Síntese de Oligonucleotídeos - Wikipedia

26/03/2018 Síntese de oligonucleotídeos - Wikipedia
Síntese de oligonucleotídeos
A síntese de oligonucleótidos é a síntese química de fragmentos relativamente curtos de ácidos nucleicos com
estrutura química definida ( sequência ). A técnica é extremamente útil na prática laboratorial atual porque fornece
um acesso rápido e barato a oligonucleotídeos feitos sob encomenda da seqüência desejada. Considerando que as
enzimas sintetizam DNA e RNA apenas na direção 5 'para 3' , a síntese química de oligonucleotídeos não tem essa
limitação, embora seja, na maioria das vezes, realizada na direção oposta 3 'a 5'. Atualmente, o processo é
implementado como síntese de fase sólida usando fosforamiditométodo e blocos de construção de fosforamidite
derivados de 2'-desoxinucleósidos protegidos ( dA , dC , dG e T ), ribonucleósidos ( A , C , G e U ), ou nucleósidos
quimicamente modificados, por exemplo, LNA ou BNA .
Para obter o oligonucleótido desejado, os blocos de construção são sequencialmente acoplados à cadeia
oligonucleotídica em crescimento na ordem requerida pela sequência do produto (ver ciclo Sintético abaixo). O
processo foi totalmente automatizado desde o final dos anos 70. Após a conclusão da montagem da cadeia, o produto é
liberado da fase sólida para solução, desprotegido e coletado. A ocorrï¿½cia de reacï¿½es secundï¿½ias estabelece
limites prï¿½icos para o comprimento de oligonucleï¿½idos sintï¿½icos (atï¿½cerca de 200 resï¿½uos
nucleotï¿½icos ) porque o nï¿½ero de erros se acumula com o comprimento do oligonucleï¿½ido a ser sintetizado.
[1] Os produtos são frequentemente isolados por cromatografia líquida de alta performance(HPLC) para obter os
oligonucleótidos desejados em alta pureza. Tipicamente, os oligonucleótidos sintéticos são moléculas de DNA ou RNA
de cadeia simples com cerca de 15 a 25 bases de comprimento.
Os oligonucleótidos encontram uma variedade de aplicações em biologia molecular e medicina. São mais vulgarmente
utilizados como oligonucleótidos anti-sentido , ARN interferente pequeno , iniciadores para sequenciação e
amplificação de ADN , sondas para detectar ADN ou ARN complementar via hibridação molecular , ferramentas para
a introdução direccionada de mutações e locais de restrição e para a síntese de genes artificiais .
Conteúdo
História
trabalho inicial e a síntese contemporânea de H-fosfonato
Síntese de fosfodiéster
Síntese de Fosfotriester
Síntese de fosfato triéster
Síntese pelo método do fosforamidito
Blocos de construção
Fosforamiditos de nucleósidos
não nucleósidos
Ciclo Sintético
Etapa 1: Desbloqueio (detritalização)
Passo 2: Acoplamento
Passo 3: capping
Passo 4: Oxidação
Suportes sólidos
Material de suporte sólido
Química do Linker
Fosforotioatos oligonucleotídicos e sua síntese
Automação
Primeiros sintetizadores de oligonucleótidos disponíveis no mercado
https://en.wikipedia.org/wiki/Oligonucleotide_synthesis 1/21
História da síntese de oligonucleotídeos de médio a grande porte

Síntese de microarrays de oligonucleotídeos
Processamento pós-sintético
Caracterização
Veja também
referências
Leitura adicional
História
A evolução da síntese de oligonucleótidos viu quatro métodos principais de formação de ligações internucleosídicas e
foi revista na literatura em grande detalhe. [2] [3] [4]
Primeiros trabalhos e síntese contemporânea de H-fosfonato

No início dos anos 50, o grupo de
Alexander Todd foi o pioneiro
dos métodos H-fosfonato e
fosfato triéster da síntese de
oligonucleotídeos. [5] [6] A reação
dos compostos 1 e 2 para formar
o diéster 3 do H-fosfonato é um
Esquema. 1. i : N- Clorossuccinimida; Bn = -CH Ph
acoplamento de H-fosfonato em 2
solução, enquanto o dos
compostos 4 e 5 para dar 6 é um
acoplamento de fosfotriéster (ver síntese de fosfotriéster abaixo).
Trinta anos depois, este trabalho

inspirou, de forma independente,
dois grupos de pesquisa a adotar
a química do H-fosfonato na
síntese em fase sólida usando
monoésteres de fosfato de H do
nucleosídeo 7 como blocos de
construção e cloreto de pivaloílo,
cloreto de 2,4,6-
triisopropilbenzenossulfonila
(TPS -Cl) e outros compostos
como ativadores. [7] [8] A
implementação prática do
método H-fosfonato resultou em
um ciclo sintético muito curto e Esquema 2. Síntese de oligonucleótidos pelo método H-fosfonato
simples, consistindo de apenas
duas etapas, a detritilação e o
acoplamento (Esquema 2). Oxidação das ligações diéster H-fosfonato internucleosídico em ligações 8 a fosfodiéster
em 9 com uma solução de iodo em piridina aquosaé realizado no final da cadeia de montagem e não como um passo
no ciclo sintético. Se desejado, a oxidação pode ser realizada sob condições anidras. [9] Alternativamente, 8 pode ser
convertido em fosforotioato 10 [10] [11] [12] [13] ou fosforoselenoato 11 (X = Se), [14] ou oxidado por CCl na presença de
4
aminas primárias ou secundárias a análogos de fosforamidato 12 . [15] [16]O método é muito conveniente na medida em
que vários tipos de modificações de fosfato (fosfato / fosforotioato / fosforamidato) podem ser introduzidos no mesmo
oligonucleótido para modulação das suas propriedades. [17] [18] [19]
Mais frequentemente, os blocos de construção H-fosfonato são protegidos no grupo 5'-hidroxi e no grupo amino das
bases nucleicas A, C e G da mesma maneira que os blocos de construção de fosforamidite (ver abaixo). No entanto, a
proteção no grupo amino não é obrigatória. [9] [20]
Síntese de fosfodiéster
Na década de 1950, Har Gobind Khorana e colaboradores
desenvolveram um método fosfodiéster onde 3'- O -
acetilnucleosídeo-5'- O- fosfato 2 (Esquema 3) foi ativado
com N , N ' -diciclohexilcarbodiimida (DCC) ou 4-
toluenossulfonila cloreto (Ts-Cl). As espécies ativadas foram
reagidas com um nucleosídeo 5'- O- protegido 1 para dar um
monofosfato dinucleósido protegido 3 . [21] Após a remoção
de 3'- Ogrupo -acetilo utilizando hidrólise catalisada por
base, procedeu-se a um maior alongamento da cadeia. Esquema. 3 Acoplamento de oligonucleótidos
Seguindo essa metodologia, conjuntos de tri- e pelo método fosfodiéster; Tr = -CPh
3
tetradeoxirribonucleotídeos foram sintetizados e convertidos
enzimaticamente em oligonucleotídeos mais longos, o que
permitiu a elucidação do código genético . A principal limitação do método fosfodiéster consistiu na formação de
oligômeros de pirofosfato e oligonucleotídeos ramificados no fosfato internucleosídico. O método parece ser um passo
atrás da química mais seletiva descrita anteriormente; entretanto, naquela época, a maioria dos grupos de proteção de
fosfato disponíveis agora ainda não haviam sido introduzidos. A falta da estratégia de proteção conveniente exigiu um
recuo para uma química mais lenta e menos seletiva para alcançar o objetivo final do estudo. [2]
Síntese de fosfotriéster
Na década de 1960, grupos liderados por R. Letsinger [22] e C.
Reese [23] desenvolveram uma abordagem de fosfotriester. A
diferenï¿½ definidora da abordagem fosfodiï¿½ter foi a
protecï¿½o da porï¿½o fosfato no bloco de construï¿½o 1
(Esquema 4) e no produto 3 com o grupo 2-cianoetilo . Isto
impediu a formação de oligonucleótidos ramificados no
fosfato internucleosídico. A maior seletividade do método
permitiu o uso de agentes de acoplamento e catalisadores
Esquema 4. Acoplamento de oligonucleï¿½idos
mais eficientes, [24] [25] o que reduziu drasticamente o pelo mï¿½odo de fosfotriï¿½ter; MMT = -CPh
2
comprimento da síntese. O método, desenvolvido
(4-MeOC H ).
inicialmente para a síntese em fase de solução, também foi 6 4
implementado em poliestireno de "pipoca" de baixa[26] e mais

tarde em vidro de poro controlado (CPG, ver "Material de suporte sólido" abaixo), que iniciou um esforço maciço de
pesquisa na síntese de oligonucleotídeos em fase sólida e levou à automação da montagem da cadeia oligonucleotídica.
Síntese de fosfato triéster

Na década de 1970, derivados P (III) substancialmente mais reativos de nucleosídeos, 3'- O- clorofosfitos, foram
usados com sucesso para a formação de ligações internucleosídicas. [27] Isso levou à descoberta da metodologia de
triéster de fosfito . O grupo liderado por M. Caruthers aproveitou a vantagem de 1 H -tetrazolidofosfitos menos
agressivos e mais seletivos e implementou o método em fase sólida. [28] Muito pouco tempo depois, os trabalhadores
do mesmo grupo melhoraram o método usando fosforamiditos de nucleósidos mais estáveis como blocos de
construção. [29] O uso do grupo protetor de fosfato de 2-cianoetila [30] no lugar de um metilo grupo [31] [32] conduziu
aos fosforamiditos nucleosídeos atualmente usados na síntese de oligonucleotídeos (veja blocos de construção de
Fosforamidita abaixo). Muitas melhorias posteriores ao fabrico de blocos de construção, sintetizadores de
oligonucleótidos e protocolos sintéticos tornaram a química de fosforamidite um método de escolha muito fiável e
expedito para a preparação de oligonucleótidos sintéticos. [1]
Síntese pelo método do fosforamidito
Blocos de construção
Fosforamiditos nucleosídeos
Como mencionado acima,
os nucleótidos que ocorrem
naturalmente (nucleósido-
3 'ou 5' -fosfatos) e os seus
análogos fosfodiéster são
insuficientemente reactivos
para proporcionar uma
preparação sintética
expedita de
oligonucleótidos com
elevados rendimentos. A Fosforamiditos 2'-desoxinucleósidos protegidos.
selectividade e a taxa de
formação de ligações
internucleosídicas é drasticamente melhorada utilizando derivados de 3'- O- ( N , N- diisopropilfosforamidite) de
nucleósidos (fosforamiditos nucleósidos) que servem como blocos de construção na metodologia de fosfito triéster.
Para evitar reações colaterais indesejadas, todos os outros grupos funcionais presentes nos nucleosídeos devem ser
tornados não reativos (protegidos) por meio da fixação de grupos de proteção. Após a conclusão da montagem da
cadeia oligonucleotídica, todos os grupos protectores são removidos para produzir os oligonucleótidos desejados.
Abaixo, os grupos de proteção usados atualmente em [33] [34] [35] [36] comercialmente disponíveis e os blocos de
construção de fosforamidito de nucleosídeo mais comuns são brevemente revisados:
O grupo 5'-hidroxilo é protegido por um grupo DMT (4,4'-dimetoxitritilo) instável em ácido .

A timina e o uracilo , bases nucleicas de timidina e uridina , respectivamente, não possuem grupos amino
exocíclicos e, portanto, não requerem qualquer proteção.
Embora a base nucleica de guanosina e 2'-desoxiguanosina tenha um grupo amino exocíclico, sua basicidade é
baixa a ponto de não reagir com fosforamiditos sob as condições da reação de acoplamento. Contudo, um
fosforamidito derivado da 5'- O -DMT-2'-desoxiguanosina não protegida com N2 é fracamente solúvel em
acetonitrilo , o solvente vulgarmente utilizado na síntese de oligonucleótidos. [37] Em contraste, as versões do
mesmo composto protegidas com N2 se dissolvem bem em acetonitrila e, portanto, são amplamente utilizadas.
Bases Nucleicas Adenina e Citosinasuportar os grupos amino exocíclicos reactivos com os fosforamiditos
activados sob as condições da reacção de acoplamento. Através da utilização de passos adicionais no ciclo
sintético [38] [39] ou agentes de acoplamento alternativos e sistemas de solventes, [37] o conjunto de cadeias
oligonucleotídicas pode ser realizado utilizando fosforamiditos dA e dC com grupos amino não protegidos. No
entanto, essas abordagens permanecem atualmente no estágio de pesquisa. Na síntese de oligonucleótidos de
rotina, os grupos amino exocíclicos nos nucleósidos são mantidos permanentemente protegidos ao longo de todo
o comprimento da montagem da cadeia oligonucleotídica.
A protecção dos grupos amino exocíclicos tem de ser ortogonal à do grupo 5'-hidroxi porque o último é removido no
final de cada ciclo sintético. A estratégia mais simples de implementar e, portanto, a mais amplamente utilizada, é
instalar um grupo de proteção lábil à base nos grupos amino exocíclicos. Na maioria das vezes, dois esquemas de
proteção são usados.
No primeiro, o esquema padrão e mais robusto (Figura), proteção Bz (benzoíla) é usado para A, dA, C e dC,
enquanto G e dG são protegidos com o grupo isobutiril. Mais recentemente, o grupo Ac (acetil) é usado para
proteger C e dC, como mostrado na figura. [40]
No segundo, esquema de proteção leve, A e dA são protegidos com isobutiril [41] ou grupos fenoxiacetil (PAC).
[42] C e dC urso acetil protecção, [40] e L e dG são protegidos com 4-isopropylphenoxyacetyl ( i Pr-PAC) [43] ou
dimethylformamidino (DMF) [44] grupos. Grupos protetores leves são removidos mais prontamente do que os
grupos protetores padrão. No entanto, os fosforamiditos que suportam estes grupos são menos estáveis quando
armazenados em solução.
O grupo fosfito é protegido por um grupo 2-cianoetil lábil a base . [30] Uma vez que um fosforamidito foi acoplado
ao oligonucleotídeo ligado ao suporte sólido e as porções fosfito foram convertidas nas espécies P (V), a
presença da proteção fosfato não é obrigatória para a condução bem-sucedida de outras reações de
acoplamento. [45]
Na síntese de RNA, o grupo 2'-hidroxi é

protegido com o grupo TBDMS ( t-
butildimetilsilil). [46] [47] [48] [49] ou com o
grupo TOM (tri- iso- propilsililoximetil),
[50] [51] sendo ambos removíveis por
tratamento com íon flúor.
A porção fosfito também carrega um
diisopropilamino ( i Pr N) grupo reactivo Fosforamiditos ribonucleósidos 2'- O- protegidos.
2
sob condições ácidas. Após activação, o
grupo di-isopropilamino deixa de ser
substituído pelo grupo 5'-hidroxi do oligonucleótido ligado ao suporte (ver "Passo 2: Acoplamento" abaixo).
Fosforamiditos não nucleósidos

Os fosforamiditos não nucleósidos são os reagentes de fosforamidite concebidos para introduzir várias
funcionalidades nos terminais de oligonucleótidos sintéticos ou entre resíduos de nucleótidos no meio da sequência.
Para ser introduzido dentro da sequência, um modificador não nucleosídico tem de possuir pelo menos dois grupos
hidroxi, um dos quais é frequentemente protegido com o grupo DMT enquanto o outro suporta a porção fosforamidite
reactiva.
Os fosforamiditos nï¿½ nucleosï¿½icos sï¿½ utilizados para introduzir grupos desejados que nï¿½ estï¿½
disponï¿½eis em nucleï¿½idos naturais ou que podem ser introduzidos mais rapidamente utilizando concepï¿½es
quï¿½icas mais simples. Uma seleção muito curta de reagentes comerciais de fosforamidita é mostrada no Esquema
para a demonstração da diversidade estrutural e funcional disponível. Estes reagentes servir para a ligação de fosfato
de 5'-terminal ( 1 ), [52] NH ( 2 ), [53] SH ( 3 ), [54] aldeído ( 4 ), [55] e os grupos carboxílicos ( 5 ) , [56] CC ligações
2
triplas ( 6 ), [57]etiquetas não radioactivas e desactivadores (exemplificados por amidito 6-FAM 7 [58] para a fixação de
fluoresceína e dabcil amidito 8 , [59] , respectivamente), hidrófilo e modificadores hidrófobos (exemplificado por
hexaetilenoglicol amidito 9 [60] [61] e amidito de colesterol 10 , [62] respectivamente) e biotina amidita 11 . [63]
Ciclo sintético
A síntese de oligonucleótidos é levada a cabo por uma adição gradual de resíduos de nucleótidos ao terminal 5 'da
cadeia crescente até a sequência desejada ser montada. Cada adição é referida como ciclo sintético (Esquema 5) e
consiste em quatro reações químicas:
Etapa 1: Desbloqueio (detritalização)
O grupo DMT é removido com uma solução

de um ácido, tal como ácido tricloroacético a
2% (TCA) ou ácido dicloroacético a 3%
(DCA), num solvente inerte ( diclorometano
ou tolueno ). O catião DMT cor de laranja
formado é lavado; o passo resulta no
precursor de oligonucleótido ligado ao
suporte sólido contendo um grupo hidroxilo
no terminal 5 'livre. Vale a pena recordar
que a condução de detritilação durante um
período prolongado ou com soluções de
ácidos mais fortes do que as recomendadas
leva à depurinação de oligonucleótidos
ligados a suporte sólido e reduz assim o
rendimento do produto completo desejado.
Passo 2: Acoplamento
Uma solução de fosforamidito de
nucleosídeo de 0,02-0,2 M (ou uma mistura
de vários fosforamiditos) em acetonitrila é
ativada por uma solução de 0,2 - 0,7 M de
um catalisador azólico ácido , 1 H -tetrazole ,
Fosforamiditos não nucleósidos para a modificação 5 'de
5-etiltio-1H-tetrazol, [64] 2- oligonucleótidos sintéticos. MMT = mono-metoxitritilo, (4-
benzylthiotetrazole, [65] [66] 4,5-diciano metoxifenil) difenilmetilo.
imidazol , [67] ou de um número de
compostos semelhantes. Uma informação
mais extensa sobre o uso de vários agentes
de acoplamento na síntese de
oligonucleotídeos pode ser encontrada em
uma revisão recente. [68]A mistura é
geralmente muito breve e ocorre em linhas
fluidas de sintetizadores de
oligonucleotídeos (veja abaixo) enquanto os
componentes estão sendo entregues aos
reatores contendo suporte sólido. O
fosforamidito activado em excesso de 1,5 a
20 vezes sobre o material ligado ao suporte é
então colocado em contacto com o suporte
sólido inicial (primeiro acoplamento) ou um
precursor oligonucleotídico ligado ao
suporte (seguintes acoplamentos) cujo Esquema 5. Ciclo sintico para preparao de oligonucleidos pelo
grupo 5'-hidroxi reage com o porção modo fosforamidito.
fosforamidite activada do fosforamidito
nucleósido que se aproxima para formar
uma ligação triéster de fosfito. O acoplamento de fosforamiditos de 2'-desoxinucleósidos é muito rápido e requer, em
pequena escala, cerca de 20 s para a sua conclusão. Em contraste, 2'- O estericamente impedidofosforamiditos
ribonucleósidos protegidos necessitam de 5-15 min para serem acoplados em elevados rendimentos. [47] [69] [70] [71] A
reação também é altamente sensível à presença de água, particularmente quando soluções diluídas de fosforamiditos
são usadas, e é comumente realizada em acetonitrila anidro. Geralmente, quanto maior a escala da síntese, menor o
excesso e maior é a concentração dos fosforamiditos. Em contraste, a concentração do ativador é determinada

principalmente por sua solubilidade em acetonitrila e é independente da escala da síntese. Após a conclusão do
acoplamento, quaisquer reagentes e subprodutos não ligados são removidos por lavagem.
Passo 3: Capping
A etapa de cobertura é realizada tratando o material ligado ao suporte sólido com uma mistura de anidrido acético e 1-
metilimidazole ou, menos frequentemente, DMAP como catalisadores e, no método da fosforamidite, serve a dois
propósitos.
Após a conclusão da reação de acoplamento, uma pequena porcentagem dos grupos 5'-OH ligados a suporte
sólidos (0,1 a 1%) permanece sem reação e precisa ser permanentemente bloqueada de outros alongamentos
de cadeia para evitar a formação de oligonucleotídeos com uma base interna deleção comumente referido como
(n-1) shortmers. Os grupos 5 '-hidroxi não reagidos são, em grande medida, acetilados pela mistura de
cobertura.
Também tem sido relatado que fosforamiditos activadas com 1 H -tetrazole reagir, numa pequena extensão, com
6
o O posição de guanosina. [72] Após oxidação com I / água, este produto secundário, possivelmente via
2
6
migração de O -N7, sofre depurinação . Os locais apurínicos assim formados são prontamente clivados no
decurso da desprotecção final do oligonucleótido sob as condições básicas (ver abaixo) para dar dois
6
oligonucleótidos mais curtos, reduzindo assim o rendimento do produto completo. As modificações de O são
rapidamente removidas por tratamento com o reagente de cobertura, desde que a etapa de cobertura seja
realizada antesa oxidação com I / água.
2
A stese de fosforotioatos oligonucleoticos (OPS, ver abaixo) n envolve a oxidao com I / ua e, respectivamente,
2
n sofre a reaco colateral descrita acima. Por outro lado, se o passo de nivelamento for realizado antes da
sulfurização, o suporte sólido pode conter o anidrido acético residual e o N-metilimidazol deixado após o passo
de nivelamento. A mistura de proteco interfere com a reaco de transfercia de enxofre, o que resulta na extensiva
formao das ligaes internucleosicas de triestero de fosfato em vez dos triiteres desejados de PS. Portanto, para a
síntese de OPS, é aconselhável conduzir a etapa de sulfurização antes da etapa de nivelamento. [73]
Etapa 4: Oxidação
A ligaï¿½o triï¿½tero triï¿½tero de fosfito recentemente formada nï¿½ ï¿½ natural e tem uma estabilidade limitada
nas condiï¿½es da sï¿½tese de oligonucleï¿½idos. O tratamento do material ligado ao suporte com iodo e água na
presença de uma base fraca (piridina, lutidina ou colidina ) oxida o triéster de fosfito num triéster de fosfato
tetracoordenado, um precursor protegido da ligação internafleosídica de diéster de fosfato que ocorre naturalmente. A
oxidação pode ser realizada sob condições anidras utilizando hidroperóxido de terc-butilo [74] ou, mais eficientemente,
(1S) - (+) - (10-canforsulfonil) -oxaziridina (CSO). [75] [76] [77]O passo de oxidaï¿½o ï¿½substituï¿½o por um passo de
sulfurizaï¿½o para obter fosforotioatos de oligonucleï¿½idos (ver fosforotioatos de oligonucleï¿½idos e a sua
sï¿½tese abaixo). Neste último caso, o passo de sulfurização é melhor realizado antes do nivelamento.
Suportes sólidos
Na síntese em fase sólida, um oligonucleótido a ser montado é covalentemente ligado, através do seu grupo hidroxi 3 '-
terminal, a um material sólido de suporte e permanece ligado a ele ao longo de todo o curso da cadeia de montagem. O
suporte sólido está contido em colunas cujas dimensões dependem da escala de síntese e podem variar entre 0,05 mL
e vários litros. A esmagadora maioria dos oligonucleótidos é sintetizada em pequena escala variando de 10 n mol a 1
µmol. Mais recentemente, a síntese de oligonucleótidos de elevado rendimento, em que o suporte sólido está contido
nos poços de placas de múltiplos poços (mais frequentemente, 96 ou 384 poços por placa), tornou-se um método de
escolha para a síntese paralela de oligonucleótidos em pequena escala. [78] No final da montagem da cadeia, o
oligonucleótido é libertado do suporte sólido e é eluído da coluna ou do poço.
Material de suporte sólido
Em contraste com a stese de fase sida orgica e stese de ptidos , a stese de oligonucleidos prossegue melhor em suportes
sidos n dilateis ou pouco expanseis. Os dois materiais de fase sólida mais usados são o vidro de poros controlados
(CPG) e o poliestireno macroporoso (MPPS). [79]
CPG é comumente definido por seu tamanho de poro. Em química de oligonucleotídeos, tamanhos de poros de
500, 1000, 1500, 2000 e 3000 Å são usados para permitir a preparação de oligonucleotídeos de
aproximadamente 50, 80, 100, 150 e 200 mer, respectivamente. Para tornar o CPG nativo adequado para
processamento adicional, a superfície do material é tratada com (3-aminopropil) trietoxissilano para dar CPG de
aminopropilo. O braço aminopropilo pode ser adicionalmente prolongado para resultar em CPG de aminoalquilo
de cadeia longa (LCAA). O grupo amino é então utilizado como um ponto de ancoragem para ligantes
adequados para a síntese de oligonucleótidos (ver abaixo).
MPPS adequado para a síntese de oligonucleótidos é um baixo dilatel, altamente reticulada de poliestireno
obtida por polimerização de divinilbenzeno (min 60%), estireno , e 4- clorometilestireno na presença de um
agente porogeneous. O MPOP clorometil macroporoso obtido é convertido em aminometil MPPS.
Linker chemistry
Para tornar o material sólido de suporte
adequado para a síntese de oligonucleótidos,
os ligantes não nucleosídicos ou os
succinatos de nucleósidos estão ligados
covalentemente aos grupos amino reactivos
em aminopropil CPG, LCAA CPG ou
aminometil MPPS. Os restantes grupos
amino que não reagiram são cobertos com
anidrido acético . Normalmente, três grupos
conceitualmente diferentes de suportes
sólidos são usados.
Suportes comerciais sólidos para a síntese de oligonucleótidos.
Suportes universais . Num método mais
recente, mais conveniente e mais
amplamente utilizado, a síntese
começa com o suporte universal onde
um ligador não nucleosidico está ligado
ao material de suporte sólido
(compostos 1 e 2 ). Uma fosforamidite
respectiva ao resíduo nucleósido 3 '-
terminal é acoplada ao suporte sólido
universal no primeiro ciclo sintético da
montagem da cadeia oligonucleotidica
utilizando os protocolos padrão. A
montagem da cadeia é então
continuada até à conclusão, após o que Esquema 6. Mecanismo de 3? -fosforilao de oligonucleidos
o oligonucleótido ligado ao suporte montados em suportes sidos universais.
sólido é desprotegido. A característica
dos suportes sólidos universais é que a
liberação dos oligonucleotídeos ocorre
pela clivagem hidrolítica de uma ligação PO que liga o 3'- Odo resï¿½uo nucleotï¿½ico 3'-terminal ao ligante
universal como mostrado no Esquema 6. A vantagem crï¿½ica desta abordagem ï¿½que o mesmo suporte
sï¿½ido ï¿½utilizado independentemente da sequï¿½cia do oligonucleï¿½ido a ser sintetizado. Para a remoção
completa do ligante e do fosfato do terminal 3 'do oligonucleótido montado, o suporte sólido 1 e vários suportes
sólidos [80] requerem amoníaco gasoso, [81] hidróxido de amónio aquoso, metilamina aquosa, [82] ou a sua
mistura [83] e estão comercialmente disponíveis. [84] [85] O suporte sólido 2 [86] requer uma solução de amônia em
anidrometanol e também está comercialmente disponível. [87] [88]
Suportes sólidos nucleosídicos . Numa abordagem historicamente inédita e ainda popular, o grupo 3'-hidroxi do
resíduo nucleósido 3 '-terminal está ligado ao suporte sólido via, mais frequentemente, o grupo 3'- O- succinilo
como no composto 3 . A montagem da cadeia oligonucleotídica começa com o acoplamento de um bloco de
construção de fosforamidito respectivo ao nucleótidoresíduo segundo a partir do terminal 3 '. O grupo hidroxi 3 '-
terminal em oligonucleótidos sintetizados em suportes sólidos nucleosídicos é desprotegido sob condições um
pouco mais suaves do que as aplicáveis a suportes sólidos universais. No entanto, o fato de um suporte sólido
nucleosídico ter de ser selecionado de uma maneira específica da sequência reduz o rendimento de todo o
processo sintético e aumenta a probabilidade de erro humano.
Suportes sólidos especiais são utilizados para a ligação de grupos funcionais ou repórter desejados no terminal 3
'de oligonucleótidos sintéticos. Por exemplo, o suporte sólido comercial [89] 4 [90] permite a preparação de
oligonucleótidos contendo o ligante 3-aminopropilo 3'-terminal. Similarmente aos fosforamiditos não
nucleosídicos, muitos outros suportes sólidos especiais concebidos para a ligação de grupos funcionais
reactivos, grupos repórter não radioactivos e modificadores terminais ( colesterol ec ou outras cadeias
hidrofóbicas) e adequados para várias aplicações estão comercialmente disponíveis. Uma informação mais
detalhada sobre vários suportes sólidos para a síntese de oligonucleotídeos pode ser encontrada em uma
revisão recente. [78]
Fosforotioatos oligonucleotídeos e sua síntese

Os fosforotioatos oligonucleoticos (OPS) s oligonucleidos
modificados em que um dos omos de oxigio na poro fosfato
substituo por enxofre. Apenas os fosforotioatos com enxofre
numa posição não ligante, como mostrado na figura, são
amplamente utilizados e estão disponíveis comercialmente. A
substituição do oxigênio não-ponte por enxofre cria um novo
centro de quiralidade no fósforo . Em um caso simples de um
dinucleótido, isto resulta na formação de um diastereomérica
par de S - e R monophosphorothioates -dinucleoside cujas
p p
Ligações fosforotioato internucleossídicas S e R
estruturas são mostradas na Figura. Em um oligonucleotídeo p
n- mer onde todos ( n - 1) as ligações internucleosídicas são diastereoméricas.
p-
ligações fosforotioato, o número de diastereómeros m é
( - 1)
calculado como m = 2 n . Sendo análogos não naturais de
ácidos nucleicos, os OPS são substancialmente mais estáveis em relação à hidrólise por nucleases , a classe de enzimas
que destroem os ácidos nucleicos quebrando a ligação PO em ponte da porção fosfodiéster. Esta propriedade
determina a utilização de OPS como oligonucleótidos anti-sentido em aplicações in vitro e in vivo , em que a exposição
extensiva a nucleases é inevitável. Da mesma forma, para melhorar a estabilidade do siRNA, pelo menos uma ligação
fosforotioato é frequentemente introduzida no terminal 3 'de ambas as cadeias com sentido e anti-sentido. Em OPS
quiralmente puro, todos os diastereómeros de todos os Sp são mais estáveis à degradação enzimática do que os seus
análogos de todos os Rp. [91] No entanto, a preparação de OPS quiralmente pura continua sendo um desafio sintético.
[13] [92] Na prática de laboratório, misturas de diastereômeros de OPS são comumente usadas.
A síntese de OPS é muito semelhante à dos oligonucleótidos naturais. A diferença é que a etapa de oxidação é
substituída pela reação de transferência de enxofre (sulfurização) e que a etapa de cobertura é realizada após a
sulfurização. De muitos reagentes relatados capazes de transferência eficiente de enxofre, apenas três estão
comercialmente disponíveis:
A 3- (dimetilaminometilideno) amino-3H-1,2,4-ditiazol-3-tiona, DDTT (

3 ) proporciona cinética rápida de sulfurização e alta estabilidade em
solução. [73] [93] [94] O reagente está disponível em várias fontes.
[95] [96]
O 1,1-diido de 3H -1,2-benzoditiol-3-ona ( 4 ) [97] [98] tamb conhecido

como reagente de Beaucage apresenta uma melhor solubilidade em
acetonitrilo e tempos de reaco curtos. No entanto, o reagente tem
estabilidade limitada em solução e é menos eficiente nas ligações de Agentes comerciais de transferência
RNA de sulfuração. [93] [94] de enxofre para a síntese de
O dissulfureto de N, N, N'N'- tetraetiltiuram (TETD) é solúvel em oligonucleotídeos.
acetonitrilo e está comercialmente disponível. [99] No entanto, a
reação de sulfurização de uma ligação de DNA internucleosídico com
TETD requer 15 min, [100] que é mais de 10 vezes mais lento que com os compostos 3 e 4 .
Automação
No passado, a síntese de oligonucleótidos foi realizada manualmente em solução ou em fase sólida. A síntese em fase
sólida foi implementada usando, como recipientes para a fase sólida, colunas de vidro em miniatura similares em sua
forma a colunas de cromatografia de baixa pressão ou seringas equipadas com filtros porosos. [101] Atualmente, a
síntese de oligonucleotídeos em fase sólida é realizada automaticamente usando instrumentos controlados por
computador (sintetizadores de oligonucleotídeos) e é tecnicamente implementada em formatos de colunas, placas de
múltiplos poços e matrizes. O formato da coluna é mais adequado para pesquisa e aplicativos de grande escala, em que
não é necessário um alto rendimento. [102]O formato de placa de múltiplos poços é projetado especificamente para
síntese de alto rendimento em pequena escala para satisfazer a crescente demanda da indústria e da academia por
oligonucleotídeos sintéticos. [103] Um número de sintetizadores de oligonucleotídeos para síntese em pequena escala
[104] [105] [106] [107] [108] e síntese de médio a grande escala [109] estão disponíveis comercialmente.
Primeiros sintetizadores de oligonucleotídeos disponíveis no mercado

Em março de 1982, um curso prático foi organizado pelo Departamento de Bioquímica da Technische Hochschule
Darmstadt, na Alemanha. MH Caruthers, MJ Gait, HG Gassen, H. Koster, K. Itakura e C. Birr, entre outros,
compareceram. O programa compreendeu trabalho prático, palestras e seminários sobre síntese química em fase
sólida de oligonucleotídeos. Um seleto grupo de 15 alunos compareceu e teve uma oportunidade sem precedentes de
ser instruído pelo estimado corpo docente.
Juntamente com exercícios manuais, várias empresas proeminentes de

automação participaram do curso. Biosearch de Novato, CA, Genetic
Design de Watertown, MA, foram duas das várias empresas a demonstrar
sintetizadores automatizados no curso. A Biosearch apresentou seu novo
sintetizador SAM I. A Genetic Design desenvolveu seu sintetizador a partir
do projeto de seu seqüenciador de peptídeos em fase sólida (Sequemat). O
projeto genético organizado com o Dr. Christian Birr (Instituto Max-Planck
de Pesquisa Médica) [1] (http://www.orpechem.com/en/company/Manag
ement.php)uma semana antes do evento para converter seu sequenciador
de fase sólida no sintetizador semi-automático. A equipa liderada pelo Dr.
Alex Bonner e Rick Neves converteu a unidade e transportou-a para
Darmstadt para o evento e instalou-se no laboratório de Bioquímica da
Technische Hochschule. Como o sistema era semi-automático, o usuário
injetava a próxima base a ser adicionada à sequência crescente durante
cada ciclo. O sistema funcionou bem e produziu uma série de tubos de
ensaio preenchidos com uma cor vermelha brilhante indicando o acoplamento completo em cada etapa. Este sistema
foi posteriormente totalmente automatizado pela inclusão de um auto injetor e foi designado o Modelo 25A.
História da síntese de oligonucleotídeos de médio a grande porte

Os sintetizadores de oligonucleótidos em larga escala foram frequentemente desenvolvidos aumentando as
capacidades de uma plataforma de instrumentos preexistente. Um dos primeiros sintetizadores de média escala
apareceu no final da década de 1980, fabricado pela empresa Biosearch em Novato, CA (The 8800). Esta plataforma
foi originalmente projetada como um sintetizador de peptídeos e fez uso de um reator de leito fluidizado essencial para
acomodar as características de inchamento dos suportes de poliestireno usados na metodologia Merrifield. A síntese
de oligonucleótidos envolveu a utilização de CPG (vidro de poro controlado) que é um suporte rígido e é mais
adequado para reactores de coluna como descrito acima. A escala do 8800 foi limitada à taxa de fluxo necessária para
fluidizar o suporte. Alguns novos projetos de reatores, bem como pressões mais altas do que o normal, permitiram que
o 8800 atingisse escalas que preparariam 1 mmole de oligonucleotídeo. Em meados da década de 1990, várias
empresas desenvolveram plataformas baseadas em cromatógrafos líquidos semipreparativos e preparativos. Esses
sistemas foram bem adequados para uma abordagem de reator de coluna. Na maioria dos casos, tudo o que era
necessário era aumentar o número de fluidos que poderiam ser entregues à coluna. A síntese de oligo requer um
mínimo de 10 e os cromatógrafos líquidos geralmente acomodam 4. Esta foi uma tarefa de projeto fácil e algumas
estratégias semiautomáticas funcionaram sem quaisquer modificações no equipamento de LC preexistente. A
PerSeptive Biosystems e a Pharmacia (GE) foram duas das várias empresas que desenvolveram sintetizadores a partir
de cromatógrafos líquidos. Genomic Technologies, Inc. Em meados da década de 1990, várias empresas
desenvolveram plataformas baseadas em cromatógrafos líquidos semipreparativos e preparativos. Esses sistemas
foram bem adequados para uma abordagem de reator de coluna. Na maioria dos casos, tudo o que era necessário era
aumentar o número de fluidos que poderiam ser entregues à coluna. A síntese de oligo requer um mínimo de 10 e os
cromatógrafos líquidos geralmente acomodam 4. Esta foi uma tarefa de projeto fácil e algumas estratégias
semiautomáticas funcionaram sem quaisquer modificações no equipamento de LC preexistente. A PerSeptive
Biosystems e a Pharmacia (GE) foram duas das várias empresas que desenvolveram sintetizadores a partir de
cromatógrafos líquidos. Genomic Technologies, Inc. Em meados da década de 1990, várias empresas desenvolveram
plataformas baseadas em cromatógrafos líquidos semipreparativos e preparativos. Esses sistemas foram bem
adequados para uma abordagem de reator de coluna. Na maioria dos casos, tudo o que era necessário era aumentar o
número de fluidos que poderiam ser entregues à coluna. A síntese de oligo requer um mínimo de 10 e os
cromatógrafos líquidos. Genomic Technologies, Inc. Esses sistemas foram bem adequados para uma abordagem de
reator de coluna. Na maioria dos casos, tudo o que era necessário era aumentar o número de fluidos que poderiam ser
entregues à coluna. A síntese de oligo requer um mínimo de 10 e os cromatógrafos líquidos geralmente acomodam 4.
Esta foi uma tarefa de projeto fácil e algumas estratégias semiautomáticas funcionaram sem quaisquer modificações
no equipamento de LC preexistente. A PerSeptive Biosystems e a Pharmacia (GE) foram duas das várias empresas que
desenvolveram sintetizadores a partir de cromatógrafos líquidos. Genomic Technologies, Inc. Esses sistemas foram
bem adequados para uma abordagem de reator de coluna. Na maioria dos casos, tudo o que era necessário era
aumentar o número de fluidos que poderiam ser entregues à coluna. A síntese de oligo requer um mínimo de 10 e os
cromatógrafos líquidos. Genomic Technologies, Inc. Esta foi uma tarefa fácil de projeto e algumas estratégias semi-
automáticas funcionaram sem qualquer modificação no equipamento LC pré-existente. A PerSeptive Biosystems e a
Pharmacia (GE) foram duas das várias empresas que desenvolveram sintetizadores a partir de cromatógrafos líquidos.
Genomic Technologies, Inc. Esta foi uma tarefa fácil de projeto e algumas estratégias semi-automáticas funcionaram
sem qualquer modificação no equipamento LC pré-existente. A PerSeptive Biosystems e a Pharmacia (GE) foram duas
das várias empresas que desenvolveram sintetizadores a partir de cromatógrafos líquidos. Genomic Technologies,
Inc.[110] foi uma das poucas empresas a desenvolver um sintetizador de oligonucleotídeos em larga escala que era,
desde o início, um sintetizador de oligonucleotídeos. A plataforma inicial chamada de VLSS para um sintetizador de
grande escala utilizava grandes colunas de cromatografia líquida da Pharmacia como reatores e podia sintetizar até 75
milimoles de material. Muitas fábricas de síntese de oligonucleotídeos projetaram e manufaturaram suas próprias
plataformas personalizadas e pouco é conhecido devido aos projetos serem proprietários. O design de VLSS continuou
a ser refinado e é continuado no sintetizador QMaster [111], que é uma plataforma reduzida que fornece miligramas a
gramas de oligonucleótido sintético.
As práticas atuais de síntese de oligonucleotídeos quimicamente modificados em larga escala foram recentemente
revisadas. [112]
Síntese de microarrays de oligonucleotídeos
Pode-se visualizar um microarray de oligonucleotídeo como uma placa de múltiplos poços em miniatura, onde os
divisores físicos entre os poços (paredes de plástico) são intencionalmente removidos. No que diz respeito à química, a
síntese de microarranjos de oligonucleótidos é diferente da síntese convencional de oligonucleótidos em dois aspectos:
Os oligonucleótidos permanecem permanentemente ligados à fase

sólida, o que requer o uso de ligantes que são estáveis sob as
condições do procedimento final de desproteção.
A ausência de divisores físicos entre os locais ocupados por
oligonucleotídeos individuais, um espaço muito limitado na superfície
do microarray (uma seqüência de oligonucleotídeos ocupa um
quadrado 25 × 25 μm) [113] e a exigência de alta fidelidade da síntese
de oligonucleotídeos dita o uso de tnicas de desproteco 5? Em uma
abordagem, a remoção do grupo 5'- O- DMT é efetuada pela geração
eletroquímica do ácido no (s) local (is) requerido (s). [114] Outra 5'- O -MeNPOC-fosforamidito
abordagem utiliza o grupo protetor 5'- O- (α-metil-6- nucleosídeo protegido.
nitropiperoniloxicarbonila) (MeNPOC), que pode ser removido por
irradiação com luz UV de comprimento de onda de 365 nm. [113]
Processamento pós-sintético
Após a conclusão da montagem da cadeia, o oligonucleótido ligado ao suporte sólido é totalmente protegido:
O grupo 5'-terminal 5'-hidróxi é protegido com o grupo DMT;

As porções fosfato ou fosforotioato internucleosídicas são protegidas com grupos 2-cianoetilo;
Os grupos amino exocíclicos em todas as bases nucleicas, com excepção de T e U, são protegidos com grupos
protectores de acilo.
Para fornecer um oligonucleótido funcional, todos os grupos protectores têm de ser removidos. A protecï¿½o da base
de N-acilo e a protecï¿½o do 2-cianoetilfosfato podem ser e sï¿½ frequentemente removidas simultaneamente por
tratamento com bases inorgï¿½icas ou aminas. No entanto, a aplicabilidade deste método é limitada pelo facto de a
clivagem da protecção 2-cianoetilfosfato originar acrilonitrilo como produto secundário. Sob as condições básicas
fortes necessárias para a remoção da proteção de N-acil, o acrilonitrilo é capaz de alquilar bases nucléicas,
principalmente, na posição N3 dos resíduos de timina e uracila para dar os respectivos adutos de N3- (2-cianoetil) via
Michael reação. A formação destes produtos secundários pode ser evitada tratando os oligonucleótidos ligados ao
suporte sólido com soluções de bases num solvente orgânico, por exemplo, com 50% de trietilamina em acetonitrilo
[115] ou 10% de dietilamina em acetonitrilo. [116] Esse tratamento é fortemente recomendado para preparações de
média e grande escala e é opcional para sínteses em pequena escala, onde a concentração de acrilonitrila gerada na
mistura de desproteção é baixa.
Independentemente de os grupos protectores de fosfato terem sido removidos em primeiro lugar, os oligonucleótidos
ligados ao suporte sólido são desprotegidos utilizando uma das duas abordagens gerais.
(1) Mais frequentemente, o grupo 5'-DMT é removido no final da montagem da cadeia oligonucleotídica. Os
oligonucleotídeos são então liberados da fase sólida e desprotegidos (base e fosfato) por tratamento com
hidróxido de amônio aquoso , metilamina aquosa , suas misturas, [40] amônia gasosa ou metilamina [117] ou,
menos comumente, soluções de outras aminas primárias ou alcalinos a temperatura ambiente ou elevada. Isto
remove todos os restantes grupos de protecção dos 2'-desoxi-oligonucleótidos, resultando numa mistura
reaccional contendo o produto desejado. Se o oligonucleótido contiver quaisquer resíduos de ribonucleótido 2'-
O- protegidos, o protocolo de desprotecção inclui o segundo passo em que o 2'- OOs grupos sililo-protectores
são removidos por tratamento com ião fluoreto por vários métodos. [118] O produto totalmente desprotegido é
utilizado como tal, ou o oligonucleótido desejado pode ser purificado por vários métodos. Mais comumente, o
produto bruto é dessalinizado usando precipitação com etanol , cromatografia por exclusão de tamanho ou HPLC
de fase reversa . Para eliminar produtos de truncagem indesejados, os oligonucleótidos podem ser purificados
via electroforese em gel de poliacrilamida ou HPLC de permuta aniónica, seguido de dessalinização.
(2) A segunda abordagem é usada apenas quando o método pretendido de purificação é HPLC de fase reversa .
Neste caso, o grupo DMT 5'-terminal que serve como um manipulador hidrofóbico para purificação é mantido no
final da síntese. O oligonucleótido é desprotegido sob condições básicas como descrito acima e, após
evaporação, é purificado por HPLC de fase reversa. O material coletado é então detritivado sob condições ácidas
aquosas. Em pequena escala (inferior a 0,01-0,02 mmol), o tratamento com ácido acético aquoso a 80% durante
15-30 min à temperatura ambiente é frequentemente utilizado seguido de evaporação da mistura reaccional até à
secura in vacuo . Finalmente, o produto é dessalinizado como descrito acima.

Para algumas aplicaï¿½es, grupos repï¿½teres adicionais podem ser ligados a um oligonucleï¿½ido utilizando
uma variedade de procedimentos pï¿½-sintï¿½icos.
Caracterização
Tal como com qualquer outro
composto orgânico, é prudente
caracterizar os
oligonucleótidos sintéticos
após a sua preparação. Em
casos mais complexos
(pesquisas e sínteses em
grande escala), os
oligonucleotídeos são
caracterizados após sua
desproteção e após a
purificação. Embora a
abordagem final para a
caracterização seja o
sequenciamento , um
procedimento relativamente
barato e de rotina, as Deconvoluídos ES MS de oligonucleótido em bruto 5'-DMT-T (calculado de
20
considerações da redução de
massa 6324,26 Da).
custo impedem seu uso na
fabricação rotineira de
oligonucleotídeos. Na prática do dia-a-dia, é suficiente obter a massa molecular de um oligonucleótido, registrando o
seu espectro de massa . Atualmente, dois métodos são amplamente utilizados para a caracterização de
oligonucleotídeos: espectrometria de massa por eletrospray (ES MS) eDesabspção a laser assistida por matriz /
ionização por espectrometria de massa de tempo de voo ( MALDI-TOF ). Para obter espectros informativos, é muito
importante trocar todos os íons metálicos que possam estar presentes na amostra por íons amônio ou trialquilamônio
+
[ ec trietilamônio, (C H ) NH ] antes de submeter uma amostra à análise por dos métodos.
2 5 3
No espectro ES MS, um dado oligonucleótido gera um conjunto de iões que correspondem a diferentes estados
de ionização do composto. Assim, o oligonucleotídeo com massa molecular M gera íons com massas (M - n H) /
n onde M é a massa molecular do oligonucleotídeo na forma de um ácido livre (todas as cargas negativas de
+
grupos fosfodiéster internucleosídicos são neutralizadas com H ) , n é o estado de ionização e H é a massa
atômica do hidrogênio (1 Da ). Os mais úteis para caracterização são os íons com n variando de 2 a 5. O
software fornecido com os instrumentos fabricados mais recentemente é capaz de executarprocesso de
deconvolução , ou seja, encontra picos de íons que pertencem ao mesmo conjunto e deriva a massa molecular
do oligonucleotídeo.
Para obter informação mais detalhada sobre o perfil de impurezas dos oligonucleótidos, utiliza-se espectrometria
de massa por cromatografia líquida (LC-MS ou HPLC-MS) [119] ou espectrometria de massa por electroforese
capilar (CEMS) [120] .
Veja também
Ácidos nucleicos
Análogos de ácido nucleico
Ácido nucléico peptídico
Ácidos Nucleicos Ligados
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26/03/2018 Síntese de oligonucleotídeos - Wikipedia

História da síntese de oligonucleotídeos de médio a grande porte

Primeiros trabalhos e síntese contemporânea de H-fosfonato

Trinta anos depois, este trabalho

implementado em poliestireno de "pipoca" de baixa[26] e mais

Síntese de fosfato triéster

Síntese pelo método do fosforamidito

O grupo 5'-hidroxilo é protegido por um grupo DMT (4,4'-dimetoxitritilo) instável em ácido .

Na síntese de RNA, o grupo 2'-hidroxi é

Fosforamiditos não nucleósidos

Etapa 1: Desbloqueio (detritalização)

O grupo DMT é removido com uma solução

excesso e maior é a concentração dos fosforamiditos. Em contraste, a concentração do ativador é determinada

Material de suporte sólido

Fosforotioatos oligonucleotídeos e sua síntese

A 3- (dimetilaminometilideno) amino-3H-1,2,4-ditiazol-3-tiona, DDTT (

O 1,1-diido de 3H -1,2-benzoditiol-3-ona ( 4 ) [97] [98] tamb conhecido

Primeiros sintetizadores de oligonucleotídeos disponíveis no mercado

Juntamente com exercícios manuais, várias empresas proeminentes de

História da síntese de oligonucleotídeos de médio a grande porte

Síntese de microarrays de oligonucleotídeos

Os oligonucleótidos permanecem permanentemente ligados à fase

O grupo 5'-terminal 5'-hidróxi é protegido com o grupo DMT;

secura in vacuo . Finalmente, o produto é dessalinizado como descrito acima.

33. "Beta-Cyanoethyl Phosphoramidites" (https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavi

104. "DNA / RNA Oligonucleotide Synthesizer: MerMade" (http://www.bioautomation.com/). Bioautomation.com.

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