Instituto Politécnico Nacional

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología

Laboratorio de Biotecnología de Cultivos Celulares

Práctica No. 1 y 2: Efecto de los reguladores de crecimiento en un cultivo

de callos de zanahoria y cultivo de células vegetales en suspensión para
la obtención de 𝝱-carotenoides.

Equipo Patentadas

Martínez Moreno Diana Guadalupe Ruíz Tapia María Isabel

Nevárez Barrera Jacqueline.

Grupo: 3FM3

Profesoras:
M. en F. D. Moreno Guerrero Karen Gisela
M. en B. Ramírez López Donají A.
Flores Gómez Estela

Fecha de entrega: 25 de Noviembre de 2016

 I. OBJETIVOS

GENERALES
 Evaluar el efecto de la adición de reguladores de crecimiento vegetal sobre la inducción y
crecimiento de callos a partir de explantes de cambium de zanahoria.
 Establecer cultivos de células en suspensión en medio MS líquido, a partir de callos de
zanahoria (Daucus carota) para la extracción de 𝝱-caroteno.

ESPECÍFICOS
 Identificar el efecto de la adición de dos tipos de RCV (auxinas y citosinas) sobre la inducción
de callos de zanahoria.
 Identificar la combinación de RCV que induce la formación de callos en mayor proporción y
con mayor friabilidad sobre el explante sometido a la experimentación.
 Obtener callos de zanahoria, de tamaño y friabilidad adecuados para el establecimiento de
cultivos de células en suspensión.
 Identificar las características necesarias en un callo vegetal para ser utilizado como explante
para un cultivo en suspensión.
 Observar el efecto de RCV adicionados al medio de cultivo sobre la proliferación, disgregación
y diferenciación de células en un medio líquido.
 Analizar cualitativamente la producción y extracción de 𝝱-caroteno a partir de células en
suspensión de zanahoria (Daucus carota).
 II. INTRODUCCIÓN
Cultivo de tejidos vegetales
El término genérico “cultivo de tejidos vegetales” involucra a diferentes técnicas de cultivo de
material vegetal diverso, incluyendo a los protoplastos (células desprovistas de su pared celular),
células, tejidos, órganos y plantas completas. Mediante éstas y otras técnicas de cultivo, es posible
obtener plantas libres de microbios en un medio nutritivo aséptico (estéril) en condiciones
ambientales controladas. También se lo conoce como “cultivo in vitro de plantas” por realizarse en
recipientes de vidrio (hoy también de otros materiales)1.
Hoy esta técnica tiene numerosas aplicaciones:
• Propagación masiva de plantas, especialmente para especies de difícil propagación por otros
métodos, o en vías de extinción
• Clonación de individuos de características agronómicas muy deseables durante todo el año
• Obtención de plantas libres de virus
• Producción de semillas sintéticas
• Conservación de germoplasma (conjunto de individuos que representan la variabilidad genética de
una población vegetal)
• Obtención de metabolitos secundarios
• Producción de nuevos híbridos
• Mejora genética de plantas (incluyendo obtención de plantas transgénicas)
• Germinación de semillas.
• Producción de haploides.
• Estudios fisiológicos diversos.

Totipotencialidad
La reproducción asexual de plantas por cultivo de tejidos es posible gracias a que, en general, varias
células de un individuo vegetal poseen la capacidad necesaria para permitir el crecimiento y el
desarrollo de un nuevo individuo completo, sin que medie ningún tipo de fusión de células sexuales
o gametas. Esta capacidad se denomina totipotencialidad celular, y es característica de un grupo de
células vegetales conocidas como células meristemáticas, presentes en los distintos órganos de la
planta. La potencialidad de una célula diferenciada (una célula de conducción, epidérmica, etc.) para
generar tejidos nuevos y eventualmente un organismo completo, disminuye con el grado de
diferenciación alcanzado por esa célula (Serentín, 2013).
Para realizar el cultivo in vtro se necesita tomar una porción de la planta a estudiar, es decir, un
explante. Éste es el tejido, órgano o embrión que se va a cultivar para obtener una planta igual a la
planta donante. Dependerá de la especie y del sitio de la planta. En general los meritemos apicales,
florales o las yemas apicales son los más usados como material vegetal de origen (Rojas 2004)2.
Las células vegetales crecidas en condiciones asépticas sobre medios de cultivo adicionados con
hormonas vegetales, pueden dividirse dando dos tipos de respuesta:

1
Seretín M.(2013) Los cultivos celulares y sus aplicaciones II (cultivos de células vegetales).Argenbio [en línea]
24/noviembre/16: www.argenbio.org/adc/uploads/pdf/Cultivos%20celulares%20II%20Euge.pdf
2
Rojas s (2004) Propagación asexual de las plantas. Colombia: CORPOICA/PRONATA/MADR.
 - una Desdiferenciación celular acompañada de crecimiento tumoral, que da lugar a una masa
de células indiferenciadas denominada callo, la cual bajo las condiciones adecuadas es capaz
de generar órganos o embriones somáticos (llamados así porque son estructuras similares a
un embrión, pero que no se originaron por unión de gametas),
- una respuesta morfogenética por la cual se forman directamente órganos (organogénesis) o
embriones (embriones somáticos).
Para que un tejido de células vegetales se lleve a cabo exitosamente, hay factores bióticos y abióticos
que controlar como el pH, húmedad, luz, intercambio gaseoso, fotosíntesis,etc. El factor más
importante a analizar es la variacón de la adición de reguladores de crecimiento al cultivo.
Reguladores de crecimiento
La auxina natural es una hormna que se produce en los meristemas apicales de brotes y en ápices de
los coleoptilos. Viaja unidireccionalmente hacia la base de la planta estimulando la elongación celular,
también interviene en la diferenciación del tejido vascular, induce la formación de raíces adventicias
en los esquejes y retrasa la absiciónen las hojas, flores y frutos.
Las Citocininas inducen la división celular y la formación de yemas en los cultivos de células vegetales
. Las Citocininas también pueden actuar en coordinación con la auxina para provocar la división
celular en los cultivos de tejidos vegetales. Estas hormonas impiden la senescencia de las hojas
estimulando la síntesis de proteínas. 3
En la figura 1 se muestran resumidas las hormonas y su efecto:

3
Raven P, Evert F & Eichhorn S (1992) Biología de las plantas. Barcelona: Reverté
 Figura 1. Fitohormonas y sus efectos.

Para el cumplimiento de los objetivos de esta práctica, lo que se busca es la formación de callo, es
decir, una masa de células indiferenciadas que se forma en las heridas de las plantas o en los cultivos
de tejidos a partir de células aisladas, para posteriormente hacer un cultivo de células en suspensión
para la obtención de B-carotenoides.

Cultivo de células en suspensión

En las suspensiones, las células individuales se distribuyen en forma homogénea a través del medio
de cultivo y por estar rodeadas del mismo, se facilita la transferencia de nutrientes y oxígeno hacia el
citoplasma. Este tipo de cultivo presenta la ventaja de permitir el control relativamente sencillo de
variables como temperatura, pH y oxígeno disuelto; sin embargo, pueden verse modificadas algunas
características de las células presentes en las plantas como su diferenciación y la comunicación
intercelular, lo que implica en muchos casos la disminución en la producción de metabolitos
secundarios, pues se ha reportado que en algunas especies la síntesis de ciertos metabolitos requiere
la coexistencia de diferentes tipos celulares o la compartimentalización intracelular.
Las suspensiones celulares finas están constituidas principalmente por células meristemáticas
indiferenciadas, más débiles e inestables en comparación con su estado en el ambiente natural (6)
pero con respecto a los cultivos de células diferenciadas (raíces y brotes), presentan las ventajas de
poder ser cultivadas a mayores concentraciones celulares y a mayores velocidades de crecimiento.
En el cultivo en suspensión el estado que más se aproxima a las condiciones naturales es la fase
estacionaria, en la que diversos autores han reportado un cierto grado de diferenciación,
observándose que la acumulación de metabolitos secundarios se presenta principalmente durante
este periodo; sin embargo, en caso de metabolitos asociados al crecimiento, su acumulación puede
ser proporcional a la producción de biomasa y se ha observado durante la fase exponencial en ciertas
líneas celulares, tales son los casos de la producción de betalaínas, carotenoides y azadiractina.
Las células vegetales en suspensión tienden a formar agregados de manera natural ya que al dividirse
no se separan adecuadamente, lo cual puede afectar la producción de metabolitos secundarios,
probablemente por el estrés nutricional, especialmente de oxígeno, que es causado por la limitación
a la transferencia de masa en los agregados y por la diferenciación celular dentro de los mismos;
además el aumento de las interacciones intercelulares puede facilitar el intercambio de señales y
metabolitos, necesarios en la síntesis de algunos metabolitos particulares.4

4
Arias M, Aguirre A., Angarita M, Montoya C, Restrepo J (2008) aspectos ingenieriles del cultivo in vitro de
células vegetales para la producción de metabolitos secundarios. Grupo de Biotecnología Industrial, Universidad
Nacional de Colombia.
 III. DESARROLLO EXPERIMENTAL
a) Efecto de los reguladores de crecimiento.
Preparación de medio de cultivo

Tabla 1. Concentraciones y combinaciones de los reguladores de crecimiento a utilizar.

Equipo Concentración final de reguladores.

Auxina Citocinina
Íkaro 90 µL 450 µL
Anfibios 60 µL 750 µL
Patentadas 30 µL 1,050 µL
Okazaki 90 µL 450 µL
Azul 120 µL 150 µL
α 60 µL 750 µL
 Establecimiento de cultivos de zanahoria

Nota:
Actividades que deben realizarse dentro de la campana laminar

Actividades que deben realizarse fuera de la campana laminar

b) Obtención de 𝝱-carotenoides
Preparación de MS líquido
Inoculación de matraces

Extracción de 𝝱-carotenoides
Prueba de Lieberman-Buchnard
 IV. RESULTADOS
a) Efecto de los reguladores de crecimiento.
Tabla 2 Resultados después de la primera semana de incubación. (Primera siembra)
Equipo Auxinas Citocininas No. de frascos Tipo de No. De frascos No. De explantes Color Humedad
contaminados contaminación viables viables
Íkaro 90 µL 450 µL 4/4 Bacteria 0 - - -

Anfibios 60 µL 750 µL 5/5 Bacteria 0 - - -

Patentadas 30 µL 1,050 µL 4/5 Bacteria 1 3 +++ +++
Okazaki 90 µL 450 µL 2/5 Bacteria 0 - - -
Azul 120 µL 150 µL 4/5 Bacteria 0 - - -

α 60 µL 750 µL 2/5 Bacteria 3 4 ++ ++

Interpretación de la tabla
Equipos con mejores resultados.
+++ Frascos con mayor coloración y mejor humectados
++ Frascos con menor coloración y poco humectados
+ Frascos con mínima coloración y humectación.
Tabla 3. Resultados después de la primera semana de incubación. (Segunda siembra)
Equipo Auxinas Citocininas No. De explantes Presencia de Color Humedad Observaciones
viables callo
Patentadas 30 µL 1,050 µL 3 1/3 + + Oxidado sin contaminación. Ligero
crecimiento de callo.
Azul 120 µL 150 µL 11 5/11 ++++ ++++ Ligera coloración café, sin contaminación,
callos muy pequeños.
Íkaro 90 µL 450 µL 8 4/8 ++ ++ Sin contaminación, la película de callo es
muy delgada.
α 60 µL 750 µL 6 2/6 ++ ++ Sin contaminación, callos muy pequeños.
Okazaki 90 µL 450 µL 6 0/6 + + Oxidación en todos los explantes

Anfibios 60 µL 750 µL 10 5/10 ++ ++ Sin contaminación, ligera deshidratación.

Interpretación de la tabla
Equipos con mejores resultados.
++++ Frascos con las mejores condiciones de color y humedad
+++ Frascos con mayor coloración y mejor humectados
++ Frascos con menor coloración y poco humectados
+ Frascos con mínima coloración y humectación.
 Tabla 4. Resultados después de la segunda semana de incubación. (Segunda siembra)
Equipo Aux Cit No. De frascos Tipo de Número de No de Color Humedad Crecimiento Observaciones
contaminados contaminación frascos viables explantes de callo.
viables
Íkaro 90 450 3/5 Bacteria 2/5 8 + ++ 2/8 Oxidación en floema.
µL µL Crecimiento apenas
notable
Anfibios 60 750 1/4 Bacteria 3/4 14 ++ +++ 4/14 Crecimiento mínimo de
µL µL callo. Trasplante de
frasco contaminado
Patentadas 30 1,050 4/5 Bacteria 1/5 2 + + 0
µL µL
Okazaki 90 450 1/3 Bacteria 2/3 2 + + 0 No hay callo. Un frasco
µL µL tiene contaminación en
todos los explantes
Azul 120 150 1/4 Bacteria 3/4 9 +++ +++ 1/9 Trasplante de explante de
µL µL un medio contaminado,
α 60 750 2/4 Bacteria 2/4 7 +++ +++ 2/7 Se trasplantaron 3
µL µL explantes

Interpretación de la tabla
Equipos con mejores resultados.
++++ Frascos con las mejores condiciones de color y humedad
+++ Frascos con mayor coloración y mejor humectados
++ Frascos con menor coloración y poco humectados
+ Frascos con mínima coloración y humectación.
Figura 2. Explantes no viables. Equipo : Patentadas, Figura 3. Explantes viables. Equipo: Patentadas,
Tiempo de incubación: 1 semana Tiempo de incubación: 1 semana.

Figura 4. Explantes viables. Equipo: Patentadas, Figura 5. Explantes oxidados. Equipo: Patentadas,
Tiempo de incubación: 2 semanas. Medio sin Tiempo de incubación: 2 semanas.
contaminación
 b) Cultivo de células vegetales en suspensión para la obtención de 𝝱-carotenoides

Tabla 5. Resultados a la Reacción Lieberman-Buchnard

Equipo Reacción Lieberman- Observaciones

Buchnard
Okazaki (+) Medio turbio, células muertas y ponchdas,
olor a zanahoria
Azul (+) Células vivas y disgregadas, inodoro, no hay
turbidez, no hay contaminación (+) Prueba positiva
Patentadas (+) Hay células vivas,muertas y disgregadsa, (-) Prueba negativa
medio turbio, aroma a zanahoria, sin
contaminación
Anfibios (+) Pocas células muertas, digregadas y
pequeñas, aglomerados celulares
Ícaro (+) Células rotas, contaminación,medio turbio
Alfa (+) Contaminación, células vivas, turbidez,
aroma a zanahoria

Figura 6. Células de callo de suspensión Figura 7. Cultivo en suspensión de callos de zanahoria

después de una semana.

Figura 8. Cultivo en suspensión de callos de zanahoria Figura 9. Tinción de células del cultivo en suspensión
después de dos semanas. observada al microscopio
Figura 10. Prueba de Lieberman-Buchnard; positiva.
 V. ANÁLISIS DE RESULTADOS
Para la producción de callos a partir de explante de zanahoria, el primer punto a analizar es la técnica aséptica. En la
primera siembra del explante de zanahoria que se hizo (ver tabla 2) observamos que casi todos los frascos de los equipos
presentaron contaminación bacteriana, solo los equipos Patentadas y Alfa obtuvieron explantes viables, es decir,
explantes que se observaron con buena hidratación, de color naranja y no blanco, este último significaría un daño en el
tejido durante el lavado con la solución de hipoclorito.
Como lo menciona Gil-Loyzaga en “Cultivo de células animales y humanas, aplicaciones en medicina regenerativa”5
cuando se trabaja en la campana de flujo laminar, el operador es la principal fuente de contaminación por ser portador
de innumerables microorganismos, por lo tanto, al no obtener explantes libres de contaminación, se volvió a realizar la
siembra pero mejorando la técnica aséptica, ésto consistió en limpiar minuciosamente la campana de flujo laminar, el
uso de cubrebocas, cofia, higienización de los brazos con jabón antiséptico, cuidar la distancia entre el operador y la
campana, etc.
En la tabla 3 se registraron los resultados tras una semana de crecimiento. Observamos que hubo una mejora de la
técnica aséptica tras obtener menos frascos contaminados y la formación de callo en los frascos de los equipos Anfibios,
Azul e Ícaro.
En la segunda semana de crecimiento (tabla 4) notamos un patrón común entre los explantes de los equipos Patentadas,
azul, ícaro y Okazaki: la oxidación del explante (coloración negra). (ver Figura 4)

Se entiende como oxidación u oscurecimiento de tejidos cultivados in vitro al daño por radicales libres de diferentes
componentes celulares, así como, la oxidación de compuestos fenólicos catalizado por la enzima polifenol oxidasa (PPO)
para producir quinonas, las cuales son especies químicas muy reactivas y propensas a reaccionar, generando daño e
incluso la muerte celular (Amiot et al. 1996, Bray et al. 2000).[1]
La mayoría de radicales libres se producen a partir del metabolismo del oxígeno y se les llama especies de oxígeno
reactivo o intermediarios de oxígeno reactivo.
 Causas de la oxidación:
-En las células vegetales, los radicales libres se forman constantemente durante las reacciones redox de varias vías
metabólicas
-Incompleta reducción del oxígeno o de la oxidación del agua en el cloroplasto o la mitocondria.
-Los radicales libres también se pueden generar en otras organelas celulares, como los peroxisomas y los lisosomas, a
consecuencia de los cortes realizados en los explantes (Karp 1998).
-La producción de especies reactivas puede ser activada por inductores específicos (como parte del metabolismo normal
de la planta) o también por mecanismos no específicos, por ejemplo en respuesta a un tipo de estrés. Minutos después
de la estimulación inicial ocurre, en respuesta, una producción elevada de especies reactivas de oxígeno (Arauz 1998)

La célula vegetal sometida a un estrés reacciona produciendo mayores niveles de radicales; los cuales generan una
reacción en cascada, cuando el electrón libre se transfiere de una molécula a otra. Una de las consecuencias que trae
consigo es la acción de enzimas oxidasas, frecuentemente nombradas como polifenol oxidasas (PPOs), fenolasas y
tirosinasas, así como de las peroxidasas (POX). Las cuales son liberadas, sintetizadas o están presentes en ciertos
sustratos y en condiciones oxidativas cuando los tejidos son lesionados o se encuentran senescentes.
La enzima y el sustrato entran en contacto cuando la célula sufre algún daño, estrés o se encuentra senescente y,
generalmente, da como resultado la muerte del explante (Bhat y Chandel 1991, George, 1996, Vatanpour-Azghandi et
al. 2002, Tang y Newton, 2004, Gratão et al. 2005, Pompeu et al. 2008).

Factores ambientales como: intensidad de luz, cortes, herbicidas, senescencia, patógenos, metales pesados, lesiones,
sustancias abrasivas pueden desencadenar el estrés oxidativo (Bray et al. 2000, Pompeu et al. 2008). En el caso

5
Gyl-Loyzaga (2011) Cultivo de células animales y humanas, aplicaciones en medicina regenerativa. Madrid: Vision libros.p. 54
particular del cultivo de tejidos in vitro, los procesos de oxidación son causados principalmente por el efecto abrasivo
del agente desinfectante aplicado durante la asepsia del explante, los cortes que sufre el explante, composición del
medio de cultivo, volumen y calidad del frasco de cultivo (George 1993, Tabiyeh et al. 2006, Van Staden et al. 2006,
Abdelwahd et al. 2008).
·
 Estrategias para evitar la oxidación de explantes
*Uso de explantes en estado juvenil o de material en crecimiento activo.
*Uso de antioxidantes en la preparación del explante para su cultivo o en el medio de cultivo.. Elección de los
reguladores del crecimiento.
*Evitar condiciones de estrés para el explante.

Tras analizar las tablas de los resultados obtenidos, las variables en esta práctica a cuidar para la obtención de callos en
explante de cambium de zanahoria son:
-Elección del explante
-La relación entre las concentraciones añadidas de los reguladores de crecimiento utilizados y su interacción.

Elección del explante

La selección del explante variará dependiendo de manera general del genotipo, edad de la planta y estado fisiológico
(Abdelnour A, 1994)6, dicha selección está determinada por el objetivo perseguido y la especie vegetal utilizada.
Las plantas jóvenes o en desarrollo con tejidos meristemáticos y crecimiento vegetativo vigoroso son la mejor fuente de
explantes. Aunque en una misma planta se puede encontrar tanto crecimiento juvenil como adulto, el primero se
caracteriza por ser activo y por la ausencia de estructuras reproductoras, mientras que el adulto es más lento y presenta
estructuras sexuales para la reproducción de la planta. Además, las plantas adultas pueden haber acumulado mayor
cantidad de microorganismos en sus tejidos y contener menos células meristemáticas, necesarias para establecer los
cultivos in vitro (Calva, 2005)7.
Las células meritemáticas se diferencian rápidamente en respuesta a estímulos organogenéticos como variación en el
tipo y concentración de substancias reguladoras del crecimiento vegetal. Las células meristemáticas se distinguen de
otras células por su tamaño relativamente pequeño, citoplasma denso, forma isodiamétrica, pared celular fina, mínima
vacuolación y un gran núcleo (Doerner 2000).

En el artículo Propagación in vitro de Heliconia bihai (L.) cv. Lobster Salmón a partir de meristemos florales, se menciona
que se observó que para la propagación masiva de las especies trabajadas, el uso de tejido meritemático ofreció una
mayor tasa de superiviencia. Marulanda e Isaza (2004) observaron un declive en la actividad del tejido meristemático
como consecuencia del daño al explante debido a los cortes, disminuyendo la regeneración celular, el crecimiento y
desarrollo de la planta.
Este daño en el corte se explicó que provoca la acción de las enzimas polifenoloxidasas.

En el artículo Producción de aloína en callos y hojas de brotes de zábila regenerados in vitro ,un artículo acerca de la
obtención de codeína a partir de cultivo de tejidos de Aloe barbadensis Mil” también se hace mención al efecto
significativo que tiene la importancia de la obtención del explante a través de un buen corte, pues éste influye en la
capacidad regenerativa del tejido para obtener un mayor número de brotes; lo que garantizaría un aumento de la
productividad y eficiencia de la fase de multiplicación para la propagación in vitro de zábila y con ello producción de
aloína. Esta respuesta pudiera estar relacionada con una menor oxidación fenólica en los explantes al usar el corte

6
Abdelnour A (1994) Conceptos básicos del cultivo de tejidos vegetales. Turrialba: CATIE.

7
Calva (2005) Cultivo de células y tejidos vegetales: fuente de alimentos para el futuro. Revista digital universitaria. Volumen 6
Número 11
transversal; ya que Pérez et al. (1998) señaló que a medida que se incrementan los cortes a los tejidos, existe una mayor
posibilidad de segregar fenoles, ocasionando deterioros a los explantes (Calva G., 2005).
Dados todos estos argumentos, sugerimos que el no haber obtenido callo se debió al mal corte realizado en la obtención
del explante evidenciado tras la oxidación de los mismos, así mismo la zanahoria seleccionada presentó senescencia
evidenciada por la poca elasticidad y coloración café al exterior siendo ésta la razón del poco contenido de tejido
meristemático impidiento el crecimiento vegetativo.
En el equipo de patentadas, la incorrecta elección y obtención del explante fue decisivo para el nulo crecimiento de callo
puesto que tras haber adicionado una dosis extra de reguladores de crecimiento no se vio favorecido en absoluto la
formación de éste.
La relación entre las concentraciones añadidas de los reguladores de crecimiento utilizados y su interacción
Alterando ligeramente las concentraciones relativas de auxina y citocinina, se ha podido modificar el desarrollo de las
células indiferenciadas de los cutios de tejidos.
De acuerdo con lo reportado en la bibliografía (UPV, 2003), una concentración más o menos igual de las dos hormonas,
hace que las células sigan indiferenciadas, formando callos.
Cuando la concentración de auxina es superior, el tejido indiferenciado organiza raíces.
Con una concentración superior de citocinina, se forman yemas.
Con un cuidadoso equilibrio de las dos hormonas se puede producir raíces y yemas, y por lo tanto, una plantita
incipiente.
El equipo Patentadas tuvo una relación de auxina/citocinina de 0.028, es decir, la concentración de BAP (citocinina) fue
mucho mayor que la de ANA (auxina), por lo tanto, se debieron haber formado yemas. Sin embargo, experimentalmente
no se obtienen esos resultados.
En el artículo Inducción in vitro de callogénesis y organogénesis indirecta a partir de explantes de cotiledón, hipocótilo y
hoja en Ugni molinae (Rodríguez M, 2014) se estimuló la producción de callos, y se observó su tipología y respuesta
organogénica bajo diferentes medios de inducción y de diferenciación en explantes de cotiledón, hipocótilo y hoja de
Ugni molinae. Esto se hizo utilizando medio MS y variando las concentraciones de los fitorreguladores ANA y BAP
también se utilizaron Se utilizaron diferentes explantes mostrados en la figura 11:
 Figura 11. Tratameintos de inducción de callos en medio MS
Se obtuvieron los resultados mostrados en la figura 11:

Figura 12. Resultados de callogénesis

Los mayores porcentajes de callogenésis se lograron con cotiledones con 0,5 mg L -1 de ácido naftalenacético (ANA),
como también en explantes de hipocótilo con 1,0 y 5,0 mg L-1 de ANA, además del testigo (62, 62, 74 y 64 %,
respectivamente). No obstante, se concluyó se puede prescindir de fitohormonas exógenas para la formación de callo.
 No olvidemos que la planta por si sola también tiene sus propias fitohormonas y con ello tambien tiene inhibidores de
las mismas, como el ácido abscísico, éste promueve la senescencia y con ello no puede ser posible la formación de callos.
El equipo Okazaki se formaron raíces siendo la relación de auxina/citocinia de 0.2 lo cual no nos explicamos puesto que
la relación de citocinina (BAP) es mayor que la de auxina (ANA).
En un artículo titulado “Obtención de callos con estructuras embriogénicas de Stevia rebaudiana Bert. en medios de
cultivo semisólidos”, donde también se utiliza el medio MS y explantes de tamaño similar, se observó el efecto de la
adición de 2,4-D (Auxina) y 6-BAP (Citoquininas) a diferentes explantes a diversas concentraciones de dichos
reguladores. En todos se observó la formación de callo.
· 1.13 μM de 2,4-D y 2.22 μM de 6-BAP
· 2.26 μM de 2,4-D y 2.22 μM de 6-BAP
· 4.52 μM de 2,4-D y 2.22 μM de 6-BAP
Se observó que en los tratamientos que incluían la combinación con el regulador de crecimiento 6-BAP, el inicio en la
formación de callo se registró durante la tercera semana de cultivo, en contraposición de lo que ocurre en los
tratamientos con 2,4-D solo, en donde el inicio de la formación del callo se produce durante la cuarta semana del cultivo.
Se generó callo en todas las variaciones de concentración de auxina y citocinina comprobando nuevamente que en la
cuestión experimental no es necesario que la relación entre los reguladores sea igual a 1 para la generación de tejido
calloso
Conjuntando la información de ambos artículos podemos entonces decir que las plantas ya contienen fitohormonas y
son capaces de generar callos sin adición de éstas. Sin embargo, al agregar reguladores de crecimiento aumentamos la
probabilidad de obtener uno.

ß-carotenoides.

El objetivo general de la práctica consistió en establecer cultivos en suspensión en medio MS líquido a partir de los callos
previamente obtenidos con la finalidad de obtener ß-carotenos.

Debido a que ninguno de los equipos consiguió la producción de callos, se nos asignaron callos de dos meses de edad. La
combinación de reguladores asignado a este cultivo fue:

 2 mg/L de 2,4-D y 1 mg/L de BAP

Como se observa se utilizó una auxina diferente a la que se fue administrada en los cultivos de todos los equipos; El 2,4-
D es una potente auxina que se usa en el cultivo in vitro para la formación de callos y la inducción de embriones somáticos
(Rivero et al., 2008). Se ha utilizado como regulador del crecimiento para este primer propósito en diversas especies de
plantas, con buenos resultados (Silva, 2006; Medero, 2006; Paneque, 2006).

Figura 13. Callos de dos meses.

 En el artículo Efecto del tipo de explante y la concentración de ácido 2,4-diclorofenoxiacético en la formación de callos en
Morus alba L.8 se menciona que la callogénesis solo ocurrió en los medios de cultivo con 2,4-D y que el aumento de la
concentración de 2,4-D en el medio de cultivo incrementó el tamaño de los callos, con los mejores resultados en las
concentraciones de 1,0 y 2,0 mg.L-1.
Por lo que al haber referencias sobre el éxito de esta auxina a estas concentraciones fundamenta la obtención de callos.

Además se observa la formación de los callos en la zona donde se hicieron los cortes, es decir, a partir del tejido de
cicatrización (Figura 13), esto pudiera asociarse a que en esta última se encuentran células menos diferenciadas, en
comparación con las del resto del explante, las que responden más rápidamente al efecto de los reguladores del
crecimiento y favorecen que se formen los callos (Michaux- Ferriere y Carron, 1989).

Una vez analizado la obtención de callo, nos enfocaremos a la obtención de B-carotenoides , que como se mencionó, es
el objetivo general de la práctica.

Se conoce que los carotenoides o tetraterpenoides son una clase de pigmentos terpenoides con 40 átomos de carbono
derivados biosintéticamente a partir de dos unidades de geranil-geranilpirofosfato, en su mayoría son solubles en
solventes apolares y de coloraciones que oscilan entre el amarillo (por ejemplo el ß-caroteno) y el rojo (por ejemplo el
licopeno).
Constituyen el grupo más numeroso de metabolitos secundarios (más de 40.000 moléculas diferentes).

Figura 14. Diversidad de terpenos.

El caroteno más comúnmente encontrado es el b-caroteno, y normalmente constituye entre el 25-30 % del contenido
total de carotenoides en las plantas. La luteína es la xantofila más abundante (40-45 %), pero siempre se encuentra en
menor proporción que el b-caroteno9.

Uso que se les da a los B-carotenos :

8
Efecto del tipo de explante y la concentración de ácido 2,4-diclorofenoxiacético en la formación de
callos en Morus alba L. en: http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0864-
03942012000400006 . Fecha de consulta: 24 de Noviembre de 2016
9
Carotenoides por : Alejandro Martínez Martínez. Facultad de Química Farmacéutica.
Aunque su valor vitamínico es solamente de alrededor de un sexto del valor del retinol,, su abundancia en los vegetales y
también en algunos alimentos animales, como la leche, hace de él una fuente fundamental de vitamina A para muchísimas
personas.
Debido a que se utilizó el cultivo en suspensión (Figura 6) para la obtención de células se destacan las particularidades de
esta técnica:

Las suspensiones celulares consisten en células libre y agregados celulares distribuidos en un medio en movimiento. Estas
suspensiones pueden ser permanentes mediante el suministro continuo de nutrientes. Los cultivos en suspensión son
propios de aquellas células capaces de proliferar sin necesidad de adherirse al sustrato. Es de destacar que en todo tejido
existe una fracción o tipo celular que es capaz de crecer en suspensión.

Para el cultivo de suspensiones celulares de una gran variedad de plantas se ha utilizado el medio MS, desarrollado por
Murashige y Skoog.

El mejor inóculo para la iniciación de suspensiones celulares es sin duda un callo friable, con un alto ritmo de división
celular, como el que se nos fue proporcionado (Figura 13).
La turbidez del medio indica que las células se disgregaron (Figura 7 y 8)

Ventaja de este tipo de cultivo:

 Permitir el control relativamente sencillo de variables como temperatura, pH y oxígeno disuelto.

En el cultivo en suspensión el estado que más se aproxima a las condiciones naturales es la fase estacionaria, en la que
diversos autores han reportado un cierto grado de diferenciación, observándose que la acumulación de metabolitos
secundarios se presenta principalmente durante este periodo; sin embargo, en caso de metabolitos asociados al
crecimiento, su acumulación puede ser proporcional a la producción de biomasa y se ha observado durante la fase
exponencial en ciertas líneas celulares, tales son los casos de la producción de betalaínas, carotenoides y azadiractina.

La biosíntesis de B-carotenoides parte de la ruta de ácido mevalónico (ver figura 15), el precursor de la síntesis de terpenos
es el Isopentil fosfato (IPP), después, se añadirán a la molécula más moléculas de isopreno formando otros tipos de
terpenos para finalmente obtener el B-caroteno (figura15).
Figura 15. Síntesis de terpenos Figura 16. Ruta de síntesis de ß- carotenoides

Uno de los pasos experimentales fue someter a sonicación las células. La sonicación es una herramienta muy eficiente y
confiable para la desintegración de la célula que permite un control total sobre los parámetros de sonicación. Esto asegura
una alta selectividad en materiales de pureza liberación y producto. [Balasundaram et al., 2009] Es adecuado para todos
los tipos de la célula y fácilmente aplicable en pequeña y gran escala.10
Para evaluar el estado de las células se procedió a realizar la Tinción con Azul de Tripano y observar al microscopio.El azul
tripano (azul diamina, azul niágara, azul vital) es un colorante derivado de la toluidina que posee la capacidad de teñir a
tejidos y células muertas. Este colorante es uno de varios empleados para evaluar la viabilidad de células por exclusión de
captación, ya que no puede penetrar y teñir a las células vivas con membranas íntegras.
Como se observa en la Figura 9 se tienen dos células del cultivo en suspensión; una está completamente teñida y la otra
sólo en la membrana, se trata de una célula muerta y una viva respectivamente.
Finalmente para la verificación de ß- carotenos se realiza la prueba Lieberman-Buchnard
Fundamento de la prueba.

10
Lisis en : https://www.hielscher.com/es/ultrasonic-lysis-cell-disruption-extraction.htm
Fecha de consulta: 25-Noviembre-2016
 Figura 17. Reacción de Liebermann-Burchard
La presencia de varios enlaces dobles C=C conjugados, reaccionan con el reactivo de Liebermann-Burchard (Figura 17),
usado para el reconocimiento de esteroides y/o triterpenoides, por lo tanto debe tenerse en cuenta que los carotenoides
son falsos positivos para esteroides y/o triterpenoides, sin embargo la presencia de los carotenoides en una muestra
vegetal se reconoce por sus colores característicos (amarillo-naranja-rojo).
La presencia de un color amarillo (Figura 10) indica la oxidación de los ß- carotenoides.
Los carotenoides se oxidan con facilidad; la exposición a la luz, aire y daños físicos afectan la tasa de pérdida de
carotenoides una vez la muestra es removida de la planta. 11
Por lo que debido a las condiciones en las cuales se realizó este prueba es factible este daño ; hubo exposición al ambiente
durante un tiempo prolongado (10 min), en lo que se preparaban los reactivos para la prueba.

11
Revista infomusa. Vol. 15. Junio-Diciembre 2006. Página 40
 VI. MEMORIA DE CÁLCULO
 Concentración de reguladores de crecimiento
𝐶1 𝑉1 = 𝐶2 𝑉2

𝐂𝟏 Solución Stock 1mg/L

𝑉1 Volumen que se adicionará de cada regulador
𝐶2 Concentración de regulador;
Auxina: 0.1mg/L Citocinina: 1mg/L
𝑉2 Volumen final a preparar

Patentadas Cálculo
 Auxinas 2x ∴
𝐦𝐠
 2X 𝑪𝟐 = 𝟎. 𝟐 𝐋

𝐦𝐠
𝐂𝟐 𝐕𝟐 (𝟎. 𝟐 𝐋 ) (𝟎. 𝟏𝟓𝟎 𝐋)
𝐕𝟏 = = 𝐦𝐠 = 𝟎. 𝟎𝟑𝐦𝐋 = 𝟑𝟎µ𝐋
𝐂𝟏 𝟏 𝐦𝐋

 Citocininas 7x ∴
𝐦𝐠
 7X 𝑪𝟐 = 𝟕 𝐋

𝐦𝐠
𝐂𝟐 𝐕𝟐 (𝟕 𝐋 ) (𝟎. 𝟏𝟓𝟎 𝐋)
𝐕𝟏 = = 𝐦𝐠 = 𝟏. 𝟎𝟓𝟎𝐦𝐋 = 𝟏𝟎𝟓𝟎µ𝐋
𝐂𝟏 𝟏 𝐦𝐋
 VII. CONCLUSIONES
Generales:
o Se evaluó la interacción de diferentes concentraciones de la auxina ANA (ácido naftalenacético) y de la citocinina BAP
(Bencilaminopurina) para la producción de callos de cambium de zanahoria.
o La senescencia del vegetal seleccionado afecta directamente en la formación de callos.
o Dependerá de la relación de las concentraciones de auxinas y citocininas para el desarrollo de callos, raíces o brotes,
dicha relación se determinará experimentalmente dado que dependerá del explante utilizado, el genotipo, factores
ambientales, etc.
o Es necesario llevar a cabo la técnica aséptica adecuadamente al trabajar en la campana de flujo laminar para evitar
contaminación por bacterias, hongos o levaduras.
o Con una concentración alta de Citocininas si habrá friabilidad en el callo formado pero tardará más.
o El herbicida 2,4-D favorece la formación de callo en combinación con BAP en una proporción 2:1 respectivamente.
o Se estableció un cultivo en suspensión a partir de callos de zanahoria obteniendo B-carotenos como metabolitos
secundarios analizados cualitativamente con la prueba de Lieberman-Buchnard.

Particulares:
 Martínez Moreno Diana Guadalupe.
- El proceso de oxidación es causado por las enzimas polifenoloxidasas.
- La combinación 2 mg/L de 2,4-D y 1 mg/L de BAP es una opción friable para la obtención de callos
 Nevárez Barrera Jacqueline:
- La adición de reguladores de crecimiento solo aumenta la probabilidad de generar tejido calloso pero no es
indispensable.
- Para la obtención de callos el factor primordial a cuidar es la selección y obtención del explante, éste debe de contener
en mayor proporción tejido meristemático.
- El corte del tejido igual afecta directamente a la oxidación temprana del explante por acción de enzimas oxidativas.
- Para realizar un cultivo de células vegetales en suspensión, el callo a utilizar debe callo friable, con un alto ritmo de
división celular.
VIII. BIBLIOGRAFÍA
 Seretín M.(2013) Los cultivos celulares y sus aplicaciones II (cultivos de células vegetales).Argenbio [en línea]
24/noviembre/16: www.argenbio.org/adc/uploads/pdf/Cultivos%20celulares%20II%20Euge.pdf
 Rojas s (2004) Propagación asexual de las plantas. Colombia: CORPOICA/PRONATA/MADR.
 Raven P, Evert F & Eichhorn S (1992) Biología de las plantas. Barcelona: Reverté
 Arias M, Aguirre A., Angarita M, Montoya C, Restrepo J (2008) aspectos ingenieriles del cultivo in vitro de células
vegetales para la producción de metabolitos secundarios. Grupo de Biotecnología Industrial, Universidad Nacional de
Colombia.