Comparación de estabilidad térmica y rendimiento de

inmovilización de Candida antarctica lipasa B (CALB)

inmovilizada en soportes Octil (Oc) y Glioxil (Gx)

Diana Leiva Portilla

1. Introducción
Las enzimas tienen algunas limitaciones como biocatalizadores industriales, por ejemplo, la
actividad y estabilidad moderada de las enzimas en las condiciones requeridas a veces por la
industria, donde incluso es necesario reutilizarlas. La estabilidad operativa de la enzima
puede mejorarse mediante herramientas de biología molecular, modificaciones químicas,
inmovilización enzimática y también seleccionando condiciones de reacción adecuadas.
La inmovilización de enzimas es una estrategia conveniente para la preparación de
biocatalizadores industriales y aumentar su rendimiento operacional. Se ha desarrollado
como una herramienta que puede permitir la mejora de propiedades enzimáticas como
estabilidad, actividad, selectividad, especificidad o resistencia a la inhibición y además su
reutilización (Sheldon, 2007). Para la elección del tipo de inmovilización, este depende de
diferentes factores y requisitos específicos de un proceso en particular.
Las lipasas se encuentran entre las enzimas más utilizadas en biocatálisis, debido a su amplia
especificidad, estabilidad en diferentes medios de reacción y versatilidad (Rueda et al., 2005).
Generalmente, las lipasas, como la mayoría de las enzimas, requieren la inmovilización
previa para facilitar su recuperación y el control del reactor para su uso como biocatalizadores
industriales.
El objetivo de este estudio fue determinar diferentes parámetros asociados a la
inmovilización de la Candida antarctica lipasa B (CALB) en dos soportes: Octil (Oc) y
Glioxil (Gx); y además comparar la estabilidad térmica a 50 °C de los biocatalizadores
inmovilizados.
 2. Materiales y métodos

2.1. Materiales
La lipasa de Candida antarctica lipasa B (CALB) utilizada fue lipozyme® CALB
(Novozyme), el sustrato utilizado fue p-Nitrofenil butirato (p-NPB) (Sigma Chemical Co.,
St. Louis, MO, USA).

2.2. Inmovilización de la CALB

Para determinar la cinética de inmovilización y tener el comportamiento global del proceso,
se midió actividad al control, suspensión y sobrenadante. La solución control en la enzima
inmovilizada en Oc corresponde a la solución madre de CALB, donde se tomaron 110 µl de
CALB en 15 ml de buffer pH=7.0, en cambio en la solución control de la enzima
inmovilizada en Gx, el buffer utilizado para la dilución fue pH=10.04. La suspensión
corresponde 12 ml de solución madre con 300 mg de soporte, esta solución se mantuvo
durante todo el proceso en agitación. Luego se midió la actividad del sobrenadante que se
obtuvo luego de centrifugar 200 µl de la suspensión. Periódicamente, se retiraron muestras
del sobrenadante y la suspensión, y la actividad de la enzima se midió como se describe en
el punto 2.3.

2.3. Ensayo de actividad enzimática

La hidrólisis de p-NPB se usó como ensayo de actividad estándar. El p-nitrofenol liberado
en buffer fosfato de sodio 25 mM a pH 7,0 y 25 °C se determinó a 348 nm, donde el
coeficiente de extinción molar (ε) es 5,235. La reacción se inicializó añadiendo 2 ml de buffer
fosfato pH=7.0, 50 μl de solución o suspensión de lipasa y 25 μl de sustrato (p-NPB) y se
midió espectrofotométricamente (JASCO modelo AS-2089). Una unidad internacional de
actividad (UI) se definió como la cantidad de enzima que hidroliza 1 μmol de p-NPB por
minuto en las condiciones descritas anteriormente.

2.4. Estabilidad térmica del biocatalizador

La estabilidad del biocatalizador se obtuvo incubando la solución control e inmovilizada en
un baño a 50 °C durante 24 h. Periódicamente, se retiraron muestras control e inmovilizadas,
luego se midió la actividad enzimática en tampón fosfato de sodio 25 mM, pH=7.0 con el
objetivo de comparar la estabilidad de los diferentes soportes utilizados, en este caso de octil
(Oc) y glioxil (Gx).

2.5. Determinación de rendimiento de inmovilización

El rendimiento de inmovilización en términos de actividad (IYa) se calculó de acuerdo a la
siguiente ecuación:

𝐴𝑒
𝐼𝑌𝑎% = 𝑥 100
𝐴𝑜

donde Ao es la actividad ofrecida, y Ae es la actividad expresada en la enzima inmovilizada.

3. Resultados y discusión

3.1. Cinética de inmovilización

La CALB inmovilizada en Oc (ver Figura 1), en la primera medición realizada, a los 30

minutos presentó diferencias entre el control, sobrenadante y suspensión. Estas diferencias
se mantuvieron en todos los puntos de medición (durante 3 horas). La actividad en el
sobrenadante cae un 60% respecto al control, este resultado es positivo, debido a que esta
baja en la actividad indica que la enzima pasó al soporte y está inmovilizada. Mientras que
la actividad en la suspensión, que corresponde la enzima inmovilizada, se obtuvieron valores
cercanos al control. Lo similar de estos valores indica que la enzima no se inactivó bajo las
condiciones de inmovilización, y que mantiene una alta actividad. Pasadas 1 h de incubación
la actividad en la muestra control disminuye en el tiempo, llegando a un 82% de actividad a
las 3 h. En este caso no se podría atribuir esta baja al pH. De acuerdo a estos resultados la
CALB fue inmovilizada con éxito en soporte Oc. Por otra parte, la CALB inmovilizada en
Gx (ver Figura 2) a los 30 min la actividad enzimática en el control aumentó a un 144,7%
mientras que en la suspensión disminuyó al 42,2%. Si bien la actividad del sobrenadante
disminuyó al 30%, indicando que la enzima se inmovilizó, la baja en la actividad en la
suspensión podría significar una inactivación debido a las condiciones de pH que pudieron
haber afectado a la enzima y su actividad. Finalmente, los valores de actividad relativa entre
la enzima soluble e inmovilizada pasadas 1 h de inmovilización con Gx; fueron iguales, por
lo tanto, las enzimas no se inactivaron y aguantaron las condiciones de inmovilización.
La CALB inmovilizada en Oc obtuvo un mejor rendimiento en la expresión de actividad
(IYa%) alcanzando un 97,3% (ver Figura 3), lo que representa una alta selectividad con este
soporte, ya que la enzima se inmovilizó casi en su totalidad. Esto se debe principalmente a la
presencia de grupos octil en el soporte, estos grupos proporcionan mayor hidrofobicidad a la
superficie del soporte, lo que lograría una alta carga de enzimas a este (Blanco et al., 2004).
Barbosa et al. (2012) reportaron una actividad similar obtenida con la CALB inmovilizada
en octil-agarosa, esta fue de un 95%. Mientras que la CALB inmovilizada en Gx alcanzó un
63,6%.

120

100
Actividad relativa (%)

80

60

40

20

0
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
Tiempo (h)

Control Sobrenadante Suspensión

Figura 1. Actividad relativa de la CALB inmovilizada en soporte octil (Oc)

 160
140

Actividad relativa (%)

120
100
80
60
40
20
0
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
Tiempo (h)

Control Sobrenadante Suspensión

Figura 2. Actividad relativa de la CALB inmovilizada en soporte glioxil (Gx).

Actividad Actividad
Soporte expresada ofrecida IYa%
(UI/g) (UI/g)
Oc 54,04 55,6 97,2
Gx 28,5 44,8 63,6

Figura 3. Rendimiento (IYa %) de la enzima CALB inmovilizada en distintos soportes.

3.2. Estabilidad de la CALB inmovilizada

La estabilidad de la CALB inmovilizada con los soportes Oc y Gx se muestra en la figura 4

y 5 respectivamente.
Durante las primeras 1.5 h no hay mayores diferencias en el comportamiento de la enzima
soluble e insoluble, la CALB soluble e inmovilizada en Oc tuvieron una caída en su actividad
llegando al 73% y 66% respectivamente, estos valores se mantienen hasta las 6 h. Luego de
8 h de incubación aparecen diferencias de estabilidad entre la enzima soluble e inmovilizada,
donde la actividad de la enzima soluble cae dramáticamente hasta el 35%, mientras que la
enzima inmovilizada en Oc presenta una actividad del 81%, teniendo una diferencia del orden
del 50% de actividad respecto a la enzima sin inmovilizar. Si bien al principio las enzimas
soluble e inmovilizada obtuvieron un similar comportamiento, esta última resistió de mejor
forma las condiciones de temperatura a la que fue incubada, esto se debe a que los enlaces
hidrofóbicos le confirieron estabilidad térmica a la enzima evitando el despliegue de
proteínas (Rueda et al., 2016).
Hasta las 24 h hay una tendencia a la disminución de la actividad relativa en la enzima
inmovilizada, alcanzándose valores muy similares a la enzima soluble, por lo que pierde su
estabilidad. La CALB exhibe una baja estabilidad térmica al ser inmovilizada en soporte Oc,
probablemente porque la lipasa solo se adsorbe por interacciones hidrofóbicas que no
proporcionan estabilidad adicional contra la temperatura. Vescovi et al. (2016) reportan la
estabilidad térmica de la CALB a 45 °C inmovilizada en soporte Oc (pH=7.0), la actividad
relativa disminuye hasta el 60%, los autores lo asocian a que las lipasas pueden adsorberse
irreversiblemente en superficies hidrófobas y posteriormente inactivarse.

Por otra parte, la enzima inmovilizada en soporte Gx presentó notables diferencias respecto
a la enzima soluble, mientras que la enzima inmovilizada mantiene relativamente estable su
actividad en el tiempo, la enzima soluble presenta una disminución hasta el 40% de su
actividad inicial. Las dos enzimas, si bien tienen grandes diferencias en su actividad relativa,
mantienen un comportamiento estable en el tiempo, sin presentar bajas (ver Figura 5). Los
valores de actividad durante las primeras 6 horas de la enzima soluble a pH=7 son mayores
que los de la enzima soluble a pH=10, por lo tanto, la alcalinidad del medio es un factor que
afectó a la estabilidad de la CALB durante las primeras horas de incubación a 50 °C.
Haciendo una comparación entre los biocatalizadores inmovilizados en los diferentes
soportes presentados en este estudio, la estabilidad de la CALB inmovilizada en Gx fue
mayor que en la Oc, donde el biocatalizador en soporte Gx a las 24 h tuvo una actividad del
orden del 80%, con Oc en cambio, la actividad se vio muy disminuida hasta el 38%. Estas
diferencias se presentan probablemente a la apropiada congruencia geométrica de los poros
del soporte; y a la rigidez impuesta por la unión covalente entre la enzima y el soporte Gx,
lo que confiere una mayor estabilidad a la enzima impidiendo su desnaturalización. La unión
covalente brinda una fuerte interacción entre la enzima y el soporte, lo que deviene en una
alta estabilidad térmica (Bernal et al., 2012). Esta fuerte interacción podría tener
consecuencias en la actividad enzimática debido a la rigidez en el soporte a la que se expone
la enzima. Esta situación se refleja en los valores de actividad específica obtenidos con el
biocatalizador inmovilizado en Gx y la enzima soluble, estos valores fueron 1,21 y 0,71
respectivamente, donde la actividad del biocatalizador disminuyó luego de ser inmovilizada
la enzima, situación que está en estrecha relación con las características de la unión al soporte,
el sitio activo se rigidiza cuando se forman los enlaces covalentes entre la enzima y el soporte,
lo que afectaría directamente a su actividad (Bernal et al., 2014).

120

100
Actividad relativa (%)

80

60

40

20

0
0 4 8 12 16 20 24
Tiempo (h)

Control Inmovilizada

Figura 4. Actividad relativa a 50 °C durante 24 h de la CALB inmovilizada en soporte octil

(Oc).
 120

100

Actividad relativa (%)

80

60

40

20

0
0 4 8 12 16 20 24
Tiempo (h)

Control Inmovilizada Gx

Figura 5. Actividad relativa a 50 °C durante 24 h de la CALB inmovilizada en soporte

glioxil (Gx).

4. Conclusiones

Las enzimas inmovilizadas mediante soporte con grupos glioxil (Gx) presentaron mejor
estabilidad térmica a 50 °C que las inmovilizadas con soporte octil (Oc), este resultado se
atribuye al efecto de los enlaces que hay en la unión enzima-soporte. Los enlaces covalentes
del soporte Gx le dieron estabilidad térmica a la CALB, manteniendo su actividad relativa
incluso en condiciones de alcalinidad (pH=10), los enlaces hidrofóbicos del soporte Oc en
cambio, no fueron suficientes para mantener estable la CALB inmovilizada e incubada a 50
°C. Si bien la inmovilización con soporte Oc tuvo una mayor afinidad con la enzima, llegando
a un 97% en el rendimiento de inmovilización, su actividad se mantuvo más baja que la
enzima soluble, en el caso del biocatalizador inmovilizado en Gx, pasada la primera hora, la
actividad respecto a la enzima insoluble se mantiene igual.
A este estudio se le podría agregar valores de tiempo de vida media y rendimiento en la carga
de proteínas al soporte, con estos antecedentes se podrían obtener una idea más exacta de las
posibles interacciones enzima-soporte. En conclusión, la CALB inmovilizada en soporte Gx
tiene mayor estabilidad en el tiempo, por lo que es la opción más óptima encontrada en este
estudio.
 5. Referencias

Barbosa, O., Torres, R., Ortiz, C. 2012. Versatility of glutaraldehyde to immobilize lipases:
Effect of the immobilization protocol on the properties of lipase B from Candida antárctica.
Process Biochemistry, 47, 1220–1227.

Bernal, C., Sierra, L., Mesa, M. 2012. Improvement of thermal stability of β-galactosidase
from Bacillus circulans by multipoint covalent immobilization in hierarchical macro-
mesoporous silica. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 84, pp. 166-172.

Bernal, C., Illanes, A., Wilson, L. 2014. Heterofunctional hydrophilic-hydrophobic porous

silica as support for multipoint covalent immobilization of lipases: Application to lactulose
palmitate synthesis. Langmuir. 30, pp. 3557-3566.

Blanco, R., Terreros, P., Fernandez-Perez, M., Otero, C. 2004. Functionalization of

mesoporous silica for lipase immobilization Characterization of the support and the catalysts,
Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 30, 83–93.

Blanco, R., Terreros, P., Muñoz, N., Serra, E. 2007. Ethanol improves lipase
immobilization on a hydrophobic support. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 47,
13–20.

Rueda, N., Albuquerque, T., Bartolomé-Cabrero, M. Fernandez-Lopez, R., Torres, R. Ortiz,

C. 2016. Reversible Immobilization of Lipases on Heterofunctional Octyl-Amino Agarose
Beads Prevents Enzyme Desorption. Molecules , 21, 646.

Sheldon, R. 2007. Enzyme Immobilization: The Quest for Optimum Performance. Adv.
Synth. Catal., 349, 1289 – 1307.

Vescovi, V., Guisan, J., Mendes, A. 2016. Improved catalytic properties of Candida
antarctica lipase B multi-attached on tailor-made hydrophobic silica. Process Biochemistry
67, 567–623.