INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

“PRODUCCION DE AMILASAS POR MICROORGANISMOS

HALOFILICOS Y NO HALOFILICOS EN CULTIVO POR LOTE
SUMERGIDO”

INTEGRANTES: GRUPO: 6IM2

ÁLVAREZ RANGEL JENNIFER
DELGADO MEZA ANGÉLICA JOSSELIN
DOMINGUEZ OLIVARES ALMA ESTEFANIA
OCHOA POBLANO APOLINAR RAFAEL

EQUIPO: 4 / SECCION: 2

PROFESORAS:
ERIKA YANET TAPIA GARCIA
MARICELA SANCHEZ CAMPOS

FECHA DE ENTREGRA: _03/05/2017__

 1. OBJETIVOS
 Elaborar un biorreactor para cultivo sumergido, por lote, aerobio.
 Determinar la actividad enzimática y pH durante el proceso de fermentación por medio
de muestras recolectadas cada tiempo establecido.
 Determinar la producción de biomasa y enzimas de los microorganismos.

2. RESULTADOS Y MEMORIA DE CÁLCULO

TABLA NO.1 DENSIDADES ÓPTICAS A DIFERENTES TIEMPOS DE CINÉTICA

ɅT (h) Tiempo (h) D.O Dilución D.O total
0 0 0.097 - 0.097
4.45 4.45 0.121 - 0.121
5.30 9.75 0.282 - 0.282
11.4 21.15 0.466 - 0.466
5.56 26.71 0.650 - 0.650
6 32.71 0.163 1:4 0.652

Object 3

Fig. 1 Grafica de crecimiento (D.O)

¿ D .01−¿ D .0
µ= ∆t
0

µ0 = 0
µ1= 0.049
µ2= 0.159
µ3=-0.044
µ4 = 0.059
µ5 = 5.12 x 10-4
Por lo tanto
µmáx. = 0.159 a las 9.75h
 ¿2
tduplicación=
µ max
td= 4.35 -1

Ecuación de la recta obtenida de la curva tipo de Maltosa

Y = -0.0543 + 1.4022x10-3 x
Donde:
X: Concentración de maltosa (µg/mL)
Y: Absorbancia
ACTIVIDAD ENZIMATICA
Tiempo (h) A600 (Dil. 1:20)
T0 0 0.061
T1 4.45 0.053
T2 9.75 0.062
T3 21.15 0.067
T4 26.71 0.068
T5 32.71 0.080

SUSTITUYENDO EN LA ECUACION DE LA RECTA:

Y +0.0543
X= 1.4022 x 10−3

X0= 82.22 µg/mL

X1=76.52 µg/mL
X2=82.94 µg/mL
X3=86.50 µg/mL
X4=87.22 µg/mL
X5 = 95.77 µg/mL
Dilucion 1:20 Alicuota 0.5 mL
1
X0= 82.22 µg/mL ( ¿ (20) = 3288.8 µg/mL
0.5 mL
1
X1=76.52 µg/mL ( ¿ (20) = 3060.8 µg/mL
0.5 mL
1
X2=82.94 µg/mL ( ¿ (20) = 3317.6 µg/mL
0.5 mL
 1
X3=86.50 µg/mL ( ¿ (20) = 3460 µg/mL
0.5 mL
1
X4=87.22 µg/mL ( ¿ (20) = 3488.8 µg/mL
0.5 mL
1
X5 = 95.77 µg/mL ( ¿ (20) = 3830.8 µg/mL
0.5 mL
Tiempo 30 min
1
X0= 3288.8 µg/mL ( ¿ = 6577.7 µg/mL h
0.5 h
1
X1=3060.8 µg/mL ( ¿ = 6121.6 µg/mL h
0.5 h
1
X2= 3317.6 µg/mL ( ¿ = 6635.2 µg/mL h
0.5 h
1
X3= 3460 µg/mL ( ¿ = 6920 µg/mL h
0.5 h
1
X4= 3488.8 µg/mL ( ¿ = 6977.6 µg/mL h
0.5 h
1
X5= 3830.8 µg/mL ( ¿ = 7661.6 µg/mL h
0.5 h
PM Maltosa= 342 µg/ µmol
X0= 6577.7 µ g/mL h / 342 µg/ µmol = 19.23 µmol maltosa / mL h

X1= 6121.6µg/mL h / 342 µg/ µmol = 17.89 µmol maltosa / mL h

X2= 6635.2 µg/mL h / 342 µg/ µmol = 19.40 µmol maltosa / mL h
X3= 6920 µg/mL h/ 342 µg/ µmol = 20.23 µmol maltosa / mL h
X4= 6977.6 µg/mL h / 342 µg/ µmol = 20.40 µmol maltosa / mL h
X5= 7661.6 µg/mL h / 342 µg/ µmol = 22.40 µmol maltosa / mL h
ACTIVIDAD ENZIMATICA
UA0=19.23 µmol maltosa / mL h
UA1=17.89 µmol maltosa / mL h
UA2=19.40 µmol maltosa / mL h
UA3=20.23 µmol maltosa / mL h
UA4=20.40 µmol maltosa / mL h
UA5=22.40 µmol maltosa / mL h
 AZÚCARES RESIDUALES

Ecuación de la recta obtenida de la curva tipo de Maltosa

Y = -0.0543 + 1.4022x10-3 x
Donde:
X: Concentración de maltosa (µg/mL)
Y: Absorbancia

Tiempo 1:10
T0 0.042
T1 0.063
T2 0.049
T3 0.039
T4 0.041
T5 0.033

Sustituyendo los valores de Absorbancia en la ecuación de la recta y multiplicando por su

factor de dilución (10), así mismo, dividiendo entre la alÍcuota obtenemos la concentración
de los azúcares residuales en µ g /ml. Posteriormente se convierten a µ mol /ml de
maltosa

0.042+ 0.0543 68.6777 µ g µ g µ mol µ mol

t 0=
1.4022 x 10 3
=
1 ml
( 10 )=686.777 ( )
ml 342 µ g
=2.008
ml

0.063+0.0543 83.6542 µ g µ g µ mol µ mol

t 1=
1.402 2 x 103
=
1 ml
(10 )=836.542 (
ml 342 µ g ) =2.4460
ml

0.049+0.0543 73.66 µ g µ g µ mol µ mol

t 2=
1.4022 x 10 3
=
1 ml
( 10 )=736.6 (
ml 342 µ g )=2.153
ml

0.039+ 0.0543 66.53 µ g µ g µ mol µ mol

t 3=
1.4022 x 10 3
=
1 ml
( 10 )=665.3 (
ml 342 µ g )=1.945
ml

0.041+0.0543 67.96 µ g µ g µ mol µ mol

t 4=
1.402 2 x 103
=
1 ml
( 10 )=679.6
ml ( 342 µ g ) =1.987
ml

0.033+ 0.0543 62.25 µ g µ g µ mol µ mol

t 5=
1.4022 x 10 3
=
1 ml
( 10 )=622.5
ml ( 342 µ g )=1.820
ml
 QX1= 5.39 x 10-3
pH QX2= 0.030
t0= 6.84 QX3=0.0161
t1= 7.03 QX4=0.0330
t2= 7.63 QX5=3.33x10-4
t3= 7.93 Qp
t4=8.29 U . A1−U . A
Qp = 0

t5=8.23 ∆t
QP0= 0
QP1= -0.3011
Qx QP2= 0.2849
D .01− D .0 QP3=0.0728
Qx = 0

∆t
QP4=0.0305
Q0 = 0
QP5=0.3333
 TABLA NO.2 Resultados Finales de Crecimiento
TIEMPO D.O U. A pH AR QX QP
0 0.097 19.23 6.84 2.008 0 0
4.45 0.121 17.89 7.03 2.446 0.00539 -0.30111
9.75 0.282 19.4 7.63 2.153 0.03 0.2849
21.15 0.466 20.23 7.93 1.945 0.0161 0.0728
26.71 0.65 20.4 8.29 1.987 0.033 0.0305
32.71 0.652 22.4 8.23 1.82 0.000333 0.3333

25 3

2.5
20
U.A ( µmol maltosa / mL h)

2
15

1.5

D.O
pH

10
1

5
0.5

0 0
0 5 10 15 20 25 30 35
TIEMPO (h)

Fig 1. Comportamiento de la densidad óptica (D.O), pH, azúcares reductores (A.R) y actividad enzimática (U.A) en base al tiempo.

0.4

0.3

0.2

0.1
Qx((UFC/h)
Qp((UA/h)

0
0 5 10 15 20 25 30 35 Qx
Qp
-0.1

-0.2

-0.3

-0.4

TIEMPO (h)
 Fig 2. Velocidades volumétricas de producto (Qp) y biomasa (Qx)

3. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
A partir de microorganismos halofílicos amilolíticos aislados de un medio contaminado se buscó
determinar la producción de amilasas, así como su actividad enzimática, el efecto del pH en esta
enzima, sus velocidades volumétricas, la biomasa producida y el azúcar residual. En el medio de
cultivo se tenía como fuente de carbono el almidón al 2%. Las amilasas son enzimas que
hidrolizan el almidón para la obtención de dextrinas y polímeros pequeños compuestos por
unidades de glucosa. [1]
En la figura 1 se observa que la actividad enzimática y la cantidad de azúcares residuales no
están asociadas, por el contrario, en donde hay un máximo en un parámetro se localiza un
mínimo en el otro. Esto no concuerda con la idealidad, pues la cantidad de azúcares residuales
presentes en el medio son producidos por las amilasas generadas por el microorganismo y la
actividad de las mismas, por lo que si hay una gran cantidad de azúcares residuales se esperaría
una actividad enzimática alta debido a que el microorganismo sintetiza amilasas para obtener un
fuente de carbono y energía de fácil asimilación como maltosa, dextrina, entre otros, por lo que
incrementa la actividad enzimática y los azúcares residuales incrementan y disminuyen a la par
por el consumo de los mismos. Una de las razones por las que se pudo haber roto esta idealidad
es el incremento en el pH, pues es un factor que afecta la actividad enzimática de la amilasa, al
igual que la temperatura y el tiempo de incubación en la producción. El pH óptimo para la
actividad de las amilasas se encuentra entre 4 y 6, [2] mientras que en la parte experimental se
obtuvo un pH hasta de 8.29, lo que pudo afectar la actividad enzimática, sin embargo, esto no
explica que no exista una asociación entre la actividad enzimática y la cantidad de azúcares
reductores, pero la temperatura y el tiempo de incubación podrían hacerlo.
El incremento del pH podría deberse a la formación de aminas que alcalinizan el medio, esto
ocurre por la desnaturalización de proteínas o enzimas, pues en este proceso los grupos amino
contenidos en las proteínas pueden reaccionar y formar aminas.
Como se ha mencionado, la temperatura es un factor que afecta la hidrólisis de almidón, por una
parte, debido a que afecta la actividad enzimática y por otro, porque provoca la hidrólisis parcial
de almidón, en este último punto también influye el tiempo de incubación, pues entre más tiempo
pase mayor será la cantidad de almidón hidrolizado, por lo cual incrementa la cantidad de
azúcares residuales, aunque la actividad enzimática disminuya por los mismos factores. En la
parte experimental el tiempo de incubación fue de 30 minutos y la temperatura correspondiente a
50°C, considerando que la temperatura óptima para estas enzimas está entre 28 y 37°C, por lo
que es muy probable que haya ocurrido lo anterior. Esto a su vez, explica que en las primeras
horas haya una cantidad muy elevada de azúcares residuales si hay una baja actividad
enzimática.
Siguiendo con los demás puntos de la figura 1, se puede notar que los azúcares residuales
comienzan a disminuir y la actividad amilolítica incrementa ligeramente, esto se atribuye al
consumo de los azúcares residuales por parte del microorganismo, al llegar a concentraciones
bajas, éste comienza a sintetizar una mayor cantidad de amilasas, incrementando como
consecuencia la actividad enzimática, para obtener nuevamente fuentes de carbono y energía,
esto se explica con los mecanismos de regulación metabólica de inducción enzimática y
represión catabólica.
La técnica más utilizada para medir la biomasa producida por un microorganismo es un método
óptico que consiste en medir la cantidad de luz difractada por una suspensión de células. Las
partículas pequeñas difractan la luz de manera proporcional a su concentración, cuando un haz
de luz pasa a través de la suspensión bacteriana, la reducción en la cantidad de luz trasmitida a
consecuencia de la difracción es una medida de la masa bacteriana presente. [3] En el cultivo
analizado, a las primeras 5 horas de haber sido inoculado, la densidad óptica se mantuvo casi
constante, es decir no hay crecimiento de células el cual se podría deber a que el organismo se
encuentra en la fase de adaptación donde se inducen enzimas, y el material genético que
necesita para su crecimiento y funciones vitales. Después de estas 5 horas empieza la fase de
aceleración y crecimiento exponencial donde las amilasas sintetizadas hidrolizan el almidón en
azucares más pequeños para que el microorganismo pueda ocuparla como fuente de carbono y
se reproduzca, es donde hay un equilibrio del consumo de los nutrientes. A las 18 horas se
presenta la máxima densidad óptica, es decir la máxima producción de biomasa, después de
estas horas la densidad óptica se mantiene constante debido a que el sustrato se va terminando,
no hay producción de nuevas células y se producen los metabolitos secundarios. Una desventaja
que presenta este método es que no difiere entre células vivas y células muertas, por lo tanto, la
densidad óptica que se tiene presenta un margen de error para células vivas.
El ln de las densidades ópticas nos permiten determinar la velocidad especifica de crecimiento
máxima del microorganismo que es de 0.1596 h -1 que nos indica que el microorganismo tiene una
velocidad de crecimiento de 0.16 por cada hora. y se presenta en la fase de exponencial debido a
que en esta esta fase la concentración de sustrato es mucho mayor al Ks (constante de
saturación).
En la figura 2 se puede observar que las velocidades volumétricas de producto y de células
tienen el mismo máximo a un tiempo de 10 horas esto debido a que conforme crece el
microorganismo va sintetizando la enzima, es decir la ocupa para degradar el almidón. Estos
parámetros nos indican el cambio de concentración de sustrato durante el proceso y se considera
que la cantidad de células y producto producidos están asociados.

4. CONCLUSIONES.
 Los factores como temperatura, pH y tiempo de incubación afectan tanto la actividad
enzimática como al almidón al hidrolizarlo parcialmente.
 La asociación entre la actividad enzimática y la cantidad de azúcares residuales puede
romperse al encontrarse inicialmente una concentración de azúcares de fácil asimilación.
 Conforme aumenta la densidad óptica de la suspensión del microrganismo, aumenta el
número de células presentes en ella.
 La velocidad especifica de crecimiento se presentará cuando la concentración del sustrato sea
mucho mayor a la constante de saturación.
 Al estar asociadas Qp y Qx producción inicia al mismo tiempo que las células se están
duplicando.
5. BIBLIOGRAFÍA
1. Pamela E. Canales. Caracterización de bacterias halófilas productoras de amilasas
aisladas de las Salinas de San Blas en Junín. Universidad Nacional Mayor de San
Marcos. 2014
2. Andrea Guadarrama, et. al. Obtención de α-amilasa a partir de Aspergillus oryzae.
Universiad Autónoma del Estado de México. Consultado en:
 http://www.smbb.com.mx/congresos
%20smbb/morelia07/TRABAJOS/Area_III/Carteles/CIII-24.pdf
3. Roger Y. Stanier. (1992). Microbiología. España: Reverte.pp-199.