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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

LABORATORIO DE MÉTODOS DE ANÁLISIS

“SEPARACION DE UNA MEZCLA DE DOS AMINOACIDOS POR CROMATOGRAFIA POR


INTERCAMBIO IONICO”

PROFESORA : GUILLERMINA ROSAS SANDOVAL

ALUMNA: CABRERA RENDÓN CITLALLI ODALIZ

GRUPO: 5QV2 SECCIÓN: III

CIUDAD DE MEXICO, 23 DE MARZO DE 2018.


“SEPARACIÓN DE UNA MEZCLA DE DOS AMINOÁCIDOS POR CROMATOGRAFÍA POR INTERCAMBIO
IÓNICO”
Objetivos:

 Separar una mezcla de dos aminoácidos mediante la técnica de intercambio iónico.


 Comprobar la separación de aminoácidos mediante una reacción colorida y el perfil de elución.
Resultados experimentales:
Para llevar a cabo este experimento y obtener la separación de los aminoácidos, los cuales fueron prolina e
histidina, se realizó una cromatografía por intercambio iónico utilizando como fase móvil regulador de citratos
0.1 M, pH 5.25 y pH 2, el intercambiador iónico (resina) y el revelador que fue ninhidrina al 0.2%, recolectando
de esto diversas fracciones que fueron sometidas a baño maría a ebullición para llevar a cabo la reacción
colorida y verificar la separación de dichos aminoácidos mediante el color, posterior a esto se leyó en el
espectrofotómetro cada una de estas fracciones a 400y 570 nm respectivamente, cuyos valores de las
absorbancias obtenidas se presentan en la siguiente tabla (tabla 1):
Tabla 1. Valores de absorbancias obtenidos de las fracciones colectadas por la separación de prolina e
histidina mediante cromatografía por intercambio iónico.

Volumen de A 400 A570 Volumen de A400 A 570


elución (mL) elución (mL)
3 0.065 0.043 63 0.254 0.421
6 0.075 0.050 66 0.686 0.842
9 0.056 0.052 69 1.089 1.233
12 0.178 0.036 72 0.789 0.983
15 0.489 0.017 75 1.193 1.368
18 0.728 0.035 78 1.023 1.255
21 0.859 0.037 81 0.945 1.272
24 0.975 0.098 84 1.093 1.290
27 0.845 0.080 87 0.69 0.937
30 0.801 0.082 90 0.732 0.998
33 0.561 0.026 93 1.651 1.748
36 0.504 0.022 96 1.109 1.261
39 0.485 0.055 99 1.241 1.375
42 0.401 0.046 102 0.466 0.655
45 0.306 0.020 105 0.432 0.622
48 0.341 0.083 108 0.306 0.493
51 0.364 0.105 111 0.054 0.228
54 0.405 0.169 114 0.035 0.175
57 0.362 0.176 117 0.03 0.113
60 0.401 0.199 120 0.079 0.048
Con los datos obtenidos anteriormente, se construyó el perfil de elución colocando en el eje de las abscisas el
volumen de elución y en un doble eje de ordenadas el valor de absorbancia correspondiente (Fig.1)

2 2.5

1.8

1.6 2

1.4

1.2 1.5
Absorbancia

1
570nm

0.8 1 400nm

0.6

0.4 0.5

0.2

0 0
3 9 15 21 27 33 39 45 51 57 63 69 75 81 87 93 99 105 111 117
Volumen de elucion (mL)

Figura 1. Grafico del perfil de elución construido con la absorbancia en el eje de las ordenadas y el volumen
de elución en mL en el eje de las abscisas.
Discusión:
El principio básico de la cromatografía de intercambio iónico es que las moléculas cargadas se adhieren a los
intercambiadores de forma reversible de modo que dichas moléculas pueden ser asociadas o disociadas
cambiando el ambiente iónico. (Álvarez, C., Diaz, Z. et al.)
La cromatografía de intercambio iónico es un método que permite la separación de moléculas basada en sus
propiedades de carga eléctrica. Se compone de dos fases: la fase estacionaria o intercambiador iónico, y la
fase móvil. (Álvarez, C., Diaz, Z. et al.). En esta práctica la fase estacionaria empleada fue resina catiónica
(amberlita ICR-50),esta es un polímero inerte que se une a los grupos funcionales de manera covalente, es
derivada de los ácidos carboxílicos que son ácidos débiles, confiriéndole la característica de ser débil, por lo
tanto se trata de un intercambiador catiónico débil, cuya carga que posee es negativa, por lo que al ser esta un
intercambiador catiónico débil va a permitir tanto la captura de cargas positivas como la modulación de la
retención de estas cargas, es decir, esta fase estacionaria llevara en la superficie cargas electrostáticas fijas,
que retienen contraiones móviles que pueden intercambiarse por iones de la fase móvil, la cual fue regulador
de citratos 0.1 M, PH 5.25 y pH 2, para esta práctica, donde los iones de estos compiten con los analitos por
los sitios activos de la fase estacionaria.
Por lo tanto, con lo anteriormente descrito se puede explicar el perfil de elución dado en la columna (soporte)
en donde, las moléculas captadas por el intercambiador (resina) fueron eludías debido a cambios en la
composición del regulador, realizando un cambio en el PH del solvente. Este cambio de PH, de tal modo de
acercarnos al punto isoeléctrico (PI) de cada aminoácido para que la carga neta de estos fuera disminuyendo y
en algún punto dejar de interaccionar con la matriz, logrando separar la mezcla de los dos aminoácidos, prolina
e histidina. Esta disminución del pH protona a los grupos negativos de los aminoácidos, teniendo carga neta
positiva , por lo que la resina logra interaccionar con estas cargas. La prolina es un aminoácido neutro, mientras
que histidina es básico. (Fig. 2 y 3).

+1 0 -1

pk1 (-COOH)=1.99
pk2 (-NH3+)=10.96

Figura 2. Estructura molecular de Prolina con los valores de sus pKa, demostrando su carga de la molécula,
con punto isoeléctrico de 6.3.

pk1 (-COOH)
=1.82
pkR (grupo R)=6
pk2 (-NH3+)
=9,17

pk2 (-NH3+)=10.96

Figura 3. Estructura molecular de Histidina con el valor de sus pKa, teniendo como punto isoeléctrico 7.59.
De acuerdo a la gráfica mostrada en la figura 1 se pudo observar la elución de cada aminoácido de acuerdo a
sus cargas, observando la prolina es el primero en eluir pues esta con el regulador de citratos 0.1M a pH=5.25
se encontraba en su punto isoeléctrico, lo que provoco que fuese la primera en eluir por la columna junto con el
eluyente, pues al tener carga neta cero no interactuaba con la resina y por tanto de esta manera se dedujo que
las primeras fracciones del perfil de elusión pertenecieron a prolina. En cambio, cuando se hizo el cambio de
regulador de citratos 0.1M pH= 2 el cual esta mezclado con cloruro de sodio (NaCl), se deduce que la resina
logra sustituir a la Histidina ya que hay mayor número de iones Na+ y protones en la solución aumentando de
esta manera la concentración de la fase móvil, por lo que los iones compiten cada vez más con la muestra por
los sitios activos cargados de la fase estacionaria. Por lo que la histidina fue el segundo aminoacido en eluir.
(Nelson D. Cox M. 2009). Así también el perfil de elusión (Fig. 1) tiene la particularidad de tener un pico de
absorción máxima a 400nm y otro pico de absorción a 570 nm.
Las diversas fracciones colectadas pudieron analizarse cuantitativamente mediante la reacción con ninhidrina.
Esta reacción es bastante importante, pues es universalmente empleada para detectar cualitativamente y
cuantitativamente a los aminoácidos. Para los aminoácidos esta es una de las reacciones de color,
verdaderamente importante. La Ninhidirna es una agente oxidante, reacciona con uno de los grupos alfa-amino,
liberando amoniaco, CO2 y el correspondiente aldehído. Una coloración violeta determina positiva la prueba y
para este caso también un color Vino tinto la determinara como positiva. En esta prueba se obtuvo una
coloración anaranjada para prolina y azul para histidina. (Nelson D. Cox M. 2009)
Conclusiones:

 Se logró la separación de la mezcla de dos aminoácidos por cromatografía de intercambio iónico.


 La cromatografía por intercambio iónico permite separar mezclas de componentes con carga.
 La resina y la fase móvil son los dos componentes que determinan la separación de una mezcla.
 Es necesario un perfil de elusión para determinar si la separación fue exitosa o no en una
cromatografía por intercambio iónico.
Bibliografía:

 Nelson D. Cox M. 2009. “Lehninger Principios de Bioquímica”. 5ª ed. Ediciones OMEGA. México.
75,78-80.
 Gary D Christian “Quimica Analitica” edit. McGrawHill 6ta edición, 2009 pags. 73-82
 Álvarez, C., Diaz, Z. et al. Cromatografía de intercambio iónico. Disponible en:
https://docobook.com/queue/cromatografia-de-intercambio-ionico-ufqunqeduar.html.Consultado el día
21 de marzo de 2018.

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