UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN SENYAWA

FLAVONOID DARI BUAH ANGGUR DENGAN

MENGGUNAKAN DPPH

PROPOSAL PENELITIAN

Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Guna Memenuhi Tugas Mata Kuliah
Metode Penelitian Pada Program Studi S1 Farmasi STIKes Bakti Tunas Husada
Tasikmalaya

DEDE YULIASIH

31115068

BAKTI TUNAS HUSADA TASIKMALAYA

PROGRAM STUDI FARMASI
TASIKMALAYA
2018
 KATA PENGANTAR

Puji syukur ke hadirat Alloh SWT Berkat limpahan karunia nikmat-Nya sehingga
proposal yang berjudul “uji aktivitas antioksidan senyawa flavonoid dari buah anggur
Menggunakan Metode DPPH dengan lancar. Dalam proses penyusunan proposal ini
tidak lepas dari bantuan, arahan dan masukan dari berbagai pihak. Untuk itu saya
mengucapkan terima kasih atas segala partisipasinya dalam menyelesaikan makalah
ini. Meski demikian, penulis menyadari masih banyak kekurangan dan kekeliruan di
dalam penulisan proposal ini, baik dari segi tanda baca, tata bahasa maupun isi.
Sehingga penulis secara terbuka menerima segala kritik dan saran positif dari
pembaca.

Demikian apa yang dapat saya sampaikan. Semoga makalah ini dapat bermanfaat
untuk masyarakat umumnya, dan untuk saya sendiri khususnya.

Tasikmalaya, 20 Maret 2018

Penulis

i
 DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR ........................................................................... i
DAFTAR ISI .......................................................................................... ii
DAFTAR TABEL.................................................................................. iv
DAFTAR GAMBAR ............................................................................. vi
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang .....................................................................................................1
1.2 Rumusan Masalah ................................................................................................4
1.3 Tujuan Penelitian .................................................................................................4
1.4 Kegunaan Penelitian.............................................................................................5
1.5 Kerangka Pemikiran .............................................................................................5
1.6 Metodologi Penelitian ..........................................................................................5
1.7 Lokasi dan waktu Penelitian ................................................................................5
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Anggur .................................................................................................................6
2.1.1 Klasifikasi Tumbuhan .......................................................................................6
2.1.2 Deskripsi Tumbuhan .........................................................................................7
2.1.3 Morfologi Tumbuhan .......................................................................................7
21.4 Kandungan dan Manfaat ...................................................................................8
2.1.5 Senyawa Fenol .................................................................................................8
2.1.6 Flavonoid .........................................................................................................8
2.1.7 Antosianin .......................................................................................................11
2.1.8 Resveratrol ........................................................................................................12
2.1.9 Komponen buah anggur sebagai antioksidan ....................................................13
2.2 Ekstraksi ...............................................................................................................14
2.2.1 Pengertian Ekstraksi ..........................................................................................14
2.2.2 Mekanisme Ekstraksi ........................................................................................15
2.2.3 Maserasi ............................................................................................................16
2.3 Metode Isolasi ......................................................................................................19

ii
2.3.1 Kromatografi .....................................................................................................19
2.3.2 Kromatografi Lapis Tipis ..................................................................................20
2.3.3 Identifikasi Kromatografi ..................................................................................22
2.3.4 Kromatografi Kolom .........................................................................................23
2.4 Antioksidan ..........................................................................................................23
2.4.1 pengertian antioksidan ......................................................................................23
2.4.2 mekanisme Antioksidan ....................................................................................25
2.4.3 Uji Aktivitas Antioksidan .................................................................................25
2.4.4 Faktor Penyebab ................................................................................................26

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Jenis dan Lokasi Penelitian ..................................................................................27
3.1.1 Jenis Penelitian .................................................................................................27
3.1.2 Lokasi Penelitian ...............................................................................................27
3.1.3 Waktu Penelitian ...............................................................................................27
3.2 Variabel Penelitian ...............................................................................................27
3.2.1 Variabel Indenpenden .......................................................................................27
3.2.2 Varabel Dependen .............................................................................................27
3.3. Bahan Penelitian..................................................................................................28
3.4 Alat Penelitian ......................................................................................................28
3.5 Metodologi Penelitian ..........................................................................................28
3.5.1 Determinasi Tumbuhan .....................................................................................28
3.5.2 Pengumpulan Bahan dan Pengolahan Bahan ....................................................28
3.5.3 Ekstraksi Sampel Buah Anggur ........................................................................29
3.5.4 Penafisan Fitokimia ...........................................................................................29
3.5.5 Penafisan Kromatografi Lapis Tipis GF 254 ....................................................31
3.5.6 Pemisahan Dengan Kromatografi Kolom .........................................................33
3.5.7 Uji Aktivias Antioksidan Secara Kualitatif Pada Fraksi Kolom .......................34
3.5.8 Uji Aktivitas Antioksidan Dengan Metode DPPH ...........................................34
3.6 Pembuatan Ekstrak ...............................................................................................35

iii
3.7 Penentuan Persen Inhibisi, Nilai IC50 dan Nilai AAI .........................................36
DAFTAR PUSTAKA

iv
 DAFTAR TABEL

Tabel 1.1 Jadwal kegiatan Penelitian .........................................................................5

v
 DAFTAR GAMBAR
Gambar 2.1 Buah Anggur .........................................................................................8

vi
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Penelitian

Indonesia merupakan Negara beriklim tropis dengan berbagai jenis tumbuhan

yang memiliki khasiat sebagai obat. Obat tradisional yang berasal dari tumbuhan
telah sejak lama digunakan oleh sebagian besar masyarakat Indonesia.
Masyarakat Indonesia umumnya menggunakan obat-obatan berbagai penyakit.
Banyaknya penggunaan obat tradisional dengan pemanfaatan tumbuhan-
tumbuhan di Indonesia menyebabkan perlu dilakukan berbagai penelitian dan
pengujian terhadap berbagai jenis tumbuhan yang ada di Indonesia, agar
penggunaannya sebagai obat tradisional menjadi lebih rasional. Saat ini
penggunaan obat tradisional berbahan herbal lebih digemari oleh sebagian besar
masyarakat Indonesia. Meningkatnya minat masyarakat terhadap obat tradisional
ditandai dengan meningkatnya jumlah industry obat tradisional di Indonesia
(Dewoto, 2007).
Radikal bebas adalah molekul yang mengandung satu atau lebih elektron tidak
berpasangan pada orbital terluarnya, radikal bebas sangat reaktif dan tidak stabil,
sebagai usaha untuk mencapai kestabilannya radikal bebas akan bereaksi dengan
atom atau molekul di sekitarnya untuk memperoleh pasangan elektron. Reaksi ini
berlangsung terus menerus dalam tubuh, dan menimbulkan reaksi berantai yang
mampu merusak struktur sel,12 bila tidak dihentikan akan menimbulkan berbagai
penyakit seperti kanker, jantung, katarak, penuaan dini, serta penyakit degeneratif
lainnya. Untuk meredam aktivitas radikal bebas diperlukan antioksidan.
Antioksidan adalah molekul yang dapat mendonorkan elektronnya kepada
molekul radikal bebas, sehingga menghentikan reaksi berantai tersebut.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa beberapa ekstrak tanaman memiliki
senyawa antioksidan seperti fenolik, flavonoid yang lebih efektif dan lebih aman
daripada antioksidan sintetis, seperti butylated hydroxytoluene. Antioksidan asam

1
fenolat, polifenol, flavonoid menghambat radikal peroksida, hidroperoksida atau
lipid peroxyl, menghambat mekanisme oksidatif, sehingga mencegah penyakit
degeneratif, selain itu berguna sebagai anti tumor dan mempunyai efek
pencegahan pada kerusakan hati. Flavonoid memiliki kemampuan anti-inflamasi
dan antioksidan yang terbukti mampu menghambat proses stress oksidatif pada
penyakit kardiovaskular dan neurodegeneratif.

Antioksidan dapat dimanfaatkan pada produk pangan sebagai aditif untuk

mencegah kerusakan akibat oksidasi, diantaranya untuk mencegah oksidasi lipid,
perubahan warna dan aroma pada pangan, selain itu antioksidan juga dapat
berperan
sebagai pengawet pangan. Salah satu alternatif antioksidan alami yang cukup
potensial adalah buah anggur. Buah anggur memiliki kadar antioksidan dan nilai
gizi yang tinggi, kaya akan vitamin C, serat, kalsium, zat besi, fosfor dan kalium,
selain itu buah anggur merupakan tanaman buah berupa perdu merambat yang
termasuk ke dalam keluarga Vitaceae. Buah ini biasanya digunakan untuk
membuat jus anggur, jelly, minuman anggur, minyak biji anggur dan kismis, atau
dimakan langsung. Buah ini juga dikenal karena mengandung banyak senyawa
polifenol dan resveratol yang berperan aktif dalam berbagai metabolisme tubuh,
serta mampu mencegah terbentuknya sel kanker dan berbagai penyakit lainnya.
Aktivitas ini juga terkait dengan adanya senyawa metabolit sekunder di dalam
buah anggur yang berperan sebagai senyawa antioksidan yang mampu
menangkal radikal bebas. sumber flavonoid yang baik. Buah anggur memiliki
aktivitas antioksidan dan kandungan fenolik yang lebih tinggi dari stroberi,
jambu batu, pepaya dan belimbing. Berdasarkan potensi yang dimiliki buah
anggur sebagai antioksidan alami dan mengandung komponen yang bioaktif
(flavonoid, fenol), maka perlu dipelajari lebih lanjut proses ekstraksi antioksidan
dan senyawa aktif pada buah anggur, sehingga dapat dimanfaatkan pada berbagai
produk makanan dan suplemen kesehatan Komponen kimia yang berperan
sebagai antioksidan adalah senyawa fenolik dan polifenolik. Senyawa-senyawa

2
golongan tersebut banyak terdapat di alam, terutama pada buah-buahan dan
rempah yang memiliki kemampuan menangkap radikal bebas. Salah satu metode
yang digunakan dalam menguji aktivitas antioksidan yaitu metode DPPH (1,1-
difenil-2-pikrilhidrazil). Metode pengujian ini merupakan metode yang
konvensial dan telah lama digunakan untuk penetapan aktivitas senyawa
antioksidan. Menurut Widyastuti (2010), metode DPPH mudah digunakan, cepat,
cukup teliti dan baik digunakan dalam pelarut organik.

Antioksidan merupakan senyawa yang melindungi sel dari stress oksidatif

yang dapat menyebabkan kerusakan terhadap lemak, protein, dan DNA yang
terbukti berperan dalam proses terbentuknya berbagai penyakit berbahaya.
(Mar’atirrosyidiah dan Estiasih, 2015). Fidrianny dkk (2014) melaporkan
bahwaIC50 ekstrak etanolik daun mentimun sebesar 416 ppm dan ekstrak etanol
buah anggur pada konsentrasi 1000 ppm memiliki aktivitas penangkapan radikal
DPPH sebesar 86,17%. Salah satu cara yang dapat digunakan untuk
meningkatkan aktivitas antiradikal suatu senyawa yakni menggunakan metode
fraksinasi atau purifikasi agar diperoleh ekstrak dengan kandungan senyawa yang
lebih spesifik yang telah terpisah dari senyawa lain yang kemungkinan tidak
mendukung aktivitasnya.

Reaksi oksidasi terjadi setiap saat, ketika manusia bernapas terjadi reaksi
oksidasi. Reaksi ini mencetuskan terbentuknya radikal bebas yang sangat aktif,
yang dapat merusak struktur serta fungsi sel. Namun, reaktivitas radikal bebas itu
dapat dihambat oleh sistem antioksidan yang melengkapi sistem kekebalan tubuh
(Winarsi, 2007).

Fraksinasi atau purifikasi dapat dilakukan secara langsung menggunakan

metode esktraksi padat-cair dengan pelarut yang memiliki polaritas bertingkat
terhadap serbuk sampel maupun secara tidak langsung yakni dengan metode
esktraksi cair-cair dari ekstrak yang telah dimiliki. Penentuan aktivitas
penangkapan radikal DPPH menggunakan metode ekstraksi dengan polaritas

3
 bertingkat secara langsung dari serbuk daun mentimun juga telah dilakukan
Fidrianny dkk. (2014)

Radiasi ionisasi merupakan salah satu penyebab terbentuknya radikal bebas,

dengan evaporator hingga diperoleh ekstrak kental.

Berdasarkan latar belakang inilah yang membuat peneliti ingin membuat

peneliti ingin mmbuktikan bahwa senyawa flavonoid terdapat di dalam buah
anggur (Vitis vinifera) yang memiliki khasiat sebagai antioksidan dengan judul
“ekstraksiantioksidan dan senyawa aktif dari buah anggur (Vitis vinifera)”

1.2 Rumusan Masalah

Identifikasi masalah dalam penelitian ini :
1. Apakah ada aktivitas antioksidan dari buah anggur ?
2. Apakah ada aktivitas antioksidan dari golongan senyawa flavonoid dari buah
anggur?
3. Berapa nilai IC 50 dari golongan flavonoid buah anggur)
4. Senyawa flavonoid apa yang memberikan aktivitas antioksidan tinggi?
1.3 Maksud dan Tujuan
1. Mengekstraksi antioksidan pada buah anggur dengan variasi rasio umpan
terhadap pelarut dan temperatur ekstraksi.
2. Menguji aktivitas antioksidan dengan menggunakan DPPH (1,1-Diphenyl-
picrylhidrazyl) sebagai radikal bebas.
3. Mempelajari dan menganalisis komponen aktif dalam ekstrak etanol buah
anggur.
1.4 Kegunaan Penelitian
Penelitian diharapkan dapat dijadikan sumber informasi mengenai khasiat dari
buah anggur (Vitis vinifera) sebagai antioksidan, sehingga dapat dijadikan sebagai
antioksidan.

4
1.5 Kerangka Pemikiran
Buah anggur (Vitis vinifera) digunakan secara empiris digunakan sebagai
antioksidan ataupun radikal bebas.

1.6 Metodologi Penelitian

Penelitian yang dilakukan adalah penelitian ini yang bertujuan untuk
mengekstraksi antioksidan pada buah anggur dengan variasi rasio umpan terhadap
pelarut dan temperatur ekstraksi. Buah anggur diekstraksi dengan metode
soxhletasi dengan menggunakan etanol. Lalu filtrate dikumpulkan dan diuapkan .
setelah itu penentuan kadar air, lalu skrining fitokimia, lalu dilakukan uji aktivitas
antioksidan dengan metode DPPH.
1.7 Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan September sampai bulan November
2018 di Laboratorium Farmakognosi Program Studi S1 Farmasi STIKes Bakti
Tunas Husada Tasikmalaya.

Oktober November
KEGIATAN 1 2 3 4 1 S 3 4 1 2 3 4
e
p
t
e
m
b
e
r
Preparasi sampel
Pembuatan ekstrak
Penafisan Fitokimia

5
 Uji aktifitas
antioksidan
Analisis Data
Statistik

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Anggur (Vitis vinifera)

2.1.1 Klasifikasi Tumbuhan

Klasifikasi anggur sebagai berikut :

Kingdom : Plantae

Division : Magnoliophyta

Class : Magnoliopsida

Order : Vitales

Family : Vitaceae

Genus : Vitis

Species :Vitis vinifera L., Vitis labrusca, Vitis acerifolia, Vitis

aestivalis, Vitis amurensis, Vitis arizonica, Vitis berlandieri, Vitis californica,

6
Vitis champinii, Vitis cinerel, Vitis coignetiae, Vitis davidii, Vitis doaniana,
Vitis girdiana, Vitis lincecumii, Vitis munsiniana, Vitis muscadinia, Vitis
mustangensis, Vitis novae-angliae, Vitis palmata, Vitis 7 riparia, Vitis
rotundifolia, Vitis rupestris, Vitis shuttleworthii, Vitis tiliifolia (Setiadi,
2005).

2.1.2 Deskripsi Tumbuhan

Anggur merupakan komoditi yang memberikan nilai tambah. Artinya,

bisa dikonsumsi sebagai buah segar, jus anggur, minuman (wine), kismis dan
lain-lain (Setiadi, 2005). Anggur merupakan tanaman yang tumbuh memanjat,
yang mempunyai keistimewaan yaitu ranting-rantingnya dapat mengeluarkan
buah yang lebat (Nurcahyo, 1999). Anggur dapat tumbuh dan dibudidayakan
di daerah dingin, subtropis, maupun tropis. Tanaman anggur tumbuh pertama
kali di dataran Eropa, Amerika Utara, Islandia, daerah dingin yang dekat
dengan Kutub Utara, Greenland dan menyebar ke Asia, termasuk Indonesia.
Di Indonesia, anggur lokal dipandang sebagai tanaman yang bernilai
komersial (Setiadi, 2005).

2.1.3 Morfologi Tumbuhan

Anggur dikelompokkan dalam kelas dikotil (biji berkeping dua). Daun

anggur berbentuk jantung yang mempunyai tepi bergerigi dan tepinya
berlekuk atau bercangap. Daunnya mempunyai tulang menjari, ujungnya
runcing dan berbentuk bulat hingga lonjong. Jenis Vitis vinifera, daunnya
tipis, berwarna hijau kemerahan dan tidak berbulu (Nurcahyo, 1999).

Batang anggur dibiarkan tumbuh liar, batang anggur mempunyai cabang yang
tidak jauh dari permukaan tanah. Sifat percabangan ini menjadikan anggur
sebagai golongan tumbuhan semak. Batang dapat tumbuh dan berkembang
hingga diameter lebih dari 10 cm. Awal pertumbuhan, batang anggur selalu
mencari penopang, bisa berupa tanaman hidup atau benda mati. Anggur

7
menggunakan bantuan cabang pembelit atau dikenal dengan sulur untuk
tumbuh memanjat. Sulur ini tumbuh dengan membentuk lilitan (Nurcahyo,
1999).

Akar anggur mempunyai perkembangan yang cepat jika tanahnya

gembur, bila musim hujan akar anggur dapat muncul pada akar ranting. Ini
membuat anggur mudah dikembangbiakkan dengan cara setek atau cangkok
dibandingkan dengan biji. Bunga anggur muncul pada ranting.

Bunganya berbentuk malai. Malai muncul sebagai kumpulan bunga

yang padat. Satu ranting bisa muncul lebih dari satu malai. Setelah bunga
pada malai mekar akan tumbuh buah berupa bulatan kecil. Bulatan ini akan
berubah warna sesuai dengan jenis tanaman anggur (Nurcahyo, 1999).

2.1 Tanaman anggur

2.1.4 kandungan dan manfaat

Anggur mempunyai nilai gizi yang baik seperti vitamin, mineral,

karbohidrat dan senyawa fitokimia. Polifenol merupakan komponen fitokimia
yang terkandung dalam anggur karena mempunyai aktivitas biologi dan
bermanfaat untuk kesehatan. Komponen polifenol diantaranya antosianin,
flavonoid, tannin, resveratrol dan asam fenolat (Xia et al., 2010).

8
2.1.5 Senyawa Fenol

Senyawa fenol mempunyai peranan yang sangat penting dalam

memberikan manfaat antioksidan pada buah dan sayuran. Kandungan
senyawa fenol paling banyak ditemukan pada kulit, stem, daun dan biji dari
anggur. Senyawa fenol dipercaya dapat digunakan untuk membunuh bakteri
(bakterisid) (Xia et al., 2010).

2.1.6 Flavonoid

Flavonoid merupakan komponen terbesar dalam senyawa fenol yang

mempunyai struktur kimia C6-C3-C6. Flavonoid terdapat dalam semua
bagian anggur diantaranya kulit, daging, daun dan bijinya. Flavonoid pada
prinsipnya mempunyai kandungan (+) catechin, (-) epicatechin dan polimer
procyanidin (Petrussa et al., 2013).

Flavonoid adalah suatu kelompok senyawa fenol yang terbesar

ditemukan di alam. Senyawa-senyawa ini merupakan zat warna merah, ungu,
dan biru, dan sebagian zat warna kuning yang ditemukan dalam tumbuh-
tumbuhan. Flavonoid merupakan kelompok molekul organik yang tersebar di
hampir seluruh bagian tanaman. Hampir semua bagian tanaman yaitu daun,
akar, kayu, tepung sari, nektar, bunga, buah dan biji dapat mengandung
flavonoid (Markham, 1988). Penyebaran jenis flavonoid terbesar terdapat
pada angiospermae (tumbuhan berbiji tertutup). Flavonoid mempunyai
potensi sebagai antioksidan (Goldberg, 1996).

Flavonoid mempunyai banyak efek yang baik terhadap kesehatan

tubuh manusia. Para peneliti menemukan flavonoid yang bermanfaat sebagai
antioksidan; berperan sebagai molekul messenger dalam interaksi antar sel;
antiinflamasi dengan memutus efek jalur metabolisme asam arakidonat,
mempengaruhi produksi prostaglandin dan pelepasan histamin, mempunyai
aktivitas scavenging, antitumor dengan memutus aktivitas promotor tumor,
dan antivirus diperkirakan memutus sintesis asam nukleat.

Flavonoid merupakan kelompok fenol dengan sebuah cincin aromatik

dan satu atau lebih gugus hidroksil yang tersebar di alam. Senyawa fenol
cenderung larut dalam air karena paling sering dijumpai bergabung dengan

9
 gula (glikosida) dan biasanya terdapat dalam rongga sel. Kurang lebih dua
ribu jenis golongan flavonoid tersebar di alam (Goldberg, 1996).

Flavonoid merupakan kelompok molekul organik yang tersebar di

hampir seluruh bagian tanaman. Hampir semua bagian tanaman yaitu daun,
akar, kayu, tepung sari, nektar, bunga, buah dan biji dapat mengandung
flavonoid (Markham, 1988). Penyebaran jenis flavonoid terbesar terdapat
pada angiospermae (tumbuhan berbiji tertutup). Flavonoid mempunyai
potensi sebagai antioksidan (Goldberg, 1996).

Penyebaran flavonoid pada tumbuhan yang secara taksonomi berkaitan

mempunyai kecenderungan kuat menghasilkan flavonoid dengan jenis serupa.
Informasi yang berguna tentang jenis flavonoid yang ditemukan pada
tumbuhan yang sedang ditelaah dapat diperoleh dengan melihat pustaka
mengenai telaah flavonoid terdahulu dalam tumbuhan yang berkaitan,
misalnya dari marga atau suku yang sama (Markham, 1988).

Flavonoid mempunyai banyak efek yang baik terhadap kesehatan

tubuh manusia. Para peneliti menemukan flavonoid yang bermanfaat sebagai
antioksidan; berperan sebagai molekul messenger dalam interaksi antar sel;
antiinflamasi dengan memutus efek jalur metabolisme asam arakidonat,
mempengaruhi produksi prostaglandin dan pelepasan histamin, mempunyai
aktivitas scavenging, antitumor dengan memutus aktivitas promotor tumor,
dan antivirus diperkirakan memutus sintesis asam nukleat (Markham, 1988).

Flavonoid adalah senyawa yang tersusun dari 15 atom karbon dan

terdiri dari 2 cincin benzen yang dihubungkan oleh 3 atom karbon yang dapat
membentuk cincin ketiga. Flavonoid dibagi menjadi 3 macam, yaitu:

1. Flavonoid yang memiliki cincin ketiga berupa gugus piran. Flavonoid ini
disebut flavan atau fenilbenzopiran. Turunan flavan banyak digunakan
sebagai astringen (turunan tanin).
2. Flavonoid yang memiiliki cincin ketiga berupa gugus piron. Flavonoid ini
disebut flavon atau fenilbenzopiron. Turunan flavon adalah jenis flavonoid
yang paling banyak memiliki aktivitas farmakologi.
3. Flavonoid yang memiiliki cincin ketiga berupa gugus pirilium. Flavonoid ini
disebut flavilium atau antosian. Turunan pirilium biasa digunakan sebagai
pewarna alami.
 Sifat- sifat dari senyawa flavonoid antara lain:

Sifat Fisika dan Kimia Senyawa Flavonoid

10
 Flavonoid merupakan senyawa polifenol sehingga bersifat kimia
senyawa fenol yaitu agak asam dan dapat larut dalam basa, dan karena
merupakan senyawa polihidroksi (gugus hidroksil) maka juga bersifat polar
sehingga dapat larut dalan pelarut polar seperti metanol, etanol, aseton, air,
butanol, dimetil sulfoksida, dimetil formamida. Disamping itu dengan adanya
gugus glikosida yang terikat pada gugus flavonoid sehingga cenderung
menyebabkan flavonoid mudah larut dalam air. Senyawa-senyawa ini
merupakan zat warna merah, ungu, biru, dan sebagai zat berwarna kuning
yang ditemukan dalam tumbuh-tumbuhan.Perkembangan pengetahuan
menunjukkan bahwa flavonoid termasuk salah satu kelompok senyawa
aromatik yang termasuk polifenol dan mengandung antioksidan (Harborne,
1987).

Flavonoid juga memiliki beberapa sifat seperti hepatoprotektif,

antitrombotik, antiinflamasi, dan antivirus. Sifat antiradikal flavonoid
terutama terhadap radikal hidroksil, anionsuperoksida, radikal peroksil, dan
alkoksil. Senyawa flavonoid ini memiliki afinitas yang sangat kuat terhadap
ion Fe (Fe diketahui dapat mengkatalisis beberapa proses yang menyebabkan
terbentuknya radikal bebas). Aktivitas antiperoksidatif flavonoid ditunjukkan
melalui potensinya sebagai pengkelat (Harborne, 1987).

Flavonoid terutama berupa senyawa yang larut dalam air. Mereka

dapat diekstraksi dengan etanol 70 % dan tetap ada dalam lapisan air setelah
ekstrak ini dikocok dengan eter minyak bumi. Flavonoid berupa senyawa
fenol, karena itu warnanya berubah bila ditambah basa atau amonia, jadi
mereka mudah dideteksipada kromatogram atau dalam larutan (Harborne,
1987).

Karotenoid adalah pigmen berwarna kuning, orange, dan orange

kemerahan yang terlarut dalam lipid meliputi kelompok hidrokarbon yang
disebut karoten dan derivat oksigenasinya xantofil (Ratna, 2005: 14)

2.1.7 Antosianin

Antosianin merupakan kelompok flavonoid yang berperan sebagai

pigmen yang memberikan warna ungu pada beberapa buah dan sayuran
seperti anggur. Komponen ini bermanfaat sebagai antioksidan dan
menginduksi 2-4 kali meningkatkan DNA fragmen (Indra, 2012). Flavonoid
bersifat antibakteri karena mampu berinteraksi dengan DNA bakteri yang

11
menyebabkan terjadinya kerusakan permeabilitas dinding sel bakteri,
mikrosom dan lisosom. Flavonoid mempunyai kemampuan untuk merusak
protein ekstraseluler dan protein yang larut serta merusak dinding sel bakteri
(Setyohadi et al.,2010)

2.1.8 Resveratrol

Resveratrol banyak terdapat pada bagian kulit dan biji anggur. Kulit
anggur segar mempunyai kandungan resveratrol sebanyak 40 mg perliter
ekstrak. Resveratrol juga banyak terdapat pada produk olahan anggur yaitu
wine. Resveratrol yang terdapat pada buah anggur dapat meningkatkan aliran
darah pada otak, sehingga dapat mereduksi penyakit stroke, mencegah
penyakit kanker, menghambat senyawa benzopyrene, yaitu senyawa yang
dapat menyebabkan kanker, serta menghambat pertumbuhan sel tumor (Xia et
al., 2010).

Beberapa penelitian menunjukan 47% konsumen lebih memilih

mengkonsumsi jus karena mengandung banyak vitamin. Manusia lebih
memilih membuat jus buah dan sayuran atau mengkombinasi keduanya
karena mempunyai rasa yang enak dan mengandung kaya vitamin dan
mineral. Jus anggur mengandung senyawa fenol termasuk resveratrol, caffeic
acid, ellagic acid yang mempunyai manfaat sebagai antioksidan, antibakteri,
antivirus, dan antikanker (Sloan, 2003 cit. Ravi et al., 2011).

Cara pembuatan jus anggur yang baik adalah dengan menghancurkan

seluruh bagian buah anggur kemudian disaring, sehingga didapatkan jus
anggur tanpa ampas. Jus yang dihasilkan akan berwarna seperti buah anggur,
yaitu berwarna ungu ini karena pigmen warna pada buah anggur mengandung

12
antosianin. Jus anggur yang diproses lebih lanjut bisa menjadi wine (Dani et
al., 2012).

Buah anggur dalam bentuk jus mengandung air 70-80%, karbohidrat

15-25%, asam organik 0,3-1,5%, tannin 0,01-0,10%, protein 0,0001-0,01%,
amino 0,017-0,11%, amoniak 0,001-0,012% dan mineral 0,3-0,6% (Setiadi,
2005). Menurut Dani et al (2012), jus anggur merupakan sumber penting
antioksidan. Jus anggur biru/hitam mempunyai kandungan mineral (Mg, Ca,
Mn, Fe, Cu, Zn, Si, S, Cl) dan senyawa fenol yang banyak dibandingkan
dengan dengan jus anggur putih.

Metode penelitian yang digunakan adalah preparasi anggur, ekstraksi

anggur yang meliputi teknik maserasi, soxhletasi dan supercritical fluid
extraction, uji fitokimia, konsentrasi hambat minimum, serta tahap kapsulasi.
Rendemen ekstrak anggur laut (Caulerpa racemosa) yang terbesar adalah
menggunakan metode soxhlet sebesar 17,28%. Komponen aktif yang
terkandung pada ekstrak maserasi dan soxhlet meliputi alkaloid, tanin, fenol
hidrokuinon, flavonoid, steroid, dan terpenoid, sedangkan komponen SFE
meliputi tanin, steroid, dan triterpenoid. Nilai LC50 ekstrak anggur laut yang
didapatkan lebih besar dari 1000ppm. Ekstrak mampu menghambat
pertumbuhan Salmonella Typhi berkisar 0,33-5,67 mm. Nilai KHM ekstrak
maserasi dan soxhlet terhadap ketiga jenis bakteri uji adalah 0,5 mg/ml.

2.1.9 komponen buah anggur sebagai antioksidan

Aktivitas antioksidan anggur terbentuk karena kerja sama antara

flavonoid, antosianin, vitamin, dan mineral yang dikandungnya. Aktivitas
antioksidan anggur yang sangat hebat tidak terlepas dari keberadaan pigmen
merah keunguan antosianin yang dimilikinya. Anggur merah termasuk buah
dengan kandungan antosianin yang tertinggi dari semua buah yang berwarna
merah keunguan. Ada beberapa jenis antosianin yang memberi warna merah
atau merah keunguan pada buah anggur, yakni eyanidin, peonidin,

13
 delphinidin.dan malvidin. Selain antosianin yang memberi warna merah
keunguan pada buah anggur, ada lagi dua jenis flavonoid utama yang dapat
kita temukan pada anggur, yakni quercitin dan resveratrol. Resveratrol
memiliki kemampuan antioksidan dua puluh kali lebih unggul dibanding
antioksidan standar — vitamin E. Selain itu, dalam jumlah yang relatif sedikit
anggur juga mengandung flavonoid lain berupa rutin, amentoflavon, dan
apigenin. Dalam menjalankan perannya sebagai antioksidan, seluruh
komponen antioksidan anggur saling bekerja sama menyusun kekuatan yang
tangguh untuk melawan radikal bebas. Efek perlindungan yang diberikan
meliputi bagian ekstraseluler dan intraseluler. Jenis radikal bebas yang
mampu direduksinya pun sangat beragam, baik yang bersifat larut dalam air
ataupun larut dalam lemak. Setidaknya ada dua penyakit yang mampu
dihalangi oleh antioksidan anggur, yakni penyakit yang ada hubungannya
dengan pembuluh darah serta kanker. Antosianin merupakan flavonoid terkuat
dari semua jenis flavonoid yang telah dikenal. Antosianin berperan sebagai
antioksidan melalui berbagai mekanisme. Pigmen alami anggur tersebut
memberi perlindungan yang sangat baik terhadap membran sel lemak. Selain
itu, antosianin juga memiliki kinerja sebagai anti inflamasi yang tangguh. Dua
kinerja tersebut sangat bermanfaat untuk memperbaiki kerusakan dinding
pembuluh darah dari pajanan radikal bebas. Dengan efektivitas seperti inilah,
maka konsumsi anggur sangat bermanfaat bagi penderita diabetes dan
hiperlipidemia yang rawan mengalami kerusakan pembuluh darah.

2.2Ekstraksi

2.2.1 Pengertian Ekstraksi

Ekstraksi adalah suatu proses pemisahan dari bahan padat maupun cair
dengan bantuan pelarut. Pelarut yang digunakan harus dapat mengekstrak
substansi yang diinginkan tanpa melarutkan material lainnya. Ekstraksi
merupakan proses pemisahan suatu bahan dari campurannya, ekstraksi dapat

14
dilakukan dengan berbagai cara. Ekstraksi menggunakan pelarut didasarkan
pada kelarutan komponen terhadap komponen lain dalam campuran (Suyitno
et al. 1989).

Ekstraksi adalah proses melarutkan komponen-komponen kimia yang

terdapat dalam suatu sampel dengan menggunakan pelarut yang sesuai dengan
komponen yang diinginkan. Ekstraksi ini didasarkan pada perpindahan masa
komponen zat padat ke dalam dan perpindahan mulai terjadi pada lapisan
antarmuka, kemudian terdifusi masuk ke dalam pelarut (Dirjen POM, 1986).

Dari hasil ekstraksi diperoleh ekstrak.Ekstrak adalah sediaan kental

yang diperoleh dengan mengekstraksi senyawa aktif dari simplisia nabati atau
simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai (Depkes RI Dirjen POM,
2000).

Ekstraksi tumbuhan adalah proses penarikan zat aktif dalam tumbuhan

dengan menggunakan pelarut tertentu. Senyawa atau kandungan dalam
tumbuhan memiliki kelarutan berbeda-beda dalam pelarut yang berbeda.
Pelarut-pelarut yang biasa digunakan antara lain: kloroform, eter, aseton,
alkohol, metanol, etanol, dan etil asetat (Harbone, 2006).

2.2.2 Mekanisme Ekstraksi

Umumnya, zat aktif yang terkandung dalam tanaman maupun hewan

lebih larut dalam pelarut organik. Pelarut organik akan menembus dinding sel
dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif akan
terlarut sehingga terjadi perbedaan konsentrasi antara zat aktif di dalam sel
dan pelarut organik di luar sel. Larutan dengan konsentrasi tinggi akan
berdifusi keluar sel dan proses ini berulang terus sampai terjadi
kesetimbangan antara konsentrasi zat aktif di dalam sel dan di luar sel (Dirjen
POM, 1986).

15
 Dengan mengalirnya bahan pelarut ke dalam ruang sel, protoplasma
akan membengkak dan bahan kandungan sel akan terlarut sesuai dengan
tingkat kelarutannya. Bahan kandungan sel akan terus masuk ke dalam cairan
disebelah luar sampai difusi melintasi membran mencapai keseimbangannya
yakni pada saat konsentrasi antara larutan di sebelah dalam dan sebelah luar
sel sama besar (Voigt, 1995).

2.2.3 Maserasi

Istilah maceration berasal dari bahasa latin macerare, yang artinya

“merendam”. Merupakan proses paling tepat dimana obat (sampel) yang telah
halus memungkinkan untuk direndam dalam menstrum sampai meresap dan
melunankkan susunan sel, sehingga zat-zat yang mudah larut akan melarut
(Ansel, 2005).

Ekstraksi adalah suatu cara penyarian simplisi dengan menggunakan

penyari tertentu (Harborne, 1987). Ekstraksi adalah kegiatan penarikan
kandungan kimia yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak
larut dengan pelarut cair (Ditjen POM, 2000).

Ekstrak adalah sediaan sari pekat tumbuh-tumbuhan atau hewan yang

diperoleh dengan cara melepaskan zat aktif dari masing-masing bahan obat,
menggunakan penyari yang cocok (Ansel, 1989). Ekstrak juga dapat diartikan
sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi senyawa aktif dari
simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai,
kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk
yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah
ditetapkan (Anonim, 2000). Cairan pelarut dalam proses pembuatan ekstrak
adalah pelarut yang baik (optimal) untuk senyawa kandungan yang berkhasiat
atau yang aktif, dengan demikian senyawa tersebut dapat terpisahkan dari

16
 bahan dan dari senyawa kandungan lainnya, serta ekstrak hanya mengandung
sebagian besar senyawa kandungan yang diinginkan.

Maserasi merupakan proses perendaman sampel dalam pelarut organik

yang digunakan pada temperatur ruangan. Penekanan utama pada maserasi
adalah tersedianya waktu kontak yang cukup antara pelarut dan jaringan yang
akan diekstraksi (Guether, 1987).

Maserasi digunakan untuk penyarian simplisia yang mengandung zat

aktif yang mudah larut dalam cairan penyari, tidak mengandung zat yang
mudah mengembang dalam cairan penyari, tidak mengandung benzoin, stirak,
dan lain-lain. Keuntungan cara maserasi adalah cara pengerjaan dan peralatan
yang digunakan sederhana dan mudah didapatkan (Anonim, 1986).

Proses ini sangat menguntungkan dalam isolasi bahan alam karena

dalam perendaman sampel tumbuhan akan terjadi pemecahan dinding dan
membran sel akibat perbedaan tekanan antara di dalam dan di luar sel
sehingga metabolit sekunder yang ada dalam sitoplasma akan terlarut dalam
pelarut organik dan ekstraksi senyawa akan sempurna karena dapat diatur
lama perendaman yang dilakukan. Pemilihan pelarut untuk proses maserasi
akan memberikan efektifitas yang tinggi dengan memperhatikan kelarutan
bahan alam dalam pelarut tersebut (Lenny, 2006).

 Faktor-faktor yang mempengaruhi ekstraksi

 Ukuran Bahan

Bahan yang akan diekstrak sebaiknya memiliki luas permukaan yang

besar untuk mempermudah kontak antara bahan dengan pelarut sehingga
ekstraksi berlangsung dengan baik (Hukmah, 2007). Kehalusan bubuk yang
sesuai akan menghasilkan ekstraksi yang sempurna dalam waktu yang singkat
(Guether, 1987).

 Lama dan Suhu Ekstraksi

17
 Lamanya waktu maserasi berbeda-beda tergantung pada sifat atau ciri
campuran obat dan menstruum.Lamanya harus cukup supaya dapat memasuki
semua rongga dari struktur sampel dan melarutkan semua zat yang mudah
larut. Lamanya maserasi bisa memerlukan waktu beberapa jam atau beberapa
hari untuk ekstraksi yang optimum (Ansel, 2005: 612).

Ekstraksi akan berlangsung cepat dilakukan pada suhu yang tinggi,

tetapi hal ini dapat mengakibatkan beberapa komponen yang terdapat dalam
rempah-rempah akan mengalami kerusakan (Hijaz, 2009). Ekstraksi yang baik
dilakukan pada kisaran suhu 20 ºC sampai 80 ºC tetapi suhu yang digunakan
harus di bawah titik didih pelarut yang digunakan. Semakin lama waktu
ekstraksi, kesempatan untuk bersentuhan semakin besar sehingga hasil
ekstraksi semakin bertambah banyak (Hukmah, 2007).

 Jenis dan Konsentrasi Pelarut

Menurut (Hukmah, 2007), ada dua pertimbangan dalam memilih jenis

pelarut yaitu pelarut harus mempunyai daya larut yang tinggi, pelarut tidak
berbahaya dan beracun.Pelarut yang paling aman adalah etanol.

Pemilihan cairan penyari harus mempertimbangkan banyak faktor.

Cairan penyari yang baik harus memenuhi kriteria murah dan mudah
diperoleh, stabil secara fisika dan kimia, bereaksi netral, tidak mudah
menguap dan tidak mudah terbakar, selektif yaitu hanya menarik zat
berkhasiat yang dikehendaki, tidak mempengaruhi zat berkhasiat,
diperbolehkan oleh peraturan (Anonim, 1986).

Etanol dipertimbangkan sebagai cairan penyari karena : lebih selektif,

kapang dan kuman sulit tumbuh dalam etanol 20% ke atas, tidak beracun,
netral, absorbsinya baik, etanol dapat bercampur dengan air pada segala
perbandingan, panas yang diperlukan untuk pemekatan lebih sedikit (Anonim,
1986).

18
 Metode ekstraksi yang digunakan dalam penelitian ini adalah
maserasi.Maserasi digunakan untuk penyarian simplisia yang mengandung zat
yang mudah larut dalam cairan penyari.Cairan penyari yang digunakan dapat
berupa air, air-etanol, pelarut lain. Keuntungan metode ini adalah pengerjaan
dan peralatan yang digunakan sederhana dan mudah diperoleh.Namun,
kerugian metode ini yaitu pengerjaanya lama dan penyariannya kurang
sempurna (Endah, 2008).

2.3 Metode Isolasi

Suatu ekstrak yang telah dihasilkan dari suatu ekstraksi, langkah

selanjutnya adalah fraksinasi ekstrak menggunakan metode pemisahan
sehingga komponen aktif dapat diisolasi (Heinrich, et al.2004).

Isolasi adalah suatu usaha bagaimana caranya memisahkan senyawa yang

bercampur sehingga kita dapat menghasilkan senyawa tunggal yang murni.
Tumbuhan mengandung ribuan senyawa sebagai metabolit primer dan
metabolitsekunder. Biasanya proses isolasi senyawa dari bahan alami
mengisolasi senyawa metabolit sekunder,karena dapat memberikan manfaat
bagi kehidupan manusia. Kandungan senyawa dari tumbuhan untuk isolasi
dapat diarahkan pada suatu senyawa yang lebih dominan dan salah satu usaha
isolasi senyawa tertentu maka dapat dimanfaatkan pemilihan pelarut organik
yang akan digunakan pada isolasi tersebut, dimana pelarut polar akan lebih
mudah melarutkan senyawa polar dan sebaliknya senyawaa non polar lebih
mudah larut dalam pelarut non polar. (Harborne, 1987)

Pemisahan dan pemurnian kandungan tumbuhan terutama dilakukan

dengan menggunkan salah satu dari keempat teknik kromatografi atau
gabungan teknik tersebut. Keempat teknik kromatografi itu adalah:
kromatografi kertas (KKt), kromatografi lapis tipis (KLT). Kromatografi gas
cair (KGC), dan kromatografi kinerja tinggi (KCKT) (Harborne, 1987).

19
2.3.1 Kromatografi

Kromatografi didefinisikan dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua

fase atau lebih, salah satu diantaranya bergerak secara berkesinambungan
dalam arah tertentu dan didalamnya zat-zat itu menunjukkan perbedaan
mobilitasdisebabkan adanya perbedaan dan adsorbsi, partisi, kelarutan,
tekanan uap, ukuran molekul atau kerapatan ion. Dengan demikian masing-
masing zat dapat diidentifikasi atau ditetapkan (Harbone, 1996).

Kromatografi merupakan metode pemisahan untukmemisahkan

campuran senyawa berdasarkan perbedaan waktu huni komponen campuran
dalam sistem fase diam dan fase gerak (Hostettman, et al., 1995). Fase gerak
membawa zat terlarut melalui fase diam dengan kecepatan tergantung pada
daya ikat setiap zat terlarut terhadap kedua fase. Zat terlarut yang lebih kuat
terikat pada fase gerak dari fase diam. Fase diam bertindak sebagai zat
penjerap seperti alumina, silika gel, dan resin penukar ion atau bertindak
melarutkan zat terlarut seperti pada kromatografi kertas (Harborne, 1996).

Prinsip pemisahan kromatografi yaitu adanya distribusi komponen-

komponen dalam fase diam dan fase gerak berdasarkan sifat fisik komponen
yang akan dipisahkan. Pada dasarnya semua cara kromatografi menggunakan
dua fase, yaitu fase diam (stationer) dan fase gerak (mobile).

2.3.2 Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan metode pemisahan

fisikokimia. Lapisan yang memisahkan terdiri dari fase diam yang
ditempatkan pada penyangga berupa pelat gelas, logam, atau lapisan yang
cocok. Campuran yang akan dipisahkan adalah berupa larutan yang ditotolkan
berupa bercak atau pita. Setelah pelat atau lapisan ditaruh didalam bejana
tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok, pemisahan terjadi

20
selama perambatan kapiler. Selanjutnya, senyawa yang tidak berwarna harus
ditampakkan (Sudjadi, 1983).

Kromatografi lapis tipis (KLT) dapat digunakan untuk tujuan analitik

dan preparatif. KLT analitik digunakan untuk menganalisa senyawa-senyawa
organikdalam jumlah kecil misalnya, menentukan jumlah komponen dalam
campuran dan menentukan pelarut yang tepat untuk pemisahan dengan KLT
preparatif. Sedangkan KLT preparatif digunakan untuk memisahkan
campuran senyawa darisampel dalam jumlah besar berdasarkan fraksinya,
yang selanjutnya fraksi -fraksi tersebut dikumpulkan dan digunakan untuk
analisa berikutnya (Townshend,1995).

Kromatografi lapis tipis (KLT) mempunyai banyak keuntungan,

misalnya peralatan yang diperlukan sedikit, murah, sederhana, waktu analisis
cepat dan daya pisah cukup baik (Sudjadi, 1983). Kelebihan khas KLT ialah
keserbagunaan, kecepatan, dan kepekaannya (Harborne, 1987). KLT
merupakan teknik yang benar-benar menguntungkan karena tingkat
sensitifitasnya sangat besar dan konsekuensinya jumlah sampel lebih sedikit
(Brain & Turner, 1975). Pada semua prosedur kromatografi, kondisi optimum
untuk suatu pemisahan merupakan hasil kecocokan antara fase diam dan fase
gerak dalam KLT (Sudjadi, 1983).

Jumlah volume fase gerak harus mampu mengelusi lempeng sampai

ketinggian lempeng yang telah ditentukan. Setelah lempeng terelusi,
dilakukan deteksi bercak (Gandjar & Rohman, 2007). Laju pergerakan fase
gerak terhadap fase diam dihitung sebagai retardation farctor (Rf). Nilai Rf
diperoleh dengan membandingkan jarak yang ditempuh oleh zat terlarut
dengan jarak yang ditempuh oleh fase gerak (Gandjar & Rohman, 2007).

Fase gerak harus memiliki kemurnian yang tinggi. Hal ini dikarenakan
KLT yang memiliki tingkat polaritas tersendiri, melarutkan senyawa contoh,
dan tidak bereaksi dengan penjerap (Gritter, et al., 1991). Adsorben umumnya

21
digunakan dalam KLT meliputi partikel silika gel , alumina, mineral oksida,
silika gel dengan ikatan kimia, selulosa, poliamida, polimer penukar ion,
silika gel, dan fase kiral (Gocan, 2002).

2.3.3 Identifikasi Kromatografi

Ada beberapa cara untuk mendeteksi senyawa yang tidak berwarna

pada kromatogram. Deteksi paling sederhana adalah jika senyawa
menunjukkan penyerapan di daerah UV gelombang pendek (radiasi utama
kira-kira 254 nm) atau jika senyawa itu dapat dieksitasi pada radiasi UV
gelombang pendek dan gelombang panjang (365 nm). Pada senyawa yang
mempuyai dua ikatan rangkap atau lebih dan senyawa aromatik seperti
turunan benzena, mempunyai serapan kuat ± di daerah 230-300 nm (Stahl,
1985).

Identifikasi dari senyawa-senyawa yang terpisah dari lapisan tipis

menggunakan harga Rf. Harga Rf didefinisikan sebagai berikut
(Sastrohamidjojo, 2005).

𝑗𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑔𝑒𝑟𝑎𝑘𝑎𝑛 𝑜𝑙𝑒ℎ 𝑠𝑒𝑛𝑦𝑎𝑤𝑎 𝑑𝑎𝑟𝑖 𝑡𝑖𝑡𝑖𝑘 𝑎𝑤𝑎𝑙

Rf = 𝑗𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑔𝑒𝑟𝑎𝑘𝑎𝑛 𝑜𝑙𝑒ℎ 𝑝𝑒𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡 𝑑𝑎𝑟𝑖 𝑡𝑖𝑡𝑖𝑘 𝑎𝑤𝑎𝑙

Nilai Rf untuk senyawa-senyawa murni dapat dibandingkan dengan harga-

harga standar. Nilai-nilai Rf yang diperoleh hanya berlaku untuk campuran
tertentu dari pelarut dan penyerap yang digunakan, meskipun demikian daftar
dari harga-harga untuk berbagai campuran dari pelarut dan penyerap dapat
diperoleh (Sastrohamidjojo, 2005).

2.3.4 Kromatografi kolom

22
 Kromatografi kolom merupakan metode kromatografi klasik yang
digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa dalam jumlah banyak
berdasarkan adsorpsi dan partisi (Gritter, et al., 1991). Kromatografi kolom
membutuhkan zat terlarut yang terdistribusi diantara dua fase, satu
diantaranya fase diam dan yang lainnya fase gerak. Fase gerak membawa zat
terlarut melalui media, hingga terpisah dari zat terlarut lain yang terelusi lebih
awal atau akhir. Umunya zat terlarut dibawa melewati media pemisah oleh
aliran suatu pelarut berbentuk cairan atau gas yang disebut pelarut (Harborne,
1987).

Pada kromatografi kolom, tabung pemisah diisi penjerap. Penjerap

yang biasa digunakan ialah silika gel. Pengisian ini harus dilakukan secara
berhati-hatidan merata. Penjerap dapat dikemas dalam tabung dengan cara
basah maupun kering (Harborne, 1987). Cara basah, silika gel terlebih dahulu
dijenuhkan dengan cairan pengelusi yang akan digunakan. Kemudian
dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding kolom secara kontinyu sedikit
demi sedikit, sambil kran kolom dibuka. Kemudian pelarut dialirkan hingga
silika gel mampat. Setelah silika gel mampat, pelarut dibiarkan mengalir
hingga batas adsorben. Kemudian kran ditutup dan sampel dimasukkan,
sampel yang dimasukkan terlebih dahulu dilarutkan dalam pelarut hingga
diperoleh kelarutan yang spesifik. Kemudian sampel dipipet dandimasukkan
ke dalam kolom melalui dinding kolom sedikit demi sedikit hingga semua
sampel masuk. Selanjutnya kran dibuka dan diatur tetesannya, serta
ditambahakan dengan cairan pengelusi. Tetesan yang keluar ditampung
sebagai fraksi-fraksi (Gritter, et al., 1991). Sedangkan cara kering, yaitu
dengan memasukkan silika gel ke dalam kolom yang telah diberi kapas sedikit
demi sedikit dan diratakan dengan alat pemampat kemudian ditambahkan
dengan cairan pengelusi (Gritter, et al., 1991).

2.4 Antioksidan

23
2.4.1 Pengertian antioksidan

Antioksidan adalah senyawa yang mampu menghilangkan,

membersihkan, dan menghambat pembentukan oksigen reaktif atau radikal
bebas dalam tubuh. Radikal bebas adalah atom atau molekul yang tidak stabil
karena memiliki elektron yang tidak berpasangan dalam orbital luarnya
sehingga sangat reaktif untuk mendapatkan pasangan elektron dengan
mengikat sel-sel tubuh. Apabila hal tersebut terjadi secara terus-menerus
dapat menyebabkan kerusakan dan kematian sel (Lautan, 1997). Antioksidan
ditujukan untuk mencegah dan mengobati penyakit seperti aterosklerosis,
stroke, diabetes, alzheimer, dan kanker (Aqil dkk., 2006). Antioksidan dapat
dibagi menjadi dua kelompok berdasarkan sumbernya yakni antioksidan
sintetik dan antioksidan alami (Triyem, 2010). Antioksidan dapat
menghambat atau memperlambat oksidasi melalui dua mekanisme, yaitu
pertama melalui penangkapan radikal bebas (free radical scavenging).
Antioksidan jenis ini disebut antioksidan primer. Termasuk jenis ini adalah
vitamin E (α-tokoferol) dan flavonoid, dan jalur kedua tanpa melibatkan
penangkapan radikal bebas. Antioksidan ini disebut dengan antioksidan
sekunder yang mekanismenya dapat melalui penangkapan logam, meredam
oksigen singlet (oxygen singlet quencher), mengubah hidroperoksida menjadi
spesies non-radikal, menyerap sinar ultraviolet dan mendeaktivasi oksigen
singlet (Ariyanto, 2006).

Menururt Karadag dkk. (2009) antioksidan memiliki beberapa

mekanisme, antara lain bertindak sebagai :

a . Hambatan fisik untuk mencegah akses ROS (reactive oxigen species) ke

bagian penting biologis, misalnya filter UV dan membran sel

b. Penangkap kimia (menyerap energi elektron, memadamkan ROSseperti

karotenoid, antosianidin)

24
 c. Katalisatior yang menetralisir atau mengalihkan ROS, misalnya antioksidan
enzim SOD (Superoxide Dismutase), katalase, dan glutation peroksidase

d. Mengikat atau menginaktivasi ion logam untuk mencegah generasi ROS,

misalnya feritin, seruloplasmin, dan katekin

e. Antioksidan rantai pemecah yang menangkap dan menghancurkan ROS,

seperti asam akrobat (vitamin C), tokoferol (vitamin E), asam urat, glutation,
dan flavonoid

2.4.2 Mekanisme kerja antioksidan

Radikal bebas yang terbentuk selama oksidasi berada dalam keadaan

yang sangat tidak stabil sehingga memiliki kecenderungan melepaskan
elektron atau menyerap elektron dari sel. Setiap kali sebuah elektron
dilepaskan atau ditangkap oleh radikal bebas, maka akan terbentuk radikal
bebas yang baru. Radikal bebas yang baru terbentuk akan terus melakukan hal
yang sama. Dengan cara ini, rantai radikal bebas tercipta. Jika kondisi ini terus
terjadi dalam waktu yang lama, sel tubuh akan menjadi rusak. Antioksidan
seperti beta karoten, vitamin C, dan vitamin E membantu mengubah radikal
bebas yang tidak stabil ke dalam bentuk yang stabil. Artinya, rantai radikal
bebas akan terhenti sehingga menghentikan pula proses oksidasi. Suatu jenis
antioksidan umumnya hanya efektif pada radikal bebas jenis tertentu. Itu
sebab, pada radikal bebas yang berlainan, suatu antioksidan mungkin tidak
akan menunjukkan efek yang diinginkan.

2.4.3 Uji aktivitas antioksidan

Metode DPPH

Metode DPPH merupakan metode yang cepat, sederhana, tidak

membutuhkan biaya tinggi dalam menentukan kemampuan antioksidan
menggunakan radikal bebas 2,2-diphenyl-1picrylhydrazyl (DPPH). Metode ini

25
 sering digunakan untuk menguji senyawa yang berperan sebagai free radical
scavengers atau donor hydrogen dan mengevaluasi aktivitas antioksidanya,
serta mengkuantifikasi jumlah kompleks radikal antioksidan yang terbentuk.
Metode DPPH dapat digunakan untuk sampel yang berupa padatan maupun
cairan (Prakash, Rigelhof, dan Miller, 2001).

Gugus krmofor dan ausokrom pada radikal bebas DPPH memberikan

absorbansi maksimum pada panjang gelombang 517 nm sehingga
menimbulkan warna ungu. Warna DPPH akan berubah dari ungu menjadi
kuning seiring penambahan antioksidan yaitu saat electron tunggal pada
DPPH berpasangan dengan hydrogen dari antioksidan. Hasil dekoloriasai oleh
antioksidan setara dengan jumlah electron yang tertangkap

2.4.4 Faktor penyebab

 Asap rokok dan vape : Merokok berada disatu ruangan bersama perokok
 Polusi udara :Berkendaraan (terutama sepeda motor),
mengoprasikan mesin (kendaraan, fotokopi, pendingin, pabrik, dll), berlama-
lama diruangan ber-AC
 Radiasi UV : Bekerja diluar ruangan, berkendara sepeda motor,
beraktivitas dilaut dan pantai.
 Pestisida : Menyemprotkan perstisida, memakan sayur dan buah
yang tercemar pestisida
 Obat-obatan : Mengonsumsi obat kanker seperti bleomycin,
anthracyclines, dan methotrexate. Atau obat lain yakni fenilbutason, beberapa
asam fenamat dan komponen aminosalisilat dari sulfasalasin.
 Olahraga berlebihan : Olahraga (terutama otot dan kardio) yang berlebihan
hingga terlalu lelah.

26
 BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Jenis dan Lokasi Penelitian

3.1.1 Jenis Penelitian

Penelitian dilakukan dengan menggunakan metode eksperimental

laboratorium yang menggunakan alat DPPH sebagai alat untuk mengukur
antioksidan.

3.1.2 Lokasi Penelitian

Penelitian ini dilakukan di laboratorium Bahan Alam Program Studi

S1 Farmasi STIKes Bakti Tunas Husada Tasikmalaya.

3.1.3 Waktu Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan September sampai Nopember 2018

3.2 Variabel Penelitian

3.2.1 Variabel Independen

Variabel independen adalah variabel yang variasinya berpengaruh

terhadap variabel lain. Variabel independen dalam penelitian ini adalah
perlakuan dengan ekstaksi dari buah anggur (Vitis vinifera) yang dibuat
dengan etano yang diberikan sebagai antioksidan.

27
 3.2.2 Variabel Dependen

Variabel Dependen adalah variabel penelitian yang diukur untuk

mengetahui besarnya efek atau pengaruh dari variabel lain. Varibel dependen
dalam penelitian ini adalah sebagai antioksidan dan senyawa aktif flavonoid
dari buah anggur (Vitis vinifera).

3.3 Bahan Penelitian

Bahan uji yang digunakan adalah buah anggur yang diperoleh dari
pasar singaparna, kabupaten Tasikmalaya, Tasikmalaya. Bahan kimia yang
digunakan dalam penelitian ini yaitu, aquadest, bahan kimia kualitas teknis
berupa etanol, bahan kimia kualitas pro analitik (sigma chem. Co.) berupa
DPPH. HCL, Mg.

3.4 Alat Penelitian

Alat yang digunnakan dalam penelitian ini, antara lain : gelas kimia
1L, alumunium foil, erlenmayer, cawan porselin, pipet tetes, gelas ukur, pipet
volume, spektofotometer uv-vis, vial.

3.5 Metodologi Penelitian

3.5.1 Determinasi tumbuhan

Determinasi tumbuhan ini dilakukan untuk menetapkan kebenaran

sampel tanaman buah anggur (Vitis vinifera) dengan mencocockan cirri-ciri
morfologi tanaman terhadap pustaka. Di determinasi di Laboratorium
Herbarium Sekolah Ilmu dan teknolgi Hayati, Institut Teknologi Bandung.

3.5.2 Pengumpulan bahan dan pengelolaan bahan

Tumbuhan uji yang digunakan adalah buah anggur (Vitis vinifera)

yang diperoleh dari pasar Singaparna, Kabupaten Tasikmalaya. Bagian
tumbuhan yang digunakan adalah buahnya, buah disortasi basah dengan cara

28
 dibersihkan, dicuci sampai bersih. Dengan tujuan untuk menghilangkan atau
memisahkan kototan atau bahan- bahan asing lainya dari bahan simplisia. Hal
tersebut dikarenakan ataupun ditakutkan ada mikroba yang tersisa. Kemudian
dirajang dan dikeringkan di dalam oven dengan suhu 50 – 60oC, tanpa
terkena sinar matahari langsung. Buah anggur yang telah dikeringkan
dihaluskan/ diserbukan dengan cara di blender.

3.5.3 Ekstraksi sampel buah anggur (Vitis vinifera)

Pembuatan ekstrak etanol 70% buah anggur menggunakan metode

maserasi, karena pada proses maserasi tidak memerlukan proses pemanasan
karena didalam buah anggur (Vitis vinifera) memiliki zat aktif minyak atsiri
yaitu zat yang mudah menguap sehingga dapat menghindari rusaknya zat-zat
dalam simplisia yang tidak tahan terhadap pemanasan, selanjutnya buah
anggur (Vitis vinifera) yang telah kering ditimbang sebanyak kurang lebih
800gram dimasukan ke dalam wadah maserasi, dibasahi dengan pelarut etanol
70% hingga semua simplisia terbasahi, diaduk kemudian ditambahkan
kembali etanol hingga batas pelarut 2 cm diatas simplisia. Wadah maserasi
ditutup dan disimpan selama 2 x 24 jam ditempat yang terlindung dari sinar
matahari. Selanjutnya disaring dipisahkan antara ampas dan filtrat. Kemudian
dilakukan remaserasi selama 2 x 24 jam, lalu dipisahkan antara ampas dan
filtrate dengan cara disaring. Filtrat yang diperoleh kemudian di rotary
evaporator dan diuapkan hingga diperoleh ekstrak etanol yang kental. Ekstrak
yang diperoleh di timbang dengan menggunakan neraca analitik.

3.5.4 Penafisan Fitokimia

Penafisan fitokimia dilakukan untuk mengetahui adanya kandungan

metabolit sekunder dalam sampel seperti pemeriksaan alkaloid, flavonoid, tanin,
polifenol, steroid, triterpenoid dan kuinon dalam bauh anggur.

1. Alkaloid

29
 Sebanyak 2 gram sampel dibasakan dengan amoniak 25%, digerus dalam
mortir kemudian ditambahkan dengan kloroform dan gerus.Campuran disaring
kemudian, filtrate atau lapisan kloroform ditambah HCL 10% lalu dikocok. Fraksi
air dibagi menjadi 2 bagian, dimasukan kedalam masing-masing tabung reaksi
dan diuji dengan pereaksi dragendorff dan mayer. Hasil positif ditunjukan dengan
terbentuknya endapan merah kecoklatan untuk dragendorf, endapan putih untuk
mayer (Farnsworth, 1996).

2. Flavonoid

Sampel ditambah air panas, didihkan selama 15 menit kemudian disaring.

Masukan filtrate kedalam tabung reaksi, kemudian ditambah serbuk Mg, larutan
alcohol HCL (1:1) dan ditambah amil alcohol, dikocok dan kemudian dibiarkan
memisah, jika timbul warna merah atau kuninh atau jingga pada lapisan
menandakan adanya senyawa flavonoid (Farnsworth, 1996).

3. Saponin

Ekstrak diambil 1 mg, dimasukkan dalam tabung reaksi, ditambah air

(1:1) dan sambil dikocok selama 1 menit, apabila menimbulkan busa
ditambahkan HCl 1 N, bila busa yang terbentuk dapat bertahan selama 10 menit
dengan ketinggian 1-3 cm, maka ekstrak positif mengandung saponin.

4. Tanin

Sampel ditambah dengan air panas, didihkan selama 15 menit, dinginkan

lalu saring.Filtrate dibagi menjadi 2 bagian, dimasukan kedalam masing-masing
tabung reaksi dan diuji dengan FeCl3 1% dan gelatin. Hasil positif ditunjukan
dengan terbentuknya waena hijau-ungu pada FeCl3 dan terbentuk endapan putih
pada gelatin (Farnsworth, 1996).

5. Kuinon

30
 Sampel ditambah air panas, didihkan selama 15 menit, dinginkan lalu
saring.Masukan 5 ml filtrat ke dalam tabung reaksi kemudian tambahkan
NaOH.Jika terbentuk warna merah menandakan adanya kuinon (Farnsworth,
1996).

6. Steroid dan Triterpenoid

Sampel buah anggur diambil 1 mg, dimasukkan dalam tabung reaksi,

dilarutkan dalam 0,5 mL kloroform dan ditambah dengan 0,5 mL asam asetat
anhidrat. Campuran ini selanjutnya ditambah dengan 1-2 mL H2SO4 pekat
melalui dinding tabung tersebut.Jika hasil yang diperoleh berupa cincin
kecoklatan atau violet pada perbatasan dua pelarut maka ekstrak tersebut
menunjukkan adanya triterpenoid, sedangkan jika hasil yang diperoleh terbentuk
warna hijau kebiruan maka ekstrak tersebut menunjukkan adanya steroid.

7. Polifenol

Sampel ditambah larutan pereaksi FeCl3 1% dalam air/etanol.Terbentuk

warna biru-hijau menunjukan adanya polifenol (Harbone, 1996).

3.5.5 penafisan Kromatografi Lapis Tipis GF 254

1. Uji Kualitatif dan Total Flavonoid

Proses pemisahan fraksi menjadi komponenkomponenya dilakukan untuk

mengetahui jumlah dan jenis flavonoid dalam fraksi yaitu dengan cara
menotolkan fraksi pada plat KLT GF254 lalu dielusi dengan eluen terpilih hasil
optimasi. Selanjutnya disemprot dengan pereaksi sitroborat yang spesifik dan
selektif untuk senyawa flavonoid. Bercak positif flavonoid jika terbentuk warna
kuning terang yang berpendar di bawah UV 366 (Markham, 1998). Untuk
mengukur total flavonoid dalam sampel digunakan prosedur berikut : Sebanyak 5
mg quercetin ditimbang dan dilarutkan dalam 10 metanol sebagai larutan stok

31
(500 µg/mL) lalu diencerkan sedemikian rupa sehingga diperoleh konsentrasi
larutan quercetin 40-120 µg/mL.

Ambil 0,5 mL larutan tersebut tambahkan 1,5 mL metanol; 0,1 mL AlCl3

10 %,; 0,1 mL Na asetat anhidrat 1M dan 2,8 mL aquades. Inkubasi selama 30
menit ukur absorbansinya pada π 415 nm. Setelah absorbansi diperoleh buat
persamaan regresinya (Chang et al., 2002).

Sampel uji ekstrak kloroform dengan konsentrasi 1000 µg/mL, ekstrak

etilasetat 1000 µg/mL dilarutkan dalam etanol, tambah 0,1 mL AlCl3 10 %; 0,1
mL Na asetat anhidrat 1M dan 2,8 mL aquades. Inkubasi selama 30 menit ukur
absorbansinya pada π 415 nm. Setelah absorbansi diperoleh lalu masukkan dalam
persamaan regresi yang dipeoleh diatas. Flavonoid total dinyatakan sebagai
quersetin equivalen per 100 gram bahan (mg QE/100 g ).

2. Uji Kualitatif dan Kuantitatif Aktivitas Antioksidan

Potensi antioksidan diuji dengan menyemprot bercak pada plat KLT

dengan larutan DPPH 0,2%. Apabila terjadi perubahan warna DPPH dari
ungu menjadi kuning maka senyawa tersebut bersifat antioksidan (Molyneux,
2004). Diamati bercak mana saja yang mengalami reaksi dengan DPPH. Hasil
uji harus dikonfirmasi dengan hasil uji kualitatif senyawa flavonoid karena
senyawa yang bersifat antioksidan tidak terbatas hanya pada senyawa
flavonoid saja. Uji kuantitatif aktivitas antioksidan dinyatakan sebagai IC50
yang dilakukan dengan tahapan berikut: Buat larutan stok DPPH pada
konsentrasi yang memberi serapan pada angka sekitar 1,0 yaitu pada
konsentrasi 50-100 M (Molyneux, 2004). Lalu buat juga larutan senyawa uji
sehingga diperoleh konsentrasi tertentu lalu tambahkan DPPH 50 g/mL
dengan perbandingan volume sama (1:1) pada setiap seri konsentrasi dan
diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37oC. Absorbansi diukur pada 515-517

32
nm. Kontrol positif menggunakan larutan vitamin C dengan kadar 15, 29, 30
dan 40 ppm dan diperlakukan seperti pada larutan uji. Nilai absorbansi yang
diperoleh kemudian dikonversi menjadi nilai IC50 dengan cara membuat
persamaan garis regresi linear, y=bx+a dimana y=daya hambat terhadap
DPPH dan x=kadar senyawa uji. Daya hambat dinyatakan sebagai % daya
hambat terhadap DPPH dan dihitung dengan persamaan berikut:

% daya hambat = 1 – Absorbansi senyawa uji/Absorbansi DPPH

Nilai IC50 merupakan hasil ekstrapolasi dari persamaan y=bx+a di atas, nilai
ini menggambarkan kadar suatu senyawa yang dapat menonaktifkan separuh
dari kekuatan DPPH.

3. Isolasi dan Penentuan Struktur Senyawa Flavonoid

Isolasi dilakukan terhadap fraksi yang mengandung flavonoid sebagai

antioksidan menggunakan kromatografi kolom. Eluen yang digunakan sama
dengan eluen pada proses KLT. Pengisian kolom menggunakan silika yang
sebelumnya dibuat bubur dengan cara mencampur silika sebanyak 15 g
dengan 30 ml eluen (1:2).Fraksi sebelumnya diimpregnasi dengan cara
menambahkan 1,2 g fraksi pekat dengan eluen dan serbuk silika hingga
diperoleh 15 g hasil impregnasi. Hasil optimasi menunjukkan bahwa untuk
sekali proses kromatografi dengan panjang kolom 30 cm diperlukan 3 gram
bahan hasil impregnasi. Hasil kromatografi ditampung dalam vial-vial 15 mL
dan selalu dikontrol dengan KLT, untuk vial yang menunjukkan bercak yang
sama dapat digabungkan. Penentuan struktur senyawa FC1 dilakukan dengan
spektroskopi UV-Vis dan 1HNMR. Hal tersebut didasarkan pada pendapat
Mabry et.al (1970) yang mengatakan bahwa senyawa flavonoid dapat
diidentifikasi jenis dan strukturnya menggunakan kedua metode tersebut

3.5.6 Pemisahan dengan Kromatografi Kolom

33
 Kromatografi kolom dibuat dari silika gel 60H sebagai fasa diam.
Adapun perbandingan campuran pelarut yang digunakan adalah n-heksan :
kloroform : etil asetat yaitu 1 : 2 : 3, etil asetat, etil asetat : etanol yaitu (14 :
1), (12 : 3), (10 : 5), (8 : 7), (6 : 9), (4 : 11), (2 : 13) dan etanol. Fraksi-fraksi
hasil kromatografi kolom dianalisis dengan KLT menggunakan campuran
pelarut n-butanol, asam asetat anhidrida, akuades dengan perbandingan 4 : 1 :
5. Fraksi yang memiliki noda yang sama atau mirip dijadikan satu fraksi
besar.

3.5.7 Uji Aktivitas Antioksidan Secara Kualitatif pada Fraksi Kolom

Fraksi kolom dilakukan KLT dengan campuran pelarut n-butanol,

asam asetat anhidrida dan akuades dengan perbandingan 4 : 1 : 5. Setelah
elusi selesai, lempeng dikeringkan dan disemprot dengan larutan 0,05 mM
DPPH dalam etanol. Fraksi kolom yang memberikan peredaman terbesar
terhadap perubahan warna DPPH dilanjutkan dengan penentuan aktivitas
antioksidan secara kuantitatif.

Dibuat kurva linear antara konsentrasi larutan uji sebagai absis (sumbu x) dan
% peredaman sebagai ordinat (sumbu y) dari kurva kalibrasi ditentukan
persamaan linearnya, kemudian nilai IC50 dihitung dari persamaan tersebut.

3.5.8 Uji Aktivitas Antioksidan Secara Kuantitatif dengan Metode DPPH

1. Pembuatan Larutan DPPH 0,1 mM

Sebanyak 4 mg serbuk DPPH ditimbang seksama, dilarutkan dengan metanol
p.a, dimasukkan ke dalam 100 mL labu ukur gelap, dan dicukupkan
pelarutnya hingga tanda batas kemudian dikocok hingga homogen. Untuk
setiap pengujian larutan DPPH dibuat baru.
2. Optimasi Panjang Gelombang DPPH
Larutan DPPH 0,1 mM sebanyak 2 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi
dan ditambahkan metanol p.a sebanyak 2 mL. Selanjutnya divortex hingga

34
 homogen, diinkubasi pada suhu kamar dalam ruangan gelap selama 30 menit.
Kemudian, tentukan spektrum serapannya menggunakan spektrofotometer
UVVis pada panjang gelombang 400 nm - 800 nm dan tentukan panjang
gelombang maksimumnya.
3. Pembuatan Larutan Blanko

Larutan DPPH 0,1 mM sebanyak 2 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan

ditambahkan metanol p.a sebanyak 2 mL, kemudian divortex hingga homogen,
diinkubasi pada suhu kamar dalam ruangan gelap selama 30 menit. Selanjutnya
larutan uji diukur serapannya menggunakan alat spektrofotometer UV-Vis pada
panjang gelombang 515,5 nm.

4. Pembuatan Larutan Vitamin C sebagai pembanding

Vitamin C dibuat larutan induk dengan konsentrasi 1000 ppm dengan cara
menimbang vitamin C sebanyak 10 mg, kemudian dilarutkan dengan metanol
p.a, dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL, dan dicukupkan pelarutnya
hingga tanda batas. Selanjutnya dibuat seri kosentrasi 2, 4, 6, 8, dan 10 ppm.
Masing-masing konsentrasi dimasukkan ke dalam labu ukur dan ditambahkan
metanol p.a sampai tanda batas. Masing-masing larutan uji di pipet sebanyak
2 mL, dimasukkan kedalam tabung reaksi, ditambahkan larutan DPPH 0,1mM
sebanyak 2 mL, kemudian divortex hingga homogen dan diinkubasi pada
suhu kamar selama 30 menit. Selanjutnya larutan uji diukur serapannya
menggunakan alat spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 515,5
nm.
5. Pengukuran serapan dengan menggunakan spektofotometer UV-Vis
Larutan uji pembanding sebanyak 2 mL dimasukan kedalam tabung reaksi,
tambahkan larutan DPPH 0,1 mM sebanyak 2 mL, dikocok dengan vortex
hingga homogeny, diinkubasi dalam ruang gelap selama 30 menit (
Molyneux, 2004, pp. 216) selanjutnya, serapan diukur pada panjang
gelombang 515,4nm.

35
3.6 Pembuatan Larutan Ekstrak

Ekstrak n-heksan, ekstrak etil asetat dan ekstrak metanol dibuat larutan
induk dengan konsentrasi 1000 ppm dengan cara menimbang masing-masing
ekstrak sebanyak 10 mg, kemudian dilarutkan dengan metanol p.a,
dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL, dan dicukupkan pelarutnya hingga
tanda batas. Selanjutnya masing-masing larutan ekstrak dibuat seri
konsentrasi 5, 10, 15, 20, dan 25 ppm. Pada masing-masing konsentrasi
dimasukkan ke dalam labu ukur dan ditambahkan metanol p.a sampai tanda
batas. Masing masing larutan uji di pipet sebanyak 2 mL, dimasukkan ke
dalam tabung reaksi, ditambahkan DPPH 0,1mM sebanyak 2 mL, kemudian
divortex hingga homogen dan diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit.
Selanjutnya larutan uji diukur serapannya menggunakan spektrofotometer
UV-Vis pada panjang gelombang 515,5 nm.

3.7 Penentuan Persen Inhibisi, Nilai IC50 (Inhibition Concentration)

dan Nilai AAI (Antioxidant Activity Index)

Persentase inhibisi adalah persentase yang menunjukan aktivitas radikal

tersebut. Persentase inhibisi terhadap radikal DPPH dari masing-masing

konsentrasi larutan sampel dapat dihitung dengan rumus:

𝑨𝒃𝒔𝒐𝒓𝒃𝒂𝒏 𝑩𝒍𝒂𝒏𝒌𝒐−𝑨𝒃𝒔𝒐𝒓𝒃𝒂𝒏 𝑺𝒂𝒎𝒑𝒆𝒍

% Inhibisi = 𝑿 𝟏𝟎𝟎 %
𝑨𝒃𝒔𝒐𝒓𝒃𝒂𝒏 𝑩𝒍𝒂𝒏𝒌𝒐

Setelah didapatkan persentase inhibisi dari masing-masing konsentrasi,

konsentrasi sampel dan persen inhibisi yang didapat diplotkan masing-masing

pada sumbu x dan y dalam persamaan regresi linear y = a ± bx. Persamaan
tersebut digunakan untuk menentukan nilai IC50 dari masing-masing sampel.
Nilai IC50 adalah konsentrasi sampel yang dapat meredam radikal DPPH
sebanyak 50% konsentraasi awal. Nilai IC50 didapatkan dari nilai x setelah

36
mengganti nilai y dengan 50 (Murni, 2012). Perhitungan nilai AAI
(Antioxidant Activity Index) digunakan untuk mengetahui index aktivitas
antioksidan dengan rumus:

𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝐷𝑃𝑃𝐻 (𝑝𝑝𝑚)

Nilai AAI : 𝐼𝐶50 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 (𝑝𝑝𝑚)

Menurut Scherer dan Godoy (2009) aktivitas antioksidan berdasarkan nilai

AAI (Antioxidant Activity Index), dikatakan lemah sebagai antioksidan jika

nilai

AAI < 0.5, aktivitas antioksidan sedang jika 0,5 < AAI < 1.0, aktivitas

antioksidan kuat 1.0 < AAI < 2.0 dan aktivitas antioksidan sangat kuat jika
nilai AAI > 2.0 (Faustino, et al, 2010).

37
 DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 2000. Parameter Ekstrak Tumbuhan Obat 1,3 direktorat. Jendral

pengawasan Obat dan Makanan Departemen Kesehatan Republik Indonesia.
Jakarta

Anonim. 1986. Sediaan Galenika. 2-3. Jakarta : Departemen Kesehatan Republik

Indonesia
Apriori dan Frequent Pattern- Growth (FP-Growth): Studi Kasus Percetakan PT.
Gramedia. Volume 4 No.1, halaman 121.

Ariyanto, M. 2006. Psikoterapi Dengan Doa. Suhuf. Jurnal Fakultas Agama Islam
Universitas Muhammadiyah Surakarta. Surakarta : Diakses 17 Oktober 2012.
http://eprints.ums.ac.id/1471
Dewoto, H.R., 2007, Pengembangan Obat Tradisional Indonesia menjadi
Fitofarmaka, Majalah kedokteran indonesia, 57(7): 205-211

Ditjen POM. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Cetakan Pertama.
Jakarta: Departemen Kesehatan RI. 2000.
Endah, N.A. 2008. Optimasi pembuatan ekstrak daun dewantaru (Eugenia uniflora
L.) menggunakan metode soxhletasi dengan parameter kadar total senyawa
fenolik dan flavonoid.

38
Gunadi, Goldie & Sensue, Dana Indra. 2012. Penerapan Metode Data Mining Market
Basket analysis terhadap Data Penjualan Produk Buku dengan Menggunakan
Alogaritma

Harborne, J.B. (2006). Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis

Tumbuhan (alih bahasa: Kosasih Padmawinata & Iwang Soediro).Bandung :
Penerbit ITB.

Hukmah, S. Aktivitas Antioksidan Katekin dari Teh Hijau (Camellia Sinensis O.K.
Var. Assamica (mast)) Hasil Ekstraksi Dengan Variasi Pelarut dan Suhu.
Skripsi. Malang Jurusan Kimia Fakultas Sains dan Teknologi Universitas
Islam Negeri. 2007.

Nurcahyo, Eko., 1999, Anggur dalam Pot, Jakarta : Penebar Swadaya

Petrussa, E., Braidot, E., Zancani, M., Peresson, C., Bertolini, A., Patui, S., dan
Vianello, A. 2013. Review: Plant Flavonoids—Biosynthesis, Transport and
Involvement in Stress Responses. International Journal of Molecular
Sciences, 14: 14950-14973

Setiadi, 2005, Bertanam Anggur, Jakarta : Penebar Swadaya

39