PLÁSMIDOS

Los plásmidos son moléculas circulares de ADN de doble cadena que se encuentran naturalmente en varias especies
de bacterias. Su tamaño varía desde 1 kb a 250 kb, contienen de 2 hasta 30 genes. Los plásmidos se replican y se
transmiten independiente del cromosoma bacteriano ya que existen plásmidos cuya replicación no está relacionada
con la del cromosoma y codifican para una gran variedad de enzimas que confieren resistencia a antibióticos y
metales pesados, degradan complejos orgánicos y/o producen toxinas . La replicación y la transcripción de los
plásmidos dependen de las proteínas de la célula huésped. Los genes codificados por los plásmidos le donan ciertos
privilegios a la célula huésped.

El número de plásmidos puede variar, dependiendo de su tipo, desde una sola copia hasta algunos cientos por
célula. En general, no contienen información esencial, sino que confieren ventajas al hospedador en condiciones de
crecimiento determinado.

Los plásmidos a menudo contienen genes o paquetes de genes que les confieren una ventaja selectiva, Cada
plásmido contiene al menos una secuencia de ADN que sirve como un origen de replicación u ORI (un punto inicial
para la replicación del ADN), lo cual habilita al ADN para ser duplicado independientemente del ADN cromosomal

Episoma: Si el plásmido posee la capacidad de insertarse en el cromosoma bacteriano se le denomina

episoma. Dentro de este grupo de plásmidos se encuentran los factores de fertilidad o plásmidos F, que
regulan el proceso de conjugación bacteriana

Conjugación, seducción y plásmido R

La conjugación bacteriana es un proceso por el que se transfiere material genético (un plásmido o el
genoma bacteriano) entre bacterias. La célula que aporta el material genético se llama donadora y aquélla
que lo recibe receptora.

La bacteria donadora debe tener un plásmido, el factor F, que contenga la información genética necesaria
para la formación del pili sexual. Un pilus es un "tubo" que se extienden desde la superficie de la célula
bacteriana donadora.
Se llama (F-) a las bacterias que no poseen el plásmido F, (F+) si poseen dicho factor en su citoplasma y
(Hfr) (High frequency of recombination) si el plásmido F está integrado en su cromosoma (episoma), lo que
aumenta la frecuencia de la transferencia

La restricción limita en todos los casos la conjugación (ver el capítulo sobre las enzimas de restricción).

Una bacteria receptora recibe ADN de la célula donante. Una vez que el fragmento de ADN de la donante
está dentro de la célula receptora es posible la recombinación: el ADN de la donante se alinea con el de la
receptora y por entrecruzamiento (crossing over) se intercambian genes, pasando a formar parte del
genoma.

Una variante de la conjugación es la seducción. En la seducción un trozo definido de material genético de

la donadora es transferido como parte de un plásmido conjugativo.

El plásmido F contiene 25 genes que controlan la producción de los pilis.

Los pili se observan prácticamente solo en bacterias Gram negativas y solo escasos organismos Gram-
positivos los poseen.

El plásmido R confiere, a las células que lo poseen, resistencia a los antibióticos o drogas. Un plásmido R
puede llegar a tener hasta 10 genes que confieren resistencia y pueden transferirse a otra

bacteria por la conjugación. El plásmido R pueden también ser transmitidos por virus, por ejemplo el fago
P1: un error de encapsidation del fago P1 permite la integración del plásmido en el capside.

Tipos de plásmidos

Una forma de agrupar plásmidos es por su habilidad de transferirse a otra bacteria. Los plásmidos
conjugativos contienen “tra-genes”, los cuales ejecutan complejos procesos de conjugación, como la
transferencia sexual de plásmidos a otra bacteria. Los plásmidos no-conjugativos, son incapaces de iniciar
una conjugación, de allí que ellos pueden transferirse únicamente con la asistencia de los plásmidos
conjugativos y lo hacen “por accidente”. Una clase intermedia de plásmidos son los “movilizables” los
cuales llevan solo un subtipo de genes requeridos para la transferencia. Ellos pueden “parasitar” un
plásmido conjugativo, transfiriéndose a una alta frecuencia solo en su presencia.

Es posible para plásmidos de diferentes tipos el coexistir en una celular simple.

Siete tipos diferentes de plásmidos han sido encontrados en la E.Coli. Pero normalmente plásmidos
relacionados son incompatibles, en el sentido de que solo uno de ellos sobrevive en la línea celular, debido
a la regulación de las funciones vitales de los plásmidos. Por lo tanto, los plásmidos pueden ser
diferenciados de acuerdo a grupos de compatibilidad.

Otra forma de clasificar plásmidos es por función. Hay 5 clases principales:

 Plásmidos de fertilidad: los cuales contienen tra-genes, son capaces de conjugarse.

 Plásmidos de resistencia: los cuales contienen genes que pueden constituir resistencia contra
antibióticos o venenos. Históricamente conocidos como Factores R, antes de que se entendiera la
naturaleza de los plásmidos.
 Col-plásmidos: los cuales contienen genes que codifican (determinan la producción de) colinas y
proteínas que pueden matar a otra bacteria.
 Plásmidos degradativos: los cuales habilitan la digestión de sustancias inusuales como tolueno o ácido
salicílico.
 Plásmidos virulentos: los cuales convierten la bacteria en un patógeno.

Los plásmidos pueden pertenecer a más de uno de estos grupos funcionales.

Los plásmidos solo pueden coexistir como una o más copias en cada bacteria, debido a la división celular
pueden perderse en una de las bacterias segregadas.

Algunos plásmidos incluyen un sistema de adición o “Sistema de Muerte Postsegregacional” (PSK:

Postsegregational Killing System). Ellos producen en conjunto un veneno de larga vida y un antídoto de
vida corta. Las células hija que retienen una copia del plásmido sobreviven, mientras que una célula hija
que falla al integrar el plásmido muere o sufre una reducida tasa de crecimiento debido al veneno que
obtuvo de la célula padre. Este es un ejemplo de plásmidos como el ADN replicante.

Estructuras del plasmido

Las formas de ADN

Los plásmidos se encuentran principalmente en forma superenrollada en las bacterias. Las formas de ADN
pueden visualizarse en el microscopio electrónico como círculos relajados o superenrollados.

Además, pueden identificarse por electroforesis o por centrifugación. En estos casos, la estructura
compactada del ADN superenrollado aumenta su migración electroforética y su velocidad de
sedimentación, lo cual permite diferenciarlo del ADN circular relajado o del ADN lineal.
Las topoisomerasa I y II

La topoisomerasa II tiene la propiedad de transformar un ADN circular relajado en superenrollado. Este

proceso implica pasar de una forma sin almacenamiento de energía a una forma con alto contenido
energético, y por lo tanto es necesaria la presencia de adenosinatrifosfato (ATP) como donante energético.
Por el contrario, la transformación de ADN superenrollado en relajado con subsecuente liberación de
energía es catalizada directamente por la topoisomerasa I sin necesidad de ATP. La ADN girasa es una de
las topoisomerasas I.

La ADN girasa

La ADN girasa, como las topoisomerasas, tiene una función muy importante en la modulación del estado
topológico del ADN, pues regula su estructura superhelicoidal.

A diferencia de la topoisomerasa 1, la ADN girasa, corta las dos cadenas de la doble hélice del ADN; y
actúa en la replicación del ADN. Mientras, la topoisomerasa 1 corta una cadena del ADN para aliviar el
superenrrollamiento, y actúa durante la transcripción del ADN.

APLICACIONES DE LAS PLÁSMIDOS

El gen a ser replicado se inserta en copias de un plásmido el cual contiene genes que hacen células
resistentes a un antibiótico en particular. En el paso siguiente el plásmido es insertado en la bacteria por
medio de un proceso llamado transformación. Luego, la bacteria es expuesta a un antibiótico particular.
Solo la bacteria que toma copias del plásmido sobrevive al antibiótico debido a que el plásmido lo hace
resistente. En particular, los genes protectores son expresados (usados para hacer proteína) y la proteína
expresada evita la acción del antibiótico. De esta forma, los antibióticos actúan como un filtro que
seleccionan únicamente la bacteria modificada. Ahora, estas bacterias pueden ser cultivadas en largas
cantidades, cosechadas y el plásmido de interés puede ser aislado.

Otro uso importante de los plásmidos es fabricar grandes cantidades de proteínas. En este se deja crecer
la bacteria que contiene el plásmido que encierra al gen de interés. Solo como la bacteria produce la
proteína que le confiere si resistencia a los antibióticos, este también puede ser usado para producir
proteínas en grandes cantidades desde el gen insertado. Esta es una forma barata y fácil de producir
genes o proteínas que este codifica de forma masiva, como por ejemplo insulina, o inclusive antibióticos.
CONFORMACIONES DE LOS PLASMIDOS

Los plásmidos tienen una conformación variable que puede ser lineal, circular o con estructura superenrrollada. El
control de la replicación del plásmido depende del tipo de plásmido. El ADN plásmido puede aparecer en uno de
cinco conformaciones, las cuales (para un tamaño dado) corren a diferentes velocidades en un gel durante
electroforesis. Las conformaciones se muestran abajo en orden de movilidad electroforética (velocidad para un
voltaje dado), del más lento al más rápido:

 Mellado abierto circular: el ADN tiene un solo corte filamentario.

 Lineal: ADN tiene terminales libres, ya sea porque los filamentos fueron cortados o porque el ADN era linear in
vivo. Usted puede modelar este como un cordón que no se ha conectado así mismo.
 circular relajado: ADN que interactúa completamente con ambos filamentos sin cortar, pero que ha sido
enzimáticamente “relajado”. Usted puede modelar este dejando un cordón relajado y luego conectándolo a sí
mismo.
 superespiral desnaturalizado: ADN como el ADN superespiral o superenrollado (ver más abajo), pero que tiene
regiones sin unir que lo hacen ligeramente menos compacto; esto resulta de una excesiva alcalinidad durante la
preparación del plásmido.
 ADN superespiral: Es un ADN totalmente intacto con los filamentos sin cortar, y con forma de remolino,
resultando en una forma compacta.

CLONAJE

Vector de clonaje:

El principio de la clonación en biologia molecular consiste en insertar un segmento de ADN extranjero en una
molécula pequeña capáz de replicarse automática. A ése tipo de molécula de ADN se lo denomina vector de
clonaje.

plásmidos recombinados:

Los plásmidos son excelentes vectore de clonaje. Puede ser "cortado" con una ó dos enzimas de restricción ó
puede incorporársele un fragmento de ADN que ha sido previamente cortado usando mas mismas enzimas de
restricción. Los plásmidos así modificados se los denomina plásmidos recombinados. En éste estado, se los
introduce entonces en una bacteria donde serán replicados.

.
Dadas estas características , los plásmidos han sido empleados como vectores o vehículos de clonación de moléculas
de ADN foráneas que permiten el transporte y manipular del mismo. Es asicomo , hoy en dia, se dispone de una gran
variedad de plasmidos sintéticos de naturaleza molecular con características diversas para lograr ya sea la clonación
de un fragmento de ADN genómico, de (cADN ) El ADN complementario o ADN copia o de PCR (reacción en cadena
de la polimerasa) , o por la expresión de los mismos y obtención del respectivo producto proteico.

Entre las propiedades de los plasmidos que favorecen su utilización como vector de clonación se incluyen:

 Su pequeño tamaño que hace que el ADN sea fácil de aislar y de manipular.
 Su naturaleza circular que hace que el ADN sea mas estable durante la extracción
 Su origen de replicación independiente del control directo de la replicacion del cromosoma bacteriano
 Su multiplenumero de copias, de manera que se aumenta la eficiencia de la extracción del ADN
plasmidico.
 La presencia de marcadores seleccionables, tales como genes de resistencia a antibióticos, haciendo
asimas fácil la detección y selección de las bacterias que contienen plasmidos.

La estructura molecular de todos los plasmidos comprende básicamente:

1. Su origen de replicacion autónomo que permita un alto numero de copias por bacteria(replicació
relajada).
2. Genes de resistencia a antibióticos.
3. Marcadores de selección.
4. Un sitio múltiple de clonación, caracterizado por la presencia de sitios únicos para enzimas de
restricción, no encontrados en ninguna otra región del plásmido.