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TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS

Bqca. Esp. Beda Elizabeth Mereles Rodríguez


La medición de las interacciones Ag-Ac con fines diagnósticos se
realizan por 2 vías

Dx directo Dx. indirecto


Utilización de Acs específicos Utilización de Ags específicos
para detectar Ags para detectar Acs
Etapas de la reacción Ag-Ac

Para observarla se aplican técnicas que


utilizan marcadores
Etapas de la reacción Ag-Ac

aglutinación

Las reacciones secundarias valoran los cambios físicos de la


interacción Ag-Ac tras la formación del inmunocomplejo.
Formación del agregado visible

Cuando un Ag en solución es agregado


progresivamente a un antisuero forman pp del
complejo Ag-Ac.
 El entrecruzamiento Ags y Acs da origen a
estructuras enrejadas tridimensionales que
forman grandes agregados que pp.
 A medida que se agregan más Ag se
alcanza un óptimo después del cual, se forma
menos pp. En esta etapa puede demostrarse
que el sobrenadante contiene complejos
solubles de Ag-Ac.
TIPOS DE INMUNOENSAYOS

Marcados,
RIA (Marcador: isótopo radiactivo)
conjugados a ELISA (Marcador: enzima)
moléculas que IF (Marcador: partícula fluorescente)
emiten señales CLIA (marcador: sust.quimioluminiscente)
detectables
Inmunoensayo
Formación de
complejos Ag-Ac
No marcados,
medidos por Precipitación
visualización Aglutinación
directa
Sensibilidad
Método mg Ab/ml

Técnicas de
interacción 2ª
INMUNOENSAYOS
Comparación de
sensibilidad

Técnicas de
interacción 1ª
TECNICAS DE INTERACCIÓN SECUNDARIA

Antígeno Anticuerpo Antígeno


soluble particulado

PRECIPITACIÓN AGLUTINACIÓN
TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS
DE INTERACCIÓN SECUNDARIA

Técnicas inmunológicas de
precipitación
Técnicas inmunológicas de precipitación

Antígeno
soluble

Se basan en la aparición de un precipitado visible cuando se


enfrentan antígenos solubles con sus anticuerpos específicos
Técnicas inmunológicas de precipitación

Precipitación en medio líquido


De uso infrecuente en la actualidad,
detecta la presencia de Ags ó Acs,
cuando se mezclan en fase líquida.

Precipitación en medio sólido


Utiliza un soporte sólido gelificado en el
que difunden el Ags y Acs. Se distinguen
2 dos categorías: inmunodifusión y
técnicas inmunoelectroforéticas.
Técnicas de precipitación en medio sólido
Se basan en el hecho de las proteínas pueden difundir libremente
a través de los poros del gel.
Hay ausencia de reacción fca y qca entre los inmunoreactantes y
el gel.
Al contactarse Ag y Ac específicos, forman banda de pp en la
zona de equivalencia.

Estructura macroreticular con una


malla muy abierta
Los soportes más utilizados Ausencia de grupos iónicos , es
son los geles de agarosa una estructura neutra e inerte
No hay interacción de las moléculas
a difundir con la estructura del gel.
TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS DE PRECIPITACIÓN

VENTAJAS
Existen varias pruebas
Se observan fácilmente
No requieren equipos costosos
Pueden ser cuali o cuantitativas

DESVENTAJAS
Poseen baja sensibilidad
Técnicas de pp en medios gelosados

Varias técnicas

Técnica de difusión doble de Ouchterlony


Técnica de difusión radial
Técnica de inmunoelectroforesis
Técnica de contrainmunoelectroforesis
Métodos de inmunodifusión doble
Usos
Inmunoprecipitación

P/ determinar la concentración de Ags o Acs


(cuantitativos)

P/ comparar Ags y evaluar su pureza


(cualitativos)
Doble difusión en placa (Ouchterlony)-IDD

Base del método: Difusión de


macromoléculas en gel de agar

Difusión depende de:


concentración del gel
concentración de reactantes
tamaño de las moléculas Ag y Ac
Técnica de ID bidimensional (IDD)
Ambos inmunoreactantes difunden radialmente uno hacia el otro
 Cuando están en la zona de equivalencia se observa la banda de pp
Distancia de difusión de los reactantes

Relación directa
r/ concentración

Relación inversa
r/ PM
Se formarán tantas bandas de pp como sistemas Ag-Ac
se tengan en la muestra
IDD. Patrones de precipitación
Ag y Ac sembrados en pocillos Difusión de los mismos Formación de banda de pp

Antígenos
ayb

Antisuero
anti a + anti b

(I) Antígenos idénticos: las líneas no se cruzan (Identidad total)


(II) Antígenos diferentes: las líneas se cruzan (No identidad)
(III) Antígenos relacionados: las líneas se unen parcialmente (Id. parcial)
Ag a Ag a

PATRONES DE PRECIPITACIÓN

Antígenos: a y b
Anti a+ anti b 1 Antisuero: anti a + anti b
Ag ab Ag b

1 Identidad total
2 Identidad parcial
3 No identidad

Anti a+ anti b
2
Ag a Ag b

Anti a+ anti b
3
Inmunodifusión Radial (IDR)
Método de cuantificación de antígenos

Útil en inmunología clínica para cuantificar


diversas proteínas plasmáticas:
 Inmunoglobulinas Igs G, A, M
 Fracciones del complemento C3 y C4
 Factores de coagulación
 Otras
Técnica de inmunodifusión radial
Ig G en MP
Ag en pocillo
MP

El diámetro del
Gel agarosa círculo del pp
guarda relación
Halo de difusión con la cantidad
Pocillo cavado en el gel 16 – 20 horas de Ag.
24 hs
D2
inmunoprecipitación

Anti – Anticuerpo Ig G incorporado en


Ac incorporado al gel
capa de agarosa

C mg/dL
Bandas de pp
circulares
Bandas de pp circulares

Se establece una curva de referencia con Se puede utilizar tabla diámetro vs concentración
cantidades conocidas del Ag y se interpola provisto con la placa. Verificar si el control da
los valores de las muestras desconocidas. resultado esperado
INMUNOELECTROFORESIS

Método combinado
 Electroforesis de mezcla de Ags de acuerdo a su
carga
 Difusión de proteínas separadas, que reaccionan con
Abs específicos y precipitan

•Diferenciar fracciones antigénicas específicas


•Determinar Acs monoclonales clásicos en
mieloma, linfomas
•Otros
INMUNOELECTROFORESIS

Siembra del Ag
Soporte: agarosa+ buffer pH alcalino

Electroforesis del antígeno

Migración de antígenos por carga

CÁTODO
ÁNODO

Formación de un canal

Siembra del Ac

Difusión de Ag y Ac

Formación de banda de pp
Electroforesis del antígeno Formación de banda de pp

Siembra del Ac y difusión de Ag y Ac Tinción y observación de bandas de pp

Canal
Las inmunoprecipitaciones se interpretan comparándolas con patrones

Ag patrón

Ag
desconocido
TÉCNICA DE CONTRAINMUNOELECTROFORESIS

Agarosa+buffer pH alcalino

Antigeno Anticuerpos

Electroendosmosis

Cualitativo
Banda de pp Antisuero

Antígeno
TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS
DE INTERACCIÓN SECUNDARIA

Técnicas inmunológicas de
aglutinación
TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS DE AGLUTINACIÓN
Se basan en la aparición de una aglutinación visible a simple vista cuando
se enfrentan antígenos particulados con sus anticuerpos específicos
Anticuerpo

Célula o
partícula

Antígeno

Anticuerpo

Antígeno
Antígeno
Célula o
partícula
particulado
Aglutinación Directa (AD):
Esta técnica inmunológica se puede llevar a cabo si los Ags
son partículas en forma nativa.

Ej: Detección de Ags eritocitarios


Aglutinación Directa (AD)
Ej: Detección de anticuerpos contra Ags microbianos

-
Aglutinación Indirecta (Al) o Pasiva (AP)
Esta técnica se basa en que los Ags solubles pueden fijarse sobre
partículas más grandes ej. glóbulos rojos, partículas de látex, gelatina, etc.
HEMAGLUTINACION INDIRECTA

TANIZACION de GR

+ Ac.tánico

Hematies Hematies tanados

SENSIBILIZACIÓN

Hematies tanados + Antígeno Hematies sensibilizados

DESARROLLO DE LA PRUEBA

Hematies sensibilizados + Acs


específicos

Hemaglutinación
-

+
Titulación de sueros

Técnica semi-cuantitativa
Técnica de aglutinación reversa pasiva

Antígenos

Anticuerpos unidos a
partículas
Técnica de inhibición de la aglutinación (1)

Ag soluble Vs Ag unidos a partículas