See

discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.net/publication/274956714

Evaluación de la productividad de dos medios

de cultivo para el muestreo ambiental
microbiológico

Research · April 2015

DOI: 10.13140/RG.2.1.2485.2006

CITATIONS READS

0 325

1 author:

Biunayki Reyes
Center for Genetic Engineering and Biotechnology
30 PUBLICATIONS 243 CITATIONS

SEE PROFILE

Some of the authors of this publication are also working on these related projects:

Cleaning Validation automatic filling machine View project

Environmental monitoring of clean rooms View project

All content following this page was uploaded by Biunayki Reyes on 14 April 2015.

The user has requested enhancement of the downloaded file.

••• Control de Calidad
Evaluación de la productividad
de dos medios de cultivo
para el muestreo ambiental
microbiológico
••• Entre las actividades de control de la Industria Farmacéutica donde se
utilizan los ensayos microbiológicos se encuentran los muestreos am-
bientales, validación de la limpieza de las áreas y equipamientos, bio-
carga de los procesos, prueba de esterilidad y límite microbiano de los
productos.
Ing. Caridad A. Gasmuri
González1, Lic. Biunayki
Reyes Díaz1, Téc. Noelia
Baltrell Mena1, Téc. Suanai
Brown Valdés1, Téc. Caridad
Isla Quevedo1, Téc. Amaury
Hierrezuelo Malberty1, y
Téc. Cilia Medros Robaina2,
Lic. Juana Maria Hernandez
Rodríguez2, Dra Marisel
Quintana Esquivel2.
Grupo de Control Microbiológico.
1
Dirección de Producción.
Laboratorio de Microbiología.
2
Dirección de Control de la
Calidad.
Centro de Ingeniería Genética
y Biotecnología de Cuba
Introducción
Como parte de la vigilancia
ambiental en las áreas de pro-
ducción se utilizan 4 métodos:
Sedimentación (placa expues-
ta), Volumétrico, muestreo de
superficies del área de equipos
y de las ropas del personal por
placas de contacto y control de
las manos enguantadas.
30 lifescienceslab sep-oct
Para el muestreo ambien-
tal se recomiendan medios de
cultivo de propósito general
y suplementados con aditivos
para minimizar el efecto de los
agentes higienizantes (USP 31,
1116, 2008). Es importante que
los resultados sean confiables y
reproducibles, y en tal sentido,
los medios de cultivo tienen
que ser estériles y capaces de
sustentar el crecimiento de los
microorganismos. Para ello es
vital la utilización de medios de
cultivo y cepas de referencias
de proveedores certificados
internacionalmente y pueden
incluirse microorganismos re-
presentativos aislados del am-
biente (ISO 11133-1, 2000)
La calidad de los medios
afecta directamente las obser-
vaciones e interfieren en las
características culturales de los
microorganismos, por lo que
el chequeo de la promoción de
crecimiento asegura la calidad
de estos, (Basu et al., 2005)
Según se refiere en varios
artículos (ISO 11133-2, 2000;
Sutton 2006 y 2007), la prue-
ba de promoción del medio de
cultivo, el límite de aceptación
para medios no selectivos es
70%, considerando la exactitud
del método y la variabilidad
biológica en el comportamiento
de los diferentes microorganis-
mos. En nuestro caso estableci-
mos como límite de aceptación
el criterio ≥ 80% de eficiencia
de crecimiento para todos los
microorganismos de prueba.
En este estudio se evaluó
la productividad de dos me-
dios de cultivo en diferentes
presentaciones: Agar Caso en
placas de contacto de 65 mm
ø, en placas petri de 90 y 100
mm ø y Agar Caso con Leci-
tina y Polisorbato 80 en placas
de contacto de 65 mm ø.
Algunas consideraciones de
Buenas Prácticas que se de-
ben en cuenta para el Control
de Calidad en la preparación
de los medios de cultivo.
Los medios de cultivos pre-
parados, listos para el uso,
deben ser almacenados bajo
condiciones que aseguren la
calidad del mismo hasta la fe-
cha de vencimiento. En la ISO
11133-2 se declara que la con-
servación de los medios en su
envase final puede ser mante-
nida en refrigeración entre 4 y
12 °C no más de 3 meses. En la
USP 30 solamente indican que
las condiciones de almacena-
miento deben ser validadas. La
MERCK en sus indicaciones
generales recomienda el alma-
cenamiento entre 12 y 15 °C
para períodos de tiempo más
prolongados, nunca deben
guardarse por debajo de O °C.
Para los ensayos microbio-
lógicos existen diferentes cri-
terios. En la ISO 11133-2, para
la prueba de esterilidad se re-
Tabla 1. Lista de las cepas de microorganismos usadas en este estudio
sugieren la incubación de 1
unidad durante toda la noche
Es vital la y como límite de aceptación
recomiendan que si más del
utilización 10% del total de las unidades
con medios de cultivos están
de medios de contaminadas, el lote comple-
to debe ser rechazado (Arora,
cultivo y cepas D,2004). Si se garantiza la ca-
lidad del medio y los compo-
de referencias nentes a utilizar, entonces se
debe prever una correcta pre-
de proveedores paración de acuerdo a los pro-
cedimientos establecidos.
certificados En estos procedimientos, al-
gunas de las operaciones a las
internacionalmente que se le prestará una atención
especial son: las de pesada y
y pueden incluirse disolución; la esterilización
donde se tendrán en cuentan
microorganismos todas las medidas planteadas
para esta operación; el control
representativos del agua utilizada que debe ser
destilada, desionizada o de ós-
aislados del mosis inversa, de manera que
esté libre de sustancias que
ambiente (ISO puedan inhibir el crecimiento
de los microorganismos.
11133-1, 2000)
Materiales y Métodos
Cepas bacterianas
Las cepas bacterianas que se
comienda utilizar el 1% de las utilizaron fueron cepas reco-
unidades seleccionadas al final mendadas por el suministra-
del proceso de dispensación, dor, siendo al menos 4 cepas
incubándolas a 37 °C durante de microorganismos aislados
18 horas. El criterio de acepta- en los ambientes de produc-
ción debe ser establecido por ción, 3 cepas bacterianas y un
el fabricante para cada medio hongo filamentoso; estos mi-
de cultivo. En otros artículos croorganismos de prueba se
sembraron por duplicado y se
incubaron entre 30 y 35 °C du-
rante 24 horas para las bacte-
rias y 72 horas para los hongos
(Tabla1)
Medios de cultivo
Se utilizaron dos medios de
cultivo: Agar Caso y Agar
Caso con Lecitina y Polisor-
bato 80, de la firma comercial
MERCK.
Placas estériles y desechables
Fueron utilizadas placas petri
de 100 mm ø de la firma co-
mercial Greiner BioOne, placas
petri de 90 mm ø de DeltaLab
Eurotubo y placas RODAC de
PBI International.
lifescienceslab sep-oct
Preparación del medio de
cultivo
El medio de cultivo se preparó
según las indicaciones del fa-
bricante descritas en el Manual
de Microbiología MERCK. El
vertimiento en las placas se
realizó de forma manual en
Cabina de flujo laminar hori-
zontal grado A, manteniendo
las precauciones en el trabajo
aséptico.
Flujograma de la preparación de medios de cultivo
Todas las etapas durante la
preparación de los medios de
cultivo son consideradas como
puntos críticos que deben ser
controladas para una correc-
ta elaboración de los mismos.
Los pasos para la preparación
de los medios son comunes,
estos son:
1.Pesar. Debe tenerse en cuen-
ta la cantidad a pesar depen-
diendo del volumen final de
medio a preparar. Siempre es
conveniente pesar un poco
más de la cantidad requerida
si el pesaje se hace a parte del
recipiente que contendrá el
medio final.
2.Disolver. Adicionar 2/3 par-
tes del volumen de agua
destilada a temperatura
templada sobre las paredes
del recipiente para arrastrar
el medio deshidratado que
haya quedado adherido a las
mismas.
3.C alentamiento-Ebullición.
Este paso se lleva a cabo
siempre en constante agi-
tación y su fin es facilitar la
disolución completa del me-
dio.
4.Esterilizar. Esta etapa solo
se realiza para aquellos me-
dios que en su formulación
/ composición no posean
componentes termosensibles
31
••• Control de Calidad

o cuando el fabricante así Partimos de la preparación

lo recomiende. En gene-
ral, el régimen de tem-
peratura-tiempo para la
esterilización de medios
de cultivo es 121ºC por
15 minutos.
5.Verter. Finalmente, una
vez terminado el tiempo
de esterilización debe de-
jarse atemperar el medio
hasta alcanzar tempera-
turas de 55ºC antes de
dispersarlo en las placas.
No se recomienda verter más
caliente ya que desprende
vapor de agua y así las placas
quedarán muy húmedas y
condensadas, pero tampoco
más frío por la compacta-
ción del gel.
Controles a los Medios de
Cultivo
Preparados los medios de cul-
tivos y vertidos en su envase
final, es vital realizar el control
de parámetros físicos y mi-
crobiológicos que certifican la
calidad final del medio de cul-
tivo. Como parámetro físico se
determina el pH del medio y
las características organolép-
ticas; microbiológicamente se
evalúa la esterilidad y la pro-
moción de crecimiento (Basu,
S. et al.2005)
Esquema de trabajo para la producción de placas con
medios de cultivo pH y Esterilidad
El agua utilizada es purifica-
da, correspondiente al punto
de uso AP-PU033. En la gráfi-
ca adjunta se muestra el com-
portamiento de la medición de
pH y conductividad del agua.
El comportamiento de am-
bos parámetros es positivo, to-
dos los valores se encuentran
dentro de los límites de control
establecidos. Estos resultados
ofrecen garantía de la calidad
del agua utilizada para la pro-
ducción de placas con medios
de cultivos.
Para cada medio de cultivo
se verificó el pH del medio
listo para usar teniendo en
cuenta que debe estar pH 7.3
± 0.2, por el método poten-
ciométrico con un pH-metro
(PHM 83 AUTOCAL, Radio-
meter, Dinamarca), así como
su esterilidad, para lo cual las
placas se incubaron durante 5
días a una temperatura entre
30 y 35 °C.
Como características orga-
nolépticas esta que sea de color
carmelita amarillo claro
Se evalúa la estabilidad del
medio realizando periódica-
mente los procedimientos
antes mencionados a los
medios almacenados, a fin
de determinar si las condi-
ciones son óptimas.
Promoción de crecimiento
La promoción del creci-
miento es la verificación
de que los lotes de medios
facilitan el crecimiento de
determinados cultivos mi-
crobianos procedentes de
una colección reconocida.
También debe verificar que los
medios selectivos inhiben el
crecimiento de microorganis-
mos no deseados. En lugar de
utilizar el método frecuente de
cultivo en línea, se recomien-
da utilizar un procedimiento
cuantitativo que consiste en
inocular en el medio un nú-
de un inoculo el cual a partir
Las operaciones de un cultivo en caldo tristona
soya de 24 horas para las bac-
a las que se le terias y levaduras, añadimos
solución salina peptonada y
prestará una realizamos diluciones seriadas
hasta obtener una concentra-
atención especial ción no mayor a 103 UFC/mL;
tuvimos en cuanta que para el
son: las de pesada caso de los hongos filamento-
sos las suspensiones de esporas
y disolución; la de cultivos de 5 a 7 días pue-
den ser mantenidas a tempera-
esterilización turas de 2 a 8°C, por periodos
de hasta 3 meses.
donde se tendrán Ejecución del ensayo: To-
mamos 2 placas del medio
en cuentan todas de cultivo a ensayar por cada
microorganismo de prueba, a
las medidas las que se inocularon 0.1mL
de la ultima dilución de cada
planteadas para microorganismo, con ayuda
de la espátula de Drgalsky se
esta operación; el disemino el inoculo, y luego
fueron incubadas de 30 a 35°C
control del agua de 18 a 24 horas
Para evaluar la productivi-
utilizada que debe dad de los medios de cultivo
se utilizó la técnica cuantita-
ser destilada, tiva de siembra en placa, con
la evaluación de las caracte-
desionizada o de rísticas culturales de las uni-
dades formadoras de colonias
ósmosis inversa, (UFC).
de manera que Análisis de los resultados
Para el análisis de los resul-
esté libre de tados utilizamos el software
estadístico STATGRAPHICS
sustancias que Centurion versión XV; usando
método No Paramétricos.
puedan inhibir el Después de la incubación,
se considera válido el conteo
crecimiento de los de las unidades formadoras de
colonias entre 20 y 100 (ISO
microorganismos 11133-2), determinándose la
productividad a través de la
siguiente expresión:
mero conocido, normalmente
pequeño, de microorganismos
y evaluar el número de micro- donde:
organismos recuperados. Este Pp: UFC presentes en la pla-
método puede utilizarse para ca de estudio por el factor de
establecer el nivel de recupe- dilución.
ración por debajo del cual se Pc: UFC presentes en la pla-
rechaza un lote. ca control por el factor de di-
Los pasos a seguir en el en- lución.
sayo de promoción del creci-
miento fueron: Evaluación de la productivi-

32 lifescienceslab sep-oct
dad.
Según Scott Sutton PhD, en su
artículo publicado en la revista
PMF Newsletter 2006, existe
una pregunta fundamental
del ensayo de Promoción de
Crecimiento la cual puede ser
expresada como: Es el nuevo
lote de medio tan bueno como
el anteriormente calificado?;
También dice que esta pregun-
ta no debe ser respondida ade-
cuadamente excepto por una
comparación estadística dado
la variabilidad de los datos mi-
crobiológicos.
Esto nos da la medida que
la evaluación de la calidad no
solo es medible por criterios
de resultados analíticos, si no
que el análisis estadístico de
los resultados obtenidos nos
reportan mejores elementos,
destacando como en la actua-
lidad son numerosas las publi-
caciones y guías regulatorias
que basan el análisis de resul-
tados siempre sobre una base
estadística; entonces, nues-
tros medios de cultivo fueron
evaluados a través de 15 lotes
consecutivos, midiéndose el
comportamiento entre las me-
dias calculadas empleando la
prueba W de Mann-Whitney
(Wilcoxon) (p>0.05). Según la
Hipótesis nula de que todas las
medias para los 15 lotes eva-
luados son iguales.
Prueba W de Mann-Whit-
ney (Wilcoxon) para comparar
medianas
• Hipótesis Nula: mediana1 =
mediana2
• Hipótesis Alt.: mediana1 <>
mediana2
• Rango Promedio de muestra
1: 9.38889
• Rango Promedio de muestra
2: 9.61111
• W = 1.0 valor-P = 0.964558
View publication stats
• No se rechaza la hipótesis
nula para alfa = 0.05; por lo
que no existen diferencias es-
tadísticamente significativas
entre los lotes
En la siguiente tabla se
muestran los resultados del
promedio en la productividad
de ambos medios evaluados
con las cepas de control utili-
zadas, para las placas RODAC
utilizadas en el monitoreo de
superficies.
Otro análisis que realizamos
a los medios de cultivo fue;
como se comportaron los mis-
mos, pero teniendo en cuenta
en el tipo de placa vertido, es
decir comparamos los resulta-
dos obtenidos en la promoción
del crecimiento para el medio
vertido en Placas RODAC y el
medio vertido en placas petri,
lo cual nos indica la calidad en
el proceso de vertimiento en
placas, teniendo en conside-
ración que para cada tipo de
placa el vertimiento es diferen-
te; ya que el uso posterior de
ambas es diferente, RODAC es
utilizada en el muestreo de su-
perficie contacto y placas petri
su uso es básicamente para el
monitoreo ambiental micro-
biológico por placa expuesta.
Aquí los resultados que ob-
tuvimos fueron muy satisfac-
torios, indicando que nuestros
operarios están altamente ca-
lificados y entrenados en esta
actividad pues como se obser-
va en la siguiente figura y para
la prueba de Friedman por el
método de comparación de
muestras, se evalua para los 15
lotes evaluados, el vertimien-
to en ambos tipos de placas
con los diferentes medios no
hay diferencias significativas,
aceptando igualmente la hipó-
tesis de que los valores de las
medianas calculadas para el
promedio de Pr son iguales ya
que valor de P > 0.05.
Conclusiones
Los resultados obtenidos ava-
lan el positivo desempeño del
personal que realiza la produc-
ción de placas con medios de
cultivos, las condiciones ope-
racionales, correcto funciona-
miento del equipamiento y la
calidad de las materias primas
lifescienceslab sep-oct
y componentes utilizados.
El por ciento de recupera-
ción de los microorganismos
de prueba es superior al 70%,
lo que demuestra la calidad de
los bancos de microorganismos
utilizados en cada ensayo. •
Referencias:
1. Arora, D. Quality assurance in Microbiology. In-
dia Journal of Medical Microbiology, (2004) 22
(2): 81-86
2. B asu S, Pal A, Desai P. K. Quality control of cul-
ture media in a microbiology laboratory. Indian J
Med Microbiol 2005; 23 (3): 159-63.
3. M anual de Microbiología MERCK 12ma edición,
2007
4. U SP 31, NF 26 ø1116ø Microbiological evalua-
tion of clean rooms and other controlled envi-
ronmental environments. 2008.
5. ISO 11133-1. Microbiology of food and animal
feeding stuffs – Guidelines on preparation and
production of culture media. General guidelines
on quality assurance for the preparation of cul-
ture media in the laboratory. 2000.
6. ISO 11133-2. Microbiology of food and animal
feeding stuffs – Guidelines on preparation and
production of culture media. Practical guidelines
on performance testing of culture media. 2000.
7. Sutton, S. Quality control of microbiological
culture media. PMF Newsletter, (2006) 12 (1):
2-11.
8. Sutton, S. Quality microbial recovery studies 50
% or 70 %. PMF Newsletter, (2007) 13 (9): 3.
33