1.

-Según los criterios microbiológicos;¿Que microrganismos están considerados en alteración,

higiene, patógenos?.

Grupos de microorganismos
Como referencia para los criterios microbiológicos, en general los microorganismos se agrupan como:

1. - Microorganismos indicadores de alteración: las categorías 1, 2, 3 definen los microorganismos asociados con la
vida útil y alteración del producto tales como microorganismos aeróbios mesófilos, aerobios mesófilos esporulados,
Mohos y Levaduras, Lactobacillus, microorganismos lipolíticos.

2. - Microorganismos indicadores de higiene: en las categorías 4, 5, y 6 se encuentran los microorganismos no

patógenos que suelen estar asociados a ellos, como Coliformes (que para efectos de la presente norma sanitaria se
refiere a Coliformes Totales), Enterobacteriaceas, a excepción de este último en el caso de "Preparaciones en polvo
para Lactantes.

3. - Microorganismos patógenos: son los que se hallan en las categorías 7 a la 15. Las categorías 7, 8 y 9 corresponde
a microorganismos patógenos tales como Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, cuya cantidad en los alimentos
condiciona su peligrosidad para causar enfermedades alimentarías. A partir de la categoría 10 corresponde a
microorganismos patógenos, tales como Salmonella sp, Listeria monocytogenes, Escherichia coli H7 O15,7 entre
otros patógenos, cuya sola presencia en los alimentos condiciona su peligrosidad para la salud

2.- Estructura morfológica y bioquímica de las bacterias, mohos, levadura

BACTERIAS:

Generalidades estructurales

• Bacteria: bacterium = bastón

• Características

– Ribosoma 70S

– Pared bacteriana

– Ausencia de esteroles

– Ausencia de mitocondrias, RE, AG

– Órganos de Movilidad

– Cromosoma único

– Plásmidos
Morfología bacteriana

Tamaño:

– 0.2 a 3-4 µm de diámetro.

– Mycoplasma (pequeñas)

Tamaño pequeño intercambio más eficiente, permite mayor

velocidad metabólica

Forma:

– Cocos– Bacilos– Espirales– Filamentosas– Pleomórficas

Tinción de Gram
Se tiñe con:

1.- Cristal violeta

2.- Lugol

3.- Decolorante (acetona)

4.- Contraste (safranina)

No es una prueba fiable

• No diferencia a Micobacterias (que poseen una envoltura externa cerosa y se distinguen mediante la tinción de
acidorresistencia) y los Micoplasmas(carecen de peptidoglucano).
Pared Celular

• Estructura exclusiva de las bacterias (10 – 40% peso bacteriano)

• Superficie externa cubierta de proteínas

• Funciones:

- Rigidez y resistencia osmótica (mantener la forma, evitar la lisis).

- Comunicación con el medio exterior.

- Puede estar involucrada en patogenicidad (LPS)

- Barrera contra ciertos agentes tóxicos (antibióticos β-lactámicos)

• Componente básico: Peptidoglicano o mureina

• Ausente en Micoplasmas
MOHOS:

Morfología del Moho La morfología estudia la forma y estructura de los mohos. Los mohos son vegetales del reino
Myceteae. Carecen de raíces tallos , hojas y no poseen clorofila. Pertenecen a los eumycetes u hogos verdaderos.
Mediante la observación macroscópica y microscópica se identifican y clasifican. Tienen aspecto velloso u
esponjoso. FORMAS: Un moho tiene la forma de filamento tubular y bifurcado que se extiende cada vez más, y
forma redes conectadas e irregulares. Algunos filamentos se compactan en patrones densos. También existe de forma
ovoide o esferoide.

Características Generales de los Mohos

Crecen en condiciones que las bacterias no pueden pH bajos Bajos niveles de actividad acuosa (Aw) Altas
presiones osmóticas Aspectos negativos: Microorganismos que echan a perder los alimentos. Algunas cepas
producen micotoxinas. Aspectos positivos: Utilizan en bioprocesos de los alimentos. Utilizan producción de
aditivos para alimentos y enzimas.

Partes del Moho

Micelio (Talo de un hongo) Es el conjunto de hifas que constituye el talo de un moho. El micelio de un moho
parásito crece en el hospedante, ya sea superficialmente o en el interior del mismo. El micelio intercelular se alimenta
por absorción a través de la membrana o la pared del hospedante. Si entra dentro de la célula, entra en contacto con
el protoplasma del huésped. Hifas Las hifas son ramificaciones y se clasifican en vegetativas, cuya misión
fundamental es la incorporación de nutrientes y fértiles, que poseen las estructuras reproductoras en soportes aéreos.

DIVISON DEL MOHO SEPTADOS NO SEPTADOS

Aspergillus Hifa septada.

Esporas asexuales color negro en las conidias. La mayoría son xerolíficas (crecen en niveles bajos de actividad de
agua). Pudren y echan a perder: mermeladas, granos, jamones curados, nueces, frutas y verduras. Ejemplos:
Aspergillus flavus. – produce alfatoxinas Aspergillus oryzae. – hidroliza almidón por alfa-amilasa en la producción
de sake. Aspergillus niger. – obtiene ácido cítrico de sucrosa, produce enzimas como Beta-galactosidasa.
 Rhizopus Hifas aseptadas, forman esporangioforas en el esporangio.
Echan a perder frutas y verduras. Ejemplo: Rhizopus stolonifer. – Moho negro que se presenta en el pan.

Levadura

Las levaduras son hongos unicelulares de forma oval o esférica con un diámetro de
aproximadamente 3 a 5 µm. El crecimiento de las levaduras ocurre por un proceso de gemación en
la que la célula madre emite un brote y duplica su núcleo, uno de los nú- cleos pasa al brote y
posteriormente la célula hija, madura y se separa de la madre. Al- gunas veces la célula madre y su
progenie permanecen adheridas formando los pseu- domicelios.

Las levaduras son importantes por su capacidad para realizar la descomposición mediante
fermentación (predominantemente alcohólica) de diversos compuestos orgánicos,
principalmente los azúcares o hidratos de carbono, produciendo distintas sustancias.

características Generales de Levaduras

Aspectos negativos: Microorganismos que echan a perder los alimentos. Aspectos

positivos: Utilizan en bioprocesos de los alimentos. Utilizan producción de aditivos para
alimentos y enzimas.

características Generales de Levaduras

Aspectos negativos: Microorganismos que echan a perder los alimentos. Aspectos positivos: Utilizan en
bioprocesos de los alimentos. Utilizan producción de aditivos para alimentos y enzimas.

Pichia Células son ovaladas y cilíndricas.

Forman películas en vinos y cervezas que estropean las bebidas. Algunos son utilizados en la fermentación
de comidas orientales. Ejemplo: Pichia membranaefaciens.

Rhodotorula Levaduras formadores de pigmentos.

Causan decoloración carnes, pescados y sauerkraut. Ejemplo: Rhodotorula glutinis.

Torulopsis Estropean la leche, porque pueden fermentar la lactosa.

Estropean jugos de frutas concentrados y frutas ácidas. Ejemplo: Torulopsis versatilis
3.- ¿Cuáles son los tipos de muestreo?

Planes de muestreo
El plan de muestreo sólo se aplica a lote o lotes de alimentos y bebidas. Se sustenta en el riesgo para
la salud y las condiciones normales de manipulación y consumo del alimento, y establece:

1. Categoría de riesgo: Escala relativa al riesgo que representa un alimento y a la manipulación

posterior prevista.
2. Componentes del plan de muestreo
o "n" (minúscula): Número de unidades de muestra requeridas para realizar el análisis,
que se eligen separada e independientemente, de acuerdo a normas nacionales o
internacionales referidas a alimentos y bebidas apropiadas para fines microbiológicos.
o "c": Número máximo permitido de unidades de muestra rechazables en un plan de
muestreo de 2 clases o unidades de muestra provisionalmente aceptables en un plan de
muestreo de 3 clases. Cuando se detecte un número de unidades de muestra mayor a
“c” se rechaza el lote.
o "m" (minúscula): Límite microbiológico que separa la calidad aceptable de la
rechazable. En general, un valor igual o menor a “m”, representa un producto aceptable
y los valores superiores a "m” indican lotes rechazables en un plan de muestreo de 2
clases.
o

o "M" (mayúscula): Los valores de recuentos microbianos superiores a "M" son

inaceptables, el alimento representa un riesgo para la salud.
3. Tipos de plan de muestreo para lote o lotes:

 Plan de 2 clases: Es un plan de muestreo por atributos, donde puede establecerse únicamente la
condición de "aceptable" o "rechazable". Un plan de 2 clases queda definido por “n” y “c”;
o Para microorganismos patógenos:
Condición de "aceptable" = ausencia
Condición de "rechazable" = presencia
 o Para otros microorganismos
Condición de "aceptable" = menor o igual al nivel crítico establecido, “c”
Condición de "rechazable" = mayor al nivel crítico establecido, “c”
o

 Plan de 3 clases: Es un plan de muestreo por atributos que queda definido por "n", "c", "m", "M";
donde se establece:

Condición de "aceptable":
Cuando todas las unidades de muestra presentan recuentos igual o inferiores a "m".
Cuando hasta "c" unidades de muestra pueden tener recuentos entre "m" y "M" (incluido
"M").
Condición de "rechazo":
Cuando más de "c" unidades de muestra presentan recuentos entre "m" y "M" (incluido
"M").
Cuando al menos 1 de las unidades de muestra presentan recuentos superiores a "M".
 PLANES DE MUESTREO PARA COMBINACIONES DE DIFERENTE GRADO DE RIESGO PARA LA
SALUD Y DIVERSAS CONDICIONES DE MANIPULACIÓN

4 : Tipos o métodos de conservación que se utilizan para mantenimiento de microorganismo de uso

Industrial.

PARAMETROS PARA LA SELECCIÓN DE LOS METODOS DE

PRESERVACION

Existe una gran variedad de métodos que tienen ventajas y desventajas, disponibles para la
conservación de microorganismos, sin embargo hay que seleccionar el método que permita la mayor
estabilidad en la característica de interés investigativo ó industrial por la cual se va a conservar la
cepa. Si se tiene en cuenta que la reata de supervivencia y el mantenimiento de su actividad no siempre
se relacionan (Maruyama, 1982).
La función básica de la conservación es mantener la viabilidad, no contaminación y estabilidad de las
características de manera la cepa conservada sea lo más posible igual a la original. No todas las cepas
responden de igual forma al mismo método, incluso algunas especies son variables al mismo proceso.
Es importante enfatizar que el éxito o el fracaso de cualquier método, depende de la utilización de un
medio adecuado, procedimiento utilizado en la cultivación y edad del cultivo, esto es particularmente
importante cuando trabajamos con bacterias que contienen plasmidos de resistencia o DNA
recombinante, ó que exhiben fases de crecimiento como los esporoformadores

Los siguientes parámetros son las consideraciones que deben ser tenidas en cuenta en la selección de
un método de conservación.

1. Mantenimiento de la Viabilidad: La muerte celular, puede ocurrir durante el proceso de

conservación y almacenamiento, es por ello que se debe seleccionarse un método que disminuya
el riesgo de pérdida de la viabilidad por periodos prolongados de tiempo.
2. Selección por Cambios en la Población: La reducción en el número de células viables, puede
ocasionar la selección de la población, lo cual puede introducir posibilidad de cambio a la cepa
originalmente conservada. Por lo tanto se debe seleccionar el método de conservación que
favorezca el mantenimiento del mayor número de células viables, de manera que la población sea
lo más cercana a la originalmente conservada.
3. Cambios Genéticos: Es importante que el microorganismo conserve las características de interés
científico ó industrial, por las cuales fueron conservadas, es por ello que el método de conservación
utilizado, no debe favorecer ni la pérdida ni ganancia de otras características.
4. Pureza: Los cultivos conservados deben permanecer puros y el método utilizado debe disminuir
la posibilidad de contaminación.
5. Costo: El costo de mantenimiento de los cultivos incluye personal, equipos, reactivos y materiales.
6. Réplicas: Para la consideración de este parámetro es necesario tener en cuenta: número de
operarios que se requieren para la conservación, evaluaciones periódicas a realizar y el espacio
disponible.
7. Importancia del Cultivo: Es importante selecciona el método que me permita disminuir los
riesgos de pérdida, por lo tanto es necesario la selección de más de un método de conservación.
Para cepas de menor valor, criterios como costo deben ser tenidos.

8. Suministro y Transporte del Cultivo: Si las cepas son suministradas debe existir réplicas de
estas, estas réplicas pueden ser preparadas cuando son requeridas, esto depende del método de
conservación y del número de cultivos a ser distribuidos. Es importante que el método
seleccionado para el suministro debe resistir las condiciones de envió, por otra parte se debe tener
en cuenta las regulaciones existentes en cuanto el envió de las cepas.

9. Frecuencia en la Utilización del Cultivo: Los cultivos requeridos con frecuencia, como
en el caso de ensayos de control de calidad, deben tenerse en cuenta el riesgo de
contaminación y la necesidad de recuperación cada vez de que sea necesitado.
 METODOS DE PRESERVACION

Los métodos de preservación se dividen en métodos de corto y largo plazo:

MÉTODOS DE CORTO PLAZO:

1. Subcultivo
2. Inmersión en Aceite
3. Congelación Ordinaria -20ºC
4. Baja Congelación -70ºC
5. Secado
Suelo O Arena Papel De Filtro
Tapones Presecados Gelatina

Silica Gel
Perlas De Vidrio Y Porcelana

METODOS A LARGO PLAZO

1. LIOFILIZACION
2. ULTRACONGELACION

Subcultivo: Consiste en la inoculación del cultivo en un medio adecuado, para el crecimiento

y almacenamiento en condiciones favorables. El intervalo de transferencia depende del tipo
de microorganismo, medio utilizado y condiciones de almacenamiento. El cultivo se repica
cada vez a un medio fresco, antes de que el cultivo expire. El tiempo necesario para el repique
depende del tipo de microorganismo. En el caso de Neisseria sp se requiere un subcultivo
antes de unas pocas semanas.
 Ventajas Desventajas
Poco costo en términos de equipo Costo en cuanto al personal necesario para
realizar los subcultivos
Fácilmente recuperables, cuando son cultivos Alto riesgo de contaminación por
que se requieren con alta frecuencia subcultivo

Alto riesgo de mutación

Alto riesgo de selección en la
población y pérdida de características
Aplicable a un amplio rango de Se requiere de un espacio amplio para el
microorganismos almacenamiento.
No es un método recomendable para el
suministro, por que las condiciones de envío
pueden resultar adversas.

Inmersión en Aceite: Algunas bacterias pueden sobrevivir meses e incluso años inmersas
en aceite mineral estéril grado medicinal o con la utilización de parafina de gravedad
especifica 0.865 - 0.890. El aceite se esteriliza en calor seco a 180ºC x 2horas, la
autoclavación no es recomendable, luego se debe chequear la esterilidad del aceite en un
caldo nutritivo.
Congelación ordinaria: el rango de temperatura es de o -20ºC, el éxito depende de la especie
bacteriana, algunas bacterias pueden sobrevivir por 6 meses a 2 años. En general no es muy
recomendable por el daño que produce a nivel de congelación de la célula.
Cuando la temperatura de la suspención celular cae más abajo de los 0ºC, el liquido
extracelular empieza a congelarse y formar cristales de hielo externo, estos aumentan la
concentración de soluto y el agua intracelular empieza a migrar hacia fuera de la célula por
la diferencia de presión osmótica, esta remoción de agua resulta en un daño celular.

. Baja Congelación:

El almacenamiento a -70ºC, ha sido ampliamente utilizado para una variedad de

microorganismos que incluyen; bacterias, hongos, micoplasmas, protozoos y virus. Para la
realización de esta metodología, se prepara una suspención celular en un caldo con glicerol
(30 -50%v/v).las células se recuperan por descongelación en un baño a 37ºC.

Ventajas Desventajas
Utilizado para una amplia variedad de Costo de equipo
bacterias
Metodología rápida y fácil, no requiere No es utilizado cuando las muestras
subsecuente manipulación, durante el se requieren con mucha frecuencia
almacenamiento
Espacio mínimo
Utilizado para la preservación de
microorganismos por periodos
prolongados de tiempo
Secado: Los métodos de desecado consisten básicamente, en la remoción de agua y prevenir
la rehidratación. Este método es ampliamente utilizado para la conservación de hongos.

Suelo, Arena:
Varias especies de hongos esporulados sobreviven por períodos superiores a cinco años, sin
pérdida en las características (Altlkinson 1954). Las esporas son más resistentes si ellas son
secadas adicionalmente en un secador con un medio higroscópico (suelo, arena),
favoreciendo la formación de esporas en organismos esporoformadores. Las esporas nos son
necesariamente más resistentes por su protección contra la deshidratación.

Tiras ó Discos de Papel de Filtro:

Es un método simple y poco laborioso, preserva un amplio número de bacterias, lo cual
involucrado el secado sobre papel de filtro Whatman No 4, en tiras ó discos. Para la
realización de esta técnica, los discos ó tiras de papel se impregnan con la suspención, se
secan al aire ó en el desecador, y se almacenan en tubo ó tiras de papel plástico transparente
estériles en el desecador.
El almacenamiento del desecador en un refrigerador, incrementa la vida del cultivo.
 Tapones de proceso

Varios materiales como almidón, peptona y dextran han sido utilizados para hacer tapones
presecados, sobre los cuales son goteadas suspensión de organismos antes de ser secados y
almacenados en condiciones de vacío. Este método ha sido exitosamente utilizado para
bacterias que difícilmente pueden ser almacenadas por liofilización tales como Neisseria
gonorrheae y Vibrio cholerae (Annear 1956, Malik Cap 4,10)

Discos de gelatina:
Se ha reportado que las bacterias pueden sobrevivir por periodos prolongados de tiempo por
este método.
Este método ha sido ampliamente utilizado para la conservación de bacterias heterótrofas.
La suspensión de microorganismos se centrifuga y se resuspende (108 - 109 células mL) en
un medio con gelatina a 30ºC, utilizando pipeta de pasteur estéril se coloca una gota de esta
suspención en la base de una caja de petri y se permite la solidificación, luego se coloca la
caja en un desecador con pentóxido de fósforo, después de secados los discos se transfieren
a un tubo tapa rosca y se almacenan.

Silica Gel:
Es un método ampliamente utilizado para una variedad de microorganismos, es simple y
poco laborioso. Los tubos se llenan hasta la mitad con silica gel (malla 6- 12), grado 40,
actividad desecante y se esterilizan en un horno a 180ºC x 2 horas. Simultáneamente se
prepara la suspensión (1x108 células ó esporas) y se resuspende en 1 a 2 mL de leche
descremada al 10% v/V. A partir de esta suspención se toma 0.5mL a los tubos con sílica
previamente enfriados(manteniéndolos en hielo picado), para disminuir el efecto del calor
que se genera al absorber el cultivo, los gránulos anhídridos de silica).

Perlas de Vidrio ó de Porcelana Porosas:

Método ampliamente utilizado para la conservación de una gran variedad de bacterias

heterotróficas, 13 de 202 cultivos no fueron viables después de 21 años de
almacenamiento en perlas de vidr
 Método de Preservación Costo Longevilidad Estabilidad

Genética

Material Labor

Transferencia Periódica
Baja Alto 1-6 meses Variable
Media Alto 6 -12 variable
Almacenamiento a
Baja Bajo/Medio meses Pobre
Baja Bajo/Medio 1 -40 años Moderada
temperatura ambiente Media Bajo/Medio 1- 5 años Moderada
4 - 5 años
Almacenamiento en el

refrigerador

Almacenamiento en aceite

Almacenamiento en agua

Almacenamiento en

congelación

Secado
Baja Medio 5 - 25 años Moderada a baja
Suelo Baja medio 5 - 19 años Buena
Alta Inicialmente 4 - 40 años Buena
Silica gel Media

Liofilización

Congelación
Nitrógeno Líquido Alto Baja Infinita Buena: 23 años

En la Tabla se describe la comparación de los diferentes métodos utilizados para

la preservación de microorganismos y la efectividad de los mismos.
Bibliografía

Stevenson, R and Hatt, H (1992). Culture Collection , Functions. Encyclopedia of

Microbiology, Volumen 1, ed. Advisory Board. Academic Press, p 615 - 619.

Brock T. y Madigan T. Microbiología. Sexta Edition, 1993 Prentice-Hall.

Rickettsias y Clamidias (2008)MORFOLOGÍA Y ESTRUCTURA DE LOS

MICROORGANISMOS: Bacterias, Micoplasmas,. Mohos y Levaduras. Virus. Priones

http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/08_Tema_2_
morfologia.pdf

http://academico.upv.cl/doctos/ENFE-6017/%7B103AD534-8A1F-456C-9BF8-
99DD8BE54F05%7D/2012/S1/5.-
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http://www.sebbm.com/revista/imagenes/revistasebbm_0176.pdf