INFORME DE LABORATORIO

Practica 2: CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO.

Practica 3: CUANTIFICACIÓN DE AZUCARES

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGIA

PRESENTADO POR

JULIETH MANCILLA VIAFARA COD: 38667680

Correo: yusamavi@gmail.com
Nombre del tutor virtual: Fedra Lorena Ortiz.
Numero de grupo colaborativo en la plataforma: 305689_17

ANGELA MARIA WAGNER ORJUELA

Correo: angelawaqner@misena.edu.co
Nombre del tutor virtual: Fedra Lorena Ortiz.
Numero de grupo colaborativo en la plataforma: 305689_13

XIOMARA COBO ALVARADO COD: 1.113.653.323

Correo: xioma0109@hotmail.com
Nombre del tutor virtual: Fedra Lorena Ortiz
Numero de grupo colaborativo en la plataforma: 305689_13

EDWIN SARMIENTO COD 1069302615

Correo: eas101087@hotmail.com
Nombre del tutor virtual: Fedra Lorena Ortiz
Numero de grupo colaborativo en la plataforma: 305689_13

PRESENTADO A
LAURA MARCELA BERNAL

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD

ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS TECNOLOGIA E INGENIERIA
INGENIERIA DE ALIMENTOS
MAYO / 2017
 INFORME DE LABORATORIO

Practica 2: CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO.

Practica 3: CUANTIFICACIÓN DE AZUCARES

TABLA DE CONTENIDO

Practica N° 1 Determinación de la Curva de Crecimiento para Bacterias .................. 1

Practica N° 2 Cuantificación de azucares ....................................................................... 2
Referencias Bibliográficas .................................................................................................. 3
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Practica 2: CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO.

Practica 3: CUANTIFICACIÓN DE AZUCARES

Práctica 1: DETERMINACIÓN DE LA CURVA DE CRECIMIENTO PARA

BACTERIAS

INTRODUCCIÓN

Las bacterias, al igual que los demás seres vivos requieren de una serie de condiciones o
factores ambientales para el desarrollo celular y conformación de poblaciones y
comunidades. Los factores pueden diferenciarse en abióticos, referidos a aquellos
relacionados con aspectos propios del medio donde se desarrollan, como la temperatura, el
pH, los gases respiratorios (O2 y CO2), las radiaciones (lumínicas, sonoras,
electromagnéticas), la presión (atmosférica, hidrostática, osmótica) y la presencia de
nutrientes y en bióticos, referidos a aquellos relacionados con las interrelaciones que se dan
entre las diversas poblaciones y comunidades.

Cuando la bacteria encuentra condiciones propicias para su desarrollo o se adapta a las

nuevas condiciones del medio, ocurre inicialmente un crecimiento en masa celular y
posteriormente, en el número de células a medida que avanza el tiempo.

El aspecto de la curva de crecimiento varía de acuerdo con las condiciones del cultivo, el
medio empleado y características del inóculo (“edad del cultivo” y medio de donde proceda)
entre otros aspectos.

METODO:

A través de ventanas que representan la hoja de cálculo Excel desarrollemos un ejercicio de

construcción de curvas de crecimiento y estimación, cono los siguientes datos: a manera de
ejemplo supondremos que se desarrolló un experimento de crecimiento de s. aureus a una
temperatura de 37°C durante 25 horas aproximadamente, obteniendo los resultados
mostrados en la tabal 1:
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Practica 3: CUANTIFICACIÓN DE AZUCARES

Tabla de datos crecimiento de S.aureus

Tiempo (Horas) Población (ufc/g) Log 10 ufc/g

0.00 100 2,00
1,08 105 2,02
2,16 230 2,36
3,24 1230 3,09
4,32 4266 3,63
5,4 15136 4,18
6,48 52481 4,72
7,56 186209 5,27
8,64 645654 5,81
9,72 2187762 6,34
10,8 7244360 6,86
11,88 22387211 7,35
12,96 61659500 7,79
14,04 141253754 8,15
15,12 251188643 8,40
16,2 354813389 8,55
17,28 426579519 8,63
18,36 457088190 8,66
19,44 478630092 8,68
20,52 489778819 8,69
21,6 489778819 8,69
23,4 489778819 8,69
25,2 489778819 8,69
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Curva de Crecimiento de S. aureus a 37°C

10.00
9.00 y = 2.8624ln(x) - 0.0202
8.00 R² = 0.9199
7.00
Log 10 ufc/g

6.00
5.00
4.00 Series1
3.00
Logaritmica( S.aureus)
2.00
1.00
0.00
-1.00 0 5 10 15 20 25
Tiempo (Horas)

CONCLUSIONES DE LA GRAFICA

Se presentan 3 fases, la primera fase de adaptación en donde las bacterias se adaptan a las
condiciones de crecimiento. Es el período en el que las bacterias individuales están
madurando y no tienen aún la posibilidad de dividirse, donde se evidencia en la curva de
crecimiento de S. aureus que en el tiempo 0.00 con log 2.00 hasta el tiempo 1.08 con log 2,02
están en una fase de adaptación las bacterias.

Se continua con la fase exponencial es un período caracterizado por la duplicación celular.

El número de nuevas bacterias que aparecen por unidad de tiempo es proporcional a la
población actual. En la gráfica la fase exponencial va desde el tiempo 2,16 con log 2,36 hasta
el tiempo 20.52 con log 8,69, por lo tanto el número de células de la población se duplicaron
con cada período de tiempo consecutivo.

Se termina con la fase estacionaria, la tasa de crecimiento disminuye como consecuencia del
agotamiento de nutrientes y la acumulación de productos tóxicos. En la gráfica podemos
observar esta fase en el tiempo 21,6 con log 8,69 hasta 25,2 con log 8,69, en donde el valor
fue constante. Esta fase se caracteriza por un valor constante del número de bacterias a
medida que la tasa de crecimiento de las bacterias se iguala con la tasa de muerte bacteriana.
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Practica 3: CUANTIFICACIÓN DE AZUCARES

Practica 2. CUANTIFICACIÓN DE AZUCARES

INTRODUCCIÓN

Los microorganismos consumen diferentes tipos de sustratos, pero poseen preferencia por un
tipo particular de sustrato y algunos resultan no consumibles para algunas cepas de una
especie en particular. Cuando dos o más sustratos están presentes en el medio de cultivo, los
microorganismos no los consumen por igual, sino que consumen preferencialmente uno de
ellos hasta agotarlo. Solo en este punto inician el consumo del siguiente sustrato preferido.
Este fenómeno se conoce como diauxia.
Esa preferencia por un sustrato en particular es diferente para cada una de las cepas de un
organismo, y puede ser medida como la variación en la velocidad de crecimiento, consumo
de sustrato o generación de producto.

METODO:

Uso de la diauxia en la agroindustria o industria.

CONCEPTOS:

Diauxia: Patrón de crecimiento microbiano bifásico que tiene lugar cuando hay presentes
dos sustratos diferentes que pueden ser utilizados como fuente de carbono (por ejemplo,
glucosa y lactosa). Este tipo de crecimiento microbiano es debido a la utilización secuencial
de las distintas fuentes de carbono.

El metabolismo del microorganismo es selectivo para uno de los sustratos: primero utiliza el
sustrato que permite un crecimiento más rápido y cuando este se agota comienza a
metabolizar el otro.
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Practica 3: CUANTIFICACIÓN DE AZUCARES

Cuando se utilizan soluciones nutritivas complejas, frecuentemente se producen dos fases de

logarítmicas separadas por una fase de latencia. Este proceso se denomina diauxia y se
produce debido a que uno de los dos substratos se cataboliza preferentemente. Las enzimas
para el catabolismo de los otros substratos se inducen sólo después de que el primer substrato
haya sido completamente metabolizado

Curva de crecimiento diaúxica

Glucosa + lactosa: Primero utiliza la glucosa y luego la lactosa; notar la fase lag interna o
intermedia.
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Practica 3: CUANTIFICACIÓN DE AZUCARES

Historia:
Jacques Lucien Monod (February 9, 1910 – May 31, 1976).
J. L. Monod acuñó el término francés “diauxie” en el año 1941 para
describir el crecimiento de Escherichia coli y Bacillus subtilis en un
medio definido conteniendo una mezcla de distintos azúcares.
Posteriormente, basándose en el modelo de crecimiento diaúxico de E.
coli propuso el modelo de regulación de expresión del operón lac.

ARTICULO CIENTIFICO

Titulo original
Aproveitamento Biotecnológico De Soro E Permeado De Soro De Queijo Para A Produção
De Etanol Por Saccharomyces Cerevisiae

Título traducido al español

Aprovechamiento biotecnológico de suero y permeado de queso para la producción de etanol
Usando Saccharomyces Cerevisiae

RESUMEN. El desarrollo de la investigación para la producción de biocombustibles

alternativos ha sido significativo en los últimos años, entre los que podemos mencionar el
uso de sustratos alternativos y de bajo costo para la producción de etanol. Este estudio evaluó
el uso de suero de leche y suero de queso de permeado para la producción de etanol usando
levadura Saccharomyces cerevisiae EP-2. El suero y permeado de suero se trataron
enzimáticamente para hidrolizar la lactosa y se utiliza como medio de cultivo sin
suplementación. Los cultivos se realizaron en incubadora que gira a 30 ° C, 150 rpm durante
48 h. La glucosa se metaboliza fácilmente en ambos medios de cultivo, mientras que la
galactosa se metaboliza más lentamente en permeato de suero.
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Practica 3: CUANTIFICACIÓN DE AZUCARES

1. INTRODUCCIÓN

La mejora de los procesos de fermentación asociados con la creciente preocupación

medioambiental ha impulsado la investigación para desarrollar tecnologías de generación de
energía alternativa (Canacki y Sanli, 2008). El uso de subproductos industriales para la
producción de etanol ha sido significativo en los últimos años debido al crecimiento del
mercado y la reducción potencial de los costes de producción asociados con su uso. El uso
de sustratos alternativos y de bajo costo, tales como permeado y suero de leche, y ayudar en
la producción de etanol puede también minimizar los problemas medioambientales por su
uso en este bioproceso (Gabardo et al. 2012).
El suero de queso, un subproducto de la industria láctea, se caracteriza por ser rica en
nutrientes, que contiene cantidades apreciables de lactosa (45-50 g L- 1) proteínas (6-8 g L
1) y minerales (8-10% de materia seca). Procesos que se están valor del lactosuero
constantemente celebrada, incluyendo la recuperación de proteínas por el proceso de
separación de ultrafiltración, que genera grandes volúmenes de lactosa también llamado
permeado restantes. Este producto, permeado, como el suero de leche sigue siendo un
contaminante importante porque retienen más del 70% de los sólidos totales presentes en
suero de queso. Por lo tanto, el permeado presenta problemas de eliminación, tanto en
términos de volumen producidos como carga orgánica aproximadamente igual a la de suero
de queso (Siso, 1996; Domingues et al. 2001; Guimarães et al. 2010). Caracterizado por altos
valores de demanda de oxígeno bioquímico (30-50 g L- 1) presenta suero de queso
contaminantes potenciales aproximadamente 100 veces mayor que la de aguas residuales
(Siso, 1996; Guimaraes et al. 2010). A medida que la cantidad de lactosa disponible en el
mundo para la producción de etanol de más de 4 millones de toneladas por año, es un gran
uso sugestivo de esta posible fuente de carbono alternativa para la realización de este proceso
biotecnológico (Guimarães et al. 2010).
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Practica 3: CUANTIFICACIÓN DE AZUCARES

La producción mundial de etanol fue de aproximadamente 65 mil millones de litros en 2008,

con las Américas representa el 70% de esta producción. El mayor productor es Estados
Unidos, en 2008 la producción de aproximadamente 34,0 mil millones de litros. En segundo
lugar está Brasil, alcanzando una producción de 25,7 mil millones de litros en 2010, lo que
contribuye de manera significativa en el ámbito internacional (Demirbas, 2007; Guimarães
et al.

2010; Mussato et al. 2010). Con la perspectiva de crecimiento de las tecnologías de la

demanda de etanol que mejoran la ganancia de rendimiento del proceso fundamental
importancia en Brasil y en todo el mundo. Las levaduras utilizadas tradicionalmente en
plantas industriales en Brasil, como el género Saccharomyces cerevisiae, reconocido por la
tolerancia a altas concentraciones de etanol y azúcar, no son capaces de usar la lactosa como
fuente de energía. Sin embargo, estas cepas son capaces de metabolizar la glucosa y la
galactosa, lactosa monómeros constituyentes. En este sentido, el presente estudio tuvo como
objetivo evaluar la producción de etanol por Saccharomyces cerevisiae PE-2 en el suero y
permeado de suero previamente hidroliza con β-galactosidasa y comparar la capacidad de
bioconversión en diferentes medios de cultivo.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 y permeado de suero de queso

El permeado de suero de queso en polvo fue suministrada por Sooro (PR, Brasil) y suero de
queso en polvo proporcionado por Lácteos SA (RS, Brasil). Para su conservación, ambos
permanecieron almacena en un congelador a -16 ° C2,2 microorganismo y el mantenimiento
de células de levadura Saccharomyces cerevisiae PE-2 fue proporcionada por el
Departamento de Ciencias Biológicas Center de la Universidad Federal de Pernambuco
Genética. La cepa se mantuvo en placas de Petri que contenían medio YEPD nutriente, que
consiste en extracto de levadura (10 g L 1) peptona bacteriológica (20 g L 1) glucosa (20 g
L 1) y agar (20 g L 1) pH ajustado a 7,0 con NaOH 0,1 M antes de su uso, el medio de cultivo
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se esterilizó en autoclave a 121 ° C durante 15 min. La cepa se cultivó en placas sobre YEPD
y se incubaron en una incubadora a 30 ° C durante 48 h para el crecimiento celular y después
se almacenó a 4 ° C. Cada 30 días los cultivos se renovaron a través de subcultivo.

2.3 Fermentación en matraces de agitación

El pre-inóculo se preparó transfiriendo asépticamente una sola colonia en 50 ml de YEPD
(extracto de levadura, 10 g L 1; peptona bacteriológica, 20 g L 1 y glucosa, 20 g L 1 pH 7,0)
en matraces de 250 ml cónicos. La cepa se incubó en un agitador rotatorio con agitación
orbital de 180 rpm a una temperatura de 30 ° C (± 0,2 ° C) durante 12 h. Los inóculos se
prepararon mediante la estandarización de la concentración de células para la densidad óptica
a 600 nm ( LA 600) igual a 1. Los medios libres de suero y permeato de suero se hidrolizaron
previamente usando βgalactosidase comercial un volumen de 0,5 ml de L-enzima 1 a
temperatura ambiente a pH 7,0 durante 8 h bajo agitación suave. El cultivo se llevó a cabo
en 250 ml matraces cónicos que contienen 144 ml de medio de fermentación esterilizado
(121 ° C, 15 min), pH 7,0 y 16 ml de inóculo un volumen total de 160 ml de fermentación.
Para evitar la precipitación de la proteína durante el proceso de esterilización, el suero de
leche se hidrolizó previamente con una proteasa comercial a 55 ° C, pH 8,5 durante 3 h. Los
matraces cónicos que contienen cultivos se incubaron en un agitador orbital a una
temperatura de 30 ° C (± 0,2 ° C) bajo agitación de 150 rpm durante 48 h.

2.4 Métodos Analíticos

Las muestras de 3 ml del medio de fermentación se recogieron a 0 h, 6 h, 12 h, 24 h y 48 h
de cultivo para determinar la concentración de glucosa, galactosa y etanol. La preparación de
la muestra se realizó por centrifugación a 3000 × g durante 15 min, 4 ° C (Brinkmann
Instruments Inc., Bench centrífuga Eppendorf, modelo 5410, Alemania) para separar las
células del medio de cultivo y se analizó el sobrenadante. Las concentraciones de azúcares y
etanol se analizaron por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) (Shimadzu) con
detector de índice de refracción (RI) y la columna 87H Bio-Rad Aminex HPX a 45 ° C,
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usando una solución de ácido sulfúrico 5 mM (H 2 SO 4) como fase móvil a un caudal de 0,6
ml min- 1 y 20 uL de volumen de muestra.

2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

la sepa de S. cerevisiae PE-2 se utiliza convencionalmente en plantas industriales con etanol

Brasil debido a sus características fisiológicas, tales como, por ejemplo, la tolerancia a
concentraciones de etanol altos y altos rendimientos obtenidos de la caña de azúcar y melaza
(Basso et al. 2008). Sin embargo, esta cepa no se ha explotado para la bioconversión a etanol
a partir de suero y permeado de suero. el género Saccharomyces cerevisiae Se caracteriza por
no asimilar la lactosa directamente debido a la ausencia de los genes LAC12 y LAC4, que
codifican las enzimas, la lactosa permeasa y β-galactosidasa, respectivamente. Sin embargo,
si la lactosa se hidroliza a su monosacáridos, glucosa y galactosa a través de la acción de la
βgalactosidade enzima, pueden ser metabolizados y convertidos a etanol por Leloir y las vías
glicolíticas (Rubio-Teixeira, 2005; Timson 2007; Bai et al. 2008; Silva et al. 2010).

La cinética de la consumo de monosacáridos glucosa y la galactosa y la producción de etanol

en suero y permeado de suero se pueden ver en la Figura 1. Un comportamiento diauxico se
observa para ambos medios de cultivo en el que la glucosa se consume en primera galactosa.
Este hecho es característica de las líneas S. cerevisiae y es debido a la represión catabólica
de los genes GAL por la glucosa (Guimaraes et al. 2010). Por otra parte, la galactosa se
metaboliza más lentamente que la glucosa, lo que lleva más de dos veces más largo para su
agotamiento. Esto puede explicarse por el hecho de que la bioconversión de galactosa
requiere energía y los pasos catabólico adicional, ya que la galactosa debe primero ir hacia
Leloir, convirtiéndose en un intermedio glicolítica, después de entrar en la vía glucolítica y
en última instancia ser reducido etanol (Rubio-Texeira, 2005; Timson, 2007). Además, el
metabolismo de la galactosa difiere de diferentes maneras. Una explicación para esto es
debido al medio de suero de queso a ser más ricos en nutrientes, que contiene mayores
cantidades de proteína y minerales, que promueven el crecimiento celular y la producción de
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etanol. En este mismo sentido, la cinética de producción de etanol eran más rápidos en el
queso de suero de filtrado de suero lácteo de queso durante las primeras 24 h, pero durante
el periodo de 48 h, la producción de etanol fue mayor en permeato de suero queso (19 g L 1)
que se tradujo en una mayor productividad volumétrica (tabla 1). Esto es debido a la
diferencia inicial de los azúcares en el que el inicio del experimento la concentración de
glucosa y galactosa era 20 g L 1 mientras que en la concentración inicial de permeato de
suero fue de 25 g L 1. Los azúcares de etanol factor de conversión fueron mayor en el medio
de suero de queso, lo que sugiere una mayor adaptación de queso en el suero por la levadura.
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Figura 1. Cinética de consumo de glucosa y galactosa y la producción de etanol por

Saccharomyces cerevisiae PE. en el suero de queso (a) y de permeado de suero queso

Glucosa ( ),
Galactosa (●),
Etanol (▲).
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CONCLUSIONES

Se logró convertir (0,48 g g- 1) Esto se logró por S. cerevisiae genéticamente modificado

(GRF167) de medio sintético que contiene 20 g L 1 glucosa y galactosa (Ramakrishnan y
Hartley,

1993). Valores similares se obtuvieron en este estudio fueron observados por Domingues et
al. ( 1999) usando S. cerevisiae modificado genéticamente (Línea T1) alcanzando una
productividad volumétrica de 0,40 g L 1 h- 1 y una eficiencia de 60% a partir de medio
sintético que contiene lactosa como fuente de carbono.

En este estudio, la bioconversión es evidente capacidad del suero y permeado de suero por
S. cerevisiae PE-2, una levadura empleado convencionalmente en plantas industriales, que
posteriormente permite más condiciones de prueba aproximarse a las condiciones
industriales. El uso de permeado de suero y suero de leche como una fuente de carbono
alternativa en procesos de fermentación, se compone de una propuesta muy interesante y
puede minimizar su potencial de contaminación, así como la fabricación de producción de
etanol de un proceso menos costoso y potencialmente económicamente competitiva.
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REFERENCIAS

 El texto completo está modificado de “Cómo construir y estimar curvas de crecimiento y

muerte bacteriana por medio de hojas de cálculo EXCEL” de Enrique Alfonso Cabeza
Herrera.

 Rosa María Pérez Silva, M. I. (2008). Ciencias Biologicas.

http://www.redalyc.org/html/1812/181214889004/

 Microbiologia general. Trabajo practico Nº 2. - Crecimiento microbiano y Curva de

crecimiento. Recuperado de:
http://www.iib.unsam.edu.ar/php/docencia/licenciatura/biotecnologia/2011/MicroBiol/c
recimiento_diauxico.pdf

 S. Gabardo , G. F. Pereira , M. P. Klein , P.F. Hertz , R. Rech , M.A.Z. Ayub

Aprovechamiento biotecnológico de suero y Permeato de suero para la producción
de etanol Usando Saccharomyces Cerevisiae,(2014). Recuperado de:
http://pdf.blucher.com.br.s3-sa-east-
1.amazonaws.com/chemicalengineeringproceedings/cobeq2014/0639-24632-
139472.pdf