INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DETERMINACION DE AMINOACIDOS TERMINALES CON GRUPO ALFA AMINO LIBRE METODO DE
SANGER.
3FV1 Seccion:3

Juárez Vargas C. Fabián

INTRODUCCIÓN.
Las proteínas son macromoléculas formadas por cadenas lineales de aminoácidos.
Las proteínas desempeñan un papel fundamental en los seres vivos y son las biomolécula más versátiles y más diversas.
Realizan una enorme cantidad de funciones diferentes, entre las que destacan la enzimática, hormonal, transportadora
(hemoglobina), defensiva (anticuerpos), estructural (colágeno), etc.

Un polipéptido, en otras palabras, es una secuencia de aminoácidos que están vinculados a través de enlaces
peptídicos.

Con el método de Sanger se determina el grupo α-amino libre de las cadenas polipeptídicas, este reacciona, con el 1-
fluoro-2,4-dinitrobenceno [DNFB] en un medio ligeramente alcalino, formando los DNP derivados. Una hidrólisis
posterior con HCl 6N aplicando temperatura y presión provee los aminoácidos libres y dinitrofenil derivados, estos
derivados pueden extraerse del hidrolizado con éter e identificarse con una cromatografía en papel.

OBJETIVO.
Utilizar el método de Sanger para identificar los aminoácidos que contienen el grupo alfa-amino terminal de las cadenas
de la molécula de hemoglobina.

RESULTADOS.
Rf = distancia recorrida por el soluto / distancia recorrida por el solvente

Muestras Rf
Problema 22/50=.44
DNFB 24/50=.48
Problema 35/50=..70
DNP-Val 36/50=.72
DNP- Ala 29/50=.58
DNP-Phe 31/50=.62

Discusiones
Cuando se le adiciona bicarbonato de sodio al 4% a la hemoglobina, realizamos un medio alcalino el cual favorece la
reacción, posteriormente al agregar el reactivo de Sanger 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno (DNFB) agitamos el tubo para
favorecer la reacción y así obtener DNP derivados de la hemoglobina.

Se acidifico el medio con HCl 3N para detener la reacción del (DNFB) con la hemoglobina en medio alcalino que
realizamos anteriormente, se extrajo con éter para separar en dos fases, la orgánica que es nuestra sustancia problema
que contiene aminoácidos dinitrofelinados, y la etérea la cual hace que se eliminen los residuos del (DNFB) que no
reaccionaron en la etapa anterior de nuestra reacción, posteriormente se agregó HCl 6N para realizar una hidrolisis
acida, que al aplicar temperatura y presión en el autoclave esta provee que los aminoácidos libres y dinitrofenil
derivados puedan extraerse del hidrolizado.

Para identificar y separar el grupo amino terminal de la hemoglobina, se utilizo el extracto obtenido en la hidrolisis y con
éter se extrajo nuestra sustancia problema calentamos los extractos etéreos en una parrilla con el fin de evaporar el
éter que hay en nuestra sustancia para que nuestro problema estuviera concentrado y sin residuo alguno de las
sustancias anteriores que utilizamos, disolvimos en alcohol absoluto para la aplicación en cromatografía nuestro DNP-
problema, que es el grupo amino terminal de la hemoglobina.

Para la aplicación de nuestro problema en la cromatografía, se realizó con papel Whatman; aplicamos las muestras de
DNP-Phe, DNP-Ala, DNP-VAL, DNFB y nuestra sustancia problema para identificar y hacer una comparación de cuál de
estas sustancias que colocamos es nuestro aminoácido con grupo α-amino terminal.

En donde se colocaron estos estándares [DNP-derivados]. Al revelar el cromatograma se encontraron dos manchas en la
corrida del problema, uno correspondiente al DNP-Valina y el otro corresponde al DNFB sin reaccionar. Hubo unas
ligeras diferencias entre la corrida del problema y de los DNP-derivados. Estas diferencias se pueden deber a la
temperatura ambiente la cual hace que acelere o sea más lento cuando el cromatograma corre en el disolvente.
Además, el problema presento DNFB, lo cual se debe a los restos de DNFB que se quedaron en la muestra debido a que
no se extrajo en su totalidad antes de la hidrólisis que se hizo con el fin de eliminar todo este exceso.

Conclusiones
Se determinó con el método de Sanger y la cromatografía el alfa-amino terminal de la hemoglobina es valina con un Rf =
.70

BIBLIOGRAFÍA
➢ DONALD VOET, JUDITH G. VOET. 2006 FUNDAMENTOS DE BIOQUÍMICA 2DA EDICION EDITORIAL PANAMERICANA PAGS.
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➢ LEHNINGER, A,L. “PRINCIPIOS DE BIOQUIMICA”. EDITORIAL OMEGA,ESPAÑA

➢ ENRIQUE BATTANER ARIAS, 2012 BIOMOLECULAS 1RA. EDICIÓN. EDICIONES UNIVERSIDAD DE SALAMANCA.ESPAÑA.
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