UNIVERSIDAD AUTÓNOMA CHAPINGO

DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA
PROGRAMA EDUCATIVO DE
AGRONOMIA EN HORTICULTURA PROTEGIDA

CURSO: CULTIVO PROTEGIDO DE ORQUÍDEAS

PRACTICA 7. PRUEBAS DE VIABILIDAD EN SEMILLAS DE ORQUÍDEAS

Erik R. Navarro López e Isaías Gil Vázquez

1. Introducción
Esta práctica permitirá conocer y desarrollar la prueba de cloruro de tetrazolio usada para estimar la viabilidad
de semillas de orquídeas mexicanas y comerciales. Esta prueba nos permite conocer cuales semillas están aptas
para la reproducción vía germinación in vitro de especies de orquídeas, endémicas, amenazadas, raras, sujetas
a protección especial, en peligro de extinción; así como, de especies de orquídeas de interés comercial. La
prueba de viabilidad de cloruro de tetrazolio está relacionada con la práctica ocho donde se verá el tema de
germinación in vitro de semillas de orquídeas.

La misma es de apoyo a los conocimientos expuestos en la Unidad cuatro titulada “Reproducción y

propagación orquídeas”, del Programa teórico del curso “Cultivo Protegido de Orquídeas”. La práctica se
realiza en el Laboratorio de Biotecnología Sección de Cultivo de Tejidos Vegetales, del Departamento de
Preparatoria Agrícola, en un tiempo estimado de una hora.

La semilla es una unidad reproductiva compleja, característica de las plantas vasculares superiores, que se
forma a partir del óvulo vegetal, generalmente después de la fertilización (Doria, 2010). Las semillas de las
orquídeas no poseen endospermo, solo consisten de un pequeño embrión suspendido dentro de una
membrana (testa), comúnmente transparente, aunque en ocasiones pigmentada. El número de semillas por
cápsula puede variar de 13,000 a 4,000,000 ya que son muy pequeñas de 0,25 a 1,2 mm de largo y 0,009 a
0,27 mm de ancho (Arditti, 1967). En la naturaleza las semillas de las orquídeas solo germinan cuando se
asocian con las micorrizas (hongos), por lo que la germinación natural tan solo puede alcanzar un máximo del
2 a 3 % (Vu Quoc Luan et al., 2006). Esta característica de las semillas de las orquídeas, hace necesario conocer
cuál es el porcentaje de viabilidad antes de planear su reproducción in vitro. Para conocer la viabilidad de las
semillas de orquídeas algunas de las pruebas comúnmente utilizadas son: a) la tinción con Cloruro de Trifenil
tetrazolio (CTT) y b) la tinción con Diacetato de fuoresceína (DF) (Vujanovic et al., 2000). La prueba de
viabilidad con CTT, es la más reconocida por la International Seed Testing Association; y se considera como
un método rápido que podría sustituir el conteo de semillas germinadas para conocer la viabilidad. Esta prueba
ha sido utilizada exitosamente con orquídeas tropicales epífitas y adaptada para varias especies europeas y
especies terrestres de América del Norte (Singh, 1999).

2. Objetivos
2.1. Objetivo general. Realizar pruebas de viabilidad con cloruro de tetrazolio al 0.2 % en varias especies de
orquídeas nativas o comerciales, para decidir cuáles son las más apropiadas para la reproducción in vitro.

1
2.2. Objetivos particulares. Como resultado del proceso de enseñanza y aprendizaje en esta práctica, los
estudiantes deben obtener conocimientos y desarrollar capacidades y habilidades bajo los siguientes términos:

 Conocer las características de forma de la testa y embrión de semillas de algunas especies de orquídeas
nativas o comerciales.
 Identificar las diferentes intensidades coloraciones que presentan los embriones de semillas de
orquídeas después de 24 horas en CTT.
 Conocer las condiciones apropiadas de luz y temperatura, que favorecen el desarrollo apropiado de la
prueba de viabilidad con CTT.
 Conocer el efecto que tiene la autopolinización y polinización cruzada sobre la viabilidad de las
semillas obtenidas mediante una polinización manual.
 Realizar la prueba de viabilidad con CTT en semillas de orquídeas nativas o comerciales.

3. Recursos materiales y equipo

Para el desarrollo de esta práctica, es necesario el siguiente material y equipo.

- Instructivo de la práctica.
- Libreta y lápiz o pluma.
- Semillas de diferentes orquídeas en sobres amarillos (8.7x16.4 cm).
- Cajas de petri chicas PYREX (base 53 mm y tapa 61 mm).
- Microespátula.
- Papel aluminio (14x14 cm).
- Plumón indeleble.
- Solución de cloruro de tetrazolio [2, 3, 5-Cloruro Trifenil Tetrazolio (2 %, pH=6.5)].
- Microscopio estereoscópico.
- Cámara fotográfica.
- Computadora con procesador de textos.

4. Metodología
Lugar. La práctica se realizará en el Laboratorio de Biotecnología Sección Cultivo de Tejidos de Preparatoria
Agrícola (UACh).

Indicaciones. Primero, el profesor explicará le metodología y secuencia de la práctica para la prueba de

viabilidad con Cloruro de Tetrazolio; posteriormente los estudiante procederán a establecer y realizar
la prueba de viabilidad y otras actividades complementarias de la práctica.

Actividades. Después de la explicación y aclaración de dudas por parte del profesor, los estudiantes realizarán
la actividad práctica, se tomarán datos, fotos y la información necesaria para la elaboración del reporte
en formato de artículo descriptivo.

5. Descripción del desarrollo de la práctica. Esta práctica se realizará en el Laboratorio de Biotecnología

Sección Cultivo de Tejidos de Preparatoria Agrícola (UACh) ubicado en el área de catacumbas, para lo cual
se debe seguir la siguiente secuencia por equipos.

2
Primero. Descripción del material y equipo para la prueba de viabilidad con cloruro de tetrazolio. El
profesor a cargo de la práctica describirá los materiales, equipos y metodología para realizar la
práctica.
Segundo. Observación y reconocimiento de semillas de orquídeas. Antes de realizar la práctica se
colocarán varias muestras de semillas para ser observadas y familiarizarse con la estructura de las
semillas de orquídeas (forma, testa y embrión).
Tercero. Elección del material vegetal. Previo a la práctica se colocarán varios sobres amarillos con semillas
de diferentes especies de orquídeas. Se asignarán dos sobres por equipo con especies diferentes.
Nota: Con los datos correspondientes, hacer cuadro.
Cuarto. Toma de muestra de semilla. De cada especie, con ayuda de una microespátula colocar una
pequeña porción de semillas en una caja de petri.
Quinto. Colocación de la solución de Colruro de Tetrazolio. Agregar gotas de cloruro de tetrazolio al
2%, hasta cubrir totalmente las semillas.
Sexto. Tapado, etiquetado y protección con papel aluminio. Tapar la caja de petri y etiquetar con los
siguientes datos: Especies, fecha de colecta, fecha y hora de establecimiento de la prueba. Después,
cubrir con papel aluminio (14x14 cm) la caja petri, colocar un trozo de masking tape (4 cm) y
etiquetará con el nombre del equipo.
Séptimo. Ubicación en la sala de incubación. Colocará las cajas de petri en la sala de incubación donde
permanecerá durante 24 horas a una temperatura de entre 20 a 25 °C (aproximadamente).
Octavo. Toma de fotografías y conteo de semillas. Una vez transcurridas las 24 horas cada equipo tomará
fotografías de 4 campos visuales y realizará los conteos respectivos de las semillas: con embrión,
sin embrión, de color pálido, rosa, naranja, rojo y café.
Nota: Hacer una escala de coloración de semillas.
Noveno. Cálculo del porcentaje de viabilidad. Después de realizados los conteos se procederá a estimar
el porcentaje de viabilidad de las semillas. Cómo en esta práctica se utilizaron semillas sin seleccionar,
el porcentaje de viabilidad se calculará con la fórmula siguiente:

Viabilidad (%) = (SCET/ST) x 100

Donde se tiene que:

ST = Número de semillas totales (con y sin embrión).
SCET = Número de semillas con embrión teñido de rojo (naranja y rojo).

Nota. Hacer un cuadro con los resultados de todos los equipos.

Décimo. Elección de las semillas para la reproducción in vitro. De las semillas con mayor porcentaje de
viabilidad (cuadro de todos los equipos), se elegirá una especie por cada equipo para la siembra in
vitro en la siguiente práctica.

6. Resultados y conclusiones

Al final de esta actividad se entregará una bitácora por equipo donde vendrán evidencias fotográficas sobre el
procedimiento y resultados obtenidos, aunado a este reporte se entregará la versión digital en un disco,
utilizando el procesador de textos Microsoft Word. Los resultados deben incluir:

a) Hacer un cuadro con los datos de las especies utilizadas en la prueba de viabilidad.

3
 Especie Procedencia Fecha de Fecha de Fecha de la
polinización colecta prueba

b) Con las fotografías de los campos visuales, hacer una escala de coloración de las semillas:
1. Sin embrión.
2. Embrión color blanco.
3. Embrión color rosa.
4. Embrión color naranja.
5. Embrión color rojo o café-rojo.
Nota. Anotar a cuantas X de ampliación se tomó la fotografía.

c) Hacer un cuadro con los datos de: especie, semillas totales, semillas con embrión, semillas con embrión
teñido, porcentaje de semillas con embrión y porcentaje de viabilidad.
Especie ST SCE SCET PSCE PV

ST: Semilla totales; SCE: Semillas con embrión; SCET: Semillas coloreadas; PSCE: Semillas con
embrión (%); PV: Viabilidad (%).

d) Después de analizar los datos del porcentaje de viabilidad, hacer la propuesta de cuales semillas son
más apropiadas para la reproducción in vitro.

e) Hacer una discusión breve de los resultados obtenidos.

Nota 1. En la introducción, materiales y métodos, y las discusiones puede usarse información de libros,
folletos, tesis, tesinas, compilados de congresos, revistas (con temas hortícolas), páginas de internet (con todos
sus datos), y como mínimo 2 artículos científicos (impresos o digital archivo PDF), debidamente citados.
El coordinador en turno por equipo es responsable del buen desarrollo de la práctica, de la participación,
recopilación de información (datos, fotos, cálculos, etc.) por parte de sus compañeros, de la articulación del
reporte y de la entrega del mismo en tiempo y forma ya acordados en la primera clase.

7. Evaluación y acreditación

La evaluación será mediante la asistencia a la práctica y la entrega del reporte escrito de acuerdo a formato
anteriormente indicado. El contenido de la práctica puede ser materia de un examen.
Quien no asista, o no participe en la práctica, en la toma de datos y en la elaboración del reporte, “no podrá
ser incluido en el reporte.

4
8. Bibliografía

Allikas, G.; N. Nash. 2004. A Pocket Guide to Orchids. Chartwell Books, Inc. Malaysia. 256 p.
Arditti, J. 1967. Factors affecting the germination of orchid seeds. Bot. Rev. 33:1–97.
Doria, J. 2010. Generalidades sobre las semillas: Su producción, conservación y almacenamiento. Cultivos
Tropicales 31(1): 74-85.
Gil Vázquez, I. 2007. Prácticas de Manejo de Orquídeas, pp. 145-169. In: Introducción a la Reproducción y
Manejo de Orquídeas Mexicanas. Bastida T. A.; G. Flores Escobar; I. Gil Vázquez; E. R. Navarro
López. Serie de publicaciones Agribot. Departamento de Preparatoria Agrícola. Universidad
Autónoma Chapingo. Chapingo, México.
Gilland, T. 2000. Orchid are Easy: A Beginner´s Guide to Their Care and Cultivation. Guild of Master
Craftsman Publications. Buckinghamshire, U.K. 120 p.
Imes, R. 1997. Orquídeas: Breve Guía de Estudio e Identificación. Editorial Zendrera Zariquiey. Barcelona,
España. 80 p.
Jaworski, H. 1992. Orchids Simplified: An Indoor Gardening Guide. Chapters Publishers & booksellers.
Manitoba, Canadá. 143 p.
Kramer, J. 1999. Botanical Orchids and How to Grow Them. Garden Art Press. Suffal, U.K. 222 p.
Ossenbach, C.; J. Arce; J. Warner; 2007. Almacenamiento de semillas de diferentes especies de orquídeas
para su conservación en un banco de germoplasma, I Maduración, viabilidad y longevidad de
semillas. Tierra Tropical 3 (1): 37-45.
Santos-Hernández, L.; M. Martínez-García; J. E. Campos; E. Aguirre-León. 2005. In vitro propagation
of Laelia albida (Orchidaceae) for conservation and ornamental purposes in Mexico. HortScience
40(2): 439-442.
Singh, F. 1999. Differential staining of orchid seeds for viability testing. Amer. Orchid Soc. Bull. 50:416–418.
Velasco Ortega, L.; G. Pino Donoso. 2008. Orquídeas del Parque Natural Sierra de Grazalema. Consejería
del Medio Ambiente. Junta de Andalucía. Andalucía, España. 247 p.
Vu Quoc Luan; Nguyen Quoc Thien; Dinh Van Khiem; Duong Tan Nhut. 2006. In vitro germination
capacity and plant recovery of some native and rare orchid. Proceedings of International Workshop
on Biotechnology in Agriculture. Nong Lam University Ho Chi Minh City. 175-177.
Vujanovic, V.; M. St-Arnaud; D. Barabé; G. Thibeault. 2000. Viability Testing of Orchid Seed and the
Promotion of Colouration and Germination. Annals of Botany 86: 79-86.