 horas de fermentação. Como apresentado na Tabela 12, as atividades de
xilanase previstas pelo modelo matemático tiveram boa correlação com as
atividades observadas experimentalmente, estando a grande maioria delas dentro
da margem de erro explicada pelo modelo.
(a)
(b)
(c)
Figura 21 – Superfícies de resposta e curvas de contorno da interação entre caseína e
bagaço de laranja (a), caseína e farelo de soja (b) e bagaço de laranja e farelo de soja (c)
na produção de xilanase por B. licheniformis CBMAI 1609
163
(-1,41, -1, 0, 1, 1,41: valores codificados das variáveis estudadas em cada um dos níveis de estudo).
Os valores apresentados entre parênteses referem-se aos valores reais utilizados em cada nível de
estudo das variáveis.
Equação 5:
Atividade de xilanase (U/mL) = 6,16 + 1,96*(TEMP) – 2,09*(TEMP)2 + 1,39*(AGIT) –
0,55*(AGIT)2 + 1,03*(TEMP*AGIT)
Adhyaru, Bhatt e Modi (2014), altas concentrações de inóculo não são requeridas
em processos fermentativos industriais, pois podem levar ao rápido consumo dos
nutrientes e a um menor crescimento microbiano e, consequentemente, resultar em
uma menor produção de enzimas. Por isso, segundo estes autores é importante um
balanço entre a proliferação de biomassa microbiana e os nutrientes disponíveis no
meio de cultura para se alcançar a máxima produção de enzimas. O pH do meio de
cultura pode alterar profundamente a produção de enzimas, o transporte de vários
compostos através da membrana celular assim como o crescimento microbiano e a
estabilidade das enzimas produzidas (Kapoor; Nair; Kuhad, 2008; Rehman, Qader;
Aman, 2012). Neste sentido, foram realizados estudos univariáveis para se
determinar as melhores condições destes dois parâmetros na produção de xilanase
por B. licheniformis CBMAI 1609 e os resultados obtidos estão representados nas
Figuras 23a e 23b.
neste período as células começaram a entrar na fase de morte celular, e ao final das
96 horas de fermentação foi obtida atividade de xilanase de 4,4 U/mL.
Durante o cultivo do micro-organismo no meio de cultura otimizado foi
verificada a diminuição na concentração de açúcares redutores simultaneamente
com o aumento do crescimento celular nas primeiras 24 horas do processo
fermentativo, indicando que estes açúcares possivelmente estavam sendo
consumidos pelo micro-organismo como substrato para o crescimento. Observou-se
também que as maiores produções de xilanase coincidiram com as menores
concentrações de açúcares redutores (aproximadamente 0,12 mg/mL) e que estas
permaneceram sem grandes alterações até o final do cultivo microbiano.
Quanto a concentração de proteínas solúveis totais, observou-se que o
meio de cultura tinha no início da fermentação um alto teor de proteínas (23 mg/mL),
sendo que grande parte deste conteúdo foi utilizado pelo micro-organismo nas 24
primeiras horas de cultivo e diminuiu para cerca de 4 mg/mL. Verificou-se que o teor
de proteínas voltou a aumentar com o aumento da produção de xilanase e
permaneceu entre 5 e 6 mg/mL no restante da fermentação. Com relação ao pH do
meio de cultura, foi observado que este aumentou durante toda a fermentação,
passando de 6,2 no início do cultivo para 9,3 ao final das 96 horas de fermentação.
horas de cultivo. Foi também observado neste estudo, que os açúcares presentes no
meio de cultura no início da fermentação foram consumidos pelo micro-organismo
para sustentar seu crescimento, sendo que a maior atividade de xilanase também
ocorreu nas menores concentrações de açúcar.
homogeneização dos nutrientes, assim como pela maior área superficial para
crescimento do micro-organismo. Segundo Humphrey (1998), normalmente, pode
ser observado um aumento no rendimento dos processos fermentativos nos cultivos
realizados em reatores, pois há um melhor controle dos parâmetros do processo em
comparação aos cultivos em frascos agitados.
Tagliari (1999) ao realizar um ensaio para o aumento da escala de
produção de xilanase por uma linhagem de B. pumilus também observou uma
melhora na produção de enzima. A produção de xilanase neste trabalho passou de
129 U/mL após 20 horas de cultivo em frascos Erlenmeyer de 50 mL com 12 mL de
meio de cultura otimizado, a 40 ºC e 230 rpm de agitação, para 173 U/mL com 10
horas de cultivo em reator de bancada de 2 litros contendo 1,5 litros de meio de
cultura otimizado, a 40 ºC e com nível de oxigênio dissolvido mantido em 50 % de
saturação.
Sharma, Adhikari e Satyanarayana (2007), ao realizarem um ensaio de
aumento da escala de produção de xilanase por Geobacillus thermoleovorans para
reator de 22 litros com 10 litros de meio de cultura otimizado, verificaram a
manutenção dos níveis de produção enzimática e a redução do tempo de cultivo
para a máxima produção em 30 horas (passando de 72 para 42 horas) quando
comparado aos resultados observados em frascos Erlenmeyer de 250 mL com 50
mL de meio de cultura.
Em outro estudo, Kapoor, Nair e Kuhad (2008) avaliaram a produção de
xilanase por B. pumilus MK001 através do cultivo em reator de 5 L contendo 2,5 L de
meio de cultura otimizado a 37 ºC, agitação entre 200 a 300 rpm, aeração de 0,5 a
2,0 vvm e pH controlado em 9,0. Os autores relataram um pequeno aumento na
produção de xilanase e a diminuição do tempo de cultivo para 32 horas em
comparação aos resultados alcançados previamente após 40 horas de cultivo em
frascos Erlenmeyer de 250 mL com 50 mL de meio de cultura a 37 ºC e 200 rpm de
agitação.
Kumar e Satyanarayana (2014), constataram um ligeiro acréscimo da
atividade de xilanase e a redução do tempo de fermentação de 48 horas para 36
horas de cultivo ao realizarem a ampliação da escala de produção de xilanase por B.
halodurans TSEV1 de frascos agitados para reator de bancada de 7 L com 4 L de
meio de cultura otimizado.
177
agitados, foi estimado um valor de R$ 4,02 por litro de meio de cultura, neste caso, a
produção de 1.000 U de xilanase teria um custo de aproximadamente R$ 0,50.
Considerando-se os resultados de atividade de xilanase alcançados em reator de
bancada utilizando o meio de cultura otimizado com 24 horas de cultivo (18,5 U/mL),
teria-se um custo de aproximadamente R$ 0,21 para a produção enzimática de
1.000 U de xilanase.
Comparativamente, o custo do litro do meio de cultura descrito por
Damiano et al. (2003) para a produção de xilanase por B. licheniformis 77-2,
composto de 1 % de extrato de carne, 1 % de peptona, 1 % de NaCl, 0,1 % de
KH2PO4, 0,5 % de Na2CO3 e 2 % de xilana comercial (m/v), foi estimado em R$
229,10. Utilizando este meio de cultura, os autores obtiveram, após 48 horas de
fermentação a 50 ºC e 150 rpm, atividades enzimáticas de xilanase de 46,47 U/mL,
o que corresponderia a um custo de R$ 4,93 para a produção de 1.000 U de
xilanase. Ainda neste trabalho, os autores realizaram a substituição da xilana
comercial do meio de cultura por bagaço de laranja e obtiveram atividades
enzimáticas de xilanase de 30,24 U/mL, neste caso o litro do meio de cultura foi
estimado em R$ 8,51 e o custo de produção de 1.000 U de xilanase reduzido para
R$ 0,28.
O custo estimado do meio de cultura, composto por 0,5 % de peptona,
0,5 % de extrato de levedura, 0,1 % de K2HPO4, 0,02 % de MgSO4, 0,2 % de
Na2CO3 e 0,5 % de xilana (m/v), utilizado por Yang, Zhuang e Jeffries (1995) para a
produção de xilanase por Bacillus sp. (V1-4) foi de R$ 59,05 por litro. Com este meio
de cultura foi observado, após 72 horas de cultivo, atividades enzimáticas de
xilanase de 15 U/mL, assim teria-se um custo de R$ 3,93 para a obtenção de 1.000
U de xilanase. Neste estudo, os autores também realizaram a substituição da xilana
comercial por 3 % (m/v) de farelo de trigo e obtiveram, após o mesmo período de
cultivo, atividades de xilanase de 22 U/mL, desta forma o custo estimado do litro do
meio de cultura foi reduzido para R$ 3,91 e o custo para produção de 1.000 U de
xilanase seria de aproximadamente R$ 0,18.
Já o custo do litro do meio de cultura utilizado na produção de xilanase
por uma linhagem de B. pumilus descrito por Tagliari (1999), que possuía em sua
composição 3 % de xilana comercial, 0,6 % de peptona, 0,15 % de (NH4)2SO4 e 0,1
% de KH2PO4 (m/v), foi avaliado em R$ 333,12. Neste trabalho os autores obtiveram
uma alta produtividade de xilanase e uma atividade enzimática de 173,3 U/mL após
180
para prevenir reações indesejadas; podem se ligar a enzima e ao substrato por meio
de ligações coordenadas e manter os grupos reativos na orientação tridimensional
requerida; podem simplesmente estabilizar a conformação cataliticamente ativa da
enzima (Palmer, 2007). Na Tabela 18 são apresentados os efeitos de diferentes íons
metálicos e dos compostos quelantes EDTA e EGTA na atividade enzimática do
sistema xilanolítico presente no extrato enzimático bruto da linhagem Bacillus
licheniformis CBMAI 1609.
Constatou-se que a atividade enzimática do sistema xilanolítico
apresentou uma tendência de inibição com a adição de ácido
etilenodiaminotetracético (EDTA), que é um conhecido composto complexante de
íons metálicos divalentes. Observou-se também uma pequena tendência de redução
(menos de 10 %) na atividade enzimática com a adição do composto EGTA (ácido
etilenoglicol-bis(2-aminoetileter)-N,N,N’,N’-tetracético), que é um quelante de íons
cálcio e também de íons divalentes. Como o efeito inibitório observado para os
compostos EDTA e EGTA foi menor que 40 %, pode-se considerar que o
requerimento de íons metálicos divalentes não é absoluto para a catálise enzimática
do sistema xilanolítico produzido por B. licheniformis CBMAI 1609.
A Tabela 18 ilustra que a atividade enzimática do sistema xilanolítico
apresentou um pequeno aumento na presença dos íons metálicos monovalentes K+,
Li+ e Na+, sendo verificado que a adição de 5 mM de KCl promoveu um aumento de
30 % na atividade enzimática em comparação ao controle. Foi também observada
uma tendência de ativação do sistema xilanolítico na presença dos íons metálicos
divalentes Ca2+, Mg2+ e Ni2+, sendo obtido um aumento de 85 % na atividade
enzimática com a adição de 5 mM de MgCl2.
Para os íons metálicos Co2+, Mn2+, Fe3+ foi verificada uma tendência de
inibição da atividade enzimática nas duas concentrações avaliadas, sendo
observadas atividades enzimáticas residuais de 75, 30 e 10 %, respectivamente, na
presença destes íons. Por outro lado, a atividade enzimática do sistema xilanolítico
de B. licheniformis CBMAI 1609 foi fortemente inibida pelos íons metálicos Cu2+ e
Zn2+ nas duas concentrações avaliadas. A inibição enzimática por estes dois íons,
que reagem preferencialmente com grupos tióis causando sua oxidação, sugere a
possível presença de resíduos de cisteína no sítio ativo do sistema xilanolítico
avaliado, assim como relatado para outras xilanases microbianas (Adhyaru; Bhatt;
Modi, 2014; Prakash et al., 2012; Saleem et al., 2012).
190
Diante dos resultados obtidos nos testes realizados para purificação das
hidrolases glicosídicas presentes no extrato enzimático bruto e após uma breve
análise da literatura sobre o assunto (Jones; Van Dyk; Pletschke, 2012; Pason et al.,
2010; Tachaapaikoon et al., 2012b; Van Dyk et al., 2009), foi sugerido que o micro-
organismo B. licheniformis CBMAI 1609 poderia estar produzindo a maioria das suas
hidrolases glicosídicas na forma complexada, semelhante aos complexos
195
Sobrenadante final
250 0,57 115 0,005 < 0,01 0,04
da precipitação
* Preparações enzimáticas concentradas por precipitação fracionada com sulfato de amônio nas
concentrações de 40, 60 e 80 % de saturação, respectivamente. Após o processo de diálise e
liofilização, essas amostras foram ressuspendidas em tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 6,0, na
concentração final de 10 mg/mL.
picos, denominados D1, D2, D3 e D4. A análise por gel nativo das frações coletadas
dos 4 picos de proteínas separados pela coluna DEAE Sepharose também revelou a
separação do possível complexo multienzimático das demais proteínas presentes na
amostra injetada na coluna, sendo este encontrado praticamente puro nos dois
primeiros picos de eluição das proteínas (picos D1 e D2). Foi também observado
que o possível complexo multienzimático de B. licheniformis CBMAI 1609 está
presente em maior concentração na amostra do pico D1. A análise das amostras dos
outros dois picos desta purificação (picos D3 e D4) por eletroforese em gel nativo
revelou a presença de várias bandas de proteínas de menor tamanho e também a
existência de bandas de proteínas com alta massa molecular.
Pico D1
2,7 0,27 0,13 2,07 1,23 0,14
Superdex 200
Figura 39 – Análise eletroforética por SDS-PAGE das amostras dos picos de eluição das
proteínas obtidos nas purificações em colunas de troca aniônica DEAE Sepharose Fast Flow
e de exclusão molecular Superdex 200 10/300 GL
(M: marcador de massa molecular; 1: preparação enzimática concentrada com 60 % de sulfato de
amônio; 2: amostra proteínas pico D1; 3: amostra proteínas pico D2; 4: amostra proteínas pico D3; 5:
amostra proteínas pico D4; 6: amostra proteínas pico D1 após cromatografia de exclusão molecular)
ainda maiores, sendo estas compostas por até 50 subunidades proteicas (Schwarz,
2001).
A composição do complexo multienzimático purificado neste trabalho
aparentemente apresentou algumas similaridades com o complexo multienzimático
isolado por Van Dyk et al. (2010) a partir do sobrenadante de cultivo da linhagem B.
licheniformis SVD1 em meio de cultura contendo xilana como substrato indutor. Os
autores observaram que este complexo multienzimático apresentava massa
molecular de 2.000 kDa e a análise deste por SDS-PAGE revelou a presença de 17
proteínas com tamanho entre 19 e 79 kDa na sua constituição.
No estudo realizado por Jones, Van Dyk e Pletschke (2012) foi observado
que as duas isoformas do complexo multienzimático de B. subtilis SJ01 também
eram formadas por subunidades proteicas menores que 100 kDa, sendo a maior
isoforma desse complexo multienzimático, com 371 kDa, composta de 16 proteínas
enquanto a menor isoforma, com 267 kDa, era formada por 18 proteínas.
Comparativamente, Pason, Kyu e Ratanakhanokchai (2006) relataram
que uma das isoformas do complexo multienzimático produzido por Paenibacillus
curdlanolyticus B-6, quando este foi cultivado em meio de cultura contendo xilana,
apresentava massa molecular de 1.450 kDa e era composta por 8 subunidades
proteicas com massa molecular entre 48 e 224 kDa. Em outro estudo,
Tachaapaikoon et al. (2012b) constataram que o complexo multienzimático de
Paenibacillus sp. TW1 apresentava aproximadamente 1.950 kDa e era formado por
18 subunidades proteicas com massa molecular entre 17 e 271 kDa.
Por outro lado, o complexo multienzimático celulolítico isolado por Wang,
Chen e Hseu (2014) a partir do sobrenadante de cultivo do fungo anaeróbico
Neocallimastix patriciarum J11 apresentava massa molecular de 670 kDa e análise
por SDS-PAGE revelou que este era constituído por 12 proteínas com tamanho
entre 28 e 250 kDa. No estudo realizado por Ponpium, Ratanakhanokchai e Kyu
(2000), foi detectado que o complexo multienzimático do tipo celulossomo de
Bacteroides sp. P-1 apresentava massa molecular de aproximadamente 1.400 kDa
e era formado por 12 subunidades proteicas com massa molecular entre 49 e 209
kDa. Lamed, Setter e Bayer (1983) relataram que o complexo multienzimático do tipo
celulossomo produzido por Clostridium thermocellum possuía massa molecular
maior que 2.000 kDa e era composto de 14 proteínas que apresentavam massa
molecular entre 20 a 250 kDa.
213
análise por SDS-PAGE (Figura 39) tinha revelado a perda de proteínas do complexo
multienzimático durante o passo de exclusão molecular, no entanto, não foram
observadas alterações nos perfis de presença de bandas ativas nas duas amostras
do complexo multienzimático nas análises de zimografia realizadas. O zimograma
em pectina também foi realizado e neste caso foi detectada a presença de uma
banda com atividade de pectinase nas duas amostras (dados não apresentados).
Comparativamente, Van Dyk et al. (2010) relataram a presença de duas
endoglucanases, sete xilanases, duas mananases e uma pectinase no complexo
multienzimático da linhagem B. licheniformis SVD1 através de análises de
zimografia. No estudo realizado por Kim e Kim (1993) foi constatado por meio de
zimogramas que a isoforma do complexo multienzimático de B. circulans com 669
kDa apresentava 5 celulases e 2 xilanases, já a isoforma com 443 kDa era composta
por 3 celulases e 4 xilanases.
No trabalho realizado por Jones, Van Dyk e Pletschke (2012), foi
verificado através de zimogramas em xilana que as duas isoformas do complexo
multienzimático de B. subtilis SJ01 apresentavam cinco xilanases com a mesma
massa molecular em sua composição. Esses autores também avaliaram a presença
de celulases através de zimogramas em CMC e Avicel, no entanto, não detectaram
nenhuma banda de proteína ativa sobre estes substratos.
Por outro lado, as análises de zimografia realizadas por Pason, Kyu e
Ratanakhanokchai (2006) e Waeonukul et al. (2009) revelaram que a maior isoforma
do complexo multienzimático produzido por Paenibacillus curdlanolyticus B-6 era
composta por 5 celulases e 7 xilanases, quando o micro-organismo era cultivado em
xilana. Porém, quando esse mesmo micro-organismo foi cultivado em meio de
cultura contendo Avicel constatou-se nesta isoforma do complexo multienzimático a
presença de 10 celulases e 11 xilanases. Em outro estudo, Phitsuwan et al. (2012)
relataram que o complexo multienzimático associado as células do micro-organismo
Tepidimicrobium xylanilyticum BT14 apresentava 4 xilanases e uma celulase em sua
composição.
O número de bandas ativas visualizadas nos zimogramas no presente
trabalho foi menor em comparação com alguns trabalhos na literatura sobre
complexos multienzimáticos e pode não representar o número real de proteínas com
atividade catalítica sobre os substratos avaliados. Este fato pode ter sido em
decorrência da baixa concentração de proteínas nas amostras que foram aplicadas
216
nos géis e também pela inativação das enzimas devido ao tempo de exposição à
alta temperatura na presença de SDS e β-mercaptoetanol para dissociação das
proteínas do complexo multienzimático. A realização de ensaios posteriores de
análise proteômica poderá revelar a existência de mais xilanases, celulases,
pectinases e outras enzimas na composição deste complexo multienzimático.
Foi realizado também no presente estudo um ensaio qualitativo de
especificidade enzimática com o objetivo de avaliar a capacidade de hidrólise de
diferentes substratos polissacarídicos e assim identificar as possíveis atividades
enzimáticas presentes no complexo multienzimático purificado de B. licheniformis
CBMAI 1609 e nas outras amostras proteicas obtidas durante os passos de
purificação. A Figura 41 ilustra o resultado desse teste de especificidade enzimática
com os diferentes substratos avaliados. Neste ensaio enzimático o tempo de reação
precisou ser alterado para 3 horas devido ao baixo teor de proteínas utilizado
(aproximadamente 0,05 μg de proteína para cada amostra).
A preparação enzimática concentrada com 60 % de sulfato de amônio foi
capaz de hidrolisar os substratos arabinana desramificada, arabinana de beterraba
sacarina, arabinoxilana, xilana, CMC, β-glucano, liquenano, manana, pectina,
xiloglucano e galactana, indicando a possível presença nesta amostra das atividades
enzimáticas de arabinanase, α-L-arabinofuranosidase, xilanase, endoglucanase,
liquenase, mananase, poligalacturonase, xiloglucanase e galactanase. Essa amostra
proteica só não foi capaz de hidrolisar o substrato laminarina, indicando a possível
ausência da atividade enzimática de laminarinase (β-1,3-glucanase). A atividade de
laminarinase também não foi observada em nenhuma das demais amostras
proteicas obtidas nos passos da purificação cromatográfica do complexo
multienzimático.
As amostras dos picos D1 e D2 da purificação em coluna de troca
aniônica DEAE Sepharose, que tinham apresentado no gel nativo apenas uma única
banda proteica de alta massa molecular, apresentaram basicamente todas as
atividades enzimáticas descritas anteriormente na preparação enzimática
concentrada com 60 % de sulfato de amônio. Essas duas amostras só diferiram
entre si pela ausência da atividade enzimática de mananase e pela aparente menor
atividade de poligalacturonase na amostra do pico D1. As amostras dos picos D3 e
D4 da purificação em coluna de troca aniônica DEAE Sepharose também
apresentaram semelhanças entre si quanto à presença das enzimas avaliadas,
217
O vetor pUC19 foi escolhido para ser utilizado nesta etapa do trabalho
pelo fato de ser um dos vetores plasmidiais mais utilizados em clonagens e na
construção de bibliotecas genômicas microbianas. Este possui as vantagens de ser
relativamente pequeno (contém somente 2.686 pb), ser estavelmente mantido em
células de E. coli com um número relativamente elevado de cópias, permitir a
222
Figura 48 – Análise de domínios conservados para uma das ORFs encontradas no inserto
de DNA do clone D12 através da ferramenta Conserved Domains
Assim como ocorreu para os clones M7, N18 e L18, o inserto de DNA do
clone K3 também não foi totalmente sequenciado utilizando os oligonucleotídeos
iniciadores M13F e M13R. No entanto, foram localizadas nas sequências de
nucleotídeos das extremidades do inserto gênico deste clone duas ORFs,
denominadas de ORF1 e ORF2. A ORF1 apresentou 956 nucleotídeos e foi predito
que a mesma codificava um polipeptídeo de 318 aminoácidos, que apresentava
99 % de identidade com sequências depositadas para a enzima β-galactosidase de
algumas linhagens do gênero Bacillus (número de acesso no NCBI das sequências
com maior identidade: WP023856854.1, WP026580391.1, KFM84596.1 e
WP020453573.1). Foi também constatado que a ORF1 apresentava domínios
conservados para a família 42 das hidrolases glicosídicas (GH42), como ilustrado na
Figura 49a. A atividade enzimática mais comum na família GH42 é a de β-
galactosidase (EC 3.2.1.23), mas também podem ser encontradas nesta família
enzimas com atividade de α-L-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) e β-D-fucosidase
(EC 3.2.1.38) (Moracci, 2015). Este gene foi então denominado de BlGat.
Quanto à ORF2, foi verificado que essa possuía 423 bp e codificava um
polipeptídeo de 140 aminoácidos. A comparação da sequência de aminoácidos
228
(a)
(b)
Figura 49 - Análise de domínios conservados para a ORF1 (a) e ORF2 (b) encontradas no
inserto de DNA do clone K3 através da ferramenta Conserved Domains
fragmento de DNA com o tamanho esperado para este gene sem o peptídeo sinal,
que era de 699 bp (canaletas 1 e 2). A amplificação do gene BlGal também foi
realizada com sucesso, sendo observada a presença de uma única banda no gel de
agarose com o tamanho próximo ao esperado de 1.275 bp (canaleta 4 e 5).
Figura 50 – Eletroforese em gel de agarose dos produtos das amplificações por PCR dos
genes BlGAl e BlXeg de B. licheniformis CBMAI 1609
(M: 1 kb Plus DNA Ladder (Invitrogen); 1 e 2: gene BlXeg; 3 e 4: gene BlGal)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
Figura 52 - Análise de domínios conservados para os genes BlAra (a), BlAbf (b), BlCel (c),
BlRhg (d) e BlLac (e) da linhagem B. licheniformis ATCC 14580 através da ferramenta
Conserved Domains
Figura 53 – Eletroforese em gel de agarose dos produtos das amplificações por PCR dos
genes BlAra, BlAbf, BlCel, BlRhg e BlLac a partir do DNA genômico da linhagem B.
licheniformis CBMAI 1609
(M: 1 kb Plus DNA Ladder (Invitrogen); 1: gene BlAra; 2: gene BlRhg; 3: gene BlCel; 4: gene BlLac; 5:
gene BlAbf)
depositada para este gene da linhagem B. licheniformis ATCC 14580. Foi também
constatada a presença de várias mutações pontuais no gene BlRhg clonado. O
sequenciamento de outro clone positivo contendo a construção do gene BlRhg no
vetor pET-28a(+) foi realizado e este confirmou o resultado observado
anteriormente. Possivelmente, algumas dessas mutações podem ter sido inseridas
pela Taq DNA polimerase durante o processo de amplificação desse gene para a
clonagem. Essas mutações no gene BlRhg ocasionaram a geração de vários códons
que sinalizam o fim da síntese proteica (stop códons) no meio da sequência de
aminoácidos predita para a enzima codificada por este gene. Um teste para avaliar a
expressão da enzima ramnogalacturonase pelo gene BlRhg foi realizado utilizando
as linhagens E. coli BL21 e pRare2, mas como era previsto, não foi observada a
expressão proteica devido a presença dos stop códons no meio da sequência. A
caracterização desta enzima não foi conduzida no presente trabalho, pois são
necessários outros estudos para solucionar os problemas encontrados na clonagem
deste gene.
Os estudos para a expressão heteróloga, purificação e caracterização da
enzima arabinanase codificada pelo gene BlAra da linhagem B. licheniformis CBMAI
1609 também não foram realizados no presente trabalho, pois a sequência de
aminoácidos predita para esta enzima era muito similar a sequência de aminoácidos
predita para a arabinanase de B. licheniformis ATCC 14580, cujo estudo de
caracterização e aplicação já estava sendo conduzido pelo nosso grupo de pesquisa
(Machado et al., 2015).
valores obtidos para estas duas constantes foram 555,8 s-1 (± 47,10) e 241,6 s-1 mg-1
mL (± 27,90), respectivamente.
molécula de enzima (ou sítio ativo) por unidade de tempo quando a enzima está
totalmente saturada pelo substrato (Voet; Voet, 2013). O valor estimado para este
parâmetro no presente estudo foi 2,3 vezes maior que o observado para a
galactanase de Geobacillus stearothermophilus T-6, que foi de 240 s-1 (Tabachnikov;
Shoham, 2013). Por outro lado, Braithwaite et al. (1997) relataram que os valores de
Kcat da galactanase de Pseudomonas fluorescens subsp. cellulosa nos substratos
galactana de tremoço-amarelo e azo-galactana foram 681 s-1 e 326 s-1,
respectivamente.
O parâmetro cinético Kcat/Km é considerado uma das melhores maneiras
de se comparar enzimas diferentes, pois relaciona a eficiência catalítica da enzima
com a sua afinidade pelo substrato. Consequentemente, quanto maior for esta
relação melhor é a atuação da enzima sobre um determinado substrato (Nelson;
Cox, 2014; Voet; Voet, 2013). Foi verificado que a galactanase de B. licheniformis
CBMAI 1609 apresentava uma eficiência catalítica (Kcat/Km) para hidrólise de
galactana de batata cerca de 5 vezes menor que a observada para a galactanase de
Geobacillus stearothermophilus T-6, cujo valor foi de 1.200 s-1 mg-1 mL
(Tabachnikov; Shoham, 2013). Não foram encontrados na literatura consultada
outros valores de Kcat/Km de galactanases para uma comparação mais detalhada da
eficiência catalítica da enzima estudada na hidrólise de galactanas.
Na tentativa de identificar os produtos formados e confirmar o modo de
ação da galactanase de B. licheniformis CBMAI 1609, foram realizadas análises de
eletroforese capilar utilizando amostras recolhidas durante a reação de hidrólise do
substrato galactana de batata. Na Figura 60 são apresentados os eletroferogramas
do padrão galactose e dos produtos formados durante a hidrólise do substrato
galactana de batata pela galactanase estudada ao longo de 16 horas de reação. No
início da hidrólise (tempo 0 h) foi identificado apenas o pico referente ao fluoróforo
APTS. Após 30 minutos de reação sob as condições ótimas de atividade enzimática
foi observado que a galactanase de B. licheniformis CBMAI 1609 possivelmente
atuava sobre as ligações glicosídicas internas da cadeia da galactana liberando
principalmente galactotetraose (G4) como produto de hidrólise. No decorrer do
tempo de hidrólise até o final do período de reação de 16 horas, foi verificada a
diminuição do pico de galactotetraose e a formação dos produtos galactotriose (G3),
galactobiose (G2) e galactose (G1). Aparentemente esta enzima tem como produtos
finais principalmente galactose e galactotriose. A identificação dos possíveis picos
251
e de tamanho que existem nas alças de ligação ao substrato, como foi observado
por Ryttersgaard et al. (2004).
histidina (68), triptofano (69), ácido aspártico (108), triptofano (110), metionina (128),
glicina (137), triptofano (168) e fenilalanina (216).
1999; Sinitsyna et al., 2010; Song et al., 2013). Gloster et al. (2007) e Liu et al.
(2004), por exemplo, relataram que a endoglucanase/xiloglucanase de B.
licheniformis ATCC 14580 e uma endoglucanase da família GH12 de B. licheniformis
GXN151 apresentavam massas moleculares iguais a 26 e 29 KDa, respectivamente.
A expressão heteróloga da enzima codificada pelo gene BlXeg clonada no
vetor pET-28a(+) foi avaliada utilizando as linhagens E. coli BL21(DE3),
BL21(DE3)pRare2, Rosseta-gami-2(DE3) e Artic express (DE3) sob as condições
descritas no item 3.3.4. Os géis de eletroforese SDS-PAGE apresentados na Figura
63 ilustram os resultados desses testes de expressão.
Observou-se pelas análises eletroforéticas que a enzima de interesse foi
expressa no citoplasma das 4 linhagens de E. coli sob as condições de cultivo
utilizadas após a indução com IPTG. A massa molecular da proteína expressa foi
estimada, a partir da relação gráfica Rf (fator de retenção) x log da massa molecular
dos padrões de proteínas utilizados, em aproximadamente 27 KDa. Este valor de
massa molecular foi próximo ao valor predito pela ferramenta Protparam.
Foi verificado ainda um alto nível de expressão proteica quando foi
utilizada a linhagem E. coli BL21(DE3)pRare2, seguido pelas linhagens BL21(DE3) e
Artic Express (DE3) (canaletas 2 dos géis). Quantidades semelhantes da enzima na
forma solúvel foram observadas para as 4 linhagens ao final do período de indução
com IPTG (canaletas 4 dos géis). Testes de atividade enzimática com os substratos
CMC e xiloglucano de tamarindo foram realizados e confirmaram que a enzima
expressa estava ativa nos sobrenadantes do processo de lise celular das 4
linhagens utilizadas para a expressão proteica.
A densidade óptica a 600 nm das culturas microbianas também foi
acompanhada durante os cultivos e indicou que a linhagem E. coli
BL21(DE3)pRare2 teve o melhor crescimento e consequentemente gerou uma maior
quantidade de massa celular ao final da expressão (dados não apresentados). A
partir desses resultados, foi selecionada essa linhagem de E. coli para a expressão
da enzima em maior volume sob as mesmas condições utilizadas nos testes de
expressão. Uma possível explicação para os melhores resultados de expressão com
esta linhagem pode ser o fato de que o plasmídeo pRare2 dispõe de genes que
codificam RNAt para vários códons raros, com isso a expressão deixou de ser
limitada pelos códons especificamente utilizados pela E. coli (Alvarez, 2013).
257
Foi verificado que a enzima codificada pelo gene BlXeg apresentava alta
especificidade enzimática para os substratos xiloglucano de tamarindo e β-glucano
de cevada. Não foram constatadas diferenças estatísticas nos resultados obtidos
sobre estes dois substratos ao nível de significância de 5 %. O β-glucano de cevada
é um polissacarídeo estruturalmente similar à celulose, sendo formado por unidades
de glicose unidas por ligações glicosídicas do tipo β-1,4 e também β-1,3 na
proporção 2:1, e esse normalmente é hidrolisado por endoglucanases. Foi verificado
ainda que a enzima apresentou 50 e 6 % de atividade enzimática relativa sobre os
polissacarídeos liquenano e CMC, respectivamente. Essa menor atividade
enzimática observada sobre esses dois substratos pode ter sido em decorrência de
uma menor interação enzima-substrato por causa da maior proporção de ligações
glicosídicas β-1,3 em relação às ligações β-1,4 dos resíduos de glicose no liquenano
(2,3 - 2,7:1) e o grau de metilação da celulose no CMC. Para os demais substratos
avaliados foram verificadas atividades enzimáticas relativas abaixo de 1 % ou nulas.
O fato da enzima não ter atuado sobre o substrato laminarina indica que ela não é
capaz de hidrolisar ligações do tipo β-1,3 entre resíduos de glicose.
mais ativa. Em outro estudo, Master et al. (2008) verificaram que a xiloglucanase de
A. niger mostrava atividade ótima para degradação do xiloglucano de tamarindo na
faixa de temperatura entre 50 e 60 ºC. Os resultados obtidos no presente estudo
diferiam dos observados para as xiloglucanases de Rhizomucor miehei que tiveram
atividade máxima entre 60 e 65 ºC (Song et al., 2013). Por outro lado, a temperatura
ótima de atividade da xiloglucanase de B. licheniformis CBMAI 1609 foi mais elevada
do que o observado por Araújo (2013) para a xiloglucanase da família GH74 de
Xanthomonas campestris, a qual mostrou atividade máxima a 42 ºC.
foram observadas alterações nos produtos formados após a incubação por períodos
de tempo mais longos (Figura 69). Resultados semelhantes aos observados neste
trabalho foram relatados para as xiloglucanases estudadas por Damásio et al.
(2012), Gloster et al. (2007), Grishutin et al. (2004), Master et al. (2008).
purificação. Foi verificado que a enzima foi eluída praticamente pura da coluna de
afinidade em um único pico durante a realização do gradiente de imidazol no tampão
de corrida, com aproximadamente 150 mM de imidazol (canaleta 2 do gel). As
frações coletadas neste pico com atividade enzimática sobre os substratos β-
glucano e CMC foram utilizadas na etapa de purificação na coluna de exclusão
molecular, que permitiu a separação da proteína de interesse de alguns poucos
interferentes que havia na amostra e a obtenção desta com alto grau de pureza
(canaleta 3 do gel). Verificou-se também que a enzima recombinante purificada
apresentava massa molecular de aproximadamente 60 kDa, que é um valor próximo
do predito com o auxílio da ferramenta ProtParam.
6,5 e em temperaturas entre 50 e 55 ºC. Wong et al. (2010) relataram que uma
xiloglucanase GH5, obtida de uma biblioteca genômica construída a partir de
bactérias de rúmen bovino, apresentava atividade relativa aproximada de 70% para
a hidrólise do xiloglucano na faixa de pH entre 5,0 e 8,0 e em temperaturas entre 20
e 60 ºC, sendo a atividade ótima verificada entre 40 e 50°C e em pH 7,0.
A estabilidade da endoglucanase GH5 de B. licheniformis CBMAI 1609
em diferentes valores de pH e temperatura também foi avaliada e os resultados
obtidos estão representados na Figura 78. A atividade enzimática residual neste
caso foi determinada utilizando o substrato xiloglucano de tamarindo nas condições
ótimas de atuação da enzima sobre esse substrato. Quanto ao pH de estabilidade,
foi verificado que essa endoglucanase GH5 era estável em uma ampla faixa de pH,
de 4,0 a 10,0. Neste intervalo de pH foi observada a manutenção de mais de 75 %
da atividade enzimática inicial após 24 horas de incubação a 4 ºC. Constatou-se
também que a enzima foi instável após incubação em pH ácido (pH 2,0 e 3,0). Com
relação ao efeito da temperatura na estabilidade, foi observado que essa
endoglucanase reteve 100 % da sua atividade enzimática inicial após 1 hora de
incubação em pH 6,5 nas temperaturas entre 25 e 55 ºC. A enzima manteve 72 %
de atividade residual após tratamento térmico por 1 hora a 60 ºC e foi
completamente inibida quando incubada em temperaturas acima de 65 ºC.
Em comparação com os resultados obtidos para a endoglucanase GH12
(item 4.4.4), a endoglucanase GH5 mostrou-se mais estável quanto aos efeitos do
pH e da temperatura. Com relação a literatura, não foram observadas grandes
diferenças na estabilidade da enzima estudada em relação a outras endoglucanases
e xiloglucanases da família GH5. Venditto et al. (2015), por exemplo, verificaram que
a endoglucanase de B. halodurans foi estável após 30 minutos de incubação em
temperaturas abaixo de 50ºC e que a enzima era também inibida acima de 60 ºC.
Por outro lado, a xiloglucanase caracterizada por Wong et al. (2010) reteve mais de
90 % da sua atividade inicial após 16 horas de incubação a 25 ºC em valores de pH
entre 5,0 e 9,0 e após 10 minutos de incubação em temperaturas abaixo de 50 ºC.
Em outro estudo, Bischoff, Liu e Hughes (2007) relataram que uma
endoglucanase GH5 de B. licheniformis B-41361 reteve mais de 80 % da sua
atividade enzimática inicial após 1 hora de incubação a 55 ºC em valores de pH
entre 4,5 e 8,0. Esta enzima mostrou-se estável em temperaturas de até 55ºC após
1 hora de tratamento térmico e reteve somente 10 e 5 % da atividade inicial quando
280
(Koschorreck; Schmid; Urlacher, 2008; Wang et al., 2015). O centro ativo das
lacases, geralmente, contém 4 íons de cobre, os quais com base na sua
coordenação e propriedades espectroscópicas são classificados em 3 tipos (T1, T2 e
T3). O cobre tipo 1 (T1) é um centro mononuclear onde ocorre a ligação e oxidação
do substrato. Este cobre confere à enzima a coloração azul, típica de proteínas
multicobre, que é resultante da intensa absorção eletrônica próxima a 610 nm
causada pela ligação covalente entre este íon de cobre e um resíduo de cisteína. O
cobre tipo 2 (T2) também é um centro mononuclear, porém não é detectável
espectrofotometricamente na região visível. O cobre tipo 3 (T3) é um centro
binuclear, onde dois íons de cobre estão ligados por uma ligação hidroxila, e que
apresenta fraca absorção próximo a 330 nm. Os íons de cobre T2 e T3 formam um
centro trinuclear, coordenados por resíduos de histidinas, onde o oxigênio se liga e é
reduzido à água (Claus, 2004; Furtado, 2009).
Esta enzima está amplamente distribuída entre plantas, insetos, fungos e
bactérias. Contudo, as lacases de origem bacteriana são ainda pouco estudadas e
usadas em processos industriais, pois o seu rendimento de produção e potencial
redox são menores do que os das lacases fúngicas (Lu et al., 2012). Contudo, as
lacases bacterianas possuem propriedades interessantes para aplicação industrial,
como alta termotolerância, manutenção de altos níveis de atividade em condições
neutras à alcalinas, independência de cofatores enzimáticos, são produzidas em
meios baratos e em menor tempo de cultivo e também podem ser facilmente
expressas de forma heteróloga e modificadas geneticamente (Loncar et al., 2013; Lu
et al., 2012; Reiss; Ihssen; Thony-Meyer, 2011).
A mais conhecida e estudada lacase bacteriana até hoje é a CotA de B.
subtilis, essa enzima é um componente da capa do endósporo bacteriano que
possui similaridades com outras multicobre oxidases e está associada com a
biossíntese de melanina e com a resistência do esporo à luz ultravioleta e ao
peróxido de hidrogênio (Guan et al., 2014b). No presente trabalho o gene de uma
lacase CotA em B. licheniformis CBMAI 1609 foi amplificado e clonado no vetor pET-
28a(+) para a realização de estudos de expressão heteróloga, purificação e
caracterização desta enzima.
A sequência de nucleotídeos do gene da lacase clonada de B.
licheniformis CBMAI 1609 apresentou 93 % de identidade com a sequência de
nucleotídeos depositada para a CotA de B. licheniformis ATCC 14580. A
288
(a)
(b)
Figura 84 – Géis de eletroforese SDS-PAGE para avaliação da expressão da lacase
codificada pelo gene BlLac de B. licheniformis CBMAI1609 nas linhagens E. coli BL21(DE3),
BL21(DE3)pRare2 e Rosetta-gami 2(DE3) (a) e testes de atividade enzimática de lacase
com os sobrenadantes do processo de lise celular (b)
(Figura 84a - M: marcador de massa molecular; 1: proteínas obtidas das células antes da indução
com IPTG; 2: proteínas obtidas das células ao final do período de 20 horas de indução com IPTG 3:
proteínas insolúveis após o processo de lise celular; 4: proteínas solúveis presentes no sobrenadante
do processo de lise celular; Figura 84b - 5, 6 e 7: reações enzimáticas com os sobrenadantes do
processo de lise celular das linhagens E. coli BL21(DE3), BL21(DE3)pRare2, Rosetta-gami 2(DE3),
respectivamente; 8: Branco (controle negativo da reação enzimática)). As setas indicam as bandas
correspondentes a lacase expressa.
E. coli BL21(DE3) (canaleta 2 do gel). Essa enzima apresentou alta afinidade pela
resina e foi eluída da coluna cromatográfica durante a realização do gradiente de
imidazol (com aproximadamente 250 mM de imidazol) em um único pico e com alto
teor de pureza (canaleta 4 do gel). As frações coletadas neste pico com atividade
de lacase foram reunidas, dialisadas e utilizadas nos ensaios de caracterização
enzimática.
(Controle: atividade enzimática sem a adição de íons metálicos e de compostos quelantes; ND:
atividade enzimática não detectada)
subsp. subtilis 168 e de Bacillus sp. HR03. A enzima de B. subtilis apresentou Km,
Kcat e Kcat/Km iguais a 30 μM, 5 s-1 e 0,167 s-1 μM-1, respectivamente (Furtado et al.,
2013). Segundo Mohammadian et al. (2010), o Km, Kcat e Kcat/Km da lacase de
Bacillus sp. HR03 foram estimados em 535 μM, 127 s-1 e 0,24 s-1 μM,
respectivamente, quando se utilizou ABTS como substrato.
Na Figura 89 é apresentado a análise de dicroísmo circular realizada para
avaliar o perfil de estrutura secundária da lacase de B. licheniformis CBMAI 1609. O
espectro de UV-distante da lacase purificada obtido a 20 ºC e em pH 7,4 apresentou
2 picos principais, um pico positivo com elipticidade molar máxima a 200 nm e um
pico negativo com menor valor de elipticidade molar próximo a 215 nm. Este tipo de
espectro é característico de proteínas ricas em estrutura secundária do tipo folha-β,
como proposto por Corrêa e Ramos (2009). Esta observação foi consistente com o
espectro de CD obtido por Furtado (2009) para a lacase de B. subtilis subsp. subtilis
168. O resultado obtido também está de acordo com proposto pelo Protein Data
Bank para a estrutura secundária da lacase de B. subtilis, esta enzima apresentou
cerca de 40 % de folhas-β e 8 % de α-hélice (Disponível em: http://www.rcsb.org/
pdb/explore/remediatedSequence.do?structureId=1GSK).
Também foi realizado neste estudo o monitoramento da elipticidade molar
a 215 nm durante gradiente térmico de 20 a 90 ºC, para a avaliação da
desnaturação térmica da estrutura secundária da lacase de B. licheniformis CBMAI
1609. No entanto, a qualidade dos dados obtidos não foi boa, por isso esse
resultado não foi conclusivo e não será apresentado nesta tese.
5. CONCLUSÕES
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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7. APÊNDICES
reacional de 1 mL. Após incubação a 45 ºC sob agitação de 750 rpm por 24 horas,
as misturas reacionais foram centrifugadas a 10.000 x g por 10 minutos a
temperatura ambiente para a separação do sobrenadante da biomassa residual.
Esse sobrenadante foi utilizado na quantificação dos açúcares redutores liberados
através do método de DNS (Miller, 1959). Os resultados obtidos da leitura de
absorbância a 540 nm foram relacionados com uma curva de calibração preparada
com D-glicose. Reações controle contendo apenas a enzima comercial e outra sem
adição de nenhuma enzima também foram preparadas. Todos os ensaios foram
realizados em triplicata.
Na Figura 90 são apresentados os resultados da avaliação da
suplementação do coquetel enzimático comercial Accellerase® 1500 com a enzima
galactanase de B. licheniformis CBMAI 1609 para a hidrólise de bagaço de cana-de-
açúcar pré-tratado. O teor de pectina na parede celular da cana-de-açúcar é menor
que 10 % e esta pode ser encontrada ligada a compostos fenólicos da parede
celular e/ou lignina e também associada com a celulose (Souza et al., 2013). Mesmo
sendo possivelmente baixo o teor desse polissacarídeo no bagaço da cana-de-
açúcar foi verificado que a adição da galactanase proporcionou um aumento
estatisticamente significativo, ao nível de confiança de 95 %, na liberação de
açúcares redutores. Foi observada uma melhora de cerca de 25 % no rendimento da
hidrólise com a utilização dessa enzima.
2008). Este valor também condiz com o relatado por Pei e Shao (2008) para a α-L-
arabinofuranosidase de B. pumilus ARA, que exibiu massa molecular estimada em
56 KDa, e com o verificado por Lee e Lee (2014) para a α-L-arabinofuranosidase de
Paenibacillus sp. DG-22, que possuía massa molecular de 56,5 KDa.
A expressão da α-L-arabinofuranosidase recombinante de B. licheniformis
CBMAI 1609 foi avaliada, como descrito no item 3.4.4, utilizando as linhagens de E.
coli BL21(DE3), BL21(DE3)pRare2, Rosetta-gami 2(DE3) e Artic Express (DE3) e os
resultados obtidos estão apresentados na Figura 92.
Como pode ser visualizado nas canaletas de número 2 e 4 dos géis da
Figura 92a, não foi observado um alto nível de expressão da enzima sob as
condições utilizadas, pois não foi detectada a presença de bandas de proteínas com
o tamanho esperado para esta enzima após 4 horas de indução nas linhagens de E.
coli BL21(DE3), BL21(DE3)pRare2, Rosetta-gami 2(DE3) e após 20 horas de
indução para a linhagem E. coli Artic Express. No entanto, testes de atividade
enzimática utilizando os sobrenadantes do processo de lise celular e os substratos
arabinana de beterraba sacarina linear e desramificada confirmaram a expressão da
α-L-arabinofuranosidase pela linhagem E. coli BL21(DE3), como apresentado na
Figura 92b.
Comparativamente, Pei e Shao (2008) ao clonarem a α-L-
arabinofuranosidase de B. pumilus ARA também observaram uma baixa expressão
da enzima. Para obter uma maior expressão da enzima os autores promoveram
algumas mutações no gene clonado para otimizar os códons e reduzir estruturas
secundárias na região de iniciação de tradução do RNAm. Com esta estratégia os
autores conseguiram aumentar o nível de expressão da enzima em cerca de 225 %
em comparação ao gene não mutado.
356
8. ANEXOS