GUIA DE ESTUDIO PRIMER PARCIAL ANALISIS MICROBIOLOGICOS.

I. Seguridad en el laboratorio de Microbiología:

Normas De seguridad.
Finalidad: Es obligatorio que todas las personas que participan en el laboratorio de bacteriología conozcan y cumplan
con las normas de seguridad establecidas, para que el trabajo se realice con un riesgo mínimo, y haya nula
probabilidad de contaminar el medio ambiente.
Las medidas de control establecidas están diseñadas para proteger a las personas y al ambiente de la posible
exposición a microorganismos potencialmente patógenos que se manejan en la secuencia del trabajo técnico y la
disposición adecuada de los desechos biológico infecciosos.
ES necesario:
Tener conocimiento básico de la patogenicidad de las bacterias y el método de transmisión de las mismas para
desarrollar métodos preventivos que minimicen los riesgos.
Riesgos bacteriológicos: toma de muestra, transporte, proceso (mayor probabilidad), almacenaje y desecho

Rutas por las que puede ingresar un MOO después de una exposición:

1. Oral: comer, beber, fumar, salpicaduras, artículos o dedos a la boca

2. La piel: punzocortantes, cortaduras, derrames a piel dañada o intacta.
3. Membranas mucosas: ocular, nasal. Salpicaduras, dedos a nariz u ojos.
4. Inhalación: Al inocular o estriar medios, flamear asas, derramar suspensiones, contaminar con pipetas, muestras
lìquidas al agitar ó centrifugar, abrir frascos
Nivel de Bioseguridad 2
Para el grado de riesgo que se maneja comúnmente en los laboratorios de diagnóstico o
laboratorios básicos, estos se podrían incluir en el Nivel de bioseguridad 2 donde se trabaja
con bacterias de riesgo moderado que se encuentran presentes en la comunidad, que estan
asociadas a infecciones de gravedad variable,( ej: Streptocococcus, Salmonella, Brucella,
etc). y que se buscan en muestras biologicas como exudados, secreciones, fluidos
corporales, tejidos, etc..

Principios para nivel de Bioseguridad 2:

1. El personal de laboratorio tiene entrenamiento específico en el manejo de agentes patógenos

2. El acceso al laboratorio es restringido cuando se está realizando algún trabajo
3. Las personas deben lavarse las manos luego de manipular material biológico, después de quitarse los
guantes y antes de retirarse del laboratorio
4. No está permitido comer, beber, manipular lentes de contacto, maquillarse o almacenar alimentos
para uso humano en áreas de trabajo. Los alimentos deben de almacenarse fuera del área, en
gabinetes o refrigeradores asignados para ello.
5. Se toman precauciones extremas con instrumentos punzocortantes contaminados RPBI
6. Las personas que usan lentes de contacto, deben también utilizar anteojos o un protector facial
(careta o gafas de proteccion).
7. No pipetear con la boca. Se deben de utilizar dispositivos mecánicos para este fin.
8. Ciertos procedimientos en los cuales pueden salpicar los agentes o aerosoles se llevan a cabo en
gabinetes de trabajo biológico
9. Aplicar la NOM 087 de RPBI.
 II. NORMAS

NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, PROTECCIÓN AMBIENTAL - SALUD

AMBIENTAL - RESIDUOS PELIGROSOS BIOLÓGICO-INFECCIOSOS - CLASIFICACIÓN Y ESPECIFICACIONES DE MANEJO

Clasificaciòn:

Se consideran RPBI los siguientes:

1. La sangre y sus derivados

2. Los cultivos y cepas de agentes biológico infecciosos (cajas Petri y utensilios desechables)
3. Los patológicos: tejidos y muestras biológicas excluyendo orina y excremento.
4. Los residuos no anatómicos:
a. materiales empapados de sangre o líquidos corporales.
b. Materiales con secreciones respiratorias (esputo) ó con sospecha de TB u otra enfermedad
boletinada por SSA
c. Materiales empapados de sangre o secreciones de pacientes con sospecha de fiebres hemorrágicas
u otra boletinada por SSA
d. Materiales absorbentes de jaulas de animales inoculados con enteropatógenos
e. Punzocortantes
NORMA Oficial Mexicana NOM-007-SSA3-2011, Para la organización y funcionamiento de los laboratorios
clínicos.
1 Objetivo y campo de aplicación
1.1 Esta norma tiene por objeto establecer las especificaciones que se deben satisfacer para la
organización y funcionamiento de los laboratorios clínicos.
1.2 Esta norma es de observancia obligatoria para los laboratorios clínicos, así como para los
profesionales y técnicos del área de la salud de los sectores público, social y privado que intervengan en la
organización y funcionamiento de dichos establecimientos
4.3 Los laboratorios clínicos deberán contar con un responsable sanitario, que deberá ser:
4.3.1 Químico con currículum orientado al laboratorio clínico, que cuente con un mínimo de 3 años de
experiencia comprobable en el área técnica o con especialidad, grado universitario de maestría o doctorado
en las áreas de laboratorio clínico
III. REQUISITOS GENERALES PARA EL CULTIVO DE MICROORGANISMOS
A. Por su finalidad o utilidad los medios de cultivo se clasifican:
a) Medios enriquecidos: Alto contenido de nutrientes, especiales para ciertos microorganismos. (agar sangre,
agar chocolate)
b) Medios selectivos: sólo permiten el desarrollo de ciertos microorganismos, contienen inhibidores,
Ej: Manitol salado, Mc Conckey, SS
c) Medios diferenciales: Contienen algún substrato a utilizar por la bacteria lo cual permite distinguir
características de identificación bacteriana. (ej. SS, EMB, McConkey, cromogénicos)
B. Factores ambientales:
Concentración de O2:
a) Aerobios: Requieren O2 para su crecimiento
b) Anaerobios: No requieren, No toleran O2
c) Anaerobios facultativos: Pueden obtener energía en ausencia de oxígeno, pero el oxígeno no les es tóxico.
d) Microaerofílicos: Necesitan O2, en bajas concentraciones.
Por su estado físico se clasifican en:
a) Sólidos: Alto contenido de agar.(12-14gr/L)
b) Semisólidos: con bajo contenido de agar: (ej: MIO 2.0 gr/L) útiles para evaluar motilidad
Líquidos o caldos: no contiene agar: útiles para crecimiento y conservación de bacterias.
 IV. Control de Calidad:
Fase Preanalìtica:
El laboratorio debe:
Tener instrucciones documentadas para la recolección de las muestras.
Entregar al paciente un instructivo para la toma de muestras de orina para el urocultivo.
Usar medios de transporte cuando sea necesario.
Tener criterios documentados para la aceptación o rechazo de muestras.
Fase Analítica:
Calidad en reactivos: catalasa, oxidasa, indol, bacitracina, optoquina, cefinasa, antisueros, sangre de borrego: con
cepas control, no necesariamente ATCC.
Calidad en tinciones: tinción de gram (cómo se hace control de calidad para la tinción)
Calidad de los medios de cultivo. I. Almacenamiento, II. Medios preparados, III. calidad en cada nuevo lote para
medios selectivos, diferenciales y capacidad de hemólisis. , verificar esterilidad de los medios, inocular cepas control
para verificar ya sea capacidad nutritiva, selectividad o diferenciabilidad
Calidad en los diferentes tipos de cultivo: faríngeo, urocultivo, etc
Fase Post analítica: post-examen:
Estadísticos de positividad
Revisar los resultados para detectar y corregir:
 Errores de captura
 Errores analíticos
 Resultados inconsistentes
 Resultados inusuales
Informe: Taxonomía de Bergey
1) Aseguramiento de la calidad: Participar en un programa de control de calidad externo.
Ej: PACAL

Fase Preanalítica Fase analítica Fase post-analítica

Equipos -Calibración -Manejo -Limpieza
Microscopio -Validación -Bitácora de manejo -Interpretación
(Köhler) -Mantenimiento -Verificación de -Reportar problema
Incubadora (Bitácora): Norma resultados
Autoclave -Manual de
Operaciones : Norma
a)Operación
b)Limpieza
c) Resolución de
problemas comunes

V. MICROSCOPIA
a) M. campo claro: preparaciones en fresco, y muestras teñidas con colorantes.
b) M. campo oscuro: la luz incide en ángulo oblicuo, se observa sólo la luz que incide en los objetos, el
fondo queda oscuro. Se utiliza para observar preparaciones en fresco para búsqueda de espiroquetas.
c) M. de contraste de fases: El índice de refracción de la muestra provee un contraste, contiene anillos de
difracción en el condensador y objetivo, se observan diferentes grosores. El contraste permite observar
organelos en eucariotas, preparaciones en fresco.
d) M. fluorescencia: preparaciones fijas; microorganismos en muestras de tejidos. Requiere colorantes
fluorocromos (fluorescentes porque la luz primero se absorbe y cuando regresa a su nivel de energía
emite luz visible) generalmente utiliza luz UV, requiere cuidados al ojo (filtros al ocular).
e) M. electrónico: emisor fotónico emite electrones que inciden sobre la muestra que posteriormente
enfocan en campos electromagnéticos. Forman imagen en pantalla. Preparaciones teñidas con metales
 pesados. Es el mic. con máxima resolución,. De Transmisión: a través. De Barrido: escanea (vista
tridimensional.
VI. RESPUESTA INMUNE
Se clasifica en Innata y Adaptativa.
Innata: no es específica, no tiene memoria, misma respuesta a lo largo de la vida.
 Piel: Barrera mecánica
 Lágrimas y saliva: lisozimas
 Estómago: acidez
 Fagocitos.
 Tracto respiratorio: células ciliadas
 Nariz: pelos
 Inflamación
Adaptativa: Específica, tiene memoria, evoluciona en el transcurso de la vida.
 Humoral: Anticuerpos
 Celular: Linfocitos T

Antígeno: Moléculas que el organismo reconoce como extrañas, las cuales son capaces de estimular el
sistema inmune para producir anticuerpos.
Anticuerpo: Molécula producida como respuesta a un antígeno, que tiene la propiedad de combinarse
específicamente con el antígeno que indujo su producción.
Llamados inmunoglobulinas, son glucoproteínas en forma de Y: tienen una región variable Fab (las 2 puntas)
que es donde se une al antígeno (que lo originó), una región constante Fc ( cola de la Y) que son las zonas de
unión para el complemento y receptores de superficie celular.
La molécula de inmunoglobulina es simétrica: consta de 2 cadenas pesadas H (heavy) y 2 ligeras L (light).
Los isotipos de las inmunoglobulinas son: IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, y están determinados por el tipo de cadena
H pesada.
La IgM es pentamérica y tiene 10 sitios de unión al antígeno. La IgG tiene 2 sitios de unión al antígeno.
La IgG puede atravesar la barrera placentaria (es la única) proporcionando inmunidad al recién nacido, y
utiliza su fracción Fc para activar complemento.
La IgA provee inmunidad en las mucosas (leche, saliva, secreciones)
La IgE nos defiende contra parásitos y también promueve las alergias.
La IgM activa el complemento y es muy aglutinante (10 sitios de unión)
La IgD: Es como precursora de las otras y se encuentra en los linfocitos B

Un epítope o determinante antigénico: es una porción del antígeno con capacidad de desencadenar la
respuesta inmune.
RESPUESTA INMUNE ADAPTATIVA: Fases
A) Los macrófagos fagocitan la bacteria por endocitosis (fagosoma), luego al fagosoma incorporan lisozimas
para digerirla (fagolisosoma)
B) Los macrófagos presentan el antígeno: utilizan el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y lo
colocan en la superficie de su membrana. Por esto se llaman células presentadoras de antígeno.
C) Esta célula presentadora de antígeno se une a un linfocito Th (helper) que tiene a su vez un receptor. Y
se activa
D) El linfocito Th activado libera interleucinas (también llamadas linfocinas, o citoquinas) las cuales
provocan expansión clonal (forman más linfocitos T) y también estimulan a otros macrófagos.
E) Los linfocitos nuevos formados pueden DIFERENCIARSE EN Th1 para activar inmunidad celular*, y Th2
para activar inmunidad humoral **(o sea para activar a linfocitos B) otros se diferencian en Tc
***(citotóxicos), y otros serán células de memoria.
 F) * los Th1 liberan interleucinas que activan a los macrófagos para que dirijan al sitio de la infección y van
“programados” a fagocitar las células infectadas.
G) ** Los Th2 se especializan en ponerse en contacto con linfocitos B para que se activen****
H) Un linfocito B se puede activar por 2 mecanismos: por ** un Th2 (que se pone en contacto con él tienen
un receptor) ó por contacto directo con el antígeno .
I) **** el linfocito B activado sufre expansión clonal, algunos se diferencian a células plasmáticas para
producir anticuerpos, otros serán células de memoria.
J) ***Los linfocitos citotóxicos Tc se especializan en reconocer y MATAR células infectadas, también
algunos quedan como memoria.

Célula plasmática: es un linfocito B que cambió para producir anticuerpos. Están en los tejidos.
Linfocitos Th también conocidos como CD4
Linfocitos Tc también conocidos como CD8

TODO EL PROCESO DESDE A la J, dura 4 ó 5 días.

VII. DIAGNOSTICO SEROLOGICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS. RESPUESTA INMUNE PRIMARIA Y

SECUNDARIA.
RESPUESTA INMUNE PRIMARIA: Primera vez (en su vida) que el paciente tiene contacto con el antígeno.

Fase aguda: el paciente tiene síntomas se descubre o sospecha la enfermedad. Usualmente primer semana a 10 días
Fase convalesciente: El paciente ya resolvió la infección (con sus defensas) 2 semanas después de la fase aguda.
En fase aguda: primero se eleva IgM. Una IgM detectada en el laboratorio dá un diagnóstico específico positivo de
infección.
La IgG aumenta después y un aumento en sus títulos de 4 veces (cuadruplicado) con una diferencia de 2 semanas
entre una determinación y otra confirma el diagnóstico. Si bajan después de la determinación confirma diagnóstico e
indican que entró en convalescencia.
Cuando los anticuerpos IgG comienzan a bajar, el paciente entró en convalescencia.
Si se efectúa una sola determinación también sirve para valorar el estatus inmune del paciente. (si está vacunado)
También debe tomarse en cuenta que hay pacientes inmunosuprimidos que no tendrán la respuesta inmune
esperada y los métodos serológicos pueden no ser representativos.
RESPUESTA SECUNDARIA: REINFECCIÓN (Segunda vez de encuentro con el Ag)
Los anticuerpos IgM son muy bajos, los IgG son los más representativos.
La respuesta es más rápida en el día 5 ya se puede medir. Y la IgG aumenta más que en la respuesta primaria.
También en la convalescencia bajan.

VIII. METODOS SEROLOGICOS.

a) Aglutinación: Rx Ag-Ac provoca aglutinación directa visible. Ejs: Rxs. Febriles.
Se llama Rx de Widal: para antígenos de S. typhi
 Rx. De Weil-Felix para antígenos de Proteus OX-19 que dan reacción cruzada con Ricketsias. Sirve para
diagnosticar Tifo.
Se llama Huddleson: cuando diagnosticamos brucelosis con antígenos de B. abortus.
b) Aglutinación con partículas: utilizan generalmente látex para visualizar la reacción de aglutinación:
ejemplo la prueba de ASLO que hicieron.
c) Floculación: ejemplo prueba de VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) la “aglutinación” es visible
por agregados de densidades diferentes.
d) Inmunodifusión: en una matriz de agar difunden por una parte los Ag y por otra los Acs formando zonas
visibles en la región donde reaccionan.
e) Neutralización: Se buscan los anticuerpos capaces de bloquear o neutralizar las capacidades dañinas del
antígeno. Un ejemplo es el método de ASLO antiguo que utilizaba estreptolisina.
f) ELISA: Enzime Linked Immuno Sorbent Assay.
El antigeno se coloca unido a pocillos. El suero del paciente contiene anticuerpos. Agrego un segundo
anticuerpo marcado con una enzima (enzime linked) (el cual es Anti IgG contra la fracción Fc). Luego
agrego un sustrato para que la enzima reaccione (esto si el paciente tenía anticuerpos), la enzima dá una
reacción coloreada que mido espectrofotométricamente.

IX. OBTENCION DE ANTISUEROS: Generalmente se inoculan ratones.

Se denominan anticuerpos monoclonales los que se dirigen contra un solo determinante antigénico
(epítope)
Son muy específicos pero menos sensibles.
Para obtenerlos provocan una fusión de linfocitos B ya sensibilizados con una célula de mieloma múltiple
formando un hibridoma que “equivale” a una célula productora “máquina” de anticuerpos monoclonales.
Los antisueros policlonales contienen anticuerpos varios dirigidos contra un mismo antígeno pero contra sus
diferentes epítopes. Son muy sensibles, pero pueden dar reacciones cruzadas (menos específicos).