Inmunología e

Inmunoquímica
Fundamentos

Quinta edición

Ricardo Aníbal Margni

P rofesor Em érito de la U niversidad de Buenos Aires. P rofesor H onorario de la U niversidad del Salvador. Ex-Profesor
Titular Plenario de Inm unología e Inm unoquím ica de la F acultad de F arm acia y B ioquím ica de la U niversidad de
Buenos A ires. M iem bro de la C arrera del Investigador Científico (Investigador clase Superior) del C onsejo N acional
de Investigaciones C ientíficas y Tecnológicas (CO N ICET). D irector del ID EH U -Instituto de Estudios d e ia
Inm unidad H um oral (CONICET--UBA)

ERRNVPHGLFRVRUJ : ! V B
UaiCACíON

ll\A ' ¡BOiS

______ e d i t o r i a l m e d ic a ----------_
C^paaamericana^
M A R C E L O T. DE ALV EAR 2145 - BUENOS A IRES
B O G O T Á - C A R A C A S - M A D R ID - M É X IC O - S A O P A U L O
P rim era edición, octubre de 1972
S egunda edición, setiem bre de 1977
T ercera edición, enero de 1982
C uarta edición, ju lio de 1989
Q uinta edición, setiem bre de 1996

ISBN 950-06-1495-2
84-7903-317-7

IM PR E SO EN LA A R G EN TIN A

Q ueda hecho el depósito que dispone la ley 11.723.

Todos los derechos reservados.
E ste libro o cualquiera de sus partes
no po d ráa ser reproducidos ni archivados en sistem as recuperables,
ni transm itidos en ninguna form a o por ningún m edio,
ya sean m ecánicos o electrónicos, fotocopiadoras, grabaciones
o cualquier otro, sin el perm iso previo
de Editorial M édica P anam ericana S.A.
»

© 1996 ED ITO R IA L M ÉD ICA P A N A M E R IC A N A S.A.

M arcelo T. de A lvear 2145 - Buenos A ires, A rgentina

E sta edición se term inó de im prim ir

en'e.' .mes de setiem bre de 1996
en los talleres de Editorial M édica P anam ericana S.A.
A v. A m an d o A lcorta 1695, Buenos A ires
Colaboradores
Leopoldo F. Abdon
D ocente de la C átedra de Inm unología de la Facultad de
Farm acia y B ioquím ica de la U niversidad de B uenos A ires
M iem bro del IDEHU
Élida Álvarez
Profesora A djunta de Inm unología, Facultad de Farm acia y
B ioquím ica cíe la U niversidad de B uenos Aires. M iem bro
de la C arrera de Investigador Científico del CO N ICET.
M iem bro del ID EH U
Angel Basualdo
Profesor Titulíu- de M icrobiología de la Facultad de M ed i­
cina de la U niversidad N acional de La Plata
Guillermo Blanco
M iem bro de ia Carrera deJ Investigador Científico del
C O N IC E T, M iem bro del ID EH U
Marta Braun
Profesora T itular de Inm unología de la Facultad de
V eterinaria de la U niversidad de B uenos Aires, M iem bro
de la C arrera del Investigador Científico del C O N IC E T
Gloria E. Cerrone
B ecaria Posdoctoral del CONICFH’, Laboratorio de B io lo ­
gía M olecular, Hospital de C línicas “José de San M artín” ,
Facultad de M edicina, D ocente de la Cátedra de G enética y
B iología M olecular de la Facultad de Farm acia y B io q u í­
mica de la U nivei'sidad de Buenos A ires
Ménica G. Chíaramonte
B ecaria Posdoctoral del CO N IC E T. D ocente de la
C átedra de Inm unología de la Facultad de Farm acia y
B ioquím ica de la U niversidad de Buenos Aires.
M iem bro del ID EH U
Ramón A. de Torres
P rofesor T itular de M icrobiología de la Facultad de F arm a­
cia y B ioquím ica de la U niversidad de Buenos A ires,
M iem bro de la C arrera de! Investigador Científico del
CO N IC E T
Elvira L. Durante de Isola
P rofesora A djunta de) D epartam ento de M icrobiología, I’a-
rasitología e inm unología de la Facultad de M edicina de la
U niversidad de Buenos A ires
Leonardo Fainboim
Profesor Titular del D epartam ento de M icrobiología, Para-
sitología e Inm unología, áren Inm unología, de ¡a Facultad
de M edicina de la U niversidad de B uenos Aires, M iem b ro
de la C arrera del Investigador C ientífico del C O N ÍC E T
Alberto Fossati
P rofesor A djunto de Inm unología de la Facultad d e C ie n ­
cias E xactas de la U niversidad N acional de La Plata,
M iem bro de la C arrera del Investigador C ientífico del
C O N IC E T , M iem bro del IDEHU
Mirta Franco
P rofesora A djunta de M icrobiología de la I’acultad d e F ar­
m acia y B ioquím ica de la U niversidad de B uenos A ires
Mirta Giordano
Instituto de Investigaciones H em atológicas de la A cadem ia
N acional de M edicina, M iem bro de la Carrera del In v e sti­
gador Científico del CO N IC E T
Fernando Goldbaum
D ocente de la C átedra de Inm unología de la F acu ltad de
F arm acia y Bioquím ica d e la U niversidad de B u en o s Aires
M iem bro del ID EH U
Stella M. González Cappa
P rofesora Titular del D epartam ento de M icrobiología, P a­
rasitología e Inm unología de la Facultad de M ed ic in a de la
U niversidad de Buenos A ires, M iem bro de la C a rrera del
Investigador C ientífico del C O N IC E T
Silvia E. Hajos
P rofesora Titular de Inm unología de la Facultad d e I:<'arma-
cia y B ioquím ica de la U niversidad de Buenos A ires,
M iem bro de la C arrera del Investigador Científico del
C O N IC E T . M iem bro del IDEHU
Nora Halperin
L aboratorio de Inm unogenética. H ospital de C lín icas “José
de S an M artín”
Ileaiia Malan Borel
D ocente de la Cátedra d e Inm unología de la F acu ltad de
F arm acia y B ioquím ica de la U niversidad de B u en o s Aires
M iem bro de la C arrera del Investigador C ientífico del
C O N IC E T . M iem bro del ID EH U
VI Colaboradores
Emilio L. Malchiodi
Profesor A djunto de Inm unología de la Facultad de Farm a-
cia y B ioquím ica de la U niversidad de Buenos Aires.
M iem bro de la C arrera del Investigador Científico del
CO N IC ET. M iem bro del IDEHU
Marcela A. Manghi
Profesora A djunta de Inm unología de la Facultad de F ar­
m acia y B ioquím ica de la U niversidad de Buenos Aires.
M iem bro de la C arrera del Investigador C ientífico del
CO N IC ET. M iem bro del IDEHU
Irina Mathov
D ocente de la C átedra de Inm unología de la Facultad de
Farm acia y B ioquím ica de la U niversidad de Buenos A ires
M iem bro del IDEHU
Gerardo Mirkin
D ocente del D epartam ento de M icrobiología, P arasitología
e Inm unología de la Facultad de M edicina de la U niversi­
dad de Buenos Aires
Marta Minvielle
Profesora A djunta de M icrobiología de la F acultad de
M edicina de la U niversidad N acional de L a P lata
Claudia Mongini
B ecaria Posdoctoral de C O N IC E T. D ocente de la Cátedra
de Inm unología de la Facultad de Farm acia y Biociuímica
de la U niversidad de Buenos A ires. M iem bro del ID EH U
Laura Morelli
D ocente de la Cátedra de Inm unología de la Facultad de
Farm acia y B ioquím ica de la U niversidad de Buenos Aires
M iem bro de la C arrera del Investigador Científico del
CO N IC ET. M iem bro del ID EH U
Ricardo Negroni
C entro de M icología de la F acultad de M edicina de la U ni­
versidad de B uenos A ires
M. Rosa Padrós Vindrola
Laboratorio de Inm unogenética. C entro de Investigaciones
M édicas A lberto Einstein. Profesora de la Facultad de M e­
dicina de la U niversidad del Salvador
Marco Pizzolato
Profesor A djunto del D epartam ento de A nálisis Clínicos,
O rientación Q uím ica de P roteínas de la Facultad de F ar­
m acia y B ioquím ica de la U niversidad de Buenos A ires
Edgardo Poskus
Profesor T itular de Inm unología de la F acultad de F arm a­
cia y B ioquím ica de la LIniversidad de Buenos Aires,
M iem bro de la C arrera del Investigador Científico del
CO N IC ET. M iem bro del ID EH U
Clelia M. Riera
Profesora T itular de Inm unología y Serología de la F acu l­
tad de C iencias Q uím icas de la U niversidad N acional de
Córdoba, M iem bro de la C arrera del Investigador C ientífi­
co del CO N IC E T
María Rivas
Servicio de Inm unología del H ospital N acional de Pediatría
“Dr. Juan P. G arrahan”
Estela Roux
D epartam ento de B rom atología y Nutrición de la Facultad
de Farm acia y Bioquím ica de la U niversidad de Buenos
Aires. M iem bro de la C arrera del Investigador C ientífico
del CO N IC E T
M. Leonardo Satz
Profesor A djunto del D epartam ento de M icrobiología,
Parasitología e Inm unología, área Inm unología de la
Facultad de M edicina de la U niversidad de Buenos
Aires, M iem bro de la C arrera del Investigador C ientífico
del CO N IC E T
Norma S. de Speziale
Profesora A djunta de Q uím ica B iológica P atológica de la
Facultad de Farm acia y B ioquím ica de la U niversidad de
Buenos A ires, M iem bro de la C arrera del Investigador
Científico del C O N IC E T
Liliana G. Vauthay
D ocente del D epartam ento de B iología C elular, H istología,
Em briología y G enética de la Facultad de M edicina de la
U niversidad de Buenos A ires, P rofesional Investigador,
D epartam ento B ioterio y C áncer E xperim ental, Instituto de
O ncología “A ngel R offo” ,
Claudia Waldner
Becaria Posdoctoral del C O N IC ET, D ocente de la
C átedra de Inm unología de la Facultad de Farm acia y
B ioquím ica de la U niversidad de Buenos A ires, M iem bro
del ID EH U
Nora Yranzo-Volonté
D ocente de la C átedra de Inm unología y Serología de la
Facultad de Ciencias Q uím icas de la U niversidad N acional
de Córdoba, M iem bro de la Carrera del Investigador C ien ­
tífico del C O N IC E T
Marta Zelazko
Jefe del Servicio de Inm unología del H ospital N acional de
Pediatría “Dr. Juan P. G arrahan”
Norberto W. Zwirner
Becario Posdoctoral del C O N IC E T. D ocente de la C átedra
de Inm unología de la Facultad de Ciencias Exactas de la
U niversidad N acional de La Plata, M iem bro del ID EH U
Indice

Prólogos IX 13. El reconocimiento antigénico y

activación de los linfocitos B y T 257
R icardo A. M argni
I. A SPEC TO S BÁSICO S D E LA 14. Evolución del sistema inmune 267
INM UNIDAD I Guillerm.o Blanco

15. Respuesta inmune humoral 278

1. Mecanismos de defensa contra R icardo A. M argni
la agresión 3
R icardo A. M argni 16. Hipersensibilidad tardía y otras
reacciones de inmunidad mediada ■
2. La respuesta inmune 14 por la activación de macrófagos 296
R icardo A. M argni Marta. Braun
3. Bases celulares de la respuesta 17. El sistema inmune de mucosas 306
inmune. Órganos linfoides primarios
PR IM E R A PA R TE
y secundarios 33
M aría E.nela R oux
M arta Braun

4. Antígenos 47 S E G U N D A PA R T E
R icardo A. M argni Regulación neuroendocrina de la
inmunidad de mucosas: un sistema
5. Anticuerpos 75
interactivo-adaptativo 317
R icardo A. M argni
M aría Estela R oux y Liliana G raciela Vauthay
6. El origen de la diversidad de los
18. Regulación de la respuesta inmune 327
anticuerpos 131 M arta Braun
M. L eonardo Satz y Ricardo /l. M argni
19. Anticuerpos no precipitantes,
7. Estructura y organización genética anticuerpos asimétricos de las
del receptor T 144 clases IgG. Su relación con los
M. L eonardo Satz
precipitantes 345
8. Reacción antígeno-anticuerpo R icardo A. M argni
in vitro. Interacción primaria 154 20. Inmunización activa y pasiva 362
Ricardo A. M argni
R icardo A. M argni
9. Reacción antígeno-anticuerpo
in vitro. Interacción secundaria 176
Ricardo A. M argni
II. M EC A N ISM O S E F EC T O R E S
D E L A RESPU ESTA INM UNE 373
10. El complejo mayor de histocom­
patibilidad y su relación con la 21. Mecanismos citotóxicos mediados
respuesta inmune 201 por células 375
M. L eonardo Satz. M artín Isturiz y M irta G iordano
II . Moléculas de adhesión 219 22. Complemento 386
M arcela A. M anghi R icardo A. M argni

12. Citoquinas 231 23. Inflamación 435

Elida Alvarez N orm a S. de Spezicile
VIII índice

III. INMUNOPATOLOGÍA 473 39. Inmunoanálisis radiométrícos 821

Edgardo Poskus
24. Inmunología de las infecciones 40. Metodologías básicas en biología
microbianas 475 molecular. Técnicas de hibridizaeión
M irta Franco y reacción en cadena de la
25. Inmunología de las micosis 496 polimerasa (PCR) 852
Ricardo N egroni G loria E. C errone y Laura MorelU

26. Inmunología de las infecciones

parasitarias 521 V. MÉTODOS INMUNOQUÍMICOS 867
Stelia M. G onzález Cappa, Elvira L D urante
de J.^olay Gerardo A. M irkin 41. Métodos cromatográficos de fase
27. Inmunología de las infecciones líquido-sólido (LSC) aplicados a
virales 531 la purificación de proteínas 869
Juliana Leone, Irina M atov y Leopoldo
Ram ón A. de Torre.y, Juan A n g e l Ba,gualdo
E. A bdon
y M arta C. M invielle

28. Autoinmunidad 559 42. Electroforesis en gel de

Clelia Riera, Juliana L eoni y Nora
poliacrilamida; isoeleetroenfocado;
Yranzo-Volonté
inmunotransferencia
(“immunoblotting”) 906
29. Estructura y función del complejo Ricardo A. M argni, Em ilio L. M alchiodi
mayor de histocompatibilidad 593 y M ónica G. C hiaram onte
M. Leonardo Satz y L eonarch F ainboim
43. Antígenos bacterianos 923
30. Inmunodeficiencias 609 Ricardo A. M argni
M arta Zelazkj) y M aría Rivas
44. Antígenos proteicos 932
31. Gammopatías monoclonales 627 Ricardo A. M argni
¡Marco Pizzolato
45. Preparación de sueros inmunes y
32. Manifestaciones de hipersensibilidad. purificación de anticuerpos 937
Alergia 639 Ricardo A. M argni
Ricardo A. M argni
46. Fraccionamiento de
33. Inmunología tumoral 664 inmunoglobulinas 945
Silvia E. Hajos Ricardo A. M argni
34. Inmunología de la reproducción 681
Ricardo A. M argni e Ileana M alan B orel
VI. APÉNDICES 951

695 I. Preparación de adyuvantes 953

IV. M E T O D O L O G IA S
R icardo A. M argni

II. Soluciones buffer más comunes

35. Métodos utilizados para la usadas en inmunología 957
identificación y cuantificación R icardo A. M argni
de antígenos y anticuerpos 697
Ricardo A. M argni III. Coeficientes de extinción molar
(E“^„,) de sustancias de bajo pe'S’o
36. Metodologías para la evaluación de molecular usadas en inmunología
las células inmunocompetentes 729 y Coeficientes de extinción porcentual
Claudia M ongini y Claudia W akiner
(E|'*n,) de proteínas usadas en
37. Hibridomas y anticuerpos inmunología 960
monoclonales 781 Ricardo A. M argni
Fernando A lberto G oldbaum
IV. Nomenclatura de los aminoácidos 962
y Carlos A lberto Fossati
R icardo A. M argni
38. ELISA 798
N orberto W. Z w irner índice analítico 963
Prólogo de la quinta edición
El avance acelerado de los conocim ientos
en e] cam po de la inm unología, sustentados
en hipótesis planteadas y en el desarrollo de
una m etodología de avanzada, ha hecho que
los textos sobre tem as relacionados con esta
ram a de las ciencias biológicas deban ser re­
novados perm anentem ente, y muy esp ecial­
mente si ellos pretenden dar una visión gene­
ralizada de los fen óm en o s inm unológicos.
H asta no hace m ucho tiem po, un libro con
cinco años de antigüedad, salvo raras ex cep ­
ciones tenía plena vigencia. En la actualidad,
ese tiem po m arca la necesidad de elab o rar
una n ueva edición con la in corporación de
todos los conocim ientos surgidos durante ese
período.
Ése es el m otivo de la 5"' edición de In m u ­
nología e Inm unoquím ica y es nuestro deseo
que ésta llegue a tener la acogida de las cua­
tro ediciones anteriores. Para que ello pueda
concretarse se ha hecho una revisión p o rm e­
norizada de los diferentes capítulos que co m ­
ponen el libro, incorporando nuevos concep­
tos e hipótesis así com o la m etodología m ás
adecuada para poder encarar, desde el punto
de vista experim ental, los diferentes estudios
que puedan llevar a la clarificación de h e ­
chos aún no dilucidados. Se ha procurado,
además, que la m ayor cantidad posible de las
figuras sean en colores para que sus interpre­
taciones se vean facilitadas.
D ada la im portancia de las m oléculas de
adhesión en el desarrollo del proceso in m u ­
nológico, al igual que las citoquinas en él in­
volucradas, se han incorporado sendos ca p í­
tulos sobre estos tem as y el capítulo sobre in­
flam ación ha sido actualizado sobre la base
de esos conocim ientos. Del mismo m od o se
incluye" el análisis de los eventos b io q u ím i­
cos que ocurren durante la tran sd u cció n de
señales que llevan a la activación de lo s lin­
focitos T y B y a la desgranulación y lib e ra ­
ción de m ediadores quím icos por las células
b a só fila s e sp ec ífic am e n te e stim u la d a s. El
avance en el conocim iento de la estructura y
función de los anticuerpos IgG asim étricos
nos h a llevado a la am pliación del capítu lo
correspondiente y a la incorporación d e un
capítulo sobre Inm unología de la R eproduc­
ción, proceso en el que estos anticuerpos de­
sem peñan un papel im portante.
D esde el punto de vista m etodológico los
capítulos correspondientes han sido a c tu a li­
zados, incorporando nuevas técnicas d e uso
corriente en el laboratorio inm unológico co­
mo son las técnicas básicas de biología m o le ­
cular, hibridaciones, PCR, crom atografía l í ­
quida de alta eficiencia (HPLC, FPLC), téc­
nicas p ara estudios de la inm unidad celular,
etc., y todas aquellas que resultan in d isp en ­
sables para un buen estudio inm unológico e
inm unoquím ieo.
L a base del desarrollo de nuestros conoci-
m entos es el ID EH U -Instituto de E studios de
Inm unidad H um oral (C O N IC ET-U B A ) y la
c á te d ra de In m u n o lo g ía de la F a c u ltad de
F arm acia y Bioquím ica de la U niversidad de
Buenos Aires. Jóvenes que con el co rrer del
X Prólogo de la quinta edición
tiem po se han ido incorporando a nuestro lu-
gar de trabajo, se han transform ado hoy en
expertos en diferentes aspectos de la inm u-
nología. Es por este m otivo que a los inm u-
nólogos de prestigio que colaboraron en la
edición anterior, se sum an en esta 5"* edición
nuevos autores, que aportan todos sus cono-
cim ientos adquiridos en el desarrollo de sus
tem as de trabajo. Como en ediciones anterio­
res, los diferentes autores han respetado los
lincam ientos generales del libro, pero han le­
nido plena libertad para expresar sus conocí-
mientos.
Finalm ente, quiero expresar mi agradecí-
m iento a Editorial M édica Panam ericana por
todo lo hecho p ara que esta nueva edición
del libro pudiera concretarse,
R ic a rd o A. M arg n i
Prólogo de la primera edición
En la últim a década se han pubhcado nu­
m erosos y muy buenos textos sobre Inm uno­
logía e Inm unoquím ica, escritos p rin c ip a l­
m ente en inglés y fran cés, algunos d e los
cuales fueron traducidos al español. L am en­
tablemente, dado el tiem po transcurrido entre
su escritura en el idiom a original y la apari­
ción de las traducciones, y la constante evo­
lución de los diferentes aspectos de la In m u ­
nología, algunos de los capítulos incluidos
en aquéllos han perdido actualidad.
Cuando se decidió la publicación de este
libro, en ningún m om ento se pensó en térm i­
nos de com petición. Sim plem ente, se procu­
ró escribir en español un texto que pudiera
ser útil y accesible no sólo a nuestros alum ­
nos de la carrera de B ioquím ica que deben
cursar Inm unología e Inm unoquím ica, sino
tam bién a todos aquellos que deseen iniciar­
se en estas disciplinas y no dominen lenguas
extranjeras, en especial el inglés.
El libro ha sido dividido en tres partes, y se
han incluido adem ás tres apéndices. En la
parte prim era se han expuesto los conceptos
teóricos básicos de la Inm unología. A dem ás
de hacerse el estudio de los antígenos, anti­
cuerpos y complemento y sus mecanism os de
interacción in vitro e in vivo, se han incluido
un capítulo sobre enfermedades autoinmunes,
en especial las de tipo experimental, y otro so­
bre las bases inm unológicas de) rechazo al in­
jerto homólogo por considerarlo de sum a im­
portancia en el m om ento actual. Los funda­
mentos teóricos sobre el concepto de afinidad
de los anticuerpos y los métodos para medir
su Ko (constante de asociación intrínseca pro­
m edio), n (valencia) y a (factor de hom oge­
neidad), han sido desarrollados en detalle.
L a p a rte segunda in cluy e la d escripción
detallada de los m étodos serológicos m ás im­
portantes para la identificación y cuantifica­
ción de antígenos y anticuerpos.
U na serie de técnicas de uso frecuente en
In m u n o q u ím ic a han sido a g ru p a d as en la
p a rte tercera.
M étodos para la activación de resin as de
intercam bio iónico, preparación de colum nas
para crom atografía y filtración por g eles, dis­
tintos buffer de uso en Inm unología e Inm u­
noquím ica y una hsta de los y de
num erosas sustancias, en especial haptenos
de com posición quím ica definida y proteínas
antigénicas o con actividad anticuerpo, for­
m an parte de los tres apéndices.
Se ha incluido un buen núm ero de gráficos
y fotografías, de modo que faciliten la inter­
pretació n de los hechos. Han sido elab o ra­
dos, en su mayoría, con datos experim entales
provenientes de nuestro laboratorios.
En el capítulo 4, para la identificación dei
Complemento, de los com plejos in term edio s.
resultantes y de los productos de degradación
enzim ática de algunos de sus com ponentes,
se ha em pleado la nom enclatura antigua. Ello
ha sido realizado con el objeto de facilitar a
los que recién se inician, el acceso y com­
prensión de la bibliografía no m uy reciente
sobre e) tema. N o obstante en la p a rte final
del capítulo se transcribe ia nom enclatura ac­
tual, recom endada por la O rganización iVIun-
XII Prólogo de la primera edición
dial de la Salud, así com o sus relaciones con
la utilizada.
Puesto que es éste un lib ro p ara p rin c i­
p ian tes, la b ib lio g rafía no fo rm a p arte del
texto. Al final de cada capítulo se acom paña
una Bibliografía en la que se indican los li­
bros, actualizaciones y trabajos m ás im por­
tantes, que el lector podrá consultar píira p o ­
der am pliar sus conocim ientos.
En los casos particu lares de d escripción
d e m étodos o técn icas, las re fe re n cia s b i­
bliográficas están indicadas en el pie de p á­
gina.
Al finalizar este breve prólogo se deja e x ­
presado el reconocim iento del autor a todos
aquellos que de una u otra m anera han co n ­
tribuido a que sus deseos de escribir un l i ­
bro en español sobre fundam entos de la In ­
m unología y la Inm unoquím ica se co n creta­
ran.
R ic a rd o A. M a rg n i
Prólogo de la segunda edición
La circunstancia de que la prim era edición
de Inm unología e Inm unoquím ica se agotara
antes de lo previsto planteó la necesidad in ­
m ediata de su segunda edición.
Com o en los últim os cinco años gran parte
de los conocim ientos en los diferentes cam ­
pos de la Inm unología experim entaron cam ­
bios de im portancia, la m ayoría de los capí­
tulos del libro original fueron m odificados,
reescritos íntegram ente, subdivididos y am ­
pliados para su adaptación.
D e las consultas y sugerencias recib id as
surgió la necesidad de incorporar nuevos ca­
pítulos, en especial sobre órganos linfoides y
células que intervienen en la respuesta inm u­
ne; la respuesta inm une mediada por células;
algunos aspectos de inm unopatología com o
las inm uno deficiencias y las enferm edades
por autoagresión desarrolladas en el hom bre;
los anticuerpos no precipitantes; problem as
particulares en el campo de la inm unoquím i­
ca, y otros. Ello hizo que para el desarrollo de
algunos de esos temas, que no eran de nuestra
esp ecialid ad , so licitara la co lab o ració n de
destacados inm unólogos de nuestro m edio. A
quienes lean la segunda edición de Inm unolo­
gía e Inm unoquím ica no les quedarán dudas
de que todos lo han hecho con el m áxim o de
eficacia y que la experiencia por ellos vertida
habrá de resultarles muy útil.
El objetivo inicial de la redacción de este
libro fue el de presentar una obra o rig in al­
m en te esc rita en español, con los c o n o c i­
m ie n to s in m u n o ló g ico s básico s a c tu a liz a ­
dos, y en la que adem ás fuera posible hallar
la m etodología necesaria para poder llev ar a
cab o los ex p erim en to s q u e p u d ieran p la n ­
tearse aquellos que se inician en la inv esti­
g a c ió n in m u n o ló g ica . P o r tal m o tiv o , esa
m e to d o lo g ía h a sido am pliada, in clu y en d o
las técnicas indispensables para los estudios
de in m un id ad a nivel celu lar, los m étodos
in m u n o q u ím ic o s m ás ú tiles para p u rific a ­
ción de diferentes tipos de antígenos y anti­
cuerpos y toda la m etodología acceso ria ne­
cesaria para estos fines.
Es nuestro m ayor deseo que este libro, en
el que figura una m etodología am pliam ente
e x p erim en tad a, pueda e sta r en la m e s a de
trab ajo de aquellos que están h a c ie n d o sus
prim eras armas en el cam po de la Inm unolo­
gía y la Inm unoquím ica.
N o podría cerrar este breve prólogo sin an­
tes agradecer profundam ente a todos los que
han colaborado en su redacción, a quienes
con sus com entarios hicieron apreciar la ne­
cesidad de una am pliación en su contenido y
a E ditorial M édica Panam ericana, responsa­
ble de esta segunda edición, por to d o el em­
p e ñ o p u e sto p a ra q u e p u e d a n c u m p lirs e
nuestros deseos.
R ic a rd o A. M a rg n i
Prólogo de la tercera edición
Dos años y medio fueron suficientes para
que la segunda edición de Inmunología e Inm u­
noquímica se agotara. Pero en este lapso tam­
bién se clarificaron algunos conocimientos en
el campo de la inmunología y surgieron hechos
y metodologías que hicieron que optáramos por
elaborar una nueva edición del libro en lugar
de su reimpresión.
Para que este manual pueda prestar utilidad
al mayor número de personas interesadas en la
inm unología se incluyeron nuevos capítulos,
entre ellos: Inmunogenética, Inmunidad en las
infecciones bacterianas. Inm unidad en las in­
fecciones virales. Inmunidad en las infecciones
parasitarias. Inmunidad en las infecciones mi-
cóticas e Inmunidad tumoral, los que han sido
escritos por especialistas en los respectivos te­
mas. Los restantes capítulos han sido corregi­
dos y actualizados para que el libro mantenga
vigencia permanente.
A los colaboradores iniciales y a los que se
han incorporado en esta edición, mi sincero
agradecimiento por su contribución, la que in­
dudablem ente habrá de ser apreciada por los
lectores. A E ditorial M édica Panam ericana,
responsable de la edición, mi reconocimiento
por todo lo hecho.
R ic a r d o A. M arg n i
Prólogo de la cuarta edición
Los avances logrados en el cam po de la
biología m olecular, los aportes de la ingenie­
ría genética, el uso de anticuerpos m onoclo­
nales, de cepas seleccionadas de anim ales de
experim entación y el desarrollo de sofistica­
das m etodologías, entre otros, han hecho que
num erosos conocim ientos inm unológicos h a­
yan sido clarificados en lo que va de la déca­
da de 1980. A ello se debe que tengam os hoy
un concepto claro sobre el origen de la di v er­
sificación de las cadenas L y H de las inm u­
noglobulinas, la que en gran parte es conse­
cuencia de recom binaciones de exones cuya
ubicación en el genom a se conoce. Lo m is­
m o cabe decir para el receptor antigénico de
los linfocitos T y para algunas interleuqui­
nas, así com o para los antígenos H L A . En
este caso no sólo se ha avanzado en lo que a
H L A y re s p u e s ta in m u n e se re fie re , sin o
tam bién a posibles relaciones entre H L A y
enfermedad.
Los estudios de difracción de rayos X de
com plejos form ados por el fragm ento F ab de
inm unoglobulinas m onoclonales y m oléculas
an tig én icas p e q u eñ as han p e rm itid o te n e r
una idea mucho más precisa sobre el sitio de
com binación de los anticuerpos y la topogra­
fía de algunos determ inantes antigénicos.
En el cam po del diagnóstico, el em pleo de
reacciones inm unológicas de tipo inm unoen-
zim áticas ha d em ostrad o su e x trao rd in aria
sensibilidad y la posibihdad de su desarrollo
sin necesidad de tener que recurrir a reacti­
vos radiom arcados o al em pleo de m icrosco­
pia óptica no convencional.
A nivel celular, en especial en lo referente
a la participación que tienen las células acce­
sorias y las diferentes poblaciones de lin fo c i­
tos en los m ecanism os de reconocim iento de
los epitopes antigénicos y en la regulación de
la respuesta inm une, los avances tam bién han
sido notables.
T odos estos hechos son los que han d eter­
m inado la reedición de nuestro libro d e In ­
m unología e Inm unoquím ica escrito en esp a ­
ñol -c u y a liltim a edición data de 1 9 8 2 - para
p o d er incorporar los grandes avances d e la
inm unología que tuvieron lugar durante estos
últim os seis a siete años.
En esta o p o rtu n id ad p articip aro n v e in ti­
cuatro colaboradores, aportando cada u n o su
experiencia en determ inados temas. E llo ha
h echo que algunos capítulos fueran m o d ifi­
cados sustancialm ente o reescritos y q u e fue­
ra necesario incorporar otros nuevos com o:
El origen de la diversidad de los anticuerpos
y ontogenia linfocitaria B; Estructura y orga­
nización genética del receptor T; R espuesta
inm une humoral; Inm unología de las m u co ­
sas; A nticuerpos no precipitantes de la clase
IgG y su relación con los precipitantes; M e­
canism os citotóxicos m ediados por células;
R egulación de la respuesta inmune; In flam a­
ción; El com plejo m ayor de histocom patibili­
dad humano: HLA.
Puesto que nuevas m etodologías sero ló g i­
cas y de uso inm unoquím ico han surgido úl­
tim am ente, capítulos sobre R adioinm unoen­
sayo (RIA), Enzim oinm unoensayo (ELISA );
H ib rid o m a s y a n tic u e rp o s m o n o c lo n a le s;
Electroforesis en gel de poliacrilam ida; isoe­
lectro en fo cad o ; in m u n o tran sferen cia (“im ­
m u n o b lo ttin g ”), han sido in co rp o rad o s. El
capítu lo sobre m étodos cro m ato g ráfico s ha
XVI Prólogo de la cuarta edición
sido am pliado, habiéndose incluido adem ás
el crom atoenfocado. En el capítulo Fraccio­
nam iento de Inm unoglo b u lin as, se h a d e s­
cripto la m etodología para la degradación en­
zim ática de las diferentes clases de inm uno-
g lo b u lin as de ratón, dado que no to d as se
com portan de m anera sim ilar a las de otros
vertebrados y al uso frecuente que se hace de
ellas por m edio de los anticuerpos m onoclo­
nales obtenidos por hibridización.
La cuarta edición de Inm unología e Inm u­
noquím ica, que en su versión original fuera
concebida para nuestros alum nos de la carre­
ra de B ioquím ica, podrá, en su versión ac­
tual, ser útil para todos aquellos que cursen
diferentes carreras con orientación biológica
com o medicina, veterinaria, biología, ya que
no sólo están desarrollados los aspectos bási­
cos de la inm unología, sino que tam bién es­
tán d escrip tas d istin tas in m u n o p ato lo g ías.
A dem ás, dada la am plia m etodología que el
libro contiene, sería nuestro deseo que pudie­
ra encontrarse en la m esa de trabajo de aque­
llos que desarrollen su actividad en los cam ­
pos de la inm unología básica y la aphcada.
El libro continúa siendo una obra integra­
da. N o obstante, se ha dejado en libertad a
los d istin to s c o la b o ra d o re s p ara que cad a
uno, sig u ien d o los lin cam ien to s gen erales
trazados, p u ed a expresar su punto de vista
sobre el tem a que relata y, en especial, sobre
aquellos tópicos que todavía constituyen m o­
tivo de discusión.
N o q u isiera cerrar este prólogo sin antes
agradecer profundam ente a los diferentes au­
tores, especialistas en sus tem as, por el e x ­
traordinario aporte que ha significado cada
una de sus contribuciones.
A Editorial M édica Panam ericana, al igual
q u e en ed icio n e s an terio re s, m i a g ra d e c i­
miento por el esftierzo realizado para que e s­
ta cuarta edición haya podido concretarse.
R ic a r d o A. M argni
ASPECTOS BASICOS
DE LA INMUNIDAD

I
Mecanismos de defensa
contra la agresión
RICARDO MARGNI
El hombre y los animales normalmente no
sufren el impacto de los agentes patógenos y
de todos aquellos agresores reales o potencia­
les que los rodean. Ello se debe a que poseen
m ecanism os defensivos protectores que les
aseguran cierta integridad, y sólo por fallas de
esos m ecanism os se producen infecciones o
agresiones.
MECANISMOS DE LA INFECCIÓN
La mayor parte de las bacterias deben inva­
dir los tejidos del huésped parasitado y multi­
plicarse en ellos para poder ejercer su acción
nociva, lo cual presupone que se encontrarán
con condiciones biológicas y bioquímicas par­
ticulares que harán posible esa invasión y m ul­
tiplicación.
Cuando un m icroorganism o penetra en el
huésped por cualquier vía, se instala en él, se
multiplica y, ya sea por efecto mismo de su ac­
ceso a los tejidos o por acción de ciertos pro­
ductos de su m etabolism o conocidos con el
nombre de toxinas, produce lesiones locales o a
distancia. Esto es, origina una infección.
Esta infección puede ser generalizada o loca­
lizada. En el primer caso hay una invasión que
alcanza a diversos tejidos y se producen bacte-
riemias, septicemias, localizaciones en diferen­
tes visceras. En el segundo se destaca la agre­
sión que sufren los tejidos que circundan el lu­
gar donde se ha producido la m ultiplicación
bacteriana la cual está, en cierto modo, deter­
minada por propiedades inherentes a la bacteria
misma en la mayoría de los casos.
Existen qtros microorganismos que ejercen
su acción nociva de manera distinta. Si bien se
multiplican también en el tejido que han invadi­
1
do o infectado, no alcanzan por sí mismos otros
tejidos o visceras, sino que lo hacen por inter­
medio de sustancias que, elaboradas por ellos
en el lugar donde se han localizado, son volca­
das al medio interno y, vehiculizadas por la san­
gre o la linfa, llegan a los diferentes órganos y
tejidos, donde producen lesiones características.
A los m icroorganism os que actúan p o r el
primer mecanismo se los conoce con el nom bre
de infectantes, en tanto que a los segundos se
los denomina microorganistnos tóxicos. Estos,
a su vez, pueden ser toxiinfectantes o exclusi­
vamente tóxicos. El inicroorganismo es toxiin-
fectante cuando penetra en el huésped, prolife-
ra en el tejido invadido, infecta, y elabora en
ese lugar las toxinas que por difusión van a
producir la sintomatología clásica de 1a enfer­
medad. Actúan de este modo los bacilos dei té­
tanos, de la difteria, de la gangrena gaseosa.
Hay también otro tipo de microorganismos
que no necesitan invadir para elaborar sus toxi­
nas; por el contrario, no se multiplican en los
tejidos del hombre, pero son capaces de elabo­
rar en el medio externo exotoxinas potentes, las
que, al ser ingeridas por aquél, pueden produ­
cirle alteraciones sumamente graves, capaces
de llevarlo a la muerte. El caso típico de m i­
croorganismo que actúa de esta manera, y que
es por ello considerado tóxico, es el C lo stri­
dium botulinum.
Las bacterias tóxicas y toxiinfectantes son
las que ejercen su acción patógena por interm e­
dio de sustancias de elevada toxicidad, difusi­
bles, a las que se deben las lesiones y síntomas
característicos de la enfermedad. Las toxinas
bacterianas son de dos tipos: las exotoxinas,
que son eliminadas al medio externo, y las en­
dotoxinas, que quedan unidas al protoplasm a
bacteriano.
4 Aspectos básicos de la inmunidad
Por procesos de filtración a través de mem­
branas filtrantes adecuadas es posible separar
las exotoxinas del medio de cuUivo donde ha
proliferado el germen productor. Son marcada­
mente activas y sumamente antigénicas; esto
significa que, inoculadas a un animal sensible,
estimulan la producción de antitoxinas que las
neutralizan específicamente, reacción para la
que unas y otras guardan proporcionalidad di­
recta.
Las endotoxinas no pueden ser separadas por
simple filtración; es necesario recurrir a otros
tratamientos físicos, tales como congelación y
descongelación, empleo de solventes, ultraso­
nidos, acción citolítica de detergentes, desinte­
gración mecánica, etcétera. Su índice tóxico es
inferior al de las exotoxinas y son, además, ter­
moestables y no precipitables por el sulfato de
am onio, propiedades que no com parten las
exotoxinas. Tienen muy escaso poder inmuno­
génico y en algunos casos resulta prácticamen­
te imposible preparar sueros antitóxicos.
Las exotoxinas son proteínas, en tanto que
las endotoxinas son en su mayoría complejos
glucidolipidoproteieos.
Inm unizando animales con endotoxinas se
consiguen antisueros que neutralizan pocas do­
sis letales mínimas de ehas, pero nunca se con­
sigue la relación lineal entre las cantidades de
antitoxina y toxina en una mezcla exactamente
neutralizada que, en cambio, se logra en las
exotoxinas.
Es necesario recordar que, adem ás de las
exotoxinas y endotoxinas, las bacterias pueden
producir otros metabolitos que a su vez son ca­
paces de incidir de diferente manera en el curso
de las infecciones. Algunos microorganismos,
como los estafilococos por ejemplo, son activos
productores de coagulasa, que tiene la particula­
ridad de coagular el plasma humano y de otros
vertebrados; los estreptococos producen fibrino-
lisinas, capaces de digerir los coágulos de fibri­
na; varios microorganismos son productores de
hialuronidasa, factor de difusión que facilita la
penetración, y muchos de ellos elaboran enzi­
mas de diferentes tipos que pueden tener cierta
influencia en la infección al producir alteracio­
nes en el metabolismo normal celular.
Además de las bacterias, otros agentes agre­
sores reales (virus, parásitos) o potenciales
pueden producir daños hísticos u orgánicos y
provocar como consecuencia de ello la reac­
ción del huésped.
MECANISMOS QUE IMPIDEN
LA INFECCIÓN
Los vertebrados poseen diferentes mecanis­
mos para defenderse de la agresión originada
por agentes patógenos. Esos mecanismos pue­
den ser inespecíficos y específicos, siendo los
primeros de carácter general, capaces de defen­
derlo contra cualquier agresor, en tanto que los
específicos sólo actúan contra entidades bien
definidas.
Mecanismos inespecífícos
Son de dos tipos: a) los constituidos por las
barreras naturales, y b) los de la inmunidad in­
nata o inespecífica.
Las barreras naturales
Los microorganismos patógenos se caracteri­
zan por su capacidad de penetrar y multiplicarse
en los tejidos que invaden. Para defenderse de
esa posible agresión, existen en los vertebrados
barreras naturales que, impidiendo la penetra­
ción de los agentes patógenos reales o potencia­
les, les permiten mantener su integridad.
Debemos considerar en primer lugar la piel,
la cual, intacta, actúa como una efectiva barrera
que impide el paso de las bacterias, no sólo co­
mo mero hecho físico, mecánico, sino también
por la presencia de ácidos grasos que dificultan
e impiden la proliferación bacteriana y actúan
como verdaderos elem entos inespecíficos de
defensa.
La boca, el estómago y el intestino también
lo son. Las bacterias que llegan a la boca son
retenidas en parte por fijación a la secreción
que recubre el epitelio bucal. A quellas que
pueden llegar al estómago sufren la acción bac­
tericida del jugo ácido de este órgano, el cual
las destruye en su mayoría, y por ello los exá­
menes bacteriológicos del líquido duodenal y
de la porción alta del intestino delgado denotan
frecuentemente ausencia de bacterias.
La nariz, la nasofaringe y las vías respirato­
rias, por su estructura anatómica y su capa de
células vibrátiles, actúan como elementos de­
fensivos barriendo la capa mucosa que las re­
cubre. En las fosas nasales, la cantidad de m i­
croorganismos es indudablemente superior a la
que hay en tráquea y bronquios; a nivel de es­
tos últimos, el número es escaso y puede a ve­
ces ser nulo.
La conjuntiva ocular está íntimamente rela­
cionada con las vías respiratorias superiores por
intermedio de los conductos lagrimales. El par­
padeo y las lágrimas barren la superficie ocular
y eliminan por los lagrimales en las vías respi­
ratorias altas las bacterias que pudieran hallarse
en ella; por otra parte, no hay que olvidar que la
secreción lagrimal es muy rica en una sustancia
bacteriolítica natural denominada lisozima, que
a alta dilución tiene la particularidad de produ­
cir la lisis de muchos microorganismos. Esta
 Mecanismos de defensa contra la agresión
sustancia bacteriolítica no sólo se encuentra en
la secreción lagrimal sino también en muchas
secreciones mucosas, y su presencia ha podido
ser demostrada hasta en la misma piel.
Las vías genitales están totalmente recubier­
tas por una capa dérmica. En el hombre, la m a­
yor parte de los microorganismos son barridos
por la orina. La vagina, por su parte, debido a
que normalmente posee una flora rica en lacto-
bacilos, origina un medio con un pH bajo que
impide la proliferación de otros microorganis­
mos. Junto a estos mecanismos de barrido en el
caso del hombre y de producción de ácido lác­
tico por los bacilos acidúricos en la mujer, la
mucosa genital en ambos casos posee un mar­
cado poder bactericida y ello se debe a su con­
tenido en lisozima e inhibina.
Además de la necesidad de vencer los meca­
nismos anteriormente citados, para que un m i­
croorganismo pueda penetrar e infectar, deben
darse ciertas condiciones, tales como tempera­
tura adecuada para su supervivencia y multipli­
cación. Esto serviría para explicar ciertos casos
de inmunidad natural hacia determinados m i­
croorganismos ya que, experimentalmente, se
ha podido comprobar que algunos de los ani­
males inmunes a la infección pueden contraería
cuando se los expone a variaciones térmicas; se
recuerda como ejemplo el clásico experimento
de Pasteur de la infección de la gallina por car­
bunco al someterla a enfriamiento.
La tensión de oxígeno en los tejidos puede
crear condiciones favorables o por el contrario
desfavorables para la multiplicación microbia­
na; el caso de los clostridios, cuya proliferación
en el torrente sanguíneo re su lta dificu lto sa
cuando hay una oxigenación acentuada de él,
es un ejemplo de ello.
La presencia de metabolitos, o su ausencia,
puede desem peñar un papel importante en la
proliferación de microorganismos que, habien­
do franqueado las barreras anteriormente des­
critas, llegan a los tejidos. La ausencia de algu­
nas sustancias indispensables impide su m ulti­
plicación y ha podido demostrarse con mutan­
tes particulares, en infecciones experimentales
efectuadas en animales, que el añadido de esos
metabolitos esenciales -en la dieta o mediante
inoculaciones- allana la dificultad y favorece
la infección.
Además de la lisozima, ya referida, existen
en los tejidos del hom bre y de los anim ales
otras sustancias que tienen acción bactericida o
bacteriostática, como la espermina y la esper-
rnidina, capaces de actuar sobre los bacilos tu­
berculosos; la fagocitina, obtenida de los poli­
morfonucleares; (3-lisinas; los péptidos antim i­
crobianos sintetizados por células de mamífe­
ros conocidos con el nombre de “defensinas” ;
etcétera.
5
Si las barreras naturales han sido vencidas y
hay penetración de los microorganismos pató­
genos, se ponen en marcha otros mecanismos
de resistencia “naturales”, involucrados dentro
de lo que se conoce como “inmunidad innata” .
Inmunidad innata
Sus mecanismos comienzan a actuar in m e­
diatamente después de la penetración del agente
agresor, a diferencia de lo que ocurre con la “in­
m unidad esp ecífica” que requiere de c ierto
tiempo para que se haga efectiva. Lo que se
procura en primera instancia es la eliminación
del agente infectivo y la reparación del daño ti­
sular originado, jugando un papel muy im por­
tante en ello el denominado proceso inflam ato­
rio. En este evento participan células (m onoci­
tos, polimorfonucleares, neutrófilos, células NK
[“natural killer”, asesinas], células endoteliales),
moléculas (citoquinas, componentes del sistema
complemento resultantes de la activación por la
vía alterna, metabolitos del ácido araquidónico),
m o lé c u la s de a d h esió n (L F A -1 , IC A M -1 ,
ICAM-2, ELAM-1, entre otras) y receptores de
componentes del sistema complemento (C R I,
CR2, CR3 y CR4) (véanse caps. 11 y 12).
Las células que actúan en primera instancia
son los m acrófagos locales, que ligan a su
mem brana al agente agresor. Este mecanismo
tiene lugar a través de la unión de un receptor,
frecuentemente CRI y CR2, con los productos
del sistema complemento C3b y C3bi unidos al
microorganism o y provenientes de su activ a­
ción por la vía altema, inducida por componen­
tes de la pared celular de las bacterias. Esas
uniones también ocurren entre pares de m olécu­
las de adhesión (véase cap. 11). Como conse­
cuencia de esa interacción los macrófagos sinte­
tizan y liberan interleuquina 1 (IL-1), factor ne­
crosante de tumores (TNF) y factor quimiotácti­
co de neutrófilos (NCF). Estos factores inducen
la rápida emigración de los pohmorfonucleares
neutrófilos circulantes a los sitios extravascula-
res donde se encuentra el agente patógeno, esta
migración es mediada por la interacción de m o­
léculas que se expresan en la membrana de los
neutrófilos (L FA -l) y las moléculas de ad h e­
sión ELAM-1 (moléculas endoteliales de adhe­
sión de leucocitos), ICAM -l e ICAM-2 (m olé­
culas de adhesión intercelular) que se expresan
en el endotelio de los vasos, inducidas p o r la
IL-1 y TNF de origen macrofágico. Estas cito-
quinas inducen, a su vez, alteraciones en el en­
dotelio vascular a través del cual se produce la
emigración de los neutrófilos.
Las interacciones entre las moléculas de la
membrana de los neutrófdos y las del epitelio
vascular transducen señales, en las que partici­
pan proteínas G, fosfolipasa C, proteinquinasa
6 Aspectos básicos de la inmunidad
C, entre otras, y llevan a la activación del neu-
trófilo. La injuria tisular inducida por éste es d e ­
bido a la liberación de productos intermediarios
del oxígeno (H^Oj, anión superóxido, radicales
hidroxilo) y a la exocitosis de los contenidos de
los gránulos citoplasm áticos, especialm ente
elastasa. Los oxidantes desnaturalizan a las pro­
teínas y facilitan su degradación por las enzimas
proteolíticas. En este proceso de injuria partici­
pan también los metabolitos del ácido araquidó­
nico (tromboxanos, leueotrienos) y los fragmen­
tos C3a y C5a del sistema complemento, resul­
tantes de su activación por la vía alterna.
Todo este proceso hace que los polimorfonu­
cleares neutrófilos sean Jas células defensivas
que acuden en primer término al lugar de la in­
fección, observándose acumulo de ellas en las
primeras 24 horas, y posterior destrucción, por
fagocitosis, de los neutrófilos que participaron
activamente en el proceso. A partir de ese m o­
mento las células predominantes son los macró­
fagos los que, dada su distribución, tardan más
tiempo en llegar y son las que al fagocitar las
bacterias habrán de provocar su destrucción.
La muerte de las bacterias tiene lugar por me­
canismos endocelulares que ocurren en los ma­
crófagos y por mecanismos exocelulares media­
dos por el sistema complemento. La acción fa­
gocítica se ejerce no sólo cuando un microorga­
nismo llega al tejido celular subcutáneo, sino
también cuando hay una invasión del torrente
circulatorio. Intervienen en este complejo pro­
ceso, además de los polimorfonucleares neutró­
filos sanguíneos, las células histioides libres y
aun las fijas, localizadas en hígado, bazo, sinu­
soides venosos, etc. (Para mayor información
sobre inflamación, véase cap. 23.)
Los m icroorganism os fagocitados son, en
gran parte, destruidos por acción enzimática y
metabolizados como material extraño. El pasa­
je de las partículas al citoplasma de los fagoci­
tos no es simple y ello ocurre previa invagina­
ción de la membrana citoplasmática que engol­
fa a la partícula en su fase inicial y la rodea fi­
nalm ente, originando un fagosoma. Seguida­
mente, los gránulos lisosomales se unen al fa­
gosoma y forman un fagolisosoma; durante es­
te proceso las enzimas de los gránulos lisoso­
males pasan al interior del fagolisosoma y se
inician los procesos de digestión del material
fagocitado, que es consecuencia de la activa­
ción que ha experimentado el macrófago. D u­
rante este proceso hay un aumento de los re­
ceptores para Fe y C3b que esta célula expresa
en su membrana. Entre las hidrolasas lisosoma­
les que son liberadas durante la fagocitosis se
encuentran fosfatasas, ribonucleasas, desoxiri-
bonucleasas, proteasas, lipasas, glucosidasas y
esterasas. Ocurren aquí cambios en el metabo­
lismo celular caracterizados por mayor consu­
mo de oxígeno y glucosa, con acumulación de
ácido láctico y disminución del pH por aumen­
to de la glucólisis, hiperproducción de agua
oxigenada y de los llamados radicales de oxí­
geno (anión superóxido, oxígeno singlete, radi­
cal hidroxilo). Estos productos son marcada­
mente tóxicos para las bacterias y las matan en
pocos segundos. (Para otros aspectos de la fa­
gocitosis, véanse caps. 3 y 21.)
En casos particulares como las infecciones
virales, procesos citotóxicos mediados por cé­
lulas NK pueden constituir efectivos mecanis­
mos inespecíficos de defensa (véase cap. 3).
Las células NK, cuyo origen no está bien defi­
nido, presentan semejanzas con los linfocitos
T, de los que se diferencian por carecer de re­
ceptores para el antígeno. Su unión a las célu­
las “blanco” se hace por moléculas de adhe­
sión; de esa unión surge la formación de poros
en la m em brana de la célula im pactada y su
consecuente destrucción. Este daño celular está
mediado por moléculas de la familia de las po-
rinas o perforinas que funcionan de manera si­
milar al componente C9 del sistema com ple­
mento (véase cap. 22).
En la defensa inespecífica del huésped pue­
den participar también las llamadas proteínas
de la fase aguda, entre las que se encuentran la
proteína C reactiva, la cx2-macroglobulina y la
al-a n titrip sin a . En determinadas circunstan­
cias, estos componentes séricos normales pue­
den incrementarse grandemente y, a través de
diferentes mecanismos, amplificar las defensas
naturales contra la agresión exógena.
La inmunidad innata constituye, en realidad,
la etapa previa de la respuesta inmune específi­
ca, pues para que ésta se lleve a cabo se necesi­
ta la captación de los agresores por los macró­
fagos, su degradación y procesamiento en pe­
queños péptidos para su presentación adecuada
en la membrana celular, requisito indispensable
para su reconocim iento por los linfocitos T,
elem entos de la respuesta inm une adquirida
(véase cap. 2).
Otros productos inespecíficos de defensa son
los interferones (lEN). Son péptidos con activi­
dad antiviral que desempeñan un papel impor­
tante en la resistencia inespecífica a la infec­
ción; en un comienzo se supuso que era una
sustancia tínica elaborada espontáneamente co­
mo respuesta a una infección viral. En estos
momentos se sabe que a! menos hay tres enti­
dades distintas denominadas a , p y y, las que
no sólo funcionan como antivirales, sino que
también han demostrado un efecto antiprolife-
rativo y una participación activa en los meca­
nismos regulatorios de la respuesta inmune.
Si bien el interferón no es específico para el
virus inductor, presenta ciertas características
de especificidad con relación a las células res­
 Mecanismos de defensa contra la agresión
ponsables de su elaboración. Así, el interferón
logrado por inducción de un determinado virus
es eficaz contra cualquier otro tipo de infección
viral, pero únicamente protege a las células de
la especie animal de donde proviene. Ello se
debería a que su elaboración es patrimonio de
la información genética de la célula y no del vi­
rus; de ahí su especificidad para aquélla.
En condiciones normales, todas las células
somáticas son potenciahnente capaces de pro­
ducir interferón, pero sólo lo elaboran por esti­
mulaciones preferentemente virales. No es éste
el único mecanism o para inducir su produc­
ción; la inoculación de virus atenuados ARN,
polirribonucleótidos sintéticos de doble cadena
como poli Lpoli C y algunos extractos bacteria­
nos -entre otros- pueden resultar eficaces.
Hasta el momento se han identificado los in­
terferones a , P y y, que presentan diferencias
antigénicas y son sintetizados por poblaciones
celulares distintas. El IFN -a es producido por
leucocitos estimulados por virus y polirribonu­
cleótidos. Los mismos inductores, al actuar so­
bre fibroblastos, dan origen al INF-p. El IFNy
es producido por leucocitos estimulados por vi­
rus y polirribonucleótidos. Los linfocitos esti­
mulados con antígenos o mitógenos, producen
IFNy, de allí que se lo conozca también como
interferón inmune, que funciona como una lin­
foquina. Los tres interferones tienen pesos mo­
leculares próximos (18, 20, 21-24 kD) y están
constituidos por 189, 187 y 143aa, respectiva­
mente. Presentan diferencias antigénicas entre
ellos. (Para más información véase capítulo 12.)
Los genes que codifican para los tres interfe­
rones han sido clonados. Se han identificado 14
genes para el IFN -a, 2 a 5 para el IFN-p y 1
para el IFN-y. Este último no presenta homolo­
gía con los otros genes de IFN, pese a que co­
difica una proteína de tamaño similar en la que
ciertos aminoácidos ocupan las mismas p o si­
ciones en los IFN a y p. Los interferones a y P
son estables a pH 2 a 4“C y se mantienen acti­
vos en presencia de dodeciisulfato de sodio. El
IFN-y, en cambio, es sensible a ambos trata­
mientos. Los IFN P y y son glucoproteínas, no
así el IFN -a.
Se han aislado IFN de pesos moleculares su­
periores al indicado, lo cual podría deberse, en
parte, al hidrato de carbono acom pañante, a
que el IFN formara dímeros o a que se asociase
con otras proteínas no liberadas durante la puri­
ficación.
De todos los interferones, el a y el P son los
que han demostrado un efecto viral más mani­
fiesto, en tanto que el IFN-y, si bien conserva
esa actividad, funciona mejor como una linfo­
quina.
El IFN no actúa como un anticuerpo neutra­
lizando al virus; en una mezcla de virus e inter­
ferón, el primero conserva su poder infectivo.
El ácido nucleico viral al penetrar en una célula
com ienza a replicarse y es durante esta fase
cuando la célula, por algún tipo de información
recibida, reactiva el material genético conteni­
do en el ADN nuclear transcribiendo un m en­
saje en un ARNm, que se pone en contacto con
los ribosomas del citoplasma. La traducción de
ese mensaje significa la síntesis de la proteína
“interferón”. Cada especie animal elabora su
propio IFN, que abandona la célula productora,
destinada a morir por la infección viral. Por sí
solo es incapaz de salvar a una célula agredida,
pero resulta efectivo para la protección de célu­
las no invadidas.
En relación con la actividad antiviral, los
IFN interfieren en la formación de nuevos vi­
riones. No son proteínas que inhiben ¡a replica­
ción viral, sino que inducen a las células a sin­
tetizar las proteínas responsables del efecto an­
tiviral. Los interferones no penetran en las cé­
lulas; muy posiblemente interaccionen con un
receptor de la superficie de la célula y se expre­
sen vía un segundo mensajero. En apoyo de
ello está el hecho de cjue la inyección intracelu­
lar de INF no induce efecto antiviral.
El mecanismo básico de acción del IFN pa­
recería que está relacionado con la interferencia
a que moléculas de ARNm traduzcan m olécu­
las tempranas o progenitoras de la síntesis vi­
ral. Se ha demostrado que el IFN induce la sín­
tesis de proteínas celulares, algunas con activi­
dad enzimática. Una de ellas tiene capacidad
para convertir, en presencia de ARN de doble
cadena, al ATP en un oligo A particular, que a
su vez activaría una endorribonucleasa que hi-
drolizaría los ARNm virales, inhibiendo de este
modo la síntesis de proteínas estructurales del
virus. El IFN también inhibiría la síntesis pro­
teica en forma indirecta al inducir una protein­
quinasa que, en presencia de ARN de doble
cadena, fosforila el factor de elongación, inter­
firiendo de esta forma en el proceso de traduc­
ción. Ei IFN puede, además, potenciar la inhi­
bición de la síntesis proteica al in d u cir una
fosfodiesterasa, la que escinde las secuencias
term inales 3 ’ CCA del ARNt, im pidiendo la
unión del aminoácido. Si bien los mecanismos
descritos podrían explicar la interferencia de
los IFN en la síntesis de las proteínas v irales,,
existen todavía interrogantes que no han recibi­
do respuesta adecuada.
Elementos específicos de defensa
Si bien las barreras naturales y los m ecanis­
mos de la inmunidad innata son de valor ex­
traordinario para la defensa del huésped, sabe­
mos que, si se produjesen soluciones de conti­
nuidad u otras alteraciones, pueden d e ja r de
8 Aspectos básicos de la inmunidad
cumplir eficazmente su cometido. En esos ca­
sos, los agentes agresores, al penetrar y ejercer
su acción nociva sobre tejidos y órganos, pro­
ducen enfermedad. ¿Significa ello que cuando
los mecanismos naturales inespecíficos dejan
de actuar se han agotado nuestros medios de
lucha contra la agresión? En estos casos dispo­
nemos de quim ioterápicos y antibióticos que
pueden ser eficaces en algunas oportunidades;
pero podemos además crear mecanismos de­
fensivos específicos, los de la inmunidad, cuyo
estudio habremos de encarar.
Cuando un agente agresor real o potencial
(antígeno) penetra en un vertebrado adulto (pri­
mer estímulo), éste experim enta una serie de
modificaciones que determinan que su compor­
tamiento ulterior frente a nuevas penetraciones
del mismo antígeno pueda ser de naturaleza di­
ferente. Ello depende de las dosis antigénicas
empleadas en cada caso, del tiempo transcurri­
do entre el primer estímulo y los siguientes, de
la calidad de los anticuerpos específicos forma­
dos, de ciertos factores genéticos propios del
individuo, etc., todo lo cual configura modifi­
caciones de la sensibilidad. Si las reestim ula­
ciones antigénicas provocan en el huésped va­
riaciones cuantitativas de la sensibilidad (nor-
mosensibilidad o hiposensibilidad) con respec­
to a la acción directa que ejerce el antígeno, se
dice que hay inmunidad. El ejemplo clásico es
el de la inoculación de una toxina microbiana a
dosis subletales en un animal de experimenta­
ción. T ranscurrido cierto tiem po, el anim al
puede recibir dosis superiores sin sufrir trastor­
nos, lo que significa, desde el punto de vista
cuantitativo, que ha modificado su sensibilidad
para la toxina. El animal es inmune a la acción
tóxica.
Cuando las inoculaciones de antígenos pro­
ducen en el huésped modificaciones tales que
hacen que reaccione con cambios cualitativos
de la sensibihdad frente a la reinoculación del
mismo antígeno, se dice que hay alergia. Así
ocurre, por ejemplo, al inocular un cobayo con
100 mg de ovoalbúmina y reinocularlo tres se­
manas después, por vía endovenosa, con canti­
dades inferiores de antígeno. El animal reaccio­
na frente al segundo estímulo con una sensibili­
dad exagerada que puede llevarlo a la muerte
(choque anafiláctico). Es indudable que esa hi­
persensibilidad no es causada por el antígeno
en sí, ya que se le inocularon dosis menores
que las del primer estímulo. Ello se debe a la li­
beración de mediadores químicos como conse­
cuencia de la interacción del antígeno con sus
anticuerpos específicos fijados a células (mas­
tocitos). Esos mediadores modifican la sensibi­
lidad y ésta es de una calidad distinta a la pro­
vocada directam ente por el antígeno (véase
cuadro 1-1).
inmunidad. Conceptos generales;
mecanismos
El término “inmunidad” proviene del voca­
blo latino inmun (in privativo; munus, carga; o
sea privado de carga, privilegiado). Este voca­
blo se utilizaba en la época del hiiperio Roma­
no pai-a identificar a las personas eximidas del
pago de impuestos, beneficio que podía obte­
nerse por herencia o adquirirse mediante algu­
na acción particular que era prem iada por el
Estado. Pero desde el punto de vista médico, y
para no incurrir en confusiones, es necesario
determ inar exactam ente qué se entiende por
“inmunidad” . Se la considera como sinónimo
de resistencia y sirve para expresar la resultante
de dos sistemas opuestos, el agente invasor y
las reacciones del huésped invadido, resultante
que puede tener todos los valores, desde cero a
infinito. La inm unidad se caracteriza porque
como respuesta al estím ulo antigénico no se
desencadenan manifestaciones colaterales per­
judiciales para el huésped, cosa que en cambio
ocurre en la alergia. En un sentido más amplio,
y sobre la base de los conocimientos que ac­
tualmente se tienen sobre los fenómenos inm u­
nológicos, debe considerársela como la re s­
puesta de un huésped a un agente agresor real o
potencial y las consecuencias de ella derivadas.
Un vertebrado inmune posee ciertos elemen­
tos específicos que actúan sobre el antígeno o
agente agresor que les ha dado origen, neutrali­
zándolo o impidiendo un daño real o potencial
en el organismo. ¿Pero cómo y dónde se for­
man esos elem entos? ¿Por qué en un animal
sus componentes normales no expresan esa ac­
tividad? ¿En qué casos particulares y cóm o
pueden formarse productos que actúen contra
los propios componentes orgánicos dando lugar
a las llam adas enferm edades por autinm uni-
dad? ¿Cuál es la causa del rechazo de los injer­
tos homólogos y heterólogos? Si bien hasta no
hace mucho tiempo nuestra ignorancia al res­
pecto era grande, num erosos hechos experi­
mentales han facilitado su interpretación.
Tipos de inmunidad
Dijimos ya que los inmunes eran privilegia­
dos y que este privilegio podían tenerlo desde
el nacimiento -poseían por lo tanto una inmu­
nidad natural-, o conseguirlo ulteriormente -la
inmunidcid era en este caso adquirida- Desde
el punto de vista médico existen también esos
dos tipos de inmunidad.
Inmunidad natural
Si bien es poco lo que se sabe de ella, es un
hecho cierto que diferentes especies animales
 Mecanismos de defensa contra la agresión
Cuadro 1-1. Respuesta del huésped a su agente agresor
Huésped R eacción F enóm eno
Prim er estím ulo
M odificaciones
cuantitativas de la_ - Inm unidad
M odificación de sensibilidad (nor-
la capacidad raosensibilidad o
reactiva norm al hiposensibilidad)
Estím ulos
poste- —
riores
IVIodificaciones
cualitativas de la
sensibilidad A lergia
(hipersensibilidad)
presentan resistencia variada a la acción de los
distintos microorganismos o de sus toxinas. La
razón de ello puede residir en diferentes causas:
1) Factores genéticos y raciales. Existen nu­
merosos ejemplos que demuesti'an influencias
de ese tipo. Los animales carnívoros y las aves
son resistentes al carbunco; no ocurre así con
los hervíboros, que son sensibles aunque dentro
de ciertas limitaciones. Entre las ovejas, las de
raza europea son sensibles, mientras que las ar­
gelinas son resistentes a dicha infección.
Otro hecho curioso lo presenta el gonococo,
que, si bien enferma al hombre produciéndole
blenorragia, no tiene capacidad para infectar a
ninguno de ¡os anim ales de experim entación
normalmente utilizados.
Dentro del género humano hay factores ra­
ciales que confieren a los individuos distinta
resistencia. La raza negra, por ejemplo, es m u­
cho más sensible que ¡a blanca a la tuberculo­
sis y algunas enfermedades tropicales, e inclu ­
so dentro de la última, hay individuos más o
menos resistentes a diferentes m icroorganis­
mos.
2) Edad. Es otro factor que debe tenerse en
cuenta. El virus del sarampión, cuando infecta
al hombre, por regla general no deja secuelas,
pero si la infectada es una embarazada con me­
nos de tres meses de gestación el embrión pue­
de sufrir lesiones cardíacas graves, cataratas,
sordera. Fetos de mayor edad son resistentes.
Otro ejem plo lo tenemos en el Trypanosoma
Espontánea
A ctiva
Experim ental
Espontánea
Pasiva
E xperim ental
A doptiva I Experim ental
A c tiv a
A nafilaxia
P a s iv a
A nticuerpos
séricos fijos
A c tiv a
Inm ediata a células A topia
P a siv a
A nticuerpos Fenóm eno /Votivo
séricos circu ­ de A rthus
lantes P asiv o
, [c é lu la s esp ecífica m en -í Alergia tipo tuberculínico
K ctaiüaaa 4 sensibilizadas 1 „ , ,. ■■ , ,
[ Rechazo al nomoinjerto, etc.
cruzi que, si bien no infecta a la rata adulta, tie­
ne marcado poder infectivo sobre las crías lac­
tantes de menos de una semana de vida.
3) Influencias hormonales. Variaciones hor­
monales pueden producir modificaciones en la
resistencia a la infección por diferentes agentes
agresores. Los diabéticos son susceptibles a las
infecciones de piel, en especial la furunculosis;
tanto los hipotiroideos como los hipertiroideos
-y se suman quienes padecen de hipoadrenalis-
m o - poseen mayor susceptibilidad a la infec­
ción que los individuos normales.
4) Anticuerpos naturales. En algunos anim a­
les con marcada resistencia a distintos agentes
agresores se ha demostrado la existencia de an­
ticuerpos específicos similares a los formados
en el proceso inmunitario adquirido. Se obser­
va a veces que individuos que exhiben alta re­
sistencia a ciertas exotoxinas bacterianas tienen
en su sangre circulante antitoxinas similares a
las que aparecen en infectados o vacunados
contra ellas. Esto podría deberse a infecciones
subagudas que pasaron inadvertidas, pero que
han servido para dejar algún grado de resisten­
cia. Lo que resulta muy difícil de explicar es
que en determ inadas personas o anim ales se
encuentran anticuerpos contra numerosos m i­
croorganismos, lo que significaría, de acuerdo
con la concepción anterior, que han sufrido in­
fecciones m últiples, cosa un tanto difícil de
aceptar, sobre todo teniendo en cuenta que esos
anticuerpos han sido observados a veces en
anim ales refractarios a la acción de lo s m i­
1o Aspectos básicos de la inmunidad
croorganism os cuyos correspondientes an ti­
cuerpos contienen. Cuando se iiaga referencia a
la incidencia de las mutaciones somáticas en la
creación de diversificación en las inm unoglo­
bulinas (cap. 6) se podrá apreciar la posibilidad
de aparición de estos anticuerpos como conse­
cuencia de ese hecho.
Por hibridación de células de bazo de ratones
embrionarios con células de plasmocitom a se
han conseguido híbridos que sintetizan an ti­
cuerpos específicos de la clase IgM, de baja
afinidad. Dado que los embriones no fueron es­
timulados ni expuestos a antígenos extraños,
ello significa que en sus células de bazo ya
existía información para la síntesis de ciertos
tipos de anticuerpos, los que, dadas las circuns­
tancias expuestas, deben ser considerados co­
mo naturales.
Sea cual fuere el mecanismo que confiere la
inmunidad natural, es innegable que hay una
resistencia particular, natural o genética, que
hace que la resultante de la interacción de ese
sistema opuesto “agente invasor-huésped infec­
tado” se desplace totalmente hacia este tiltimo
lado y ese privilegio natural o inmunidad natu­
ral sea un hecho concreto.
Inm unidad adquirida
Es la que en realidad nos interesa, ya que se
trata de una lucha específica entre el agente in­
vasor y los anticuerpos y células sensibihzadas
por él originados. Puede ser de tres tipos: acti­
va, pasiva y adoptiva.
1) La inmunidad activa se divide a su vez en:
a) Adquirida espontáneamente
b) Provocada artificialmente
En la inmunidad activa adquirida espontá­
neam ente, las defensas específicas se co n si­
guen como consecuencia de la penetración en
el individuo de un agente invasor que lo enfer­
ma. No obstante, el huésped invadido consigue
activar las células del sistema inmune y elabo­
rar anticuerpos específicos, los que perm ane­
cen en el organismo aun mucho después de ha­
ber desaparecido el agente infectante.
La inm unidad activa provocada artificial­
mente se consigue mediante la inoculación de
antígenos, que pueden ser proteínas com ple­
jas, m icroorganism os vivos atenuados, m i­
croorganism os m uertos, o bien las toxinas
m ism as, pero m odificadas de modo tal que
conserven su capacidad antigénica aunque en
el proceso de modificación hayan perdido su
acción tóxica (toxoides). El huésped, ante es­
tos estímulos, responde como en el caso ante­
rior. La inmunidad es activa porque el infecta­
do o vacunado elabora sus propios elementos
defensivos y además es de larga duración por­
que - a pesar de que los anticuerpos elabora­
dos, como proteínas que son, se metabolizan y
eliminan por los emuntorios en un período no
superior al m e s- el aparato encargado de su
fo rm a ció n sig u e tra b a jan d o y re p o n ie n d o
constantemente, por un tiempo bastante largo,
los anticuerpos que van desapareciendo del
torrente circulatorio.
2) La inm unidad adquirida pasiva puede ser
también:
a) Espontánea (congénita)
b) Conferida artificialmente
La inmunidad adquirida en forma pasiva y
espontánea es la que tiene el recién nacido co­
mo consecuencia de su transferencia por la ma­
dre a través de la placenta o el calostro; en
cambio, la pasiva conferida artificialmente es
la que se consigue por inoculación de suero
proveniente de otros individuos o animales in­
munizados con anterioridad y en los cuales hay
un alto contenido de anticuerpos específicos.
Este tipo de inmunidad es de corta duración,
pues los anticuerpos son metabolizados como
todas las proteínas y eliminados por los emun­
torios a breve plazo, de modo que el estado in­
munitario termina con la desaparición de di­
chos anticuerpos por no estar estim ulado su
propio aparato formador.
La inmunización activa artificial provocada
por vacunación persigue el logro de una protec­
ción de larga duración para que actúe preventi­
vamente. Como las defensas en este caso tardan
un tiempo en aparecer, algo más de una semana,
la vacunación no puede ser utilizada como cura­
tiva. Se apelará entonces a la inmunización pa­
siva, mediante seroterapia o la administración
de inmunoglobulinas hiperinmunes, ya que esos
anticuerpos introducidos actuarán de inmediato,
neutralizando el agente mórbido o sus toxinas y
favoreciendo el restablecimiento.
3) Inmunidad adoptiva:
Es la que se consigue cuando se transfieren
células inm unológieam ente com petentes. Su
duración será distinta según que las células
transferidas sean isólogas, homólogas o heteró­
logas.
Mecanismo de la inmunidad antiinfecciosa
Cuando las bacterias se introducen directa­
mente en la sangre, gran parte de ellas son en­
globadas por los macrófagos e histiocitos fijos
del hígado, bazo, sinusoides venosos y en parte
son fagocitadas por los polim orfonucleares e
histiocitos de los pulm ones, donde floculan
 Mecanismos de defensa contra la agresión
parcialmente. Si las bacterias que han penetra­
do son avirulentas, este mecanismo las elimina
rápidamente, En el caso de bacterias de marca­
do poder patógeno, a esa primera eliminación
parcial le sigue una multiplicación exagerada
en el sitio donde se han localizado y sobreviene
como consecuencia una invasión al torrente
sanguíneo; del triunfo de la multiplicación so­
bre el mecanismo de la eliminación, o vicever­
sa, depende la infección.
La muerte del animal por septicemia aguda
se produce cuando esos mecanismos resultan
insuficientes.
Las bacterias que penetran por otras vías su­
fren un mecanismo de eliminación sim ilar al
anterior -n o tan intenso-, que depende funda­
mentalmente de la naturaleza del tejido donde
se han localizado. Si la inoculación es intrape­
ritoneal, la invasión al torrente sanguíneo es rá­
pida; lo es menos si la inoculación ha sido he­
cha por vía intram uscular y menos aun si se
inocula por vía subcutánea.
El pasaje de las bacterias desde el punto de
inoculación a la sangre se realiza siempre por
los linfáticos, y en la eliminación de los m i­
croorganismos invasores los macrófagos de los
ganglios linfáticos regionales desempeñan un
papel preponderante. Si las bacterias son aviru-
lantas o de virulencia relativa y penetran en al­
sanguíneo
Fig. 1-1. Esquem atización de los diferentes fenóm enos que pueden ocurrir cuando una bacteria penetra en un v erteb rad o
adulto. A, B acteriem ia, elim inación por fagocitosis. B, Infección aguda, septicem ia y m uerte. C, Infección m oderada, fo r­
m ación de anticuerpos, inm unidad.
11
gún tejido o zona donde el pasaje sanguíneo es
muy lento, la infección puede no llegar a la san­
gre y quedar en los ganglios, donde puede per­
manecer por mucho tiempo aunque el animal no
experimente reacciones que indiquen enferm e­
dad, En la eliminación de algunas bacterias par­
ticipan también, como ya se ha visto, sustancias
bactericidas elaboradas por el huésped, que ac­
túan por sí solas o formando parte de sistemas.
Hemos considerado hasta ahora el m ecanis­
mo por el cual son eliminadas hasta cierto pun­
to las bacterias que han penetrado en un animal
normal, pero ese mecanismo puede increm en­
tarse m ediante la inm unización esp ecífica a
partir de un cultivo muerto de dichos m icroor­
ganismos.
Un animal inmunizado activamente reaccio­
na frente a las bacterias como si éstas fueran
avirulentas o de virulencia muy escasa y logra
entonces que el equilibrio se desplace de modo
que los mecanismos de fagocitosis y de elim i­
nación predominen sobre los de penetración de
las bacterias e impidan la infección. Para con­
seguir este desplazamiento en el equilibrio pue­
de hacerse una inmunización activa, com o ya
hemos dicho, o en cambio inmunizarse pasiva­
m ente mediante la inoculación, en la m ayor
parte de los casos, de suero proveniente de ani­
m ales in m u n izad o s activ am en te. A d em á s,
Eliminación
12 Aspectos básicos de la inmunidad
cuando ha habido infección en un individuo no
inmunizado, en los períodos finales de la infec­
ción, y como consecuencia de la elaboración de
anticuerpos específicos contra el microorganis­
mo infectante, se crea un estado inm unitario
que hace que el proceso infeccioso pueda ser
vencido si no se debe a microorganismos m ar­
cadamente virulentos (fig. 1-1). Este es el me­
canismo más común de respuesta inmune a una
infección bacteriana; no obstante, en algunos
casos particulares, la inmunidad mediada por
células tiene participación activa.
El suero de los animales inoculados con do­
sis repetidas de toxina diftérica, tetánica u otras
exotoxinas, adquiere la propiedad de^ neutrali­
zarlas por formación de antitoxinas. Éstas, que
constituyen la base de la inmunidad antitóxica
considerada como el tipo más simple y sencillo
de inmunidad y que ejercen una acción neutra­
lizante específica sobre las exotoxinas, pueden
encontrarse en el suero del hom bre o de los
animales como consecuencia de procesos in­
fecciosos por bacilos toxigénicos, o por la ino­
culación experimental de toxinas o toxoides.
Además de estas antitoxinas originadas por un
proceso inmunitario activo, puede conseguirse
cierto título de las mismas en la sangre circu­
lante del hombre o animales de experim enta­
ción m ediante su inoculación bajo form a de
suero antitóxico. La inm unidad antitóxica es
simple, ya que se produce mediante la neutrali­
zación directa de la toxina por su respectiva an­
titoxina existente en el medio circulante, sin
que haya necesidad de que intervengan los ma­
crófagos y otros fagocitos indispensables para
la inmunidad antibacteriana.
Su mecanismo en nada depende del comple­
jo sistema de células que, en cambio, es funda­
mental en el caso de que la infección sea pro­
ducida exclusivamente por microorganismos y
no por sus toxinas. Un hecho muy característi­
co de la inmunidad anütóxica es que la concen­
tración de la antitoxina microbiana presente en
el torrente circulatorio es relativam ente baja;
así, en el caso de la difteria hay inm unidad
cuando la concentración de antitoxina circulan­
te, conseguida como consecuencia de una in­
munización activa, es alrededor de 0,01 U.A.
Esta pequeña cantidad de antitoxina sería sufi­
ciente para neutralizar la toxina originada en
una infección primaria. Si las cantidades de to­
xina rebasan la capacidad neutralizante de la
antitoxina la infección puede producirse, pero
es necesario hacer notar que en los individuos
inm unizados activam ente, a diferencia de lo
que pasa con los no inmunes, pequeños estím u­
los, conseguidos como consecuencia del nuevo
ingreso de toxina a los tejidos, hacen que rápi­
damente y con suma facilidad elaboren gran
cantidad de antitoxina y de este modo aumen­
ten enormemente las defensas específicas (véa­
se cap. 24).
Nuestros conocimientos sobre la inmunidad
antiviral no son tan claros como desearíamos;
no obstante sabemos que en la defensa contra
los virus los principales elementos de defensa
son los linfocitos citotóxicos. Es necesario te­
ner en cuenta una serie de factores que pueden
incidir en dicha inmunidad, factores que están
relacionados con la especie animal, la edad del
sujeto en experimentación, el tejido donde se
im planta el virus, la vía de inoculación. Un
ejemplo lo tenemos en el virus de la influenza,
que inoculado por vía subcutánea no infecta al
ratón pero, si en cambio es inoculado por vía
intranasal, sí le produce la típica neumonía vi­
ral al cabo de una semana.
El mecanismo de invasión viral y las opera­
ciones de limpieza llevadas a cabo por el ma-
croorganismo infectado son muy similares a lo
que ocurre en las infecciones bacterianas pero
no debemos olvidar cuál es la estructura y me­
tabolismo de los virus y su exclusiva prolifera­
ción en las células del huésped.
Lo que sí es evidente es que, cuando se ino­
culan por las vías que corresponden suspensio­
nes de virus atenuados, o en los casos de infec­
ciones virales por enfermedad, se consigue una
inmunización activa de largo plazo, muchas ve­
ces de por vida, mucho más eficaz que la inmu­
nidad bacteriana. Es también evidente que me­
diante la inoculación de esos virus atenuados a
animales adecuados puede conseguirse la pre­
paración de sueros antivirus para ser emplea­
dos eficazm ente en la inm unización pasiva
(véase cap. 27).
In m u n id ad local
Desde hace mucho tiempo se sospechaba la
existencia de un estado inmunitario local, en
cierto modo independiente de la inm unidad
general, pero sólo en los últimos tiempos, con
el descubrimiento de los anticuerpos citofílicos
y la inm unoglobulina IgA secretoria (véase
cap. 5) se ha logrado una explicación convin­
cente.
Sabemos que en el hombre y ios animales
existen diferentes clases de inmunoglobulinas
que pueden tener especificidad para un mismo
determinante antigénico; tenemos conocimien­
to también de que los anticuerpos, como con­
secuencia de modificaciones en sus estructu­
ras, pueden variar en su comportamiento bio­
lógico. Algunos de ellos tienen capacidad para
fijarse a células, en especial a macrófagos: son
los anticuerpos “citofílicos” y se caracterizan
porque al fijarse a receptores celulares del ma­
crófago lo “arm an” con anticuerpos específi­
cos capaces de fijar al antígeno. El armado de
 Mecanismos de defensa contra la agresión
los macrófagos con anticuerpos citofílicos, vía
receptor para Fe, puede ocurrir en el curso de
una infección, en la zona inflamada donde se
ha originado el proceso o en los nódulos linfá­
ticos, por contacto de los macrófagos con célu­
las form adoras de anticuerpos o anticuerpos
circulantes. Los macrófagos armados pueden,
regionalmente o a distancia de la infección ini­
cial, posibilitar la fagocitosis del antígeno por
fijación previa a su membrana, lo que favorece
su endocitosis, o facilitar su destrucción por un
mecanismo no fagocítico. No caben dudas de
que los m acrófagos que tienen fijados an ti­
cuerpos citofílicos deben desempeñar un papel
im portante en la inm unidad local contra los
agentes agresores externos.
Bl hecho que ha contribuido a una m ejor
comprensión de la inmunidad local ha sido el
d escubrim iento de que la inm unoglobulina
IgA, que se encuentra en el torrente sanguíneo
en pequeñas cantidades, está presente en con­
centraciones relativamente altas en el calostro,
sahva, lágrimas, secreción bronquial e intesti­
nal. En todas estas secreciones, la IgA no res­
ponde a su estructura normal, sino que adquie­
re una estructura dimérica asociada a un com ­
ponente “S” o secretorio, diferente de los pép­
tidos constitutivos de las inm unoglobulinas,
elaborados por las células epiteliales glandula­
res y que le confiere al anticuerpo resistencia a
la acción de las enzim as proteolíticas. Esta
IgA es de origen local y está elaborada por las
células formadoras de anticuerpos ubicadas su-
bepitelialm ente en las glándulas m ucosas y
membranas. Es de singular importancia en la
13
regulación de la inmunidad local, por su parti­
cipación en la defensa de las membranas y ca­
vidades abiertas contra los agentes de la agre­
sión (véanse caps. 5 y 17).
B IB L IO G R A FIA
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La respuesta inmune
RICARDO MARGNI
En el capítulo 1, al discutir los mecanismos
de la defensa contra la agresión de patógenos
reales o potenciales, se enfatizaba que en todos
los vertebrados adultos podía activarse un sis­
tema de reconocimiento específico del agente
agresor, conocido como sistema inmune. A fi­
nes del siglo pasado y en los comienzos de esta
centuria, se discutió vivamente si ese mecanis­
mo era mediado por moléculas o por células,
siendo activos defensores de estas postulacio­
nes Ehrlich y Metchnicoff. Este último sostenía
que la defensa inmune era ejercida por los m a­
crófagos, los que al fagocitar las bacterias por
un proceso similar al que ocurre con las partí­
culas inertes, aseguraban su destrucción. Ehr­
lich, en cambio, consideraba que las células
elaboraban receptores específicos en sus mem­
branas los que, luego eran liberados al plasma
circulante, y que esas moléculas eran las que
neutralizaban al antígeno o agente agresor.
Entre los años 1930 y 1960, especialmente
en lo que a respuesta humoral se refiere, dos ti­
pos de teorías fueron expuestas. Las instructi­
vas postulaban que el antígeno inoculado, ac­
tuando como molde o matriz, interfería en la
conformación de la gamma globulina que nor­
malmente se sintetizaba, haciendo que su es­
tructura fuese complementaria de la del antíge­
no. Las otras teorías, denominadas selectivas,
consideraban que el antígeno no influía sobre
el tipo de anticuerpo que habría de formarse,
sino que aquél seleccionaba y estim ulaba las
células que elaboran el anticuerpo específico,
para lo que estaban programadas desde el naci­
miento.
Con el correr del tiempo los conceptos han
ido cambiando, en gran parte se han integrado
y actualmente sabemos que el sistema inmune
está formado por dos grupos fundamentales de
2
células. Por un lado macrófagos y células simi­
lares que actuando en forma inespecífica parti­
cipan, de la captación del antígeno, su procesa­
miento y presentación para el reconocimiento
por los linfocitos, células con actividad especí­
fica. Algunas estirpes de estas células sólo son
capaces de reconocer al antígeno por contacto
directo, cuando les es presentado por el macró­
fago en forma adecuada; otras secretan molécu­
las denominadas anticuerpos, poseedoras de es­
tructuras especiales, que pueden unirse al antí­
geno específicam ente y neutralizar su efecto
agresor. A las células capaces de interaccionar
específicamente con el antígeno o de secretar
moléculas que puedan hacerlo se las denomina
inmunocompetentes, y a las que participan en
otras etapas de la respuesta inmune células ac­
cesorias.
En el hombre y demás vertebrados normal­
mente existen estas células, de modo que ten­
gan asegurada la posibilidad de poner en mar­
chados mecanismos de defensa específica con­
tra los agentes patógenos, agresores reales o
potenciales. ¿De dónde provienen esas células?
¿Cómo se originan y adquieren capacidad para
el reconocimiento específico? ¿Cómo es ese re­
conocim iento y cuáles son los m ecanism os
efectores? ¿Las células inm unocom petentes
constituyen una única estirpe celular o hay va­
rios tipos de ellas con funciones distintas?
Células indiferenciadas multipotentes
Las células del sistema inmune se originan
durante la hematopoyesis, proceso por el cual a
partir de eélulas indiferenciadas multipotentes
o “stem cells” y en función del microambiente
que las rodea, estas células pueden diferenciar­
se en distintas líneas celulares: mieloide, linfoi-

de, eritroblastoide, monocitoide, megacarioci-
toide. Aquellas células de la serie linfoide ori­
ginadas durante este proceso constituyen el
componente celular específico del sistema in­
mune (fig. 2-1).
Al comienzo del desarrollo embrionario las
primitivas células indiferenciadas desarrollan a
partir del m esénquim a; a m edida que el em ­
brión evoluciona se las encuentra en el saco vi-
telino, hígado fetal, bazo y médula ósea, lugar
éste donde perduran durante la vida extrauteri­
na. Durante el desaiTollo óseo las células me-
senqui males se localizan en el área subendos-
tal, surgiendo por un lado los osteoblastos y os­
teoclastos y por el otro las células indiferencia-
das o “stem cells” pluripotentes. Estas células
se dividen dando células hijas, algunas de las
cuales retienen sus características subsistiendo
com o células in diferen ciad as, en tanto que
otras se diferencian en las distintas líneas celu­
lares del sistema hematopoyético. Se han en ­
contrado “stem cells” con capacidad de desa­
rrollo más limitado dentro del linaje de las cé­
lulas sanguíneas. Así, algunas de ellas sólo son
Progenitor eritroide
F ig. 2-1. G eneración de células hem atopoyéticas a partir de una célula indiferenciada o “stem ceU" pluripotente. C 'FU:
unidad form adora de colonias; G M -CSF: factor estim ulante de colonias d e monocitos; G -CSF: factor estim ulante d e ca o lo - .
nias de granulocitos; 11.-1, lL -3, lL-7: interleuquinas ), 3 y 7.
La respuesta inmune 15
capaces de diferenciarse en células mieloides, o
células linfoides, o células eritroides.
Segtin el microambiente que las rodee, y su
posibilidad de interaccionar con matrices celu­
lares como hialuronato, otras moléculas pro tei­
cas de membranas celulares y moléculas libres
del tipo de las interleuquinas, especialm ente
IL-7, una célula indiferenciada podrá derivar
en una determ inada línea celular del sistem a
hematopoyético. Todo ello tiene lugar por in­
teracciones proteína-proteína, jugando un p a ­
pel muy importante en este mecanismo la m o­
lécula CD44, uno de los constituyentes de los
“elu ster” o grupos de diferenciación (v éase
cap. 11) y el ácido hialurónico. CD44 es una
proteína trasm em bránica, cuyo gen tíene 20
exones IO de los cuales pueden ser ensam bla­
dos en forma alternativa, originando isoformas
cuyo dom ino extracelular expresa diferentes
aminoácidos insertados en la forma estandard
de la proteína, lo que hace que se pueda un ir a
diferentes ligandos, hecho regulado por el m i­
croambiente en el que prolifera. En embriones
de ratón la molécula CD44 es deteetable cu an ­
Antiouerpos
Y A
AA
16 Aspectos básicos de la inmunidad
do se desarrolla el mesodermo y endodermo y
cuando ocurren las migraciones celulares, per­
mitiendo de este modo, según el sitio de reca­
lada, las diferenciaciones de las “stem cells” .
Mediante el uso de anticuerpos monoclonales
específicos esta molécula ha sido detectada en
las células indiferenciadas, en progenitores de
la serie linfoide y en las células que penetran
al timo y son inducidas a diferenciarse en ti­
mocitos.
Otras moléculas que juegan un rol importan­
te en la fijación y migración de estas células en
su entorno son los componentes de la familia
de las integrinas (véase cap. 12), glucoproteí­
nas constituyentes de los receptores de adhe­
sión. Isoform as de una de ellas, la proteína
VLA, pueden actuar como receptores para la-
minina, fibronectina y colágeno. Las integri­
nas, de las que se han identificado 20 formas
distintas, son heterodímeros formados por las
cadenas peptídicas a y (3 no covalentem ente
unidas; de éstas se conocen 14 y 8 cadenas di­
ferentes, respectivam ente. V arias isoform as
son originadas por empalmes alternativos de
exones ocurridos a nivel génico y algunas mo­
dificaciones postraduccionales. Estas integrinas
parecen desempeñar un papel importante, fun­
cionando como verdaderas señales durante la
migración celular a distintos órganos y tejidos.
Linfocitos
A partir de estas células indiferenciadas deri­
van las distintas estirpes de linfocitos o células
inmunológieamente competentes. En los mamí­
feros, entre el 0,5% y 10% de las células pro­
ducidas diariamente son linfocitos, muchos de
los cuales mueren en pocos días, mientras que
algunos se mantienen como células de larga vi­
da (células con memoria).
Existen poblaciones de linfocitos funcional-
mente distintas, hecho relacionado con el órga­
no linfoide primario en el que han adquirido
competencia inmunológica. Entre estas células,
los linfocitos B (LB) son los productores de an­
ticuerpos o inmunoglobiilinas; los linfocitos T
(LT), en cambio, carecen de esa propiedad. Los
LT pueden ser “efectores” como los LT citotó­
xicos (Te) o citolíticos (CTL) que matan y des­
truyen aquellas células “blanco” que expresan
epitopes extraños en su superficie, o “regulado­
res” como los linfocitos T cooperadores o “hel-
per” (Th) que ayudan a los LB y Te a cumplir
su función eficientemente. Si bien con frecuen­
cia se hace mención de una población de linfo­
citos T reguladores, capaces de expresar una
función supresora (Ts), contraria a la desarro­
llada por los Th, hasta el momento no se ha po­
dido aislar ningún clon de células linfoides que
expresen exclusivamente tal función. Los me­
canismos de supresión existen en una respuesta
inmune, y es muy probable que los mismos es­
tén regulados a nivel molecular por interaccio­
nes mediadas por moléculas sintetizadas por
las otras estirpes linfoides conocidas.
Los linfocitos T y B no son diferenciables
morfológica ni tintorialmente; no obstante ello
puede hacerse a través de la detección, median­
te el uso de anticuerpos monoclonales específi­
cos, de los marcadores de membrana propios
que cada uno de ellos expresa. A las células
linfoides que no poseen los marcadores clási­
cos de membrana se las denomina linfocitos T
nulos o TO.
Si una célula indiferenciada, inmunológica-
mente incompetente, adquiere competencia in­
munológica en el ambiente de la bursa de Fa-
bricius (aves) u otros órganos linfoides prima­
rios de otros vertebrados (médula ósea, placas
de Peyer, amígdalas, apéndice cecal), la célula
resultante será un linfocito B. Si lo hace en el
ambiente del timo, el producto de diferencia­
ción será un linfocito T. El contacto de estas
células con células epiteliales de los órganos
linfoides primarios, bursa o bursa símilis y del
timo, inducen programas de expresión de genes
que serán específicos para los linfocitos B o los
linfocitos T, respectivamente. Dicha expresión
tiene lugar a lo largo de la diferenciación que
experimentan estas células hasta lograr la com­
petencia inmunológica y su funcionalidad, por
lo que la identificación de determinados marca­
dores de membrana permitirá, en cada una de
estas líneas celulares, establecer el grado de
madurez adquirido.
Linfocitos B: características y ontogenia
Durante el proceso de diferenciación los lin­
focitos B evolucionan, a partir de una “stem
cell”, en célula “Pro-B” o precursor B inmadu­
ro, célula “Pre-B” , linfocito B inmaduro y lin­
focito B maduro, el que a su vez puede diferen­
ciarse en célula plasmática. En los diferentes
estadios aparecen en la membrana celular pro­
teínas específicas o marcadores, algunos de los
cuales perduran durante la mayor parte de la
evolución y otros son propios de distintos esta­
dios celulares.
La célula Pro-B se caracteriza por expresar
en su superficie marcadores típicos del linaje
B, pero no sintetiza ninguna de las cadenas
constitutivas de inmunoglobulinas. En este es­
tadio de diferenciación sólo se produce el rea­
rreglo de los genes D^,, Jj_, y V,_, (véase cap. 6).
La enzima deoxinucleotidil transferasa termi­
nal (TdT) está presente en el núcleo de los pri­
meros progenitores de los linfocitos B y T y
tiene un papel importante en la creación de di­
versificación, ya que su función es catalizar la

incorporación al azar de nucleótidos en extre­
mos expuestos de ADN. Ello lleva a la inser­
ción de residuos de origen no germinal durante
ei rearreglo de los genes D,.,, y Vj^, aumen­
tando la diversificación del sitio de combina­
ción de la molécula anticuerpo, especialmente
a nivel de CDR3 (tercera zona de hipervariabi­
lidad de las cadenas H). Esta enzima constituye
un excelente marcador del estadio inicial de di­
ferenciación de los linfocitos B y T, ya que en
el estadio siguiente esta enzima no se expresa.
Los antígenos del Complejo Mayor de H is­
tocompatibilidad llamados HLA-DR son molé­
culas que se expresan en los linfocitos B desde
los comienzos de su diferenciación y perduran
durante todo el linaje de las células B, dejando
de hacerlo en los plasmocitos. Estos antígenos
son fundamentales para la expresión en mem ­
brana de los péptidos antigénicos que habrá de
reconocer el linfocito Th para ejercer su efecto
cooperativo (véase más adelante).
Las moléculas CDl 9 y CD24 son marcado­
res que se expresan en las eélulas Pro-B. El pri­
mero de ellos se conserva hasta en el linfocito
B activado, mientras que CD24 se pierde du­
rante la activación.
Las células Pre-B expresan CDIO, una endo-
peptidasa neutra, y C D l9, glucoproteína trans­
membránica que puede asociarse no covalente­
mente con los componentes del complejo que
constituye el receptor antigénico del linfocito
B. CD20 y CD22 comienzan a expresarse tam ­
bién en este estadio, perdurando el primero en
los linfocitos B activados, lo que no ocurre con
CD22. E stu d io s estru ctu rales sugieren que
CD20 podría ser un canal iónico que funciona­
ría durante la activación celular. Otra proteína
detectada en los progenitores iniciales de la di­
ferenciación es CD34, con una estructura pare­
cida a la mucina y que funcionaría como m olé­
cula de adhesión por un mecanismo similar al
de las leetinas.
Una molécula del linaje B maduro es CD21,
que muestra baja afinidad por el componente
del complemento C3d y constituye el receptor
del virus Epstein-Barr, productor de la mono-
nucleosis infecciosa y el linfoma de Burkitt. La
molécula CD21 se pierde durante la activación
linfocitaria.
El marcador típico del linfocito B es su re­
ceptor antigénico, el que está constituido por
una molécula monomérica de inmunoglobulina
de la clase IgM í(|0.k)2 o (jAA-jj], idéntica al anti­
cuerpo que habrá de secretar luego la corres-
poncüente célula plasmática (véase cap. 5). El
reordenamiento de los genes que dirigen la sín­
tesis de las cadenas pesadas (fj.) constitutivas de
la IgM tiene lugar en el estadio Pro-B. El pri­
mer hecho suele ser la aproximación de un seg­
mento Dy (“diversity”) del gen de cadena pesa­
La respuesta inmune 17
da a un segmento J¡_, (“joining”), produciéndose
un rearreglo Dj^/Jj_,, el que a su vez se une a uno
de los varios segmentos VH (“variable”), origi­
nando VjyDj.,Jj.j. En el hombre esto ocurre en
uno de los cromosomas 14. Si se logra ensam ­
blar un gen activo que codificará para el seg ­
mento variable de la cadena, el otro haplotipo
de cadena pesada presente en el otro crom oso­
ma 14 permanece sin cambios o reordenamien­
tos (en configuración germinal). Si en el prim er
intento no se logra ensam blar un gen activo
(recombinación abortiva), se procede a reorde-
nar los genes de cadena pesada del otro crom o­
soma. No se conocen las señales que regulan
estos hechos, pero ellos explican el fenómeno
de exclusión alélica.
Las células Pre-B tienen reordenados su ge­
nes para la síntesis de cadenas |Li, las cadenas H
o pesadas de IgM, pero no han adquirido aún la
capacidad de expresar las cadenas livianas K o
X. Simultáneamente aparecen cadenas |Li en el
citoplasma. En este estado se expresan dos ge­
nes adicionales, X5 y VpreB, y sus productos ca­
dena (X) (omega, 18 kDa) y cadena t (iota, 14
kD a), constituyen la denom inada cad en a L
“su stitu ía ” o “pseudo” cadena L que p u ed e
combinarse con una cadena naciente y expre­
sarse en la membrana celular. Se ha demostrado
que la cadena se une covalentemente al produc­
to del gen X5 (cadena (o) y se asocia no cova­
lentemente al producto del gen Vp„B (cadena i).
Los genes X5 y VpreB tienen secuencias hom olo­
gas con las cadenas ^ y no han experimentado
rearreglos antes de su expresión. Parecería que
la función que cumple esta asociación, que no
tiene actividad de receptor de antígeno, es la de
facilitar interacciones del linfocito Pre-B con
células estromales y otros componentes del m i­
croam biente de la médula ósea. No obstante,
estudios recientes parecen demostrar que la ex­
presión de cadenas ja en la superficie celular es
condición indispensable para que tenga lugar la
expresión de cadenas livianas.
En este estado de diferenciación se expresan
también otros dos genes relacionados con el re­
ceptor B. Son los identificados en el ratón como
mb-1 y B29, cuyos productos de expresión, las
proteínas Ig a e ígP, asociadas a la IgMm cons­
tituyen el complejo que funciona como receptor
antigénico del hnfocito B (véase cap. 11).
Las células proceden luego a reordenar los
genes de cadenas livianas (V^^ y Jj^). A parente­
mente el orden de los sucesos no ocurre al azar,
sino que se observa un orden jerárquico. Se co­
mienza con la familia k (kappa) en un crom o­
soma 2; si el suceso es exitoso, el otro haploti­
po k y ambos cromosomas 22 que llevan 1a fa­
milia X (lambda) se conservan en configuración
germinal. Si el primer intento X resulta aborti­
vo, se procede a reordenar el segundo haplotipo
18 Aspectos básicos de la Inmunidad

K, manteniendo X en configuración germinal. Si baja afinidad para IgE, es un marcador exclusi­

este intento también falla, recién se procede a
utilizar la familia X, intentando primero uno de
los dos alelos. La preferencia en la utilización
de cadena liviana K puede tener que ver con la
mayor posibilidad de diversidad que ofrece este
sistema respecto del X y se refleja en las inmu­
noglobulinas circulantes: en el ratón el 95% de
los anticuerpos poseen cadenas liv ian as K,
mientras que en humano el 60% utiliza k . Ello
es consecuencia de que en el ratón existen apro­
ximadamente 250 genes Vk, en tanto que hay
solo dos genes YX, mientras que en el hombre
esos valores son 50 y 30, respectivamente.
Finalmente, una vez que la cadena liviana se
transcribe y se traduce, en el citoplasma se une
a la cadena pesada para ensamlslar una IgM
monomérica que se expresará en la membrana
celular (IgMm). A continuación por empalme
(“splicing”) alternativo del pre-ARNm, las cé­
lulas sintetizan en form a sim ultánea cadenas
pesadas p. y 5 y expresan en la superficie IgM e
IgD. Todos los hechos descritos en el proceso
de diferenciación de los linfocitos B ocurren en
alrededor de tres días.
A partir de aquí la célula está madura y mi­
gra hacia los órganos linfoides secundarios.
Luego de la activación antigénica las células
dejan de expresar IgM e IgD de superficie y
pasan a secretar IgM. El CD23, un receptor de
vo de este estadio de activación del linfocito B.
La característica fundamental del receptor de
los hnfocitos B es su capacidad para reconocer
antígenos en solución, sin necesidad de inter­
mediarios. En la membrana celular se encuen­
tran asociadas a la IgM las cadenas peptídicas
Ig a e IgP, las que tienen una activa participa­
ción en los mecanismos de transducción de se­
ñales al interior de la célula cuando el receptor
antigénico del LB interacciona con el antígeno.
Los linfocitos B experim entan durante su
evolución un proceso que los lleva a la no reac­
tividad contra los antígenos propios. Ello ocu­
rre en los primeros estadios de la diferencia­
ción, donde los contactos prematuros con esos
antígenos pueden inducir anergia, deleción clo­
nal y muerte celular.
Los linfocitos B maduros se localizan en di­
ferentes órganos linfoides secundarios, pasando
a formar parte de la población de linfocitos B
recirculantes, los que están en condiciones de
responder a un estímulo antigénico. El 20% de
estas células se encuentran en sangre periférica;
el 70%, repartido aproximadamente en partes
iguales, en el bazo, zona fohcular de los gan­
glios linfáticos y conducto torácico; el resto en
médula ósea y amígdalas.
La figura 2-2 esquematiza los distintos esta­
dios de diferenciación y los marcadores celula­

Célula B Y
con memoria

Anticuerpos

Célula Célula Pro-B Célula Pre-B Célula

indiferenciada (Precursor inmaduro) plasmática

TdT (-h-H-t) HLA-DR {++++) HLA-DR (++++) HLA-DR (++++) CD38 (-t-t)
HLA-DR (+) CD10 (+-H-H-) CD10 (-H-+H-) CD19 (-t-t-H-) CD78 {+++)
CD10 (-I-) CD19 (-t-t-i-H-) GD19 (-I--I-+-!-) GD20 {+++) (i en citoplas­
CD19 {+++) CD20 {++++) GD20 (++++) CD23 (+-H--F) ma (-H--H-)
CD24 (-I--H-) GD24 (-i-f++) GD24 ^++-1-) GD72 (++++) Genes H reor­
CD72 {++) CD22 (+++) GD22 (+++) GD78 (+++) denados (-H--I-I-)
Genes H reor­ CD72 (-t-h+-t) GD72 (-H--H-) IgM sup (+-I-+H-) Genes L reor­
denados (-H-h) CD78 {++) GD78 {+++) Genes H reor­ denados (-H--H-)
|i en citoplas­ IgM sup (-r-H-t) denados (-H--H-)
ma (-)-i-++) IgD sup (-(-+-M-) Genes L reor­
Genes H reor­ Genes H reorde­ denados (-H--H-)
denados (-H--H-) nados (-t-t++)
Genes L, inicia­ Genes L reorde­
ción reordena­ nados {++++)
miento (-t-t)

Fig. 2-2. Evolución y expresión de m arcadores durante el proceso de diferenciación por los com ponentes celulares de la
línea de linfocitos B.
 La respuesta inmune 19

res que identifican a las células de linaje B. Por
inm unofluorescencia indirecta y usando anti­
cuerpos m onoclonales específicos para cada
marcador, se los puede poner en evidencia. Por
el mismo procedim iento, usando suero an ti­
gamma globulina, puede detectarse en los lin­
focitos B su receptor antigénico (véase cap. 3).
Linfocitos T: características y ontogenia
Las células indiferenciadas que migran al ti­
mo encuentran el microambiente para su dife­
renciación en linfocitos T. Estas células pueden
participar en ciertos mecanismos inm unológi­
cos como el rechazo de injertos, reacciones de
hipersensibilidad retardada, reacciones de in­
jerto contra huésped, defensa contra virus y cé­
lulas tumorales, o en procesos de regulación de
la respuesta inmune. Las células que entran al
timo provienen de la médula ósea y son TdT" y
HLA-DR+. Este último marcador se pierde in­
mediatamente. En el microambiente del timo,
como consecuencia del entorno y la influencia
de productos de naturaleza peptídica (timosina,
etc), la célula indiferenciada comienza a dife­
renciarse. Los primeros cambios ocurren en la
zona cortical del timo; estos timocitos inm adu­
ros (protim ocitos) expresan los m arcadores
CD2 y CD7, y posteriormente CD5 (tim ocito
inmaduro). En esta etapa los timocitos com ien­
zan a reordenar los genes que codifican para el
receptor antigénico, un heterodímero form ado

TIMO

dula

T dT

SANGRE
CIRCULANTE

F ig. 2-3. D iferenciación de los linfocitos T. La p rim era etapa ocurre en la corteza del tim o, continuando luego en la zona
m edular. D urante este pasaje los linfocitos experim entan estadios de diferenciación caracterizados por la ap a rició n en
m em brana de diferentes m arcadores antigénicos. F inalm ente se separan en dos grupos, los que expresan los m arcadores
CD4 y C D 8, respectivam ente. A lcanzado ese grado de diferenciación los tim ocitos se vuelcan al torrente linfático y san­
guíneo y constituyen las poblaciones de linfocito T que expresan CD 4 (T H I y TFI2) y CDS (Te).
20 Aspectos básicos de la inmunidad
por dos cadenas peptídicas, a/|3 o X/b, unidas
covalentemente (véase cap. 7). Los genes que
se reordenan primero son los T[3 y Ty. Reorde­
nados los genes, com ienza a expresarse en
ARNm. La etapa siguiente de maduración tiene
lugar en la zona m edular del tim o (tim ocito
“común”), y en su inicio incorporan nuevos an­
tígenos y marcadores de membrana: C D l, CD4
y CD8. La denominación de timocito “común”
proviene de que estas células expresan ambos
marcadores CD4 y CD8. Dentro de la zona me­
dular, en una etapa posterior de diferenciación,
los LT pierden C Dl e incorporan el antígeno
CD3, asociado al receptor antigénico, pero las
células ya se diferencian en dos grupos: el que
expresa CD4 y el que expresa CD8, marcado­
res de los linfocitos Th y Te respectivamente.
Además se reordenan y expresan los genes T a
(véase cap. 7). Teniendo en cuenta varias simi­
litudes en el desarrollo entre los linfocitos B y
T, es de esperar que una cadena “a sustituta”
juegue en el linfocito T un papel similar al ejer­
cido por la cadena “L sustituta” en el linfocito
B. En ratones CD3+CD4"CD8" deficientes en
cadenas a , se han encontrado timocitos grandes
que expresan cadenas |3 asociados, vía puente
d isulfuro, a una glucopro teín a denom inada
gp33, cuyo gen ha sido clonado. Éste codifica
una proteína con un dominio extracelular, una
porción transmembránica que contiene dos re­
siduos polares idénticos a los de la cadena a , y
una porción citoplasmática. En las cadenas a
normales estos dos residuos son necesarios pa­
ra el ensam blado y transporte del com plejo
C D 3.TcR ap. Por este motivo a la gp33 se la
denomina “cadena a sustituta” del pre-receptor
T (pTa), la que tendría un papel similar al de la
“cadena L sustituta” codificada por los genes
A.5 y VpjeB. El receptor del linfocito T sólo reco­
noce péptidos antigénicos provenientes del pro­
cesado, por las células presentadoras: a) de an­
tígenos endógenamente sintetizados (proteínas
virales, antígenos tum orales), expresados en
membranas celulares y asociados a antígenos
del Complejo M ayor de H istocom patibilidad
(CMH) clase I (linfocitos Te), o b) de antíge­
nos extraños y asociados al CMH clase II (lin­
focito Th). Esto constituye una restricción del
reconocimiento antigénico por los componen­
tes del CM H clase I, para los linfocitos Te,
efectores y del CMH clase II, para los linfoci­
tos Th, reguladores (véase cap. 7).
Cuando los timocitos completan su madura­
ción se vuelcan al torrente sanguíneo como lin­
focitos T maduros, que expresan en membrana
como m arcadores más representativos CD2,
CD3, CD4, CD5, CD7 (Th) y CD2, CD3, CD5,
CD7, CD8 (Te) (fíg. 2-3).
CD2 es el responsable de la formación de ro­
setas que tiene lugar cuando se mezclan linfo­
citos T y glóbulos rojos de carnero, reacción
que durante cierto tiempo fue considerada co­
mo una de las más efectivas en la identifica­
ción de esta estirpe de Hnfocitos. El adveni­
miento de los anticuerpos monoclonales y la
identificación de diferentes moléculas CD, le
han quitado primacía a las llamadas rosetas E.
Los linfocitos Th que expresan CD4 se dife­
rencian en dos grupos, TH l y TE12. El primero
de ellos sintetiza IL-2 e lEN-y y normalmente
son los responsables de las reacciones de hiper­
sensibilidad tardía (véase cap. 16). Los TH2,
que sintetizan IL-4, IL-5 e IL-10, son los que
ejercen el efecto cooperativo. A aquellos linfo­
citos que sintetizan las interleuquinas produci­
das por am bos grupos (T H l + TH2) se los
identifica como THO.
Los linfocitos CD8+, citotóxicos, secretan IL-
10 e lEN-y, y ejercen un efecto supresor sobre
los T H l y la síntesis de inmunoglobulina IgE.
Un efecto similar, a través de la IL-10 que se­
cretan, ejercen los TH2 sobre la población T H l.
La IL-10 secretada regula a su vez la actividad
de las células CD8+, lo que demuestra que estas
células pueden ejercer un efecto supresorio a
través de moléculas que ellas elaboran, y que la
IL-10, por otra parte, tiene un efecto regulatorio
en la proliferación de células T. Estos datos
confirmarían la suposición de la inexistencia de
una estirpe única de linfocitos T (Ts) responsa­
ble de los fenómenos de supresión que ocurren
durante una respuesta inmune.
En los linfocitos maduros ya está predeter­
minado cuál va a ser el elemento restrictivo pa­
ra el reconocimiento antigénico (CMH clase I o
II). Esta cualidad no es heredada, se la adquiere
durante la maduración linfocitaria. Los linfoci­
tos T han aprendido este reconocimiento parti­
cular durante su evolución en el timo, habiendo
experimentado en primer lugar una selección
positiva y luego una selección negativa. Duran­
te la primera sólo han sobrevivido aquellos ti­
mocitos inmaduros que reconocen a los antíge­
nos del CMH de clase I o de clase II propios
expresados en el epitelio tímico, y durante el
proceso de selección negativa mueren aquellos
timocitos que reconocen a sus antígenos pro­
pios asociados a sus antígenos del CMH de cla­
se I o de clase II. Los que sobreviven son aque­
llos que poseen receptores capaces de interac­
cionar con antígenos extraños adecuadamente
procesados por las células presentadoras de an­
tígenos y asociados a antígenos del CMH pro­
pios. Este proceso selectivo evita que prolife-
ren aquellos linfocitos capaces de reconocer
antígenos propios e inducir una respuesta in ­
mune de autoagresión, y hace que sólo perdu­
ren los que reconocen a los agentes agresores
extraños, contra los que ponen en marcha los
mecanismos de la inmunidad.

Los linfocitos que mueren durante este pro­
ceso de selección lo hacen por apoptosis o
muerte programada, la que es inducida por se­
ñales específicas. La muerte no es por necrosis;
hay fragmentación del núcleo y destrucción ce­
lular. De la población total de células que se di­
ferencian en el timo, sólo el 5% sobrevive y
pasa a circulación como linfocitos T maduros.
A aquellos linfocitos que han madurado pero
que no han sido impactados por el antígeno se
los identifica como células “náíve” (cándidas,
inocentes, vírgenes). Cuando un antígeno inte­
racciona con un linfocito no estimulado (“naV-
ve”) éste se diferencia a células efectoras/regu-
ladoras, parte de las cuales perdurarán como
células con “memoria”.
Estudios realizados por Prince y col. por ci­
tometría de flujo bicolor y tricolor, han demos­
trado que las células “naíve” son CD45RO%
C D 45R A ‘""’'" y las célu las con “m em o ria”
C D 45R O *“™'", C D 4 5 R A \ L as c é lu la s
C D 4 5 R O '““ '", C D 4 5 R A - y C D 4 5 R O '‘>^” ,
CD45RA‘*‘“™son exclusivam ente hnfocitos T,
en tanto que las CD45RO“, CD45RA‘'™“ pue­
den ser células T, células B y células “killer” .
En la conversión “náíve” a “memoria” se in­
crementa la proporción de CD25 y disminuye
ladeC D 38:
CD45RO-, CD45RA>“"”'’......CD 25 (5% ); CD 38 (76%)
CD451™, C D 45R A '‘“ >......C D 25 (24% ); CD 38 (53%)
CD45RO'"™", C D 45RA -......CD 25 (42% ); CD38 (27%)
Las moléculas C D l la, CD2 y CD4 aumen­
tan en las células “con memoria” . Ello ocurriría
después de la pérdida de CD45RA y aparición
de CD45RO y no durante los estadios interme­
dios como ocurre con CD25 y CD38.
Los linfocitos B y T que han adquirido com­
petencia inmunológica pasan a poblar los órga­
nos hnfoides secundarios, en la proporción y
distribución ya indicada para cada uno de ellos.
En ese conjunto de linfocitos recirculantes están
expresados los receptores capaces de reconocer
a los diferentes antígenos, cuyo número se esti­
ma en 5 X 10*^’ hasta 1 x 10’, pudiendo cada uno
de ellos expresar entre 5 y 10 epitopes diferen­
tes, en promedio. Dado que cada linfocito B o T
expresa un receptor capaz de reconocer sola­
mente un epitope antigénico, la población nor­
mal de linfocitos, calculada para el ratón en 10®,
es suficiente para cubrir el panorama de especi­
ficidades necesario para que la labor defensiva
contra los agentes agresores sea efectiva.
Células accesorias
Las células con funciones accesorias que
pueden presentar epitopes a los LT para su re­
conocimiento dual (CPA) son los macrófagos.
La respuesta inmune 21
monocitos, células dendríticas, astrocitos, célu­
las de Langerhans, pudiendo también cum plir
esa función los linfocitos B activados y las cé ­
lulas B de origen tum oral. La característica
fundamental de estas células es expresar en sus
membranas antígenos codificados por el CM H
de clase II y además, especialmente en los m a­
crófagos, de sintetizar y excretar factores cono­
cidos con el nombre de monoquinas, siendo el
principal de ellos la interleuquina 1 (IL-1), fac­
tor estim ulativo de fundam ental im portancia
para que los linfocitos en estado de rep o so
(GO) puedan excitarse, pasar a la fase G1 e in ­
gresar al ciclo celular. Las células accesorias
son generalmente fagocíticas y por ese m eca­
nismo captan al antígeno, lo procesan y se acti­
van, incrementando la producción de lL-1.
A las CPA se las designa “profesio n ales”
cuando en condiciones normales expresan an tí­
genos del CMH en su superficie, así co m o
otras moléculas de adhesión. Las CPA son “no
profesionales”, no clásicas, si sólo bajo deter­
minadas circunstancias expresan en su superfi­
cie antígenos del CMH.
El contacto de los antígenos con las células
fagocíticas se hace a través de receptores, en
especial por intermedio de CRl y CRII, los que
tienen como ligandos a C3b y C3bi, co m p o ­
nentes del complemento resultantes de su acti­
vación por la vía alterna. Estos componentes, al
estar unidos a los antígenos e interaccionar con
los receptores CRl y CRII actúan como puentes
entre el antígeno y el macrófago facilitando su
en d o cito sis. La adhesión del antígeno a la
m em brana del macrófago puede ocurrir ta m ­
bién por interacciones proteína-proteína o por
la unión de ciertas proteínas con funciones de
lectinas que se fijan a los hidratos de carbono
de algunas glucoproteínas aisladas o co m o
componentes de membranas celulares,
Los antígenos del CMH de clase I, que se ex­
presan en la membrana de todas las células hu­
manas, excepto los eritrocitos y espermatozoi­
des, están constituidos por una cadena a inserta­
da en la membrana celular, asociada no covalen­
tem ente a una cadena del p2 microglobulina.
Los antígenos del CMH clase II están formados
por dos cadenas peptídicas, a y P y asociadas no
covalentemente, y ambas insertadas en la m em ­
brana celular. Dentro del citoplasma celular y
antes de su expresión en membrana, los antíge­
nos de clase II tienen una tercera cadena peptídi­
ca llamada y o invariante, que no presenta iso­
formas y cumple un rol importante en el trans­
porte del péptido antigénico (véase cap. 10).
Los péptidos resultantes de la degradación de
los antígenos fagocitados constituyen los epito­
pes que finalmente reaparecerán en la superficie
de las células accesorias, asociados a los antíge­
nos del CMH mediante uniones hidrofóbicas, y
22 Aspectos básicos de la Inmunidad

Cambio
conformacional
CMH-clase I I TAP1 TAP2

Péptido

CITOPLASMA
Proteasoma Complejo
proteasoma-péptido

F ig. 2-4. Procesado por la CPA y expresión en la m em brana celular de péptidos provenientes de antígenos de síntesis en ­
dógena asociados a CM H-L Parte de la figura por debajo de la línea quebrada: visión am plificada del proceso de fragm en­
tación del antígeno (Ag) por interm edio de los proteasom as (PTS) y transporte al lum en del REÍ a través de los transporta­
dores de péptidos insertados en la m em brana del RE, a efectos de su interacción con los antígenos del CM H -clase L Com o
consecuencia del proceso éstos sufren cam bios conform acionales, los que aseguran una m ejor unión y transporte al Golgi.
P arte superior: pasaje del com plejo péptido-C M H -I a través del aparato vesicular del Golgi y trans-G olgi h asta la m em bra­
na celular para su presentación al receptor antigénico (R C T) de LT.

en ese contexto son presentados a los linfocitos
T. La única excepción a la restricción para el re­
conocimiento dual por los LT son los antígenos
del CMH extraños (alotípicos), ya que en ese
caso particular no es necesaria la participación
de los antígenos del CMH propios.
Procesado y presentación del antígeno
¿Qué acontece cuando un antígeno penetra
por primera vez en el hombre u otro vertebrado
que ya ha desarrollado su sistema inmune? Las
células que actúan en primer lugar son los m a­
crófagos y otras células presentadoras de antí­
genos. El procesamiento de ese antígeno será
distinto según se trate: a) de un antígeno endó­
genamente sintetizado, como lo son las proteí­
nas virales correspondientes a virus que infec­
tan las células, los neoantígenos producto de
células que han sufrido transformación malig­
na, etc, o b) que el agente agresor sea un coin-
ponente antigénico externo del tipo de las bac­
terias, parásitos o proteínas extrañas.
En el primer caso, la proteína viral u otra si­
milar de origen citoplasmático es degradada en
el citosol por un grupo de proteosomas (PRT),
-unidad que contiene sitios catalíticos m últi­
ples-, y se originan simultáneamente y a partir
del mismo sustrato diferentes péptidos. Estos
sitios proteolíticos múltiples facilitan la p ro ­
ducción preferencial de los pequeños péptidos
que habrán de constituir los epitopes antigéni­
cos secuenciales a reconocer por los linfocitos
T. Estos péptidos son transferidos a las unida­
des transportadoras (TAP) que residen en la
m em brana del retículo endoplásm ico (RE) y
que transfieren a su vez los péptidos al lumen
del RE, los que en el Golgi se unen a las nue­
vas inoléculas del CMH de clase 1. Esta unión
induce cambios conformacionales en las molé­
culas CMH, que habrán de llevar a su estabih-
zación y facilitar el transporte del com plejo
péptido-CMH clase 1 a la superficie celular pa­
ra su reconocimiento por el receptor antigénico
del linfocito T (fig. 2-4).
Los antígenos extraños adheridos a la super­

ficie de la célula que habrá de participar en su
presentación serán endocitados por pinocitosis,
proceso que consiste en la ingestión de partícu­
las solubles o fluidos, o por fagocitosis cuando
se trate de restos celulares, bacterias o produc­
tos de agregación. En ambos casos se forman
vesículas o vacuolas que se vierten en los en­
dosomas tempranos, primer compartimento do­
tado de proteasas eficientes a pH ácidos, nece­
sarias para iniciar la degradación del antígeno.
Entre éstas, las dos más importantes son la ca-
tepsina B y D. El proceso continúa luego en los
endosomas tardíos y concluye con la participa­
ción de las vesículas lisosomales, caracteriza­
das por contener un elevado ntímero de enzi­
mas proteolíticas.
Las moléculas de antígenos procesadas por
la vía endocítica no tienen posibilidades de
unirse a los antígenos del CMH clase L Sólo lo
hacen a moléculas de clase IL El ensamblado
de tas cadenas a y P de los antígenos del CMH
clase II para formar el heterodímero tiene lugar
en el RE. Durante la biosíntesis de estas molé­
culas una tercera cadena denominada y o inva­
riante (Ii) se une al heterodímero en forma tran­
Péptido e n d ó g e n o L iJ
CMH-clase II
F ig. 2-5. P rocesado p or la C PA y expresión en la m em brana celular de péptidos provenientes de antígenos de sín tesis ex ó ­
gena y endógena, asociados al CM H-II,
La respuesta inmune 23
sitoria, impidiendo su unión a péptidos endóge­
nos en el RE y asegurándole de este modo su
participación en la vía endocítica. Si bien el en­
samblado de la cadena no es un requerimiento
absoluto para la expresión del heterodím ero
aP , incrementa la eficiencia del proceso. Las
inoléculas de clase II transportadas a partir del
RE lo hacen bajo la forma de un armazón com ­
plejo constituido por 3 cadenas y en el que se
insertan 3 hetrodímeros ap.
C u an d o las m o lécu las lleg an al re tíc u lo
trans-G olgi (RTG) y como consecuencia de
una señal determinada, el complejo aP y se diri­
ge, por alguno de los mecanismos de la v ía en­
docítica cuya localización no ha sido determ i­
nada hasta el presente, a los endosom as que
contienen los antígenos procesados. D urante
este tránsito la cadena y es degradada y el h ete­
rodímero a p puede entonces unirse a los p ép ti­
dos antigénicos exógenos (fig. 2-5). El tiempo
que las moléculas del CMH clase II tardan en
atravesar la ruta endocítica y aparecer en la su­
perficie celular es de 1-3 horas. El pH ácido
predominante en los endosomas/lisosomas con­
tribuye a una mejor degradación de las m olécu­
Ag exógeno
Péptido exógeno
CMH-clase ['
24 Aspectos básicos de ía inmunidad

LINFOCITO Th

CMH-clase II
CELULA PRESENTADORA DE ANTIGENO

Aminoácidos componentes del epitope

Aminoácidos componentes dei agretope

Fig. 2-6. E pitope y agretope. El conjunto de am inoácidos identificados con que contactan con el RCT, constituyen
el epitope-, los identificados con (□), que contactan con el CM FI-clase II constituyen el agretope.

las de antígeno endocitadas y a un aumento de
la eficiencia de la unión de los péptidos a las
moléculas del CMH clase II.
Si bien los antígenos del CMH clase II nor­
malmente presentan péptidos provenientes de
antígenos exógenos, pueden también, en deter­
m inadas circunstancias, presentar antígenos
endógenamente sintetizados. Ello ocurre en las
respuestas con formación de anticuerpos de la
clase IgG contra antígenos procedentes de una
infección viral, las que sólo tienen lugar si el
linfocito B es “ayudado” por un linfocito T
“helper” que ha aprendido a reconocer pépti­
dos andgénicos asociados al CMH clase II. Su
mecanismo no está bien determinado; podría
ocurrir que antígenos endógenos expresados
en la membrana celular asociados a CMH cla­
se I para su reconocim iento por las células

LINFOCITO Th

Fig. 2-7. Procesam iento del an tí­

g eno por el m acrófago y p resen ­
ta c ió n d e l c o m p le jo p é p tid o -
C M H -II a las cadenas a y |3 del
R C T de un Th. Se in d ican a d e ­
m ás las cadenas peptídicas cons­
titutivas de CDS y la fam iha zeta,
C D 4 y la interacción entre CD28
y B7 y de un par de m oléculas de
adhesión (C D 2/LFA -3) com o re­
Ag procesado presentativas de estos procesos.

CD8+ fueran luego endocitados. En este caso
el proceso seguiría la vía endocítica que lleva
a la asociación con antígenos clase II y su ex­
presión en la superficie celular para su recono­
cimiento por los receptores antigénieos de las
células CD4+. Otra posibilidad es que se for­
men autofagosomas que incorporen proteínas
citoplasmáticas y que después de la fusión con
estructuras lisosomales esas proteínas antigé­
nicas sean procesadas por la vía de los antíge­
nos del CMH clase II.
La vía endógena de procesamiento del antí­
geno, utilizada cuando los péptidos resultantes
se van a unir a antígenos del CMH clase 1, es
distinta de la que tiene lugar cuando los antíge­
nos van a ser presentados por moléculas de cla­
se 11. En el primer caso el proceso puede ser
bloqueado con inhibidores de síntesis de pro­
teínas o mediante brefeldina A, un inhibidor
específico del transporte entre el RE y el Golgi,
y no es alterado por cloroquina. Esta droga en
cambio, al igual que el NH4C1, impide la acidi­
ficación de los endosomas y produce el conse­
cuente bloqueo del procesamiento del antígeno
a ser presentado por moléculas de clase II.
Un antígeno extraño, endógeno o exógeno,
será procesado por los macrófagos y otras célu­
las presentadoras del huésped, y en el contexto
de los antígenos del CMH clase 1 y clase II, pe­
queños péptidos de 8-15 aminoácidos serán ex­
presados en sus membranas. Los complejos es­
tarán en condiciones de ser reconocidos por
aquellos linfocitos T maduros que se encuen­
tran en los órganos linfoides secundarios for­
mando parte del conjunto de células T recircu­
lantes, dentro de las limitaciones de su restric­
ción y especificidad.
Los pequeños péptidos antigénieos se unen
en forma lineal, por uniones no covalentes, a la
parte variable de los antígenos del CMH clase I
y clase II, que en esa zona presentan una es­
tructura en forma de celdilla que, por estudios
de cristalografía de rayos X, se ha demostrado
que está form ada por proteína con estructura
secundaria de dos a-hélices cruzadas por es­
tructuras en lámina p plegadas (véase cap. 10).
Los aminoácidos del péptido que se unen al an­
tígeno del CMH constituyen el agretope y no
son necesariamente los mismos que se exponen
para ser reconocidos por el RCT (epitope) (fig.
2-6). Experimentalmente se ha demostrado que
en el péptido obtenido de mielina de rata y pos­
teriorm ente acetilado, compuesto de 11 am i­
noácidos (A c.A la-Ser-G ln-L ys-A rg-Pro-Ser-
Gly-Arg-His-Gly), la Gln que ocupa el lugar 3
y la Pro hacen contacto con el RCT; la Ala y la
Lys lo hacen con los antígenos del CMH.
Pai'a que la unión CPA-LT se efectivice ade­
cuadamente, además de la unión RCT-péptido
otras interacciones entre moléculas de adhesión
La respuesta inmune 25
de las membranas de ambas células tienen lu­
gar (véase cap. 11).
Sim ultáneam ente las células m acrofágicas
sintetizan y secretan lL-1 y TNF, m oléculas
que activan a los linfocitos que reconocieron al
antígeno por ellas presentado y se encuentran
en fase de reposo o GO e inducen su pasaje a
las fases G1 y S, o de síntesis, del ciclo de vida
celular (fig. 2-7). Si el linfocito T era del sero-
tipo CD8+ y su RCT tenía restricción para antí­
genos CMH clase I, el linfocito excitado habrá
adquirido capacidad para reconocer y destruir,
como célula citotóxica o linfolítica efectora, a
cualquier otra célula que exprese en su m em ­
brana ese producto CMH clase Lpéptido. Si la
célula T era CD4+, su RCT poseía restricción
para CMH clase II y sintetizaba IL-2, el linfo­
cito T estimulado adquirirá capacidad para in­
ducir respuestas de hipersensibilidad tard ía
cuando encuentre al péptido antigénico especí­
fico presentado en el contexto del CMH clase
11. Estos linfocitos, como ya se indicara, son
identificados como T H l. Algunas de estas es­
tirpes eelulai'es pueden ejercer efecto coopera­
tivo o “helper”. Si la célula T CD4* que reco­
noce al CMH clase 11-péptido es productora de
IL-4, IL-5 e IL-10, identificada como TH2,
ejercerá un efecto cooperativo sobre los linfoci­
tos B, asegurando una respuesta efectiva de es­
tas células (fig. 2-8).
Un linfocito B reconoce al antígeno en fase
fluida, sin necesidad de degradación p revia y
sin requerimiento de célula presentadora de an­
tígeno o restricción de antígenos del CM H,
Cuando el receptor B (IgM de membrana) cap­
ta al antígeno, el LB se activa, se diferencia en
célula plasmática y secreta inm unoglobulinas
de la misma especificidad que la de su recep­
tor. Si el antígeno que indujo la respuesta es T-
independiente, ella será con producción de an­
ticuerpos IgM ya que los antígenos de ese gru­
po, por poseer efecto mitogénico o determinan­
tes antigénieos próximos y repetidos, producen
agregación de los receptores y transducen las
señales que llevan a la activación y diferencia­
ción celular, aparentemente sin la necesidad de
otros intermediarios. Hay estudios que parece­
rían indicar que en algunos casos se necesitaría
el estímulo de IL-1. Los antígenos T-indepen-
dientes no inducen cambio o “switch” de clase
de inmunoglobulina por lo que la respuesta es
siempre de tipo IgM. El cambio de IgM a IgG
u otros isotipos de inmunoglobulinas es depen­
diente del antígeno y de las diferentes interleu­
quinas sintetizadas principalmente por los lin­
focitos Th.
Si el inmunógeno es un antígeno T-depen-
diente, el antígeno por sí solo no es suficiente
para que la respuesta inmune sea efectiva. Para
que ello ocurra necesita de la cooperación de
26 Aspectos básicos de la inmunidad
los linfocitos Th. D urante mucho tiem po se
consideró que el Th, para ejercer su efecto coo­
perativo reconocía, del antígeno fijado por el
LB a través del epitope, a la parte soporte o
“carrier” la que actuaba como puente entre am­
bas células.
E.ste concepto dejó de ser válido cuando se
demostró que el LT sólo reconocía pequeños
péptidos resultantes de la degradación del antí­
geno, asociados a antígenos del CMH. El LT
había aprendido a reconocer al antígeno pre­
sentado por el macrófago de una manera dife­
rente a la efectuada por el LB, ya que éste lo fi­
jaba por su epitope a través de la IgM de mem­
brana (IgMm). Actualmente esto ha sido clari­
ficado, pues se ha demostrado que el linfocito
B cuando fija al antígeno por su receptor espe­
cífico lo internaliza, procesa y expone en su
mem brana los diferentes péptidos resultantes
asociados a moléculas de antígenos CMH clase
II, de modo análogo al que hacen las células
presentadoras de antígeno. Este producto es el
que reconoce el linfocito Th. Esto implica que
el LT no reconoce el mismo epitope cjue el LB,
y que el efecto cooperativo lo pueden ejercer
los distintos Th capaces de identificar a cada
uno de los diferentes péptidos, resultantes de la
degradación antigénica, expuestos en membra­
na del LB asociados a antígenos del CMH cla­
Ag T-indOTendiente
Diferenciación
Y Y Y
IgM Proliferación y
diferenciación
IgM; IgG; IgA C é lu la
IgD; IgE Y ' ' plasmática
Fig, 2-8. Interacciones entre células presentadoras de antígenos (CPA ), linfocitos B, linfocitos T (Th, Te) y los productos
solubles por ellas sintetizados (interleuquinas), ante una estim ulación con antígenos T-independientes (A) y T -dependien­
tes (B)
se II. Al mismo tiempo el LB expresa recepto­
res para IL-2 e IL-4, los que interaccionan con
la IL-2 o IL-4 secretada por el Th. Estas inte­
racciones son las que estimulan al LB y lo lle­
van a diferenciarse en piasmocito y a sintetizar
anticuerpos con la misma especificidad que su
receptor específico (IgMm) (fig. 2-8).
Cuando un antígeno es inoculado por prime­
ra vez en un animal virgen, los eventos que se
ponen en marcha son los indicados; la respues­
ta primaria es iniciada por unos pocos linfoci­
tos (células “nai've”) que poseen receptores es­
pecíficos para el antígeno (fig. 2-9). Además,
linfocitos T y B que no se transforrnan en célu­
las efectoras, perduran en el huésped por perío­
dos prolongados como células con “memoria”
inm unológica. Nuevos estím ulos antigénicos
contactarán rápidamente las células con mem o­
ria las que, por el hecho de tener especificidad
definida y formar parte de una población celu­
lar más numerosa que las que pudieron recono­
cer al antígeno durante el primer estímulo, in­
ducen una respuesta más acelerada y de mayor
magnitud. El clon celular correspondiente a los
linfocitos T se habrá incrementado y la produc­
ción de anticuerpos por las células de la línea B
será de un nivel superior. En este caso la res­
puesta inmune inducida se denomina “secunda­
ria”, la que resulta mucho más efectiva que la
• Epitope
Péptidos
• CMH-I
« C M H -ll
« Mastocito
■oliferaclón)
, ■< Receptor B
V ^R e ce p to rT (C M H -I)
S r'R s c e p to rT (CM H-ll)
 La respuesta inmune 27

MÉDULA ÓSEA

L1‘
Células
indiferenciadas

BURSAI
TIMO

LB j J I d O I I ICtLIV

'^ m e m o r i a ( ) LTCD4+ (Th1)\

(hipersensibi­
lidad tardía)
(efectores)
LT CD8", Te
K qmM Respuesta primaria
Respuesta primaria

F ig. 2-9. R espuesta inm une prim aria y secundaria. L as células indiferenciadas de la m édula ósea pueden adquirir c o m p e ­
tencia inm unológica a través del tim o o de órganos b u rsa sím ilis, diferenciándose en linfocitos T y B, respectivam ente, los
que pasan a integrar la población de linfocitos recirculantes que no ha sido im pactada p o r antígenos. C uando esto ocurre
los linfocitos B se replican y diferencian en células plasm áticas sintetizadoras de anticuerpos (IgM ); los linfocitos T o rig i­
nan clones de células efectoras (CD4+ T H l y Te) y reguladoras (CD4+ TH 2). Parte de las células perd u ra por largos p e río ­
dos com o células de m em oria, las que ante nuevos estím ulos antigénicos se m ultiplican y diferencian rápidam ente, con
una respuesta secundaria m agnificada respecto de la respuesta prim aria.

respuesta “primaria” . Durante este proceso hay B IB L IO G R A F ÍA

maduración de la respuesta inmune, caracteri­
zada por el cambio de clase de inmunoglobuli­
na, generalmente IgG y una mayor afinidad o
capacidad de unión del antígeno a los anticuer­
pos que se sintetizan. En la inducción de este
fenómeno participan aspectos propios del antí­
geno inductor usado y distintos tipos de linfo­
quinas sin tetizad as por los lin fo cito s (fig.
2-10). El efecto resultante de las estim ulacio­
nes repetidas es el que se busca cuando se quie­
ren obtener inmunizaciones activas (vacunacio­
nes) exitosas y cuando se intenta lograr inm u­
nosueros de alto título de anticuerpos y buena
afinidad.
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28 Aspectos básicos de la inmunidad
Fig. 2-10. D iferentes interleuquinas que participan en la activación del linfocito B y en el cam bio o “sw ich” de clase de
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 La respuesta inmune 29

Compilado por: L. Fainboim

Anexo I: Listado de clusters de diferenciación (CD) leucocitarios basado en los resultados del
V Taller Internacional realizado en Boston, en noviembre 1993. Referencia sobre los m ism os
pueden encontrarse en: Leuiiocyte Typing V.- wlrite cell differentiation antigens. Eds. S. Schloss-
man y col. Oxford University Press, 1994.
CD O tras denom inaciones P M (kD) P apel biológico D Lnribución celular

CDl a T6 49 ? Ligando para cél. T y8 Tim ocito, CL

C D lb W M 25 45 Igual que C D l a Igual que C D l a
D ]c M241 43 Igual que CD 1a Igual que C D l a, Subpob. B
^ ,| 1
CD2 50 L igando para CD58 T, N K
CD2R 50 V ía alternativa de activación T T activados
CD3 T3 5 cadenas A sociado al TCR. T ransducción T
de señales T
CD4 T4 55 Interactúa con M HC clase II T que reconocen M H C clase II
T ransducción de señales
CD5 TI 67 Ligando para CD72 T, subpob. B (B la )
CD6 TI 2 100 7 A lgunos T y algunos B
CD7 40 7 T
CDS TS (hom odím eros y 34 Interactúa con M H C clase I T que reconocen M H C clase I
heterodím eros) T ransducción de señales
CD9 24 A ctivación plaquetaria? Pre-B, B inm aduros, M o, Pl
CDIO CA LLA 100 Idéntica a la endopeptidasa neu- Pro, algunos Pre-B, algunos B m ad u ro s,
ral (enkefalinasa) Gr
C D l la L FA ^Í 170 CD 11 a/C D 18 ligando L
IC A M -I e lC A M -2
C D llb CR3,M A C-1* 165 C D l lb /C D 1 8 interactúa con pro­ Cél. M ié y NK
teínas de la m atriz y es el re­
ceptor para iC3b
C D llc p l5 0 150 C D l Ic/C D l 8 ligando de fibrinó- Cél. M ié, altos niveles en Ma, m a rcad o r
geno de LCV
C D I2 90-120 7 M o, G r, Pl
CD13 150 A m inopeptidasa Prec. m ielom onocíticos, Mo, Eo, N e,
CEp, intestino delgado, túbulos ren .,
m em b. sinápticas, F i, Oc
CD14 55 (mo) R eceptor del com plejo de LPS y M o, M a, algunos Gr, B
64 (B) la proteína que une LPS
CD15 Lew is X* trisacárido El A cM inhibe fagocitosis y N e, Eo
efecto m icrobicida en N E
CD15S sLex,* form a siali- Ligando para CD 62E Igual a C D l5
tada
CD16 FcR IIIA / 50-65 R eceptor baja afinidad para IgG N K, M a
FcRIllB agregada
C D l 6b FcR lIIB 48 Unión a m em brana po r G PI. No Ne
envía señales
C D w l7 LacC er LacC er de los N e involucrado en Ne, M o, Pl
exocitosis 0 em paquetam iento
granular
CD18 cadena |32 de las inte­ 95 V éase C D l l V éase C D l 1
grinas
CD 19 B4 95 R egulación proliferación B Pro- B hasta B activadas, CFD
CD20 Bl 33-37 R egulación activación y prolife­ Pre-B hasta B activadas
ración B
CD2I CR2 145 R eceptor para C3d y EBV activa­ B m aduras, CFD, subpoblación tim ím i-
ción B ca, epitelio faríngeo
CD22 BL-CA M 130/I40Í C adena (3 ligando para C 45R 0 y B m aduras (60-80% ), I.CV citop. d e
C D 72 pro-B , pre-B, B
CD23 F ceRII, Blast-2 45 R eceptor baja afinidad IgE F cella: B. Fcellb: M o
CD24 35-45 ? Pro-B , pre-B y B, Gr, Ti (2%), n eu ro -
blastom a, T act.
CD25 IL-2R 55 Induce activación y proliferación Cél. activadas T, B y Mo
cel. T ,B ,tim ., N K, M a.
CD26 110 P roteasa de superficie celular T y B en reposo y activadas. C E p ren al
e intest., canal, biliar
CD27 55 hom odí­ L igando de CD70, señal coesti- T, Ti m edulares, B activ,, Pl
mero m uladora cél. T vírgenes
CD28 44 hom odí­ L igando de CD 80 (señal coesti­ T C D 4 (95% ), T CDS (50%)
m ero m ulatoria)
CD29 subunidad p i integri­ 130 H eterodím eros C D 29/C D 49 me­ L e en reposo y activados
nas dian adhesión célula-célula y a
m atriz
C o n tin ú a
30 Aspectos básicos de la inmunidad

Anexo I. (Continuación)

CD Otras denom inaciones P M (Ií D) P apel l)iológico D istribución celular

C D 30 Ki^ 1 105 T y B activ. Cél. R eed-Stem berg, linfo­

mas a cél. grandes anaplásticas, Pl,
M o, Gr, CE
CD31 PECA M - 130-140 M o, Pl, Gr, Ce y sus uniones
C D 32 FcyRIIA 40 R eceptor baja afinidad IgG Todas las form as en Mo, C E y trofo­
blasto. FcyRIIA y C en Ne. FC^RIIB
en B
CD33 67 Prec. M ié (luego de CD 34), M o
C D 34 105-120 Cél. hem atopoyéticas inm aduras y CE
CD 35 CRl 250 M ediador de fagocitosis por su Ne, Eo, subp T, B, M o, podocitos glo-
unión a C 3b y C4b m erulares
CD 36 88 ? R eceptor eritrocitario para G licoproteína m ayor de Pl, M o, CE, v e­
Plasm odium falciparum na um bilical
CD 37 40-45 7 B. B aja expresión céls. M ié
CD 38 TIO 43 Prec. T y B tem pranos, T y B activ, P
C D 39 78 B activ, N K activ, Subp. T, Ma, CD, C L
C D 40 50 C ooperación T-B a través de CD, B, algunas CEp
unión a gp39 en T activados
C D 41# G PIlb 125/22 C adena a del heterodím ero con Pl, m egacariocitos
C D 6 I, involucrado en adhesión
y agregación plaquetaria. Une
fibrinógeno, fibronect, vitro-
nect.
C D 42a G PIX 23 P arte del com plejo CD 42 Pl, m egacariocitos
C D 42b G P IB ,a 135,23 U nión a factor de von W ille- Pl, megacariocito.s
brand. R eceptor a trom bina
C D 42c G PIB ,p 22 Parte del com plejo CD42 Pl, m egacariocitos
C D 42d GPV 85 Parte del com plejo CD42 Pl, m egacariocitos
CD43 Sialoforina 95 (T) Ligando de CD 54 Ti, T, Gr, M o, Ma, NK, Pl, B activ, P,
115-135 (Ne) stem cells de M O y timo
C D 44 Pgp-1 80-95 R eceptor para ácido hialurónico. T, B, M o, Gr, Ti m edulares, Er, CEp,
por el cual une Li a HEV cél m em oria
Sustancia b lan ca de SNC, miisculo es-
quelético, tum ores
C D 44R 210 V ariante de CD 44 con condroitín Li
sulfato
C D 45 LCA ,B 220 180-240 A ctividad fosfo-tirosino-fosfata- Excepto Er, todas las células hem atopo­
240 (cél B) a sa. C D 45R O ligando de CD 22 yéticas. Las isoform as C D 45RA,
180 (Ti) CD 45RB , CD 45RC y C D 45R O se ex ­
presan diferencialm ente en distintas
células (véase texto)
C D 46 M CP,TLX 51-58 y 59- C o 'facto r proteico de m em brana Ti, T, B, M o, Gr, NK, Pl, CE, C Ep, F,
68 (M CP) que al unir C3b o C4b placenta, esperm a
perm ite que el factor I degrade
C3b o C4b
C D 47 47-52 Todas las cél. hem atopoyéticas, CEp,
CE, F, esperm a
C D 48 Blast-I 40-47 T, B, Ti, M O (30% ), Eo, CEp bronquial
y salival
C D 49a VLA-1 (cadena a l ) 210 H eterodím eros C D 49/C D 29 ad­ T reposo (CD49d)
hesión a m atriz extrace-m edia- T m em oria aum enta C D 49e,f
da por la secuencia Arg-Gly- Ti (CD 49d,f), B (CD 49b,c,d)
C D 49b V LA -2 (cadena a 2 ) 160 A sp (RG D ). C olágeno M o (CD 49b,e,f), Pl (C D 49b,e,t)
(CD 49a,b), Lam i-(C D 49a,b,c), C Ep (C D 49f a.sociado a cadena (34)
fibronectina (CD 49c,d,e), HEV
C D 49e V LA -3 (cadena a 3 ) 125 de placas P eyer (CD 49d)
C D 49d V LA -4 (cadena a 4 ) 150 A diferencia de otras integrinas
C D 49/C D 29 m edia adhesión
célula a célula por su unión al
C D 49e V LA -5 (cadena a 5 ) 135,25 ligando VCAM -1
CD 49f V LA -6 (cadena a 6 ) 120,25
C D 50 ICA M -3 124 Ligando LFA-1 Ti, T, B, M o, Gr
CD51 140 R eceptor para vitronectina, Pl, m egacariocitos
cadena a v (C D 51/C D 61). R econoce RGD
en m atriz extracelular, (von
W illcbrand, fibrinógeno, vitro­
nectina)
C D 52 Cam path-1 21-28 T i , T , B , G r ( l 5 % ) , E o (30% )
CD 53 32-40 Ti, T, B, M o, Pl, Gr, Oc, Ob
 La respuesta inmune 31

Anexo I. (Continuación)

CD Otras denom inaciones P M (kD) P apel biológico D istribución celular

CD 54 IC A M -I 80-114 L igando para L F A -1 A m plia. Cél. hem atopoyéticas y n o h e­

(C D I I a /C D 1 8 ) y M a c - l. R e­ m atopoyéticas
ceptor para R inovirus
CD55 DAF 70 P rotege a los tejidos del daño por A m plia. Cél. hem atopoyéticas y n o h e­
el C ’ autóiogo, im pide el arm a­ m atopoyéticas
do de la C3 convertasa
CD56 N^CAM 17.5-185 A dhesión hom otípica N K, alg. tejidos neurales
M ol. de adhesión
neural
CD57 HNK-1 lio 7 NK, 25% T y B, algunos Mo
CD58 LFA -3 55-70 L igando para CD2 A m plia en cél. hem atopoyéticas, C E
CD59 M IR L 18-20 R egula la acción del C ’ por su Le, C E, CEp, Pl
unión a C8 y C9
CD w 60* U M 4D 4 Trisacárido 7 T (25-45% ), Pl, M o
CD61 G P Illa 110 Es la cadena (3 que se asocia a Pl, M eg, IVla, cél. no hem atopoyéticas
CD41
CD 62E ELAM 4 115 Ligando del epitope sLe* C E activadas
R eceptor para N e y T
CD 62L LAM-1 75-80 Unen linfocitos a HEV L vírgenes
C D 62P PAD G EM 150 M edia la interacción de plaq. ac­ Pl activadas, IVIeg, CE
tiv. con neu. y mo. U ne sLex
CD63 53 7 Pl activ., Mo, M a, débil en Gr, B, T
CD64 FcyRI 75 R eceptor de alta afinidad IgG Mo y Ma
U nico que une m onóm eros
CDw65''‘ V lM -2 oligosacárido A ctivación de neutrófilos G r y algunos M o
C D 66a BG P 180-200 Los C D 66 pertenecen a la fila, de Ne, precursores m ieloides, ribete en ce­
CD66b CD 67 95-100 A gs carcino-em brionarios de pillo de epitelio colónico
CD66c N CA 90-95 m oléculas de adhesión involu­
CD66d C G M l 30 crada en adhesión hom otípica
C D 66e CEA 180-200
CD67 actual C D 66b
CD68 no 7 G ránulos citoplásm icos y su p erficie de
M o, M a, N e, Ba, L grandes
CD69 MLR^3 28,32 Es la m olécula que se expresa C onstitutiva en Pl, Ti CD4-^/CD8-^- T
hom odím ero m ás tem prano en la activ. cel. activadas
CD70 55,75,95,110, L igando de CD27 B y T activ.
120
CD71 95 R eceptor para transferrina T y B activ., Ma
M etabolism o del hierro y creci­
m iento y proliferación celular
CD72 42 L igando para CD5 Pro-B a B activada, M a
hom odím ero
CD73 69 Ecto. 5 ’nucleotidasa Ti, CD4-^ (10% ). C D 8+ (50%), B
(70% ), CEp, CE
CD74 43/41/35/53 C adena invariante (Ii) H L A clase B, M o, Ma, subp T act., CEp
(4 form as) II. P resentación Ag.
CDw75 53 9 T (20% ), B (aum enta con activ.) C E p ,
precurs. eritroides
C D w76 antes CD76 7 7 Subp. T , B. M elanocitos, CE, C E p , (he­
patocitos, tub. renales)
CD77* BLA epitope 7 B de centro germ inal. M arcador
carbohidrato Lin fo m a de B urkitt
CDw78 A ntígeno Ba 7 Pre-B a B (aum enta con activación),
M a, CEp
CD79a lg a ,ra b -l 33,40 Parte del com plejo recep to r de Pre-B hasta B
antígeno B . Form a un heterodí­
m ero con CD79b
CD79b Igp,B 29 33,40 V éase C D 79a Pre-B hasta B
CD80 B7,BB1 60 Ligando para CD28 y C T L A -4 Cd, subp. B y todas las B activ.
CD8) T A PA -I 22 A cM o anti-T A P A -l tien e efecto L, líneas de neuroblastom a y m e la n o ­
anti-proliferativo mas
CD82 R 2 JA 4
CD83 HB15 43 7 Alta: CID , CD, C L
Baja: L i activados
CD w84 267,152-1D5 73 7 M a, Pl, B y T activados
CD85 V M P-55 120 7 B, M o, LCV , m ielom as
CD86 B 7.2, FUN ^l 80 Señal coestim ulatoria en CPA CD, B y M o activados

C ontinúa
32 Aspectos básicos de la inmunidad

Anexo I. (Continuación)

Otras
CD denotninaciones P M (kD) P apel biológico D istribución celular

CD 87 U PA -R 50-65 Receptor para el activador del Ne, M o, M a, Eo, CE, Fi, T acüvadas, ti­
plasm inógeno tipo-urokinasa mo fetal
que prom ueve actividad fibri-
nolítica
CD 88 C5aR 42 R eceptor de la anafilotoxina C 5a Gr, M a, M astocitos, m. liso
C D 89 F caR 55-75 U ne IgA sérica y secretoria Mo, Gr, Ma, subp. B y T
C D w 90 Thy-1 25-35 ? Pro-Ti, cerebro y otros tejidos no linfoides
CD91 a2 m R (heterodí­ 600 Receptor a2-m acroglobulina. M o, M a, Fi, m. liso, hepatocitos, sincicio-
m ero) 515 M edia endocitosis del receptor trofoblasto, neuronas
85 unido a proteinasa
C D w 92 p70 70 7 Gr, M o, CE, U -9 3 7 ,T H P -I
CD93 V1MD25 120 7 Gr, M o, CE, U -9 3 7 ,T H P -I
C D 94 KP43 43 A dhesión de NK con integrinas N K, subpob. T. Aum. con activ.
CD95 A P O -l,F a s 42 A sociado con la inducción de Linaje T y m ieloide
apoptosis
C D 96 T A C TIL E 160 A dhesión de T y N K en fase tar­ T y N K activadas
día de respuesta inm une
CD 97 VIM3 74,80,89 7 T y B act., M o, NK, Gr, Pl
CD 98 4F2 80,40 7 Baja en T, B, N K, Gr. A lta en: M o, T y
N K act,, m. cardíaco, queratinocitos b a­
sales
CD 99 E2, M IC2 32 ? (form ación de rosetas con Er) Ti, Li periféricos
C D 99R 32 7 Form a más restringida de CD99
C D l 00 B B I8,A 8 150 7 A mplia. Subpob. CD4 y CD8 que se acti­
van por CD28
C D w lO l BB27, BA27 140 7 Gr, M o
C D 102 IC A M -2 60 Ligando para L F A -1 (no para L, M o, C E (alta expresión no m odulada
M ac-1) por la inflam ación)
C D l 03 HML-1 150,25 ? C adena a E de integrinas Li intraepit. de intestino
Se asocia con integrina p7
C D l 04 205 ? C adena (34 de integrinas H em idesm osom as epitehales, cél,
A sociada con a ó (CD 49f) une Schw an, CE, neuro, trofoblasto
lam inina y epiligrina
C D l 05 Endoglin 95 7 CE, M a activados
C D l 06 VCAM -1 100, l i o Ligando para V LA -4 CE
C D l 07a LAMP-1 lio Posible rol en adhesión A m plia en citop, sup, de Pl activadas, T
^ citotóxicos
C D l 07b L A M P-2 120 ? 60% hom ología con LA M Pl ídem
C D w l0 8 80 7 Li, leucem ias agudas
C D w l0 9 8A 3,7D 1 170-150 7 Pl, M eg, C E capilar y venular, T activ.
C D l 15 C S F -IR ; M -CSFR 150 La unión de M -C SF induce la di­ M o, M a y sus precursores
m erización del receptor
C D w ll6 G M -C SFR 150 C adena a del receptor une GM - M o, M a y sus precursores, Pl
CSF. Junto a la cadena |3 gene­
ra receptor alta afinidad
C D l 17 c-K it 145 R eceptor para factor de creci­ ,Stem cells, m astocitos
m iento de stetn cells
CD w 119 IFNyR 90 U ne IFN y con alta afinidad M ac, M o, B, fibro., epit., endo.
C D I 20a T N FR; 55kd 55 C D l 20a y b unen T N F a y TN Fp La m ayoría de las cél, expresan uno o am ­
con relativa alta afinidad. Co- bos TN FR s
m odulan con el antígeno Fas
C D l 20b T N FR; 75kD 75 V éase C D I2 0 a V éase C D l2 0 a
C D w l2 1 a IL -IR tipo 1 80 R eceptor IL -1 A m plia
C D w l2 1 b IL - 1R tipo 2 68 R eceptor IL -1 A m plia
C D l 22 1L-2RP 75 C adena P del 1L-2R T ,B
C D w l2 4 1L-4R 140 R eceptor IL-4 A m plia
C D l 26 IL-6R 80 R ec ep to rIL -6 A m plia
C D l 27 IL-7R 75 R ec ep to rIL -7 Precur, hem atopoyéticas
C D w l2 8 IL8R 58,67 R eceptor de IL-8 Ne, M o, queratinocitos, basófilos, sub­
pob, T
C D w l3 0 g p l3 0 ,S IG 130 S ubunidad p del receptor de IL-
6, transduce señal

(*): ep ito p e h id ro ca rb o n a d o , ($): U n id as a la m em b ra n a p o r un io n es fo sfatid il inositol. (#): C D 41 = gpMb es un h e te ro d ím e ro 120/63, q u e

fo rm a un c o m p lejo c o n g p llla (C D 61). E x p re sió n en tejidos: B, T , N K : lin fo cito s B, T y N K ; P: p lasm o cito s; Pl: plaq u e ta s; L: leucocitos;
Li: linfocitos; M o: m o n o cito s; G r: g ra n u lo c ito s; M a: m ac ró fa g o s; E o: eo sin ó filo s; N e: n eu tró filo s; Er: eritro cito s; M O : m éd u la ósea; M eg;
m eg a cario c ito s; C E p: células ep iteliales; C E; cé lu la s e n d o te lia le s; F i: fib ro b la sto s; T i: tim o cito s; C D ; cé lu la s d endríticas; C L; cé lu la s de
L an g e rh a n s; Oc; osteo cla sto s; Ob: osteo b iaslo s; C ID : cé lu la s in terd ig itad as; M ié: cé lu la s m ielo id es; LCV:. leucem ia de c é lu la s vellosas.
Bases celulares de la respuesta
inmune. Órganos linfoides primarios
y secundarios
MARTA BRAUN
CONCEPTOS PRELIMINARES
El ingreso de un antígeno no propio dentro
de un organismo induce una respuesta inmune
específica dirigida contra ese mismo antígeno
que, por la adaptabilidad del sistema inmune,
puede tomar distintas modalidades: producción
de inmunoglobulinas de diferentes clases, res­
puesta celular con activación de macrófagos,
efectos citotóxicos, etc. Es el antígeno quien
“elige” los clones de linfocitos específicos, pre-
comprometidos para reconocerlo, a los que va
a activar y que van a producir alguna de esas
respuestas. Pero, para que sucedan todos esos
mecanismos efectores específicos, no sólo de­
ben preexistir linfocitos que reconozcan al antí­
geno, sino que deben interactuar varias pobla­
ciones celulares, que colaboran entre ellas, an­
tes de que sea patente uno o más de esos meca­
nismos efectores.
De estas poblaciones, la única que reconoce
específicamente a los antígenos es la de los lin­
focitos. Pero aunque éstos aparezcan morfoló­
gicam ente idénticos entre sí, son funcional­
mente muy diferentes, no sólo por su especifi­
cidad, para la cual ya están com prom etidos
desde su maduración, sino también por sus fun­
ciones.
Existen dos grandes poblaciones de linfoci­
tos: los linfocitos B y los linfocitos T. Los pri­
meros son los encargados, casi exclusivamente,
de la síntesis de inmunoglobulinas. Los linfoci­
tos T tienen, por el contrario, una serie de fun­
ciones, algunas de ellas efectoras y otras de co­
laboración y regulación, que ejercen sobre los
linfocitos B y sobre otras subpoblaciones de T.
Además, para que se inicie una respuesta inm u­
ne deben colaborar otras células'no linfoides.
3
muy especialm ente las de la serie m onocito-
macrófago.
Así, para que se produzca una respuesta hu­
moral, por ejemplo, si bien los linfocitos B pue­
den reconocer por sí mismos el antígeno para el
cual están comprometidos, pero para que se es­
timulen, se diferencien a plasmocitos y secreten
anticuerpos, deben recibir la colaboración de
una subpoblación de linfocitos T, los linfocitos
T colaboradores o “helper” (Th). Para que los
Th reconozcan al antígeno para el cual están
' pre-comprometidos, éste debe haber sido proce­
sado y presentado, junto con un antígeno de
histocompatibilidad (CMH) propio, por otra cé ­
lula, ya sea un m acrófago u otro linfocito B
(véase cap. 10). A su vez, la respuesta inmune
efectora casi siempre se ejerce con la colabora­
ción de células o factores inespecíficos: por
ejemplo, para que las Igs secretadas tengan un
efecto de protección contra el antígeno extraño,
salvo contadas excepciones, como puede ser la
neutralización de virus o toxinas, deben interve­
nir otras células, como fagocitos o células ki­
ller, o factores, como el complemento.
Por todo esto, se comprende que la respuesta
inmune provocada por un antígeno extraño es
un proceso complicado en el cual intervienen,
en forma de cascada exquisitamente regulada,
una serie de células y factores de los que no to­
dos pertenecen al sistem a específico p ro p ia ­
mente dicho, constituido por los linfocitos.
Las células, tanto específicas como inespecí­
ficas, que intervienen en la respuesta inm une
tienen un origen común, las células troncales
(“stem cells”) de la médula ósea, pero luego
tienen diferentes vías de diferenciación, lo que
da por resultado poblaciones celulares con di­
ferentes funciones. Esta diferenciación se inicia
32 Aspectos básicos de la inmunidad

Anexo I. (Continuación)

Otras
CD denominaciones P M (IcD) P apel biológico D istribución celular

CD 87 U PA -R 50-65 Receptor para el activador del Ne, M o, M a, Eo, CE, Fi, T acüvadas, ti­
plasrainógerro tipo-urokinasa mo fetal
que prom ueve actividad fibri-
nolítica
CD 88 C5aR 42 R eceptor de la anafilotoxina C 5a Gr, M a, M astocitos, m. liso
C D 89 F caR 55-75 U ne IgA sérica y secretoria Mo, Gr, Ma, subp. B y T
C D w 90 Thy-1 25-35 ? Pro-Ti, cerebro y otros tejidos no linfoides
CD91 a2 m R (heterodí­ 600 Receptor a2-m acroglobulina. M o, M a, Fi, m. liso, hepatocitos, sincicio-
m ero) 515 M edia endocitosis del receptor trofoblasto, neuronas
85 unido a proteinasa
C D w 92 p70 70 7 Gr, M o, CE, U -9 3 7 ,T H P -I
CD93 V1MD25 120 7 Gr, M o, CE, U -937,T H P-1
C D 94 KP43 43 A dhesión de NK con integrinas N K, subpob. T. Aum. con activ.
CD95 A P O -l,F a s 42 A sociado con la inducción de Linaje T y m ieloide
apoptosis
C D 96 T A C TIL E 160 A dhesión de T y N K en fase tar­ T y N K activadas
día de respuesta inm une
CD 97 VIM3 74,80,89 7 T y B act., M o, NK, Gr, Pl
CD 98 4F2 80,40 ? Baja en T, B, N K, Gr. A lta en; M o, T y
N K aet,, m. cardíaco, queratinocitos ba-
sales
CD 99 E2, M IC2 32 ? (form ación de rosetas con Er) Ti, Li periféricos
C D 99R 32 7 Form a más restringida de CD99
C D l 00 B B I8,A 8 150 7 A mplia. Subpob. CD4 y CD8 que se acti­
van por CD28
C D w lO l BB27, BA27 140 7 Gr, M o
C D 102 IC A M -2 60 Ligando para L F A -1 (no para L, M o, C E (alta expresión no m odulada
M ac-1) por la inflam ación)
C D l 03 HML-1 150,25 ? C adena a E de integrinas Li intraepit. de intestino
Se asocia con integrina p7
C D l 04 205 ? C adena (34 de integrinas H em idesm osom as epiteliales, cél,
A sociada con a ó (CD 49f) une Schw an, CE, neuro, trofoblasto
lam inina y epiligrina
C D l 05 Endoglin 95 7 CE, M a activados
C D 106 VCAM -1 100, l i o Ligando pitra V LA -4 CE
C D l 07a L A M P -1 110 Posible rol en adhesión A m plia en citop, sup, de Pl activadas, T
^ citotóxicos
C D l 07b LAMP~2 120 ? 60% hom ología con LA M Pl ídem
C D w l0 8 80 7 Li, leucem ias agudas
C D w l0 9 8A 3,7D 1 170-150 7 Pl, M eg, C E capilar y venular, T activ.
C D l 15 C S F -IR ; M -CSFR 150 La unión de M -C SF induce la di- M o, M a y sus precursores
m erización del receptor
C D w lló G M -C SFR 150 C adena a del receptor une GM - M o, M a y sus precursores, Pl
CSF. Junto a la cadena |3 gene­
ra receptor alta afinidad
C D l 17 c-K it 145 R eceptor para factor de creci­ ,Stem cells, m astocitos
m iento de stem cells
CD w 119 IFNyR 90 U ne IFN y con alta afinidad M ac, M o, B, fibro., epit., endo.
C D l 20a T N FR; 55kd 55 C D l 20a y b unen T N F a y TN Fp La m ayoría de las cél. expresan uno o am ­
eon relativa alta afinidad. Co- bos TN FR s
inodulan con el antígeno Fas
C D l 20b T N FR; 75kD 75 V éase C D l2 0 a V éase C D l2 0 a
C D w l2 1 a IL -IR tipo 1 80 R eceptor IL -1 A m plia
C D w l2 1 b IL - 1R tipo 2 68 R eceptor IL -1 A m plia
C D l 22 1L-2RP 75 C adena P del IL-2R T ,B
C D w l2 4 IL-4R 140 R eceptor IL-4 A m plia
C D l 26 IL-5R 80 R ec ep to rIL -6 A m plia
C D l 27 IL-7R 75 R ec ep to rIL -7 Precur, hem atopoyéticas
C D w l2 8 IL8R 58,67 R eceptor de IL-8 Ne, M o, queratinocitos, basófilos, sub­
pob, T
C D w l3 0 g p l3 0 ,S IG 130 S ubunidad p del receptor de IL-
6, transduce señal

(*): ep ilo p e h id ro ca rb o n a d o , (:¡:): U n id as a la m em b ra n a p o r un io n es fo sfatid il inositol. (#): C D 41 = gpMb es un h e te ro d ím e ro 120/63, q u e

fo rm a un c o m p lejo c o n g p llla (C D 61). E x p re sió n en tejidos: B, T , N K : lin fo cito s B, T y N K ; P: p lasm o cito s; Pl: plaq u e ta s; L: leucocitos;
Li: linfocitos; M o: m o n o cito s; G r: g ra n u lo c ito s; M a: m ac ró fa g o s; E o: eo sin ó filo s; N e; n eu tró filo s; Er: eritro cito s; M O : m éd u la ósea; M eg;
m eg a cario c ito s; C E p: células ep iteliales; C E; cé lu la s e n d o te lia le s; F i: fib ro b la sto s; T i; tim o cito s; C D ; cé lu la s d endríticas; C L: cé lu la s de
L an g e rh a n s; Oc; osteo cla sto s; Ob: osteo b lasto s; C ID : cé lu la s in terd ig itad as; M ié; cé lu la s m ielo id es; LCV:. leucem ia de c é lu la s vellosas.
Bases celulares de la respuesta
inmune. Órganos linfoides primarios
y secundarios
MARTA BRAUN
CONCEPTOS PRELIMINARES
El ingreso de un antígeno no propio dentro
de un organismo induce una respuesta inmune
específica dirigida contra ese mismo antígeno
que, por la adaptabilidad del sistema inmune,
puede tomar distintas modalidades: producción
de inmunoglobulinas de diferentes clases, res­
puesta celular con activación de macrófagos,
efectos citotóxicos, etc. Es el antígeno quien
“elige” los clones de linfocitos específicos, pre­
comprometidos para reconocerlo, a los que va
a activar y que van a producir alguna de esas
respuestas, Pero, para que sucedan todos esos
mecanismos efectores específicos, no sólo de­
ben preexistir linfocitos que reconozcan al antí­
geno, sino que deben interactuar varias pobla­
ciones celulares, que colaboran entre ellas, an­
tes de que sea patente uno o más de esos meca­
nismos efectores.
De estas poblaciones, la única que reconoce
específicamente a los antígenos es la de los lin­
focitos. Pero aunque éstos aparezcan morfoló­
gicam ente idénticos entre sí, son funcional­
mente muy diferentes, no sólo por su especifi­
cidad, para la cual ya están com prom etidos
desde su maduración, sino también por sus fun­
ciones.
Existen dos grandes poblaciones de linfoci­
tos: los linfocitos B y los linfocitos T, Los pri­
meros son los encargados, casi exclusivamente,
de la síntesis de inmunoglobulinas. Los linfoci­
tos T tienen, por el contrario, una serie de fun­
ciones, algunas de ellas efectoras y otras de co­
laboración y regulación, que ejercen sobre los
linfocitos B y sobre otras subpoblaciones de T.
Además, para que se inicie una respuesta inm u­
ne deben colaborar otras células'no linfoides.
3
muy especialm ente las de la serie m onocito-
macrófago.
Así, para que se produzca una respuesta hu­
moral, por ejemplo, si bien los linfocitos B pue­
den reconocer por sí mismos el antígeno para el
cual están comprometidos, pero para que se es­
timulen, se diferencien a plasmocitos y secreten
anticuerpos, deben recibir la colaboración de
una subpoblación de linfocitos T, los linfocitos
T colaboradores o “helper” (Th). Para que los
Th reconozcan al antígeno para el cual están
' pre-comprometidos, éste debe haber sido proce­
sado y presentado, junto con un antígeno de
histocompatibilidad (CMH) propio, por otra cé ­
lula, ya sea un m acrófago u otro linfocito B
(véase cap. 10). A su vez, la respuesta inmune
efectora casi siempre se ejerce con la colabora­
ción de células o factores inespecíficos: por
ejemplo, para que las Igs secretadas tengan un
efecto de protección contra el antígeno extraño,
salvo contadas excepciones, como puede ser la
neutralización de virus o toxinas, deben interve­
nir otras células, como fagocitos o células ki­
ller, o factores, como el complemento.
Por todo esto, se comprende que la respuesta
inmune provocada por un antígeno extraño es
un proceso complicado en el cual intervienen,
en forma de cascada exquisitamente regulada,
una serie de células y factores de los que no to­
dos pertenecen al sistem a específico p ro p ia ­
mente dicho, constituido por los linfocitos.
Las células, tanto específicas como inespecí­
ficas, que intervienen en la respuesta inm une
tienen un origen común, las células troncales
(“stem cells”) de la médula ósea, pero luego
tienen diferentes vías de diferenciación, lo que
da por resultado poblaciones celulares con di­
ferentes funciones. Esta diferenciación se inicia
34 Aspectos básicos de la inmunidad
en los órganos primarios del sistema inmune,
en ausencia de antígenos externos, y luego se
continúa en los órganos secundarios, a conse­
cuencia de la entrada de esos antígenos.
ÓRGANOS LINFOIDES PRIMARIOS
Y SECUNDARIOS
Concepto
Se entiende por órganos primarios (también
llamados centrales) del sistema inmune a aque­
llos que proveen un microambiente en el cual
los linfocitos maduran y adquieren inm uno-
competencia. Los linfocitos inmaduros provie­
nen de células troncales (“stem cells”) de la
m édula ósea (véase ontogenia) y, al salir de
ella, ya están precom prom etidos para la fun­
ción T o B, o sea, son linfocitos pro-T y pro-B,
respectivamente. El microambiente de los ór­
ganos primarios se caracteriza no sólo por la
presencia de células y factores que estimulan la
maduración de los linfocitos, sino también por
la ausencia de antígenos provenientes del me­
dio externo. El órgano primario para la madu­
ración de los linfocitos T es el timo en todos
los vertebrados superiores. Para los linfocitos
B, en las aves es la bursa de Fabricius y en los
m am íferos, sus equivalentes (véase cap. 2,
fig. 2-1).
A estos órganos llegan lin fo cito s p ro v e ­
nientes de la médula que, pese a ser m orfoló­
gicam ente iguales a los maduros, no son in­
munocompetentes, es decir, son incapaces de
reconocer antígenos. Los linfocitos, en gene­
ral, no salen de los vasos, pero llevan en su
superficie moléculas de adhesión (véase cap.
11) que les perm iten adosarse a las vénulas
p o scap ilares del órgano p ara el cual están
comprometidos y así penetrar en la intimidad
de su tejido.
Los órganos secundarios o periféricos del
sistema inmune son aquellos que proveen un
microam biente donde los linfocitos maduros,
tanto B como T f provenientes de los órganos
primarios, pueden interactuar tanto con los an­
tígenos externos como entre ellos y con otras
células accesorias, muy especialmente con las
células presentadoras de antígenos de las línea
monocito-macrófago. Esta interacción o cola­
boración intercelular es la que permite el com­
plicado proceso de la respuesta inmune especí­
fica.
Los principales órganos secundarios son los
ganghos linfáticos, el bazo y el tejido linfático
asociado a las mucosas: amígdalas, placas de
Peyer, tejido linfático asociado al intestino
grueso y delgado, etc. y células linfoides libres
de la submucosa.
TIMO
Origen y desarrollo
El timo es un órgano bilobulado y es el pri­
mer órgano linfoide en aparecer durante el de­
sarrollo fetal. Deriva del endodermo de la ter­
cera y cuarta bolsas branquiales: el endodermo
de dichas bolsas, con parte del ectodermo, pe­
netra en el mesodermo que lo rodea para iniciar
la formación del timo y las glándulas paratiroi-
des; más tarde, el rudimento tímico se separa y
penetra dentro de la cavidad torácica.
La población celular tímica es variada, pues
está compuesto por células provenientes de los
procesos branquiales, sobre todo de origen epi­
telial, y células que penetran en oleadas sucesi­
vas de migraciones a partir de la sangre: son las
de la serie monocito-macrófago y los linfoci­
tos, que aquí son llamados timocitos. En la m a­
durez de un individuo, el 99% de las células tí­
micas son timocitos.
Luego de migrar al tórax, el rudimento tími­
co recibe una primera oleada de hnfocitos, que
es seguida rápidamente de otra oleada de pre­
cursores de linfocitos T. A partir de ese m o­
mento, en condiciones fisiológicas, ya no pene­
trarán al timo nuevas oleadas de células inma­
duras provenientes de la médula ósea, pero su
función se conserva y podría actuar como re­
servorio para una regeneración masiva del ti­
mo, si fuera necesaria en etapas posteriores de
la vida.
Durante el desarrollo fetal y las etapas tem­
pranas de la vida extrauterina, el timo aumenta
de tamaño absoluto y llega a su máximo en la
pubertad, cuándo comienza su involución hasta
llegar a una marcada atrofia. Pero debe remar­
carse que, en la mayoría de las especies inclui­
da la humana, antes del nacimiento, desde el
segundo tercio del desarrollo fetal, comienzan
a salir del timo hnfocitos T maduros inmuno-
competentes, que migrarán hacia los órganos
secundarios y los poblarán. Además, la vida
media de los linfocitos T es muy larga y sus
clones podrían durar incluso más que la vida
del individuo; de hecho, el establecimiento in
vitro de líneas celulares T es muy fácil y mu­
chas han perdurado durante tiempos muy pro­
longados. Estos dos hechos hacen que, en el
momento del nacimiento, en la mayoría de las
especies (salvo en la especie experimental por
antonom asia de la inm unología - e l ra tó n - y
otras pocas excepciones), la función del timo
ya esté cumplida y pueda ser extirpado sin in­
convenientes. De hecho, en los albores de la ci­
rugía cardíaca correctora de m alform aciones
fetales, cuando aún el timo era “un órgano en­
docrino de función desconocida”, los cirujanos
extirpaban el timo de los recién nacidos some­
 Bases celulares de la respuesta Inmune
tidos a operaciones cardíacas, pues les impedía
un acceso fácil al tórax; esos niños no padecie­
ron después deficiencias notables de su sistema
inmune.
Organización
El timo presenta una corteza periférica, una
corteza profunda y una región medular. Es de
hacer notar que en la corteza, tanto profunda
como superficial, existe ima barrera hemato-tí-
mica que impide, o por lo menos disminuye en
gran medida, el paso de proteínas sanguíneas
hacia la intim idad del tejido; esta barrera no
existe en la médula (véase cap. 2, fig. 2-3),
En la corteza superficial, el endotelio de las
vénulas poscapilares presenta una zona más
densa con estructura particular. Los linfocitos
pro-T reconocen estas estructuras por sus m o­
léculas superficiales, se adosan a ellas y de esa
forma llegan a la corteza, donde forman una
delgada capa de pocas células de espesor. Allí
se dividen activamente y dan origen a todos los
otros timocitos. En esta región, los timocitos
son grandes, de aspecto inmaduro y presentan
un alto índice de mitosis. En condiciones nor­
males, esta capa representa menos del 5% del
total de timocitos.
Los timocitos de la corteza superficial mi-
gran hacia la corteza profunda, que contiene un
85% de los timocitos. Esta región se caracteri­
za por la presencia de células de tipo dendríti-
co, de origen epitelial y de aspecto estrellado,
que contactan con otras células similares por
medio de pequeños desmosomas. Hay además
células originadas en precursores hematolinfoi-
des, de la serie monocito-macrófago, como cé­
lulas dendríticas y macrófagos, éstos más abun­
dantes en la médula tímica. En esta región, los
timocitos tienen menor tamaño y están en ínti­
mo contacto entre sí y, especialmente, con las
células de tipo dendrítico, que han sido deno­
minadas células nodrizas, en cuyos repliegues
se alojan en forma tal cjue hasta parecen pene­
trar en ellas. En esta región los linfocitos inm a­
duros sufren una nueva etapa de maduración y
de .selección, para pasar luego a la médula.
En la región m edular, los tim ocitos están
raenos compactados que en la cortical; algunos
son ya linfocitos T maduros, listos para pasar a
la sangre. Aquí también se encuentran células
epiteliales, organizadas a veces en corpúsculos
de Hassall, y un número importante de macró­
fagos. Los vasos de esta zona son altam ente
permeables a las proteínas plasmáticas; los lin­
focitos en su última etapa de maduración en­
tran en íntimo contacto con las proteínas pro­
pias y sufren aquí el último proceso de selec­
ción, que hace a la población migrante alta­
mente tolerante hacia las proteínas propias.
35
Los tim ocitos inm aduros de la co rteza no
sintetizan la enzima 20-hidroxil-esteroide dehi­
drogenasa y son muy sensibles a las hormonas
esteroides. Durante la pubertad, a consecuencia
de la secreción aumentada de estas hormonas,
disminuyen en forma notable, lo cual origina la
involución tímica típica de esa edad. En la mé­
dula, los timocitos más maduros ya expresan
esa hormona y son corticoide resistentes.
Como veremos más adelante, en el tim o no
sólo se producen y maduran los linfocitos T, si­
no que también sufren una rigurosa selección,
por la cual los linfocitos no aptos son elim ina­
dos. Esta selección hace que menos del 1% del
total de los linfocitos producidos emigren del
tim o: el 99% restan te m uere por ap o p to sis
(m uerte programada) en el mismo timo. Este
gasto aparentemente enorme tiene una im por­
tancia biológica también enorme: por una par­
te, sólo emigran los linfocitos capaces de reco­
nocer los antígenos de histocompatibilidad pro­
pios (selección positiva) y los que no reaccio­
nan ni contra éstos ni contra los otros antígenos
propios (selección negativa), lo que hace que la
producción del timo no sólo sea funcionalmen­
te apta, pues reconoce los antígenos de histo­
com patibilidad propios (base de la respuesta
inmune T, véase cap 10), sino también autoto-
lerante, pues no agrede a los tejidos propios.
ORGANOS PRIMARIOS
DEL SISTEMA B
Como se dijo antes, existe en la aves un ór­
gano primario de maduración de los linfocitos
B, que es la bursa de Fabricius: si se extirpa
química o quirúrgicamente la bursa durante el
desarrollo fetal, su sistema B no se desaiTolla.
Sin embargo, la ablación quirúrgica de este ór­
gano en un animal adulto no impide la produc­
ción constante de linfocitos B maduros, lo que
indica cjue esta función cambia de sitio en eta­
pas posteriores al nacimiento.
En los m am íferos, el órgano prim ario del
sistema B puede variar según la especie. E n los
ovinos, la maduración de los linfocitos B suce­
de en el tejido linfoide asociado al intestino
delgado; en el ratón y en el hombre no se ha
encontrado un órgano similar, y se admite que
la producción y maduración de los linfocitos B
se realiza íntegramente en la médula ósea. Las
placas de Peyer han sido propuestas com o ór­
ganos primarios B en otras especies y, en algu­
nos casos, la m aduración de los linfocitos B
podría lograrse en órganos, como el bazo, en
los que los linfocitos pro-B estén en contacto
estrecho entre sí. Sea cual fuere el órgano de
m aduración de los linfocitos B, éstos tienen
una vida media corta y, a diferencia de lo que
36 Aspectos básicos de la inmunidad
sucede con los linfocitos T, su producción y
maduración continúa durante toda la vida del
individuo.
ÓRGANOS SECUNDARIOS
Organización de los ganglios linfáticos
Los ganglios linfáticos son pequeños órga­
nos redondeados u ovoides, que se encuentran
generalmente en grupos, en el tejido adiposo
que rodea a los grandes vasos sanguíneos del
abdomen y el tórax, el de la nuca, el cuello, las
axilas, las ingles y el hueco poplíteo. Dentro de
una cápsula que rodea al órgano y se prolonga
en trabéculas en un estrom a reticular, se en­
cuentra un gran número de linfocitos y células
de las serie monocito-macrófago, no sólo m a­
crófagos sino también células propias de los
ganglios, las células dendríticas.
La circulación de los ganglios linfáticos pro­
viene tanto de la sangre como de los vasos lin­
fáticos y tiene una gran importancia en la mi­
gración de los linfocitos y en la provisión de un
microambiente adecuado para la interacción de
los antígenos con las distintas células inmuno-
competentes y con los anticuerpos (véase fig.
3-1), importante no sólo en la inducción de res­
puestas inmunes sino también en su regulación.
La sangre penetra por el hilio por una arteria
cuyas ramas llegan hasta la corteza superficial.
En esa zona se incurvan y se forman las vénulas
que luego se juntan para formar una vena que
sale por el hilio. En la zona de la curvatura, su
endotelio presenta un aspecto ensanchado parti­
cular y es la región que permite el paso de los
linfocitos de la sangre al interior del gangho.
Los vasos linfáticos tienen su origen en los
diferentes tejidos del organismo y forman una
red de canales, paralelos a la circulación san­
guínea, que recogen el fluido extravasado de
los capilares que, en los vasos linfáticos, recibe
el nombre de linfa. La linfa contiene también
células provenientes de la sangre o los tejidos,
muy especialmente linfocitos y células veladas.
Estas últimas se originan de las células de Lan­
gerhans de la piel y son las encargadas, junto
con los macrófagos, de llevar los antígenos a
los ganglios locales: en éstos se convertirían en
células dendríticas residentes, capaces de cap­
tar antígenos y de mantenerlos in situ por tiem ­
pos prolongados.
La linfa llega al ganglio local por los vasos
aferentes que desembocan en un seno que ro­
dea a la corteza, en la periferia del ganglio. De
allí filtra por el interior del ganglio, en un ca­
mino paralelo al de la sangre, y luego sale por
el hilio, por un linfático eferente. Los linfáticos
eferentes de varios ganglios se juntan entre
ellos y, eventualmente, desembocan en la san­
gre, a través del conducto torácico u otros co­
lectores linfáticos. De esta forma se establece
una recirculación constante entre la sangre y la
hnfa, que permite el pasaje no sólo de los flui­
dos sino también de las células, a través de los
ganglios linfáticos. Esta recirculación permite
la migración permanente de los linfocitos entre
la sangre y los órganos linfoides secundarios y,
eventualmente, los tejidos.
Los ganglios linfáticos están divididos en
tres áreas principales; la corteza superficial, la
corteza profunda y la región medular (fig. 3-1).
En las dos primeras predominan los linfocitos,
y entre ellos corre esa red de canales linfáticos
que van de la corteza a la médula.
En la corteza superficial, los linfocitos están
en íntimo contacto, muchos de ellos organiza­
dos en nódulos o folículos, compuestos en gran
proporción por linfocitos B; entre los folículos
hay linfocitos repartidos sin organización parti­
cular; la mayoría de ellos son T. Si, a partir de
Vénulas
F ig . 3 -1 . E s q u e m a de
un ganglio linfático. N ó­
te n se las d ife re n te s r e ­
giones tim odependientes
y tim o in d e p e n d ie n t e s
(véase el texto) y la cir­
c u la c ió n d e lin fa y d e
lin fo c ito s p ro v e n ie n te s
de la sangre.
 Bases celulares de la respuesta inmune
la zona que drena ese ganglio penetra un antí­
geno y se estimula la respuesta, los folículos se
agrandan y dan lugar a los llamados folículos
secundarios; en ellos aparece un área central
con células grandes y en mitosis: son los llama­
dos centros germinativos.
Los linfocitos T predominan entre los folícu­
los y en la zona medular: es la llamada zona ti­
mo-dependiente pues no se desarrolla en ani­
males timoprivos o en pacientes con deficien­
cias tímicas, en los que sólo se aprecian los fo ­
lículos primarios bien desarrollados.
En la zona que rodea a los folículos, además
de los linfocitos T y entre las células del estro­
ma, se encuentran numerosas células dendríti­
cas, cuya importante función es retener y pre­
sentar los antígenos a los linfocitos: se han en­
contrado determinantes antigénieos sobre célu­
las dendríticas mucho tiempo después que el
antígeno fuera inyectado.
Es interesante tener en cuenta que, pese a
que en el caso de una estimulación antigénica
se producen mitosis en los ganglios regionales,
la gran mayoría de los linfocitos que están en
un momento dado en los ganglios no son de
producción local, sino que provienen de la
sangre. Los vasos sanguíneos son normalmen­
te impermeables a los linfocitos, pero en la re­
gión subcapsular de los ganglios, las vénulas
poscapilares ya m encionadas expresan m olé­
culas de adhesión que son reconocidas por glu­
coproteínas superficiales de los linfocitos, tan­
to los T como los B de memoria. Éstos se ado­
san a la pared del vaso, lo atraviesan y pene­
tran en el tejido linfático, pero sólo permane­
cen unos pocos días en el ganglio, pues van
migrando hacia la médula, para salir luego por
la linfa y comenzar un nuevo ciclo de recircu­
lación.
Es de hacer notar que existe una importante
selectividad en la recirculación de los linfoci­
tos: si se marcan e inyectan linfocitos prove­
nientes del conducto torácico o de ganglios su­
perficiales, la gran mayoría se encontrará luego
en los ganglios superficiales mientras que, si se
inyectan linfocitos de bazo, se hallarán en el
bazo en grandes proporciones. Los hnfocitos
de los órganos linfoides asociados a las m uco­
sas tienen también sus rutas propias de recircu­
lación (véase cap. 17). Todas estas rutas están
dirigidas por una serie de moléculas superficia­
les, muchas de ellas ya conocidas (véase cap.
11), que permiten el pasaje de los linfocitos de
la sangre al tejido.
Organización del bazo
El bazo es un órgano abdominal cuya fun­
ción inmune en el adulto es filtrar partículas de
la sangre y concentrar antígenos circulantes; en
37
efecto, la respuesta inmune frente a antígenos
circulantes se hace principalmente en el bazo.
Tiene además función de reservorio sanguíneo,
poco importante en el hombre pero muy im por­
tante en algunas especies, es el encargado de la
hemocatéresis (destrucción de eritrocitos enve­
jecidos) y en ciertas patologías puede retom ar
funciones de hemopoyesis propias del feto. Es­
tas últimas funciones se cumplen en la pulpa
roja, rica en capilares sinusoides y con alto
contenido en eritrocitos, que forma la m ayor
parte del bazo.
La pulpa blanca, donde se cumplen las fun­
ciones inmunes del bazo, forma pequeños hu­
sos alrededor de las pequeñas arterias y las ar­
teriolas. Cada huso rodea a una arteriola, que
termina en una vénula, que nace al final de la
arteriola y se vuelve hacia atrás, formando el
seno marginal, que separa la pulpa blanca de la
roja. Por este seno los linfocitos penetran direc­
tamente de la sangre al tejido linfoide y luego,
a semejanza de lo que sucede en los ganglios,
migran lentamente a través del tejido del m an­
guito. Pasan después a la pulpa roja y abando­
nan el bazo por su vena y por sus vasos linfáti­
cos. En los husos, al igual que los ganglios, hay
regiones timodependientes y timo independien­
tes: la primera, rica en linfocitos T y en células
dendríticas y macrofágicas, es un manguito ar-
teriolar de tejido linfoide difuso que rodea in­
mediatam ente a la arteriola; la segunda com ­
prende folículos y nódulos que rodean a ese
manguito.
Tejido linfoide asociado a las mucosas
Todas las mucosas presentan acúmulos sube-
piteliales de tejido hnfoide, que en estas regio­
nes tiene la particularidad de no estar rodeado
por una cápsula de tejido conectivo. Este tejido
linfoide puede presentarse como colecciones
difusas de linfocitos, plasmocitos y macrófagos
dispersos en la lámina propia de los órganos, o
bien como acúmulos más organizados con folí­
culos semejantes a los de otros órganos secun­
darios: en el hombre éstos incluyen las am ígda­
las, las placas de Peyer y el apéndice cecal. En
su superficie mucosa, estos acúmulos presentan
células epiteliales especializadas capaces de
captar antígenos. Los hnfocitos que fueron esti­
mulados en los acúmulos pasan a la linfa y de
allí a los ganghos mesentéricos y a la sangre.
Del torrente sanguíneo migran a la lámina p ro ­
pia de las mucosas, donde aparecen dispersos y
se transforman en células productoras de IgA o
IgE.
La importancia de este sistema, la migración
especializada de los linfocitos que lo com po­
nen y su papel en la protección del individuo se
verán con más detalle en el capítulo 17.
38 Aspectos básicos de la Inmunidad
La médula ósea como órgano secundario
Si bien en el ratón y en el hombre la médula
ósea actúa como órgano primario del sistema
inmune, también tiene función de órgano se­
cundario; los linfocitos B estim ulados en los
ganglios periféricos migran a la médula donde
se diferencian a plasm ocitos. La m édula se
convierte así en un importante sitio de síntesis
de Igs, sobre todo en los períodos tardíos de la
respuesta inmune primaria y en las respuestas
secundarias.
Captación de los antígenos
en los órganos secundarios
Los antígenos que penetran del exterior se­
rán tomados por los distintos órganos secunda­
rios según sea su vía de entrada y su estructura
físico-química. En general, los antígenos solu­
bles, salvo que sean captados por alguna célu­
la, no van a quedarse en un órgano secundario:
por esta razón, es raro que induzcan respuestas
inmunes positivas y tendrán tendencia a indu­
cir tolerancia (véase cap. 18). Generalmente,
las sustancias extrañas, muy especialmente si
son particuladas, y más aún si están opsoniza-
das, son captadas por las células fagocíticas.
Estas los van a digerir y procesar, para luego
presentar sus determinantes antigénicos en la
superficie unidos a los antígenos de histocom­
patibilidad de clase II. Si penetran a los espa­
cios intercelulares de cualquier tejido y son
captados por macrófagos, éstos migran a los
ganglios drenantes. En la piel, pueden ser to­
mados por células de Langerhans, que luego
migran hacia el ganglio en form a de células
veladas. En el caso de antígenos que no hayan
sido englobados por un fagocito, pueden toda­
vía ser captados en los órganos secundarios,
siempre que exista por lo menos una pequeña
cantidad de anticuerpos contra ese antígeno y
se formen complejos; en este caso, las células
dendríticas, que tienen receptores para el Ec de
las inmunoglobulinas, pueden fijar el complejo
sobre su superficie. En algunos tejidos existen
macrófagos fijos (células de Kupffer del híga­
do, macrófagos alveolares). A quí el antígeno
queda en el lugar y no interviene en la estim u­
lación del sistema inmune, pero podría actuar
como reservorio y estimularlo más tarde, pues­
to que se ha comprobado que el antígeno del
interior de estas células está en equilibrio con
el antígeno circulante.
Los antígenos que penetran en los ganglios
junto con un macrófago, por la particular circu­
lación en los ganghos pueden llegar hasta las
zonas tim odependiente y tim oindependiente.
Dado que los linfocitos están migrando perma­
nentemente por estas zonas, la posibilidad de
que cada determinante se encuentre con un lin­
focito que lo reconozca aumenta notablemente.
En el caso de que penetre un antígeno libre
por la zona cortical, puede interactuar con célu­
las dendríticas, siempre que exista suficiente
proporción de anticuerpos. La concentración
del antígeno va disminuyendo de la corteza a la
médula y la de los anticuerpos va aumentando
paralelamente, en razón de la particular circula­
ción del ganglio; en esta forma aumentará las
posibilidades de que sea fijado por células den­
dríticas. Estas diferencias en las concentracio­
nes de los antígenos y los anticuerpos en la di­
ferentes zonas de los ganglios tiene también
importancia en la regulación de la respuesta in­
mune.
En el bazo sucede un fenómeno parecido a
partir de la sangre, pues allí también los antíge­
nos penetran a contracorriente de la migración
de los linfocitos, lo que favorece la interacción
entre ambos.
M ADURACIÓN DEL SISTEMA INMUNE
Las células que intervienen en las respuestas
inmunes provienen de los órganos hematopo­
yéticos, donde células troncales darán origen a
los distintos elem entos formes de la sangre.
Provengan de una misma célula troncal o de
células diferenciadas para precursores de linfo­
citos T o B, los linfocitos que migran de la m é­
dula ósea ya son pro-B o pro-T pero, para con­
vertirse en células inmuno-competentes, nece­
sitan (sobre todo los T) del microambiente pro­
picio que les ofrece el órgano primario. Como
ya se mencionó, éste es elegido por el linfocito
inmaduro circulante mediante sus moléculas de
adhesión superficiales. En estos órganos, los
linfocitos inmaduros comenzarán a sintetizar y
expresar en su superficie una serie de molécu­
las que les permitirán, por una parte, reconocer
a un determinante antigénico particular y, por
la otra, interactuar con las otras células involu­
cradas en la respuesta inmune (véase cap. 2,
figs. 2-2 y 2-3).
De todas las moléculas superficiales, la más
indispensable es el receptor para el antígeno.
Este se adquiere durante la maduración, m e­
diante un reacomodamiento del material gené­
tico en células somáticas, que implica pérdida
de su ADN. Este proceso, que se describe en
detalle en los capítulos 6 y 7, se realiza en au­
sencia de antígenos extraños e implica que ca­
da linfocito que maduró y sus descendientes
tengan una secuencia particular y única en la
zona que codifica para su receptor antigénico,
que le da una especificidad fija. En los linfoci­
tos T, esta secuencia no varía para nada durante
toda la vida de la célula, que es larga, ni varía
 Bases celulares de la respuesta inmune
tampoco durante sus mitosis, de modo que ca­
da linfocito maduro formará un clon, capaz de
reconocer un único determ inante antigénico.
Debe tenerse muy en cuenta que estos clones
existen independientem ente de la entrada del
antígeno que serán capaces de reconocer. Si
uno o más de los linfocitos de ese clon interac­
ciona con el antígeno para el cual están com ­
prometidos, sucederán nuevas mitosis, sin cam ­
bios nuevos para los linfocitos T pero con la
posibilidad de mutaciones puntuales para los
linfocitos B (véanse caps. 6 y 7).
Es de hacer notar que, en la mayoría de las
especies, en el momento del nacimiento el pro­
ceso de maduración de los linfocitos y su m i­
gración a los órganos secundarios ya se ha rea­
lizado, es decir, que el individuo es inmunoló-
gicamente maduro.
Maduración de los linfocitos B
La maduración y activación de los linfocitos
B se cumple en una serie de etapas; comienza
durante la vida fetal y se continúa durante toda
la existencia del individuo, pues los linfocitos
B tienen vida corta y son renovados constante­
mente. En el órgano primario, los linfocitos B
adquieren esa molécula importantísima que, no
sólo los distingue de otros linfocitos no B, sino
que es fundamental para su funcionalidad, que
es la inmunoglobulina (Ig) de superficie y que
actúa como receptor para el antígeno (véase
cap. 2, fig. 2-2).
La existencia de Ig sobre la superficie de los
linfocitos B y sólo de los B, se conoce desde
hace tiempo, y se la considera, como el princi­
pal marcador de la serie B, Luego se demostró
que esta Ig es sintetizada por el propio linfocito
y que, si bien puede cambiar en la región cons­
tante, es prácticam ente idéntica en su región
variable a la Ig que secretará ese linfocito y sus
descendientes luego de su estimulación por el
antígeno. A este respecto, cabe remarcar que la
Ig de superficie es algo más larga que la circu­
lante, puesto que en el extremo C terminal tie­
ne dos dominios más, uno hidrofóbico, que es
el que atraviesa la membrana y un último h i­
drofílico, que permanece en el citoplasma. La
capacidad del sistem a inm une para producir
tantos clones con tantas especificidades distin­
tas se debe al reacomodamiento del ADN que
codifica para la región variable de esta Ig.
Dado que la membrana celular es fluida, las
moléculas superficiales pueden moverse. La in­
teracción de las Igs superficiales con ligandos
polivalentes, ya sean antígenos o anticuerpos
,dirigidos contra ellas, que puedan form ar un
enrejado sobre su superficie, lleva a la form a­
ción de casquetes (“capping”) o sea, a la acu­
mulación de todas las moléculas sobre un polo
39
de la célula. Estas m oléculas y sus ligandos
pueden ser luego interiorizados por pinocitosis,
lo cual tiene gran importancia en la capacidad
del linfocito B de presentar antígenos a los lin­
focitos T, o para eliminarlos.
N um erosos experim entos han dem ostrado
que la Ig superficial es la que actúa com o re­
ceptor antigénico del linfocito B y que la unión
de una ligando a esta Ig inicia una serie de
eventos que culmina con el envío de una señal
activadora del linfocito. Si bien la Ig es la en­
cargada de reconocer específicamente al antí­
geno, para su función receptora no está sola si­
no t]ue forma un complejo multimolecular su­
perficial, pues está acompañada por otras molé-
lulas que no sólo la fijan sobre la membrana si­
no que contribuyen al envío de la señal al inte­
rior de la célula.
En una primera etapa, el linfocito en m adu­
ración reacomoda el ADN que codifica para la
cadena pesada y comienza a sintetizar cadenas
de clase p,. Estas no se expresan en la m em bra­
na, pero pueden ser detectadas en el citoplas­
ma; es la etapa de linfocito pre-B. Luego reaco­
moda la cadena liviana y, ahora sí, esta m olé­
cula puede expresarse en la membrana.
A partir de este momento, el linfocito B pue­
de reconocer al antígeno, pero es un linfocito B
inmaduro, que tiene la particularidad de que el
encuentro con el antígeno específico lo lleva a
la tolerancia. Si bien se discute aún cuáles son
los m ecanism os que llevan a la tolerización
de los linfocitos B inmaduros, su efecto fisioló­
gico es la eliminación funcional de los linfoci­
tos autorreactivos, pues los Ags propios entran
en contacto con ellos durante esta etapa.
En un paso siguiente, por empalmado (“sph-
cing”) alternativo del ARN de la cadena pesa­
da, el linfocito com ienza a sintetizar Ig D e
IgM. Se trata ahora de un linfocito maduro, al
cual el encuentro con su Ag específico llevará
a la activación. Estos linfocitos maduros, que
sintetizan simultáneamente IgM e IgD y expre­
san ambas en la membrana, salen de los órga­
nos primarios y migran a los órganos secunda­
rios donde formarán los folículos prim arios.
Algunos linfocitos expresan también IgA en la
superficie desde esta etapa y se encuentran en
el tejido linfoide asociado a las mucosas (véase
cap. 17). De no mediar un estímulo antigénico,
este linfocito maduro virgen tiene vida corta,
no recircula y muere en menos de 30 días en la
m ayoría de las especies. Si hay un contacto con
el Ag y con factores de los linfocitos T (véanse
caps. 2 y 13), suceden una serie de nuevas eta­
pas de mitosis y diferenciación, que converti­
rán al linfocito B maduro en plasmocitos, p ro ­
ductores de Igs, también de vida corta, o bien
en linfocitos B de memoria, de vida más larga
y recirculantes. Esta diferenciación está gene-
40 Aspectos básicos de la inmunidad
raímente acompañada de otros dos fenómenos:
por una parte, puede haber una nueva pérdida
de ADN, y el linfocito ya no podrá sintetizar
IgM e IgD y sólo sintetizará otras clases de Igs:
es el llamado “sw itch” o cambio de Igs; por
otra parte, por empalme o “splicing” alternati­
vo del ARN, se pueden perder los dominios in-
tramembrana e intracitoplasmático de la Ig, de
modo que ésta no queda fijada a la membrana
sino que se secreta; las células que sufren este
proceso son las que se diferencian a plasmoci­
tos (véase cap. 2, fig. 2-2).
Plasmocitos
En el caso de diferenciación a plasmocito, la
célula sufre varios procesos, entre los que se
incluye una diferenciación morfológica, pues
adopta el típico aspecto de célula ovoide, de
abundante citoplasma y núcleo excéntrico y en
rueda de carro. La iniciación de la diferencia­
ción a plasmocito se hace en las regiones ti-
moindependientes de los órganos secundarios,
y muchos de los plasmocitos se encuentran en
folículos de bazo, ganglios o tejido linfoide
asociado a las mucosas. Una proporción impor­
tante de ellos migra y puede establecerse en
otras regiones del ganglio o bazo, en la médula
ósea o como células linfoides no organizadas
en las submucosas.
El plasmocito es una célula terminal, que vi­
ve pocos días y cuya única función es la secre­
ción de Igs. Toda la Ig que produce es de tipo
circulante, sin región intram em brana ni cito­
plasmática. Esta célula ha perdido la Ig de su­
perficie, así como otros receptores funcionales
de linfocitos B. Por lo tanto, ya no podrá ser
activada ni ser pasible de regulación negativa.
Maduración de los linfocitos T
Las primeras observaciones que permitieron
comprobar que el sistem a inm une posee dos
grandes tipos de respuestas, humoral y celular,
adjudicaron sólo la función de inmunidad m e­
diada por células al sistema T y a ésta, casi ex­
clusivamente la de vigilancia inmunológica an-
titumoral. Poco después, se comprobó que la
función de las células derivadas del timo era
muchísimo mayor, pues se vio que su colabora­
ción es indispensable para prácticamente todas
las respuestas humorales. Al adjudicársele tam­
bién una importante función de regulación, por
medio de los linfocitos T supresores, el timo
pasó a ser considerado como “el director de la
orquesta inmunológica”. Ninguno de estos con­
ceptos ha perdido vigencia hoy, pero debe te­
nerse en cuenta que no es el timo, p er se, el que
dirige la orquesta, sino las células que en él
maduraron, que poblaron los órganos secunda­
rios y que permanecerán recirculando durante ■
la vida del individuo. A este respecto, en vista
de la dispensabihdad del timo desde el naci­
miento en la mayoría de las especies incluida
la humana, muchos autores han postulado que
existirían órganos extra-tím icos que cum pli­
rían la función de maduración de los linfocitos
T durante la vida extrauterina. Sin embargo, en
vista de la larga vida de los linfocitos, cuyos
clones pueden perdurar in vitro indefinidamen­
te, muchos autores aceptan hoy que tales órga­
nos no son necesarios y que los clones m adu­
rados en el timo durante la época fetal pueden
acompañar al individuo durante toda su vida.
Otra consideración que conviene hacer al res­
pecto, es que existen mecanismos, aún no co­
nocidos, que mantienen más o menos estable
la población total de hnfocitos T de un indivi­
duo. Después de cada estimulación antigénica
se produce una im portante expansión de los
clones que reconocen al inmunógeno y, a dife­
rencia de lo que pasa con los plasmocitos, un
gran número de los hnfocitos T no mueren lue­
go de cumplir su función, sino que se diferen­
cian a células T de memoria. Ello no significa
que la población total de linfocitos T aumente
indefinidamente durante toda la vida a conse­
cuencia de los estímulos antigénieos repetidos
que recibe cualquier individuo normal. Si bien
existen mecanismos homeostáticos que inter­
vienen para mantener constante la población T
total, muchos de esos mecanismos no son co­
nocidos aún.
Así como el conocimiento sobre la im por­
tancia del timo se logró mediante estudios en
el ratón, una de las pocas especies en que la ti­
mectomía neonatal lleva a la desaparición de la
función T, la maduración de los linfocitos T se
estudió también en el ratón y luego en el hom ­
bre. Si bien no se ha estudiado en todas las es­
pecies, los datos obtenidos hasta ahora en es­
pecies dom ésticas de vertebrados superiores
sugieren que seguirían pasos similares en to­
dos éstos.
Durante su maduración, los hnfocitos T ad­
quieren la molécula principal para su función,
el receptor antigénico o TCR, en una forma si­
milar a la adquisición de la Igs por parte de los
linfocitos B, es decir, por reacomodación con
pérdida del ADN que codifica para el receptor.
Pero también adquieren y pierden otra serie de
moléculas, con importantes funciones, cuya lis­
ta y modo de detección se detallan en el capítu­
lo 2 (fig. 2-3).
Como ya se mencionó, los linfocitos pro-T
provenientes de la médula, se alojan en la cor­
teza superficial del timo y comienzan a sufrir
varios ciclos de mitosis. Durante estos ciclos,
se hace el reacomodamiento del ADN que co­
difica para las diferentes cadenas del TCR.
 Bases celulares de la respuesta ¡nmune
En los primeros estadios de maduración, las ca­
denas que se reacomodan son las j y 5, que dan
origen a linfocitos j/5 positivos. Estos, por lo
menos en el hombre, tienden a disminuir en pe­
ríodos posteriores de la vida, y se los encuentra
especialmente en los tejidos linfáticos asocia­
dos a las mucosas. Luego comienza la reaco­
modación del ADN de las cadenas (3 y a , según
se datalla en el capítulo 7. El TCR se expresa
en la membrana en un complejo polimolecular,
unido al CD3, cuya función será, no sólo la de
anclar el TCR a la membrana, sino también la
de contribuir para el envío de la señal de acti­
vación del linfocito T. También comienzan a
sintetizarse y expresarse otras dos moléculas
importantes en la activación del linfocito T: el
CD4 y el CD8.
Estos linfocitos CD4+-CD8^ positivos se en­
cuentran en gran cantidad en la corteza profun­
da del timo. En estos momentos el linfocito en
maduración es capaz de reconocer antígenos,
pero conviene tener en cuenta desde ya que lo
único que puede reconocer un linfocito T ma­
duro son los antígenos de histocompatibilidad
propios, de clase I o IL unidos a un péptido
propio o extraño. Comienza ahora el proceso
que en una época se llamó aprendizaje tímico,
pero se trata más bien de una selección tímica,
pues los linfocitos no seleccionados mueren.
Esta selección tiene dos etapas: una selec­
ción positiva y una negativa. La primera, es la
que permite vivir a aquellos linfocitos inmadu­
ros que sí reconocen antígenos propios de Cla­
se I o II. En efecto, el reordenamiento de las
cadenas a y P del TCR se hace al azar, por lo
que sólo una proporción relativamente pequeña
de los linfocitos que reacomodaron su TCR re­
conocerá los alelos propios, ya sean de Clase I
o II. Las células de origen epitelial del timo ex­
presan ambas clases de antígenos de histocom­
patibilidad. En esta etapa, el timocito en madu­
ración ha activado su sistema de muerte pro­
gramada o apoptosis: si en este momento no es
capaz de reconocer algunas de las proteínas de
clase I o II que las células le muestran, muere
por apoptosis. Si en cambio reconoce alguna de
esas moléculas de histocompatibilidad, recibe
una señal que anula la muerte program ada y
continúa su ciclo.
Este linfocito así rescatado pasa entonces a
alojarse entre los repliegues de la membrana de
las células nodrizas, dónde puede continuar su
maduración. La clase del antígeno que ha reco­
nocido también es importante; si reconoció una
molécula de Clase I, se reprime el gen que co­
difica para CD4 y el linfocito continúa sinteti­
zando sólo CD8, Por el contrario, si reconoció
Clase II, se reprime el gen para el CD8 y el lin­
focito sólo sintetizará CD4, La consecuencia fi­
siológica de esta selección positiva es que sólo
41
saldrán del timo linfocitos funcionales, es de­
cir, linfocitos capaces de reconocer los antíge­
nos de histocompatibilidad propios (véase cap.
2, fig. 2-3).
D ado que el reacom odam iento se hace al
azar, pueden surgir linfocitos capaces no sólo
de reconocer sino también de reaccionar contra
antígenos de histocompatibilidad propios uni­
dos a péptidos propios, es decir, capaces de ini­
ciar reacciones autoagresivas. Este hecho ha
llevado a que evolucione una segunda form a de
selección, una selección negativa, que se lleva
a cabo mayoritariamente en la médula del timo.
No está demostrada cuál es la diferencia entre
reconocim iento simple y reconocim iento con
reacción, pero muchos autores la atribuyen a
una diferencia en la afinidad de unión del TCR
con su antígeno específico. Sea por interacción
de alta afinidad o por otra causa, un reconoci­
miento de antígenos propios seguido de reac­
ció n , lleva al lin fo c ito en m ad u ració n a la
muerte, en este caso a cargo de los macrófagos
medulares.
Debe tenerse en cuenta que, en la médula, la
barrera hematotímica ya no existe, y las proteí­
nas plasmáticas pueden penetrar allí. P o r otra
parte, las células propias del timo sintetizan un
gran número de moléculas típicas de otros ór­
ganos. Esto perm ite que, para casi to d o s las
proteínas propias del organismo, cuyos pépti­
dos sean presentados junto con antígenos tanto
de clase I como II, exista tolerancia, pues los
clones capaces de reaccionar contra ellos han
sido eliminados por esta selección negativa.
Los linfocitos que han terminado su madura­
ción y han sido así seleccionados están en con­
diciones de abandonar el timo y dirigirse a los
órganos secundarios, a través de los cuales, co­
mo ya se explicó, recirculan en forma de linfo­
citos maduros vírgenes, hasta tanto encuentren
al antígeno para el cual están precomprometi­
dos para reconocer y reaccionar.
Subpoblaciones funcionales
de los linfocitos T
De lo expresado antes, se d esp ren d e que
ex isten dos grandes clases de lin fo cito s T:
aquellos que reconocen antígenos de C lase I y
expresan CD8 y los que reconocen los de Cla­
se II y expresan CD4, La distribución y fun­
ciones de estas dos moléculas se detallan en el
capítulo 10, pero conviene tener desde ya en
cuenta que los de Clase I se expresan en casi
todas las células del organismo y salen a la su­
perficie unidos a péptidos de proteínas sinteti­
zadas en la mism a célula; en cambio, los de
Clase II, se expresan casi exclusivam ente en
los linfocitos B y las células de la línea mono­
cito-macrófago, que son células especializadas
42 Aspectos básicos de la Inmunidad
para la presentación de antígenos a los linfoci­
tos T, y salen a la superficie unidos a pépfidos
de proteínas que han sido fagocitadas o pinoci-
tadas por la célula.
Es de comprender entonces que los linfoci­
tos T CDS positivos pueden interactuar con ca­
si cualquier célula del organismo y pueden re­
conocer y reaccionar con cualquiera de ellas
que esté sintetizando proteínas no propias, co­
mo pueden ser las proteínas de un virus. La
función de estos linfocitos es principalm ente
citotóxica, pero también producen factores de
colaboración y regulación. T am bién en esta
subpoblación se ha determinado la presencia de
función supresora, muy discutida en este mo­
mento.
Por el contrario, los linfocitos CD4-I- sólo
pueden interactuar con células presentadoras de
antígeno y reconocen y reaccionan contra antí­
genos que hayan sido internalizados y procesa­
dos previamente por una de ellas. Esta pobla­
ción CD4-H no tiene en general función efectora
directa sino que produce factores solubles de
colaboración y constituyen la población de Th.
No se han encontrado diferencias entre los
linfocitos CD4+ vírgenes, es decir entre los que
atin no han encontrado a su antígeno. Pero en­
tre los Th previamente sensibilizados o de me­
moria, pueden reconocerse dos subpoblaciones:
los Thl y los Th2, que se diferencian por la
concentración en que expresan un biotipo de la
molécula CD45. No hay acuerdo en si los lin­
focitos Th están precomprometidos para dife­
renciarse a una de estas dos subpoblaciones an­
tes de la estimulación por el antígeno, pero evi­
dencias recientes apuntan a que el m icroam ­
biente y las señales que reciben al ser estimula­
dos por el antígeno son esenciales para que se
conviertan en una u otra subpoblación luego de
su primer contacto con el mismo (véase cap.
18). Sea cual fuere el origen de estas dos sub­
poblaciones, sus funciones son diferentes.
Los Thl son efectores y capaces de llevar a
la agresión: al ser estimulados por el antígeno
producen y secretan al medio una serie de lin­
foquinas, cuyo efecto es activar a los macrófa­
gos y aumentar su capacidad citolítica, lo que
da por resultado una reacción inflamatoria cró­
nica, cuyo exponente más típico es la hipersen-
siblidad tardía. Por el contrario, los Th2, al ser
estimulados, producen y secretan al medio una
serie de interleuquinas, cuya función es colabo­
rar con los linfocitos B, lo que da por resultado
una respuesta humoral. Además, ambas supo-
blaciones pueden ser también regulatorias e in­
cluso citotóxicas.
Como se verá en detalle en otros capítulos,
los linfocitos T ejercen realmente un número
grande de funciones muy diferentes y son, ver­
daderamente, directores de la orquesta inmuno-
lógica. Lo que no es real es dividirlos, como se
hace muy a menudo, en subpoblaciones funcio­
nalmente rígidas, y atribuir a los CD8-H las fun­
ciones citotóxicas y supresoras y a los CD4, las
de colaboración e hipersensibilidad tardía, pues
todas estas funciones son influenciables por las
señales que va recibiendo cada linfocito T du­
rante su larga vida.
Linfocitos no-T no-B
Además de las dos grandes poblaciones de
linfocitos T y B, existe otra población de linfo­
citos que no presenta moléculas superficiales
propias de los linfocitos T ni de los B. Estos
linfocitos “nulos” no pertenecen al sistema in­
mune específico, pues no tienen receptores pa­
ra el antígeno, por lo que no se los puede consi­
derar funcionalmente como linfocitos propia­
mente dichos, sino que son células pertenecien­
tes a los sistemas inespecíficos de protección.
Estas células son además distinguibles morfo­
lógicamente de los linfocitos específicos, pues
son más grandes que ellos y presentan granula­
ciones en su citoplasma, por lo que se los ha
llamado linfocitos grandes granulares (LGL).
Su función es principalm ente citotóxica: son
las encargadas de la citotoxicidad espontánea,
es decir, son las células citotóxicas naturales o
NK y también ejercen función de citotoxicidad
celular anticuerpo dependiente (véase cap. 21).
Células de la línea monocito-macrófago
Los linfocitos T y B son las únicas células
capaces de reconocer y distinguir entre sí a los
diferentes antígenos y de reaccionar contra
ellos, es decir, son las únicas células específi­
cas. Pero para ejercer su función inmune nece­
sitan de la colaboración de otras células, tanto
en la fase aferente de la respuesta como en su
fase eferente o efectora. Las principales células
que colaboran con ellos son las de la línea mo-
nocito-m acrófago, pertenecientes al llam ado
sistema reticuloendotelial.
Estas células también se originan en la mé­
dula, a partir de células troncales, que por dife­
renciación producen monocitos que salen a la
circulación sanguínea (véase cap. 2, fig. 2-1).
Estos abandonan la sangre y, en los diferentes
tejidos, se diferencian tomando formas distin­
tas pero manteniendo, en general, funciones si­
milares. Una gran proporción se diferencia a
macrófagos residentes (por ej., macrófagos al­
veolares en el pulmón, células de Kupffer en el
hígado), de vida larga, con función macrofági­
ca pero que, como ya se dijo, no intervienen
activamente en la presentación de antígenos y
no expresan normalmente antígenos de histo­
compatibilidad de clase II.
 Bases celulares de la respuesta inmune
Los macrófagos propiamente dichos son cé­
lulas migratorias que se encuentran en todo el
tejido conectivo, en especial rodeando la m em ­
brana basal de los pequeños vasos sanguíneos;
como ya se mencionó, se encuentran también
en los órganos linfoides primarios y secunda­
rios. Estas células tienen vida larga y presentan
un retículo endoplásmico bien desarrollado y
m itocondrias. Una proporción im portante de
estas células expresa antígenos de histocompa­
tibilidad de clase II y son capaces de presentar
antígenos a los linfocitos Th. También ejercen
funciones efectoras, pues son fagocíticos y
pueden lisar la m ayoría de las partículas que
han ingerido. Como veremos en otro capítulo,
son activados por las linfoquinas de los hnfoci­
tos T hl, lo que los hace mucho más activos en
su función lítica.
En otros tejidos, los monocitos se diferen­
cian en otros tipos celulares: células de Langer­
hans en la piel, células veladas en la linfa y cé­
lulas dendríticas de los ganghos, que ya fueron
mencionadas. En los glomérulos renales, cons­
tituyen las células mesangiales, en el sistema
nervioso central, la m icroglia y en el tejido
óseo, los osteoclastos.
Todas estas células tienen características su­
perficiales propias, reconocibles por anticuer­
pos monoclonales dirigidos contra sus molécu­
las de superficie y, además de los antígenos de
histocompatibilidad de clase I y II, expresan re­
ceptores comunes, funcionalmente muy im por­
tantes, como son los receptores para el Ec de
las Igs y para el C3b del complemento. Estos
receptores, que actúan sinergísticamente, p er­
miten la fijación de partículas opzonizadas so­
bre su superficie, lo cual produce un importan­
te aumento de su capacidad fagocítica.
Fagocitosis y lisis
La fagocitosis es un mecanismo inespecífico
de defensa, pero es a menudo el primer paso
que llevará a la iniciación de una respuesta in­
mune. Es una función ejercida por los macrófa­
gos y también por los leucocitos polimorfonu­
cleares o neutrófilos. Estos últimos son células
también provenientes de la médula, pero son de
vida corta y no expresan antígenos de h isto ­
compatibilidad de clase II, por lo cual no ejer­
cen función de presentación antigénica. Tienen
abundante cantidad de glucógeno y poseen tres
tipos de gránulos: los primarios o azurófilos,
que contienen m ielopero x id asa, liso zim a y
otras proteínas catiónicas; los secundarios, que
poseen lactoferrina y lisozima, y los terciarios,
parecidos a los hsosomas convencionales, que
contienen hidrolasas ácidas.
Tanto los macrófagos como los neutrófilos
ingieren partículas no solubles, no por recono­
43
cerlas como antígenos extraños, sino en forma
mecánica, al envolverlas con sus seudopodios.
La fagocitosis es más eficiente si, por alguna ra­
zón, la adherencia entre la membrana del fago­
cito y la partícula se ve aumentada. Esto puede
suceder por cargas eléctricas diferentes y com ­
plementarias y, muy especialmente, cuando la
partícula está recubierta por Igs y/o C3b; los fa­
gocitos, que tienen receptores que ligan ambas
sustancias, se pegan en ellas, con lo cual la ad­
herencia de la partícula está asegurada.
La partícula adherida a la membrana celular
es rodeada por los seudopodios de la célula,
que la abrazan y terminan uniéndose entre sí,
dejando englobada la partícula en un fagosoma,
dentro del citoplasma. La fagocitosis de partí­
culas viables, como las bacterias, es seguida
muy a menudo (pero no siempre) de lisis. Esta
se lleva a cabo por dos mecanismos. Por una
parte, los gránulos se unen al fagosoma, que
pasa a convertirse en un fagolisosoma, en el
cual vuelcan sus enzim as preformadas. Estas
enzimas tienen acción bactericida o hacterios-
tática, sobre todo a pH ácido, y tienen tam bién
acción proteolítica, por lo que se digieren los
microorganismos muertos. Este mecanismo no
es oxígeno dependiente.
Por otra parte, la ingestión de una partícula
aumenta la actividad de la vía de las hexosas
monofosfato, lo que genera NADPH, el cual,
en última instancia, reduce el citocromo b245
propio de la membrana plasmática, con un au­
mento explosivo del consumo de oxígeno, co­
nocido como estallido metabólico. Este oxíge­
no se convierte en anión superóxido, peróxido
de hidrógeno, o libre o naciente y radicales hi­
droxilo, todos ellos de potente acción m icrobi­
cida. Además, la mieloperoxidasa actúa sobre
el peróxido y sobre iones haluro, dando como
resultado un sistem a halogenante de p otente
acción bactericida. Finalmente, el consumo de
iones hidrógeno eleva el pH de manera que se
permite la función óptima de las proteínas ca-
üónicas de los gránulos (véase cap. 21).
Ambos mecanismos, oxígeno dependiente e
independiente, dan por resultado la lisis de las
bacterias fagocitadas, constituyendo así un im­
portante mecanismo de defensa inespecífico.
Interacción con el sistema inmune específico
Si bien el sistema inmune específico es filo-
genéticamente más avanzado que todos los sis­
temas inespecíficos de defensa, al igual que en
otros casos de la evolución, por ejemplo el sis­
tem a nervioso central, el sistem a n u ev o no
reemplazó al más antiguo sino que pasó a ac­
tuar en íntimo acuerdo con él.
En la rama aferente de la respuesta inmune,
las células fagocíticas tienen un importante pa-
44 Aspectos básicos de la Inmunidad
peí, no sólo en la eliminación del exceso de antí­
geno y su digestión, sino también en la produc­
ción de factores quimiotácticos e inflamatorios,
que acumulan células específicas en el siüo de
entrada del agente extraño. Además, la función
de presentación antigénica de los macrófagos a
los linfocitos T es esencial para la iniciación de
una respuesta inmune T, sin la cual la respuesta
humoral tampoco puede existir.
En la rama efectora de la respuesta inmune
también juegan los fagocitos un papel esencial
y son muchas veces los encargados de eliminar
al invasor que ha sido “marcado” como blanco
por los anticuerpos. Einalmente, la acum ula­
ción y la activación de los macrófagos, con au­
mento de su poder lítico, es el resultado de una
reacción de inmunidad mediada por los linfoci­
tos T hl.
Todo esto ejemplifica una vez más la com­
pleja relación intercelular que implica una res­
puesta inmune, pues abarca no sólo las células
específicas sino también los sistemas inespecí­
ficos.
DETECCIÓN E INDIVIDUALIZACIÓN
DE LAS CÉLULAS QUE COMPONEN
EL SISTEMA INMUNE
La inmunología, sobre todo en sus aspectos
celulares, es una ciencia muy joven y en cons­
tante expansión, que ha estado durante muchos
años muy atrasada con respecto a otras ramas
de la fisiología y la biología. Este atraso se de­
bió, en gran parte, a las dificultades para identi­
ficar diferentes poblaciones de linfocitos que,
pese a parecer todos iguales, cumplen funcio­
nes distintas. Además, el sistem a inm une no
cuenta con un órgano fijo, como casi todos los
otros sistemas de un individuo, sino que está
repartido por diferentes regiones del vertebra­
do. Para terminar de hacer difíciles las cosas,
las células que componen el sistem a inmune
muestran una tendencia a la migración no com­
parable con la de ninguna otra célula, pues pa­
san de los órganos primarios a la sangre, al ór­
gano secundario que les corresponde, a la linfa,
a la sangre, a un tejido o nuevamente al órgano
secundario, etc., en una sucesión constante y
mediante vías y sistemas regulatorios no todos
completamente conocidos. Por otra parte, son
capaces de cam biar su m igración fisiológica
habitual obedeciendo a factores quimiotácticos
que se producen en zonas de inflamación. Nin­
guna de estas migraciones es al azar, sino que
van siendo reguladas y dirigidas por las molé­
culas superficiales de cada linfocito y por las
m oléculas presentes en cada uno de los mi-
croambientes para los que está comprometido
el linfocito.
Desde hace muchos años se conoce la exis­
tencia de factores protectores en el suero, los
anticuerpos, y de otras reaccioties inmunes no
transferibles por el suero. Pero para conocer la
base de la dualidad del sistema inmune, debió
recurrirse a la ablación de órganos primarios de
animales inmunológicamente inmaduros: el ti­
mo en ratones recién nacidos y la bursa de em­
briones de pollos. Esto dio lugar a un gran
avance, pues permitió el estudio de animales T
o B privos, pero también indujo a confusiones,
porque ni todos los vertebrados parecen tener
órganos equivalentes a la bursa de Eabricius, ni
todos nacen con su sistema T inmaduro.
Otro avance muy importante fue la detección
de un aloantígeno, presente en el cerebro y en
los linfocitos T de los ratones, que fuera deno­
m inado 0 (theta) y actualm ente es llam ado
Thy. 1, que permitió identificar los linfocitos T
murinos mediante inmunofluorescencia. Ade­
más, con anticuerpos anti-Thy.l más comple­
mento, pudieron prepararse poblaciones despro­
vistas de linfocitos T, lo que permitió trabajar in
vitro o inyectar ratones previamente irradiados
con poblaciones desprovistas de linfocitos T ; de
esta manera pudo descubrirse la necesidad de
colaboración entre los linfocitos T y B.
Pero también la necesidad de trabajar in vi­
tro para establecer la mayoría de los conoci­
mientos sobre la respuesta inmune ha traído
otros inconvenientes a la inmunología. En la
mayoría de los casos no se tiene en cuenta el
resto del organismo y la interrelación del siste­
ma inmune con los otros sistemas del indivi­
duo, muy especialmente con el sistema nervio­
so central y con el endocrino. Estas interaccio­
nes tien en gran im p o rtan c ia en la fu n ció n
homeostática del sistema inmune y recién en
estos últimos años se están empezando a cono­
cer (véase cap. 17, 2da. parte).
La identificación de las subpoblaciones lin­
foides es útil, no sólo para el m ejor conoci­
miento de la maduración, diferenciación, fun­
ciones y otras características fisiológicas del
sistema inmune, sino también desde un punto
de vista aplicado o clínico, para el diagnóstico
y pronóstico de enfermedades linfoproliferati-
vas o con compromiso inmunológico.
En una primera instancia, se utilizaron sue­
ros inmunes, generalmente producidos en co­
nejos o cabras, dirigidos contra moléculas ais­
ladas de la superficie de los linfocitos o, en el
caso de las Igs, del suero sanguíneo. Luego se
pasó a la producción de anticuerpos monoclo­
nales, generalmente a partir de esplenocitos de
ratones inyectados con células enteras de esa u
otra especie. Los diferentes grupos que produ­
jeron estos anticuerpos intercam biaron infor­
mación, y esto permitió la identificación de una
serie de grupos o acúmulos (clusters) de mono-
 Bases celulares de la respuesta inmune
clónales dirigidos contra una misma estructura
de diferenciación, lo que definió las diferentes
moléculas superficiales, que llevan ahora, en el
hombre y otras especies pero no en el ratón, el
nombre de CD (“cluster of differentiation”) se­
guido de un ntimero. A ctualm ente se cuenta
con una batería de anticuerpos monoclonales
contra los CD humanos. En el Apéndice del
cap. 2, se da la lista de los CD conocidos hasta
hoy y sus funciones.
Para individualizar cada célula se las puede
incubar con el anticuerpo marcado con sustan­
cias fluorescentes y luego observarlas en m i­
croscopio con luz ultravioleta. También se pue­
de usar este mismo tipo de reactivo para apre­
ciar las proporciones de cada subpoblación en
una suspensión dada mediante el uso del cito­
fluorómetro. Este método permite también te­
ñir una célula con dos o más sustancias dife­
rentes y medir simultáneamente otras caracte­
rísticas de cada una de las células de la pobla­
ción, como tamaño, cantidad de ADN, etc., lo
que puede aportar mucha información sobre la
población celular estudiada. Además, permite
separar subpoblaciones por diferencias en bri­
llo, equivalente a la concentración de la molé­
cula marcada en la superficie celular, u otra ca­
racterística.
También se puede aislar una población m e­
diante el uso de estos anticuerpos absorbidos
sobre superficies, ya sea fondos de recipientes
o gránulos, sobre las que se pegarán las células
con la molécula en cuestión, y pueden ser res­
catadas en pureza. Por fin, se puede eliminar
una población con esos mism os anticuerpos
más complemento.
La identificación y aislamiento de los linfo­
citos B se hace, principalmente, por la Ig de la
membrana; dado que los otros linfocitos no sin­
tetizan ni expresan Ig superficial, su presencia
es el mejor marcador para reconocer los linfo­
citos B. Para identificarlos, los mejores m éto­
dos están basados en la incubación de pobla­
ciones mixtas, viables o fijadas, con anticuer­
pos anti-Ig marcados con sustancias flu o res­
centes, que luego pueden ser detectadas por
microscopia de fluorescencia o citofluorome­
tría. Como se comprende, para visualizar los
linfocitos B se deben incubar con anti-Ig de
modo que no se formen casquetes, ya sea im pi­
diendo el metabolismo celular con temperatura
baja o antimetabolitos, o fijando el sistema de
microtúbulos y microfilamentos celulares.
Mediante estas técnicas no sólo se pueden
identificar los hnfocitos B, sino que se pueden
determinar las clases de Igs que sintetizan y ex­
presan, utilizando anticuerpos, monoclonales o
polielonales, específicos para una clase de Ig de
la especie. Así se pudo determinar la secuencia
de expresión de diferentes clases de íg durante
45
la maduración de los linfocitos B y su diferen­
ciación a plasmocitos o linfocitos B de m em o­
ria. M ás aún, utilizando anticuerpos dirigidos
contra dos o más clases de Igs, marcados con
diferentes sustancias, se pudo demostrar la exis­
tencia de células doble y triplemente positivas,
lo cual llevó a la demostración del fenómeno de
“splicing” alternativo en los linfocitos.
La identificación de los linfocitos T en los
ratones se hizo mediante el uso de sueros anti-
T hy.l, como se dijo antes. En el hombre no se
encontró un antisuero similar y durante mucho
tiempo se utihzó la particular tendencia a la ad­
hesión a otras células que tienen los linfocitos
T, que forman rosetas con los eritrocitos de
carnero; estas rosetas permitieron tam bién la
purificación de poblaciones T hum anas m e­
diante centrifugación en gradientes. Hoy se sa­
be que estas rosetas se hacen a través del C D 2.
Actualmente, para identificar, aislar o eliminar
poblaciones de linfocitos T humanos, se utili­
zan anticuerpos dirigidos contra moléculas co­
munes a todos los hnfocitos T (anti-pan T), co­
mo CD2 o CDS. La identificación de la subpo­
blación Th se hace, generalm ente, con anti
CD4 y de la población citotóxica/supresora,
con anti CDS.
Aquí también, la medición de las proporcio­
nes relativas de las subpoblaciones T puede te­
ner gran importancia clínica. Por ejemplo, un
d e sc e n s o en la re la c ió n de lin fo c ito s
CD4+/CD8+ es índice de avance de la enferm e­
dad en el SIDA.
Otras moléculas superficiales
Todos los hnfocitos expresan moléculas de
histocompatibilidad de Clase I en alta concen­
tración y otras moléculas sumamente im portan­
tes para su función inmune. Los linfocitos B
expresan también antígenos de histocom patibi­
lidad de clase 11; estos últimos, que aumentan
con la estimulación antigénica, permiten al lin­
focito B presentar antígenos al linfocito T, co­
mo se indica en el capítulo 10. Los linfocitos T
no expresan, en reposo, antígenos de clase II,
pero pueden hacerlo cuando están activados.
La m ayor parte de los linfocitos B tien en
también en su superficie receptores capaces de
ligar la región Ec de las Igs modificadas por
unión con el antígeno. Su función está relacio­
nada principalm ente con la regulación d e la
respuesta inmune. Los linfocitos T activados
tam bién expresan a veces receptores para Fe.
Aproximadamente un 50 a 75% de los linfoci­
tos B expresan receptores para la fracción C3b
del com plem ento, de tipo CRI y CR2, cuya
función está relacionada con la regulación.
La identificación de estas moléculas, que se
realizaba mediante la formación de rosetas con
46 Aspectos básicos de la inmunidad
eritrocitos recubiertos con anticuerpo (rosetas
EA) o con anticuerpo y las primeras fracciones
del complemento (rosetas EAC), hoy se hace
con anticuerpos monoclonales dirigidos contra
estos receptores.
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lopmenL A nnual R eview o f Im m unology, 12, 635, 1994.
Antígenos
RICARDO MARGNI
GENERALIDADES
Son antígenos las sustancias que introducidas
en el organismo de un vertebrado adulto indu­
cen una respuesta inmune, dando lugar a la pro­
ducción de otras sustancias denominadas anti­
cuerpos o a la proliferación de células sensibili­
zadas con las que específicamente reaccionan.
La palabra antígeno, que significa formador
de anticuerpos, es una contracción de aní/soma-
tógeno, vocablo propuesto por Deutsch en 1899.
Por definición, antígeno significa capacidad
para inducir la producción de anticuerpos y es­
pecificidad para reaccionar con ellos. En la na­
turaleza existen ~o pueden obtenerse a partir de
ciertas sustancias- fracciones capaces de reac­
cionar con los anticuerpos (especificidad), pero
no de engendrarlos (poder inm unogénico) y
que Landsteiner,^ para identificarlas, las deno­
minó haptenos. Estos a su vez pueden ser hap­
tenos complejos cuando la reacción hapteno-
anticuerpo efectuada in vitro es visible, o hap­
tenos simples cuando ella no origina un fenó­
meno deteetable a simple vista.
A la zona restringida de la molécula antigé­
nica que determina la especificidad se la deno­
mina determinante antigénico. Dado que pue­
den existir varios determinantes antigénieos di­
ferentes en una molécula, la inoculación de és­
ta originará en el receptor anticuerpos con dis­
tinta especificidad (fig. 4-1).
Un hapteno o grupo hapténico definido, tal
como:
O^N C1
^ 0 d)
NH,
4
puede conjugarse covalentemente a una m olé­
cula proteica que, al ser inoculada a un Verte­
brado, induce la formación de anticuerpos con
especificidad para aquél. Un hapteno sim ple,
dentro de la molécula antigénica, constituye un
“determinante antigénico estructural” (véase
fig. 4-2).
En proteínas complejas resulta difícil diluci­
dar cuál es la estructura del determinante anti­
génico. No obstante, estucüos llevados a cabo
con proteínas de las que se conoce su estructu­
ra primaria y terciaria, como la mioglobina, li­
sozim a, insulina, nucleasa e sta filo c ó cic a y
otras, han demostrado que en algunos casos el
determinante antigénico está íntimamente rela­
cionado con uno o pocos aminoácidos c o n ti­
guos presentes en la secuencia primaria (deter­
m inante continuo), m ientras que en otros es
responsable de la conformación de una restrin­
gida zona de la molécula (determinante confor­
macional) (fig. 4-3 1),
Actualmente se sabe que en muchas m acro­
m oléculas, entre ellas lisozim a de huevo, la
parte del antígeno que interacciona con el sitio
de combinación del anticuerpo está constituida
por residuos aminoacídicos localizados distan­
tes dentro de la secuencia de su estructura p ri­
maria pero próximos uno a otros como conse­
cuencia de la estructura terciaria o cuaternaria.
Estos determinantes antigénieos topográficos
sólo funcionan mientras la molécula conserve
su estructura nativa (fig. 4-3 11). Se los identifi­
ca tam bién con la denom inación de determ i-
ncmtes antigénieos discontinuos (para m ayor
información, véase cap. 5).
Jem e ha propuesto para el sitio, grupo o área
del determinante antigénico el nombre de epi-
tope, y el de epitipo para el conjunto o fam ilia
46 Aspectos básicos de la inmunidad
eritrocitos recubiertos con anticuerpo (rosetas
EA) o con anticuerpo y las primeras fracciones
del complemento (rosetas EAC), hoy se hace
con anticuerpos monoclonales dirigidos contra
estos receptores.
B IB L IO G R A FÍA
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Antígenos
RICARDO MARGNI
GENERALIDADES
Son antígenos las sustancias que introducidas
en el organismo de un vertebrado adulto indu­
cen una respuesta inmune, dando lugar a la pro­
ducción de otras sustancias denominadas anti­
cuerpos o a la proliferación de células sensibili­
zadas con las que específicamente reaccionan.
La palabra antígeno, que significa formador
de anticuerpos, es una contracción de aní/soma-
tógeno, vocablo propuesto por Deutsch en 1899.
Por definición, antígeno significa capacidad
para inducir la producción de anticuerpos y es­
pecificidad para reaccionar con ellos. En la na­
turaleza existen ~o pueden obtenerse a partir de
ciertas sustancias- fracciones capaces de reac­
cionar con los anticuerpos (especificidad), pero
no de engendrarlos (poder inm unogénico) y
que Landsteiner,^ para identificarlas, las deno­
minó haptenos. Estos a su vez pueden ser hap­
tenos complejos cuando la reacción hapteno-
anticuerpo efectuada in vitro es visible, o hap­
tenos simples cuando ella no origina un fenó­
meno detectable a simple vista.
A la zona restringida de la molécula antigé­
nica que determina la especificidad se la deno­
mina determinante antigénico. Dado que pue­
den existir varios determinantes antigénicos di­
ferentes en una molécula, la inoculación de és­
ta originará en el receptor anticuerpos con dis­
tinta especificidad (fig. 4-1).
Un hapteno o grupo hapténico definido, tal
como:
O^N C1
^ 0 d)
NH,
4
puede conjugarse covalentemente a una m olé­
cula proteica que, al ser inoculada a un Verte­
brado, induce la formación de anticuerpos con
especificidad para aquél. Un hapteno sim ple,
dentro de la molécula antigénica, constituye un
“determinante antigénico estructural” (véase
fig. 4-2).
En proteínas complejas resulta difícil diluci­
dar cuál es la estructura del determinante anti­
génico. No obstante, estudios llevados a cabo
con proteínas de las que se conoce su estructu­
ra primaria y terciaria, como la mioglobina, li­
sozim a, insulina, nucleasa e sta filo c ó cic a y
otras, han demostrado que en algunos casos el
determinante antigénico está íntimamente rela­
cionado con uno o pocos aminoácidos c o n ti­
guos presentes en la secuencia primaria (deter­
m inante continuo), m ientras que en otros es
responsable de la conformación de una restrin­
gida zona de la molécula (determinante confor­
macional) (fig. 4-3 1).
Actualmente se sabe que en muchas m acro­
m oléculas, entre ellas lisozim a de huevo, la
parte del antígeno que interacciona con el sitio
de combinación del anticuerpo está constituida
por residuos aminoacídicos localizados distan­
tes dentro de la secuencia de su estructura p ri­
maria pero próximos uno a otros como conse­
cuencia de la estructura terciaria o cuaternaria.
Estos determinantes antigénicos topográficos
sólo funcionan mientras la molécula conserve
su estructura nativa (fig. 4-3 II). Se los identifi­
ca tam bién con la denom inación de determ i-
ncmtes antigénicos discontinuos (para m ayor
información, véase cap. 5).
Jem e ha propuesto para el sitio, grupo o área
del determinante antigénico el nombre de epi-
tope, y el de epitipo para el conjunto o fam ilia
48 Aspectos básicos de la inm unidad
3 3
1, 2, y 3 = determinantes
Reacción Ag - Ac R eacción Hp - Ac
entre un antígeno mono- entre el determinan­
específico y su corres­ te antigénico y el
pondiente anticuerpo anticuerpo originado
por el antígeno mo-
noespecítico
Fig. 4-1. R eacciones antígeno-anticuerpo y iiapteno-anticuerpo.
0,N
.(CH,), NO,
Hapteno
Determinante antigénico
Antígeno
'' inoculación a
vertebrado „
adulto
B = antígeno
poliespecífico
a, b, c = anticuerpos
antigénicos con especificidad para
los determinantes
antigénicos 1, 2 y 3
respectivamente
Reacción Ag - Ac
entre un antígeno poliespecífico y los diferentes
anticuerpos formados
de epitopes relacionados. Al sitio conaplemen-
tario de la estructura del determinante antigéni­
co ubicado en el anticuerpo lo llama paratope.
Esta denominación resulta litil en algunos ca­
sos, como ocurre con los antígenos somáticos
de las salmonelas, o con los constituyentes an­
tigénicos de los hematíes correspondientes al
sistema ABO, en que todos poseen un poliósido
comiin y sólo difieren por la naturaleza del
azijcar no reductor terminal.
Esta nomenclatura ha tenido gran aceptación
y en estos momentos la mayoría de los inm u­
nólogos la ha adoptado, identificando el deter­
m inante antigénico como epitope, cualquiera
que sea su naturaleza.
Los determinantes antigénicos o epitopes por
unidad de antígeno, sea ésta una tnolécula o
una partícula, varían grandemente, y la periodi­
cidad de su repetición es función del número
de determinantes antigénicos diferentes presen-
Fig. 4-2. R epresentación esquem ática de una m olécula de
antígeno, su determ inante antigénico estructura! y e! grupo
haptém ico.
 Antígenos 49

F ig . 4 -3Í. Estructura hipotética de un fragm ento proteico. Las zonas A y B, deUmitadas por h'neas de puntos, señ alan
áreas que podrían constituir determ inantes antigénieos conform acionales, de los que form an parte m uy pocos re sid u o s y
que afectan a una o a las dos cadenas peptídicas. La reducción del puente S-S de la zona A o el desplegam iento de la B p o ­
drían hacer perder la especificidad de los determ inantes antigénieos allí locahzados. La zona C podría corresponder a un
determ inante antigénico estructural.

tes en la misma. Se ha comprobado que una
m olécula de ovoalbtim ina posee 30 epitopes
efectivos y 62 epitopes potenciales sobre su su­
perficie, cifras que contrastan con las halladas
en una partícula enormemente mayor, un bacilo
tífico, en el que se han calculado 5,6 x 10* epi­
topes, los cuales, segtin diferentes iiavestigado-
res, no se encuentran aislados sobre la superfi­
cie bacilar, sino dispuestos en placas. La valen­
cia total del antígeno está dada por el número
de determ inantes antigénieos presentes en la
molécula, expuestos y ocultos. La valencia fu n ­

F ig . 4 -3 II. L os residuos id e n tifi­

cados con círculos rojos dentro de
la zo n a d elim itad a por líneas de
p u n to s, co n stitu y en un d e te rm i­
nante anigénico topográfico h ipo­
tético.
50 Aspectos básicos de la inmunidad
cional corresponde a los determinantes antigé­
nicos expuestos, capaces de reaccionar directa­
mente con los anticuerpos.
Existen ciertos hechos relacionados con la
definición de antígenos que conviene dejar
aclarados. Sustancias de peso m olecular no
muy elevado pueden ser excretadas rápidamen­
te y por esta circunstancia estimular deficiente­
m ente la producción de anticuerpos; pero, si
aquéllas son inoculadas junto con adyuvantes,
los resultados pueden m odificarse favorable­
mente. Por otra parte, macromoléculas que reú­
nan todas las condiciones para la antigenicidad
pueden ser buenos agentes inmunizantes para
algunos anim ales y m alos para otros, como
ocurre con los polisacáridos neum ocócicos,
que inducen buena respuesta inmunológica en
el hombre y el ratón, no así en el conejo. He­
chos similares suelen ocurrir en animales ino­
culados con antígenos para cuyas especificida­
des pueden tener cierta tolerancia inmunológi­
ca como consecuencia de poseer antígenos em­
parentados, lo que hace que su reactividad sea
escasa o nula.
Por este motivo se prefiere reservar el nom­
bre de inmunógeno para las sustancias capaces
de inducir respuesta inmune y el de antígeno
para aquellas que interaccionan con los produc­
tos de dicha respuesta. No obstante, son térmi­
nos que frecuentemente se emplean como sinó­
nimos.
CARACTERÍSTICAS DE LAS QUE
DEPENDE LA ANTIGENICIDAD
O CAPACIDAD PARA INDUCIR
RESPUESTA
¿A qué se debe que ciertas macromoléculas
al ser introducidas en el organismo induzcan
respuesta inmune y otras en cambio no tengan
capacidad inmunogénica? Para que una sustan­
cia pueda actuar como antígeno, aun cuando
ella reúna todas las condiciones para la antige­
nicidad, es indispensable que su concentración
sea la óptima cuando se la inocula al huésped,
pues pequeñas dosis podrían ser inefectivas y
un exceso podría actuar como inhibidor.
Tamaño molecular
Los antígenos completos son proteínas o hi­
dratos de carbono, pero para que puedan en­
gendrar anticuerpos deben tener un peso mole­
cular exageradamente grande, como la albúmi­
na; 70 kD, globulinas; 150 a 900 kD, polisacá­
ridos de los neumococos: 150 kD. Se admite
que para que una sustancia pueda actuar como
antígeno, su peso molecular debe ser superior a
10 kD. No obstante ello, hay algunas de peso
m olecular bajo, como el glucagón (P.M. 3,8
kD), y las insulinas (P.M. 6 kO), que inocula­
das junto con adyuvantes originan anticuerpos.
Por copulación de cupleína con isocianato de
fenilo se obtiene un complejo de peso molecu­
lar no superior a 4,5 kO, que inoculado a cone­
jos da lugar a la formación de anticuerpos pre­
cipitantes.
Los polipéptidos de síntesis han sido muy
útiles para los estudios de antigenicidad. Han
sido empleados con tal fin homopolímeros (po­
límeros de un solo aminoácido); pequeños pép­
tidos de secuencia conocida unidos a bloques
de copolímeros; copolímeros obtenidos al azar,
en los que se conoce su composición, pero no
su secuencia; copolímeros con multicadenas,
con un péptido funcionando com o colum na
vertebral con sitios de recepción múltiples a los
que pueden unirse cadenas peptídicas. Han sido
elaborados exclusivamente con D-aminoácidos
o L-aminoácidos o con mezcla de ambos. Esta
variedad de productos ha servido para tener
una información más acabada de las exigencias
que rigen en la inducción de la respuesta inm u­
ne. Se ha comprobado que los polímeros de D-
aminoácidos generalmente no inducen form a­
ción de anticuerpos, cosa que hace la mayoría
de las preparados con L-aminoácidos.
Sela, Maurer, Benacerraf y otros han puesto
en evidencia que polipéptidos de síntesis de pe­
so molecular aproximado de 4 kD, y aun me­
nos, pueden form ar anticuerpos cuando son
inoculados a vertebrados adultos, pero ese peso
molecular debe ir asociado a una estructura es­
pacial determinada, ya que algunos polipépti­
dos hneales de bajo peso molecular no forman
anticuerpos, en tanto que lo hacen los ramifica­
dos. Por otra parte, existen proteínas de peso
molecular elevado, como la histona, las prota-
minas, la gelatina, etcétera, que normalmente
no inducen la producción de anticuerpos.
Grupos químicos activos
No sólo el tam año m olecular es un factor
preponderante en la capacidad inmunitaria de
las moléculas antigénicas, sino que muchas de
ellas, fundamentalmente las proteínas, necesi­
tan de la preponderancia de ciertos radicales,
sobre todo los ácidos, para que ella se cumpla.
La no antigenicidad de la gelatina, cuando se
la inyecta en solución sin adyuvantes, se debe­
ría a la ausencia de aminoácidos tales como la
tirosina y la fenilalanina, que serían factores
preponderantes. Proteínas copuladas con los
diazoderivados de los ácidos p-am inobence-
noarsénico (ácido arsalínico) y p-aminobence-
nosulfónico (ácido sulfanílico), cuando son
inoculadas, originan anticuerpos específicos
para dichos radicales, lo que nos habla de la

importancia de éstos en la estructura de la m o­
lécula. Un hecho análogo ocurre con proteínas
a las que se les han fijado grupos dinitrobence­
no o trinitrobenceno.
Grupos básicos fuertes dentro de la molécula
proteica tienen una acción efectiva, al igual que
los grupos ácidos, en la dirección de la especi­
ficidad. Otro prerrequisito para la antigenicidad
es la rigidez en la estructura para los grupos de­
terminantes; la alta especificidad de los grupos
aromáticos en los antígenos de síntesis obteni­
dos por diazotación y copulación es debida pre­
cisamente a la rigidez del benceno. En cambio,
la inactividad com o grupo antigénico de las
grandes moléculas de los ácidos grasos se debe
a que las largas cadenas de los hidrocarburos
son fácilmente distorsionadas y sufren altera­
ciones constantes.
Con respecto a la de los determinantes anti­
génicos de los polisacáridos, generalmente es
consecuencia de combinaciones de dos o más
unidades de hexosas. Ha podido establecerse
que en el dextrano los grupos determ inantes
consisten en unidades de, por lo menos, tres
aD-glucopiranosa, las que se repiten. Para es­
tos antígenos, el determ inante antigénico d e­
penderá de la secuencia de los azúcares que lo
componen y su modo de unión, más que de su
conformación.
Posición de los radicales
en el núcleo aromático
Cuando el determinante de un antígeno es un
grupo aromático sin radicales ácidos, la especi­
ficidad es menos precisa que en estos últimos
casos y depende en gran parte de la posición
que los diferentes radicales ocupan en dicho
núcleo. Si se inoculan conejos con un antígeno
obtenido por diazotación de la p-cloroanilina y
copulación con albúmina bovina, se obtienen
anticuerpos específicos para la p-cloroanilina,
pero que también reaccionan con la p-nitrosoa-
nilina y la p-metilanilina. Esta especificidad, en
cambio, está enormemente reducida o anulada
cuando se varía la posición del radical determi­
nante, como ocurre al hacer reaccionar estos
Cuadro 4-1. Posición de los radicales en el núcleo aromático.
cc
ra
'(D
2 Cl
N=N ( o )
NH2
Antígenos 51
anticuerpos con la o-cloroanilina, m-cloroanili-
na o cualquiera de los otros derivados m encio­
nados en posición orto y meta. En estos casos
las reacciones cruzadas son menos m arcadas
que las o b servadas cuando los an ticu erp o s
reaccionan con los otros derivados, con radica­
les diferentes, pero ubicados en la misma posi­
ción del núcleo aromático (cuadro 4-1).
Influencia de la estructura espacial
del determinante antigénico
Ya hemos visto en el caso anterior la im por­
tancia que tiene la posición de un determinado
radical o grupo aromático con respecto a la es­
pecificidad, lo que nos está indicando que la
posición de éstos en el espacio es significativa
para aquélla. Landsteiner pudo diferenciar se-
rológicam ente los ácidos D- y L-paminoben-
zoilfenilaminoacético.
Del mismo modo, copulando con proteínas
los ácidos levo, dextro y meso-p-aminotartraní-
lico e inoculándolos a conejos, se obtienen anti­
cuerpos capaces de reaccionar específicamente
con los respectivos ácidos tíu-táricos, ya sea uni­
dos a la proteína a la cual fueron copulados para
transformarlos en antígenos y emplearlos en la
inm unización de los conejos, ya sea unidos a
otras seroproteínas de diferente origen animal.
El cuadro 4-2 esquematiza lo expuesto ante­
riormente.
Sela y col. demostraron en materia de anti­
genicidad la im portancia de los am inoácidos
que contienen grupos aromáticos y de su posi­
ción en las cadenas proteicas. Estos autores,
trabajando con polipéptidos de síntesis, p(Tyr-
,G lu)-pA la-pL ys, pA la-p(T yr-G lu)- -p (L y s-
Ala), han llegado a la conclusión de que, para
los polipéptidos lineales y ramificados de peso
molecular 4 kDa, la posición que el am inoáci­
do aromático ocupa en la cadena polipeptídica
es factor preponderante en la antigenicidad. Por
otra parte, han llegado a establecer que p o li­
péptidos lineales de ese peso molecular, p o r re­
gla general, no son antigénicos, en tanto que
los m ism os, como polipéptidos ram ificados,
adquieren poder inmunogénico. Ello indica que
52 Aspectos básicos de la inmunidad

C u ad ro 4-2. Especificidad inmunológica de diferentes ácidos tartáricos

A N T ÍG E N O S

C O O H — ^ (R) CO O H (R) CO O H -— (R)

Í-ÍO— C — H H-^C^OH H— C— OH
Suero inm une
contra
I I
H— C — O H ho - - c ^ h H— C— OH
I I
COOH CO O H C O OH

A cido ]-tartárico A cido d-tartárico A cido m -tartárico

Á cido 1-tartárico +++

Á cido d-tartárico
Á cido m -tartárico +

los núcleos aromáticos y la posición espacial de suma importancia en lo relativo a la antige­

de las cadenas constitutivas de las proteínas o nicidad de la sustancia. Resultados similares
de los determinantes antigénieos son factores con otros tipos de experiencias han sido obteni­
dos por otros investigadores, entre ellos Maurer
y Benacerraf.
------ p (Glu, Tyr)
Mediante el empleo de copolímeros con mul-
ticadenas se ha podido comprobar que es indis­
pensable que la región “antigénicamente impor­
•< ------ p-DL-Ala
tante” de la molécula sea accesible al mecanis­
mo que induce la formación de los anticuerpos,
= - < • - p-Lys pero ello no significa que dicha región antigéni­
ca deba encontrarse al final de las cadenas pep­
tídicas, según se deduce del siguiente hecho ex­
perim ental. Se prepararon copolím eros con
m ulticadenas de la mism a composición y un
péptido de polilisina como columna vertebral.
En un caso las cadenas laterales unidas a la lisi-
na fueron polialanina, con sustituciones termi­
-p-DL-Ala nales de poliglutamiltirosina. En el otro fue in­
vertido el orden de unión. Sólo el primero de
— p (Glu, Tyr) los polímeros fue antigénico en el conejo. Se
pudo comprobar además que, cuando el péptido
^ p -L y s
que funcionaba como columna vertebral era un
copolímero de lisina y alanina, la unión de la
cadena peptídica p (Glu, Tyr)-pAla le confería
antigenicidad, cosa que no ocurría en el caso
anterior. Ello probablemente se deba al mayor
espacio existente entre los e-aminogrupos de la
lisina a los que se unen las cadenas peptídicas,
lo que permite una mejor exposición de la re­
gión antigénicamente importante; esto demues­
tra que no necesita ser terminal en todos los ca­
sos. La figura 4-4 esquematiza lo expuesto.
Es de hacer notar que lo anteriormente dicho
es válido cuando se inmuniza con un solo antí­
geno o determinante antigénico ya que, si se
utilizan varios a la vez, por fenómenos de com­
petición puede estar inhibida la actividad de al­
guno de ellos. Esto significa que, al inmunizar
con varios antígenos simultáneamente, debe re­
Fig. 4-4. Polipéptido.? A y C antigénieos. P olipéptido B: gularse su concentración para conseguir buena
no antigénico. respuesta inmune para todos.

Hidrofíliddad y predicción de epitopes
El desconocim iento de la estructura trid i­
mensional de muchas proteínas ha hecho que
se buscaran otros parám etros que perm iten
predecir si las superficies expuestas de estas
m oléculas hacen que sean antigénicas o no.
Dado que los sitios hidrofílicos son general­
mente hallados en la superficie de la proteína
expuesta al agua, se considera que los mismos
podrían ser “blanco” de los anticuerpos. Los
análisis de numerosas proteínas han dem ostra­
do que estos sitios son componentes de deter­
minantes antigénicos. Sin embargo, una gran
parte de los sitios de la superficie son no pola­
res, y en varios casos se ha demostrado que re­
siduos aromáticos e hidrofóbicos forman parte
del epitope.
Predicción de epitopes
El interés de predecir y definir sitios antigé­
nicos de una proteína comenzó en parte con la
producción de vacunas sintéticas.
Los mayores avances sobre los conocimien­
tos del sitio antigénico fueron realizados con­
siderando la carga y polaridad de los am inoá­
cidos involucrados. Esto no descarta que inte­
racciones hidrofóbicas puedan estabilizar la
unión antígeno-anticuerpo (Ag-Ac). Sin em ­
bargo, es probable que la naturaleza direccio-
nal carga-carga y otras interacciones polares
(p. ej., uniones hidrógeno) contribuyan como
F ig. 4-5. P erfil de hidrofilicidad de
la m ioglobina. A daptada de V an Re-
g e n m o rte l M . H . V. I m m u n o lo g y
Today, 10:266, 1989.
Antígenos 53
elemento crítico de la especificidad geométrica
de los sitios de unión. Los residuos polares son
necesarios en las interacciones proteicas; los
grupos no polares ayudan, pero no son absolu­
tamente necesarios.
La reciente literatura indica que muchos la­
boratorios, para localizar sitios antigénicos so­
bre una proteína, se basan en la predicción de
sitios hidrofílicos como probables regiones de
alta antigenicidad, lo que puede incluir, ade­
más, consideraciones sobre la estructura se­
cundaria (p. ej., a-hélice, hoja plegada en p,
curvaturas en (3).
Métodos para determinar hidrofilicidad
y estructura secundaria
Es apropiado determinar simultáneamente la
predicción de la estructura secundaria e hidrofi­
licidad, ya que la estructura secundaria depen­
de de la hidrofóbica e hidrofílica de los seg­
mentos de aminoácidos considerados.
La representación del perfil hidrofílico de
una proteína se ha estandarizado con una escala
en la que se indican las secuencias hidrofílicas
hacia arriba y las hidrofóbicas hacia abajo (fig.
4-5). Si se superponen las secuencias secunda­
rias con la hidrofilicidad/hidrofobicidad se ob­
serva una significativa correlación entre ambas.
Los valles profundos generalmente ocurren en
las zonas a-hélices más largas o cerca de las
zonas de hojas plegadas en |3, las que constitu­
yen el fino paquete hidrofógico del centro de la
50 100
Aminoácidos
54 Aspectos básicos de la Inmunidad
molécula. Las a-hélices más cortas son las zo­
nas más expuestas de la molécula y, por lo tan­
to, están relacionadas con los sitios antigénicos
de la misma. Para los estudios de predicción de
epitopes en base a estructuras secundarias, se
han elaborado métodos com putacionales que
usan la información proveniente de unas pocas
proteínas bien definidas y en las que se encuen­
tran determinadas las escalas de giro o torsión.
Un giro es la secuencia de la columna vertebral
de un polipéptido involucrada en el cambio de
dirección de la cadena principal.
Papel de la movilidad atómica en la
antigenicidad e inmunogenicidad
de proteínas
El mecanismo de la especificidad depende
de la complementariedad entre el epitope anti­
génico y el sitio de combinación o paratope del
anticuerpo, estando comprometidos en ello los
puentes de hidrógeno, uniones polares, fuerzas
de Van der Walls, etc., que puedan originarse
entre ambos (véase cap. 5). Su eficiencia de­
pende de un buen acomodamiento entre ambas
estructuras.
Para determinantes antigénicos conformacio­
nales o discontinuos (topográficos) es difícil
determinar si la movilidad estructural que invo­
lucra residuos distantes, ubicados en la secuen­
cia aminoacídica, y que pueden diferir signifi­
cativamente en la movilidad relativa, juega un
papel im portante en la determ inación de la
complementariedad de la interacción antígeno-
anticuerpo. Incluso, en este caso, el desplaza­
miento de alguno/s de los residuos comprome­
tidos puede dar lugar a cambios en la superficie
de contacto originada por los residuos vecinos.
En el caso de los determ inantes antigénicos
contiguos (secuencia continuada de un niimero
determinado de residuos), la interpretación de
la movilización local en el mencionado fenó­
meno es menos ambigua.
La información sobre movilidad relativa de
diferentes átomos en proteínas, llamado “factor
de temperatura atómica”, proviene de estructu­
ras moleculares refinadas, y es sumamente útil
para entender aspectos dinámicos de estructu­
ras proteicas, en especial acerca de la flexibili­
dad de residuos aminoacídicos individuales y
elementos estructurales. Han sido muy útiles en
este sentido estudios de difracción de rayos X
desarrollados con proteínas cristalizadas.
Esos factores de temperatura atómica indivi­
duales no representan diferencias térmicas lo­
cales dentro de la molécula, sino que son lla­
mados así por la temperatura dependiente de la
velocidad del movimiento atómico y la corres­
pondiente energía térmica disponible para su­
perar esas barreras de energía potencial confor­
macional. Generalmente, cuando se hace refe­
rencia a péptidos localizados en regiones de
una proteína, se emplea el término “caliente”
para identificar una zona muy móvil (factores
de temperatura altos) y “frío” para las regiones
bien ordenadas (factores de temperatura bajos).
Los datos provenientes de anticuerpos anti-
péptidos y del “mapeo” de epitopes proteicos
sugieren que el reconocimiento antigénico en
general involucra la interacción de anticuerpos
con zonas de la proteína que puede adoptar for­
mas múltiples, distintas de la estructura prome­
dio observada por cristalografía de rayos X.
Todo perm ite suponer que la interacción del
paratope del anticuerpo con el epitope antigéni­
co es suficiente en primera instancia para el re­
conocimiento, pero que luego, debido a la m o­
vilidad atómica, hay una inducción a la estruc­
tura del epitope que mejor se adapte. En el caso
de las interacciones entre péptidos de proteínas
y sus correspondientes anticuerpos, el péptido
se une al paratope cuando su conformación se
asemeja a la que le corresponde en la proteína
nativa, acomodándose luego, como consecuen­
cia de movilización atómica, a la estructura que
reaccione m ejor con el sitio de combinación
del anticuerpo.
En este sentido resulta muy interesante que
en diferentes proteínas relativamente pequeñas,
como la neurotoxina alfa de escorpión, mioglo-
bina, lisozima nativa, citocromo c, etc., las zo­
nas de antigenicidad de la molécula (epitopes)
estén relacionados, en su mayoría, con regiones
de alta movihdad o “cahentes”, con factores de
tem peratura atómica altos. En el citocromo c
los residuos 44, 60/62 y 89/92, integrantes de
los tres epitopes detectados en esa molécula,
están asociados con áreas identificadas como
móviles en los factores de temperatura cristalo­
gráficos. Lo mismo ocurre con los tres epitopes
de la ribonucleasa, en cuya estructura partici­
pan los residuos 1/10, 63/75 y 98/104.
No obstante lo expuesto, esa relación no de­
be ser considerada como un hecho general, ya
que en algunos casos no se ha podido demos­
trar que dicha relación exista.
A LT E R A C IÓ N D E LOS A NTÍG EN OS
Desnaturalización
Los antígenos, en su gran mayoría proteínas,
pueden sufrir alteraciones derivadas de la ac­
ción que algunos agentes físicos o quím icos
pueden ejercer sobre ellos. El proceso por regla
general es progresivo, se cumple en dos o tres
etapas, y determina que esa proteína desnatura­
lizada, cuando es inoculada a un animal, esti­
mule la producción de anticuerpos, que en al­

gunos casos pueden reaccionar con la proteína
primitiva, no así en otros. Ello se debe a las
profundas modificaciones que pueden sufrir los
determinantes antigénieos originales a causa de
la desnaturalización de la proteína. La desnatu­
ralización suele producirse ya sea por trata­
miento con ácidos y bases fuertes, por calenta­
miento a altas temperaturas o por otros proce­
dimientos.
Oxidación
M ediante el empleo de peróxidos como el
permanganato de potasio, pueden modificarse
las proteínas antigénicas, las que una vez ino­
culadas al animal dan lugar a la formación de
anticuerpos, que presentan la particularidad de
no precipitar con otras proteínas modificadas,
ni aun con la proteína primitiva no oxidada.
Reducción
Por este mecanismo pueden alterarse algunas-
proteínas, pero generalmente las modificaciones
son ínfimas y los anticuerpos que se originan al
inocular animales exhiben reactividades cruza­
das para la proteína primitiva y la reducida.
Digestión
Las enzimas, actuando en medio ácido o en
medio alcahno, según sus condiciones óptimas,
pueden producir escisiones profundas en las
moléculas proteicas antigénicas haciendo que
las mismas se desdoblen en varios polipépti­
dos, algunos de los cuales, si bien no reaccio­
nan aparentemente con el anticuerpo respecti­
vo, pueden llegar a neutralizarlo, lo cual indica
que esta digestión muchas veces libera deter­
minantes antigénieos con capacidad reactiva.
A cidificación y alcalinización
Los ácidos y los álcalis pueden reaccionar
con las proteínas formando metaproteínas áci­
das o alcalinas. La actividad antigénica de éstas
disminuye menos en las metaproteínas alcah-
nas que en las ácidas, y estas últimas presentan
frecuente reactividad cruzada con otras proteí­
nas como consecuencia de las modificaciones
experimentadas.
Desaminación
La remoción de los grupos aminos libres en
las proteínas no produce modificaciones gran­
des en la antigenicidad y características de és­
tas. La remoción de más o menos un tercio de
los aminogrupos de la caseína y la albúmina de
huevo no provoca alteraciones manifiesta.s.
Antígenos 55
Esterifícación
La esterifícación de proteínas origina altera­
ciones que hacen que pierdan su capacidad pa­
ra reaccionar con los anticuerpos producidos
por la proteína no modificada.
Por su parte, la acilación, halogenación, dia-
zotación, tratam iento con gas de m o staza y
otros agentes químicos dan lugar a m odifica­
ciones de resultados análogos. Algunos proce­
dimientos físicos, como los ultrasonidos, pue­
den también provocar modificaciones y liberar
a veces grupos antigénieos de la m olécula no
evidenciados anteriormente.
C O M P O S IC IÓ N Q U ÍM IC A
DE LOS ANTÍGENOS
La mayor parte de los antígenos son proteí­
nas de alto peso molecular que contienen algu­
nos aminoácidos particulares, sobre todo po­
seedores de núcleos aromáticos, y una estructu­
ra espacial definida. Carbohidratos de alto peso
molecular pueden también actuar como antíge­
nos y habitualmente la antigenicidad está dada
por la condensación de grupos hexosas.
Estas distintas estructuras moleculares hacen
que los antígenos puedan inducir respuesta in­
mune directa sobre los linfocitos B (antígenos
T-independientes: poliósidos, lipopolisacári­
dos, flagelina polim erizada), sin la participa­
ción de los linfocitos T, o que necesiten de di­
cha cooperación (antígenos T-dependientes:
antígenos proteicos, haptenos fijados a soportes
proteicos).
Los ratones nude -q u e por padecer de una
aplasia tímica carecen de linfocitos T -, cuando
son inoculados con el antígeno T-dependiente
T N P-proteína (proteína trinitrofenolada), no
dan respuesta anti-TNP, pero lo hacen si el inó­
culo es T N P-dextrano (antígeno T -indepen-
diente).
Los antígenos T -independientes h a n sido
agrupados en dos categorías; los de tipo I y los
de tipo II.
Los de tipo I son mitogénicos de los linfoci­
tos B e inducen respuesta policlonal de anti­
cuerpos. Forman parte de este grupo los lipo­
polisacáridos (LPS) componentes de la pared
celular de las bacterias. Estos antígenos son
tam bién activadores de macrófagos e inducen
producción de interleuquinas (IL -1, IL-6, IL-
8), factor necrosante de tumores (T N F -a), in­
terferón a (IFNa), prostaglandinas, etcétera.
Los antígenos de tipo II son polím eros de
polisacáridos; poseen secuencias repetidas que
actuando como epitopes favorecen la polimeri­
zación de los receptores antigénieos de los lin­
focitos B (Ig de membrana), iniciando la trans-
56 Aspectos básicos de la inmunidad
ducción de señales que llevan a la activación
de la célula.
Las células B purificadas no responden in
vitro a los antígenos tipo IL lo que sugiere la
necesidad de algiín requerimiento, aunque mo­
desto, de alguna citoquina. Las células B en
reposo (“resting cells”) estim uladas con antí­
genos T-independientes de tipo II no secretan
anticuerpos hapteno-específicos o policlona-
les, pero lo hacen si al medio se le añade IL-2
o IL-5, respectivamente.
Los polisacáridos antigénicos más simples
son dextrano y levano, los cuales se obdenen
por acción enzimática bacteriana sobre sacaro­
sa. La dextransucrasa origina el dextrano, y la
levansucrasa, el levano. El primero resulta de
la condensación de moléculas de glucosa y el
segundo, de moléculas de fructosa. La unión
glucosídica es principalmente a (1 —> 6) en el
dextrano y a (2 ^ 6) en el levano. Hay cepas
microbianas que pueden originar otros típos de
uniones, tales como a ( l - » 3 ) o a ( l A).
En algunas oportunidades, sustancias sim­
ples de bajo peso molecular al ser inoculadas
pueden originar anticuerpos, pero ello no sig­
nifica que por sí solas tengan antigenicidad si­
no que, por combinación con las proteínas pro­
pias del huésped, se trasform an en antígenos
complejos capaces de dar lugar a la formación
de anticuerpos. Se ha dado el caso de que el
plasma extraído de una persona y conservado
por el añadido de M erthiolate, cuando le fue
reinoculado produjo un choque anafiláctico
después de la tercera inoculación. Ello se de­
bió a que la sal mercurial orgánica se combinó
con las proteínas séricas originando un antíge­
no que sensibilizó en las primeras inoculacio­
nes, desencadenando finalm ente la reacción
alérgica.
Algunas enzimas pueden formar anticuerpos
cuando son inoculadas a vertebrados adultos.
No todas ellas tienen capacidad inmunogénica
e incluso, cuando forman anticuerpos, éstos
pueden tener especificidad para la función en­
zimática, neutralizándola, o para otros deter­
minantes antigénicos presentes en la molécula,
sin que la actividad enzim ática específica de
ésta se vea modificada.
Los ácidos nucleicos (ADN y ARN) pue­
den, en determinadas condiciones, inducir la
formación de anticuerpos, pero generalmente
con reactividad cruzada para algunas de las ba­
ses o azúcares relacionados.
En general, los ácidos nucleicos desnaturali­
zados por calentamiento y enfriamiento rápido
con el objeto de romper la doble hélice, fun­
cionan m ejor com o inm unógenos, esp ecial­
mente cuando se los inocula mezclados con se­
roalbúm ina bovina metilada, la que funciona
como adyuvante. Al esterificarse los grupos
carboxilos de la albúmina, los grupos aminos
rem anentes, positivam ente cargados, forman
complejos con los grupos fosfato cargados ne­
gativamente, existentes en los ácidos nucleicos
desnaturalizados, los que, por esta circunstan­
cia, resultan accesibles a la complejación.
Los ácidos grasos no son antigénicos, pero
sí lo son algunos lípidos complejos, sobre todo
cuando se encuentran asociados a glúcidos y
proteínas, como ocurre con algunos constitu­
yentes m icrobianos y componentes de m em ­
branas celulares. La cardiolipina y la citolipina
H son ejemplos al respecto.
A ntígenos m odificados químicamente
Por diferentes procedimientos es posible in­
troducir grupos químicos en proteínas. Muchas
veces los compuestos fijados inducen respues­
ta específica y tienen capacidad para neutrali­
zar a los anticuerpos form ados. Son grupos
hapténicos entre los que figuran anillos aromá­
ticos esteroides, pequeños péptidos, drogas,
etc. Otras veces, el objeto de la modificación
del antígeno es el de introducir marcas capaces
de ser detectadas, como lo son las sustancias
fluorescentes del tipo de la rodamina y la fluo­
resceína, materiales densos al flujo de electro­
nes como la ferritina, o átomos radiactivos.
Los fundamentos de los métodos más usa­
dos para la introducción de grupos químicos
en proteínas son los siguientes:
Diazotación y copulación
Se utiliza para haptenos con grupos -NH li­
bres, como los ácidos sulfanílico, arsanílico,
paminobenzoico, etc. El producto de diazota­
ción se copula a la tirosina, en posición orto,
pudiéndolo hacer también, en menor grado, a
la lisina e histidina. Véase esquema pág. 57,
parte A.
Dinitrofenil derivados
Se obtienen por reacción entre el fluordini-
trobenceno y los grupos amino libres de las
proteínas, en especial los residuos de lisina.
Véase esquema pág. 57, parte B.
Reacción con carbodiimidas
Su fórmula general es RN = C = NR y son
muy usadas para la fijación, a temperatura am­
biente, de grupos carboxilos a aminos libres de
proteínas, form ando uniones p eptídicas. El
grupo a fijar debe tener un carboxilo libre o lo­
grárselo por oxidación, como ocurre con el hi­
droxilo prim ario de los nucleósidos. V éase
esquema pág. 57, parte C.
 Antígenos 57

CO-NHR;,

Residuo tirosina Residuo lisina Residuo histidina

pH 9,5 4“ C

t
OH OI O
H N<^
\ /
o N

( Í h ,),

CHNH-COR,
HNH-COR,
CO-NHR,
C O -N H R ,
CO-N H R ,

NH,
NO, NO,
Na,GO, / \
A ' « 2)4 + NaPi
PJ
V NO,
4°C P NO,
Fl
i; .h n h - c o r , NH

to^NHR,
ic (CH

Residuo lisina i HNH-COR, B

i 0 -N H R ,

/ ,0 n \
^ /
R 1 -C -0 N^R,
R ,- COOH + R ,- N = C = N - R,------------- ► J-H

NH,

R -C -N -C H ,-P ro te ín a + R ^-N -C -N -R g ^ CH,

H H O H Proteína
58 Aspectos básicos de ía inmunidad
Reacción con isocianatos (R -N =C =0)
y tiocianatos (R-N=C=S)
La fijación se produce por interacción con
grupos amino libres de la proteína
Fluoresceína - N = C = S +
+ H jN - CHj - Proteína
Fluoresceína - N - C - N - CH, - Proteína
H
I SI I HI
COOH
HgC^
H ,C -
DIFERENTES TIPOS DE A N TÍG EN O S
Antígenos bacterianos
Cuando una bacteria es inoculada a un ani­
mal se forma más de un anticuerpo y ello se
debe a que un microorganismo debe ser consi­
derado com o un verdadero saco antigénico
dentro del cual podemos encontrar antígenos
diferentes, cada uno de ellos con capacidad in­
munogénica y en condiciones, por lo tanto, de
originar anticuerpos. Estos antígenos microbia­
nos pueden ser proteínas, que frecuentemente
están situadas en la membrana celular y el es­
pacio periplasmático; hidratos de carbono, que
constituyen sobre todo los antígenos de super­
ficie; y en algunos casos particulares, como el
de las enterobacterias, complejos glúcido-fos-
folipídicos que son verdaderas endotoxinas y
forman parte de la pared celular. No todos los
constituyentes antigénieos de una bacteria tie­
nen la misma capacidad inmunogénica; algu­
nos originan anticuerpos con suma facilidad
mientras que otros necesitan concentraciones
altas para conseguirlo y, casi siempre, a un tí­
tulo o nivel exageradamente bajo.
A los antígenos bacterianos ubicados en el so­
ma se los denomina antígenos O, a los de envol­
tura o capsulares, antígenos y a los ciliares, H.
Reacción mixta con anhídridos
Se la usa para fijar compuestos con grupos
carboxilos a grupos amino libres de proteínas.
Aquéllos pueden formar parte de la molécula
original o puede introducírselos, por conve­
niencia, para la fijación. Es un método muy
empleado para la unión a proteínas de esteroi­
des y azúcares ácidos.
H aC ^ ^C H 3 CH,
CH GH
CH, Tributilamina CHj
----------►
R O
0=G C I 0 = C -0 -C = O
+
H jN -C H j-P roteína
OH-
u
;C H - CHj,OH + CO 2+ R - C - N - CH^- Proteína
O H
Algunos microorganismos producen sustan­
cias que son volcadas al medio externo, de ca­
rácter proteico y con marcado poder toxigénico
para los animales y el hombre. Esas sustancias,
conocidas con el nombre de exotoxinas, inmu­
nizan bien, son antígenos eficaces en pequeñas
dosis y pueden ser neutralizados totalm ente
por los anticuerpos que ellos originan. Como
muchas bacterias son productoras de enzimas,
la inoculación de un caldo de cultivo a un ani­
mal puede originar anticuerpos para todos los
antígenos mencionados e incluso para las enzi­
mas de referencia. El hecho de que un m i­
croorganismo sea un complejo antigénico ca­
paz de originar anticuerpos para cada uno de
ellos hace que muchas veces no se interpreten
correctamente las reacciones serológicas, sobre
todo las reacciones cruzadas que ocurren cuan­
do se enfrentan sueros inmunes logrados por la
inoculación de un animal con un microorganis­
mo diferente al empleado como antígeno de
reacción. Estas reacciones pueden ocurrir con
microorganismos que poseen cierto grado de
parentesco y se las observa a veces en especies
de ubicación totalmente diferente.
No todos los m icroorganism os tienen una
estructura similar. En algunos hay predominio
de componentes proteínicos, en tanto que en
otros los hidratos de carbono constituyen los

antígenos que permiten la diferenciación en ti­
pos dentro de una especie, tal el caso de los
neum ococos. D istin to s in v estig ad o res han
abordado el estudio de la estructura química de
estos polisacáridos, preferentemente por m éto­
dos que utilizan la metilación. El polisacárido
del neumococo tipo II contiene 7 partes de 2:4
di-o-m etilram nosa, 2:3 di-o-m etilglucosa, 1
parte de ácido 2:3:4 tri-o-metilglucurónico y 2
partes de ácido 2:3 di-o-m etilglucurónico, lo
que ha hecho que la estructura del mismo sea
considerada como muy ramificada, con una ca­
dena principal de moléculas de ramnosa y ca­
denas laterales de ácido glucurónico y glucosa.
Del neumococo tipo VI se ha aislado un oligo­
sacárido cristalino que responde a la estructura
galactosil-(l 3)-glucosil-(l - í ’ 3)-ramnosil-
(1 -> 3)-ribitol.
Sobre la base de ensayos de metilación y ais­
lamiento de oligosacáridos, se ha propuesto pa­
ra el neumococo tipo VIII una unidad estructu­
ral que se repite y que responde al siguiente es­
quema:
[-4-|3-D -ácido g lu c u ró n ic o 1 —> 4-¡3-D-
glucosa 1 ^ 4-a-D-glucosa 1 -h >4-a-D-galac-
tosa 1 ^ ] .
En otros microorganismos, como los estrep­
tococos, los constituyentes poliosídicos no son
superficiales y perm iten la diferenciación en
grupos. En los estreptococos del grupo A este
polisacárido es de peso molecular 8 kD y está
compuesto por ramnosa y glucosa en la propor­
ción 5 a 2, sin capacidad inmunogénica y con
características de hapteno. De estos microorga­
nismos, por extracciones ácidas, se han obteni­
do antígenos proteínicos, tipo específicos, ubi­
cados superficialmente, conocidos como M y
T. El primero es una proteína soluble en alco­
hol, termoestable y rápidamente digerible por
enzimas proteolíticas, en tanto que el antígeno
T es insoluble en alcohol, resistente a la diges­
tión, termolábil en medio ácido, pero muy re­
sistente al calentamiento en medio alcalino.
De los estafilococos patógenos y no patóge­
nos se han aislado polisacáridos diferenciales.
Ambos tienen aproximadamente un 4% de ni­
trógeno, pero se distinguen por su rotación óp­
tica específica y los tipos de azúcares obtenidos
por hidrólisis.
Un constituyente muy particular forma parte
de la cápsula del Bacilus anthracis. Se trata de
un polipéptido del D-ácido glutámico, form a
no natural del aminoácido, hecho que podría
estar relacionado con la virulencia del microor­
ganismo.
Un grupo importante de bacterias lo consti­
tuyen las salmonelas, de las que se conocen va­
rios cientos de especies. La mayoría son m óvi­
Antígenos 59
les y poseen antígenos som áticos y ciliares.
Los antígenos O forman parte del cuerpo celu­
lar y se los identifica con números arábigos.
Como las diferentes salmonelas pueden conte­
ner uno o más de esos antígenos, compartidos
por varias especies, han sido subdivididas en
grupos. Los antígenos ciliares pueden ser de
dos tipos, específicos e inespecíficos. U na mis­
ma salmonela puede presentar las dos varieda­
des de antígenos ciliares aunque no sean com­
partidos concomitantemente por la especie mi­
crobiana. Los antígenos ciliares específicos se
identifican con letras minúsculas que van de a
a z, designándose con z y subíndices a los des­
cubiertos posteriormente. Los inespecíficos se
encuentran en menor cantidad.
En la Salm onella typhi se ha identificado
además un antígeno superficial termolábil, de­
nominado Vi. No es un componente exclusivo
de este microorganismo, sino que puede hallar­
se en otras salmonelas como la S- paratyphi C,
e incluso en otras enterobacterias no pertene­
cientes al género Salmonela.
La estructura antigénica somática y ciliar ha
servido para la elaboración del esquem a de
Kauffmann-White de identificación de las sal­
monelas.
Los estudios químicos han demostrado que
el antígeno H es una proteína fibrosa, del tipo
de la miosina y la queratina. La proteína flage­
lar purificada, llamada flagelina, de peso m ole­
cular 41 kD, no contiene fósforo y sí sólo tra­
zas de lípidos e hidratos de carbono. No contie­
ne histidina, triptófano ni hidroxiprolina y sólo
pequeñas cantidades de cisteína. El antígeno O
es un complejo polimolecular formado p o r un
polisacárido específico, una proteína y un fos-
folípido. Los análisis químicos indican que en
la fracción hidrocarbonada de las salmonelas y
otras enterobacterias existe un núcleo central
formado por cinco componentes: 2keto-3 deo-
xi-octonate (KDO), heptosa fosfato, D -gluco­
samina, D-galactosa y D-glucosa. Las diferen­
tes especies se caracterizan por tener azúcares
adicionales que forman cadenas de oligosacári­
dos unidos al núcleo central. La Salmonella p a ­
ratyphi A, que forma parte del grupo A, posee
los antígenos 0: 1, 2 y 12, y el polisacárido
contiene glucosa, galactosa, mañosa, ram nosa
y paratosa (3,6-dideoxi-D-glucosa); el antígeno
2 es el característico de este grupo. El polisacá­
rido de la Salmonella typhi murium, del grupo
B, eon los antígenos 1, 4, 5 y 12, contiene glu­
cosa, galactosa, m añosa, ram nosa y abecosa
(3,6-dideoxi-D-galactosa), el que provee las ca­
racterísticas al antígeno 4, específico de este
grupo. En el caso de la Salmonella typhi, perte­
neciente al grupo D, la especificidad c o rres­
ponde al antígeno 9, que contiene tivelosa (3,6-
dideoxi-D -m anosa). En otras enterobacterias
60 Aspectos básicos de ia inmunidad
también han sido hallados aziícares particula­
res, como la colitosa (3,6-dideoxi-Lgalactosa)
en la Escherichia coli.
El antígeno Vi es de naturaleza glucolipídica
y difiere químicamente del antígeno somático 0.
Existe un grupo particular de microorganis­
mos, denom inados bacilos acidorresistentes,
entre los que se encuentra el M ycobacterium
tuberculosi.'s, ricos en componentes lipídicos.
Por diversos mecanismos se han podido sepa­
rar de la bacteria citada tres fracciones, consti­
tuidas por glicéridos, fosfátidos y ceras. Los
fosfolípidos pueden extraerse de los microorga­
nismos por tratamiento con alcohol y separar­
los por su insolubilidad en acetona. Se ha en­
contrado que la parte más activa de aquéllos es
una sustancia fosforada, sin nitrógeno, consti­
tuida por ácidos grasos, ácido ghcerofosfórico
y trazas de inositol. Entre los ácidos grasos se­
parados del fosfolípido, el principal componen­
te es el palmítico, y el oleico entre los no satu­
rados. Del bacilo tuberculoso tipo humano se
ha aislado un ácido isómero del cerótico, deno­
minado ácido phthioico, y de las ceras prove­
nientes del mismo bacilo, un ácido graso satu­
rado denominado ácido micólico, que es acido-
rresistente. Las ceras purificadas de los bacilos
tuberculosos humano y bovino contienen un al­
cohol, el phthiocerol, y polisacáridos que por
hidróhsis dan diferentes azúcares, entre los que
se encuentran la mañosa, d-arabinosa y galac­
tosa. Ha sido identificado también un ácido le­
vógiro llamado ácido mycocerótico.
De los bacilos tuberculosos se ha extraído
una cera soluble en cloroformo, la cera D. En
la variedad humana, la misma se encuentra uni­
Mycoloil
o — • Lactil
F ig. 4-6. Estructura esquem ática de ¡a cera D.
da a una cadena peptídica ausente en los otros
bacilos tuberculosos y los acidorresistentes sa­
profíticos. Esta cera ha sido fraccionada en un
péptido-glucolipoide, de extraordinaria impor­
tancia en la potenciación de los vehículos oleo­
sos con bacilos tuberculosos constitutivos del
llamado adyuvante de Freund completo, activa­
dor de la antigenicidad (fig. 4-6).
Además de los lipoides, se han extraído po­
liósidos capaces de interaccionar con sueros
provenientes de enfermos tuberculosos. Consti­
tuyen verdaderos haptenos adsorbibles a la su­
perficie de hematíes, transformándose de esta
m anera en antígenos aglutinables muy útiles
para estudios inmunoserológicos.
Uno de esos polisacáridos, que posee carac ­
terísticas de hapteno, tiene un peso molecular 9
kD, y está constituido principalmente por ma­
ñosa y arabinosa. Otro polisacárido aislado de
bacilos tuberculosos aviarios tiene un peso mo­
lecular próximo a 100 kD y por sí solo se com­
porta como antígeno. Está constituido por un
poliglucosán que por hidrólisis da únicamente
moléculas de D-glucosa.
Como constitutivos de los bacilos tuberculo­
sos, se han encontrado también proteínas, co­
nocidas con el nombre de tubereulinas, que son
liberadas en los medios de cultivo por autólisis.
A partir de cultivos en medios sintéticos se ha
obtenido un derivado proteínico purificado que
se conoce con el nombre de P.P.D. {Protein
Purified Derivative). Por migración electrofo­
rética, se ha com probado que existen por lo
menos tres proteínas diferentes denominadas
A, B y C, de las cuales parecería que A es la
más efectiva. Estas proteínas inducen poca sen-
[Arabinosa
:Galactosa
:Ac. N-glicolil murámico
O— Lactil
:N-acetilglucosamina o
:N-acetilgalactosamina
:Péptido

sibilidad tuberculínica, pero puede increm en­
tarse si se las inocula mezcladas con ceras pro­
venientes de extractos de bacilos tuberculosos,
en especial la cera D. (Para más detalles sobre
antígenos bacterianos, véase cap. 24.)
Antígenos de rickettsias y virus
Los estudios sobre estructura antigénica de
rickettsias sólo han adquirido alguna claridad
después de la obtención de suspensiones de
aquellas libres de proteínas de tejido. Varias de
las rickettsias conocidas dan reacciones cruza­
das, como la R. prowazeckii con la R. mooseri.
Se han identificado dos antígenos, uno termolá­
bil, capaz de ser destruido por calentamiento
durante una hora a 60°C, altamente específico,
y otro termoestable, no específico, relacionado
con una parcela del constituyente antigénico
som ático del P roteus 19, responsable de la
aglutinación de dichos bacilos por el suero de
enfermos de tifus exantem ático (reacción de
Weil-Félix).
Si Jos conocimientos sobre estructura antigé­
nica de rickettsias son poco claros, menos cla­
ros aun son los que poseemos sobre los antíge­
nos virales, y ello está relacionado con su ta­
maño, su simplicidad constitucional y su capa­
cidad para multiplicarse únicamente en presen­
cia de células vivas.
En cuanto a su antigenicidad, los virus se pa­
recen a las bacterias y en algunos de ellos ha
sido posible demostrar varios antígenos; la es­
tructura antigénica está frecuentemente sujeta a
variaciones.
E ntre los virus anim ales del grupo ADN,
uno de los que mejor se ha estudiado ha sido el
virus de la vacuna. Inicialmente se describió la
presencia de dos antígenos solubles, uno llama­
do L, que se destruye por calentamiento a 56°C
durante una hora, y el otro S, que resiste una
hora a 65°C. Se creyó que ambos antígenos es­
taban separados y que el componente S era un
poiisacárido con características de hapteno.
Actualmente se sabe que son constituyentes de
una misma molécula proteica. En los corpúscu­
los elementales de la vacuna se han identifica­
do además otros dos antígenos llamados N P o
antígeno nucleoproteico y el antígeno X, que es
un aglutinógeno. Un suero inmune animal ad­
sorbido con los antígenos SL, N P y X conserva
todavía poder aglutinante sobre los corpúsculos
elementales y poder neutralizante sobre el vi­
rus, lo que está indicando que además de los
descritos deben existir otros antígenos con las
propiedades indicadas.
Por exámenes serológicos se han demostrado
relaciones antigénicas entre los virus ECHO,
Coxsackie y de la pohomielitis, todos ellos per­
tenecientes al grupo ARN. Las cepas del virus
Antígenos 61
de la poliomielitis conocidas hasta el momento
corresponden a tres tipos antigénieos diferen­
tes, I, II y III, y cualquiera de eUos puede ser
responsable de epidemias.
Los estudios serológicos acerca del virus de
la influenza, principalmente mediante virus ad­
sorbidos sobre hem atíes, han dem ostrado la
existencia de dos variedades fundamentales, la
A y la B. En la primera de ellas han sido identi­
ficados varios subtipos que difieren e n tre sí
respecto de la especificidad dominante.
Ultimamente ha sido muy estudiado el virus
de la hepatitis B (HBV), Es un virus de tipo
ADN, de 42 nm de diámetro, de doble envoltu­
ra, inicialm ente conocido com o partícu la de
Dañe. Posee un compuesto antigénico que for­
ma un núcleo o core, de 27 nm de diámetro, y
antígenos de envoltura. Los antígenos del HBV
identificados hasta el momento son:
HBsAg = antígeno de superficie
HBcAg = antígeno del core
HBeAg = antígeno e íntimamente relaciona­
do con la infección por HBV
El HBsAg posee un componente a, com ún a
los diferentes subtipos, y componentes desig­
nados como d, y, w, r, que son codificados por
el genoma viral y no por el huésped. Los subti­
pos principales que resultan de la combinación
de a con ellos, se comportan como si constitu­
yeran dos tipos alélicos: d e y por un lado, y
wJ, w2, w3, w4, y r por el otro. Las 10 catego­
rías de antígenos de superficie del virus HBV
son las siguientes: ayw l, ayw2, ayw3, ayw4,
ayr, adw2, adw4, adr, adyw y adyr. También
han sido identificados otros antígenos de super­
ficie denominados q, x, f t, j, n y g. Hasta estos
mom entos no se conoce claramente qué rela­
ciones pueden existir entre éstos y los ya co­
rrectamente identificados.
Del antígeno e (HBeAg) se conocen dos va­
riedades denominadas HBeAg/1 y HBeAg/2.
Los antígenos mencionados son inm unogé­
nicos y tienen capacidad para engendrar anti­
cuerpos específicos (véase cap. 27).
La estructura antigénica del HIV o virus del
síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SI­
DA) ha sido ampliamente estudiado en los últi­
mos años. Es un retrovirus de la subfamilia de
los lentivirus constituido por ARN, transcripta­
sa inversa, proteínas estructurales y glucopro­
teínas de envoltura. Entre las proteínas estruc­
turales internas o del “core” se han identificado
las p24, p25, p l7 y p l5 ; enzimas con actividad
polimerasa como las p66, p51 y p33, y las glu­
coproteínas de envoltura g p l2 0 y gp41, entre
otras (véase cap. 27). La g p l20 es la que se une
a la molécula de superficie CD4, presente prin­
cipalm ente en los linfocitos T cooperadores.
62 Aspectos básicos de la inmunidad
cuya infección y destrucción inhiben su partici­
pación en los mecanismos inmunológicos, ori­
ginándose como consecuencia una inmunodefi­
ciencia.
Los virus productores de enfermedades en
plantas han sido en conjunto los menos estudia­
dos, no obstante haber sido uno de ellos, el del
mosaico del tabaco, el primero en ser obtenido
en estado cristalino. Estudios serológicos efec­
tuados con estos virus han demostrado la pre­
sencia de componentes comunes responsables
de reacciones cruzadas. Lo mismo puede decir­
se sobre los bacteriófagos o virus de bacterias,
acerca de los cuales últimamente se han inten­
sificado estudios de este tipo.
Toxinas microbianas
Numerosos microorganismos elaboran sus­
tancias difusibles o no en el medio externo y
capaces de provocar, en animales susceptibles,
lesiones o síntomas característicos. A las que
difunden en los medios nutricios donde esos
microorganismos son cultivados, se las designa
exotoxinas, mientras que a aquellas que forman
parte del soma microbiano y que sólo son libe­
radas por autólisis se las denomina endotoxi­
nas. Ambas son antigénicas, sobre todo las pri­
meras, dado su carácter eminentemente protei­
co, mientras que las segundas son polimolecu-
lares y forman complejos glúcido-lípidoprotei-
cos. Los anticuerpos respectivos las neutralizan
específicam ente y esta característica precisa­
mente es la que permite diferenciarlas de otros
venenos químicos, de los alcaloides, etcétera.
Los microorganismos exotóxicos ejercen su
acción a distancia por difusión de sus venenos
por vía hemática y linfática. Muchos producen
más de una toxina, pero por regla general una
es la que posee acción preponderante. Elay co­
cos que elaboran exotoxinas, entre ellos los es­
tafilococos dorados y los estreptococos hemolí­
ticos, pero los gérmenes toxigénicos más acti­
vos son bacilos pertenecientes principalmente
al género anaerobio Clostridium.
Algunas exotoxinas, como la tetánica y la
diftérica, han sido altamente purificadas y cris­
talizadas. De esta última se sabe que su peso
molecular oscila entre 62 y 63 kDa y que tien­
de a formar dímeros y agregados de alto peso
m olecular sin pérdidas apreciables del efecto
tóxico. Se conoce también parte de su secuen­
cia primaria. Posee dos puentes disulfuro que
al ser reducidos con mercaptoetanol y alquila­
dos hacen que la molécula pierda algo de su to­
xicidad. Si a continuación la molécula es some­
tida a digestión tríptica se originan dos pépti­
dos, uno correspondiente al fragmento N-ter-
minal (péptido A), de P.M. 23 kD, que se man­
tiene soluble en agua, y otro constituido por el
fragmento C-terminal (péptido B), de P.M. 38
kD, que se agrega con mucha facilidad y resul­
ta muy difícil recuperarlo en su estado nativo,
lo que dificulta su estudio biológico. El péptido
A no es tóxico (fig. 4-7).
Las características de las endotoxinas extraí­
das de los distintos microorganismos son muy
parecidas, y en los animales de experim enta­
ción producen sintomatología análoga, caracte­
rizada por elevación térmica, postración y fe­
nómenos hem orragíparos viscerales. La pro­
ducción de anticuerpos en el hombre y anima­
les es escasa o nula. El poder tóxico es varia­
ble, y algunos investigadores han aislado de
salmonelas, especialm ente Salm onella typhi,
glucidolípidos con distintos grados de pureza,
capaces de provocar reacciones febriles en el
ratón blanco con dosis que van de 0,1 ¡ig a
0,005 |ig.
Desde el punto de vista de la antigenicidad,
las más importantes son las exotoxinas, mien­
tras que las endotoxinas no son muy activas y
su poder tóxico, de muy difícil valoración bio­
lógica, se expresa en miligramos por gramo de
peso animal. Las exotoxinas pueden ser medi­
das sin inconvenientes por procedimiento bio­
lógico, y se ha establecido al respecto una serie
de unidades.
Dosis mortal mínima (DMM o DLM)
Es la menor cantidad de toxina que inocula­
da a un animal sensible le produce la muerte en
un determinado período. Esta definición, para
el caso de la toxina diftérica, tal como lo hizo
Ehrlich, es la siguiente: la menor cantidad de
toxina que inoculada a un cobayo de 250 g de
peso, por vía subcutánea, le produce la muerte
a las 96 horas de la inoculación. Para otras to­
xinas varía el animal a inocular y la vía de in­
troducción del antígeno. Es preciso respetar es­
tas condiciones para que los resultados puedan
ser comparables.
Dosis letal 50 (DL 50)
Es la menor cantidad de toxina que, inocula­
da a cada uno de los animales de un lote o gru­
po, produce la muerte del 50% de éstos en un
período determinado. Para el caso de la toxina
diftérica, los animales a emplear son cobayos
de 250 g de peso, la vía de inoculación la sub­
cutánea y el tiempo de lectura 96 horas.
Límite nulo (Lo)
Es la mayor cantidad de toxina que, unida a
una unidad antitóxica e inoculada al animal re­
ceptivo, no produce síntomas de intoxicación
en un período preestablecido.

Límite muerte ( L+)
Es la menor cantidad de toxina que, unida a
una unidad antitóxica e inoculada por vía subcu­
tánea, a un cobayo de 250 g de peso, le produce
la muerte a las 96 horas. Esta definición así ex­
presada corresponde a toxina diftérica ya que, si
valoramos toxina tetánica (tetanoespasmina), los
animales a utilizar serán cobayos de 350 g de
peso y la cantidad de antitoxina 0,1 U.A. Para
otras toxinas la cantidades de antitoxinas a em­
plear varían; están especificadas en cada caso y
dependen de la actividad de la toxina. Esta uni­
dad es una de las más utilizadas en la medición
de actividad de toxinas y antitoxinas.
Como la cantidad de unidades de antitoxina
a utilizar para los diferentes toxinas microbia­
nas es U.A./n, los valores de n establecidos son:
Antitoxina U.A.
D iftérica
Tetánica 10 0,1
Cl. welchii 5 0,2
Cl. septicum 2 0,5
Cl. histolicum 1 1
Cl. sordelli 5 0,2
Cl. aedem atiens 50 0,02
Dosis límite reaccional (LR)
Esta unidad ha sido definida para la toxina
d ifté ric a después de las o b se rv a c io n e s de
Roemmers sobre el eritema que producía ésta
cuando se la inoculaba por vía intradérmica y
la inhibición de este fenómeno por la corres­
pondiente antitoxina.
Se la define como la mínima cantidad de to­
xina que mezclada con 1/300 de unidad antitó­
xica e inoculada por vía intradérmica en el co­
bayo, en un volumen de 0,2 ml, le produce una
lesión cutánea mínima. Inicialmente se usó co­
mo dosis de antitoxina una unidad antitóxica;
actualmente se emplea tal como ha sido defini­
da e incluso hay autores que establecen la ca­
pacidad reaccional de la toxina frente a 1/250
U.A. o 1/500 U.A.
C uadro 4-3. Caracteres diferencíales de las toxinas microbianas
N autraleza quím ica Proteínas
S olubilidad en ácido tricloroacético Insolubles
Excreción al m edio de cultivo Son excretadas
Toxicidad M uy tóxicas (DEM = 0,001 mg)
Estabilidad a 80°C Inestables
Estabilidad a tem peratura am biente M uy po co estables
Estabilidad a las radiaciones ultravioleta Poco estables
A ntigenicidad M uy antigénicas
C om portam iento frente al aldehido fórm ico F orm an toxoides (antigénicos y no tóxicos)
Antígenos 63
Dosis límite floculante (Lf)
Fue establecida inicialmente por Ramón para
la toxina diftérica, y actualmente se la emplea
también para la valoración de otras toxinas. La
unidad de floculación o Lf es la cantidad de to­
xina que, mezclada con una unidad antitóxica,
flocula en el menor tiempo, cuando se ha utili­
zado para la medición una serie de mezclas que
co n tien en cantidades variab les de to x in a y
constantes de antitoxina. Al tiempo de flocula­
ción se lo denomina Kf y sirve para expresar la
avidez de los sueros o antitoxinas en estudio,
ya que dos antitoxinas diferentes con el mismo
valor de unidades antitóxicas pueden provocar
la floculación y consiguiente neutralización de
la toxina en diferentes tiempos. Esto expresa
distinta rapidez en la neutralización, fenómeno
que es tenido en cuenta en terapéutica.
En el cuadro 4-3 figura una serie com parati­
va de las propiedades de las endo y exotoxinas
bacterianas.
V enenos de vegetales superiores
De distintos vegetales han sido aisladas sus­
tancias tóxicas con carácter antigénico, desta­
c án d o se entre ellas la ab rin a, e x tra íd a del
A brus precatorius; la crotina, del C roton ú-
gliun; la ricina, del Ricinus comunis; la curcina,
del Jatropha curcas, y la robina, de la Robinia
pseudoaccacia. Todas estas sustancias tóxicas
son de carácter proteico, poseen actividad anti­
génica y son capaces, cuando se las trata por el
formol, de transformarse en toxoides, o sea to­
xinas que han perdido su efecto tóxico, pero
que conservan su función antigénica.
Algunas de estas fitotoxinas han sido purifi­
cadas por cristalizaciones y estudiadas desde el
punto de vista fisicoquímico y biológico.
De otros vegetales se han aislado algunas he­
maglutininas y hemotoxinas, pero por regla ge­
nera] no son tóxicas para el hombre cuando son
ingeridas. Sólo las cuatro nombradas en primer
término poseen aquella característica.
Exotoxina.'i Endcítoxincks
G lucolipoides
Solubles
No son excretadas
Poco tóxicas (DEM s 0,1 mg)
Estables
Estables
Estables
Poco antigénicas
No se convierten en to x o id es
64 Aspectos básicos de ¡a inmunidad
-OOC - Arg-
í H,N-
-o o c -
Toxina (PM: 62 kD)
F ig . 4-7. E structura esquem ática de la toxina diftérica y de los péptidos resultantes de la hidrólisis triplica. (Según A. M.
Pappenheim er, Jr. y D. M ichael Gilí. Sciece 182: 353, 1973.)
Venenos de origen animal
Numerosos animales producen secreciones
tóxicas para el hombre; figuran entre ellos es­
pecies de serpientes, escorpiones, arañas, sala­
mandras e incluso abejas. Los mejor estudiados
han sido los ofidios. Estos venenos son proteí­
nas antigénicas transformables en anavenenos
por acción del formol. Del veneno de la víbora
cobra (Naja flava) se ha aislado una potente
neurotoxina, con un niimero de DMM para el
ratón superior a las 100.000 por gramo de ve­
neno. Esta es de bajo peso molecular, entre 2,5
kD y 4 kD, y dializa a través de membranas de
celofán. Los venenos de estos tipos de víboras
son neurotóxicos y hemolíticos, pero muy poco
o nada hemorragíparos y citolíticos. De otros
tip.os de serpientes, entre ellos la cascabel
(Crotalus terrificus), se han aislado proteínas
tóxicas de peso molecular de aproximadamente
30 kD. Del género Bothrops, especialmente de
la Bothrops alternata o víbora yarará, se han
obtenido sustancias sum am ente tóxicas cuya
principal característica, al igual que en el caso
del Crotalus terrificus, es su alto contenido en
azufre. Por haberío hallado también en el vene­
no de escorpiones y de abejas, algunos autores
consideran que todos los venenos o toxinas de
origen animal son ricos en ese elemento.
Los venenos crotálicos, a diferencia de los
de cobra, son poco neurotóxicos, pero son he­
molíticos, coagulantes, muy hemorragíparos y
citolíticos. Los venenos de escorpiones y algu­
nos arácnidos ejercen sobre el hombre una ac­
ción muy parecida a la que se ha descrito para
los venenos de serpientes.
La m ayor parte de los venenos anim ales,
tanto los provenientes de serpientes como los
de insectos, deben su acción tóxica a neuroto-
xinas, enzimas proteolíticas y fosfatidasas, an­
tigénicas en su mayoría.
Antígenos de zooparásitos
H abida cuenta de que en los zooparásitos
-Gly-NH3
SH
SH SH SH
i- c o o -
Péptido B (PM: 38 kD)
existen constituyentes de naturaleza proteica y
glucídica con propiedades antigénicas, es lógi­
co suponer que en los casos en que aquéllos
lleguen a la intimidad de los tejidos, estimula­
rán al sistema reticuloendotelial y originarán
anticuerpos.
En algunas parasitosis tales como el paludis­
mo y la amebiasis, en los períodos de cronicidad
hay una marcada resistencia a la reinfección. En
estos casos no siempre es posible demostrar la
presencia de anticuerpos, pero todo hace supo­
ner que esa resistencia es consecuencia de una
refractariedad específica por inmunidad.
En los parásitos unicelulares, por sus condi­
ciones particulares de vida, resulta difícil el
aislamiento de sustancias químicas específicas,
en tanto que en los pluricelulares, dada su es­
tructura compleja, los estudios no son del todo
satisfactorios. Las reacciones inmunoserológi-
cas más utilizadas para el diagnóstico de estas
parasitosis son las de fijación del complemen­
to, de precipitación, inm unofluorescencia y
ELISA, principalmente para la identificación
de protozoarios, no así de vermes. Ello no se
debe a que los primeros tengan antígenos con
mayor poder inmunizante que los segundos, si­
no que está relacionado con el hábitat normal
del parásito. Las tenias, áscaris, oxiuros, anqui-
lostomas, viven en el intestino y dan pocas m a­
nifestaciones serológicas, a diferencia de lo que
ocurre con las triquinas, leishmanias, tripano­
somas, plasmodios, que indudablemente provo­
can la formación de anticuerpos.
Estudios efectuados in vitro con anquilosto-
mas y triquinas demuestran que cuando estos
parásitos vivos se ponen en contacto con sus
respectivos anticuerpos aparecen precipitados
m icroscópicos en form a de burbujas o capu­
chones que recubren electivamente los orificios
bucales de las larvas.
Con respecto a la composición química de
los antígenos parasitarios, se han aislado poli­
sacáridos que dan reacciones específicas con
los sueros de conejos inmunizados con los pa­
rásitos de los que provienen. El poiisacárido

del Ascaris lumbricoides y de la mayor parte
de los parásitos es glucógeno, formado por ca­
denas de glucosa y muy similar al glucógeno
de los mamíferos, aunque de peso m olecular
más bajo.
Las proteínas presentes en los zooparásitos
son poco conocidas porque su estudio no ha si­
do encarado a fondo.
En cuanto a los lípidos, son los comunes ha­
llados en otras especies animales.
Dado el carácter crónico de las infecciones
parasitarias, el desarrollo de alergia es muy fre­
cuente, y puede ser utilizada con fines diagnós­
ticos si se emplean extractos parasitarios como
antígenos desencadenantes.
Es conveniente recordar que sobre todo en
los cestodes y nematodes, como consecuencia
de la presencia de antígenos de grupo, son co­
munes las reacciones cruzadas (véase cap. 26).
De algunos hemoflagelados como el Tripa-
nosoma cruzi, en especial de la forma epimasti-
gote del parásito, obtenida por cultivo en m e­
dios bifásicos y rota por compresión y descom­
presión, se ha conseguido separar por centrifu­
gación diferencia] distintos componentes rela­
cionados con las fracciones nuclear, flagelar,
ribosomal, mitocondrial, etc., que han sido ana­
lizadas desde el punto de vista antigénico. La
fracción separable a 1.000 g es rica en núcleos,
flagelos y membranas, las que a su vez pueden
separarse por centrifugación en gradientes de
densidad de sacarosa; las correspondientes a
11.500 g y 30.000 g están muy enriquecidas en
membranas mitocondriales, y el sobrenadante
de 105.000 g tiene un alto contenido en proteí­
nas citoplasmáticas. Algunos de esos antígenos
son muy útiles para reacciones serológicas, co­
mo lo es la fracción soluble de 105.000 g, la
que, por otra parte, ha demostrado carecer de
poder protector en la infección experim ental
del ratón. La fracción flagelar, en cambio, es la
que mejor protege.
En nuestros laboratorios, por técnicas com ­
binadas de inm unoquím ica y el uso de an ti­
cuerpos monoclonales, ha sido posible separar
componentes antigénicos de T. cruzi. Uno de
ellos, el A gl63B 6, constitutivo de la mem bra­
na del parásito ha resultado ser muy útil para la
elaboración de reacciones serológicas de diag­
nóstico de la enfermedad de Chagas. Presenta
la característica de no dar reacciones de cruce
con componentes de Leishmanias, otro parásito
que pulula en zonas endémicas de tripanoso­
miasis americana y que muchas veces puede
confundir el diagnóstico (véase cap. 26).
Antígenos específicos de especies y órganos
Cuando un antígeno es propio de una espe­
cie y se encuentra en todos sus miembros se
Antígenos 65
dice que es específico de especie. Inyectados a
especies homólogas no producen anticuerpos,
cosa que ocurre si se inoculan a especies hete­
rólogas. En los animales de una misma especie
es p osible encontrar proteínas que cum plen
distintas funciones en el organismo, presum i­
blem ente con estructuras diferentes, las que
pueden ser diferenciadas serológicamente. Así,
por ejemplo, la hemoglobina del hombre pue­
de ser serológicamente diferenciada de las pro­
teínas renales e, incluso, los distintos com po­
nentes del plasma sanguíneo pueden ser dife­
renciados fácilmente por los métodos inmuno-
serológicos. Por otra parte, proteínas q u e en
diferentes especies animales cumplen una m is­
ma función, tíenen, por regla general, una es­
tructura parecida y por lo común dan reaccio­
nes cruzadas.
Cuando los antígenos son particulares de un
órgano de una especie animal se llaman espe­
cíficos de órgano, los que a su vez pueden ser
específicos de órgano y de especie, si la espe­
cificidad es propia y particular para ambos. El
ejemplo clásico de este tipo de antígenos es la
tiroglobulina. Otras veces la especificidad sólo
es de órgano, ya que el mismo antígeno puede
encontrarse en diferentes especies; en estos ca­
sos los antígenos son específicos de órganos,
pero heterogenéticos. El ejem plo más re p re ­
sentativo es la proteína del cristalino del ojo,
la que puede hallarse en especies tan diferentes
como el hombre y los peces, con la m ism a es­
pecificidad.
E x isten antígenos, en esp ecial p ro teín as,
que cumplen la m ism a función en diferentes
especies animales y que poseen gran similitud
en sus estructuras, siendo capaces de dar reac­
ciones cruzadas. Un ejem plo de ello son las
insulinas, las que, si bien en un principio se
creyó que eran idénticas, difieren entre sí por
modificaciones en la secuencia de sus am inoá­
cidos, de los cuales aproximadamente tres son
los que están comprometidos. Este tipo de es­
pecificidad se conoce con el nombre de fu n -
cional.
No todas las proteínas y células de los dis­
tin to s anim ales de una m ism a esp ecie son
idénticas, ya que hay posibilidades de diferen­
ciaciones serológicas, las que llevan a la esp e­
cificidad individual o alotípiea, a diferencia de
la especificidad de especie o isotípica. Son
ejem plos de estos tipos de especificidad los
antígenos de los diferentes sistemas de los gru­
pos sanguíneos, ya sean los mucopolisacáridos
del sistema ABO, o los constituyentes proteicos
de otros grupos, como los MN. Existen en los
distintos individuos de la misma especie otros
antígenos que se heredan, cuya presencia que­
da dem ostrada por la im posibilidad de tra s­
plante de tejidos homólogos.
66 Aspectos básicos de la inmunidad
Antígenos heterófilos
Forssman fue el primero en demostrar la pre­
sencia del mismo tipo de antígeno o antígenos
muy similares distribuidos en forma variada en
la naturaleza, los cuales pueden ser com parti­
dos por bacterias, hongos, vegetales superiores,
vertebrados, etc. El más conocido y estudiado
de estos antígenos ha sido el de Forssman. Se
encuentra muy repartido y es posible hallarlo
en distintas bacterias, como las shigelas en su
form a rugosa, los neum ococos, el B a ciílu s
anthracis\ se lo encuentra también en algunos
parásitos animales, como las triquinas, en algu­
nos moluscos y crustáceos, en reptiles, en el
caballo, la cabra, el carnero, el cobayo, el ra­
tón, el perro, el gato y otros felinos e incluso en
el homljre del grupo sanguíneo A.
Forssm an lo describió por prim era vez al
comprobar que conejos inyectados con riñones
triturados de cobayo producían anticuerpos líti­
cos a alta concentración para los hematíes de
carnero. Si bien a este antígeno se lo ha encon­
trado muy distribuido en la naturaleza, el con­
cepto primitivo de unidad antigénica ha cam­
biado, ya que actualmente se considera como
tales a aquellos antígenos que, inoculados a co­
nejos, producen lisina para los hematíes de car­
nero. Estos antígenos son solubles en alcohol,
resisten a la ebullición y, desde el punto de vis­
ta químico, han sido estudiados por Landstei­
ner y Levine, quienes han encontrado un alto
contenido en hidratos de carbono, aproximada­
mente 55 a 58%, y un 2 a 3% de nitrógeno. En­
tre los azúcares obtenidos por hid ró lisis se
identificaron hexosaminas.
El concepto de antígeno de Forssman ha sido
sustituido por el de hapteno y se lo concibe,
desde el punto de vista serológico, como un
conjunto de sustancias similares cuya caracte­
rística particular sería la de producir en el cone­
jo hemolisinas para los glóbulos rojos de carne­
ro. Ese hapteno es de naturaleza glucidolipídi-
ca, y la especificidad, atribuible al hidrato de
carbono.
En el curso de algunas enfermedades, como
la mononucleosis infecciosa, es posible encon­
trar anticuerpos heterófilos capaces de agluti­
nar los hematíes de carnero. En un comienzo se
los consideró como anticuerpos contra el antí­
geno de Forssman, pero trabajos posteriores
han permitido comprobar que actúan no sólo
sobre constituyentes existentes en el estroma
de los hematíes de carnero, sino también en los
del ganado vacuno, especie que por otra parte
no posee antígenos de Forssman, lo que está in­
dicando diferencias en estos tipos de antígenos.
La identificación de éstos puede hacerse por la
aglutinabilidad de los hematíes de carnero y de
vacuno por los anticuerpos de este tipo. Los an-
Cuadro 4-4. Antígenos heterófilos
A glutinación de hem atíes de carnero
Suero Suero
adsorbido adsorbido
Suero con riñón con hem atíes
sin de cobayo bovinos
Anticuerpos adsorber hervido h ervidos
Forssm an + - +
M ononucleosis + ± -
infecciosa
Enferm edad + ±0+ ±0 +
del suero
ticuerpos anti-Forssman sólo aglutinan los he­
matíes de oveja, no así los de vacuno.
Aquellos pacientes a los que se les han ino­
culado dosis repetidas de suero de caballo, pue­
den formar anticuerpos capaces de aglutinar a
los hematíes de oveja, pero no reaccionan con
los antígenos de Forssman, ni con los hematíes
de bovinos. El determinante de la formación de
estos anticuerpos constituiría, pues, otro tipo de
antígeno heterófilo.
Teniendo en cuenta que los anticuerpos anti-
Forssman son adsorbidos por suspensiones de
riñón de cobayo, pero no por los hematíes bo­
vinos; que los anticuerpos de la mononucleosis
infecciosa no son adsorbidos por las suspensio­
nes de riñón de cobayo, pero sí por los hema­
tíes de bovinos, y que los anticuerpos de la en­
fermedad del suero son débilmente adsorbidos
por las dos suspensiones mencionadas, es posi­
ble, por ensayos de aglutinación frente a hema­
tíes de carnero, del suero del paciente no adsor­
bido y previa adsorción con riñón de cobayo y
hematíes bovinos, establecer la identidad del
anticuerpo en estudio (cuadro 4-4).
Otros antígenos compartidos
Existen microorganismos que, sin tener pa­
rentesco inmediato de género o especie, com ­
parten determinantes antigénicos, lo que hace
que en muchas circunstancias ocurran reaccio­
nes cruzadas entre algunos de ellos con los sue­
ros de pacientes o animales inmunizados con
los otros microorganismos.
Un caso es el del Proteus OX, cuya variedad
OX 19 posee un antígeno común con la Pic-
kettsía prowazeckii y \'d Rickettsia ricketsli, y la
variedad OXK posee un antígeno compartido
con la Rickettsia tsutsugamushi. For este m oti­
vo, en la reacción de W eil-Félix se emplean
suspensiones de esos microorganism os como
antígenos para la investigación de anticuerpos
contra Jas rickettsias nombradas, productoras
del tifus exantemático, la fiebre manchada de
las Montañas Rocosas y fiebre tsutsugamushi.

El diagnóstico preciso de sífilis puede lograr­
se cuando se emplea como antígeno el Trepone­
ma pallidum, microorganismo no cultivable en
los medios artificiales y sólo mantenido viable
por pasajes sucesivos en conejos inoculados por
vía testicular. Pero este microorganismo tiene
una proteína muy similar a otra proteína aislada
de un treponem a cultivable, el treponem a de
Reiter, con la que comparte determinantes anti­
génicos. Con esta proteína aislada puede efec­
tuarse una serorreacción de fijación del comple­
mento para el diagnóstico de certeza de la sífilis.
Compartir antígenos por algunos microorga­
nismos y antígenos constitutivos de células o te­
jidos en el hombre no siempre es beneficioso;
tal el caso de los dextranos y polisacáridos de
algunos neumococos, como los del tipo II, XII y
XX. Personas que como consecuencia de infec­
ciones por estos microorganismos han formado
anticuerpos contra sus poliósidos, pueden sufrir
accidentes graves (choque anafiláctico) al ser
trasfundidos con soluciones de dextranos.
También se ha observado que el neumococo
tipo XIV posee un polisacárido cuya estructura
antigénica es compartida al menos por dos hi­
dratos de carbono de los isoantígenos sanguí­
neos hum anos A, B y 0. Existen num erosos
ejemplos similares a los anteriores, lo que nos
muestra la caprichosa distribución en la natura­
leza de ciertos constituyentes,que, por el hecho
de compartir determinantes antigénicos, al in-
munizai' sensibilizan para ambos antígenos, cu­
yo resultado puede ser útil en algunos casos o
francamente desfavorable como acabamos de
ver.
C onstituyentes antigénicos de los glóbulos
rojos hum anos
Las comprobaciones efectuadas inicialmente
por Landsteiner y completadas luego por nu­
merosos investigadores, con respecto a la pre­
sencia en h em atíes hum an o s de d ife re n te s
constituyentes antigénicos, han permitido sub-
dividir a aquéllos en distintos sistemas, llam a­
dos ABO, MN, S, P, Rh, etc., los que a su vez,
de acuerdo con subgrupos y frecuencia, han
llevado al encasillamiento del hombre en dife­
rentes grupos sanguíneos. Como todos estos
factores son hereditarios y cumplen las leyes
mendelianas, la im portancia de su estudio en
medicina legal, antropología, etc., es de valor
significativo.
De todos estos constituyentes antigénicos,
los mejor estudiados en lo relativo a su compo­
sición química son los del sistema ABO.
Desde el punto de vista genético se ha pro­
puesto la existencia de tres genes alélicos. A, B
y O, siendo A y B dominantes respecto de 0.
Los genes A y B rigen la formación de las sus­
Antígenos 67
tancias A y B, en tanto que el O no dirige la sín­
tesis de ningún isoantígeno.
No obstante, las células O tienen un antígeno
que ha sido reconocido por sueros normales de
algunos animales -e n especial los provenientes
de terneras y anguilas-, sueros de cabra anti-
shigela y algunas proteínas de origen vegetal.
Como el antígeno de las células O no sólo está
presente en el hombre sino también en algunos
anim ales, es heterogenético; de ahí que se lo
llame sustancia H. Esta no puede ser conside­
rada como producto del gene O, ya que es posi­
ble, con sueros anti-H, obtener aglutinaciones
positivas de glóbulos A (homocigotas) y AB.
Siendo el hombre diploide, homocigota o he­
terocigota, los dos alelos por individuo pueden
dar lugar a seis genotipos y cuatro fenotipos.
Las sustancias de los grupos sanguíneos A, B
y O no han podido obtenerse puras o serológica-
mente muy activas a partir de los hematíes hu­
manos; pero de tejidos y secreciones animales e
incluso de secreciones humanas ha sido posible
su extracción en estado de relativa pureza.
Sustancias del grupo A se obtuvieron de pep-
tonas comerciales, mucosa de estómago de cer­
do, del cuarto estómago de la vaca, de la saliva
hum ana y otros materiales. De estóm agos de
cerdos se han aislado sustancias A, B y sustan­
cia con especificidad para el grupo O (H ), al
igual que de estómagos de bovinos y de algunas
plantas. Cabe señalar que no siempre los pro­
ductos extraídos como sustancia A de diferentes
materiales eran activos, no obstante la similitud,
en algunos casos, de su contenido en hexosami-
ñas, azúcares reductores, acetilo, nitrógeno, vis­
cosidad relativa, etc. Las denominadas sustan­
cia A aisladas de materiales de origen humano
por diferentes autores, si bien son semejantes en
cuanto a su peso molecular y ciertas propieda­
des físicas y químicas, algunas son dextrógiras
y otras tienen poder levorrotatorio.
La sustancia A aislada de diferentes anim a­
les tiene mucha similitud con la de origen hu­
mano; no obstante, en algunos casos, sobre to­
do cuando se efectúan estudios m ediante las
técnicas del bloqueo o inhibición de la hem oa­
glutinación, se observan diferencias.
Las sustancias de los grupos sanguíneos A,
B y O (H) reaccionan con suero antineumocóci-
co tipo XIV, debido muy prob ab lem en te al
contenido de glucosa en todas ellas. La distinta
especificidad de aquéllas indudablem ente es
debida a otras diferencias estructurales. Todas
son polisacáridos que, inyectados en estado de
pureza a conejos, no producen anticuerpos y
sólo lo hacen si previamente son trasformados
en antígenos completos por complejación con
proteínas, preferentemente las de Shigella dy~
senteriae. Inoculadas al hombre en estado de
pureza, tal como se obtienen, por extracción fe-
68 Aspectos básicos de la inmunidad

C u ad ro 4-5. Los antígenos más importantes C u ad ro 4-5. (Continuación)

de los diferentes sistemas de los glóbulos rojos
humanos SISTEM A Rh

Sistem a ABO A glutinógenos

Progenitores G enotipo Fenotipo Nom enclatura N om enclatura

de Fisher-Race de W iener
A A x AA AA A
A A x AB AA A (lee rh
AB AB dCe rh'
AA X AO AA A dC»e rh'»
AO A* dcE rh "
A A xBB AB AB dCE rhv
AA X BO AB AB Dce Rh„
AO A* DCe Rh,
AA X 00 AO A* DC»e R h ,»
A B xA B AA A D cE Rhj
BB B D CE Rhj
AB AB D"ce Rh»
A BxA O AA A D “Ce Rh,
AO A* D “cE RH,
AB AB ID“CE RH,
BO B*
A BxBB BB B
AB AB
AB x B O BB B
BO B*
AB AB O tros sistem as Fenotipo
AO A*
A B xO O AO A* MN M
BO B* N
A O x AO AA A MN
00 0 Ss S
AO A* s
AO X BB AB AB Ss
BO B* P P,
A O xB O 00 0 P,
AO A* P
BO B* Lutheran Lu»
AB AB L u”
AO X 00 00 0 Kell K+
AO A* K-
BBxB B BB B Lewis Le‘>
BB x B O BB B Le"
BO B* D uffy Fyo
BB X 00 BO B* Fy"
BOX BO BB B Kidd Jk»
00 0 Jk"
BO B*
BOX 00 00 0
BO B*
00x00 00 0 secretores, dándose el nombre de no secretores
a quienes carecen de ellas. Esta propiedad no
L os g rupos san g u ín eo s A y B m arc ad o s con * son h ete ro cig o lo s.
E n cl c u a d ro sólo se in d ica el gru p o A y n o sus su b tip o s A , y A j
es exclusiva de las sustancias A, B y O (H), si­
no que tam bién parece estar relacionada con
otros constituyentes de los glóbulos rojos, co­
mo el Lewis Le'*,
nólico-alcohólica a partir de estómagos de cer­ Las sustancias de los grupos sanguíneos que
do, producen aumento de los anticuerpos co­ se encuentran en gran cantidad, principalmente
rrespondientes, lo que dem uestra el distinto en los fluidos de los quistes de ovario, están
comportamiento en uno y otro caso. Hay auto­ constituidas aproximadamente por un 25% de
res que sostienen que ello se debe a que, como aminoácidos y 75% de polisacáridos. Tanto las
en el hombre ya existen anticuerpos contra las de origen humano como animal contienen ga­
mismas, al penetrar y combinarse con dichos lactosa, fucosa, n-acetil galactosamina y nacetil
anticuerpos, dado su carácter proteico, harían glucosamina.
que los productos de combinación fueran verda­ Los aminoácidos presentes parecen no tener
deros antígenos y actuaran como estimulantes. mucha significación en cuanto a la especifici­
A aquellos individuos en cuyos fluidos exis­ dad del producto. Ella se modifica por hidróli­
tan las sustancias A, B o O (H) se los denomina sis ligeras que no remueven los aminoácidos

Sustancia H
N-acetilgalactosamina
D-galactosa
Fig. 4-8. R epresentación esquem ática de las estructuras quím icas de las sustancias H , A y B y sus relaciones.
presentes, pero sí producen alteraciones del hi­
drato de carbono.
Trabajando con extractos de Tricíiomonas
foetus, ricos en enzimas contra las sustancias
A, B y O (H), se demostró que algunos glúcidos
simples pueden actuar como inhibidores. La fu-
cosa actiia como inhibidora de la sustancia O
(H), la n-acetil D-galactosamina inhibe la des­
trucción de la sustancia A, y la D-galactosa la
de la sustancia B.
Los monosacáridos indicados son en reali­
dad los azúcares terminales no reductores cons­
tituyentes de los poliósidos responsables de la
especificidad. Con respecto a la sustancia B se
cree que no es exactamente la D-galactosa, si­
no la 6-acetil glucosamina. Por la potencia de
la respuesta en los ensayos de inhibición, se es­
tima que la parte activa son los polisacáridos y
que los aminoácidos hallados son secundarios.
Todo hace suponer que la sustancia H es ela­
borada por un gene H distinto de los genes alé­
licos ABO. A quélla constituiría un precursor
m acrom olecular sobre el que se fijarían los
Antígenos 69
Sustancia A Sustancia B
N-acetilglucosamina
L-fucosa
grupos determinantes de la especificidad de las
sustancias A y B. En los casos de grupo O, al
no actuar como soporte de grupos activos, que­
daría expuesta y podría expresarse como recep­
tor específico (fig. 4-8 y cuadro 4-5).
Existen otras sustancias de grupos san g u í­
neos relacionadas con el sistema ABO: los fac­
tores Lewis Le.j y Le,^. El primero de ellos se
encuentra en la saliva de la mayoría de los no
secretores A, B y O (H). Son glucolípidos no
sintetizados in situ sino adquiridos del plasma,
donde son transportados por lipoproteinas. El
mecanismo de fijación a la superficie de los he­
matíes es desconocido, se ignora si existen re­
ceptores específicos o sólo se encuentran ad­
sorbidos.
Con respecto a otros constituyentes antigéni­
cos de los hematíes, como los M y N, poco es
lo que se conoce sobre su naturaleza quím ica y
parecen localizarse exclusivamente en los he­
matíes. Se sabe que son glucoproteínas y que la
especificidad estaría relacionada con la existen­
cia de pequeños oligosacáridos; la galactosa es
70 Aspectos básicos de la Inmunidad
el carbohidrato predominante. Desde el punto
de vista físico, difieren de los A, B, O (H) en su
solubilidad y extractibilidad.
Sobre los antígenos S, P, Rh y otros menos
significativos, se conoce bastante sobre su po­
der inm unogénico, herencia, im portancia en
medicina legal y antropológica, pero se conoce
poco de su estructura química. De los antíge­
nos Rh se sabe que su síntesis está dirigida por
tres pares de alelos, Cc, Dd y Ee. Según las ca­
racterísticas de homocigotas o heterocigotas de
los progenitores, surgen los genotipos y fenoti­
pos de los distintos individuos (cuadro 4-5).
El número de determinantes o receptores an­
tigénicos en la superficie de los hematíes no es
el mismo para los diferentes sistemas. Para el
ABO se estim a en 800.000 y para el Rh en
30.000. Para otros sistemas su número es aun
Lo.s antígenos de
histocompatibilidad
La identidad o no identidad entre los antíge­
nos de histocom patibilidad del huésped y los
de un tejido u órgano trasplantado es lo que de­
termina su aceptación o rechazo. Son antígenos
de superficie y en el hombre han sido detecta­
dos en los diferentes tipos de células, incluidos
los linfocitos. Su presencia no ha sido demos­
trada en eritrocitos y espermatozoides.
Estos antígenos, insertados en la bicapa lipí­
dica de la membrana celular, son de diferentes
tipos. Los del hombre son codificados por ge­
nes ubicados en el cromosoma 6 y forman par­
te del complejo mayor de histocompatibilidad
(antígenos HLA). Los de clase I están consti­
tuidos por dos cadenas peptídicas, de P.M. 12
kD y 43 kD, respectivamente. La última contie­
ne hidratos de carbono, no así la de P.M. bajo
que ha sido identificada como la p2 microglo­
bulina, proteína cuya presencia en la orina de
pacientes con tubulopatías ha sido establecida
hace tiempo.
Los antígenos de clase II están constituidos
por dos cadenas peptídicas de P.M. 28 kD y 33
kD.
En los capítulos 12 y 20 se encontrará infor­
mación detallada sobre las principales caracte­
rísticas de esos antígenos.
M itógenos y superantígenos
A diferencia de lo que ocurre con los antí­
genos, que activan a los linfocitos interaccio-
nando a través de receptores específicos, los
mitógenos son capaces de inducir división de
linfocitos T y B en forma no específica. Algu­
nos de ellos son efectivos sobre células B,
otros sobre células T o ambas. Son activado­
res policlonales pues inducen al mismo tiem ­
po la proliferación de células provenientes de
diferentes clones. Entre los mitógenos se en­
cuentran las leetinas, como la concanavalina
A (Con A) y la fitohemaglutinina (PHA), pro­
teínas con actividad mitogénica sobre los lin ­
focitos T, con capacidad para unirse a grupos
de carbohidratos distintos. Ello les permite in­
teraccionar con glucoproteínás de membranas
iniciando la transducción de señales y activa­
ción celular.
La Con A es un tetrámero que fija hidratos
de carbono que contienen grupos a-D mañosa
o a-D glucosa terminales o grupos relaciona­
dos. Otras leetinas tienen capacidad para unirse
a otros azúcares.
Los lipopolisacáridos bacterianos (LPS) ob­
tenidos de la pared celular de bacterias Gram­
negativas son activos mitógenos de linfocitos B
y su efecto se ejerce por interacción del lípido
A, uno de sus constituyentes, con componentes
de la membrana plasmática.
Hay mitógenos capaces de activar los hnfo­
citos T y B; uno de ellos es el extraído de la
hierba carmín o “pokeweed” (PWM).
En los últimos años se han descrito antíge­
nos exógenos de origen bacteriano, en especial
la enterotoxina de Staphylococcus aureus, y de
otros m icroorganism os como Streptococcus,
Micoplasma, que para inducir una respuesta in­
m une específica no necesitan procesam iento
previo y su degradación a péptidos para su pre­
sentación por los antígenos del CMH-II al re­
ceptor de los linfocitos T (RCT) (véase cap. 2).
Tienen capacidad para activar células T que ex­
presan secuencias comunes en sus RCT, inde­
pendientemente de la efectividad por el com ­
plejo péptido-CMH. Dada esta peculiaridad se
los denom ina superantígenos. En el ratón se
han demostrado que los antígenos endógenos
M is, al igual que algunos antígenos virales,
presentan también esta característica.
Los superantígenos son activos mitógenos;
la mayor parte son proteínas básicas pequeñas
de 20-30 kD y para inducir una respuesta se
unen a la parte lateral de los antígenos del
CMH-II, que no es la convencional. Su unión
al RCT no se efectúa a través del complejo po­
lim o rfo c o d ific a d o p o r lo s g e n es V a -
JaVpD(3jp, o sitio de unión al antígeno, sino
que se une lateralmente a determinadas secuen­
cias codificadas por genes V|3 (fig, 4-9), Este
puente de unión que se crea entre el CMH-II y
el RCT es el que provoca la agregación del re­
ceptor y la activación celular,
A diferencia de lo que ocurre con los antíge­
nos convencionales donde el reconocim iento
por el linfocitó T está restringido a péptidos del
antígeno procesado asociados a antígenos el
CM H-II propios, para los superantígenos no

existe tal restricción; pueden ser presentados
por antígenos CMH-II alogeneicos y sin nece­
sidad de procesado previo por las célalas pre­
sentadoras del antígeno.
Aproximadamente 1/10-^ a 1/10® de la pobla­
ción total de linfocitos responden al estímulo
de un antígeno dado. Teniendo en cuenta que
en el ratón el número de genes V[3 identifica­
dos es 20 y en el hombre 50, y asumiendo que
todos los genes se expresaran con igual fre­
cuencia, sería lógico esperar que 1/20 a 1/50 de
la población de linfocitos T interaccionen con
un determ inado superantígeno. Sin embargo
ese número es 4-5 veces menor porque los su-
perantígenos no a reconocen los productos co­
dificados por todos los genes V(3, sino a algu­
nos de ellos. Este elevado número de células
que se activan producen una exagerada síntesis
de citoquinas las que son responsables, en gran
parte, del “shock” tóxico que se produce en es­
tos casos.
A NÁLISIS ANTIGÉNICO
Su empleo en bacteriología, micología, viro­
logía, hematología y aun en genética es muy
útil y frecuente, ya que mediante él se puede
llegar a demostrar diferencias entre microorga­
nismos, células o proteínas que por otros m é­
todos hubiese sido imposible. Consiste en esta­
blecer, utilizando antisueros específicos m ono­
valentes, cuáles son los constituyentes antigé-
nicos del agente en estudio. Claro está que en
cada caso será necesario disponer de reactivos
obtenidos con el máximo de garantía, pues ad­
sorciones insuficientes o inadecuadas, o inm u­
nizaciones incorrectas de los animales de ex­
perim entación, pueden llevar a confusiones.
En la actualidad el uso de anticuerpos mono­
clonales ha resuelto muchos de esos inconve­
nientes.
Gran parte del adelanto de la microbiología,
de la inm unología aplicada, de la serología
diagnóstica y del esclarecim iento de nuestra
ignorancia sobre problemas transfusionales y
de incom patibihdad maternofetal, se deben a
que, mediante correctos análisis antigénieos,
han podido establecerse relaciones entre entes
que no se suponía em parentados. El conoci­
miento de la composición antigénica correcta
y completa de muchos microorganismos, como
el complejo grupo de la familia de las Entero-
bacteriaceae, ha p erm itid o seleccio n ar los
reactivos adecuados para un diagnóstico de
certeza y muchas veces una correcta terapéuti­
ca, así como, en éstos y otros casos, establecer
las características de una bacteria que permiten
utilizarla en la preparación de una vacuna.
Antígenos 71
DEM OSTRACION
DE LA A N TIG EN IC ID A D
Cuando un vertebrado adulto es inoculado
con una sustancia extraña, si ésta posee cap a­
cidad inmunogénica pondrá en marcha los m e­
c an ism o s que e n g e n d ra rán la re s p u e sta al
agente agresor real o potencial.
¿Cómo puede ponerse en evidencia esa tras-
formación? Ello puede lograrse por la investi­
gación en la sangre circulante de los agentes
inmunológicos, los anticuerpos; o mediante la
inoculación de una nueva dosis de antígeno y
la investigación de la modificación de la cap a­
cidad reactiva normal de los tejidos, si es que
el mismo reúne las condiciones necesarias.
En el primer caso el nivel de los anticuerpos
form ados puede establecerse por d iferentes
mecanismos, ya sea por precipitación específi­
ca en medios líquidos o gelosados; por dosaje
del complemento consumido, en especial con
lecturas del 50%de hemólisis; por hem oagluti­
nación pasiva; por radioinmunoanálisis (RIA);
inm unofluorescencia (IF); enzim oinm unoaná­
lisis (ELISA), o bien por cuak]uier otro m eca­
nism o inm unológico que perm ita evidenciar
anticuerpos en sangre.
La investigación de la capacidad reactiva al­
terada de los tejidos puede efectuarse ex p eri­
mentalm ente por anafilaxia activa, anafilaxia
pasiva o anafilaxia cutánea pasiva. Todos estos
mecanism os se describen en los capítulos 11
y 13.
Como algunos antígenos tienen capacidad
para estim ular una respuesta inmune m ediada
por células, más que por anticuerpos, en casos
particulares la inmunogenicidad de una sustan­
cia debe ser investigada mediante el empleo de
métodos inmunológicos destinados a detectar
la inmunidad celular (véanse caps. 13 y 36).
D IN Á M IC A DE LO S A NTÍG EN OS
La acción de los antígenos, su dinám ica,
puede demostrarse de diferentes maneras. La
anafilaxia activa y pasiva ha aportado datos de
valor sobre el particular. Estando dicha dinám i­
ca establecida por la intensidad de la pro d u c­
ción de anticuerpos, sólo las dos primeras eta­
pas de la anafilaxia, la sensibilización y la fase
de incubación, sirven para ponerla de m anifies­
to, ya que en el desencadenamiento de la reac­
ción alérgica intervienen otros factores ajenos a
la interacción antígeno-anticuerpo que no son
específicos y ponderables en la determinación
de la antigenicidad. Cuando un animal es in o ­
culado con un antígeno y se sensibiliza, indica
que ha elaborado anticuerpos, y el tiempo de
72 Aspectos básicos de la inmunidad
Linfocito Th
CDS RCT Fiia
Céiuia presentadora de Ag
latencia mínimo mide el lapso necesario para
desencadenar el choque anafiláctico, cuando se
inocule la segunda dosis.
Si la determinación de la actividad la hace-
inos en la priinera etapa, la evaluación se hace
por la dosis de antígeno capaz de sensibilizar,
en tanto que en la segunda se mide por el tiem­
po m ínim o necesario para d esen cad en ar la
reacción. Indudablem ente que esto es válido
para aquellas respuestas inm unes que cursan
con formación de anticuerpos homocitotópicos,
pero no para los que carecen de esa propiedad.
Si bien este método fue muy usado en un co­
mienzo para estudiar la inmunogenicidad, en la
actualidad, el desarrollo de una m etodología
muy sensible para el dosaje de anticuerpos, co­
mo lo son la hemoaglutinación pasiva de Boy-
den, la inmunofluorescencia, la inmunoenzimo­
logía, el empleo de radioisótopos, y muy espe­
cialmente la determinación del ntimero de célu­
las linfoides formadoras de placas de hemólisis,
etc., permiten evaluar la actividad de los antíge­
nos sin recurrir al estudio de la anafilaxia; esto
es muy iinportante sobre todo para los antíge­
nos o conjuntos antigénicos de gran tamaño, co­
mo las bacterias, los hematíes y las células.
A dyuvantes y exaltación de la antigenicidad
Si bien mediante estímulos a repetición pue­
de mejorarse la respuesta inmune como conse­
cuencia de la capacidad “adyuvante intrínseca”
que tienen algunos antígenos, en otros casos se
consigue una exaltación de su inm unogenici­
dad añadiéndoles productos con capacidad “ad­
yuvante extrínseca”, los que pueden convertir
en inmunogénicas a sustancias que no lo son, o
F ig . 4 -9 . M ecan ism o de in te ra c ­
ció n d e un s u p e ra n tíg e n o co n el
C M H y el RCT. H ay una unión la­
teral con el CM H y con estructuras
codificadas por V p en el RCT, am ­
bas por fuera de las zonas a las que
.se unen los antígenos convenciona­
les. C o m p árese eo n la fig u ra 2-7,
capítulo 2.
hacer que antígenos débiles induzcan una ade­
cuada respuesta inmune. Estos productos se co­
nocen con el nombre genérico de adyuvantes,
los que pueden ser antigénicos o no. Entre los
primeros se encuentran los bacilos acidorresis-
tentes, bacterias gramnegativas y sus endotoxi­
nas, la Bordetella pertussis, los anticuerpos, la
fitoheinaglutinina, etc. Los no antigénicos pue­
den tener distinto origen, como el hidróxido de
aluminio, el alumbre, el fosfato de calcio, la
protamina-cinc, la tapioca, la lanolina, aceites
minerales, agentes tensioactivos, etcétera.
No todos los adyuvantes acttian de la misma
manera, ya que algunos exaltan la respuesta in­
mune humoral y otros la mediada por células.
Se considera que los macrófagos, los linfoci­
tos B y los hnfocitos T son las células que par­
ticipan en la exaltación de la antigenicidad. Los
antígenos particulados o solubles transform a­
dos en particulados por acción de un adyuvante
serían procesados por los macrófagos, los que
im pedirían su fuga y facilitarían su presenta­
ción a las células inm unocompetentes, m ejo­
rando de este modo la respuesta. Para algunos
de los adyuvantes parecería necesitarse la parti­
cipación de los linfocitos T y B en la exaltación
de la respuesta inmune humoral. Experimental­
mente se ha comprobado que hay adyuvantes
que no aumentan la producción de anticuerpos
en animales depletados en células T; otros en
cambio parecen actuar directamente sobre las
células B, ejerciendo sobre las tnismas un efec­
to mitogénico. La dosis de antígeno influye en
estos casos, ya que se ha observado una menor
dependencia T cuando la cantidad de inmunó­
geno inoculada es grande. El requerimiento de
células T o B ha sido estimado experimental­

mente sobre la base de la influencia del adyu­
vante en la producción, por parte del huésped,
de anticuerpos de tipo IgM o IgG. Como se sa­
be, los primeros no son T dependientes, y sí lo
son los segundos.
Varios son los mecanismos por los cuales los
adyuvantes pueden ejercer su efecto. Este pue­
de deberse a una liberación lenta y gradual del
antígeno cuando se encuentra adsorbido a geles
coloidales como el hidróxido de aluminio, fos­
fato de calcio, etcétera, o emulsionado en vehí­
culos oleosos. La vida media del antígeno au­
menta, con prolongación de su capacidad esti-
m ulativa, lo que asegura una m ayor y m ás
efectiva producción de anticuerpos.
Otro hecho que asegura una mejor respuesta
inmune es la acumulación de células inmuno-
competentes en los órganos linfoides estimula­
dos por el antígeno, el que se produce a expen­
sas de las células circulantes. La mayor parte
de los adyuvantes inducen este fenómeno y al­
gunos de ellos -especialm ente el adyuvante de
Freund completo constituido por un vehículo
oleoso adicionado de b acilo s tu b ercu lo so s
m uertos- producen un granuloma en el punto
de inoculación, donde se observa acumulación
de macrófagos y linfocitos, los que de este m o­
do están más expuestos a la acción del inm unó­
geno. Este fenómeno es más evidente para los
antígenos particulados, con adyuvancia intrín­
seca, y para los de alto peso molecular adsorbi­
dos o emulsionados. El secuestro de células de
la circulación y su reclutam iento en órganos
linfoides se logra con adyuvantes no inmuno-
génicos, y este efecto es más duradero que el
producido directamente por los antígenos. A de­
más, el sitio de acumulación de células linfoi­
des depende de la vía de inoculación del antí­
geno; el bazo es el destinatario si la inyección
se hizo por vía venosa o intraperitoneal, y el
nódulo linfático drenante si se usó la vía subcu­
tánea. Parecería que este reclutamiento de célu­
las inmunocompetentes sería indispensable pa­
ra iniciar la respuesta inmune, y que la función
de los adyuvantes sería la de exaltarla.
Hay adyuvantes que actuarían activando a
los macrófagos, los que por intermedio de la
interleuquina 1 (IL-1) sintetizada estimularían
a los linfocitos y facilitarían su respuesta. Otros
en cambio estimularían directamente la prolife­
ración y diferenciación celular. Algunos, como
los lipopolisacáridos, son mitógenos selectivos
de los linfocitos B, mientras que otros, como la
vitamina A, lo hacen directamente sobre las cé­
lulas T. Podrían actuar también modificando la
permeabilidad de la membrana citoplasmática
de los linfocitos facilitando la captación del an­
tígeno.
Se considera que ciertos adyuvantes pueden
ejercer su acción variando la cinética de la
Antígenos 73
reacción inmune humoral y celular, interfirien­
do en la regulación de la síntesis de los anti­
cuerpos de tipo IgM, estimulando la adenilci­
clasa con aumento de AMP cíclico, el que par­
ticipa en la regulación de la síntesis de ácidos
nucleicos y proliferación celular, etcétera.
M ediante la participación de uno o varios de
los mecanism os m encionados los adyuvantes
exaltan la inmunogenicidad, haciendo que antí­
genos débiles se transformen en buenos induc­
tores de la respuesta inmune.
En los últimos años se ha aislado un péptido
de la pared celular de las bacterias que forman
parte del adyuvante de Freund completo, que
luego fue sintetizado. Es el A^-acetilmuramil-L-
alanil-D-isoglutamina, al que se lo designa mu-
ramil dipéptido (MDP), y constituye la copia
de un fragmento del peptidoglicano bacteriano.
Este producto y otros derivados han dem ostra­
do poseer un notable poder adyuvante y ser
moduladores activos de la respuesta inmune.
O tra manera de conseguir inmunopotencia-
ción es incorporando los antígenos proteicos en
vesículas lipídicas o liposomas y en los llam a­
dos complejos lipofílicos inmunomoduladores
(ISCOMs), usando como intermediarios deter­
gentes o saponina, los que luego son. elim ina­
dos. Los liposomas se preparan mezclando, en
determinadas condiciones, la proteína antigéni­
ca con fosfolípidos. Se forman vesículas rodea­
das por una bicapa en la que se incorporan las
proteínas, las que orientan sus residuos hidrofí-
licos hacia la fase acuosa y los hidrofóbicos ha­
cia el centro de la vesícula. Los ISCOMs resul­
tan de la interacción entre colesterol, Quil A y
residuos hidrofóbicos de las proteínas a incor­
porar como inmunógenos. Dado que el Q uil A
es una m ezcla de varias saponinas, distintas
partidas de Quil A pueden incidir en la obten­
ción de ISCOMs inmunogénicos.
Los ISCOMs tienen capacidad para inducir
la formación de anticuerpos y de activar linfo­
citos Te específicos, así como de Th.
Para la formación de los ISCOMs las proteí­
nas a incorporar deben tener restos hidrofóbi­
cos. Es por ello que las proteínas liberadas de
membrana, que contienen un fragmento trans­
membránico de naturaleza hidrofóbica, form an
buenos ISCOMs. También han resultado efec­
tivas proteínas modificadas por tratamiento con
ácido palmítico, el que es fijado covalentemen­
te. Por este procedimiento proteínas no hid ro ­
fóbicas como ovoalbúmina y seroalbúmina bo­
vina, pueden originar ISCOMs inmunogénicos.
Los ISCOMs pueden ser usados como inm u­
nógenos por vía parenteral y oral, con buenos
resultados. En el últim o caso inducen buena
respuesta de IgA.
En los liposomas e ISCOMS las proteínas
incorporadas se expresan como inm unógenos
74 Aspectos básicos de la inmunidad
multivalentes. Estos adyuvantes han comenza­
do a usarse en la inmunización humana, sobre
todo en la formulación de vacunas que usan
péptidos como inmunógenos, los que por sí so­
los, en su mayoría, son poco efectivos.
Tiem po de perm anencia de los antígenos
La mayoría de los investigadores adm iten
que los antígenos permanecen un tiempo relati­
vamente corto en el organismo y se metaboli-
zarían de la mism a m anera que lo hacen las
restantes proteínas que llegan al organism o.
Otros han podido dem ostrar, trabajando con
azoproteínas y proteínas unidas a haptenos
marcados con '^'I, “^C, ^‘’S o su permanen­
cia por tiempo prolongado en el organismo ino­
culado. Es de hacer notar que en estas investi­
gaciones se ha demostrado, en células obteni­
das de bazo, radiactividad correspondiente a
1.000 moléculas de antígeno por célula, cinco
meses después de la inoculación, y que se redu­
cía a 100 a los ocho o nueve meses. Estas expe­
riencias m uestran la perm anencia por cierto
tiempo de materiales antigénieos marcados, no
así la totalidad del antígeno. Es probable que el
material proteico, que actúa como transporta­
dor no específico, experimente la degradación
que normalmente ocurre en esas sustancias. La
posibilidad de que la radiactividad detectada
sea consecuencia de productos de radiólisis no
puede ser descartada.
Investigaciones recientes han dem ostrado
que las células dendríticas localizadas en el ba­
zo retienen antígeno sin procesar, fijado a su
mem brana, por largos períodos. E ste hecho
cumpliría un papel muy importante en el man­
tenimiento de la memoria inmunológica; esos
antígenos serían los que estimularían en forma
repetida a los linfocitos que cumplen esa fun­
ción, asegurando la presencia de células capa­
ces de reaccionar con sus antígenos específicos
por largos períodos.
Cabe señalar que lo expuesto corresponde a
antígenos proteicos, ya que los de naturaleza
poliosídica, que se degradan con dificultad,
permanecen en el organismo del huésped por
largos períodos. Esta eliminación lenta puede
producir acumulación, la que a su vez puede
dar lugar a una parálisis inmunológica con au­
sencia de respuesta inmune (véase cap. 15).
B IB L IO G R A FÍA
A lien, P. M.; “A ntigen processing at the m olecular level” .
Im m unology Today <S: 210-213, 1987.
B en jam in y col.: T h e an tig en ic stru ctu re o f p ro tein s: a
reappraisal. En: A n n Rev Im m unol (W E Paul, C G arrison
Fathm an, H M etzger, Eds), 67-102, 1984.
Berzofsky, J. A. & Berkow er, I. J.: “Im m unogenicity and
an tig en s tru c tu re ” . En F u n d a m en ta l Im m u n o lo g y (W .
Paul, Ed.) Cap. 8, 1993, 3" ed. R aven Press.
C iba F oundation Sym posium : Im m unopotentiation. E lse­
vier Publ. N. Y ork, 1973.
C ohén S, Sadun EH: Im m unology o f Parasitic Infections.
Blackw ell Sci Publ O xford, 1976.
C hase M W , K uhns W J (Ed): S p ecificity o f S ero lo g ical
Reactions: L andsteiner C entenial. N Y A c a d Sci 169: I-
293, 1970. N Y ork A cad Sci Publ N York.
G lynn LE , Stew ard M W ; Im m unochem istry: A n A d va n ced
Textbook. J W iley and Sons. N Y ork y Londres, 1978.
In te rn a tio n a l A ss o c ia tio n o f B io lo g ic a l S ta n d a riz a tio n
(Eds): Use a n d Standarization o f C hem ical D efin ed A n ­
tigens. S. K arger, 1986.
K ab at EA : B lo o d G roup S u sta n ces. A cad em ic P ress N
Y ork, 19.56.
K abat EA: Stru ctu ra l C oncepts in Im m unology an d Im m u-
nochem istry. H olt, R inehart y W inston. N Y ork, 1976.
Ludevitz O, S taub AM , W estphal O: Im m unochem istry of
O and R antigens o f S alm onella and related Enterobacte-
riaceae. B act R ev 30:192, 1966.
N otkins A L (Ed): Viral Im m u n o lo g y cmd Im m unopatho-
logy. A cadem ic Press. N Y ork, 1976.
P ap p en h e im er A M , G ilí D M : D ip h te ria. R ec en t stu d ies
h av e cla rifie d the m o le c u la r m e ch an ism s in v o lv ed in
this pathogenesis. S cience 182:353, 1973.
R ace R R; S anger R: B lo o d G roups in M an, 6th ed, B lack ­
w ell Sci Publ O xford, 1975.
Rini, J. M ., S chultze-G ahm en V. & W ilson, 1. A.: “S tru c­
tu r a l e v id e n c e fo r in d u c e d it as a m e e h a n is m fo r
a n tib o d y -a n ig e n r e c o g n itio n ” . S cien ce 2 55: 9 6 9 -9 6 5 ,
1992.
R u d b ac h JA , B ak e r PJ (E d s); Im m u n o lo g y o f B a c teria l
P o ly s a c c h a r id e s . E ls e v ie r N o rth H o lla n d P u b lis h in g
C om pany. A m sterdam , 1979.
S altón M JR: The B a cteria l C ell Wall. E lsevier. N Y ork,
1964.
Sela M; Im m unological studies with synthetic p o ly p ep ti­
des. A d v Im m unol 5.' 1, 1966.
Sela M (Ed): The antigens: a com prehensive treatise, vols.
1-V A cadem ic Press. N Y ork, 1973-85.
Sete, A., D oria, G. & A dorini, L.: “A m icrocom puter pro-
gram for h y d ro p h ilicity and am p h ip aticity an aly sis o f
p ro te in an tig en . M o le c u la r Im m u n o lo g y 2J.-8 O 7 -8 I0 ,
1986.
Sercavz, E. (ed.). “A ntigenic determ inants and im m une re­
gulation” C hem ical Im m unology, vol. 46, 1989.
S inger SJ: S tru ctu re and F u n ctio n o f A n tig en and A n ti­
body Protein, En The Proteins, vol III. H N eurath (Ed),
A cadem ic Press, N Y ork, 1965,
S tew art-T u ll D E S , D av ies M (Eds): Im m u n o lo g y o f the
b acterial cell envelope. John W iley and Sons Ltd,, 1985,
T aim er E y col: T he atom ic m obility com ponent o f protein
antigenicity. En A n n R ev Im m unol (W E Paul, C G arrison
F athm an, H M etzger, Eds), pp 501-536, 1985,
S zentivanyi A, F ried m an H (Eds); Y irus, Im m u n ity an d
Im m unodeficiency. P lenum Publ, 1986,
In te rn a tio n a l A ss o c ia tio n o f B io lo g ic a l S ta n d a riz a tio n
(Eds): Use an d S tandarization o f C hem ical D efin ed A n ­
tigens. S K arger, 1986,
W eir DM (Ed): H a n d b o o k o f E xp erim en ta l Im m unology,
vol, I, Im m u n o ch em istry , B lack w ell S ci P ubl O xford,
1986,
W illiam s CA, C hase M W (Ed): M ethods in Im m u n o lo g y
cmd Im m u n o c h em istry, vols I y II, A cad em ic P ress. N
Y ork, 1967-68.
Anticuerpos
RICARDO MARGNI
GENERALIDADES
Son proteínas que elaboran los vertebrados
al ser estimulados con un antígeno y que tienen
capacidad para reaccionar específicamente con
el inductor.
Esto permite excluir de la definición a otras
sustancias que se encuentran en los humores de
los animales, que reaccionan de manera más o
menos específica con ciertos agentes, pero que
no son anticuerpos; nos referimos a algunos in­
hibidores de enzimas proteolíticas presentes en
el organismo que, si bien tienen acción especí­
fica sobre ellas, sus concentraciones no aumen­
tan ni sufren modificaciones por la inoculación
de dichas enzimas.
La mayor parte de los anticuerpos se halla en
el plasma circulante como constituyentes pro­
teicos de aquél. Antes de analizar y tratar de
establecer su ubicación entre las proteínas, es
conveniente aclarar conceptos que nos van a
permitir comprender mejor algunos resultados.
Los anticuerpos reaccionan específicamente
con los antígenos que les han dado origen y co­
mo consecuencia de esa reacción se produce la
neutralización. Cuando esto ocurre en el tubo
de ensayo generalmente sigue un fenómeno vi­
sible que puede ser precipitación, aglutinación,
bacteriólisis, citólisis, etcétera, según las carac­
terísticas del antígeno y la presencia o no de
sustancias complementarias. En un comienzo
se dio nombre particular al anticuerpo capaz de
producir uno u otro tipo de reacción, y se lo lla­
mó precipitina, aglutinina, anticuerpo fijador
del complemento, bacteriolisina, citolisina, et­
cétera, pero estudios posteriores perm itieron
comprobar que un mismo antisuero podía dar
todas o casi todas las reacciones serológicas in­
dicadas, lo que llevó a la postulación de la teo­
5
ría unitaria del anticuerpo. Esto ha simplificado
los hechos, pero debemos aclarar que no es ab­
soluto ya que, como se verá más adelante, un
antígeno puede originar más de un tipo de anti­
cuerpo con características fisicoquímicas dife­
rentes, de ahí su distinta manera de reaccionar
frente al antígeno y su particular co m p o rta­
miento biológico. Debemos admitir que un an­
ticuerpo puede dar una o más de las reacciones
seiialadas, pero no necesariamente todas. Son
pluripotentes, pero sin alcanzar la totalidad.
Por análisis electroforéticos de sueros de
animales normales e inmunizados, se com pro­
bó que estos últimos diferían de los prim eros
en un aumento de la fracción gammaglobulíni-
ca (fig. 5-1), y que había un gradiente progresi­
vo de aumento de dicha fracción si esos sueros
provenían de un mismo animal en el transcurso
de una inm unización. Esto hizo suponer que
los anticuerpos estaban localizados en la frac­
ción gammaglobulina, y la demostración feha­
ciente de que así era se tuvo cuando se hicieron
electroforesis simultáneas de un suero p ro ce­
dente de un animal inmunizado y del m ism o
suero previamente adsorbido con el respectivo
antígeno a efectos de eliminar el anticuerpo.
Como puede verse en la figura 5-2, la depre­
sión del pico de las gammaglobulinas es m ani­
fiesta en el segundo caso. Esto a su vez indica
que no toda la gammaglobuhna plasmática tie­
ne actividad anticuerpo para el antígeno en es­
tudio, sino parte de ella, a la que ha dado en
llamársela gammaglobulina inmune.
La introducción de otros métodos analíticos
como la ultracentrifugación, la electroforesis
en geles en la inmunoelectroforesis sirvió para
com probar que la gammaglobulina no es una
fracción homogénea, sino que puede ser subdi-
vidida en diferentes componentes. Ya los in-
74 Aspectos básicos de la inmunidad
multivalentes. Estos adyuvantes han comenza­
do a usarse en la inmunización humana, sobre
todo en la formulación de vacunas que usan
péptidos como inmunógenos, los que por sí so­
los, en su mayoría, son poco efectivos.
Tiem po de perm anencia de los antígenos
La mayoría de los investigadores adm iten
que los antígenos permanecen un tiempo relati­
vamente corto en el organismo y se metaboli-
zarían de la mism a m anera que lo hacen las
restantes proteínas que llegan al organism o.
Otros han podido dem ostrar, trabajando con
azoproteínas y proteínas unidas a haptenos
marcados con '^'I, “*C, ^‘’S o ^H, su permanen­
cia por tiempo prolongado en el organismo ino­
culado. Es de hacer notar que en estas investi­
gaciones se ha demostrado, en células obteni­
das de bazo, radiactividad correspondiente a
1.000 moléculas de antígeno por célula, cinco
meses después de la inoculación, y que se redu­
cía a 100 a los ocho o nueve meses. Estas expe­
riencias m uestran la perm anencia por cierto
tiempo de materiales antigénicos marcados, no
así la totalidad del antígeno. Es probable que el
material proteico, que actúa como transporta­
dor no específico, experimente la degradación
que normalmente ocurre en esas sustancias. La
posibilidad de que la radiactividad detectada
sea consecuencia de productos de radiólisis no
puede ser descartada.
Investigaciones recientes han dem ostrado
que las células dendríticas localizadas en el ba­
zo retienen antígeno sin procesar, fijado a su
mem brana, por largos períodos. E ste hecho
cumpliría un papel muy importante en el man­
tenimiento de la memoria inmunológica; esos
antígenos serían los que estimularían en forma
repetida a los linfocitos que cumplen esa fun­
ción, asegurando la presencia de células capa­
ces de reaccionar con sus antígenos específicos
por largos períodos.
Cabe señalar que lo expuesto corresponde a
antígenos proteicos, ya que los de naturaleza
poliosídica, que se degradan con dificultad,
permanecen en el organismo del huésped por
largos períodos. Esta eliminación lenta puede
producir acumulación, la que a su vez puede
dar lugar a una parálisis inmunológica con au­
sencia de respuesta inmune (véase cap. 15).
B IB L IO G R A FÍA
A lien, P. M.; “A ntigen processing at the m olecular level” .
Im m unology Today <S: 210-213, 1987.
B en jam ín y col.: T h e an tig en ic stru ctu re o f p ro tein s: a
reappraisal. En: A n n Rev Im m unol (W E Paul, C G arrison
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Paul, Ed.) Cap. 8, 1993, 3" ed. R aven Press.
C iba F oundation Sym posium : Im m unopotenliation. E lse­
vier Publ. N. Y ork, 1973.
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Blackw ell Sci Publ O xford, 1976.
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Reactions: L andsteiner C entenial. N Y A c a d Sci 169: 1-
293, 1970. N Y ork A cad Sci Publ N York.
G lynn LE , Stew ard M W ; Im m unochem istry: A n A d va n ced
Texlbook. J W iley and Sons. N Y ork y Londres, 1978.
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(Eds): Use a n d Standarization o f C hem ical D efin ed A n ­
tigens. S. K arger, 1986.
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Y ork, 19.56.
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Ludevitz O, S taub AM , W estphal O: Im m unochem istry of
O and R antigens o f S alm onella and related E n terobacte­
riaceae. B act R ev 30:192, 1966.
N otkins A L (Ed): Viral Im m u n o lo g y a n d Im m unopatho-
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h av e ela rifie d the m o le c u la r m e ch an ism s in v o lv ed in
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R ace R R; S anger R: B lo o d G roups in M an, 6th ed, B lack ­
w ell Sci Publ O xford, 1975.
Rini, J. M ., S ehultze-G ahm en V. & W ilson, 1. A.: “S tru c­
tu r a l e v id e n c e fo r in d u c e d it as a m e c h a n is m fo r
a n tib o d y -a n ig e n r e c o g n itio n ” . S cien ce 2 55: 9 6 9 -9 6 5 ,
1992.
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P o ly s a c c h a r id e s . E ls e v ie r N o rth H o lla n d P u b lis h in g
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des. A d v Im m unol 5.' 1, 1966.
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Sete, A., D oria, G. & A dorini, L.: “A m icrocom puter pro-
gram for h y d ro p h ilieity and am p h ip aticity an aly sis o f
p ro te in an tig en . M o le c u la r Im m u n o lo g y 2 J.-8 0 7 -8 1 0 ,
1986.
Sercavz, E. (ed.). “A ntigenic determ inants and im m une re­
gulation” C hem ical Im m unology, vol. 46, 1989.
S inger SJ: S tru ctu re and F u n ctio n o f A n tig en and A n ti­
body Protein. En The Proteins, vol 111. H N eurath (Ed).
A cadem ic Press. N Y ork, 1965.
S tew art-T u ll D E S , D av ies M (Eds): Im m u n o lo g y o f the
b acterial cell envelope. John W iley and Sons Ltd., 1985.
T aim er E y col: T he atom ie m obility com ponent o f protein
antigenicity. En A m R ev Im m unol (W E Paul, C G arrison
Fathm an, H M etzger, Eds), pp 501-536, 1985.
S zentivanyi A, F ried m an H (Eds): Virus, Im m u n ity an d
Im m unodeficiency. P lenum Publ, 1986.
In te rn a tio n a l A ss o c ia tio n o f B io lo g ic a l S ta n d a riz a tio n
(Eds): Use an d S tandarization o f C hem ical D efin ed A n ­
tigens. S K arger, 1986.
W eir DM (Ed): H a n d b o o k o f E xp erim en ta l Im m unology,
vol. I. Im m u n o ch em istry . B lack w ell S ci P ubl O xford,
1986.
W illiam s CA, C hase M W (Ed): M ethods in Im m u n o lo g y
cmd Im m u n o c h em istry, vols I y II. A cad em ic P ress. N
Y ork, 1967-68.
Anticuerpos
RICARDO MARGNI
GENERALIDADES
Son proteínas que elaboran los vertebrados
al ser estimulados con un antígeno y que tienen
capacidad para reaccionar específicamente con
el inductor.
Esto permite excluir de la definición a otras
sustancias que se encuentran en los humores de
los animales, que reaccionan de manera más o
menos específica con ciertos agentes, pero que
no son anticuerpos; nos referimos a algunos in­
hibidores de enzimas proteolíticas presentes en
el organismo que, si bien tienen acción especí­
fica sobre ellas, sus concentraciones no aumen­
tan ni sufren modificaciones por la inoculación
de dichas enzimas.
La mayor parte de los anticuerpos se halla en
el plasma circulante como constituyentes pro­
teicos de aquél. Antes de analizar y tratar de
establecer su ubicación entre las proteínas, es
conveniente aclarar conceptos que nos van a
permitir comprender mejor algunos resultados.
Los anticuerpos reaccionan específicamente
con los antígenos que les han dado origen y co­
mo consecuencia de esa reacción se produce la
neutralización. Cuando esto ocurre en el tubo
de ensayo generalmente sigue un fenómeno vi­
sible que puede ser precipitación, aglutinación,
bacteriólisis, citolisis, etcétera, según las carac­
terísticas del antígeno y la presencia o no de
sustancias complementarias. En un comienzo
se dio nombre particular al anticuerpo capaz de
producir uno u otro tipo de reacción, y se lo lla­
mó precipitina, aglutinina, anticuerpo fijador
del complemento, bacteriolisina, citolisina, et­
cétera, pero estudios posteriores perm itieron
comprobar que un mismo antisuero podía dar
todas o casi todas las reacciones serológicas in­
dicadas, lo que llevó a la postulación de la teo­
5
ría unitaria del anticuerpo. Esto ha simplificado
los hechos, pero debemos aclarar que no es ab­
soluto ya que, como se verá más adelante, un
antígeno puede originar más de un tipo de anti­
cuerpo con características fisicoquímicas dife­
rentes, de ahí su distinta manera de reaccionar
frente al antígeno y su particular co m p o rta­
miento biológico. Debemos admitir que un an­
ticuerpo puede dar una o más de las reacciones
seiialadas, pero no necesariamente todas. Son
pluripotentes, pero sin alcanzar la totalidad.
Por análisis electroforéticos de sueros de
animales normales e inmunizados, se com pro­
bó que estos últimos diferían de los prim eros
en un aumento de la fracción gammaglobulíni-
ca (fig. 5-1), y que había un gradiente progresi­
vo de aumento de dicha fracción si esos sueros
provenían de un mismo animal en el transcurso
de una inm unización. Esto hizo suponer que
los anticuerpos estaban localizados en la frac­
ción gammaglobulina, y la demostración feha­
ciente de que así era se tuvo cuando se hicieron
electroforesis simultáneas de un suero p ro ce­
dente de un animal inmunizado y del m ism o
suero previamente adsorbido con el respectivo
antígeno a efectos de eliminar el anticuerpo.
Como puede verse en la figura 5-2, la depre­
sión del pico de las gammaglobulinas es m ani­
fiesta en el segundo caso. Esto a su vez indica
que no toda la gammaglobuhna plasmática tie­
ne actividad anticuerpo para el antígeno en es­
tudio, sino parte de ella, a la que ha dado en
llamársela gammaglobulina inmune.
La introducción de otros métodos analíticos
como la ultracentrifugación, la electroforesis
en geles en la inmunoelectroforesis sirvió para
com probar que la gammaglobulina no es una
fracción homogénea, sino que puede ser subdi­
vidida en diferentes componentes. Ya los in-
76 Aspectos básicos de ía inmunidad
Fig. 5-1. Eleetroforesis en acetato de eelulosa de suero de
conejo norm al (a) y sueros del m ism o anim al después de la
inoculación de ovoalbúm ina (b, c). A m edida que el título
de anticuerpos aum enta se observa increm ento de la frac­
ción gam m aglobulina,
munólogos habían observado que algunos anti­
cuerpos con igual especificidad para un mismo
antígeno, pero provenientes de animales de dis­
tinta especie, tenían características fisicoquími­
cas diferentes. Igual fenómeno se había obser­
vado en los anticuerpos que aparecían en los
períodos iniciales de una inmunización y en los
tardíos. Los anticuerpos contra el soma bacilar
y contra las cilias obtenidos por inmunización
con Salmonella typhi tenían pesos moleculares
muy distintos.
Todos estos hechos y el desarrollo a un alto
nivel de metodologías analíticas fisicoquímicas
aplicadas a la biología permitieron abordar el
estudio de los anticuerpos y de células compro­
F ig. 5-2. G raficación de la corrida inm unoelectroforética de un suero inm une antes y después de la adsorción con el an tí­
g eno específico. I, eleetroforesis en acetato de celulosa de suero de conejo inm unizado con ovoalbúm ina. II, eleetroforesis
d el m ism o suero previa adsorción con ovoalbiim ina en zona de equivalencia (m uestra concentrada al volum en original
d espués de la adsorción).
metidas en su biosíntesis en un sentido mucho
más amplio. Se ha llegado a la conclusión de
que la gammaglobulina inmune no es un tipo
tínico de proteína, sino que es una familia a la
que se denomina inmunoglobulinas y en la que,
segtin Heremans, se incluyen todas las globuli­
nas con actividad anticuerpo. En el hombre se
han identificado las IgG, IgM, IgA, IgD, IgE
gammaglobulinas, y relacionadas con ellas es­
tán las proteínas de Bence-Jones halladas en la
orina de enfermos de mieloma (fig. 5-3).
Se las considera como una familia porque en
todas ha sido posible demostrar la función de
anticuerpo; son elaboradas por un mismo tipo
de célula, las plasmáticas; y además, actuando
como antígenos, cada una de ellas da reaccio­
nes cruzadas con los anticuerpos elaborados
por las restantes. El análisis químico ha servido
para reafirmar este agrupamiento. Se ha com­
probado que todas tienen una estructura tetra-
peptídica básica, con péptidos compartidos y
diferenciales. Estos péptidos, llamados L y H,
están unidos entre sí covalentemente y se en­
cuentran repetidos en la molécula (fig. 5-4).
Estas estructuras tetrapeptídicas pueden en­
contrarse bajo form a de m onóm eros, com o
ocurre con la IgG, IgD e IgE; de pentámeros,
como en el caso de la IgM; o de monómero, dí­
mero y trímero, como en la IgA.
Las inmunoglobulinas son glucoproteínas y
el contenido en hidratos de carbono varía para
cada una de las clases.
Las diferentes clases de inm unoglobulinas
normales constituyen una población heterogé­
nea de moléculas y son de origen policlonal.
Esa heterogeneidad es consecuencia de la va­
riabilidad de los aminoácidos constitutivos, la
que puede deberse a variaciones isotípicas, que
 Anticuerpos 77

son comunes a todos los individuos de la m is­

ma especie y que afectan a las distintas clases y
tipos de inmunoglobulinas; a variaciones alotí­
picas, que diferencian formas polimorfas de in­
munoglobulinas, las que no se encuentran pre­
sentes en toda la población molecular de una
determinada clase de inmunoglobulina de una
especie animal, y a variaciones idiotípicas, pro­
pias y particulares de cada molécula (fig. 5-5),
Las inmunoglobulinas que poseen especifici­
dad para un antígeno (anticuerpos) son más ho­
mogéneas que las inmunoglobulinas normales,
pues su síntesis depende de un ntímero restrin­
gido de clones celulares. Las proteínas de m ie­
lomas son inmunoglobulinas homogéneas por
ser de origen monoclonal (fig. 5-6). Estas han
resultado de extraordinario valor para estudios
secuenciales, ya que, en cambio, por su hetero­
geneidad, no se prestan para ello las inmuno-
globulinas normales y la mayor parte de los an­
ticuerpos.
En los últimos años se ha desarrollado una
metodología que permite obtener por fusión de
células tumorales y células productoras de anti­
cuerpos, “hibridomas”, con capacidad para pro­
liferar in vitro y sintetizar anticuerpos homogé­
neos. Estas poblaciones moleculares se están
usando en diferentes laboratorios y en distintas
líneas de investigación, ya que por clonado y
selección se pueden conseguir híbridos que sin­
F ig. 5-3. Inm unoelectroforesiíí de su ero hum ano. C o m o
tetizan anticuerpos de la clase y la especifici­ inm unosueros precipitantes se usaron: 1, suero de co n e jo
dad deseadas. andhum ano total, i , suero de conejo anti-lgG , 3, su ero de
La diferencia más apreciable entre las inm u­ conejo anti-IgA . 4, suero d e conejo anti-IgM .
noglobulinas normales y los anticuerpos es la
capacidad de estos últimos para reconocer sus
correspondientes antígenos, es decir, su especi­ cuerpos. Aquellas están constituidas por una
ficidad. En realidad, las inmunoglobulinas nor­ población molecular infinitamente grande, te ­
males del suero en nada difieren de los anti- niendo cada una de esas moléculas una especi-

Pepsina Pepsina

Fig. 5-4. Esquem atización de una m olécula de IgG (Ig G l). Los núm eros indican las posiciones de los residuos d o nde tie-
ne lugar el clivaje enzim ático. CH O significa hidratos de carbono. Las porciones trazadas con líneas de puntos co rresp o n ­
den a los fragm entos variables d e las cadenas L y H.
78 Aspectos básicos de ia inmunidad

F ig . 5-5. a, variaciones isotípicas. A fectan a todos los com ponentes de la clase o subclase de inm unoglobulina y están lo ­
calizadas en la parte constante de la cadena H, preferentem ente en el fragm ento Fe; b, variaciones alotípicas. N o están pre-
sentes en todos lo.s com ponentes de una m ism a clase o subclase y perm iten diferenciar poblaciones m oleculares dentro de
ellas. C orresponden a determ inantes antigénieos codificados por form as alélicas de un m ism o locus. N orm alm ente están
localizadas en los fragm entos constantes de las cadenas L y H; y c, variaciones idiotípicas. Son propias de cada m olécula y
afectan a los fragm entos variables de las cadenas L y H.

IV V VI VII
Clones celulares ■

• • • • • • •
IgG elaborada - 1 2 3 4 5 6 7
> a
o
1® ^ 2 1 2 3 4 5 6 7

Inmunoelectroforesis • 4 . ^ / ! \ /®\ *\ *\ / t \ / ! \

r T - T T

Suero anti-IgG

F ig. 5-6. Esquem atización de una IgG policlonal y monoclonal.


ficidad definida. La enorme dilución de cada
molécula en la población total y el hecho de no
conocer sus especificidades hace que genérica­
mente se consideren como no reactivas, cuando
en realidad lo que no tienen es capacidad para
reaccionar con un determinado antígeno en en­
sayo.
Para un mejor análisis nos ocuparemos del
estudio de las características generales de los
componentes de esta fam iha y sus relaciones
con la actividad anticuerpo, así como de los di­
ferentes factores que regulan su producción y
condicionan la especificidad.
De todas las inmunoglobulinas, la mejor es­
tudiada ha sido la IgG ; las investigaciones
efectuadas en las restantes están en su mayoría
relacionadas con esos estudios. Es por ese m o­
tivo que habrá de ser analizada en forma más
pormenorizada.
La nomenclatura con que se identifican es la
recomendada por la Organización Mundial de
la Salud.
IN M U N O G L O B U L IN A G (IgG )
Sinonimia. 1 S y globulina; globulina.
Por electroforesis aparece como una banda
algo difusa, en la zona catódica. El ancho de la
banda depende del soporte de corrida usado.
Cuando se usan geles la misma es estrecha, a
diferencia de lo que ocurría en los prim eros
análisis efectuados, en los que se empleaba pa­
pel como soporte. Por inmunoelectroforesis, la
IgG da una banda de precipitación que se ex­
tiende desde la zona de menor movilidad hasta
las a 2 globulinas, con zonas de precipitación
de mayor intensidad para las moléculas menos
móviles, que son las evidenciables por electro­
foresis en soportes inertes.
La IgG tiene una constante de sedimentación
de aproxim adam ente 7 u n id ad es S vedberg
(6,56 ± 0,32) y éste es el motivo por el que se
la conoce comúnmente como 7 S gammaglobu­
lina. Su peso molecular, calculado por diferen­
tes métodos, oscila entre 140 y 160 kD. Es la
inmunoglobulina de menor contenido en hidra­
tos de carbono, un 2,6%, de los cuales 1,2%
corresponden a hexosa y 1,14% a hexosamina;
la relación hexosamina/hexosa es de 0,94.
Frente al antígeno específico se com porta
como anticuerpo bivalente y tiene capacidad
para fijar el complemento, fijarse a piel heteró­
loga y atravesar la placenta. Porter estudió la
degradación sufrida por la gammaglobulina de
conejo cuando era tratada con papaína cristali­
zada activada con cisteína y posteriorm ente
cromatografiada en columna de resinas celuló­
sicas de intercambio iónico. Estudios similares
se han efectuado con gamm-aglobulina humana.
Anticuerpos 79
Por este procedim iento se obtienen dos fra g ­
mentos, uno de movilidad electroforética lenta
(Fab) y el otro de desplazamiento rápido (Ec).
En ei primero de ellos se encuentran locali­
zados la actividad anticuerpo, los factores ge­
néticos Km (anteriormente designados Inv) y
los determinantes antigénicos comunes a otras
inmunoglobuhnas, en tanto que el Ec, fragm en­
to cristalizable, si bien carece de actividad anti­
cuerpo, está relacionado con otras propiedades
inherentes a la molécula entera y posee los d e­
terminantes antigénicos propios y los factores
genéticos Gm exclusivos de la IgG. Este frag­
mento es el que contiene la mayor proporción
de los hidratos de carbono, calculada en apro­
ximadamente un 75%. Es el responsable de la
fijación de los anticuerpos a piel heteróloga; el
que fija el complemento cuando forma parte
del complejo antígeno-anticuerpo; el que d eter­
mina la capacidad de esta inmunoglobulina p a­
ra atravesar la placenta; el que contribuye al
control del ritmo catabólieo, y el que se fija a la
proteína A del Staphylococcm aureus.
El fragmento Fab, si bien rétiene la actividad
anticuerpo, se comporta como univalente. Los
péptidos Fab y Fe tienen la misma constante de
sedimentación, 3,5 S y un peso molecular apro­
ximado de 55 kD. Esto ocurre cuando el tiem ­
po de digestión varía entre 1 y 4 horas; en cam ­
bio, si se lo prolonga a 16 horas, aparece un
péptido F e’ antigénicamente deficiente con re s­
pecto a Fe (figs. 5-7 y 5-8).
P or digestión tríp tic a parcial se o b tien en
p ép tid o s sim ilares, a los que se d en o m in a
Fab(t) y Fc(t).
Si la IgG es clivada con pepsina durante 18
horas, se obtienen fragmentos con una constan­
te de sedimentación de 5,5 S y peso molecular
90 kD. Siguen comportándose como anticuer­
pos bivalentes precipitantes y se denom inan
F(cb’)2. Los fragmentos Fe obtenidos por d i­
gestión papaínica son destruidos durante el tra­
tam iento pépsico, por desdoblamiento en p e ­
queños péptidos dializables. Si el tiempo de di­
gestión es menor, se obtiene un péptido deriva­
do del Fe, el pF c’, muy similar al fragm ento
F e ’ resu ltan te de la digestión papaínica. El
fragmento F (ab’)2 tratado con mereaptoetanol
u otro reductor se transforma en un péptido que
tiene una constante de sedimentación de 3,5 S e
inm unológieam ente se com porta como a n ti­
cuerpo univalente. Esto fue lo que llevó a co n ­
siderar que los anticuerpos bivalentes están
constituidos por dos subunidades Fab unidas
por un puente disulfuro y un fragmento Fe que
aparece en el digesto papaínico y es degradado
por la pepsina, ello deducido de su comporta­
miento frente a los agentes hidrolizan tes. Si la
digestión papaínica se lleva a cabo con papaína
insoluble en agua (papaína unida a un copolí-
80 Aspectos básicos de ¡a inmunidad
10 20 30 40 50 60 70
mero de p-aminofenilalanina y leucina), solubi-
lizando luego los productos con detergentes
(dodecil sulfato de sodio), se obtiene un frag­
mento F (ab)2 similar al anterior, pero de P.M.
84 kD, que se desdobla con cisteína en dos
fragmentos Fab. En la figura 5-4 se encuentran
señalados los residuos donde las enzimas m en­
cionadas producen las escisiones.
F ig. 5-8. Inm unoelectroforesis de IgG hum ana y sus fragm entos obtenidos por digc^iiiMi paj)aíiiis'a. i. a la^ -í ¡loras; I I , a
las 16 horas.
F ig. 5 -7. 1, IgG h u m an a d ig erid a c o n .
p a p a ín a -c is te ín a , d u ra n te 4 h o ra s , a,
Proteína no digerida; b, m ezcla de Fab y
Fe; c, péptidos pequeños (F e ’). 2, IgG
h u m a n a d ig e rid a con p apaína-ci.steína
durante 16 horas. En am bos casos la se­
paración se hizo por filtración a través
de S ep h ad ex G-IOO, y la elu ció n con
buffer de fosfatos 0,01 M, NaCl 0,15 M.
pH 7,6. 3, separación de los fragm entos
Fab y Fe, provenientes del pico b, por
c ro m a to g ra fía en D E A E -c e lu lo sa . La
elución se hizo con gradiente de fo sfa­
tos 0,005 M /0 ,1 M, pH 7,6.
90 100 110 120 130 140 O’*’'*®
Tubos
En condiciones especiales de clivaje, el frag­
mento constituido por las porciones variables
de las cadenas L y H puede ser escindido del
resto de la molécula de inmunoglobulina. Se
designa fragmento Fv.
Cuando la IgG se reduce con m ercaptoeta­
nol, se alquila con iodoacetamida para evitar la
reoxidación y se trata con ácido acético o pro-

Fig. 5-9. Separación de cadenas H y L por filtración a través de Sephadex G-lOO estabilizado con ácido propiónico 1 M,
El producto filtrado proveniente de una IgG hum ana tratada con m ereaptoetanol, alquilada con iodoacetam ida y d ia liz ad a
contra ácido propiónico 1 M. C om o eluyente se utilizó ácido propiónico 1 M.
piónico, se desdobla en cadenas peptídicas de
dos tipos; las livianas L {ligltt), de peso mole­
cular aproximadamente 23 kD, portadoras de
factores Km y determinantes antigénieos com ­
partidos con las restantes inmunoglobulinas, y
las pesadas, H {heavy), de peso molecular 52
kD, con especificidad propia y factores genéti­
cos Gm. Su separaciíSn se consigue filtrando
por Sephadex G-lOO y empleando como elu ­
yente la misma solución ácida (fig. 5-9).
Las cadenas L, comunes a todas las inmuno-
globulinas, son de dos tipos, llamadas kappa
( k ) y lambda {X), que se encuentran presentes
en la población de cada inmunoglobulina. No
obstante, las moléculas son simétricas y cada
una posee dos cadenas K o dos cadenas X, las
cuales difieren en su antigenicidad y aminoáci­
dos constitutivos. En una población normal de
moléculas de IgG, aproxim adam ente un 60-
65% de ellas posee cadenas L tipo k , y un 30-
35%, cadenas L tipo % (relación k!X = 1,5). El
aminoácido C terminal de las cadenas k es cis­
teína, y el de las cadenas X, serina, precedido
de cisteína, aminoácido éste de suma importan­
cia que contribuye a la formación de los puen­
tes S-S entre las cadenas L y H.
Distintos investigadores han efectuado análi­
sis secuenciales de cadenas L tipo K y X y han
dem ostrado que están constituidas por 214
(213-218) aminoácidos. Para estos estudios se
han empleado los métodos generales usados en
Anticuerpos 81
mi de eluido
el anáhsis proteico. Se han efectuado hidrólisis
previas con bromuro de cianógeno (BrCN), que
rompe las uniones del grupo -COOH de la me-
tionina con el grupo -NH^ del aminoácido si­
guiente, transformando la metionina en hom o-
serina u homoserina lactona; y estos péptidos,
o sus productos de digestión por acción de la
tripsina, quimotripsina u otros degradantes, han
sido analizados para tratar de establecer, con
todos esos datos, la estructura de la proteína
inicial. Para la determinación del aminoácido
C-terminal generalmente se usó el método de la
carboxipeptidasa y para el N -term inal el de
dansyl o el de Edman, sobre todo para las de­
gradaciones seriadas.
Todas estas investigaciones han perm itido
com probar que las cadenas L están form adas
por dos fragmentos de 107 aminoácidos cada
una. La porción N-terminal es variable, con un
total de 75-77 residuos sustituibles (-70% de
variabilidad), en tanto que la C-terminal es esta­
ble para cada tipo de cadena. Cuatro residuos
cisteína, dos en la zona variable y dos en la es­
table, originan puentes -S-S-, los que form an
dos anillos o bucles, de aproximadamente 60
aminoácidos cada uno, denominados Vj y C,
que le confieren cierta estabihdad a la molécula.
La fracción variable presenta zonas estables
(fig. 5-10). Dicha variabilidad, sobre todo la
correspondiente a algunos residuos, com o se
verá m ás adelante, desem peña un papel m uy
82 Aspectos básicos de la Inmunidad

C uadro 5-1. Relaciones entre el fenotipo Km C u a d ro 5-2. V ariaciones iso típ ica s en la
y estructura primaria de la región constante de estructura prim aria del fragm ento constante
las cadenas K de las cadenas X
Fenotipo R esiduo de am inoácidos
Isotipo Posición Residuo Variante
Km 153 191
Oz 193 Lys +
(í) V al Leu
( 1. 2) A la Leu Arg
(3) A la Val Kern 156 Gly +
Ser _
fvlz 147/174 V al/A sn +
Ala/Lys ~
importante en la actividad anticuerpo de la mo­ M cg 116/118/167 A sp/Thr/l^ys +
A la/Se/Thr -
lécula. Cuando se habla de secuencia variable
se quiere significar que existen muchos lugares
ocupados por aminoácidos diferentes, en otras
cadenas del mismo tipo estudiadas. sitivos o negativos según que den reacciones es­
En la región constante de las cadenas k se pecíficas o no con los correspondientes antisue­
han observado variaciones, que están relacio­ ros. Las relaciones entre ellos y la estructura
nadas con tipos serológicos hereditarios {aloti­ primaria del fragmento constante de las cadenas
pos). Los marcadores genéticos Km se heredan \ comprometido figuran en el cuadro 5-2.
por una serie de tres alelos; K m ‘, Km''^ y K m l Si bien los primeros 20-25 residuos de las
Los análisis secuenciales han perm itido esta­ cadenas L de tipo K y pueden presentar varia­
blecer las relaciones entre -la estructura prima­ ciones consideradas cada una de ellas en con­
ria de estas cadenas y los antígenos Km (1), junto, actualmente y sobre la base de un mayor
Km (1,2) y Km (3) (cuadro 5-1). conocimiento de secuencias, el análisis detalla­
Variaciones similares ocurren en las cadenas do de esos residuos ha permitido subdividir a
X, pero aquí no se trata de marcadores genéti­ las cadenas K en los subgrupos Kj, k „ , . k y
cos, ya que están distribuidos entre las diferen­ y a las cadenas A. en los subgrupos >.j„,
tes cadenas X de todos los individuos. Se deno­ Xjy, y cada uno de ellos con los prime­
minan isotipos y a esas variedades serológica- ros 22 residuos constantes. Estos residuos son
mente identificables se las conoce como marca­ los ubicados antes de la primera cisteína N-ter­
dores Oz, Kern, Mz y Mcg, que pueden ser po- minal.

I— Cadena H

F ig . S-10. Representación esquem ática de una cadena L de tipo K. (Elaborada con datos publicados por Puttnam y M ils­
tein.)
 Anticuerpos 83

C uadro 5-3. Secuencia amino-terminal de los subgrupos de cadenas L humanas de los tipos K y X
S e c u e n c ia

Sub^
grupo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 W 11 12 13 14 ¡5 16 17 18 79 20 21 22 23

Vk, A.sp lie Gln M el Thr Gln S er P ro S er Ser Leu S er Ata Ser Val G ly A sp Arg V al Thr lie Thr Cys
Vk,i Asp lie Val M et Thr Gln S er P ro L eu Ser L eu Pro V al T hr Pro G ly G lu Pro A la Ser lie Ser Cys
VKhi Glu lie V al Leu Thr Gln S er P ro Gly Thr L eu S er Leu S e r P ro G ly G lu Arg A la Thr L eu S er Cys
V k,v A sp íle V al M et Thr G ln Ser P ro Asn Ser L eu A la V al S e r Leu G ly G lu Arg A la T h r He A sn Cys

la, PCA S er Val L eu T h r Gln P ro P ro S er (-) Val S er G ly A la P ro G ly Glu Agr Val T hr lie S er Cys
i a „ PCA Ser Ala L eu Thr G ln P ro Ala S er (- ) Val S er Gly S e r P ro G ly G ln Ser lie iT. »h r lie oSc.
er Cys
KX.||j Ser Tyr Glu L eu Thr Gln P ro P ro S er (- ) Val S er V al Ser P ro G ly Gln Thr A la Arg lie Thr Cys
(-) S er Glu L eu Thr G ln Asp Pro Ala (- ) V al Ser Val A la Leu G ly Gln Thr Val Arg lie Thr Cys
PCA S er A la L eu T h r G ln P ro P ro S er (- ) A la S er G ly S e r Pro G ly G ln S er V al T h r íle S er Cys
KX^^ Asp Phe M et I.e u Thr Gln P ro His S er (-) Val S er Glu S e r P ro G ly Lys Thr Val Thr Phe S er Cys

P C A es el s ím b o lo para el re sid u o d erivado del ácido p irro lid -2 -o n a-5 ca rb o x ílic o

L os am in o ác id o s d estac ad o s co rresp o n d e n a residuos in v aria b le s en todas las c a d e n a s secuenciadas.

El cuadro 5-3 muestra los prototipos de los Las cadenas H tienen diferente denom ina­
diferentes subtipos de cadenas L, y el cuadro ción según la inmunoglobulina de que p ro ce­
5-4 los productos de combinación de los frag­ den. Se las designa y para la IgG, \i p a ra la
mentos VL y CL para cada tipo de cadena. IgM, a para la IgA, 8 para la IgD y e para la
Las cadenas K y X que se diferencian entre sí IgE. De todas ellas la mejor conocida es la y,
por la secuencia de los aminoácidos de la mitad de la cual han sido hallados en el hombre cua­
C-terminal, poseen también ciertas fracciones tro tipos diferentes: y,, y^, yj y y^ (cuadro 5-6).
comunes (cuadro 5-5). Las fracciones N-termi~ Se conocen estudios secuenciales completos
nal en ambos tipos de cadenas presentan varia­ de cadenas H (y) (cuadro 5-7) y exámenes par­
ciones individuales, razón por la cual no pue­ ciales de algunas cadenas y de p roteínas de
den tenerse en cuenta para la diferenciación. mielomas y de “enfermedad de Franklin o de
Como consecuencia de su distinta estructura las cadenas pesadas” .
secuencial, las cadenas k y difieren antigéni­ Se ha podido comprobar que la fracción N-
camente. Teniendo en cuenta que se encuentran terminal de cadenas y, obtenidas por pronasa,
presentes en todas las inmunoglobulinas, éstas es Glu-Val-Thr, pero el NH^ grupo del am inoá­
han sido subdivididas en dos grupos, las llama­ cido terminal está bloqueado, formando un ani­
das tipo L (I) que se caracterizan por tener ca­ llo derivado del ácido pirrolidín carboxílico; de
denas L de tipo K y las llamadas tipo L (II), que ahí que su secuencia sea PC A -V al-Thr. Los
contienen cadenas L tipo X (fig. 5-11). primeros 107 a 132 residuos N-terminales de la
cadena H presentan gran variabilidad. Se ha
observado en cambio gran identidad entre pép­
tidos correspondientes a la zona C-terminal, de
C uadro 5-4. Recombinación de los fragm en­
las proteínas de mieloma pertenecientes al m is­
tos variables de las cadenas K y X con sus
mo tipo antigénico y genético.
respectivos fragmentos constantes para form ar
El octadecapéptido C-terminal, separable por
los diferentes subtipos de cadenas L
BrCN, ha sido estudiado en diferentes cadenas
H, presentando gran estabilidad. Se han obser­
vado mínimas variaciones para las cadenas y, y
y^ de origen humano y para las cadenas y de co­
nejo y caballo (cuadro 5-8).
Sobre la base de estos estudios, las cadenas
H pueden ser divididas en dos porciones, la Fd,
que posee el aminoácido N-terminal y se co­
rresponde con la cadena L, y la Fe, poseedora
del aminoácido C-terminal. Esta fracción nor­
malmente es constante en el mismo tipo de ca­
dena, no así la Fd. En el fragmento Fe se en­
cuentran ubicados los determinantes antigéni-
cos específicos de la IgG y la mayor parte de
los factores genéticos Gm. La porción Fd pue­
de ser dividida también en mitades. La N-ter-
84 Aspectos básicos de la inmunidad

Tipo K Tipo L

ic
IgA )T
-jy
X

|K XI

X,
X|

XI

IgE
|K

|K
B.Jones

__JK X mmmrnmmiumé
Fig. 5-11. E s t r u c t u r a t e t r a p e p t í d i c a d e l a s c i n c o c l a s e s d e i n m u n o g l o b u l i n a s d e o r i g e n h u m a n o c o n s u s d o s t i p o s ( k a p p a y
la m b d a ) d e c a d e n a s liv ia n a s .

C u ad ro 5-5. Cadenas L de tipo Ky X. Comparación de los fragmentos C-terminales

lio 115 120 125
C ad en a K A R G -T H R -V A L -A L A -A L A -P R O -S E R -V A L -P H E -IL E -P H E -P R O -P R O -S E R -A S X -G L U -G I.N 4 .E U -L Y S -S E R

C ad en a X G I.N ^ P R O -L Y S ~ A L A -A L A -P R O -S E R -V A L -T H R -L E U 4 > H E -P R O -P R O -S E R -S E R -G L U -G L U -E E U -G L N -A L A

'TyCT
130 140 145

GLY-THR-ALA-SER-VAL^VAL-CYS-LEU-LEU-ASN-ASN-PHE-PRO-TYR-ARG-GLU-ALA-LYS-VAL-GLN-TRP-I.YS

A S N iY S ^ A L A -T H R -L E U ^ V A L -C Y S -JJÍU -IL E ^ S E R ^ A S P -P H E -T Y R ^ P R O -G L Y -A L A -V A L -T H R ^ V A L -A I.A -T R P -L Y S

150 155 160 165 170

VAL-ASP-ASN-ALA-I,EU-GLN-SER-GLY-ASN-SER-GLN-GLU-SER-VAL^THR-GLU-GI.N^ASP-SER-LYS-ASP-SER

ALA-ASP-SER-SER-PRO-VAL-LYS-AEA~GLY-VAL-GLU^THR-THR-THR-PRC>SERT.YS^GLN-SER-ASN-ASN-I.YS

175 180 185 190

THR-TYR-SER^LEU-SER-SER-THR-LEU-THR-LEU-SER-LYS-ALA-ASP-TYR-GLU-LYS-HlS-I.YS^j''g¿'^TYR-ALA-

TYR-ALA-ALA-SER-SER-TYR-LEU-SER-LEU-THR-PRO-GLU-GLN^TRP^LYS-SER-HIS-ARG^SER-TYR-SER

195 200 205 210

C Y S -G L U -V A L -T H R -H IS -G L N -G L Y -L E U -S E R -S E R -P R O -V A L -T H R -L Y S -S E R J> H E -A S N -A R G -G L Y -G L U -C Y S 'E E l

C Y S -G L N -V A L -T H R -H IS -G L U -G L Y - S E R -T H R -V A L -G L U -L Y S -T H R ^ V A L -A L A -F R O ^ T H R -G E U -C Y S -S E R

F ig . 5 -1 2 . E s ­ Fragmento
q u e m a d e la e s ­ variable
tr u c tu r a d e u n a
c a d e n a H (y).
minal, constitutiva del fraginento Fv, es muy
variable y participa en la formación del sitio de
combinación, en tanto que la otra mitad consti­
tutiva del fragmento Fb, es estable. El fragmen­
to Fd presenta hom ología con la cadena L.
Análisis estructurales han permitido comprobar
que en las cadenas H existen cuatro bucles o
anillos similares a los observados en las cade­
nas L, denominados Vj_j, C „l, C,_,2 y C,_,3, los
dos primeros ubicados en el fragmento Fd y los
dos restantes en el Fe (fig. 5-12).
El cuadro 5-9 define los diferentes fragmen­
tos constitutivos de una molécula de inmuno-
globulina, los que se encuentran representados
en las figuras 5 -13a y 5 -13b.
La secuencia de aminoácidos de las regiones
variables de las cadenas pesadas (Vj.,) de las in­
m unoglobulinas hum anas, p ro v en ien tes de
mieloinas, fueron clasificadas originalm ente
por Kabat en tres grupos, de acuerdo con la ho­
mología en la secuencia aminoacídica. E stu ­
dios posteriores han hecho posible el reordena­
miento de éstos, sobre la base del 80% por lo
menos de homología a nivel de secuencia de
nucleótidos, en 6 fam ilias ( V h I , V h2, V h 3 ,
Vh4, V h5 y V h6), de manera similar a lo que
ocurre con las cadenas L. Las seis secuencias
prototipos de dichos subgrupos figuran en el
cuadro 5-lOa. Recientemente la familia V h I ha
C uadro 5-6. Cadenas H (humanas)
D enom inación
inm uno- D enom inación del subtipo de
globulinas de la cadena H Subtipos inm unoglobulinas
Yl Ig G l
IgG lg G 2
Y Y2
y. Ig G 3
Ig G 4
y.
Ig M
IgA a «1 Ig A l
«2 Ig A 2
IgD 8 -
IgE e - -
Anticuerpos 85
Fragmento constante
sido reclasificada en V H I y V H 7, quedando
estas familias conformadas por 11 y 1 genes
V h funcionales, respectivamente. Por otro lado,
estas fam ilias, sobre la base de su filogenia,
han sido agrupadas en 3 clanes. El clan I con­
tiene las famihas V h I , V h5 y V h7; el clan 2
contiene las familias V h2, V h4 y V h6; el clan
III contiene la fatnilia Vh3.
De los aproximadamente 95 genes VH cono­
cidos (véase cap. 6), sólo 51 tienen reordenado
el marco de lectura (“open reading frame”) por
lo que son funcionales y participan en la crea­
ción de la variabilidad de las cadenas H; los res­
tantes no tienen abierto el marco de lectura, son
seudogenes o no han sido secuenciados (cuadro
5 -10b). Estos fragmentos variables de cadenas
H son comunes a las diferentes inmunoglobuli­
nas, de lo que se deduce que las distintas cade­
nas H resultan de la recombinación de un frag­
mento H variable (V^,) común y un fragmento H
constante (Cj^) propio para cada inmunoglobuli­
na, aspecto que se discutirá más adelante.
Proteínas de mielomas, completas, han sido
analizadas con el objeto de obtener péptidos
constituidos únicamente por fragmentos de ca­
denas L, de cadenas H y mezcla de ambas uni­
das por puentes S-S. Después de la reducción
de dichos puentes con mercaptoetanol se hicie­
ron los anáhsis de los péptidos, algunos de los
cuales coincidieron con los ya conocidos en los
estudios efectuados separadamente en las cade­
nas L y H de dichas proteínas. Esto ha perm iti­
do determinar la ubicación de los puentes S-S
dentro de las cadenas FI y las uniones L-H, así
como del hidrato de carbono ligado a las inm u­
noglobulinas.
Del análisis de inmunoglobulinas de mielo-
mas, que son homogéneas, se ha concluido que
hay cuatro subclases de IgG. En la Ig G l, la
unión H-L se produce entre la cisteína C-termi-
nal o preterminal de las cadenas L y la cisteína
de la cadena H ubicada en el residuo 220. Po­
see además dos puentes disulfuro intercadenas
H-H. En las Ig02, IgG3 e IgG4 la unión H-L
86 Aspectos básicos de la inmunidad

C u ad ro 5-7. Secuencia de los aminoácidos constitutivos de una cadena H (y¡) de Ig G l humana

1 10 20
PC A -V al-G In-L eu-V al-G ln-Ser-G ly-A la-G lu-V al-L ys-Lys-Pro-G ly-Ser-Ser-V al-Lis-V al-

30 40
Ser-C ys-L ys-A Ia-Ser-G ly-G ly-T hr-Phe-Ser-A rg-Ser-A la-Ile-Ile-Trp~V al-A rg-G ln-A la-

50 60
Pro-G ly-G ln-G ly-Leu-G lu-Trp-M et-G ly-G ly-Ile-V al-Pi'o-M et-Phe-G ly-Pro-Pro-A sn-Tyr-

70 80
A la-G ln-Lys-Phe-G ln-G ly-A rg-V al-Thr-IIe-T hr-A la-A sp-G lu-Ser-Thr-A sn-T hr-A la-Tyr-

90 100
M et-G lu-L eu-Ser-Ser-L eu-A rg-Ser-G lu-A sp-T hr-A la-Phe-T yr-Phe-C ys-A la-G ly-G ly-T yr-

110 120
G ly-Ile-Tyr-Ser-Pro-G lu-G lii-Tyr-A sivG ly-G ly-Leu-V al-T hr^V al-Ser-Ser-A la-Ser-T hr-

130 140
L ys-G ly-P ro-Ser-V al-Phe-Pro-L eu-A la-P ro-Ser-Ser-L ys-Ser-T hr-Ser-G ly-G ly-T hr-A la-

150 160
A la-L eu-G ly-C ys-L eu-V al-L ys-A sp-T yr-Phe-Pro-G lu-P ro-V al-T hr-V al-Ser-T rp-A sn-S er-

170 180
G ly-A la-lxu-T hr-Ser-G ly-V al-H is-T hr-Phe-Pro-A la-V al-L eu-G ln-S er-S er-G ly-L eu-T yr-

190 200
Ser-Leu-S er-S er-V al-V aL T hr-V al-P ro-S er-S er-Ser-L eu-G ly-T hr-G ln-T hr-T yr-Ile-C ys-

210 220
A sn-V al-A sii-H iS'Lys-Pro-Ser-A sn-Thr-Lys-V al-A sp-L ys-A rg-V al-G lu-Pro-Lys-Ser-C ys-

230 240
A sp-L ys-T hr-H is-T hr-C ys-Pro-Pro-C ys-Pro-A la-Pro-G lu-L eu-L eU 'G ly-G ly-Pro-Ser-V al-

250 260
Phe-Leu-Phe-Pro-Pro-Lys-Pro-L ys-A sp-Tlir-Leu-M et~ lle-Ser-A rg-T hr-Pro-G lu-V al-T hr-

270 280
C ys-V al-V al-V al-A sp-V al-Ser-H is-G lu-A sp-Pro-G ln-V al-Lys^^Phe-A sn-Trp-Tyr-V al-A sp-

290 300
G ly-V al-G ln-V al-H is-A sn-A la-L ys-T hr-L ys-Pro-A rg-G lu-G ln-G ln-T yr-A sx-S er-T hr-T yr-

310 320
A rg-V al-V al-S er-V al-L eu-T hr-V al-L eu-H is-G ln-A sn-T rp-L eu-A sp-G ly-L ys-G lu-T yr-L ys-

330 340
C ys-L ys-V al-S er-A sn-L ys-A ia-L eu-P ro-A la-Pro-Ile-G lu-L ys-T hr-Ile-Ser-L ys-A la-L ys-

350 360
G ly-G ln-P ro-A rg-G lu-P ro-G ln-V al-T yr-T hr-L eu-P ro-Pro-S er-A rg-G lu-G ln-M et-T hr-L ys-

370 380
A sn-G ln-V al-Ser-L eu-T hr-C ys-L eu-V al-L ys-G ly-Phe-T yr-Pro-S er-A sp-lle-A la-V al-G lu-

390 400
Trp-G Iu-S er-A sn-A sp-G ly-G lu-P ro-G lu-A sn-T yr-L ys-T hr-T hr-P ro-Pro-V al-L eu-A sp-S er-

410 420
A sp-G ly-S er-P he-P he-L eu-T yr-S er-L ys-L eu-T hr-V ai-A sp-L ys-S er-A rg-T rp'G ln-G lu-G ly-

430 440
A sn-V al-Phe-Ser-C ys-S er-V ai-M et-H is-G lu-A la-L eu-H is-A sn-H is-T yr-T hr-G ln-L ys-S er-
Leu-Ser-L eu-Ser-Pro-G ly
 Anticuerpos 87

C uadro 5-8. Secuencia del octadecapéptido carboxiterminal de cadena,s pesadas de diferentes

inmunoglobulinas IgG

/ i , (Humíina): (M et) - HLS - G L U - A LA ^ LE U ^ HiS ^ ASN - HLS ~ T Y R - TH R - G L N ^ LY S ^ SER - LE U - SER - LEU - SER - PRO - GLY - (C O O H )
^G^ (H um ana): (M et) - HLS - G LU - ALA - LE U - HIS - ASN - A R G - PHE - T H R - G L N - LYS - SER - LE U - SER - LEU - SER - PRO - GLY - (C O O H )
(Conejo): (M et) - H IS - G LU - ALA - LEU - HiS - ASN - HLS - TY R - T H R - G L N - LYS - SER - ILE - SE R - A R G - SER - PRO - GLY - (C O O H )
(Caballo): (M et) - HLS ^ GLU ^ A LA ^ LE U - HÍS ^ ASN - H IS - TY R - T H R - G L N - LYS - SER - V A L - SE R - LYS - SER - PRO - GLY - (C O O H

C u a d ro 5-9. D efinición y características de los diferentes fra g m en to s constitutivos d e las

inmunoglobulinas

Fragm ento

H Cadena peptídica pesada, con caracteres propios para cada clase de inm unoglobulina. Existen dos cad en as
H idénticas po r m olécula de inm unoglobulina.

L C adena peptídica liviana, com partida p or las diferentes clases de inm unoglobulinas. Existen dos ca d en as L
idénticas po r m olécula de inm unoglobulina.

Fab C onstituido po r una cadena L y el fragm ento H y-C ^l de u n a cadena pesada. Se lo obtiene por d ig e stió n pa-
paínica. Se com porta fi'ente al antígeno com o ligando univalente.

Fe D ím ero constituido por dos fragm entos de ca d en a pesada unidos por los puentes disulfuro c o rres­
pondientes a la zona de la bisagra. Se obtiene por digestión papaínica. N o expresa actividad anticuerpo.

F(ab’)2 C onstituido p or dos fragm entos F ab ’ unidos por puentes disulfuro. Se lo obtiene por digestión p ép sic a d u ­
rante 18 hs. Se com porta frente al antígeno com o ligando bivalente. T iene capacidad p ara p recip itarlo p e­
ro no expresa otras propiedades del anticuerpo com o fijación del com plem ento, pasaje placentario, etc.

F ab’ Se obtiene por reducción del fragm ento (F (ab’)2 con m ereaptoetanol y bloqueo de los grupos-SH co n io ­
doacetam ida. Está constituido por el fragm ento Fab y restos de la región bisagra.

F e’ Es un dím ero del fragm ento Cj_j3 de ca d en a H. Se obtiene por digestión p rolongada con papaína.

Fd E stá form ado por el fragm ento V jj-C^l de cadena H. Se lo obtiene por reducción y desnaturalización del
fragm ento Fab,

Fv Constituye la parte variable del fragm ento Fab. Es un dím ero de V h-V, .

p F c’ Es sim ilar al F e ’, R esulta de digestiones cortas con pepsina,

Fb Constituye la parte constante del fragm ento Fab, Es un dím ero de Cj^,l-C,,

C uadro 5-lOa. Secuencia de los primeros 30 aminoácidos N-terminales (F R l) correspondientes

al fragmento variable de las 6 familias de cadenas H humanas
V H l (É’í / I g G l )
P ca-V a l-G ln -L e v i-V a l-G to -S e r-G ly -A la ~ G lu -V a l-L y s-L y s-P ro -G iy -S e i-S e i-V a l-L y s-V a l-S e r-C y s-L y s-A la -S e r-G ly -G ly -T h r-P h e -S e r(;)
V H 2 (COR I g G l )
P ca-V al-T Iir-L e u -A rg -G lu -S er-G ly -P ro -A Ia-L e u -V a l-L y s-P ro -T h r-G ln -T h r-L eu -T h r-L eu -T h r-C y s-T lir-P h e-S er-G ly -P h e-S e r-L e u -S er('2 )
V H 3 ( I g G A l)
G lu -V a l-G ln -L e u -L e u -G lu -S er-G ly -G ly -G ¡y -L e u -V a l-G ln -P ro -G ly -G ly -S e r-L e u -A rg ~ L eu -S er-C y ,s-A la-A la-S er-G ly -P h e-T lir-P h e -S er (3)
V H 4 (X A C /lg M )
P ca-V al-G ln -L eu -G ln -G ln -T rp -G iy -A la-G ly -L eu -L eu -L y s-P ro -S er-G lu -T h i‘-L eu -S er-L eu -T h r-C y ,s-A la-V al-T y r-G ly -G ly -S e r-P h e-S e r (4)
V H 5 (gen 5 J R f)
G lu -V a l-G ln -L e u -V a l-G ln -S e r-G ly -A la -G lu -V a l-L y s-L y s-P ro -G ly -G lu -S e r-L e u -L y s-V a l'S e r-C y s-L y s-G ly -S e r-G Iy -T h r-S e r-P h e -T h r (5)
V m ig e n lG l)
G ln-V al-G Jn -L eu -G ]n ~ G ln -S er-G ly -P ro -G ly -L eu -V al-L y s-P ro -S e r-0 1 n -T h r-L e u -S e r-L eu -T h r-C y s-A la-l)e-S er-G ly -A ,sp -S e r-V a l-S erí6 )

(I), (2), (3): S eq u en c es o f p ro te in s o f im m u n o lo g ica l in tere st, F o u rth E dil,, 1987 (K a b a t E, y col,)
(4): J. Biol. Chem., 2 6 6 :2 8 3 6 -2 8 4 2 , 1991
(5): EM BO J., 7:727-738, 1988
(6¡: Eur. J. Immun., 20:351-3,56, 1990
P C A es el s ím b o lo p a ra cl re s id u o deriv a d o del ácido p irro l¡d -2 -o n e-5 -ca rb o x ílic o
88 Aspectos básicos de la Inmunidad

C u ad ro 5-lOb. Contenido en genes Vh del locus funcional en cromosomas 14

Vh I Vh 2 V h3 Vh 4 Vh 5 Vh 6 Vh 7 Total

Con m arco de lectura reordenado II 3 22 11 2 1 51

C on m arco de lectura no reordenado 1 0 6 0 1 0 9
Pseudogenes 4 1 21 ) O O 30
N o secuenciados 1 0 2 1 0 0 5
Total 17 4 51 13 3 1 95

E lab o rad o con datos to m ad o s d e G. P, C o o k e l.M .T o n iliso n . Immunology Today, 16: 237, 1995.

se produce entre los residuos cisteína de las ca­
denas L en las posiciones indicadas y los de las
cadenas H ubicados al comienzo de la porción
constante del fragmento Fd (aproxiinadamente
residuo 140). Además, el número de puentes
disulfuro intercadenas FI-H es cuatro, once y
dos, respectivamente. La zona de la bisagra de
la IgG3 es de mayor tamaño que en las restan­
tes subclases, a causa de que un fragmento del
ADN del gen que codifica para Cy (véase cap.
6) se ha cuadruplicado. Tiene 62 residuos re­
sultantes de la unión de un segmento de 17 re­
siduos seguidos en posición C-terminal de tres
fragmentos idénticos de 15 residuos cada uno.
Ello hace que su peso m olecular sea de 170
kD. La IgG4 no fija el complemento, la IgG2
no se fija a piel heteróloga, y sólo las IgGl e
igG3 tienen capacidad opsonizante y son sensi­
bles a la acción proteolítica de la papaína en
ausencia de cisteína (fig. 5-14). La subclase
con mayor actividad fijadora del complemento
es la IgG3, que a su vez es la de menor vida
media (8 días).
La relación cadenas k/X para las diferentes
subclases de IgG es la siguiente: IgG l = 2,4;
IgG 2= l,l;Ig G 3 = l,12;IgG 4 = 5.

F (a b ’)2
 Anticuerpos 89

F ig . 5 - 1 3 b . D ib u jo s d el
esqueleto de los earbonos
a co rresp o n d ie n tes a una
m olécula de IgG com pleta,
su fragm ento Fv, la región
de la bisagra y el fragm en­
to Fe. (C o m p o sic ió n e la ­
borada con partes de las fi­
guras publicadas p or P ad ­
lan E A , A n a to m y o f lite
antibody m olecule. M o le ­
cular Im m unology, 31: 169,
1994.)

Bisagra

CH2

Fe

Todas estas investigaciones efectuadas sobre
estructuras primai'ias de inmunoglobulinas han
llevado a la formulación de la hipótesis de una
evolución estructural de las cadenas L tipo K o
X, a partir de un gen ancestral común. La ho­
mología estructural observada entre las cadenas
L y H sostiene la hipótesis de una evolución
común y una diferenciación primaria de los ge­
nes que gobiernan esta síntesis (fig. 5-15).
Es posible que el ancestro sólo tuviera 300
90 Aspectos básicos de la inmunidad

nucleótidos y que codificara para un péptido de

100 aminoácidos (un bucle); por duplicación
génica y plegadura intragénica se originaron los
IgG,
genes que gobiernan la síntesis de las distintas
cadenas L y H. Ello habría surgido con la evo­
lución. De las cadenas H, las primeras en dife­
renciarse fueron las jj. y luego lo habrían hecho
las restantes. En la figura 5-15 puede verse esa
evolución en el curso del tiempo y las especies.
Cada m olécula de IgG es bivalente, o sea
C/3 IgG, que tiene dos sitios de combinación para el de­
íi L terminante antigénico específico, que está si­
tuado en el dominio formado por las regiones
variables de las cadenas L y H, y ambas contri­
buyen a la formación del sitio de combinación.
En la naturaleza sólo han sido hallados anti­
cuerpos bivalentes para un solo determinante
antigénico. No se conocen anticuerpos heteroli-
gados naturales.
Todos estos estudios sobre productos de de­
gradación de IgG y su reactividad han llevado
a la esquematización de su molécula. Una de
las más aceptadas ha sido la propuesta por Por­
ter (fig. 5-4).
Se han analizado con el microscopio electró­
nico los productos de interacción de la IgG an­
lgG4 ticuerpo antidinitrofenol con el dihapteno co­
rrespondiente unido por cadenas de -C H ^ -.
Igualmente han sido examinados los productos
de reacción del anticuerpo completo y los obte­
nidos por digestión pépsica (Eab^’) y papaínica
F ig . 5-14. E squem a estructural de las diferentes subclases (Eab). Se pudo comprobar que, cuando el que
de IgC hum ana. reacciona es el anticuerpo completo, se forman

K A, X |J,, Ii^a, ttj Y, Yj, Y3 Y4 8 e

AÑOS ERA ESPECIES
(millones)
Primates
-6 0 Kenozoica

Aves
-200 IVIesozoica

Reptiles
Anfibios
Peces

-5 0 0 Paleozoica

^ plegadura intragénica

duplicación génica

F ig . 5-15. E volución de las cadenas L y H de las inm unoglobulinas a partir de un gene ancestral comiin. (Tom ado de E.
V an Loghem . A nn. N . Y ork A cad. Sci. 190: 137, 1971.)

Fig. 5-16. Microscopía clcclróiiiica. A: l"Ci de concjo ainidiiiilriilv-iuil al ínlcr.iccíoiiar cdu IXNI’- M l - i ( '!Ij;, N(I l)X I'. H:
La misma imnunoglobulina previamente tratada con pepsina. (Tomado de Valentine, R.A. y Green, N. iVI. J. M ol. Biol.,
27:615, 1967.)
predom inantem ente figuras triangulares con
mamelones en los extremos, los cjue desapare­
cen si el anticuerpo ha sido sometido previa­
mente a digestión pépsica (fig. 5-16). Si el trata­
miento fue papamico no se forman figuras geo­
métricas. De ello se dedujo que la IgG se ase­
meja a una Y con los dos sitios reactivos en los
extremos superiores (fig^. 5-17). Su tamaño ha
sido calculado en 200 Á de ancho. La figura
5-18 representa los triángulos formados por la
interacción de tres moléculas de IgG con tres
moléculas del dihapteno, que corresponden a
las figuras observadas al microscopio electróni­
co. Los trabajos mencionados han servido, ade­
más, para poner en evidencia que la formación
de figuras geométricas triangulares sólo tiene
lugar cuando el puente que une los dos radicales
difenilo tiene un mínimo de seis -CH^-. Si bien
la estructura en Y es la que se observa cuando
la IgG ha reaccionado con el ligando, no se tie­
ne seguridad sobre su conformación cuando se
encuentra libre en solución. Hay quienes sostie­
nen que la indicada en la figura 5-4 podría ser la
correcta, en tanto que otros, basados en estudios
de diferentes tipos, consideran que la estructura
de la IgG libre es una T, la que dada su flexibi­
lidad adquiriría la forma de Y al reaccionar con
un ligando, exponiendo de este modo ciertos re­
ceptores ocultos como serían los que facilitan la
fijación del componente C lq del sistema com­
plemento (fig. 5-19). Estudios de difracción de
rayos X efectuados con inmunoglobuhnas mo­
noclonales cristalizadas parecieran confirmar la
estructura en forma de Y.
Todas las inmunoglobulinas contienen hidra­
tos de carbono, pero ellos no molestan en el es­
Anticuerpos 91
tudio de sus estructuras-, pues se encuentran uni­
dos a sus moléculas a través de restos de aspa­
ragina y son fácilmente separables por hidróli­
sis.
Las fórmulas representativas de la IgG se­
rían Y2K2 y 72^2-
IN M U N O G L O B U L IN A M (Ig M )
Sinonimias: yM globulina: 19 S inm unoglo­
bulina; macroglobulina. Representa la m ás pe­
sada de las globulinas del sistema gamma.
Desde hace tiempo se conocía la existencia
de anticuerpos de alto peso molecular, pero sus
características fisicoquímicas y relaciones in­
munológicas y genéticas con las otras globuli­
nas inmunes han sido determinadas con poste­
rioridad a los estudios reahzados con IgG.
Su concentración en el suero normal es esca­
sa, pero en los últimos tiempos se ha logrado
conocerla m ejor com o consecuencia d e una
profundización en los estudios sobre algunas
p ato lo g ías, com o la m a cro g lo b u lin em ia de
Waldenstrom y el hallazgo del factor reum atoi­
deo. Este y la globulina aislada de la enferm e­
dad citada son 19Sy globulinas y se encuentran
en altas concentraciones. La designación de
19Sy globuhna se hace con el objeto de recor­
dar su velocidad de sedimentación equivalente
a 19 unidades Svedberg. Su peso molecular es
970 kD y ha sido calculado por ultracentrifuga­
ción. Exámenes de este tipo evidencian hetero­
geneidad de ¡a IgM y ello se debe a que, si bien
el componente más importante tiene una cons­
tante de sedimentación de 19 unidades Sved-
92 Aspectos básicos de la inmunidad

Fig. 5-19. Representación esquem ática de la m olécula de

IgG según Edelm an. ®; hidratos de carbono.

seen velocidades de sedimentación de 29 S y

F ig . 5-17. Estructura propuesta para la IgG por V alentine
y O reen de acuerdo con observaciones hechas a nivel de
m icroscopia electrónica.
berg, existen siempre fracciones adicionales
que se encuentran en menor proporción y po-
35-40 S, que constituyen polímeros de la 19 S
gammaglobulina.
Esta proteína tiene una movilidad electrofo­
rética que va desde la zona media de las gam­
ma hasta las betaglobulinas.
Su contenido en hidratos de carbono es apro­
ximadamente del 12% con un 5,2% de hexosa

NOg
F ig . 5-18. Esquem atización de las figuras triangulares con m am elones en los extrem os observadas al m icroscopio electró­
nico cuando interaccionan anticuerpos (IgG ) de conejo anti-D N P y el dihapteno correspondiente. Si la reacción se realiza
con los productos de digestión pépsica y el dihapteno, se form an figuras triangulares carentes de m am elones, de lo que se
deduce que los m ism os corresponden al fragm ento Fe de la IgG. Para que la reacción se produzca, el núm ero de - d i z ­
que unen los dos grupos dinitrofenol (D NP) debe ser superior a seis.
 Anticuerpos 93

o t/5 o
T ~T X I

SS - 88-

-88- -S 9 ~ - 88-
h é b h h h b b Ii b i aCOO-
ü
X I
-S S O co
■coo-

nK SS /
00
n
\ i f

F ig. 5-20. Estructura esquem ática de IgM m onóm era (A) e IgM polim érica (B).

y 2,9% de hexosamina, lo que determina una Cuando su peso molecular es el indicado, se

relación hexosamina/hexosa de 0,55. Por ultra-
centrifugación preparativa, crom atografía en
columnas de D EA E-celulosa o filtración por
geles se la puede obtener pura. C antidades
apreciables se pueden conseguir a partir de sue­
ros de pacientes con m acroglobulinem ia de
Waldenstróm.
ha determinado que su valencia es predom inan­
temente pentavalente, aun cuando posee otras
cinco valencias de menor afinidad. Su fórm ula
sería (iJ-jKj), y (M-25^2)5- Recientemente se h a de­
mostrado en el plasma humano la presencia de
IgM constituida por la polimerización de 6 uni­
dades monoméricas, lo que estaría relacionado
94 Aspectos básicos de ia inmunidad
F ig . 5-2 1 . M icro sco p ia e lectró n ica de u n a m o lécu la de
IgM en la que se puede apreciar su estructura en form a de
estrella. (T om ado de F einstein, A. y col.: A nn. N. York
A cad. Sci., 190: 104, 1971.)
con la cantidad de cadenas J que sintetiza el
plasmocito (véase más adelante). Aquellas cé­
lulas con bajos contenidos de cadenas J secre­
tan IgM-exámero (igM)6, secretando IgM-pen-
támero (IgM)5 las células plasmáticas que tie­
nen alto contenido de cadenas J. Los mitógenos
y polisacáridos de la pared celular de bacterias,
con subunidades de carbohidratos repetidas, in­
ducen en los linfocitos B producción de IgM en
ausencia de linfocitos Th cooperadores y sin la
participación de IL-2. En estos casos la síntesis
de IgM-exámero se ve favorecida. Fija el com­
plem ento y su capacidad de com binación es
mayor con antígenos particulados que con los
solubles (fig. 5-20). Observada al microscopio
electrónico por el método de la tinción negati­
va, tiene aspecto estrellado, con un centro en
forma de pentágono y cinco prolongaciones la­
terales (fig. 5-21).
Cuando la IgM es tratada por mercaptoeta-
nol, se disocia en subunidades 7 S, que conser­
van las características de antigenicidad de la
molécula total, no así la actividad de anticuer­
po plurivalente, si es que la molécula la poseía.
La recom binación de las 7 S subunidades se
consigue si el mereaptoetanol es eliminado por
diálisis. Estas 7 S subunidades son estables si
después del tratamiento con mereaptoetanol se
impide la reoxidación con iodoacetamida. Se
comportan como anticuerpos univalentes aun
cuando están constituidas por dos cadenas L y
dos cadenas H (P.M. 65 kD). Ello se debe a
que al combinarse con el antígeno no originan
complejos suficientemente grandes como para
precipitar o aglutinar, como consecuencia de
algún im pedim ento estérico. Que se trata de
anticuerpos bivalentes, no obstante su aparente
com portam iento de univalentes, ha sido de­
mostrado mediante la preparación de híbridos y
por estudios de interacción primaria.
La IgM da reactividad cruzada con la IgG,
siendo responsable de ello el péptido L. La trip­
sina d iv a la molécula de IgM por encima del
puente disulfuro in tercadena H, originando
Fab|i monomérico y Fc|0.5 (pentamérico). Si la
IgM es reducida por mereaptoetanol en presen­
cia de urea, se obtienen cadenas L similares a
las que se encuentran en las IgG, siendo esta
fracción de la molécula, al igual que en el caso
anterior, el lugar donde se encuentran locahza­
dos los determinantes antigénieos comunes y
los factores genéticos Km. Las cadenas H tie­
nen características propias y particulares. Se co­
noce el análisis secuencial de cadenas jj, com ­
pletas. Fi logenéti camente se considera que éstas
son las cadenas H más antiguas, de las que se
diferenciaron las cadenas y hace 200 millones
de años y las a hace 300 millones de años.
Los factores genéticos Gm, específicos de la
inmunoglobulina, no se encuentran en la IgM.
Algunos anticuerpos, que se forman por in­
m unización con antígenos T -independientes
(poliósidos, antígenos somáticos de Salmonella
typl%i) y algunas isohemoaglutininas, son IgM
globuhnas. En algunos animales de experimen­
tación e incluso en el hombre, en el curso ini­
cial de una inmunización con antígenos T-de-
pendientes, se forman anticuerpos IgM, pero
nuevas estimulaciones con los mismos antíge­
nos dan lugar a IgG inmunes. Las característi­
cas de estas variaciones en el curso de la res­
puesta inmune se exponen en el capítulo 8.
Hasta el momento no se ha podido demostrar
fehacientem ente que la IgM atraviese la p la­
centa. Algunas pocas comunicaciones sobre el
hallazgo de esta proteína en la sangre del cor­
dón umbilical deben ser tomadas con cuidado,
hasta tanto no se conozca bien la capacidad de
síntesis de aquélla por parte del feto, ya que el
aporte de datos acerca de la síntesis temprana
de esta globulina es cada vez mayor.
La cadena polipeptídica designada cadena J
(joining) se encuentra asociada con las formas
poliméricas de IgA y con el pentámero de IgM
(19S). Es un producto de síntesis de las células
p lasm áticas, tiene un peso m olecular de 15
kDa, es rica en restos -S H y se une a las men­
cionadas inmunoglobulinas mediante uniones
disulfuro. Cuando la cadena J no es detectada
en los polímeros no tratados, puede ser eviden­
ciada por la adición, previa al análisis inmu-
noelectroforético o a la inm unodifusión, de
agentes reductores.
Es interesante destacar que en los diferentes
polímeros de IgA y en IgM 19S sólo se ha de­
tectado una cadena J por polímero.
La cadena J desempeña un papel muy impor­
tante en el proceso de polimerización. Hay for­
mación de uniones covalentes de una cadena J
a dos unidades monoméricas vecinas, indepen-

dientemente de los monómeros que compongan
el polímero. El hallazgo de péptidos a - J - a es
un argumento de valor en ese sentido. Estos es­
tudios han servido también para demostrar que
la cisteína preterminal de la región C-terminal
de las cadenas a y probablemente de las ja. se
une a las cadenas J. La figura 5-22 muestra la
estructura esquemática de la cadena J.
En células plasmáticas elaboradoras de IgG
no polimériea se ha demostrado la presencia de
cadenas J, lo que indica que su hallazgo no
siempre significa polimerización. En los polí­
meros su presencia es constante.
La IgMs (subunidad monomérica) intracelu­
lar aislada no polimeriza espontáneamente, si­
no con previa reducción; esto hace suponer que
los residuos de cisteína responsables de las in-
teruniones de las subunidades están bloqueados
dentro de la célula.
Inmediatamente antes de la secreción se in­
corporan la cadena J y los hidratos de carbono
terminales.
Si bien la cadena J participa en la polimeriza­
ción, no se tiene una idea clara de cómo ocurre
ello, ya que la IgM es siempre un pentámero, en
tanto que las células que sintetizan IgA, dispo­
niendo de toda la maquinaria para la polimeri­
zación, dan productos constituidos por m onó­
meros, dímeros, trímeros y aun tetrámeros.
INMUNOGLOBULINA A (IgA)
Sinonimia: 7-13 S y globulina; p^A globuli­
na; Y, A globulina.
Dímero (IgA)j
Fig. 5-23. Inm unoglobulina A (IgA).
Anticuerpos 95
SH
Met — -----.A s p COOH
S S
S S
J _ _ _ ------- L _ pca
"r“
SH
F ig . 5-22. C adena J, estructura esquem ática.
Durante mucho tiempo ha sido inexplorada y
la mayor parte de la información que se tiene
proviene del estudio de mielomas de tipo IgA.
Se ha demostrado su actividad anticuerpo y
com probado que se encuentran ubicados en
ella algunos autoanticuerpos, tales como el an­
tinúcleo, antitiroglobulina y antiinsulina. N o es
fijadora del componente Clq del sistema com­
plem ento y el monóm ero no es precipitante.
Fue considerada en un comienzo como porta­
dora de la reagina alérgica, sensibilizante de la
piel, pero hoy sabemos que ello es patrimonio
de la IgE.
Una característica muy particular de la IgA es
su marcada heterogeneidad, la que se debe a un
conjunto de componentes con constantes de sedi­
mentación que van de 7 S a 13 S, que se forman
por polimerización y son disociables por mer-
captoetanol y urea en medio ácido (fig. 5-23).
Su contenido en hidratos de carbono ocupa
un lugar interm edio entre la IgG e IgM . Los
valores son algo superiores al 7% y la relación
hexosamina/hexosa es de 0,8. La IgA, al igual
que la IgM, no atraviesa la placenta.
96 Aspectos básicos de ia inmunidad
La degradación enzimática con papaína pro­
duce subunidades 3,5 S constituidas por pépti­
dos Fab y pequeños péptidos resultantes de la
degradación enzimática del fragmento Fe. Por
reducción y alquilaeión se obtienen péptidos L
y H. Las cadenas L son similares a las de otras
inmunoglobulinas: contienen los factores gené­
ticos Km y los determinantes antigénicos co­
munes. Las cadenas H, en cambio, tienen ca­
racterísticas propias. En cadenas (IgA^) se
ha demostrado la presencia de factores genéti­
cos, a los que se denomina Am.
Dada la dificultad en la obtención de frag­
mentos proteolíticos de esta inmunoglobulina,
similares a los logrados con IgG, las investiga­
ciones inmunoquímicas se han hecho más difí­
ciles, en especial las relacionadas con su estu­
dio secuencial. Se admite que su estructura es
la indicada en la figura 5-24.
La separación y purificación de una enzima
p roteolítica elaborada por el Streptococcus
sanguis, una bacteria aislada de heces hum a­
nas, ha significado un aporte im portante al es­
tudio de la IgA. Esa proteasa d iv a a la inm u­
noglobulina en la zona de la bisagra, por enci­
ma de los puentes S-S intercadenas H-H, dan­
do origen a los péptidos F a b a y F ea, similar
este último a los péptidos Fe de las otras inm u­
Fig. 5-25.
F ig. 5-24. Estructura pro-,
puestci para la IgA.
noglobulinas. La separación de ambos se con­
sigue por filtración a través de Bio-gel P-200.
El F e a obtenido por este procedimiento puede
aislarse como monómero, con una constante
de sedimentación 3,0 S y P.M. de 41,5 kDa, o
como dímero con un coeficiente de sedimenta­
ción de 5,3 S. Por reducción con ditiotreitol, el
dímero se transforma en monómero. La men­
cionada enzima ha resultado efectiva en el eli-
vado de IgA sérica e IgA secretoria, perm itien­
do en ambos casos obtener F ea. Según algu­
nos autores es efectiva sobre la Ig A l, no así
sobre la IgA2.
Se conocen dos subclases de IgA (IgA l e
IgA2), que difieren antigénicamente y por su
contenido en galactosamina, aminoazúcar que
sólo está presente en la primera. Los pesos mo­
leculares de las cadenas a , y son de 58 kDa
y 52 kDa, respectivamente. En una forma alotí-
pica de lgA2 (AmJ) se ha observado la ausencia
de puentes disulfuro intercadenas L-H, lo que
hace presumir que la integridad de la molécula
se debe a fuertes uniones no covalentes. La otra
forma alotípiea (Am^O tiene una estructura si­
m ilar a la IgA l y en ambas las uniones L-H
son por puentes disulfuro (fig. 5-25).
En todos los casos su estructura normal es
Kj o
Subtipos de IgA.
 Anticuerpos 97

Resulta interesante conocer que, si bien el

contenido de IgA es bajo en el suero sanguíneo
normal (1,5-2,0 mg/ml), es relativamente alto
en otros fluidos tales como la saliva, lágrimas,
secreción intestinal, fluido prostático y calos­
tro, especialmente en este tiltimo. Puede sepa­
rarse de éstos por filtración a través de Sepha­
dex G-200 o por cromatografía en DEAE-celu­
losa. A esta inmunoglobulina se la conoce co­
mo IgA secretoria y difiere en ciertos aspectos
de la sérica. Es predominantemente 11 S y está
asociada a un fragmento antigénicamente dis­
tinto de las cadenas L y H, llamado componen­
te secretorio (S). El peso molecular de la IgA
secretoria es de 385 kD y consiste en dos subu­
nidades monoméricas de IgA (7 S) y el compo­
nente secretorio de P.M de 70 kD, el que pare­
ce estar unido covalentemente a sólo una de las
unidades m onom éricas (fig. 5-26). La unión
entre las unidades 7 S es por puentes disulfuro
y en ella participa la cadena J de manera simi­
lar a lo que ocurre en la formación de los polí­
meros 19 S de la IgM. La fijación al com po­
nente S es por uniones covalentes de puentes
disulfuro y uniones no covalentes.
La IgA secretoria, cuya fórmula genérica es
(a^ k ^)2 S o ( a ^ ^ 2)2 S, es sintetizada por las cé­
lulas plasmáticas ubicadas en el subepitelio, de
donde una pequeña parte puede pasar a la cir­
culación general, mientras que el resto durante el suero normal es de 0,03 m g.m f’. M igra en la
el transporte a través del epitelio glandular o de zona de las beta lentas o gamma rápidas. Su
la superficie intestinal fija el componente se­ constante de sedimentación es 7S.
cretorio, previo a la secreción. Este componen­ Por digestión con papaína y cisteína da Ec y
te, que es elaborado por las células epiteliales, Fab. Por reducción y alquilación con mercap-
le confiere a la inm unoglobulina propiedades toetanol y iodoacetam ida libera cadenas L y
particulares, entre eUas una marcada resistencia H(5) (P.M. 69,7 kD). Las cadenas L son comu­
a la acción de las enzim as proteolíticas (fig. nes a las de las otras inmunoglobulinas y perte­
5-27). Actualmente se sabe que el componente necen a los tipos K y (fig. 5-28). La relación
S está constituido por los cinco dominios extra- cadenas k/X es 0,25.
celulares del RPolylg (receptor de IgM e IgA No posee determinantes específicos de las
poliméricas, que normalmente transporta estas IgG, IgM, IgA e IgE, pero en cambio posee de­
formas de IgM e IgA a través del epitelio intes­ terminantes específicos propios correspondien­
tinal y hepático) liberados por proteólisis. Para tes a sus cadenas H. Responde a la fórmula
mayor información véase más adelante Super­ y y ha sido identificada en otras especies
familia de las inmunoglobulinas y cap. 17. animales. En la superficie de linfocitos B del ra­
La re s iste n c ia c o n fe rid a p ro b ab lem en te tón se ha identificado una IgD similar a la hu­
constituya una necesidad biológica, ya que se mana, con la que presenta reactividad cruzada.
considera que la IgA de las secreciones desem­ Actividad específica relacionada con esta in­
peña un papel importantísimo en los m ecanis­ munoglobulina ha sido demostrada en anticuer­
mos de defensa de las m ucosas frente a los pos antipenicilina, antiinsulina y antitoxina dif­
agresores, especialmente bacterias y virus (in­ térica. De su importancia fisiológica se conoce
munidad local). Para mayor información, véan­ muy poco. Ha sido hallada como inmunoglobu­
se caps. 24 y 27. lina de membrana en linfocitos B, donde fun­
ciona como unidad de reconocimiento de antí­
geno en la respuesta inmune.
IN M U N O G LO BU LIN A D (IgD)
IN M U N O G LO BU LIN A E (IgE)
En el hombre, inicialmente fue hallada en un
caso de mieloma. Constituye el 1% de las in­ Investigaciones efectuadas en la década de
munoglobuhnas totales y su concentración en los 60’, han demostrado que el hasta entonces
98 Aspectos básicos de ¡a inmunidad
a circulación
general
Célula plasmática
denominado anticuerpo reagínico humano, res­
ponsable de la alergia atópiea, estaba localiza­
do en una nueva inmunoglobulina, a la que se
denominó IgE o gamma E la que migra en la
zona de la IgA.
Su velocidad de sedimentación en gradiente
de sacarosa es 7,8 S y su P.M. 185 kD. Por re­
ducción y alquilaeión se liberan cadenas H(e)
específicas (P.M. 72,5 kD) y cadenas L de tipo
K y A, de características similares a las otras ca­
denas L ya conocidas. Su estructura es
y predominan las que contienen cadenas
K (fig. 5-29). Se fija a piel homóloga, no así a
piel heteróloga, y es la responsable de la anafi­
laxia activa y pasiva homóloga en el hombre.
Se fija a tejidos de primates, hecho que ha sido
aprovechado para numerosos estudios experi­
mentales.
ss-
H(5).
SS
OHC
-SS
Fig. 5-28. P robable estructura de IgD.
F ig . 5-2 7 . B io sín tesis de
IgA secretoria.
%
i
(igA),S
Epitelio glandular
M ielom as identificados como de tipo IgE
han provisto material adecuado para completar
estos estudios.
Anticuerpos similares han sido reconocidos
en otras especies animales pero debido a su pe­
queña cantidad no han podido ser estudiados
inmunoquímicamente.
Una inm unoglobulina del cobayo que re s­
ponde a esas características ha sido aislada y
purificada por nosotros.
y La IgE reducida con mercaptoetanol pierde su
propiedad de inducir reacción anafiláctica, no
porque haya modificado su capacidad para unirse
al antígeno, sino porque la reducción de los
puentes S-S intercadenas H-H altera la capacidad
del fragmento Ec pai'a fijarse al receptor presente
en el mastocito o basófilo sanguíneo. La IgE ca­
lentada a 56°C se comporta de manera similar.
_
0 o o
1 X X
ü ü o
-S S
-SS .
o o
X X
o o

Mayor información sobre el comportamiento
de la IgE podrá hallarse en el capítulo 32.
Proteína de Bence-Jones
Sinonimia: gam m aglobulina microm olecu-
lar, yL globulina; 1,0-3,5 S y globulinas.
En la orina de mielomatosos se encuentra la
proteína de B ence-Jones, de peso m olecular
aproximadamente 40 kD y constante de sedi­
mentación 3,5 S, que da reacciones inmunose-
rológicas cruzadas con las inmunoglobulinas.
Se ha encontrado también que la orina normal
contiene vestigios de IgG y de gammaglobuli­
na de bajo peso molecular, de aproximadamen­
te 1,6 unidades de sedimentación, que antigéni­
camente y por sus propiedades fisicoquímicas,
aun para el ensayo del calor, se comportan co­
mo la proteína de Bence-Jones. Fueron halla­
das también en sueros humanos normales y se
las denomina y^ globulinas o microglobulinas.
Se han identificado dos tipos diferentes de
proteínas de Bence-Jones, con cuyos antisueros
pudo clasificarse a las inm unoglobulinas en
dos grupos. La profundización de estas investi­
gaciones ha permitido establecer que las proteí­
nas de Bence-Jones están constituidas por ca­
denas L y que contienen factores genéticos Km
y los determinantes antigénieos comunes pre­
sentes en las inm unoglobulinas. Se conocen
formas monoméricas de P.M. 23 kD, dímeros
de P.M. 45 kD y aun tetrám eros de P.M. 85
kD.
Experiencias efectuadas con radioisótopos
indican que el aum ento de las proteínas de
Bence-Jones en la orina, en los casos de mielo-
mas, no es una consecuencia de la exagerada
metabolización de la IgG mielomatosa sérica;
serían productos secundarios, colaterales, de la
síntesis globulínica. Su aumento en la orina en
estos casos se explicaría como una consecuen­
cia de la exagerada síntesis de la globulina
m ielom atosa por parte de clones de células
plasm áticas que han sufrido degeneraciones
t l 's s ^ L s s —I
o co
X X
O o
H (e ).
-SS L s s —J 1' l—s's —1
co co w
co co co
o I
X m
ü m
Fig. 5-29. Inm unoglobulina E (IgE).
Anticuerpos 99
malignas y han adquirido la capacidad de pro li­
ferar sin tasa, sin haber perdido el poder de sin­
tetizar la globulina normal. Las proteínas de
Bence-Jones son cadenas L libres que pueden
escapar como producto colateral y, como con­
secuencia de su bajo peso molecular, ser excre­
tadas por la orina, donde las formas diméricas
son las halladas con más frecuencia. D ada su
homogeneidad, estas proteínas han sido m uy
utilizadas para los análisis secuenciales de las
cadenas L (fig. 5-30).
Últimamente se ha demostrado que el ami-
loide de las amiloidosis está constituido por el
dominio V ,, mezclas de V, y C; y cadenas L
enteras. Esto aclara una serie de hechos, en es­
pecial los relacionados con la aparición de am i­
loidosis en los mielomas, ya que el amiloide no
sería más que producto de la degradación enzi­
mática de cadenas L.
En el cuadro 5-11 se encuentran resumidas
las propiedades más significativas de las inm u­
noglobulinas del hombre.
LOS HIDRATOS DE CARBONO
DE LAS MOLÉCULAS DE
INMUNOGLOBULINAS
Las inmunoglobulinas contienen hidratos de
carbono (heteropolisacáridos), que norm alm en­
te están localizados en las cadenas H. Las cade­
nas J, participantes de la polimerización de la
IgM e IgA, y el componente secretorio (CS) de
la (IgA)^S están glucosilados; no lo están, en
cambio, las cadenas L.
El contenido en hidratos de carbono v aría
para las diferentes clases de inmunoglobulinas,
o scilando esos valores entre 2% y 3% p ara
IgG, 7% y 11% para la IgA, 12% para la IgM ,
9% y 14% para la IgD y 12% para la IgE.
La unión de los hidratos de carbono puede
tener lugar por iV-glucosilación u 0-glucosila-
ción, siendo ésta muy poco frecuente en las in­
munoglobuhnas. En el primer caso ocurre por
O O O
X X
0 o
1 1 .
1—ss -J L s s —1
r T
ü 0 o
X 1 I
o o o
100 Aspectos básicos de ía inmunidad

cd
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Fluidos en los que está p resente O
‘3

.2 1
o oUt g '&
(U O
1—
i o 'c^3
00

Fijación a proteína G + + , + + + +
+ + + +

Fijación a proteína A + + 1+ + + +
+ + ' +

F ijación a polim orfonucleares neutrófilos + 1+ + + + 4-

Reacción con proteína A del S. aureus + + 1+ 1

i

Fijación a m acrófagos + í + í 1 1 1

Fijación a m astocitos heterólogos + 1+ + 1 1 1

*
Fijación 0 m astocitos hom ólogos 1 1 1

-o
P asaje placentario + + + 1 1

Fijación del com plem ento (vía alterna) 3 P

l i l i + + 1
§^

Fijación del com plem ento (vía clásica) í+ í 1 1 1 1

C antidad sintetizada (m g/kg/día) m

co CN
Vida m edia fdías) ^ O r-- -H 'O
CN r j (N
r- r- r-- r-
% de intravascular cataboUzada p o r día <N

lO CN
D istribución intravascular (%)
o o o o O O
C oncentración sérica (m g %) (N On0^ r- ^
00 (N
<DJS'O
2
^ 'ñ|-
D om inios de la cadena Fl
O O O O
o o o o
p q q q q q S o C
Peso m olecular de la cadena H (kD) \D C
vn VT) 'vO'T'i vn VT) \jT> Ij 1 .Í 3

Tipo de cadena H b a

ro ro co ro
Flidratos de carbono % (N CN CN r-1
3 “
3 *=: z3
Peso m olecular (kD)
\0 'O "O ''O T<3u ío
^^g
^ ^ ^ ^ S §
co
Coefic. sedim entación 00 00 00 00 00 00 00
!> i> i> r- r--
¿I ^ “
m (N ro ^ r-i fSj 3si
■~..o P
Subclase OOÜO < <
o OJ) bi) OX) b£)

es 6
s Clase <OJj H
o
O
U
 Anticuerpos 101

C u ad ro 5-12. Estructura de los oligosacári­

dos obtenidos de una mezcla de inmunoglobu­
linas de origen humano. /, ll, l l l y IV: estructu­
ra de diferentes “core ” hallados en conejo

Oligo.sacárido.s unido.'i a la.'i inm uno globulina.'^ po r N -g lu ­

cosilación

A) Tipo com plejo

N euA ca2^6G al(3 1 -4 G lc N ac P | -2 M a n a I

^4M aii|3¡~4G lcN acf3|

G lc N a c P i-
-4G lcN ac-A sn

NeuAca2-6GaiPi-4GlcNacP|~2Mana )

B) R ico en m añ osa
M a n a l- 2 M a n a K
'6
M ana 1 |-S-SR

M a n a l- 2 M a n a 1 ' ® í Monómero Dímero

M an P I -4 G lc N ac P | '4G lcN aC “A sn
3 ^
Fig. 5-30. P roteína de Bence-Jones,
M a n a 1-2 M a n a l-2 M ana 1 '

C) D iferentes “ C ore”
tán presentes en los poliósidos ni guardan las
M ana 1 ■ mismas relaciones inoleculares, aunque g en e­
ralmente lo hacen en una combinación p refe ­
M anP I-4 G lcN a cP (-4 G lc N ac -A sn
rencial, constituida por un oligosacárido neutro
- 3 ^
M ana 1 ^ o “core” y el resto del poliósido conform ado
por los restantes azúcares. Este polisacárido de
M ana U Fuca 1 tipo “complejo” se encuentra en todas las cla­
6 ' o ^
ses de inmunoglobulinas. En algunas de ellas
M an p |-4 G lc N a c P )-4 G lc N a c -A s n se han identificado unidades de hidratos de car­
3 5 bono “ricas en mañosa”, carentes de ácido siá­
lico y galactosa, las que son olivadas de la m o ­
lécula de inmunoglobulina por tratamiento con
6 I la enzima endo-(3-glueosidasa H (cuadro 5-12).
G lcN ac p I -4 M a n |3 1 -4G lcN ac(3 ] -4G lcN ac-A sn
III La glucosilación de las cadenas H y de las L
M ana 1
que tienen el aceptor Asn-X-Ser/Thr, norm al­
mente ocurre por transferencia a una cadena
M ana 1 Pu=« 1.
\ 6 'b j naciente del “core” de oligosacárido, a partir de
¡V G lc N a c P , -4 M a n P , -4 G lc N a c P , -4 G lc N ac -A sn
un lípido transportador, el dolicoldifosfato. La
^^3 I transferencia del “core” a una cadena H nacien­
M an a 1 te retrasa la elongación del polipéptido, dism i­
nuyendo su velocidad de síntesis, hecho que
contribuye a corregir el desequilibrio entre la
síntesis de cadenas H y cadenas L. Durante el
unión de un residuo de iV-acetilglucosamina al período de glucosilación, el “core” fijado es
amido grupo de una asparagina, el que debe es­ procesado y elongado por adición de azúcares
tar formando parte del triplete Asn-X-Ser/ Thr, terminales.
mientras que en el segundo la unión se produce Las unidades de hidratos de carbono están
por interacción entre un residuo de N-acetilga- localizadas principalmente en el fragmento Fe,
lactosamina o galactosa con el grupo oxidrilo y en algunos casos (IgM, IgE) han sido detecta­
de una serina o treonina. das también en el Fd. En condiciones normales,
Los azúcares identificados en los polisacári­ la IgG tiene una unidad por cada cadena H, y la
dos existentes en las diferentes inmunoglobuli­ unión ocurre en el dominio Cj2. La IgM tiene
nas han sido A-acetil-D-glucosamina, A^-acetil- un promedio de cinco oligosacáridos por cade­
D-galactosamina, ácido A-acetil-neuramínico, na ji,, cuatro en el Fe: (Cu^2:l; 0^3:2; C ^4 :l) y
L-fucosa, D-galactosa y D-manosa. No todos es- uno en el Fd (C|^l); la IgE tiene seis unidades
102 Aspectos básicos de la inmunidad
hidrocarbonadas, de las cuales tres están en el
do m in io C e l (Fd) y las re sta n te s en el Fe
(C g2:l; Ce3:2). En la IgA l se han detectado
unidades de oligosacáridos; cinco están en el
dominio C a l, una en el C qc2, una en el C(x3 y
una unidad ha sido localizada en la zona FRl
del dominio variable (V a). En la (IgAj^S, ade­
más de las unidades señaladas deben añadirse
otras dos, una correspondiente a la cadena J,
presente también en la IgM, y otra en el com­
ponente secretorio (CS). La IgD posee cuatro
unidades hidrocarbonadas en el dominio C51,
una en el C§2 y dos en el CgS.
Un residuo de A^-acetilglucosamina unido a
una treonina, ha sido identificado en la zona de
la bisagra de sólo una cadena y del 80% de las
moléculas de IgG de conejo. Parecería que en
esta glucosilación asimétrica el azúcar protege­
ría a la molécula de degradaciones biológicas,
impidiendo el acceso de las enzimas proteolíti­
cas a dicha zona. Sobre el particular resulta su­
gestivo el hallazgo en IgA e IgD de un residuo
azucarado similar, en la misma región.
Los análisis de proteínas de mielomas han
demostrado que cadenas H y L de diferentes
inm unog lobulinas que poseen la secuencia
A snX-Ser/Thr pueden presentar glucosilacio-
nes anómalas, que llegan a afectar diferentes
dominios, incluido el Fd.
Recientemente hemos podido demostrar que
los anticuerpos IgG no precipitantes (coprecipi­
tantes) de diferentes especies anim ales están
constituidos por moléculas funcionalmente asi­
métricas (cap. 19), debido a que un oligosacári­
do predominantemente rico en mañosa se halla
insertado en sólo uno de los Fab de la molécu­
la. Ese oligosacárido, que se encuentra unido al
fragmento Fd, es el que altera el sitio de com­
binación y hace que el anticuerpo tenga un
comportamiento biológico particular. La con­
canavalina A -lectina que interacciona con po­
lisacáridos con grupos m anosilo o glucosilo
terminales-, covalentemente unida a Sepharosa
(Con A-Sepharosa), fija esos anticuerpos.
Más curioso aun resulta el hecho de que
aproximadamente el 10% de las moléculas de
IgG normales del hombre y del conejo se fijan
a Con A-Sepharosa, y que el ohgosacárido in-
teractuante está localizado en el fragmento Fd
de sólo uno de los Fab. Al igual que en el caso
de los anticuerpos coprecipitantes, la unidad hi-
drocarbonada predom inantem ente es del tipo
“rica en mañosa”, y es clivada de la molécula
por tratamiento con endo-p-glucosidasa H.
Todavía no está claro cuál es la función que
cumplen los hidratos de carbono en la molécula
de los distintos isotipos de inmunoglobulinas.
En algunos casos parecería que juegan un papel
protector de la molécula al chvaje por enzimas
proteolíticas, dificultando la exposición de los
sitios de ataque. Hay datos experimentales que
hacen suponer que estos ohgosacáridos partici­
parían activamente en la secreción de las molé­
culas de anticuerpos. Si bien durante el pasaje
de la inmunoglobulina a través de los elemen­
tos membranosos de la célula hay incorpora­
ción de carbohidratos, ello no es prueba sufi­
ciente de la importancia de la glucosilación en
la secreción, ya que hay células plasm áticas
que sólo secretan cadenas L que carecen de hi­
dratos de carbono.
INMUNOGLOBULINAS DE
DIFERENTES CLASES DE
VERTEBRADOS
En distintas especies de vertebrados se han
descrito diferentes clases y subclases de inmu­
noglobulinas a las que se ha tratado de relacio­
nar con las identificadas en mamíferos, espe­
cialmente el hombre, dado que todas ellas tie­
nen un ancestro común (cuadro 5-13). El crite­
rio seguido ha sido el de comparar propiedades
fisicoquímicas y biológicas, tales como peso
molecular, movihdad electroforética, coeficien­
te de sedimentación, contenido en hidratos de
carbono, capacidad para fijar el complemento,
pasaje placentario, sensibilización de piel ho­
móloga y heteróloga, reactividad frente a sue­
ros específicos, etc. Pero esto no puede ser to­
mado como definitorio ya que en algunas espe­
cies de peces, reptiles y aves la ubicación de
las inm unoglobulinas aisladas resulta difícil.
En variedades de ranas se han descrito anti­
cuerpos de alto peso molecular, similares a la
IgM de mamíferos, que resultan de la conden­
sación de seis subunidades. En algunos peces,
como las carpas, estos anticuerpos son tetramé-
ricos. Si bien son similares, no puede decirse
con certeza que sean realmente IgM.
Una mayor definición se consigue a veces
comparando análisis secuenciales. Como ejem­
plo podría citarse el caso de la IgG (T) del ca­
ballo, considerada por mucho tiempo relacio­
nada con la IgA. Cuando se comparan los últi­
mos nueve residuos C-terminales de la cadena
H de esta inm unoglobulina y los correspon­
dientes a las cadenas y, a y )J, de IgG, IgA e
IgM humanas, no caben dudas de que su es­
tructura presenta similitud con la IgG (cuadro
5-14). Si bien la comparación de secuencias li­
mitadas en algunos casos es suficiente para la
diferenciación, en otros no lo es. En el cuadro
5-14 puede verse que los cuatro últimos resi­
duos C-terminales de IgA e IgM son idénticos
(Gly-Thr-Cys-Tyr).
Con respecto a la distribución de las cadenas
K y en las inm unoglobulinas de diferentes
animales, se ha observado que más del 95% de
 Anticuerpos 103

C uadro 5-13. Inmunoglobulinas de algunas especies de vertebrados

Especie Inm unoglobulinas

P eces 7S 14S, I9S

A nfibios IgG IgM
Reptiles 7S I9S
Aves 5 ,7 S ,7 S 19S
M am íferos
hom bre IgG l IgM IgA IgD IgE
IgG 2
IgG3
IgG 4

ratón Ig G l IgM IgA IgD IgE

IgG 2,
IgC 2,
Ig 0 3

rata Ig G l IgM IgA IgE

IgG 2
IgG2¡,
lgG 2,

cobayo Ig G l IgM IgA IgE

IgG 2

conejo IgG IgM IgA IgE

perro IgG IgM IgA IgE

vaca Ig G l IgM IgA IgE

IgG 2

caballo IgG , IgM IgA IgE

IgG ,
IgG ,
IgG (T)
IgB

oveja IgG l IgM IgA IgE

IgG 2

cabra IgG l IgM IgA IgE

IgG2

E n los casos en q u e sólo fig u ra n los c o e ficien te s d e sed im entación las in m u n o g lo b u lin as aisladas no están relacionadavS c o n las clases d e i n ­
m u n o g lo b u lin a s co n o c id as o n o se co n o c en dato s estructurales p a ra estab le cer re la cio n es.

las inmunoglobulinas séricas del caballo con­ bulinas involucradas en las distintas etapas de
tienen cadenas X, en tanto que no menos del la respuesta inmune, sobre todo si se tiene en
95% de las inmunoglobulinas del ratón contie­ cuenta que ambos animales poseen varias sub­
nen cadenas K. Es posible que ello sea conse­ clases de IgG y la distribución kJX no es la m is­
cuencia de las diferentes clases de inmunoglo­ ma para todas ellas.

C uadro 5-14. Análisis secuencial comparativo del nonapéptido C-terminal IgG, IgA e Ig M
humanas y de IgG (T) equina

Secuencia
Inm unogtoblinas
1 2 3 4 5 6 7 8 9

IgG hum ana -G lu - Lys - Ser - L eu •■Ser - Leu - Ser - Pro - G ly ■-C O O H
IgG (T) equina - Glu - Lys - A sn - Val ■- Ser - H is - Ser - Pro - Gly .-C O O H
IgA hum ana -M et .- A la - G lu - V al ■- A sp - G ly - Thr - Cys - Tyr ■- COOH
IgM hum ana - M et ■- Ser - A sx - Thr •- A sp - G ly - Thr - Cys - Tyr ■- C O O H
104 Aspectos básicos de la inmunidad
HOMOGENEIDAD
Y HETEROGENEIDAD
DE LAS INMUNOGLOBULINAS
Como ya indicáramos al comienzo del capí­
tulo, las inmunoglobulinas normales y los anti­
cuerpos no son homogéneos. A causa de ello,
en los análisis electroforéticos en acetato de ce­
lulosa a pE[ 8,2 se observa en la zona de corrida
correspondiente una banda ancha, más intensa­
mente teñida en el centro y difusa hacia los ex­
tremos. Esto se comprende fácilmente si recor­
damos que la carga neta de una proteína, que es
la que determ ina su m ovilidad en un campo
eléctrico, resulta de la suma de las cargas par­
ciales de cada uno de sus aminoácidos constitu­
tivos. Siendo estas cargas, como consecuencia
de la heterogeneidad, distintas para cada una de
las moléculas que componen las inmunoglobu­
linas norm ales, el cam ino a recorrer por las
mismas será diferente.
Si se hace una corrida electroforética en ge­
les de una IgG normal purificada y se separan
las zonas de mayor y menor movilidad, al co­
rrerlas nuevamente se observará que ambas se
desplazan de una manera diferente. Las cade­
nas L y H obtenidas de esas inmunoglobulinas
habrán de mostrar también distinta movilidad
electroforética, evidenciable en forma de ban­
das en gel de pohacrilamida.
Las proteínas de mielomas y sus respectivas
cadenas L y H generalmente muestran por co­
rrida electroforética una banda neta que corres­
ponde a la de una de las tantas moléculas cons­
titutivas de las inm unoglobulinas norm ales.
Las proteínas de Bence-Jones y cadenas L de
inmunoglobulinas de mielomas dan, por elec­
troforesis en gel de poliacrilamida, una o dos
bandas, las que corresponden a monómeros y
dímeros a diferencia de las 8 a 1 0 bandas que
se observan en las cadenas L de inmunoglobu­
linas normales y que obedecen a fenómenos de
carga.
En algunas proteínas de mielomas, no obs­
tante su homogeneidad constitutiva se ha ob­
servado más de una banda electroforética. La
causa de ello no es bien conocida. Experiencias
realizadas in vitro con cultivos de linfocitos
provenientes de ratones portadores de mielo-
mas permitieron comprobar que la inmunoglo­
bulina recientem ente sintetizada, que era ho­
mogénea, si se la marcaba con un átomo ra­
diactivo y se la inoculaba a otro ratón de la
m ism a endocría, se volvía heterogénea en el
suero, dando por electroforesis en geles hasta
cinco bandas. Ello ha hecho que la heteroge­
neidad electroforética observada en proteínas
de mieloma sea atribuida a variaciones de car­
ga eléctrica, causadas por la acción sobre aqué­
llas de enzimas séricas, que provocarían pérdi­
das de grupos lábiles que no producirían dife­
rencias en la estructura secuencial primaria, co­
mo ácido siálico, grupos amido, etcétera.
La heterogeneidad puede deberse también a
distintas glucoformas del péptido que contie­
nen diferentes restos hidrocarbonados, como
consecuencia de la acción de distintas gluco-
transferasas.
LOS SITIOS ACTIVOS DE
LAS MOLÉCULAS DE
INMUNOGLOBULINAS
Edelm an, al considerar la hom ología exis­
tente entre los fragmentos constitutivos de las
cadenas L y H como consecuencia de la forma­
ción de puentes disulfuro que originan bucles
de aproxim adam ente 60 residuos cada uno,
propuso la división de la molécula de inmuno-
globuhna en dominios, identificados como V,
y V (variables) y C ,, Cj_, 1 , y C^,3 corres­
pondientes a las zonas constantes, pivoteando
la molécula en la zona denominada gozne o de
la bisagra, ubicada en las proximidades de los
puentes disulfuro intercadenas H-H, la que no
muestra homología con ninguna otra parte de la
cadena peptídica H. Esta zona es rica en resi­
duos de prolina, aminoácido incapaz de formar
una hélice a porque su átomo de nitrógeno for­
ma parte de un anillo rígido y no es posible la
rotación del enlace N-C. Esta interrupción de la
hélice a origina un rizo o curvatura en la cade­
na peptídica, que condicionaría la flexibilidad
de los fragmentos Fab (fig. 5-31). Los dom i­
nios de las inmunoglobulinas están separados
entre sí por cadenas peptídicas de 60-70 resi­
duos, siendo la correspondiente a la zona de la
bisagra de mayor tamaño. Se considera que ca­
da dominio tiene una estructura tridimensional
similar y que origina un sitio activo relaciona­
do con diferentes funciones de la molécula. El
dominio variable participa en la formación del
sitio de combinación o paratope del anticuerpo,
responsable de la especificidad, mientras que
los dominios ubicados en las zonas constantes
son efectores de funciones, algunas de las cua­
les sólo se expresan después de la interacción
antígeno-anticuerpo.
Los estudios sobre estructura tridimensional
de las inmunoglobulinas efectuados por difrac­
ción de rayos X han demostrado que son pro­
teínas multiméricas con subunidades globula­
res (dominios), formadas cada una de ellas por
aproxim adam ente 1 1 0 am inoácidos, los que
despliegan un perfil común de plegamiento tri­
dimensional (“folding”). La estructura secun­
daria predominante de estas subunidades es la
de hoja antiparalela plegada en |3 (“p pleated
sheef’). Cada subunidad contiene dos hojas pa­
 Anticuerpos 105

Inmunoglobulina
IgG

Fig. 5-31. D om inios de la IgG .

ralelas formando un “sandwich” o emparedado, inmunoglobulinas, a causa de su mayor tam a­

constituida cada hoja por 3 o 4 fibras antipara­
lelas de aminoácidos. El volumen interno está
formado por un empaquetamiento de sitios hi­
drofóbicos. Alrededor del 50% de los aminoáci­
dos de las inm unoglobulinas están formando
parte de esta estructura. Las dos hojas plegadas
en P se hallan covalentemente unidas por un
puente S-S intracatenario, en una dirección
aproximadamente perpendicular al plano de las
hojas. Las diferentes fibras están unidas entre sí
por segmentos en “P turn” o codos (fig. 5-32).
Varias de las proteínas presentes en superfi­
cies celulares que participan en el reconoci­
miento del antígeno, como el receptor de los
linfocitos T (RCT), el complejo CD3, las molé­
culas Ig a e Igp asociadas al receptor de los lin­
focitos B, incluidas dentro de la denominada
“superfamilia de las inm unoglobulinas”, p re­
sentan esta estructura.
En las IgM e IgE existe un dominio Cj^4, co­
mo consecuencia de que las cadenas H de estas
ño, poseen cinco bucles por cadena. El nuevo
dominio en estas cadenas no está insertado d es­
pués del Cj,3, sino que está ubicado entre los
dominios C^l y C,.,2 correspondientes a las ca­
denas H de las otras inmunoglobulinas.
Estudios recientes de difracción de rayos X,
realizados con inm unoglobulinas IgG m o n o ­
clonales cristahzadas, muestran que los dom i­
nios V„-Vj^ presentan una estructura tridim en­
sional estable que se adapta a su función de si­
tio de combinación con el antígeno. Los dom i­
nios Cj^ 1 y C,.,3 de una cadena H se encuentran
apareados con los de la cadena opuesta, en fo r­
ma entrecruzada, dando lugar a una estructura
rígida. Los dominios C,.,2, en cambio, no se e n ­
trecruzan y se encuentran separados por dos ca­
denas ramificadas de hidratos de carbono —una
en cada dom inio- de aproximadamente 2 0 uni­
dades, unidas por A^-glucosilación. La estractu-
ra particular de esas cadenas es la que hace que
los dos dominios Cj^2 de la molécula se m an­
 106 Aspectos básicos de la inmunidad
Cadena L
F ig . 5-32. Estructura de lám ina plegada en p de los dom inios variable (V L) y constante (CL) de una cadena L. (A daptado
d e M . Schiffer y col., Biochem istry, 12:4620, 1973.)
tengan separados, con la suficiente flexibilidad
com o para perm itirle cum plir determ inadas
funciones (fig. 5-33).
F ig , 5 -3 3 . E s tru c tu ra esq u e m á tic a de u n a m o lécu la de
IgG , con sus dom inios, elaborada sobre la base de los da­
tos conocidos, especialm ente los provenientes de estudios
cristalográficos (C^HO hidratos de carbono).
Sitio de combinación de los anticuerpos
En las inmunoglobulinas los fragmentos Fab
son los portadores de la actividad anticuerpo,
en tanto que el Fe es el responsable de las otras
propiedades biológicas inherentes a la molécu­
la entera.
En lo referente a la actividad anticuerpo, el
problema que se planteó era saber; a) si ello era
consecuencia del plegamiento proteico o de la
secuencia de sus aminoácidos constitutivos; b)
si estaba localizada en las cadenas L o FI, si
ambas participaban de esa actividad y cuáles
eran los fragmentos comprometidos; c) si el si­
tio de combinación era uniespecífico o pluries-
pecífico y d) cuál era el tamaño aproximado de
dicho sitio.
Diferentes hipótesis se plantearon
a) La hipótesis sostenida inicialm ente por
Haurowitz de que la actividad anticuerpo era
consecuencia de una adaptación de la inmuno-
globulina al determinante antigénico producida
durante su plegamiento dejó de tener vigor des­
de el momento en que se demostró, en un m is­
mo animal, la heterogeneidad de los anticuer­
pos para distintos determinantes antigénieos.
Lo mismo ha ocurrido con la sustentación de
Karush de que ella sería consecuencia del reor­
denamiento de los puentes S-S que forman par­
te de la molécula, ello sobre la base de que su
número es de 20-25 y posibilitaría, estadística­
mente, la elaboración de más de 1 0 * moléculas
diferentes. El hecho de que el fragmento Fab
tenga actividad anticuerpo y los S-S que con­
tiene sean mínimos con respecto al total, res­
 Anticuerpos 107

tringe enormemente el ntimero de anticuerpos trar que la capacidad de unir ligando se encon­
diferentes que podrían lograrse. Además, ac­ traba principalmente en las cadenas H. El expe­
tualmente se sabe que una molécula de inm u­ rimento desarrollado en este sentido por M etz­
noglobulina reducida y alquilada, que no posee ger y Singer consistió en reducir con mercap-
uniones covalentes de S, sigue manteniendo su toetanol y alquilar con iodoacetamida la IgG
actividad anticuerpo. anticuerpo, que luego fue dializada en ácido
Todo esto hizo suponer, teniendo en cuenta propiónico 1 M, mezclada con e DNP-lisina y
las diferencias estructurales observadas entre filtrada por una colum na de Sephadex G -75
los anticuerpos, que su especificidad estaba re­ equilibrada con ácido propiónico 1 M que co n ­
lacionada con su estructura secuencial, la que a tiene 8 DNP-hsina 6 x 10 '^ M. La absorbancia
su vez determinaría qué fuerzas termodinámicas de los productos de elución fue medida a 280
obligarán a la molécula a adquirir una configu­ nm y 360 nm. Como control se efectuó una e x ­
ración energéticamente estable, que le permiti­ periencia análoga sustituyendo el anticuerpo
ría a ésta cumplir con su función específica. antiDNP por IgG normal de conejo. Las lectu­
b) Los exámenes electroforéticos en gel de ras espectrofotométricas a 280 nm de los elu i­
almidón de inmunoglobulinas normales de co­ dos permitieron ubicar los picos proteicos c o ­
bayo y anticuerpos con diferente especificidad, rrespondientes a las cadenas H (el que eluye en
previamente reducidas y alquiladas, mostraron primer término) y las cadenas L. Las lecturas a
diferencias que hicieron suponer en un comien­ 360 nm hicieron posible la ubicación de la E
zo que las cadenas L fuesen responsables de la DNP-lisina por ser máxima su absorción a esta
actividad específica. longitud de onda. Como puede verse en la fig u ­
A partir de IgG (T) de caballo, neutralizante ra 5-34, la cantidad máxima de ligando está fi­
de la toxina diftérica y de anticuerpos antitetá­ jada en las cadenas H, mientras que es insigni­
nicos y antilecitinasa del mismo tipo, se pudo ficante en las L. Las cadenas H y L de IgG n o r­
demostrar que la ruptura de los puentes S-S de mal no muestran fijación de ligando.
la molécula por reducción y alquilación no m o­ Por estudios de recombinación de cadenas L
d ificab a su activ id ad anticu erp o . A dem ás, y H se ha podido demostrar que hay comple-
cuando se separaron las respectivas cadenas L mentación entre ellas, que es más m anifiesta
y H, se comprobó que gran parte de dicha acti­ cuando derivan de una m ism a m olécula de
vidad estaba localizada en las cadenas H, la IgG, segíin se deduce de los ensayos competiti­
que era potenciada por cadenas L provenientes vos y no competitivos que a continuación se
de la mism a molécula, no así por cadenas L transcriben. A partir de dos IgG homogéneas,
procedentes de otra inmunoglobulina de la m is­ IgG(“) e IgG*'’^ se obtuvieron sus respectivas ca ­
ma clase, pero eon diferente especificidad. Las denas L y H (HW, H'W y U '’>) y con esos
cadenas L, por su paite, prácticamente carecían productos se efectuaron ensayos de recom bina­
de actividad anticuerpo. Todo esto hizo supo­ ción con los siguientes resultados:
ner que la especificidad estaba localizada en
una determinada secuencia de las cadenas H,
Tipo C adenas % de Ig G
que sería com plem entada por las cadenas L, de ensayo recoinhinadas ¡gG fo rm a d a ob ten id o
asegurando de ese modo estabilidad al sitio de
combinación. H («) + L <■» H (“>L <“) 80
Que en la fijación del determinante antigéni­ N o com petitivo
H <“) + L <»> HwL 80
co intervienen principalmente las cadenas H, se
deduciría de los estudios de equilibrio de diáli­ H <"> L I» 65
sis de cadenas L y H aisladas de IgG anti-p-azo- H (“) + L » + LW
fenil-p-lactósido y hapteno monovalente desa­ H w L <>
’) 20
C om petitivo
rrollados por Karush en los que se demostró una H <» L <"> 20
mayor afinidad de las cadenas H por el ligando. H «w + L <») + L<w
En este caso, el aislamiento de las cadenas H, H <») L <1» 65
después de la reducción y alquilación, fue he­
cho por filtración a través de Sephadex G-200
usando buffer Tris IM pH 8 , adicionado de do- Trabajando con anticuerpos IgG obtenidos
decil sulfato de sodio 0,03 M, lo cual evita el del mismo conejo, con igual especificidad pero
agregado de cadenas H que generalm ente se de distinta afinidad, se comprobó que, al re-
produce a pH ácido, base de algunas de las críti­ combinar cadenas H y L, las moléculas form a­
cas a los resultados obtenidos por otros autores das de mayor afinidad para el antígeno eran las
que no habían tenido en cuenta este hecho. obtenidas con cadenas H y L procedentes de
Aprovechando que anticuerpos de conejo an­ anticuerpos de alta afinidad, y que ella era infe­
ti-DNP de alta afinidad pueden fijar hapteno rior cuando la IgG de recombinación provenía
(e DNP-lisina) a pH ácido, fue posible demos­ de cadenas H obtenidas de anticuerpo de alta
108 Aspectos básicos de la inmunidad
F ig . 5-34. G raficación de los picos de elución correspondientes a proteínas (DO 280 nm ) y D PN -lisina (D O 360 nm ) de
Ig G de conejo norm al (-----) y anti D PN (— ) reducidas y alquiladas y filtradas por Sephadex G-75 equilibrado con ácido
propiónico 1 M y D N P-lisina 6 x IO'*M.
afinidad y cadenas L de baja afinidad. Ello es
una prueba evidente de la com plem entación
entre las cadenas El y L en la elaboración del
sitio da combinación con el antígeno, y que esa
complementación es más efectiva entre las ca­
denas H y L de una misma molécula.
Que la complementación entre dos cadenas
es fundamental para la elaboración de la estruc­
tura tridimensional que cumple las funciones
de sitio de combinación lo da el hecho de que
dímeros de cadenas L pueden fijar ligandos. En
la molécula de anticuerpo, esa complementa­
ción tiene lugar entre los fragmentos V, y Vj,.
El interrogante que surgió es si hay residuos
particulares del sitio de combinación compro­
metidos en la determinación de la especificidad
y en la conformación de esa estructura comple­
mentaria a la del ligando, que asegure la pro­
ducción de una unión firme con éste mediante
la creación de diferentes tipos de fuerzas no co­
valentes estables.
Respecto de los posibles residuos compro­
metidos en la elaboración del sitio de combina­
ción, se ha podido determinar, analizando anti­
cuerpos de conejo antiovoalbúmina, antíseroal-
búmina bovina y antifenilarzonato que, al m e­
nos en estos casos, un aminoácido capaz de fi­
jar iodo radiactivo, identificado luego como un
residuo de tirosina, form a parte del sitio de
combinación. Ello ha sido posible por iodación
mediante la técnica diferencial, que consiste en
marcar el anticuerpo purificado con y con
'^'í al mismo anticuerpo previamente mezclado
con el hapteno, el que ha sido modificado de
modo que pueda dar con algún residuo del sitio
de combinación una unión covalente estable.
Se mezclan luego los dos productos marcados
y se procede a la separación de las cadenas L y
El, las cuales son sometidas a digestión tríptica.
Los péptidos obtenidos son separados por cro­
matografía en placa y electroforesis de alto vol­
taje combinadas (mapas peptídicos), determi­
nando en cada uno de ellos el contenido en '^^1
100 15 0 200 250
y '^'I y estableciendo la relación Para
aquellos que demuestren radiactividad y no es­
tén comprometidos en la elaboración del sitio
de combinación, esa relación será próxima a la
unidad, siendo superior en el caso contrario.
Ello se debe a que, como consecuencia de su
interacción con el hapteno, el péptido que for­
ma parte del sitio de combinación es inaccesi­
ble al '^'I durante la iodación. El análisis se­
cuencial posterior de ese péptido ha permitido
tener conocimiento de algunos de los residuos
de las cadenas L y H que participan en la unión
del anticuerpo al antígeno.
No obstante esos resultados, hasta el presen­
te no existen argumentos válidos que muestren
que uno o más residuos particulares tengan par­
ticipación activa en la elaboración del sitio de
combinación de todos los anticuerpos.
Los estudios comparativos sobre variabili­
dad de cadenas L y H de inm unoglobulinas
monoclonales de diferentes clases y especies
animales, y de las provenientes de anticuerpos
homogéneos logrados en conejos por inocula­
ción de algunos poliósidos, entre ellos los de
neumococo tipo III (S-III) y tipo VIII (S-VIII),
son los que han suministrado la mayor infor­
mación sobre posibles relaciones entre residuos
y especificidad. En los fragm entos V^ y V,_,
pueden observarse variaciones ocasionales, al­
ternativas y múltiples. Las primeras responden
a variabilidad originada por mutaciones somá­
ticas, la segunda a alotipos y la tercera muy
probablemente a la relación de dicho residuo
con la elaboración de la especificidad del sitio
de combinación del anticuerpo. Como puede
verse en la figura 5-35, el grado de variabilidad
(número de aminoácidos diferentes en una de­
terminada posición/frecuencia del aminoácido
más común en esa posición) de las cadenas L
es máximo en las zonas de los residuos 24-34,
50-56 y 89-97. Analizando cadenas L de anti­
cuerpos anti-DNP y de proteínas de mieloma

Cadenas L
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
O m úi
o 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Posición de ios am inoácidos
F ig . 5-35. Z onas de hipervariabilidad de cadenas L y H de origen hum ano. Las flechas verticales indican residuos s itu a ­
dos en las zonas de hipervariabilidad o próxim os a ella, y en los que m ediante estudios de afinidad se h a dem ostrado la
unión a haptenos. (Tom ado de C apra, J. D. y Edm unson, A. B. Scientific Am erican, 1977.)
de ratón con actividad anti-DNP, se encontró
que en el primer caso el residuo 87 fijaba hap­
teno y en el segundo el residuo 32, situado este
liltimo en la primera región hipervariable y el
primero muy próximo a los residuos que cons­
tituyen la tercera región de hipervariabilidad.
En las cadenas H, regiones de mayor variabili­
dad están com prendidas entre los residuos
31-35, 50-65 y 95-102, similares en su ubica­
ción a las de las cadenas L.
Las zonas de hipervariabilidad determinan­
tes de complementariedad se identifican como
C D R l, CDR2 y CDR3 (complementarity de-
termining región) y F R l, FR2, FR3 y FR4 (jra-
meworií) a las zonas invariables interpuestas
entre ellas, que sirven para su organización.
- Estudios de estructuras prim aria y trid i­
mensional de anticuerpos revelan que los ami­
noácidos Tyr, His y Asn tienen cierta prepon­
derancia a formar parte de los CDR.
Es evidente que en las cadena L y H dos de
las zonas de marcada hipervariabilidad se en­
cuentran ubicadas posteriormente y próximas a
los residuos de cisteína (23 y 8 8 para las cade­
nas L y 22 y 92 para las cadenas H), que son
los que originan el puente disulfuro que da lu­
gar al bucle de la región variable de ambas ca­
denas. Esta simetría en la localización de las
zonas de hipervariabilidad de las cadenas L y
H provee la estructura tridimensional del sitio
de combinación, el que contiene los residuos
complementarios para su unión al determinante
antigénico.
- Si bien la unión al antígeno involucra a los
fragmentos CDR del Fab, en ocasiones resi­
duos de los fragmentos FR pueden estar com ­
Anticuerpos 109
Cadenas H
100
90
80
ii l .1- i si
70
60
50
40 —
30
20
10
O 1
O 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Posición de ios am inoácidos
prom etidos en estas interacciones. Se ha d e ­
mostrado, entre otros, que los residuos Trp 47-
H (HyHEL-5) y Thr 30-H (HyHEL-10) co m ­
ponentes de los FR de los respectivos anticuer­
pos, interaccionan con la hsozima.
Como quedara especificado al referirnos a la
estructura de cadenas L, existen residuos fijos
de ghcina. En la posición 99-101 la secuencia
más común es Gly-Gln-Gly o Gly-Gly-Gly. En
las cadenas H hay dos glicinas situadas en la
misma posición y las secuencias más comunes
son Gly-Gln-Gly, Gly-Arg-Gly o GlyGly. Se
considera que, dada su posición, podrían fu n ­
cionar como pivote para permitirle a esa zona
de la m olécula el máximo de flexibilidad de
modo de asegurar un buen contacto del antíge­
no con el sitio de combinación del anticuerpo.
La figura 5-36 esquematiza la zona variable del
fragmento Fab (Fy) donde puede verse la u b i­
cación de las regiones de hipervariabilidad.
Los aminoácidos con cadenas laterales aro ­
máticas constitutivas de los CDR pueden co n ­
tribuir significativamente en la unión al ligando
como consecuencia de su mayor tamaño - l a
que im plica un mayor efecto hidrofóbico--, su
mayor polarización -co n una mayor contribu­
ción a la interacción por fuerzas de Van d er
W aals-, y su habilidad para formar puentes de
hidrógeno - a través de sus anillos aromáticos o
de átomos polares en las cadenas laterales y,
además, por su relativa rigidez ya que tienen
pocos grados de libertad y, como consecuencia
una menor pérdida de entropía conformacional,
luego de la complejación con el ligando.
Las cadenas alifáticas apolares laterales de
Val, íle y Leu son incapaces de participar en
110 Aspectos básicos de la inmunidad
H,N NH,
F ig . 5-36. Sitio de com binación. E structura del fragm ento
v ariable de las cadenas L y H; ubicación de las respectivas
zonas de hip e rv ariab ilid a d y de los resid u o s de cisteína
(véase texto).
interacciones iónicas y sólo pueden hacerlo en
la unión al ligando a través de interacciones de
Van der W aals y de efecto hidrofóbico. T e­
niendo en cuenta su grado de libertad rotado-
F ig . 5-37. D iagram a del esqueleto de los carbonos a del
com plejo lisozim a-Fab (anticuerpo m onoclonal anti-lisozi-
ma). En el fragm ento Fab (parte superior derecha), la cade­
na H está indicada con trazo grueso, y con trazo delgado la
correspondiente a la cadena L, E n la parte inferior izquier­
da, adosada al sitio de com binación, está ubicada la lisozi­
ma. (C orresponde al estudio tridim ensional de un com plejo
antígeno-Fab, analizado por difracción de rayos X. R. Pol-
ja k y col., 1986. G entilm ente cedida por .su autor.)
nal, que puede ser congelado después de la for­
mación del complejo Fab-ligando, estos am i­
noácidos tienen una contribución negativa en
esta unión.
Las Asp están involucradas en la formación
de puentes de hidrógeno y resultan más efecti­
vas cuando están localizadas en los CDR que
en los FR. Se supone que podrían participar en
la estabilización de los bucles o “loops”.
La alta incidencia de residuos aromáticos ex­
puestos, así como el carácter apolar de las ca­
denas alifáticas laterales en parte de la superfi­
cie del Fv, darían lugar a una estructura com­
pacta que le conferiría a la molécula su capaci­
dad para unir diversos ligandos. La especifici­
dad para un determinado antígeno provendría
de la precisa complementariedad de las superfi­
cies interaccionan tes y de la correcta posición
de los posibles grupos reactivos.
La variabilidad de las cadenas L, y conse­
cuente creación de diversificación, resulta de la
asociación de genes VI y JL (véase cap. 6). D i­
cha asociación genera diversidad en la tercera
zona de complementariedad (CDR3). Investi­
gaciones recientes realizadas por Kimberly y
Capra con transcriptos de cadenas L de tipo k
generados con hígado fetal humano y linfocitos
de sangre periférica, han demostrado que apro­
ximadamente un tercio exhibía una variación
de la longitud de CDR3, independiente del seg­
mento génico J k usado. El análisis de la se­
cuencia de nucleótidos, reveló que algunos de
los nucléotidos resultantes de la unión V k -J k y
que presentaban variaciones de CDRS, eran co­
dificados por los genes V k y J k usados en estos
transcriptos. No obstante, cerca del 20% de los
transcriptos contenían adiciones de segmentos
N-terminales, resultados coincidentes con una
actividad sim ilar a la TdT (deoxinucleotidil
transferasa terminal). Esas observaciones su­
gieren que TdT o una enzima análoga podría
ser activada en un porcentaje significativo de
linfocitos B humanos durante el rearreglo de
las cadenas L (véase cap. 2). Las variaciones en
la longitud de CDR3 en las cadenas L aumenta
el repertorio potencial y constituye una posibi­
lidad adicional de generar diversificación en la
molécula de anticuerpo.
De acuerdo con estudios de Padlan, del total
de la superficie de los CDR del Fv, sólo el
26,5% y 28,4% es usado en la unión con el an­
tígeno por los anticuerpos anti-lisozim a Hy-
HEL-5 y HyHEL~10, respectivamente. Los re­
siduos de los CDR que contactan con el ligan­
do representan sólo el 37,0% y 35,8% del nú­
mero total de residuos de los CDR.
Con respecto a los CDR3-L y CDR3-H se
presume que deben jugar un rol prominente, no
sólo en la unión al ligando, sino también en la
unión con el dominio opuesto y en el contacto
 Anticuerpos 111

con otros CDR. Probablemente no sea coinci­ llo, sino que es una superficie que presenta p ro ­
dencia que los dos CDR3 presentan el máximo tuberancias y depresiones con posibilidades de
de variabilidad y que CDR3-H sea quien presu­ interacción con diferentes ligandos. La mayor o
me la mayor variabilidad en tamaño y confor­ menor posibilidad de cpe el sitio de combina­
mación, como lo han demostrado recientemen­ ción se una a ligandos diferentes dependerá del
te Wu y colab. balance entre las fuerzas de unión y de repul­
c) Otro hecho que se debe considerar es la sión que se originen en esas interacciones, d on­
uniespecificidad del sitio de combinación del de muchas veces un único residuo aminoaeídi-
anticuerpo. La pregunta que se formula es si las co del ligando o del sitio de combinación del
zonas de hipervariabilidad de una determinada anticuerpo puede jugar un papel importante.
molécula configuran especificidad para un solo Por ello, la especificidad de un suero inmune
ligando, o si en el sitio de combinación existen debe ser considerada como un fenómeno de la
subsitios para más de uno de ellos. Estas dudas población total de moléculas de anticuerpos y
surgen después de haberse demostrado, en pro­ no necesariamente la propiedad de cada m olé­
teínas monoclonales provenientes de mielomas cula de inmunoglobulina.
humanos y de ratón, la capacidad de algunas de Estudios desarrollados por Poljak y col. so­
ellas para fijar más de un ligando. La IgM (K) bre estructura tridimensional de un com plejo
EH, aislada de un paciente con macroglobuli­ Ag-Ac cristalizado (lisozima de huevo de co-
nemia de Waldenstrom, por ejemplo, fija gru­ dorniz-antilisozima) y del mismo antígeno con
pos dinitrofenol, grupos nitronaftil, ADN des­ el correspondiente fragmento Fab, hechos por
naturalizado, ARN, heparina, sulfato de dextra­ difracción de rayos X a una resolución de 2,8
no, ácido poliestirensulfónico, ácido ribitol tei­ A, muestran aspectos muy interesantes. La es­
choico y polímero ribosa-fosfato de origen bac­ tructura terciaria del antígeno lisozima, d e s­
teriano. La IgAj 460 de ratón fija DNP-lisina y pués de reaccionar con el Fab no presenta cam ­
menadiona (vitamina Kj), haptenos no relacio­ bios conformacionales respecto de la lisozim a
nados. En este caso se ha demostrado que, por nativa, y se comporta como un determ inante
modificaciones químicas introducidas en el si­ antigénico topográfico en el que participan re ­
tio de combinación, es posible conseguir que la siduos ubicados en diferentes partes de la m o ­
capacidad ligante sea para el grupo DNP o vi­ lécula, algunos bien distantes entre sí. Estos e s­
ceversa. Si bien esto sugeriría en forma indi­ tudios muestran además que la estructura cua­
recta la existencia de subsitios no continuos pa­ ternaria del sitio de combinación del anticuer­
ra estructuras de determinantes antigénicos no po, no constituye un simple bolsillo en el que
relacionados, en inmunoglobulinas monoclona­ se insertaría el epitope y en cuya formación in ­
les provenientes de mielom as, estos estudios tervendrían las regiones determinantes de com ­
deben ser extendidos a poblaciones de an ti­ plem entariedad de los fragm entos v ariables
cuerpos para obtener respuesta definitiva. En (CDR), sino que se extendería a lo largo de
un comienzo se hipotetizó (Richards y Konigs- ellos como una superficie plana con protube­
berg) que podrían existir diferentes células for­ rancias y depresiones originadas por las cade­
madoras de anticuerpos que originarían inm u­ nas laterales. Un área extensa del antígeno se
noglobulinas con sitios de combinación m últi­ pone en co ntacto con el Fab, y lo hace de
ples, no iguales, en los que la especificidad pa­ acuerdo con la topografía de ambos. Las protu­
ra un ligando podría estar repetida en varias de berancias y depresiones del ligando y del anti­
ellas. Por estim ulación antigénica se origina­ cuerpo facilitan el contacto y las interacciones
rían inmunoglobulinas diversas con especifici­ entre los residuos para formar las uniones no
dad para ligandos distintos (no esencialmente covalentes, de una manera similar a lo que o cu ­
los mismos en cada molécula), pero todos eon rre en las interacciones proteína-proteína. En el
especificidad para el antígeno inductor. Ello sistema estudiado, 16 residuos de la lisozima y
haría que en una población de moléculas de an­ 17 residuos del Fab hacen contacto, correspon­
ticuerpos para un ligando todas tuvieran espe­ diendo 10 de ellos a la cadena H. La m ayor
cificidad para éste, y que la relacionada con los parte de esos 17 residuos están ubicados en la
restantes se viera diluida como consecuencia tercera zona de hipervariabilidad (CDR3).
de la participación de clones múltiples. En algunos casos la simple sustitución de un
Estas especulaciones fueron hechas conside­ aminoácido en el antígeno varía enormemente
rando el sitio de combinación como un bolsillo, la especificidad, como se ha observado en liso-
con varios subsitios, y que cada ligando para zimas de huevo de distintas especies animales
interaccionar tendría que insertarse en él. In ­ cuando reaccionan con el fragmento Fab del
vestigaciones recientes que se describen más anticuerpo monoclonal específico para la liso ­
adelante, desarrolladas con anticuerpos mono­ zima de huevo de codorniz. Este hecho y otros,
clonales, muestran que el sitio de combinación como la diferente afinidad de anticuerpos espe­
del anticuerpo con el antígeno no es un bolsi­ cíficos para un m ism o ligando, las bases e s ­
112 Aspectos básicos de la inmunidad
tructurales de las reacciones cruzadas de un an­
ticuerpo con antígenos heterólogos, los anti­
cuerpos heteroclíticos y las reacciones idiotipo-
antiidiotipo, son fácilmente entendibles con el
modelo de sitio de combinación del anticuerpo
descrito por estos autores. Estudios hechos por
Padlan y col. con diferentes anticuerpos mono­
clonales específicos para hsozima de clara de
huevo, permitieron demostrar que, para el mis­
mo ligando (lisozima), los aminoácidos de los
Fab que interaccionan con el antígeno no son
los mismos para los distintos anticuerpos (cua­
dros 5-15A y 5-15B).
La figura 5-37 corresponde a un diagram a
del esqueleto de los carbonos a del complejo
lisozima-Fab antilisozima, y la figura 5-38 a
esa misma interacción con indicación de los re­
siduos del ligando y hgante que interaccionan.
A diferencia de lo que se suponía, se ha
comprobado que los paratopes o sitios de com­
binación con el antígeno no adoptan múltiples
conformaciones surgidas al azar como conse­
cuencia de sus aminoácidos constitutivos. Tra­
bajando con varias inmunoglobulinas monoclo­
nales se demostró que usarían para cada región
variable CDR sólo unas pocas conformaciones
a las que se denomina “estructuras canónicas”,
las que estarían determinadas por un reducido
número de aminoácidos ubicados en sitios es­
pecíficos de las zonas hipervariables. Esas es­
tructuras básicas son las que se indican en la fi­
gura 5-39.
d) Una apreciación sobre el tamaño del sitio
de combinación de un anticuerpo fue inicial­
mente lograda por ensayos de inhibición, ha­
biendo resultado útiles en este sentido los anti­
cuerpos antidextrano (poli-D-glucosa), antipo-
lialanina y DNP-polilisina.
La inhibición de la interacción específica an­
tígeno-anticuerpo por oligosacáridos y oligo-
péptidos, medida al 50% de efectividad, permi­
tió comprobar que aquélla se consigue con oli-
gómeros de 5 a 6 residuos. En el caso del DNP
(lisina)n se ha observado que el máximo de in-
F ig . 5 -3 8 . E n el m o d e lo q u e se
m u e s tra lo s á to m o s d e l a n tíg e ­
n o ( li s o z i m a ) y d e l F a b a n t i ­
c u e rp o e s tá n r e p r e s e n ta d o s en
su t o ta l id a d c o m o e s f e r a s d e
1,7 Á d e r a d io . A-. e s tr u c tu r a
d e l c o m p le jo a n tíg e n o F a b ( a n ­
t ic u e r p o ) , L a s c a d e n a s H d e l
f r a g m e n to F a b e s tá n c o l o r e a ­
d o s en a z u l, y e n a m a r illo las
c a d e n a s L, L a lis o z im a e s tá c o ­
l o re a d a en v e rd e y su r e s id u o
G ln 1 2 1 , q u e j u e g a u n p a p e l
m u y im p o rta n te e n la e s p e c ifi­
c id a d , e n ro jo , B : lo s m o d e lo s
c o rr e s p o n d ie n te s a l is o z im a y
al F a b h a n s id o s e p a ra d o s p a ra
m o s t r a r la s p r o t u b e r a n c i a s y
d e p re s io n e s en las s u p e rf ic ie s
c o m p le m e n ta ria s.
 Anticuerpos 113

F ig . 5-38 (cont.) C: s u p e rfic ie d e c o n ta c to del F ab y d e l a n tíg e n o . L o s r e s id u o s in te ra c tu a n te s e stá n n u m e ra d o s y c o lo r e a ­

d o s en ro jo , a e x c e p c ió n d e la G ln 121 d e l a n tíg e n o , q u e lo e s tá en v io le ta . L o s re s id u o s d e la c a d e n a L q u e c o n ta c ta n c o n
e l a n tíg e n o s o n ; 1 (H is 3 0 ), 2 (T y r 3 2 ), 3 (T y r 4 9 ), 4 ( T y r 5 0 ), 5 (P h e 9 1 ), 6 (T rp 9 2 ) y 7 (S e r 9 3 ). L o s d e la c a d e n a H : 8
(T h r 30), 9 (G ly 31), 10 (T y r 3 2 ), I I (T rp 5 2 ), 12 (G ly 5 3 ), 13 (A sp 5 4 ), 14 (A rg 99), 15 ( A s p 100), 16 (T y r 101) 17 ( A r g
102). L os re s id u o s d e la lis o z im a q u e c o n ta c ta n co n el a n tic u e rp o son: 1 (A s p 18), 2 (A sn 19), 3 (A rg 2 1 ), 4 (G ly 2 2 ) , 5
(T y r 23), 6 (S e r 2 4 ), 7 (L e u 2 5 ), 8 (A sn 2 7 ), 9 (L ys 1 16), 10 (G ly 117), 11 (T h r 118), 12 (A s p I 19), 13 (V a l 120), 14 ( G ln
121), 15 (lie 124), 16 (L e u 129). (L o s n ú m e ro s e n tre p a ré n te s is in d ic a n el o r d e n d e s e c u e n c ia .) (C o rre s p o n d e al m is in o e s ­
tu d io in d ic a d o e n la fig u ra 5 -3 6 . F o to g ra fía s g e n tilm e n te c e d id a s p o r el D r. R . P o ja k .)

hibición se consigue con DPN (lisina), y que
igual potencia inhibitoria tienen DNP (hsina)g y
DNP (lisina),. Resultados similares se han obte­
nido con anticuerpos antidextrano (fig, 5-40).
Ello indica que el tamaño del sitío de combina­
ción debe ser tan grande como para rodear a
aquéllos, lo que significa el compromiso de
aproximadamente 15-30 residuos de los 1.300
que constituyen una molécula de anticuerpo.
Eos estudios cristalográficos han permitido
calcular que el área del anticuerpo que interac-
ciona con un epitope tiene un tamaño aproxi­
mado de 700 A^.
Otros sitios efectores de
las inmunoglobulinas
Localización de los sitios. Como ya se indi­
cara, además de los dominios V^j y Vj^ que par­
ticipan en la formación del sitio de combina­
ción de la molécula de anticuerpo, o “paratope”
según la propuesta de Jem e (véase cap. 4),
existen en los fragmentos constantes de las ca­
denas H otros dominios, que son efectores de
funciones, algunas de las cuales se ejercen di­
rectamente, en cambio otras sólo tienen lugar
después de la unión antígeno-anticuerpo. Entre
esas propiedades figuran la capacidad de acti­
var el sistema complemento a través de la vía
clásica (fijación de Clq) o de la vía alterna, de
fijarse a mastocitos homólogos o heterólogos,
de unirse a linfocitos B, de atravesar mem bra­
nas biológicamente activas (placenta, pared in ­
testinal del recién nacido), de fijarse a la proteí­
na A del Staphylococcus aureus, de regular el
ciclo catabólico de la molécula proteica de la
que form a parte, de fijarse a macrófagos,, de
reaccionar con factor reumatoideo, etc, La m a­
yor parte de esas funciones están localizadas en
el fragm ento Fe, en los dominios y C^S
para la IgG e IgA, y en los C,_,2, Cj^3 y Cj^4 p a ­
ra la IgM e IgE.
Si bien el fragmento Ec completo separable
por tratam iento papaínico conserva práctica­
mente intacta la actividad de la molécula com ­
pleta, los dominios aislados se muestran m uy
poco efectivos no obstante existir pruebas indi­
rectas de que algunos de ellos son los responsa­
bles de determinadas funciones. Se ha observa­
do que los fragmentos Ec’ y pEc’ de IgG, cons­
tituidos casi exclusivam ente por el dom inio
Cjj3, si bien conservan algunos determinantes
antigénicos de la molécula entera y la capaci­
dad de reaccionar con algunos factores reuma-
toideos, carecen de la mayor parte de las pro­
piedades del fragmento Fe, lo que hace suponer
que gran parte de la actividad de este fragmen­
to está localizada en el dominio Cj^2. Un frag­
mento de IgG2a de ratón, obtenido por trata­
miento enzimático, que responde a las caracte-
114 Aspectos básicos de la inmunidad

Fig. 5-39. A . E l s itio d e c o m b in a c ió n d e lo s

a n tic u e rp o s e s tá f o rm a d o p o r se is b u c le s o c o ­
d o s, tre s c o rre s p o n d ie n te s al d o m in io V. ( L l ,
L 2 y L 3 ) y tre s al d o m in io V „ ( H l , H 2 y H 3 ).
B . E s tru c tu ra s c a n ó n ic a s p ro p u e s ta s p a ra la s r e ­
g io n e s h i p e r v a r i a b le s d e lo s d o m in io s V k y
V H . L a s u p e rf ic ie a c c e s ib le al a n tíg e n o es la
u b ic a d a e n la p a rte s u p e rio r d e las fig u ra s y en
la p a rte in fe rio r la c o rre s p o n d ie n te a la e s tr u c ­
tu ra ríg id a . S e m u e s tra n la c o n fo rm a c ió n d e la
c a d e n a p r in c ip a l y a lg u n a s c a d e n a s la te ra le s
d e te r m i n a n te s d e la s e s tr u c tu r a s c a n ó n ic a s .
(A d a p ta d o d e C h o th ia C ., L e s k A . M ., T r a m o n ­
ta n o A . y c o l., N ature 3 4 2 :8 7 7 , 1989).

al a n tíg en o

Vk

Ll

26 26 ||g

L2

L3

VH

26
Phe 2 9 ^

rísticas de ese dom inio, ha dem ostrado fijar
Clq, pero su capacidad para activar el sistema
complemento es menor que la del Fe entero.
Se ha demostrado que en la fijación de C lq a
la IgG l (Ejj.) humana, tienen activa participa­
ción los residuos Glu (318), Lys (320) y Lys
(322), ubicados en la parte externa del dominio
CH2, disposición que facilitaría un contacto di­
recto con C lq . La unión de protema A (frag­
mento B) a IgG l tiene lugar en las proximida­
des de la unión de CH2 y CH3.
En la IgG l de cobayo, el dominio responsa­
ble de la activación del complemento por la vía
alterna (véase cap. 22) pareciera que es el C H l,
contenido en el fragmento Fd.
El fragmento Fe de la IgA humana es el que
fija el componente secretorio y las cadenas J, y
en el caso de la IgE, sólo el Fe entero (P.M. 94
kDa) conserva la capacidad de fijación a m as­
tocitos hom ólogos, no así el F e ’ de P.M. 57
kDa.
Resulta difícil establecer con seguridad la lo­
calización de los sitios activos de la porción
constante de las cadenas H, ya que la inefecti­
vidad de dom inios aislados puede deberse a
modificaciones conformacionales derivadas de
los tratamientos enzimáticos usados para su ob­
tención. Parecería que los puentes S-S interca-
tenarios ubicados en la región de la bisagra y
que form an parte del fragm ento Fe tuvieran
cierta significación en el mantenimiento de la
actividad de este fragmento. La reducción de
esos puentes eon mereaptoetanol determina que
la capacidad de la IgG de unirse a Clq y de fi­
jarse a m acrófagos dism inuya considerable­
mente. La IgE sometida al mismo tratamiento
pierde su capacidad para fijarse a mastocitos
homólogos.
Si bien inmunoglobulinas diferentes pueden
tener propiedades biológicas similares, ello no
significa que los sitios implicados sean los m is­
mos. Dos inmunoglobulinas pueden fijarse a un
mismo receptor pero con distinta afinidad, por
no ser iguales sus estructuras, lo cual puede de­
mostrarse por competición. Pueden unirse tam ­
bién a receptores muy próximos y la fijación de
una de ellas crear un impedimento estérico para
la unión de la otra, o ejercer la misma función
por unión a receptores distintos no próximos.
En consecuencia, es difícil establecer correla­
ciones entre dominios de diferentes inmunoglo­
bulinas con respecto a una función biológica
compartida por ambas.
Las inmunoglobulinas IgG e IgM fijan Clq
con distinta afinidad, siendo la última la más
efectiva. De las subclases de IgG humana, la
IgG3 es la que fija más firmemente Clq, h a ­
ciéndolo en orden decreciente la IgG l e IgG2.
La IgC4 no fija el complemento. Los dominios
responsables de ello no son los mismos y esa
Anticuerpos 115
actividad corresponde al CH2 (P.M. 17 kDa)
de la IgG y al C„4 (P.M. 6 ,8 kDa) de la IgM.
En el caso del ratón, la fijación a macrófagos
de los anticuerpos de tipo IgM e IgG n o es
competitiva; la primera es Ca^+ dependiente.
En el cuadro 5-15 figuran algunas de las pro­
piedades atribuidas a los diferentes dom inios
de la IgG.
Cómo fu n cio n a n los sitios efectores. Hay
funciones que son puestas en marcha p o r la
molécula de inmunoglobulina, sin necesidad de
interacción previa con el antígeno. Entre ellas
está la capacidad para atravesar la placenta, la
unión a la proteína A del Staphyíococcus a u ­
reus y el control del ritmo catabólieo. Se h a de­
mostrado que esas funciones son inherentes al
fragmento Fe sin la participación del fragmento
Fab. La estructura del fragmento Fe, según la
clase o subclase de inmunoglobulina de la que
provenga, determ ina que su funcionam iento
pueda ser distinto. En el caso de la regulación
del ritmo catabólieo, la degradación de IgG es­
tá en relación directa con su concentración séri­
ca, no así para la IgM e IgA. El catabolismo de
la IgD está en relación inversa a su concentra­
ción.
La IgG humana intravascular catabolizada
por día varía según la subclase, siendo del 17%
para la IgG3 y del 7% para cada una de las res­
tantes, lo que determina que la vida m edia de
estas últimas sea de 21 días y sólo de 7 días la
de la IgG3.
En la puesta en m archa de otros procesos
biológicos mediados por anticuerpos es in d is­
pensable la interacción previa con el antígeno
para que aquéllos se efectivicen. Numerosas in­
vestigaciones han sido desarrolladas con el ob­
jeto de conocer el m ecanism o de esa activ a­
ción, y todas ellas apuntan a dos posibilidades.
Una es la que considera que la interacción del
antígeno eon el anticuerpo induce en éste cam ­
bios conform acionales, y que esa estru ctu ra
adaptada sería la que tendría mayor afinidad
por el receptor, dando una unión firme y esta­
ble capaz de poner en marcha un proceso. Si
bien por estudios de dicroísmo circulai' se han
podido detectar cambios de esa naturaleza, y en
algunos casos considerárselos como responsa­
bles, la m ayor parte de los autores p arecen
coincidir en que no constituyen una regla gene­
ral. La otra posibilidad estima que lo que debe
jugar un papel muy importante es la formación
de un retículo estable que, consecuentemente,
aumentaría la afinidad por el receptor y, si esto
ocurre sobre una membrana celular, el retículo
formado induciría modificaciones que podrían
llevar a una redistribución de los receptores de
superficie. Esta modificación sería la que indu­
ciría a la célula a cumplir una función determ i­
nada. Entre los argumentos en favor de esta in-
116 Aspectos básicos de la inmunidad

+ + + +

+
II
+
o

+ +
II
+

00 ^ + + +

+
o 2,

Ig + +

+ +
lg
~S o + +
O 'd

^R - +
e
a
-5 +
O ^

+ + + +

£>^ +

^ o + + +

II
JU o 51
+ +

í; -2 + + +
§ ^
+

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o, C +
s . ^2
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tf) K ^ 2 .

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'B' &jj c 'a . Uh x: 'o^
00 _0J g <L>
-s O <: < < £ < Ü < H
 Anticuerpos 117

+ +

+ + + +
¿ 'i

^ ÍO + +

+ + +

a, I g +
<3
K
"1 í^ i
+ +
tj

tC ji + + + 4- +

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U ¿í < E O < < co < ü
118 Aspectos básicos de ia inmunidad

F ig . 5-40. 50% de in ­
hibición por o ligosacá­
ridos de isom altosa a la
p r e c ip ita c ió n d e 1 m i
de suero anti-d ex tran o
por dextrano.

Inmoles de oligosacárido añadido

terpretación está el hecho de que la IgE entera
fijada a mastocito sólo puede desencadenar una
reacción de hipersensibilidad inmediata cuando
reacciona con un antígeno bivalente o poliva-
C u a d ro 5-16. A lgunas de las pro p ied a d es
atribuidas a los dominios constantes de la IgG
Fragm ento
D om inios constitutivos C 2 C 3
Especificidad de cla.se
E specificidad de subcla­
se
Especificidad alotípica
C apacidad de com bina­
ción con el Ag
U nión al factor reum a­
toideo
Fijación del com plem en­
to (vía clásica)
lente. Los haptenos simples y antígenos mono-
valentes carecen de esa propiedad, al igual que
los fragmentos Fab del anticuerpo reagínico.
E sta últim a interpretación estaría más de
acuerdo con los hechos, ya que la IgE sola se
fija firmemente al receptor de los mastocitos,
pero la liberación de histamina recién ocurre
cuando se produce la interacción con un ligan­
do bivalente.
Fe F c’ pF c’
La fijación de Clq a la molécula de IgG e
IgM libre es un hecho conocido, pero esta fija­
C„3 C„3 ción no lleva a la activación del sistema com­
plemento si la inmunoglobulina no ha formado
+ -1- +
un complejo Ag-Ac o ha sido agregada por mé­
+ - todos físicos o químicos. Se presume que ello
puede deberse a que la agregación expone un
número mayor de receptores por Clq -m olécu­
+ -1 -0 -* 0- *
la con seis sitios reactivos sim ilares- y que, co­
- -
mo consecuencia, se originaría un aumento en
la afinidad de la unión. Esta unión firme y esta­
ble, con cambios en la conformación de Clq o
+ + +
sin ellos, sería la que aseguraría su capacidad
para iniciar la activación de los restantes com­
- - ponentes del sistema complemento (fig. 5-41).

F ijación a m astocitos he­ -t- - -

terólogos VARIACIONES ALOTÍPICAS
C om binación con la pro­ -1- - - En las cadenas L y H de las inmunoglobuli­
teína A del S. aureus
nas del hombre y de otros vertebrados se han
C apacidad para atravesar señalado variaciones alotípicas, correspondien­
m em branas biológica­ tes a la presencia de ciertos péptidos que fun­
m ente activas: cionan como epitopes o determinantes antigé-
placenta + - -
intestino
nicos y que son heredados de acuerdo con las
leyes de Mendel. Algunos de los alotipos son
C ontrol del ritm o cata- H- - - conform acionales, por lo que necesitan estar
bólico asociados a otras cadenas polipeptídicas para
S ólo algunos factores gen é tic o s h an sido d e te ctad o s en el d o m i­ que puedan expresarse, de modo que su estruc­
n io C,.,3 tura tridimensional se mantenga. Se los deno­
** C o rre s p o n d e a en sa y o s efe c tu a d o s en ra to n e s re c ié n n a c id o s,
c o n frag m en to s de IgG de co n e jo (M o rris, T, G. Proc. R. Soc. B. mina también “factores genéticos”, son recono­
160: 276, 1964.) cidos por los receptores antigénieos de las célu-
 Anticuerpos 119

F ig . 5-41. Posibles m ecanism os de iniciación de funciones biológicas reguladas por los sitios activos ubicados en el frag^
m entó Fe de las inm unoglobulinas. A. U nión de inm unoglobulina libre a un receptor (pasaje placentario, regulación d e rit­
m o catabólieo; fijación a la proteína A del Staphyíococcus aureus). B. F orm ación de un retículo A g-A c-receptor q ue o rig i­
na m odificaciones en la m em brana celular (hipersensibilidad m ediada po r anticuerpos citotrópicos). C. 1) Form ación d e un
com plejo de baja afinidad (fijación de C lq a la IgG libre, sin activación de los restantes com ponentes de com plem ento). II)
Form ación de un com plejo de alta afinidad (fijación de C lq a un com plejo A g-A c con subsecuente activación de los otro s
com ponentes del com plem ento.

las B y T y pueden ser simples o complejos. El Los distintos alotipos están bajo el respecti­
origen de los primeros puede explicarse fácil­ vo control genético de locus segregados in d e­
m ente por m utaciones som áticas, las cuales pendientem ente. Son autosómicos y codom i-
pueden haber originado formas alélicas de un nantes, lo cual significa que se expresan en he-
mismo locus. El origen de los alotipos comple­ terocigotas y son independientes del sexo.
jos es más difícil de concebir y sobre el parti­ En las cadenas L de tipo k humanas han sido
cular se han formulado diferentes hipótesis. identificados los alotipos Km, y los Gm y Am

C uadro 5-17. Nomenclatura y localización de los alotipos más frecuentes del hoi.ibre y conejo

Especie L ocus Localización A lotipos Aminoácido.^ com prom etidos*

H om bre
G lm C yl (C „I) G lm (4 ) A rg (214)
G lm (1 7 ) Lys (214)
Cyl (C„3) G lm ( I) A sp(356)-G lu-L eu(358)-T hr-L ys
G lm (-I) G lu(356)-G lu-M et(358)-T hr-L ys
G 2m Cy2 (C„2) G2m (23)
G 2m (-23)
G3m Cy3 (C,.,2) G 3m(5)
G 3m(-5)
G3m (15)
G3ni(16)
G3m (21) Tyr(296)
G 3m (-2I) P he(296)
Cy3 (C„3) G 3m(6)
G 3 m (ll) P he(436)
G 3 m (-ll) Tyr(436)
G 3m (13)
G 3m (I4)
Cy4 (G„2) G 4m (4a)
G 4m (4b)
C a 2 (C„3) A 2 m (l) P h e(4 1 1 )-A sp(428)-V al(458)-V aI(467)
G 4m C[- A 2m (2) T h r(4 1 1)-G lu(428)-Ile(458)-A la(467)
K m (l) V al(I5 3 ), Leu(191)
A 2m K m (l,2 ) A la(I5 3 ), L eu(19I)
Km Km(3) A la(I5 3 ), V al(191)

Conejo
V„ A l, A2, A3 S ustituciones múltiples
B4, B5, B6, B 9 Sustituciones miiltiples
C l, C21
c, d ll M et(225)
d l2 Thr(225)
c. e l4 Thr(309)
e l5 A la(309)
Ms c. M sl6 , M sl7

' E í nú m ero e n tre p arén tesis c o rresp o n d e a la ubicación en la s e c u e n c ia am in o ac íd ic a.

120 Aspectos básicos de la inmunidad
en las cadenas y y a de las inmunoglobulinas
IgG e IgA, respectivamente. Los alotipos de las
cadenas H (Gm y Am) están asociados con las
diferentes subclases de inmunoglobulinas y go­
bernados por loci relacionados, algunos de los
cuales son multialélieos.
Si bien en un comienzo existió cierta anar­
quía en la nomenclatura de los alotipos, actual­
mente se identifican con las letras que se co­
rresponden con la clase y subclase de cadenas
H, seguido de m y de inmediato y entre parén­
tesis el número del alelo. Ejemplos: G lm (l) y
G lm ( 1 7 ); G 3 m (6 ), G 3 m (1 3 ), G 3 m (1 4 );
A 2m (l) y A2m(2). En las cadenas L de tipo k
han sido identificados tres alotipos, K m (l),
K m (l,2 )y Km(3).
Cada alotipo Gm está localizado en sólo una
subclase de cadena y. Los alotípos Gm y Am
están ubicados en el fragmento constante, espe­
cialm ente en los dom inios C„2 y Cj,3 (Ec),
aunque algunos de ellos están en el dominio
Cj^l (Ed). Los alotipos Km se encuentran en el
fragmento constante C, de las cadenas K (cua­
dro 5-17). Los alotípos Km están presentes en
todas las clases de inmunoglobulinas, mientras
que los Gm y Am lo están exclusivamente en
las IgG e IgA.
En subclases de IgG se ha dem ostrado la
presencia de marcadores genéticos (Gm) que
pueden existir como isoantígenos en otras sub­
clases de cadenas y. Se los designa “no marca­
dores” o isoalotípos, y es posible que sean se­
cuencias básicas comunes a genes de las dife­
rentes subclases de IgG. Las variantes 4a y 4b
son alelos presentes en las cadenas y^ y se los
denomina G4m(4a) y G4m(4b). Este último ha
sido hallado en la cadena y^, pero expresado en
ambos genes parentales, lo cual no constituye
un marcador diferencial. Es posible que la re­
gión del ADN que codifica para estos antíge­
nos en uno de los genes haya podido ser altera­
da por mutaciones, generando polimorfismo en
una de las subclases. El alotipo G lm (l), por
ejemplo, se ha encontrado en las cadenas yj, y
cuando está presente el fragmento responsable
es el pentapéptido Asp-Glu-Leu-Thr-Lys en la
posición 355-360, Cuando en esta cadena se
halla ausente [G lm (-l)], la secuencia del pépti­
do es Glu-Glu-Met-Thr-Lys, difiriendo del an­
terior en dos aminoácidos. La secuencia corres­
pondiente al alotipo G lm (l) se encuentra tam­
bién en la IgG2 y en la IgG3, pero no en la
IgG4. Puede originar anticuerpos específicos,
está siempre presente por lo que no es un aloti-
,po, y por tanto en estas subclases de inmuno-
globulina IgG sólo es un “no marcador” (cua­
dro 5-18).
Los alotipos Km están relacionados con va­
riaciones aminoacídicas en las posiciones 153
y 191 [K m (l): Val(153), Leu(191); K m (l,2):
Fig. 5-18. Factores genéticos “no m arcado­
res ” o isoalotipos en el hombre
‘'No m a rca d o res”
Subclase N om enclatura N om enclatura
de cadena original actual
no-Uj n G m l(l)
n o -b n G m 3 (5 )
llO-b m G m 3 (l 1)
no-g n O m 3 (2 1 )
y., 4b n G m 4 (4 b )
A la (1 5 3 ), L e u (1 9 1 ); K m (3) : A la (1 5 3 ),
Val(191)].
En el conejo el conjunto de alotipos es muy
extenso, y marcadores que corresponden a esta
categoría han sido identificados en las cadenas
y (IgG), a (IgA), |i (IgM), k (L) y A (L). Al
igual ciue en los alotipos humanos, son multia-
lélicos, codominantes y segregados indepen­
dientemente.
El locus a tiene tres alelos (al, a2 y a3) y los
alotipos se expresan en la parte variable de to­
das las cadenas H. Son alotipos complejos, ya
que cada uno difiere del otro en no menos de
seis aminoácidos. Siendo el fragmento variable
de las cadenas H la expresión de un producto
de recombinación de genes, que aparentemente
ocurre al azar, este alehsmo es difícil de expli­
car. Algunos suponen que podría estar localiza­
do en un fragmento regulatorio adyacente a di­
chos genes.
El locus b, con nueve alelos, cuatro de los
cuales (b4, b5, b 6 y b9) son predominantes, de­
terminan características antigénicas localizadas
en el fragmento constante de las cadenas L de
tipo K. Son alotipos com plejos, y cuando se
compíu-an las secuencias de aminoácidos entre
ellos, muestran diferencias próximas al 30%,
El locus c codifica para cadenas L de tipo k .
Se conocen los alelos c l y c21, y hay conejos
homocigotas que no expresan ninguno de ellos.
Estos animales se identifican como “c-negati-
vos”.
Los alotipos d l l , d l2 , e l4 y e l5 , correspon­
dientes a los locus d y e, están localizados en
las cadenas y de la IgG de conejo. Los alotipos
d i 1 y d i 2 están ubicados en la zona de la bisa­
gra. El di 1 está asociado con la presencia de
un residuo de metionina en posición 225 (adya­
cente y aminoterminal de la cisteína que parti­
cipa en la formación del puente disulfuro inter­
cadenas H), mientras que el d i 2 está asociado a
una treonina en esa posición. Los alelos e l4 y
e l 5 están ubicados en la porción terminal del
fragmento Fe (residuo 309). En el alotipo e l4
en esa posición hay treonina, la cual es sustitui­
da por alanina en el e l 5.

En las cadenas (i ha sido identificado el lo­
cus del alotipo Mn, del que se conocen ocho
alotipos.
En ratas, ratones y otros mamíferos también
se han identificado alotipos de inmunoglobuli­
nas. l^a rata presenta alotipos en el fragmento
constante de las cadenas L k , mientras que en el
ratón no existen alotipos para ninguno de los
subtipos de cadenas k y X,. Ambos anim ales
presentan alotipos en los fragmentos constantes
de las cadenas H (y). Para su identificación se
han usado diferentes nomenclaturas.
Es posible obtener anti sueros contra los dife­
rentes alotipos de las inm unoglobulinas del
hombre, conejo y otros animales; ello ha per­
mitido la tipificación serológica y determina­
ción del tipo genético a que pertenecen, en es­
pecial las inm unoglobulinas hom ogéneas de
mielomas. La tipificación de la IgG provenien­
te de un suero humano normal, constituida por
una mezcla de IgG l, IgG2, IgG3 e IgG4, sólo
perm ite conocer los alotipos presentes en la
mezcla, pero no los individuales. En el conejo,
el fenotipo hallado depende del carácter homo-
cigoto o heteroeigoto del animal en estudio.
Los métodos serológicos empleados para es­
tos ensayos se basan en la inhibición de la
aglutinación que la inmunoglobulina en estudio
puede producir, al actuar sobre un sistem a
aglutinante constituido por hematíes que tienen
fijada IgG de genotipo conocido, y su corres­
pondiente anticuerpo. Su determinación puede
efectuarse también por ELISA.
VARIACIONES IDIOTÍPICAS
Kunkel pudo dem ostrar que al inocular un
conejo con una determinada IgG de mieloma se
obtenía un antisuero y que, al ser absorbido con
otra IgG de mieloma distinta a la anterior pero
perteneciente a la misma subclase, quedaba un
remanente de anticuerpos que sólo reacciona­
ban con la IgG usada como inmunógeno. C on­
cluyó que la especificidad estaba dirigida con­
tra determinantes antigénieos presentes en la
parte variable de las cadenas L y H de la m olé­
cula, los que se identificaron con el nombre de
idiotipos.
Un determinante simple del fragmento varia­
ble (Fv) se denom ina “idiotopo” y se llam a
“idiotipo” a la suma de todos aquellos que se
encuentran presentes en un dominio variable.
Los anticuerpos capaces de reconocerlos se lla­
man “antiidiotípicos”. Se han identificado idio­
tipos localizados en las cadenas L, H y algunos
que involucran a am bas. T am bién se los ha
identificado en los fragmentos variables de las
cadenas L y H que no están relacionados con la
zonas de hipervariabilidad. Teniendo en cuenta
Anticuerpos 121
el mecanismo por el cual se genera diversifica-
ción en las inmunoglobuhnas, que es el resulta­
do de recombinación de múltiples genes V^,
V|^, D|,, y que aparentemente ocurre al azar,
es comprensible que un mismo idiotipo pueda
estar localizado en sitios de combinación o p a­
ratopes correspondientes a anticuerpos con dis­
tinta especificidad, y que en algunos casos ha­
ya sido posible agruparlos en familias, en las
que pueden estar incluidos anticuerpos con es­
pecificidad no relacionada. A estos idiotipos se
los llam a “públicos” , y “privados” si sólo se
hallan presentes en una determinada molécula.
El hecho de que un epitope antigénico pueda
ser reconocido por paratopes que no comparten
el m ism o idiotipo y que un m ism o id io tip o
pueda estar en paratopes diferentes constituyó
la base de la hipótesis de Jeme sobre la regula­
ción del sistema inmune a través de la red idio-
tipo-antiidiotipo.
A GLUTIN IN AS PR O C E D E N TE S
DE PLAN TAS E IN VERTEBRAD OS
A partir de diferentes variedades de h a b i­
chuelas (Phaseolus limensis, Vicia craca, Vicia
gramínea, Vicia fava. Vicia ervília), de sem i­
llas de ricino {Ricínus comunis), Bauhinía p u r­
purea, etc., se han preparado extractos en los
que se han encontrado sustancias con capaci­
dad para interaccionar con componentes anti-
génicos de los glóbulos rojos y prc lucir agluti­
nación. Estas sustancias, cuya especificidad es
para componentes hidrocarbonados, son cono­
cidas con el nombre de lectinas; pueden fijar
m onosacáridos y oligosacáridos y precip itar
glucoproteínas. La actividad más común es an-
ti-A, anti-H, anti-N y a veces anti-B y anti-M.
No se han encontrado lectinas contra antígenos
del sistema Rh. Ello podría deberse a que estos
antígenos son lipoproteínas y en las lectinas só­
lo ha podido dem ostrarse especificidad para
azúcares (cuadro 5-19).
Estas sustancias han sido empleadas en for­
ma rutinaria en la agrupación sanguínea, en es­
pecial en la determinación de subgrupos A y
AB y en la investigación de secretores.
Los estudios fisicoquímicos han demostrado
que, si bien interaccionan con antígenos hem á­
ticos, no son inmunoglobulinas. Se fijan a re­
ceptores hemáticos expuestos en la membrana
de la célula y en algunos casos se ha consegui­
do, con monosacáridos y oligosacáridos, inhi­
bir su acción aglutinante. Se han intentado es­
tudios de interacción primaria con el objeto de
determinar la valencia de las lectinas, pero en
su mayoría se han visto dificultados por no ha­
berse podido determ inar con certeza el peso
molecular de las sustancias ensayadas.
122 Aspectos básicos de la inm unidad

C u ad ro 5-19. Especificidad de diferentes lee- mentos constantes en las cadenas L y H (fig.

tinas para eritrocitos humanos 4-29) y de subtipos para ambos tipos de cade­
nas, propuso la siguiente nomenclatura:
Especificidad O rigen

P haseolus limensis C adenas L

Phaseolus lunatus
C rotolaria aegyptica C k y Cy para los segmentos constantes de
C rotolaria fa lca ta ambas cadenas.
Vicia peregrina
Anti-A Vicia vilíosa VKp V k „, Vk,jj, V k ,.^, para los subtipos de
D olichos biflorus cadenas K con variabilidad localizada en el seg­
H elix pom atia mento variable.
CUtocyba nebularis V^,, VI,j, V l|„, VX,y, VA,av^, VXy,, para los
O tala lactea
H yptos siiayeolens subtipos de cadenas A, con variabilidad locali­
zada en el segmento variable.
M arasm ius oreales
B andeiraea sim plicifolia
Anti-B C adenasH
Polysporus fom entarius
Sophora ja p ó n ica
Cy, Cft, C a , C5, Ce, para los segm entos
U lex europaeus constantes de las cadenas H de IgG, IgM, IgA,
L otus tetragonolohus IgD e IgE, respectivamente.
Cytisus sessifolis
A nli-H Laburnurn alpinum Vy, Vji, V a, V 8 , Ve, para los segmentos va­
O nonis spinosa riables de las mismas cadenas.
Xylaria polym orpha Para la IgG que tiene cuatro subtipos de ca­
Tetragonolobus purpureas denas H, con diferenciación en el segm ento
A nti-M Iberis am ara constante, Cy se amplía a Cy,, Cyj, Cy, y Cy_^.
De igual modo C|J, C a l, Ca2.
Anti-N
Vicia gram ínea C om o cada segm ento H constante puede
Bauhinia purpurea subdividirse en tres dominios, uno correspon­
diente al segmento Fd y los restantes al frag­
mento Fe, cada fragmento H constante estará
constituido por CH,, CH^ y CH,,.
En la hemolinfa de crustáceos, moluscos y Sobre la base de lo expuesto, las fórmulas de
otros invertebrados se han encontrado también las inmunoglobulinas pueden expresarse de una
aglutininas similares a las anteriores, capaces manera más compleja, pero a su vez más explí­
de aglutinar bacterias y glóbulos rojos de verte­ cita.
brados. Son sustancias proteicas de alto peso La IgG del tipo 1, es decir la IgG l, con ca­
molecular, muy resistentes a las enzimas pro­ denas K del tipo II, tiene la fórmula
teolíticas. En el fluido celónico de loinbrices de
tierra portadoras de injertos heterólogos se han 1(Vk „ . C k) (V y . Cyl)]^
encontrado sustancias no presentes en lombri­
ces portadoras de injertos autólogos, las que re­ Si se quiere hacer referencia a los com po­
presentarían aglutininas contra los antígenos nentes de las fracciones constantes de las cade­
extraños. nas H, la fórmula se amplía:
Algunas de las leetinas conocidas son mito­
génicas de determinados tipos de células linfoi­ [ ( V K „ . C K ) ( V y . C y , ' . Cy, 2. Cy,3)
des; de ahí que últimamente se las haya utiliza­
do con éxito en la diferenciación de linfocitos La fórmula general de la IgM será:
T y B. También, dada su capacidad para inte­
raccionar con hidratos de carbono, algunas de I [ (V k . C k ) (V ^ . C[i) ], 1,
ellas, como la concanavalina A, ha sido utiliza­
da para aislar y purificar glucoproteínas, inclui­ El mismo esquema se utiliza para las restan­
das inmunoglobulinas. tes inmunoglobulinas.
Estas fórm ulas son útiles para expresar la
composición de algunas inmunoglobulinas, en
N O M EN CLA TU RA especial un tipo de IgA en que las dos cadenas
DE LAS INMUNOGLOBULINAS L están unidas entre sí al igual que las cadenas
H, y las uniones L-H no son de tipo covalente
Un comité de expertos de la Organización por puentes S-S. Para ellas la fórmula sería:
M undial de la Salud, teniendo en cuenta la
existencia de segm entos variables y de seg­ (V k . C k) (V a . C a),

Para el caso de las IgA halladas en secrecio­
nes, la fórmula resultante es la siguiente:
[ [ (V k . C k) (V a . C a) J^S
Siendo S el componente secretorio.
O T R A S M O L É C U L A S R E L A C IO N A D A S
CO N L A S INMUNOGLOBULINAS
L a superfam ilia
de las inm unoglobulinas
Bajo este rubro se incluyen moléculas pro­
teicas cuya principal característica es la de pre­
sentar en su estructura bucles o “loops” simila­
res a los que se observan en los fragmentos va­
riables (V) y constantes (C) de las cadenas L y
H de las inmunoglobulinas. El número de bu­
cles no es constante y -varía según el origen de
la molécula. Estos bucles como en las inmuno-
globulinas, están constituidos por dos hojas an­
tiparalelas plegadas en p, formando un “sand­
wich” o emparedado, presentando cada una de
las hojas 3 o 4 fibras. En la mayoría de los ca­
sos ambas hojas están unidas por un puente di-
sulfuro perpendicular a las mismas, estando los
residuos hidrofóbicos orientados hacia el cen­
tro del núcleo.
A los dom inios que presentan hom ología
con el dominio variable de las cadenas L o H,
constituidos por 65-75 residuos, se los designa
V, y con C a los que presentan homología con
los dominios constantes, los que están consti­
tuidos por 55-60 residuos. En este caso se los
designa C l , y con C 2 a aquellos que poseen es­
tructuras intermedias con los dominios V y C.
Por regla general la secuencia de aminoácidos
es menor que la correspondiente al C l, origi­
nando un bucle más pequeño.
Cabe hacer notar que a aquellos dominios de
las moléculas de la Superfamilia que presentan
hom ología con los dominios variables de las
inmunoglobulinas se los denomina V, por su
similitud con estos dominios, sin que ello sig­
nifique variabilidad tal como ocurre con los do­
minios V de las cadenas L y H (fig. 5-42).
Los estudios estructurales de estas proteínas
llevan a suponer un origen común a partir de
un gen ancestral correspondiente a un receptor
primordial de superficie, que codificaría para
1 0 0 residuos, con dos restos de cisteína que al
unirse y originar un puente disulfuro darían lu­
gar a un bucle. Los genes que codifican para
los diferentes miembros de la Superfamilia ha­
brían surgido por duplicación génica y diver­
gencia a partir de ese dominio primordial. Los
genes que codifican para estas proteínas están
distribuidos en distintos cromosomas.
Anticuerpos 123
Las proteínas que forman parte de la Super­
familia de la inmunoglobulina pueden incluir­
se en diferentes grupos según la función que
cumplen y el tejido con el que están relaciona­
das. Los grupos más importantes son: a) inm u­
noglobulinas: cadenas H, cadenas k y cadenas
A; b) complejo RCT-CD3: cadenas a ,p o yS del
RCT y cadenas y,5,e de CD3; c) complejo m a­
y o r de h isto c o m p a tib ilid a d : cadenas oc de
CMH-I y pj-microglobulina, cadenas a y ¡i de
CMEl-II; d) antígenos asociados a (i^-micro-
globulina: cadenas a de los antígenos TL, Qa
y C D l a; e) moléculas de adhesión: CD2, LFA-
3; f) a ntígenos de su p erficie de lin fo cito s:
CD4, cadenas T y II de CD 8 y CTLA-4; g) an­
tígenos localizados en cerebro y linfocitos:
Thy-1, MRC OH-2; h) receptores de inmuno-
globulinas: RPolylg, RPcy2b/yl; i) m oléculas
re la c io n a d a s con tejid o n ervio so : N C A M
(m o lécu la de adhesión de tejido n erv io so ),
MAG (glucoproteína asociada a m ielina), Po
(proteína de mielina); j) antígenos tumorales:
CEA (antígeno carcinoembrionario; k) recep­
tores de factores de crecimiento: RPDGF (re­
ceptor del factor de crecim iento derivado de
plaquetas), RCSE-1 (receptor del factor esti­
m ulante de colonias- 1 ); 1) moléculas que no
form an parte de la superficie celular: a ,B g p
(glucoproteína a,B ), LINK (proteína de unión
a membrana basal).
En el cuadro 5-20 figuran algunas de las ca­
racterísticas más importantes de estas p ro teí­
nas.
Casi todas las proteínas de la Superfamilia
asociadas a células tienen una parte citoplas­
mática, la C-term inal, seguida de una tra n s­
membránica de carácter hidrofóbico y una por­
ción extracelular donde se encuentran localiza­
dos los dominios V y/o C. Algunas de estas
proteínas no están insertadas en la mem brana
celular, sino que están unidas a ésta por un an­
claje de tipo glucofoslipídico (fig. 5-42: proteí­
nas THy-1, LEA-3, CEA).
En los receptores antigénicos de los linfoci­
tos B y T la unión al ligando (antígeno o CM H-
péptido) tiene lugar a través de la superficie
que en la parte superior de la molécula forman
los fragmentos V, y C, de la Ig y las cadenas a
y p del RCT. Las otras interacciones de los do­
minios de las inm unoglobulinas tienen lugar
por contacto entre las caras de las hojas plega­
das en p como ocurre con C, y C,., (fragmento
Fb, unión heterofílica) y Cj,3...C^3 (fragmento
Fe, unión homofílica). Ello hace suponer que
las interacciones entre moléculas de la Superfa­
milia tienen lugar por un mecanismo sim ilar,
que los dominios V, C l o C2 pueden interac­
cionar con otras moléculas a través de alguna
parte accesible de sus superficies, y que las
uniones son no covalentes y de distinta afini-
124 Aspectos básicos de la inmunidad

C uadro 5-20. Principales componentes de la Superfamilia de las inmunoglobulinas, la mayoría

de las cuales se expresan en la superficie de diferentes células

M olécula Tejido en el que se expresan Función

Ig (inm unoglobulinas) Sólo en linfocitos B R eceptor antigénico del LB, A nticuer­

R C T (receptor del LT) En linfocitos T y tim ocitos
CD3 (cadenas y, 5, e) En linfocitos T y tim ocitos
C M H (antígenos del com plejo m ayor D iferentes tipos celulares; inducidos
de de histocom patibilidad) po r interferón
P,-m globulina D iferentes grupos de células linfoides
C b 2 y LFA-3 Linfocitos y tim ocitos
C D 4 y CD8 CD 4 y CD8 en tim ocitos y poblaciones
C TLA -4 de linfocitos T
CD 4 en m acrófagos
CD 8 en células N K
C TL A -4 en células T activadas
Thy-1 C élulas linfoides y cerebro. Se locali­
zan en neuronas, fibroblastos y dife­
rentes células linfoides
M R C OX-2 Se localiza en neuronas, endotelio y d i­
ferentes linfocitos
pos
R eceptor antigénico del LT, N o se co ­
nocen form as solubles del R C T
Form an parte del com plejo RCT-CD 3
Presentan péptidos de antígenos ex tra­
ños al RC T
Se desconoce su función
C D 2 de célula T interacciona con
LFA -3 presente en otras células m e­
diante reacciones de adhesión. F un­
ciones sim ilares cum plen las m olécu­
las CA M (moléculas de adhesión ce ­
lular)
C D 4 y CD8 controlan la interacción de
los L T con los antígenos CM H clase
lyll,
C TLA-4: función desconocida
A nticuerpos anti-Thy-I inducen divi­
sión de los linfocitos T, No se cono­
cen sus receptores en el sistem a ner­
vioso
Se desconoce su función

R P o ly lg (receptor de IgM e IgA poli­
méricas)
RFC-ylb/yl (receptor de IgG)
N C A M (m olécula de adhesión del sis­
tem a nervioso)
M A G (glucoproteína asociada a m ieli­
na)
P o (proteína de m ielina)
CEA (antígeno carcinocm brionario)
R P D G F (receptor del factor de creci­
m iento derivado de plaquetas)
R C S F l (receptor del factor estim ulante
de co lo n ias-1)
L IN K (proteína de unión a m em brana
b asal)
a l B-gp (glucoproteína a IB)
E pitelio intestinal y hepático
M acrófagos
Form a parte del grupo de moléculas
asociadas al sistem a nervioso. Se la
encuentra en las neuronas y glía
C orresponde al m ism o grupo de m olé­
culas que N CA M , Se localiza en
m ielina central y periférica y algunas
neuronas
M ielina periférica
Células epiteliales y sus tum ores
C élulas m esenquim al es
M onocitos
M em brana basal (no es una m olécula
de superficie celular)
G lucoproteína hallada en suero
T ransporta form as m nltim éricas de
IgM e IgA a través del epitelio. El
p rim er dom inio fija IgA, Los dom i­
nios extracelulares liberados de
m em brana por proteólisis constitu­
yen el Com ponente Secretorio (S)
Fija IgA agregada
M edia la adhesión de células nerviosas
Podría funcionar en m ielinización
Constituye el 50% de la proteína de
m ielina periférica
M arcador tum oral. F unción desconoci­
da
Interacciona con factores de creci­
m iento para iniciar división celular y
otras actividades
Sim ilar a R PD G F
Actiia com o m olécula de unión entre
proteoglicano y hialuronatos
Se desconoce su función y ligandos

dad según la función que esas interaceiones po­
nen en marcha.
Considerando el supuesto origen común de
estas diferentes moléculas de la Superfamilia de
las inmunoglobuhnas, se ha sugerido que el rol
primitivo de estas moléculas ha sido el de reco­
nocim iento celular, y que una diferenciación
posterior las ha llevado a cumplir distintas fun­
ciones como la adhesión celular, la captación de
ligandos actuando coino receptores, etc. Estas
funciones las cumplen no sólo a través de las
células y tejidos comprometidos con la respues­
ta ininune, sino también con otros tejidos, entre
ellos los componentes del sistema nervioso.
Si bien las m oléculas descritas han sido
identificadas en vertebrados, sería muy impor­
tante tener conocimiento sobre su posible exis­
tencia en invertebrados; ello sería de gran utili­
dad para establecer su evolución estructural y
funcional.
 Anticuerpos 125

Inmunoglobulina Complejo RCT-CD3

(IgM)

F ig . 5-42. Superfam ilia de las imrrunoglobulinas. Las siglas con las que se identifican las diferentes proteínas com i^onen-
tes de esta fam ilia son las indicadas en el cuadro 5-18. Los dom inios señalados con V y Cl presentan sim ilitud con lo s d o ­
m inios V y C de las cadenas H de las inm unoglobulinas. Los identificados con C2 corresponden a estructuras interm edias
com partidas con V y C y son de m enor tam año por estar constituidos po r un núm ero de residuos inferior al co rresp o n d ien ­
te a los dom inios constantes de las inm unoglobulinas. L as m oléculas en las que se representan dom inios distintos a lo s b u ­
cles, corresponden a estructuras no sim ilares a los dom inios V o C de las inm unoglobulinas. El signo (®) indica h id ra to de
carbono. El anclado a m em brana por unión gluco-fosfatidilinositol de algunas de las proteínas está indicado por una flech a
( i ) . (A daptado de W illiam s, A. F., Barclay, A. N. Ann. Rev. Inim unol, 6:381, 1988).
126 Aspectos básicos de ia inmunidad
Cuadro 5-21. Receptores para Fe (humanos)
Am inoácidos
N om enclatura Cadenas PM (kD ) Citopl. Transm.. E xtracel.
huR IFcy S im ple 72 63 21 273
huR IlF cy S im ple 40 76 28 186
huR IIIFcy a-y2aC 2 50-80 25 21 191
huR lF ce a|3Y2 45-65 31 21 180
Receptores para Fe
Por regla general los fragmentos Fe de las
inmunoglobulinas pueden ser fijados a la su­
perficie celular por moléculas del grupo de las
glucosiltransferasas que reconocen la parte hi-
drocarbonada de la molécula, por moléculas si­
milares a leetinas y por los receptores para Fe.
Desde com ienzo de siglo se tenía conoci­
miento de la existencia en el suero de factores
termoestables y termosensibles conocidos co­
mo opsoninas, con capacidad para unirse a bac­
terias y facilitar su captación y fagocitosis por
los macrófagos. Actualmente se sabe que esos
factores son anticuerpos y componentes del sis­
tema complemento, los que se unen a los fago­
citos por intermedio de receptores para esos li­
gandos. A los que tienen capacidad para-fijar
inmunoglobulinas se los designa receptores Fe
(RFC).
Los RFc fueron identificados en el hombre y
otros vertebrados a partir de 1972, cuando se
hicieron los primeros estudios sobre los meca­
nismos de la fijación de complejos Ag-Ac so­
bre linfocitos B y T . Esos estudios estuvieron
dificultados por la metodología disponible en
esos momentos. El advenimiento de los anti­
cuerpos monoclonales, el clonado de líneas ce­
lulares, la citometría de flujo y los estudios a
nivel de genes han permitido tener un concepto
claro sobre estructura, función y relaciones en­
tre los receptores para Fe de las distintas clases
y/o subclases de inmunoglobulinas. Estos re­
ceptores juegan un rol fundamental en aquellos
mecanismos celulares de defensa iniciados por
la fijación del Fe de moléculas de anticuerpos o
complejos inmunes sobre diferentes células del
sistema hematopoyético, entre los que cabe ci­
tar la fagocitosis, la citotoxicidad dependiente
de anticuerpo (ADCC), la citotoxicidad por cé­
lulas NK (“natural killer”), la captura y presen­
tación de antígenos, procesos en los que se ha
demostrado que el evento inicial para los RFc
es la agregación.
Además de participar en funciones efectoras
de la respuesta inmune, los RFc, al interaccio­
nar con los Fe de las moléculas de anticuerpos,
A fin id a d para
CD IgG (Ka) Ig E (K a ) E specificidad
CD 64 I0**-109 I g G l> Ig G 3 > Ig G 4 » Ig G 2
C D w 32 <10’ I g G l= Ig G 3 » Ig G 2 ,Ig G 4
CD 16 <10’ I g G I= lg G 3 » Ig G 2 ,Ig G 4
10‘' IgE
pueden regular otras funciones como la expre­
sión de linfoquinas, otros receptores celulares e
iniciar procesos de diferenciación celular.
Para identificar la inmunoglobulina que son
capaces de fijar, los RFc llevan adicionada la
letra griega de la correspondiente cadena Bl:
RFcy, RFc|i., R F ca, RF ce, RF c5. En aquellos
casos que exista más de un receptor por clase
de inmunoglobulina, la letra R va seguida del
n ú m ero ro m a n o c o rre s p o n d ie n te : R IF cy,
RIIFcy, RIIIFcy, RIFce, RIIFce.
Los receptores para Fe han sido estudiados
en el hombre y otras especies animales como
ratón y rata. Se los identifica anteponiendo a la
letra R las siglas “hu”(humano), “mu”(murino),
“rt”(rata): huRIFcy, muRFcy2b, rtRIFce, etc.
Los receptores para Fe están formados por
un número variable de unidades según el recep­
tor; tien en p o rcio n es in trac ito p la sm á tic as,
transmembránicas y extracelulares, y presentan
dominios similares a los C2 de la Superfamilia
de las inmunoglobulinas, en la que han sido in­
cluidos. Hace excepción a esta regla el RIFce,
que fija moléculas de IgE con uniones de baja
afinidad.
Se han descrito receptores para todos los iso­
tipos de inmunoglobulinas, no obstante, son los
RFcy y los RFce los que han sido mejor estu­
diados y sobre los que se han volcado la mayo­
ría de los análisis estructurales correspondien­
tes a estas moléculas.
Receptores para Fe de IgG en humanos
(huRFcy)
Los receptores para Fe de origen hum ano
con esp ecificid ad para IgG (huRFcy) están
agrupados en tres categorías de acuerdo con su
e stru c tu ra y re a c tiv id a d : R IFcy, R IIF cy y
RIIIFcy. En la figura 5-43 se encuentran esque­
m atizadas dichas estructuras y en el cuadro
5-21 resumidas sus propiedades.
El R IF cy es de alta afinidad, capaz de fijar
IgG monomérica con una constante de afinidad
(Ka) del orden 10“-10’ M*‘. Este receptor está
presente en monocitos y macrófagos, y en poli­
morfonucleares neutrófilos humanos puede ser
 Anticuerpos 127

inducido por interferón gamma (INF-y). En al­ nas estirpes de linfocitos T periféricos. La prin­
gunas líneas de monocitos el INF-y puede in­ cipal característica de este receptor es que en
crem en tar h asta 2 0 veces la expresión del macrófagos y células NK se expresa como una
RIFcy, cuyo número normal por célula oscila proteína transmembránica, en tanto que en neu­
entre 1 x IO'* a 5 x lO"*. La Reunión de Expertos trófilos lo hace como una proteína fijada por
en Antígenos de Diferenciación ha designado a una unión glucano-fosfatidilnositol (fig. 5-43).
huRIFc y como CD64. A diferencia de los otros O tra característica de este receptor es que la
receptores de baja afinidad, que poseen dos do­ proteína posee ácido aspártico, aminoácido car­
minios extracelulares del tipo C2, el huRIFcy gado, en la porción correspondiente al sector
tiene tres. Los dos primeros dominios extrace- transmembránico. La expresión transmembráni­
luiares son homólogos a los dominios corres­ ca del RIIIFcy es dependiente de la coexpresión
pondientes a los receptores RIIFcy y RIIIFcy. de la subunidad y del RIFce o de la subunidad ^
Todo hace presumir que el tercer dominio del del complejo RCT-CD3, ambas con residuos
RIFcy debe desem peñar un rol importante en cargados en el dominio transmembránico.
las uniones de alta afinidad del receptor a li­ Aproximadamente 10^ copias de R IIIFcy se
gandos. El RIFcy tiene una masa relativa de 72 expresan en la superficie de los neutrófilos hu­
kD y la capacidad para fijar los diferentes sub­ manos. Estos receptores están altamente gluco­
clases de IgG humanas varía en el siguiente or­ silados y en geles migran como proteínas de 50-
den: IgG l> IgG 3> IgG 4»IgG 2. 80 kDa, en tanto que los expresados en m acró­
Todos los ensayos señalados parecen indicar fagos lo hacen como proteínas de 53 kD. El fac­
que el RIFcy es univalente. La principal fun­ tor de transformación de crecimiento-p (TGF-
ción efectora en la que el receptor participa es p) aumenta la expresión del RIIIFcy en las su­
la ADCC. perficies celulares. Se identifica al RIIIFcy con
El segundo receptor para IgG humano {hu- el antígeno de diferenciación C D l 6 .
RIlFcy) es una proteína de 40-50 kD, presente En los macrófagos, en los que el receptor es
en una variedad de tipos celulares entre los que de tipo transmembránico, activa la fagocitosis.
se incluyen monocitos, macrófagos, plaquetas, En los neutrófilos, en los que el anclado del re­
eosinófilos y linfocitos B; no se lo encuentra en ceptor a membrana es por unión glucano-fosfa-
células T. tidilinositol, se discute que función cum ple.
Siguiendo las recomendaciones del Comité Ello porque el entrecruzamiento de este recep­
de Expertos en Antígenos de Diferenciación se tor mediado por un anticuerpo anti-receptor es­
lo designa CDw32. A nivel genómico se han pecífico induce en los neutrófilos aumento de
identificado tres genes denominados IIA, IIB y calcio libre en el citosol y de actina F, lo que
IIC los que codifican seis transcriptos. Todos estaría indicando que es capaz de mediar algu­
ellos se expresan en monocitos; IIA y IIC se na señal transm em bránica aunque no se en­
expresan en polimorfonucleares neutrófilos y cuentre insertado en ella.
algunas células pluripotenciales, y no lo hacen En cuanto a la especificidad por las inmuno-
en linfocitos y células NK. HuRIIBFcy se ex­ g lo b u lin as es sim ila r a la in dicada p a ra el
presa preferencialm ente en linfocitos. Su nú­ RIIFcy.
mero por células es variable, siendo del orden
de 10-’ en plaquetas, 3 x 10“ en neutrófilos y 2,6 Receptores para Fe de IgE en humanos
X lO"”en macrófagos alveolares. (RFce)
A diferencia del RIFcy, el receptor RIIFcy es
de baja afinidad para IgG monomérica; los va­ Se conocen dos receptores capaces de inte­
lores de Ka son inferiores a 10’ M ‘. No obstan­ raccionar con el fragmento Fe de IgE; el RIFce
te, la función de receptor ha sido demostrada lo hace con una unión de alta afinidad y el
por la capacidad para fijar inmunocomplejos y RIIFce con baja afinidad. Solo el RIFce está re­
se considera que podría participar en fagocito­ lacionado con la Superfamilia de las inm uno-
sis mediada por células mononucleares y poli­ globulinas.
morfonucleares neutrófilos. Se estima también El RIFce es el componente de la superficie
que RIIFcy puede mediar ADCC y la liberación celular que inicia las reacciones alérgicas (véa­
de anión superóxido y factor necrosante de tu- se cap. 32) y a diferencia de los receptores Fcy
mores-(x (TNF-a). y sólo está presente en mastocitos y células ba-
La especificidad de huRIIFcy para las sub­ .sófilas. Su activación induce en estas células
clases de IgG humanas es similar para IgG l e degranulación y liberación de contenidos gra­
IgG3, la que a su vez es mayor que la corres­ nulares como histamina, la síntesis y secreción
pondiente a IgG2 e IgG4. de ácido araquidónico y sus metabolitos como
El huR IIlF cjes un receptor que no se expre­ ias prostaglandinas y los leucotrienos. Además,
sa en monocitos, pero que lo hace en macrófa­ esta activación celular induce la síntesis y se­
gos, neutrófilos, eosinófilos, células NK y algu­ creción del factor estim ulante de colonias de
128 Aspectos básicos de ía inmunidad
CD64
RIFcy
CDw32
RIIFCy
Extracelular
Membrana
celular
Citoplasma
(y/02
RIFCe
F ig. 5-43. Estructura esquem ática de los receptores para el fragm ento Fe de inm unoglobulinas.
granulocitos y macrófagos (GM-CSF) e inter­
leuquinas (IL -la, lL-3, IL-4, IL-5, IL- 6 , INF-y)
entre otras. Para que la activación celular tenga
lugar se necesita, en primer término, que la IgE
sintetizada por linfocitos B se fije al RIFce, y
luego que la IgE fijada, a través de su paratope
interaccione con su antígeno específico multi­
valente. El receptor es univalente y fija IgE mo­
nomérica y la interacción con el antígeno multi­
valente determina agregación del receptor, he­
cho fundamental para que el fenómeno se haga
efectivo. La interacción previa de la IgE con el
antígeno y su posterior unión al RIFce no es su­
ficiente para la acüvación celular.
El RIFce está constituido por 3 cadenas pep­
tídicas denominadas a , |3 y y. Su unión al Fe de
IgE es con alta afinidad (Ka = 10‘" M"' y al
igual que el RIIIFcy, la cadena a , necesita de la
coexpresión de las cadenas p y y para un co­
rrecto ensam blado y transporte a membrana.
CD16 C D 16TM
RIIIFCy RIIIFOy
(T/Q2
GPI
Extracelular
Membrana
celular
RFC, Citoplasma
Esta cadena y es la misma que usa el RIIIFcy;
en cuanto a la cadena p, relacionada con CD20,
no se conoce qué función cumple.
Se ha demostrado que en el RIFce, la cadena
a está asociada con una cadena p y dos cade­
nas y unidas entre sí por un puente di sulfuro. El
sitio de unión en el receptor consiste en tres re­
giones localizadas en el segundo dominio ex­
tracelular de la cadena a . Este receptor se ex­
presa muy temprano durante la diferenciación
celular de los mastocitos y células basófilas;
células en los primeros estadios de diferencia­
ción ya lo expresan en sus membranas.
De los tres dominios que integran el frag­
mento Fce (Ce2, Ce3, Ce4), una porción ubica­
da entre Ce2 y Ce3 es la que se une al RIFce.
La unión de IgE a RIFce es relativamente es­
pecífica. Otros isotipos no coinpiten con IgE,
pero IgE de otras especies como las de rata y
ratón se unen al huRIFce.

El huRIlFce, identificado como la proteína
de membrana CD23, es una proteína glucosila­
da de 45 kD la que ha sido clonada y secuen-
ciada. Está constituido por un segmento cito­
plasmático de 23 aminoácidos, uno transmem­
bránico que contiene 2 1 residuos hidrofóbicos
y un resto extracelular de 277 residuos. El
CD23 tiene una orientación inusual, con el re­
siduo N-terminal en el citoplasma y el C-termi­
nal extracelular.
Se han identificado dos formas alélicas de­
nominadas RlIaEce y RIlbFce.
Se expresa en la m em brana de monocitos,
macrófagos, eosinófilos, plaquetas y linfocitos.
Es un receptor que une IgE con baja afinidad y
no está comprometido en el desencadenamien­
to de reacciones alérgicas.
Se desconoce cuál es su función; no obstante
se ha descrito que la isoforma RIIbEcs expresa­
da en monocitos y eosinófilos, y no la RIIaEce
expresada en linfocitos B, es capaz de mediar
fagocitosis de complejos formados por anticuer­
pos de la clase IgE. Otras funciones atribuidas
como liberación de ácido araquidónico y sus
metabolitos cuando linfocitos interaccionan con
inm unocom plejos de IgE son dubitativas, ya
que en esos experimentos no puede descartarse
que los resultados obtenidos estén mediados por
otros receptores diferentes al RIIFce o CD23.
Conviene recordar sobre el particular que re ­
cientem ente se ha dem ostrado que RIIEcy y
RIIIFcy fijan inmunocomplejos de IgE.
La presencia de un factor soluble de unión a
IgE o CD23 soluble, resultante del clivaje pro­
teolítico de RIIFce, ha sido demostrada y se es­
pecula que el mismo podría jugar un papel im ­
portante en la regulación de la síntesis de IgE.
Receptor para Fe de IgM
Hace tiempo fué descrito un receptor especí­
fico para IgM, el RFc|ii, presente en linfocitos
B humanos y murinos. Es inhibido por IgM
pentamérica, en tanto que resultan inefectivas
proteínas monoclonales de las clases IgG, IgA
e IgE, ensayadas a concentraciones 200 veces
superiores a las usadas para IgM. La unión del
Fc|j, al receptor se hace a través del dominio
Cj.,3, sin la participación de C,_,l, Cj^2 o Cj^4. Se
ha demostrado que el receptor fija únicamente
IgM pentamérica, por lo que se estima que es
de baja afinidad.
No se conoce su estructura. No se tiene in­
formación sobre clonado o secuenciación de
este receptor, ni cuál es la función que real­
mente cumple.
Receptor para Fe de IgA
En granulocitos neutrófilos, m onocitos y
Anticuerpos 129
macrófagos humanos se ha descrito la presen­
cia de un receptor para IgA de masa relativa de
60 kD, cuyo ADNc codifica una proteína de
287 aminoácidos que presenta homología con
receptores para Fcy y con el receptor para IgE
de alta afinidad (RIFce). Presenta una arginina
en la región transmembránica, hecho anómalo
que recuerda lo ya descrito para RIIIFcy.
Este receptor, que es distinto al RPolylg que
transporta IgA polimériea a través de epitelios,
media por parte de neutrófilos y monocitos fa­
gocitosis de partículas recubiertas con IgA y
secreción de anión superóxido.
Receptor para Fe de IgD
E stu d io s prelim in ares parecen in d ic a r la
existencia de un receptor para IgD, denomina­
do RFc 6 , presente en células B normales y neo­
plásicas. Esos datos reflejan la posible existen­
cia de un receptor para Fe de IgD, pero la m is­
ma deberá ser confirmada.
Receptores similares a los descritos para los
fragmentos Fe de los diferentes isotipos de in­
munoglobulinas humanas se han encontrado en
otras especies animales, como ratón y rata, en
los que se ha demostrado, especialmente para
los REcy, la especificidad de subclase que p o ­
seen, las funciones que cumplen y sus relacio­
nes con ios receptores para Fe de origen h um a­
no.
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El origen de la diversidad
de los anticuerpos
M. LEONARDO SATZ
RICARDO MARGNI
T eorías sobre el origen de la diversificación
de los anticuerpos
A principios de siglo, Ehrlich postuló la teo­
ría de “los receptores celulares específicos”, se­
gún la cual el antígeno (Ag) interactúa con “re­
ceptores” específicos en la superficie de las cé­
lulas productoras de anticuerpos (Ac) y activa
las mismas para producir más Acs. Esta idea es
bastante aproximada a la concepción actual de
la selección clonal. En la década del ’30, Hau-
rovitz y luego Pauling postularon las llamadas
teorías instructivas, que intentaron explicar el
am plio repertorio de reconocim iento de los
Acs, aun contra moléculas sintéticas. Se postu­
ló que existía una única molécula de Ac, de es­
tructura flexible, a la cual el Ag, al actuar como
molde, instruía de forma de determinar su es­
tructura tridimensional única y específica con­
tra él. Hacia la década del ’60, los avances en
la determinación de las secuencias aminoacídi­
cas de los primeros Acs mostraron su diversi­
dad en moléculas dirigidas contra Ags distintos
e hicieron insostenibles estas teorías.
Predominaron luego las llamadas teorías se­
lectivas y, en especial, la noción de la selección
o expansión clonal sugerida por Burnett y Jer-
ne. Se postuló que cada linfocito B es capaz de
producir Acs de una especificidad única y que
el Ag selecciona, activa y expande el clon es­
pecífico. Para explicar el origen de la diversi­
dad de los Acs en cada clon, se postularon dos
ideas alternativas esenciales; la existencia de
miles de genes para cadenas pesadas (H) y li­
vianas (L) en la línea germinal, o la existencia
de un solo gen sobre el cual se acumulan muta­
ciones específicas para cada clon (ya sea du­
rante la vida embrionaria o durante la diferen­
6
ciación linfocitaria B). Teniendo en cuenta la
longitud de las cadenas L y H, se ha estimado
que se requeriría un 15% del genoma de un
mamífero para codificar los Acs diferentes. Los
entusiastas de estas nociones justificaban que
los anim ales superiores destinasen una gran
fracción de su genoma para un mecanismo in­
mune de gran valor para su supervivencia.
Hacia principios de la década del ’60 se d e­
terminaron las secuencias aminoacídicas de va­
rias cadenas L diferentes. Se observó que todas
las cadenas difieren entre sí y que todas las di­
ferencias están localizadas en los primeros 106
aminoácidos del extremo aminoterminal (lo que
llamamos región variable de la cadena liviana o
VL). En 1965, Dreyer y Bennet razonaron que,
si es que existen cientos de miles de genes, de­
bía existir un mecanismo especial por el cual
luego de millones de años de evolución se haya
preservado sin cambios la región constante (C)
y sí se hayan acumulado variaciones o m utacio­
nes sobre la región V. Postularon como explica­
ción alternativa que, en el genoma, la informa­
ción para una cadena L no se halla en una se­
cuencia nucleotídica continua, sino fragmenta­
da, con la presencia de uno o muy pocos genes
que codifican para la región C y cientos o miles
de genes para la región V. Estos postulados p re­
decían que, si existe un solo gen para la región
C, una mutación que altere sus secuencias en un
gameto o cigota, el cambio se verá reflejado en
todas las cadenas. Postulaban además que, n e ­
cesariam ente, la información presente en los
bloques separados debía generar un gen o un
ARNm continuo para garantizar la síntesis de
una cadena proteica. Estas nociones, sumamen­
te radicales en su momento, resultaron ser esen­
cialmente correctas, como lo han dem ostrado
130 Aspectos básicos de la Inmunidad
D ay, E. D. “A dvanced Im m unochem estry, 2“ ed. W iley-
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C D R H 3 in an tib o d ies” , Proteins: Struct. Funct. Genet.
16:1, 1993.
El origen de la diversidad
de los anticuerpos
M. LEONARDO SATZ
RICARDO MARGNI
T eorías sobre el origen de la diversificación
de los anticuerpos
A principios de siglo, Ehrlich postuló la teo­
ría de “los receptores celulares específicos”, se­
gún la cual el antígeno (Ag) interactúa con “re­
ceptores” específicos en la superficie de las cé­
lulas productoras de anticuerpos (Ac) y activa
las mismas para producir más Acs. Esta idea es
bastante aproximada a la concepción actual de
la selección clonal. En la década del ’30, Hau­
rovitz y luego Pauling postularon las llamadas
teorías instructivas, que intentaron explicar el
am plio repertorio de reconocim iento de los
Acs, aun contra moléculas sintéticas. Se postu­
ló que existía una única molécula de Ac, de es­
tructura flexible, a la cual el Ag, al actuar como
molde, instruía de forma de determinar su es­
tructura tridimensional única y e.specífica con­
tra él. Hacia la década del ’60, los avances en
la determinación de las secuencias aminoacídi-
cas de los primeros Acs mostraron su diversi­
dad en moléculas dirigidas contra Ags distintos
e hicieron insostenibles estas teorías.
Predominaron luego las llamadas teorías se­
lectivas y, en especial, la noción de la selección
o expansión clonal sugerida por Burnett y Jer-
ne. Se postuló que cada linfocito B es capaz de
producir Acs de una especificidad única y que
el Ag selecciona, activa y expande el clon es­
pecífico. Para explicar el origen de la diversi­
dad de los Acs en cada clon, se postularon dos
ideas alternativas esenciales; la existencia de
miles de genes para cadenas pesadas (H) y li­
vianas (L) en la línea germinal, o la existencia
de un solo gen sobre el cual se acumulan muta­
ciones específicas para cada clon (ya sea du­
rante la vida embrionaria o durante la diferen­
6
ciación linfocitaria B). Teniendo en cuenta la
longitud de las cadenas L y H, se ha estimado
que se requeriría un 15% del genoma de un
mamífero para codificar los Acs diferentes. Los
entusiastas de estas nociones justificaban que
los anim ales superiores destinasen una gran
fracción de su genoma para un mecanismo in­
mune de gran valor para su supervivencia.
Hacia principios de la década del ’60 se d e­
terminaron las secuencias aminoacídicas de va­
rias cadenas L diferentes. Se observó que todas
las cadenas difieren entre sí y que todas las di­
ferencias están localizadas en los primeros 106
aminoácidos del extremo aminoterminal (lo que
llamamos región variable de la cadena liviana o
VE). En 1965, Dreyer y Bennet razonaron que,
si es que existen cientos de miles de genes, de­
bía existir un mecanismo especial por el cual
luego de millones de años de evolución se haya
preservado sin cambios la región constante (C)
y sí se hayan acumulado variaciones o m utacio­
nes sobre la región V. Postularon como explica­
ción alternativa que, en el genoma, la informa­
ción para una cadena L no se halla en una se­
cuencia nucleotídica continua, sino fragmenta­
da, con la presencia de uno o muy pocos genes
que codifican para la región C y cientos o miles
de genes para la región V. Estos po.stulados pre­
decían que, si existe un solo gen para la región
C, una mutación que altere sus secuencias en un
gameto o cigota, el cambio se verá reflejado en
todas las cadenas. Postulaban además que, n e ­
cesariam ente, la información presente en los
bloques separados debía generar un gen o un
ARNm continuo para garantizar la síntesis de
una cadena proteica. Estas nociones, sumamen­
te radicales en su momento, resultaron ser esen­
cialmente correctas, como lo han dem ostrado
132 Aspectos básicos de la inmunidad

independientemente Tonegawa y Leder una dé­ demostrado previamente la existencia de dos

cada más tarde, mediante el uso de técnicas de
ADN recombinante.
Los genes de inmunoglobulinas
se reordenan durante la ontogenia:
su hallazgo experimental
Los primeros experimentos que analizaron la
complejidad de los genes de Igs fueron realiza­
dos por P. Leder y col. en los Institutos Nacio­
nales de la Salud (NIH, E E.U U .) en el año
1974. E stos in v estig ad o re s p u rifica ro n un
ARNm para cadena liviana kappa y sintetiza­
ron un ADN complementario (ADNc) para la
porción constante del mismo, al cual marcaron
con ^H. Usaron esta “sonda” para evaluar su ci­
nética de hibridación a ADN de distintos tipos
celulares, en forma comparativa con la cinética
de un gen de beta globina, para el cual habían
copias por célula. Sus resultados sugirieron la
existencia también de sólo dos genes por célula
para la región constante de la cadena Lj^.
En 1976, Hozum i y T onegaw a usaron un
ARNm purificado de un mieloma (tumor plas-
mocitario) productor de cadenas livianas lamb­
da, para analizar la organización de los respec­
tivos genes en el ADN nuclear. Para ello, puri­
ficaron ADN embrionario y ADN del mieloma
de ratón (que representan tejidos indiferenciado
y diferenciado en producción de anticuerpos,
respectivamente) y los fragmentaron con una
endonucleasa de restricción. Luego fracciona­
ron por eleetroforesis el ADN, purificaron nu­
merosas fracciones según su tamaño molecular
e hibridaron cada una de las mism as con el
ARNm antes mencionado (fig. 6-1). El ARNm
hibridó con dos fragm entos distin to s en el
ADN em brionario pero hibridó con un solo

ADN EMBRIONARIO ADN DE MIELOMA

V 0

Fragmentación con
endonucleasas de
restricción

i Separación de los
fragmentos según
tamaño por elec-
troforesis
V C
/ - V jI

i Hibridación con
ARNm radioactivo

Dos bandas de hibridación Una sola banda de hibridación

una posee el gen V y otra el C conteniendo los genes V y C en
el mismo fragmento de ADN

F ig . 6 -L Experim entos que m ostraron la diferente organización de los genes de inm unoglobulinas en el ADN em brionario
y en el ADN de células productoras de anticuerpos.
 El origen de la diversidad de ios anticuerpos 133

fragmento (diferente de los anteriores) en el
ADN del mieloma. Los datos sugirieron que
las secuencias que codifican para las regiones
C y V se hallan separadas en el ADN e m ­
brionario y que se han “rearreglado” en un solo
fragmento en el ADN de hnfocitos B maduros.
Los mismos resultados fueron confirmados m e­
diante la técnica de “Southern b lo f’, mediante
la cual el ADN fragmentado, luego de su frac­
cionamiento por eleetroforesis, es desnaturali­
zado y transferido a una m em brana para su
posterior hibridación.
Familia de genes de cadena liviana
k ap p a ( k )
En humanos, está localizada en el cromoso­
ma 2 banda p l l y en el ratón en el cromosoma
6 . La región constante de la cadena liviana ka­
ppa está codificada por un único gen constante
denominado C k , cuya secuencia nucleotídica
mostró la presencia de información para los re­
siduos 109 hasta el 214 de la cadena polipeptí-
dica.
La inform ación p ara región variable está
segmentada en dos familias de genes, denom i­
nadas V K y Jk, locahzadas en el mismo crom o­
soma, aunque a decenas de miles de nucleóti­
dos de C k (fig. 6-2). Hay aproximadamente 50
genes V k distintos, cada uno precedido p o r un
pequeño exón (bloque codificante de ADN) pa­
ra el péptido señal (leader peptide), del cual es­
tá separado por un pequeño intrón (bloque no
codificante de ADN). Este péptido señal le per­
mite a la cadena su traslocación a través de las
m em branas del retículo endoplasm ático (du­
rante el cual es chvado) para su expresión su­
perficial o secreción. La secuencia de A D N de
cada gen V k revela la información para los úl­
timos tres residuos del péptido señal y los pri­
meros 95 aminoácidos de la región variable. En
el hom bre hay cinco genes J k , muy cercanos
entre sí, cada uno de los cuales puede codificar
para los residuos 96 a 108 de la cadena liviana.
Esta fam ilia está localizada entre los genes V k
y el gen C k , a unas 3 kb (3.000 bases) de este
último (fig. 6-2). Esta organización de la fam i­
lia kappa es la hallada en todas las células del

CADENA K

Vk, V k, Vk „ Jk Ck

ADN"
germinal « k -i -it-
1 2 3 4 5 Reordenamiento del ADN

L Vk J Ck
A
ADN
reordenado
4 5

Transcripción y empalme del pre ARNm

L Vk J Ck
ARNm I

Traducción y transporte de la proteína

Proteína madura k
presente en el
anticuerpo

Sk QX. Sk CA.3 J?. QX, JA, c:

40kb

F ig. 6-2. A . O rganización genóm ica en las familias de cadena liviana kappa. Se indican los residuos codificados p o r los
bloques L, V, J y C. Se m uestra un reordenam iento hipotético de un gen Vj^ hacia un gen B. O rganización gen ó m ica
en la fam ilia de cadena liviana lambda. El tramo de A I)N que contiene a los genes CA.2 y C a3 posee una longitud v ariab le
en los distintos individuos, con la presencia de 2, 3, 4 o 5 genes constantes (polim orfism o poblacional); esto d eterm in a
que el níím ero total de genes C a oscile entre 6 y 9, segtin el individuo. Los tres p rim eros genes constantes se c o rre sp o n ­
den con los m arcadores isotípicos M cg, Ke-Oz- y K e-O z+,
134 Aspectos básicos de la inmunidad
organismo, excepto las del linaje B, y se deno­
mina organización germinal. El ratón posee 4
J k funcionales. Durante la diferenciación linfo-
citaria B, cada linfocito elige uno de los genes
V k (acompañado de su propio exón líder) y lo
reacomoda delante de alguno de los genes J,^.
A parentem ente la selección del gen V k y Jk
por cada célula es al azar. Luego de este reor­
denamiento genético, los genes V k y Jk previa­
mente localizados entre el V k y Jk elegidos, se
pierden. Nótese en la figura 6-2 que ahora se
ha ensamblado un bloque variable kappa conti­
nuo (la suma de V -i- J), a continuación del cual
todavía pueden hallarse otros genes Jk. Esta
nueva disposición de los genes se denom ina
configuración reordenada y es la que será
transcripta por la célula B en un precursor del
ARNm. Este precursor com ienza con la se­
cuencia del exón líder, continúa con el intrón
que lo separa del gen Vk, el gen V k contiguo a
un gen Jk, los restantes Jk presentes a conti­
nuación del usado (separados por pequeños in­
trones), y un intrón hasta el gen C k , Durante su
m igración del núcleo al citoplasma, este pre-
ARNm madura, adquiere las modificaciones en
los extremos 5’ y 3’ (cap y poli A) y “empal­
m a” el exón señal con el V k-Jk y el C k , elimi­
nando los intrones y los Jk presentes a conti­
nuación del usado (“splicing” o empalmado del
pre ARNm). Ya en el citoplasm a, el ARNm
maduro se traduce en polirribosomas de retícu­
lo rugoso.
Complejidad de la fam ilia Vk: Los genes
V k humanos se agrupan en siete familias dis ­
tintas, según el grado de hom ología que po­
seen entre sí. Existen a! menos 76 genes V, de
los cuales 40 están localizados en un tramo de
600 kb de AND proximales al locus Ck; 38 de
estos 40 genes Vk, poseen la mism a orienta­
ción de transcripción que el locus Jk-C k y se
reordenan por mecanismos de acercamiento y
deleción (véase más adelante Mecanismos de
reordenamiento genético). H acia 5 ’ de esta re­
gión de genes Vk, hay un segmento de ADN
de 800 kb que aparentemente carece de genes
V y a continuación hay un segmento de 440
kb que posee los otros 36 genes V k ; los genes
V de este segmento distal tienen orientación
de transcripción inversa al locus J k - C k y se
re o rd e n a n p o r m e c a n ism o s de in v e rs ió n
(véase más adelante). De los 76 genes identi­
ficados, 26 no serían funcionales (seudoge-
oes) y de los otros 50, sólo la mitad (los más
proximales al locus C k ) se reordenan frecuen­
temente. Un estudio reciente de W inter y col.
mostró que en más de 200 ADNc de cadenas
livianas k , los V k más distales al locus C k es­
taban representados en m enos del 5%; esto
podría deberse a las distancias relativas de las
regiones proximales y distales respecto de Jk-
Ck, o al mecanismo diferente de recom bina­
ción que se requiere para producir un rearre­
glo productivo. Es interesante notar que en la
población existe un haplotipo frecuente (deno­
minado haplotipo 11) que carece de un seg­
mento de aproximadamente un millón de nu­
cleótidos (1 Mb) de la región distal y por lo
tanto le faltan los 36 genes V k de esta región;
los portadores homocigotas de este haplotipo
son tan inmunocompetentes como los que po­
seen la dotación genética completa.
Familia de genes de cadena liviana
lambda (X)
Aproximadamente un tercio de los anticuer­
pos humanos poseen cadenas hvianas lambda;
en el ratón constituyen menos del 10%. Los ge­
nes para esta fam ilia están en el crom osom a
22ql 1 humano y cromosoma 16 murino. A di­
ferencia de la familia kappa, existen varios ge­
nes que codifican para la porción constante,
Ck, cuyo número varía entre 6 y 9 según el in­
dividuo. Cada uno de estos genes constantes
está precedido por un gen iX propio (fig. 6 -2 ).
La secuencia nucleotídica de los prim eros
tres genes constantes reveló que se correspon­
den con los marcadores isotípicos Mcg, Ke-Oz-
y Ke-Oz+ presentes en el suero humano (fig.
6-2). Estas tres cadenas son muy parecidas en­
tre sí, difieren en 1-4 aminoácidos, lo que hace
sospechar de una duplicación reciente de estos
genes.
Por otro lado, existen numerosos genes VX,
cada uno de los cuales codifica para los prime­
ros 95 aminoácidos de la proteína, y cada uno
acompañado de su propio exón señal. Para el
ensamblado de una configuración reordenada,
uno de los genes V k se reacomoda próximo a
uno de los genes J?i, donde ya queda definido
cuál de los genes CA, se usará. Nótese que aun
cuando el gen C k no contribuye con diversidad
de reconocimiento, sí lo hace cada uno de los
JA. que lo acompañan.
Complejidad de lafamilia VX. Se han identificado
en el humano al menos 67 genes VA en un segmento
de 850 kb de DNA, aunque un 40% de los mismos
parecen ser seudogenes. Se los agrupa en diez fami­
lias, con más de 75% de homología entre miembros
de una misma familia y 55-69% de homología ínter-
familia. En esta región también se localiza el gen pa­
ra la cadena VpreB cuyo producto forma parte del
receptor pre B (véase más adelante).
En el ratón se han identificado cuatro genes cons­
tantes (aunque uno no es funcional), cada uno tam­
bién acompañado de un gen J. Como se observa en
la figura 6-2, se los halla en unidades agrupadas de a
dos, cada uno precedido de un solo gen VA. El ratón
posee entonces, sólo dos genes YA.
 El origen de la diversidad de los anticuerpos
Familia de genes de cadena pesada
Están localizados en el cromosoma 14q32.3
humano, estimándose la longitud total del lo­
cus en 1500 kb. Esta familia posee una organi-
zación algo más compleja: existen varios ge­
nes constantes, uno por cada isotipo de cadena
pesada conocido; cada gen constante está a su
vez organizado en intrones y exones que co­
rresponden a los diversos dominios constantes
CHI, CH2, etc.; finalmente la información pa­
ra región variable de la cadena pesada está
subdividida en tres familias de genes (en lugar
de dos), denominados V,.,, y (véase fíg.
6-3).
Cada gen posee información para los pri­
meros 99 am inoácidos de la región variable.
Hacia 5’, luego de un intrón de unas 80-100 bp,
cada gen está precedido de un exón que co­
difica los primeros 15 residuos del péptido se­
ñal (los cuatro aminoácidos restantes están co­
dificados al comienzo del exón V^,),
Complejidad de la familia En el ser humano,
esta región se extiende por una lOÜÜ Kb, que co­
mienzan a unas lü Kb 5’ de la región D|_|. Los estu­
dios más recientes de mapeo han identificado 87 ge­
nes V,_|, de los cuales 29 son seudogenes y al menos
46 han sido hallados en inmunoglobulinas (esto es,
son funcionales). Al igual que en los loci de cadenas
livianas, aquí también hay algunos segmentos (con­
teniendo 1 a 4 genes V^,) duplicados o delecciona-
dos, según el individuo estudiado. De acuerdo a su
homología se los agrupa en siete familias, con más
de 80% de homología entre los miembros de una
misma familia; las familias V„3, V,j4 y V^^l son las
que más miembros poseen.
La familia de genes D„ está compuesta por
un número aproxim ado de 20 miembros. En
general están agrupados en un tramo de 1 0 0 kb,
aunque otros están intercalados con genes y modifica luego del “switch” isotípico.
uno solo está junto a la familia J,_|. l^a secuencia
nucleotídica de estos genes indica que cada
segmento D codifica para 3-4 aminoácidos.
La familia de genes en humanos posee 9
miembros de los cuales 3 no son funcionales
(seudogenes); el ratón posee cuatro J^. Cada
uno codifica para un tramo de 1 0 - 1 2 aminoáci­
dos. Todos los genes y C,_, poseen la
misma orientación de transcripción, lo que tie­
ne implicancias con los mecanismos de reorde­
namiento (véase más adelante).
Hacia la derecha de la familia (hacia 3’), y
a una distancia de 8 kb de la misma, comienza
la familia de genes Ch, esparcidos a lo largo de
unas 150 kb (fig. 6-3). El orden de los mismos
es el siguiente: C|a., C 8 , Cy 3, C yl, Ce2 (un
seudogén). C a l, Cy2, Cy4, C el y C a2. Esta
organización sugiere que estos genes se han
135
originado de la duplicación de un bloque an­
cestral y-y-£-a.
Durante la diferenciación de los linfocitos B,
uno de los prim eros eventos m adurativos lo
constituye el reordenamiento de los genes de
cadena pesada. wSe produce primero la elección
de un gen D,_j que será reacomodado próxim o a
uno de los genes J^,, con la pérdida de los genes
comprendidos entre ellos. En una segunda eta­
pa, se produce el reordenamiento de uno de los
genes Vj_j próximo al bloque Djj/J|,. Esta orga­
nización reordenada V/D/J-C|J, es la que será
transcripta y los intrones y genes Jj, adicionales
serán eliminados durante el “splicing” del pre-
RNAm.
En el ratón el locus H se halla en el crom o­
soma 1 2 . Todos los genes C¡_, son funcionales,
para la generación de cadenas pesadas mu,
delta, gamma 3, gamma 1, gamma 2b, gam m a
2a, epsilon y alfa. Por lo tanto el ratón ha du­
plicado sus genes gamma sin afectar los épsi-
lon y alfa.
Cambio de isotipo de cadena
pesada
Durante la activación de los linfocitos B en
la respuesta primaria, la mayoría de las células
producen activam ente IgM. Algunas células
del clon en expansión dejan de sintetizar cade­
na pesada mu y comienzan a sintetizar algún
otro isotipo: gamma, épsilon o alfa. Para ello,
la célula padece un nuevo evento de reordena­
m iento genético, por el cual todo el b loque
VDJ se reacom oda próxim o a un nuevo gen
constante; se elim inan los genes constantes
presentes entre C¡i (incluido él) y el nuevo gen
C,_| elegido (fig, 6-3). Nótese que todo el con­
junto VDJ continúa codificando a la porción
variable de la cadena pesada, por lo que la es­
pecificidad de reconocimiento antigénico no se
Se han id en tificad o las secuencias en el
ADN que intervienen en estos procesos de re­
combinación: se denominan sitios S y están lo­
calizadas previo a cada gen C^, excepto a C5
que no la posee. Se trata de secuencias repetiti­
vas de ADN que interactúan entre sí, diferentes
a las que operan en los reordenamientos antes
descritos. Hay evidencias de que un m ism o
clon celular puede realizar cambios sucesivos
de isotipo de cadena pesada, hacia genes Cj^
más distales.
El cambio de isotipo es un fenómeno que de­
pende de la cooperación de las células T (véase
cap. 2). Las células T proveen señales a través
de moléculas de membrana (como CD40) y a
través de citoquinas; por ejemplo IL-4 prom ue­
ve el cambio a isotipos IgE e IgG4, T G F p e
IL -6 a IgA, IIv-10 a IgG, e IgG^,
136 Aspectos básicos de la inmunidad

ADN GERMINAL

LVH, LVH,D„ LVH„ Dh J„ Cfx C5 Cy. C'/i xj/Eg Ccx., Cy, Cy| C e^ CíXg

1500 100 58 51

Reordenamiento durante la diferenciación

L V DJJ Ii cC|j,
u C5 CYj Cy, \|/ej Ca, Cy^ Cy^ Ce, Ca^
ADN
REORDENADO

Cambio (“switch”) isotípico

durante la expansión clonal

L V DJ J Ca,

pre-RNAm
H O lK t ADN

Transcripción y
ensamblado (“splicing”)

L V DJ Ca^
Producción Producción de
L V DJ CS simultánea de
lOIII cadena pesada

I
cadenas n y y

F ig . 6-3. O rganización genóm ica en la fam ilia de cadena pesada. El círculo negro que precede a cada gen constante (ex ­
cepto C8) indica los sitios S. El pequeño cuadrado que sigue a la fam ilia de genes J„ representa al enhancer de cadena p e­
sada. Los genes pesados están esquem atizados sin la subdivisión en exones e intrones. V éase texto para seguir los proce­
sos de reordenam iento y expresión.

7 9 9 7
23 12
V

■
M r , A r , A G T G | ------- — ------- [ a CATAAAC c !-------- / / -------(g GTTTTTG t ] ¡CACTGTG
■
CADENA K

IJ k

23

CADENA PESADA

— 7 9 23
23 A ...... 12 12 ®

F ig . 6-4. A. H eptám eros, nonám eros y espaciadores que acom pañan a los genes de las tres lam ilias de cadenas de inm u­
noglobulinas.
 El origen de la diversidad de los anticuerpos 137

L Vk,3

F ig. 6-4 (coni.). B. A proxim ación espacial de los genes V y J que recom binan. La estructura secundaria estaría esta b iliza­
d a por el apaream iento de las bases com plem entarias de heptám eros y nonám eros.

Mecanismos de reordenamiento genético servados en longitud y secuencia (fig. 6-4A).

El análisis de las secuencias de ADN flan­
queantes a los genes V, D y J de cadena pesada
y V y J de cadena liviana, mostró un patrón
muy conservado de nucleótidos, que se denomi­
nan secuencias de reconocimiento o RS, y que
tienen un papel muy importante en los mecanis­
mos de reordenamiento. Los genes de inmuno-
globulinas con RS mutados (por ej. en ciertos
seudogenes o por mutaciones realizadas delibe­
radamente in vitro) no pueden reordenarse.
En posición 3 ’ a cada gen V existe un tramo
de siete nucleótidos, heptámero (idéntico en to­
dos los genes); a continuación se halla un tra­
mo de 12 o 23 nucleótidos (segtín la familia)
conservados en longitud pero no en secuencia
(denominado espaciador o “spacer”). F inal­
mente, sigue un nonámero (9 nucleótidos) con­
Un ordenamiento similar de heptámeros, espa­
ciadores y nonámeros está presente también al
comienzo y fin de cada gen D„ y precediendo a
cada gen J,
Una inspección cuidadosa de las secuencias
de los heptámeros y nonámeros que siguen al
final de los genes V y D revela que es com ple­
mentaria a la presente en los heptámeros y no­
námeros que preceden a los genes D y J (véase
fig. 6-4A). Esto hace pensar que estas secuen­
cias podrían facilitar el acercamiento de los ge­
nes que interactúan, prom oviendo el ap area­
miento de los tramos complementarios en una
de las hebras del ADN (fig. 6-4B). Estas “hor­
quillas” poseen en su base a los genes acerca­
dos, con los tramos de ADN entre ambos hacia
arriba. Esta estructura secundaria se generaría
por el apareamiento de las bases complementa­
138 Aspectos básicos de la inmunidad
rias antes m encionada, y sería la reconocida
por un sistema enzimático especializado en su
eliminación.
En cada familia de genes, la organización de
los espaciadores hace que siempre el reordena­
miento ocurra entre un gen con espaciador de
12 y otro de 23. Los espaciadores de 12 y 23
bases equivalen, respectivamente, a una y dos
vueltas de la doble hélice del ADN. Estas ca­
racterísticas peculiares de la regla 12/23 sugie­
ren que esta organización aportaría señales im­
portantes para la recombinación.
M a q u in a r ia e n z im á tic a in v o lu c r a d a e n la r e c o m ­
b in a c ió n . Al conjunto de enzimas y proteínas res­
ponsables de los reordenamientos genéticos recién
descritos, se denomina r e c o m b in a s a . Hay tres evi­
dencias indirectas que sugieren que una misma re­
combinasa V(D)J opera en el ünaje B y el T (véase
cap. 7): (a) los loci que reordenan están flanqueados
por RS (heptámeros, espaciadores, nonámeros) con­
servados; (b) ocurren reordenamientos D-J en los lo­
ci beta del receptor T y de la cadena pesada mu en
linfocitos B y T respectivamente; (c) los mismos dos
genes R A G (véase más adelante) que pueden inducir
recombinaeión V(D)J en células de linaje no-linfoi-
de, se expresan coordinadamente en linfocitos B y T
en los estadios de diferenciación donde ocurre activa
recombinación.
R A G -1 y R A G -2 (“gen activante de la recombina­
ción”): son dos genes estrechamente ligados en el
cromosoma 11 humano (sólo distantes 8 kb entre sí),
extremadamente conservados entre los vertebrados,
aunque no poseen homología entre sí. Los mismos
fueron aislados por Baltimore y col. mediante expe­
rimentos en los que se transfectaron fibroblastos en
cultivo con ADN genómico total y donde un 0,1%
de los transfectantes dio origen a células eon activi­
dad de “recombinasa” estable (evaluada por su capa­
cidad de reordenar genes V/D/J contenidos en un
plásmido); luego de sucesivos ciclos de transfección,
se identificaron estos loci por métodos clásicos de
clonado molecular, con una estrategia similar a la
usada para aislar los primeros oncogenes. Por lo tan­
to, aunque la actívidad de “recombinasa” se expresa
reguladamente sólo en líneas linfoides inmaduras, la
expresión constitutiva de estos dos genes en otras
células es suficiente para activar la recombinasa.
Además, estos dos genes son esenciales para esta ac­
tividad; ratones mulantes en uno u otro gen RAG
son inmunodeficientes ya que carecen de linfocitos
B y T. Se desconoce aíin el mecanismo de acción de
los genes RAG. Se han propuesto dos modelos: (a)
los productos de RAG tendrían actividad enzimática
y participarían directamente en la reacción de re-
cOmbinación o (b) tendrían actividad regulatoria y
activarían la maquinaria de recombinación. El análi­
sis estructura! de los genes favorece la idea de un rol
directo de los RAG en la reeombinación: el extremo
C-terminal de RAG-1, que posee un dominio con
homología a topoisomerasas (enzimas asociadas a
recombinaciones de ADN en una gran variedad de
sistemas), es esencial para su función; sin embargo,
la eliminación de otros segmentos génicos homólo­
gos a dominios con función regulatoria (tales como
el extremo N-terminal de RAG-1 que incluye un do­
minio tipo “dedo de Zn”, o un dominio acídico de
RAG-2) no anula la actividad recombinasa.
Otras enzimas: hay numerosas evidencias que
involucran a otros productos además de los RAG.
Por ejemplo, los ratones mutantes s c id son inmuno-
deficientes severos, carecen de linfocitos T y B, y
tienen recombinaciones V(D)J defectuosas. La mu­
tación mapea en un locus distinto al de los genes
RAG y además, las células no linfoides exhiben de­
fectos en la reparación del ADN dañado por radia­
ciones X. Recientemente fue identificada una de las
proteínas involucradas en estos procesos de repara­
ción enzimática del ADN y que también es necesaria
para la actividad de recombinasa V(D)J: se trata del
llamado “autoantígeno” Ku, una proteína capaz de
unirse a extremos libres de hebras de ADN. Final­
mente, se sabe que la enzima deoxinucleotidil trans­
ferasa terminal es la responsable del agregado de nu­
cleótidos al azar en los sitios de yuxtaposición
V(D)J (véase más adelante).
Diversidad originada
por recombínación somática
Teniendo en cuenta el niimero de genes en
cada familia, se puede estimar el potencial de
diversificación que tiene este sistem a. Si la
elección de genes se produce al azar, es válido
aphcar combinatoria para el cálculo:
Familia kappa: 50 genes x 5 genes Jj^ =
250 cadenas livianas kappa
Familia H: 50 genes x 20 genes Dj^ x 6
genes = 6 . 0 0 0 cadenas pesadas
Recuérdese que el ensamblado entre cadenas
pesadas y livianas para generar un anticuerpo
involucra uniones covalentes entre residuos de
cisteínas. Vale decir que a priori no hay cons­
tricciones estructurales que impidan la combi­
nación de cualquier cadena pesada con cual­
quiera liviana. Por lo tanto, parece válido vol­
ver a aplicar combinatoria para estimar el total
de anticuerpos distintos posibles, según el po­
tencial de genes existentes:
250 c a d e n a s L x 6 .0 0 0 c a d e n a s H =
1.500.000 anticuerpos diferentes
Un núm ero para nada despreciable, si se
considera que se requiere de menos de 300 ge­
nes en el genoma para su generación y que no
se incluyó en este cálculo a las cadenas livianas
lambda, que en humanos poseen un repertorio
 El origen de la diversidad de los anticuerpos
similar al de kappa. Cabe mencionar que aun
cuando casi todos los genes eucariotas están
fragm entados en exones e intrones, inform a­
ción que se empalma durante el “splicing” de
los pre-ARNm, los reordenamientos que ocu­
rren en los genes de inmunoglobulinas acercan
la información a nivel del ADN, algo no des­
crito para ninguna otra familia de genes euca­
riotas.
Mecanismos adicionales de diversificación
a) Imprecisiones en la recombinación: Habi­
tualmente el codón 95 en las cadenas livianas
es aportado por el gen y el 96 por el gen
Sin embargo no existe un límite preciso de fin
y comienzo de estos genes. Por esta flexib ili­
dad en el sitio de yuxtaposición se generan co­
dones alternativos para el residuo 96, según
cuál sea el último nucleótido contribuido por el
gen (véase fig. 6-5). En el primer ejemplo
de la figura, el codón 95 y el 96 son contribui­
dos por V y J respectivamente. En el segundo
ejemplo, el gen V contribuye con un nucleótido
adicional, por lo que el gen J comienza con el
segundo nucleótido del codón 96; esto genera
un nuevo triplete que reemplaza triptófano por
arginina en el residuo 96. En el tercer ejemplo
el gen V aporta dos bases extras y J sólo una
del codón 96; ahora el triplete codifica para
prolina en lugar de arginina o triptófano. Hay
situaciones en donde el gen V contribuye con
un triplete entero adicional y esa cadena será
un aminoácido más largo (cuarto ejemplo), o
con un codón de menos, lo que producirá una
cadena más corta. Esta flexibilidad en el enlace
de los genes que recombinan se extiende hacia
el codón 95 y 97 de la cadena liviana y por otro
lado, el fenómeno también se observa en la re­
combinación V/D y D/J de la cadena pesada.
Hay ejemplos bien documentados en donde el
cambio de un solo residuo en esta tercera re­
gión hipervariable afecta dram áticam ente la
afinidad de un anticuerpo por un epitope.
b) D iversificación N-terminal: Al analizar
las secuencias de nucleótidos de los ARNm o
de los genes reordenados, se observa frecuente­
mente en el sitio de recombinación la presencia
de 1 a 6 nucleótidos adicionales no codificados
por los respectivos genes de la línea germinal.
Asimismo, la longitud de las secuencias Dj_, y
Jj_, es frecuentemente menor que la codificada
en línea germinal. Este fenómeno aporta obvia­
mente diversidad adicional al repertorio de es­
pecificidades y ha sido denominado diversifi­
cación N-terminal. La enzima deoxinucleotidil
transferasa terminal estaría involucrada en este
agregado de nucleótidos libre de templado.
Para resumir, dos anticuerpos cuyas cadenas
han utilizado idénticos genes V ,, V,^, Dj^ y
139
Jjj, pueden poseer especificidades de reconoci­
miento diferentes debido a estos fenómenos de
flexibilidad en el sitio de enlace y diversifica­
ción N-terminal. Como consecuencia de estos
dos fenómenos, es frecuente que en la configu­
ración reordenada de los bloques no se respete
el marco de lectura de los codones (por ej., en
la fig. 6-5, si el tercer nucleótido del codón 95
se enlazara con el segundo nucleótido del co­
dón 96 en el gen J). La consecuencia del cam ­
bio del marco de lectura es la aparición de co­
dones de terminación de síntesis proteica en las
secuencias D o J y ese reordenamiento no será
viable (abortivo). De este ejemplo se desprende
que los dos m ecanism os recién descritos, si
bien contribuyen para generar diversidad, pue­
den por otro lado conducir a reordenamientos
abortivos.
La flexibihdad en el sitio de recombinación
y la diversificación N-terminal, se estim a que
aumentan el repertorio de especificidades por
un factor de 1 0 en las cadenas livianas y p o r un
factor de 100 en las cadenas pesadas. P o r lo
tanto, el núm ero total de p osibilidades que
ofrece el sistema es superior a 1 0 ^ (6 . 0 0 0 x fO^
x 2 5 0 x 10= 1,5 X 109).
El lector no debe pensar que un individuo
debe expresar simultáneamente el total de este
repertorio en sus linfocitos periféricos. Las cé­
lulas B maduras que salen a periferia recirculan
con una vida m edia relativam ente co rta, de
unas pocas semanas y, si no se produce el en­
cuentro con un antígeno apropiado, m ueren.
Diariamente la médula ósea produce y exporta
al menos 5 x 1 0 ’ linfocitos B, que irán reno­
vando el “pool” de especificidades. Si se re­
cuerda que los microorganism os enfrentan al
sistema inmune no con uno, sino con un m osai­
co de epitopes diferentes, lo más probable es
que exista alguna célula B capaz de reconocer
alguno de los epitopes extraños. Aun si la afini­
dad de ese anticuerpo es modesta, podrá iniciar
la respuesta inmune, a la que contribuirán otros
clones dirigidos contra otros epitopes en los
días sucesivos.
Mutación somática
Durante la expansión clonal de los Hnfocitos
B en la respuesta primaria, las primeras células
sufren una diferenciación terminal hacia plas­
mocitos productores de IgM. Otras células pro­
ducen el cambio de isotipo (switch) que perm i­
tirá la secreción de anticuerpos con otras cade­
nas pesadas. Una porción de las células activa­
das es la que se expande para generar el pool
de células B de memoria. Este proceso ocurre
en los linfocitos B activados (centroblastos)
presentes en los centros germinales de los gan­
glios linfáticos. A continuación, las células pa-
140 Aspectos básicos de la inmunidad
RESIDUO: 94 95
CCC :
' Pro :
2) CGC :
Pro
CGC :
Pro :
4) CCC :
Pro ;
F ig . 6-5. Flexibilidad en la recom binación V-J. Se m uestran las secuencias finales de un gen V k y las iniciales de un gen
J k que recom binan (véase descripción en el texto).
sarían a recircular a la espera del segundo con­
tacto.
Durante este proceso de expansión clonal, al
cabo de 7-10 días de iniciada la respuesta, los
genes reordenados de cadena liviana y pesada
comienzan a acumular una serie de mutaciones
puntuales, a un ritmo de 10 '^ por nucleótido por
generación. Estas mutaciones se evidencian al
determinar la secuencia nucleotídica de los ge­
nes reordenados o del ARNm en hibridom as
secretantes de anticuerpos específicos. Si se
compara esta secuencia con aquella de los ge­
nes de línea germinal se observan los cambios
puntuales mencionados. Las mismas mutacio­
nes, al estar presentes también en las células de
memoria, se evidenciarán en la respuesta se­
cundaria, durante la cual se agregarán cambios
adicionales.
Todas las mutaciones se esparcen en una re­
gión de 1 .0 0 0 nucleótidos que incluyen a los
genes VJ y VDJ y los intrones que los flan­
quean; no afectan al gen constante, ni a los ge­
nes no reordenados, aunque sí a los reordena­
dos abortivamente en el otro cromosoma (si los
hubiere). I^a afinidad de los anticuerpos secre­
tados por los clones mutados es usualm ente
5-100 veces mayor que aquella de los anticuer­
pos de la respuesta primaria; se detectan tam­
bién unos pocos clones cuya afinidad es igual o
menor, Muchos de los cambios afectan a resi­
duos críticos en las regiones CDRl y CDR2 de
las cadenas. Durante la generación de las eélu-
la.s de memoria, el antígeno seleccionaría y fa­
^ H g e n j H
97
TGG A ce
Trp Thr
C Gt3 ^ ACG
Arg Thr
CC G i ACG
Pro Thr
CCA TGG ACG
: Pro Trp Thr
vorecería la expansión de los clones cuya in­
munoglobulina superficial posee mayor afini­
dad. En la respuesta secundaria serán predomi­
nantes estos clones, así como otros que utilicen
otros genes variables.
Expresión de los genes: promotores
y enhancers
En un linfocito B, la transcripción de los ge­
nes de inmunoglobulinas (comenzando desde
el exón señal que precede a los genes V) no
ocurre en los genes en configuración germinal
pero sí en los genes reordenados. Ello se debe
fundam entalmente a la presencia de unas se­
cuencias aumentadoras cíe la transcripción o
"enhancers”, localizadas en el intrón que sepa­
ra al último gen J y el gen constante, tanto en
cadenas livianas como en pesadas. Los enhan­
cers se definen como secuencias regulatorias
que aumentan la transcripción de promotores
vecinos. El promotor (región en el ADN donde
la ARN polimerasa inicia la transcripción) de
los genes de inmunoglobulinas se localiza pre­
vio a cada exón señal de cada gen V. Este pro­
motor está normalmente alejado del enhancer,
excepto cuando ocurre el reordenamiento, que
lo lleva contiguo a un gen J y próximo a la ór­
bita de acción del enhancer. El enhancer de es­
tos genes tiene una longitud de menos de 300
bases y después del cambio de clase (en los ge­
nes de cadena pesada) acom paña al bloque
V/D/J hacia su nueva localización.
 El origen de la diversidad de los anticuerpos 141

A unos pocos nucleótidos previos al sitio de
iniciación de transcripción de todos los genes
V„, se halla un octanucleótido conservado, cu­
ya secuencia complementaria se encuentra en
un sitio análogo en los genes de cadenas livia­
nas y en el enhancer de las cadenas pesadas.
El enhancer de las cadenas üvianas también
posee una secuencia conservada. Estas secuen­
cias son esenciales para la expresión de estos
genes, a los que les conferiría la especificidad
de expresión en tejido linfoide. Se han identifi­
cado las proteínas nucleares que se unen a estas
secuencias regulatorias; las llamadas oct J y
oct 2 se unen al octanucléotido y NF-kB se une
al enhancer.
Reordenaraientos y expresión durante
la maduración Iinfocitaria
Uno de los primeros eventos en la diferen­
ciación del linaje B lo constituye el reordena­
miento de los genes de cadena pesada de inm u­
noglobulinas. La célula procede primero con la
recom binación D/J (habitualm ente en ambos
cromosomas 14) y luego con la V — > D/J en
uno sólo de los crom osomas 14: si logra en­
samblar correctamente los genes, se transcribe
y traduce la cadena pesada (X. Si el reordena­
miento no es productivo (abortivo) debido a
deleciones, mutaciones o cambios en el marco
de lectura de los codones, la célula procede a
reordenar el otro cromosoma 14 del par aléüco.
Si ambos intentos son aborüvos, la célula m ue­
re por apoptosis. Luego de un reordenamiento
exitoso, la cadena pesada p, se asocia tem pora­
riamente en el retículo endoplasmático con una
proteína chaperona de 78 kD denominada BiP,
y una pequeña proporción de las moléculas se
asocian covalentemente a la llamada cadena li­
viana sustituía ( “surrogate light chain”) con la
cual migra a superficie.
Esta c a d e n a liv ia n a s u s titu ía es un dímero no co­
valente de dos péptidos llamados (X^ (26 kD) y
(16 kD), que adopta una conformación espacial si­
milar a una cadena liviana. A través de la porción
se une por enlace disulfuro a la cadena pesada ju y
todo el complejo se expresa en superficie junto a las
m.oléculas accesorias Ig e Igfi. Este complejo mole­
cular, denominado r e c e p t o r p r e - B , sería importante
en el envío de señales de diferenciación por parte de
células del estroma de la médula ósea y/o sus cito-
quinas. y X5 están codificados por genes loca­
lizados en el cromosoma 22, dentro de la familia de
genes de cadena liviana lambda; son genes muy
conservados en distintas especies y n o se r e o r d e n a n
previo a su expresión. Esta c a d e n a liv ia n a s u s t itu í a
es crítica para e! desarrollo linfocitario B, ya que en
ratones mutantes donde se ha alterado deliberada­
mente su estructura para evitar su expresión, la on­
togenia B se afecta profundamente, con una dismi­
nución en 40-veces del número total de linfocitos
pre-B.
La presencia de una cadena |a, funcional en
este estadio parece constituir una señal para
dos eventos: 1 ) que la célula no proceda a reo r­
denar los genes del otro cromosoma 14 (si el

ARNm p ara
, c a d e n a 5 de
su p e rfic ie

F ig. 6-6. Síntesis sim ultánea de dos A R N m maduros p ara cadena pesada |i. y cadena p esada delta en linfocitos B m ad u ro s
vírgenes. U n pre A RN m que incluye a todos los exones de C p y C8 se procesa en form a diferencial {splicing alternativo)
para generar dos A RNm m aduros, uno para cadena p y otro para delta, q u e incluyen en am bos casos los últimos ex o n es h i­
drofóbicos M p y M 5 . Los linfocitos B activados transcriben un pre A R N m más corto q u e excluye los exones de C ; al
m adurar, se elim inan los exones hidrofóbicos M p y la cadena term ina en un tram o hidrofílico (S), q ue evitará su an c lad o a
ia m em brana. Las flechas indican los sitios de poli-adenilación.
142 Aspectos básicos de la Inmunidad
primer intento fue productivo); 2) que comien­
cen los reordenamientos de los genes de cadena
liviana. Para las mismas hay una jerarquía en la
elección de los cuatro loci disponibles; primero
siempre se intenta con la familia kappa, en uno
de los cromosomas 2. Si el evento es producti­
vo, el otro locus kappa y la familia lambda per­
manecen en configuración germinal. Si el pri­
mer intento falla, se reordenan los loci kappa
en el otro cromosohia 2 y, si éste también falla,
recién entonces se reordenan los genes lambda
(también un cromosoma por intento). En otras
palabras, un clon que expresa cadenas lambda,
posee ambos loci kappa abortivamente reorde­
nados, Estos fenóm enos explican m olecular­
mente la llamada exclusión alélica, por la cual
una célula B sólo expresa uno de los dos alelos
posibles (materno o paterno) de cadena liviana
y pesada, y sólo una de las dos cadenas livianas
posibles.
Una vez que la célula produce una cadena li­
viana funcional, su ensamble con la cadena pe­
sada ocurre dentro del retículo endoplasmático,
ya sea a través de un intermediario de hemimo-
íécula H-L o de un dímero H-H al cual se unen
luego ias cadenas üvianas; estas vías dependen
del isotipo de cadena pesada involucrada. En el
retículo también comienza la glucosilación de
la proteína, que continúa durante su tránsito ha­
cia la membrana a través del Golgi.
En el estadio más avanzado de diferencia­
ción, la célula expresa simultáneamente IgM e
IgD en la superficie, marcadores con los que
migra a la periferia. La célula puede producir
las dos cadenas pesadas, ya que transcribe un
pre-ARNm muy largo que incluye el bloque
variable VDJ, el gen constante C |i y el gen
constante C5. Por empalme o splicing alterna­
tivo del pre-ARNm, se producen dos mensaje­
ros m aduros, uno para cada cadena p esad a
(véase fig. 6-6). Ellos incluyen a los dos últi­
mos exones de cada gen pesado, que poseen
aminoácidos hidrófobos, y que le permiten a la
cadena pesada expresarse como una proteína
integral de superficie celular.
Cuando comienza la activación y expansión
clonal inducida por el antígeno, sólo se sinteti­
za IgM; el pre-ARNm no incluye ai gen C5, En
las células plasmáticas, el anticuerpo no se ex­
presa en superficie sino que se secreta. Para
ello, se produce un ARNm para C |l algo más
corto, que excluye a los últimos exones hidró­
fobos y termina al final del dominio CH4 con
20 codones hidrofíiicos. Los niveles acumula­
dos de ARNm son 20-100 veces mayores a los
presentes en un linfocito B en reposo y es con­
secuencia, en partes iguales, de un aumento en
el ritmo de transcripción y un aumento en la es­
tabilidad de los ARNm. Cuando las cadenas
pesadas carecen de los dominios de transmem­
brana, se transportan como moléculas solubles
dentro de vesículas que liberan su contenido al
exterior por exocitosis. Un plasmocito maduro
puede secretar hasta 10“’ moléculas de anticuer­
po por minuto.
Existe un número muy pequeño de linfocitos
B maduros que exhiben simultáneamente anti­
cuerpos con dos isotipos distintos de cadena
pesada, por ejemplo IgG -i- IgE, etc. El análisis
molecular de este tipo de población fue realiza­
do en muy pocos casos, en los que se demostró
la presencia de pre-ARNm largos que incluyen
a más de un gen constante. El procesamiento
diferencial del mismo (similar al que ocurre pa­
ra la expresión simultánea de IgM e IgD) gene­
raría ARNm maduros para dos cadenas pesadas
diferentes. Se desconoce si estas células perte­
necen a una subpoblación con relevancia fun­
cional.
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Estructura y organización
genética del receptor T
M. LEONARDO SATZ
Antecedentes históricos
Desde el descubrimiento de los fenómenos
de restricción en el reconocimiento antigénico
por los linfocitos T a principios de la década
del ’70, y durante más de una década, la natu­
raleza del receptor T (TCR) ha sido tem a de
gran controversia en inmunología. La existen­
cia de Jgs como elemento de reconocimiento y
la existencia de uno o dos receptores para ex­
plicar la restricción por los linfocitos T fueron
quizá las áreas más debatidas durante ése tiem­
po.
A lo largo de muchos años, numerosos estu­
dios contribuyeron a la noción de que el reco­
nocimiento antigénico por parte de los linfoci­
tos T es diferente del de los linfocitos B. En lo
que se refiere al repertorio o espectro de reco­
nocimiento, queda claro que aun cuando puede
haber epitopes reconocidos por células de am­
bos linajes, los linfocitos B reconocen determi­
nantes “nativos” en el Ag (sean lineales o con­
formacionales), mientras que el TCR sólo reco­
noce péptidos antigénicos generados por las
maquinarias de procesamiento (véase cap. 1 0 )
y presentados en la superficie de las células
presentadoras de Ag (CPA) por moléculas de
histocompatibilidad (MHC).
Hubo dos estrategias de estudio que, inde­
pendientemente, han permitido la dilucidación
de la estructura del TCR. La primera de ellas
analizó el efecto de Acs monoclonales sobre el
reconocimiento de Ag por células T y, even­
tualmente, llevó a la caracterización bioquími­
ca del TCR. La segunda encaró directamente el
aislamiento de los genes que codifican para el
TCR.
7
Efectos de ACs monoclonales sobre
el reconocimiento T
La herram ienta esencial en estos estudios
constituyó la disponibilidad de clones de linfo­
citos T, tanto humanos como murinos. Ellos se
obtienen estimulando repetidas veces in vitro
linfocitos T inmunes con el Ag específico (y
CPA) y en presencia de IL-2 en el medio de
cultivo. Luego de un tiempo, las células son ca­
paces de crecer y dividirse, teniendo como tíni­
co requisito la provisión de IL-2 exógena. Las
células pueden ser clonadas por dilución y el
clon resultante manifestará un reconocimiento
antigénico específico, de naturaleza “monoclo­
nal”. Se han generado clones T con actividad
“helper” que, ante la presentación de Ag por
CPA singeneicos, aceleran su proliferación y
secretan IL-2 y citoquinas. También se han ge­
nerado clones T con actividad citotóxica espe­
cífica.
La caracterización fenotípica de los clones T
citotóxicos mostró que la mayoría de ellos son
CD 8 -I- y están dirigidos contra epitopes presen­
tados en el contexto de MHC de clase 1. Sin
embargo, un pequeño porcentaje de ellos son
de fenotipo CD4-h y reconocen epitopes p re­
sentados por MHC de clase II. La asociación
entre el fenotipo superficial y la clase de molé­
culas reconocidas sugirió que quizá las molé­
culas CD4 y CDS facilitan el reconocimiento
y/o la lisis de las células blanco. Si se preincu-
ban los clones T citotóxicos con Acs monoclo­
nales anti-CD4 y anti-CD 8 , previo al ensayo de
su actividad biológica, los primeros inhiben la
citotoxicidad de los clones CD4+ y los segun­
dos la de los clones CD 8 -1-. Este efecto se ob­
 Estructura y organización genética del receptor T
serva sobre clones dirigidos contra blancos dis­
tintos y el grado de inhibición de la citotoxici­
dad varía.
Las moléculas CD4 y CD8 (véanse cap. 2 y
cap. 13), presentes en la superficie de las dos
poblaciones T predominantes en periferia, es­
tán codificadas por genes no polim órficos e
idénticos en las distintas células. Por lo tanto,
se especuló como poco probable que ellas sean
parte del TCR. Sabemos hoy que estas molécu­
las, reconocen estructuras conservadoras (mo-
nomórficas) sobre las MHC de clase I y clase II
(de allí la asociación CD4-clase II y CD8-clase
1). No sólo ayudarían a la estabilización de la
interacción de la célula T con la CPA, sino que
además transducen señales de activación celu­
lar (véase cap. 13).
El complejo molecular CD3 está presente en
la superficie celular del 95% de los hnfocitos T
maduros. Está compuesto por un complejo de 5
cadenas polipeptídicas cuyos PM oscilan entre
16 y 26 kD. Se ha observado que durante la ac­
tivación antigénica la cadena CD3-zeta es fos-
forilada en residuos de serina. Cuando se prein-
cuban clones de linfocitos T con Acs monoclo­
nales contra CD3, según las circunstancias ex­
perimentales, s'e bloquea la activación antigéni­
ca o se induce la activación de las células, aun
en ausencia del Ag específico. Estos efectos
también se manifiestan sobre diversos clones
T, independientemente de la especificidad anti­
génica. El complejo molecular CD3 no exhibe
variaciones en las distintas células o in d iv i­
duos, y por ello no constituye la estructura pri­
maria del reconocimiento.
Los experim entos clave con estos mism os
clones T se hicieron cuando se los usó para in­
munizar ratones y preparar Acs monoclonales
contra ellos. Los Acs fueron caracterizados, se­
gún su capacidad para bloquear o inhibir el re­
conocimiento antigénico o la activación de los
clones. Algunos de los Acs obtenidos reaccio­
naron e inhibieron específicamente el reconoci­
miento antigénico por el clon utilizado en la in­
munización y se los denominó “Acs clonotípi­
cos”. Estos Acs clonotípicos fueron utilizados
para caracterizar bioquímicamente las molécu­
las contra las cuales estaban dirigidos en la su­
perficie celular T.
En los diversos clones T, independientemen­
te de su fenotipo superficial (CD4 o CD8) su
función (helper o citotóxica), o su especificidad
antigénica, estos Acs reconocen glucoproteínas
de alrededor de 90 kD. En estos experimentos
de inmunoprecipitación, con frecuencia se co-
purifican también los componentes del comple­
jo CD3. Por otra parte, si previamente se entre­
lazan las proteínas con Acs contra CD3, se co-
purifican las moléculas de 90 kD arriba mencio­
nadas; estos experim entos sugieren que los
145
componentes del CD3 están locahzados física­
mente muy cercanos a las moléculas de 90 kD.
Los Acs clonotípicos también fueron utiliza­
dos para purificar estas moléculas. Cuando se
analizaron digestiones trípticas de las m olécu­
las aisladas de diversos clones, la crom atogra­
fía reveló péptidos comunes y otros específicos
de cada clon. Esta característica sería la que
puede esperarse de una molécula con función
de TCR, con regiones C y V, como en las Igs.
Una de las cadenas se llamó T a y la otra Tp.
Luego se obtuvo información parcial de las se­
cuencias aminoacídicas de las cadenas purifica­
das con estos Acs y se demostraron pequeños
tramos de homología con las cadenas pesadas y
livianas de las Igs.
Todas estas evidencias experimentales fue­
ron obtenidas durante los años 1983-1984 y su­
girieron, obviamente, que las estructuras reco­
nocidas formaban parte del TCR. La confirm a­
ción provino de los estudios moleculares de ca­
racterización de los genes de la cadena p del
TCR, lograda en form a independiente en el
transcurso de los mismos años (véase más ade­
lante). La segunda fam ilia de genes de TCR
identificada se creyó que era la correspondiente
a la cadena T a; se trataba en realidad de los ge­
nes Ty, que codifican para un TCR diferente.
Pronto quedó claro que existen dos estructuras
diferentes de TCR, presentes en distintas po­
blaciones de linfocitos T, que se denom inan
a /p y y/8 y cuyo origen, distribución y función
parecen ser diferentes. Ambos tipos de recepto­
res están estrechamente asociados en la mem ­
brana al complejo molecular CD3 que, como
vim os antes, se requiere para el correcto en­
samblado y transporte del TCR a la superficie
y también para la transducción de señales al in­
terior de la célula. El cuadro 7-1 resume las ca­
racterísticas de ambos tipos de células T.
Estrategias de aislamiento
de los genes de! T C R
Durante 1983 M ark Davis y col. establecie­
ron una estrategia para el aislamiento de los ge­
nes del TCR, basada en las siguientes presun­
ciones: a) los genes deben expresarse en célu­
las T y no en células B, b) los ARNm para el
TCR deben hallarse en polisem as adosados a.
membranas del retículo endoplasmático rugo­
so, con la proteína naciente unida al retículo
por el péptido señal, c) los genes que codifican
el TCR deben sufrir reordenamientos genéticos
de hnfocitos T para generar diversidad con es­
trategias similares a las usadas por las Igs, y d)
al igual que en los genes de Igs, debe haber re­
giones V y regiones C.
Sobre la base de estas suposiciones se desa­
rrolló una estrategia de clonado, teniendo en
146 Aspectos básicos de la inmunidad

C u ad ro 7-1. Descripción comparativa de los linfocitos con receptores a jiy yS

R eceptor aj3 R eceptor yS

Estructura: H eterodím ero unido S-S H eterodím ero unido S-S o no covalente
D iversidad; a : - 6 0 V, -6 0 J, 1 C 8: 5 - I 0 V , 3 D , 4 J , 1 C
P: - 7 0 V, 2D , 13 J, 2 C y: 9 V, 5 J, 2 C
D istribución: Sangre periférica 60-70% Sangre periférica < 10%. Epitelio intestinal, genital, piel.
G anglios, bazo líquido sinovial
Fenotipo: 60% CD 4 + CDS - < 1% CD 4 + CDS -
35% CD 4 - CDS + 20-50% C D 4 - CDS débil
<1% C D 4 - C D S - 50-80% CD 4 - CDS -
100% CD 2+ CD34-, > 95% CD5 -F 100% CD 2+ CD 3+, C D 5- o débil
Ontogenia: T ím ica (tardía) Tím ica (tem prana)
Extratím ica im probable Extratím ica probable
F unción: Reconoce péptidos presentados sobre m olé­ Posibles: prim era línea de defensa contra antígenos m icro­
culas de histocom patibilidad de clase I y II bianos conservados. R econocim iento de péptidos sobre
clásicas m oléculas de histocom patibilidad clásicas o no clásicas
(C D l en hum anos,
TL /Q a m urinos)

cuenta que los linfocitos B y T difieren sola­
mente en la expresión de unos 200-300 genes y
que sólo un 3% de los ARNm se hallan unidos
a polisomas de retículo rugoso. Se preparó una
colección de ADNc a partir de ARNm purifica­
do de polisomas de retículo de células T, usan­
do uno de los precursores de la síntesis de
ADN m arcado por Se hibridizaron con
ARNm proveniente de linfocitos B para elimi­
nar las secuencias comunes a ambos linajes ce­
lulares y los ADNc específicos T restantes se
utilizaron como una sonda para identificar clo­
nes con secuencias de ADN homólogas, en otra
colección de ADNc específicos de células T

TCRP TCRa

F ig . 7 -1 . E s q u e m a d e l
c o m p le jo C D 3 /r e c e p to r
T a.p en la su p erficie c e lu ­
lar. Los signos (+) y (-) en
las porciones transm em brá­
nicas representan am inoáci­
dos cargados en las cadenas
del receptor y de las m o lé­
culas CD3. H ay evidencias
a h o ra d e la p r e s e n c ia d e
dos cadenas e en C D 3, u na
aso ciad a a C D 3-8 y o tra a
CD3~y.
 Estructura y organización genética del receptor T
construidos como antes. Se aislaron clones po­
sitivos, y con cada uno de ellos se evaluó su
expresión exclusiva en linfocitos T y si sus se­
cuencias se hallaban reordenadas en linfocitos
T y no en B (patrones e hibridizaeión diferen­
tes al cortar el ADN de linfocitos B y T con nu­
cleasas de restricción). Uno de los clones aisla­
dos cumplió con todos estos requisitos. Se tra­
tó, en efecto, de la cadena T(3 murina, cuya se­
cuencia nucleotídica reveló tramos de homolo­
gía con las Igs. Este primer clon fue usado a su
vez como sonda para identificar secuencias ho­
mólogas en una colección de ADNc preparada
a partir de ARNm tímico. Se identificaron nue­
vos clones, cuya secuencia nucleotídica era va­
riable en los primeros 100 codones, pero cons­
tante en los últimos 200.
Con estrategias sim ilares se identificaron
otros genes de los TCR murino y humano. Los
primeros clones de ADNc perm itieron aislar
luego clones genómieos y conocer la organiza­
ción de las familias de estos genes.
Heterodímero a p
La cadena a posee unos 260 aminoácidos y
la P unos 300, de los cuales los primeros 100-
120 (del extrem o N -term in a l de cada una)
constituyen la región variable. La yuxtaposi­
ción espacial de la región V a y v p determina
el sitio de reconocim iento del receptor (fig.
7-1). El dominio más próximo a la membrana
es conservado y se lo llama región constante,
C a y C¡3. Los dominios V y C en ambas cade­
nas poseen puentes di sulfuro intraeatenarios, tí­
picos de la estructura general que poseen las
inmunoglobulinas y MHC. Ambas cadenas es­
tán unidas covalentemente por cisteínas locali­
zadas próxim as a la m em brana plasm ática.
Luego de un segmento hidrófobo transmembrá­
nico (19-22 aminoácidos), las cadenas term i­
nan con 5-12 residuos intracitoplásmicos. A m ­
bas cadenas están glucosiladas, y poseen una
masa relativa de 45-60 kD y 40-50 kD para la
a y p respectivamente.
La estructura tridimensional de los dominios
variables de las cadenas a y p del receptor T
(RCT), determinada por cristolografía de rayos
X se observa en la figura 7-2.
Genética del receptor ap
U ICR está codificado por genes que, en lí-
nep generales, siguen la misma estrategia que
k' genes de inmunoglobulinas para generar di­
versidad. Esto es, durante la diferenciación los
linfocitos T reacom odan blo q u es de genes
V(D)J para ensam blar una región variable y
traerla próxima a la región constante.
147
Familia de genes a. En humanos, está locali­
zada en el cromosoma 14, en el sitio alejado del
locus de cadena pesada de inmunoglobulinas;
en ratón, se hallan en el cromosoma 14. E stá
compuesta por un único gen constante, denom i­
nado Ca, dividido en cuatro exones. La infor­
mación para la porción variable de la cadena al­
fa está fragmentada en dos familias, una deno­
minada V a y otra Ja. Esta última está com pues­
ta por al menos 61 miembros, esparcidos en un
tramo de unas 70 kb vecinas a C a (fig. 7-3); al
menos cinco J a son seudogenes. Cada J a posee
una longitud de unos 55-65 bp y por lo tanto
codifica para unos 18-21 residuos. A continua­
ción del locus Ja , se halla el locus de genes 5
(véase más adelante) y luego el conjunto de g e­
nes V a , cada uno de ellos está precedido por un
exón señal. Existen como mínimo 60 genes V a
clasificados en 29 subfamilias. Esta región del
genom a está extrem adam ente conservada en
murinos, donde también hay unos 60 segmentos
J a y unos 100 genes V a.
Para generar diversidad en esta cadena, du­
rante la diferenciación intratímica, cada célula
elige un gen del “pool” V a y lo reacomoda v e­
cino a alguno de los genes Ja. Al cabo de este
proceso se eliminan todos los genes localizados
entre ambos V a -Ja que reordenan, incluyendo
a todo el locus delta (fig. 7-3). Por el gran es-
paciam iento de la fam ilia Ja , los pre-ARNm
que se generan por transcripción del locus re o r­
denado son notablemente largos. La transcrip­
ción de este locus está regulada por un enhan­
cer, localizado a 4,5 kb hacia 3 ’ del gen C a ,
que afecta al promotor de cada gen V a luego
de la reeombinación V a /Ja . Por la gran exten­
sión de la región Ja , se presume que este e n ­
hancer debe ser lo suficientemente activo para
afectar la transcripción de genes V a que han
reordenado a J a muy distales.
F a m ilia de genes ¡3. Está localizada en el
cromosoma 7 humano y 6 murino (alejado de
la familia de genes de cadena liviana k). Tanto
en el humano como en el ratón, existen dos g e­
nes constantes denominados C/37 y C¡}2. A m ­
bos son genes funcionales, subdivididos en
cuatro exones, con muy alta homología (>95% )
entre sí. Poseen cierta homología ancestral (32-
37%) con los genes Ce y el dominio CHI de la
cadena pesada gamma de inmunoglobulinas.
C p l está precedido en un tramo de -4-5 kb
por un grupo de seis genes 7/3 y un gen D¡5,
mientras que CB2 está precedido por siete j p y
un D p (fig. 7-3). Cada gen Dp codifica p ara
3-5 aminoácidos y cada Jp para 15-17 residuos.
Existen además no raenos de 70 genes V¡3
humanos, cada uno precedido de un exón señal.
Esta fam ilia está localizada previo a D p i, e x ­
cepto para un gen v p ubicado unos 10 kb a
continuación de CP2, con una orientación de
148 Aspectos básicos de la Inmunidad
transcripción inversa a la del gen constante. Es­
te último gen Vp es funcional. La diversidad
v p murina es menor, con aproximadamente 25
miembros.
Para generar diversidad en la familia p, du­
rante la diferenciación intratím ica una célula
procede a reacomodar estos genes. En primer
término se produce la recom binación D p-Jp:
D p i tiene 13 opciones Jp para elegir (seis del
prim er grupo y siete del segundo), m ientras
que Dp2 sólo tiene siete (fig. 7-3). En una se­
gunda etapa, uno de los genes VP es elegido y
reacomodado vecino al bloque Dp/Jp. Los ge­
nes C pi y CP2 son utilizados indistintamente
en los linfocitos T, independientemente del fe­
notipo de superficie o función de los mismos.
Función del receptor aP
L as células T p o rtad o res el rec e p to r a p
constituyen el 60-70% de los linfocitos de san­
gre periférica y son también los predominantes
en ganglios y bazo. Esta molécula está presen­
te en la superficie tanto de las células CD4-{-
F ig . 7-2. A. E structura tridim ensional
determ inada por cristalografía de rayos
X de los dom inios variables (V) de las
cadenas a (am arillo) y p (celeste) del
receptor para antígenos de las células T
(RCT). Las regiones de com plem enta­
riedad hipervariables que interaccionan
eo n el co m p lejo p é p tid o -m o lécu la de
clase II del C M H están in d icad as en
a z u l ( C D R I ) , b la n c o (C D R 2 ), ro jo
(C D R 3) y en m agenta /a región de íii-
pervariabiU dad 4 (HVA). B. La mism a
estru c tu ra m o stran d o la su p erficie d e
contacto eon el com plejo péptido-m olé­
cula clase II del CM H con el mism o có ­
digo de colores. Fotografías gentilm en­
te cedidas por los Dres. B. A. Fields, E.
L. M alchiodi y R. A. M ariuzza.
como las CD8+, secm colaboradoras o citotó-
xicas/supresoras. Su función es la de reconocer
MHC de clase I o clase II que acarrean pépti­
dos antigénicos en su sitio de presentación.
Correlación en tre la estructura del recep­
tor T y la especificidad antigénica. La des­
cripción de los genes a y p como responsables
de la codificación de las cadenas del receptor
antigénico presente en la mayor parte de los
linfocitos T permitió luego encarar estrategias
experimentales para conocer cuál es la contri­
bución de ambas cadenas en la especificidad fi­
na del reconocimiento. Numerosos experimen­
tos demuestran que ambas cadenas son necesa­
rias para el reconocimiento T. Por ejemplo, Ya-
gue y col. aislaron tres clones T murinos espe­
cíficos contra ovalbúmina de pollo junto a la
MHC de clase II, I-A‘'. Los tres clones utilizan
los mismos genes a y P; líneas mutantes que
dejan de expresar una u otra cadena, pierden su
capacidad de reconocer Ag, lo que se restaura
al fusionar dos mutantes (una a y otra P). En
otros modelos de mutantes similares, la intro­
ducción exógena del gen, cuya expresión endó­
 Estructura y organización genética dei receptor T
gena se ha perdido en ei mutante, también res­
taura ia expresión dei receptor T. Recuérdese
que ias m utantes que no expresan ei dím ero
T a, P, tampoco expresan CD3 y que ia reex­
presión dei RCT también restaura CD3.
Con ei objeto de saber si ia cadena a o ia p
participan independientem ente dei reconoci­
miento dei epitope antigénico y de ia MHC, se
hicieron ios siguientes experimentos: a partir
de un clon T citotóxico se aislaron ios genes
reordenados T a y Tp y se introdujeron para su
expresión en otro cion citotóxico, de especifici­
dad distinta. Luego de ia transferencia, ias nue­
vas céiuias conservaron su especificidad origi-
nai, adquirieron ia especificidad de ias céiuias
“donantes” de ios genes, pero no adquirieron
nuevas especificidades combinadas para reco­
nocer cada uno de los péptidos antigénieos en
ei contexto de ia MHC del otro cion. Estos re­
sultados sugieren una vez más que ambas cade­
nas son ias responsables dei reconocim iento
dei complejo péptido-MHC.
Por otra parte, no hay una utilización prefe-
renciai de determinados genes variables ( a o p)
por una u otra subpoblación CD4 o CD8 de lin­
focitos T. Estas observaciones coinciden con ia
noción de que ia MHC de ciase I y de clase II
posee una estructura tridimensional similar.
CADENA p
CADENA a
L Va
CADENA.8
'L V a LV5 LVa
CADENA Y
L Vy L Vy
F ig. 7-3. O rganización genóm ica en las cuatro fam ilias de cadenas del TCR. El locus delta está entre los genes V a y J a .
V éase el texto para más detalles. Un C om ité de N om enclatura de la O N U acordó recientem ente designar a los resp ectiv o s
genes con letras m ayúsculas, por ej.: T C R A C , es el gen constante C a , T C R A J se refiere a los genes J a , etcétera.
149
Heterodímero jd
Se expresa en ia superficie asociado ai com ­
plejo m olecular CD3, en linfocitos T que no
expresan el dimero a p . Las cadenas y tienen
una m asa relativa de 45-55 kD (algo m ás de
300 aminoácidos) y las 8 de 40-50 kDa (~ 275
aminoácidos). Ambas están glucosiladas.
En humanos hay dos tipos de cadenas g a ­
mma que difieren en su posición constante, de­
nominadas T y l y Ty2 según utilicen genes Cyl
o Cy2 (véase más adelante). Tyl forma un dí­
mero unido por puentes disulfuro con ia cadena
5, m ientras que Ty2 se enlaza no co valente­
mente con 5 ya que carece de cisteínas por fue­
ra del dom inio transm em brana. En el rató n
aparentemente todos los TCR y8 poseen enla­
ces covalentes.
Genética del receptor y§
Está codificado por segmentos génicos que
también se reordenan durante la ontogenia para
generar diversidad.
F a m ilia de genes y. Está localizada en ei
cromosoma 7 humano, en un locus alejado del
que codifica para los genes beta; en el ratón se
halla en el cromosoma 13. Existen dos genes
2 5 kb
Ja Ja Ja Ja J a Ja Ja Ja Ja Ca
80 Kb
D5,_3 J5,_, C5
lfV8 L
15 Kb
Jy Cy, Jy Cy,
150 Aspectos básicos de la inmunidad
constantes funcionales denom inados C yl y
Cy2, separados entre sí por unas 16 kb (fig.
7-3). Cyl es precedido por tres genes J y y
por dos Jy adicionales. Se han identificado 14
genes Vy, agrupados en 4 familias. La primera
incluye 5 genes funcionales y cuatro seudoge­
nes, las otras tres poseen un miembro cada una
aunque sólo un gen (V9) es funcional. Al igual
que en las otras cadenas, el apropiado reorde­
namiento Vy-Jy permite la transcripción de un
gen funcional. La organización murina es simi­
lar, aunque hay cuatro clusters Jy-Cy, uno de
ellos no funcional. Hay al menos siete Vy mu­
rinos funcionales.
Familia de genes 5. Este locus se halla en­
tre los genes V a y J a (fig. 7-3). Existe un úni­
co gen constante CS, organizado en cuatro exo­
nes. Está precedido de cuatro segmentos J5 y
tres genes D5. Se han identificado hasta el pre­
sente por lo menos cuatro genes VS, uno locali­
zado a continuación de C5 en orientación de
transcripción invertida y los otros parecen estar
esparcidos entre los genes de la familia V a. A
unas 2 kb hacia 5 ’ del segmento C5 (entre C5 y
J5), se halla el enhancer que regula la trans­
cripción de los genes. La familia está extrema­
damente conservada entre humanos y murinos.
Función del receptor y§
En humanos, las células T con receptores y5
constituyen una fracción minoritaria de los lin­
focitos T de sangre periférica (<10% ), gan­
glios, bazo y timo (<1%), esto es, en órganos
donde predominan las células T a p . Sin embar­
go en rumiantes, la sangre periférica posee pre­
dominio de Ty5. Estas células se hallan en di­
versos epitelios y se acumulan en lesiones in­
flamatorias causadas por numerosos patógenos.
La mayoría no expresa en superficie las molé­
culas accesorias CD4 y CDS; las presentes en
epitelio intestinal expresan un hom odím ero
C D Saa. Se desconoce la función precisa de es­
tos linfocitos, aunque las evidencias sugieren
que pueden ejercer diversas funciones efectoras
y regulatorias (véase más adelante).
Hay evidencias que sugieren que los linajes
que se diferencian hacia células a[3 y y6 en el
timo, son independientes. Se ha postulado la
existencia de una célula precursora que inten­
ta reordenar productivam ente el locus gamma:
de lograrlo, continúa su m aduración reorde­
nando el locus delta. Si falla el reordenam ien­
to de gamma, la célula reordenaría genes -beta
y finalmente genes alfa. Durante la diferencia­
ción, las células Ty6 realizan selección positi­
va y selección negativa y hay evidencias de
que tanto las moléculas de histocom paribili-
dad clásicas como las no clásicas están invo­
lucradas en este proceso. A lgunas subpobla­
ciones Ty5 parecen ser seleccionadas en en ­
tornos extratímicos, presumiblemente por an­
tígenos ambientales.
En humanos existen fundamentalmente dos
subpoblaciones de linfocitos Ty6. La subpobla­
ción V8l usa preferentemente una combinación
V81/D51 y D82, y se une en forma no covalen­
te a cadenas gamma que usan Cy2 y el Jy más
vecino que lo precede, pero no tienen preferen­
cia por un dado Vy. Esta población aparece en
timo 4-6 meses después del nacimiento, posee
gran diversidad en el sitio de yuxtaposición
V/(D)J, son minoritarias en sangre, donde exhi­
ben un fenotipo CD45 RA. La subpoblación
V52 es de ontogenia más temprana, aparecen
en timos fetales de 10 semanas y con el desa­
rrollo pasan a sangre periférica, donde son más
abundantes que las V 8 l y poseen fenotipo
CD45RO. Están form adas por cadenas delta
V82/D83 unidas covalentemente a cadenas ga­
mma con uso preferencial Vyl o Vy9/Jyl/Cyl.
Es como si ambas subpoblaciones balancearan
el uso recíproco de genes.
La población V82 de sangre periférica hu­
mana exhibe una citotoxicidad inespecífica, ti­
po NK, contra determinadas células tumorales,
luego de su activación in vitro con mitógenos
(PHA) e IL-2. También expresan receptores Ec
y algunos clones Ty8 pueden ejercer ADCC.
La población V81, tiene menor potencial cito-
tóxico. Algunos clones T con estas característi­
cas responden con intensa proliferación ante
ciertos HLA-DR alogeneieos respecto de las
células T; esta estimulación se bloquea con an­
ticuerpos anti HLA-DR, demostrando el reco­
nocimiento por el receptor y5 de una molécula
de histocom patibilidad. Algunos clones TyS
murinos tam bién m ostraron esta reactividad.
Tanto clones humanos como murinos secretan
algunas citoquinas in vitro.
En el ratón, los linfocitos Ty8 son los prime­
ros en colonizar el timo en el día 14 de la gesta­
ción, donde reordenan y expresan predominan­
temente el gen Vy3. En el día 17 se produce otra
onda de expansión de timocitos y8, que expre­
san predominantemente el gen Vy3. En el día 17
se produce otra onda de expansión de timocitos
y8, que expresan predom inantem ente el gen
Vy4. Estos linfocitos fetales migran para coloni­
zar la piel y epitelios genitales, respectivamente,
donde exhiben muy limitada diversidad de reco­
nocimiento (véase más adelante. Diversidad).
En ratones adultos se halla una población Ty8
con mucha diversificación, que coloniza epitelio
intestinal y parece desarrollarse (o al menos ex­
pandirse) en entornos extratímicos.
Papel de las células T yS en infecciones. Se
ha comprobado recientemente que en determi­
nadas patologías infecciosas, se acumulan lin­
focitos Ty8 en sitios inflamatorios. En reaccio­
 Estructura y organización genética del receptor T
nes granulomatosas cutáneas en pacientes con
lep ra tu b e rc u lo id e , hay ap ro x im a d a m e n te
25-35% de linfocitos Ty5, comparado con un
-5% presente en piel normal. Se pudieron ge­
nerar algunas líneas celulares de estos pacien­
tes, que proliferaron intensamente ante lepro-
mina y PPD, aunque no se estableció claramen­
te la necesidad o no de reconocimiento del an­
tígeno junto a m oléculas HLA. En pacientes
con Leishmaniasis cutánea también se observó
un incremento de 7 veces en el número de lin­
focitos TyS en las lesiones granulomatosas. Por
otro lado, en el líquido sinovial de pacientes
con a r tr itis re u m a to id e a , se a cu m u la un
10-20% de linfocitos TyS. Cuando se incuba in
vitro esta población con extractos antigénicos
de Mycobacterium tuberculosis y proteínas de
estrés térmico (HSP-60) purificadas, se induce
la activación celular. Una estimulación similar
se observa con células Ty5 de sangre periférica
de individuos positivos al PPD. Clones TyS
(Vy9-i-) de sangre de individuos normales ejer­
cen citotoxicidad contra células preincubadas
con enterotoxinas de estafilococos. Durante la
fase aguda de infección con el virus de Epstein
BaiT, aumentan en sangre periférica los núm e­
ros de linfocitos Ty5 Vy9/Vy2. Las Ty5 tam ­
bién aumentan en humanos infectados con Sal­
monella o Brucella.
Los modelos experimentales murinos aporta­
ron en los últimos año numerosos ejemplos del
papel de las células Ty8. Los ratones donde se
eliminaron las células T y5 (por tratamientos in
vivo con anticuerpos monoclonales anti-Ty5, o
con animales donde se mutaron deliberadamen­
te los genes y5 de forma tal que no se permite
la m aduración de estas células), son m ucho
menos eficientes en la depuración de bacterias
o parásitos tales como Listeria, Salmonella o
Leishmania. En experimentos muy recientes se
ha docum entado que las células TyS pueden
constituir parte de la inmunidad innata produ­
ciendo diferencialm ente citoquinas que indu­
cen respuestas T hl y Th2. Así, ratones infecta­
dos por vía intraperitoneal con Listeria, acum u­
lan en esta cavidad durante 10 días células TyS
que secretan INFy; por otra parte, ratones in­
fectados con un parásito extracelular {Nipos-
trongylus), acumulan linfocitos TyS que secre­
tan IL-4. Evidentemente las células TyS pueden
discrim inar am bos patógenos en las etapas
tempranas de la infección y producir citoquinas
asociadas de respuestas Thl o Th2.
El rol de ias células TyS no se hmita a este
papel regulador de las respuestas inmunes: ra­
tones que carecen de células T ap , pero que po­
seen núm eros norm ales de células TyS, son
mucho más eficientes en la eliminación de L is­
teria comparados con animales en donde am ­
bas poblaciones T están ausentes; esto indica
151
que las células TyS pueden jugar un papel más
directo en la eliminación de patógenos.
En los casos donde se la analizó, la partici­
pación de las moléculas de histocompatibilidad
(M HC) clásicas en el reconocim iento p o r la
TyS constituye una excepción; en algunas si­
tuaciones, se requiere una MHC aunque no se
observa restricción genética. Por otro lado, nu­
merosos clones TyS reconocen células que ex­
presan determ inadas MHC no-clásicas, tales
como TL/Qa murinas o C D l y CD48 humanas.
M ecanismos de reordenamiento genético
Los miembros de las cuatro familias de ge­
nes del TCR poseen señales de recombinación
con heptámeros, nonámeros y espaciadores de
12 y 23, muy similares a los presentes en los
genes de inmunoglobulinas (cap. 6). Su organi­
zación muestra que también se cumpliría la re­
gla 12/23 para los genes que interactúan (fig. 7-
4). Por la disposición de las señales en el locus
Tp, nótese que podría ocurrir una recom bina­
ción V[3-Jp directa, o una recombinación D p i-
Dp2, sin violar esta regla (fig. 7-4). Sin em bar­
go, estos fenómenos no parecen ser habituales.
Otro mecanismo de recombinación sería el uti-
hzado por los genes Vp y VS hallados en posi­
ción in v ertid a a co n tin u ació n de los genes
constantes CP2 y CS respectivamente.
Diversidad de los receptores T
La diversidad exhibida por los receptores aP
es de una magnitud similar a la de las inmuno-
globulinas. En todas las familias de genes del
TCR existe flexibilidad en el sitio de yuxtapo­
sición de los genes que recombinan y también
ocurre el agregado de 1-12 nucleótidos libre de
tem plado en dichos sitios (diversificación N-
term inal). Esta di versificación en el sitio de
yuxtaposición varía en las diferentes etapas de
ios ontogenia TyS murina, desconociéndose los
factores que la regulan.
Por otro lado, en la familia de genes TP, am­
bos elementos Dp pueden ser usados en los tres
marcos de lectura sin la aparición de codones
de terminación. Esto permite eodificai' distintos
residuos, lo que aumenta notablemente la di­
versificación. Lo mismo sucede con los genes
DS, donde además se han identificado num ero­
sas cadenas que utilizan simultáneamente dos
regiones DS. Estos mecanismos proveen al sis­
tem a yS de un enorme potencial pese a que es­
tas familias disponen de un aparente reducido
número de genes variables.
En el ratón, los linfocitos TyS de la piel y
epitelio genital expresan predom inantem ente
un par de cadenas yS, donde sus genes poseen
muy reducida variabilidad en los sitios de re-
152 Aspectos básicos de la inmunidad
CADENA a
7
23
Va
CADENA p
— . 7 ü 9 7
vp — I_____-/ /■_ 1—
CADENA y
23
CADENAS
— , 7 12
23 12
V8. //-
F ig. 7-4. H eptám eros, nonám eros y espaciadores que ñanciuean a los genes de las cuatro cadenas de los receptores T. O b­
sérvese que, por la disposición de los espaciadores vecinos a D p y D6, se perm ite la recom binación entre dos genes D.
combinación. Por lo tanto, el repertorio de re­
conocimiento de estas células es muy limitado.
A diferencia de lo que sucede con los genes
de inm unoglobulinas, no hay evidencias que
sugieran la existencia de mutación somática en
lo genes de receptor T.
Moléculas accesorias
E l complejo molecular CD3. Ambos hetero-
dímeros de reconocim iento T están estrecha­
mente unidos en la superficie celular con un
grupo de moléculas que colectivamente se de­
signan complejo CD3 (fig. 7-1). Como se ha
mencionado antes, se trata de cinco cadenas
polipep tídicas de 150-180 residuos, dos de
ellas glucosiladas llam adas CD3y y CD3s, y
dos no glucosiladas, denominadas CDSsiépsi-
lon) y CD3( (zeta), habiendo dos m.oléculas de
esta última por complejo molecular. No se de-
he confundir a estas cadenas con las moléculas
del receptor Tpropiam ente dicho.
Son proteínas integrales de membrana, uni­
das no covalentemente entre sí, excepto las dos
moléculas que están unidas por enlaces di­
sulfuro. Excepto CD3i;, el resto de las molécu­
las poseen los dos tercios de la proteína e x ­
puestos al exterior, seguidos a continuación de
® 12 Ja
Dp 7
12
1 Jp
12
Jy
D5
23
-// J8
una región transmembrana de unos 26 residuos.
Este tramo posee un aminoácido con carga ne­
gativa, que puede constituir uno de los m eca­
nismos que estabilizan su interacción con las
cadenas del heterodímero receptor, que poseen
en esta porción uno o dos residuos con carga
positiva.
Las porciones intracitoplasm áticas de los
componentes son significativamente más largas
que las de los receptores, por lo que se cree que
pueden interactuar con otros componentes del
citoplasm a en la transducción de señales. Su
secuencia no es homóloga a dominios de actí­
vidad quinasa o proteínas que ligan GTP. Co­
mo se describirá en el capítulo 13, los compo­
nentes de CD3 participan en la transducción de
señales durante la activación celular.
El complejo molecular CD3 es esencial, ade­
más, en el ensamblado y transporte del TCR a
la superficie. La unión de las moléculas ocurre
en el retículo endoplasmático, donde participa
una cadena adicional denominada CD3co(ome-
ga). Células mutantes para la expresión de al­
guna de las cadenas de CD3 no exportan el re­
ceptor T hacia la superficie.
Las cadenas CD3 y, 5 y e se sintetizan desde
estadios muy tempranos de maduración tímica,
pero permanecen en el interior celular. Recién
 Estructura y organización genética del receptor T
en los estadios más avanzados de maduración,
ei reordenamiento y la expresión de los genes
del TER permiten el ensamblado del conjunto
para su exposición superficial.
Los genes que codifican CD3 7 , 8 y e están
estrechamente ligados en un tramo de 60 kd del
cromosoma 1 lq23 humano y 9 murino.
Otras moléculas accesorias. En las células
portadoras del receptor a p , las moléculas CD4
y CD 8 juegan un papel importante en el mco-
noeimiento de porciones no polimórficas de las
MHC de clase II y I respectivamente. También
participarían en la transducción de señales al
interior, ya que están asociadas a una tirosina
quinasa que puede fosforilar ¡a cadena CD3 ^
(véase cap. 13).
B IB L IO G R A F ÍA
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Reacción antígeno-anticuerpo in vitro
interacción primaria
RICARDO MARGNI
GENERALIDADES
L a reacción inm unológica depende de la
complementariedad que pueda existir entre un
antígeno y un anticuerpo y constituye una inte­
racción típica entre macromoléculas. En el de­
terminante antigénico y en el sitio de combina­
ción del anticuerpo específico hay estructuras
que se corresponden y la regulan. No solamen­
te las estructuras primarias son las responsables
sino que, tal como ocurre con algunas enzimas,
las estructuras secundarias y terciarias también
participan facilitando el acoplamiento, como la
llave a la cerradura según la expresión clásica.
Las fuerzas que facilitan esta unión no son
de tipo covalente, son más lábiles, lo que per­
mite en ciertas condiciones la disociación de
complejos Ag-Ac ya formados.
Cuando antígeno y anticuerpo se encuentran
en fase acuosa, la interacción de las moléculas
de agua con ambos reactivos juega un papel
muy im portante en la combinación ligante-li-
gando. Las fuerzas responsables de esa unión
se producen en prim er térm ino como conse­
cuencia de una disminución de la entalpia que
lleva a la sustitución de las interacciones de fi­
jación entre el agua y el antígeno o el anticuer­
po, por interacciones más estables entre el antí­
geno y el anticuerpo y, en segundo lugar, por
un aumento de la entropía originariamente de­
pendiente de la liberación de agua por ambos
reactivos. La energía libre de fijación es la que
tiene que vencer la disminución de la entropía
originada a consecuencia de la com binación
del antígeno con el anticuerpo para formar un
complejo Ag-Ac más estable.
D iferentes formas de unión no covalentes
contribuyen a la formación de la unión Ag-Ac,
las que están determ inadas por la naturaleza
8
química del solvente. Entre ellas figuran unio­
nes electrostáticas (atracción entre átomos car­
gados positivam ente y negativamente), unio­
nes o puentes de hidrógeno (atracción entre
átomos polarizados opuestos de hidrógeno y
oxígeno), fuerzas de Van der Waals (atracción
entre electrones y núcleos atómicos), fuerzas
de dispersión de London (dependen de la pola­
ridad electrónica de los grupos interactivos),
etc. Una característica de todas esas fuerzas de
atracción es que son inversamente proporcio­
nales a la distancia entre los grupos interaccio-
nantes. Así, las uniones iónicas son inversa­
mente proporcionales al cuadrado de la distan­
cia que los separa, en tanto que las fuerzas de
Van der Waals son inversamente proporciona­
les a la sexta potencia de la distancia entre los
grupos. Además, en estas interacciones partici­
pa la llamada repulsión estérica, que es inver­
samente proporcional a la décima potencia de
la distancia entre los grupos reaccionantes. Es­
tas fuerzas se deben a la interpenetración de
las nubes electrónicas de los átomos no uni­
dos.. C uando hay co m p lem en taried ad entre
ellos, estas fuerzas se minimizan, ocurriendo
lo contrario cuando el ligando no es específico
para los grupos reactivos del sitio de combina­
ción del anticuerpo. La contribución de esas
fuerzas a la energía libre de unión es del orden
de -1 a -2 Kcal/mol para las interacciones ió­
nicas; de -1 Kcal/mol para los puentes de hi­
drógeno, y m enos de -1 K cal/ mol p ara las
fuerzas de London, La mayor contribución a la
energía libre de unión no proviene de las unio­
nes débiles entre superficies apolares, sino del
aumento de la entropía como consecuencia de
la liberación de moléculas de agua alrededor
de grupos apolares de los reactivos interaccio-
nantes, que es de aproximadamente -4,1 Kcal-
 Reacción antígeno-anticuerpo in vitro
/mol. Cuando residuos hidrofóbicos de un de­
terminante antigénico interaccionan con resi­
duos hidrofóbicos del sitio de combinación del
anticuerpo, las moléculas de agua que estaban
en contacto con cada uno de ellos se excluyen,
lo cual facilita la estabilización de la interac­
ción. Ocurre algo similar a lo que acontece con
moléculas proteicas ricas en residuos hidrofó­
bicos superficiales, las que en solución acuosa
no pueden permanecer como monómeros pues
dimerizan con facilidad. La contribución de los
puentes de hidrógeno a la energía lib re de
unión del complejo Ag-Ac, que podría ser sig­
nificativa, -4,5 Kcal/mol, se ve muy disminui­
da como consecuencia de que las moléculas de
agua compiten eficazmente con el antígeno y el
anticuerpo en esas interacciones. La energía li­
bre de fijación total de la unión del antígeno
con el anticuerpo, que es aditiva, oscila entre
-8 y -1 5 Kcal/mol.
Una de las mayores dificultades para el estu­
dio de las interacciones antígenos-anticuerpos
séricos es la gran heterogeneidad de éstos. El
advenimiento de los anticuerpos monoclonales
homogéneos, obtenidos de hibridomas habrá de
facilitar los hechos. No obstante, esos resulta­
dos serán válidos para estudios experimentales,
ya que la homogeneidad no es la característica
de la población total de anticuerpos séricos de
una respuesta inmune, donde la población mo­
lecular, de origen policlonal, está formada por
anticuerpos de diferente afinidad, que a su vez
pueden reconocer diferencias en los epitopes
para los cuales tienen especificidad.
En el laboratorio es factible realizar el estu­
dio fisicoquímico de esa interacción y la medi­
ción de las fuerzas que la regulan en cada caso.
Para ello, partículas antigénicas tales como
bacterias, hem atíes, células, etc., no resultan
útiles pues son muchos los componentes anti­
génicos que las forman. Tampoco son eficaces
la m ayor parte de las proteínas sim ples por
contener varios determinantes antigénicos dife­
rentes por molécula, lo que llevaría a la medi­
ción de la interacción simultánea de distintos
sistemas ligando-anticuerpo. Los mejores siste­
mas son los constituidos por anticuerpos con
especificidad para grupos químicos definidos
(antiácido arsanílico, antidinitrofenol, antilac-
tósido, etc.) y sus correspondientes haptenos.
Puede recurrirse también al empleo de inmuno-
sueros obtenidos por inmunización con deter­
minadas bacterias capsuladas, las que por con­
tener en sus poliósidos constitutivos algunos
residuos simples, tales como el ácido cellobiu-
rónico en el neumococo tipo líl, originan anti­
cuerpos con especificidad para ellos.
Si se inmuniza un animal y se lo sangra pe­
riódicam ente, los anticuerpos formados reac­
cionan con el agente inmunizante a velocidades
155
diferentes y originan precipitados o aglutinados
que se disocian de distinta m anera según la
sangría de la que fueron obtenidos. Ello es con­
secuencia de su distinta afinidad, que depende
del tipo de fuerzas que gobiernan esas uniones.
¿Cómo puede medirse esa afinidad?
Si consideramos un hapteno con un solo gru­
po reactivo por molécula (Hp), cuando reaccio­
ne con su anticuerpo específico lo hará de la si­
guiente manera;
Ac + Hp ^ A c H p
k ’i
AcHp + Hp AcHp^
k ’.
AcHp„_, + H p ^ AcHp„
k ’„
n representa el número máximo de moléculas
de ligando m onovalente capaces de unirse a
una molécula de anticuerpo, o sea el número de
sitios de com binación o valencia de éste; en
tanto que k y k ‘ son las constantes de las velo­
cidades de asociación y disociación (constantes
cinéticas) para las distintas etapas de la reac­
ción, y su relación k /k ’ = K la constante de
asociación. El valor de K puede calcularse de­
terminando la concentración de cada uno de los
reactivos cuando el sistema se haya equilibra­
do. El valor de K determinado en esas condi­
ciones se denomina constante de asociación in­
trínseca, y la ecuación que expresa ese estado
de equilibrio es la siguiente;
(AcHp)
= K (1)
(Ac) (Hp) k’
Es necesario, para poder comparar los resul­
tados obtenidos con diferentes sistemas, deter­
minar las condiciones de equilibrio para el cál­
culo de K. Se ha establecido que éste corres­
ponde al caso en que ia mitad o el 50% de ¡os
sitios de combinación del anticuerpo estén ocu­
pados por ligando monovalente. Este valor de
K se denomina “constante de asociación intrín­
seca mediana”, se identifica como y es sinó­
nimo de afinidad. Suele representarse también
con (constante de afinidad).
De la ecuación (1) deriva la siguiente;
K (Ac) (Hp) = (AcHp) (2)
La concentración total de anticuerpo (Act) es
igual a la suma de sus moléculas unidas al hap-
156 Aspectos básicos de la inmunidad

teño (AcHp) y las que se encuentran libres en cuál debe ser la concentración aproximada de
el medio (Ac): ligando (Hp) que se debe añadir para poder lo­
grar la saturación de aquél.
(Act) = (Ac) + (AcHp) (3) La ecuación (7) es una expresión de la ley de
acción de las masas, similar a la derivada por
Ello considerando al anticuerpo como univa­ Langmuir para la adsorción de gases sobre sóli­
lente, pero dado que éste posee más de un sitio dos.
de combinación por m olécula (n), este valor De la ecuación (7) puede derivarse otra, que
debe ser tenido en cuenta, como se verá más permite calcular K q determinando las concen­
adelante. traciones de hapteno libre y combinado para
La ecuación (3) puede reescribirse: los diferentes sistem as en equilibrio. Si esa
ecuación es invertida:
(Ac) = (Act) - (AcHp) (4) (Act) 1 -I- K (Hp)
(8)
Sustituyendo el valor (Ac) en la ecuación (2) (AcHp) K (Hp)
por el de la ecuación (4) resulta:
Si se pasa (Act) al lado derecho de la ecuación:
K (Hp) l(Act)-(AcHp)] - (AcHp) (5)
1 1 + K (Hp)
Resolviendo el lado izquierdo de la ecuación (9)
(AcHp) (Act) K (Hp)
y reordenando
Desarrollando el lado derecho de la ecuación:
K (Hp) (Act) - K (Hp) (Ac Hp) = (Ac Hp)
K (Hp) (Act) = (AcHp) 4- K (Hp) (AcHp) ] 1 1
(10)
K (Hp) (Act) = (AcHp) [ 1 K (Hp)] (6) (AcHp) (Act) K (Hp) (Act)
Transfiriendo (Act) del lado izquierdo de la Si sustituimos (AcHp) = hapteno combinado,
ecuación hacia el derecho y [1 4- K (Hp)] en por b y (Hp) = hapteno hbre, por c, la ecuación
sentido inverso, resulta; anterior puede escribirse:
1 1 1
(AcHp) K( Hp) ---------- = --------------- + -------- ( 11)
(7) Act K c Act
(Act) 1 -HK (Hp)
Graficando por el método de Scatchard 1/fo ver­
(AcHp) sus 1/c (fig. 8-1) se obtiene una curva que per­
constituye la relación entre el número mite calcular, además de Kq, los sitios de com­
binación o paratopes existentes en la muestra
de moléculas de hapteno combinado por molé­ por extrapolación de la curva a Mb, ya que en
cula de anticuerpo y equivale a la fracción de la ese punto c - y 1/c = O y, de acuerdo con la
molécula de anticuerpo unida al hapteno. ecuación (11), la ordenada al origen es MAct.
Si en la ecuación (7) (Act) se lo transfiere al Si se trabaja con anticuerpo purificado, puede
lado derecho, se transforma en determinarse su valencia dividiendo la concen­
K (Hp) (Act) tración de sitios de combinación por la concen­
(AcHp) = ---------------- (7 ’) tración de anticuerpo total.
1 -f K (Hp) La ecuación (7) está referida a un anticuerpo
o ligante que posee un solo sitio de combina­
Siendo K q expresado en M ‘ y (Hp) en M, el ción pero, teniendo en cuenta que en los anti­
producto K (Hp) no tiene unidades. Este valor, cuerpos existen n sitios, ella debe escribirse
relativo de 1 determina el grado de saturación
del anticuerpo (Act) por el ligando (Hp). Así, si (AcHp) n K (Hp)
( 12)
K; es 10*' M “' y la concentración del ligando (Act) 1 -)- K (Hp)
(rfp) es 10 '' M, Ko (Hp) = 0,1, por lo tanto, de
acuerdo con la ecuación (7^), el total de anti­ (AcHp)
cuerpo ocupado sérá Si llamamos r a la relación --------- y c a la
0,1 0,1 ( Act)
--------- = ------ = 9 % concentración de hapteno libre (Hp), la ecua­
1-1-0,1 1,1 ción anterior puede escribirse:
Esta observación es muy interesante ya que
permite saber, para una determinada concentra­ nK C
ción de anticuerpo (Act) y conociendo su Kq, (13)
1 - hKc
 Reacción antígeno-anticuerpo in vitro
1/cxlo^M '’
F ig . 8-1. E laborada con los datos del cuadro 8-2. La curva
experim ental fue linealizada por el método del análisis re­
gresivo. In te rcep ció n d e la lín ea a )/b = 8,4 x 10“ M -'.
C oncentración de sitios de com binación = 0,119 x 1 0 M.
C o n c e n tra c ió n de in m u n o g lo b u lin a a n tic u e rp o = 0,95
m g .m l-';K o = 0 ,9 x 1 0 ’ M -'.
Esta expresión resulta muy útil ya que si me­
diante la aplicación de alguna de las metodolo­
gías conocidas es posible lograr diferentes esta­
dos de equilibrio para una misma concentra­
ción de anticuerpo y concentraciones variables
de hapteno monovalente, pueden obtenerse di­
ferentes valores de r y de c. Esto permite grafi­
car por el método de Scatchard r/c versus r y
F ig . 8-2. E laborada con los datos del cuadro 9-1. A. graficación por el m étodo de Scatchard. B, g raficación por el méto­
do de Sips.
157
obtener una línea cuya pendiente es - K (véase
fig. 8-2A). Ésta no es una recta, índice de la he­
terogeneidad de los anticuerpos.
Cuando la concentración de hapteno libre c
es enormemente grande, r se aproxima a n, y
para r/c = O, el punto en que la curva intercepta
a r será la valencia del anticuerpo o número
máximo de moléculas de ligando monovalente
capaces de fijarse a una molécula de anticuer­
po. Esta graficación, como se verá más adelan­
te, sirve para determinar el valor de Kq.
Pasando 1 -i- Kc al lado izquierdo de la ecua­
ción y reordenando se obtiene;
r -(- r K c = nKc
r = n K c - r K c = c (nK - r)
= nK-rK (14)
Al igual que la ecuación (11), la (14) no es
una recta, razón por la que no son las expresio­
nes más recomendadas para los cálculos de Kq.
En este sentido es m uy útil la ecuación deriva­
da por Sips de la de Langmuir (9) para la ad­
sorción de un gas en un sólido y que, para el
equilibrio de proteínas e iones en solución, uti­
lizando la nomenclatura ya indicada, resulta:
n (K c)“
(J5)
I -t (K c)“
en la que a es el índice de heterogeneidad de
los anticuerpos o grado de disp ersió n de la
constante de equilibrio en torno a Ko-
158 Aspectos básicos de la Inmunidad
Pasando 1 + (Kc)“ al lado izquierdo de la
ecuación (15) y resolviendo se obtiene:
r + r(Kc)“ = n(Kc)^'
r = n(Kc)‘>- r(Kc^'
r = (n - r) (Kc)=>
= (K c )“ (16)
la que mediante la aplicación de logaritmos se
transforma en:
log = a log K - a log c (17)
Cuando se grafican los valores de log
versus log c se obtiene una recta (fig. 8-2B),
siendo a el valor de la pendiente. Teóricamente
el valor de a (o a , como también se lo designa)
oscila entre 1 y 0. El valor 1 correspondería al
de un anticuerpo en el que todas sus moléculas
tuviesen el mismo valor de K, cosa que a ex­
cepción de los anticuerpos monoclonales, en la
práctica difícilm ente ocurre. Valores de a =
0,5-0,7 se obtienen con mucha frecuencia. Para
valores de c = 0,5, el 75% de los sitios de com­
binación dei anticuerpo analizado tienen valo­
res de K que oscilan entre 0,025 Kq y 40 Kq.
Esta dispersión es menor cuando el valor de a
se aproxima a la unidad. Para a = 0,8, ella osci­
la entre 0,27 y 3,7 de K^.
La ecuación de Sips puede expresarse de dos
maneras; una de ellas es la (17).
En esta forma, para su cálculo es necesario
aislar y purificar el Ac específico involucrado,
ya que es requisito para la determinación de r.
Ai igual que con la ecuación de Scatchard,
donde existen dos formas de expresión, una en
términos de r (ecuación 14) y otra independien­
te de r y que, por ende, no requiere conocer
concentración de inmunoglobulina Ac por una
vía independiente (véase cap. 39, ecuación 16),
la equación de Sips puede expresarse indepen­
dientemente de r. Partiendo de una equación
que veremos más adelante (ecuación 27).
1 1 1 o sea, que K q será igual a la inversa de la con­
Act K“ c" Act
donde Act corresponde a la concentración total
de sitios, tal como se lo definió para la ecua­
ción (11) y cuya determinación puede hacerse
por un experimento de desplazamiento, se de­
duce que
log = a log K -I-a log c (17’)
Act-r
Su representación gráfica se muestra en la figu­
ra 8-2C. Por esta vía es posible estudiar la ho­
mogeneidad funcional de un anticuerpo mono­
clonal directam ente de los sobrenadantes de
cultivos de los hibridomas o de las ascitis que
se prepararon para su expansión.
Act-b
Afinidad y avidez
La ecuación (14) puede escribirse así:
— = K (n-r) (18)
de la que deriva
= K (19)
(n-r) c
Esta ecuación permite establecer el valor de
K q, cualquiera que haya sido el método de gra­
ficación empleado. Si se trata de un anticuerpo
b ivalente, cuando la m itad de sus sitios de
combinación estén ocupados, r = 1 y n-r = 1, de
donde
r 1
-------- = K = — (20)
(n-r) c c
centración de hapteno libre.
Cuando se determina Kq usando como ligan­
do un hapteno simple se habla de afinidad y, si
para ello se utiliza un antígeno, se considera
que el valor obtenido expresa la avidez, ya que
las fuerzas de unión en este caso están aumen­
tadas. Lo que se determina es una constante de
asociación aparente, m agnificada respecto de
K(), pues otras fuerzas, que no son las corres­
pondientes a la unión entre el sitio de combina­
ción y un epitope aislado, pueden participar.
 Reacción antígeno-anticuerpo in vitro
Cuando lo que interacciona con un anticuerpo
es un antígeno que posee un solo epitope y un
paratope de la molécula de anticuerpo, puedan
ocurrir otras uniones proteína-proteína entre la
estructura soporte del antígeno y del anticuerpo
no involucradas en el sitio de com binación.
Puede ocurrir también que su interacción con
un sitio de com binación del anticuerpo -p o r
creación de mecanismos alostéricos- haga que
el otro sitio de combinación pueda reaccionar
con el ligando de una manera más efectiva. Si
el antígeno posee repetido un mismo epitope, y
siempre que no haya im pedim entos estéricos
que le permitan interaccionar con más de un si­
tio de combinación de la molécula de anticuer­
po (interacción m onogám ica), originará una
fuerza de unión mayor que cuando interacciona
un ligando simple. Termodinámicamente signi­
fica que para su disociación, no obstante tratar­
se de una molécula de antígeno y una molécula
de anticuerpo las que interaccionan, se necesi­
tará mayor energía que si estuviera unido sólo
un sitio de combinación.
En síntesis, toda transgresión a la unión sim­
ple entre un sitio de combinación y un ligando
univalente pequeño como lo es un hapteno (afi­
nidad, K q), dará lugar a una constante de aso­
ciación aparente magnificada respecto de Kq.
El valor de esa constante de asociación múlti­
ple o se llama avidez. Singer y Campbell
analizaron la interacción entre un anticuerpo y
un antígeno con un epitope repetido varias ve­
ces. Llegaron a la conclusión de que la posibili­
dad de interacción múltiple “sitios de combina-
ción-antígeno” dependía del núm ero de esos
epitopes por unidad de antígeno. Ello les per­
mitió, para estos casos, expresar la ecuación
= E • Ko/n como representativa de la avi­
dez, siendo F la valencia del antígeno y n el
número de sitios de combinación de la molécu­
la de anticuerpo interviniente.
Por este motivo puede ocurrir que anticuer­
pos con valores de K q bajos determinados con
un hapteno tengan valores mayores cuando el
ligando es un antígeno. En algunos casos, esas
diferencias han llegado a ser 10.000 veces más
efectivas.
Todo lo expresado está relacionado con el
estudio de las fuerzas que regulan la unión de
los complejos Ag-Ac o afinidad^ que no debe
confundirse con especificidad. Esta es mayor
para aquellos determinantes antigénicos idénti­
cos a los utilizados en la inmunización y dismi­
nuye a medida que se diferencian. Determinan­
tes antigénicos con grupos compartidos pueden
dar reacciones cruzadas con los anticuerpos
o rig in ad o s p o r uno de ellos. In ic ia lm e n te
Landsteiner y posteriormente otros investiga­
dores han efectuado experiencias bien demos­
trativas sobre el particular (cap. 4).
159
Fig. 8-3.
A = inm unógeno.
B = ligando que d a reactividad cruzada d e tip o I.
C = ligando que da reactividad cruzada d e tip o II.
R = relación B /F del ligando radioinarcado.
R o = lím ite de R, cuando la concentración d e todo el ligan­
do, incluido el trazador, se aproxim a a O (cero ).
Recientemente Berzofsky y Schetchter, utili­
zando el radioinm unoanálisis de competición
como método analítico (véase cap. 38), han de­
finido dos tipos de reacciones cruzadas. La del
tipo I es la originada por un ligando distinto del
usado en la inmunización, que reconoce al anti­
cuerpo originado por éste, pero con menor afi­
nidad. En este caso, las curvas de competición
muestran que el segundo ligando puede llegar a
desplazar totalmente al trazador, pero con ma­
yor consumo de antígeno que el correspondien­
te al inductor de la respuesta inm une. Ello es
consecuencia de su menor afinidad (fig. 8-3).
La reactividad cruzada de tipo II tiene lugar
cuando en el suero en análisis hay una mezcla
de anticuerpos originados por el antígeno in­
ductor. En este caso, el segundo ligando sólo
reconoce algunos de ellos y puede hacerlo con
una afinidad similar a la de! ligando original,
pero aunque se aumente su concentración no
interacciona con los otros anticuerpos presentes
-q u e sí reconocen al prim ero-, de allí que el
desplazamiento del trazador no sea total.
La afinidad de un anticuerpo para dos deter­
m inantes antigénicos relacionados es mayor
para el homólogo, esto es, para el inductor de
ia respuesta inmune. Existen anticuerpos deno­
minados “heteroclíticos”, que tienen mayor afi­
nidad de fijación por antígenos relacionados
con el inmunógeno que por éste.
Cuando un suero contiene anticuerpos de al­
ta afinidad, éstos pueden reaccionar con deter­
minantes antigénicos relacionados, cosa que
generalmente no ocurre con los de baja afini­
dad. En efecto, un anticuerpo de este típo, ca-
160 Aspectos básicos de la inmunidad.

paz de dar una débil reacción visualizable con en la que K q y son las constantes de asocia­
su determ inante antigénico específico, no da ción determinadas a las temperaturas absolutas
reacciones visibles con antígenos relacionados, T, y T^ respectivamente.
cosa que puede hacer uno de alta afinidad. Ello Resolviendo la ecuación (23) se obtiene:
significa que los sueros con anticuerpos de alta
afinidad pueden tener una especificidad menor AH” / 1 1
que los de baja afinidad, usados a la mism a
concentración. El problema por lo general se
log K ()2 - log Ko, =
2,303 R ( t i)
resuelve diluyendo convenientemente el anti­
suero. log Ko2 - log Ko, A H‘> A H°

1 1 2,303 R 4,576
TERMODINÁMICA
D E LA INTERACCIÓN
H A PT E N O -A N T IC U E R PO
4,576 (log K 02 - log Kq,)
Al formarse los complejos antícuerpo-hapte-
no producen cambios de la energía libre están­ AH° ------------------------------- ^----- (24)
1 1
dar A F°, que puede medirse a partir de K q de
acuerdo con la siguiente ecuación: T, T^
A F° = -R T In K,-o (21 ) La entropía A S° se calcula a partir de:

en la que R es la constante universal de los ga­ A F° = A H” - ■A S° (25)

ses (1,9871 cal/grado/mol) y T la temperatura
absoluta, que se obtiene sumando la temperatu­ de donde:
ra en "C a 273,15; In K q es el logaritmo natural
de Ko, que es igual a 2,303 log Kq. Se emplea A S° ■T = A H° - A F°
el signo menos (-) porque, por convención, un
cambio negativo en la energía libre correspon­ A H“ - A F°
AS" = --------------- (26)
de a uniones positivas. De todo ello resulta

A F“ = — 4,576 T = log K q (22 )

La ecuación (22) es muy interesante, ya que
muestra que grandes variaciones de la afinidad
pueden significar muchas veces pequeños cam­
bios de la energía libre estándar A F°.
Si consideramos tres anticuerpos (I, II y III)
con valores de 10^ M *, 10'’ M ' y 10^ M ', res­
pectivam ente, y la reacción tu v iera lugar a
20°C, los valores de A F® serían:
(I) A F" = -4,576 X 293,15 X 5 = ^6,7 Kcal/mol
(II) A F° = -4,576 X 293,15 x 6 = -8,0 Kcal/mol
(III) A F" = -4,576 X 293,15 x 7 = -9,4 Kcal/mol
Ello indica que una diferencia de 100 veces
en la afinidad (anticuerpos I y III) significa una
variación de AF“ en -2 ,7 Kcal/mol, práctica­
mente la energía de algo más de medio puente
de hidrógeno (4,5 Kcal/mol) o de dos interac­
ciones iónicas (1 a 2 Kcal/mol).
La entalpia A H° puede calcularse haciendo
dos determinaciones de Kq a diferentes tempe­
raturas, de acuerdo con la siguiente ecuación:
Kn, AH°
log (23)
2,303 R
D ET E R M IN A C IÓ N DE
(CONSTANTE DE ASOCIACIÓN
INTRÍNSECA PROMEDIO)
Puede hacerse por equilibrio de diálisis, ex­
tinción iquenching) de fluorescencia, polariza­
ción de fluorescencia, por precipitación con
sulfato de amonio de los complejos Ag-Ac for­
mados, por ultracentrifugación o filtración por
geles, etc. La mayoría de estos métodos no ne­
cesitan que el anticuerpo en estudio esté purifi­
cado, y usan para su análisis suero entero o su
fracción gam m aglobulínica. O tros, como el
quenching de fluorescencia sólo pueden llevar­
se a cabo con el anticuerpo aislado.
Equilibro de diálisis
Se funda en los siguientes hechos: si separa­
dos por una membrana hemipermeable coloca­
mos en un compartimiento de la cámara una
solución de hapteno dializahle y en la otra el
anticuerpo no dializahle, después de cierto
tiempo parte del hapteno que ha atravesado la
membrana se combinará con el anticuerpo, lle­
gándose finalm ente a un estado de equilibrio
estable entre las concentraciones de hapteno li­
 Reacción antígeno-anticuerpo in vitro 161

H apteno Anticuerpo

Inicial Final

F ig. 8-4. R epresentación esquem ática de un equilibrio de diálisis.

bre de ambos com partim ientos (fig. 8-4). La
cantidad de hapteno com binado, de acuerdo
con la ley de acción de las masas que regula es­
te equilibrio, dependerá de la concentración de
hapteno colocado inicialmente en su correspon­
diente celda. Es posible, mediante el empleo de
varios juegos de cámaras en las que se coloca
la misma cantidad de anticuefpo y cantidades
variables de hapteno en cada una de ellas, con­
seguir diferentes estados de equilibrio en los
que el anticuerpo estará bloqueado por el hap­
teno a distintos grados de saturación. Si obteni­
dos los estados de equilibrio se miden las con­
centraciones de hapteno libre y combinado, se
podrán calcular los diferentes valores necesa­
rios para la graficación de los resultados y de­
terminar K q = 1/c. La concentración de hapteno
en la celda donde originariamente se la colocó
dará el valor de hapteno libre, mientras que la
concentración de hapteno en la celda donde se
colocó el anticuerpo corresponderá a hapteno
libre más hapteno combinado. La concentra­
ción de este último se determina por diferencia
entre.los valores obtenidos.
e) Pequeñas lám inas de papel celofán. Se
utilizan para separar los compartimientos de la
cámara y permitir el equilibrio. Antes de su uso
conviene lavarlas con agua destilada para eli­
minar el apresto que pudieran contener.
f) Pipetas de 1, 2 y 10 mi.
g) Agitador adecuado.
h) Espectrofotómetro.
Método
Armar las cámaras de diálisis. Para ello co­
locar entre dos compartimientos una lam inilla
de papel celofán y unirlos manteniéndolos fijos
mediante el ajuste de los correspondientes tor­
nillos. Numerar las cámaras de modo que pue­
dan ser identificados los diferentes com parti­
mientos. En un compartimiento de cada una de
ellas colocar 2 mi de la solución de anticuerpo
y en los restantes las diferentes soluciones de
hapteno, procurando que quede una burbuja de
aire para facilitar la agitación. Cerrar las aber­
turas de carga.

P arte e x p e r im e n t a l

Material necesario
a) Anticuerpo antidinitrofenol purificado. Se
obtiene a partir de suero de ovejas inmunizadas
con gamm aglobulina humana dinitrofenoiada
(GGH-DNP). El método de preparación y las
indicaciones para la purificación del anticuerpo
son los especificados en el capítulo 44, Para el
ensayo se prepara una solución 2,5 x 10"^ M
(3,75 mg • mi *) en solución salina fosfatada.
b) Hapteno. Se utiliza dinitrofenol disuelto
en solución salina fosfatada. Para el ensayo se
preparan soluciones 1 x 10"^ M; 5 x 10 '* M; 2,5
X lO-'* M; 1 X lO-"* M; 5 x 10-^ M y 1,5 x 10-’ M,
c) Solución salina fosfatada. NaCl 0,15 M,
fosfatos 0,01 M, pH 7,6.
d) Cámaras para equilibrio de diálisis. Pue­
den usarse distintos modelos. Son muy útiles F ig. 8-5. Pequeñas cám aras de acrílico, para eq uilibrio de
las de acrílico que se muestran en la figura 8-5. diálisis.
162 Aspectos básicos de la inmunidad

C uadro 8-1. Resultados obtenidos p o r equilibrio de diálisis en la determinación de la capacidad

de combinación del anticuerpo con su hapteno específico
H apteno
H apteno com binado
H apteno libre com binado
Cám ara Anticuerpo (c) (h) anticuerpo r/c
N” xia^M X 10-^ M X 70-5 M (r) 10* M-' lo g c log r/n-r

2.5 0,18 1,02 0,41 22,8 -5 ,7 4 4 7 -0 .5 8 5 0

2.5 0,50 1.95 0,78 15,6 -5 ,3 0 3 6 -0 ,1 9 3 8
2.5 1.65 2,80 1,12 7,2 -^ ,7 8 2 5 0.1038
2.5 4.66 3,50 1,40 3 -4 ,3 3 1 6 0,3674
2.5 8,50 3.95 1,58 1,9 -4 ,0 7 0 6 0,5712
2.5 31,60 4,75 1,90 0,6 -3,5 0 0 3 1,2788

A n ticu e rp o an a liz ad o : Ig G l a n ti-D N P d e oveja; P .M .: 160.000; IO/e S : 0,68.

H a p te n o : D in itro fe n o l (D N P -O H ); P .M .: 184; 14.900.

D O (280 nm ) ■0,68
C álcu lo d e la.s m olaridade.s: A n ticu e rp o =
160.000
D O (3 6 0 nm )

14.900

Es necesario colocar como controles cáma­ trofotomctría, se calculan sobre la base del nú­
ras que contengan solución salina fosfatada y mero de c.p.m. de la solución.
hapteno (dosis media) y otra con anticuerpo de El equilibrio de diálisis no excluye la posibi­
especificidad diferente y hapteno. La primera lidad de que el ensayo se efectúe con suero to­
de ellas permite determinar si se ha logrado el tal o la fracción globulínica precipitada con
equilibrio (igual concentración final de hapteno sulfato de amonio al 50% de saturación. En es­
en ambos compartimientos), y la segunda, si el tos casos es necesario colocar controles para
hapteno se ha fijado inespecíficamente. establecer la fijación inespecífica del hapteno,
Todas las cámaras son colocadas en el agita­ que debe ser descontada para los cálculos. Es
dor, que es puesto en funcionamiento. La agita­ preferible usar las globulinas precipitadas por
ción se mantiene durante 18 horas a temperatu­ el sulfato de amonio, dada la gran captación de
ra ambiente, tiempo suficiente para lograr los dinitrofenol por la albúmina, o en su defecto
equilibrios. Transcurrido el lapso, desobturar usar otros haptenos, como la e-dinitrofenil lisi­
ios compartimientos de las cámaras, retirar los na o el ácido dinitrofenil e-aminocaproico, de
contenidos y determ inar la concentración de fijación inespecífica míniina.
hapteno por lectura espectrofotométrica de las
DO a 360 nm. Las lecturas de los contenidos
de los compartimientos en que inicialmente se
colocó el hapteno permitirán calcular el hapte­ C u ad ro 8-2. Determinación de la concentra­
no libre, y las correspondientes a los comparti­ ción de anticuerpo en un suero mediante inte­
mientos en que se ubicó el anticuerpo, el hapte­ racción primaria anticuerpo-hapteno
no libre más el hapteno combinado. Este últi­
mo se calculará por diferencia entre ambas de­ H apteno H apteno
libre com binado
terminaciones. (c) (b) ]/c ]/b
Para transformar las DO (360 nm) en molari­ N" JO-I M 10-'''M W M -' l(P M -i
dades, dividir las lecturas espectrofotométricas
por 14.900 (E rom del dinitrofenol). 1 1,14 1,10 0,87 90,90
2 1,64 1,60 0,61 62,50
Conociendo las concentraciones de anticuer­ 3 2,38 1,99 0,42 50,24
po, hapteno libre y hapteno combinado calcular 4 2.94 2,40 0,34 41,55
las relaciones necesarias para graficar según las 5 5,26 4,31 0,19 23,15
ecuaciones (11), (14) o (17) (cuadros 8-1, 8-2 y 6 7,14 4,75 0,14 21,03
7 10,12 5,81 0,10 17,20
8-3; figs. 8-],8-2A y8-2B ),
Si se dispone de hapteno marcado con -’H y M éto d o d e m edición de la in tera cció n prim aria; P rec ip itac ió n c o n
s u lfato d e am onio al 50% d e satu ra ció n d e los c o m p lejo s an tic u e r­
espectrómetro de centelleo líquido para las lec­ p o -h a p te n o form ados.
turas, el ensayo puede hacerse con cantidades D iiuvenle; Ig G l d e o veja (20 m g • m l‘') aislad a d e un suero norm a]
menores de anticuerpo (10 ^ M), ya que en este d e oveja, djlu id a 1:5 para .su uso.
H apteno; A cido d in itro fen il y-a m in o b u tírico (D N P -G A B A ).
caso las concentraciones de hapteno, que son A ntisuero; A n ti-D N P d e o veja (título ap ro x im a d o 4 m g • ml'*)'
muy bajas y no pueden determinarse por espec- P M IgG ^ ONq-a = 1 6 0 k D .
 Reacción antígeno-anticuerpo in vitro 163

C uadro 8-3. Resultados obtenidos por extinción (quenching) de fluorescencia en la determina­

ción de la capacidad de combinación del anticuerpo con. su hapteno específico
Hapteno
Quench Quench comh. Hapteno
Hapteno Corree- Lectura % % l(A e )x 2 x Ubre Hapteno
---------------------- ción p o r corre- (Qmáx (Qm áx Quench. ¡ (c) comh./Ac r/c* log
ú nm ol Lectura volumen gida =100% ) = 7 8 % ) nm ol nm ol (r) r/n-r n m oles'' r/n-r log c

100 100 O O
0,01 0,25 91,7 0,5 92,2 7,8 10 0,23 0,02 0,20 0,11 10,0 ^0,959 -1,699
0,02 0,50 84 0,8 85 15 19 0,44 0,06 0,38 0,23 6,3 -0,638 - 1,222
0.03 0,75 77 1,2 78 22 28 0,65 0,10 0,56 0,38 5,6 -0,420 -0,999
0,04 1 59 1,4 70.5 29.5 38 0,87 0,13 0,76 0,61 5.8 -0,215 - 0,886
0,05 1.25 63 1,6 64.5 35.5 46 1,05 0,20 0.91 0,83 4.5 -0,081 -0,699
0,06 1.50 5< 1.7 57.7 42,3 54 1,24 0,26 1,07 1.15 4.1 0,60 -0,585
0,07 1,75 5! 1.8 52.8 47,2 60 1,38 0,37 1,20 1,50 3.2 0,176 -0,432
0,08 2 46,5 1,9 48.5 51.5 66 1,51 0,49 1,31 1,89 2.6 0,276 -0,3‘10
0,09 2.25 46 48 52 67 1,54 0,71 1,34 2,03 1.8 0.307 -0,149
0,10 2.50 44 46 54 69 1,59 0,91 1,38 2,22 1,5 0,346 -0,041
0,12 3 40 2,5 42.5 57.5 75 1,72 1,28 1,50 3,0 1,17 0.477 0,107
0,14 3.50 38 2,9 41 59 76 1,75 1,75 1,-52 3.16 0,86 0,499 0,243
0,16 4 37 3,2 40 60 77 1.77 2,23 1.54 3,34 0,64 0,524 0,348
0,20 5 35 3,7 39 61 78 1.78 3,22 1.55 3,44 0,48 0.536 0,508

A n ticu e rp o Ig G l a n ti-D N P d e o v eja , 0,575 [xM (2 m i = 1 ,1 5 m |0,m ol); Q tnáx = 7 8 % ,

H apteno: D in itro fe n o l (D N P -O H ), 25 |jM (25 m nm ol/nil).
P ara e x p re s a r K q en L /M , al v alo r de 1/c en n m oles- ' o b te n id o (en este ca so p re v ia m u ltip licac ió n p o r 2 ya q u e se trabajó c o n 2 m i de
solución d e a n ticu e rp o ) m u ltip licarlo p o r 10^’

Extinción (quenching) de fluorescencia ción de anticuerpo, lo que asegura que en esas

Una proteína irradiada con luz ultravioleta a
una longitud de onda correspondiente a su m á­
xima absorción (280 nm) adquirirá fluorescen­
cia porque la energía absorbida es emitida co­
mo luz de una m ayor longitud de onda (350
nm). El principal crom óforo que actíía como
absorbente es el triptófano. Si un hapteno se
une al sitio de combinación del anticuerpo, par­
te de la energía que debe ser em itida com o
fluorescencia por el triptófano puede ser trans­
ferida al hapteno. Ello traerá como consecuen­
cia una dism inución de la fluorescencia que
normalmente debe emitir la proteína anticuer­
po, que estará en relación directa con la con­
centración de hapteno fijado. La máxima efec­
tividad se obtiene cuando el hapteno absorbe
en la región de la emisión de fluorescencia. El
método resulta muy útil para los anticuerpos
antidinitrofenol, pues sus haptenos (dinitrofe­
nol, ácido dinitrofenil e-aminocaproico, e-dini-
trofenil lisina, ácido dinitrofenil y-aminobutíri-
co) tienen su máxima absorción a 360 nm.
Para el empleo de este método en los estu­
dios sobre capacidad de combinación del anti­
cuerpo, es necesario saber cuál es la extinción
(quenching) máxim a de fluorescencia que un
hapteno puede provocar sobre su anticuerpo es­
pecífico. Este valor debe ser determinado expe­
rim entalm ente para cada anticuerpo y su co­
rrespondiente hapteno, añadiendo a una canti­
dad conocida de anticuerpo exceso de hapteno,
de manera que su concentración final sea no
menos de cien veces superior a la concentra­
condiciones prácticam ente todos los sitios de
combinación del anticuerpo estén ocupados por
el hapteno. La máxima extinción de fluorescen­
cia conseguida en esas condiciones constituye
el quenching máximo (Qmáx) (fig. 8-6).
A diferencia del equilibrio de diálisis, sólo
puede hacerse con anticuerpo purificado. Ade­
más no se puede determinar valencia, dato que
ha de conocerse previamente para poder efec­
tuar los cálculos.
P a rte e x p e rim e n ta l
M aterial necesario
a) Anticuerpo purificado. Solución ap ro x i­
madamente 1 |xM de anticuerpo bivalente
antidinitrofenol de oveja (IgGl).
Hapteno. Solución de dinitrofenol aproxi­
madamente 25 |iM.
Pipetas de 10 ¡a.1,1 mi, 2 mi y 10 rnl.
Espectrofluorómetro.
Método
C olocar 2 mi de la solución de anticuerpo en
la cuba del espectrofluoróm etro, previam ente
calibrado y ajustar a 100% de fluorescencia.
Añadir 10 |il de hapteno, mezclar por rotación
con una pequeña varilla de vidrio con su extre­
midad doblada en ángulo y leer. Continuar con
adiciones sucesivas de 10 )t1 de hapteno hasta
com pletar 150-200 ¡xl, anotando el porcentaje
de fluorescencia de la mezcla después de cada
164 Aspectos básicos de la inmunidad
F ig . 8-6. D eterm inación dei Q m áx para Ig G l de oveja anti-D N P. Cuando el anticuerpo está saturado por el hapteno sólo
se consigue reducir la fluorescencia en un 78% (Qmáx).
adición. Con los resultados obtenidos, efectuar
los cálculos, tenietido en cuenta para ello las
variaciones de volumen que ocurren después
de cada adición y el valor de la extinción máxi­
ma de la fluorescencia o quenching máximo
(Qmáx) para el anticuerpo y hapteno en estu­
dio. El hapteno combinado se calcula multipli­
cando el valor del quenching por 2 (anticuerpo
bivalente) y por la molaridad del anticuerpo de
ensayo, ello sobre la base de que el quenching
logrado está en relación directa con la cantidad
de hapteno que se unió al anticuerpo. El hapte­
no libre se determina por diferencia entre el to­
tal de hapteno añadido y el combinado (véase
cuadro 8-3).
Precipitación c o n s u lf a t o de amonio de los
complejos anticuerpo-hapteno formados
Si una mezcla de anticuerpo y hapteno des­
pués que ha alcanzado el estado de equilibrio
es precipitada con sulfato de amonio al 50% de
saturación, el hapteno libre quedará en el so­
brenadante y el combinado en el precipitado.
Conociendo la concentración de anticuerpo, la
cantidad total de hapteno añadida y la del so­
brenadante, es fácil calcular hapteno libre y
combinado y las relaciones de ellos derivadas.
Si el ensayo se hace en una serie de tubos, para
una misma concentración de anticuerpo y con­
centraciones variables de hapteno, los resulta­
dos obtenidos pueden graficarse.
Este método puede utilizarse para anticuer­
pos puros o antisueros sin purificar. En este úl­
mi de DNP-OH 50 ¡xM
timo caso es conveniente separar previamente
la albúmina por precipitación salina pues para
algunos haptenos, dinitrofenol en especial, tie­
ne un marcado poder de fijación inespecífico.
Puede usarse para ligandos de mayor tamaño
siempre que no precipiten con sulfato de amo­
nio al 50% de saturación.
Para la descripción del método se usará sue­
ro de conejo antidinitrofenol como fuente de
anticuerpo, y ácido dinitrofenil e-aminocaproi­
co como hapteno.
P a r te e x p e rim e n ta l
Material necesario
a) Suero de conejo normal (diluyente). El
suero de conejo no inm unizado es m ezclado
con un volumen igual de solución saturada de
sulfato de amonio (760 g de sulfato de amonio
disueltos en 1.000 mi de agua destilada y ajus­
tados a pH 7 con NaOH IN). Se deja a tempe­
ratura am biente una hora y se cen trifu g a a
5.000 r.p.m. durante 30 minutos. Se elimina el
sobrenadante y se disuelve el precipitado en
NaCl 0,15 M en un volumen cinco veces supe­
rior al inicial. Esta dilución 1:5 de globulinas
normales es lo que se usa como diluyente.
En los casos en que el hapteno no se fije a
albúmina, se emplea directam ente suero nor­
mal de conejo diluido 1:5 en NaCl 0,15 M.
b) Suero para valorar o anticuerpo purificado
(antidinitrofenol). Si se tratara de anticuerpo
purificado, se prepara con él una solución de 2
 Reacción antígeno-anticuerpo in vitro 165

mg/ml, usando como diluyente el indicado en
a). En el caso de sueros totales es conveniente
separar la fracción globulínica y preparar con
ella una solución diluyente 1:5, que contenga 2
mg-ml'‘ de anticuerpo, determinados por curva
de precipitación de acuerdo con las especifica­
ciones del capítulo 34.
c) Hapteno (ácido dinitrofenil e-aminocaproi­
co). Se preparan soluciones de distintas concen­
traciones. Para la experiencia, usar las siguien­
tes; l X lO^' M; 7 x 1 0 -5 M; 5 x 10 ^ M; 2,5
x 10-5 M; l x 10-5 M; 8 x 10-<> M y 5 x 10-^ M.
Las diluciones de hapteno se hacen en NaCl
0,15 M, fosfatos 0,01 M, pH 7,6.
d) Tubos de hemólisis.
e) Pipetas de 0,1, 1 y 5 mi.
f) Centrífuga; espectrofotómetro. ^ (11), (14) y (17). La elección depende de los
Método
Numerar dos series de tubos del l al 7 (A) y
del r al 7 ’ (B). A todos los tubos de la serie A
añadirles 0,5 mi de la solución de anticuerpo, y
a los de la serie B, 0,5 ral de diluyente (suero
normal o fracción globulínica normal 1;5). A
los tubos 1 y r agregar ) mi de la primera di­
lución de hapteno; a los tubos 2 y 2’ 1 ral de la
segunda y, de m anera similar, a los tubos si­
guientes las restantes soluciones de hapteno.
Dejar en contacto a temperatura ambiente (o a
la deseada) por 30 minutos. Añadir a todos los
tubos 1,5 mi de solución saturada de sulfato de
amonio y dejar a la misma temperatura durante
una hora. Centrifugar a 5.000 r.p.m. por 30 m i­
nutos, separar los sobrenadantes y en ellos cal­
cular las concentraciones de hapteno por lectu­
ra de las DO a 360 nm. Las concentraciones
molares resultan de dividir las DO (360 nm)
por 17.800 (Efcm del ácido dinitrofenil e-ami-
nocaproico).
Los valores obtenidos con los tubos de la se­
rie A corresponden a concentraciones de hapte­
no libre y los de la serie B a hapteno total. El
hapteno combinado se determina por diferen­
cia. Con los valores hallados se calculan las re­
laciones (cuadro 8-4) y se grafica.
Al igual que para equilibrio de diálisis, el
empleo de haptenos marcados con átom os ra­
d iactivos perm ite desarrollar el m étodo con
concentraciones de anticuerpo diez veces infe­
riores a las indicadas.
CÁLCULO DE K(), n, a, Ac
Ko puede calcularse a partir de cualquiera de
los valores graficados utilizando las ecuaciones
datos experimentales disponibles.
Si no se conoce la valencia ni la concentra­
ción en anticuerpo de la muestra en estudio, el
cálculo de Kq puede hacerse graficando l/b
versus 1/c (ecuación 11) (fig, 8-1). En el punto
en que la curva intercepta a l/b , el valor seña­
lado corresponde a la inversa de la concentra­
ción de ligando monovalente que satura to tal­
mente al anticuerpo. El doble de dicho valor es
la inversa de la concentración de ligando cjue
sólo satura el 50% de los sitios de com bina­
ción. Buscando ese valor en el eje de las orde­
nadas y trazando una perpendicular a él, ésta
cortará la curva experimental en un punto. El
valor correspondiente de la inversa de la con­
centración de ligando libre (eje de las abscisas)
será 1/c = Kq.
La graficación de la figura 8-1 puede servir
también para establecer la concentración total
de anticuerpo (Act) de la m uestra analizada,
sobre todo cuando se trata de anticuerpos de
muy baja afinidad que no dan uniones firm es
con el antígeno y resultan difíciles de valorar

C uadro 8-4. Precipitación con sulfato de amonio de los complejos form ados en la determinación
de la capacidad de combinación del anticuerpo con su hapteno específico

H apteno
H apteno H apteno com binado
H apteno libre com binado r/c
Anticuerpo total (c) X 10-'' anticuerpo xW ’
N" xlO '> M X 10 '’ M X /0-« M M (r) M'i r/n-r log r/n-r log c

I 2 ,2 2 1,63 0,1 3 1,50 0 ,6 7 51 0 ,5 0 ^ 0 ,3 0 1 - 0 ,8 8 6

2 2 ,2 2 2 ,5 2 0,41 2,11 0 ,9 5 23 0 ,9 0 - 0 ,0 4 6 - 0 ,3 8 7
3 2^22 3 ,9 3 1,01 2 92 1,31 13 1,89 0 ,2 7 6 0 ,0 0 4
4 2 ,2 2 4 ,9 2 1,70 X22 1,45 12 2 ,6 3 0 ,4 2 0 0 ,0 7 9
.5 2^2 5 ,4 7 1,59 3 ,8 8 1,74 11 6 ,6 9 0 ,8 2 5 0 ,2 0 1
6 2 ,2 2 6 .2 9 2 ,5 5 3 ,7 4 1,68 6 ,2 5 ,2 5 0 ,7 2 0 0 ,4 0 6
7 2,2 2 8,2 5 4 ,3 7 3 ,8 8 1,74 3,9 6 ,6 9 0 ,8 2 5 0 ,6 4 0
8 222 11,69 7 ,5 2 4 ,1 7 1,87 2.4 14,3 1,155 0 ,8 7 6

A nticuerpo an a liz ad o : IgG 2 a n ti-D N P p re cip ita n te d e oveja.

H apteno: ^H D N P^G A B A = 17.500).
L as m olaridades d e h ap te n o en los tubo,‘; de re acc ió n fueron c a lc u la d o s por co n v e rsió n d e c.p.m . en JM, co n o c ien d o la re la ció n M /c.p .m . d el
h ap te n o añadido.
1 (56 Aspectos básicos de la inmunidad
por otros procedimientos específicos. Cuando
la curva experimental intercepta a I/b, el valor
de la ordenada al origen corresponde a la inver­
sa de la concentración de anticuerpo total [1/
Act, ecuación (11)]. Para determinar esa con­
centración hay que tener en cuenta que los va­
lores de la gráfica para 1/b corresponden a li­
gando monovalente (moles.litro '), y que por lo
tanto debe considerarse la concentración de an­
ticuerpo expresada en sitios de combinación,
cuyo PM es de 75 kD (si el anticuerpo es IgG).
Para el caso de la figura 8-1, la curva intercepta
a 1/b en el valor 8,4 x 10'' M ', cuya inversa
equivale a la concentración de sitios de combi­
nación del anticuerpo, igual a 0,19 x 10 ' M. Si
se considera para cada sitio de combinación un
PM de 80 kD (IgGl de oveja, PM = 160 kD),
la concentración de anticuerpo en la m ezcla
analizada será de 0,95 mg.mk'.
Cuando la concentración de anticuerpo es
conocida, no así su valencia, K q puede ser de­
terminado graficando r/c versus r (fig. 8-2A),
recordando que para el valor r = 1 (mitad de los
sitios de combinación de un anticuerpo biva­
lente ocupados por el hapteno), r/c = 7/c, que
por definición es igual a K q. Levantando una
perpendicular a r en el punto equivalente a la
mitad de la saturación (en este caso r/2 = 1), el
valor de r/c correspondiente a la intersección
de dicha recta con la curva graficada con los
valores experimentales será i/c == Kq.
Cuando el valor de r/2 es diferente de 1, para
obtener el valor de K q el resultado experimen­
tal hay que dividirlo por r/2. Si la curva hubie­
se interceptado a r = 2,4, el valor de r/2 sería
1,2. Si para ese valor el resultado experimental
fuera r/c = 8 x 10'' M '’, para transformarlo en
]/c es necesario dividirlo por 1,2. En este caso,
Ko = 1/c - 8/1,2 X 105 = 6,6 x 10= M >.
Por este procedimiento es posible, además,
calculíu' « (valencia o número máximo de mo­
léculas de ligando monovalente que se fijan por
molécula de anticuerpo), ya que en el punto en
que la proyección de la curva experimental in­
tercepta a r corresponde al valor r/c - O y r -
oo, o sea aquel en que el anticuerpo está total­
mente saturado por el ligando. Que r = n s t de­
duce de la ecuación:
cuando
luego r K = n K y por lo tanto r n específico (en este caso ÍgM monomérica mar­
Esta graficación perm ite tam bién calcular
Kav o “constante de afinidad media pesada o
ponderada”, que corresponde al promedio de
las afinidades pesada o ponderada por la. con­
centración de los anticuerpos con cada afini­
dad. La pendiente de la recta que une los pun­
tos en que la curva intercepta a r/c y r constitu­
ye Kav, y experimentalmente se calcula deter­
minando el cociente entre esos dos valores de
r/c y r.
Si Kq se calcula graficando log r/n-r versus
log c (fig. 8-2B), para lo cual es necesario co­
nocer previamente la valencia y concentración
del anticuerpo en análisis, cuando r/2 = 1 (mi­
tad de los sitios de combinación saturados), log
r/n-r = 0. Trazando una perpendicular a log r/
n-r en el valor O, dicha recta cortará a la traza­
da con los valores experimentales, lo que per­
mitirá determinar el log c en ese punto. Con
ese dato se calcula c, y 1/c = K(>.
La graficación de Sips (fig. 8-2B) permite
además calcular a o índice de heterogeneidad
de los anticuerpos. Dado que éste no es más
que el valor de la pendiente de la recta grafica­
da, puede hallarse determinando
A y
----- = a
AX
El valor a puede también calcularse a partir
de la ecuación (16) o de la siguiente:
(27)
Act K“c» Act
deducida a partir de la (7’), pero adaptada para
un sistema policlonal, elevando K y c a la po­
tencia a, y con la nomenclatura utilizada en la
ecuación (11)
Los estudios de interacción primaria ligante-
ligando pueden servir también para determinar
el número de receptores y determinantes anti­
génicos existentes en una membrana celular,
así como su constante de afinidad. En estos ca­
sos, la graficación que mejor resulta es l/b ver­
sus 1/c (fig. 8-1), derivada de la ecuación de
Langmuir adaptada (11).
1 1 1
L.K.c. L
donde L es el ligante, b y c las concentraciones
de ligando combinado y libre, respectivamente.
Si se quiere determinar, por ejemplo, el nú­
mero de receptores para Fe en la superficie de
un eritrocito, es necesario hacer interaccionar
cantidades iguales de una suspensión de un nú­
mero conocido de células ■mh* con el ligando
cada con = “ ‘^^'LIgM.7S”) a concentracio­
nes variables. Transcurrido el tiempo suficiente
para que la reacción se equilibre se centrifugan
los tubos y se determina la radiactividad del so­
 Reacción antígeno-anticuerpo in vitro 167

brenadante (ligando libre = c) y del sedimento l

(ligando combinado = b), las que se transfor­ So =■ -t- B (30)
man en molaridades conociendo previamente la F Ka
relación c.p.m./concentración molar del ligan­ La “capacidad fijadora de antígeno” ,
do usado. Con los resultados obtenidos se gra­
1
fica 1/b versus 1/c y la curva obtenida, lineari- ABC = ------------ B (31)
zada por análisis regresivo o por el método de
dil. suero
los cuadrados mínimos, es extrapolada hasta
interceptar 1/b. Este valor corresponde a la in­ ABC puede expresarse también en términos
versa de ligando combinado ('^'I.ÍgM.7S, PM = de sitios de fijación:
180 kD ), que satu ra to talm en te al lig an te
So (no diluido)
(FcR), y con los datos obtenidos se calcula la ABC = -------- ------------- B (32)
concentración molar del ligando y el número So
de moles en el volumen usado. Asumiendo que
a cada FcR se une una molécula de ‘^‘LIgM.7S, donde So (no diluido) es la concentración total
multiplicando los moles fijados por 6,02 x 10^^ de sitios de combinación en el suero sin diluir y
(número de Avogadro) se obtiene el número de So la concentración total de sitios de combina­
moléculas fijadas por la totalidad de las células ción en la dilución del suero en la que B sitios
reaccionantes cuando el ligante está saturado, están combinados; es decir.
valor que equivale al número total de FcR exis­
So (no diluido) 1
tentes. Dividiendo ese valor por el número de
eritrocitos usados en el ensayo se obtiene el nú­ So dil. suero
mero de FcR por célula.
Por este procedim iento hemos podido de­ Se ha observado que la ABC de u n suero,
mostrar que la densidad de receptores hemáti­ medida a diferentes concentraciones de ligando
cos para Fe por célula es 1,2 x 10^ en los eritro­ total, está relacionada con la avidez de los anti­
citos de carnero y 1,2 x 10^’ en los de pollo. cuerpos contenidos en ese suero. Para deducir
Los valores de la constante de afinidad entre una expresión que describa esa relación, se ha
ligante y ligando se calculan en la forma ya in­ definido un nuevo término;
dicada (fig. 8-1).
ABCx
R = (33)
Capacidad fija d o ra de antígeno
En 1975, W. E. Paul y G. J, Elfenbein des­ en la que ABCi es la capacidad de fijación de
cribieron un método que permite calcular afini­ antígeno con una concentración total de ligan­
dades relativas, utilizando la técnica de Farr de do referida com o concentración ín d ice (i) y
precipitación con sulfato de amonio. En los en­ ABCx es la capacidad de fijación de antígeno
sayos tipo Farr, los resultados generalm ente con una concentración de ligando diferente, ge­
son expresados en términos de “capacidad fija­ neralmente menor, llamada concentración en
dora de antígeno” o ABC {antigen binding ca~ análisis o experimental (x).
pacity). Sustituyendo en la ecuación (33) los equiva­
Cuando un hapteno H interacciona con un lentes de la (32), resulta;
anticuerpo que tiene S sitios de combinación
con el ligando y el sistema se equilibra. So (no diluido)
-----^-------------- B (x)
jHS] So (x) So(i) B(x)
(28) R = .---------------------------- = --------------- (34)
[H] [S] So (no diluido) Soíx) B(i)
Si sustituimos [HS] por B (ligando unido o
bound y [H] por F (ligando libre o fre e ), la
ecuación (28) puede escribirse Usando ia expresión (30), la ecuación (34) pue­
de escribirse;
B 1
Ka (29) [(B/F)i (1/Ka) 4- Bi] Bx
F So - B R = ^--------- ^------------- (35)
[B/F)x (1/Ka) + Bx] Bi
La concentración de [SJ libres es igual a la
concentración total de So menos la concentra­ de donde
ción de sitios combinados B, luego [S] = So - B. (B/F) X Bi - (B/F)i Bx
La ecuación (29) puede reordenarse para re­ Ka = --------- ^ ^ ------(36)
solver So (l-R )B i Bx
168 Aspectos básicos de la inmunidad

La expresión (36) permite calcular Ka sin re­ APENDICE

querir el valor de la concentración de los sitios
totales (So).
Para estas determinaciones de afinidades re­
lativas, es conveniente comparar sólo ABC ob­
tenidos cuando el 33% del ligando está unido
(ABC33), en cuyo caso B/F 0,5. En estas con­
diciones, la ecuación (36) se simplifica:
R B i-B x
Ka =
2(1 -R ) Bi Bx
Es conveniente señalar que Ka (37) corres­
ponde a la afinidad relativa Kr o Ka 33%, lo
que no significa Ko o constante de asociación
intrínseca mediana.
Cuando para estudios de interacción prima­
ria se grafican resultados, en especial ///? ver­
sus 7/ t', muchas veces resulta difícil trazar la
línea que une esos puntos experimentales. Co­
mo la ecuación matemática que representa a di­
cha curva es y = a + bx, puede lograrse el traza­
do de una línea corregida mediante la aplica­
ción de análisis regresivo, o bien, por el méto­
(37)
do de los cuadrados mínimos.
Tomemos como ejemplo el cuadro 8-2 y la
curva resultante de la graficación de dichos da­
tos experimentales (fig. 8-2). En ella x = 1/c, y
= I/b, siendo N = número de determinaciones.
Para dichos datos experimentales

Parte experimental: S X = 2,67 Zy = 304

E x2 = 1,4867 Sy^ = 17.384
10 jj,l de ligando específico radioisotópiea- x = 0,38 y = 43,39
mente marcado, a concentraciones 10 M (con­ (Ex)2 = 7,13 (Ey)2 = 92,416
centración índice) y 10 ’ M o 10 M (concen­
tración experimental) se mezclan con 10 |u,l de Exy =159
diluciones seriadas del antisuero. Las mezclas N=7
se dejan 30-60 minutos a 4°C y se les añade a
cada una de ellas 20 [xl de solución saturada de Conociendo las varianeias (S^) de x e y, y la co­
sulfato de amonio. Se incuba 30 minutos a 4“C, variancia, esos datos pueden ser computados y
se centrifuga a 2.500 r.p.m. por 30 minutos a la usados luego para la elaboración de la recta.
misma temperatura. En 20 jul de los sobrena­
dantes (si el radioisótopo em ite radiaciones / (2 x)2 \
gamm a) o en las m ism as cantidades p revia­ S2(x) = ■ (z x = - - - ) = 0 .0 *
mente mezcladas con 6 ml de Aquasol (si el ra­ N -l
dioisótopo emite radiaciones beta) se mide la
radiactividad, utilizando en cada caso el conta­ 1 / (Z y f \
dor de radiaciones correspondiente. S 2 ( y ) = ------ / X y 2 ---- ^ \ = 705
Se incluye una serie testigo en la que el anti­ N-l
suero es sustituido por suero normal de la mis­
ma especie. 1
El porcentaje de ligando unido se define co­ Covariancia (xy) =
mo: N -l

< radiactividad del sobrenadante ' g X )(£ y)

en presencia de antisuero
100- 100 N
radiactividad del sobrenadante
\ en presencia de suero norm al ,
El coeficiente de correlación r =

La dilución de anticuerpo requerida para tal covariancia (xy)

unión (ABC33) se determina experimental mente = 0,97
graficando “porcentaje de ligando fijado” con­ ~ 1 s (X ) S (yT
tra “logaritmo de la dilución del suero” . Ello
permite determinar Siendo S (x) = (x) y S (y) = (y )

El resultado obtenido es un buen valor para

B
dil. una correlación ya que r está matemáticamente
restringido a estar situado dentro del rango -1 a
y con los resultados obtenidos calcular R de -1-1. La ecuación de la línea regresiva de la figu­
acuerdo con la ecuación (33) y Ka mediante la ra 8-1 es
ecuación (37). y = a + bx
 Reacción antígeno-anticuerpo in vitro
covariancia (xy)
b = ---------------- ^ =91,3
(X )
siendo:
a = y - bx = 8,7
por lo tanto, la ecuación que m ejor une los
.puntos experimentales de la figura 8 -1 es
y = 8,7 + 91,3 X identificación de microorganismos en m ateria­
Para dos diferentes valores de ;c, dentro de la
escala de la gráfica, se obtienen otros tantos va­
lores de y, con los que puede trazarse la recta
deseada. Ello puede lograrse también calculan­
do un solo valor de 3; para determinado valor de
X ya que el otro punto de la recta sería a pues
ésta es la ordenada al origen. La recta que une
los puntos experimentales de la figura 8 - 1 lia
sido trazada con los valores antes indicados.
Otro método que puede usarse para hallar los
valores de a y ¿> en la ecuación (28) es el de los
cuadrados mínimos. En este caso se determinan
de la siguiente manera:
Z x^ • Ey ^ Lx • i: xy
N Í x 2 ^ (X x y
N 2 : xy - E X • E y
b =
N E x2 - (E X) 2
ALGUNAS R EA C C IO N ES
DE INTERACCIÓN PRIMARIA
USADAS PARA LA D ET E C C IÓ N DE
ANTÍGENOS Y ANTICUERPOS
En los últimos 25 años se han descrito una
serie de métodos de interacción primaria para
la detección de antígenos y anticuerpos, de
gran sensibilidad y marcada especificidad, en­
tre los que merecen destacarse el radioinm u­
noanálisis, el enzimoinmunoanálisis, la inm u­
nofluorescencia y, muy recientemente, el inm u­
noanálisis por quimioluminiscencia. Por regla
general se designan con siglas: RIA (radioin-
munoanális; IRMA (análisis radioinm unom é­
trico); ELISA (análisis con reactivo inm une
marcado con enzima); IF (inmunofluorescencia
directa); IFI (inm unofluorescencia indirecta).
Algunas de estas técnicas han sido modificadas
y no obstante constituir simples variantes de
ellas, se han usado siglas para su identificación,
las que muchas veces se prestan a confusiones.
Todas ellas se caracterizan porque la identi­
ficación del antígeno o del anticuerpo tiene lu­
gar por una interacción simple, sin la participa­
ción de fenómenos asociados, como ocurre en
las reacciones de interacción secundaria.
169
INMUNOFLUORESCENCIA (IF)
Los métodos serológicos comunes resultan
inapropiados para investigar la presencia de an­
tígenos en la superficie de células, bacterias y
parásitos, así como su distribución, o cuáles
son las células comprometidas en la biosíntesis
de los anticuerpos.
Para estas investigaciones, así como para la
les infectados y algunas reacciones antígeno-
anticuerpo desarrolladas con cantidades m íni­
mas de reactivos, ha sido descrito un m étodo
de alta sensibilidad y que ha permitido resolver
problem as insolubles hasta el momento. L la­
mado inmunofluorescencia, se basa en el em ­
pleo de anticuerpos marcados con sustancias
fluorescentes como el isotioeianato de fluores­
ceína o lisamina-rodamina. Estas sustancias, al
ser excitadas eon longitudes de onda del rango
ultravioleta, emiten luz de mayor longitud, la
que se demuestra por fluorescencia am arillo-
verdosa o anaranjadorrojiza, respectivamente.
La inmunofluorescencia puede ser directa o
indirecta. En el primer caso lo que se m arca es
el anticuerpo que habrá de interaccionar direc­
tamente con el antígeno. En la forma indirecta
se emplea como reactivo marcado un suero an-
ügam m aglobulina (contra la gam m aglobulina
de la especie animal de la que proviene el anti­
cuerpo). Se lo hace actuar sobre el com plejo
antígeno-anticuerpo no marcado que ha reac­
cionado en una primera etapa.
La metodología consiste en colocar sobre un
portaobjetos el material que contiene el antíge­
no para analizar. En la técnica directa, éste se
cubre con el antisuero marcado con fluoresceí-
na y, después de lavado para eliminar el m ate­
rial fluorescente no fijado específicamente, se
hace la observación microscópica, utilizando
una fuente de luz ultravioleta y los filtros ade­
cuados. Cuando se emplea la técnica indirecta,
lo que se añade al portaobjetos que contiene el
m aterial antigénico es el antisuero específico
sin marca. Luego de cierto tiempo de contacto
el preparado se lava, se cubre con suero anti­
gammaglobulina marcada, se deja reaccionar y
se lava nuevamente. Se observa con el m icros­
copio en la forma ya descrita. En el prim er ca­
so, si el antígeno ha fijado el anticuerpo con
marca, el complejo emite fluorescencia. En el
segundo caso, el antígeno fija el anticuerpo sin
marcar, pero sobre éste se acopla la antigam ­
maglobulina marcada, que es la que emite fluo­
rescencia (figs. 8-7 y 8 - 8 ).
C om o en toda reacción inm unológica, son
necesarios controles adecuados. El tratamiento
previo del material antigénico con antisuero es­
pecífico sin marcar debe inhibir la fijación del
mismo anticuerpo con marca y, por otra parte.
170 Aspectos básicos de la inm unidad
Anticuerpo Antígeno
marcado sin marca
I: Esquema de reacción de inmunofluorescencia directa
Primera etapa
¥ .
Anticuerpo Antígeno
sin marca sin marca
Segunda etapa
^\U/, si/-
-4;
~Vs'*
Complejo Ag-Ac Anticuerpo marcado
sin marca (antigammaglobulina)
II; Esquema de reacción de inmunofluorescencia indirecta
la adición de antígeno soluble en exceso al an­
ticuerpo marcado debe inhibir su fijación pos­
terior al antígeno fijado al portaobjetos.
Se obtiene un buen reactivo cuando el anti­
cuerpo ha fijado dos o tres grupos fluorescentes
por molécula. Si está muy marcado puede teñir
inespecíficamente tejidos. Para reducir al míni­
mo este inconveniente, y con el objeto de eli­
minar la mayor parte de la proteína muy mar­
cada, es necesario filtrar por Sephadex G-25,
resinas intercam biadoras o adsorber el suero
con polvo de tejidos, en especial hígado de ra­
tón desecado con acetona. Si el suero tiene un
alto título de anticuerpos (3-5 mg/ml), la dilu­
ción para su uso minimiza las tinciones inespe­
cíficas.
La inmunofluorescencia ha sido muy utiliza­
da, sobre todo para la investigación rápida y es­
pecífica de agentes infectivos en m ateriales
sospechosos. Empleando anticuerpos con mar­
cas diferentes, ha sido posible investigar más
de un antígeno en un mismo preparado micros­
Fig. 8-7. In m u n o flu o re s c e n c ia
d irecta e i,udicecta.
Complejo
Ag-Ac marcado
♦
Complejo Ag-Ac
sin marca
'/ a''
Complejo Ag-Ac
marcado
cópico. E sta m etodología es la que proveyó
una de las evidencias de que las células plas­
máticas son las principales elaboradoras de los
anticuerpos, y que en los linfocitos B existen
inmunoglobulinas de superficie.
De las técnicas descritas, la directa tiene el
inconveniente de que debe disponerse de anti­
cuerpo m arcado con especificidad para cada
antígeno. La indirecta, en cambio, solamente
utiliza antigammaglobulina marcada con fluo­
rocromo.
Para detalles metodológicos véase el capítu­
lo 34.
RADIOINMUNOANÁLISIS (RIA)
Y A N Á LISIS RADIOINMUNOMETRICO
(IRMA)
La cuantificación de pequeñas cantidades de
antígenos, no detectables por los métodos con­
vencionales, puede lograrse sin inconvenientes
 Reacción antígeno-anticuerpo in vitro
B’ig. 8-8. Epim astigotes de T ripanosom a cruzi,
visualizados por inm unofluorescencia indirecta.
si están marcados con átomos radiactivos. M e­
diante su em pleo ha sido desarrollado el ra­
dioinmunoanálisis, método sensible y específi­
co, muy utilizado sobre todo en endocrinología
para Ja cuantificación de hormonas peptídicas.
Se ha usado también con éxito en estudios de
interacción hapteno-anticuerpo y en el análisis
de hormonas esteroides.
El hecho más significativo del radioinm u­
noanálisis es el de que utiliza una marcación
radioisotópica para discriminar entre antígeno
unido al anticuerpo y antígeno libre. El radioi­
sótopo es un átomo inestable que se va desinte­
grando y em ite partícu la s subatóm icas y/o
energía en la forma de radiación, que pueden
ser medidas en aparatos apropiados. Cada isó­
topo radiactivo tiene una vida media (t 1/2) es­
pecífica, factor limitante para su uso en algu­
nos casos. Los átomos radiactivos más utiliza­
dos con 3H (t 1 /2 = 1 2 años), '^'C (t 1/2 = 5.730
años), 57Co (t 1/2 = 270 días), (t 1/2 = 60
días), (t 1/2 = 8 días); la energía emitida es­
tá constituida por radiaciones P en los dos pri­
meros y Y en los restantes.
El marcado de los antígenos con radioisóto­
pos puede hacerse por diferentes métodos.
171
Para la separación del antígeno libre y com­
binado, valores que se usarán para las grafica-
ciones, pueden emplearse métodos fisicoquími­
cos como la electroforesis, adsorciones croma-
tográficas, resinas intercarabiadoras, filtración
por geles, precipitación salina o con polietilen­
glicol, etc., o métodos inmunológicos mediante
el em pleo de un anticuerpo con especificidad
para la especie animal del anticuerpo q u e en
prim era instancia reaccionó con el antígeno
(método del doble anticuerpo).
Uno de los radioinmunoanálisis más utiliza­
dos es el de competición que se basa en el si­
guiente principio; si a una serie de tubos que
contienen una mezcla de anticuerpo y antígeno
radiactivo en cantidad suficiente para saturar el
50% de los sitios de combinación, se le añade
cantidades crecientes de antígeno sin m arca,
habrá competición por la ocupación de esos si­
tios. Se producirá una caída secuencial del antí­
geno marcado combinado a lo largo de la serie.
Con los datos obtenidos puede graficarse antí­
geno marcado combinado (escala lineal) versus
antígeno sin marcado añadido (escala lo garít­
mica). Dentro de cierto rango, la curva regresi­
va es lineal, lo que permite por interpolación de
172 Aspectos básicos de la Inmunidad
los resultados obtenidos en un ensayo similar
con un antígeno sin marca, de concentración
desconocida, hacer su cuantificación.
El análisis radioinm unométrico (IRMA), o
inmunoanálisis utihzando anticuerpo marcado
con un átomo radiactivo, es cada vez más utili­
zado y con frecuencia es más sensible y especí­
fico que el RIA. El fundamento es similar al
del RIA, pero invariablemente usa una técnica
. de separación en fase sóhda del anticuerpo li­
bre, para discriminar entre éste y el anticuerpo
unido al ligando. En este ensayo, la cantidad de
antígeno es medida en función de la cantidad
de anticuerpo marcado que se ha unido. Para
más detalles sobre el tema véase el capítulo 38.
ENZIMOINMUNOANÁLISIS
(ELISA)
La histoquím ica ha provisto los principios
que han servido de base para el desarrollo de
una nueva metodología inmunológica, la inmu­
noenzimología, que en forma directa o indirec­
ta permite identificar antígenos. Los fundamen­
tos son similares a los de la inmunofluorescen­
cia, de la que se diferencia en que emplea anti­
cuerpos (método directo) o antigammaglobuli­
na (método indirecto) marcados con una enzi­
ma capaz de desarrollar una reacción colorea­
da. La enzima usada con más frecuencia para el
marcado es la peroxidasa y el sustrato la o-fe-
nilendiamina y H , 0 2 .
A provechando la propiedad que tienen las
proteínas de adsorberse a pH 9-10 a tubos, es­
feras, discos o concavidades en placas de plás­
tico (poiiestireno y polipropileno), se han desa­
rrollado métodos de ELISA que perm iten la
cuantificación de pequeñas cantidades de antí­
genos, con una sensibilidad próxim a a la del
RIA, y tiene la ventaja de no tener que usar
m aterial radiactivo ni aparatos especiales de
medición de radiactividad.
El m étodo puede desarro llarse fijando al
plástico cantidades limitantes de anticuerpo, el
cual se hace interaccionar con diferentes con­
centraciones del antígeno que se ha de valorar
y la cantidad adecuada del m ism o antígeno
marcado con la enzima. La fijación de ésta es­
tará en proporción inversa a la del antígeno no
marcado. Existiendo una fase sólida que retiene
al antígeno combinado, la discriminación entre
éste y el antígeno libre, será fácil, datos funda­
mentales para la graficación y cuantificación.
El ELISA puede hacerse también con anti­
cuerpo al que se ha fijado la enzim a o anti­
gammaglobulina (segundo anticuerpo) marca­
da. En el primer caso, a cantidades variables
de antígeno fijadas al plástico se le añaden
concentraciones constantes de anticuerpo enzi­
ma marcado. Por lavado se elimina el anticuer­
po que no se fijó, y el anticuerpo fijado se de­
tecta añadiendo el sustrato correspondiente,
que desarrollará color en forma proporcional a
la de anticuerpo presente. Como en la inmuno-
fluorescencia indirecta, el ELISA puede desa­
rrollarse usando antigammaglobulina contra la
especie animal a la que pertenece el anticuerpo
usado en la primera etapa, hecho que lo hace
más general y evita el uso del antisuero especí­
fico marcado para cada una de las oportunida­
des. En este caso se fijan al plástico diferentes
c o n cen tracio n es de antígeno que se hacen
reaccionar con anticuerpo específico sin m ar­
ca. D espués de lavar se añade la correspon­
diente antigammaglobulina marcada con la en­
zima, y transcurrido el tiempo conveniente y
luego de lavar se adiciona el sustrato adecuado
para el desarrollo de color y lectura de los re­
sultados.
Para detalles técnicos véase el capítulo 37.
INMUNOANÁLISIS CON REACTIVOS
M ARCADOS CON SUSTANCIAS
LUMINISCENTES
La luminiscencia es un fenómeno similar al
de la fluorescencia. La diferencia radica en que
en la fluorescencia la energía excitante es luz
ultravioleta, mientras que en la luminiscencia
es provista por una reacción química.
Existen dos tipos de luminiscencia. La “bio-
luminiscencia” es una reacción en la que parti­
cipa un organismo viviente, tanto del reino ani­
mal como vegetal. Lo hacen a través de un sis­
tema enzimático, el de la luciferasa. Algunas
luciferasas son específicas para el ATP, casi
siempre con producción de un fotón por cada
molécula de ÁTP que reacciona. Otras lucifera­
sas, especialmente las de origen bacteriano, son
menos eficientes y tienen especificidad para
NADH o NADPH. La reacción de “quimiolu-
miniscencia” produce luz a partir de reacciones
químicas simples, que involucran la acción del
oxígeno o de peróxidos en la oxidación de sus­
tratos orgánicos. Como consecuencia de la ex­
citación, algunas moléculas del sustrato lumi­
n iscente em iten fotones m ientras que otras
emiten calor. Los sistemas más eficientes son
aquellos en los que la emisión de fotones es
máxima. En los sistemas bioluminiscentes, esa
eficiencia puede variar entre un 10% y un 90%,
m ientras que en los quim iolum iniscentes los
valores oscilan en alrededor del 1%.
Recientemente se han desarrollado métodos
de inmunoanáhsis que utilizan este principio,
especialmente la quimioluminisceneia por ser
de menor costo, no obstante la mayor eficien­
cia de los sistemas bioluminiscentes.
 Reacción antígeno-anticuerpo in vitro 173

«y

Biotina
Ac

F ig . 8-9. Inm unoanálisis po r form ación de com plejos avidina-biotina.

Una de las reacciones de quimioluminiscen- heminas como catalizadores. La reacción pue­

cia más estudiada es la producción de luz por el de ser catalizada también por peroxidasa a pH
lum inol en presencia de peróxidos, reacción neutro.
que requiere pH alcalino y algunos metales o La luz producida puede ser medida y su in­
174 Aspectos básicos de la inmunidad
tensidad depende de la cantidad de sustancia
lum iniscente presente. Si el lum inol u otras
sustancias quimioluminiscentes como el isolu-
minol, pirogalol, derivados del luminol y éste-
res ele acridinio, entre otras, son unidas cova­
NH
+ 2 H ,0 , + OH---------—
^ ^ catalizador
ilH
NH.,
‘ O
Luminol
FORMACION DE COMPLEJOS
AVID IN A-BIOTIN A
La avidina es una glucoproteína que fija la
biotina con una unión de muy alta afinidad (K^
= 10^-“^ M). Ambos reactivos pueden ser fijados
en forma covalente a anticuerpos, antígenos,
enzimas, sustancias fluorescentes, células, etc.,
productos que pueden obtenerse en el com er­
cio. Esto ha hecho que la formación del com­
plejo avidina-biotina sea usado con buenos re­
sultados en estudios de interacciones anticuer­
po-ligando, facilitando el desarrollo de enzi­
moinmunoanálisis, radioinm unoanálisis, estu­
dio de interacciones antígeno-anticuerpo a n i­
vel celular, etcétera.
La biotina es un factor soluble del complejo
vitamínico B y actúa como coenzima de enzi­
mas involucradas en mecanismos de carboxila-
ción. Se puede copular fácilmente a anticuer­
pos o enzimas sin pérdida de su actívidad. Esta
unión, de tipo covalente, se produce entre el
grupo carboxilo de la biotina -p rev ia activa­
ción- y los grupos amino libres de las proteí­
nas.
La avidina, compuesto proteico de la clara
de huevo, es muy estable y presenta varios si­
tios de unión por lo que puede actuar como
puente entre dos moléculas biotiniladas o unir­
se covalentemente a enzimas formando un con­
jugado capaz de reaccionar con anticuerpos o
antígenos biotinilados.
Los enzimoinmunoanálisis que aprovechan
la formación del complejo avidina-biotina ge­
neralmente se desarrollan fijando el anticuerpo
específico sin marca a una fase sólida. Después
de interaccionar con su correspondiente antíge­
no el complejo se lava y se le añade el mismo
anticuerpo al que previamente se le ha fijado
lentem ente a antígenos o anticuerpos, estos
productos pueden ser usados para inmunoanáli­
sis de quimioluminiscencia.
La reacción de quimioluminiscencia del lu­
minol es la siguiente;
O
II
C — O-
- Luz
X máx. 430 nm)
C — O'
NH,
a-aminoftaiato
+ N ,+ 3H ,0
biotina covalentemente. Después de producida
la reacción se lava y se añade avidina marcada
con peroxidasa, y luego se continúa la reacción
añadiendo el sustrato correspondiente, como se
indicó en enzim oinm unoanálisis (fig. 8-9A).
También ha dado muy buenos resultados para
la identificación de anticuerpos monoclonales
(de origen murino). En este caso, al antígeno
fijado a una fase sólida se le añade el material
que contiene los anticuerpos monoclonales que
se han de valorar. Los complejos formádos se
hacen interaccionar luego con suero antiinmu-
noglobulina de ratón, obtenido de otra especie
animal, al que previamente se le fijó biotina.
Después de lavar se añade avidina marcada con
peroxidasa y luego se desarrolla la reacción co­
loreada mediante el añadido del sustrato co­
rrespondiente (O-fenilendiamina y H^O,) (fig.
8-9B),
Han sido descritas diferentes variantes de los
dos mecanismos generales señalados.
B IB L IO G R A F ÍA
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Reac^íión antígeno-anticuerpo in vitro
Interacción secundaria
■RICAF^DO MARGNI
Dada Ja especificidad de la reacción antíge-
’no-anticuerpo, ésta ha sido utihzada con m ag­
níficos resultados en "a diferenciación e identi­
ficación de microor£ mismos, hematíes, antíge­
nos solubles, así como en la investigación y
cuantificación de anticuerpos séricos, sobre to­
do con fines de diagnóstico. En este sentido
han sido muy útiles las diferentes metodologías
aportadas por la serología.
En un principio se creyó que los diferentes
fenómenos visuaiizables de las reacciones antí-
geno-anticuerpo, como ya se señaló al comien­
zo del capítulo 5, dependían exclusivamente de
las características propias y particulares de és­
tos. Hoy se sabe que en ello participan distintos
factores.
En la interacción in vitro de un antígeno
con su correspondiente anticuerpo se distin­
guen dos etapas, la reacción prim aría no vi-
sualizable y la reacción secundaria, que sigue
a !a anterior y se caracteriza por la aparición
de un fenómeno visible como la aglutinación,
la precipitación, etc. Cuando la reacción ocu­
rre in vivo, como consecuencia de esta inte­
racción pueden aparecer fenóm enos b iológi­
cos colaterales como la necrosis en la reacción
de Arthus; los fenómenos vasógenos y de con-
íractura de la musculatura lisa en la anafilaxia
como resultado de la liberación de histam ina y
otros mediadores quím icos, etc. Estas m ani­
festaciones se consideran com o reacciones
terciarias.
Los mecanismos que regulan la reacción pri­
maria ya han sido expuestos en el capítulo 8.
Los complejos iniciales que se forman rápi­
damente y sobre los que, dentro de ciertos lími­
tes, las variaciones de temperatura y concentra­
ción salina tienen poca influencia, se agregan
luego para dar diferentes fenóm enos visibles
9
cuyas características dependen en gran parte
del estado físico del antígeno. Esta etapa se
acelera con la tem peratura, la agitación y es
electrólito-dependiente.
Es importante separar las etapas de la reac ­
ción antígeno-anticuerpo. Puede ocurrir que se
demuestre la presencia de anticuerpo por inte­
racción primaria, pero que éste no sea detecta-
ble por interacción secundaria o terciaria. Esto
puede ser consecuencia de variaciones cuanti­
tativas, ya que para conseguir fenómenos visi­
bles son indispensables deternrinadas concen­
traciones de anticuerpo, y cualitativas inheren­
tes a las propiedades de la clase de inmunoglo­
bulina comprometida en la respuesta inmune,
así como de las características del ligando. Si
bien es posible detectar un anticuerpo mediante
estudios de interacción primaria, como ya se ha
visto, ello no significa cjue siempre deban ocu­
rrir reacciones secundarias o tei'ciarias.
Las diferentes m anifestaciones de tipo se
eundario serán estudiadas en sus pormenores,
en tanto que las terciarias podrán ser halladas
en los distintos capítulos, en especial en el refe­
rente a m anifestaciones de hipersensibilidad.
Las metodologías utilizadas para el desarrollo
de las diferentes reacciones secundarias figuran
en el capítulo 35.
P K E C IP IT A C IÓ N
Cuando un anticuerpo, excepción hecha de
los bloqueantes y no precipitantes, es puesto en
contacto con una solución de la macromolécula
que lo originó, se form an com plejos Ac-Ag
que se insolubilizan luego en su mayor part:
dando una reacción de precipitación, que p u e­
de ser total o zonal (fig. 9-1).
 Reacción antígeno-anticuerpo in vitro
Como expresáramos al comienzo del libro,
ésta es una propiedad de la mayor parte de los
anticuerpos y no una característica particular de
un determinado tipo al que originalmente se lo
llamó anticuerpo precipitante.
Precipitación en medios líquidos
Precipitación cualitativa
E^sta reacción se produce en dos etapas. En la
inicial, que se desarrolla rápidamente y es in­
fluida muy poco por la temperatura y los elec­
trólitos, se forman los complejos Ac-Ag prima­
rios. A medida que el tiempo transcurre, .esos
complejos iniciales se agregan, originando mi-
celas de diferentes tamaños, las que finalmente
precipitan. Algunos complejos no alcanzan a
hacerlo y quedan en solución. La velocidad de
sedimentación es proporcional a V-((p-(po) g,
siendo V el volumen de la partícula, (p y cpo las
densidades de las partículas y el solvente, res­
pectivamente, y g, el campo gravitacional.
La'tem peratura acelera esta segunda etapa,
siendo además electrólito-dependiente. Cloruro
. sódico al 0,85% (0,15 M) es la concentración
óptima en la mayor parte de los casos, excep­
ción hecha de los anticuerpos de origen aviario,
en que se eleva al 8%. Es rnucho más lenta que
la inicial, puede durar minutos, e incluso horas,
para que se complete.
La form ación de agregados es una co n se­
cuencia de la bivalencia de los anticuerpos y
multivalencia de los antígenos. Con haptenos
monovalentes o antígenos que poseen un solo
determinante antigénico por molécula, la preci­
pitación no se produce. Experiencias muy inte­
resantes sobre el particular se han realizado con
ribonucleasa pancreática marcada con dinitro­
fenol (D NP-RNAsa) en la que las relaciones
molares eran 1:1. Los sueros de animales in­
munizados por DNP-BSA no precipitan con ri­
bonucleasa monodinitrofenilada, pero sí lo ha­
cen los de animales inm unizados con ribonu­
cleasa.; Ello es consecuencia de la presencia de
uú solo grupo DNP y de varios determinantes
aátigéñjcos específicos para ribonucleasa por
molécula de DNP-ARNsa.
Un hecho muy particular lo constituyen los
anticuerpos m onoclonales, que en su m ayor
parte no muestran actividad precipitante. Ello se
debe a que en muchos de los casos, especial­
mente cuando están dirigidos contra macromo­
léculas en solución, reconocen a un único epito­
pe no repetido, lo que les impide formar agrega­
dos. Con los sueros inmunes obtenidos de ani­
males inoculados con macromoléculas, ¡a preci­
pitación tiene lugar, pues en esos sueros hay
una mezcla de anticuerpos capaces de interac­
cionar con diferentes epitopes del mism.o antí­
177
geno, lo que posibilita la formación de com ple­
jos mixtos Ac-Ag, insolubles (fig. 9 -Ib).
Si se utiliza un antígeno marcado fácil de d e­
mostrar en el precipitado, es posible conocer la
composición de los complejos Ac-Ag que p re­
cipitan, y si se analizan los precipitados que se
forman en una serie de tubos en los que se han
colocado cantidades iguales de anticuerpo y
variables de antígeno, se verá que las relacio­
nes molares Ac/Ag son aproximadamente 1 en
la zona de exceso de antígeno, 4 en la zona de
equivalencia o proporciones óptimas y 7 en la
de exceso de anticuerpo. El peso molecular del
antígeno ejerce marcada influencia en esa rela­
ción. Siendo el peso molecular y la valencia del
anticuerpo constantes, mayor número-de m o lé­
culas de éste podrán interaccionar con moléctl-
las de antígeno grandes que con pequeñas. En
la zona de exceso de anticuerpo la relación es
40 para el sistema tiroglobulina-antitiroglobuli-
na (tiroglobulina PM, 700 kD) y 5 para ovoal­
búmina-antiovoalbúmina (ovoalbúmina PM , 43
!cD). Con otras proteínas de diferentes pesos
m oleculares esas relacio n es varían. P a ra la
gammaglobulina humana (PM, 150 kD) es 7,
para la ribonucleasa pancreática bovina (PM ,
13,6 kD) es 3 y para si virus del mosaico del
tabaco (PM, 40.000 kD) es 650. Estos valores
están influidos por la especie animal de donde
proviene el anticuerpo y su grado de inm uniza­
ción, ello como consecuencia de la calidad de
los anticuerpos elaborados. Es conveniente re­
cordar que, en el curso de una inm unización,
los anticuerpos que aparecen primero son IgM
y luego IgG, si el inmunógeno es T-dependien­
te y no debe olvidarse además la existencia de
anticuerpos no precipitantes capaces de origi­
nar uniones Ac-Ag, pero no de precipitar, por
ser funcionalmente univalentes.
La formación de estos diferentes complejos
ha sido exphcada mediante la llamada teoría
dél enrejado, que considera que la composición
del precipitado formado es una consecuencia
del modo en que anticuerpo y antígeno se han
unido. Dada la bivalencia del anticuerpo y m ul­
tivalencia del antígeno, las posibilidades de
com binación varían según que en la m ezcla
exista exceso de antígeno, exceso de anticuerpo
o equivalencia de ambos (fig. 9-2). Las fórm u­
las de dichos complejos son; Ac^Ag, Ac^Ag pa­
ra la zona de exceso de anticuerpo; ACjAg,
Ac^Ag para la zona de equivalencia; y AcAgj,
Ac^Agj para la zona de exceso de antígeno,
constituyendo complejos solubles, que se for­
man en la zona de marcado exceso de Ag.
Precipitación cuantitativa
Si bien la precipitación en medios líquidos
es muy útil para ia identificación de antígenos
 178 Aspectos básicos de la inmunidad

F ig. 9 - la . P recipitación en m edio líquido. T ubos a y d,

precipitación zonal con form ación de un precipitado anu­
lar. Tubo b, precipitación total con enturbiatniento. Tubo
c, testigo.

A n tígen o

A nticuerpo m on oclon al S u e ro inm une

V Y VV V anti-a anti-a anti-b anti-c

y
V
C om plejo A g-A c C om plejo insoluble
n o precipitable

Fig. 9 - lb . Interacción de un antígeno que presenta m últiples epitopes (a, b, c) no repetidos, con un anticuerpo m onoclo­
nal (anti-a) y con un suero inm une que contiene anticuerpos anti-a, anti-b y anti-c. Sólo el suero inm une puede originar
com plejos A c-A g insolubles.
 Reacción antígeno-anticuerpo in vitro 179

Fig. 9-2. F orm ación de precipita­

Precipitados
dos o com plejos solubles segíin las
concentraciones de antígeno y an­
ticuerpo presentes en la mezcla.

Ac/Ag = 3 Ac/Ag = 2

Complejos solubles formados en exceso de antígeno

O O a-
Ac/Ag = 0,5
= 0 ,6 7

Complejos formados en exceso de anticuerpo

Antígeno

■( ) Anticuerpo

Ac/Ag = 6 Ac/Ag = 5

y anticuerpos, teniendo en cuenta lo expuesto Un hecho que llama la atención, y que pare­
anteriormente, en lo relativo a la formación de cería que está en desacuerdo con lo expresado
los precipitados, ella puede usarse con fines respecto de la formación de. los precipitados, es
cuantitativos y constituye un buen método, para que la cantidad de anticuerpo no aum enta con
la medida de la concentración de los anticuer­ el incremento de antígeno, sino que existe una
pos presentes en un suero. Puede usarse tam ­ zona óptima, llamada zona o punto de equiva­
bién para medir niveles de antígeno. lencia, ubicada entre las zonas de exceso de an­
Si suponemos que se desea valorar un suero ticuerpo y exceso de antígeno, donde la preci­
antineumocócico tipo III y disponemos del po- pitación es máxima. Si se analiza el sobrena­
lisacárido antigénico suficientemente purifica­ dante de ese tubo, recurriendo a métodos sufi-
do, el método que se ha de seguir es el siguien­
te: en una serie de tubos se colocan voliimenes
iguales del suero para valorar y cantidades cre­
cientes del poiisacárido. Después de la incuba­ C u a d ro 9-1. Valoración de anticuerpos anti-
ción, y producida la precipitación, todos los tu­ polisacáridos neumocócico tipo III
bos son centrifugados y los precipitados lava­ A n á lisis
Poiisacárido
dos con solución salina tamponada (NaCl 0,15 neum ocócico Proteína del sobi'en a d a n te
M, fosfato 0,01 M, pH 7,6) para elim inar las Suero tipo III del ppdo^ Exceso E xceso
proteínas séricas no específicas contaminantes. mi Hg/0,5 rnl (Ac) mg de Ag d e Ac
Si por cualquier procedim iento sensible (mi-
1 25 1,61 +
croKjeldahl, Folin-Ciocalteau, espectrofotome- 1 50 3,32 .... +
tría) valoramos la proteína de los precipitados, 1 75 4,15 - -1-

ella corresponderá al anticuerpo, ya que el antí­ 1 100 4,75 - +

geno no tiene carácter proteico (cuadro 9-1 y 1 150 4,96 -

1 200 4,07 -h -
fig. 9-3), Cuando se hacen estas valoraciones 1 300 3,19 + -
es necesario añadir EDTA al suero para evitar 1 400 2.53 + -
la copreeipitación del complemento.
180 Aspectos básicos de la inm unidad

Sobrenadante

|j,g de Ag añadido

Fig. 9-3. Curva de precipitación correspondiente al sistem a polisacárido neum ocócico tipo Ill-antipolisacárido, elaborada
con los datos del cuadro 9-1.

cientemente sensibles, se observa que en él no DNP-SAB (dinitrofenil seroalbúmina bovina),

hay exceso de anticuerpo ni de antígeno. Ello por lectura espectrofotom étrica a 360 nm se
significa que el anticuerpo contenido en ese puede determinar la concentración de antíge­
precipitado corresponde a la totalidad de él, no y a 280 nm su contenido proteico. C ono­
existente en el suero para valorar. ciendo este hecho de antemano es posible, por
Este hecho se explica si se tiene en cuenta simple sustracción, calcular la proteína anti­
que la reacción de precipitación es reversible y cuerpo del precipitado (véanse cuadro 9-2 y
que tiene lugar bajo rigurosas condiciones de fig. 9-4).
equilibrio: En caso de que el antígeno no tuviese marca,
ovoalbúmina por ejemplo, es necesario por el
Ag . Ac análisis de los sobrenadantes frente a antígeno
: + Ac
(precipitado) y frente a anticuerpo, por separado, determinar
la zona de equivalencia. Como en ese punto la
En exceso de Ag el equilibrio se desplaza, precipitación del antígeno es total, restando del
formándose complejos solubles, y disminuye precipitado la cantidad de él añadida conocere­
por lo tanto la cantidad de anticuerpos en el mos la cantidad de proteína anticuerpo (véase
precipitado: cuadro 9-3).
Cuando en la valoración de anticuerpos por
Ag Ac + Ag Agj Ac
precipitación el punto de equivalencia se deter­
(precipitado) (soluble)
mina mediante la investigación de exceso de Ac
El mismo efecto anterior puede lograrse aña­ o de Ag en el sobrenadante, es indispensable
diendo exceso de hapteno al precipitado. En es­ que el antígeno empleado en este examen sea de
tas condiciones pueden form arse com plejos la máxima pureza. Si no fuese así, la mayor pre­
Hp^ Ac solubles, hecho éste que se emplea con cipitación podría corresponder a mezcla de anti­
suma frecuencia cuando quieren disociarse pre­ cuerpos y además podría ocurrir que anticuer­
cipitados para la purificación de anticuerpos. pos contra la im pureza, que se encuentran a
La mayor o menor cantidad de Hp^ Ac formado concentraciones distintas de las del anticuerpo
dependerá de la afinidad de aquél por el antíge­ para valorar, tengan zonas de equivalencia dife­
no y el hapteno. rentes y dificulten el análisis (fig. 9-5).
Si el anticuerpo para valorar fuera específi­ Si el antígeno empleado en la inmunización
co contra un antígeno proteico, el método de y en la valoración es una proteína con varios
valoración para emplear sería el mismo, pero determ inantes antigénicos, ovoalbúm ina por
en este caso la proteína del precipitado no se­ ejemplo, el título obtenido corresponderá a más
ría exclusivaiíiente anticuerpo. Si el antígeno de un anticuerpo que han precipitado simultá­
tuviera una m arca identíficable, por ejem plo neamente. El problema se complica aun más si
 Reacción antígeno-anticuerpo in vitro 181

ng de Ag añadido

F ig . 9-4. C urva de precipitación correspondiente al sistem a D N P -anü-D N P, elaborada con los datos del cu a d ro 5-3.

se tiene en cuenta que cada uno de los determi­ com binación del anticuerpo son bloqueados
nantes puede tener una heterogeneidad distinta por el hapteno, imposibilitando la interacción
con respecto a la afinidad. posterior del antígeno.
Mediante este método ha sido posible tener
Inhibición de la precipitación m ejor información sobre la especificidad del
po r haptenos anticuerpo que cuando se emplea la precipita­
ción cualitativa.
Siendo el hapteno la parte de la molécula an­ El método también puede hacerse cuantitati­
tigénica que le confiere la especificidad, es ló­ vo y generalmente se elige como punto final de
gico que el anticuerpo originado reaccione con la reacción el 50% de inhibición.
ambos. Si bien la interacción directa anticuer- Tiene la ventaja de permitir la medición de
po-hapteno (A c-H p) no puede v isualizarse, la capacidad inhibitoria de haptenos relaciona­
puede ponerse de manifiesto mediante la inhi­ dos y establecer comparaciones entre ambos,
bición de la precipitación cuando es añadido el en especial sus afinidades con relación al antí­
antígeno. Durante la primera etapa, los sitios de geno inmunizante (fig. 9-6).

C u ad ro 9-2. Valoración de anticuerpos antidinitrofenol (anti-DPN)

DO D O (360) DO (280) A c en A g en
Suero A ntígeno x 0 ,6 2 corregido ppdo. ppdo. Relación
mi ¡lg/0,2 m i 360 280 (a) (b) (a-b) - mg fíg Ac/Ag

0,5 40 0,290 1.060 0,180 0,880 1,10 53 20,7

0,5 75 0,385 1,221 0,238 0,983 1,22 70 17,4
0,5 100 0,502 1.305 0,311 0,994 1,25 92 13,4
0,5 125 0,611 1.542 0,379 1,163 1,45 112 12,9
0,5 150 0,740 1,634 0,458 1,176 1,47 136 10,8'
0,5 175 0,796 1.609 0,493 1,116 1,39 145 9.5
0,5 200 0,737 1,530 0,457 1,073 1,34 135 9,9

S u ero valorado: su ero de co n e jo in m u n iz ad o con g am m a g lo b u lin a h u m a n a d in itro fen o la d a (D N P -H G G ).

A n tíg en o em p lea d o : alb ú m in a b o v in a din itro fen o la d a (D N P -B S A ). P ara D O (3 6 0 nm ) = 1 c o rresp o n d e n 93 }Xg d e antígeno (fig . 35-1).
Inc u b ació n : 1 h o ra a 37"C y 24 h o ra s a 4 ‘'’C.
í.ec tu ras: esp e ctro fo to m étric as (v o lu m en final d e lo s tu b o s 2 m i).
10/E^^i^, p ara la Ig G d e conejo: 0,625.
C álculos:
A n ticu e rp o en el p p d o .: D O (280 n m ) (a-b) x 2 x 0 ,6 2 5 : m g/ppdo.
A n tíg en o en el p p d o .: D O (360 nm ) x 2 x 93: )ig/ppdo.
R elación A c/A g: [ig A c en p p d o /|ig A g en ppdo.
T ítu lo d e an ticu e rp o s anti-D Ñ P : m á x im a cantidad d e A c en ppdo. x 2.
P ara el ca so de an alizado: ] ,5 x 2 = 3 m g - mi"' de suero.
182 Aspectos básicos de la inmunidad

Fig. 9-S. C urva de precipÍT

tación efectu ad a con suero
d e o v e ja in m u n iz a d a con
H G G -D N P. En los solwena-
d a n te s se o b s e rv a n tu b o s
c o n e x c e s o d e A g y A c.
Ello es debido a que se trata
de un sistem a m ultiespeeífi-
co, constituido por anticuer­
pos anti-H G G (-------) y an­
ti-DN P

|ig de Ag añadido

-Precipitación con HGG - DNP

-Precipitación con HGG
-Precipitación con BSA - DNP

Reacción de floculación Parecería que es una propiedad dependiente

Un hecho no bien entendido es la llam ada
reacción de floculación. Ésta se caracteriza por
no formar precipitados hasta que la cantidad de
antígeno añadido no exceda de ciertos límites,
cosa que no ocurre con la precipitación. Aquí
hay formación de agregados que sedimentan con
el añadido de cantidades mínimas de antígeno.
En la floculación, los complejos formados se
agregan y sedimentan en un rango nruy estre­
cho de la relación Ac/Ag; en la zona de exceso
de antígeno y exceso de anticuerpos sólo se
forman complejos solubles. En la precipitación
esto es bien manifiesto en la zona de exceso de
antígeno (fig. 9-7).
más de los anticuerpos que de los antígenos.
Los sueros que dan floculación son los que se
obtienen por inmunización de caballos con al­
gunos tipos de proteínas, en especial toxinas
m icrobianas, como la diftérica y la tetánica.
Los sueros de los mismos animales inoculados
con polisacáridos se comportan como precipi­
tantes y no como floculantes. Los conejos, ca­
bras y ovejas dan sueros precipitantes, cual­
quiera que sea el tipo de antígeno empleado.
En el hombre se ha observado que algunos
sueros provenientes de enfermos con tiroiditis
de fíashimoto, enfermedad en la que aparecen
autoanticuerpos antitiroglobulina, se com por­
tan como floculantes.

C u ad ro 9-3. Valoración de anticuerpos antio­

voalbúmina
O voal­ Proteína Análi'sis
búm ina DO del d el sobrenadante
Suero llg/0,2 (280 ppdo. Exceso Exceso
ml ml nm,} mg deA g cleA c

0,5 50 0,820 1,03 _ +

0,5 75 1,150 1,44 - +
0,5 100 1,350 1,69 - +
0,5 125 1,550 1,94 _ +
0,5 150 1,795 2,24 _

0,5 175 1,725 2,16 + -

|iM de hapteno añadido _
0,5 200 1,610 2,01 +
0,5 225 1,525 1,90 + -
F ig. 9-6. G raficación de los resultados obtenidos en la in­ C álculos;
hibición de la precipitación por un hapteno. Sistem a reacti­ D O (280) X 0 ,625 x 2: P ro teín a del pre cip ita d o .
vo: D N P-anti-D N P. A nticuerpo: 0,5 m l de suero de oveja (P roteína del ppdo. en zo n a d e eq u iv a le n cia) - (A g a ñ a d id o en zona
anti-D N P (inm unizada con D N P-H G G ). A ntígeno: 150 lig de eq u iv a le n cia) = A n ticu e rp o en ppdo. en zo n a de eq u iv a le n cia.
D N P-BSA (dosis óptim a). H apteno: dinitrofenol (D NP). P ara el caso analizado: 2 ,2 4 - 0,15() = 2 ,09 m g/0,5 m l d e suero.
 Reacción antígeno-anticuerpo in vitro
Fig. 9-7. Curvas de
p recip itació n y flo-
culación. En la p re ­
cip ita c ió n sólo hay
fo rm a c ió n de c o m ­
p le jo s s o lu b le s en
exceso de antígeno,
en ta n to q u e en la
f lo c u la c i ó n e llo
ocurre en exceso de
an tíg en o y de a n ti­
cuerpo.
P R E C IP IT A C IÓ N
Los sueros con anticuerpos que dan precipi­
tación se identifican como de tipo R, y como de
tipo H los que producen floculación.
Esta denominación se ha adoptado teniendo
en cuenta que los sueros de conejo (rabbit) y
los de caballo (horse) son los que tienen esas
características.
Precipitación en medios con geles
Las macromoléculas pueden difundir libre­
mente a través de geles; esta difusión está limi­
tada por la concentración del gel. Empleando
soportes adecuados, en especial aquellos que
como base tienen agar disuelto en electrólitos,
es posible hacer migrar antígenos y anticuerpos
de modo que al encontrarse interaccionen. Pue­
den utilizarse también geles con base de pecti-
na, alginatos, poliacrilamida y aun tiras de ace­
tato de celulosa gelatinizado.
Los precipitados que se originan se visuali­
zan como nítidas bandas de precipitación, que
permanecerán estables mientras un mayor aflu­
jo de moléculas de los reactivos no provoquen
redisolución.
Se han descrito numerosas técnicas cualitati­
vas y cuantitativas basadas en este principio,
entre las que pueden citarse la difusión simple
monodimensional, doble difusión monodimen-
sional, doble difusión bidimensional, difusión
radial, inmunoelectroforesis.
Difusión simple monodimensional
M étodo conocido también como técnica de
Oudin simple, por ser éste el autor que lo des­
cribió; consiste en colocar en un tubo de ensa­
yo pequeño agar fundido (solución al 1% en
NaCl 0,15 M) mezclado con un volumen igual
del antisuero para analizar. Producida la solidi­
ficación, se añade la solución de antígeno. Por
difusión a través del gel el antígeno va pene­
183
trando, creando un gradiente de concentración.
En la interfase gel-líquido no se form an preci­
pitados, dada la alta concentración antigénica,
y aparecen con la forma de bandas cuando la
concentración del antígeno que ha difundido es
la óptima.
Si en el suero había más de un anticuerpo y
en la solución añadida más de un antígeno que
se correspondan, se formarán tantas bandas de
precipitación como sistemas hayan interaccio­
nado.
Esto no es exacto, pues si se tiene en cuenta
que estas separaciones dependen de las veloci­
dades de difusión de las diferentes moléculas
antigénicas, sólo será cierto si aquéllas son dis­
tintas. El número de bandas de precipitación
nos indica la cantidad mínima de sistem as reac­
cionantes presentes. Esto también es relativo,
ya que es indispensable que los reactivos no es­
tén a concentraciones inferiores a las necesarias
para que la reacción ocurra.
Teniendo en cuenta que la velocidad de mi­
gración depende del coeficiente de difusión del
antígeno y de su concentración, Oudin trató de
aplicar las leyes de la difusión con el objeto de
transform ar el m étodo en cuantitativo, estu­
diando los factores que influyen en la forma­
ción de los precipitados. Las fórmulas para la
cuantificació n p ropuestas por él son las si­
guientes:
1) h =K
VT
2) ÍL = y lo g ^
VF Ago
, h Ag
— = a log —
VF Ago
184 Aspectos básicos de la inmunidad
h es la distancia desde el borde del gel a la ban­
da de precipitación en un tiempo t; y y a son
constantes y Ag y Ac las concentraciones ini­
ciales de antígeno y de anticuerpo. Agg y ACg
son los correspondientes valores extrapolados
para
h
— = O
VT
La fórmula 2 se aplica cuando el anticuerpo
es constante y el antígeno variable, y la 3, en el
caso contrario.
Posteriormente, el mismo autor pudo com­
probar que hay una relación lineal entre K y lo­
garitmo de la concentración antigénica (log C)
para valores bajos de ~ y entre y el mis-
h
mo logaritmo para valores altos de — . En con-
VF
secuencia, para bajas concentraciones antigéni-
h
se aproxima a log C, mientras que a al­
VT
tas concentraciones lo hace a —
VT
Han sido propuestos otros métodos de cuan­
tificación incluso el empleo de densitómetros
especialmente diseñados, pero a pesar de ello
actualmente sólo se utilizan como metodología
cualitativa, ya que para la cuantificación de Ag
y Ac existen otros métodos más eficientes.
Difusión simple bidimensional
En este caso, la reacción se efectúa colocan­
do en la parte inferior del tubo un volumen de
agar al 1% fundido, mezclado con partes igua­
les del antisuero. Producida la gelificación, se
agrega agar al 0,5% en solución salina, en un
volumen igual a la mitad del anterior. Después
de la solidificación se cubre todo con un volu­
men de agar al 1% fundido, mezclado con igual
volumen de la solución antigénica.
Antígenos y anticuerpos migrarán hacia la
zona media y, cuando los que son equivalentes
se encuentren, interaccionarán desencadenán­
dose la precipitación cuando las concentracio­
nes sean las óptimas. Si las cantidades de Ag y
Ac añadidas son las que corresponden a la zona
de equivalencia, la precipitación se producirá
en la parte central de la zona de reacción y las
bandas formadas serán nítidas y estables, en
tanto que estarán desplazadas hacia los extre­
mos cuando estas condiciones no se cumplan, y
en parte se redisolverán. Estando la difusión en
relación directa con la concentración de la sus­
tancia que difunde, la banda de precipitación
estará m ás próxim a a la zona del antígeno
Solución Ag + agar
de Ag ai 1%
en S.F.
r 0,5%
Solución
de Ac Ac + agar
en agar ai 1%
Difusión simple Difusión dobie
Ag Ag
Ac Ac Ac
Precipitación en Precipitación en Precipitación en
exceso de Ac zona de equivalencia exceso de Ag
F ig. 9-8. A . Esquem atización de la inm unodifusión sim ­
ple y doble. B . Los tubos indican las características de la
banda de precipitación en la inm unodifusión doble, la que
es nítida y está ubicada en el centro cuando se form a en la
zona de equivalencia, y d ifusa y desplazada cuando io h a­
ce en p resen cia d e exceso de an tígeno o an ticu erp o . La
banda se desplaza hacia la zona del antígeno, y la red iso lu ­
ción del precipitado (zona difusa) se produce del lado don­
de está ubicad o el an ticu erp o cu ando h ay exceso d e él;
ocurre lo contrario cuando el antígeno es el que se encuen­
tra en m ayor concentración.
cuando hay exceso de anticuerpo, y ocurrirá lo
inverso en caso contrario.
Éste es un buen método cualitativo que per­
mite demostrar varios sistemas reactivos simul­
táneos, cosa que no ocurre en la precipitación
en medios líquidos (figs. 9-8 y 9-9). Pueden
detectarse hasta 10 |J,g por mi de anticuerpo.
Doble difusión bidimensional
Un método interesante de doble difusión en
placas fue descrito por Ouchterlony, que luego
fue transformado en micrométodo al emplear
portaobjetos cubiertos con agar al 1,5% en so­
lución salina como base de la reacción. Consis­
te en enfrentar en pequeñas perforaciones efec­
tuadas en el agar, y a distancias convenientes,
las soluciones de antígeno y anticuerpo.
 Reacción antígeno-anticuerpo in vitro 185

F ig . 9 -9 . In m u n o d ifu sió n d o b le en
exceso de antígeno (1), zona de equi--
v alen cia (2) y ex c eso de an ticuerpo
(3). L as ban d as de p re c ip ita c ió n de
los tubos 4 y 5 corresponden a ia inte^
racció n de distintos sistem as a n tíg e­
no--anticuerpo.

Al difundir ambos y ponerse en contacto, m ediante el empleo simultáneo, en el mismo

producirán una banda de precipitación cuando esquema de reacción, de antígenos y anticuer­
estén en la relación óptima. Si la concentración pos conocidos. O riginariam ente O uchterlony
de Ag y Ac colocados en los reservorios es la describió, de acuerdo con este hecho, tres tipos
que corresponde a la zona de equivalencia, la de reacciones y el esquema correspondiente a
banda de precipitación estará situada aproxima­ ellas puede verse en la figura 9-11. Fueron de­
damente en la distancia media que separa esos nom inadas como reacciones de identidad, no
reservorios. Cuando hay exceso de Ag o de Ac, identidad e identidad parcial.
la banda de precipitación formada estará próxi­ En el primer caso, los dos sistemas reactivos
ma al reservorio del anticuerpo o del antígeno, se funden en una única banda de precipitación.
respectivamente. Si los sistemas no son iguales (reacciones de
Con esta técnica puede tenerse una idea de no identidad), cada uno reacciona independien­
las relaciones entre los pesos moleculares de tem ente originando bandas de precipitación
los antígenos y anticuerpos reaccionantes. Tra­ que se cruzan. Cuando uno de los antígenos
bajando con concentraciones óptimas de Ag y analizados tiene algún com ponente capaz de
Ac, si la banda de precipitación formada es rec­ dar una reacción cruzada con el anticuerpo ela­
ta, indica que los pesos moleculares de ambos borado por el otro (identidad parcial), las ban-
son muy próximos. Si la banda es cóncava con
respecto al reservorio del antígeno, señala que
el peso molecular de éste es superior al del an­
ticuerpo, siendo m enor en el caso en que la
banda presente convexidad.
Todo esto es una consecuencia de las leyes
generales de la difusión, que establecen que la
distancia a la que una sustancia difunde está en
relación directa con su concentración y en rela­
ción inversa con su peso molecular. Mediante
esta metodología es posible identificar varios
sistemas reaccionantes simultáneamente, pues
cada uno de ellos dará una banda de precipita­
ción específica y, además, investigar reaccio­
nes cruzadas, pues en estos casos habrá fusión
de bandas. Teniendo en cuenta ello se han idea­
do distintos modelos de matrices con las que
pueden elaborarse diferentes esquemas reacti­
vos (fig. 9-10).
Este método resulta muy interesante porque F ig . 9-10. D istin to s esquem as para inm unoprecipitación
permite identificar las bandas de precipitación en p lacas de agar (técnica de O uchterlony).
186 Aspectos básicos de la Inmunidad
das de precipitación de ambos sistemas se unen
y funden parcialm ente en una banda, apare­
ciendo una prolongación o espolón en la co­
rrespondiente al antígeno que se empleó para la
obtención del antisuero. Esto indica que en este
antígeno hay componentes antigénicos no com­
partidos con el restante.
Las reacciones descritas son las que respon­
den a los lincamientos generales de los esque­
mas expuestos y muy especialm ente cuando
Ag y Ac están en relaciones óptimas. Variacio­
nes en sus concentraciones pueden influir en
los resultados, hechos éstos que deben tenerse
muy en cuenta para su interpretación correcta.
La figura 9-12 muestra algunos de ellos.
La difusión doble en placa es un excelente
método cualitativo para el estudio de la homo-
10
A íá
F ig . 9 -1 2 . In m u n o p re c ip ita c ió n en p la c a (m é to d o de
O uchterlony). Pueden apreciarse sistem as sim ples y m últi­
ples, bandas de identidad, y de no identidad.
F ig . 9-11. E squem as de rea c c iO '
geneidad de antígenos y anticuerpos purifica­
dos. Resulta muy útil también para la búsqueda
de impurezas, lo cual está limitado por la con­
centración en que ellas se encuentren presentes,
ya que la precipitación se hace visible cuando
los reactivos exceden valores mínimos. Para
obviar este inconveniente, en la práctica se em ­
plean generalm ente altas concentraciones de
Ag y Ac que, si bien no resultan útiles para el
sistema principal, pues deja de estar en las con­
diciones óptimas, perm iten aumentar la con­
centración de la impureza y asegurar su preci­
pitación.
Difusión simple en placa o difusión radial
Es un método que resulta poco útil desde el
punto de vista cualitativo, ya que la doble difu­
sión descrita por Ouchterlony provee mayor in­
formación. En líneas generales, consiste en la
preparación de una placa con agar al 3% en so­
lución salina, al que previa fusión se le añade
un volumen igual del suero inmune que contie­
ne los anticuerpos. Producida la soUdificación,
se practican orificios en la placa y en cada uno
de ellos se colocan los antígenos para analizar.
Si los sistemas son equivalentes rodeará al ori­
ficio un círculo de precipitación, pero pueden
aparecer varios si se encuentra presente más de
un sistema reaccionante.
Este método ha dado magníficos resultados
para la cuantificación de antígenos; permite de­
tectar en mezclas cantidades mínimas, proble­
ma que no había sido resuelto hasta ese m o­
mento. Cuando un antígeno es colocado en el
orificio circular practicado en la placa de agar
adicionado de anticuerpo m onoespecífico di­
funde en form a radial y, de acuerdo con los
principios básicos de la difusión, el diámetro
del halo de precipitación está en relación direc­
ta con su concentración. Si esta operación se
efectúa colocando en varios orificios de la pla­
ca cantidades variables conocidas del antígeno
específico para el antisuero m ezclado con e!
agar y se deja a tem peratura am biente hasta
que el halo de precipitación no se modifique.
 Reacción antígeno-anticuerpo in vitro
F ig . 9 - 1 3 . C u rv a p a r a la
cuantificación de antígenos
por in m u n o d ifu sió n radial.
El s is te m a u s a d o p a ra su
elaboración ha sido seroal­
búm ina hiim ana-antiseroal-
búm ina hum ana. P arte infe­
rior: fo to g ra fía de los d iá ­
m etros de los halos de p re­
cipitación.
con los resultados obtenidos se puede confec­
cionar una curva relacionando la superficie de
los círculos de precipitación o sus r^ con las co­
rrespondientes concentracio n es an tigénicas
(fig. 9-13). Esta curva permite calcular la con­
centración de ese mismo antígeno en cualquier
inuestra desconocida, ya que estableciendo
cuál es el diám etro del halo de precipitación
para un volumen añadido se puede determinar
r^ y, con el auxilio de la curva de precipitación,
establecer la concentración antigénica en él.
Por simple cálculo podrá determinarse luego su
concentración por ml. La confección de la cur­
va y la valoración del desconocido conviene
h acerlas sim ultáneam en te con el o b jeto de
igualar las condiciones de la reacción.
La difusión radial se utiliza con muy buenos
resultados en la valoración de proteínas que se
encuentran presentes en mezclas complejas co­
mo lo son los componentes del suero humano.
Es indispensable disponer para ello de antisue­
ros monoespecíficos destinados a los antígenos
que se quieren valorar.
187
Antígeno (mg/ml)
Reoforesis
Es un método de inmunodifusión que se basa
en los siguientes hechos: si en una p la c a de
agarosa o agar purificado que contiene anti­
cuerpo en un orificio central y antígeno en los
circundantes, o viceversa, se confecciona sobre
el gel una canaleta periférica en la que se colo­
ca buffer y se perfora centralmente la tapa de la
placa, como consecuencia de la evaporación a
través de este orificio se originan corrientes del
líquido que obligan al material contenido en los
orificios periféricos a desplazarse hacia el cen­
tro, con lo que se logra una interacción antíge­
no-anticuerpo más efectiva y por lo tanto mejo­
res arcos de precipitación. La figura 9-14 es­
quematiza lo expuesto.
Inmunoelectroforesis
Grabar y Williams tuvieron la feliz id ea de
concebir un método analítico de proteínas aJ
que llamaron análisis inmunoelectroforético y
188 Aspectos básicos de la inmunidad
Base Tapa
conteniendo buffer
F ig . 9-14. E squem a de re o fo re s is ,------- ^ indican el senti­
do de la corriente líquida originada por la evaporación a
través del orificio central de la tapa.
que resulta de extraordinario valor para los
exámenes inmunoserológicos e inm unoquími­
cos. Si se efectúa la separación electroforética
de los constituyentes de una mezcla de antíge­
nos, en gel de agar como soporte, y aprove­
chando la técnica de Ouchterlony se hace di­
fundir lateralmente un inmunosuero específico
para los constituyentes de la mezcla en estudio,
en las zonas correspondientes a la interacción
de cada antígeno con su anticuerpo aparecerá
una banda de precipitación. Su ubicación de­
penderá de la movilidad electroforética y velo­
cidad de difusión del antígeno, lo que permite
hacer las diferenciaciones (figs, 9-15 y 9-16).
Algunos antígenos, incluso, pueden ser identi­
ficados mediante reacciones particulares sobre
las bandas de precipitación, aprovechando la
presencia en el antígeno de algún grupo reacti­
vo especial que pueda ser demostrado por una
reacción química o enzimática.
Para su puesta en marcha no son necesarios
dispositivos complicados. Solamente hace falta
una fuente de poder capaz de proveer el voltaje
y miliamperaje indispensables, agar purificado,
cubas de material plástico, soluciones regula­
doras, inmunosueros y algunos reactivos colo­
rantes.
El agar que se utilizará debe ser de muy bue­
na calidad, libre de impurezas, ya que si éstas
son de carácter antigénico pueden incidir en los
resultados. El gel se prepara disolviendo el agar
al 1,25% en el buffer adecuado; el más usado es
el de veronal sódico de fuerza iónica 0,05, ajus­
tado a pH 8,4 con ácido clorhídrico IN.
Las placas inicialm ente usadas por Grabar
para las corridas elec tro fo réticas eran muy
grandes, lo que significaba largos tiempos de
corrida e inm unoprecipitación y consum o de
apreciables cantidades de antisuero. Scheide-
gger propuso luego el empleo de portaobjetos
como placas de corrida y desarrolló un método
llamado microinmunoelectroforesis, que es el
que se emplea actualmente.
En el comercio existen diferentes modelos
de aparatos con sus correspondientes fuentes
de poder, cubas y matrices para la confección
de las placas, lo que facihta las tareas.
Como el agar no es una sustancia absoluta­
mente neutra, un fenómeno secundario, la elec­
troendósm osis, acompaña a la eleetroforesis,
que consiste en un movimiento de la totalidad
del líquido que em bebe el gel en el sentido
opuesto al de la corriente eléctrica. En efecto,
los diferentes soportes (agar, agarosa, acetato
de celulosa) cuando se impregnan en el buffer
alcalino, dada su naturaleza, exhiben cargas ne­
gativas. Ello hace que el agua se cargue positi­
vamente dando una unión muy débil con aqué­
llos. Como los soportes no pueden m overse
cuando se aplica la corriente eléctrica, las mo­
léculas de agua se disocian y se dirigen al polo
negativo (cátodo). El efecto será más o menos
intenso según la naturaleza del soporte; en el
caso de los medios gelosados, el efecto es má­
ximo para el agar y mínimo para la agarosa. In­
fluyen tam bién en este fenóm eno el pH , la
fuerza iónica y el potencial aplicado. Este mo­
vimiento es regular y no interfiere en los des­
plazam ientos por eleetroforesis. Si estas dos
migraciones son iguales tendremos la im pre­
sión de que la sustancia no se ha movido; en
cambio su movilidad será la del sentido de la
corriente, aunque más reducida, si sus molécu­
las están fuertemente cargadas. Las moléculas
poco cargadas son desplazadas por electroen­
dósmosis en sentido contrario al de su migra­
ción electroforética real. Las sustancias neutras
sólo son movilizadas por la corriente endosmó-
tica y ocuparán, después de la corrida electro­
forética, una posición que correspondería al
punto cero de migración. Este hecho obliga a
depositar la sustancia para analizar, si es desco­
nocida, en un reservorio confeccionado en el
centro de la placa para evitar que algunos cons­
tituyentes se desplacen fuera de ella. Para sus­
tancias conocidas, la siembra podrá efectuarse
en el punto más conveniente, de acuerdo con su
comportamiento.
Cuando se trabaja con el material indicado,
una corriente de 6 volts/cm permite una buena
separación en 75 minutos. La inmunoprecipita­
ción tiene lugar en las 24 horas siguientes. El
examen de las bandas obtenidas puede hacerse
directamente o por coloración con negro am i­
do, nigrosina, fucsina ácida, azocarmín u otro
colorante, previa desecación del ge! de agar.
Pueden emplearse otros soportes diferentes
del agar, y merecen destacarse las tiras de ace­
tato de celulosa gelatinizado, por su gran poder
de resolución (fig. 9-17).
 Reacción antígeno-anticuerpo in vitro 189

A B
A = esquema para inmunoelectroforesis con un antígeno (a) y dos inmunosueros (1 y 2)
B = esquema para inmunoelectroforesis con dos antígenos (a y b) y un inmunosuero (1)

A = electroforesis en agar
B = esquema de la inmunodifusión posterior a la electroforesis
C = inmunoprecipitación

F ig . 9-15. Inm unoelectroforesis.

“Crossing-over” electroforesis dica. Haciendo un estudio de las distancias a

o contrainmunoelectroforesis
Durante la electroforesis en medios gelosa-
dos a pH 8, las gammaglobulinas y por lo tanto
los anticuerpos, no obstante estar cargados ne­
gativamente, se desplazan hacia el cátodo co­
mo consecuencia del flujo endosmótico origi­
nado en el proceso. Otras proteínas antigénicas
en esas condiciones migrarán en dirección anó-
las que pueden sembrarse los antígenos y los
anticuerpos, puede lograrse que el desplaza­
miento sea convergente y, como consecuencia,
que en la zona de interacción se produzca una
banda de precipitación (fig. 9-18). Este método
se desarrolla en corto tiempo, 20-30 minutos, y
perm ite identificar antígenos y anticuerpos en
m uestras de sueros desconocidos. H a tenido
gran aplicación, especialmente en la investiga­
190 Aspectos básicos de la inmunidad

I^ig. 9-lí». Inm unoelectroforesis en agar de suero hum ano.

ción del agente causal de la hepatitis viral (an­

tígeno Au).

Electroinmunodifusión o “rocket”
electroforesis
Es un método que sirve para cuantificar pro­ Fig. 9 -Í8 . C ontrainm unoelectroforesis. Sistem a analizado
teínas. Cuando una partícula antigénica se des­ alb ú m in a h u m an a (d erecha); a n tialb ú m in a h u m a n a (iz ­
plaza bajo la acción de un campo eléctrico, en quierda). Soporte: agar.
un medio soporte que contiene el correspon­
diente antisuero, durante la migración electro­ cuerpos, el efecto de electroforesis cruzada no
forética el antígeno y su correspondiente anti­ se cumple en condiciones óptimas.
cuerpo van formando líneas de precipitación en Cuando se hacen estas determinaciones es ne­
el sentido de la corrida; el frente de ella experi­ cesario correr simultáneamente una muestra del
menta sucesivas precipitaciones y redisolucio­ mismo antígeno de concentración conocida, ya
nes, y concluye en un pico delimitado por un que la cuantificación se hará relacionando las al­
precipitado estable formado cuando la concen­ turas de los picos de precipitación obtenidos.
tración del antígeno remanente es mínima. Es­
tos arcos de precipitación, dada su forma pun­ Electroforesis cruzada
tiaguda (fig. 9-19), han sido denominados ro-
ckets y su altura depende de la concentración Laurell describió una modificación de la in­
del antígeno en cuestión. Como soporte de co­ munoelectroforesis, que puede ser utilizada con
rrida puede usarse agarosa o acetato de celulo­ fines cualitativos y cuantitativos. Resulta su-
sa gelatinizado.
El método, descrito por Laurell, tiene ciertas
limitaciones. Proteínas antigénicas como las in­
m unoglobulinas no puede ser cu antificadas
adecuadamente ya que por su movilidad elec­
troforética similar a los correspondientes anti-

B’ig. 9-17. Electroforesis (parte sup erior) e inm unoelectro­

foresis (parte in ferior) en acetato de celulosa de suero hu­ Fig. 9-19. “R ocket” electroforesis desarrollada en acetato
mano. de celulosa gelatinizado.
 Reacción antígeno-anticuerpo in vitro 191

mámente útil para estudios de proteínas séricas

y puede desarrollarse sobre agarosa u otros ge­
les, incluso acetato de celulosa.
Cuando se utiliza agarosa como soporte, so­
bre una placa de 1,5 mm de espesor preparada
con ella y usando buffer de veronal pH 8,6, se
hace una corrida electroforética de 3 horas, em­
pleando un potencial de 10 V/cm. Terminada
ésta, se corta una tira longitudinal del gel de
corrida y se deposita en otra placa, en la que a
la agarosa se le ha añadido una dilución conve­
niente de antisuero que contiene anticuerpos
para los antígenos en estudio. Haciendo girar la
placa 90° sobre la cürección de la corrida ini­
cial, se le aplica un potencial similar al ante­
rior. El tiempo de corrida varía entre 30 y 90
minutos, de acuerdo con las proporciones rela­
tivas de antígeno y anticuerpo. En esta segunda
corrida, los antígenos de la tira de agarosa así
como los anticuerpos incorporados al gel mi-
gran según su movilidad electroforética. Para
cada sistema antígeno-anticuerpo se forman zo­
nas de precipitación, las que m igran rápida­ F ig . 9-20. Inm unoelectroforesis cruzada o bidim ensional.
mente influidas por el exceso de antígeno, y así M edio de soporte: acetato de celulosa.
se originan arcos de precipitación que se esta­
bilizan cuando este exceso no ocurre. Los arcos
formados difieren de los logrados por inm u­
noelectroforesis clásica y los resultados obteni­ Cuando la técnica se desarrolla sobre acetato
dos pueden ser utilizados con fines cualitativos de celulosa, la prim era corrida electroforética
y cuantitativos, ya que las áreas de precipita­ se hace sobre un extremo de la p laca y la se­
ción formadas pueden ser cuantificadas (fig. 9- gunda sobre la misma placa girada en ángulo
20 ). de 90°, pero antes se ha recubierto el resto de
La intensidad de las bandas de precipitación su superficie con una dilución conveniente de
puede magnificarse si se recurre al siguiente ar­ antisuero.
tificio: después de la corrida en segunda dimen­
sión, la placa es lavada por 24 horas con buffer Radioinmunoelectroforesis
de fosfatos 0,01 M. Sobre la zona correspon­
diente a las bandas de precipitación se coloca La inmunoelectroforesis puede ser desarro­
un trozo de papel de filtro seco y se deja en llada usando antígenos o haptenos marcados
contacto, a temperatura ambiente, por 2-3 ho­ con radioisótopos, especialm ente [q que
ras. Su finalidad es la deshidratación parcial de permite por autorradiografía visualizar una in­
la zona para que se forme una concavidad te­ teracción ligando-anticuerpo que por sus carac­
nue, sobre Ja que se esparcirán 200 fxl de anti­ terísticas no puede ser detectada directamente.
suero con especificidad para la especie animal Es lo que ocurre con las uniones anticuerpo-
de la que provienen las inmunoglobulinas espe­ hapteno, pequeñas cantidades de antisuero y li­
cíficas usadas en la inmunoprecipitación inicial. gando de gran tamaño o las originadas por anti­
Dejar 24 horas a temperatura ambiente y lavar. cuerpos no precipitantes y sus correspondientes
El método puede simplificarse. Una vez ter­ antígenos.
minada la corrida en la segunda dimensión y Para la investigación de anticuerpos, el sue­
efectuado el lavado de las placas por 24 horas, ro en ensayo es corrido en una p laca de gel co­
éstas se cubren con papel de filtro impregnado mo se hace norm alm ente. Cuando la separa­
en la dilución conveniente del inmunosuero es­ ción de las proteínas se ha completado, en la
pecífico para las inmunoglobulinas, ya señala­ canaleta longitudinal se coloca u n a mezcla de
do. Después de 2-3 horas de contacto, a tempe­ antígeno radiactivo y antisuero contra la frac­
ratura ambiente, se retira el papel de filtro y las ción globulínica del suero en ensayo. El antí­
placas se incuban a la misma temperatura, en geno se combina con el anticuerpo específico
cámara húmeda, por 24 horas. Lavar las placas formando complejos, que luego son precipita­
convenientemente, finahzada la incubación. Si dos por el suero antigammaglobulina. Después
se desea, las bandas pueden ser coloreadas si­ de lavar para eliminar las proteínas no precipi­
guiendo para ello el método ya descrito. tadas, el preparado es secado y previa colora-
192 Aspectos básicos de la inmunidad
F ig . 9-21. Esquem atización de la radioinm unoelectrofore-
sis. 1, electroforesis. 2, inm unodifusión con una m ezcla de
hapteno (*) y anticuerpos antigam m aglobulina (o). 3, in-
m unoelectrof'oresis. 4, autorradiografía.
ción o sin ella las placas son puestas en con­
tacto con Una película sensible a los rayos X
como la NS-54T de Kodak u otra similar. D es­
pués de una exposición conveniente la película
es revelada. La coloración previa de las placas
permite comparar los resultados obtenidos por
inm unoelectroforesis y radioinmunoelectrofo-
resis. La figura 9-21 esquematiza esta metodo-
loeía.
INMUNOFIJACIÓN
Es una técnica que ha sido introducida con
éxito para estudios diferenciales de proteínas
hom ogéneas, en especial inm unoglobulinas
monoclonales, tanto para la identificación de la
clase de inmunoglobulina comprometida, como
para establecer el tipo de cadena L.
Consiste en efectuar varias corridas electro­
foréticas paralelas, usando acetato de celulosa
como soporte, preferentemente no gelatinizado
pues éste consume mayor cantidad de inmuno-
suero específico. Terminada la corrida, una de
las tiras es coloreada con el objeto de ubicar la
banda m onoclonal. Inm ediatam ente después,
en esa zona, se cubre cada una de las corridas
restantes con los diferentes sueros monoespecí­
ficos para determinar la clase de inmunoglobu­
lina y el tipo de cadena L. Se dejan actuar los
inmunosueros durante 5-10 minutos, se lavan
las tiras con solución salina para eliminar las
proteínas que no han formado complejos AgAc
insolubles, y se procede al teñido.
La proteína monoclonal sólo se fijará al so­
porte de corrida cuando al interaccionar con los
anticuerpos específicos forme complejos inso­
lubles. Conociendo la especificidad de los in­
munosueros puede establecerse la identidad de
la proteína analizada.
Este método resulta muy útil para identificar
y establecer la movilidad electroforética de un
antígeno presente en una mezcla compleja, en
especial cuando se analizan productos de ex­
tracción de m em branas celulares. El método
adquiere m ayor sensibilidad si se usan anti­
cuerpos marcados con átomos radiactivos, es­
pecialm ente '^’I, y la revelación se hace por
métodos autorradiográficos.
Actualmente otras variantes y nuevos méto­
dos se usan para la investigación de antígenos
y anticuerpos por inmunoprecipitación (véanse
caps. 35 y 42).
AGLUTINACIÓN
Cuando un anticuerpo es puesto en contacto
con su antígeno específico, si éste se encuentra
al estado particulado (hematíes, bacterias, célu­
las), las partículas se agruman y aglutinan. Los
principios que regulan esta reacción son los
mismos que para la precipitación. La ocurrencia
de uno u otro fenómeno depende de si el antíge­
no es particulado (suspensión) o está en solu­
ción. En un comienzo se creyó que el hecho es­
taba regido por el anticuerpo al que se denomi­
naba aglutinina. Hoy sabemos que un mismo
anticuerpo puede dar aglutinación con una sus­
pensión bacteriana y precipitación con un lisado
obtenido a partir del mismo microorganismo.
 Reacción antígeno-anticuerpo in vitro 193

La aglutinación se lleva a cabo en medio sa­
lino. La concentración óptima de electrólitos es
0,15 M. Concentraciones mayores pueden neu­
tralizar las cargas superficiales negativas que
las bacterias y otros antígenos particulados po­
seen a pH neutro y provocar aglutinación es­
pontánea no específica. C oncentraciones de
NaCl inferiores a 0,001 M son inefectivas.
El mecanismo de la aglutinación ha sido ex­
plicado de diferentes maneras. Bordet y Eagle
consideraron que inespecíficamente el electró­
lito era el responsable de la aglutinación, sobre
la base del siguiente mecanism o: durante la
reacción el antígeno se rodearía de una capa
monomolecular de globulina anticuerpo; si en
el medio no hay electrólitos, la ionización de la
proteína sería suficiente como para mantener la
dispersión, pero la presencia de electrólitos im­
pediría esa ionización, y al disminuir las cargas
por debajo de ciertos límites se originaría el fe­
nómeno de aglutinación. Esta interpretación es
criticable, ya que si dos antígenos particulados
bien diferenciables a la observación e incapa­
ces de dar reacciones cruzadas, son puestos en
contacto con una mezcla de sus respectivos an­
ticuerpos, en presencia de electrólito se produ­
ce la aglutinación y al microscopio se observan
grumos originados por cada uno de los antíge­
nos y no mezcla de ambos (fig. 9-22). Este he­
cho está en total acuerdo con la teoría del enre­
jado expuesta antes. Lo que probablemente de­
be ocurrir es que los iones opuestos del electró­
lito neutralizan en parte las cargas superficiales
de las partículas antigénicas evitando el recha­
zo entre ellas y asegurando la aproximación in­
dispensable para que una molécula de anticuer­
po, al reaccionar con dos de ellas, pueda iniciar
la form ación de los grum os que llev an a la
aglutinación específica. Si la interpretación de
Eagle fuera la correcta, los grumos microscópi­
cos de la experiencia anteriormente expuesta
deberían ser mixtos.
Reacciones de aglutinación
M étodos cualitativos
Son muy utilizados en serología diagnóstica
con el objeto de identificar bacterias, en las de­
term inaciones de grupos sanguíneos, etc. En
estos casos, es indispensable disponer de sue­
ros monoespecíficos obtenidos mediante adsor­
ciones cruzadas. Estas reacciones se efectúan
en portaobjetos mezclando suspensiones de las
bacterias o hematíes para identificar con anti­
sueros diferentes. La formación de grum os in­

Fig. 9-22. Izquierda: O bservación m icroscópica de la reacción de aglutinación efectuada m ezclando glóbulos rojos de
carnero dinitrofenolados y Salm onella typhi, con suero de conejo antidinitrofenol y am i-Salnionella typhi. S e observan
grum os de eritrocitos y grum os de bacterias aislados y no grum os m ixtos. D erecha: T estigo constituido por u na m ezcla de
am bos antígenos en ausencia de anticuerpos. (V éanse explicaciones en el texto.)
194 Aspectos básicos de la inmunidad
F ig. 9-23. A y B, aglutinación m acroscópica de una suspensión de Salm onella lyphi por diferentes diluciones de su anti­
suero específico. C, control negativo.
dicará la especificidad del sistema reaccionante
(fig. 9-23). No obstante que las bacterias o célu­
las en el huésped (inyección, infección) se de­
gradan y originan anticuerpos contra los antíge­
nos superficiales y citoplasmáticos, en las reac­
ciones de aglutinación sólo interaccionan los
primeros, dada la imposibilidad de penetración
de los anticuerpos al interior de las células.
Valoración de antisueros
Los métodos son semicuantitativos y consis­
ten en determinar cuál es la máxima dilución
del suero para analizar capaz de aglutinar al an­
tígeno específico. Las diluciones generalmente
se hacen en razcin 2 y el título se expresa por la
inversa de la máxima dilución aglutinante. Si la
dilución 1/1024 aglutina y no lo hace la dilu­
ción 1/2048, el título será 1024. Los valores
obtenidos son groseros y pueden aproximarse
efectuando diluciones intermedias. No obstante
ello, es una metodología de singular importan­
cia diagnóstica, ya que, efectuada en forma se­
riada, la variación del título de anticuerpos
puede ser muy útil para seguir la evolución de
una infección bacteriana o de una isosensibili-
zación por antígenos hemáticos.
El dosaje de anticuerpos por aglutinación
puede hacerse mediante reacciones de lectura
lenta o rápida. En el prim er caso se emplean
suspensiones diluidas de antígeno, que se mez­
clan con voMmenes iguales de las diferentes
diluciones del suero para valorar, empleando
como diluente cloruro de sodio 0,15 M. Los tu­
bos son incubados en baño de agua a 37°C du­
rante dos horas y dejados luego en la refrigera­
dora hasta el día siguiente para que la reacción
se complete. El título se determina buscando
cuál es el líltimo tubo de la serie que presenta
aglutinación.
La aglutinación rápida es muy usada en sero­
logía diagnóstica (reacción de Huddleson para
brucelosis, reacción de Widal para las salmone-
losis, etc.). En este caso, la reacción se efectúa
en placas, el antígeno que se emplea es veinte
veces más concentrado que el usado en la aglu­
tinación lenta y la lectura de los resultados se
hace a los 3-5 minutos. Los fundamentos del
método y determinación del título son similares
a los indicados anteriormente.
Fenómeno de prozona. Cuando se valora un
antisuero, la dism inución de los anticuerpos
por dilución hace que decrezca la aglutinación
hasta hacerse nula. No obstante ello, en algu­
nos sueros se observa un comportamiento par­
ticular, caracterizado por ausencia de aglutina­
ción en los primeros tubos de la serie, en los
que la concentración de anticuerpos es m áxi­
ma, con aglutinación positiva a diluciones ma­
yores. A este fenómeno se lo llama prozona.
Mediante el empleo de anticuerpos marcados y
otras metodologías, se ha podido demostrar que
en esos tubos, aun en ausencia de aglutinación,
el anticuerpo está unido al antígeno. Existiendo
un marcado exceso de anticuerpo con respecto
a los determinantes antigénicos de la superficie
celular, estadísticamente es muy poco probable
que los dos sitios activos del anticuerpo puedan
unirse a grupos receptivos específicos ubicados
en células diferentes. Teniendo el anticuerpo
suficiente flexibilidad, las moléculas pueden
bloquear pares de determinantes de la misma
célula, inhibiéndose de este modo la formación
de grumos.
No hay que olvidar tampoco que se han des­
crito anticuerpos “incompletos” o bloqueantes,
similares a los anticuerpos coprecipitantes y no
precipitantes (cap. 19), y que su presencia en el
suero, sim ultáneam ente con los anticuerpos
normales, puede incidir en ef fenómeno de pro­
zona.
Valoración de anticuerpos “incompletos”
o bloqueantes
Estos anticuerpos, además de no aglutinar, al
ser puestos en presencia de las correspondien­
tes partículas antigénicas las bloquean e impi­
 Reacción antígeno-anticuerpo in vitro
den su aglutinación por el anticuerpo específi­
co bivalente. En un comienzo se supuso que
eran univalentes pero algunas experiencias he­
chas con híbridos y estudios sobre equilibrio de
diálisis, hacen que deban considerarse como bi­
valentes. Impedimentos estéricos o fenómenos
de carga deben determinar el comportamiento
particular de estos anticuerpos.
Su investigación y valoración son muy co­
rrientes en clínica hematológica, en especial en
isosensibilizaciones maternofetales por antíge­
nos del sistema Rh. Su presencia ha sido de­
mostrada también en algunas infecciones bac­
terianas, en especial brucelosis y salmonelosis.
La valoración puede hacerse por bloqueo,
c o n g lu tin a c ió n o m e d ia n te el m é to d o de
Coombs o test de la antiglobulina.
a) Bloqueo. Para ello, en una batería de tu­
bos se colocan volúmenes iguales de la suspen­
sión antigénica con especificidad para el anti­
cuerpo que se analiza. A todos los tubos se
añade un volumen igual de cada una de las di­
luciones en razón 2 del suero a valorar. Se in­
cuban a 37°C durante una hora y luego se cen­
trifugan; se lava el sedimento tres veces con
solución salina tam ponada. Se resuspende el
antígeno en la misma solución hasta igualar el
volumen original y luego se añade a todos los
tubos, en un mismo volumen, anticuerpo biva­
lente específico en concentración suficiente co­
mo para aglutinar el antígeno presente. Se in­
cuba a 37°C durante una hora y se determina
cuál es la dilución máxima del suero capaz de
inhibir la aglutinación. La inversa de ella cons­
tituye el título del anticuerpo bloqueante en la
muestra examinada.
b) Método de Coombs o de la antiglobulina.
Para esta determinación es necesario disponer
de un antisuero específico contra la gamm a-
globulina de la especie animal de la que pro­
vienen los anticuerpos que se han de investi­
Anticuerpos
Glóbulos rojos incompletos
Complejos Ag-Ac
no aglutinables
F ig. 9-24. E squem atización de la reacción de Coom bs para la identificación d e anticuerpos incom pletos.
195
gar. Si los anticuerpos bloqueantes fuesen hu­
m a n o s , la a n tig a m m a g lo b u lin a (s u e ro de
Coombs) será específica para la gammaglobu­
lina humana. El método consiste en m ezclar el
antígeno con diluciones del suero que contiene
los anticuerpos “incom pletos” e in cu b ar las
mezclas a 37°C durante una hora. Si bien no
hay aglutinación, hay fijación dei anticuerpo al
antígeno, lo que significa que éste se cubre de
moléculas de gammaglobulina. Si después de
lavar tres veces con solución salina tamponada
se añade a todos los tubos suero de Coombs,
como éste es específico para los determinantes
antigénieos de la gam m aglobulina, en todos
aquellos tubos en que exista anticuerpo “in­
com pleto” fijado al antígeno habrá aglutina­
ción. El título corresponderá a la inversa de la
máxim a dilución del suero en examen que dé
aglutinación (fig. 9-24).
c) Conglutinación. Si la suspensión antigéni­
ca se prepara en albúmina bovina al 20% y las
diluciones del suero para valorar se hacen en el
m ism o diluyente, los anticuerpos “incom ple­
tos” pueden aglutinar al antígeno después de
una hora de incubación a 37°C correspondien­
do el título a la inversa de la máxima dilución
aglutinante. Ello se debería a que, como conse­
cuencia de la interacción antígeno-anticuerpos
“incompletos” , el complejo formado fija algu­
nos de los componentes del complemento, en
especial C3. En la albúmina bovina existe una
sustancia llamada conglutinina, capaz de fijarse
a los hidratos de carbono presentes en las mo­
lécu las de dicha fracción, originando como
consecuencia de ello la aglutinación.
La neutralización de cargas por parte de la al­
búmina, lo que facilitaría la aproximación de las
partículas y por consiguiente su aglutinación, es
un mecanismo que no puede descartarse, así co­
mo posibles interacciones entre la albúm ina y el
fragmento Fe de la inmunoglobulina.
Anticuerpos
anti-gamma globulina
(Suero de Coombs)
Complejos Ag-Ac
aglutinables
196 Aspectos básicos de la Inmunidad
Aglutinación cuantitativa
Es un método que no se emplea rutinaria­
mente, no obstante lo cual puede servir para
determinar los mg de anticuerpo específico pa­
ra un antígeno particulado existentes en un sue­
ro inmune. Para ello se determina por micro-
Kjeldahl el nitrógeno correspondiente a un vo­
lumen de antígeno puesto en contacto con el
suero inmune y el de un volumen igual del an­
tígeno puesto en contacto con suero normal de
la misma especie animal que contenían los an­
ticuerpos.
Las determ inaciones de N deben hacerse
previo lavado de los sedimentos con solución
salina para eliminar toda proteína no fijada es­
pecíficam ente, y la reacción de aglutinación
debe efectuarse en presencia de EDTA para in­
hibir la fijación del C. La cantidad de proteína
anticuerpo se calcula multiplicando el N halla­
do por diferencia entre los dos ensayos, por el
factor de conversión 6,25.
Aglutinación pasiva
Cantidades de anticuerpos contra un antíge­
no soluble no pueden detectarse por precipita­
ción si su concentración no excede los 20 )J,g •
m i '. Teniendo en cuenta que la aglutinación es
más sensible (cuadro 9-4), se ha procurado fijar
antígenos solubles a partículas, de m odo de
transform ar la precipitación en aglutinación.
Ello se ha logrado, y con magníficos resulta­
dos, mediante su fijación a hematíes y partícu­
las inertes como el poliestireno, la bentonita y
el colodión. A la reacción que resulta del em ­
pleo de glóbulos rojos como soporte se la llama
hemoaglutinación pasiva, y simplemente aglu­
tinación pasiva cuando se utilizan otros. Gene­
ralmente las uniones de los antígenos a los so­
portes son no covalentes y la fijación se obtie­
ne por mezcla directa o previo acondiciona­
miento de la superficie de las partículas. En el
caso de los hematíes, la fijación de hidratos de
carbono no necesita intermediarios; en cambio
para las proteínas es necesario el tañado previo
o tratam iento con aldehidos simples como el
fórmico, piriívico o glutárico. Mediante el em­
pleo de ciertos reactivos, tales como la bencidi­
na bis-diazotizada o el toluene-2-4-isocianato,
con dos grupos funcionales por molécula, se
consiguen uniones covalentes de proteínas a la
superficie de los hematíes. Es posible también,
teniendo en cuenta que en la membrana celular
hay restos de lisina, fijar grupos DNP utilizan­
do como reactivo FDNB (fluordinitrobenceno)
(fig. 9-25). Los hematíes frescos marcados se
conservan poco tiempo, pero éste puede pro­
longarse mediante la formalización de los eri­
trocitos.
C u ad ro 9-4. Valores aproximados de la con­
centración mínima de anticuerpos detectables
por los diferentes métodos inmuno serológic os
Anticuerpo Sensibilidad
M étodo ng ■m f relativa
Precipitación (m edio gelosado) 20 1
Precipitación (m edio líquido) 10 n
F ijación del com plem ento 5 4
(100% de lisis)
Fijación del com plem ento 0,2 100
(50% de lisis)
A glutinación 0,4 50 '
H em aglutinación pasiva 0,15 133
IFI 0,05 400
E LISA 0,01 2.000
R IA 0,001 20.000
P ara los cálculos d e sensibilidad re la tiv a se asig n ó el v a lo r 1 a la
c o rresp o n d ien te a p re cip ita ció n en m ed io g eíosado.
La aglutinación pasiva es un método semi-
cuantitativo que, al igual que la aglutinación,
perm ite determ inar concentraciones relativas
de anticuerpos sobre la base de la máxima di­
lución aglutinante. Es cuatro veces más sensi­
ble que la aglutinación y mucho más aun que
la precipitación.
Ello es consecuencia del tamaño de las par­
tículas antigénicas que intervienen en la reac­
ción. En la precipitación, el antígeno es mole­
cular y se necesitan muchos complejos Ag-Ac
agregados para que la reacción se visualice, en
tanto que en la aglutinación pasiva se lo ha
transformado en una partícula de gran tamaño,
capaz de dar aglutinados con pocas de ellas. El
número de moléculas de anticuerpo que inter­
vienen en uno y otro caso difiere muchísimo,
de ahí la distinta sensibilidad.
La reacción se efectúa colocando en tubos
0,5 mi de las diluciones del suero para valorar y
0,05 mi del antígeno fijado al soporte, que se
agitan para mezclar. Se dejan a temperatura am­
biente 18-24 horas y se observan los tubos sin
centrifugar por la parte inferior, para determinar
si ha habido aglutinación (fig. 9-26). Existen
dispositivos que mediante el empleo de espejos
e iluminación indirecta permiten ver reflejados
sobre aquéllos los fondos de los tubos.
Esta técnica es muy utilizada en serología
diagnóstica, ya sea bajo la forma de aglutina­
ción pasiva directa o midiendo su inhibición.
Esto sirve para investigar hormonas y antíge­
nos solubles diversos en sangre, orina y otros
fluidos y especialm ente para el diagnóstico
tem prano del embarazo, puesto que en estos
casos hay marcado aumento de gonadotrofina
urinaria: si se mezcla un antígeno constituido
por partículas inertes a las que se les ha fijado
la gonadotrofina y suero antigonadotrofina bi­
valente, habrá aglutinación. M ezclando dicho
 Reacción antígeno-anticuerpo in vitro
suero con la orina a analizar, en caso de que és­
ta contenga gonadotrofina, el anticuerpo será
neutralizado, y si luego se añade el antígeno fi­
jado al soporte inerte, no habrá aglutinación.
Ello significa que el anticuerpo fue totalmente
neutralizado en la primera etapa y que por lo
tanto la concentración de gonadotrofina urina­
ria es alta, lo que perm ite hacer diagnóstico
temprano de embarazo. La aglutinación hubie­
se hecho descartar esa posibilidad. Actualmen­
te la aglutinación pasiva en tubo ha sido susti­
tuida por la aglutinación en policubetas de po-
liestireno u otros tipos de plásticos.
FIJACIÓN DEL COMPLEMENTO
En el capítulo 22 se ha indicado la cinética
de la inmunohemólisis por acción del comple­
mento (C) y el efecto que él ejerce sobre las
m em branas si los antíg en o s son c elu lares.
Cuando el sistema Ag-Ac sobre el que actúa
son hem atíes-hem olisina, produce hem ólisis,
originando citólisis o bacteriólisis cuando lo
hace sobre sistemas en que los antígenos son
células o bacterias. El C se inactiva tam bién
con complejos originados por antígenos solu­
bles, pero aquí el fenómeno no es demostrable
en forma directa o por microscopia como ocu­
rre en cambio en los casos anteriores.
Teniendo en cuenta la hemólisis que produce
cuando se fija a hematíes sensibilizados, en es­
pecial glóbulos rojos de carnero, se ha ideado
una reacción serológica denominada/yacfów del
complemento, la que mediante un sistema indi­
cador permite determinar la fijación de C a cual­
quier complejo Ag-Ac, esté el antígeno en solu­
ción o en suspensión. El reactivo indicador es el
sistema hemolítico -hem atíes de carnero y he­
molisina-, el que añadido en segunda instancia
al tubo que contiene la cupla que se analiza y C
dará hemólisis o no según que exista C libre. De
haber C libre, significa cjue no hay correlación
entre el antígeno y anticuerpo analizado, en tan­
to que la ausencia estaría indicando que el C ha
sido fijado por el primer sistema y que en este
caso Ag y Ac se relacionan (fig. 9-27).
Para que una reacción de fijación del com­
plemento funcione correctamente, es indispen­
sable que la cantidad de C añadida al primer
sistema reactivo sea igual a la necesaria para
producir el 100% o 50% de lisis del sistema he­
molítico, según se utihcen como punto final de
la reacción lecturas del 100% o 50% de hemó­
lisis. De añadirse un exceso de C, la fijación de
parte de él en la primera etapa de la reacción
podría no ser detectada por los glóbulos rojos
sensibilizados.
Las reacciones de fijación del complemento
pueden ser cualitativas o cuantitativas. En este
197
último caso sólo se valoran cantidades relativas
de anticuerpo, pues al igual que en la aglutina­
ción, el título del suero estará dado por la in­
versa de la m áxim a dilución que, puesta en
contacto con el antígeno, tenga capacidad para
fijar el complemento. Además, su em pleo está
limitado por la calidad del anticuerpo, ya que,
como se indicó en el capítulo 5, hay algunos
que no fijan el C.
Algunas muestras para analizar presentan la
particularidad de fijar el complemento en au­
sencia de antígeno. Estos sueros se denominan
anticomplementarios, y ello se debe a que con­
tienen gammaglobulina desnaturalizada y agre­
gada, que tiene capacidad fijadora del C (véase
cap. 22). Para evitar estos inconvenientes es
n ecesario que los sueros para an a liz a r sean
frescos y mantenidos en refrigeradora por no
más de 48 horas. En caso de que deban conser­
varse por más tiempo, para evitar los agregados
de gammaglobulina por desnaturaUzación físi­
ca o contaminaciones, es conveniente añadirles
0,1% de cisteína o glicina y 0,01% de Merthio­
late. Estas sustancias, a las concentraciones in­
dicadas, no interfieren en la reacción.
Para las reacciones de fijación del comple­
mento es necesario disponer de glóbulos rojos
de carnero, hem olisina antiglóbulos rojos de
carnero, complemento (suero fresco de cobayo)
y soluciones salinas tamponadas.
Todos estos reactivos deben estar estabihza-
dos y valorados, ya que para cada sistem a hay
una dosis óptima.
Las reacciones cualitativas de fijación del
complemento con lecturas del 100% de hemo­
lisis se efectúan colocando en pequeños tubos
cantidades adecuadas de antígeno y suero para
valorar y la dosis de C que es capaz de produ­
cir el 100% de lisis del sistem a hem olítico.
Después de una hora de incubación a 37°C se
agrega la cantidad correspondiente de glóbulos
rojos sensibihzados y se vuelve a incubar por
30 minutos. La ausencia de hemólisis indicará
especificidad entre el sistem a A g-A c que se
analiza. Esta mism a reacción puede transfor­
marse en cuantitativa si se hace en varios tubos
con distintas diluciones del suero para valorar.
Teniendo en cuenta que la curva sigmoidal
obtenida cuando se relaciona porcentaje de lisis
con cantidades de complemento demuestra que
la sensibilidad es m áxim a para lectu ras del
50% de hemólisis, actualmente las reacciones
de fijación del complemento se hacen utilizan­
do la dosis de éste capaz de producir este efec­
to. En estos casos, como se trabaja entre límites
muy estrechos, es indispensable determ inar,
para las condiciones en que se realiza la prueba
(fijaciones a 37°C o 4“C, tiempo de incuba­
ción), cuántas unidades de com plem ento se
consum en inespecíficamente, de m odo que la
198 Aspectos básicos de la inmunidad
F ig. 9-25. Representación esquem ática de la hem aglutinación pasiva. A, lo,s hem atíes son sensibilizados por tratam iento
previo con solución de ácido tánico. B, la bencidina bis-diazotizada actúa com o ligante del antígeno al hem atíe. C, la fija­
ción de hapteno al hem atíe se consigue directam ente com o consecuencia de la reacción que se produce entre el FD N B y
los restos de lisina de la m em brana de los eritrocitos.
cantidad para añadir en la reacción no sea insu­
ficiente. Los diferentes sistemas fijan inespecí­
ficam ente entre 2 y 4 unidades CRj,,; de ahí
que las dosis que se han de emplear en las reac­
ciones varían entre 3 y 5 unidades.
Para las reacciones cualitativas, las lecturas
se hacen directamente o por simple compara­
ción con testigos correspondientes a diferentes
grados de hemólisis del sistema hemolítico. En
F ig . 9-26. H em aglutinación pasiva. E! tubo de la izquier­
da corresponde a una reacción negativa; en los restantes
tubos pueden observarse distintos grados de positividad.
las cuantitativas, la determinación de la dilu­
ción que da 50% de hemólisis y su inversa, se
hace de manera similar a la indicada en valora­
ción de compilemento, ya sea graficando los re­
sultados obtenidos -dilución del suero versus
y
, o mediante el empleo de tablas con-
1 - y
feccionadas sobre la base de x =
y
que
1 - y.
dependerán del valor de 1/n. Éste está influido
por la concentración de hematíes del sistem a
hem olítico y volumen de la reacción; de ahí
que cuando se utilicen estas tablas deberán res­
petarse las condiciones de la reacción para la
que fueron calculadas.
Para establecer si un anticuerpo activa el .sis­
tema complemento por la vía alterna, se hace
interaccionar el com plejo A g-Ac con suero
fresco de cobayo (fuente de complemento de tí­
tulo conocido) en presencia de etilenglicol dia-
m in o tetraacético (EGTA) 10 mM y Mg^+ 2
mM, estableciéndose después de 1 hora de in­
cubación a 37°C y previa recalcificación con
Ca^+ hasta 4 mM, el título del complemento re­
sidual. Como el EGTA bloquea Ca^+ pero no
 Reacción antígeno-anticuerpo in vitro 199

A gl

KC1

+ NO LISIS

1 SH
Reacción Ag-Ac específica

Fig. 9-27. R epresentación esquem ática de una reacción de fijación del com plem ento. A g l y A g2 antígenos.- A c l , anti­
cuerpo. C , com plem ento, S H , sistem a hem olítico.

Mg^+, si hubo consumo de complemento signi­
fica que su activación tuvo lugar por la vía al­
terna, ya que el Ca^“' es indispensable para que
la vía clásica fimcione.
OTROS TIPOS DE REACCIONES
USADAS
nismos sensibilizados por sus correspondientes
anticuerpos pueden fijarse a hematíes en e! to­
rrente circulatorio y ser fagocitados m ás fácil­
mente. Hoy se sabe que en este proceso inter­
vienen receptores celulares para componentes
del complemento, en especial para C3b.
Opsonización

Inmunoadherencia Cuando un elemento particulado, ya sea una

Hace algo más de medio siglo se describió la
reacción de la trombocitobarina, que resultaba
de la fijación de bacterias a plaquetas. Hoy co­
nocemos algo más sobre ese fenómeno, deno­
minado inmunoadherencia, que consiste en una
aglutinación basada en la capacidad que tienen
com plejos antígeno-anticuerpo-com plem ento
de adherirse a la superficie de partículas no
sensibilizadas, tales como glóbulos rojos, leu­
cocitos, plaquetas y gránulos de almidón. Este
mecanismo fue utilizado para la investigación
de anticuerpos específicos contra el Treponema
pallidum.
Ha sido observado in vivo y se lo relacionó
con la fagocitosis. Se considera que microorga­
bacteria, hematíe, etc., penetra en un vertebra­
do adulto, es fagocitado por las células fagocí­
ticas. Las bacterias patógenas tienen en su su­
perficie estructuras que hacen que se vuelvan
resistentes a dicha acción. Los neumococos pa­
tógenos como consecuencia de la cápsula de
naturaleza poliosídica que los recubre, son difí­
cilmente fagocitados, a menos que previamente
hayan estado en contacto con su anticuerpo es­
pecífico, Esta acción previa del anticuerpo se
denomina opsonización, estando su acción fa­
cilitada por C3b, componente del complemento
derivado de C3.
Existen evidencias de que sueros de muchos
anim ales presentan anticuerpos opsonizantes
para numerosás bacterias. Probablemente ello
200 Aspectos básicos de la inmunidad
se deba a contactos previos con esos agentes
infectivos. La sugerencia de que una opsonina
específica es indispensable para la fagocitosis
de cualquier elemento particulado es objetable,
ya que, si bien su presencia es comprensible en
el caso de las bacterias, resulta difícil de expli­
car para partículas inertes. En los capítulos 3 y
5 se ha indicado la im portancia que los recep­
tores para Fe y C3b expresados en la membra­
na de los macrófagos, tienen en los m ecanis­
mos de opsonización.
Se ha descrito la existencia de proteínas séri­
cas no específicas opsonizantes. Una de ellas,
sensibilizante de bacterias, no es una gamma-
globulina, no actúa a 0“C, no es dependien­
te ni Mg^+ dependiente, no fija el complemento
y es inactivada por amoníaco o hidrazina.
La cantidad de opsonina presente en un sue­
ro determ ina su capacidad opsónica o índice
opsonocitofágico, que se establece estudiando
comparativamente la fagocitosis inducida por
dicho suero y uno normal.
Los anticuerpos citofílicos, con capacidad
para fijarse a receptores particulares de los ma­
crófagos, son opsonizantes. For este m ecanis­
mo logran que los antígenos retenidos a nivel
de la membrana de estas células sean incorpo­
rados al citoplasma.
NEUTRALIZACIÓN O INHIBICIÓN
DE EFECTO
Cuando un antígeno tiene una actívidad de
fácil medición, puede ser identificado y cuanti-
ficado mediante su neutralización por el anti­
cuerpo específico.
Las exotoxinas bacterianas de alto poder to-
xigénico en los animales receptivos no ejercen
su efecto si previam ente han sido mezcladas
con su correspondiente antisuero. Lo mismo
ocurre con los antígenos virales, capaces de
aglutinar eritrocitos de diferentes especies ani­
males o de ejercer citopatogenia sobre cultivos
celulares. Ambos efectos pueden ser inhibidos
por el anticuerpo específico, lo que permite la
identificación y cuantificación del número de
partículas virales por unidad de volum en del
material analizado.
Uno de los métodos más sensibles para la
detección de anticuerpos es el de la neutraliza­
ción de bacteriófagos por sus correspondientes
anticuerpos. Al inhibirse su capacidad infecti­
va, no form an placas de lisis cuando se los
siembra en placas de agar juntam ente con la
bacteria sensitiva. Usando diferentes diluciones
de antisuero puede establecerse cuál es la que
produce una disminución del 50% de las placas
de lisis. La inversa de esa dilución expresará el
título de anticuerpos en el suero.
Otro ejemplo de cuantificación de anticuer­
pos por este método es el dosaje de antiestrep­
tolisina O por la inhibición de la actívidad líti­
ca que la estreptolisina tiene sobre los glóbulos
rojos de conejo.
BIB L IO G R A FÍA
1. A xelsen, N. H. "H igh resolution electrophoresis and
im m unofixation. Butterw orths. B oston, 1987.
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tion to im m unochem ical analysis. En: M ethods in M e ­
dical Research. Vol 5, pág 335. Y ear B ook M ed Publ.
C hicago, 1962.
19. Rose, N R y B igazzi, P E (Ed): M ethods in Im m uno-
d ia g n o sis.'H 'ú ty , 1973.
20. R o se, N R , C o n w ay d e M a c a rio , E ,, F a h e y , J. L .,
F riedm an, H .. Pen, G .M . "M anual o f clinical la b o ra ­
tory Im m u n o lo g y" 4 “ ed. Amer. Society for m icrobiol.
W ashington DC, 1992.
21. W eir, D M (Ed): Hcmdbook o f Experim ental Im m uno-
logy. Vols I-II. B lackw ell Sci Publ. O xford. 1986.
22. W illiam s, C A y Chase, M W (Ed): M ethods in Im mu-
n o lo g y a n d im m u n o c h e m is tr y . V o ls l - l l - l l l , IV , V.
A cadem ic Press. N Y ork, 1967, 1968, 1970.
El complejo mayor de histocompatibilidad
y su relación con la respuesta inmune
M. LEONARDO SATZ
CONCEPTOS GENERALES
El complejo mayor de histocom patibilidad
(CMH) es un locus genético muy polimórfico
que codifica la expresión de una serie de gluco­
proteínas que presentan péptidos antigénicos
para su reconocimiento por los linfocitos T. El
CMH, llamado HLA en el humano y H-2 en el
ratón, está presente en todos los vertebrados su­
periores estudiados hasta el presente. El CMH
fue identificado originalmente por el papel que
juega en el rechazo de los trasplantes. Cuando
se injertan tejidos de un individuo a otro de la
misma especie, la presencia de alelos idénticos
o distintos en los productos codificados por el
CMH, determina la sobrevida del injerto. Hoy
se sabe que las moléculas de histocompatíbili-
dad (MHC) presentes en la superficie celular
participan directamente del reconocimiento de
un Ag por parte de los linfocitos T colaborado­
res y citotóxicos. En este capítulo se describe la
estructura y organización del sistema H-2 y los
fenóm enos inm unológicos asociados con el
CMH. En el capítulo 29 se describe el sistema
HLA, su importancia en los trasplantes y las en­
fermedades asociadas con él.
La historia del CMH com ienza en 1903,
cuando Jensen logró propagar 19 veces un car­
cinoma murino en su laboratorio, pero fracasó
cuando intentó trasplantar el mismo tum or a
ratones de otro laboratorio. En 1914 se propu­
so la existencia de genes dom inantes como
responsables de la susceptibilidad al trasplante
tumoral y que su rechazo era consecuencia de
mecanismos activos de defensa del huésped.
H acia 1933 Landsteiner y Haldane propusie­
ron que la inm unidad estaba dirigida contra
aloantígenos presentes en los tejidos, similares
i n
a los de grupos sanguíneos, más q u e contra
Ags tumorales. Estas ideas llevaron a Gorer en
1936 a investigar los Ags presentes en los eri­
trocitos de ratón. Mostró la presencia de cuatro
grupos sanguíneos, uno de los cuales, el Ag 2,
correlacionó su presencia en tumores con cier­
tas cepas de ratones que poseían el m ism o Ag
2. Asimismo, los ratones que rechazaban el tu­
mor tenían altos títulos de Acs hemaglutinan-
tes contra el Ag 2. En la década del ’40, Meda-
war y col. demostraron las bases inmunológi­
cas del rechazo de trasplantes, comparando in­
jertos de piel entre animales alogeneieos. Un
ratón de raza A rechaza un injerto de piel de
raza B en aproximadamente 12 días. Si luego
del rechazo se lo desafía nuevamente con piel
B, se produce un rechazo acelerado (7 días).
Esta memoria inmunológica es específica: un
desafío con piel C se rechaza a los 12 días y
además es sistémica: el injerto se rechaza ace­
leradam ente con independencia d el sitio de
implante. M edawar demostró tam bién que se
produce el rechazo acelerado si se inyecta pre­
viamente al animal con células de otros tejidos
(por ej., bazo) del mismo donante. Mitchison
(1957) mostró que la respuesta inm une respon­
sable del rechazo acelerado puede ser transfe­
rida de ratones vírgenes de tratam iento me­
diante células linfoides de animales que pre­
viamente han rechazado un injerto. H oy se sa­
be que el rechazo se produce por una reacción
inflam atoria mediada por linfocitos T CD4 y
p o r linfocitos T citotóxicos CDS. P o r esos
años, Snell propuso designar como genes y an­
tígenos de histocompatibilidad a los responsa­
bles del rechazo de tejidos y llamó H -2 al lo­
cus que codifica para el Ag 2. Emprendió, ade­
más, la tarea de generar cepas de ratones sin-
200 Aspectos básicos de la inmunidad
se deba a contactos previos con esos agentes
infectivos. La sugerencia de que una opsonina
específica es indispensable para la fagocitosis
de cualquier elemento particulado es objetable,
ya que, si bien su presencia es comprensible en
el caso de las bacterias, resulta difi'cil de expli­
car para partículas inertes. En los capítulos 3 y
5 se fia indicado la im portancia que los recep­
tores para Fe y C3b expresados en la membra­
na de los macrófagos, tienen en los m ecanis­
mos de opsonización.
Se ha descrito la existencia de proteínas séri­
cas no específicas opsonizantes. Una de ellas,
sensibilizante de bacterias, no es una gamma-
globulina, no actúa a 0“C, no es dependien­
te ni Mg^+ dependiente, no fija el complemento
y es inactivada por amoníaco o hidrazina.
La cantidad de opsonina presente en un sue­
ro determ ina su capacidad opsónica o índice
opsonocitofágico, que se establece estudiando
comparativamente la fagocitosis inducida por
dicho suero y uno normal.
Los anticuerpos citofílicos, con capacidad
para fijarse a receptores particulares de los ma­
crófagos, son opsonizantes. Por este m ecanis­
mo logran que los antígenos retenidos a nivel
de la membrana de estas células sean incorpo­
rados al citoplasma.
NEUTRALIZACIÓN O INHIBICIÓN
DE EFECTO
Cuando un antígeno tiene una actividad de
fácil medición, puede ser identificado y cuanti­
ficado mediante su neutralización por el anti­
cuerpo específico.
Las exotoxinas bacterianas de alto poder to-
xigénico en los animales receptivos no ejercen
su efecto si previam ente han sido mezcladas
con su correspondiente antisuero. I_^o mismo
ocurre con los antígenos virales, capaces de
aglutinar eritrocitos de diferentes especies ani­
males o de ejercer citopatogenia sobre cultivos
celulares. Ambos efectos pueden ser inhibidos
por el anticuerpo específico, lo que permite la
identificación y cuantificación del número de
partículas virales por unidad de volum en del
material analizado.
Uno de los métodos más sensibles para la
detección de anticuerpos es el de la neutraliza­
ción de bacteriófagos por sus correspondientes
anticuerpos. Al inhibirse su capacidad infecti­
va, no form an placas de lisis cuando se los
siembra en placas de agar juntam ente con la
bacteria sensitiva. Usando diferentes diluciones
de antisuero puede establecerse cuál es la que
produce una disminución del 50% de las placas
de lisis. La inversa de esa dilución expresará el
título de anticuerpos en el suero.
Otro ejemplo de cuantificación de anticuer­
pos por este método es el dosaje de antiestrep-
tolisina O por la inhibición de la actividad líti­
ca que la estreptolisina tiene sobre los glóbulos
rojos de conejo.
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A cadem ic Press. N Y ork, 1967, 1968, 1970.
El complejo mayor de histocompatibilidad
y su relación con la respuesta inmune
M. LEONARDO SATZ
CONCEPTOS GENERALES
El complejo mayor de histocom patibilidad
(CMH) es un locus genético muy polimórfico
que codifica la expresión de una serie de gluco­
proteínas que presentan péptidos antigénicos
para su reconocimiento por los linfocitos T. El
CMH, llamado HLA en el humano y H-2 en el
ratón, está presente en todos los vertebrados su­
periores estudiados hasta el presente. El CMH
fue identificado originalmente por el papel que
juega en el rechazo de los trasplantes. Cuando
se injertan tejidos de un individuo a otro de la
misma especie, la presencia de alelos idénticos
o distintos en los productos codificados por el
CMH, determina la sobrevida del injerto. Hoy
se sabe que las moléculas de histocompatíbili-
dad (MHC) presentes en la superficie celular
participan directamente del reconocimiento de
un Ag por parte de los linfocitos T colaborado­
res y citotóxicos. En este capítulo se describe la
estructura y organización del sistema H-2 y los
fenóm enos inm unológicos asociados con el
CMH. En el capítulo 29 se describe el sistema
HLA, su importancia en los trasplantes y las en­
fermedades asociadas con él.
La historia del CMH com ienza en 1903,
cuando Jensen logró propagar 19 veces un car­
cinoma murino en su laboratorio, pero fracasó
cuando intentó trasplantar el mismo tum or a
ratones de otro laboratorio. En 1914 se propu­
so la existencia de genes dom inantes como
responsables de la susceptibilidad al trasplante
tumoral y que su rechazo era consecuencia de
mecanismos activos de defensa del huésped.
H acia 1933 Landsteiner y Haldane propusie­
ron que la inm unidad estaba dirigida contra
aloantígenos presentes en los tejidos, similares
i n
a los de grupos sanguíneos, más q u e contra
Ags tumorales. Estas ideas llevaron a Gorer en
1936 a investigar los Ags presentes en los eri­
trocitos de ratón. Mostró la presencia de cuatro
grupos sanguíneos, uno de los cuales, el Ag 2,
correlacionó su presencia en tumores con cier­
tas cepas de ratones que poseían el m ism o Ag
2. Asimismo, los ratones que rechazaban el tu­
mor tenían altos títulos de Acs hemaglutinan-
tes contra el Ag 2. En la década del ’40, Meda­
war y col. demostraron las bases inmunológi­
cas del rechazo de trasplantes, comparando in­
jertos de piel entre animales alogeneieos. Un
ratón de raza A rechaza un injerto de piel de
raza B en aproximadamente 12 días. Si luego
del rechazo se lo desafía nuevamente con piel
B, se produce un rechazo acelerado (7 días).
Esta memoria inmunológica es específica: un
desafío con piel C se rechaza a los 12 días y
además es sistémica: el injerto se rechaza ace­
leradam ente con independencia d el sitio de
implante. M edawar demostró tam bién que se
produce el rechazo acelerado si se inyecta pre­
viamente al animal con células de otros tejidos
(por ej., bazo) del mismo donante. Mitchison
(1957) mostró que la respuesta inm une respon­
sable del rechazo acelerado puede ser transfe­
rida de ratones vírgenes de tratam iento me­
diante células linfoides de animales que pre­
viamente han rechazado un injerto. H oy se sa­
be que el rechazo se produce por una reacción
inflam atoria mediada por linfocitos T CD4 y
p o r linfocitos T citotóxicos CDS. P o r esos
años, Snell propuso designar como genes y an­
tígenos de histocompatibilidad a los responsa­
bles del rechazo de tejidos y llamó H -2 al lo­
cus que codifica para el Ag 2. Emprendió, ade­
más, la tarea de generar cepas de ratones sin-
202 Aspectos básicos de ia inmunidad
geneicos o consanguíneos, m ediante aparea­
mientos repetidos entre hermanos en genera­
ciones sucesivas. Utilizando este método de en-
docría por más de 20 generaciones, los anima­
les terminan siendo idénticos para todos sus
cromosomas. También se produjeron cepas de
ratones congénicos, es decir cepas que sólo di­
fieren en su H-2 y poseen idéntico el resto de
su genoma. La disponibilidad de cepas congé-
nicas y singeneicas permitió, en las décadas si­
guientes, mapear el sistema H-2, identificar sus
genes, sus productos y sus funciones. Permitió
tam bién describir la presencia de genes que
mapean fuera del H-2, cuya disparidad también
conduce al rechazo de injertos, aunque en ge­
neral el rechazo es más lento; se los denomina
loci menores de histocompatibilidad.
En la década del ’70 (más de 50 años luego
de su descripción original como antígenos de
trasplante) surgieron las prim eras evidencias
experimentales que mostraron que los linfoci­
tos T requieren para su activación, del recono­
cimiento simultáneo del antígeno junto a MHC
presente en la superficie de células presentado­
ras. Este fenómeno se denominó restricción en
el reconocimiento T p o r el CMH. En la década
del ’80 se demostró que, a diferencia de los
Acs, el receptor T (véase cap. 7) interactúa con
epitopes secuenciales del antígeno (péptidos
cortos -d e 8 a 20 am inoácidos- generados por
procesamiento intracelular) acarreados por las
MHC. Existen dos tipos de MHC que cumplen
esta función de presentación antigénica, llama­
das M HC de clase 1 y de clase II, que presentan
péptidos antigénieos a los linfocitos T CD8 y a
los T CD4, respectivamente.
I
Productos K A|3AaE[3
Clase II II II
Fig. 10-1. Productos de los genes de las regiones Q, T y M (véase inform ación en el texto).
O RG A N IZA C IÓ N G EN ÉTICA
DEL SISTEMA H-2
El sistema H-2 está ubicado en el cromoso­
ma 17, a unos 15 centimorgans (cM) del cen-
trómetro (fig. 10-1). Al principio se creyó que
el H-2 codificaba para un solo producto. Los
estudios posteriores mostraron la presencia de
recombinaciones dentro del sistema H-2 y hoy
se conocen varios productos y un gran número
de genes presentes en él. Se divide en cuatro
regiones, designadas con las letras mayúsculas
K, 1, S y D. M ediante inmunizaciones aloge­
neicas, se obtuvieron Acs capaces de reconocer
los productos codificados por las diferentes re­
giones del PL2 {aloanticuerpos). Estos Acs
fueron utilizados para identificar la expresión
de las MHC en la superficie celular por inm u­
nofluorescencia y citotoxicidad m ediada por
complemento, y para su caracterización bioquí­
mica y funcional. Las regiones K y D codifican
para MHC de clase I y las regiones LA e LE
codifican para MHC de clase IL La región S
codifica para algunos de los componentes del
sistema complemento y aun cuando sus funcio­
nes inmunológicas no tienen nada que ver con
la de las MHC, algunos autores las denominan
moléculas de clase III. Los extremos del H-2,
definidos por las regiones K y D, están separa­
dos por aproximadamente 0,5 cM, que corres­
ponderían a unas 1.500 kilobases (kb) de ADN.
A causa del estrecho ligamiento que poseen en­
tre sí, los alelos presentes en cada locus se here­
dan en bloque durante la segregación de los cro­
mosomas homólogos. Es así como la descen­
dencia hereda lo que se denomina un haplotipo;
Ecx C4 Qa^ TL Hmt
SIp Q a,
C.
Bf

C uadro 10-1. Designación de los productos de clase / y clase II en diversas cepas endocriadas
de ratones
Cepa H aplotipo
Balb/c H -2‘'
AKR
BIO H-2»
B 10.D 2 H -2‘‘
BIO .BR B-2'‘
B IO .HTG H~2*
B IO .AQ R H-2y'
En las ce p as re cornbinantes, la letra m inúscula que d e s ig n a el ale lo p re sen te en ca d a p ro d u c to es la co rresp o n d ien te de a c u erd o c o n su ori­
gen, au n q u e la d esig n ac ió n d el hap lo tip o hl-2 de d icha c e p a llev a una letra o d e n o m in ac ió n p ro p ia diferente.
0 sea, un conjunto de especificidades que se he­
redan juntas. Por otra parte, cabe destacar que la
expresión de estos genes es codominante.
El haplotipo H-2 de una cepa endocriada de
ratones se designa con una letra minúscula su-
perscripta al término H-2. Por ejemplo, las ce­
pas Balb/c y DBA/2 son H-2^ las cepas AKR y
C3H son H-2'‘, la cepa BIO es H-2^ etc. Hay
muchas cepas congénicas construidas sobre el
“b a c k g ro u n d ” B IO . P or eje m p lo , la cep a
B10.D2 es H -2^ la BIO.BR es H-2^ etc. Los
alelos de los productos codificados por las dife­
rentes regiones del H-2 también se denominan
con una letra m inúscula superscripta (véase
cuadro lO-l). Existen cepas recombinan tes que
poseen alelos de un aplotipo en algunos de sus
productos y alelos de otro en los productos res­
tantes. Por ejemplo, la cepa BIO.HTG, congé-
nica del BIO, posee alelos d en las regiones K,
1 y S y alelo b en la región D. Hay cepas que
poseen más de un suceso de recom binación
(véanse ejemplos en el cuadro 10-1). Existen
en el cromosoma 17, en posición telomérica a
la región D, otros loci que codifican para molé­
culas estructuralmente similares a las de clase I
[en las regiones Q, T y M (véase fig. 10-1)].
A lgunos de los productos de estas regiones
pueden presentar péptidos antigénicos (véase
más adelante).
ESTR U CTU RA Y EX PR ESIÓ N
DE LAS M O L ÉC U LA S D E CLASE I
Dentro del H-2, la región K codifica para la
expresión de una molécula de clase 1 llamada
H-2K. La región D también codifica para la ex­
presión de moléculas de clase I, aunque su nú­
mero varía de acuerdo con la cepa de ratón: to­
das poseen al m enos una p roteína llam ada
H-2D, mientras que sólo algunas cepas expre­
san además proteínas llamadas H-2L. La distri­
bución de las MHC de clase I en el organismo
es muy amplia y están presentes en práctica­
mente todos los tejidos incluidos los eritrocitos
El complejo mayor de histocompatibilidad 203
Regiones H -2
K I D
H -2K ‘¡ ]-A‘' 1-E" H -2 D ‘'
H-2K'-' I-A" 1-Ek EI-2D''
H-2K'> I-A^' EE» H -2D »
H -2K" I-A ‘' I-&' H -2 D ‘'
H-2K^ 1-A‘ EE'- H-2Dk
H -2K “ I-A^' I-E"* H -2 D '’
H -2K “ I-A “ I-Ek H -2 D ‘'
y las plaquetas. La densidad de expresión no es
homogénea: es más alta en células de tejidos
linfoides y muy baja, por ejemplo, en el híga­
do. Están ausentes en los espermatozoides, en
los primeros estadios embrionarios y en el tro­
foblasto, En el hombre no se expresan en los
eritrocitos.
Las MHC de clase I están constituidas por
dos p o lip ép tid o s: una caden a p esad a a , de
aproxim adam ente 340 aminoácidos d e longi­
tud, glucosilada, de alrededor de 44 kD de ta­
maño molecular, asociada no covalentemente a
una cadena liviana llamada p2-microglobulina,
no glucosilada, de aproxim adam ente 12 kD
(fig. 10-2). La cadena a está codificada por ge­
nes dentro del CMH, mientras que el gen para
la P2-microglobulina está ubicado en un cro­
m osoma distinto (2 en el ratón). La cadena pe­
sada posee tres dominios proteicos globulares,
llamados a l , a 2 y a3, que se exponen en la su­
p erficie externa de la mem brana plasm ática
(fig. 10-2). Cada dominio posee aproxim ada­
m ente 90 aminoácidos de longitud, siendo el
dominio a l el que contiene el extremo amino-
terminal y el dominio a3 el más cercano a la
m em brana plasm ática. La molécula continúa
con un segmento transmembránico hidrofóbico
de alrededor de 30 a 40 aminoácidos de longi­
tud y finalmente termina en el interior de la cé­
lula eon un segmento hidrofílico de unos 20 a
30 aminoácidos, que contiene el carboxilo ter­
minal. Los dominios globulares a 2 y a 3 po­
seen su estructura estabilizada por la presencia
de puentes disulfuro de cisteínas separadas en­
tre sí por aproxim adam ente 60 aminoácidos.
Las moléculas de clase I murinas tienen dos re­
siduos de hidratos de carbono, uno en la aspa­
ragina de posición 86 (dominio a l ) y el otro en
la asparagina de posición 176 (domino a2 ). Só­
lo el primero está presente en las moléculas hu­
manas. La [32-microglobulina es un polipéptido
globular, estabilizado por puentes disulfuro in­
ternos, unido no covalentemente a! dominio a3
de la cadena pesada. No sólo es idéntica en to­
das las moléculas de clase I, sino que también
204 Aspectos básicos de ia inmunidad

C la s e I

\\ I I \\ L //

Exterior

M em brana
p lasm ática

P éptido

F ig . 10-2. Estructura de las m oléculas de histocom patibilidad. A. Esquem a sim plificado de la organización de los dom i­
nios estructurales de las m oléculas de clase I y clase II. B. Sitio de presentación de péptidos en una M H C de clase I, según
la interpretación de los estudios cristalográficos, tal coino sería visto por el receptor T. L a flecha indica el extrem o N -ter­
minal. L a porción a -h élice superior y las cuatro lám inas ^ plegadas de la izquierda provienen del dom inio a l ; las otras
cuatro lám inas (3 y el a hélice inferior corresponden al dom inio a l . C. Interpretación artística de la m olécula de clase 1 en
la superficie celular.

lo es en todos los individuos de una especie y
es muy conservada entre varias especies.
L os p ro d u cto s H -2K y H -2D p o seen un
enorme polimorfismo poblacional: se conocen
más de 50 alelos para cada uno de ellos en la
naturaleza.
Las especificidades antigénicas presentes en
las MHC de clase I fueron originahnente carac­
terizadas por serología, es decir, m ediante
aloantisueros y posteriorm ente mediante Acs
monoclonales. Tanto los Acs policlonales co­
mo los monoclonales, se obtuvieron inm uni­
zando apropiadamente diversas cepas de rato­
nes con células linfoides o injertos de piel pro­
venientes de anim ales que difieren en uno o
más loci del CMH. Los análisis serológicos de­
mostraron la presencia de determinantes anti­
génicos o epitopes comunes a varias moléculas
de clase 1 distintas (ya sea derivadas de distin­
tos loci en un haplotipo dado o de un mismo
locus en distintos haplotipos) a las que se llamó
“especificidades públicas”. También se demos-
 El complejo mayor de histocompatibilidad
C u ad ro 10-2. Homología de la secuencia p ro ­
teica de diversos antígenos de clase I murinos
(expresada como %)
H -2D ‘' H -2D ‘’ H-2K'’
H-2D''
H-2D'’ 84
H-2K'’ 83
H-2K" 80 81 84
H-2L‘i 85
tro la presencia de epitopes tínicos o exclusivos
de una molécula determinada, a los que se lla­
mó “especificidades priv ad as” . La inm ensa
mayoría de los aloanticuerpos reconocen estas
especificidades aloantigénicas en los dominios
a l y a 2 de la cadena pesada. El análisis bio­
químico de la secuencia de aminoácidos de las
cadenas pesadas de clase I y el análisis de las
secuencias de ADN de los genes de clase I, de­
mostraron la existencia de una homología glo­
bal entre los diversos productos, que oscila en­
tre el 75% y el 99% a nivel de las proteínas.
Precisamente en los dominios a l y a 2 es don­
de aparece la mayor variabilidad entre los di­
versos productos, mientras que el dominio a3,
que une la (32 micro-globulina, es el más con­
servado. En el cuadro 10-2 se comparan las se­
cuencias de aminoácidos de varios productos
de clase I murinos. Como se ve claramente, no
existe m ayor hom ología entre los productos
alélicos de un mismo locus (H-2K'’ y H-2K‘*)
que la homología existente entre los productos
de distintos loci de un mismo haplotipo o dis­
tinto. Así, por ejem plo, H-2K'^ y H-2K'* son
84% homólogos mientras que H-2L^' y H-2D<^
son 85% homólogos. Dicho de otra forma, la
homología global de los productos determina la
ausencia de características propias en las molé­
culas codificadas por cada región.
A diferencia de los antígenos H-2K y H-2D,
los productos de los genes de las regiones Q, T
y M (véase fig. 10-1) exhiben un polimorfismo
genético muy limitado. Estructuralmente, estas
moléculas poseen las características generales
de todos los productos de clase 1: los dominios
a l , «2 y a3 poseen longitud similar; se conser­
van las cisteínas requeridas para la formación
de puentes disulfuro; el dominio a3 , que une
p2 microglobulina, muestra una homología de
90% con el de otros pro d u cto s de clase 1,
mientras que los dominios al y a2 conservan
un 60-80% de homología. Su función biológica
se discute más adelante.
E structura tridimensional. En los últimos
años se ha determinado la estructura cristalo­
gráfica de la MHC de clase I murina H-2K'’ y
de varios alelos de clase I humanos (HLA-A2,
205
HLA-Aw68 y HLA-B27; véase cap. 29). To­
dos ellos coinciden en una estructura espacial
que describiremos a continuación. Los domi­
nios a l y a2 se combinan para ensamblar una
estructura de tipo fo sa acanalada, localizada en
la porción más externa de la molécula, y que
constituye el sitio de unión de p ép tid o s (fig.
10-2). Uno de los surcos está definido por una
estructura de a-h éh ce del dominio a l (entre
los aminoácidos 50 y 84) y el otro está definido
por una a-hélice del dominio a 2 (entre los resi­
duos 138 y 180). La base de la fosa está consti­
tuida por ocho láminas ¡3 plegadas, cuatro apor­
tadas por cada dominio. Las dim ensiones de
esta estructura son 25 A° de largo x 10 A“ de
ancho y 11 A° de profundidad, que brinda sitio
suficiente para acom odar péptidos pequeños
(menores que 15 aminoácidos en alfa-hélices o
péptidos menores en conformación m ás exten­
dida). Toda esta estructura estaría apoyada so­
bre un armazón determinado por los dominios
más conservados a3 y (32 microglobulina (fig.
10-2). El análisis comparativo de varios alelos
de clase I muestra que la mayor parte de los re­
siduos pohmórficos implican aminoácidos lo­
calizados en el sitio de unión de péptidos.
Topografía de la unión de p ép tid o s a las
M H C de clase 1. Uno de los detalles m ás inte­
resantes en estos estudios de difracción de ra­
yos X, es el hallazgo de un material “electrón
denso” en esta fosa acanalada, que co-purifica
con la MHC. El estudio de este m aterial esta­
bleció que su naturaleza es ajena a la secuencia
conocida de las moléculas de clase I. L os anáh­
sis cristalográficos de mayor resolución, reve­
lan imágenes que se interpretan com o nona-
péptidos presentes en una conformación exten­
dida. Esta observación es consistente con otros
estudios que caracterizaron a péptidos eluidos
de MHC de clase I purificadas y donde la lon­
gitud hallada para los mismos fue tam bién de 9
aminoácidos (véase más adelante). El sitio de
unión de péptidos de la MHC de clase 1 tiene
seis “bolsillos” (llamados A,B,C,D,E y F), que
interactúan con las cadenas laterales del pépti­
do unido (fig. 10-3). Los bolsillos A y E, que
definen el extremo “derecho” e “izquierdo” del
sitio de unión, están estructurados por residuos
bastante conservados en la MHC de clase I; es­
to determina que los extremos N- y C- de los
péptidos se asocien siempre con A y E respecti­
vam ente, y la orientación de los m ism os sea
siempre la misma. Además, la longitud preferi­
da será la mínima necesaria para cubrir la re­
gión central del sitio de unión y optimizar la in­
teracción de los extremos. La longitud de los
péptidos unidos se definió tanto por métodos
cristalográficos como por métodos bioquímicos
mencionados más adelante. La figura 10-3 es­
quematiza la orientación de las cadenas latera-
206 Aspectos básicos de la inmunidad

Bolsillo: A B D C E

F ig. 10-3. Representación esquem ática de ia orientación de las cadenas laterales de un nonapéptido unido a una M H C de
clase I. Las posiciones P I , P4 y P5 protruyen hacia el solvente y por ello son accesibles al reconocim iento por el TCR . Las
cadena.s laterales de P2, P3, P6 y P9 m iran hacia el interior del sitio de unión, se acom odan en los bolsillos correspondien­
tes y no están accesibles al TCR. En algunos alelos, son las cadenas laterales de P5 (en vez de las de P6) las que se acom o­
dan en el bolsillo C.

les de los aminoácidos en un nonapéptido uni­ determinante importante en la especificidad de

do a una MHC de cJase I. la unión. Interactiia con el bolsillo F, cuyo resi­
Ligandos peptídicos de las M H C de clase duo 116 es extrem ad am en te p o lim ó rfico y
I. Mediante métodos bioquímicos se puede pu­ afecta a la naturaleza de la unión. Los péptidos
rificar grandes cantidades de una determinada típicos de cada alelo de clase 1, también poseen
MHC, eluir de ella los péptidos que posee aso­ un am inoácido conservado en la posición 2,
ciados a su sitio de unión y caracterizar la se­ que interactiia con el bolsillo B. Ocasionalmen­
cuencia aminoacídica de los mismos. Este aná­ te, algunos alelos exhiben sitios de anclaje
lisis ya se realizó para más de diez alelos de complementarios en la posición 3 del péptido,
clase I diferentes (cuadro 10-3) y permitió con­ mientras que en otros hay una fuerte selectivi­
cluir que; (a) las MHC extraídas de células no dad en la posición 5; curiosamente en estos úl­
infectadas, poseen en su sitio de unión péptidos timos no hay restricción en la posición 2. El
derivados de proteínas celulares; (b) el 80% de cuadro 10-3 muestra los motivos estructurales
los péptidos eluidos son de 8-9 residuos y el conservados de los péptidos específicos para
20% restante pueden ser m ás largos (hasta diversas MHC clase I murinas. Considerando
10-12 aminoácidos); (c) los péptidos unidos a la flexibilidad que permiten ciertas posiciones
cada alelo poseen patrones o motivos estructu­ de los péptidos, resulta claro que un alelo HLA
rales conservados. Habitualm ente el extremo dado tendrá la capacidad de unir miíltiples pép­
C-terminal del péptido (posición 8 o 9) es un tidos (se refiere a uno por vez). La totalidad
potencial de péptidos capaces de ser unidos por
un alelo de clase I resultará de aplicar combina­
C u a d ro 10-3. Residuos aminoacídicos críti­ toria de los diversos aminoácidos que puedan
cos hallados en péptidos específicos de ciertos ocupar posiciones flexibles. Se estima que un
alelos de clase I murinos determinado alelo de clase I puede tener en la
superficie celular, unos 1000 péptidos diferen­
P2 P3 P5 P7 P8/9 tes, con cientos de copias de c/u. La superficie
de una célula tendría unos 10.000 péptidos di­
A lelo de clase I ferentes (exhibidos por diversos alelos de clase
H -2D ‘'* G P I/L
I), de los que 2.000 serían las especies más
H-2D>’* N L/M abundantes.
H -2K ‘’ F/Y L Las restricciones estructurales que poseen
H -2K ‘'* y 1/L/V los péptidos en ciertos residuos para poder inte­
H -2L“ P
H-2K'' E r ractuar con un determinado alelo (así como la
Q a-2“ H L/I flexibilidad en los aminoácidos que pueden ex­
H -2M 3 péptidos N -form ilados hibirse en las otras posiciones) fue confirmada
en muchos casos, preparando péptidos sintéti­
P ara los alelo s in dicados con {*), un 2 0 % d e los pép tid o s son 10-12
am in o ác id o s de longitud. E n esto s casos, se o b s e rv a el m ism o am i­ cos, los que usaron en ensayos de “binding” a
n o ác id o esp e cífico en la P 10-P 12, en lu g ar de P9- E n el re s to de las MHC de clase I purificadas. Todos estos traba­
p o sicio n es (P4, P 7, etc.) hay cie rta flex ib ilid ad en cu a n to ai am i­
n o ác id o q u e p u e d e usarse, a u n q u e hay algunos estric ta m en te p ro h i­ jos permiten identificar y predecir epitopes in-
b idos; su p re sen cia in h ib e to lah iren te su u n ió n a ia M H C . m unogénicos de antígenos m icrobianos, que

pueden ser reconocidos por Hnfocitos T citotó­
xicos; son muy útiles por lo tanto, para el desa­
rrollo de vacunas.
B iosíntesis. La biosíntesis y ensamblado de
una MHC de clase I ocurre en el retículo endo­
plasmático. El correcto plegamiento de la mo­
lécula de clase I no .sólo requiere de la cadena
liviana p2-microglobulina, sino de la unión de
un péptido en su sitio de presentación. Ciertas
células mutantes con defectos en la capacidad
de generar o traslocar péptidos hacia el retícu­
lo endoplasmático (véase cap. 2), expresan ba­
jos niveles de MHC de clase I en la superficie;
estas moléculas son inestables (corta vida me­
dia) y carecen de péptidos en su sitio de pre­
sentación.
El origen de los péptidos que se incorporan
durante el ensamblado de la molécula de clase
I puede ser básicamente de tres tipos: (a) Deri­
vados de la degradación de proteínas endóge­
nas propias de las células; (b) en el caso de cé­
lulas infectadas con patógenos intracelulares,
péptidos derivados de proteínas extrañas o aje­
nas a la célula. Así, por ejemplo, se ha eluido e
identificado de células normales, péptidos co­
rrespondientes a proteínas celulares abundan­
tes, tales como histonas, proteínas ribosomales
y de estrés térmico. A partir de células infecta­
das con determinados virus, se logró eluir y ca­
racterizar epitopes peptídicos virales. Los pép­
tidos descritos en (a) y (b) utilizan la llamada
vía endógena de procesamiento y presentación
antigénica (véase cap. 2). (c) En pequeña pro­
porción, los péptidos señal (leader peptide) ge­
nerados durante la traslocación de proteínas al
retículo endoplásmico, también pueden unirse
a las MHC de clase I.
GEN
Cadena pesadal
de clase I
Aminoácidos ^ 183
F ig. 10-4. E structura de un gen de histocom patibilidad dé clase I. L os exones (E) se indican con rectángulos verdes y los
intrones (I) con rectángulos blancos. En la proteína se indican los tres dom inios externos a l , a 2 y a 3 , el transm em bránico
(TM ) y el citoplasm ático (CIT). El exón 1 codifica para el péptido señal (L). El segm ento 3 ’U T (rectángulo azu l) contiene
secuencias presentes en el A R N m pero ausentes en la proteína.
El complejo m ayor de histocompatibilidad 207
GENES DE CLASE I
Estructura
Con el advenimiento de las técnicas de inge­
niería genética, a principios de la década de]
’80 se ai.slaron los primeros ADNc de molécu­
las de clase I murinas y humanas. Estos clones
fueron utilizados inm ediatam ente p ara aislar
los primeros clones genómicos de clase 1. La
estructura y organización de estos g enes fue
determinada al obtener su secuencia de nucleó­
tidos. Se han secuenciado varias decenas de ge­
nes de clase I y todos ellos poseen la organiza­
ción que se muestra en la fig. 10-4. Están cons­
tituidos por ocho exones separados entre sí por
siete intrones. Los exones se corresponden con
los dominios estructurales presentes en la mo­
lécula de clase I (fig. 10-4). El primer exón co­
difica para el péptido señal; los exones 2, 3 y 4
codifican los dominios externos a l , a 2 y a3
respectivamente; el exón 5 codifica para el seg­
m ento hidrofóbico transmembránico y los exo­
nes 6, 7 y 8 codifican el dominio intracitoplás-
mico.
Organización genética
Además de los genes que codifican para las
clásicas m oléculas H-2K, D y L, el genoma
m urino contiene unos 30-40 genes de clase I
(fig. fO-5). La mayoría de ellos m apea en las
regiones Q, T y M. La organización molecular
de estos genes está bien estudiada en varias ce­
pas de ratones y muestra que el número de ge­
nes de clase I en las diversas regiones del H-2,
varía en las mismas (véase más adelante). La
4kb
E4 E5 E6 E7 E8 3 ’UT
13
u3 /TM
■r"
275 / \ 348
315 326 339
CIT
208 Aspectos básicos de la inm unidad
caracterización de cada uno de estos genes se
realizó mediante diferentes tipos de estudios.
En primer lugar, el ADN de los clones genómi­
cos fue introducido en fibroblastos de ratón y
su eventual expresión se evaluó mediante reac­
ciones serológicas con Acs de la especificidad
apropiada. En segundo lugar, y como se men­
cionó antes, se determinó la secuencia nucleotí­
dica de muchos de ellos, la que pudo ser com­
parada con datos parciales de secuencias ami-
noacídicas. Finalmente, la posición relativa de
estos genes en el genoma se determinó compa­
rando los polimorfismos presentes en cepas de
ratones congénicas recombinantes para las dis­
tintas regiones.
La figura 10-5 muestra un esquema de la or­
ganización de los genes de clase I identificados
en los ratones Balb/c (H-2d). En la región K se
han identificado dos genes de clase 1, separa­
dos unas 15 kb entre sí. Uno de ellos corres­
ponde al gen que codifica para la molécula H-
2K. El gen vecino no parece ser funcional. A
unas 75 kb del gen H-2K se halla un gen de
clase II denominado A(33. Este gen fue mapea-
do en la región I del H-2 por lo que el gen
H-2K fue orientado hacia la región 1 y su veci­
no hacia el centrómero (fig. 10-5). La presencia
de estos dos genes de clase l en la región K fue
verificada en varias cepas de ratones.
La región D del sistema H-2 posee un ntime-
ro variable de genes de clase I. Por ejemplo, las
cepas H-2*’ y H-2'‘ poseen sólo el gen que codi­
fica para H-2D, mientras que la cepa H-2'“ po­
see en dicha reg ió n cin co genes; uno para
H-2L, otro para H-2D, y otros tres genes no
funcionales (fig. 10-5). Por su posición homó­
loga en el genoma (vecino a la región Q), H-2L
se corresponde con el gen llamado H-2D en las
cepas que sólo poseen un sólo gen en esta re­
gión.
La región H-2Q
A menos de 100 kb comienzan los genes de
la región Q, cuyo número oscila entre 5 y 10
según las cepas de ratones. Se numeran conse­
cutivamente y se designa en superscripto la ce­
pa correspondiente; por ejemplo, Q P , Q2*’, etc.
El haplotipo H-2*’ posee diez miembros, el H-2‘^
tiene nueve (carece del Q3) y los ratones H-2*‘
poseen cinco. Todos ellos están orientados en
el mismo sentido de transcripción. Para investi­
gar la naturaleza de los productos codificados
por estos genes, éstos fueron introducidos en
células L de ratón y su expresión se evaluó m e­
diante antisuerós anti Q a2,3. Sólo los genes
Q6, Q7, Q8 y Q9 inducen la síntesis de proteí­
nas reconocidas por dichos sueros en estos fi­
broblastos. Algunos de los genes de la región Q
se presentan de a pares de genes cercanos y ho­
mólogos entre sí. Por ejemplo, el par Q6-Q7 es
muy similar al par Q8-Q9, no sólo en los genes
sino en las regiones que los flanquean. Por
ejemplo, la secuencia nucleotídica de Q7 y Q9
muestra que son 99% homólogos. Se postula
que esta región ha evolucionado duplicando
pares de genes de clase 1. Por otra parte, las se­
cuencias que flanquean a los genes K2-H-2K
en la región K, son similares a los pares Q6-Q7
y Q8-Q9; esto sugiere que los genes de la re­
gión K se generaron por la translocación de un
par de genes de la región Q. Cabe recordar que
el ratón es la única especie de todas las estudia­
das que posee genes de clase I a ambos flancos
de los genes de clase II, y que en todas las
otras, los genes de clase II están en orientación
centromérica, los de clase I en posición telomé-
rica y los de clase III entre ambos. Por otra par­
te, los alelos de un gen en varias cepas (por ej.,
Q7 en H-2'’ y H-2‘') muestran un 99% de homo­
logía, consistente con la noción de escaso poli­
morfismo en los productos de esta región.
Los genes Q5^ Q6^ Q6'‘, Q 7^ Q 7‘' y 0 9 ^
codifican para una molécula de clase I denomi­
nada Qa-2, extremadam ente conservada, que
puede ser reconocida por aloantisueros y por
linfocitos T citotóxicos (CTL). Se expresan en
una variada gama de linfocitos y precursores
hematopoyéticos. Los genes pueden producir
por “splicíng ” o empalme alternativo, dos for­
mas; una de ellas se secreta y la otra se expresa
en superficie anclada por enlaces glicofosfati-
dil-inositol (GPI). El papel biológico de Qa-2
se desconoce, aunque la molécula posee un si­
tio de presentación de péptidos de naturaleza
sim ilar al de las MHC de clase I “clásicas” ;
además, de ella se han eluido y caracterizado
péptidos endógenos, perm itiéndose definir el
patrón estructural de los mismos (cuadro 10-3).
Q4 codifica para una m olécula denom inada
Qb-1, que también es secretada, o expresada en
supert'icie mediante enlaces GPI. QIO codifica
para una proteína soluble, sintetizada funda­
mentalmente por el hígado. La función de estas
moléculas se desconoce.
La región H-2T
Posee entre 15 y 20 genes, según el haploti­
po H-2. Se los designa en forma similar a los
de la región Q: TL', T2‘*, etc. Los antígenos TL,
descritos originalmente en timocitos de algunas
cepas y en leucemias tímicas, son producto de
los genes T3'’ y TI 8'*. Asimismo, el antígeno
Qa-1 es producto del gen T23'’. Ambos se de­
tectan mediante aloantisueros; Qa-1 también
puede ser identificado por CTL. Todas las ce­
pas de ratones expresan TL en epitelio intesti­
nal, donde pueden presentar péptidos antigéni-
cos a linfocitos T gama/delta y activar su cito-

D D2
■VA
O - ' 1500
R e g ió n I
T20 T21
T I6T17T 18T 19 T22T23
F ig. 10-5. Esquem a de la organización de los genes de clase I m urinos (véase texto).
toxicidad. Los productos de otros genes T tam­
bién pueden ser reconocidos por linfocitos T
gama/delta.
ÍM región H-2M
Posee ocho genes, designados en form a si­
milar a los de las regiones Q y T. C uatro de
ellos son funcionales. H -2M 3“ codifica para
una molécula que presenta un péptido del ex­
tremo N-terminal de una NADH deshidrogena­
sa mitocondrial; esta enzim a tiene cuatro v a­
riantes alélicas y sus expresión sigue la heren­
c i a materna. Se demostró luego que M3 puede
unir y presentar eficientemente una variada ga-
iT ia de péptidos con formil-metionina en su ex­
tremo N-terminal, típicos de procariontes. Al­
gunos de estos péptidos pueden ser inmunodo­
minantes en la respuesta inmune murina de lin­
focitos T CD8 alfa/beta frente a Listeria m o­
nocytogenes.
La expresión superficial de H-2M es norm al­
mente muy baja y parece deberse a la poca dis­
ponibilidad de péptidos endógenos con formil-
metionina. La infección por bacterias intracelu­
lares incrementaría la oferta de estos lo que fa­
cilitaría la expresión superficial de H-2M.
EV O L U C IÓ N D E LOS GENES
DE CLA SE I
Como se mencionó antes, los productos de
clase I H-2K y H-2D poseen un enorme poh-
morfismo poblacional. En las variantes aléli­
cas, los cambios se concentran en los dominios
a l y a 2 de la proteína. Asimismo, los epitopes
reconocidos por los Acs fueron identificados
analizando su reactividad sobre productos codi­
ficados por genes de clase 1 “quiméricos” ; me­
diante técnicas de ingeniería genética se reem­
El complejo m ayor de histocompatibilidad 209
D3 D4 L Q1 Q2 Q4 Q5 Q6 Q7 0 8 /9 Q10
...
T6 T6
T3 T4
T24 TI j / T7 T8 T9 M5 M4 M6
r
o
i 10 20
i 60
8ii J i
60 70
plazó el segundo o tercer exón de un gen dado
(p. ej, L‘‘) por el exón correspondiente de otro
gen de clase 1. Estos genes quiméricos se pue­
den expresar en el sistema de las células L de
ratón, sobre las cuales se estudió la unión de
los Acs. La inm ensa mayoría de estos mapea
epitopes en el prim ero o segundo dom inio y
una minoría en el tercer dominio.
Los alelos difieren entre sí en varios residuos
consecutivos o cercanos y por eso se los desig­
na alelos o alotipos complejos, a diferencia de
los alotipos simples presentes en los genes de
globina o citocromo c, que, en general, difieren
en sustituciones puntuales de aminoácidos. A
pesar de estas sustituciones múltiples, todas las
moléculas conservan un 80-90% de homología
entre sí y no existen secuencias “típicas” de lo­
cus H-2K o de H-2D. Sobre la base de estas
observaciones, varios investigadores han suge­
rid o la existencia de mecanism os especiales
que aseguran un rápido intercambio de la infor­
mación entre los genes de clase I de form a tal
de “mezclar” las secuencias entre sí y evitar así
que los genes H-2K y H-2D evolucionen con
características propias en forma independiente.
Un mecanismo del tipo de la conversión génica
perm itiría la copia de secuencias de un gen a
otro dentro de la familia multigenética y man­
tener así la homogeneidad global de las secuen­
cias. En la conversión génica (un mecanismo
sólo demostrado hasta el presente en eucariotes
inferiores), un gen A interactúa con un gen B
en forma tal que una parte (o toda) de la se­
cuencia del gen A se hace idéntica a la secuen­
cia del gen B (fig. 10-6). En esta interacción,
los genes A y B conservan su tamaiio e integri­
dad y sus localizaciones originales; sólo ocurre
una alteración no recíproca en la estructura de
uno de ellos. Los genes A y B pueden ser genes
alelos en crom osom as hom ólogos, genes no
alélicos en un m ism o crom osom a, genes no
210 Aspectos básicos de la inmunidad
A B
C Apareamiento
c rzE
A B
Segregación Segregación A/B
A/B
HUZM D
__ D I ^
A/B
c = r:-A c iiz z iz z m
A A/B
F ig. 10-6, Ejem plo hipotético de la interacción de dos genes no alélicos relacionados, por conversión génica o Crossing
over desigual.
alélicos en crom átides herm anas o un par de
genes relacionados ubicados en distintos cro­
mosomas; la interacción podría ocurrir durante
la meiosis o mitosis. En la figura 10-6 se mues­
tra un ejemplo hipotético de la interacción de
dos genes de una misma familia ubicados en el
brazo largo de un cromosoma. La interacción
mostrada es la que ocurriría entre cromátides
hermanas. Hay diversos modelos moleculares
para explicar estos mecanismos de copia.
El otro mecanismo posible para mantener la
hom ogeneidad de secuencias en una fam ilia
multigenética es el llamado Crossing over des­
igual (fig. 10-6). Aquí, los sucesos involucran
un Crossing over entre dos genes no alélicos de
una fam ilia durante la meiosis o mitosis; los
genes que interactúan pueden estar en dos cro­
mátides hermanas (como en la fig. 10-6) o en
cromosomas homólogos. Como resultado de un
Crossing over desigual, además de la modifica­
ción de secuencias, hay un aumento o una dis­
minución en el número de genes de la familia.
La existencia en el sistema H-2 de números va­
riables de genes de clase I en las distintas cepas
de ratones constituye una evidencia en favor de
la existencia de mecanismos del tipo de Cross­
ing over desigual que permitirían la expansión
y la contracción de la familia.
Un sisteiTta que ha permitido evaluar el papel
de la conversión génica en la generación de po­
limorfismo en las moléculas de clase 1 es aquel
de los ratones portadores de mutantes de la mo­
lécula H-2K'’. Estos mutantes fueron identifica­
dos cuando, en una cepa endocriada, ocasional­
mente un ratón rechaza un injerto de piel de un
hermano. La caracterización de estos animales
EIZZMD
A B/A B A/B A
B
/VB B
3zznnzaD
Segregación.
~a¡— r MD
A B
Segregación A/B
8 A A/B B
mostró que con frecuencia hay catnbios en la
secuencia de aminoácidos de las MHC de clase
1 o clase IL Los mutantes de H-2K'’, denomina­
dos Kb™, poseen varias características destaca-
bles: a) ocurren con una frecuencia relativa­
mente alta; b) por lo general involucran a dos o
más aminoácidos vecinos o cercanos entre sí,
siendo improbable que dos o más sucesos de
mutación puntual ocurran en forma indepen­
diente en posiciones tan cercanas; c) a menudo
se observan mutantes idénticos que surgen in­
dependientem ente; d) por últim o y quizá lo
más importante, casi todos los mutantes poseen
en las posiciones alteradas, residuos presentes
en otras moléculas de clase 1. Por ejemplo, en
las posiciones 23 y 24 (dominio a l ) la molécu­
la K’’ posee los aminoácidos Met-Glu, mientras
que los mutantes K*”" poseen lle-Ser en su lu­
gar; precisam ente, lle-Ser están presentes en
esas posiciones en los genes Q7*^, L'*, y D'’. En
posición 89, la molécula Kb posee una Lys y la
mulante K'”"’ tiene Ala en su lugar, al igual que
L‘*, D'" y D'*. Cabe destacar que el codón para
Lys difiere en por lo menos dos nucleótidos del
codón para Ala, por lo que es improbable que
los cam bios hayan ocurrido por m utaciones
puntuales.
Estos y otros ejemplos sugirieron que en el
genoma de la cepa H-2'’ podrían existir otros
genes de clase I que poseen estas secuencias
comunes a otras moléculas de clase I y que ser­
virían de donantes de ellas para “corregir” o
cambiar la secuencia del gen H-2K*’. Para in­
vestigar esta posibilidad, Flavell y col. estudia­
ron en detalle la secuencia del gen K’”"' y en­
contraron que difiere de K'’ en siete nucleóti-

C u a d ro 10-4. Comparación de la secuencia
de aminoácidos y nucleótidos de varios genes
de clase /. Los guiones representan identidad
de la secuencia en esa posición
Gen Secuencia
150
H-2K'> GCT GGT CAA GCA GAG AGA CTC AGG
Ala Gly Glu Ala Glu Arg Leu
................... -CT .................... TAT TA-
y Q lO '’
................... Ala ................ ....Tyr Tyr
1-1^2 L' ................... -CT .................... TAT TA-
................... Ala ................ ....Tyr Tyr
dos, que causan el cambio de tres aminoácidos.
Luego observaron que uno de los 26 genes de
clase I presentes en el genoma H-2*’, el QIO'",
posee exactamente esta secuencia y podría ser
el generador de este cambio, por un mecanismo
del tipo de conversión génica (cuadro 10-4).
Estos 7 nucleótidos sustituidos (que son idénti­
cos a los presentes en el gen L'*) están ubicados
en un tramo de, como máximo, 57 nucleótidos,
ya que las secuencias de QIO'’ y K"®difieren por
fuera de este tramo. El gen QIO está ubicado a
una distancia considerable del gen H-2K; por
lo tanto, estos sucesos podrían involucrar seg­
mentos pequeños de ADN y ocurrir a través de
grandes distancias en el genoma. Una observa­
ción similar se hizo en el caso de la mutante
que posee Phe y Arg en lugar de Tyr y
Cys en las posiciones 116 y 121 respectiva­
mente. La secuencia del ADN mostró cambios
de un nucleótido en cada codón, separados en­
tre sí por 15 nucleótidos. Se encontró que el
gen Q4’’ posee exactamente esa secuencia en
esas posiciones y por lo tanto constituye el do­
nante potencial para la generación del mutante
J^bmó
Los genes de histocompatibilidad de clase I
(así como también los de clase 11) pudieron ha­
ber surgido de un ancestro común a los genes
de inmunoglobulinas, B2-microglobulina y los
antígenos de diferenciación ThyL CD8 (Lyt2)
y otras moléculas pertenecientes a la superfa­
milia de las Igs. Las evidencias son las siguien­
tes: el tamaño de los dominios externos y la
presencia de un puente disulfuro de igual longi­
tud es común a todos estos genes. Las reglas
que gobiernan el splicing o empalme de exones
durante la maduración del ARNm es la misma
en los genes de Igs y de histocompatibilidad.
Finalmente, las secuencias de ADN del exón 4
(dominio a3 ) de las moléculas de clase 1, los
dominios a2 y ¡32 de las moléculas de clase IJ,
la p2-microglolDulina y los exones constantes
de las inm unoglobulinas poseen algunos tra­
mos de homología ancestral.
El complejo mayor de histocompatibilidad 211
MOLÉCULAS DE CLASE II
La región I del sistema H-2 (denominada así
por la presencia de genes de respuesta /nmune
y no de clase 1) está ubicada entre las regiones
K y S y codifica para la expresión de las molé­
culas de clase II, I-A e I-E (fig. 10-1). Las mo­
157
léculas de clase II murinas se denominan tam­
Arg bién la (asociadas con la región I). Am bas mo­
léculas están constituidas por heterodímeros,
con una cadena a y una cadena (3 unidas entre
sí p o r unio n es no co v ale n tes (fig s. 10-2 y
10-7). Las cadenas que las componen y sus ge­
nes respectivos, se ilustran en la figura 10-7 e
incluyen; se designan A a, A(3, E a y E¡5, y el
alelo de origen se designa con una letra minús­
cula superscripta (ej. Aa^*).
Las cadenas A a y E a poseen un tam año mo­
lecular de aproximadamente 31-33 kD a. Están
constituidas por 230 aminoácidos, distribuidos
de la siguiente forma; dos dominios globulares
extracelulares de 84 y 94 aminoácidos, un pe­
queño tramo hidrofílieo de 10 aminoácidos que
lleva al segmento transmem bránico (30 ami­
noácidos) y el segmento intracitoplásmico (car-
boxiterminal) de aproximadamente 12 aminoá­
cidos. El segundo dominio posee su estructura
estabilizada por un puente disulfuro de cisteí­
nas separadas entre sí por 56 residuos. Existen
dos sitios de glucosilación unidos a asparagi-
nas, en las posiciones 78 y 118, de! primero y
segundo dominio, respectivamente.
Las cadenas A(3 y E|3 poseen aproximada­
mente 240 aminoácidos, distribuidos de la si­
guiente forma: dos dominios extracelulares de
95 aminoácidos cada uno, un segm ento hidro­
fóbico transm em bránico de alrededor de 35
aminoácidos, y el extremo carboxiterminal de
aproximadam ente 12 residuos. Poseen un solo
sitio de glucosilación asociado a u n a Asn en
la posición 20 del primer dominio. E n ambos
dominios externos hay puentes disulfuro entre
cisteínas ubicadas unos 60 residuos entre sí.
El tamaño m olecular de las cadenas p oscila
entre 28 y 29 kO; por lo tanto, la diferencia
entre los tamaños de las cadenas a y ¡3 se debe
fundam entalmente a diferencias en la glucosi­
lación.
Durante su biosíntesis, las cadenas a y ¡3 se
asocian intracelularm ente entre sí y con una
tercera cadena, de alrededor de 31kD, glucosi­
lada, denominada cadena Ii o invariante, codi­
ficada por fuera del H-2. Las tres cadenas son
transportadas a través del Golgi y posterior­
m ente hacia los endosom as, en don d e el pH
ácido y ciertas proteasas disocian la cadena íi
del dímero a[3; facilitan así la unión de pépti­
dos antigénicos generados por la v ía exógena
(véase cap. 2). Finalmente las MHC de ciase II
migran a la superficie celular.
212 Aspectos básicos de la inmunidad
Región ---------------------------- A -----------
Pb
Genes
Productos
A ( i|
l-A
F ig. 10-7. M oléculas de histocom patibilidad de clase 11. Cadenas que las com ponen y sus respectivos genes.
Las moléculas I-A e I-E pOvSeen una distribu­
ción tisular muy limitada: linfocitos B, macró­
fagos (y sus equivalentes en varios tejidos) cé­
lulas de Langerhans, algunas células T activa­
das. Se ha demostrado que, en la superficie ce­
lular de un individuo heterocigota para dos ha­
plotipos H-2 distintos, puede ocurrir la trans
asociación entre las cadenas a de un haplotipo
con las cadenas (3 del otro, tanto para las molé­
culas I-A como para las I-E. Así, por ejemplo,
un ratón El (H-2‘*x H-2'^) podrá expresar en la
superficie de una célula dendrítica ocho MHC
de clase II diferentes:
I-A: A a7A|3‘*, AaVA13\ A tfV A p\ AaVA(3‘>
I-E: E a ‘'/E(3^ EaVE(3\ E a “/E|3k, EaVE(3‘'
Los determinantes aloantigénicos en las mo­
léculas de clase II fueron establecidos por m e­
dio de aloanticuerpos monoclonales y pohclo-
nales. Gran parte de los epitopes fueron identi­
ficados en las cadenas |3, aunque muchos de
ellos dependen de una interacción apropiada
con la cadena a correspondiente. A causa de la
trans asociación de moléculas mencionadas an­
tes, los individuos F l pueden expresar en las
moléculas de clase II determinantes aloantigé­
nicos ausentes en ambos padres.
Ab Aa Eb2
Ao
Los estudios bioquímicos y moleculares de
las MHC de clase II mostraron que el mayor
polimorfismo reside en las moléculas A a , A(3 y
Ep. La comparación de las secuencias de los
genes E a de los haplotipos k, d u muestra una
homología > del 98% a nivel de las proteínas.
El análisis comparativo de las secuencias de la
cadena A a de los haplotipos k, d, b, f, u y q,
muestra que éstas exhiben una homología que
oscila entre el 82% y el 93% (cuadro 10-5),
con la mayor parte de los cambios presentes en
el primer dominio ( a l ) de la proteína. La com­
paración de las secuencias de la cadena A|3 de
los haplotipos b, d y k, revela una homología
global de 90-95%, siempre con la mayor parte
C u ad ro 10-5. Comparación de las secuencias
de aminoácidos de varias cadenas A a prove­
nientes de diversos haplotipos (expresada co­
mo % de disparidad)
u k q f d
b 7 11 14 12 16
n 7 13 13 18
k 15 13 14
q 8 14
f 11
 E l complejo mayor de histocompatibilidad
de los cambios en el dominio (31. Por último, la
comparación de las secuencias de los genes E|3
de los haplotipos k, d, b, u j; s, muestra una ho­
mología global del 95%, con los cambio.s con­
centrados en el primer dominio.
Cuando se comparan las cadenas E a y A a ,
se observa una homología de aproximadamente
50%, y entre las cadenas A(3 y EP 60-65%. En
ambos casos existe una sorprendente conserva­
ción (~ 80%) en la región transm em bránica,
cosa que no ocurre en esa porción de las molé­
culas de clase I. Se ha especulado que esta ho­
mología en la región transmembránica de las
moléculas de clase II sería importante en las in­
teracciones de las cadenas a y |3 entre sí o con
otras proteínas.
G E N E S DE C LA SE II
El análisis de las secuencias nucleotídicas de
numerosos genes de clase II, permitió estable­
cer homologías entre las diversas moléculas, ya
descritas en el punto anterior, y reveló además
que los genes E a y Ep son análogos de los ge­
nes D R a y DRp humanos, mientras que los ge­
nes A a y Ap son la contraparte de los genes
D Q a y DQP humanos (véase cap. 29).
En los genes de clase II, al igual que en los
de clase I, hay una estrecha correlación entre
los exones y los dominios proteicos (fig. 10-8).
Los genes a poseen un exón para el péptido se­
ñal; un primer intrón significativamente largo,
de más de 2kb (similar al gen de P2-microglo-
bulina) y a continuación los exones para los
dominios extremos a l y a2 ; un tínico exón de
175 n u cleótidos co d ifica para el segm ento
transm em bránico y citoplásm ico. E x iste un
cuarto intrón ubicado dentro de la región 3 ’ no
traducida, dividiéndola en dos. Los genes P po­
8kb
Fig. 10-8. Estructura de ios genes a y P de las m oléculas de histocom patibilidad de clase 11. Los rectángulos llen o s re­
presentan los exones. t^ = exón que codifica para el péptido señal, a l y ¡il = dom inios externos distales (am inoterm inal).
a 2 y |32 = dom inios externos próximo.s a la superficie. TM = transm em bránico, C IT = intracitoplásm ico. 3 ’U T = región
3 ’ presente en el A RN m pero ausente en la proteína; I = intrones.
213
seen un exón para el péptido señal, dos exones
para los dominios externos, exones individua­
les para los dominios transmembránicos y cito-
plásmicos y no hay intrones en la región 3 ’ no
traducida.
Al igual que lo encontrado con las moléculas
de clase I, la genética molecular describió la
presencia de otros genes de clase II, además de
aquellos que codifican para las moléculas I-A e
I-E. La organización de estos genes fue estudia­
da en varias cepas de ratones y está esquemati­
zada en las figuras 10-7 y 10-9. En orientación
centromérica a Ap, se hallan los genes Pb (pre­
viamente designado Ap3) y Ob (antes llamado
AP2). Pb se halla a tan sólo 75 kb de H-2K. Re­
cibió la designación de Pb por tener 83% de ho­
mología con el gen humano DPp. Este gen po­
see una deleción de 8 nucleótidos en el medio
del dominio P2 que produce un corrimiento en
el marco de lectura de los codones durante la
traducción. Esto provoca la presencia de nume­
rosos codones de term inación, por lo que se
considera que Pb es un seudogén. Esta deleción
está presente al menos en las cepas H-2'’ y H-2'‘.
La mayor parte de los genes de clase II han
sido mapeados en un tram o de aproxim ada­
mente 200 kb. Ob (antes llamado A p2) posee
un 49-56% de homología con otros genes p y
se observó su expresión a nivel de A RN m en
los mismos tipos celulares que expresan I-A e
I-E, aunque no se conoce su producto proteico
ni su respectiva cadena alfa. Com parado con
los genes p humanos, en su segundo dominio
es un 83% homólogo con el gen DOp, un pare­
cido similar al existente entre los pares I-A/DQ
y DR/I-E. Esto sugiere que han existido ances­
tros comunes para cada uno de estos pares, an­
tes de la especiación hombre-ratón.
A unas 20 kb de Ob se halla Ap y a 15 kb de
éste, el gen A a. Estos codifican para el dímero
TM/CIT 3’UT
12
- A a, Ea
TM CIT
■A|3. Ep
214 Aspectos básicos de la inmunidad
C u ad ro 10-6. Comparación de las secuencias de parte del dominio ¡3J de los genes A fí’,
E p ’. Los guiones representan identidad en la secuencia. La secuencia subrayada muestra el tra­
mo mínimo y la línea de puntos el tramo máximo involucrado en el suceso de conversión génica
60
Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Pro Glu lie Leu Glu Arg Thr Arg Ala Glu Leu Asp
AP» GAG TAC TGG AAC AGC CAG CCG GAG ATC CTG GAG CGA ACG CGG GCC GAG CTG GAC
AP*»
Asn
Ep'’ A..
l-A (fig. 10-7) y poseen direcciones de trans­
cripción opuestas, al igual que los otros genes a
y p. A unas 20 kb se ubica el gen Ep, en cuyo
intrón 2 se localiza un “punto caliente” de re­
combinación; numerosas cepas de ratones que
poseen genes H-2K e I-A de un haplotipo y ge­
nes H-2D de otro, y se mapeó el sitio de recom­
binación exactamente en este intrón. En orienta­
ción telomérica, le sigue el gen Eb2, cuyo pro­
ducto proteico se desconoce, aunque se transcri­
be en algunos tipos celulai'es. Finalmente se ha­
lla Ea y este último está a unas 90 kb del gen
C4 (ya dentro de la región S del H-2).
Más recientemente, entre los genes Pb y Ob,
se han identificado otros genes, cuyos produc­
tos juegan un papel importante en los mecanis­
mos de procesamiento y presentación antigéni­
ca (fig. 10-9). Los genes LMP2 y LM P7 codifi­
can para subunidades catalíticas de los protea-
somas, implicados en el catabolismo de proteí­
nas en el citosol celular (véase cap. 2). Los ge­
nes TAP] y TAP2 codifican para un heterodí­
mero que transporta péptidos desde el citosol
h acia el interior del retículo endoplásm ico,
donde ocurre su ensamble con las MHC de cla­
se I. Finalmente, los genes Ma y Mb (equiva­
lentes de los humanos DMA y DMB) codifican
para moléculas que facilitan en los endosomas
la disociación de la cadena li de las MHC de
clase II y la unión de péptidos generados por la
vía exógena (véase cap. 2). Existe una notable
conservación evolutiva en la organización de
estos genes entre el humano y el ratón.
Como hemos mencionado antes, las MHC de
clase II poseen una distribución tisular muy
restringida. Se ha demostrado, tanto in vitro co­
mo in vivo, que el IFN gama induce la expre­
sión de novo de moléculas de clase II en célu­
las que carecen de ellas. Todas las especies de
IFN producen un aumento de la expresión de
moléculas de clase 1 en células que ya las ex­
presan. Ambos efectos involucran un aumento
en los niveles de transcripción de los respecti­
vos genes.
y
70
Phe Gln Lys
T.. A.. ■A.
Phe Gln Lys Val
T. A.. A. .G.
Las cepas de ratones de los haplotipos b, f, q
y s no expresan moléculas I-E en la superficie
y, aunque sí poseen cadenas EP en el citoplas­
ma, carecen de cadenas E a. Se demostró que,
al menos en la cepa H-2'’, esto se debe a una
deleción de aproximadamente 600 bases en el
gen E a, que involucra el péptido señal y parte
de la región 5 ’ que flanquea al gen (región pro­
motora).
P O L IM O R F IS M O Y EV O LU C IÓ N
DE LA R E G IÓ N I D EL H-2
Hay evidencias de que en los genes de clase
II también operarían mecanismos del tipo de la
conversión génica para generar polimorfismo
en sus secuencias. Estas provienen de los estu­
dios hechos con los matantes de las cepas H-2'’.
Se ha determinado la secuencia nucleotídica del
mutante Ap'””'^ y se halló que difiere A p'’ en
tres nucleótidos ubicados en un tramo de 14 ba­
ses, lo que resulta en el cambio de tres aminoá­
cidos. La secuencia cambiada es la misma que
está presente en ese tramo en el gen Epb, lo que
sugiere que Epb pudo haber sido la secuencia
donante, en un evento evolutivo del tipo de la
conversión génica. El tramo mínimo involucra­
do en la transferencia sería de 14 bases y el má­
ximo de 44 bases (véase cuadro 10-6).
Como ya se mencionó, existe una homología
entre todas las cadenas a entre sí y las P entre
sí. Esto ha sugerido que los diversos productos
génicos pudieron haber surgido a partir de un
ancestro a y p común, a partir de los cuales ha­
brían evolucionado independientem ente cada
locus.
Las subregiones l-A e I-E del H-2 habían si­
do separadas por estudios de genética clásica,
con la obtención de cepas recombinantes de ra­
tones que poseen alelos distintos en las molécu­
las I-A e I-E. Como se mencionó antes, el análi­
sis molecular de varias de estas cepas recombi­
nantes demostró que en todas ellas el sitio de
 El complejo m ayor de histocompatibilidad
recombinación involucra el gen Ep, cuya por­
ción 5 ’ mapea dentro de I-A y su porción 3 ’
dentro de 1-E (fig. 10-7) y que el sitio caliente o
“hot spot” en la recombinación ocurre en el se­
gundo intrón, que separa los dominios p l y p2.
Este hallazgo tiene importantes implicaciones
en l o s mecanismos evolutivos que operan en la
generación de polim orfism o en estos genes.
Steirnmetz y col. compararon las secuencias de
A D N dentro de la región I de las cepas Ji, d y
una cepa salvaje mediante la ubicación
de sitios reconocidos por nucleasas de restric­
ción. Observaron un alto grado de polimorfismo
en el ADN desde el gen Ep hacia el centrómero
(hacia la “izquierda” del mapa) y una gran con­
servación de las secuencias desde Ep hacia la
región S (“derecha” del mapa). Esto es consis­
tente con el conocido escaso polimorfismo del
gen E a , Slp y C4 (de la región S; véase más
adelante). Nuevamente, estas observaciones su­
gieren la existencia de mecanismos especiales
para la evolución de estas secuencias.
Entre las subregiones I-A e I-E del H-2, la
genética clásica mapeó la presencia de la lla­
mada subregión I-J. La inmunización cruzada
entre cepas dispares en esta región, genera Acs
que reconocen una sub población de linfocitos
T supresores y factores solubles con activida­
des supresoras, derivados de ellos. Ya que el
punto de recom binación entre I-A e I-E fue
ubicado en el segundo intrón del gen Ep, no
existe espacio físico para localizar la subregión
I-J. Cuando se usó ad gen Ep para evaluar la
presencia de ARNm complementarios a él en
células T supresoras (I-J+), no se los halló. For
lo tanto, el m apa físico no concuerda con el
mapa genético de la subregión; alternativamen­
te los genes para I-J mapean por fuera del H-2.
Evidencias en favor de esta posibilidad surgen
del reciente hallazgo que las cepas originales
que permitieron definir esta subregión, difieren
en otras porciones del genoma, además de la
región H-2. Una mejor caracterización bioquí­
mica de estas moléculas permitirá aclarar estas
discrepancias.
REGIÓN S
La región S (también denominada región de
clase III) está ubicada entre las regiones I y D
del sistema H-2 (fig. 10-1). Esta región ha sido
bien caracterizada por clonado molecular y es
similar en el humano y en el ratón (fig. 10-10).
En un tramo de alrededor de 200 kb se hallan
los genes que codifican para los componentes
del complemento C2, Bf, C4, Slp y para la 21
hidroxilasa (210H).
C4, uno de los com ponentes del sistem a
complemento (véase cap. 22) y Slp, una molé­
215
cula estructuralm ente relacionada a C 4, son
glucoproteínás que circulan en sangre periféri­
ca. Su actividad biológica es diferente. C4 está
presente en la circulación de todas las cepas de
ratones, es activa su participación en la activa­
ción de la cascada del complemento (C3 con­
vertasa y sustrato para C lq ) y es sintetizada en
el hígado y macrófagos. Slp sólo está presente
en determinadas cepas de ratones, en algunas
de las cuales sus niveles dependen de los nive­
les de testosterona. No participa en la cascada
del complemento y su función exacta se desco­
noce. Los genes para C4 y Slp ocupan aproxi­
madamente 15-20 kb, están separados p o r unas
70 kb y son 96% hom ólogos entre sí. En el
hombre estas dos formas de C4 son activas y
corresponden a los isotipos Rodgers y Chido.
Vecinos a cada uno de los genes C4 y Slp (a
4 kb de distancia) se hallan los genes 210HA y
210HB, respectivamente. Codifican p a ra una
proteína de 52 kD con actividad de citocromo
P450, que participa en la hidroxilación de este­
roides adrenales. El gen 210HA es transcrip-
cio n alm en te m ucho más activo que el gen
210HB en la adrenal murina. La presencia de
un gen 21 OH vecino a cada gen C4 sugiere que
éstos se originaron a partir de la duplicación de
dos genes ancestrales. Los P450 comprenden
una familia amplia de enzimas conocidas como
monooxigenasas especializadas en la oxidación
de sustratos hidrofóbicos. El ligamiento de ge­
nes absolutamente no relacionados, com o los
de 21 OH y C4, pareciera que es accidental y no
posee alguna implicancia funcional obvia.
Cercanos a la región H-2I, se hallan los ge­
nes para C2 y Bf. Son glucoproteínás de 102
kD y 90 kD respectivamente, con estructura y
función similares. Son serina proteasas respon­
sables de la actividad proteolítica de las C3 y
C5 convertasas de las vías clásica y alterna de
activación del com plem ento (véase cap. 22).
Los genes poseen cierta homología (37 %) y se
postula que pudieron haber surgido de un an­
cestro común, por una duplicación m uy ante­
rior a la que originó a los pares de C4 y 210H,
Se ha especulado que la estrecha cercanía de
ambos (menos de 1 kb) les ha permitido evolu­
cionar juntos y adquirir la especialización fun­
cional que poseen en ambas vías del comple­
mento.
RESPUESTA INMUNE CONTRA
MOLÉCULAS DE
HISTOCOMPATIBILIDAD
Como vimos antes, si se trasplanta piel (o
cualquier órgano) entre dos animales histoin­
compatibles (que poseen alelos de histocompa­
tibilidad diferentes), los linfocitos T CD4 y
21 6 Aspectos básicos de la inmunidad
Región
Pb Ob
Genes
Mb2 Mbl
Genes
F ig. 10-9. O tros genes de clase II ubicados entre los genes Pb y Ob.
CDS reconocen como extrañas a las MHC del
donante, producen una intensa reacción infla­
matoria y destruyen a las células extraña.s. Las
células T CD4 y CDS reconocen a las molécu­
las de clase II y clase I extraña.s, respectiva­
mente. La respuesta inm une contra las MHC
extrañas se denomina respuesta alogeneica. In
vivo, la respuesta incluye además la síntesis de
anticuerpos contra las MHC ajenas (aloanti-
cuerpos).
Esta reacción puede evidenciarse y reprodu­
cirse in vitro, en el llamado cultivo mixto linfo­
citario (cuadro 10-7). Si se mezclan en un sis­
tema de cultivo, linfocitos proveniente de dos
animales alogeneieos, las células T CD4 res­
ponden con una intensa proliferación y libera­
ción de mediadores al reconocer moléculas de
clase II extrañas, presentes sobre la superficie
de células que estimulan (linfocitos B, células
dendríticas). Además, las células T CDS se ac­
tivan al reconocer moléculas de clase I extrañas
sobre la superficie de todas las células ajenas.
Además de este reconocimiento directo de las
MHC extrañas por el receptor T, se ha demos­
trado que las MHC ajenas pueden ser procesa­
C u a d ro 10-7. Respuestas en el cultivo mixto linfocitario p or M H C alogeneicas de clase I y
clase 1¡
D isparidad en las M H C entre las células
que e.nimulan y las que responden
Clase I Cla.se II
Sí SÍ
SÍ NO
NO SÍ
Las cé lu la s efectoras son de fe n o tip o C D 4 y re co n o ce n M H C d e c la se II alo g en eicas
Las cé lu la s efecto ras son de fe n o tip o C D S y re co n o ce n M H C de clase I alogeneicíKs
Ab Aa Eb Eb2 Ea
LMP2 TAP1 LMP7
l'J
das y presentadas por MHC propias: esto se de­
nomina reconocimiento indirecto de aloantíge­
nos. En el cultivo mixto, si las cepas sólo difie­
ren en MHC de clase I, la proliferación será es­
casa, aunque sí se generarán efectores citotóxi­
cos CDS (cuadro 10-7).
La frecuencia de linfocitos T que responden
en un cultivo mixto linfocitario es de alrededor
de 0.2%, varios órdenes de magnitud mayor
que los que responden a un antígeno conven­
cional. Esto explica la magnitud de la respuesta
en el cultivo mixto.
En numerosos y elegantes experimentos se
ha demostrado que un mismo clon de linfocitos
T que responde específicamente ante un pépti­
do presentado por una M HC propia, puede
eventualmente responder y proliferar ante una
célula alogeneica, en ausencia aparente del
péptido específico. Más aun, se ha demostrado
Ibrmalmente, que es la misma molécula del re­
ceptor T la responsable del reconocimiento en
ambos casos. Se ha hipotetizado la existencia
de una suerte de reactividad cruzada entre el re­
conocimiento de la MHC propia + péptido y la
molécula de histocompatibilidad ajena. Sin em-
Producción
Proliferación de citocinas E fectores citotóxicos
++++ + ++ + “ ++++'=
+
+++ + ++“' +>’
 E l complejo mayor de histocompatibilidad
C2 BF SIp
20 40 60
Fig. ÍO-10. O rganización genóm ica de la región S del sistem a H -2. L os genes están representados por rectán g u lo s y sus
tam años y distancias que los separan están en escala. El gen C2 lim ita con la región H-21 y el gen 2 1 0 H B con la región
H-2D. Las flecha.s indican las direcciones de transcripción.
bargo, han surgido en los últimos años numero-
s'ds evidencias que sugieren que el TCR no re­
conoce MHC “desnudas” o vacías, sino MHC
que acarrean péptidos. En el reconocimiento
alogeneico directo, estos péptidos derivarían de
p roteínas endógenas de la célula y podrán
eventualmente ser específicas de un tejido. Se
ha demostrado que algunos clones de linfocitos
T CD4 aloreactivos proliferan ante una molé­
cula de clase II alogeneica expuesta en la su­
perficie de linfocitos B, pero no cuando la mis­
ma molécula está sobre monocitos o fibroblas­
tos. Esto implica que la especificidad fina de
este clon T reconoce la molécula de clase II
junto a un péptido específico de linfocitos B y
derivado de una proteína que estaría ausente de
monocitos o fibroblastos. Otros clones T res­
ponden igualmente cuando el aloantígeno está
sobre diversos tipos celulares y en este caso se
reconocería un péptido derivado de una proteí­
na celular presente en varios linajes.
Estas y otras evidencias son consistentes con
la hipótesis que la respuesta alogeneica directa
se produce contra antígenos celulares (por ej.,
estructurales) presentados por moléculas aloge­
neicas, asociaciones contra las cuales un indivi­
duo no es tolerante, pero que sí es tolerante a
esos autoantígenos presentados por moléculas
propias. La gran magnitud de la respuesta en el
cultivo mixto se explicíiría según esta noción,
por la enorme cantidád de clones T que tendrían
la capacidad de reconocer las diferentes combi­
naciones entre péptidos tisulares -1- moléculas
HLA alogeneicas (com binaciones co ntra las
cuales uno no es tolerante). Más aun, por el pro­
pio polimorfismo de las MHC, las moléculas
alogeneicas no necesariam ente acarrearán los
mismos péptidos tisulares que aquellos presen­
tes en las MHC propias; a éstas últimas seremos
tolerantes, pero no a las primeras! Esto aumenta
la magnitud de la respuesta. Finalmente, a esto
debe agregarse la contribución de la respuesta
indirecta donde los aloantígenos procesados son
re-presentados por las MHC propias.
FUNCIONES DE LAS MOLÉCULAS
D E HISTOCOMPATIBILIDAD
Es evidente que la función biológica esencial
de las MHC no es la de impedir trasplantes alo­
217
I21OHBI
100 120 140 160 180 Kb
geneicos. A com ienzos de la década del ’70
surgieron varias evidencias independientes que
demostraron la participación de las mism as en
el reconocimiento de antígenos convencionales
por parte de los hnfocitos T (el fenómeno lla­
mado restricción por el complejo mayor de his­
tocompatibihdad).
Hoy está claro el papel de las M H C en la
presentación de péptidos generados por el pro­
cesam iento intracelular (cap. 2). Más aun, es
p o sib le incubar in vitro M HC con péptidos
apropiados, m edir su afinidad, su cinética de
asociación y ensayar su actividad biológica por
su capacidad para activar linfocitos T. Se ha
demostrado que la unión tiene lugar con cinéti­
cas de asociación y sobre todo disociación len­
tas (tl/2 = 30 hs), con constantes de afinidad
moderadas del orden de 10'" M *. Las cinéticas
de asociación obtenidas al ensayar la unión de
péptidos a células, revelaron ser más rápidas.
La lenta disociación sugiere que, una vez uni­
do, el complejo péptido-molécula de histocom­
patibilidad de clase II sería relativamente esta­
ble; si se garantiza la presencia de este comple­
jo sobre la superficie de la célula presentadora
durante un tiempo prolongado, se favorece el
encuentro con un linfocito T de especificidad
apropiada.
Para modelos en donde una misma molécula
de clase II es capaz de unir diversos péptidos,
los estudios de com petición han sugerido la
existencia de un sólo sitio de unión. Las imáge­
nes cristalográficas de las MHC han confirma­
do esta noción.
En num erosos sistem as se ha dem ostrado
que determinados alelos de clase I o clase 11
“sirven” o “no sirven” para presentar ciertos
péptidos antigénieos. Esto explica los primeros
estudios in vivo que mostraron que ciertas ce­
pas de ratones son “buenos” respondedores y
otros “malos” respondedores a un antígeno da­
do y que los genes que regulan esto mapean en
el sistema H-2. Esto ha permitido asignarle a
los genes de histocompatibilidad el nombre de
genes de re.spuesta inmune. La caracterización
de ligandos peptídicos naturalm ente hallados
en las MHC y los ensayos de unión in vitro a
M H C purificadas, confirm an que u n a buena
respuesta depende en primer lugar de la capaci­
dad del péptido de unirse a una determinada
MHC.
218 Aspectos básicos de la inmunidad
En la mayoría de las especies donde fue es­
tudiado, el sistema mayor de histocompatibili­
dad es extremadamente polimórfico. En aque­
llas especies donde el p o lim orfism o de las
MHC es [imitado, las proteínas implicadas en
el p ro c e s a m ie n to (L m p2y7) y tra n s p o rte
(Tapl/2) de péptidos antigénicos hacia el inte­
rior del retículo, contribuyen con un moderado
polimorfismo, en la selección de los epitopes
presentados. Se ha postulado que todo este po­
limorfismo y la rápida evolución de este siste­
ma, evitaría la aparición de un patógeno “per­
fecto” que pueda evitar una adecuada presenta­
ción por una MHC, o que pueda mimetizar uno
de ellos y evadir así el reconocimiento inmune.
La presentación antigénica sobre superficies
celulares m ediada por las MHC, pudo haber
evolucionado como un mecanismo especializa­
do de los hnfocitos T, ya que la función de es­
tas células siempre está asociada a la interac­
ción con células presentadoras de antígeno: la
activación de linfocitos B y la activación de
células inflamatorias por la acción directa de
citoquinas. La utilización de dos MHC dife­
rentes (clase I y clase II) quizá haya surgido
como consecuencia de una especialización de
las poblaciones T: los CTL CD 8 -1- no pueden
eliminar bacterias y sus toxinas (función reser­
vada a los T CD4 inductores y su efecto poste­
rior sobre linfocitos B) sino que deben focali­
zar su respuesta citotóxica sobre cuakjuier cé­
lula del organismo que exhiba en sus MHC de
clase I péptidos tumorales o de patógenos in­
tracelulares.
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Moléculas de adhesión
MARCELA A. MANGHI
IN TRO D U C CIÓ N
Hasta hace poco tiempo, el endotelio vascu­
lar era considerado como un tejido que cubría
los vasos sanguíneos cuya función sólo era la
de prevenir la coagulación sanguínea y separar
el espacio vascular de los tejidos. Las células
endoteliales fueron consideradas menos acti­
vas, menos complejas y menos interesantes que
muchos otros tipos celulares.
Hoy se sabe que el endotelio vascular parti­
cipa activam ente en una amplia variedad de
procesos fisiopatológicos que incluyen infla­
mación e inmunidad. El intenso estudio de los
mecanismos moleculares de la adhesión de los
leucocitos al endotelio permitió identificar, ca­
racterizar y clonar múltiples moléculas acceso­
rias en la superficie de la célula endotelial que
soportan la adhesión a través de una interac­
ción con ligandos específicos sobre los leucoci­
tos facilitando su tráfico.
MOLECULAS ACCESORIAS
La superfamilia de las integrinas
La familia de las integrinas incluye más de
20 heterodímeros de superficie celular, diferen­
tes pero estructuralm ente relacionados, com­
puestos de cadenas a y |3 unidas en forma no-
covalente. Estas moléculas intervienen en la
adhesión de células a proteínas de la matriz ex­
tracelular (ECM) y en las interacciones célula-
célula. Se conocen 8 subunidades |3 y 14 subu­
nidades a. Varias integrinas que utilizan la ca­
dena p, han sido denominadas antígenos VLA
(very late after activation) dado que dos de los
primeros miembros de este grupo aparecen so­
bre los linfocitos después de su activación. Sin
em bargo, dado que la m ayoría de las células
del cuerpo expresan por lo menos una de las in­
tegrinas p i en forma constitutiva y puesto que
algunas de las cadenas pueden estar combina­
das con otras subunidades p, la nomenclatura
VLA dejó de ser apropiada y ha sido reempla­
zada por la nomenclatura a P (véanse cuadros
11-1 y 11-2).
La función general de los miembros de la fa­
m ilia de las integrinas es interactuar con una
amplia variedad de ligandos incluidos glucopro-
teínas de la ECM , componentes del comple­
m ento, y otras células “integrando” el medio
ambiente extracelular con el citoesqueleto. Si
bien las 8 cadenas P y las 14 cadenas a podrían
teóricamente dar origen a más de 100 heterodí­
meros, la diversidad real es mucho m ás restrin­
gida dado que muchas cadenas a se asocian con
una única cadena p y que otras cadenas a (por
ej., av ) se asocian con varias cadenas P diferen­
tes. Las integrinas individuales pueden unir más
de un ligando, y los ligandos individuales pue­
den ser reconocidos por más de una integrina
(cuadro 11-1). Algunas de las integrinas pueden
reconocer proteínas integrales de m em brana
pertenecientes a la superfamilia de las inmuno-
globulinas (ICAM-1, 2, 3 y VCAM-1) y mediar
la adhesión directa célula-célula.
Las integrinas intervienen en la adhesión cé­
lula-célula y célula-matriz en muchos procesos
fisiológicam ente importantes: desarrollo em­
brional, hemostasis, trombosis, cicatrización de
heridas, mecanismos de defensa inm une y no-
inmune, y transformación oncogénica.
De acuerdo a sus características estructura­
les, las integrinas pueden ser divididas en va­
rios subgrupos. Un grupo que sufre clivaje pos-
translacional de la cadena a , y otro grupo que
218 Aspectos básicos de la inmunidad
En la mayoría de las especies donde fue es­
tudiado, el sistema mayor de histocompatibili­
dad es extremadamente polimórfico. En aque­
llas especies donde el p o lim orfism o de las
MHC es [imitado, las proteínas implicadas en
el p ro c e s a m ie n to (L m p2y7) y tra n s p o rte
(Tap 1/2) de péptidos antigénieos hacia el inte­
rior del retículo, contribuyen con un moderado
polimorfismo, en la selección de los epitopes
presentados. Se ha postulado que todo este po­
limorfismo y la rápida evolución de este siste­
ma, evitaría la aparición de un patógeno “per­
fecto” que pueda evitar una adecuada presenta­
ción por una MHC, o que pueda mimetizar uno
de ellos y evadir así el reconocimiento inmune.
La presentación antigénica sobre superficies
celulares m ediada por las MHC, pudo haber
evolucionado como un mecanismo especializa­
do de los hnfocitos T, ya que la función de es­
tas células siempre está asociada a la interac­
ción con células presentadoras de antígeno: la
activación de linfocitos B y la activación de
células inflamatorias por la acción directa de
citoquinas. La utilización de dos MHC dife­
rentes (clase I y clase II) quizá haya surgido
como consecuencia de una especialización de
las poblaciones T: los CTL CD 8 -1- no pueden
eliminar bacterias y sus toxinas (función reser­
vada a los T CD4 inductores y su efecto poste­
rior sobre linfocitos B) sino que deben focali­
zar su respuesta citotóxica sobre cualcjuier cé­
lula del organismo que exhiba en sus MHC de
clase I péptidos tumorales o de patógenos in­
tracelulares.
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Moléculas de adhesión
MARCELA A. MANGHI
IN TRO D U C CIÓ N
Hasta hace poco tiempo, el endoteUo vascu­
lar era considerado como un tejido que cubría
los vasos sanguíneos cuya función sólo era la
de prevenir la coagulación sanguínea y separar
el espacio vascular de los tejidos. Las células
endoteliales fueron consideradas menos acti­
vas, menos complejas y menos interesantes que
muchos otros tipos celulares.
Hoy se sabe que el endotelio vascular parti­
cipa activam ente en una amplia variedad de
procesos fisiopatológicos que incluyen infla­
mación e inmunidad. El intenso estudio de los
mecanismos moleculares de la adhesión de los
leucocitos al endotelio permitió identificar, ca­
racterizar y clonar múltiples moléculas acceso­
rias en la superficie de la célula endotelial que
soportan la adhesión a través de una interac­
ción con Hgandos específicos sobre los leucoci­
tos facilitando su tráfico.
MOLECULAS ACCESORIAS
La superfamilia de las integrinas
La familia de las integrinas incluye más de
20 heterodímeros de superficie celular, diferen­
tes pero estructuralm ente relacionados, com­
puestos de cadenas a y |3 unidas en forma no-
covalente. Estas moléculas intervienen en la
adhesión de células a proteínas de la matriz ex­
tracelular (ECM) y en las interacciones célula-
célula. Se conocen 8 subunidades |3 y 14 subu­
nidades a. Varias integrinas que utilizan la ca­
dena p, han sido denominadas antígenos VLA
(very late after activation) dado que dos de los
primeros miembro,s de este grupo aparecen so­
bre los linfocitos después de su activación. Sin
em bargo, dado que la m ayoría de las células
del cuerpo expresan por lo menos una de las in­
tegrinas p i en forma constitutiva y puesto que
algunas de las cadenas pueden estar combina­
das con otras subunidades p, la nomenclatura
VLA dejó de ser apropiada y ha sido reempla­
zada por la nomenclatura a P (véanse cuadros
11-1 y 11-2).
La función general de los miembros de la fa­
m ilia de las integrinas es interactuar con una
amplia variedad de ligandos incluidos glucopro­
teínas de la ECM , componentes del comple­
m ento, y otras células “integrando” el medio
ambiente extracelular con el citoesqueleto. Si
bien las 8 cadenas P y las 14 cadenas a podrían
teóricamente dar origen a más de 100 heterodí­
meros, la diversidad real es mucho m ás restrin­
gida dado que muchas cadenas a se asocian con
una única cadena p y que otras cadenas a (por
ej., av ) se asocian con varias cadenas P diferen­
tes. Las integrinas individuales pueden unir más
de un ligando, y los ligandos individuales pue­
den ser reconocidos por más de una integrina
(cuadro 11-1). Algunas de las integrinas pueden
reconocer proteínas integrales de m em brana
pertenecientes a la superfamilia de las inmuno-
globulinas (ICAM-1, 2, 3 y VCAM-1) y mediar
la adhesión directa célula-célula.
Las integrinas intervienen en la adhesión cé­
lula-célula y célula-matriz en muchos procesos
fisiológicam ente importantes: desarrollo em­
brional, hemostasis, trombosis, cicatrización de
heridas, mecanismos de defensa inm une y no-
inmune, y transformación oncogénica.
De acuerdo a sus características estructura­
les, las integrinas pueden ser divididas en va­
rios subgrupos. Un grupo que sufre clivaje pos-
translacional de la cadena a , y otro grupo que
220 Aspectos básicos de la inmunidad

Cuadro 11-1. Nombres alternativos _yligandos de las integrinas

C adena a C adena ¡i N om bres alternativos Ligando

al pl C D 49a/C D 29, VLA-1 Colágeno, lam inina

al pl C D 49b/C D 29, V LA -2, [a/IIa Colágeno, lam inina
a2 pi C D 49c/C D 29, LV A -3 Fibronectina, lam inina, colágeno
a3 pl C D 49d/C D 29, V LA -4, LPAM ^2 F ibronectina, V C A M -1
a4 ¡57 C D 49d/-,L P A M -l Fibronectina, V C A M -1, H EV cercanas a las placas de P eyer
a4 p) C D 49e/C D 29. V LA -5, Ic/Ha Fibronectina
aS pi CD49Í7CD29, VLA-6, Ic/Ila Lam inina
a6 p4 C D 4 9 f/-. L am inina (?)
a6 pi -/C D 2 9 L am inina
a7 pi -/C D 2 9 (?)
a8 P2 C D H a /C D 18, LFA-1 íCA M -1,2,3
aL P2 C D Ilb /C D l8 , M A C-1, CR3 C 3bi, fibrinógeno, factor X, lCAM -1
aM P2 C D Ilc /C D lS , P150/95, CR4 C3bi, fibrinógeno
aX p3 C D 4 I/C D 6 I F ibrinógeno, fibronectina, vitronectina, throm bospondina
a l lb p3 CD 51/CD 61 V itronectina, fibrinógeno, throm bospondina, fibronectina, os-
teopontina
aV pi C D 51/C D 29 V itronectina, fibronectina
aV P5 C D 5 1 /- V itronectina
aV p6 C D 5 1 /- Fibronectina
aV ps C D 5 1 /- 9
a lE L p7 H M L -I,M 2 9 0 H EV cercanas a las placas de Peyer

contiene dominios de 180 a 200 aminoácidos,
llam ado dom in io s I (in se rtiv o -in te ra c tiv o )
(cuadro 11-2). Las cadenas a clivadas están
compuestas por un dominio transmembrana de
25-30 KD unido por unión disulfuro a una ca­
dena más larga totalmente extracelular. En ca­
da cadena a hay 18 a 24 cisteínas, y 14 a 16 de
ellas están conservadas en todas las subunida­
des a conocidas. El dominio I está compuesto
por 180 a 200 aminoácidos insertados a partir
del aminoácido 130.
Las cadenas p i, ¡52 y ¡53 humanas han sido
clonadas y completamente secuenciadas. Ellas
son semejantes en un 44% a 47% y conservan
las 56 cisteínas. Hay una alta conservación de
las cadenas p, a través de las especies. La P4 es
claramente diferente de las otras cadenas P de
las integrinas, es más grande (210.000 PM) y
s?u dominio citoplasmático supera los 1.000 aa.
La asociación de las cadenas a y p es requerida
para la expresión en la superficie celular y apa­
rentemente la velocidad de expresión estaría li­

C uadro 11-2. Propiedades moleculares de las integrinas

D om inio /
Cadena Tam año reducido T am año no-reducido de las integrinas Clivado

al 210.000 200.000 Sí No
a2 16,5.000 160.000 Sí No
a3 130.000/25.000 150.000 No Sí
a4 150,000 140.000 No No
aS 135,000/25.000 155.000 No Sí
a6 120.000/30.000 140.000 No Sí
a.1 95.000 120.000 No Sí
a8 140,000 160.000 No Sí
aL 180,000 170,000 Sí No
aM 170,000 165.000 Sí No
aX 150,000 145.000 Sí No
a l lb 120,000/25,000 145.000 No Sí
aV 125,000/24,000 150,000 No Sí
a lE L 150.000/25.000 175.000 7 Sí
81 130.000 110,000 No No
P2 95.000 90,000 No No
33 105,000 90.000 No No
34 220.000 210,000 No No
P5 110.000 100,000 No No
S6 106.000 No No
(estim ado)
P7 130.000 105,000 No No
P8 97.000 95,000 No No

mitada por la síntesis de la cadena a , la cual re­
gula la maduración y la aparición de la cadena
p en la superficie celular.
Se acepta que en cada integrina los dominios
N-terminal de las cadenas a y p se combinan
para formar una cabeza que une al ligando y
que los dominios citoplasmáticos pueden inte­
ractuar con proteínas del citoesqueleto. La pre­
sencia en cada cadena a de los dominios cito­
plasmáticos, que son estructuralmente únicos,
origina la posibilidad de que estos receptores
puedan interactuar con diferentes componentes
de! citoesqueleto.
Es importante destacar que una integrina par­
ticular en una célula dada puede no unirse a to­
dos los ligandos listados en el cuadro 11-1, Por
ejemplo, la a2 p 1 de las plaquetas une colágeno
pero no laminina, mientras que en otros tipos
celulares puede reconocer a ambos ligandos.
L a fam ilia de las integrinas (32
Las leucointegrinas
Las leucointegrinas constituyen una familia
de tres glucoproteínas de la superficie celular
que usan la cadena P2 de la familia de las inte­
grinas y que median la interacción célula-célu-
la en la inflamación. Estas glucoproteínas son
tam bién com únm ente d enom inadas LFA-1
(aL , (32 o C D lla /C D 1 8 ), Mac-1 (a M , [32 o
C D llb /C D lB ) y p l5 0 /9 5 (a X , (32 o C D c/
CD 18),
La familia de las selectinas
Esta familia de moléculas de adhesión está
compuesta de 3 glucoproteínas de la superficie
E-selectina
NH2
Lectina EGF
P-selectina
NH2 i / 1 ■■ 2 i!
Lectina EGF
L-selectina
NH2
Lectina EGF
F ig. 11-1. Esquem a de las estructuras de E P y L - .selectina. N6te.se e) dom inio lectina am ino term inal, el EG F, el nú­
m ero variable de m ódulos sim ilares a los encontrados en proteínas que unen com plem ento, el dom inio transm em brana y el
eitoplasm ático.
Moléculas de adhesión 221
celular presentes en células endoteliales (E-se-
lectina), plaquetas (P-selectina) y linfocitos (L-
seleetina),
A partir de estudios de secuencia se pudo
predecir la estructura de cada una de estas 3
moléculas: una proteína transmembrana con un
dominio N-terminal semejante a una lectina, un
mismo factor de crecimiento epidemial (EGF),
y un número variable de módulos (de aproxi­
madamente 60 aa, cada uno) similares a los en­
contrados en ciertas proteínas que unen com­
plemento (fig, 11-1), El término selectina fue
propuesto para resaltar el dominio lectina N~
terminal y para indicar la función y expresión
selectiva de estas moléculas (cuadro 11-3),
La relación encontrada entre la región N-ter­
minal de estas tres moléculas y los dominios de
reconocimiento de carbohidratos presentes en
las lectinas animales dependientes de Ca^^ dio
lugar a una búsqueda intensiva de los ligandos
carbohidratos involucrados,
E-,P-, y L- selectinas se unen a uno o más ti­
pos de carbohidratos, incluyendo estructuras
re la c io n a d a s al an tíg en o L ew is’' sialid ad o
(s L e’'), polisacáridos sulfatados (heparina, fu-
coidán), y monosacáridos y pohsacáridos fosfa­
tados. Además, las proteínas celulares específi­
cas pueden participar en la presentación de li­
gandos para selectinas. Si bien los detalles mo­
leculares de las interacciones ligando-selectina
no han sido aún determinados, se presume que
la unión de las selectinas individuales a diferen­
tes tipos de carbohidratos puede involucrar o no
el mismo mecanismo. Para conocer estas inte­
racciones se requerirá determinar las afinidades
de unión y las constantes de velocidad, así co­
mo del análisis cristalográfico por rayos X.
. 7 8 i, 0 y 'C O O H
222 Aspectos básicos de ia inmunidad

Cuadro 11-3. Moléculas de adhesión de la fam ilia de las selectinas: expresión y función
N om enclatura anterior E xpresada por: Se une a:

E-selectina ELAM -1 Endotelio N eutrófilos

M onocitos
A lgunas células T

P-selectina PA D G EM Plaquetas N eutrófilos

G M P -140 Endotelio M onocitos
A lgunas células T

L-selectina m L H R ,L e u 8 ,T Q -l,g p - L infocitos V énulas endoteliales supe­

9 0 « ® S L am -],L ec an j-l M onocitos riores de los nódulos lin fá­
N eutrófilos ticos

M oléculas de adhesión intercelular (ICAMs)
ICAM-1, ICAM-2, e ICAM-3 son moléculas
de la superficie celular que pertenecen a la su­
perfamilia de las inmunoglobulinas (véase cap.
5) y están distribuidas en diferentes tipos celu­
lares (endoteliales, epidemiales, fibroblásticas).
Estas moléculas intervienen frecuentemente en
las reacciones de adhesión y transmigración de
los leucocitos sanguíneos a través de la unión
directa a las integrinas de la superficie celular
de los leucocitos.
E structuralm ente, las ICAM s varían en el
número de dominios de inmunoglobulina en el
fragmento extracelular (fig. 11-2). Si bien estas
porciones extracelulares presentan un alto gra­
do de homología entre sí, las porciones intraci-
toplásmica y transmembrana presentan una ho­
mología mucho más baja. Sin embargo, el gra­
do de homología entre los dominios extracelu-
lares de las moléculas ICAM es variable. Por
ejemplo, ICAM-3 tiene una homología de se­
cuencia total del 48% con ICAM-1 y de sólo
31% con ICAM-2, aunque la homología entre
los dominios individuales varía marcadamente.
La gran similitud entre las diferentes moléculas
ICAM sugiere que todas ellas podrían derivar
de una misma molécula ancestral. Suponiendo
que fuera así, el grado de diversidad de estas
moléculas es ¡o suficientemente grande como
para determinar en ellas diferentes funciones,
ya que presentan diferencias en: la distribución
celular, su actividad de unión a LFA-1, y las
regiones citoplasmáticas.
VCAM-1 / INCAM-110
Si bien se conocía el rol de ICAM-1 y E-se­
lectina en la adhesión de los leucocitos a las cé­
lulas endoteliales, se presumía de la existencia

Dominios ig-“like”
iJ U iiiM ir u o l y -
iir v c

ICAM-1 (CD54)
7 7°L <V>^L m 9T7°L 20% 11 o/„ (510 aa)

ICAM-3 (CD50)
(518 aa)

lCAM-2 (GDI 02)

(256 aa)

F ig . 11-2. H om ología entre las p roteínas ICA M . N ótese la porción transm em brana (TM ) y la porción citoplasm ática
(Cyt).

de una tercera molécula de adhesión endotelial
inducible por citoquinas, dado que: I) la adhe­
sión de la mayoría de los linfocitos sanguíneos
periféricos al endotelio activado no podría ser
explicada totalmente por lCAM-1 y E-selecti­
na, y 2) ciertas células funcionales linfoides
(por ej., melanomas) se adhieren al endotelio
activado por mecanismos aparentemente inde­
pendientes de ICAM-1 y E-selectina.
Mediante el empleo de un anticuerpo mono­
clonal generado contra el endotelio activado
con TNF, se identificó una glucoproteína endo­
telial de 110 KD inducible por citoquinas que
es inm un o q u ím icam en te d istin ta de las ya
nombradas; se la denominó molécula de adhe­
sión celular inducible -110 (INCAM-110). Por
otra parte, empleando un c-DNA aislado de cé­
lulas endoteliales activadas con citoquinas,
otros investigadores identificaron una molécula
que participaba en la adhesión de los linfocitos
y la llamaron molécula de adhesión vascular-1
(VCAM-1). Poco después se demostró que se
trataba de la m ism a m olécula IN CAM -110.
A ctualm ente, el nom bre VCAM-1 es el más
empleado para esta proteína, que pertenece a la
superfamilia de las Igs y está compuesta de 1
dominio extracelular que contiene 7 dominios
de Ig, una región transmembrana y una región
citoplásmica corta.
La expresión de VCAM-1 sobre las células
endoteliales es inducida rápidamente por IL-1
y TN F-a en 6-12 horas. VCAM-1 está también
expresada en diversos tipos celulares no-vascu­
lares, incluidas células dendríticas en nódulo
linfático y piel, células estromales en m édula
ósea, y células sinoviales en articulaciones in­
flamadas.
La molécula VCAM-1 interviene en la adhe­
sión de las células endoteliales a linfocitos y
monocitos (pero no neutrófilos) a través de una
interacción con la in teg rin a a 4 [3 (V L A -4;
CD49d/CD29), la que también se une a la fi­
bronectina.
La expresión de VCAM-1 no está restringida
a las células endoteliales activadas, ya que esta
molécula es expresada por las células dendríti­
cas linfoides en amígdalas, bazo y nódulos lin­
fáticos periféricos, y por ciertos m acrófagos
presentes en bazo y timo. En consecuencia, es
posible que VCAM-1 juegue un rol como mo­
lécula coestimulatoria sobre la superficie de las
células accesorias durante la activación de las
células T específicas en ciertos sitios anatómi­
cos.
CD 44
CD44 (Pgp-1, Ly-24, ECMR-III) es una glu­
coproteína de membrana de naturaleza acídica
sulfatada de PM variable (80 kD - 200 kD) se­
Moléculas de adhesión 223
gún el grado de glucosilación y de asociación
de condroitín sulfato. Se expresa en las células
epiteliales, linfocitos T y B, queratinocitos y
una variedad de tumores, presentando diferen­
tes isoterm as. También se ha encontrado una
form a so lu b le en sangre y fluido sin o v ia l.
CD44 interactúa con diferentes superficies ce­
lulares y componentes de matrices, que inclu­
yen fibronectina, colágeno, y un glucosamino-
glucano no-sulfatado llamado hialuronato.
CD 31 (PECAM-1, endoCAM)
CD31 Es una glucoproteína transmembráni­
ca de aproximadamente 130 kD que se halla en
células endoteliales, plaquetas, neutrófilos, m o­
nocitos y subpoblaciones de células T, E s un
miembro de la superfamilia de las Igs que, se­
gún estudios de predicción de secuencia efec­
tuados a partir de su c-DNA, contendría 6 do­
minios de Ig. Esta molécula podría m ediar la
adhesión célula-célula a través de interacciones
h o m o fílic a s (C D 3 1 -C D 3 1 ) y h e te ro fílic a s
(CD31-contrarreceptor desconocido).
C D 3 1 está constitutivamente expresada y en
form a abundante en el endotelio. C uando las
células endoteliales entran en contacto para for­
mar una monocapa, C D 31 se redistribuye hacia
los bordes celulares y participa en las interac­
ciones célula endotelial-célula endotelial que
limitan la permeabilidad vascular.
Es probable que en los procesos inflam ato­
rios, la retracción celular del endotelio produci­
da por mediadores como la trombina y la hista­
m ina se deba a un efecto sobre CD31. Estos
mediadores estimulan la fosforilación de los re­
siduos de serina en la región citoplasmática de
CD31 modulando ias interacciones producidas
en el citoesqueleto.
Las interacciones de unión homofílicas entre
CD31 del leucocito y CD31 endotelial podrían
ser p artic u larm e n te im p o rtan tes d u ra n te la
transmigración, cuando el leucocito debería en­
contrar la mayor densidad de moléculas CD31
endoteliales.
CD 45
CD45 consiste de un grupo de glucoproteí-
nas integrales de m em brana cuyo PM oscila
entre 180 y 220 kD, y que sólo son expresadas
en linfocitos inmaduros y maduros, incluyendo
células T y B, tim ocitos, fagocitos m ononu­
cleares y leucocitos polimorfonucleares. L a fa­
milia del CD45 está constituida por múltiples
miembros que son todos productos de un único
gen complejo. Este gen contiene 34 exones, 3
de los cuales son alternativamente olivados a
nivel de la transcripción del RNA prim ario pa­
ra generar hasta 8 RNAm diferentes y 8 pro­
224 Aspectos básicos de la inmunidad
ductos proteicos diferentes. Según las secuen­
cias de aminoácidos, las proteínas predecibles
incluyen dominios externos de 391-552 am i­
noácidos, una región transmembrana, y un do­
minio eitoplasm ático muy conservado. A de­
más, ios diferentes patrones de glucosilación de
la misma estructura peptídica también contri­
buyen a ia lieterogeneidad de los miembros de
esta fam ilia de proteínas. Varios anticuerpos
monoclonales diferentes que reconocen miem­
bros individuales han sido de gran utilidad en
el estudio de la distribución y de las funciones
de las proteínas CD45.
Las isoformas de las proteínas CD45 que son
expresadas en un grupo restringido de tipos ce­
lulares son denominadas CD45R y su expre­
sión sobre las células T es de interés por varias
razones. En primer término, la expresión de di­
ferentes formas de CD45R es regulada por el
desarrollo durante el proceso de maduración de
las células T. Las distintas subpoblaciones de
células T que expresan CD4 en diferentes esta­
dios de maduración o con diferentes capacida­
des funcionales in vitro han sido diferenciadas
por la e x p re sió n de d ife re n te s fo rm a s de
CD45R. Las células T nativas expresan una
forma de CD45R llamada CD45RA, y las célu­
las T con memoria inducidas por la exposición
al antígeno expresan otra isoforma denominada
CD45RO. En segundo término, el dominio ci-
toplasmático largo de CD45 tiene una actividad
fosfatasa tirosina intrínseca, la que puede ser
importante en la regulación de los distintos ca­
minos de activación que involucran actividad
tirosina quinasa (véase cap. 13).
La migración transendotelial de las células
T en la inflamación crónica
Si bien muchas veces no se conocen los estí­
mulos etiológicos iniciadores de las respuestas
inflamatorias en la enfermedad clínica, un cua­
dro característico de la inflamación crónica ya
establecida es la persistente extravasación de
células mononucleares dentro del tejido. A un­
que en los tejidos inflamados se encuentran cé­
lulas de diversos tipos, incluidas las células T,
B, y presentadoras de Ag, parece ser que las
células T son las que orquestan la iniciación y
persistencia de muchas enfermedades inflama­
torias crónicas. Por ejemplo, la artritis reuma­
toidea (AR), que es una enfermedad inflamato­
ria crónica de etiología desconocida, se carac­
teriza por inflamación persistente del tejido si­
novia!, destrucción local de hueso y cartílago, y
muchas otras m anifestaciones sistémicas. La
activación de las poblaciones específicas de cé­
lulas T que han infiltrado la sinovia reumatoi­
dea, es el eje central de la evolución de esta en­
fermedad. Por consiguiente, para entender los
mecanismos inmunopatogénicos de tales enfer­
medades inflamatorias, es necesario entender
los mecanism os com plejos que gobiernan la
migración y acumulación de las células T en
las lesiones inflamatorias.
La capacidad de las células T para acceder a
los sitios inflam atorios está influenciada por
distintas propiedades de estas células, inclu­
yendo la expresión en su superficie de una va­
riedad de moléculas de adhesión, su movihdad
intrínseca y su capacidad para alterar su funcio­
nalidad m ediante interacciones con células,
moléculas de matriz extracelular y otras seña­
les de activación. Las células T, mediante inte­
racciones de adhesión mediadas por receptor,
pueden interactuar con las células endoteliales
que cubren las vénulas poscapilares que pue­
den potencialmente facilitar la entrada de célu­
las T en los tejidos. Dichos eventos mediados
por receptor son necesarios para la localización
celular, pero no son suficientes para la extrava­
sación, dado que no todas las células T que ex­
presan receptores de adhesión pueden tener ac­
ceso a todos los tejidos. Es decir, la extravasa­
ción exitosa de las células T en los tejidos in­
flamados parecería estar gobernada por otros
factores que incluyen la capacidad migratoria
de estas células.
Por otra parte, ei endotelio, que normalmen­
te funciona como una barrera a la extravasa­
ción celular, puede ser inducido a expresar
contrarreceptores para las moléculas de adhe­
sión de las células T, los cuales intervienen en
la unión y transmigración de las células T espe­
cíficas. Además, el endotelio puede tam bién
producir sustancias quemotácticas (quemoqui-
nas) proinflamatorias que pi'omueven la trans­
migración de las células T específicas. Por lo
tanto, la extravasación de las células T dentro
de los ciclos inflamatorios es la resultante de
un número de mecanismos fisiológicos distin­
tos. (Para mayor información véase cap. 23.)
M ecanism os de adhesión que median
el tráfico de linfocitos
En general, la extravasación de hnfocitos in­
volucra las actividades concertadas de una va­
riedad de receptores de adhesión. C om o se
muestra en la figura 11-3, la migración de las
células T dentro del tejido perivascular es un
proceso de adhesión de múltiples pasos que in­
volucra el contacto inicial de las células T a la
superficie de las células endoteliales, la induc­
ción o activación de receptores de adhesión de
la superficie celular para mediar uniones firmes
y estables con el endotelio, y luego el despegue
de las células unidas de modo tal que ellas pue­
dan transmigrar a través de la capa de células
endoteliales. La transmigración de los linfoci-

Linfocito T
Contacto Unión Desadhesión
inicial estabilizada
F ig. 11-3. E squem a de la migración transendotelial de los linfocitos com o un proceso de m últiples pasos.
tos unidos es también un proceso mediado por
receptores que involucra pares receptor-contra-
rreceptor específicos que pueden haber estado
implicados en la unión inicial o no. Las células
transmigrantes deben poseer una capacidad mi­
gratoria intrínseca, de modo que ellas se m ue­
van a través de la capa de células endoteliales
en vez de retornar nuevamente a la circulación.
No todas las células T circulantes pueden mi­
grar hacia los sitios inflamatorios. Las que lo
hacen in vivo tienen un fenotipo distintivo y
son subpoblaciones de células T con memoria.
R ecirculación n o rm al de los linfocitos
Durante la generación de las respuestas in­
munes efectivas, los linfocitos recirculan nor­
malmente a través de los tejidos linfoides y no-
linfoides. Varios estudios han demostrado que
el sitio hacia el cual los linfocitos recirculan es
dependiente en parte de su estado de diferen­
ciación. Las células T nativas que no se han en­
contrado previamente con el antígeno recircu­
lan predominantemente desde el torrente san­
guíneo hacia los tejidos linfoides secundarios,
mientras que las células T con memoria extra­
vasan dentro de los tejidos no-linfoides. Tanto
es así que cuando las eélulas T con mem oria
entran a los nódulos linfáticos de los sitios de
inflamación, lo hacen principalmente a través
de los linfáticos aferentes.
La extravasación de las células T en los nó­
dulos linfáticos periféricos involucra la unión
mediada por L-selectina, que es responsable de
las interacciones débiles de los linfocitos con
las vénulas endoteliales superiores especializa­
das. Los ligandos que intervienen en esta unión
son ohgosacáridos cargados que están expresa­
dos en los receptores superficiales de las célu­
las e n d o te lia le s (C D 34 y G LY C A M e n tre
otros). Además, los linfocitos usan L-selectina
para unirse a otros contrarreceptores que tam­
bién expresan oligosacáridos apropiados. Tal
Moléculas de adhesión 225
Trans­
migración
es el caso de la adresina vascular m ucosal
(MAdCAM-1) expresada por las vénulas endo­
teliales superiores del tejido mucosal.
N o se conocen bien los eventos de adhesión
que ocurren en las interacciones firmes célula
endotelial-célula T y en la migración transen­
dotelial a los nódulos linfáticos periféricos. La
inducción de la firme adhesión de los linfocitos
al endotelio de los nódulos linfáticos periféri­
cos parecería iniciarse con el disparo de una se­
ñal mediada por proteínas G, que puede ser in­
hibida por toxina pertussis. Las integrinas co­
mo LFA-1 (C D lla , CDl 8) pueden tam bién ju­
gar un rol, dado que se ha observado que los
anticuerpos monoclonales contra LFA-1 inhi­
ben parcialmente la unión de los linfocitos a las
vénulas endoteliales superiores de los nódulos
linfáticos periféricos.
Los neutrófilos también emplean L-selectina
para su anclaje en el endotelio y, luego, usan
L F A -1 en la estabilización de la adhesión y en
la migración transendotelial.
Reclutamiento de los linfocitos en los sitios
inflamados
Contrastando con los caminos norm ales de
recirculación de las células T, hay otros meca­
nismos que intervienen en el reclutamiento de
las poblaciones de las células T en los sitios ex-
travasculares. Durante las respuestas inflam ato­
rias, las células T con memoria se acumulan en
los tejidos. El endotelio del tejido inflam ado
crónicam ente expresa receptores de adhesión
involucrados en la extravasación de células T,
muchos de los cuales, incluidos VCAM-1, E-
selectina, y P-selectina, no son expresados por
las células endoteliales del tejido hnfoide se­
cundario ni por el tejido normal no-inflamado.
La expresión de estos receptores de adhesión
resulta de la exposición del endotelio a citoqui­
nas pro-inflamatorias como el TN F-a e inter­
leuquina 1(3 (IL-lp). Estos receptores se unen a
226 Aspectos básicos de la inmunidad
sus contrarreceptores presentes en las células T
y pueden facilitar así el reclutamiento selectivo
de estas células en los sitios inflamados.
La acumulación de células T se lleva a cabo
siguiendo una serie de pasos. Primero, éstas se
adhieren al endotelio, inicialm ente en form a
débil y después más fuertemente. Luego, algu­
nas de las células T unidas transmigran entre
las uniones celulares del endotelio. Estos pro­
cesos están controlados en forma separada por
moléculas de adhesión, que contribuyen a la
acumulación selectiva de subpoblaciones parti­
culares de células T en la lesión inflamatoria.
Unión de las células T
Es probable que la función de un número de
receptores de adhesión sea la de facilitar la in­
filtración de las células T en los sitios de infla­
mación. Tales pares de receptores-contrarre-
ceptores están esquem atizados en la figura
11-4. Como en el caso de L-selectina, las molé­
culas de adhesión CD44 y CD31 parecieran no
requerir un paso de activación y, por consi­
guiente, estos receptores de adhesión constitu­
tivam ente activos podrían in iciar p o ten cial­
mente la unión de las células T en reposo a las
células endoteliales.
La m olécula CD44, una glucoproteína ex­
presada en diversos tipos celulares (células T,
B, granulocitos, macrófagos, eritrocitos, célu­
las neurales, epiteliales y fibroblastos), une el
citoesqueleto de ciertas células con la m atriz
extracelular (colágeno, fibronectina, ácido hia­
lurónico) y, además, tiene otros ligandos como
la adresina vascular específica de tejido muco-
sal (MAd CAM -1).
Los contrarreceptores para C D 31 no son co­
nocidos, aunque se ha demostrado que pueden
unirse a la heparina. D uran te la m igración
transendotelial, la molécula C D 31 presente en
las células inflamatorias puede también inter­
venir en adhesiones homotípicas por dimeriza­
ción a CD31 de las células endoteliales. Es
probable que los receptores de adhesión cons­
titutivamente activos, al unirse a sus contrarre­
ceptores en las células endoteliales, disparen
señales intracelulares que conduzcan a la acti­
vación de las integrinas y, luego, a la estabili­
zación de la unión célula endotelial-célula T.
Por ejemplo, la unión de CD44 estimula un au­
mento en el calcio libre intracelular, la asocia­
ción de CD44 con el citoesqueleto, la agrega­
ción homotípica de las células T dependientes
de L F A -1, y la unión celular a células endote­
liales en cultivo.
En general, las uniones más estables entre
los hnfocitos y las células endoteliales son las
mediadas por las integrinas. Las m oléculas
VLA-4 y LFA-1, que intervienen en esta unión
en condiciones estáticas, requieren ser activa;
das para poder unirse a sus contrarreceptores.
La unión no resulta de un aumento en la expre­
sión de estas moléculas por parte de los hnfoci­
tos, sino que parecería estar relacionada con
cambios conformacionales en la estructura de
las mismas.
La m olécula de LFA-1 puede ser activada
funcionalmente in vitro por estimulación de los
linfocitos con ésteres de forbol, que activan la
proteína quinasa C, así como por la ligazón de
CD3 o por cultivo in vitro. En forma similar,
VLA-4 puede ser activada por la ligazón de
CD31 y presumiblemente por otras señales.
Si bien VLA-4 y LFA-1 median la adhesión
de los linfocitos a las células endoteliales, no
todas las uniones pueden ser explicadas por las
actividades de estas dos moléculas. El recono­
cimiento de VLA-4 por parte de VCAM-1 es el
más importante en la unión de las células T a
las células endoteliales activadas por citoqui­
nas. Si bien el receptor a 4 p7 es importante en
la recirculación de las céluias T, no se conoce
su rol en el reclutamiento de las células T en
los sitios inflam atorios. Recientem ente se ha
demostrado que el tejido sinovial inflamado, en
comparación con la sangre periférica y el flui­
do sinovial, está enriquecido en células T que
expresan a 4 ¡37. No se sabe aún si hay un re­
clutamiento selectivo de células T a 4 |37-t- des­
de la sangre periférica hacia el tejido sinovial,
o si hay inducción de la expresión de este re­
ceptor sobre las células T extravasadas por un
proceso de activación local. Tampoco se cono­
ce si las células endoteliales sinoviales expre­
san MAdCAM-1, un contrarreceptor de a 4 (37.
La molécula LFA-1 de las células T activa­
das y de las en reposo, interviene en la adhe­
sión a las células endoteliales no estimuladas
uniéndose a las moléculas de adhesión interce­
lular ICAM -1, ICA M -2 y, potencialm ente a
ICAM-3. En la unión de los linfocitos interven­
drían también las moléculas de E-selectina y P-
selectina, las que son expresadas por las células
endoteliales activadas. La adhesión de una sub­
población de células T con memoria a E-selec-
tina está mediada por el antígeno linfocitario
cutáneo (CLA). En el caso de la unión del lin­
focito a P-selectina, no se conoce la naturaleza
del contrarreceptor del linfocito si bien es muy
p ro b ab le que esté re la c io n a d o al an tíg en o
Lewis’^ sialidado. Otros receptores de adhesión,
como la proteína vascular-1 (V A P-I) y CD2,
podrían ser mediadores en las interacciones de
la célula T con el endotelio en los sitios de in­
flamación. La molécula VAP-1 interviene en la
unión de los linfocitos y está expresada en el
endotelio de muchos tejidos tales como los nó­
dulos linfáticos periféricos normales y los in­
volucrados en la inflamación crónica.

La unión de los linfocitos al endotelio puede
también ser facilitada por la unión de CD2 a
sus contrarreceptores CD58 (LFA-3), CD59 o
CD48. CD2 está expresada en todas las células
T y cumple un rol accesorio durante la activa­
ción de la célula T, mientras que las células en­
doteliales expresan los tres contrarreceptores
de CD2.
Transmigración de la célula T
En contraste con lo que sucede en la unión
de la célula T a las células endoteliales, sólo
un número limitado de receptores de adhesión
intervienen en la migración transendotelial de
las células T (fig. 11-4). El hecho de que no
todas las células T adheridas transmigren a tra­
vés de la capa celular del endotelio indica que
la adhesión y la migración son fenómenos se­
parados que estarían regulados por diferentes
señales intracelulares. Por ejemplo, los agentes
que elevan los niveles de AMPc, tanto en la
células T como en las células endotehales, in­
hiben la migración transendotelial pero no la
unión célula T-célula endotelial. Si bien no se
sabe cuáles son las señales que conducen la
m igración tran sen d o telial, es probable que
ellas involucren la acción de proteína quinasa
C, ya que el tratamiento de las células T con
ésteres de forbol estim ula la m ovilidad y la
migración transendotelial. Las señales que re­
gulan la migración transendotelial pueden ser
inducidas por la unión de los receptores de ad­
hesión, como es el caso de LEA-1 y de VLA-
4, que envían señales coestimulatorias a las cé­
lulas T. En consecuencia, la ligazón de los re­
ceptores involucrados en la unión célula T-cé-
lula endotelial podría ser importante no sólo en
el contacto célula-célula, sino también en la
transmisión de las señales que alteran la capa­
cidad funcional de las células.
Se ha demostrado, en experimentos de blo­
queo con anticuerpos monoclonales, que en la
migración transendotelial de las células T uni­
das a las células endoteliales, intervienen LEA-
1 e ICAM-1, pero no VLA-4, VCAM-1, LEA-
3 ni E-selectina. Más aún, esto fue observado
en células endotehales activadas con IL -ip en
las cuales la interacción inicial estuvo mediada
por uniones VLA-4 - VCAM-1. Estos resulta­
dos implican que un número de receptores de
adhesión que intervienen en la adhesión inicial
entre las células T y las endotehales no juegan
necesariamente un rol principal durante la m i­
gración transendotelial subsiguiente.
Resultados de experiencias in vivo indican
que la molécula ICAM-1 interviene en la infil­
tración de los linfocitos dentro de la sinovia
reum atoidea. En efecto, la administración de
anticuerpo monoclonal específico para ICAM-
Moléculas de adhesión 227
1 a pacientes con artritis reumatoidea provoca
una marcada modificación en la actividad de la
enfermedad, presumiblemente por la alteración
del tráfico de las células T en los tejidos.
Por otra parte, la extravasación de los linfo­
citos en los sitios de inflamación, además de
ser facilitada por la acción de las moléculas de
adhesión, es aumentada por la elaboración de
mediadores quemotácticos. Ciertas quemoqui-
nas, que inducen específicamente la quemota-
xis de poblaciones específicas de células T,
también pueden activar receptores de la adhe­
sión de linfocitos.
Marcadores de las células T migrantes
La naturaleza de las células T que han extra­
vasado en los sitios inflamatorios ha sido objeto
de diversos estudios. El tejido sinovial reum a­
toideo contiene poblaciones de células T que
tienen el fenotipo de la célula con m em oria
(CD4VCD45 ROVCD45 RA7CD29/L-selecti-
na/CD7), y además expresan mayor número de
ciertos receptores de adhesión. Estas células
también expresan cieitas moléculas característi­
cas de las células T activadas. La acumulación
perivascular de células T con memoria activa­
das también se ha encontrado en una variedad
de procesos inflamatorios crónicos que involu­
cran a otros órganos. En tejidos inflamados y en
fluidos sinoviales en la artritis reum atoidea,
además de células T CD4+ se han encontrado
células T CD8*. Por otra parte, las células T y8,
aunque en un menor número, están significati­
vamente enriquecidas. Por lo tanto, los tejidos
inflamados crónicamente, tales como la sinovia
reumatoidea, están infiltrados por una variedad
de diferentes poblaciones de células T.
La acumulación de poblaciones específicas
de células T en los tejidos inflamados podría
ser explicada por el reclutamiento específico,
retención, o la activación local y posterior dife­
renciación, o ambos.
Tanto las subpoblaciones de células T CD4+
como las CD4^ tienen capacidad para m igrar a
través del endotelio. Las células T yS son las
que tienen m ayor capacidad m ig rato ria, si­
guiendo en la frecuencia de migración las célu­
las T a p CD8+ y luego las células T a p CD4+.
La figura 11 -5 muestra los distintos fenotipos
de las diferentes poblaciones migratorias de las
células T.
Las células T CD4“^ migratorias expresan el
fe n o tip o CD45 R O V C D 29 (a u m .)/L E A -l
(aum.)/VLA-2VVLA-4 (aum.)/VLA-5 (aum .)/
CD 44 (aum .)/L F A -3 (aum .)/C D 27 (d ism .)/
CD26 (aum.)/CD31 (dism.)/L-selectina-.
Aparentemente las células T del torrente cir­
culatorio normal no requieren ser activadas pa­
ra migrar, dado que la mayoría de las células T
228 Aspectos básicos de la inmunidad

LFA-1/1CAM-1 # lCAM-2

VLA-4/VCAM-1

P-selectina / oligosacárido cargado

Fig. 11-4. Izares de receptor - contrarreceptor que facilitan la extravasación de las células T hacia los sidos de in flam a­
ción.

CD4+ migratorias no expresan los marcadores
de activación HLA-DR, CD25 y CD69. Es no­
table como todas, las células CD4+ migratorias
expresan densidades igualmente aumentadas de
VLA-4, CD44 y CD26, mientras que ninguna,
o muy pocas, de las células T no-migratorias
expresan este fenotipo. Salvo en la falta de ex­
presión de los marcadores de activación, las cé­
lulas T CD4+ m igratorias tienen un fenotipo
que recuerda al de las células T identificadas
en los tejidos inflamados crónicamente. Es pro­
bable que la expresión de los m arcadores de

L-SDlcclina
CD4- y/8RcT+
GD45RO*

CD7dis CD45RA CD8-

VLA-4ini Seleetina >

/
CD45RO+
VLA-5int
CD8- I CD2r CD8-f
CD44int^l^
CD26int lA - l in t VLA-4* V L-selectina

CD58in C D45RO FLA-1int

:D 3 d is CD 44ínt / CD29+
VLA-5*
VLA-4*
CD45RA VLA-5*
RcTo/p CD4* RcTy/5
CD26int
F LA -lin t
CD44int

RcTo/p CDS*

F ig. 11-5. M igración transendotelial de las células T.


activación y la retención dentro de los tejidos
sean consecuencia de fenóm enos posteriores
que ocurren en los sitios de inflamación.
Si bien la migración de las células T norma­
les, aparte de la interacción con el endotelio, no
requiere activación específica, la estimulación
puede aumentar la capacidad migratoria de al­
gunas células T adicionales. Sin embargo, sólo
hay diferencias modestas en los fenotipos de
las células T que migran después de haber sido
activadas.
Los resultados de investigaciones recientes
insintian que las células T CD4+ con memoria
m igran en form a p re fere n c ial sin ten er en
cuenta su estado de activación. Si bien la acti­
vación aumenta el número de las células que
migran, parecería no ser necesaria para que la
mayoría de las células crucen las barreras en­
doteliales.
En concluisión, la capacidad para la m igra­
ción transendotelial es una propiedad intrínseca
de las células con memoria que está algo au­
mentada por las señales de activación.
Transmigración de las células jb
En los tejidos inflamatorios crónicos, además
de las células T CD4+, hay un número reducido
de células CD4". Entre las últimas están las que
son TCR ap-^/CDS* como las TCR yS/CDS^ y
CD 8 “. Todas estas poblaciones contienen célu­
las migratorias en mayor frecuencia que las cé­
lulas T a p CD4+. Se ha establecido el fenotipo
de estas células migratorias CD4 . La mayoría
(> 80%) de las células T TCR aP-h/CD 8 + con
una capacidad m igratoria transendotelial son
CD45 R0+, no obstante algunas células T CD45
RA+ (< 40%) también migran. Las células mi­
gratorias también poseen estas características:
C D 29 (a u m .)/C D 2 6 + /L -s e le c tin a -/L E A -l
(aum .)/C D 44 (aum .)/V L A -4V V L A -5" (fig.
11-5). Además, como ocurre con la subpobla­
ción CD4+, el fenotipo de las células T C D 8 -I-
migratorias no es afectado por la activación o
por la estimulación del endotelio por citoqui­
nas. La intensidad de la expresión de las p l in­
tegrinas (VLAs) en las células T CD 8 + migra­
torias es menor que en las células T CD4+. Da­
do que las p i integrinas son importantes m e­
diadores de las in teraccio n es celulares con
componentes de matrices extracelulares, la lo­
calización preferencial de las células T CD4+
en muchos tejidos inflamados podría reflejar su
retención selectiva en los tejidos que poseen
expresión aumentada de los receptores de pi
integrinas. A este respecto, se ha observado
que las células T a p CD 8 + no son retenidas en
los sitios de hipersensibilidad de tipo retardada,
com o efe c tiv a m e n te lo son las c élu las a P
CD4+. La expresión diferencial de las pl inte­
Moléculas de adhesión 229
grinas sobre las células T aP CD4+ y CD 8 + po­
drían contribuir a este fenómeno.
Aunque el rol de las células T TCR 7 8 “^ no es
totalm ente conocido, estas parecen ser funda­
mentales en la vigilancia inmune. En el hombre,
estas células, que recirculan preferencialmente a
través de los órganos no-linfoides, se acumulan
en los tejidos inflamados, incluyendo la sinovia
reumatoidea. No se sabe aún si la presencia de
las células T TCR 7 8 ' en los diferentes tejidos es
debido al aumento de la capacidad migratoria
transendotelial de estas células.
Las células T TCR y8 ^ contienen una pobla­
ción principal CD4 /C D 8 “, y una menor CD4-
/CD 8 *, y también expresan CD45 RO y CD45
RA (fig. 11-5). Todas las células T yS expresan
intensamente CD29 (aum.). Algunas de las cé­
lulas T yS migratorias expresan tanto CD45 RO
como CD45 RA, sugiriendo que ellas pueden
haber sido recientemente activadas y están en
el proceso de diferenciación. Por consiguiente,
para las células T y5, las células T CD45 RA
pueden migrar efectivamente, a diferencia de
las células T aP migratorias, las cuales son en
su mayoría CD45 RA“. Esto es consistente con
la observación de que la sinovia reum atoidea
contiene células T TCR y8+/CD45 RA+. Las cé­
lulas T y 8 de la sangre periférica también ex­
presan en forma intensa y uniforme LFA-1 y
CD44; por lo tanto estos dos m arcadores no
distinguen a las células migratorias de las otras
poblaciones.
A diferencia de otras poblaciones migratorias
de células T, muchas células T yS migratorias
expresan intensamente L-selectina. Si bien en el
bovino las células T y 8 usan L-selectina al unir­
se a las células endoteliales de los nódulos lin­
fáticos periféricos, no se sabe si en el hombre
las células T y8 pueden utilizarla para la m igra­
ción transendotelial. Las células T TCR y5+, de­
bido a la expresión de L-selectina, podrían estar
involucradas en la iniciación de las respuestas
inflamatorias. Mediante un mecanismo similar
al usado por los neutrófilos, la m olécula de
L-selectina podría mediar las interacciones ini­
ciales de las células T y8 con el endotelio cuan­
do la inflamación no está acentuada, y el flujo
sanguíneo está intacto. Subsiguientemente, la
estabilización de la adhesión por los receptores
de adhesión para las integrinas podría permitir
la migración transendotelial de las células T y5
hacia el tejido. La presencia de estas células en
el tejido y la activación de las mismas, podría
inducir alteraciones fenotípicas y funcionales en
el endotelio, resultando en una disminución del
flujo sanguíneo, un aumento en la expresión de
las moléculas de adhesión, o en la elaboración
de quemoquinas, o ambos. Tales condiciones
podrían permitir la extravasación de las células
T TCR a p “^ con capacidad migratoria y la acu­
230 Aspectos básicos de la inmunidad
mulación de las mismas en el tejido inflamado
y en los compartimentos fluidos.
En resumen, la migración transendotelial es
una propiedad intrínseca de distintas subpobla­
ciones de células T que tienen características fe­
notípicas específicas. Una variedad de recepto­
res de adhesión desempeña un papel central en
el reclutamiento selectivo de estas poblaciones
celulares en los sitios inflamatorios y, por con­
siguiente, en la patogénesis de las enfermedades
inflamatorias crónicas. Durante las condiciones
inflamatorias, las moléculas de adhesión inter­
vienen en las interacciones de los linfocitos con
las células endoteliales y con las moléculas de
la matriz extracelular durante la migración tran­
sendotelial, y en el envío de señales coestimula-
torias involucradas en la activación de estas cé­
lulas, Las poblaciones específicas de las células
T capaces de entrar en el tejido, pueden cambiar
a medida que evoluciona la lesión inflamatoria.
La perpetuación de las respuestas está dada por
la orquestación de la entrada de subpoblaciones
específicas de células T en los sitios inflamato­
rios, y ofrece muchos blancos para las potencia­
les intervenciones terapéuticas.
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Citoquinas
ELIDA ALVAREZ
INTRODUCCIÓN
La respuesta inmune es el fruto de la interac­
ción entre los linfocitos T (LT), los linfocitos B
(LB) y los monocitos/macrófagos. Esta coope­
ración conduce a la proliferación celular, la
producción de anticuerpos (Ac), la diferencia­
ción de células citotóxicas, el aumento de la ac­
tividad microbicida y la diferenciación hemato-
poyética.
La regulación de esta compleja red de res­
puestas inm unitarias e inflamatorias depende
sobre todo de la comunicación entre las células
participantes e interactuantes, la cual se logra
por medio de moléculas proteicas solubles que
se denominan citoquinas.
En la inmunidad natural la mayoría de estas
proteínas son elaboradas por monocitos y fue­
ron por ello denominadas monoquinas. En este
caso, las citoquinas pueden ser elaboradas co­
mo respuesta directa a los microorganismos o
también como consecuencia de estímulos indu­
cidos por el Ag sobre los LT, los que luego a
su vez estimulan la secreción de factores solu­
bles por parte de los monocitos/macrófagos.
La mayoría de las citoquinas producidas en
la respuesta inmune específica son elaboradas
por los LT y por ello tales moléculas son cono­
cidas como linfoquinas. Las células T produ­
cen una serie de moléculas que sirven en pri­
mera instancia para regular el crecimiento y la
diferenciación de varias poblaciones linfocita­
rias y por ello son factores esenciales de la res­
puesta T dependiente. También producen sus­
tancias que activan y regulan las células que
participan de las respuestas inílamatorias/efec-
toras ejercidas por macrófagos/mononucleares,
neutrófilos y eosinófilos.
12
Adem ás, se producen otras citoquinas que
estimulan el crecimiento y la diferenciación de
células indiferenciadas de médula ósea las que
son denominadas factores estimulantes de co­
lonias (CSFs).
Por lo expuesto, es necesario tener presente
que las interacciones de las citoquinas deben
ser analizadas como un todo integrado en el
que se incluyan las relaciones de las células del
sistema inmune con células ubicadas fuera de
dicho sistema y también con las células que di­
rigen y controlan el proceso hematopoyético.
Los prim eros estudios sobre citoquinas se
extendieron entre 1950-1970 e im plicaron la
descripción de num erosos factores proteicos
producidos por varios tipos celulares. C ada uno
de ellos m ediaban alguna función b iológica
particular definida por ensayos realizados “in
vitro”.
Una segunda fase de la investigación, desa­
rrollada a partir de 1970, involucró la purifica­
ción parcial y la caracterización de m uchas ci­
toquinas individuales junto con la producción
de antisueros neutralizantes de su acción. En
este período, distintos investigadores estudia­
ron diferentes efectos biológicos, los cuales en
realidad eran mediados por las mismas molécu­
las. Por ejem plo, el interferón j (IFN y) fue
descubierto por equipos de virólogos com o un
producto derivado de los LT, el cual poseía
propiedades antivirales e independientem ente
fue descubierto por los inmunólogos también
como un factor producido por los LT, el que
actuaba como un activador de las funciones del
macrófago. Hechos similares acontecieron con
la IL-1, descubierta como un estimulador endó­
geno, mediador del aumento de la temperatura
corporal el cual se producía en respuesta a in-
230 Aspectos básicos de la inmunidad
mulación de las mismas en el tejido inflamado
y en los compartimentos fluidos.
En resumen, la migración transendotelial es
una propiedad intrínseca de distintas subpobla­
ciones de células T que tienen características fe­
notípicas específicas. Una variedad de recepto­
res de adhesión desempeña un papel central en
el reclutamiento selectivo de estas poblaciones
celulares en los sitios inflamatorios y, por con­
siguiente, en la patogénesis de las enfermedades
inflamatorias crónicas. Durante las condiciones
inflamatorias, las moléculas de adhesión inter­
vienen en las interacciones de los linfocitos con
las células endoteliales y con las moléculas de
la matriz extracelular durante la migración tran­
sendotelial, y en el envío de señales coestimula-
torias involucradas en la activación de estas cé­
lulas, Las poblaciones específicas de las células
T capaces de entrar en el tejido, pueden cambiar
a medida que evoluciona la lesión inflamatoria.
La perpetuación de las respuestas está dada por
la orquestación de la entrada de subpoblaciones
específicas de células T en los sitios inflamato­
rios, y ofrece muchos blancos para las potencia­
les intervenciones terapéuticas.
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Citoquinas
ELIDA ALVAREZ
INTRODUCCIÓN
La respuesta inmune es el fruto de la interac­
ción entre los linfocitos T (LT), los linfocitos B
(LB) y los monocitos/macrófagos. Esta coope­
ración conduce a la proliferación celular, la
producción de anticuerpos (Ac), la diferencia­
ción de células citotóxicas, el aumento de la ac­
tividad microbicida y la diferenciación hemato-
poyética.
La regulación de esta compleja red de res­
puestas inm unitarias e inflamatorias depende
sobre todo de la comunicación entre las células
participantes e interactuantes, la cual se logra
por medio de moléculas proteicas solubles que
se denominan citoquinas.
En la inmunidad natural la mayoría de estas
proteínas son elaboradas por monocitos y fue­
ron por ello denominadas monoquinas. En este
caso, las citoquinas pueden ser elaboradas co­
mo respuesta directa a los microorganismos o
también como consecuencia de estímulos indu­
cidos por el Ag sobre los LT, los que luego a
su vez estimulan la secreción de factores solu­
bles por parte de los monocitos/macrófagos.
La mayoría de las citoquinas producidas en
la respuesta inmune específica son elaboradas
por los LT y por ello tales moléculas son cono­
cidas como linfoquinas. Las células T produ­
cen una serie de moléculas que sirven en pri­
mera instancia para regular el crecimiento y la
diferenciación de varias poblaciones linfocita­
rias y por ello son factores esenciales de la res­
puesta T dependiente. También producen sus­
tancias que activan y regulan las células que
participan de las respuestas inflamatorias/efec-
toras ejercidas por macrófagos/mononucleares,
neutrófilos y eosinófilos.
12
Adem ás, se producen otras citoquinas que
estimulan el crecimiento y la diferenciación de
células indiferenciadas de médula ósea las que
son denominadas factores estim ulantes de co­
lonias (CSEs).
Por lo expuesto, es necesario tener presente
que las interacciones de las citoquinas deben
ser analizadas como un todo integrado en el
que se incluyan las relaciones de las células del
sistema inmune con células ubicadas fuera de
dicho sistema y también con las células que di­
rigen y controlan el proceso hematopoyético.
Los prim eros estudios sobre citoquinas se
extendieron entre 1950-1970 e im plicaron la
descripción de num erosos factores proteicos
producidos por varios tipos celulares. C ada uno
de ellos m ediaban alguna función b iológica
particular definida por ensayos realizados “in
vitro”.
Una segunda fase de la investigación, desa­
rrollada a partir de 1970, involucró la purifica­
ción parcial y la caracterización de m uchas ci­
toquinas individuales junto con la producción
de antisueros neutralizantes de su acción. En
este período, distintos investigadores estudia­
ron diferentes efectos biológicos, los cuales en
realidad eran mediados por las mismas molécu­
las. Por ejem plo, el interferón j (IFN y) fue
descubierto por equipos de virólogos com o un
producto derivado de los LT, el cual poseía
propiedades antivirales e independientem ente
fue descubierto por los inmunólogos también
como un factor producido por los LT, el que
actuaba como un activador de las funciones del
macrófago. Hechos similares acontecieron con
la IL -I, descubierta como un estimulador endó­
geno, mediador del aumento de la temperatura
corporal el cual se producía en respuesta a in­
232 Aspectos básicos de la inmunidad
fecciones bacterianas mientras que los inmunó­
logos lo revelaban como un factor co-estimu-
lante de la proliferación de células tímicas. Es
importante destacar que en esta etapa la carac­
terización biológica y química fue un logro de
las investigaciones inmunológicas. Cabe agre­
gar que, como consecuencia de los estudios
realizados en estos tiempos, surgió la idea de
que las citoquinas eran principalmente produci­
das por leucocitos con el fin de m antener en
prim era instancia relaciones intercelulares y
por ello surgió la idea de denominarlas inter-
leuquinas(IL).
La era de mayores avances en la investiga­
ción de las citoquinas com enzó en 1.980, las
mismas fueron entonces caracterizadas a través
del clonado molecular, la expresión en forma
individual de cada una de ellas y por la obten­
ción de anticuerpos monoespecíficos (frecuen­
temente monoclonales) contra las mismas, los
que permitieron neutralizar su acción. Con es­
tos reactivos y el desarrollo de nuevas estrate­
gias se logró la identificación de la estructura y
propiedades de cada citoquina en particular. El
entendimiento global de los complejos patrones
de estímulos inducidos, así como la participa­
ción en las diferentes fases y mecanismos de la
respuesta inmune en los que estos factores par­
ticipan podrá obtenerse gracias al desarrollo de
nuevas estrategias de estudios con la utiliza­
ción de citoquinas recom binantes, anim ales
transgénicos para la expresión de sus genes y
animales obtenidos por tecnología “knock-out”
en los cuales se consigue la falta de expresión
de dichas moléculas.
Los estudios emprendidos en los últimos 25
años han permitido reconocer que estas sustan­
cias no sólo afectan la respuesta inmune, la he­
matopoyesis y la integración del sistema inm u­
ne con el sistem a neuroendocrino, sino que
también están im plicadas en la fisiopatología
de un gran número enfermedades entre otras el
cáncer, las inmunodeficiencias, las enfermeda­
des autoinmunes y los procesos infecciosos. Un
mejor entendimiento de su accionar permitirá
el uso de las citoquinas como potenciales agen­
tes bioterapéuticos así com o tam bién lo p o ­
drían ser la utilización de formas solubles de
sus receptores o anticuerpos monoclonales es­
pecíficos y el desarrollo de biomoléculas ago­
nistas o antagonistas de sus efectos.
Propiedades generales
Si bien las citoquinas representan un conjun­
to de moléculas muy diversas comparten una
serie de propiedades que las definen desde el
punto de vista biológico. Estas sustancias son
glucoproteínas o proteínas de bajo peso mole­
cular (PM), generalmente 8-75 kD, las que son
producidas durante la fase efectora de la res­
puesta inmune tanto natural como de la especí­
fica, con el fin de mediar y regular la amplitud
y duración de las respuestas inmune e inflama­
toria.
La producción de las citoquinas está caracte­
rizada por producirse en un evento breve y au-
tolimitado. No se encuentran preelaboradas en
compartimentos celulares sino que la síntesis
se inicia como consecuencia de acciones bre­
ves que implican la transcripción y obtención
del ARN mensajero (ARNm), el cual es muy
inestable. Las secuencias ricas en poli UAUU
en las regiones 3 ’no traducidas de los ARNm
de muchas citoquinas se relacionan de manera
directa con una rápida degradación por aumen­
to de la sensibihdad a la acción de nucleasas.
Estos hechos aseguran que la producción de las
citoquinas sea un hecho trasciente. Se observó
además que algunas citoquinas poseen un me­
canismo postranscripcional que permite el con­
trol de su producción, por ejemplo, la libera­
ción de enzimas que transforman los productos
activos en inactivos.
La síntesis de una citoquina en particular
puede estar influenciadas por la síntesis de
otras produciéndose entonces una reacción en
cascada. Se generan así una serie de circuitos
regulatorios tanto para el sistema inmune como
también para el sistema inflamatorio.
Otro hecho que caracteriza a estas moléculas
es que una misma citoquina pueden ser produ­
cidas por múltiples tipos celulares y a su vez
cada una de ellas pueden actuar sobre células
d ife re n te s, e sta p ro p ie d a d es d e n o m in a d a
pleiotropismo.
Las acciones de las citoquinas pueden resul­
tar aún sobre el mismo blanco en diferentes
efectos según el tiempo y la concentración del
factor secretado. Existe una considerable su­
perposición y redundancia entre las mismas da­
do que ciertos efectos son compartidos entre
ellas.
La acción de una citoquina puede en algunos
casos interactuar con la de otra produciéndose
efectos sinérgicos en algunas ocasiones y an­
tagónicos en otras.
Tal como ocurre con las hormonas, la acción
de las citoquinas se produce por unión a recep­
tores específicos (R) presentes en las superfi­
cies celulares. Sin embargo, a diferencia de las
hormonas las citoquinas ejercen su acción a ni­
vel local, activando receptores presentes en las
mismas células elaboradoras, ejerciéndose una
acción autocrina o interactuando con recepto­
res de células que se encuentran en la cercanía
ejerciendo una efecto paracrino. Sólo en cier­
tas ocasiones puede hallarse un efecto sobre cé­
lulas distantes en el caso en los que las concen­
traciones liberadas hacia el torrente circulatorio

son muy altas, pudiendo ejercer entonces una
acción endocrina.
Los receptores para citoquinas pertenecen a
diferentes familias, pero todos ellos se caracte­
rizan por ser específicos y de muy alta afini­
dad po r sus lig a n d o s, p resen ta n K d e n tre
Como consecuencia de ello sólo
muy pequeñas cantidades de citoquinas (con­
centraciones femtomolares) son requeridas para
gatillar el efecto biológico. La expresión celu­
lar de estos receptores es regulada a través de
señales específicas que pueden ser generadas
por otra o aún la misma citoquina, lo cual per­
mite amplificar una señal positiva o generar un
efecto de retroalimentación negativa.
La respuesta celular a las citoquinas es lenta
(hs) dado que requiere de la form ación del
ARNm y de la posterior síntesis de las proteí­
nas. Luego la señal generada parece ser que es­
timula la unión de factores nucleares específi­
cos que a su vez regulan la transcripción. D ife­
rentes mecanismos llevan a la transcripción ge­
nética y a la síntesis de las proteínas, aunque
hasta el presente para la mayoría de ellas sigue
siendo desconocido el verdadero camino de ac­
tivación celular.
Clasificación funcional de las citoquinas
De acuerdo con lo expuesto en el desarrollo
de la introducción y las propiedades generales
de las citoquinas, se deduce que los roles fisio­
lógicos atribuibles son de singular importancia.
Todos ellos se encuentran interconectados de
manera tal que, a pesar del amplio éxito logra­
do en la clonación y el conocimiento de las se­
cuencias nucleotídicas y aminoacídicas de cada
factor en particular y de muchos de sus recep­
tores, aún permanecen muchos interrogantes en
relación con las vías a través de las cuales se
integran las células blanco y la manera en que
los múltiples estím ulos recibidos se transfor­
man en una respuesta eficiente.
Desde el punto de vista de una mejor inter­
pretación de sus efectos, podemos agruparlas
en diferentes categorías teniendo en cuenta las
principales acciones ejercidas por cada una en
especial pero en realidad la mayoría de ellas
puede ser incluida en más de una de las catego­
rías indicadas,
- Citoquinas m.ediadoras de la respuesta in ­
m une innata, secretadas en respuesta a agen­
tes infecciosos capaces de activar a los fa g o ci­
tos mononucleares. Este conjunto de citoquinas
tiene fundam entalm ente acción contra las in ­
fecciones virales y/o aquellas que se inician por
procesos inflamatorios y que confieren protec­
ción contra las infecciones bacterianas,
- Citoquinas reguladoras de la activación,
el crecimiento y la diferenciación linfocitaria,
Citoquinas 233
las que son producidas en la respuesta in m u n e
específica. Ejercen una acción reguladora sobre
el crecimiento y la diferenciación de los linfo­
citos a la vez que son mediadores de las fases
de activación de la respuesta específica, tanto
de la respuesta inmvme humoral como celular.
- Citoquinas reguladoras de las respuestas
efectoras e inflamatorias producida como con­
secuencia de una respuesta inm une específica.
Estas citoquinas derivan fundamentalmente de
los LT CD4+ y CD8+, permiten activar los m e­
canismos efectores no específicos. Tienen un
rol importante en la fase efectora mediada por
células.
- Citoquinas que actúan como factores esti-
m ulatorios de la hem atopoyesis y del cre c i­
miento y de la diferenciación de los leucocitos
inmaduros. Dado que en las respuestas inm une
e inflamatoria se pi'oduce una utilización y con­
sumo de células, éstas deben ser continuamente
reemplazadas. Las nuevas células son produci­
das como consecuencia de una progresiva ex­
presión y diferenciación a partir de células plu­
ripotenciales {stem cells). Las citoquinas que
participan de este accionar (CSFs) estimulan la
formación de colonias celulares en la m édula
ósea (MO). La denominación de cada u n a de
ellas refleja el tipo de colonias que son capaces
de inducir in vitro. Es interesante observar que
la mayoría de los CSFs están localizados en un
conjunto de genes ubicados sobre el crom oso­
ma 5 humano y II nmrino. En el cuadro 12-1
se ejemplifica cada una de las categorías enun­
ciadas.
Receptores de citoquinas
Las propiedades y efectos producidos p o r las
citoquinas se explican por la estructura y la dis­
tribución celular de los receptores de m em bra­
na capaces de unirlas específicamente. A pesar
del hecho de cjue los mecanismos im plicados
en las señales de transducción no están aún
aclarados, existe abundante información en re­
lación a las estructuras de la mayoría de estos
receptores.
La principal función del receptor es recono­
cer específicam ente a una citoquina d a d a y
convertir esa interacción en una señal intracelu­
lar adecuada.
Todos los receptores de citoquinas co n o ci­
dos son glucoproteínás, constituidos por lo m e­
nos por tres regiones. Un dominio extracelular'
el cual provee de la región de reconocimiento
para la citoquina y genera la especificidad de
unión para el ligando; una región transmembra­
na expandido a lo largo de ía biocapa lipídica
de la membrana plasmática y el dominio intra­
c e lu la r resp o n sab le de g en erar la se ñ a l de
transducción; esta íiltim a región puede tener
234 Aspectos básicos de la inmunidad
Cuadro 12-1. Clasificación funcional de las citoquinas que participan de la respuesta inmu­
ne e inflamatoria
l 'i iiu i p ü ie s circiiin c.-
M e d i a d o r e s t l e li! r o s p u e s u i i n i i a l a
R egulación de la activación, del crecim iento y de la diferen­
ciación de los linfocitos B y T .
A ctivación de m ecanism os efectores
Estim ulación del crecim iento y la diferenciación de células
inm aduras
actividad enzimática intrínseca o, en otros ca­
sos, puede tener capacidad para unirse a otras
moléculas que son responsables de crear la se­
ñal intracelular en respuesta a la unión de la ci­
toquina al dominio extracelular del receptor.
En la actualidad es bien conocido que algunos
receptores de citoquinas están constituidos por
una simple cadena polipetídica, la cual cumple
todas las funciones y en cambio otros pueden
ser receptores constituidos por complejos mul-
ticatenarios, donde algunas cadenas efectúan la
unión específica del ligante y otra es la encar­
gada de producir la señal de transducción que
lleve a la respuesta celular, por lo general esta
última cadena es compartida por diferentes uni­
dades receptoras (fig, 12-1).
Dado que los genes de un gran número de
receptores para citoquinas han sido clonados,
lográndose la expresión de las proteínas y obte­
niéndose la secuencia de las mismas, se llegó a
determ inar las similitudes estructurales entre
ellas y se estableció la existencia de secuencias
conservadas. En base a tales unidades estructu­
rales o secuencias homólogas los receptores de
citoquinas fueron agrupados en cinco superfa-
milias (fig. 12-2).
El primer grupo lo constituyen los receptores
que pertenecen a la su p erfa m ilia de las Igs.
Estos receptores están caracterizados por un
número variable de dominios Ig. símil y pre­
sentar actividad tirosin quinasa. A esta familia
pertenecen los receptores de IL-1 de tipo I, M-
CSF, la subunidad a del IL-6R, la subunidad P
del PDGE y varios miembros de los EGE.
La segunda familia es la más numerosa, de­
nominada superfamilia de receptores hem a­
topoyéticos o receptores de tipo I. Estos recep­
tores están caracterizados por la presencia de
residuos conservados de cisteína y de una se­
cuencia de hom ología constituida por cinco
aminoácidos característicos, la unidad Trp-Ser~
X-Trp-Ser (WSXWS), secuencia referida como
unidad “WS”, donde X es variable y representa
a cualquier aminoácido. Esta unidad WS se en­
cuentra localizada próxim a al dominio trans­
C7ají.'í/(7?í?s
.■N-(/.. i l ' N - | l I I . i. II.- fl, ll.-.S, I N I «
IL-2, IL-4, IL-6, IL-IO, IL-13, IL-14, IL-15, TGFP
IFN-y, TN PP, IL-.5, IL-12
IL-3, IL-7, IL-9, I L - I l , G M -G SF, G -C SF, M -C SF
membránico. Esta región funcionaría como el
principal sitio de unión para el ligando.Todos
los receptores de citoquinas que utilizan esta
unidad interactúan con citoquinas que compar­
ten en su secuencia cuatro regiones a hélice e
incluyen a los receptores de EPO, cadenas |3 y
Y del IL-2R, cadenas a y p del IL-3R, cadena a
del IL-4, cadenas a y p del IL-5R, IL-6R, ca­
dena a y 7 del IL-7R, cadena P y y del IL-I5R,
GM-CSER, G-CSER, cadena gp 130, LIE, etc.
En el caso particular del receptor de IL-6 se da
el hecho de que en una misma cadena pohpetí-
dica se establece un dominio similar a las Igs. y
otro de unidad WS.
El tercer grupo fue denominado de la super­
familia de los IFN s o receptores de Tipo II,
incluye a los IFN de tipo I y de tipo II. Su rela­
ción estructural ha sido definida en relación
con la secuencia aminoacídica. Los miembros
de esta familia comparten una organización si­
m ilar, con un dom inio que presenta una se­
cuencia de 210 aa, el cual contiene un par de
cisteínas conservadas en la región N terminal y
otro en al región C terminal. Esta familia pare­
cería estar distancialmente relacionada con los
receptores de tipo I. Estudios de transfección
de los distintos genes para receptores de IFN
humanos indican que probablemente el recep­
tor funcional para IFN requiera de cadenas adi­
cionales (IFNRT: cadena transductora del re­
ceptor de IFN ), lo que gen eraría un nuevo
ejemplo de receptores multicatenarios.
La cuarta familia corresponde a aquellos re­
ceptores relacionados estructuralmente con los
dos receptores del TNF, tanto p55 como p75,
razón por la cual se denominan superfamilia
de receptores del TNF. A ella pertenecen ade­
más del TNFR, el receptor de baja afinidad pa­
ra el NGF (factor de crecimiento neuronal), la
proteína codificada por el gen Fas y glucopro­
teínas transmembránicas que incluyen a CD40,
CD27, CD30, 0X 4 0 y 4-lB B . Esta fam ilia está
caracterizada por la presencia de cuatro domi­
nios ricos en residuos repetitivos de cisteínas,
la localización de los mismos está altamente

conservada sugiriendo que habrían derivado de
un gen ancestral común. Son también denomi­
nados de Tipo III.
Finalmente, los integrantes de la quinta fa-
miha presentan homología estructural con pro­
teínas transmembránicas caracterizadas por la
presencia de siete regiones a hélice que actúan
como receptores de alta afinidad para quim io­
quinas e IL-8. Esta unidad funcional fue origi­
nalmente encontrada en los receptores adrenér-
gicos y en la rodopsina de la retina, está am­
pliamente compartida por receptores unidos a
proteínas heterotrim éricas que se acoplan a
proteína G {G-copulatedproteins).
De manera similar, estudios de secuencia­
ción del dominio intracitoplasmático ha perm i­
tido encontrar regiones altamente conservadas.
Por ejemplo, existen estrechas regiones consti­
tuidas por tres residuos aminoacídicos que es­
tán altamente conservados entre los receptores
para el G-CSF y la cadena gpl30 del receptor
de IL-6, de los cuales uno o dos son críticos pa­
ra la señal de transducción.
Otra característica de los receptores de cito-
quinas es la aparición de formas solubles, las
que aparecen por clivaje proteolítico del recep­
tor de membrana o por empalme (“splicing”)
alternativo de los ARNm. Estas formas poseen
capacidad para asociarse a sus ligandos especí­
ficos pudiendo regular sus efectos biológicos.
De los hallazgos encontrados hasta el pre­
sente es de esperar que la mayoría de los recep­
tores para citoquinas estén constituidos por dos
o m ás cadenas polipeptídicas y constituyan
complejos multicatenarios. Entre los distintos
complejos multicatenarios encontramos las si­
guientes asociaciones;
a. com plejo IL-2R: las acciones de la IL-2
son iniciadas por unión a receptores de su­
perficie que están constituidos por tres cade­
nas a , ¡3 y y. Las cadenas fi y y pertenecen a
la superfam ilia de receptores ele tipo I, en
cambio la cadena a no pertenece a ninguna
familia de las hasta ahora establecida. La ca­
dena y se asocia a los receptores de 11-4,
IL7, IL-9 e I L l5 y es requerida para enviar
la señal de transducción intracelular.
b. complejo IL -6R ; está constituido por una
cadena de SOkD que actúa como receptor
propiamente dicho la cual interactúa con un
segundo componente la gp 130 kD, molécu­
la de transmembrana que contiene dominios
Ig símil y la unidad WS (de igual manera
que el Re de IL-6 propiamente dicho). La
segunda cadena es requerida para generar el
receptor de alta afinidad y la señal de trans­
ducción intracitoplasmática. Está comparti­
da por otros receptores por ejemplo, IL -ll,
CNTF, oncostatína M (OSM) y LIE.
Citoquinas 235
complejo IL-3R, IL-5R y GM-CSFR: los
receptores para estas citoquinas consisten en
dos componentes, a y ¡3, ambos miembros de
la superfamilia de tipo I. Cada una de ellas
)osee una cadena a específica y una cadena
3 de 150 líD que permite la respuesta celu­
lar. Esta estructura m ulticatenaria permite
explicar los resultados de com petencia de
unión y la similitud en las acciones biológi­
cas ejercidas por las citoquinas indicadas.
Con excepción del M-CSF y c-kit, factores de
crecimiento cuyos receptores poseen tirosin-qui-
nasas, los eventos moleculares involucrados en
generar las señales intracelulares por acción de
las citoquinas no están completamente entendi­
dos. Dado el esfuerzo de numerosos laboratorios
es de esperar que en un futuro cercano sean
completamente esclarecidos. Las similitudes es­
tructurales entre los receptores de citoquinas po­
dría imphear que los mismos utilicen mecanis­
mos comunes o estrechamente relacionados para
medial' la señal de transducción intracelular. Ma­
yores consideraciones estructurales y funciona­
les serán expuestas en los próximos párrafos.
A continuación se describirán las caracterís­
ticas estructurales y funcionales más importan­
tes de las citoquinas de mayor interés que parti­
cipan de las distintas fases de la respuesta in­
mune, cuyas principales propiedades inmuno-
biológicas se presentan en el cuadro 12-2.
INTERLEUQUINAS
Interleuquina 1 (IL-1)
Originalmente se pensó que la IL-1 era pro­
ducida por la serie monoeítica/macrofágica. No
obstante, la IL-1 puede ser producida por una
variedad de otros tipos celulares que incluyen
queratinocitos de la piel, células endoteliales,
células mesangiales renales, astrocitos, células
gliales, células ciliares neuronales, células NK,
células del epitelio córneo, células dendríticas
y células de Kuffer.
Sin embargo, la principal fuente de produc­
ción de la IL-1 son los monocitos/macrófagos
en respuesta a una variedad de estím ulos que
van desde productos bacterianos ta le s como
LPS, la acción de otras citoquinas por ejemplo,
TNF o la misma IL-1, el efecto de adyuvantes
hasta cristales de urato o síhca.
Dado que esta citoquina posee una variedad
muy amplia de órganos “blanco”, desencadena
una serie muy amplia de efectos. Inicialmente
la IL-1 fue descrita acorde con sus funciones,
de allí que fuese denom inada anteriorm ente
Factor activador de leucocitos (LAF), Pirógeno
endógeno (EP), Factor de células mononuclea-
236 Aspectos básicos de la inmunidad

Ac
c

/a íc \
w c c
c c
c
w

IL-6R gp 1 3 0 IL-3R |3

IL-2R

Fíg. 12-1. Representación esquem ática de !o.s receptores m ulticatenarios.

Superfamilia de re cep to res h em a to p o y ético s

Superfam ilia del TNF Superfam ilia d e r e cep to res d e IFN Superfam ilia d e recep to res
u nid os a p roteína G

Fig. 12-2. R epresentación esquem ática de las diferentes fam ilias de receptores para citoquinas.
 Citoquinas 237

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238 Aspectos básicos de la inmunidad

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res (M CF), M ediador endógeno leucocitario
(LEF), Factor activador de timocitos epidérmi­
cos (E T A F), F acto r inductor de p ro teó lisis
(PIFX Factor sinovial (SF), catabolina, factor
de proliferación de fibroblastos, factor activan­
te de osteoclastos (OAF), hem atopoyetina 1,
Factor inhibidor del crecim iento de m elano­
mas. La accesibilidad a la IL-1 recombinante,
anticuerpos monoclonales y técnicas de clona­
do molecular, ha establecido que todas estas
propiedades son atribuibles a una misma molé­
cula la IL-1.
Los estudios bioquímicos y de biología mole­
cular han demostrado que tanto IL-1 humana
como la murina existen en dos formas funcio­
nalmente activas I L - la e IL-1 p, cada una de
ellas codificada por un gen independiente aun­
que son capaces de reconocer al mismo receptor
sobre las superficies celulares. Ambas proteínas
son sintetizadas como precursores de 31-33 kD,
los cuales son clivados por enzimas citoplasma-
ticas específicas para generar la molécula activa
que posee 15-17 kD. Las IL-1 a y P comparten
una limitada secuencia homóloga a nivel de los
aminoácidos (22-26%) y las formas activas di­
fieren en sus FI 5 y 7 para IL-1 ce y ¡5 respecti­
vamente. Entre las diferentes especies, la se­
cuencia aminoacídica de la IL -la está conser­
vada entre un 60-70% , m ientras que para la
IL -lp dicho valor oscila entre un 73-78%.
A diferencia de la mayoría de las proteínas
secretadas, la IL -l posee un precursor de PM
mayor que no posee un péptido hidrofóbico se­
ñal N terminal para el clivaje o una secuencia
señal interna, la cual determine la asociación y
el transporte dentro de la membrana microso­
mal y la subsecuente entrada en el camino se­
cretorio. Por lo tanto, parecería que la secreción
de IL-1 podría ocurrir por un camino indepen­
diente o que el procesamiento ocurre en el pun­
to de secreción.
La IL-1 humana es activa sobre líneas celula­
res murinas, tanto IL -la como la IL -lp, poseen
sitios potenciales de glucosilación pero las pro­
teínas recombinantes no glucosiladas mantienen
su actividad biológica.
Los ADNc para ambas formas han sido clo­
nados en humanos, cerdos, vacas, conejos, rata y
ratón. El gen para IL -ip es de 7,8kb mientras
que el de IL -la posee 10,5kb, ambos se encuen­
tran localizados en el cromosoma 2 humano.
La IL-1 es la citoquina más im portante de
los procesos inflamatorios, infecciones, injuria
tisular y enfermedades malignas, desencadena
una respuesta de fase aguda que se caracteriza
por fiebre, aumento de la permeabilidad vascu­
lar y de la síntesis de proteínas de fase aguda
(proteína C reactiva, glucoproteína ácida 1, a,
antitripsina, macroglobulina y proteína ami-
loide sérica) por parte de los hepatocitos. La
Citoquinas 239
IL -I entre todas las citoquinas identificadas,
fue la primera para la cual se pudo establecer
sus efectos sistémicos. Entre ellos, el aumento
de temperatura parece ser un hecho fisiológico
importante que facilita la activación de los LT.
La IL-1 activa el eje hipotalámico-hipofisario
causando la liberación de glucocorticoides. Es­
tos datos permiten explicar cómo infecciones o
lesiones del SNC conducen a manifestaciones
sistémicas, por ejemplo, respuesta de fase agu­
da. H a sido reportado un aumento de II - 1 e
IL-6 luego del daño cerebral por ejem plo, en
enfermedad por el virus HIV.
En el sistema inm une los primeros efectos
descritos lo definían como un factor co-mitogé-
nico de los timocitos y dado que ia IL-1 puede
inducir la producción de IL-6, IFNs e IL -2 por
parte de algunas células, ésta puede actuar si­
nérgicamente con estos mediadores para esti­
mular el crecimiento y diferenciación de los LT
y los LB, células NK y células LAK.
L a IL-1 es requerida tam bién como factor
co-estimulante de los Ag. y mitógenos para la
activación de algunas células T, estimula la li­
beración de IL-2 por parte de los LT periféri­
cos y facilitaría la expresión del IL-2R pero es­
te efecto podría no ser una acción directa sino
ser debido a la producción de IL-6 a su vez in­
ducida por la IL-1.
La IL -lp es producida por el macrófago en
su form a precursora inactiva mientras que el
péptido precursor de la I L - la es procesado por
la célula a su forma madura antes de ser libera­
da, no obstante el péptido precursor de IL -la
de 31kD es activo en sí mismo.
De la totalidad de células que secretan la
lL-1 el macrófago es el mayor productor. En
h u m an o s se secreta p rep o n d eran tem en te la
IL -lp , mientras que otros tipos celulares pro­
ducen preponderantemente IL -la . Los macró­
fagos responden a IL-1 liberando PGE^ y pro­
duciendo TNF. La PGE^ puede inhibir la pro­
ducción de IL-1 por parte del macrófago y re­
gular negativamente la expresión de antígenos
del CMH-II, se genera así un proceso autolimi-
tante. La IL-1 tam bién induce la sín tesis de
PGE^ por parte de células endoteliales y las cé­
lulas del músculo liso. Es de resaltar que la IL-1
actúa como una citoquina con efecto autocrino
induciendo su propia .síntesis y además la pro­
ducción de TNF e IL-6. Actuando sobre LT ac­
tivados induce la síntesis de GM-CSF e IL-4.
Algunas actividades de 1a IL-1 podrían ser
de significado patológico dado que conduce a
una inflam ación crónica o shock séptico. La
IL-1 puede aumentar la expresión de moléculas
de adhesión sobre células del endotelio vascu­
lar. In vivo este efecto conduciría a un aumento
del tráfico de hnfocitos y neutrófilos hacia el
sitio de inflamación. La IL-1 también induce la
240 Aspectos básicos de la Inmunidad
proliferación de fibroblastos y la síntesis de co­
lágeno de tipo I, 111 y IV, por lo cual podría
ejercer algún efecto en la patología de la artritis
reumatoidea. Posee, in vitro acción sobre los
osteoclastos, los condrocitos y sobre células si­
noviales los que podrían actuar en forma sinér­
gica con otras citoquinas que conducen a las al­
teraciones del cartílago y a la reabsorción ósea
observada en las enfermedades articulares.
En médula ósea, la producción de IL-1 por
parte de las células endoteliales o del macrófa­
go podría conducir a la síntesis de factores esti­
mulantes de colonias principalmente de la serie
granulocítica y macrofágica (GM-CSF).
La producción y la actividad de la IL-1 son
m oduladas por una variedad de agentes, por
ejemplo, ACTH. Además, fue demostrado que
el organismo produce antagonistas endógenos
del IL -IR (IL-lRa) de importancia fisiológica.
E sta proteína actúa com petitivam ente por la
unión al receptor de IL-1 (IL-IR), ha sido ori­
ginalmente aislada de la orina de pacientes con
leucemias monocíticas. El ADNc que codifica
para esta proteína indica que posee inform a­
ción para la síntesis de un producto de 152 aa,
25 kD y que presenta un 26% de hom ología
con la IL -ip y un 19% con la IL-1 a. Su acción
inhibitoria es ejercida por unión al receptor de
tipo I, pero esta unión es incapaz de generar
una señal de transducción. La unión con recep­
tores de tipo II es de muy baja afinidad. Si bien
originalmente se vió que era producida por cé­
lulas monocitos/macrófagos, se encontró tam ­
bién que la producen los neutrófilos y los fibro­
blastos. La secuencia estudiada en el humano,
ratón, rata y conejo muestra entre sí un 75% de
hom ología. Fisiológicam ente, su producción
permite limitar los potenciales efectos nocivos
de la superproducción de IL-1, previniendo la
muerte por shock séptico producido por LPS y
el desarrollo de las cohtis inducidas por com­
plejos inmunes, entre otros. En la actualidad, la
posible utilización del IL -lR a esta siendo eva­
luada en ensayos preclínicos.
La mayoría de las acciones de la IL-1 son
mediadas por efectos transcripcionales que in­
volucran la translocación del complejo NF-kB
desde el citoplasma al núcleo. Esa transloca­
ción se logra una vez que en el citoplasma el
com plejo NF-kB se disocia en la subunidad
I-kB y la subunidad NF-kB, la cual m igra al
núcleo y produce la activación genética. La ac­
tivación del proceso de disociación del comple­
jo NF-kB involucra la activación de quinasas
dependientes de ceramida.
El receptor de IL-I (IL-IR)
Los efectos producidos por la IL-1 a y P re­
sultan de la unión de cualquiera de ellas con el
receptor celular. El IL-IR puede ser de dos fi-
po s 1 o II, am bos p o seen un v alo r de Kd
5 X 10-'‘M. El IL -IR de tipo I es una proteína
de 80 kD presente en la superficie de LT, fibro­
blastos, queratinocitos, células endoteliales,
condrocitos y hepatocitos. Éstos han sido clo­
nados, secuenciados y expresados en LT y fi­
broblastos tanto en el humano como en el ra­
tón. Se conoce que posee tres dominios de 319
aa, 21 aa y 217 aa que constituyen las porcio­
nes extracelular, transmembránica e intracelu­
lar respectivamente. El IL-IR de tipo II es una
proteína de 68 kD que se expresa sobre los LB
y las células PMN. Ambos son miembros de la
superfamilia de las inmunoglobulinas.
En general, el IL-IR de tipo I une mejor a la
IL-1 a mientras que el IL -IR de tipo II posee
mejor capacidad para unir IL -ip . El IL -IR de
tipo II actúa como precursor de una forma solu­
ble del IL -IR que antagoniza y modula la acti­
vidad de la IL-1. Ambos receptores muestran
aproximadamente un 28% de homología en su
dominio extracelular. A nivel del dominio intra­
citoplasmático se observó que mientras que el
IL-I R de tipo I está constituido por 213 aa, el
de tipo II solamente presenta 29 aa. Estudios
realizados indican que el receptor de tipo I es el
único involucrado en la génesis de la señal de
transducción y por ende es responsable de pro­
ducir los efectos biológicos de esta citoquina.
In te rle u q u in a 2 (IL-2)
La IL-2, in icialm ente denom inada T cell
growth factor (TCGF), es una glucoproteína que
induce la proliferación de los LT de manera au­
tocrina y favorece la expansión clonal de las cé­
lulas que han sido impactadas por el Ag. Condu­
ce a las células de la fase Gj a la fase de síntesis
(S), permitiendo la producción de IL-2 y la ex­
presión sobre la membrana celular del receptor
específico (IL-2R). También actúa de manera
paracrina, ejerciendo su acción sobre células ve­
cinas del sistema inmune o no inmune.
Es producida por los LThl (CD4+) y en me­
nor cantidad por las células CD8+, células NK,
m acrófagos y células LGL, del inglés “large
granulocytes lymphocytes”.
La IL-2 es una glucoproteína de 15-18 kD
que presenta diferentes grados de glucosilación
por lo cual también presenta un rango de Pl
que la caracterizan 6.6-8.2. Aunque es una mo­
lécula glucosilada, los hidratos de carbono no
son esenciales para ejercer sus efectos biológi­
cos, dado que la IL-2 recombinante obtenida en
células procarióticas es igualmente efectiva en
la activación de los LT. La IL-2 murina presen­
ta un 63% de hom ología en la secuencia de
aminoácidos con la IL-2 humana, siendo ambas
activas sobre líneas celulares murinas.

El gen ha sido clonado, se encuentra ubicado
en el cromosoma 4 humano. Posee información
para la síntesis de una proteína de 153 aa, la
que presenta una secuencia señal o líder de 20
aa. Esta secuencia es clivada para obtener la
proteína madura, que contiene tres residuos de
cisteína conservados, dos de los cuales generan
un puente disulfuro el que es requerido para
desarrollar su actividad biológica. La estructura
cristalográfica revela que es una proteína glo­
bular, conteniendo dos regiones a hélice, sin
presentar conformación lámina [3. Dicha estruc­
tura conformacional es característica de proteí­
nas que interactúan con receptores de la familia
de Tipo L El proceso de secreción se realiza
por la vía clásica para lo cual presenta una se­
ñal hidrofóbica. La síntesis conduce a un nivel
máximo de secreción a las 4 horas y es inhibida
por corticoides, ciclosporina A y PGs.
Las principales acciones de la IL-2 se ejer­
cen sobre los LT, lo cual conduce a una expan­
sión de la respuesta inm une cuya m agnitud
puede ser estim ada por determinación de los
niveles de IL-2. Sobre dichas células también
posee actividad para inducir la síntesis de IFNy
y lini'otoxina (TNFP) y es capaz de programar­
los hacia la apoptosis.
Actúa como factor de crecimiento y diferen­
ciación para las células NK, LB, puede activar
a los macrófagos y neutrófilos. Sobre el SNC
actúa como inmunomodulador, favoreciendo el
crecimiento de las células gliales. Sobre los LB
estimula la síntesis y secreción de anticuerpos
pero no induce cambios en el isotipo secretado
(switching). Las células NK son estim uladas
cuando existen altos niveles de IL-2 capaces de
unirse a receptores de tipo py, lo que induce la
producción de IFN y y potencia la acción citoK-
tica de estas células generando las llamadas cé­
lulas LAK (lymphokine activated killer cells).
El receptor de IL-2 (IL-2R)
La IL-2 ejerce sus acciones biológicas a tra­
vés de un complejo receptor multicatenario. Si
bien los prim eros estudios indicaban que la
IL-2R era un heterodímero constituido por las
cadenas a (anteriormente Tac) y p, hoy se co­
noce cjue existe un tercer integrante, la cadena
y, la que es compartida por receptores de dife­
rentes citoquinas (fig. 12-3). De la com bina­
ción de dichas cadenas se producen diferentes
formas denominados receptores de baja, inter­
media y alta afinidad las que poseen Kd 10 *,
10 * - 10 ‘° y 10 "M respectivamente. El recep­
tor de afinidad intermedia esta constituido por
las cadenas P y y; se expresa sobre LT en repo­
so. El receptor de alta afinidad está constituido
por las cadenas a, p y y; se expresa solamente
cuando el hnfocito está activado.
Citoquinas 241
Las cadenas a, P y y son glicoproteínas de 55
kD, 75 kD y 64 kD. Los genes que regulan sus
síntesis no están relacionados. La cadena a tie­
ne un dominio extracelular de 219 aa, una re ­
gión transmembrana de 19 aa y la región intra-
citoplamática es corta, constituida por 13 aa. La
cadena a no se expresa constitutivam ente en
linfocitos en reposo pero es inducida rá p id a ­
mente luego de la activación del LT, puede ex­
presarse anómalamente en leucemias y otros
desórdenes del sistema inmune. La cadena p,
está constituida por 214 aa en su dominio extra-
celular, 25 aa en la región de transmembrana y
286 aa correspondientes a la cola intracitoplas­
mática. Esta última cadena, esta involucrada en
el envío de la señal de transducción. La cadena
y es una proteína de 347 aa de los cuales 232 aa
corresponden al dominio extracelular, 29 aa a la
región transmembrana y 86 aa corresponden al
dom inio intracitoplasm ático. E sta cadena se
asocia a la cadena P y es necesaria para que se
produzca la internalización del ligando que
acompaña a la transducción de señal. La cadena
y se expresa en Ja mayoría de las células linfoi­
des pero sólo posee capacidad para unir la IL-2
cuando la cadena P está presente.
La expresión en fibroblastos del ADNc de la
cadena a genera un receptor de baja afinidad,
incapaz de traducir señal alguna de activación.
La co-expresión con la cadena P permite obte­
ner un receptor de afinidad intermedia que tam ­
poco puede efectuar la transducción de señal.
La expresión de las cadenas p y y posee tam ­
bién una afinidad intermedia pero en este caso
concentraciones relativamente altas de IL-2 le
permiten enviar una señal de activación. A pe­
sar de ello, la señal solamente será asegurada si
los dominios intracitoplasmáticos de las cade­
nas p y y se encuentran en estrecha relación y
existe conjuntamente la co-expresión de la ca­
dena a , la cual aumenta significativamente la
afinidad por el ligando. Cada una de las formas
del receptor indicadas, posee patrones cinéticos
que las caracteriza (cuadro 12-3). Si se analizan
los tiem pos medios de asociación y d iso cia­
ción, se concluye que el organismo se asegura
de esa manera que la lL-2 sea unida, retenida e
internalizada en el rango de concentraciones fi­
siológicas.
La mayoría de las células NK expresan cons­
titutivamente el receptor de afinidad intermedia
y una subpoblación de células NK (C D l6^), ex­
presa el receptor de alta afinidad; Ambas po­
blaciones manifiestan aumento de la actividad
citotóxica luego de la incubación de IL-2 pero
sólo aquellas que expresan el receptor de alta
afinidad serían de importancia desde el punto
de vista fisiológico.
Los monocitos humanos responden a la IL-2
con aumento del nivel del ARNm para IL-1 y
242 Aspectos básicos de ia inmunidad
IL-2
F ig. 12-3. C om plejo m ulticatenario receptor de IL-2.
al mismo tiempo aumentan su actividad citotó­
xica. Estas células expresan solamente el re­
ceptor de afinidad intermedia.
La form a soluble del recep to r a ha sido
identificada en pacientes con enferm edades
malignas, autoinmunes, enfermedades parasita­
rias, etc. Se supone que el mismo sería produ­
cido por clivaje proteolítico y ejercería un efec­
to regulatorio sobre el sistema inmune. T am ­
bién se ha informado la existencia de formas
solubles de la cadena (3.
A pesar de los avances en el conocimiento
del complejo multicatenario receptor de la IL-
2, los eventos intracelulares que llevan a la ac­
tivación celular no están completamente enten­
didos. Hasta el presente es conocido que la ca­
dena (3 carece de una secuencia de unión para
el ATP pero se uniría física y funcionalmente a
otras m oléculas para p roducir la activación.
Existe una asociación a través de una región
acídica del dom inio intracitoplasm ático con
una proteína de la familia src tirosin-quinasas
C u ad ro 12-3. Parámetros cinéticos del receptor de IL-2
a ap apY
K d (M ) 10* 10>» 10"
Transducción de señal no ? sí
(p56'“‘‘) capaz de activar protooncogenes nu­
cleares. Otra 1‘egión diferente de la cadena p in-
teractuaría con el sistema de quinasas JAK, he­
cho en que también podría estar implicada la
cadena y aunque no está completamente deter­
minado todavía.
Interleuquina 3 (IL-3)
La IL-3 es un factor pleiotrópico que fuera
previamente conocido como factor estimulante
de múltiples colonias (MCSF), B cell stimula­
ting factor, mast cell growth factor. Es produ­
cida por los LT activados, células epiteliales tí-
micas, queratinocitos y mastocitos.
La IL-3 es una glucoproteína de 26-28 kD
constituida por 134/140 aa que, si bien presenta
dos variantes murinas que se diferencian en la
región N terminal, ambas poseen los mismos
efectos biológicos. No obstante ser una molé­
cula glucosilada, los hidratos de carbono no
son esenciales para ejercer su rol biológico.
Pt P T
10*' 10’ no une IL-2
sí ? no

Los genes que regulan su síntesis se ubican
en el cromosoma 5 humano y 11 murino, liga­
dos a los genes de IL-4, IL-5 y GM-CSF. El
ADN codifica la expresión de una proteína que
es posteriormente clivada para originar la m o­
lécula madura, la cual posee un puente disulfu­
ro intracatenario el que es esencial para su acti­
vidad. Existe un 29% de homología entre las
proteínas murinas y humana y los efectos son
especie específicos.
Produce efectos sobre el crecimiento de to­
dos los linajes hematopoyéticos; es responsable
de la proliferación de progenitores multipoten-
ciales en los primeros estadios de su desarrollo.
A ctúa sin é rg ic a m e n te con la IL -1, IL -6 y
G'CSF. Fuera del sistema hematopoyético ac­
túa fundamentalmente sobre los mastocitos de
mucosas, células intestinales y dérmicas. Tam ­
bién es un importante mediador de las respues­
ta inflamatorias y es capaz de inducir la expre­
sión de antígenos del CMH de clase I y de las
moléculas de adhesión (LFA-1) de macrófagos
peritoneales. Actúa sinérgicamente con agentes
que facilitan la producción de IL-1 pero no
produce aumento de la citotoxicidad mediada
por los macrófagos. Sobre los eosinófilos pro­
mueve la fagocitosis y la quimiotaxis.
El receptor de lL-3 (IL-3R)
Las acciones biológicas de la IL--3 son ejer­
cidas por unión a un receptor específico. Los
estudios realizados indican que existe una for­
ma única del IL-3R de alta afinidad en las célu­
las hematopoyéticas humanas. En cambio las
células hematopoyéticas murinas presentan dos
formas, una de alta y otra de baja afinidad. Bl
receptor de alta afinidad, tanto humano como
murino es un heterodímero formado por las ca­
denas a y p. La cadena a es específica de la
IL-3, posee un PM de 70 kD mientras que la
cadena p posee 120-150 kD de PM y es común
a otros receptores.
Se ha obtenido el ADNc de la cadena a hu­
mana, el cual codifica para una proteína de 360
aa, forma parte de los receptores de citoquinas
de Tipo I. Esta cadena puede unir la IL-3 con
baja afinidad pero la co-expresión junto a la .su­
bunidad p evidencia la presencia del receptor
de alta afinidad. El sistema murino está siendo
estudiado, se ha podido clonar la cadena p, la
que presenta dos formas alternativas que pre­
sentan una hom ología del 91%. Se cree que
han surgido por duplicación genética a poste-
riori de la divergencia entre las especies huma­
na y murina.
El m ecanism o involucrado en la señal de
transducción no está completamente dilucida­
do, ha sido sugerida la participación del siste­
ma lA K - STAT.
Citoquinas 243
In terle u q u in a 4 (IL-4)
L a IL -4 fue d e n o m in ad a p rim a ria m e n te
B cell stimulcitory fa cto r (BCSF). Es una glu-
coproteína de 20 kD, producida por los linfoci­
tos CD4+ (Th2) pero también la sintetizan los
timocitos fetales, LT CD8+ y en menor propor­
ción los mastocitos activados, las células basó-
filas y líneas celulares de LB CD5+.
El gen ha sido clonado, tanto humano como
murino. Posee información para la síntesis de
proteínas de 153 aa y 140 aa respectivamente.
Este precursor es clivado para originar la pro­
teína madura de 129 aa y 120 aa. Es una proteí­
na globular, que posee cuatro regiones de con­
formación a hélice. Ambas poseen potenciales
sitios de glucosilación y seis residuos conser­
v ad o s de cisteín a resp o n sa b le s de g e n e ra r
puentes de sulfuro intracatenarios. Si bien es
una proteína glucosilada, los azúcares no son
im portantes para ejercer in vitro su actividad
biológica. Tanto la IL-4 humana como murina
presentan actividad especie específica.
L a IL-4 posee múltiples funciones inmuno-
rreguladoras, actúa sobre los LT, LB, inanoci-
tos, neutrófilos, fibroblastos, células epitelia­
les, endoteliales y progenitores hem atopoyéti­
cos. Es fundamentalmente un factor regulador
de las reacciones alérgicas. Estimula el creci­
miento de los LT en desarrollo, siendo im por­
tante modulador de la diferenciación de LTh2
de manera autocrina. En cambio ejerce accio­
nes de retroalim entación negativa so b re los
L T h l, como consecuencia de estos hechos la
IL-4 permite un desplazamiento hacia la res­
puesta inm une hum oral en detrim ento de la
actividad NK y de la inmunidad m ediada por
células.
La IL-4 actúa sobre los LB en reposo, favo­
rece su proliferación y diferenciación. Produce
un aumento de la expresión de CD23 y de antí­
genos del CMH de clase II, favoreciendo así el
rol del LB en la presentación antigénica y jue­
ga un rol crítico favoreciendo la secreción de
anticuerpos y el cam bio de isotipos h acia la
IgE y la IgG4,
Sobre los macrófagos favorece la expresión
de antígenos de superficie e inhibe la produc­
ción de IL-1, IL-6, lL-8, T N F a, NO y PGs.; en
cambio, aumenta la producción de ÍL -lR a . A
nivel de médula ósea, puede ejercer efectos si­
nérgicos con la IL -11. Estiinula la expresión de
moléculas de adhesión (VCAM-1) sobre célu­
las endoteliales. Actúa sobre fibroblastos esti­
mulando su proliferación y favoreciendo la se­
creción de colágeno. Actúa como factor de cre­
c im ien to para m asto cito s y puede te n e r un
efecto activador sobre la función del epitelio
intestinal, acción que cumple en forma sinérgi­
ca con la IL-3.
 244 Aspectos básicos de ia inmunidad
El receptor de IL-4 (IL-4R)
Los efectos biológicos son ejercidos por
unión a receptores de superficie, el IL-4R per­
tenece a los receptores complejos multicatena­
rios. El receptor de alta afinidad está constitui­
do por una cadena a específica y una cadena y
común a otros receptores. Una forma soluble
ha sido detectada tanto en los fluidos murinos
como en los humanos.
El ADN que codifica para la cadena especí-
, fica ha sido clonado para el ser humano y para
el ratón. La cadena humana es una proteína de
transmembrana de 140 kD, constituida por 800
aa; 207 residuos corresponden al dominio ex­
tracelular, 24 a la región transmembrana y 569
al dominio intracelular. Esta cadena pertenece
a la superfamilia de receptores de tipo I y for­
ma parte también del receptor para lL-13, cito-
quina con la que comparte la mayoría de las
funciones biológicas. La interacción de la cade­
na a con la cadena |3 le confiere una incremen­
to en cinco veces el valor de su constante de
afinidad. Una forma soluble del IL-4R a ha si­
do identificado en el ratón y en el hombre. El
IL-4Rs actúa como inhibidor competitivo para
la LL-4.
La interacción de la IL-4 con el complejo re­
ceptor conduce a la activación de las quinasas
de Jak 1 y Jak 3. También se observó la fosfo­
rilación de la subunidad receptora a y de resi-
. dúos tirosina de las proteínas STAT.
Interleuquina 5 (IL-5)
La interleuquina 5 inicialmente denominada
T cell replacing factor (TRF) o B cell growth
factor II, es un factor soluble producido por los
LTh2, eosinófilos y mastocitos activados. La
IL-5 es una proteína glucosilada de 20 kD, que
genera un homodímero glucosilado a través de
uniones de puente disulfuro, con un PM apa­
rente de 45kD.
Su principal función es estimular la quimio­
taxis y activación de los eosinófilos, hecho que
permite al sistema inmune que los LT puedan
regular la respuesta inflamatoria a través de los
eosinófilos y la respuesta efectora celular diri­
gida contra helmintos. También actúa en los úl­
timos estadios de diferenciación de los eosinó­
filos para lo cual posee acción sinérgica con los
factores estimulantes de colonias. La IL-5 es
responsable de la eosinofilia encontrada en las
infecciones parasitarias.
Actúa sinérgicamente con otras citoquinas es­
timulando el crecimiento y diferenciación de los
LB y sólo por un lapso breve favorece la secre­
ción de Igs, estimulando la producción de IgA.
El gen que posee información para la IL-5 se
ubica en el cromosoma 5 humano y 11 murino.
El ADN, tanto humano como murino, contiene
información para la síntesis de una proteína ma­
dura constituida por 112 aa. Las proteínas re-
combinantes han sido obtenidas utilizando sis­
temas de expresión procarióticos y eucarióticos.
Ello permitió analizar el rol de los azúcares que
lo constituyen, se sabe por dichos estudios que
la N-glucosilación le confiere estabilidad térmi­
ca a la molécula. La IL-5 humana y murina po­
seen un 70% de homología y son capaces de
producir reacciones en sistemas cruzados, es
decir, que no existe especificidad de especie.
El receptor de IL-5 (IL-5R)
El receptor para IL-5, ha sido identificado en
la superficie de células hum anas y murinas.
Las células humanas expresan un receptor de
alta afinidad; en cambio, las células murinas
presentan dos formas: una de alta y otra de baja
afinidad. En ratones, el IL-5R presenta al me­
nos dos proteínas de membrana denominadas a
o p60, la cual es capaz de unir específicamente
a la citoquina con baja afinidad y una segunda
cadena de mayor PM, denominada |3, que per­
m ite gen erar el recep to r de alta afin id ad y
transducir la señal de activación.
El ADN para la cadena a , codifica la infor­
mación para una glucoproteína de 415 aa. El
dominio extracelular de esta cadena contiene 4
residuos de cisteínas conservadas y próximo a
la m em brana celular presenta la unidad WS,
característica de receptores de tipo 1. La cadena
P murina es compartida por los receptores para
IL-3 y GM-CSF. Si bien esta cadena no es ca­
paz de unir por sí misma a ninguna de las cito-
quinas incluidas, su expresión junto con la ca­
dena a específica estabiliza la unión. A dife­
rencia del receptor murino, el IL-5R humano
posee una cadena a que le perm ite unir a la
IL-5 con alta afinidad, a pesar de ello la cadena
P es requerida para formar el complejo multi­
catenario da alta afinidad, capaz de generar la
señal de transducción. Las cadenas a humana y
murina presentan un 79% de homología a nivel
de los aminoácidos. Tal como ocurre con otros
receptores una forma soluble de la cadena a ha
sido detectada, la cual se genera por empalme
{“splicing”) alternativo y actuaría com o ele­
mento regulatorio de la respuesta inmune.
Interleuquina 6 (IL-6)
La IL-6 es una proteína monomérica. Si bien
es producida principalmente por los macrófa­
gos, también es secretada por las células del
endotelio vascular, fibroblastos y por algunos
LT activados, en respuesta a la estimulación de
IL-1 y en menor grado al TNF. A su vez su
producción es inhibida por la IL-4 y la IL-13.

fil ADNc para la IL-6 humana y murina ha
sido clonado, los genes se encuentran ubicados
sobre íos cromosomas 7 y 5 respectivamente.
Codifican para precursores de 212 y 211 aa, los
que posee una secuencia hidrofóbica señal de
28-y 24 aa. Poseen dos sitios potenciales de
glucosilación, sin embargo la presencia de los
hidratos de carbono no son esenciales para el
desarrollo de la actividad biológica. La proteí­
na madura posee un PM de 26 kD y está cons­
tituida por 184 aa. Ambas proteínas presentan
un 65% de homología en la secuencia nucleotí­
dica y de 42% en la secuencia de aa. La IL-6
humana y murina son igualmente activas sobre
células murinas, pero la IL-6 murina no ejerce
acciones sobre células humanas.
La IL-6 comparte acciones biológicas con la
IL-1 pero a diferencia de ella no causa trombo-
si.s intravascular ni injuria tisular. Las mejores
acciones descritas son la acción sobre los hepa­
tocitos a los que estimula para producir proteí­
nas de fase aguda. Posee una importante acción
sobre LB para los que actúa como factor de
crecimiento en las últimas etapas de la diferen­
ciación celular. La IL-6 es un factor de creci­
miento para mielomas y plasmocitomas y pue­
de tener un efecto co-estimulante sobre los LT
maduros y los timocitos.
El receptor de IL-6 (IL-6R)
El complejo receptor de IL-6 está constitui­
do por dos cadenas glucoproteicas pertenecien­
tes a superfamilia de Igs. La menor de ella po­
see un PM de 80 kD, es la subunidad de unión
específica (IL-6R). La segunda cadena posee
un PM de 130 kD (gpl30), es una cadena poli-
peptídica com partida con otros receptores de
factores de crecimiento. La cadena IL-6R hu­
m ana está form ada por 468 aa; p resen ta un
54% de homología con la cadena ÍL-6R muri­
na, la cual está constituida por 460 aa. La re­
gión extracelular de ambas especies esta inte­
grada por un dominio Ig. símil y otro dominio
perteneciente a la estructura de receptores de ti­
po I (unidad WS). La gp 130 posee 77% de ho­
mología a nivel de la secuencia amonoacídica
entre la cadena humana y la murina y también
es una estructura que presenta un dominio Ig
símil y otro de receptor de citoquinas de tipo I.
Una forma soluble de 50 kD ha sido detectada
en humanos. Esta forma actuaría facilitando la
reactividad de IL-6 por lo que sería capaz de
unirse directamente a la gp 130. Por otro lado,
ha sido encontrada una forma soluble de la ca­
dena gp 130 la que puede inhibir la actividad
dei complejo IL-6/IL-6Rs indicando la comple­
jidad del sistema regulatorio.
La presencia de ambas cadenas es requerida
para generar el receptor de alta afinidad y el
Citoquinas 245
subsiguiente envío de la señal de traducción.
La exacta composición del complejo IL-6R no
está determinada. Algunos investigadores su­
gieren que dos unidades de IL-6 se asocian con
una molécula del receptor. Otros sugieren que
una molécula de lL-6 se asocia con una de IL-
6R y que este complejo se une luego a gp 130 e
induce su dimerización. Si bien la gp 130 no
posee actividad tirosin-quinasa intrínseca, se ha
encontrado que se asocia a la familia de quina­
sas Jak, lo que lleva a una rápida fosforilación
de proteínas STAT. También ha sido informa­
da la activación de RAS y MAPK esenciales
para la activación del factor NF-IL6.
Interleuquina 7 (IL-7)
La interleuquina 7 fue inicialmente denomi­
nada linfopoyetina I y fue reconocida como un
factor capaz de inducir la proliferación de lin­
focitos pre-B m urinos. E studios posteriores
permitieron atribuirle una gran variedad de ac­
ciones biológicas que afectan también al linaje
T. La IL-7 es producida por un variedad de cé­
lulas que incluyen al LB, fibroblastos de médu­
la ósea, células epiteliales y timocitos a nivel
cortical.
El ADNc murino ha sido aislado, el mismo
posee información para la síntesis de una pro­
teína constituida por 154 aa, de los cuales 25 aa
corresponden al péptido señal. La proteína po­
see seis residuos de cisteína y dos potenciales
puentes disulfuro. La proteína madura presenta
un PM de 20-25 kD. El ADNc humano permite
la sín tesis de una p ro te ín a c o n stitu id a por
177 aa, la diferencia con el murino se debe a la
inserción en el gen de un exón extra el cual so­
lamente se encuentra en el genoma humano. La
proteína originada presenta seis residuos de
cisteínas conservados y tres sitios potenciales
de gluco.silación. El PM estimado es de 17.4
kD. Ambas proteínas, murina y hum ana, pre­
sentan un 70% de homología y mientras que la
IL-7 humana posee actividad sobre células mu­
rinas, la IL-7 murina carece de efectos sobre
las células humanas.
La acción primaria atribuida la comprometía
con el linaje B, por su capacidad para favorecer
la diferenciación de linfocitos pre-B . Actual­
mente es claro que también favorece el creci­
miento y la diferenciación de células LT huma­
nas y murinas, con acción a nivel del reordena­
miento de los genes de receptor T. Se ha de­
mostrado asimismo que estimula la prolifera­
ción de LT maduros, favorece el desarrollo y la
actividad citotóxica de células CD8"“ y células
LAK. Debido a estas últimas acciones la IL-7
es un muy buen candidato para el tratamiento
de inmunodeficiencias primarias así como para
la inmunoterapia del cáncer.
246 Aspectos básicos de la inmunidad
El receptor de lL-7 (IL-7R)
Sus acciones biológicas son ejercidas a tra­
vés de receptores de superficie, IL-7R, el cual
es un complejo multicatenario de alta afinidad.
Está constituido por dos cadenas polipeptídicas
correspondientes a la superfamilia de recepto­
res de tipo 1, una es la subunidad específica de­
nominada a y la segunda cadena y, com ún a
otros receptores de citoquinas. El IL-7R huma­
no presenta dos formas una de alta (Kd lO^'^M)
, y otra de baja afinidad (Kd 10 ‘^M), la cadena y
participa en la formación del receptor de alta
afinidad. El estudio del receptor murino perm i­
tió identificar tres formas para el IL-7R, un re­
ceptor de baja afinidad (Kd 1.45 lO^^M), un re­
ceptor de afinidad intermedia (Kd 2.5 10 '®M) y
una forma de alta afinidad (Kd 4 1 0 ‘^M) de la
cual participa la cadena y.
Interleuquina 8 (IL-8)
La IL-8 integra la familia de citoquinas in­
flamatorias de bajo peso molecular que han si­
do referidas como quemoquinas, entre las cua­
les la IL-8 es la mejor caracterizada. Estas cito-
quinas presentan la particularidad estructural
que las caracteriza, la presencia de cuatro resi­
duos conservados de cisteína. Actúa como fac­
tor quimiotáctico y activante para los neutrófi­
los y en menor grado para los basófilos y los
linfocitos.
La IL-8 es producida por fagocitos mononu­
cleares, LT activados, neutrófilos, eosinófilos,
fibroblastos, células endoteliales, plaquetas,
queratinocitos, hepatocitos, condrocitos, astro-
citos y células NK.
El ADNc humano indica que el precursor
proteico posee 99 aa, el cual genera una proteí­
na madura de 8kD. A pesar de que la IL-8 es
capaz de generar puentes disulfuro intereatena-
rios, no está aclarado aún si la forma biológica­
mente activa está constituida por la forma m o­
nomérica o dimérica. Se han obtenido produc­
tos maduros que difieren el número de aa que
los constituyen (69-72-77 aa) dependiendo de
la fuente celular utilizada. El péptido de 72 aa
es el que posee mayor potencia biológica, este
hecho sugiere la existencia de un mecanismo
de activación el que podría requerir de un cli­
vaje proteolítico.
La IL-8 ejerce además un gran número de
actividades pro-inflamatorias. Produce degra­
nulación de los neutrófilos, induce la expresión
de moléculas de adhesión y favorece así la ad­
herencia de los neutrófilos a las células endote­
liales. Posee efecto co-mitogénico para los que­
ratinocitos y actúa como factor autocrino en
ciertos melanomas.
El receptor de IL-8 (IL-8)
Los efectos biológicos son desarrollados a tra­
vés de receptores de superficie (IL-8R). En el ser
humano han sido documentadas dos entidades
las que se cree que surgieron por duplicación ge­
nética. Ambas poseen 77% de homología, se las
denomina IL-8R tipo I o a e IL-8R tipo II o |3.
Son miembros de los receptores de citoquinas
acoplados a proteína G y poseen capacidad para
unir a su ligando específico con alta afinidad.
Interleuquina 9 (IL-9)
La IL-9 en una glucoproteína derivada de los
LT, tanto CD4‘^ como CD8+, la que favorece la
sobrevida de líneas celulares T y la actividad
de los mastocitos.
El ADNc para IL-9 humana y de ratón han
sido clonados. El gen humano se ubica sobre el
cromosoma 13 y el murino en el cromosoma 5.
Ambos codifican la síntesis de proteínas pre­
cursoras de 144 aa, en los cuales los 18 prime­
ros aa corresponden al péptido señal. La proteí­
na madura presenta un PM predecible de 14 kD
conteniendo cuatro sitios potenciales de gluco­
silación. Las proteínas humanas y murinas pre­
sentan una homología de 56% a nivel de la se­
cuencia de aa y de 67% a nivel de los residuos
mucleotídicos. La IL-9 murina es activa sobre
células humanas pero la IL-9 humana no lo es
sobre las células murinas.
La IL-9 es un factor que perm ite el creci­
miento de las células mieloides y de los masto­
citos. En médula ósea actúa sinérgicamente con
la eritropoyetina (EPO), perm ite el cultivo a
largo plazo de los LT activados, tanto CD4+ co­
mo CD8+. En el ratón, han sido comunicadas
acciones a nivel de los timocitos lo que facili­
taría la ontogenia de los LT. La lL-9 actúa so­
bre los LB, tiene acción sinérgica con la IL-4
potenciando la producción de IgG e IgE.
El receptor de IL-9 (IL-9R)
El receptor de superficie para la IL-9 perte­
nece al grupo de receptores multicatenarios que
comparten la cadena y. Además, posee una ca­
dena específica (IL-9R). Los ADNc p ara el
IL-9R han sido clonados, tanto en humano co­
mo murino, codifican la síntesis de proteínas
de 533 aa y 468 aa respectivamente. Los IL-9R
humano y murino presentan 53% de hom olo­
gía, pertenecen a la superfamilia de receptores
hematopoyéticos o de tipo I. También ha sido
aislado un ADNc que posee información sobre
la síntesis de una forma soluble del receptor la
que resultaría de la delección de los dominios
transmembránico y citoplasmático de la cadena
específica del IL-9R.

Interleuquina 10 (IL-10)
La IL-10 fue inicialmente denominada factor
inhibidor de la síntesis de citoquinas (CSIF),
fue descubierta como un producto de los LTh2
capaz de inhibir la producción de citoquinas
por parte de los L T h l. La 11-10 es producida
por los LTh2, los timocitos fetales activados,
los macrófago, los LB normales y los querati­
nocitos.
A partir de los estudios realizados sobre su
actividad biológica, se llegó a aislar el ADNc
de IL-10 murino y subsecuentemente por hibri-
dización cruzada se aisló el ADNc humano.
Los genes se encuentran ubicados sobre el cro­
mosoma 1 y poseen 81 % de homología a nivel
de la secuencia nucleotídica. Las proteínas ob­
tenidas poseen un 73% de homología. Los pre­
cursores sintetizadas están constituidas por 178
aa, poseen una señal hidrofóbica que una vez
clivada origina una proteína de 160 aa, la que
contienen cinco residuos de cisteína conserva­
dos y dos sitios potenciales de glucosilación.
La proteína murina posee un PM 17-20 kD, de­
pendiendo del grado de glucosilación. La IL-10
humana en cambio no presenta glucosilación y
su PM es de 18 kD. Ambas interleuquinas son
lábiles en medio ácido. La IL-10 humana es ac­
tiva sobre células m urinas m ientras que la
IL-10 murina no es activa sobre células hum a­
nas.
La IL-IO posee acciones pleiotrópicas, tiene
efectos inmunosupresores y en otros casos pue­
de ejercer efectos estimulatorios.Tiene acción
regulatoria de la actividad de los L T hl, inhi­
biendo la producción de IFN y e IL-2, sin em ­
bargo en la actualidad se estim a que esta ac­
ción sería un efecto indirecto, dado que la ac­
ción primaria se ejercería sobre los macrófagos
previniendo la producción de la IL-12.
La IL-10 puede regular la expresión de m o­
léculas del CMH de tipo II y es un potente in­
munosupresor de las actividades de los macró­
fagos. Sobre estas células suprime la produc­
ción de PGEj, de citoquinas pro-inflamatorias
(TN Fa, IL-1, IL-6, IL-12) y de moléculas de
adhesión (lCAM-1 y B7). Por otro lado, favo­
rece la producción del IL -lR a y la producción
de receptor soluble para el TNF. También fa­
vorece la expresión de FcyR (CD64), hecho
que permite un aumento en la actividad de cito-
toxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC)
ejercida por los macrófagos. Sobre estas célu­
las también suprime la acción del anión superó­
xido y modula la síntesis de NO.
Dado que la IL-10 favorece la proliferación
de los LB y la secreción de IgA, IgG, e IgGj
tendría fundamental importancia en el desarro­
llo de la respuesta inmune humoral.
Citoquinas 247
El receptor de IL-10 (IL-IOR)
El receptor para IL-10 (IL-IOR) es una glu­
coproteína de 110 kD; en el ratón está consti­
tuido por 561 aa y en el hombre por 557 aa,
existiendo entre ellos un 60% de homología. El
IL-IOR está estrueturalmente relacionado con
el receptor de IFNs, une a la IL-10 con alta afi­
nidad (Kd 7-20*'M).
Interleuquina 11 (I L -ll)
La IL -II es un factor pleiotrópico con fun­
ción sobre la hematopoyesis, la hnfopoyesis, la
respuesta de fase aguda y el desarrollo de adi-
pocitos, neuronas y osteoclastos. Es producida
por las células del estroma de médula ósea, fi­
broblastos, células del trofoblasto, condrocitos
y células sinoviales. Su producción es inducida
por la IL -l y el TGF.
El ADNc para humano, primate y ratón ha
sido clonado y secuenciado, existe una hom o­
logía del 90% entre ellos. El ADNc hum ano
contiene información para una proteína precur­
sora de 199 aa, de los cuales 21 aa correspon­
den al péptido señal, el que es clivado para ori­
ginar la proteína madura. Esta proteína posee
un P l 11.7 y no posee ni residuos de cisteínas
conservadas ni sitios potenciales de glucosila­
ción. Su PM es de 19 kD y el gen se encuentra
ubicado en el cromosoma 19 humano.
L a IL-11 posee m últiple efectos sobre las
poblaciones hem atopoyéticas actuando como
factor de crecimiento; estim ula la megacario-
poyesis y sinergiza las acciones con la IL-3,
IL-4 y GM-CSF. Su efecto lo ejerce abrevian­
do el período Go de la diferenciación temprana
de los progenitores hematopoyéticos. También
favorece la acción de la IL-7 sobre el pre LB.
A nivel de los hepatocitos favorece la sínte­
sis de las proteínas de fase aguda, también pro­
mueve la diferenciación neuronal y actúa como
inhibidor de la adipogénesis.
El receptor de IL-11 (IL-1 IR )
Las acciones biológicas se desencadenan por
interacción eon un receptor de alta afinidad. El
complejo multicatenario IL-1 IR está constitui­
do por una cadena a , miembro de la fam ilia de
receptores de hemopoyetinas y es capaz de unir
a la IL -II con baja afinidad. Esta cadena es si­
milar a la cadena a del IL-6R y como ella inte­
ractúa con la g p l3 0 para generar la señal de
transducción. Los resultados del estudio de los
mecanismos de activación mediadas por lL-11
muestran la participación de proteínas quinasas
Jak 1 y 2, junto con un nuevo miembro de la
familia de proteínas STAT (APRF/STAT3).
248 Aspectos básicos de la inmunidad
Interleuquina 12 (IL-12)
La IL-12 es una citoquina pleiotrópica que
fuera originalmente identificada en el sobrena­
dante de cultivo de células transformadas por el
virus de Epstein Bar. También se lo conoció
como natural killer stimulatory factor (NKSF)
y como cytotoxic lymphocyte maturation factor
(CLMF).
La IL-12 es una glucoproteína heterodímera
de 75 kD compuesta por dos subunidades p35 y
p40, no relacionadas genéticamente. Ambas ca­
denas se encuentran unidas covalentemente a
través de un puente disulfuro, condición esencial
para que conserve su actividad biológica. La su­
bunidad p35 presenta homología con la IL-6 y
con G-CSF, en tanto que la subunidad mayor es
similar al receptor de IL-6. Esta estructura su­
giere que la IL-12 habría derivado de genes de
algún complejo citoquina/receptor anterior.
La fuente de producción de esta citoquina
comprende a los monocitos/macrófagos, LB y
mastocitos como respuesta a la acción de bacte­
rias, productos bacterianos y parásitos intracelu­
lares, estableciéndose así un puente funcional
entre la inmunidad natural y la específica. La IL-
12 mostró tener efectos específicos de especie,
habiéndose reportado una actividad mínima de
IL-12 humano sobre células murinas.
Cada subunidad corresponde a un único gen.
La expresión de la cadena p35 es facilitada por
la simultánea expresión de la cadena p40. La
transcripción de ambas cadenas es normalmen­
te coordinada. N inguna cadena por sí misma
presenta actividad de IL-12. En los humanos la
cadena p35 está constituida por 197 aa, 22 de
los cuales corresponden al péptido señal, pre­
senta 7 residuos de cys y tres sitios potenciales
de glucosilación. La cadena p40 está constitui­
da por 306 aa, conteniendo diez residuos de
c is te ín a s c o n se rv a d o s y c u a tro s itio s de
glucosilación. La subunidad p35 murina pre­
senta 60% de homología con la cadena huma­
na, posee 193 aa y siete residuos de cisteína
con tres sitios potenciales de glucosilación. La
cadena p40 presenta 70% de homología con la
humana y está constituida po 313 aa, también
presenta 22 aa correspondientes al péptido se­
ñal, 11 residuos de cys conservados y tres sitios
de N-ghcosilación.
El significado biológico de cada cadena se­
parada es hasta hoy desconocido. En el ratón se
observó que la cadena pesada forma homodí-
meros con actividad antagónica, hecho no de­
mostrado para IL-12 humana. En relación con
la molécula entera, los primeros estudios indi­
carían ciue la p40 estaría involucrada en la
unión al receptor mientras que la cadena p35 es
importante para el envío de la señal de trans­
ducción a través del IL -12R.
La IL-12 posee múltiples efectos sobre'las
células NK y los LT, promueve el crecimiento
y diferenciación de las células NK y de las cé­
lulas T, tanto CD4+ (T hl) como CD8+. Favore­
ce la proliferación de la subpoblación T h l, con
producción de altos niveles de IFNy, el que a
su vez posee un efecto autocrino sobre esta
subpoblación linfocitaria. A dem ás, produce
una inhibición de la producción de la IL-4 por
parte de los LTh2. Favorece la actividad citotó­
xica mediada por los LT, la citotoxicidad NK e
incrementa la citotoxicidad celular mediada por
anticuerpos (ADCC). Por otro lado, como con­
secuencia de la inducción de la síntesis de IFNy
indirectam ente contribuye a la activación de
los macrófagos.
La lL-12 actúa sobre células NK y produce
un aumento de la expresión de Ags, de mem­
brana (CD 56, CD2, CDI la) y también posibi­
lita la generación de células LAK. Aumenta la
secreción de IFN y y de T N F a y facilita la libe­
ración de p55 y p75 solubles de los receptores
para TNF por parte de las células NK.
Recientem ente se documentó que la IL-12
ejerce efectos sobre la síntesis de inmunoglo-
buhnas, es capaz de suprimir la síntesis de IgE
inducida por IL-4 sobre células mononucleares
de sangre periférica.
El receptor de IL-12 (1L-12R)
El receptor fue clonado, el ADNc codifica
para una proteína de 638 aa, la cual posee un
PM predecible de 70,4 kD, pertenece al grupo
de receptores hematopoyéticos. Esta proteína
une IL-12 con Kd 2-5 10 ‘^ M correspondiente
al receptor de baja afinidad, el que se expresa
en líneas celulares de LT activados. La cadena
clonada posee un 21% de homología en su do­
minio citoplasmático con la IL-6. En estos mo­
mentos se están realizando estudios que permi­
tan dilucidar las características del mismo.
Existen evidencias experimentales que indican
que el IL-12R pertenece a un complejo multi-
catenario constituido al menos por dos cadenas
polipeptídicas.
Interleuquina 13 (IL-13)
La IL -13 es un factor pleiotrópico que com­
parte muchas propiedades con la IL-4 con la
cual posee un 30% de homología en su secuen­
cia aminoacídica. Es secretada por LT activa­
dos tanto CD4+ como CD8^. De manera similar
a la IL-4 posee efectos sobre el LB y los ma­
crófagos pero a diferencia de aquélla no posee
efectos sobre los LT.
El gen que codifica para la IL-13 fue descu­
bierto en 1989 en L T h l murinos y denominado
P600, habiéndose determinado que una vez que

la célula es activada el ARNm se expresa rápi­
damente y persiste por un período relativamen­
te mayor que el ARNm para la IL-4. Los genes
de IL-4 e IL-13 están estrechamente relaciona­
dos tanto en el genom a humano como en el
murino.
El ADNc para la IL-13 murina codifica la
síntesis de una proteína de 131 aa que presenta
un péptido señal de 20 aa, el cual es clivado pa­
ra generar la proteína madura. En el caso del
ADNc de IL-13 humano existe información pa­
ra una proteína de 132 aa. El ADNc humano
presenta un 66% de homología con el ADNc
de IL-13 murina. Tanto la IL-13 humana como
la murina poseen en su secuencia cinco resi­
duos de cisteínas conservados y múltiples sitios
potenciales de glucosilación. Existe un 58% de
homología en su secuencia aminoacídica. Ade­
más, también fue clonado el gen de IL-13 de
rata y la secuencia aminoacídica deducida de­
muestra que existe un 79% de homología con
la proteína de ratón y 63% con la proteína hu­
mana. La actividad para la IL-13 humana y la
murina sobre células humanas es similar. En
cambio, la IL-13 humana es menos activa que
la murina sobre células de ratón.
La IL-13 es un potente regulador de las res­
puestas inmune e inflamatoria. De igual mane­
ra que la IL-4, la IL-13 aumenta la expresión
de CD23 y favorece ia expresión de integrinas
(C D llb , C D llc , C D l8, CD29, CD49e). y de
los Ags. del CMH de clase II sobre los monoci­
tos/macrófagos, pero como disminuye la expre­
sión del receptor para Fe de Ig G, es capaz de
inhibir la citotoxicidad anticuerpo dependiente
y la capacidad de los macrófagos para matar
parásitos intracelulares.
Se demostró que inhibe la expresión de cito-
quinas pro-inflamatorias (IFN5, IL-1, IL-6, IL-
8, IL-12) y de quimoquinas (MIP, M FC) a la
vez que favorece la producción de la IL -lR a.
Estudios realizados en macrófagos evidencian
una inhibición de la producción de óxido nítri­
co. Las consecuencias fisiológicas del efecto de
la IL-13 sobre los monocitos deberá ser conve­
nientemente definida, pero es posible que indi­
rectam ente inhiba el desarrollo de L T h l por
efecto de regulación negativa sobre la produc­
ción de IL -12 por parte de los monocitos.
Cuando se estudió la acción de IL-13 sobre
los LB humanos se encontró que la IL-13 regu­
la positivamente la expresión de CD23, CD71,
CD72, Ig. de sup. y moléculas del CMH de cla­
se II. Favorece la proliferación de LB maduros
e induce la síntesis de IgE e IgG^. H asta el pre­
sente no se determinó que la lL-13 tenga acti­
vidad sobre los LB murinos.
En ensayos con células NK altamente purifi­
cadas se encontró que la IL-13 inhibe la pro­
ducción de IFN y inducida por la IL-2. En cam­
Citoquinas 249
bio ha sido reportado que al actuar sobre linfo­
citos granulares grandes (LGL), la IL-13 siner-
giza la acción de la IL-2, conduciendo a la pro­
ducción de IFNy. Recientes investigaciones in­
dican que la IL-13 posee acción quimiotáctica
sobre los macrófagos pero no sobre células po­
limorfonucleares .
El receptor de IL-13 (IL-I3R)
Basados en datos experimentales de compe­
tencia de la IL-13 con la IL-4, se hipotetiza que
el receptor de ÍL-13 es un heterodím ero que
contiene subunidades del IL-4R y una subuni­
dad propia de unión de IL-13. La similitud de
las propiedades biológicas y la alta homología
en la secuencia de IL-13 e IL-4, sugiere una es­
trecha relación entre ambos receptores. Dife­
rentes estudios son consistentes con esta hipó­
tesis, sus características deberán ser pronto cla­
rificadas.
Interleuquina 14 (IL-14)
La IL-14 es la denominación propuesta pai'a
una factor producido por LT normales y malig­
nos que tiene la capacidad de inducir la prolife­
ración de LB activados pero no en reposo, ini­
c ialm en te fue den o m in ad o higfi m o lecu la r
weigth B cell growth fa cto r (HMW-BCGF). El
HMW -BCGF posee similitud antigénica con la
fracción Bb del sistema complemento y éste úl­
timo tiene capacidad de competir por el recep­
tor para HMW-BCGF.
Si bien ambos factores están relacionados
antigénicamente sólo posee un 8% de homolo­
gía estructural. Las únicas células sobre las
que se ha encontrado acción son células del li­
naje B. Datos prelim inares sugieren que ten­
dría acción sobre una subpoblación de LB de
memoria.
La secuencia del ADNc predice que la pro­
teína madura está formada por 486 aa, que con­
duce a un producto de PM predecible de 53,1
kD. Presenta un péptido señal de 15 aa, el cual
facilitaría su secreción. Posee tres sitios poten­
ciales de N-glucosilación y múltiples sitios de
cisteínas conservadas que podrían potencial­
mente participar de la formación de puentes di­
sulfuro. El ARNm es expresado entre las 8 -12
horas después de la estimulación de los LT con
ConA o PHA persistiendo por un período de
hasta 48 horas. Se ha postulado que el AMPc
actúa como segundo mensajero de la señal de
activación celular.
Interleuquina 15 (IL-15)
Éste es un factor descubierto en form a si­
multánea por los grupos de Gabstein y col. y
250 Aspectos básicos de la Inmunidad
Burton y col., investigadores que lo denomina­
ron IL-I 5 e IL-T respectivamente. Del mismo
modo que otras cito q u in a s (p o r ej. IL -4 e
IL-10) parece compartir funciones biológicas
con la IL-2. Ambas proteínas, IL-15 e IL-T, pa­
recen ser la misma molécula, su hallazgo per­
mite clarificar experiencias previas realizadas
con ratones deficientes en IL-2 en donde IL-15
e IL-T permitirían justificar los resultados en­
contrados.
Gabstein y col. detectaron el factor al inves-
tigai' la presencia de citoquinas en el sobrena­
dante de cultivo de una línea celular originada
de tejido epitelial de riñón de simio. Esta cito-
quina es capaz de producir la proliferación de
una línea dependiente de IL-2. La clonación y
obtención del ADNc permite deducir las carac­
terísticas de la proteína. E sta pro teín a está
constituida por 162 aa, con una secuencia señal
de 48aa, sin que posea homología con otra cito-
quina conocida. La predicción de la estructura
secundaria de la proteína, sugiere la presencia
de cuatro regiones a hélice y la presencia de
dos puentes disulfuro, uno de los cuales es aná­
logo al puente disulfuro hallado en la estructura
cristalográfica de la IL-2. L a expresión del
ARNm fue analizada en células humanas, la
máxima expresión fue encontrada en placenta y
músculo esquelético. Es muy importante la ex­
presión en monocitos, células epiteliales y fi­
broblastos. No hay expresión ni en LT activa­
dos, ni en líneas linfoblastoideas B. La IL-15
es capaz de estimular a los LT activados con
PHA, se observó que responden tanto los LT
CD4+ como los CD8+. La IL-15 es capaz de ge­
nerar in vitro LT citotóxicos y células LAK,
aunque posee menor potencia que la IL-2 para
inducir estos cambios.
Estudios de com petencia con la IL-2 y de
bloqueo del IL-2R con anticuerpos monoclona­
les han permitido demostrar que la IL-15 inte-
ractúa con las cadenas p/y del IL-2R pero no
con la cadena a . Fue propuesto que las subuni­
dades p/y se combinan con una subunidad es­
pecífica del IL-15R para generar un receptor de
alta afinidad y que la cadenas p/y son requeri­
das para enviar la señal de transducción intra­
celular.
La caracterización original del factor IL-T
realizada por Burton y col., le otorgó a este fac­
tor un PM de 14 IcD y se vió que compartían las
mismas acciones biológicas que fueron atribui­
das a la IL-15. La IL-T estimula los LT y las cé­
lulas LAK de igual manera que lo hace la IL-2.
Dado que no existen datos sobre al secuencia
del ADN de la IL-T no puede asegurarse la
identidad absoluta de ambos factores. Sin em-
bai'go el hecho de poseer igual PM e igual es­
pecificidad por el IL-2R, sugiere que se trataría
de la misma molécula.
IN T ER FE R O N ES
Los interferones (IFNs) son un grupo de pro­
teínas inmunorreguladoras sintetizadas princi­
palmente en respuesta a un estímulo viral y que
se hallan fisiológicamente relacionadas por sus
efectos antivirales.
Los interferones han sido clasificados en ti­
pos I y II. El IFN de tipo I está constituido por
los IFNs a y P los que son producidos por dife­
rentes células pero comparten la totalidad de
sus acciones biológicas. El IFN de tipo II (INFy
o IFN inmune) se produce durante una respues­
ta inmune como consecuencia de un estímulo
antigénico y que comparte algunas propiedades
con los anteriores.
Interferón (IFN) de tipo I
Los integrantes de este grupo se han caracte­
rizado fundamentalmente por sus efectos anti-
proliferativos y anti virales. Tanto el IFN a co­
mo el p, pueden ser secretados durante una res­
puesta inmune específica como consecuencia
de la activación de los macrófagos y los fibro­
blastos por acción de otras citoquinas elabora­
das por los LT.
Ambos IFNs, comparten los mismos recep­
tores celulares, conocidos como receptores de
IFN de tipo I (IFN-Rl), éste es una glucopro­
teína de 90 kD, formado por una única cadena
que se caracteriza por la presencia de 210 resi­
duos de aa conservados.
IF N a
El INF a es un conjunto de por lo menos 20
glucoproteínas inmunoregulatorias constituidas
por 189 aa, los que generan moléculas de un
PM de 18 kD. La información para las síntesis
de las diferentes moléculas se encuentra en ge­
nes separados, los que se ubican en el cromoso­
ma 9 humano.
Los efectos del IFN se realizan en forma pa-
racrina, las células infectadas secretan las bio­
moléculas hacia las células vecinas sobre las
que ejercen sus efectos biológicos. Algunos in­
vestigadores, subclasifican al IFN a en dos
grupos a , y u co, en relación a la secuencia
de los aa que los constituyen.
La principal fuente de producción son los fa­
gocitos mononucleares, razón por la cual tam­
bién es denominado IFN leucocitario. Su secre­
ción es inducida por polinucleótidos, ADN Y
ARN virales.
El INF a actúa sobre receptores de tipo I el
cual se expresa en casi todas las células y ello
les confiere capacidad para prevenir la replica-

ción viral, a través de la inducción de enzimas
que interfieren en dicho proceso. Además, ejer­
ce efectos antiproliferativos e induce la expre­
sión de antígenos del CMH de clase I.
Actúa sobre células NK, induciendo su acti­
vación y favoreciendo así su capacidad lítica.
Actúa sobre los LB ejerciendo un efecto inm u­
norregulatorio sobre la secreción de anticuer­
pos.
EITFN a es utilizado como agente antiproli-
ferativo en leucemias de células vellosas, sar­
coma de Kaposi, leucemias mieloides, hepatitis
crónica y lesiones ocasionadas por el virus pa­
piloma.
IF N ¡3
El IFN p, en una proteína producida por un
gen único, es una proteína constituida por 187
aa que presenta un PM de 20 kD. Posee una
homología del 30% en la secuencia aa en rela­
ción con el IFN a . El IFN (3 es producido por
los fibroblastos y, al igual que todos los facto­
res que integran este grupo, posee propiedades
antivirales.
Dado que comparte el receptor de superficie
con el IFN a , sus funciones biológicas son las
mismas. Las principales acciones conducen a
establecer un estado de actividad antiviral en
las células, la activación de mecanismos líticos
por parte de las células NK y el aumento de la
expresión de Ags del CMH de clase I con el fin
de activar los mecanismos efectores en la res­
puesta específica.
IFN tipo II
IF N Y
El INF Y o IFN inmune, es una glucoproteína
multifuncional caracterizada por sus propieda­
des antivirales. Es producido por los L T h l
(CD4+), por los LT CD8+ y en menor grado por
las células NK.
El IFN Y humano es una glucoproteína cons­
tituida pro 143 aa, que presenta diferentes gra­
dos de glucosilación, es una proteína homodi-
mérica de 21-24 kD. La información genética
está codificada en un gen único ubicado en el
cromosoma 12 humano. Existen dos variantes
alélicas que difieren en la posición del aa 137
(Arg o Gln). A pesar de ia simihtud funcional
con los IFNs de tipo I, no posee alta homología
estructural con dichas proteínas.
El IFN Y comparte muchas acciones con los
IFNs de tipo I. Produce efectos antiproliferati­
vos, antivirales y antiprotozoáricos. A dem ás
posee acciones inmunomoduladoras; aumenta
la expresión de las moléculas del CMH de cla­
se I y de clase II, actúa sobre los LB, ios m a­
Citoquinas 251
c ró fa g o s y de m an era a u to c rin a so b re lo s
LThJ, favoreciendo su propia síntesis.
Participa de la respuesta inflamatoria; sobre
las células mononucleares posee un efecto acti­
vador, induce la síntesis de proteínas de las ca­
dena respiratoria lo que le permite ejercer un
efecto microbicida, razón por la cual en alguna
clasificación es incluido dentro de las citoqui­
nas denominadas macrophage-activacting fa c ­
tor (MAFs). Aumenta la producción de IL-1,
IL-12, H jO j y dism inuye la expresión d e la
IL-8. Es quimiotáctico para monocitos pero no
para neutrófilos.
El IFN Y induce la diferenciación de LB y
LT de modo tal que se promueve la m adura­
ción de los LT citotóxicos y ¡a secreción de
Igs. En el ratón se observó que favorece el
cambio de isotipo de las Ig hacia IgO^^, e IgG,,
lo que perm ite antagonizar el efecto ejercido
por la IL4, la cual conduce hacia la producción
de IgE e IgG^.
También actúa sobre los neutrófilos aunque
su acción es más débil que la producida por
TNF o linfotoxina. Activa las células N K , fa­
voreciendo su acción citotóxica. Actúa sobre
células endoteliales favoreciendo la extravasa­
ción linfocitaria por aumento de la expresión
de m o lécu las de adhesión IC A M l p e ro no
V C A M l o selectina E.
La totah'dad de las acciones del IFN y condu­
cen a promover las acciones de los LThl y los
macrófagos, suprimiendo la acción de los LTh2
y de los neutrófilos.
El receptor de membrana para IFN y está re­
lacionado estructuralmente con el receptor de
los IFNs de tipo I pero es diferente y específi­
co. EL R-INFy es una glucoproteína de 90 kD,
constituido por una cadena polipeptídica. El
análisis de la secuencia generada a p artir del
ADNc permite establecer que los 17 aa del ex­
tremo amino terminal corresponden al péptido
señal, seguido por una secuencia de 228 aa co­
rrespondientes al dominio extracelular, 21aa a
la región transmembránica y 223 aa al dominio
intracelular. El dominio extracelular es crítico
para la acción especie específica que presentan
los IFNs. Una forma soluble del receptor h a si­
do encontrada en orina humana en condiciones
fisiológicas norm ales. El receptor se expresa
en todas las células a excepción de los eritroci­
tos. La información para su síntesis está codi­
ficada en el cromosoma 6 humano. Los estu­
dios realizados hasta e¡ presente permiten infe­
rir la existencia de otra cadena adicional nece­
saria para generar la señal de transducción. La
unión del IFN lleva a una dimerización del re­
ceptor y posterior activación de las proteínas
Jak 1 y Jak 2, lo que conduce a la activación
de proteínas intracitoplasmáticas de unión es­
pecíficas.
252 Aspectos básicos de ia inmunidad
FACTORES ESTIMULANTES
DE COLONIAS (CSF)
Los factores estimulantes de colonias son ci­
toquinas que inicialmente fueron identificadas
por su capacidad de estimular in vitro la forma­
ción de colonias de progenitores de m édula
ósea, estimulando su expansión y diferencia­
ción celular. Las acciones de este grupo de ci­
toquinas son influenciadas en gran medida por
otras citoquinas, existiendo efectos sinérgicos y
antagónicos entre ellas. Todas son necesarias
para mantener un correcto funcionamiento de
los mecanismos de defensa.
GM-CSF
El factor estimulante de colonias granulocíti-
cas-macrofágicas es un factor pleiotrópico, es­
timulante de la proliferación y maduración de
colonias de granulocitos y macrófagos. Es pro­
ducido por los LT activados, los macrófagos
activados, los LB, las células del endotelio vas­
cular, los fibroblastos y los mastocitos. Actúa
en médula ósea sobre células que presumible­
mente fueron estimuladas previamente por la
IL-3. Su acción es fundamental para el linaje
leucocitario aunque tam bién tiene capacidad
para activar leucocitos maduros.
El gen que codifica su síntesis mapea en el
cromosoma 5 humano y 11 murino, en una re­
gión estrecham ente ligada con los genes de
IL-3, lL-4, lL-5, M -CSF y c-fms. Los ADNc
humano y murino han sido clonados y contie­
nen información para una proteína constituida
por 124-127 aa de los cuales 17 aa correspon­
den al péptido señal. Posee múltiples sitios de
glucosilación, aunque los hidratos de carbono
no son importantes para el ejercicio de sus ac­
ciones biológicas. Posee dos puentes disulfuro
intracatenarios que son esenciales para su fun­
ción. Existe un 54% de homología entre la se­
cuencia aminoacídica del G-CSF humano y mu­
rino, ambas proteínas son especie específicas.
Si bien en un primer momento se le atribuyó
acción sobre la diferenciación de granulocitos
y m acrófagos, se ha dem ostrado que posee
efectos sobre la serie eritroide y megacariocíti-
ca y que además permite la diferenciación de
las células dendríticas.
El GM-CSF tiene capacidad para prolongar
la sobrevida de los eosinófilos y neutrófilos
maduros. Favorece la activación y el desarrollo
de los mecanismos citotóxicos m ediados por
los neutrófilos, los eosinófilos y los macrófa­
gos contra las células tumorales y, además, es­
timula la síntesis y liberación de la IL-1, IL-8 y
el T N F a por parte de los monocitos.
A ctúa como factor quim iotáctico para los
eosinófilos y los neutrófilos y favorece la mi­
gración transendotelial de los eosinófilos pero
no de los neutrófilos.
E l receptor para GM-CSF
Es un complejo multicatenario relacionado
con el IL-3 R y el IL-5R. Está constituido por
dos cadenas, una denominada a , responsable
de la unión de la citoquina con baja afinidad y
la segunda, denominada (3, la cual confiere al
receptor alta afinidad por el ligando. Ambas
cadenas pertenecen a los receptores de citoqui­
nas de tipo I. La homología estructural entre las
cadenas a humana y murina, es muy baja lo
que justifica la especificidad de especie esta­
blecida para esta citoquina. La subunidad (3
permite el envío de la señal de transducción,
para lo cual se ha reconocido una región cito­
plasmática cuya integridad es requerida para la
inducción de las acciones mitogénicas y la acti­
vación de las proteínas Jak.
M -C SF
El factor estimulante de colonias monocíti-
cas/m acrofágicas fue originalm ente descrito
como un factor que permitía originar colonias
de macrófagos desde progenitores de médula
ósea (C SF-I). Es producido por fibroblastos,
células del estroma de médula ósea, astroeitos,
osteoblastos, queratinocitos, macrófagos acti­
vados, LB, LT y células endoteliales.
La principal función es regular el crecimien­
to y diferenciación de los fagocitos mononu­
cleares. Aunque puede actuar sobre otros tipos
celulares fundam entalm ente las células de la
decidua y del trofoblasto placentario.
Las proteínas purificadas desde sobrenadan­
tes de cultivo de células humanas y murinas in­
dican que el M-CSF es una glucoproteína de 40
kD, homodimérica. El gen responsable de su
síntesis está ubicado sobre el cromosoma 1 hu­
mano y 3 del ratón. Ambas especies presentan
ARNm de diferentes longitudes como resultado
de un empalme (“splicing”) alternativo que ge­
nera proteínas maduras constituidas por 224,
406 o 522 aa. Todas ellas poseen un péptido se­
ñal de 32 aa y contienen m últiples sitios de
glucosilación. Los 150 aa correspondientes a la
región amino terminal están altamente conserva­
dos en el humano y el ratón (80%), en la región
correspondiente a la interacción con el receptor
específico. Si bien el M-CSF humano es capaz
de estimular células murinas no ocurre lo mismo
con el factor murino que es especie específico.
El M -CSF actúa perm itiendo la pro lifera­
ción, la diferenciación y la sobrevida de las cé­
lulas de médula ósea comprometidas en el de­
sarrollo de los monocitos. Posee efectos sobre
osteoclastos y células de la mieroglia. Su ac­

ción es local, no se lo encuentra en la circula­
ción. Los efectos se ejercen sobre células de la
progenie, que se encuentran más diferenciadas
que aquellas sobre las que actúa el GM-CSF.
El receptor de M -CSF (M-CSFR)
EL M-CSF ejerce sus acciones biológicas a
través de un receptor de alta afinidad. El recep­
tor humano es una glucoproteína transmembrá-
nica que consiste de 512 aa para el dominio ex­
tracelular, el que adquiere una distribución si­
milar a ios dominios de las Igs; 25 aa para la
región transmembrana y 435 aa en el dominio
intracelular; este dominio contiene una región
tirosin-quinasa.
G-CSF
El G-CSF es un factor pieiotrópico con efec­
tos sobre la proliferación, la diferenciación y la
activación de precursores h em atopoyéticos
comprometidos con el linaje gfanulocítico. Es
producido por m acrófagos activados, células
endotehales, fibroblastos, astrocitos, osteoclas­
tos y células del estroma de médula ósea.
El G -C SF es un polipéptido de 19 kD, el
cual puede ser detectado en la circulación. El
ADNc murino ha sido clonado y se ha determi­
nado que el mismo posee la información para
un precursor de 208 aa, de los cuales 30 corres­
ponden al péptido señal el que, al ser chvado
proteolíticamente, origina una proteína madura
de 178 aa. En el ser humano han sido identifi­
cados dos clones, los cuales codifican para pre­
cursores proteicos de 207 aa y 204 aa ambos
presentan un péptido señal de 30 aa. La proteí­
na madura de 177 aa posee una actividad bioló­
gica diez veces menor que la producida por la
isoform a de 174 aa. Las proteínas hum ana y
murina presentan un 73% de homología a nivel
de la secuencia de aa y se ha encontrado que
ambas especies presentan reactividad cruzada.
Existe además una significativa homología en
la secuencia aminoacídica en relación con la
IL-6, lo que sugiere que podrían presentar una
estructura terciaria similar.
Se ha encontrado que el G-CSF actúa sobre
células pre-diferenciadas que se hallan compro­
metidas con el desarrollo de los granulocitos,
estimulando la formación de colonias de neu­
trófilos a partir de precursores hematopoyéticos
de médula ósea. Aumenta la sobrevida de ios
neutrófilos maduros a la vez que favorece la
funciones citotóxicas dependientes de anticuer­
pos, la producción de anión superóxido y la
síntesis de fosfatasa alcalina. También se ha
encontrado que posee efectos quim iotácticos
para granulocitos y monocitos humanos.
El G-CSF es utilizado en medicina clínica en
Citoquinas 253
pacientes que sufren granulocitopenias com o
consecuencia de la aplicación de quimioterapia
o drogas inmunosupresoras.
E l receptor del G-CSF (G-CSFR)
Los efectos biológicos son ejercidos a través
de un receptor específico de alta afinidad, el
cual se expresa en precursores hem atopoyéti­
cos, neutrófilos, células placentarias, células en­
d o teliales y algunas células tum orales. Los
ADNc humano y murino han sido clonados. La
proteína madura m urina está constituida por
812 aa y presenta un alto grado de glucosila­
ción. El dominio extracelular contiene tres re­
giones de homología con otros receptores, el
extremo amino terminal presenta un dominio Ig
símil, posee otra región característica de los re­
ceptores de hematopoyetinas o tipo I y un do­
minio similar al dominio de fibronectína de tipo
III. El receptor humano contiene 813 aa y posee
un 62% de homología con el receptor de las cé­
lulas m urinas. A dem ás se han hallad o tres
transcriptos que permiten la síntesis de dos iso­
formas de la proteína transmembránica y una
forma soluble para el receptor. El G-CSFR no
contiene un dominio intracelular con actividad
quinasa, sin embargo se lo ha encontrado aso­
ciado a quinasas del grupo de las proteínas Jak
las que a su vez activarían a la proteína STAT3.
FACTOR TRANSFORMANTE
DEL CRECIMIENTO CELULAR (TGF)
El factor transformante del crecimiento celu­
lar es un factor multifuncional que modifica el
crecimiento de las células. Este factor fue des­
cubierto como una agente que permitía crecer a
las células NK en agar blando de igual forma
que lo hacen células malignas.
Las acciones ejercidas por el TGF muestran
diferencias que dependen del origen tisular de
las células blanco. Así, sobre células de origen
mesenquimal posee acciones estimulatorias en
cambio sobre células de origen epitelial o neu-
roectodérmico ejerce acciones inhibitorias.
El factor reconocido como TGF(3, es actual­
m ente identificado como TG FP,, existe otro
grupo de proteínas estrechamente relacionadas
denominada TGFp^, TGFp,, TGFp, y TOEp,,
las que poseen 70-80% de hom ología entre
ellas. La proteína madura es un dímero consti­
tuido por dos cadenas de M 2 aa unidas a través
de un puente disulfuro la cual posee un PM
aparente de 25 kD.
EL TG pp es un im portante m odulador del
crecimiento, la diferenciación y las actividades
de diferentes tipos celulares, está involucrado
tanto en la respuesta humoral como en la celu­
254 Aspectos básicos de la inmunidad
lar. Actúa sobre los LT, los LB, las células NK,
las células LAK, los monocitos/macrófagos y
los precursores hematopoyéticos. Es una cito-
quina importante para la regulación de la res­
puesta inmune porque antagoniza los efectos
linfocitarios, por ejemplo, sobre los LT y LB
actúa inhibiendo la proliferación celular, en el
caso de los LB inhibe la secreción de Igs, inhibe
el cultivo mixto linfocitario y la maduración de
los LT citotóxicos. También inhibe la actividad
citolítica de células NK y de los macrófagos ac­
tivados. Además, contrarresta la acción infla­
matoria de otras citoquinas sobre los PMN y las
células endoteliales. Por lo tanto, el TGF actúa
como factor supresor de la respuesta inmune.
El receptor no está completamente identifi­
cado, estudios prelim inares han identificado
tres diferentes formas de PM 53 kD, 70-85 kD
y 250-350 kD.
FA C T O R DE N EC R O SIS
TU M O R A L (TNF)
Los factores de necrosis tumoral son proteí­
nas generalmente referidas como citoquinas in­
flamatorias. El TNF fue originalmente identifi­
cado como un factor responsable de la necrosis
tumoral presente en el suero de animales trata­
dos con EPS, acción de la cual deriva su nom­
bre. Está constituido por dos especies molecu­
lares el T N Fa y el TNFp.
El T N F a es la principal citoquina elaborada
en la respuesta contra infecciones bacterianas
por agentes gram-negativos, fue conocido ini­
cialmente como cachetina. EL TNFP o linfoto­
xina (LT) es elaborado durante la respuesta in­
mune específica. Ambas comparten los mismos
receptores celulares.
Los TNFs son factores altamente pleiotrópi-
cos. El TNF es producido principalmente por
macrófagos activados, células NK, linfocitos
LAK, astrocitos, células endoteliales. El TNF
es producido por los L T hl.
El T N Fa humano es una proteína constituida
por 157 aa mientras que en el ratón y la rata es­
tá constituida por 156 aa. El TNF es un produc­
to constituido por 171 aa. Los PM aparentes de
ambas proteínas en condiciones desnaturalizan­
tes son de 17 y 25 kD respectivamente y po­
seen un 30% de homología. La diferencia de
PM es debida al diferente grado de glucosila­
ción. EL T N F a humano es una m olécula no
glucosilada a diferencia del murino que sí lo es.
Las formas biológicam ente activas, tanto del
T N F a como del TNF p, están constituidas por
trímeros unidos no covalentemente que presen­
tan un PM de 51 kD.
El TNF a se origina de una proteína precur­
sora de 25 kD con un dominio hidrofóbico y
otro hidrofílieo, se inserta en la membrana ce­
lular y luego es clivada para originar la forma
soluble de 17 kD a nivel extracelular. El TNFp
en cambio se sintetiza y hbera como cualquier
otra proteína se secreción.
Las principales acciones biológicas son com­
partidas, ello surge del hecho de compartir los
receptores celulares. Estas deben ser considera­
das en relación con la concentración efectiva. A
bajas concentraciones (10^’°M) ejercen un efec­
to local paracrino y autocrino que conduce a un
aumento en la expresión de las moléculas de
adhesión, lo que prom ueve la adherencia de
neutrófilos, monocitos y linfocitos a las células
endoteliales. Esta acción permite la acum ula­
ción de leucocitos en el sitio de inflamación.
Produce también activación de neutrófilos, eo­
sinófilos y macrófagos. Estimula a los fagocitos
mononucleares a producir IL -I, IL-6, quemo-
quinas y el propio TNF. Aumenta la expresión
de moléculas del CMH de clase I favoreciendo
así la citotoxicidad mediada por células. A altas
concentraciones posee efectos endocrinos que
conducen a un aumento de la temperatura por
acción a nivel del SNC y sobre los hepatocitos
induce un aumento de proteína sérica amiloide
A. Por otro lado, es capaz de activar el sistema
de coagulación e inhibir la diferenciación de cé­
lulas pluripotenciales en médula ósea y en con­
diciones extremas es capaz de llevar al organis­
mo a un estado de caquexia. La combinación de
aumento de fiebre, aumento de proteínas de fa­
se aguda, leucopenia y activación del sistema
de coagulación han sido encontrados como
efectos adversos en pacientes con cáncer que
recibían TNF como agente terapéutico.
Los TNF presentan receptores que se expre­
san en la mayor parte de las células del orga­
nismo. Han sido identificados dos receptores
de superficie que unen tanto al T N F a como al
p. El re c e p to r d e n o m in ad o tip o A, p75 o
TNFR-II es una proteína con un PM de 75 kD
constituida por 439 aa. El otro, tipo B, p55 o
TNFR-I está constituido por 426 aa y posee un
PM de 55 kD. Los receptores son inmunológi­
camente diferentes pero sus dominios extrace­
lulares son similares con relación al número de
cisteínas que los constituyen y los dominios es­
tructurales generados.
Dado que el factor biológicamente activo es
un trímero, se requiere la aproximación de dos
o tres unidades receptoras para que se produzca
la señal de transducción intracelular. Los domi­
nios intracelulares de ambos receptores no es­
tán aparentemente relacionados. La unión de
los receptores con los dos factores es de una
afinidad relativam ente baja en relación con
otros receptores de citoquinas (Kd para p75 5
M y para p55 Kd 1 x lO ^M), no existe eviden­
cia de interacción entre ellos.

Han sido identificadas form as solubles de
ambas cadenas también denominadas TNF-BPI
y TNF-BPII para p35 y p75 respectivamente.
Ellas surgen como consecuencia de la libera­
ción del dominio extracelular probablemente
por proteólisis del receptor. Estos pueden neu­
tralizar la acción de las citoquinas y servirían
como elementos regulatorios de la respuesta in­
flamatoria y, al mismo tiempo, actuarían como
protectores de la acción sobre las células veci­
nas.
Señales de activación celular mediadas
por citoquinas
La mayoría de los eventos bioquímicos im­
plican la activación de las células T y B, lo que
les permite pasar de su estado de reposo (GO) a
la fase (G l) del ciclo celular. Las señales que
derivan de las interacciones entre las citoquinas
y los receptores, le permiten luego a la célula
progresar de la fase S a la fase de proliferación.
Algunas citoquinas a la vez permiten generar
eventos de diferenciación celular.
Existen muchos mecanismos que generan las
señales intracelulares a los cuales las células
responden de una manera específica,
Se ha encontrado que algunos complejos re-
ceptor-citoquina son rápidamente internaliza­
dos por la células. Ello implica fosforilaciones
del receptor, que podría involucrar la disocia­
ción del receptor y la reutilización del mismo
en la superficie celular y también podría formar
parte de señales intracelulares.
La unión del ligando a su receptor específico
en algunos casos activa dominios intracelulares
y, así, dominios Tirosín-quinasa catalizan la
fosforilación específica de los residuos tirosina
de ciertas proteínas intracitoplasm áticas. Sin
embargo, la mayoría de los receptores conoci­
dos conducen a la fosforilación de residuos de
tirosina sin poseer actividad quinasa intrínseca.
Las señales bioquímicas en la respuesta de
IL-2 con su receptor han sido objeto de num e­
rosos estudios. La IL-2 puede activar a la PKC
e inducir fosforilación de sustratos celulares, a
pesai’ de no encontrarse hidrólisis de PIP2 o au­
mento de Ca++ intracelular. Sin embargo, el ba­
jo nivel de activación de PKC, no parece ser
importante para inducir la proliferación celular.
Además, el aumento de AMPc bloquea la acti­
vación de PKC pero no bloquea la respuesta
proliferativa inducida por IL-2.
En el caso de los LT, la interacción de la
IL-2 con su receptor induce la fosforilación de
Tyr de varios sustratos entre ellos p56'‘^^ Para
que ello ocurra la presencia de la subunidad |3
es suficiente, siendo frecuente que ¡as señales
intracelulai'cs estén mediadas por otras proteí­
nas con las que interactúa.
Citoquinas 255
En el caso de la IL-4; las señales de activa­
ción tam poco perm iten detectar hidrólisis de
P IP 2, m o v iliza c ió n de Ca++, ni a c tiv a c ió n
dePKC o depolarización de la membrana celu­
lar, pero en el caso de los LB permite la fosfo­
rilación de una proteína de 42-44 kD. Los últi­
mos estudios con IL-4 y los LB han sugerido
que la IL-4 podría inducir una rápida produc­
ción de IP3 y aumento de Ca++ con cambios en
el nivel de AMPc. El conocimiento de las seña­
les generadas por las citoquinas es hasta el pre­
sente limitado.
Por otro lado, en los últimos años, ha sido
estudiado el mecanismos Jak-STAT como una
forma por la cual ciertas citoquinas envían se­
ñales de activación a los genes específicos. En
este mecanismo participan dos familias de pro­
teínas transductoras; la familia de quinasas Jak
{Janus kinase) que manifiestan su actividad co­
mo integrantes de complejos multiméricos de
receptores activados por sus ligandos. L a se­
gunda fam ilia está constituida por proteínas
que regulan la transcripción genética y son de­
nominadas STAT (Signal transducer and acti-
vator transcription proteins), estas proteínas se
encuentran inactivadas hasta que son fosforila-
das por las proteínas Jak.
Los miembros de las proteínas Jak hasta aho­
ra identificados son; Jak l, Jak2, Jak3 y Tyk2,
están ampliamente distribuidos en los distintos
tipos celulares con excepción, de Jak3 la cual
fue encontrada sólo en leucocitos. Las proteínas
Jak son rápidamente fosforiladas en un residuo
de tirosina cuando el receptor apropiado es acti­
vado. El mecanismo no está completamente en­
tendido pero se cree que la proteína Jak unida a
la proteína receptora dimerizada serían capaces
de fosforilarse una a la otra, posterior a este
evento, el complejo fosforilado produciría una
acción catalítica que conduce a la fosforilación
de las proteínas citoplasmáticas STAT.
La fosforilación de tirosinas de las proteínas
integrantes de la familia STAT, conduciría a la
form ación de dím eros, los que activarían la
transcripción a nivel nuclear luego de com bi­
narse con secuencias de unión específica regu­
ladoras presentes en el ADN.
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256 Aspectos básicos de la inmunidad
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4-like cytokine th at acts on m onocystes and B cells,
bu t n o t on T ce lls. Im m u n o l. T o d a y , 15, 1, 19-26,
1994.
El reconocimiento antigénico
y activación de los linfocitos B y T
RICARDO MARGNI
Un esbozo general de la respuesta inmune y
una descripción pormenorizada de los recepto­
res antigénieos de los linfocitos B y T han sido
efectuados en los capítulos 2, 3, 6 y 7. Se ha in­
dicado cómo los antígenos de síntesis celular
endógena o exógena son procesados por las cé­
lulas presentadoras de antígenos (CPA) y cómo
son expuestos en las membranas celulares para
su reconocimiento por los linfocitos T efecto-
res (Te, LCT) y reguladores (Th). Aquí habre­
mos de referirnos a cómo es ese reconocimien­
to antigénico por los linfocitos B y T y cuál es
la consecuencia de este hecho.
El receptor antigénico del linfocito B
y reconocimiento del antígeno
El receptor antigénico del linfocito B es la
inm unoglobulina IgM de membrana (IgMm),
la que presenta algunas diferencias estructura­
les con la secretada por los plasmocitos (IgMs).
En la IgMm los últimos 20 aminoácidos de la
porción C-terminal de la cadena |J, de la IgMs
están ausentes y son sustituidos por una se­
cuencia diferente de 41 aminoácidos, 12 de los
cuales son extracelulares, los 26 siguientes son
los residuos hidrofóbicos responsables de la in­
serción de la IgM en la membrana celular, y los
3 restantes constituyen la fracción intracito-
plasmátiea. Ello es consecuencia de la existen­
cia en la posición 3 ’ de! gen que transcribe Cji
de dos exones denominados C|is y Ciim, los
que al recombinarse con el gen C|X confieren el
carácter de IgMs o IgMm de la inmunoglobuli­
na sintetizada. La IgMm capta antígeno nativo
presente en una fase fluida, sin que medien mo­
dificaciones previas. Como consecuencia de la
interacción se ponen en marcha una serie de
eventos que llevan a la proliferación y diferen­
13
ciación celular y secreción de anticuerpos con
una estructura idéntica a la del receptor del lin­
focito B, pero expresado como IgMs.
Últimamente se ha podido demostrar que pa­
ra que la célula pueda transducir señales que
llevan a su activación, se necesita de la partici­
pación de otras proteínas de membrana. El re­
ceptor B existe como un complejo formado por
una molécula de IgMm y al menos otros dos
polipéptidos transm em bránicos denom inados
Ig -a e Ig-P, originando un complejo sim ilar al
que forman el receptor del linfocito T (RCT) y
CD3.
La existencia de los polipéptidos Ig -a e Ig-p
permaneció largo tiempo inadvertida debido a
que los detergentes no iónicos NP-40 y Tritón
X -100, com únm ente usados para o b ten er la
IgM m, disocian al complejo. Estos polipépti­
dos están también asociados a los otros isotipos
de inmunoglobulinas cuando, durante la m adu­
ración de la respuesta inmune, se expresan en
membrana.
Los polipéptidos Ig -a e Ig-p forman hetero-
dímeros unidos por puentes disulfuro. En el ra­
tón la proteína Ig a es el producto del gen lla­
mado mb-l y la Ig-p, la del gen B29. Estos ge­
nes se expresan en linfocitos B y no lo hacen
en los LT. El gen m b-l codifica una proteína
de 220 aminoácidos que incluye una secuencia
líder, un sitio extracelular con dos sitios poten­
ciales de N-glucosilación, una porción trans­
membránica y un dominio C-terminal intracito-
plasmático.
Los polipéptidos Ig-a e Ig-p aislados de cé­
lulas B de ratón tienen un PM de 34 y 40 kD,
respectivamente, y una estructura sim ilar a la
de los tres polipéptidos (y, 8 y e) del com po­
nente CD3 del linfocito T. En los polipéptidos
aislados de hnfocitos B humanos los PM seña-
256 Aspectos básicos de la inmunidad
5. D arnell, ]. Jr,, K er Tan y col. Jak-S T A T Pathway,s and
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1994.
El reconocimiento antigénico
y activación de los linfocitos B y T
RICARDO MARGNI
Un esbozo general de la respuesta inmune y
una descripción pormenorizada de los recepto­
res antigénieos de los linfocitos B y T han sido
efectuados en los capítulos 2, 3, 6 y 7. Se ha in­
dicado cómo los antígenos de síntesis celular
endógena o exógena son procesados por las cé­
lulas presentadoras de antígenos (CPA) y cómo
son expuestos en las membranas celulares para
su reconocimiento por los linfocitos T efecto-
res (Te, LCT) y reguladores (Th). Aquí habre­
mos de referirnos a cómo es ese reconocimien­
to antigénico por los linfocitos B y T y cuál es
la consecuencia de este hecho.
El receptor antigénico del linfocito B
y reconocimiento del antígeno
El receptor antigénico del linfocito B es la
inm unoglobulina IgM de membrana (IgMm),
la que presenta algunas diferencias estructura­
les con la secretada por los plasmocitos (IgMs).
En la IgMm los últimos 20 aminoácidos de la
porción C-terminal de la cadena |J, de la IgMs
están ausentes y son sustituidos por una se­
cuencia diferente de 41 aminoácidos, 12 de los
cuales son extracelulares, los 26 siguientes son
los residuos hidrofóbicos responsables de la in­
serción de la IgM en la membrana celular, y los
3 restantes constituyen la fracción intracito-
plasmátiea. Ello es consecuencia de la existen­
cia en la posición 3 ’ de! gen que transcribe Cji
de dos exones denominados C|is y Ciim, los
que al recombinarse con el gen C|X confieren el
carácter de IgMs o IgMm de la inmunoglobuli­
na sintetizada. La IgMm capta antígeno nativo
presente en una fase fluida, sin que medien mo­
dificaciones previas. Como consecuencia de la
interacción se ponen en marcha una serie de
eventos que llevan a la proliferación y diferen­
13
ciación celular y secreción de anticuerpos con
una estructura idéntica a la del receptor del lin­
focito B, pero expresado como IgMs.
Últimamente se ha podido demostrar que pa­
ra que la célula pueda transducir señales que
llevan a su activación, se necesita de la partici­
pación de otras proteínas de membrana. El re­
ceptor B existe como un complejo formado por
una molécula de IgMm y al menos otros dos
polipéptidos transm em bránicos denom inados
Ig -a e Ig-P, originando un complejo sim ilar al
que forman el receptor del linfocito T (RCT) y
CD3.
La existencia de los polipéptidos Ig -a e Ig-p
permaneció largo tiempo inadvertida debido a
que los detergentes no iónicos NP-40 y Tritón
X -100, com únm ente usados para o b ten er la
IgM m, disocian al complejo. Estos polipépti­
dos están también asociados a los otros isotipos
de inmunoglobulinas cuando, durante la m adu­
ración de la respuesta inmune, se expresan en
membrana.
Los polipéptidos Ig -a e Ig-p forman hetero-
dímeros unidos por puentes disulfuro. En el ra­
tón la proteína Ig a es el producto del gen lla­
mado mb-l y la Ig-p, la del gen B29. Estos ge­
nes se expresan en linfocitos B y no lo hacen
en los LT. El gen m b-l codifica una proteína
de 220 aminoácidos que incluye una secuencia
líder, un sitio extracelular con dos sitios poten­
ciales de N-glucosilación, una porción trans­
membránica y un dominio C-terminal intracito-
plasmático.
Los polipéptidos Ig-a e Ig-p aislados de cé­
lulas B de ratón tienen un PM de 34 y 40 kD,
respectivamente, y una estructura sim ilar a la
de los tres polipéptidos (y, 5 y e) del com po­
nente CD3 del linfocito T. En los polipéptidos
aislados de hnfocitos B humanos los PM seña­
258 Aspectos básicos de la inmunidad
Receptor antigénico del
Linfocito r
Fig. 13-1. Representación esquem ática de los receptores antigénicos de los linfocitos B y T. El receptor del LB reconoce
un epitope conform acional de un antígeno nativo expuesto en una fase fluida. El receptor del linfocito T, en este caso un
Th, reconoce uno de los péptidos resultantes del procesado del antígeno por la CPA y expuesto en m em brana asociado al
CM H-IL
lados para ratón se encuentran invertidos, posi­
blemente como consecuencia de una alta glu­
cosilación de las cadenas Ig-a.
El dominio citoplásmico de íg - a consta de
61 aminoácidos y el de Ig-[3 de 48 aminoáci­
dos, lo suficientemente largos como para trans-
ducir señales, lo que se presume ocurriría con
la participación de estructuras patrones dom i­
nantes (“motifs”) homólogas presentes en am­
bas cadenas. Esto permitiría entender el posible
mecanismo de activación celular inducido por
la interacción del antígeno con el receptor del
LB (IgMm), teniendo en cuenta que la cadena
[t de esta inmunoglobulina sólo tiene 3 aminoá­
cidos ubicados en la región citoplasmática, lo
que lim ita enorm em en te su p o sib ilid a d de
transmitir señales al interior de la célula.
Las proteínas accesorias Ig -a e Ig-p también
son necesarias para que se produzca el tránsito
a la membrana celular de la IgMm sintetizada.
No se conoce exactamente el niimero de he-
terodímeros Ig-a/Ig-P que están asociados a la
Receptor antigénico dei
Linfocito T
C PA CIMH-II
M W M M
péptido
IgMm; se presume como posibles un niimero
de dos.
En la figura 13-1 puede apreciarse la estruc­
tura esquemática del complejo que constituye
el receptor antigénico del linfocito B.
El antígeno específicamente reconocido por
el linfocito B como proteína extraña es proce­
sado de manera similar a lo que hace una célula
presentadora de antígeno (CPA), siguiendo la
vía endocítica. Los diferentes péptidos resul­
tantes serán expresados en su membrana aso­
ciados a antígenos del CMH-clase II, segtín se
indicó en el capítulo 2. Esos complejos CMH-
ll-péptido serán los que reconocerán los Th ac­
tivados los que, como consecuencia de esa in­
teracción, habrán de poner en marcha el efecto
cooperativo. Los linfocitos Th han aprendido a
reconocer esos complejos al contactarse eon las
CPA que han endocitado esos mismos antíge­
nos. Los diferentes péptidos resultantes del
p ro c e sa d o de esto s a n tíg en o s a so c iad o s a
CMH-clase II serán expresados en la membra-
 El reconocimiento antigénico y activación de los linfocitos B y T 259

IgMm
Ag
-—
CPA

RE
LB

-CM H-II
m CPA

Ag
CMH-II , Ag endocitado
\
endocitado endosomas

LB p péptidos -I- M
CMH-ll

R E ^^\ CPA

i
3
ív péptidos +
CMH-ll

RCT

LB

/Th
4
Til activado

Célula
I I plasmática
Anticuerpos

Fig. 13-2. R econocim iento del antígeno por el linfocito B y efecto cooperativo de un Tii activado por interacción con
CPA. El antígeno es procesado en los endosom as originándose los péptidos que se unirán al CM H -II sintetizado en el retí­
culo endoplasm ático (RE) y se expondrán en la m em brana plasm ática p ara su reconocim iento por el Th.

na de la CPA y los distintos linfocitos Th con
receptores específicos para ellos se activarán al
ponerse en contacto.
Ello significa que diferentes Th podrán ejer­
cer efecto cooperativo sobre un mismo linfoci­
to B ya que, si bien esta célula posee un único
receptor específico para un epitope del antíge­
no extraño sin modificar, cuando éste es endo­
citado y procesado son varios los péptidos pro­
venientes del mismo antígeno original que se
expondrán en membrana (fig. 13-2).
El receptor antigénico del linfocito T
y reconocimiento del antígeno
A diferencia de lo que ocurre con el linfocito
B, que interacciona con antígenos no modifica­
dos, el linfocito T sólo reconoce péptidos de
aproxim adam ente 8-15 am inoácidos p ro v e ­
nientes de la degradación del antígeno p o r las
células CPA, y estando esos péptidos expuestos
en la membrana celular y asociados a antígenos
del CM H de clase I cuando el antígeno es de
síntesis endógena (proteínas virales, antígenos
tumorales), o CMH de clase lí si el antígeno es
de origen exógeiio (bacterias, parásitos). Dado
que el sitio de interacción del CMH-clase 1 con
el péptido es el producto de una sola cadena
(a) y el del CMH-clase II de las cadenas peptí­
dicas a y [3 (véase cap. 12), en este últim o se
origina una estructura de mayor amplitud para
su asociación con ios péptidos a presentar. Se
ha demostrado que las moléculas del CM H -cla­
se I pueden presentar péptidos de 7- 10 resi-
260 Aspectos básicos de la inmunidad
dúos, en tanto que las moléculas del CM H-cla­
se II normalmente presentan péptidos constitui­
dos por 12-15 aminoácidos.
El R C T está asociado al complejo CD3, el
que está constituido por las cadenas polipeptí­
dicas y, 8 y e, la última de las cuales forma he-
terodímeros con Y y 5 (ey, e5) y los componen­
tes de la “familia zeta”, que en el 90% de los
casos constituyen un homodímero (i^2: dos ca­
denas zeta) y un heterím ero (Í¡T|; una cadena
zeta y una cadena eta) en el 10% de los casos
restantes. Estas cadenas polipeptídicas son fun­
damentales y participan activamente en los me­
canismos de activación celular cOmo se verá
más adelante. Los antígenos de membrana CD4
y CD8, que identifican a poblaciones de células
T reguladoras y efectoras, respectivamente, tie­
nen también participación activa (fig. 13-1).
Si bien las interacciones CM H -ILpéptido-
RCT y CMH-I-péptido-RCT son las responsa­
bles de ia unión específica entre las CPA-Th,
Th-LB y CPA-Tc, las mismas no son suficien­
tes para que la activación celular se efectivice.
Otras uniones entre componentes de las mem­
branas de estas células deben ocurrir para que
se originen los entrecruzamientos o agregados
de los receptores, indispensables para que la
activación de las células, su diferenciación y
expresión de moléculas con actividad biológica
tenga lugar. En la figura 13-3 están resumidas
las experiencias realizadas por Emmrich con el
objeto de demostrar la importancia de la agre­
gación.
Diferentes proteínas de membrana presentes
en las CPA y en los Th y Te, especialmente las
conocidas con el nombre de moléculas de ad­
hesión, constituyen pares moleculares que inte­
raccionan entre sí y originan uniones proteína-
proteína, asegurando a la unión célula-célula la
suficiente afinidad para que los mecanismos de
C u ad ro 13-1. Pares de moléculas que interactúan como ligandos en las interacciones entre lin­
focitos Th y linfocitos B
Linfocitos Th
M oléculas de adhesión
CD2
t.FA-1 (C D l la )
¡CAM-1 (CD 54)
M oléculas de coestim ulación
CD 28
CTLA-4
CD 40L
O tras m oléculas
CD 45RO
CD5
activación celular se pongan en marcha u origi­
nando coestimulaciones fundamentales para la
activación.
En el cuadro 13-1 están indicados diferentes
pares moleculares que participan en la adhe­
sión y coestimulación entre linfocitos Th y lin­
focitos B.
CD2 es una molécula proteica presente en Jos
linfocitos T y su ligando en los linfocitos B es
la molécula LPA-3 (CD58). Como consecuen­
cia de esa interacción hay activación de quina­
sas de tirosina, especialmente p59'>'" y la consi­
guiente fosforilación de diferentes sustratos.
LFA-1 (CDl la), cuyo epitope es un hidrato
de carbono, tiene com o ligando a ICAM-1
(CD54) e lC A M -2 (CD102). Estos pares de
moléculas están presentes en los linfocitos Th y
LB, lo que implica que la contribución a la ad­
hesión celular puede tener lugar en ambos sen­
tidos. Cuando las eélulas se activan aumenta la
afinidad de estas moléculas por sus ligandos,
especulándose que en ello están involucradas
fosforilaciones mediadas por quinasas.
La molécula CD28 y la CTLA-4 -que se ex­
presa en el linfocito Th activado-, tienen como
ligando en los linfocitos B a las moléculas de la
familia B7 (B7.1 y B7.2), identificadas como
CD80 y CD86 respectivamente, siendo la afini­
dad de CTLA-4 por sus ligandos mayor que la
correspondiente a CD28. Esta interacción no es
la de una simple adhesión, sino que hay una
coestimulación para c[ue el efecto cooperador
tenga lugar. Algo similar ocurre entre CD40,
antígeno de diferenciación del linfocito B y
CD40L (ligando de CD40) existente en la mem­
brana de los linfocitos CD4+ activados (Th).
Interacciones de adhesión también han sido
demostradas entre los antígenos de membrana
CD45RO y CD5 de los hnfocitos T y las molé­
culas CD22 y CD72 de los linfocitos B. Para
Linfocitos B
L F A -3’ (CD 58)
IC A M -1(C D 54)/IC A M -2 (CD 102)
LFA~1 (C D lla )
B7 (B 7.I/B 7.2)
B7 (B 7.I/B 7.2)
CD 40
CD 22
CD 72
 El reconocimiento antigénico y activación de los linfocitos B y T
más detalles sobre estas moléculas y sus inte­
racciones véase el apéndice del capítulo 2 y ca­
pítulo 11.
M ecanism os de transducción en linfocitos B
M ecanismos sim ilares a los descritos para
otras interacciones receptor-ligando, consisten­
tes en la activación y liberación de segundos
mensajeros, han sido descritos para la unión
IgMm-Ag y RCT-CMH-II-péptido.
En el caso del receptor B o Ig-a/Ig-|3-IgMm,
la transducción o envío de señales es puesta en
marcha por el entrecruzam iento o agregación
del receptor por antígenos que expresan por
unidad un mismo epitope repetido. Se conside­
ra que debe ser así pues artificialmente se pue­
de inducir el mismo efecto con anticuerpos an-
ti-inmunoglobulina y, en cambio, no se logra
activación celular con ligandos univalentes. Lo
primero que se observa durante este proceso es
la aparición de un cierto número de proteínas
con sus tirosinas fosforiladas, entre ellas Ig -a e
Ig-p, lo que se estima es debido a la activación
de diferentes protein-quinasas de tirosina. Por
analogía a lo que ocurre con el RCT y el com ­
plejo CD3, se presum e que los polipéptidos
Ig-a e Ig-p deben jugar un papel importante en
los mecanismos de activación celular. Su real
participación en este evento no ha sido aún fe­
hacientemente demostrada.
Se considera, sobre la base de resultados ex­
perimentales, que diferentes quinasas de tirosi­
na participan en este proceso de fosforilación
de proteínas, especialmente algunos miembros
de la familia Src-tirosin quinasa, como p56“ y
p59í'"', proteínas de 56 y 59 kD respectivamen­
te, productos de expresión de los proto-oncoge-
nes Ick y fyn.
Se especula sobre el mecanismo por el cual
el entrecruzamiento del receptor del linfocito B
puede inducir la activación de las quinasas de
tirosina. Los componentes de la familia Src-ti-
rosin-quinasa tienen dos dominios homólogos
denominados SH2 y SH3 (SH por homología
Src). Los SH2 median las interacciones proteí­
na-proteína entre la enzima y la proteína con
restos de tirosina a fosforilar. Los SH3 recono­
cen secuencias ricas en prolina y pueden unirse
a otras proteínas capaces de transducir señales.
Tienen además una región N-terminal que con­
tiene un sitio de miristilación involucrado en
localización en membrana y un dominio estruc­
tural con actividad de quinasa de tirosina, do­
minio que, a su vez, tiene dos tirosinas que ac­
túan como sitios de regulación de la actívidad
de la enzima. La fosforilación de uno de esos
sitios, el correspondiente a la tirosina 394, por
otra quinasa de tirosina, es un evento activante,
mientras que la fosforilación de la tirosina 505
261
decrece su actividad enzimática (fig. 13-4). En
los linfocitos en reposo la Tyr 505 está fosfori-
lada, produciéndose la desfosforilación durante
la activación celular, seguida de la activación
de la capacidad quinasa y autofosforilación de
la Tyr 394. Hay quienes suponen que la p56lck
es inactiva en los linfocitos en reposo debido a
la interacción entre el sitio de regulación nega­
tiva y el dominio SH2 de su propia molécula,
lo que llevaría a producir un cambio alostérico
que inhibiría la actividad quinasa o la accesibi­
lidad de substrato. Se considera qufc el entre-
cruzamiento del receptor B llevaría a la rem o­
ción del fosfato correspondiente al sitio inhibi­
torio, predominando el efecto activante. Jugaría
un papel im portante en este proceso C D 45,
proteína de membrana de los linfocitos con ac­
tividad de fosfatasa de tirosina, la que ha sido
bien estudiada en las células T.
O tras p ro tein -q u in asas de tiro sin a co m o
p53/56'J'", p55'>"‘, PTK72 y ZAP-70 probable­
mente participen tam bién en forma activa en
los procesos de fosforilación de proteínas que
intervienen en la activación del linfocito B.
Un mecanismo de fosforilación que ju eg a un
rol importante en la transmisión de señales me­
diadas por el receptor del linfocito B, cuando
se produce su entrecruzamiento por antígeno o
anticuerpo anti-inmunoglobulina, es el que se
inicia con la hidrólisis de fosfatidil inositol di­
fosfato (PIP2) por fosfolipasa C (PLCyl), que
lleva a la producción de inositol trifosfato (IP3)
y diacilglieerol (DAG). El IP3 formado estim u­
la la salida de Ca^+ del retículo endoplasmático
e influjo de Ca^+ desde el exterior de la célula a
través de canales transmembránicos y activa a
su vez una proteinquinasa dependiente de Ca^+
y calmodulina (Ca^VCaM quinasa). Este Ca^+,
juntam ente con el DAG que actúa como cofac­
tor, provocan una translocación de proteinqui­
nasa de serina/treonina (PKC) a la m em brana
citoplasmática, la que así activada fosforila su
sustrato, modificando el pH y alterando la acti­
vidad de estructuras responsables del transporte
de varios iones, entre ellos Na+, H+, Ca^+ y K+
(fig. 13-5) La activación de estas cascadas le
permite al linfocito B progresar a la fase S del
ciclo celular, caracterizada por la síntesis de
ADN. Durante este proceso hay aumento de la
e x p re s ió n en m em b ra n a de a n tíg e n o s del
CMH-clase II, facilitándose la presentación al
linfocito Th de los péptidos antigénieos resul­
tantes de la degradación del antígeno y de re­
ceptores para IL-2 e IL-4. Con posterioridad a
esa interacción hay aumento de AMPc prom o­
viéndose la diferenciación celular que llega
hasta el estado de plasmocitos, sintetizadores
de una inmunoglobulina o anticuerpo estructu­
ralmente igual a la del receptor antigénico, la
que es secretada.
262 Aspectos básicos de la inmunidad

^C D 8

W ' rct

F(ab’)2
hetero­
dímero
(++)

anti-CD8

anti-CD3

F ig. 13-3. D em ostración m ediante el em pleo de anticuerpos rnonoclonales unidos a una fase sólida o hibridizados por m é­
todos quím icos de que la agregación de R C T/CD 3 con otras m oléculas es indispensable p ara la activación celular. L a reac­
ción A es negativa (control). El entrecruzam iento con anticuerpos anti-CD 3 y anti-CD 8 no resulta efectivo, si uno de los
anticuerpos está en solución (B, C ), Las reacciones D , E y F son positivas, en los tres casos hay entrecruzam iento de CD3
con CD8 por estar am bos anticuerpos unidos a una fase sólida (D), agregados por un F (ab ’)2 anti-IgG (E) o heterodim eri-
zados por m étodos quím icos (F). Las reacciones G , H e ! son negativas por no e.xistir entrecruzam iento. (A daptada de
Em m rich F, Im m unology Today, 90: 296, 1988.)

Mecanismos de transducción cuando el linfocito T, a través del RCT/CD3

en el linfocito T in teractú a con el co rresp o n d ien te p éptido-
CMH. Este hecho, al igual que el entrecruza­
Un mecanismo de fosforilación similar al in­ miento del RCT/CD3 con un anticuerpo mono­
dicado en la activación del linfocito B ocurre clonal específico, induce cambios conforma-

Sitio de Dominio con

miristilación actividad de quinasa

SH3 SH2
Tyr 394 Tyr 505
sitio regulador sitio reguiador
positivo negativo
F ig. 13-4. Representación esquem ática dé p56'‘’' com ponente de la fam ilia Src de tirosin quinasas de proteínas.
 El reconocimiento antigénico y activación de los linfocitos B y T 263

Fig. 13-5. E.squem atización de la activacióji de una célula B por agregación del receptor (IgM m ) con un antígeno. Una
fosfolipasa C activada (PLC*) hidroliza derivados polifosfoinosínicos (PiP2) en inositol trifosfato (IP3) y diacilglicerol
(DAG). H ay m ovilización de Ca^*, el que junto con el DAG induce la translocación de proteinquinasa de serina/treonina
(PKC) del citoplasm a a m em brana (PKC*). El IP3 activa a su vez u n a proteinquinasa dependiente de Ca^+ y calm o d u lin a
(Ca^VCaM). Estas enzim as fosforilan sus sustratos proteicos y se ponen en m archa los m ecanism os de activación celu lar.

cionales en una o varias de sus unidades y la L a cadena C, es el único co m p o n en te del

consecuente fosforilación por una o más quina­
sas de proteínas.
Así como la función del heterodím ero a /p
del' RCT es la de reconocer el ligando específi­
co, la función de los péptidos constitutivos de
CD3 y de las cadenas ^ es la de acoplar RCT a
los componentes celulares que transducen las
señales. Las dos principales quinasas de proteí­
nas asociadas a R C T y a los co-receptores
CD4/CD8 son pSó'*'* y p59^'", las que surgen
como fosforilantes de diferentes sustratos en­
dógenos. La primera de ellas está directamente
asociada a los dom inios citoplasm áticos de
CD4 o CDS, o ambos.
RCT/CD3 que experimenta fosforilación de ti­
rosinas y ha podido demostrarse que su región
citoplasm ática es capaz de transducir señales
correspondientes a eventos relacionados con el
RCT.
Recientemente se ha descrito otra proteína
que por inmuno-precipitación coprecipita con
las cadenas ^ a partir de materiales provenien­
tes de linfocitos T activados. Se la denomina
ZAP-70 por ser una proteína de 70 kD asociada
a la cadena que experimenta in vivo fosfori­
lación de tirosinas a continuación de la estimu­
lación del RCT. La asociación de ZAP-70 y ca­
denas producida con posterioridad a la esti-
264 Aspectos básicos de la inmunidad
muJación del RCT se correlaciona con un au­
mento de la actividad de quinasa de proteína
que se detecta en los inmunoprecipitados. Ello
hace que se considere que ZAP-70 debe estar
asociada con transducción de señales que tie­
nen lugar cuando un linfocito T es estimulado,
aunque la naturaleza de la función que esta
PKT cumple in vivo es desconocida. Un posi­
ble rol sería el de unir el RCT, a través de la
cadena ^ a moléculas adicionales que funciona­
rían en otras etapas del camino que lleva a la
transducción de señales.
En los linfocitos T activados la PLC experi­
menta una rápida y transiente fosforilación de
sus tirosinas. Ello ocurre porque la molécula
posee un dominio SH2 que le permite asocia­
ción con quinasas de proteínas. Cuando el RCT
fija su ligando específico se activan algunas de
las fosfotirosin quinasas de proteína asociadas
a este evento, siguiendo Ju eg o la fosforilación
y activación de PL C yl. Ésta hidroliza PIP2 pa­
CPA
CMH-II
péptido
CD45
ATP
F ig. 13-6. Reconocim iento antigénico del com plejo CIVIH-II-péptido por el R C T y puesta en m archa de los m ecanism os
de fosforilación y desfosforilación de proteínas que llevan a la activación celular.
ra formar los segundos mensajeros IP3 y DAG,
que activan a PKC, la que fosforila una varie­
dad de substratos que contienen serina o treoni­
na siguiendo la cascada ya indicada en activa­
ción del linfocito B.
Otras quinasas han sido identificadas en lin­
focitos, entre ellas: quinasas dependientes de
AMPc (PKA), quinasas dependientes de GMPc
(PKG) y quinasas de proteínas activadas por
mitógenos (MÁP-quinasas), se considera que
éstas deben también participar en los eventos
que llevan a la activación celular.
El estado de fosforilación de las proteínas es
debido a un equilibrio dinámico entre la acción
de quinasas y fosfatasas, las primeras fosfori-
lando y las segundas desfosforilando. Una acti­
vidad de fosfotirosin fosfatasa ha sido identifi­
cada en la porción citoplasmática de CD45, un
antígeno de diferenciación común para los di­
ferentes linfocitos. Se estima que podría inter­
venir regulando el balance fosforilación/des-
 El reconocimiento antigénico y activación de los linfocitos B y T
fosforilación de las tirosinas de proteínas del
linfocito T comprometidas en la puesta en m ar­
cha de señales de activación celular. Otras fos-
fotirosin fosfatasas, entre ellas las denominadas
PEP y SHP que presentan un dominio citoplas­
mático de gran tamaño y se expresan en Hnfo­
citos, podrían participar también en los meca­
nismos regulatorios de desfosforilación (fig.
13-6).
Eventos que se ponen en marcha
por estimulación antigénica
En el linfocito B
C uando un antíg en o in teraccio n a con la
IgMm, en el linfocito B ocurren una serie de
hechos, algunos de expresión inmediata y que
tienen lugar a los segundos o pocos minutos de
ocurrido el contacto, en tanto que otros sólo se
expresan después de cierto tiempo.
La producción de segundos mensajeros, co­
mo IP3, DAG e incremento de Ca^+, provenien­
tes de la hidrólisis de PIP2 por P L C yl, y la fos­
forilación de tirosinas por diferentes quinasas
inducen en las células B en reposo (GO) la en­
trada a la fase G l del ciclo celular. Esta se ca­
racteriza por un aumento del tamaño del linfo­
cito e incremento de la síntesis de ARN, espe­
cialmente el correspondiente a los proto-onco-
genes c-fos y c-myc que codifican para factores
de transcripción, los que son inducidos en dife­
rentes sistemas celulares por interacciones re­
ceptor-ligando. Por otra parte el aumento de
Ca^+ juega un rol muy importante en la regula­
ción de genes y en el aumento de complejos de
unión a ADN.
La agregación de IgMm induce la transcrip­
ción de genes del CMH-II. El aumento de la
expresión de m oléculas del CM H-II es muy
importante ya que esas moléculas, siguiendo la
ruta endocítica se ponen en contacto con los
péptidos procesados por los endosomas y los
transportan a la membrana celular para su reco­
nocimiento por los linfocitos Th. Durante este
proceso hay también activación de los genes
que codifican la síntesis de los receptores de
IL-2 (RlL-2) e IL-4 (RIL-4).
La proliferación celular y la síntesis de anti­
cuerpos por los linfocitos B dependerá en pri­
mera instancia de los diferentes mecanismos
expuestos que llevan a la expresión de genes y
síntesis de proteínas reguladoras y, en segundo
lugar, a su reconocim iento por los linfocitos
Th. Estos habrán de actuar por contacto directo
a través de su receptor antigénico, el co-i'ecep-
tor CD4, los diferentes pares de moléculas de
adhesión y por intermedio de distintas interleu­
quinas por él sintetizadas, especialmente IL-2 e
IL-4. Las interleuquinas podrán ejercer su fun­
265
ción por interacción con los correspondientes
receptores, expresados en la membrana de los
linfocitos B como consecuencia de la agrega­
ción inicial del receptor Ig-a/Ig-p-IgM m por
interacción con un ligando adecuado.
En el linfocito T
La unión del péptido-CMH al RCT/CD3 ge­
nera señales al interior de la célula que, al igual
que en linfocito B, incrementan la transcripción
de genes y la síntesis de proteínas esenciales
para la mitosis y ei funcionamiento celular. Los
eventos que se originan pueden ser de ex p re­
sión inmediata o tardía.
Entre los de expresión inmediata está la fos­
forilación de proteínas, entre ellas las cadenas y
y 5 de CDS, que fosforilan residuos de serina
de Ja porción intracitoplasmática y las cadenas
^ que fosforilan sus residuos de tirosina. Se
fosforilan tam bién, y así pueden cum plir su
función, proteínas reguladoras de transcripción
o factores nucleares, que se fijan a determina­
das secuencias de ADN de las regiones corres­
pondientes a mejoradores de la expresión (“en-
hancer”) o promotores de genes. Como y a se
indicara, participan activamente en este proce­
so diferentes quinasas de proteínas y el D A G e
IP3 provenientes de la hidrólisis de fosfolípi­
dos de la membrana plasmática por incremento
de la actividad catalítica de la fosfolipasa C
(PLCyl). Estas fosforilaciones ocurren pocos
segundos después de la interacción RCT/CD3-
péptido/CM H, al igual que un aumento de la
actividad intercambiadora NaVH^ por parte de
la mem brana citoplasmática, resultante en un
aumento de! pH intracelular.
Otro evento que ocurre es la transcripción de
genes, cuyos productos proteicos son fu n d a­
m entales para la activación celular. N o rm al­
m ente estos procesos requieren más tiem po,
pueden oscilar entre m inutos y horas. E ntre
esos genes están los proto-oncogenes ya seña­
lados c~fos y c-myc, así llamados porque una
superexpresión o productos de mutaciones pue­
den inducir en las células transformaciones ma­
lignas. En condiciones normales los productos
de estos genes actúan dentro del núcleo regu­
lando el crecimiento celular.
La transcripción de los genes de las interleu­
quinas es un hecho muy importante, en espe­
cial el de la lL-2, así como la correspondiente a
los genes que transcriben a sus receptores. En
el linfocito T la expresión del receptor de IL-2
(RIL-2) es un hecho significativo, ya que ello
permitirá que la IL-2 sintetizada por ¡a misma
célula pueda interaccionar con su receptor y
funcionar como factor de crecimiento endocri­
no. (Para más detalles sobre interleuquinas y
sus receptores véase cap. 12.)
266 Aspectos básicos de ¡a inmunidad
Cuando una célula inmunológicamente com­
petente -u n linfocito B o un Hnfocito T -, inte­
racciona con un ligando a través de su receptor
específico, se activa una serie de mecanismos
bioquímicos que hacen que una célula en repo­
so (fase GO) entre en el ciclo celular y se pro­
duzca su pasaje a las fases G l/S . Como conse­
cuencia de ello la célula sintetizará moléculas
funcionalm ente activas las que le perm itirán
cum plir funciones específicas. C uando ello
ocurra, en términos estrictamente inm unológi­
cos diremos que una respuesta inmune se ha
puesto en marcha.
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S em inars in Im m unology “C onserved signaling m o tifs in
antigen and Fe receptors” . Vol. 7, N° 1, 1995.
Evolución del sistema inmune
GUILLERMO BLANCO
INTRODUCCIÓN
Durante muchos años la inmunidad fue con­
siderada como la resistencia de un organismo a
la enfermedad. M edaw ar introdujo el prim er
modelo experimenta] en el cual se hizo eviden­
te que la resistencia a la enfermedad no era la
única razón de ser del sistema inmune. Sus ex­
periencias con transplantes hicieron evidente
que el sistem a inm une estaba involucrado en
respuestas que no tenían una relación aparente
con la infección y la enfermedad. El reconoci­
miento específico, la memoria y una segunda
respuesta aumentada fueron las evidencias fun­
cionales que definían la presencia de un siste­
ma inmune clásico. En la década del ’50 Bur­
net propone que la propiedad funcional que de­
fine la presencia de un sistema inmune es la ca­
pacidad de distinguir lo propio y lo no propio.
Si bien todas las especies del reino animal son
capaces de distinguir lo propio y lo no propio,
no todas requieren del poder de discriminación
y adaptación de los vertebrados.
Los invertebrados comprenden el 95% de las
especies conocidas. Poseen sistemas inmunes
no adaptativos que, pese a su relativa simplici­
dad, han permitido a muchas especies sobrevi­
vir satisfactoriamente durante cientos de millo­
nes de años sobre la superficie terrestre.
EL SISTEM A IN M U NE
DE L O S IN V ER TEB R A D O S
Sobre la base de diferencias embriológicas,
los invertebrados celomados se dividen en dos
grandes líneas evolutivas; los protostomados y
los deuterostomados. De estos últimos se origi­
na a su vez la línea evolutiva que da origen a
los vertebrados (fig. 14-1),
14
El conocimiento actual del sistema inm une
de los invertebrados deriva en su mayor parte
del estu d io de los protostom ados d ado que
entre los artrópodos y moluscos se cuentan es­
pecies de gran importancia económica y sani­
taria.
La primera línea de defensa frente la infec­
ción es la barrera fisicoquím ica conform ada
por el exoesqueleto en los artrópodos, la cu­
bierta calcárea en los bivalvos o la abundante
secreción mucosa externa de los anélidos y mo­
luscos. Una vez rota esta barrera se ponen en
marcha repuestas de defensa celulares y hum o­
rales tales eomo fagocitosis, coagulación, for­
mación de nódulos, encapsulación, activación
de enzimas y/o liberación de factores de opso­
nización. Existen variaciones entre los distintos
grupos pero es posible reconocer características
esenciales compartidas por todos ellos, que re­
sumen una buena parte del conocim iento que
se tiene de estos sistemas.
Fagocitosis
La fagocitosis es la respuesta celular m ás co­
mún y se considera que no es un proceso auto­
mático dependiente de! contacto entre fagocito
y partícula a endocitar, sino que existe una se­
lección basada en el reconocimiento del agente
extraño por medio de moléculas de superficie
de membrana. En muchas especies se han iden­
tificado leetinas para las que se propone un rol
similar al de los receptores de fagocitosis para
a-m ananos y p-glucanos presentes en monoci­
tos y macrófagos humanos y murinos. Estos re­
ceptores son los mediadores de la fagocitosis
en ausencia de opsonización por medio de Igs
o el factor C3 del sistema complemento (véase
fig. 14-2).
266 Aspectos básicos de ¡a inmunidad
Cuando una célula inmunológicamente com­
petente -u n linfocito B o un Hnfocito T -, inte­
racciona con un ligando a través de su receptor
específico, se activa una serie de mecanismos
bioquímicos que hacen que una célula en repo­
so (fase GO) entre en el ciclo celular y se pro­
duzca su pasaje a las fases G l/S . Como conse­
cuencia de ello la célula sintetizará moléculas
funcionalm ente activas las que le perm itirán
cum plir funciones específicas. C uando ello
ocurra, en términos estrictamente inm unológi­
cos diremos que una respuesta inmune se ha
puesto en marcha.
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antigen and Fe receptors” . Vol. 7, N° 1, 1995.
Evolución del sistema inmune
GUILLERMO BLANCO
INTRODUCCIÓN
Durante muchos años la inmunidad fue con­
siderada como la resistencia de un organismo a
la enfermedad. M edaw ar introdujo el prim er
modelo experimenta] en el cual se hizo eviden­
te que la resistencia a la enfermedad no era la
única razón de ser del sistema inmune. Sus ex­
periencias con transplantes hicieron evidente
que el sistem a inm une estaba involucrado en
respuestas que no tenían una relación aparente
con la infección y la enfermedad. El reconoci­
miento específico, la memoria y una segunda
respuesta aumentada fueron las evidencias fun­
cionales que definían la presencia de un siste­
ma inmune clásico. En la década del ’50 Bur­
net propone que la propiedad funcional que de­
fine la presencia de un sistema inmune es la ca­
pacidad de distinguir lo propio y lo no propio.
Si bien todas las especies del reino animal son
capaces de distinguir lo propio y lo no propio,
no todas requieren del poder de discriminación
y adaptación de los vertebrados.
Los invertebrados comprenden el 95% de las
especies conocidas. Poseen sistemas inmunes
no adaptativos que, pese a su relativa simplici­
dad, han permitido a muchas especies sobrevi­
vir satisfactoriamente durante cientos de millo­
nes de años sobre la superficie terrestre.
EL SISTEM A IN M U NE
DE L O S IN V ER TEB R A D O S
Sobre la base de diferencias embriológicas,
los invertebrados celomados se dividen en dos
grandes líneas evolutivas; los protostomados y
los deuterostomados. De estos últimos se origi­
na a su vez la línea evolutiva que da origen a
los vertebrados (fig. 14-1),
14
El conocimiento actual del sistema inm une
de los invertebrados deriva en su mayor parte
del estu d io de los protostom ados d ado que
entre los artrópodos y moluscos se cuentan es­
pecies de gran importancia económica y sani­
taria.
La primera línea de defensa frente la infec­
ción es la barrera fisicoquím ica conform ada
por el exoesqueleto en los artrópodos, la cu­
bierta calcárea en los bivalvos o la abundante
secreción mucosa externa de los anélidos y mo­
luscos. Una vez rota esta barrera se ponen en
marcha repuestas de defensa celulares y hum o­
rales tales eomo fagocitosis, coagulación, for­
mación de nódulos, encapsulación, activación
de enzimas y/o liberación de factores de opso­
nización. Existen variaciones entre los distintos
grupos pero es posible reconocer características
esenciales compartidas por todos ellos, que re­
sumen una buena parte del conocim iento que
se tiene de estos sistemas.
Fagocitosis
La fagocitosis es la respuesta celular m ás co­
mún y se considera que no es un proceso auto­
mático dependiente de! contacto entre fagocito
y partícula a endocitar, sino que existe una se­
lección basada en el reconocimiento del agente
extraño por medio de moléculas de superficie
de membrana. En muchas especies se han iden­
tificado leetinas para las que se propone un rol
similar al de los receptores de fagocitosis para
a-m ananos y p-glucanos presentes en monoci­
tos y macrófagos humanos y murinos. Estos re­
ceptores son los mediadores de la fagocitosis
en ausencia de opsonización por medio de Igs
o el factor C3 del sistema complemento (véase
fig. 14-2).
268 Aspectos básicos de la inmunidad
Se distinguen cuatro fases: quimiotáctica, de
adhesión, de ingestión y de destrucción y me­
tabolism o. La prim era ha sido observada en
estudios sobre anélidos, moluscos e insectos.
La fase de adhesión requiere de la participa­
ción de moléculas del tipo de las lectinas aso­
ciadas a membranas y, en algunos casos, se ha
identificado la participación de moléculas si­
milares a los factores del complemento. La fa­
se de ingestión comprende la formación de un
fagosom a que luego se une a los lisosom as
donde el m aterial endocitado tom a contacto
con distintas hidrolasas tales como fosfatasa
ácida, esterasas ácidas inespecíficas y peroxi­
dasa. En algunos casos estas enzimas pueden
ser simultáneamente liberadas al medio con un
objetivo de defensa. La fase de destrucción y
m etabolism o, com prende la destrucción por
hidrolasas lisosomales. Los artrópodos poseen
un sistema de destrucción basado en la produc­
ción de melanina mediado por una fenoloxida-
sa en presencia de sustratos adecuados tales
como L-dopa o tirosina. La melanina u otros
intermediarios precursores son altamente tóxi­
cos y responsables de la destrucción de parási­
tos. Se ha observado que en muchas especies
el consumo de oxígeno aumenta muy poco du­
rante la fagocitosis por lo que no existiría el
estallido respiratorio con la resultante produc­
ción de HjOj propio de muchos fagocitos ver­
tebrados.
Formación de nódulos
Cuando la cavidad celómica o hemocele de
un invertebrado es invadida por una cantidad
de microorganismos superior a los que pueden
ser eliminados por fagocitosis, se observa la
formación de acúmulos celulares denominados
nódulos. En algunos casos los nódulos presen­
tan depósitos de m elanina. A lgunos autores
consideran a los nódulos hom ólogos de los
granulomas de los vertebrados. En su form a­
ción participan fagocitos que luego de la etapa
inicial de adhesión sufren un proceso de adel­
gazamiento progresivo que culmina en la con­
formación de una envoltura m ulticelular que
encierra una masa de células en degeneración
y parásitos secuestrados (fig. 14-3).
Encapsulación
El proceso de encapsulación permite que los
invertebrados sean capaces de inmovilizar pa­
rásitos tales como cestodes, trematodes, nema­
todes, hongos y protozoarios de gran tamaño,
encerrándolos con varias capas de células. El
m ecanism o de form ación de las cápsulas se
considera idéntico al de los nódulos. La encap­
sulación ha sido más frecuentem ente descrita
en insectos y moluscos pero también ha sidp
observada en tunicados, equinodermos, crustá­
ceos, sipuncúlidos, anélidos, celenterados y es­
pongiarios
Citotoxicidad
La citotoxicidad es una forma de respuesta
muy difundida entre los invertebrados y ha si­
do observada en espongiarios, celenterados, si­
puncúlidos, anélidos, moluscos, equinodermos
y protocordados. Los espongiarios, celentera­
dos y protocordados son invertebrados colo­
niales y en ellos las reacciones de citotoxici­
dad participan en las funciones de preserva­
ción de la identidad de la colonia. En los gru­
pos no coloniales, la citotoxicidad natural o es­
pontánea estaría destinada entre otras cosas a
la eliminación de células transformadas. Expe­
riencias con sipuncúlidos demostraron la pre­
sencia de citotoxicidad alogeneica cuando las
especies habitaban regiones separadas por más
de 30 km. La citotoxicidad es dependiente del
contacto célula blanco-célula efectora, es inde­
pendiente de la exposición previa al antígeno,
no ocurre en todas las combinaciones aloge­
neicas y es inhibida por la presencia de varios
carbohidratos. Se la considera similar a la cito-
toxicidad mediada por células NK de los verte­
brados.
Respuestas humorales
Los invertebrados no poseen Igs en sus lí­
quidos corporales. Sin em bargo poseen una
variedad de factores con capacidad lítica, de
aglutinación, y otros efectos antimicrobianos.
Estos factores están presentes en forma natural
y en algunos casos su formación ocurre luego
de una estimulación antigénica. No obstante,
se caracterizan por carecer de la propiedad
anamnésica de las Igs. Entre estas sustancias
se cuentan hsinas, aglutininas, factores simila­
res a citoquinas y otros factores antimicrobia­
nos. Sin embargo, esta separación es artificial
y muchas sustancias poseen más de una de las
propiedades señaladas.
Lisinas
En los vertebrados, el papel más activo en la
lisis humoral de agentes extraños, está a cargo
de los componentes del sistema complemento.
En los invertebrados se ha postulado la exis­
tencia de un sistema similar a la vía alterna del
complemento. Su existencia ha sido sugerida a
partir de la observación de lisinas termosensi-
bles y calcio-dependientes, supresión de la he­
mólisis con el uso de inhibidores del com ple­
mento como hidrazina y suramina y opsoniza-

ción de la fagocitosis de macrófagos de ratón.
Sin embargo aún es prematuro trazar homolo­
gías entre ambos sistemas. La lisozima, una li­
sina capaz de hidrolizar los enlaces entre el
ácido N -acetil-neuramínico y la N-acetil-glu-
cosamina presentes en la pared de algunas bac­
terias, ha sido identificada en moluscos, insec­
tos y equinodermos.
A glutininas/opsoninas
M uchos invertebrados poseen factores h u ­
morales capaces de aglutinar bacterias, proto-
zoarios, eritrocitos de vertebrados, linfocitos y
parásitos metazoarios. Se considera que estas
sustancias, también presentes en plantas y en
el suero de vertebrados, han evolucionado va­
rias veces y cumplen distintas funciones m u­
chas de ellas no relacionadas con la inm uni­
dad. La mayoría de las aglutininas de inverte­
brados han sido estudiadas en base a su capa­
cidad para aglutinar eritrocitos de vertebrados.
Estas h em ag lu tin in as actúan por m edio de
unión a carbohidratos específicos de la super­
ficie de membrana del eritrocito y pertenecen a
una categoría más general de moléculas cono­
cidas como leetinas. En algunas especies se ha
demostrado su participación como factores de
opsonización de la fagocitosis o promotores de
la formación de nódulos y cápsulas.
C itoquinas
Se han descrito varios factores con propieda­
des similares a citoquinas en equinodermos (As­
teria forbesi y Asteria rubens), insectos y tuni­
cados. Evaluadas en sistemas mamíferos estas
sustancias reproducen muchas de las caracterís­
ticas de las citoquinas de los vertebrados.
Recientemente se ha aislado y caracterizado
la interleuquina-1 (IL -l)a y P de un tunicado
utilizando un ensayo de proliferación de tim o­
citos murinos. La IL-1 de tunicado comparte
muchas de las características de la IL-1 de m a­
míferos. En los invertebrados esta citoquina
estim ula la fagocitosis en hemocitos y es un
promotor de la primera etapa de la formación
de nódulos y de la encapsulación, dado que au­
menta la adhesión y agregación de los hem oci­
tos. En los invertebrados deuterostomados se
han caracterizado factores con actividad sim i­
lar a IL-2.
Inmunoproteínas no inmunoglobulinas
Las p e n trax in as, fam ilia de p ro teín a s C
reactivas, constituyen parte de un sistema ge­
neral de reconocimiento extremadamente pri­
mitivo. Este sistema se originó tempranamente
en la evolución y fue conservado en especies
Evolución del sistema inmune 269
tan distantes filogenéticam ente como los an­
cestros de los artrópodos (el fósil viviente Li-
mulus polyphemus) y los mamíferos. Si bien
no existen evidencias de que las pentraxinas
tengan un ancestro com ún con las Igs, estas
moléculas pueden expresar sitios de com bina­
ción muy similares a aquellos presentes en las
Igs y pueden interactuar con componentes del
sistema complemento y otras moléculas inmu-
norreguladoras en form a análoga a los a n ti­
cuerpos. Estas moléculas probablemente repre­
senten un sistema de reconocimiento muy anti­
guo y primitivo que se ha mantenido a través
de la evolución de los vertebrados, a pesar de
que éstos hayan desarrollado un sistema más
complejo de reconocimiento antigénico.
Reconocimiento alogeneico
Todos los invertebrados estudiados m u es­
tran capacidad de rechazo de injertos xenoge-
neicos en tanto que el reconocimiento aloge­
neico tam b ién está presente en m uchos de
ellos incluyendo espongiarios, celenterados,
anéhdos, sipuncúhdos, equinodermos y tunica­
dos. No se lo ha observado en nemertinos, mo­
luscos y artrópodos. Curiosamente los artrópo­
dos y moluscos exhiben la mayor incidencia
de neoplasias y contienen la mayoría de los
hospedadores intermediarios y vectores d e pa­
rásitos protozoarios y helmínticos. Sin em bar­
go no existe una correlación entre la presencia
de alorreactividad y la eficiencia de la respues­
ta contra la infección ni con la evolución de
inm unidad adaptativa como la de los v e rte ­
brados.
Los experimentos de transplantes realizados
con esponjas y corales, invertebrados de hábi­
tos coloniales, demostraron la presencia de re­
conocimiento alogeneico y sugieren la presen­
cia de un complejo de genes de histocom pati­
bilidad conformado por varios loci con m últi­
ples alelos. En tunicados coloniales se h a de­
mostrado que el reconocimiento alogeneico y
el control de la fertilización son caracteres li­
gados y controlados por un mismo locus con
múltiples alelos.
Linfocitos
Los anélidos, sipunciilidos y nemertinos po­
seen células con características m orfológicas
similares a linfocitos. En algunos casos se las
ha observado involucradas en las reacciones
de rechazo de aloinjertos o de citotoxicidad
alogeneica por lo que han sido consideradas
células T primitivas. Sin embargo se observa
respuesta de proliferación con lipopolisacári­
dos bacterianos (LPS), concanavahna A (Con
A) y fitohemaglutinina (PHA) por lo que se ha
270 Aspectos básicos de la inmunidad

as/ mamíferos j YHILPC

:YHIPC aves >
crustáceos L
: YHC ( reptiles )»«» anfibios ] YHC

teleósteo^ ] YHC
ciclóstomos C insectos ] LI
>8»^lasmobranquios] YH

T — c _____ idos J P
cordados
LP DM|
tunicados artrópodos
DM
anélidos
Deuterostomados ■^e q u in o d e rm o s ] L
-X . T
moluscos
sipuncúlidos
Protostomados
celomados

nemertinos
celenterados
plathelmintos

LUÜIUIlIcK.
acelomados
Y anticuerpos
esp o n g la rio sj- H complejo mayor de histocompatibilidad
I moléculas de adhesión de la superfamilia de Igs
protozoarios L leetinas tipo C asociadas a membrana o libres
P pentraxinas (proteína C reactiva)
C sistema complemento
DM evento de duplicación masiva de genes

Fig. 14-1. Las modificaciones de estructura (m oléculas, células, órganos y tejidos) constituyen un proceso continuo en la
evolución de las especies en el que es posible reconocer hom ologías, En cam bio, las ftinciones no se conservan y evolucio­
nan en form a discontinua. Por esta razón el estudio evolutivo de un sistem a biológico requiere la identificación y com para­
ción de estructuras más que de funciones. La figura m uestra un árbol filogenético donde las relaciones evolutivas fueron or­
ganizadas segtín m ecanism os de desarrollo em briológico. Sobre este árbol se ilustran las moléculas de reconocim iento iden­
tificadas en los diversos phyla. Los protostom ados y deuterostom ados se separaron hace aproxim adam ente 500 a 600 m illo­
nes de años. Los m ecanism os de recom binación, esenciales para la respuesta inm une anticipada m ediada por anticuerpos (y)
y receptor de célula T, surgieron en la línea evolutiva de los deuterostom ados que conduce a los vertebrados, luego de un
evento de duplicación m asiva (D M ) del cual se originó el sistem a m ultigénico VJC. Este evento pudo haber tenido lugar an­
tes de la divergencia de los tunicados contem poráneos o después de esta divergencia, pero antes del surgim iento d e los ci­
clóstom os ancestrales. Las m oléculas que participan en funciones de adhesión celular y regulación (I) están am pliam ente
distribuidas en la filogenia al igual que las m oléculas de reconocim iento hom ólogas a las leetinas tipo C de los vertebrados
(L). Las pentraxinas (P) constituyen ejem plos extraordinarios de estructuras de reconocim iento conservadas a lo largo de la
evolución de las especies. Se las ha identificado en artrópodos, tunicados y mam íferos. La proteína C reactiva es específica
para ciertas bacterias y para pequeñas m oléculas orgánicas, com o la tosforilcolina, e interactúa con com ponentes del sistem a
inm une com o el com plem ento y el receptor Fe a pesar de que no tiene relación estructural con las Igs.

considerado que comparten propiedades de cé­ las reacciones de rechazo de aloinjertos y de

lulas B y T . citotoxicidad natural. En los protocordados es­
Los equinodermos y protocordados poseen tas células responden a la estim ulación con
células similares a linfocitos que participan en PHA.

Fig. 14-2. La respuesta de fase aguda es el sistem a de defensa m ás antiguo y frecuente en el reino animal. C onsiste en una
com pleja red de reconocim iento y m ecanism os efectores que no tiene el elevado nivel de especificidad de la respuesta in­
m une m ediada por inm unoglobulinas. Las leetinas participan en ia respuesta de fase aguda com o m ediadoras directas o in­
directas de m ecanism os inm unes a través de funciones de opsonización, aglutinación, activación de com plem ento y reco­
nocim iento celular. (A) esquem a que representa el reconocim iento de agentes extraños m ediante leetinas asociadas a
m em branas por parte de células fagocíticas. (B) reconocim iento m ediante opsonización por leetinas séricas. Existen co n si­
derables evidencias experim entales que sugieren la exposición por parte de lectinas-opsoninas de sitios glucosídicos crípti­
cos de reconocim iento luego de un cam bio conform acional originado en la unión al agente. Estos sitios tienen afinidad por
m oléculas de reconocim iento asociadas a la m em brana de los fagocitos con capacidad de unión a carbohidratos. D e esta
form a se produce una transición del estado “m olécula propia” al estado “m olécula no p ropia” .
 Evolución del sistema inmune 271

Lectinas asociadas

Microorganismo patógeno

Lectina sérica opsonizante

Microorganismo opsonizado
y exposición de residuos
crípticos
272 Aspectos básicos de la inmunidad
E L SISTEMA INMUNE
DE LO S VERTEBRADOS
Los vertebrados form an parte del phylum
Chordata junto con los urocordados o tunica­
dos y los cefalocordados. En todas las clases se
observa la presencia de los elementos funda­
mentales del sistema (fig. 14-1). Tienen capaci­
dad para producir anticuerpos contra una gran
variedad de antígenos, rechazan injertos aloge­
neicos y responden a una segundo injerto en
forma específica y más rápida. La especificidad
y memoria está asociada a la presencia de lin­
focitos en todos los vertebrados estudiados. En
la mayoría de las clases se ha demostrado la
presencia de un complejo mayor de histocom­
patibilidad (CMH).
Anticuerpos e inm unoglobulinas
Los anticuerpos producidos por todos los
vertebrados poseen carga polidispersa, eviden­
ciado por múltiples bandas en el espectrotipo
de isolelectronfoque (lEF), y están compuestos
por cadenas polipeptídicas similares en su peso
molecular a las cadenas pesadas y livianas de
los mamíferos. Los estudios de genética mole­
cular con vertebrados placodermos son aún in­
completos pero permiten afirmar que las inmu­
noglobuhnas están codificadas por segmentos
de genes V, J y C y que los mecanismos de re­
com binación a nivel de estos genes son una
parte esencial de la generación de diversidad.
Los segmentos de genes que codifican las re­
giones J son los más conservados. Se considera
que esto refleja el hecho de que todos los m e­
canism os de recom binación dependen de la
presencia del segm ento J para ensam blar el
conjunto completo de genes de Igs a ser trans­
cripto.
Los segmentos correspondientes a las zonas
invariantes (framework) interpuestas entre las
zonas de hipervariabilidad de las regiones V
son altamente conservadas en la evolución de
los vertebrados, tanto cuando se las compara
con las Igs clásicas como con el receptor de cé­
lula T.
Los segmentos que codifican para la región
C de las cadenas livianas de los vertebrados in­
feriores son homólogos de los correspondientes
en mamíferos. No obstante, el grado de conser­
vación de la estructura de la región C en la filo­
genia es menor en apariencia al de la región V.
Es posible reproducir árboles filogenéticos en
base a las regiones C pero no en base a regio­
nes V. Esta generalización surge de numerosos
estudios filogenéticos realizados con regiones
V de cadenas livianas y pesadas y algunos me­
nos con regiones C. Por ejemplo, la compara­
ción de las secuencias de regiones C de los ti­
burones, ratones, aves y ei ser humano permite
construir un árbol evolutivo que reproduce el
conocimiento actual de las relaciones filogené-
ticas entre estas clases.
Los elementos de reconocimiento de los an­
ticuerpos han sido conservados a lo largo de la
evolución de los vertebrados. Las regiones C
muestran el tipo de cambio evolutivo caracte­
rístico de otras proteínas especificadas por ge­
nes de copia individual (transcripción directa
sin previa recombinación).
La naturaleza multigénica de las regiones V
y la necesidad de recombinación con los seg­
mentos J ha establecido presiones selectivas
que condicionaron la preservación de la estruc­
tura de las zonas invariantes (framework) e hi-
pervariables (fig. 14-4).
Los datos acerca del origen de los segmentos
V y J son consistentes con la hipótesis de que
un evento de duplicación masiva de genes tuvo
lugar luego de la divergencia entre los proto­
cordados y los vertebrados ancestrales, pero
antes de la divergencia entre placodermos y os-
tracodermos. Este evento dio lugar a la adquisi­
ción de un sistema de reconocimiento basado
en múltiples genes V, J y C, necesario para la
generación de diversidad en los anticuerpos y
el receptor de célula T (fig. 14-1).
Se ha identificado en la hemolinfa del tuni­
cado Boltenia ovípera una proteína de 26 kD
que serológicamente exhibe reacción cruzada
con la cadena pesada de tiburón y con la región
J. Sin embargo la molécula no posee carga po­
lidispersa. La ausencia de diversidad en el es­
pectrotipo de lEE sugiere la ausencia de meca­
nismos de recombinación en el ensamblado de
la molécula. Dado que los tunicados son ances­
tros próximos de los vertebrados, los estudios
con estos animales tienen el propósito de cono­
cer el estado y la organización primitiva de los
elementos que dieron origen al sistema inmune
clásico.
El complejo mayor de histocompatibilidad
(CMH)
El CMH es una región compleja con muchos
genes segregados en forma ligada, cuyo origen
evolutivo es difícil de conocer. Se han aislado
una gran cantidad de genes de clase I y clase II
en anfibios, reptiles, aves, peces óseos y carti­
laginosos, pero en muy pocos casos se estable­
ció la correspondencia con las moléculas fun­
cionales del CMH de la especie de la cual fue­
ron aislados. La observación de moléculas de
clase I y clase II en los peces cartilaginosos,
hace suponer que el surgimiento de los genes
del CMH es un evento antiguo, que tuvo lugar
a nivel de los invertebrados superiores. Actual­
m ente se investiga la posibilidad de que las

moléculas primitivas hayan sobrevivido en al-
giin grupo invertebrado en base a técnicas de
biología molecular.
En los vertebrados más primitivos (ciclósto-
mos) sólo se han obtenido evidencias funciona­
les de la existencia de un CMH: respuesta pro­
life ra tiv a en el c u ltiv o m ix to lin fo c ita rio
(CML) aunque con índices poco significativos
y rechazo crónico de aloinjertos. Los peces car­
tilaginosos exhiben rechazo crónico de aloin­
jertos aunque no se ha observado respuesta de
proliferación en cultivos mixtos leucocitarios a
pesar de la presencia de timo.
En los peces óseos, se ha observado el recha­
zo agudo de aloinjertos, el cual es notablemen­
te afectado por la temperatura. En el control de
!a respuesta están involucrados varios loci. En
algunas especies de esta clase se observó tam ­
bién respuesta proliferativa en el cultivo mixto
de linfocitos (CML). El ADN genómico de ge­
nes de clase I y clase II aislados por PCR
muestra similitud con los genes de mamíferos.
Xenopus, un género de anfibios pertenecien­
te al orden anura, posee un locus denominado
XLA (CMH propio de Xenopus) definido p ri­
meramente como una entidad genética. En tér­
minos funcionales en Xenopus se observa re­
chazo agudo de aloinjertos, respuesta citotóxi­
ca de células T ligada al CMH, y colaboración
B-T restringida por CMH (la respuesta requiere
al menos un alelo compartido). El polimorfis­
mo de las moléculas del CMH de Xenopus es
alto y también se ha observado desequilibrio de
ligamiento. La cadena pesada de las moléculas
de clase I tiene 44 kD, en tanto que las molécu­
las de clase II se componen de dos cadenas de
30 a 35 kD. Existe homología con la secuencia
de las cadenas a de mamíferos.
Entre los anfibios pertenecientes al orden
Urodela los eventos que funcionalmente indi­
can la presencia de un CMH (rechazo agudo de
aloinjertos, proliferación en CML y reacción de
injerto contra huésped) han mostrado niveles
de respuesta inferiores. Sin embargo la re s ­
puesta observada es suprimida por timectomía ’
previa. En Ambistoma mexicanum (axolote) se
han identificado moléculas de clase II estructu­
ralmente similares a las de los mamíferos.
Todos los reptiles muestran respuestas fun­
cionales com patibles con la presencia de un
CMH; rechazo agudo de aloinjertos, prolifera­
ción en CML y reacción de injerto contra hués­
ped. Existe una alta correlación entre el recha­
zo agudo de aloinjertos y la producción de lin­
focitos T citotóxicos. Por inmunoprecipitación
con anticuerpos que muestran reacciones cru­
zadas se ha aislado lo que se considera proba­
bles moléculas de clase I, clase II y j32-micro-
globuhna en caimanes, tortugas, y ofidios. La
obtención de numerosos ADNc de clase I en
Evolución de! sistema inmune 273
algunas especies sugiere la presencia de m últi­
ples loci y polimorfismo. Sin embargo aún no
se ha establecido ninguna correspondencia con
la expresión de proteínas.
En aves y mamíferos se han identificado y
secuenciado moléculas con actividad funcional.
En las aves las moléculas de clase I consisten
de una cadena pesada de 43 kD unida en form a
no covalente a una P2-m icroglobulina de 12
kD. Las moléculas de clase II consisten de ca­
denas a y P de 30 kD y se expresan sólo en cé­
lulas B y monocitos. Los exones que codifican
los dominios p i, P2 y de transmembrana tienen
un 62 a 66% de homología con la secuencia p
de HLA-DQ. En los pollos existen por lo m e­
nos tres genes p distintos. La característica más
prominente del CMH de las aves es el tam año
reducido, resultado de la presencia de intrones
cortos y un número relativamente bajo de ge­
nes de clase I y clase II.
Las comparaciones dei CM H de aves y m a­
míferos demuestran similitud en la ubicación
de los residuos polimórficos, conservación de
los residuos invaiiantes que se unen a p é p ti­
dos, conservación de los residuos de contacto
dentro y entre dom inios, y conservación del
dominio intracitoplasmático responsable de la
unión a quinasas. El nivel de h o m ología es
muy diferente en cada uno de los dominios ex­
tracelulares. Este hecho sugiere la existencia
de diferentes proceso de selección durante la
evolución. Los dominios a-2 y a-3 evolucio­
naron más lentam ente que los dom inios a-1
dado que habrían estado sometidos a mayores
restricciones: interacción entre sí y con la P-2
microglobulina.
En todas las clases de vertebrados el CM H
de clase I y clase II es muy polimórfico. Se ha
sugerido que el polimorfismo surgió como res­
puesta a la necesidad de reconocim iento de
agentes patógenos, aunque hay muy pocos ca­
sos en los que un alelo de MHC se asocia con
resistencia a la infección y, en cambio, hay m u­
chos casos en los que se asocia a la susceptibi­
lidad a una determinada enfermedad. Algunos
autores sostienen que el nivel de polimorfismo
sería dependiente del número de alelos disponi­
bles en el momento de la especiación y de la
longevidad de la especie. Para otros en cambio,
la presión selectiva que condiciona la aparición
de polimorfismo en el CMH radica en funcio­
nes no relacionadas con la resistencia a la in­
fección, tales como la selección durante el apa­
reamiento sexual. Por ejemplo, los ratones son
capaces de distin gu ir com pañeros g e n é tic a ­
mente idénticos excepto en el conjunto d e ge­
nes del CMH en base a su alta sensibilidad ol­
fatoria. Existe una correspondencia e n tre el
olor de un ratón y sus genes del CMH. Los ani­
males con el mismo olor se rechazan durante la
274 Aspectos básicos de la inmunidad

Leucocitos granulares

Parásito

F ig. 14-3. Los leucocitos de invertebrados son capaces de inm ovilizar parásitos, tales com o cestodes, trem atodes, nem ato-
des, hongos y protozoarios, que son dem asiado grandes para ser fagocitados, encerrándolos con varias capas d e células.
Esta form a de respuesta ha sido observada en tunicados, equinoderm os, crustáceos, sipuncúlidos, anélidos, celenterados y
espongiarios. En los insectos el contacto entre el parásito y leucocitos granulares induce la degranulación y form ación de
un coágulo localizado. D e este evento se originan señales quim iotácticas que reclutan un segundo tipo celular hialino o
am eboide con actividad fagocítica (plasm atocitos). Estas células se agregan en capas, sufren un proceso de adelgazam iento
y form an una cubierta m ulticelular que encierra una m asa de m aterial necrotizado y parásitos secuestrados. M ecanism os
sim ilares han sido descritos en m oluscos, particularm ente en especies que actúan com o vectores de parásitos que afectan al
hom bre. L a form ación de nódulos puede ser iniciada por la presencia de lipolisacáridos bacterianos, glucanos p-1,3 o zy-
mosan.

selección de apareamiento sexual, evitando la durante el apareamiento en base a los colores

endocría, garantizando la herencia de dos ha­
plotipos distintos e incrementando el polimor­
fismo. Se ha demostrado que es suficiente la al­
teración de un único gen del CMH para modifi­
car el olor del ratón. Es decir que CMH provee
una serie de estigmas sociales que permiten la
distinción de lo propio y lo no propio además
de participar de los eventos de reconocimiento
célula-célula. En este sentido el CMH del ratón
cumple un rol similar a su correspondiente de
los primitivos invertebrados coloniales, deter­
minando si dos colonias se fusionan en un caso
o si dos ratones se aparean en el otro. En las
aves se han obtenido ejemplos similares de co­
rrespondencia entre genes de CMH y selección
del plumaje.
Linfocitos y órganos linfoides
Los linfocitos han sido descritos en todas las
clases de vertebrados y se aprecia una gran si­
militud a lo largo de toda la línea evolutiva,
desde las lam preas hasta los mamíferos. Los
órganos linfoides muestran una com plejidad
creciente a lo largo de la misma línea evoluti­
va. En las especies más primitivas sólo se ob­
serva tejido hnfoide asociado al tracto intesti­
nal (TLAI). Los linfocitos, derivados de la capa
mesodérmica, colonizan tejido de origen endo-
dérmico. Muchos de los órganos linfoides que
 Evolución del sistema inmune 275

20 CDR1 40 CDR2
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L V„ J „ C L V„ J „C L V,„
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(b)

L V,, J,3 C ,3 J„C „

(C) ___ la .

(d )
L V, J. C, J, C ,. J, C „ J, J, c ,

B
Fig. 14-4. L a estructura de los anticuerpos en los distintos vertebrados es similar, pero la organización de los g en e s de ca­
denas pesadas y livianas así com o la regulación de la producción de anticuerpos es diferente en las diversas clases. A. Co­
mo ejem plo se m uestra la secuencia de am inoácidos de cadenas livianas X del tiburón H eterodontus fra n ch e sc h ii en la
parte superior y del hom bre en la parte inferior. L a hom ología entre am bas secuencias en la región V es m ayor q u e 50%.
B. Los tiburones tienen ocim encias m últiples de segm entos V nJnC n de cadenas livianas X separados entre sí al m en o s por
20 kb. L a secuencia de cada uno de estos segm entos es distinta. E n la línea germ inal, las regiones V y J están separadas
por 0.4 kb y contienen los heptám eros y nonám eros necesarios para la recom binación (a). En cam bio, en algunos caso s las
regiones V y J aparecen unidas por lo que no existiría recom binación p ara generar diversidad (b). Es decir que la diversi­
dad en los tiburones depende de la ocurrencia m últiple de .segmentos VJC, En (c) y (cl) se m uestra la organización de ge­
nes de cadena liviana X de ratón y hum ana respectivam ente. Se ha postulado que la organización prim itiva de g en e s de Igs
hallada en los peces cartilaginosos habría dado origen a la que se observa en teleósteos, anfibios, y m am íferos p o r selec­
ción de segm entos V JC y am plificación por duplicación m asiva en tándem de las regiones V. La organización d e genes en
las aves en las que existe una sola región V y m últiples seudogenes y en donde la diversidad se obtiene por co n v ersió n gé­
nica sería una deform ación de la línea evolutiva teleósteos-anfibios-m am íferos.

se observan en las etapas posteriores de la evo­ Los linfocitos de los vertebrados primitivos
lución, como el timo, bazo y las placas de Pe­ (ciclóstomos) no han adquirido especialización
yer constituyen especializaciones del TLAI que y muestran simultáneamente características de
se observa en las especies primitivas (cuadro células T y B (proliferación en CML, capaci­
14-1). dad de producción de anticuerpos, participa-
276 Aspectos básicos de la inmunidad

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ción de células B en las reacciones de rechazo).
No se ha demostrado la presencia de timo ni
bazo, y los principales sitios de linfopoyesis
son el TLAI que muestra acúmulos linfoides a
nivel de la submucosa intestinal, y el riñón en
algunas especies.
Los peces cartilaginosos (elasmobranquios)
son los primeros vertebrados en los que se de­
muestra la presencia de timo. Sin embargo la
separación funcional no es todavía completa y
es posible observar células plasmáticas en el ti­
mo luego de la estim ulación antigénica. El
TLAI es muy prominente y el bazo se destaca
como órgano linfohemopoyético.
Los peces óseos muestran una arquitectura y
distribución de los órganos linfoides similar. El
bazo tiene una mayor participación y se distin­
guen estructuras similares a centros germinati­
vos durante el curso de la respuesta inmune.
Las células de tim o responden únicam ente a
mitógenos T, las células provenientes del tejido
linfoide renal responden sólo a LPS y las célu­
las de bazo a ambos. Las respuestas a antígenos
T dependientes requieren de la presencia de cé­
lulas T, B y macrófagos. Las respuestas a antí­
genos T independientes requieren de células B
y macrófagos.
Los anfibios presentan un timo con actividad
linfopoyética de estructura similar a la de otros
vertebrados. En el bazo se diferencian las áreas
de pulpa blanca y pulpa roja. En Urodela, una
subclase de anfibios, se observan áreas T de­
pendientes pero no existen verdaderos centros
germinativos. El TLAI es prominente y se ob­
servan áreas con actividad linfopoyética en ri­
ñón, mesenterio, hígado y branquias. En la sub­
clase Anura se ha identificado la presencia de
células T colaboradoras diferenciadas de las cé­
lulas T citotóxicas.
En los reptiles y aves el timo muestra una
clara separación entre corteza y médula, en tan­
to que el bazo tiene bien definidas las regiones
correspondientes a pulpa blanca y pulpa roja,
pero sólo en las aves se observan verdaderos
centros germinativos y se definen con claridad
las zona T y B dependientes. La presencia de
centros germinativos podría explicar las dife­
rencias en la respuesta de anticuerpos entre
vertebrados de sangre fría y sangre caliente, a
pesar de que muestran una organización de ge­
nes y mecanismos de generación de diversidad
similares. Los centros germinativos están invo­
Evolución del sistema Inmune 277
lucrados en la selección de mutantes y su au­
sencia sería responsable de una ineficiente m a­
duración de afinidad en el caso de los reptiles y
demás vertebrados de sangre fría.
Citoquinas
Las citoquinas son moléculas muy conserva­
das a lo largo de la evolución. El sistema inm u­
ne de los vertebrados tiene una dependencia
crítica sobre estas moléculas. De hecho, no se
han descrito casos de individuos con deficien­
cias genéticas en la producción de ninguna ci­
toquina. Se han identificado principalm ente
aquellas derivadas de monocitos y macrófagos.
La IL-I ha sido aislada o se ha detectado su ac­
tividad en varias especies de anfibios y peces.
En el último caso también se identificó activi­
dad de interferón gamm a (lEN-y) asociada a
péptidos de 32 kD y lOkD que mostraron capa­
cidad de activación de macrófagos y otras ca­
racterísticas del IFN-y de mamíferos. La IL-2
es detectable en los sobrenadantes de C M L y
células estimuladas con PHA de varios v erte­
brados inferiores. Ha sido extensamente estu­
diada la IL-2 de Xenopus. En los reptiles la
producción de IL-2 tendría importantes varia­
ciones estacionales. En todos los casos la IL-2
es específica de especie.
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Respuesta inmune humoral
RICARDO MARGNI
Un vertebrado -q u e posee en su estructura
un número relativamente grande de moléculas
que responden a las características de los antí­
genos- se encuentra, a su vez, inmerso en un
universo de antígenos provenientes del medio
que lo rodea (bacterias, virus, pai'ásitos, tejidos,
etc.). Si bien al comienzo su sistema inmune no
tiene capacidad para diferenciar “lo suyo” de lo
“no propio”, a medida que se desarrolla apren­
de a hacerlo, poniendo en marcha mecanismos
de tolerancia que aseguren la protección de “lo
propio” y de reactividad positiva para los agen­
tes extraños, de modo de evitar el daño que és­
tos pudieran causarle. Los mecanismos que in­
tervienen en estos procesos, como ya se vio en
el capítulo 2, son los de la inmunidad humoral,
mediada por anticuerpos, y de la inm unidad
llamada “celular” , mediada por linfocitos. Es­
tos mecanismos no son independientes, están
interrelacionados.
Las células indiferenciadas m ultipotentes
{stem cells), que durante el período embriona­
rio colonizan inicialmente el hígado y luego la
médula ósea, se diferencian en células capaces
de poner en marcha una respuesta inmune hu­
m oral cuando encuentran el m icroam biente
adecuado. Ello ocurre en la bursa de Fabricius
en las aves; el principal equivalente en el hom­
bre son las placas de Peyer. En este proceso in­
terviene la interleuquina 3 (IL-3) y luego GM-
CSF (factor estimulante de colonias de granu­
locitos y monocitos), IL-4, IL-6 e IL-7, que ha­
ce que un prolinfocito m adure en linfocito.
Cuando un precursor de linfocito B madura en
linfocito B, que expresa receptor para antígeno
(inmunoglobulina de superficie), pierde sus re­
ceptores para IL-3.
En el adulto, las células indiferenciadas, co­
lonizadas en la m édula ósea, constituyen la
15
fuente de producción de linfocitos y las que re­
constituyen durante la vida a los animales ago­
tados en células linfoides.
Cuando las células indiferenciadas encuen­
tran en el sistema bursa o “bursa símihs” el mi­
croambiente necesario para adquirir competen­
cia inmunológica se transforman en linfocitos
B, que se caracterizan por poseer insertadas en
sus membranas moléculas de inmunoglobulinas
(Ig-sup). Estas moléculas constituyen los recep­
tores específicos para los epitopes antigénieos.
Un 20% de estas células se encuentra en sangre
periférica, 27% en el bazo, 23% en la zona foli­
cular de los ganghos linfáticos, 18% en el con­
ducto torácico, 6% en la médula ósea, 6% en
las amígdalas. Tras estimulación antigénica, los
linfocitos B se diferencian en células plasmáti­
cas que sintetizan y excretan anticuerpos, cons­
tituidos por moléculas de inmunoglobulinas con
una estructura idéntica a la Ig-sup (receptor an­
tigénico) expresado por el linfocito B del que
provienen (véase cap. 2). La figura 15-1 mues­
tra la evolución de la célula indiferenciada mul-
tipotente-célula plasmática, producto final de la
diferenciación de un linfocito B.
La mayor parte de los antígenos, al ser ino­
culados, inducen la formación de anticuerpos,
¿pero es idéntico el tipo de respuesta inmune
en el caso de la inoculación de una primera do­
sis de antígeno, sin inm unidad de base (res­
puesta prim aria), y en las reestim ulaciones
(respuesta secundaria)? Indudablem ente, no.
Los hechos experimentales nos demuestran que
cuando un antígeno penetra por primera vez en
el receptor, la concentración de anticuerpos au­
menta en forma progresiva, hasta un nivel de­
terminado, para descender luego más o menos
rápidamente según los casos. En la figura 15-2
puede verse la curva de inmunización de un co­
 Respuesta inmune humoral 279

Receptor
lL-3

LB activado Piasmocito IgE

Fig. 15-1. Esquem atización de la respuesta inm une hum oral. P rocesos celulares que llevan en definitiva a la secreció n de
inm unoglobulinas.

nejo inoculado con Proteus vulgaris, repre.sen- La mayor producción de anticuerpos se debe
tativa de este tipo de respuesta. La inoculación a que en una respuesta secundaria participan
de antígenos en solución produce una cantidad los linfocitos con “m em oria inm unológica”,
de anticuerpos detectables en un lapso mayor originados en una respuesta prim aria (véase
que en el caso anterior. cap. 2), que tienen capacidad para reconocer el
Cuando el anim al recibe varios estím ulos antígeno específico y montar de inmediato una
reiterados, la respuesta difiere totalmente de la respuesta inmune. Estos hnfocitos con m em o­
descrita. Las características de ésta han sido ria son de larga vida y son los que hacen que
muy bien estudiadas. La figura 15-3 correspon­ reestimulaciones a distancia induzcan respues­
de a la inmunización de un cobayo con toxoide tas inmunes evidenciables a plazos más cortos
diftérico altamente purificado y obtenido por y de mayor magnitud.
cultivo de Corynebacteríum diphtheriae en me­
dio sintético. El animal recibió el antígeno por
vía subcutánea. Como puede verse, la tasa de
200
anticuerpos en los primeros 20 días es baja, y
aumenta con la repetición de los estímulos. Ca­
da reestimulación causa elevación de anticuer­ 150
pos hasta alcanzar un límite, pasado el cual no
hay más aum ento, y se puede llegar, por la
aplicación de nuevos estím ulos y a m ayores
concentraciones, a la inhibición de la produc­ 100
ción de anticuerpos, fenómeno conocido con el
nombre de “parálisis inmunológica”, que luego
se verá. Si la investigación del título de anti­
cuerpos se efectúa a intervalos más cortos se
podrá observar que la curva presenta, al prime­
ro y segundo días siguientes a la inoculación
del reestím ulo, una pequeña inflexión como
consecuencia del descenso de los anticuerpos
circulantes al reaccionar con la nueva dosis de F ig . 15-2. Respuesta in m u n e a u na única in o c u lació n de
antígeno inoculado (fig. 15-4). un antígeno paiticulado (Proteus vulgaris).
280 Aspectos básicos de ¡a inmunidad

10 20 30 40 50 60 70 80 90 1 00 110 12 0 130 140 1 50

Días

Fig. 15-3. R espuesta inm une al estím ulo prim ario y secundario, en un anim al inoculado con un antígeno soluble (toxoide
diftérico).

Cuando se inyectan al hombre polisacáridos el tiempo transcurrido entre el primero y el se­

neumocócicos, después de la inoculación y de
una fase inicial de baja producción de anticuer­
pos, esta producción aum enta y se m antiene
elevada por meses, incluso hasta años. La rees­
timulación produce poco aumento de anticuer­
pos y con este tipo de antígenos no se consigue
la respuesta anterior. Es probable que ello en
parte esté relacionado con la composición quí­
mica de estos antígenos, los que por el hecho
de no ser de carácter proteico no son rápida­
m ente d eg rad ad o s, p u d ie n d o a c tu a r com o
agentes estimulativos por un tiempo más pro­
longado. Además, no debe olvidarse que estos
antígenos son T-independientes y que la res­
puesta inmune inducida por ellos difiere de la
lograda con antígenos proteicos (T-dependien-
tes) (véase cap, 2).
Es necesario destacar que en la respuesta se­
cundaria desempeña un papel muy importante
gundo estímulo. Las inoculaciones de toxoide
diftérico en cobayos, al mes, a los dos meses y
a los tres meses de la inoculación primaria, de­
muestran que el título de anticuerpos consegui­
do en una y otra difieren totalmente, siendo va­
rias veces superior la cantidad de antitoxina
circulante que se consigue en la tercera inocu­
lación respecto de la primera.
Estudios efectuados en el hombre, inmuniza­
do con vacuna antidiftérica, evidencian que
puede conseguirse una respuesta secundaria
cinco a seis años después de la primera inocu­
lación, aun cuando en el plasma circulante no
hayan sido previamente detectados anticuerpos.
No hay una relación estable entre la magni­
tud de las respuestas primaria y secundaria, ya
que existen animales que responden bien al pri­
mer estímulo y otros lo hacen escasamente. In­
vestigaciones efectuadas en cobayos inyecta-

1/160

" 1/80

.3 1/40
O
co)
~ 1/20

1/10
Fig. 15-4. En las reestim ulaciones se p u ed e obser­
var, inm ediatam ente después de la inyección del in ­
20 22 24 26 28 30 32 34 35 36 40 m unógeno, lig era dism in u ció n de los anticuerpos
circulantes com o consecuencia de la com plejación
Días de una parte de ellos con el antígeno inyectado.

dos con toxoide diftérico, y sobre todo cuando
la dosis inicial es muy pequeña, permiten esta­
blecer cierto grado de relaciones. Caballos ino­
culados con to x o id e d iftérico p rev iam en te
puesto en contacto con antitoxina dan una res­
puesta inmune de hiperinmunización más rápi­
da que cuando se inocula el toxoide únicamen­
te, pero es de hacer notar que en tal caso el an­
tígeno ya no actúa por sí solo, sino como fijado
a un adyuvante, y de ahí que los resultados no
puedan compararse.
El aumento de anticuerpos en las reestimula­
ciones y las respuestas secundarias observadas
en individuos primoinoculados mucho tiempo
atrás y en los que no se detectaban anticuerpos,
se deben a “memoria inmunológica”. En este
caso, pequeños linfocitos que se generan por
estim ulación prim aria y son los responsables
de esa memoria, al ser estimulados por el antí­
geno específico, activan el mecanismo que lle­
va a la rápida proliferación de células formado-
ras de anticuerpos.
La síntesis de los anticuerpos dura pocos m i­
nutos y, por diferentes métodos, se ha demos­
trado que el número de células formadoras de
anticuerpos presentes en la pulpa espléniea de
ratones en el primer día de estimulación es re­
ducido, apenas alcanza a unas decenas, para
llegar a varios miles al cuarto y quinto día. En
las reestimulaciones, el incremento de células
formadoras de anticuerpos se hace muy eviden­
te desde el comienzo.
PRODUCCIÓN DE A N T IC U E R P O S
Síntesis, catabolismo y distribución
de las inmunoglobulinas
Si bien en los animales y el hombre adulto la
producción de gammaglobulina está asegurada,
diferentes investigadores, empleando métodos
analíticos muy sensibles, han comprobado que
ella está muy restringida en los animales recién
nacidos. Esto tiene importancia, ya que hasta
no hace mucho tiem po se sostenía que estos
animales no sintetizaban gammaglobulina.
La gammaglobulina materna que lleva el re­
cién nacido es eliminada totalmente a las tres o
cuatro semanas de vida; de ahí que la inmuni­
dad pasiva congénita tenga esta duración. La
relativa incapacidad del recién nacido para for­
mar gammaglobulina queda evidenciada por el
hecho de que los caracteres genéticos de su
gammaglobulina al nacer son similares a los de
la madre, pudiendo cambiar después, lo que se
debe, como se indicó anteriormente, a que en
este último caso predom ina y se estabiliza la
gam m aglobulina propia. Hay quienes sostie­
nen, sobre la base de estudios efectuados con
Respuesta inmune humoral 281
animales criados en condiciones de esterilidad,
que la iniciación de la biosíntesis de la gamma-
globulina depende de estimulaciones antigéni­
cas, ya que en ellos la concentración de gam­
maglobulina circulante es muy baja en relación
con animales no estériles.
L a inm unoglobulina desnaturalizada y los
complejos inmunes son catabolizados rápida­
mente por las células del reticuloendotelio; el
hígado, por intermedio de sus células parenqui-
m*ales, cataboliza alrededor de un 30%.
L a concentración de IgG en los tejid o s es
aproximadamente igual a la circulante, m ien­
tras que de la IgM sólo pequeñas cantidades es­
tán distribuidas extravascularm ente. L a IgG
elaborada por el hombre adulto es de unos 2 g
por día, nivel que aumenta durante las inm uni­
zaciones, como resultado de la replicación de
las células formadoras de anticuerpos. L a infor­
mación sobre las otras inmunoglobulinas puede
verse en el capítulo 5, cuadro 5-11.
Biosíntesis de las inmunoglobulinas
Un linfocito B produce W a 10^ moléculas
de inmunoglobulina por célula, las que son uti­
lizadas en su totalidad como receptores antigé­
nicos en ¡a superficie celular. Una célula plas­
m ática, en cambio, produce y secreta aproxi­
m adam ente 2.000 moléculas por segundo de
anticuerpo de especificidad definida correspon­
diente a una clase o subclase de inmunoglobu­
lina.
D esd e el p u nto de vista m o lecu lar se ha
comprobado, a partir de extractos de células es-
plénicas y de nódulos linfáticos de animales in­
munizados, que la biosíntesis de las cadenas L
y H de IgG tiene lugar en los polisem as. Por
ultracentrifugación en gradiente de sacarosa se
han separado dos picos, co rrespondientes a
conglomerados de 15 a 20 (270-290 S) y 7 a 10
(190 S) ribosomas, respectivamente. Se ha de­
m ostrado que los primeros son formadores de
cadenas H, y los segundos de L. La síntesis de
las cadenas L dura 30-40 segundos, y la de las
H, 60-90. Las cadenas L y H son sintetizadas
como precursores que contienen un péptido hi­
drofóbico adicional de 19 residuos, llam ada se­
cuencia líder, la que sirve para guiar las cade­
nas al lumen del retículo endoplasmático rugo­
so (RER) donde luego es clivado.
El ensamblado y formación del puente disul­
furo entre las cadenas L y H y la glucosilación
de las moléculas de inmunoglobulinas tiene lu­
gar durante el pasaje de la cisterna del RER al
Golgi y luego en las vesículas secretorias que
se fusionan con la membrana plasmática. El or­
den del ensamblado de las cadenas L y H no es
el mismo según que se trate de la síntesis de
IgM o IgG, En el primer caso una cadena L y
282 Aspectos básicos de la inmunidad
una cadena H se unen para formar una hemi-
molécula (HL), uniéndose luego dos hemimo­
léculas para form ar una m olécula com pleta
(H2L2). En el caso de la IgG se unen dos ca­
denas H (H2) las que, primero, unen una cade­
na L para formar el intermediario H2L y, final­
mente, la otra cadena L para formar la molécu­
la completa H2L2. Si la molécula form_ada tie­
ne la secuencia transm em bránica hidrofóbica
de la inmunoglobuhna de membrana, se fija a
la membrana de la vesícula secretoria y es in­
sertada en la membrana plasmática cuando la
vesícula se fusiona con ésta. Si la secuencia de
la cadena H de la inmunoglobulina sintetizada
contiene la estructura de la inm unoglobulina
que se secreta, es transportada libremente den­
tro de la vesícula secretoria y liberada de la cé­
lula cuando la vesícula se fusiona con la mem­
brana plasmática.
Formados los puentes disulfuro entre las ca­
denas L y H y durante el transporte del retículo
endoplásmico al Golgi, las moléculas se gluco-
silan.
Los cinco aziicares que se encuentran en la
glucoproteína sérica (N-acetil D-glucosamina,
D-manosa, D-galactosa, ácido N-acetil neura-
mínico y L-fucosa), generalm ente están p re­
sentes en más de una unidad, con un PM glo­
bal de 2,5 kD.
La glucosamina y mañosa se fijarían a las
cadenas H de las moléculas de inmunoglobuli­
nas unidas a las membranas asociadas a los ri­
bosomas, y los restantes aziicares cuando se
encuentran ligadas a otras membranas intrace­
lulares y especialmente durante el pasaje por el
aparato de Golgi, donde se forma la vesícula
secretora (fig. 15-5).
Si bien durante el pasaje de la inmunoglobu­
lina a través de los elementos membranosos de
la célula hay incorporación de carbohidratos,
no es ello prueba suficiente de la importancia
de la glucosilación en la secreción, ya que hay
células plasmáticas que secretan cadenas L, las
que carecen de hidratos de carbono.
Una molécula de inmunoglobulina pasa 2/3
de su vida intracelular dentro del retículo endo­
plásmico rugoso y 1/3 en el aparato de Golgi.
Aproxim adamente 30-90 minutos después de
su síntesis las moléculas son excretadas de las
células.
Las cadenas L que están en exceso y no se
unen a cadenas H para formar moléculas de in­
munoglobulina, dado su bajo peso molecular,
son excretadas por la orina como microglobuli-
nas. En el caso de mielomas, esas cadenas L en
exceso que filtran por riñón y aparecen en la
orina constituyen la proteína de Bence-Jones.
Cabe señalar que no todas las cadenas L en ex­
ceso son elim inadas por este m ecanism o, ya
que en gran parte son metabolizadas por algún
mecanismo regulatorio desconocido. Se ha ob­
servado también en ciertas patologías la apari­
ción en sangre y orina de cadenas H carentes
de cadenas L. Se caracterizan por deleciones en
la zona del fragmento Fd. En esta enfermedad,
llamada de las cadenas pesadas, se han aislado
cadenas y, |J, y a con las deleciones indicadas.
En los últimos años se ha descrito una pro­
teína, designada “proteína de unión de las ca­
denas H” o BiP (heavy chain binding protein),
una chaperona que sería responsable de la re­
gulación del transporte de las moléculas H^L^
(Ig) resultantes del ensamblado de cadenas L y
H. El mecanismo propuesto para ello sería el
que se describe a continuación. Las cadenas H
sintetizadas por los ribosomas son translocadas
al lumen del retículo endoplasmático donde de
inmediato se unen a BiP, la cual interfiere con
la señal de expresión del transporte en las cade­
nas H. Si no se sintetizan cadenas L, BiP queda
unida a la cadena H, que es degradada interna­
mente. Si hubo producción de cadenas L, cuan­
do éstas se acoplan a las cadenas H la proteína
BiP se disocia rápidamente, la señal de trans­
porte se expresa y se inicia la migración de la
inm unoglobulina (H jLj) hacia el Golgi. Este
mecanismo trataría de explicar por qué no hay
acumulación de cadenas H en el citoplasma de
las células que las sintetizan.
La pérdida espontánea de expresión de cade­
nas H es de 1 X 10^ por célula por generación,
y con respecto a cadenas L, de 4,5 x 10“ por cé­
lula por generación, lo que explica la existencia
de mielomas que no secretan inmunoglobulinas
pero sí cadenas L, hallazgo bastante frecuente
cuando se analizan proteínas monoclonales.
La IgM e IgA que normalmente se encuen­
tran en el suero como polímeros, en el citoplas­
ma sólo están como monómeros; la polimeriza­
ción ocurre durante la secreción.
Las células B en reposo no expresan recepto­
res para IL-2, interleuquina que parece tener un
rol muy importante en la inducción de la secre­
ción de IgM pentamérica. No obstante, IL-4 in­
duce en estas células la expresión de la subuni­
dad (3 de 75 kD del receptor de IL-2, y la IL-5
induce la expresión de la cadena a de 55 kD de
dicho receptor. Como consecuencia de ello el
receptor de alta afinidad formado por la asocia­
ción de ambas cadenas se expresa y la célula B
puede interaccionar con IL-2. La interacción de
esta interleuquina con el receptor de alta afini­
dad induce la expresión de cadenas I, la que es
indispensable para la secreción de IgM penta­
mérica.
En el capítulo 6 se describe el ordenamiento
y distribución de los genes que codifican para
la síntesis de las cadenas L y H, tanto en el ge­
noma de las células indiferenciadas como en el
de los linfocitos B.

Ribosomas
Fig. 15-5. Representación esquem ática de ia síntesis y secreción de las inm unoglobulinas séricas. P rL y PrH, p recu rso res
de cadenas L y H, respectivam ente.
Factores que inciden en la formación
de los anticuerpos
A) R e l a t iv o s a l e s t ím u l o a n t ig é n ic o
Dosis
Para conseguir una respuesta inmune es in­
dispensable la inoculación de un antígeno, pero
el grado de respuesta depende en gran parte de
la dosis inoculada. En trabajos efectuados con
Salm onella paratyphi B se comprobó que la
cantidad de anticuerpos producidos dependía
del número de bacilos inyectados. Cuando éste
era de 10^ bacilos por kilo de peso (en el cone­
jo), el título de anticuerpos dosados por agluti­
nación era inferior a la dilución 1;4; en cambio
el título era 1;330 cuando los bacilos inocula­
dos fueron 1 0 \ 1:1.860 para 10’' y 1:3.540 para
10*^. Los títulos consignados son los máximos
obtenidos en cada uno de los lotes de los ani­
males de la experiencia.
Por inoculación de voluntarios con polisacári-
do neumocócico del tipo II se encontró que con
dos dosis de 0,05 mg de antígeno se obtenían
después de tres semanas 1,37 mg.mL de proteí­
na anticuerpo. Lo dicho no significa que al au­
mentar las concentraciones de antígeno inocula­
Respuesta inmune humoral 283
do habrá de aumentar siempre el título de los an­
ticuerpos; se ha observado que la inmunización
de ratones blancos con polisacáridos del neum o­
coco tipo I es posible cuando se inoculan canti­
dades comprendidas entre 1 y 0,01 (tg, en tanto
que dosis de 100 fxg a 1.000 |Ltg son ineficaces.
Dosis excesivas de antígeno pueden llevar a la
parálisis inmunológica o ausencia de respuestas
del aparato formador de anticuerpos. P o r otra
paite, la reinoculación de pequeñas dosis de an­
tígeno desencadenará una estimulación selectiva
de los clones de mayor afinidad.
Añadido de adyuvantes
La respuesta inmune no es la misma según
se inocule antígeno solo o adicionado de adyu­
vantes (fig. 15-6). Los más comunes y su ma­
nera de comportarse han sido ya descritos en el
capítulo 4, pero es conveniente recordar que su
acción no se debe únicam ente a la adsorción
del antígeno, lo que hace que el mismo se libe­
re de a poco produciendo un efecto sim ilar al
de las reestim ulaciones, sino que interviene
también, y eon un papel muy importante, qui­
zás el principa], el granuloma formado en el
punto de inoculación y las linfoquinas sinteti­
zadas por las células intervinientes.
284 Aspectos básicos de la inmunidad
o
e-
'D N P - BSA en solución salina
'D N P - BSA en solución salina - adyuvante de Freund completo
C uando un antígeno se inocula m ezclado
con un adyuvante, se consigue una respuesta
superior a la que se logra con la misma dosis
de antígeno solo. Se observa la aparición de an­
ticuerpos a alta concentración y por tiem po
prolongado, similar a la lograda cuando se ha­
cen reestimulaciones antigénicas, con la venta­
ja de que este efecto se logra con la inoculación
de una sola dosis de antígeno. El empleo de los
adyuvantes es lo que ha permitido mejorar últi­
mamente las distintas vacunas utihzadas en la
inmunización humana y animal y corregir fa­
vorablemente los planes y métodos de inmuni­
zación para la preparación de los distintos anti­
sueros empleados en los laboratorios con fines
de experimentación y de los plasmas antitóxi­
cos obtenidos de grandes anim ales para ser
transformados luego en antitoxinas de uso tera­
péutico.
Concurrencia de antígenos
Un hecho que es necesario tener en cuenta
cuando se inmunizan animales es el número de
antígenos diferentes que se inyectan sim ultá­
neamente.
En el hombre, con mucha frecuencia se em­
plean las vacunas combinadas, como la diftéri-
co-tetánica, y también con estos toxoides aso­
ciados a su vez con la Bordetella pertussis o
Salmonella typhi e incluso al virus polio.
En conejos se ha observado que la inocula­
ción intravenosa simultánea de mezclas de has­
ta 35 antígenos proteicos purificados, constitui­
dos por hemoglobina y albúminas de distinto
origen, provocaba la formación de anticuerpos
-detectables por precipitación- contra la mayo­
ría de ellos.
Esto pudo lograrse por un balance adecuado
de la concentración de los antígenos mezclados
F ig . 15-6. D istin ta resp u esta
in m u n o ló g ica p ara u n a tínica
d o sis d e un m ism o an tíg en o
inoculado solo y con adyuvan­
te de Freund com pleto.
Semanas
en cada caso ya que, si no se procede así, pue­
de haber preponderancia de uno sobre los otros
y no aparecer en los animales inoculados anti­
cuerpos para todos los antígenos inyectados. Se
ha comprobado que la inoculación simultánea
de toxoide diftérico con otros antígenos hace
que el título de anticuerpos para la toxina sea
menor que el logrado cuando ese antígeno es
inoculado solo. Esto ocurre cuando uno de los
antígenos está presente en exceso.
Si se inocula un animal con toxoide tetánico
mezclado con un segundo antígeno y el animal
tiene cierta inmunidad de base para este último,
ios anticuerpos formados para la toxina son es­
casos, en tanto que la concentración es alta pa­
ra el otro. Probablemente se deba a que el se­
gundo antígeno provoca una respuesta de tipo
reestim ulativo, lo que haría que el animal se
ocupe principalmente de la síntesis de este anti­
cuerpo. Respuestas similares se observaron al
inocular conejos con proteínas obtenidas de la
clara de huevo. En este caso existen cuatro
componentes antigénieos predominantes que se
encuentran en la proporción aproxim ada del
92% y otros secundarios en un 8%. El 50% de
los anticuerpos formados era para los compo­
nentes principales y el 50% restante para los
secundarios, lo que nos está indicando que no
existe una relación entre las cantidades de antí­
geno inoculadas y el título de anticuerpos pro­
ducidos.
Al inyectar conejos con grandes cantidades
de plasma humano se encontró que, si bien no
producían anticuerpos para la albúmina y glo­
bulina, desarrollaban enferm edad del suero,
probablemente a causa de los componentes an-
tigénicos secundarios que se encuentran en el
plasma en menor proporción.
De lo expuesto se deduce que, cuando haya
que inmunizar a animales con varios antígenos

a la vez, o cuando deba elaborarse una vacuna
polivalente, habrá de tenerse en cuenta lo dicho
para lograr, mediante una dosificación adecua­
da de los distintos antígenos, una respuesta in­
m unitaria correcta para todos. Como ello no
siempre es factible, es recomendable, sobre to­
do en la inm unización hum ana, no em plear
mezclas de m uchos antígenos a la vez si se
quiere lograr el fin preventivo deseado.
Tipo de antígeno inoculado
La gam m aglobulina inm une que se form a
como consecuencia de la penetración de un an­
tígeno no siempre es de un mismo tipo, y ello
depende en gran parte del antígeno inoculado.
El caballo, cuando es inyectado con polisacári­
do neum ocócico da anticuerpos de alto peso
molecular del tipo IgM en tanto que, cuando se
le inocula toxoide diftérico, albúmina de huevo
y otros tipos de antígenos, elabora anticuerpos
que responden a las características de las IgG.
El hombre, por regla general, forma anticuer­
pos de este último tipo, pero cuando es inocula­
do con los antígenos somáticos de Salmonella
typhi, los anticuerpos que elabora responden a
las características de la IgM, de peso molecular
alrededor de un millón.
Los antígenos Rh originan por isosensibili-
zación anticuerpos de tipo IgM al comienzo de
la respuesta inmune, pero éstos son de tipo IgG
en las sensibilizaciones a repetición. Las isohe-
moaglutininas naturales del sistema ABO son
inm unoglobulina IgM. A lgunos autores han
descrito anticuerpos contra los antígenos de los
grupos sanguíneos ubicados en la IgA.
Lo dicho significa que el tipo de anticuerpo
formado, si bien puede estar influido por algu­
nas circunstancias particu lares, depende en
gran parte del tipo de antígeno que actúa como
inductor. Como ya se ha visto, según su com­
posición química, pueden inducir una respuesta
sobre los linfocitos B, independientemente de
ios T, originando anticuerpos de tipo IgM (li­
popolisacáridos, poliósidos), o necesitar del
efecto cooperativo T B para lograr una res­
puesta eficiente, con anticuerpos de tipo IgG
(antígenos proteicos). (Véase cap. 2.)
Es conveniente recordar también que el mo­
mento en que cursa la inmunización puede in­
fluir en las características fisicoquímicas del
anticuerpo producido. En el hombre y algunos
animales de experimentación se ha comproba­
do que en la fase inicial de la inmunización ela­
boran anticuerpos IgM, produciendo posterior­
mente anticuerpos IgG, si el antígeno inductor
es T-dependiente, Existen numerosos hechos
experimentales que parecen probar que la IgG
pondría en marcha un mecanismo inhibidor de
la biosíntesis de IgM y que su efecto sería ma-
Respuesta inmune humoral 285
S em a n as
F ig. 15-7. Síntesis de inm unoglobulina durante la v id a in­
trauterina y en los prim ero s meses después del n acim iento
(hom bre).
yor a medida que aumenta su concentración en
el plasma. Esta inhibición es específica, o sea,
para clases de anticuerpos con especificidad
para un mismo antígeno, y puede aun conse­
guirse con digestos pépsicos del anticuerpo
IgG (fig. 15-7).
Se considera que la expresión del fragmento
constante de las cadenas |i (Cjx) es in depen­
diente del tipo de antígeno y que el mecanismo
de desviación hacia la síntesis de los fragmen­
tos constantes de las otras inmunoglobulinas es
dependiente del antígeno y de determinadas in­
terleuquinas (véase cap. 2). Con respecto a qué
clase de inmunoglobulina expresa las siguien­
tes inducciones, las rutas posibles serían dos, la
secuencial C |i ^ C8 —> Cy ^ Ce —> C a o la
par-alela
Si bien la prim era pareciera que es la más
probable, existen datos experimentales que de­
notan la síntesis de IgE o IgA con posterioridad
a la síntesis de IgM. Ello estaría indicando que
para determinadas inmunoglobulinas, en espe­
cial IgE, la meta no sería la secuencial. En el
capítulo 6 se encuentran expuestos cuáles son
los mecanismos responsables de estos hechos.
El cambio de clase de inm unoglobuhna puede
resultar de la unión del exón reordenado que
codifica para el fragmento variable de la cade­
na H con el exón que codifica para.el fragmen­
to constante de otra cadena H distinta de (y,
e, a), con deleción del ADN comprendido en­
tre los dos exones recombinados. Pero también
pueden producirse cambios de clases de inmu­
noglobulinas como consecuencia de transcrip­
tos alternativos a nivel de ARN precursor, sin
que ello signifique deleción de ADN genómi-
286 Aspectos básicos de la inmunidad
co. La inducción de respuesta con producción
de anticuerpos ígM no necesita de la coopera­
ción T -T’ B y pueden darla todos los antígenos.
La formación de anticuerpos de tipo IgG es ti­
modependiente y la ponen en marcha los antí­
genos proteicos, portadores o no de haptenos,
no así los poliósidos o lipopolisacáridos que en
las condiciones normales de estimulación sólo
forman anticuerpos IgM. Estos antígenos origi­
nan anticuerpos por estimulación directa de los
linfocitos B, no necesitando para ello la coope­
ración de los LT.
B) R e la t iv o s a l h u ésp ed
Edad
La capacidad para formar anticuerpos es una
propiedad inherente al vertebrado adulto. En el
lactante está muy disminuida (fig. 15-8). En el
recién nacido se puede llegar a anular la res­
puesta futura si las dosis de antígeno inocula­
das son lo suficientemente grandes.
La infección de huevos embrionados con di­
ferentes virus se ve facilitada por la incapaci­
dad del embrión para formar anticuerpos. Al no
oponerse un mecanismo específico de defensa
la proliferación de los virus no encuentra resis­
tencia. Hechos similares se han observado en
animales recién nacidos y de diferentes días de
vida.
Todos estos antecedentes son los que hacen
que la vacunación profiláctica en los niños con
diferentes tipos de antígenos, sólo se haga des­
pués de los 3-4 meses de vida, ya que antes de
esa edad el aparato inmunológico no está bien
desarrollado.
Una serie de observaciones parece indicar
que en la vejez la capacidad normal de form a­
ción de anticuerpos sufre una depresión, aun­
que no tan marcada como en la lactancia.
Radiaciones ionizantes
La acción que los rayos X pueden tener sobre
la respuesta inmune difiere según la irradiación
haya sido efectuada antes o después del estímu­
lo antigénico. En este último caso las modifica­
ciones a la respuesta no son significativas, en
tanto que se observa una marcada depresión si
la irradiación es previa a la inoculación del antí­
geno. En la inmunización de conejos con hema­
tíes de carnero como antígeno, se comprobó
que cuando los animales eran irradiados con
500 r la respuesta inmunitaria no difería de los
controles no irradiados, si el antígeno inmuni­
zante era inoculado después de las dos horas de
la irradiación. En cambio, se observó una mar­
cada depresión en la producción de anticuerpos
cuando el animal era sometido a irradiación 24
horas antes de la estimulación. Estas experien­
cias muestran que las células productoras de an­
ticuerpos en actividad son relativamente radio-
rresistentes y, además, nos permite comprender
por qué es posible conseguir la implantación de
heteroinjertos en animales previamente irradia­
dos, cosa que no se logra en los normales. Las
sustancias radiomiméticas, como la mostaza ni­
trogenada y sus análogos, inhiben también la
producción de anticuerpos.
Vía de inoculación
Si se inocula al caballo con toxoide diftérico,
para conseguir un buena respuesta inmune es
necesario que la misma sea hecha por vía sub­
cutánea, y no por vía intravenosa. En cambio,
si lo que se desea obtener son anticuerpos anti­
neumocócicos, los microorganismos deben ino­
cularse por vía intravenosa, siendo desfavora­
bles los resultados si se emplea la vía subcutá­
nea. Si el animal inoculado es el conejo y la vía
de inmunización es la intravenosa, la inocula­
F ig . 1 5 -8 . R e p re se n ta c ió n
gráfica seriada del títu lo de
anticuerpos anti-D N P ub ica­
dos en la IgM e IgG. M ues­
tras provenientes de un cone­
jo in m u n izad o con gam m a-
g lo b u lin a hum ana d in itro fe­
nolada. Puede apreciarse una
rápida form ación de aquéllos
en la IgM , la que dism inuye
rápidam ente a m edida que se
increm entan los ubicados en
la Ig G (m ecan isin o v s de
“feed-back”).

ción de neumococos produce anticuerpos anti-
polisacáridos, en tanto que el mismo microor­
ganismo, inoculado por vía subcutánea, induce
la formación de anticuerpos preferentem ente
antinucleoproteínas, pudiendo desarrollar al
mismo tiempo alergia de tipo retardado.
Cuando antígenos polínicos penetran en el
hombre por la mucosa y lo hacen en forma es­
pontánea, originan anticuerpos, localizados en
la IgE, y si los mismos pólenes son inyectados
por vía subcutánea, forman anticuerpos, ubica­
dos en la IgG.
Otros factores
Si bien la inanición produce una dism inu­
ción de las proteínas plasmáticas, en especial
de la albúmina, en individuos que se encuen­
tran en esta condición no se observa una dismi­
nución en la producción de anticuerpos, salvo
en casos muy particulares en que la inanición
haya sido prolongada. Estudios realizados en
prisioneros de guerra mostraron que las defi­
ciencias nutricias no interferían manifiestamen­
te en la producción de anticuerpos. A lgunas
h o rm o n as, y en esp ecia l la c o rtiso n a y la
ACTH, pueden influir en la respuesta inmuni-
taria. Conejos inoculados con un determinado
antígeno no forman anticuerpos si previamente
son tratados con cortisona y ACTH, principal­
mente la primera. Su acción es muy marcada
cuando su introducción precede a la inmuniza­
ción o al comienzo de ésta, en tanto que su in­
fluencia es poco manifiesta cuando ya el ani­
mal ha comenzado a elaborar anticuerpos y és­
tos alcanzar títulos elevados en ia sangre circu­
lante. La cortisona es una sustancia que influye
desfavorablemente sobre la fagocitosis y depri­
me la inflamación, lo que hace que su acción
esté relacionada con la inhibición de la etapa
inicial de la formación de anticuerpos.
Parálisis y tolerancia inmunológica
La irradiación con rayos X, la adm inistra­
ción de algunas drogas como la 6-mercaptopu-
rina, que interfiere la síntesis del ARN, o de la
cortisona, que al deprimir la respuesta inflam a­
toria disminuye la actividad fagocitaria, etc.,
pueden inespecíficamente inhibir la formación
de anticuerpos. La inhibición en estos casos no
es para un antígeno determ inado sino para
cualquiera.
Estos hechos se diferencian fundam ental­
mente de otros de carácter específico en los
que la inhibición para la formación de anticuer­
pos es propia y particular para el antígeno en
estudio. Felton demostró que la inoculación en
el ratón adulto de grandes cantidades de polisa­
cáridos neumocócicos, muchas veces superio­
Respuesta inmune humoral 287
res a las necesarias para lograr la formación de
anticuerpos, inhibe la producción de éstos. Los
ratones son incapaces de form ar anticuerpos
contra dicho poiisacárido por largo tiempo, pe­
ro permanece intacta su capacidad para elabo­
rar cualquier otro tipo de anticuerpo.
R espuestas similares se han conseguido en
conejos con la introducción de grandes cantida­
des, y a repetición, de proteínas heterólogas. En
este caso, como en los anteriores, la respuesta
es específica para el antígeno interviniente. Este
fenómeno, inicialmente llamado parálisis inm u­
nológica, se produce en animales adultos y se
consigue con la inoculación de altas dosis de
antígeno. Conviene aclarar que un animal puede
incluso quedar paralizado inmunológicamente
con dosis de antígeno que en otros animales po­
drían actuar como estimulantes; ello se observa
cuando por algún mecanismo o tratamiento es­
pecial se consigue disminuir apreciablemente el
número de células inmunológicamente com pe­
tentes. En estos casos, con menores cantidades
de antígeno se logra el mismo efecto, ya que las
células inmunológicamente activas se encuen­
tran grandemente reducidas.
Un fenómeno similar al anterior, regulador
de la respuesta inmune, es la tolerancia inm u­
nológica (cap. 18). Se caracteriza por la falta o
depresión de la respuesta específica a un estí­
mulo antigénico por animales previamente ex­
puestos al antígeno. Desde el punto de vista
operativo, constituiría el fenómeno opuesto a
una respuesta inm une secundaria, que cursa
con un incremento de ella ante nuevos estím u­
los antigénieos. Numerosas observaciones y re­
sultados experimentales’ muestran que ia tole­
rancia es un hecho general en los distintos ver­
tebrados, y que puede ser inducido por células
vivas o sustancias antigénicas inertes com o las
proteínas. Hay una serie de hechos que es con­
veniente recordar, ya que son significativos en
el desarrollo de este fenómeno. Cuando los an­
tígenos que se utilizan y los del huésped no son
muy diferenciados, por ejemplo, células de ga­
llina inoculadas al pavo, células de distintas ra­
zas de una misma especie, la inoculación de
proteínas plasmáticas del hombre al ratón, co­
nejo, cobayo, etc., estos fenómenos de inmuno-
tolerancia son muy manifiestos, siendo m ás di­
fíciles de lograr cuando existen marcadas dife-.
rencias. Un ejemplo de ello es la tolerancia par­
cial de la rata a la hemocianina, que es una pro­
teína de un crustáceo, con características fisico­
químicas bastante diferenciadas de las proteí­
nas de ese animal.
Esta tolerancia es específica, ya que la desa­
rrollada para un antígeno no lo es para los de­
más, y un animal con tolerancia para la albúmi­
na bovina puede elaborar sin inconveniente anti­
cuerpos para cualquier otro antígeno inoculado.
288 Aspectos básicos de la inmunidad
Factores que promueven la inducción
de tolerancia
Estado de los órganos linfoides centrales
y periféricos
Según la teoría de la selección clonal, si los
órganos linfoides son estimulados prem atura­
mente, antes de un estado crítico durante la em­
briogénesis, se produce la inactivación o elimi­
nación de las células sensitivas al antígeno. Lo
dicho no es totalmente cierto pues está demos­
trado que el feto puede producir anticuerpos y
que es posible inducir tolerancia en adultos.
Si bien es posible inducir tolerancia más fá­
cilmente en animales con su tejido linfoide da­
ñado o inmaduro, la falta de respuesta cuando
se inoculan simultáneamente ratones con antí­
geno y ciclofosfamida - la que depleta princi­
palmente a los linfocitos B -, o antígeno y suero
antilinfocito, no indica claramente si ello se de­
be a una interrupción en la producción de anti­
cuerpos que llevarían rápidamente a la toleran­
cia, o si es consecuencia de un cambio activo
en las células sensitivas al antígeno. Lo que sí
está bien probado es que la tolerancia puede in­
ducirse más fácilmente en el embrión o neona­
to que en el adulto. Estos distintos tipos de to­
lerancia se discuten en el capítulo 18.
Propiedades del antígeno
a) Tamaño molecular. El estado de agrega­
ción de un antígeno puede influir en su com ­
portamiento como inmunógeno o tolerógeno.
Las soluciones de albúmina o IgG a las que por
centrifugación se les elimina la proteína agre­
gada son tolerogénicas, mientras que los pro­
ductos sin centrifugar inducen buena respuesta
inmune.
La flagelina es una proteína que ha sido utili­
zada para estos tipos de estudios. Puede encon­
trarse bajo la forma de monómero (PM 40 kD)
o polím ero (PM 10.000 kD ). E sta ú ltim a es
marcadamente inm unogénica, en tanto que el
monómero es antigénico en bajas dosis y tole­
rogénico en concentraciones altas. A partir de la
flagelina monomérica, por tratamiento con bro­
muro de cianógeno, se ha obtenido un fragmen­
to de PM 18 kD que es tolerogénico a todas las
dosis ensayadas. Siendo la flagelina una molé­
cula constituida por subunidades a repetición,
esas experiencias demuestran que el efecto está
relacionado con el tamaño molecular y no con
cambios en la especificidad del antígeno.
b) Características del antígeno. Algunas for­
mas químicas de determinadas moléculas o pe­
queños cambios introducidos en las mismas ha­
cen que funcionen mejor como tolerógenos que
como inmunógenos.
Los polím eros de D -am inoácidos general­
mente son potentes tolerógenos, a diferencia de
lo que ocurre con los de L-aminoácidos. La fla­
gelina monomérica acetilada pierde capacidad
antigénica y se convierte en tolerógeno.
c) Dosis de antígeno. Hay una dosis crítica
para inducir tolerancia o inmunidad. Para algu­
nas proteínas hay dos zonas donde pueden in­
ducir tolerancia, una de baja concentración y
otra de alta concentración, funcionando a con­
centraciones intermedias como inductores de la
producción de anticuerpos. La albúmina bovina
induce tolerancia a las concentraciones 10 * M
(zona de baja concentración de antígeno) y 10^^
M (zona de alta concentración de antígeno). A
la concentración 10 ’ M induce respuesta inmu­
ne, y las células así informadas dan respuesta
secundaria aun con dosis de antígeno del orden
1 0 * '0 M .
Shellam y Nossal, trabajando con flagelina
polimériea, han demostrado que es posible in­
ducir tolerancia con concentraciones de antíge­
no 0,1 pg/g peso animal/día (zona de baja con­
centración) y 20 ng/g peso animal/día (zona de
alta concentración). Con concentraciones inter­
medias se logra respuesta inmune (fig. 15-9).
Tolerancia a nivel celular
Teniendo en cuenta que en la respuesta in­
mune participan linfocitos T y B, resulta intere­
sante saber si la tolerancia creada en cada una
de ellas induce o no tolerancia a todo nivel en
el animal, y por cuánto tiempo esas células son
tolerogénicas. Las experiencias de W eigle son
bien demostrativas en ese sentido. Este autor
estudió la tolerancia en células T y B, a varios
intervalos, después de la inducción de toleran­
cia en ratones inoculados con gammaglobulina
humana (GGH). Transfirió a ratones irradiados
células tolerantes de timo y células normales de
médula ósea, o células normales de timo y cé­
lulas tolerantes de médula ósea. La respuesta
de esas mezclas de células a GGH y a un antí­
geno no relacionado como la gammaglobulina
de pavo (GGP), fue analizada inoculando para
ello a los animales con dosis inmunogénicas de
ambas proteínas. Se pudo demostrar tolerancia
para las células T a los dos días, la que persis­
tió por 150 días. Para las células B la tolerancia
tuvo lugar a la semana y se mantuvo por 50
días. No obstante ser esta tolerancia de diferen­
te duración, la falta de respuesta en uno de am­
bos tipos de células lleva a la tolerancia opera-
cional en todo el organismo (cuadro 15-1).
Hoy se sabe que la tolerancia inducida por
alta dosis de antígeno afecta a las eélulas T y
B, en tanto que la de baja dosis de antígeno so­
lamente afecta a las células T cooperadoras. A
favor de ello está el hecho de que los antígenos
 Respuesta inmune humoral 289

IgM, IgG, IgA, etc., existe en sus comienzos

IgD de superficie, que luego se pierde. Ello
ocurriría porque esta inm unoglobulina y a no
cumple ninguna función, pues esos linfocitos B
son células que se han transformado en respon­
dedoras, capaces de diferenciarse en células
plasmáticas sintetizadoras de la correspondien­
te inmunoglobulina (fig. 15-1).
Los mecanismos capaces de inducir toleran­
cia pueden ser distintos, pero casi todos ellos
apuntan a alterar el funcionamiento norm al de
los linfocitos B y T cooperadores. Cabe men­
cionar otros, entre ellos la hiperfuncionalidad
de células T funcionalmente supresoras, dele­
ción o bloqueo de clones celulares, bloqueo de
los receptores antigénicos, inhibición de la di­
ferenciación celular terminal, la participación
de anticuerpos antiidiotipos, etcétera.
La tolerancia inmunológica resulta, pues, de
la participación de distintos mecanismos, que
tienen lugar tanto para inmunógenos inertes co­
mo para células vivas. Algunos de esos meca­
nism os pareciera que son norm ales, los que
participarían en el mantenimiento de la toleran­
cia a “lo propio” o no inducción de respuesta
inmune por parte de los componentes antigéni­
Fig. 15-9. Zonas de tolerancia (según Shellam y N ossal).
cos del individuo.

Respuesta inmune en las disglobulinernias

T-independientes no inducen dos zonas de tole­
rancia. Otro hecho destacable es que las células En los recién nacidos, la estimulación anti­
T maduras son más susceptibles a la tolerancia génica no produce respuesta inmune. En el ni­
que las células B maduras. Generalmente, el fe­ ño hay respuesta inmunológica sólo después de
nómeno se consigue con dosis de antígeno 100 las cuatro semanas de vida y en momentos en
a 1.000 veces inferiores que las requeridas para que sus niveles de gammaglobulina circulante
las células B. Los precursores de linfocitos B propia coinienzan a incrementarse. Al nacer, la
presentan un susceptibilidad a la tolerancia si­ casi totalidad de la gammaglobulina presente
milar a la de los linfocitos T cooperadores. es de origen materno y en ella se encuentran lo­
Por qué una célula linfoide es inducible o to- calizados los anticuerpos transmitidos pasiva­
lerogénica es algo no aclarado. mente, que son los que les confieren cierta re­
En los linfocitos B portadores de inmunoglo­ sistencia a las infecciones en los períodos ini­
bulinas de superficie aparece en primera instan­ ciales de la vida.
cia IgM e IgD, ambas con el mismo idiotipo En los casos de las hipogammaglobulinemias
(receptor del antígeno). La función de la IgD congénitas o adquiridas, el estado inmunitario
sería evitar la tolerancia en los primeros esta­ del niño es deficiente para algunos tipos de in­
dios de la diferenciación de los LB. En los lin­ fecciones, sobre todo las bacterianas y las fún­
focitos B ya program ados para la síntesis de gicas, en tanto que es satisfactorio para las in­
fecciones víricas. No obstante, pueden desaíro-
llar alergia retardada similar a la de los normo-
globulinémicos, capaces de originar pruebas cu­
Cuadro 15-1 táneas positivas para los agentes sensibilizantes,
e incluso, rechazar homoinjertos. Esta sensibili­
Células usadas Anticuerpos con
para reconstituir especificidad p a ra
dad adquirida puede ser transmitida pasivamen­
te por transferencia de leucocitos del enfermo,
Tim o M édula ósea GGH GGP
pero los resultados son negativos cuando se tra­
ta de inmunizar pasivamente por la inoculación
Norma! N orm al + + de sueros de estos pacientes. Ello se debe a que
GGH tolerante N orm al - + en estos casos está afectado el aparato inmuno-
Normal G G H tolerante - +
GGH tolerante G G H tolerante + lógico de la inmunidad humoral, no así el que
-
regula la mediada por células.
290 Aspectos básicos de la inmunidad
Al comienzo de la década del ’60 se realiza­
ron los primeros estudios estructurales sobre
inmunoglobulinas y anticuerpos. En esos m o­
mentos surgió e l interrogante de si en los casos
de hipergam m aglobulinem ias m onoclonales,
como lo eran ios mielomas por IgG e IgA del
hombre y el ratón, las inmunizaciones con antí­
genos definidos podrían significar un in cre­
mento de anticuerpos producidos, localizados
en la inmunoglobulina monoclonal. Pudo de­
mostrarse que la actividad anticuerpo no invo­
lucraba a esta inm unogloblina. Los estudios
realizados demostraron que, por el contrario,
algunos de los portadores de mielomas son ma­
los productores de anticuerpos y pueden sufrir
infecciones de distintos tipos que logran mejo­
rar, muchas veces, al igual que en los casos de
hipogammaglobulinemias, con transfusiones de
gammaglobulina de personas normales.
Estas observaciones son com prensibles en
estos momentos, pues se sabe que los mielo-
mas son la consecuencia de la transformación
mahgna de un clon de células plasmáticas sin-
tetizador de un determinado tipo de inmuno-
globulina -q u e ha adquirido la propiedad de
proliferar sin tasa-, sin que ello signifique que
la inmunoglobulina elaborada por este clon ce­
lular tenga actividad específica para un inmu­
nógeno dado o sea diferente a la normal. La
proteína elaborada está constituida por un con­
junto de moléculas iguales, sintetizadas por un
único clon de plasmocitos derivado de uno de
los millones de linfocitos B que componen el
sistem a inm une de un individuo (véase fig.
15-10 y cap. 5, fig. 5-6) . En algunos casos par­
ticulares se ha demostrado que esas proteínas
monoclonales reconocen a determinados antí­
genos. En otros ello no ha podido demostrarse,
probablemente por no haber tenido la posibili­
dad de poder confrontarlas con el antígeno cu­
yo epitope esa inm unoglobuhna reconoce, ya
que es sabido que el paratope de cada una de
las moléculas de inmunoglobulina tiene posibi­
lidad de interactuar con un antígeno dado.
Si bien en algunos casos, como en la artritis
reumatoidea y en las inmunizaciones contra an­
tígenos hemáticos o antígeno O de S. typhi, li­
geros aumentos de la fracción IgM están liga­
dos a aumentos del título de anticuerpos, en el
caso particular de la m acroglobulinem ia de
W aldenstrom con un gran incremento de IgM
monoclonal, no se ha podido demostrar que és­
te pueda estar relacionado con aumentos de la
actividad anticuerpo. Incluso la inm unización
F ig . 1 5 -1 0 . E l e e t r o f o r e s i s e
in m u n o e le c tro fo re s is e n a c e ta ­
to d e c e lu lo s a d e u n s u e ro c o ­
r re s p o n d ie n te a un m ie io m a
Ig G . A , e le e t r o f o r e s i s . B , in ­
m u n o e le c tr o fo r e s is u s a n d o
su e ro d e c a b ra a n tih u m a n o c o ­
m o r e a c tiv o p re c ip ita n te . Parte
su p er io r: s u e r o n o r m a l c o n ­
tro l; p arte in ferio r, s u e r o d e
m ie lo m a . C , el m is m o e s q u e ­
m a a n te r io r , u t il iz a n d o s u e ro
d e c o n e jo a n ti-Ig G m o n o e s p e -
c ífic o p a ra la in m u n o p re c ip ita ­
c ió n .

específica en estos tipos de pacientes no ha
permitido evidenciar )a aparición de anticuer­
pos en dicha fracción globulínica.
VIDA MEDIA DE LOS ANTICUERPOS
De los datos experimentales de que se dispo­
ne se desprende que la vida media de los anti­
cuerpos es similar a la de la gammaglobulina
de la m ism a especie animal, con variaciones
relacionadas con la especie y su actividad me­
tabólica. Se ha comprobado que la vida media
de la gammaglobulina es de aproximadamente
25 días para los niños de 6 a 8 años y de 21
días para el adulto. La antitoxina diftérica,
transmitida pasivamente al recién nacido, tiene
una vida media de aproximadamente un mes, al
igual que los anticuerpos anti-Rh presentes en
el recién nacido por pasaje placentario. Cuando
anticuerpos transferidos provienen de una espe­
cie homóloga, su desaparición se produce con
la misma rapidez que las globuhnas normales,
en tanto que, si es de una especie heteróloga, si
bien al principio la desaparición sigue el m is­
mo ritmo, posteriormente aumenta.
Si se hace una segunda inoculación de estos
anticuerpos heterólogos 15 días después de la
primera inoculación, su desaparición se acelera
como consecuencia de los anticuerpos que el
animal ha originado contra la proteína portado­
ra de la actividad anticuerpo y que en primera
instancia ha actuado como antígeno.
La vida media de los anticuerpos puede estu­
diarse tanto en la inmunización pasiva como en
la activa. En el primer caso puede hacerse m i­
10
-m g de anticuerpo
-c.p,m.
Fig. 15-11. G rá fic a c o m p a ra tiv a d e la c u rv a d e p ro d u c c ió n d e a n tic u e rp o s (v a lo ra d o s p o r p re c ip ita c ió n ) y la v id a m edia
d e los m is m o s (c.p .in . d e lo s p re c ip iía d o s ).
Respuesta inmune humoral 291
diendo la desaparición del torrente sanguíneo
del anticuerpo homólogo o heterólogo inocula­
do, en tanto que en el segundo se hace p o r la
introducción de una marca interna, como es la
incorporación de un átomo radiactivo en el an­
ticuerpo que se forma en un animal que es in­
munizado activamente.
Si se inm uniza un conejo con neumococos
tipo III y después se le inoculan por vía intra­
venosa anticuerpos contra neumococos tipo I,
al alim entar al animal así preparado con ‘‘’N
glicina, se observa que el '-’N aparece en los an­
ticuerpos contra el neumococo tipo III, o sea,
los producidos por inmunización activa, pero
no aparece en los anticuerpos antineumocóci-
cos tipo 1 inocülados ya preformados.
Los anticuerpos se sintetizan, desintegran y
resintetizan de la misma manera y con la mis­
ma velocidad que las inmunoglobulinas norm a­
les. Para demostrarlo se inmunizaron conejos
con neumococos y 10 días después se los ah-
mentó durante tres días seguidos con '^N-glici-
na. El estudio posterior seriado de estos anim a­
les permitió comprobar que el '-‘’N se incorpora
en cantidades iguales a ¡a nueva globulina nor­
mal elaborada por el animal y a la nueva globu­
lina anticuerpo, que tiene una sobrevida de
aproximadamente 14 a 15 días, sin que por ello
decline la tasa total de anticuerpos, ya que el
anim al sustituye, y en exceso, el anticuerpo
m etabolizado, como consecuencia de la esti­
mulación del aparato formador de anticuerpos
por parte del antígeno inoculado (véase fig.
15-11).
Todas estas experiencias nos indican que la
vida m edia de los anticuerpos, tanto en la in­
15 20 25 30 35 40 45
Días
292 Aspectos básicos de la inmunidad
munidad activa como en la pasiva, es aproxi­
madamente la misma, y que en el primer caso
el título de los anticuerpos se mantiene cons­
tante o aumenta como consecuencia de la con­
tinua elaboración de ellos, no así en la inmuni­
zación pasiva, en la que el estado inmunitario
finaliza cuando todos los anticuerpos inocula­
dos han sido metabolizados.
Cabe señalar que la vida media de los anti­
cuerpos depende de la clase de inmunoglobuli­
na portadora de dicha actividad. En el hombre
ella es de 2-3 días para la IgE, en tanto que pa­
ra la IgA es de 4-5 días, para la IgM de 5 a 6
días, y para la IgG de 21 días (véase cap. 5,
cuadro 5-11).
OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS
IN VITRO
La obtención de anticuerpos in vitro ha sido
preocupación perm anente. Si bien existen lí­
neas celulares de mielomas que producen in-
munoglobuhnas para algunas de las cuales ha
podido determinarse su especificidad para li­
gandos, la obtención de anticuerpos por esta
vía es muy restringida. Conviene señalar que,
en estos casos, la identificación de la especifi­
cidad de la inmunoglobulina sintetizada por las
células ha sido determinada mediante ensayos
de confrontación entre esas inmunoglobulinas
y gran cantidad de antígenos, tarea tediosa y en
muchos casos ineficaz.
La inmunización de animales portadores de
mielomas, o la inducción de mielomas en ani­
males preinmunizados, no ha permitido obtener
inmunoglobulinas monoclonales con especifi­
cidad para el antígeno usado.
En estos líltimos años, mediante técnicas de
hibridización, se han conseguido líneas celula­
res similares a las provenientes de mielomas,
con la enorme ventaja de que por clonado se
han logrado productos que elaboran inmuno-
globulinas correspondientes a una determinada
clase o .subclase y con capacidad para reaccio­
nar específicamente con un antígeno preselec-
cionado. La especificidad de esos anticuerpos
es para un único determinante antigénico, no
obstante la complejidad que pueda tener el an­
tígeno total usado.
El método de hibridización es bastante sim­
ple y consiste en la fusión de células tumorales
derivadas de los linfocitos B, provenientes de
un mieloma y adaptadas a crecer in vitro, con
células normales de origen B procedentes de un
animal preinmunizado. El producto resultante
(hibridoma) tiene capacidad para multiplicarse
en medios de cultivo apropiados y de sintetizar
una inmunoglobulina con especificidad para el
antígeno utilizado en la inmunización.
La línea celular inicialmente usada fue la X-
6 3-A g 8 , d e riv a d a p o r c lo n ad o de la lín e a
MOPC-21 proveniente de un mieloma de ratón
(BALB/c) que sintetiza IgG l, y adaptada al cul­
tivo in vitro. Actualmente se emplea con gran
ventaja una variante de esa línea, la NS-0, que
no sintetiza cadenas H ni L, que facilita la se­
lección del clon celular que elabora inmunoglo­
bulina de naturaleza similar a la sintetizada por
la parental productora de anticuerpo. No debe
olvidarse que los híbridos provenientes de dos
células distintas elaboradoras de inmunoglobu­
linas expresan todas las cadenas peptídicas
constitutivas de esas proteínas presentes en am­
bos parentales pues son tetraploides. Es necesa­
rio, por lo tanto, mediante clonados adecuados,
seleccionar aquella línea que sólo sintetiza la
inmunoglobulina de estructura deseada.
Afortunadamente, la selección de clones que
elaboran inmunoglobulinas con cadenas H y L
similares a las del parental proveniente del bazo
del animal inmunizado no es difícil de obtener.
A partir de clones que sintetizan formas tetra-
méricas constituidas por cadenas H y L de am­
bos parentales, pueden lograrse por subclonado
líneas que expresan las cadenas H de la célula
productora de anticuerpo y las cadenas L de la
célula normal y la tumoral. Subclonados poste­
riores permiten seleccionar células que sólo sin­
tetizan inmunoglobulinas cuyas cadenas H y L
no están relacionadas con la célula tumoral que
inicialmente dio origen al híbrido. El uso de la
variante celular NS-0, que no sintetiza cadenas
H ni L, facilita esta tarea.
Para la obtención de hibridomas productores
de anticuerpos se mezclan células provenientes
del bazo de un ratón preinmunizado con las cé­
lulas tumorales ya indicadas, a las que se añade
el agente fusionante (inicialmente se usó virus
Sendai, en la actualidad se emplea polietilen­
glicol 1.000-1.500), manteniéndolo en contacto
por dos minutos. Como medio de cultivo gene­
ralm ente se usa el de Eagle m odificado por
Dulbecco (DME) o el RPMI. A partir de allí se
realiza el clonado para la selección del híbrido
deseado.
Con el objeto de facilitar esta operación, las
células tumorales han sido adaptadas para cre­
cer en 8-azo guanina, por lo que carecen de la
enzima hipoxantina guanina fosforribosil trans­
ferasa, requerida para el crecimiento en medios
de cultivo conteniendo hipoxantina, aminopteri­
na y timidina (HAT). Cuando los productos de
hibridización sean cultivados en m edios con
HAT, sólo podrán multiplicarse las células re­
sultantes de la fusión de células tumorales y cé­
lulas normales del bazo, pues poseen en su ge­
noma la información para la síntesis de la men­
cionada enzima aportada por las células del ani­
mal inmunizado. Las células normales del bazo

no proliferarán por carecer de la propiedad de
multiplicarse in vitro, y las células tumorales no
hibridizadas tampoco por ser enzima-deficien-
tes y el medio de cultivo contener HAT.
Los híbridos que se cultivaron en las condi­
ciones señaladas deben ser clonados y seleccio­
nados en cuanto a su especificidad como anti­
cuerpo y clase de inmunoglobulina; esto puede
realizarse por el método de las células forma-
doras de placas de hemólisis, empleando la téc­
nica directa o indirecta según la clase de inm u­
noglobulina que se desea investigar.
La selección se puede efectuar también me­
diante el análisis de los sobrenadantes de los
cultivos de los híbridos.
Los clones seleccionados son cultivados lue­
go en frascos para obtener los anticuerpos se­
cretados. Con el objeto de asegurar su estabili­
dad todos aquellos clones que interesen deben
ser conservados a muy baja temperatura (nitró­
geno líquido), que en estas condiciones se
mantienen viables por muy largo tiempo.
Numerosos laboratorios están dedicados a la
obtención de híbridos por fusión celular. Se
han aislado clones productores de anticuerpos
monoclonales contra diferentes proteínas, poli­
sacáridos, haptenos, heteroantígenos y haloan-
tígenos contenidos en superficies celulares (in­
cluidos los de histocompatibilidad), etc. Tam ­
bién se han logrado híbridos productores de an­
ticuerpos resultantes de la fusión de células de
mieloma de ratón y de bazo de ratas inmunes.
Como consecuencia del éxito obtenido en la
fusión de células de m ielom as (derivadas de
linfocitos B), se han efectuado numerosos in­
tentos para lograr hibridomas a partir de célu­
las de linfomas (derivadas de linfocitos T). Se
han logrado líneas celulares de hnfomas T en­
zima-deficiente que han facilitado la tarea. Ello
ha posibilitado la obtención de clones de célu­
las T que expresan diferentes funciones y que
contienen en su superficie antígenos determina­
dos, en especial de la región I del com plejo
mayor de histocompatibihdad.
A diferencia de lo que ocurre con los hibri­
domas derivados de células de mielom as, el
clonado resulta muy dificultoso cuando provie­
ne de linfocitos T, como consecuencia de las
técnicas a utilizar en estos casos, sobre todo si
se trata del aislamiento de células con funcio­
nes efectoras, cooperadoras o secretoras de di­
ferentes factores.
No caben dudas de que la obtención de hi­
bridomas por fusión de células tumorales con
células normales participantes de la respuesta
inmune ha ampliado el horizonte de la inm uno­
logía.
En el capítulo 36 se trata este tema en detalle
y se describe la metodología usada con tal fin
en nuestros laboratorios.
Respuesta inmune humoral 293
TIPOS DE ANTICUERPOS
Sabem os que los anticuerpos pueden estar
ubicados en las diferentes inm unoglobulinas, y
al referirnos a sus estructuras hemos visto que
sus m oléculas tienen repetido, por lo m enos
dos veces, el sitio de combinación para el de­
terminante antigénico. Se los denomina biva­
lentes. En la naturaleza no ha podido com pro­
barse que estos sitios dentro de la m ism a mo­
lécula puedan reaccionar con determ inantes
antigénieos diferentes, y solamente en el labo­
ratorio, por recombinación, se han conseguido
híbridos con estas características. Vimos tam ­
bién que en determinadas circunstancias, por
degradación enzimática o química, estos anti­
cuerpos se desdoblan transformándose en uni­
valentes.
C uando un anim al es inm unizado, form a
siem pre anticuerpos bivalentes, pero pueden
aparecer anticuerpos “funcionalm ente univa­
lentes o incom pletos” , como se observa con
mucha frecuencia en las sensibihzaciones que
experimentan madres Rh negativas por transfe­
rencia de eritrocitos del tipo Rh positivo. Estu­
dios llevados a cabo con híbridos obtenidos a
partir de anticuerpos anti-Rh y anti-B, han de­
m o s tra d o c la ra m e n te que los a n tic u e rp o s
anti-Rh incompletos son bivalentes. En medio
sahno no pueden aglutinar ni precipitar por no
originar com plejos antígeno-anticuerpo sufi­
cientem ente grandes. Tienen capacidad para
aglutinar en medio albuminoso.
Los anticuerpos bivalentes y “univalentes”
obtenidos por inmunización con un m ism o an­
tígeno, si bien tienen la particularidad de pre­
sentar la misma especificidad para el antígeno
inmunizante, se diferencian fundamentalmente
en que sólo los bivalentes pueden dar con el
antígeno reacciones de aglutinación o precipi­
tación visibles, ya que la bivalencia será 1a que
perm itirá formar el conglomerado de com ple­
jos iniciales que llevarán a la aglutinación o
precipitación, teniendo lugar estas reacciones
en medios salinos.
Los anticuerpos “univalentes o incom ple­
tos”, en cambio, como consecuencia de su úni­
ca valencia activa, saturan las moléculas de an­
tígeno e impiden la formación de agregados y
por lo tanto la aparición del fenómeno visible.
Este tipo de anticuerpo puede ponerse en evi­
dencia por otros mecanismos, como el ideado
por Coombs. Teniendo en cuenta que el anti­
cuerpo univalente al saturar la partícula antigé­
nica expone sus propios determinantes, si dicho
producto de reacción es enfrentado con un sue­
ro antiglobulina de la misma especie animal, se
producirá aglutinación. En este caso, la gam­
maglobulina anticuerpo fijada al antígeno ac­
tuará como antígeno particulado multivalente.
294 Aspectos básicos de la inmunidad
Estos anticuerpos tienen capacidad para atrave­
sar la placenta, razón por la cual en las isoin-
muizaciones maternofetales su presencia puede
provocar daño al feto.
Cada vez son mayores las pruebas de que en
las distintas enfermedades, sobre todo en las
infecciones crónicas como la brucelosis, sal-
monelosis, tripanosom iasis americana, gono-
cocia, etc., pueden aparecer estos tipos de anti­
cuerpos. Los mismos, con especificidad para
los antígenos paternales, juegan un rol muy
importante en la protección al feto en el útero
materno, ya que al bloquear dichos antígenos
los protegen y evitan su destrucción por los di­
ferentes m ecanism os b iológicos p uestos en
marcha en una respuesta inmune. Un enfoque
amplio sobre el tema se efectúa en los capítu­
los 19 y 34.
A esto cabe añadir, como ya se ha indicado,
que los anticuerpos pueden estar ubicados en
inmunoglobuhnas diferentes al comienzo y fi­
nal de la inmunización, o la actividad anticuer­
po ser patrimonio exclusivo de la IgM.
En el suero de pacientes con fiebre de heno,
asma y otros tipos de alergia, conocidas con el
nombre de alergias atópicas, se han identifica­
do anticuerpos originariamente llamados rea­
ginas. Tienen algunas de las características de
los anticuerpos bivalentes clásicos, pero se di­
ferencian en que no dan reacciones de precipi­
tación en el tubo de ensayo, son en cierto mo­
do termolábiles -u n calentamiento a 56°C du­
rante 60 minutos anula su actividad sensibili­
zante-, no atraviesan la barrera placentaria y
tienen la particularidad de permanecer locali­
zados por largo tiempo en las zonas de la piel
de los sitios donde han sido transferidos pasi­
vamente. Este com portam iento particular se
debe a que pertenecen a la clase IgE, la que se
fija a receptores específicos. En diferentes es­
pecies anim ales han sido identificados anti­
cuerpos que responden a estas características.
El del cobayo ha sido inicialmente aislado por
nosotros.
Es im portante recordar tam bién que an ti­
cuerpos ubicados en la IgG e IgM tienen la
particularidad de fijarse, por intermedio de sus
Fe, a receptores específicos existentes en los
macrófagos y polimorfonucleares neutrófilos.
Estos anticuerpos, llamados citofílicos, arman
esas células para su acción captadora de antí­
genos. Las partículas antigénicas que reaccio­
nan con los sitios de combinación de anticuer­
pos fijados a la superficie celular quedan an­
cladas, con lo cual la acción fagocítica se ve
facilitada.
A esto cabe añadir que en toda respuesta in­
mune los anticuerpos IgG formados no son ho­
mogéneos, corresponden a diferentes tipos, he­
cho que será analizado en el capítulo 19.
TRANSFERENCIA DE ANTICUERPOS '
DE LA M A DRE AL FETO
El feto se encuentra incapacitado para for­
mar anticuerpos contra los agentes antigénicos
externos, protegido como está en su enclaustra-
miento intrauterino materno y, además, como
ya hemos visto, por su incapacidad para elabo­
rar gammaglobulina a niveles suficientes aun
en los primeros estadios de vida.
A pesar de todo ello y del medio infeccioso
en que se encuentra después del nacimiento, el
recién nacido no se infecta como consecuencia
de cierta resisten cia esp ecífica log rad a por
transferencia m aterna de anticuerpos. Estos
pueden llegar al feto o al recién nacido por vía
uterina o por el calostro y la leche, lo cual de­
pende de la especie animal, y sobre todo en el
caso del feto, de la estructura constitutiva de la
placenta en cuanto al número de capas y grosor
del tejido que se interpone entre la circulación
fetal y la materna. Por supuesto que el pasaje
de proteínas será dificultoso cuando haya va­
rias capas de células interpuestas, en tanto que
en aquellos casos en que no existe capa mater­
na y sólo capas fetales m ínim as com o en el
hombre, mono, conejo, cobayo, ratón, etc., esto
ocurre con alguna facilidad. Se ha comprobado
que los cerdos y rumiantes, cuyo número de ca­
pas entre la circulación materna y fetal es de 5
y 4 respectivamente, solamente transfieren an­
ticuerpos por el calostro, en tanto que el hom­
bre y roedores, que poseen una, lo hacen por
vía placentaria.
En el hombre, el pasaje de inm unoglobuh­
nas de la madre al feto se produce después del
primer trimestre de la gestación, y sólo pueden
atravesar la placenta la IgG, no así la IgM, IgA
e IgE, entre las que se encuentran isoaglutini-
nas para los antígenos hemáticos, que induda­
blemente podrían resultar perjudiciales para el
feto. Ese pasaje placentario de los anticuerpos
es selectivo,y no está relacionado con su tama­
ño m olecular, como se supuso inicialm ente.
En la placenta existen receptores para el frag­
mento Fe de IgG y es ésta la única inm unoglo­
bulina que puede atravesarla siem pre que la
molécula mantenga su integridad. El fragmen­
to F(ab’)2, carente del fragmento Fe, no la atra­
viesa no obstante su menor peso molecular. Si
a una embarazada se le inocula con fines tera­
péuticos un suero antitóxico que contiene anti­
cuerpos IgG que han sido sometidos a proce­
sos de purificación por tratamiento con pepsi­
na, lo que en realidad recibe son los fragmen­
tos F(ab ’ )2 de esos anticuerpos los que, por lo
expuesto anteriormente, no atravesarán la pla­
centa y no podrán conferir inm unidad pasiva
congénita, si hubiese sido ésa la finalidad de la
inoculación.

En casos particulares existen otras vías de
transmisión. La gallina puede transferir anticuer­
pos a la yema del huevo de donde son absorbi­
dos por el embrión a través del saco vitelino.
En cobayas preñadas se observó que, cuando
se las inmunizaba con antitoxinas diftéricas ob­
tenidas de distintos animales, la antitoxina ho­
móloga pasaba de la madre al feto con más fa­
cilidad que las heterólogas. Experiencias reali­
zadas en conejas en gestación llevan a conclu­
siones similares.
Un punto no muy claro es la manera en que
esa transmisión de los anticuerpos se produce a
través del útero, ya que ha sido demostrado en
experiencias efectuadas con antitoxina estafilo­
cócica y anticuerpo mü-Escherichia coli que el
pasaje de ellos no es igual en el sentido mater-
nofetal y viceversa. En dichas experiencias se
han encontrado diferencias entre la tasa de anti­
cuerpos maternos y los dosados en el cordón
umbilical o en el recién nacido, y se ha llegado
a establecer que el título de anticuerpos es su­
perior en el feto comparado con el de la madre.
En el calostro de la mujer se ha demostrado
la existencia de anticuerpos, pero siempre con
un título inferior que el de los presentes en ia
sangre, salvo en los casos particulares de infec­
ciones mamarias, ya que se podrían desarrollar
anticuerpos locales contra el agente infeccioso;
lo interesante es que dichos anticuerpos dism i­
nuyen por la succión y son absorbidos por los
lactantes. En terneros se ha observado que los
anticuerpos del calostro son más absorbibles
que los del suero. Parecería que la glándula
mam aria acondicionara de alguna m anera la
globulina que segrega, generando esta propie­
dad. En los ratones se ha observado también
que en los casos de infecciones experimentales
con virus herpes, hay un pasaje de anticuerpos
contra este virus de la madre al recién nacido
por transferencia a través de la leche.
Se ha comprobado que la absorción de anti­
cuerpos transmitidos por la leche y el calostro
en terneros y en ratones se produce por vía in­
testinal y que dicha absorción, en cierto modo
selectiva, se mantiene por uno o varios días se­
gún la especie animal.
Si bien la transferencia de anticuerpos de la
madre al feto resulta sumamente útil en la ma­
yor parte de los casos, en algunas oportunidades
puede ser perjudicial, como ocurre en el hom­
bre en las isoinmunizaciones por antígenos con­
tenidos en los elementos figurados de la sangre.
(Para mayor información véase cap. 34.)
Respuesta inmune humoral 295
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Hipersensibilidad tardía y otras reacciones
de inmunidad mediada por la activación
de macrófagos
MARTA BRAUN
INTRODUCCIÓN
La respuesta inmune específica se desarrolla
por la suma de una serie de fenómenos de inte­
racción celular cuya resultante final es la apari­
ción de células efectoras que, en algunos casos,
secretan inmunoglobulinas específicas para el
antígeno y, en otros, no producen anticuerpos
específicos sino que actúan directa o indirecta­
mente sobre el antígeno. En esta división sim­
plificada, a la primera se la llama inmunidad
humoral y a la segunda inm unidad celular o
mediada por células. Es decir que, en la protec­
ción de un individuo co n tra la invasión de
agentes patógenos, intervienen no sólo los anti­
cuerpos secretados sino también células que los
reconocen específicam ente pero no secretan
sustancias específicas.
Estas últimas funciones serían, filogenética­
mente, más antiguas que la inmunidad humoral
y provendrían de mecanismos primitivos de re­
conocimiento interespecie e intraespecie, pero
fueron descritas mucho después que los anti­
cuerpos y las reacciones mediadas por ellos.
Durante un tiempo relativamente largo, la in­
munología estuvo dominada por la serología y
tanto las células que intervienen en la síntesis
de los anticuerpos como las que actúan en la
inmunidad mediada por células fueron conoci­
das mucho después.
Las primeras nociones sobre inmunidad m e­
diada por células surgieron del estudio de las
reacciones de hipersensibiUdad tardía, provoca­
das por la tuberculina y por ciertas sustancias
quím icas capaces de pro d u cir derm atitis de
contacto, por lo cual se las consideró sólo co­
mo una forma de alergia, como un efecto perju­
16
dicial de la respuesta inm une. Más tarde, se
comprendió la importancia de estas reacciones
no sólo en el rechazo de injertos sino también
en la protección contra microorganismos pató­
genos, sobre todo contra los patógenos intrace­
lulares obligados o facultativos (virus, parási­
tos protozoarios, ciertas bacterias y hongos).
Luego se comprobó que algunos de los meca­
nismos de colaboración que intervienen en las
respuestas celulares son necesarios también en
la respuesta humoral contra los antígenos pro­
teicos, aun cuando la resultante “visible” de és­
ta sea una respuesta humoral. Hubo entonces, y
existe todavía, cierta confusión sobre el térm i­
no “inm unidad celular”, pues éste abarcó no
sólo las reacciones celulares cuya resultante es
la respuesta humoral sino también los mecanis­
mos efectores de ésta última mediados por cé­
lulas como, por ejemplo, la citotoxicidad celu­
lar dependiente de anticuerpos. Por eso se utili­
za la expresión de “inmunidad mediada por cé­
lulas” para definir las reacciones específicas en
las que no intervienen anticuerpos.
Sin embargo, entre éstas existen dos tipos de
fenómenos efectores: la citotoxicidad directa
ejercida por los linfocitos T, que se discute en
el capítulo 2, y las reacciones celulares media­
das por los linfocitos de fenotipo T h l, cuyo
efecto final es la activación de los macrófagos,
con un aumento enorme de su poder lítico. Se­
ría entonces mejor definir a esta última función
como inmunidad mediada por macrófagos acti­
vados, Estos macrófagos activados, efectores
finales de la reacción de los linfocitos T h l, son
muy diferentes, tanto de los macrófagos en re­
poso, como de los estimulados por efecto de la
fagocitosis, y no sólo por su mayor actividad lí-
 Hipersensibilidad tardía y otras reacciones de inmunidad
tica externa e interna sino por la secreción de
factores capaces de acción a distancia.
En términos generales, puede decirse que la
activación de los macrófagos es el arma más
poderosa que tienen los organismos superiores
para defenderse de patógenos intracelulares
optativos, capaces de escapar de la lisis luego
de ser fagocitados por macrófagos no activa­
dos. Pero tam bién es un arm a de doble filo
pues im plica, en m ayor o m enor m edida, la
aparición de reacciones típicas de hipersensibi­
lidad tardía, cuya resultante es la destrucción
de tejidos propios, incluso de células no para-
sitadas, que vendrían a ser los “testigos ino­
centes” que mueren como consecuencia de la
interacción patógeno-huésped.
En general, dada la existencia de fenómenos
exquisitos de regulación de las respuestas in­
munes, luego de la infección con un patógeno
extracelular, se ponen en m archa en form a
prioritaria los procesos de inmunidad humoral
y/o de citotoxicidad directa por linfocitos T; la
inmunidad mediada por macrófagos activados
sólo se hace preponderante en las infecciones
crónicas y, sobre todo, en las producidas por
patógenos intracelulares. Un buen nivel de an­
ticuerpos locales o circulantes es a menudo su­
ficiente para im pedir la entrada de un agente o
su diseminación, pero para la eliminación de
patógenos intracelulares obligados o la conten­
ción de aquellos con capacidad de eludir la li­
sis en los fagocitos, uno u otro tipo de inm uni­
dad m ediada por células es a menudo indis­
pensable. Esta im plica casi siempre un cierto
grado de lesión, que puede llegar a veces a ser
más importante que la lesión directa producida
por el invasor.
Historia
La historia de la inmunidad mediada por cé­
lulas comenzó en 1891, con las observaciones
de Koch, sobre la diferencia en la respuesta a
la inoculación cutánea de bacilos virulentos de
la tuberculosis en cobayos sanos o previamen­
te infectados con el mismo bacilo. Comprobó
que, en los animales sanos, a las tres semanas
de la inoculación aparecía una ulceración, se­
guida de adenopatía satélite y de generaliza­
ción de la infección; por el contrario, en los
animales previamente infectados, la reinocula­
ción provocaba la formación acelerada de esa
ulceración, con necrosis y eliminación de! teji­
do neerosado, pero sin adenopatía satélite y sin
generalización de la reinfección. En 1906, von
Pirket estudió las reacciones locales en cone­
jos inyectados con turberculina, pero recién
Jans Zinssen, en 1921, pudo distinguir entre
las reacciones de tipo anafilaxia hum oral de
las provocadas por la tuberculina. Según Zins­
297
sen “en cobayos hay dos tipos de reacciones
intradérm icas fundam entalm ente diferentes.
Una es inm ediata y transitoria, y aparece en
animales sensibilizados contra proteínas; pue­
de clasificarse como una manifestación de hi­
persensibilidad proteica general, o anafilaxis.
La otra es del tipo de la reacción cutánea con­
tra la tuberculina, que se desarrolla despacio,
lleva a una mayor injuria de los tejidos y es in­
dependiente de la anafilaxis” .
En 1932, Dienes y Mallory demostraron que
la hipersensibilidad tardía puede hacerse evi­
dente poco después de la inmunización, antes
de la aparición de anticuerpos circulantes, y
que no puede ser transmitida pasivamente por
suero; hicieron también una descripción histo­
lógica de la reacción cutánea tardía. En 1948
Raffel y, en 1956, Freund describieron la im­
portancia del uso de adyuvantes en la in d u c­
ción de hipersensibilidad tardía.
H asta ese momento, la hipersensibilidad tar­
día tenía una posición poco clara en la inm uno­
logía. No parecía ser una reacción claramente
protectora, sino sólo un fenómeno inflamatorio,
indoloro, observable en la piel en el lugar de la
inyección de un antígeno hacia el cual el hués­
ped estab a previam ente sensibilizado. C on­
tribuía a la confusión la dificultad para obtener
reacciones puras de inmunidad mediada p o r cé­
lulas, sin la aparición simultánea de anafilaxia
o de reacciones tipo Arthus. La ausencia de an­
ticuerpos circulantes no sólo hacía dudar de la
naturaleza inmune del fenómeno, sino que ade­
más impedía su análisis, hasta que Lansteiner y
Chase lograron, con gran sorpresa de la com u­
nidad científica de entonces, transferir hiper­
sensibilidad tardía con células provenientes de
ganglio o exudado peritoneal de animales sen­
sibilizados. Este descubrimiento hizo posible la
separación de ¡as respuestas inmunes mediadas
por anticuerpos de las mediadas por células y
permitió que comenzase el análisis in vivo de
éstas. La técnica de transferencia celular fue
muy usada para el estudio de los rechazos de
injertos, de enfermedades autoinmunes, de la
inmunidad en infecciones y tumores, y para el
conocimiento de las células responsables y el
mecanism o íntimo de la reacción. Se definió
así a la hipersensibilidad tardía como una reac­
ción inflamatoria, que aparece sólo en sujetos
presensibilizados, que tarda 24 hs o más en de­
sarrollarse luego de la reestimulación local con
el antígeno, que tiene un aspecto histológico
caracterizado por infiltrado celular m ononu­
clear, que no necesita de la presencia de anti­
cuerpos para hacerse patente y que no es trans-
ferible por suero pero sí por células linfoides
viables. Gells y Coombs, en su sistematización
de las alergias. Ja denominaron hipersensibili­
dad de tipo IV.
298 Aspectos básicos de la Inmunidad
Para conocer los mecanismos de esta reac­
ción contribuyeron mucho los trabajos de Da-
vies y de Bloom y Benet, que demostraron que
los linfocitos T presensibilizados, en presencia
del antígeno específico, producen y liberan al
medio factores capaces de actuar sobre otras
células en forma inespecífica, dando como re­
sultado reacciones típicas de hipersensibilidad
tardía. Luego se estudiaron estos factores, a los
que se llamó linfoquinas, y se determinó que
son producidos por una subpoblación funcio­
nal de células T presensibilizadas, a las que se
llamó T inductoras, o se determinó
que el principal mecanismo efector de la hiper­
sensibilidad tardía es la producción de factores
capaces de reclutar y activar macrófagos, con
aumento de su capacidad lítica.
Durante todo este período se fue descubrien­
do que las reacciones m ediadas por células
pueden intervenir en la defensa de los organis­
mos pero que, además de los fenómenos del ti­
po de la hipersensibilidad tardía, existían otras
reacciones mediadas por leucocitos que, con o
sin la intervención de los anticuerpos y por di­
ferentes mecanismos, pueden llevar a la lisis
de células u organism os propios o extraños.
Estos m ecanism os celulares citotóxicos son
analizados en el capítulo 21.
A demás, tam bién se fue dem ostrando que
en la colaboración celular intervenían células,
las llamadas T colaboradores o Th, que no p o ­
dían ser distin g u id as p o r sus antíg en o s de
membrana de las inductoras de la hipersensibi­
lidad tardía, pues ambas son CD4+, por lo que
se llamó a esta población linfocitos T colabo­
radores/inductores. Se demostró que en la co­
laboración también intervienen factores, y que
algunos de ellos son comunes en muchas reac­
ciones inmunes. Por fin, se pudo determ inar
que dentro de la población CD4'" ya sensibili­
zada pueden distinguirse dos fenotipos funcio­
nales, los Th2, cuyos factores actúan principal­
mente en la colaboración con los linfocitos B,
y los Thl cuyos factores actúan principalmen­
te en el reclutamiento y activación de macrófa­
gos.
A ctualm ente, el aislam iento de genes que
codifican para estos factores (que incluyen las
llamadas interleuquinas, linfoquinas, monoqui­
nas, etc.) ha permitido conocer mejor su fun­
ción, pues se han podido aislar en pureza para
estudiar su acción in vivo e in vitro sobre pó-
blaciones celulares. Además su efecto biológi­
co in vivo se está conociendo mediante el estu­
dio de ratones transfectados y “knock out”, a
los que se ha agregado o eliminado, respecti­
vamente, uno de dichos genes. Todo esto está
llevando a comenzar a comprender la intrinca­
da red de factores regulatorios de la función
ASPECTO MORFOLÓGICO
DE LAS REACCIONES MEDIADAS
POR LINFOCITOS TIPO Thl
Respuesta cutánea. Hipersensibilidad
de tipo IV
La característica común y principal de las
reacciones inmunes mediadas por los linfocitos
de fenotipo T hl es la presencia de linfocitos y
de macrófagos activados en la zona de depósito
del antígeno. El fenómeno puede adoptar dife­
rentes aspectos morfológicos según el órgano
donde se desarrolla o las características del an­
tígeno. La forma más común de observarlo es
mediante la inyección intradérmica de antíge­
nos proteicos.
Como ya se mencionó, la primera reacción
conocida de inm unidad celular fue la clásica
reacción de hipersensibilidad tardía o retardada,
que puede ser inducida en la piel de individuos
presensibilizados y es fácilmente distinguible
de otras reacciones cutáneas (cuadro 16-1).
M acroscópicam ente se caracteriza por una
induración indolora, acompañada o no de erite­
ma: es una reacción “que se toca más que se
ve” . La induración, común en todas las espe­
cies, se debe mucho al infiltrado celular y poco
a la hiperemia y el edema. Microscópicamente,
este infiltrado está constituido por linfocitos
pequeños y monocitos, pero, por sobre todo,
está acom pañado por m acrófagos activados.
Estos infiltran la dermis superficial y profunda
y hasta el panículo adiposo, y persisten después
de desaparecido el edema o eritema.
Es común que las reacciones sean mixtas y
estén acompañadas de cierto grado de reacción
de Arthus. Esta es provocada por la formación
local de complejos inmunes y su deposición a
lo largo de las paredes vasculares y está carac­
terizada por desarrollo temprano (2 a 4 horas),
presencia de hemorragia por daño vascular e
infiltrado neutrofílico. La reacción de Arthus
Cuadro 16-1. Características de las reaccio­
nes inmunes en piel
Reacción Tiem po H istología M ecanism os
H ip e rs e n s i­ 2 4 -4 8 hs In filtra d o d e L in fo c ito s T ->
b ilid a d ta r­ m a c ró fa g o s y lin fo q u in a s ->
d ía alg u n o s lin f o ­ m a c ró fa g o s
c ito s
Arthu.s 2a4hs In filtra d o d e C o m p le jo s
n e u tró filo s A g -A c -C >
p o lim o rf o ­
n u c le a re s
A n a fila x ia P o c o s m i­ E d e m a , m u y Ig E -> m a s to c i­
n u to s p o c a s c é lu la s to s
 Hipersensibilidad tardía y otras reacciones de inmunidad
requiere la inyección de cantidades relativa­
mente grandes de antígeno en la piel; si se re­
duce su cantidad, se puede minimizar ese com ­
ponente sin que desaparezca la reacción de hi­
persensibilidad tardía.
La h ip ersen sib ilid ad tard ía cutánea, muy
evidente en el hombre, puede ser más o menos
fácil de ver en diferentes especies de animales
de laboratorio o domésticos. Así, en los coba­
yos es muy evidente, mientras que en los rato­
nes es poco notable y para medirla se usa la in­
yección en la almohadilla plantar o en la oreja.
En los grandes anim ales dom ésticos, deben
elegirse sitios de piel fina o transparente, como
los pliegues de alrededor del rabo, m ientras
que en especies domésticas pequeñas es muy
difícil de identificar, por lo tardío de su apari-
• ción y el rascado que provoca la inyección,
con la consecuente inflamación secundaria que
induce. En todas las especies, la infiltración
celular mononuclear da el diagnóstico de cer­
teza.
También pueden provocarse reacciones de
hipersensibiUdad de tipo IV en otros órganos,
como córnea, vejiga, mucosas u órganos sóli­
dos, y en todos tienen características sem ejan­
tes a las descritas, es decir, la infiltración con
células m ononucleares y la aparición de m a­
crófagos activados.
Si bien la gran m ayoría de las reacciones
alérgicas cutáneas son debidas a otros m eca­
nismos de hipersensibilidad, algunos haptenos,
capaces de penetrar a través de la piel y unirse
a una proteína propia que le sirve de “carrier”
o soporte, inducen hipersensibilidad de tipo
IV. Entre dichos alergenos se cuentan sustan­
cias inorgánicas, como detergentes, derivados
del petróleo, colorantes, sustancias usadas en
cosmética, dinitro o trinitrofenoles, y también
de origen biológico, como un hapteno de la sa­
liva de la pulga y toxinas de ciertas plantas,
entre las cuales la más conocida es ia hiedra
p o nzoñosa (poison ivy), m aleza com iin en
América del Norte. Este tipo de alergias p re­
sentan características clínicas diferentes de !a
alergia mediada por IgE, son generalmente de
difícil tratam iento y configuran el cuadro de
las dermatitis por contacto.
Reacciones producidas por inyección
endovenosa del antígeno
Si a un animal con manifestaciones de hi­
persensibilidad tardía se le inyecta el antígeno
en form a endovenosa, se le induce una reac­
ción sistémica, que puede ser grave, y cuyas
manifestaciones incluyen fiebre, m sh cutáneo,
m onocitopenia y producción de proteínas de
fase aguda. Estas m anifestaciones son la ex­
presión de la liberación sistémica de factores
299
de los linfocitos tipo T h l, que inducen la sali­
da de los monocitos de la sangre y la activa­
ción generalizada de los macrófagos. A su vez,
éstos liberan también nuevos factores, capaces
de inducir fiebre, síntesis de proteínas de fase
aguda, caquexia, etcétera.
Reacciones producidas
por m icroorganism os patógenos:
inflamación crónica
Cuando el antígeno no es una sustancia que
penetra en pequeña cantidad por la piel sino
que es un patógeno que forma un foco infec­
cioso local, la reacción mediada por linfocitos
tipo T h l conduce a la formación del granulo­
ma típico de la inflam ación crónica. É ste se
caracteriza por la presencia de gran núm ero de
macrófagos, con o sin bacterias fagocitadas en
su interior, que adhieren íntimamente entre sí
hasta adoptar el aspecto típico de célula epite-
lioide y que pueden llegar a fusionarse entre
ellos formando células gigantes multinuclea-
res. En el interior del granuloma puede apre­
ciarse necrosis en distintos grados, que puede
progresar hasta la ulceración o la formación de
caseum.
E ste granulom a ya fue descrito por Koch,
que remarcó tanto la necesidad de presensibili-
zación para su formación como su importancia
en la protección del animal: si bien la reacción
produce gran daño tisular, el animal inm une
puede circunscribir la infección y así frenar la
progresión de la enfermedad. El mecanism o de
esta protección fue estudiado por los grupos de
Lurie y MacKaness, quienes demostraron que
la diferencia entre los fagocitos de anim ales
sensibilizados y no sensibilizados es q u e los
prim eros pueden lisar este tipo de bacterias
que escapa al ataque lítico, mientras, q ue, en
los fagocitos de los animales del segundo gru­
po, las bacterias no sólo sobreviven, sino que
hasta se replican y aprovechan a los m acrófa­
gos para migrar desde el foco de entrada e in­
vadir otras regiones del organismo.
Estudios posteriores dem ostraron q u e los
m ecanism os que activan a los m acrófagos,
con aum ento de su capacidad lítica, son los
mismos que se ponen en juego en la hipersen­
sibilidad tardía y que ambos fenóm enos son
m anifestaciones de una sola función. Se en­
tiende ahora que esta respuesta inmune es una
form a de protección mediada por los linfoci­
tos de tipo T h l y los factores que producen,
que reclutan y activan macrófagos en el sitio
de interacción entre el antígeno y los linfoci­
tos presensibilizados y que, si bien es sum^a-
m ente importante en la defensa contra patóge­
nos intracelulares, tiene como consecuencia
lesiones tisulares.
300 Aspectos básicos de la inmunidad
ACTIVACIÓN DE LOS MACRÓFAGOS
Cambios en el sistema inmune durante
la inducción de una respuesta celular
La fase inductiva de la inmunidad mediada
por células implica una serie de cambios en el
sistema inmune, que toman por lo menos 4 días
en desarrollarse; en general, pasan 9 a 12 días
desde el primer contacto con el antígeno hasta
que pueda apreciarse una típica reacción de hi­
persensibilidad tardía. Durante este tiempo, los
linfocitos Th vírgenes, preefectores, se conyier-
ten en hnfocitos sensibilizados tipo T hl, efecto-
res. Esto, igual que para una reacción de tipo hu­
moral, sucede en los órganos secundarios, parti­
cularmente en el ganglio que drena el sitio de
penetración del antígeno, el cual generalmente
queda retenido en ellos. Microscópicamente, en
sus zonas timodependientes, o sea la zona pai-a-
cortical de los ganglios o el manguito que rodea
a las arteriolas de la pulpa blanca, se aprecia una
mayor celularidad con aparición de células gran­
des de tipo linfoblástico. Este crecimiento en nú­
mero y tamaño de las células refleja el atrapa­
miento y la estimulación de los linfocitos T pre­
determinados pai'a reconocer a ese antígeno que
ha quedado atrapado en el ganglio; los que lo re­
conocen quedan retenidos, proliferan, y se pro­
duce en ellos la maduración a efectores T h l. Es­
tos hnfocitos así modificados salen luego del ór­
gano secundario, recirculan por todo el organis­
mo y serán capaces de producir una reacción lo­
cal en cadena dondequiera que se encuentren
nuevamente con el antígeno.
Estados fisiológicos de los macrófagos
Si bien los macrófagos son células que siem­
pre tienen capacidad fag o cítica y lítica, no
siempre están en el mismo estado de actividad
y podemos distinguir por lo menos tres grados,
a saber:
1) M acrófagos en reposo. Los m onocitos
migran de la sangre y se instalan en los tejidos,
donde se transforman en macrófagos o en otras
células de la línea m onocito/m acrófago. En
condiciones normales, estos macrófagos tisula­
res residentes están en reposo y su actividad se
expresa sólo por su movilidad ameboide y su
migración a través de lo tejidos.
2) Macrófagos estimulados. Si durante dicha
migración chocan con una partícula y la fagoci-
tan, se estimulan; este estímulo contribuye a la
lisis de la partícula ingerida y a una mejor pre­
sentación antigénica. En estas con d icio n es
muestran un aumento de la actividad ameboide,
lo que aumenta su capacidad fagocítica, se pro­
duce la unión de los gránulos preformados al
fagosoma, al que convierten en fagolisosoma, y
hay un estallido respiratorio, que contribuye a
la lisis de las bacterias ingeridas. Además, hay
un aumento de la expresión de m oléculas de
histocompatibihdad y de varios receptores su­
perficiales, que permitirán una mejor presenta­
ción de los antígenos a los hnfocitos T CD4+, y
hay síntesis y secreción de factores, especial­
mente IL l, que contribuyen a la iniciación de
la respuesta inmune.
3) M acrófagos activados. Si el m acrófago
recibe la influencia de las linfoquinas produci­
das por los linfocitos de fenotipo T h l, haya o
no haya preingerido una partícula, se activa.
Esta activación se traduce en varios cambios.
Hay, fundamentalmente, una disminución de su
m ovilidad y capacidad de traslación (la muy
estudiada inhibición de la migración de los ma­
crófagos), y un gran aumento de su capacidad
lítica, dado por la producción de NO. La capa­
cidad lítica se manifiesta no sólo sobre las bac­
terias ingeridas, sino que puede hacerse exter­
namente, con liberación de enzimas y NO al
exterior del macrófago, y lleva a la destrucción
de células propias normales, los famosos “testi­
gos inocentes” de la reacción, y a la necrosis
local. Por último, los macrófagos activados, in­
movilizados en el sitio, tienden a unirse entre
ellos formando las células multinucleadas de
Langerhans, típicas de la inflamación crónica.
Activación de los macrófagos
Como ya se mencionó, la hipersensibilidad
tardía y los fenómenos de inmunidad protectiva
mediada por células, obedecen a esta activa­
ción de los macrófagos, pero los mecanismos
que llevan a esta activación fueron difíciles de
conocer.
La técnica de transferencias celulares posibi­
litó que se los comenzara a estudiar, pues se
demostró que los linfocitos B son totalmente
incapaces de transferir la reacción, m ientras
que sí la transfieren los T y, entre éstos, los
TCD4+. Los experim entos con transferencias
mostraron también que las células que se acu­
mulan en el lugar de inyección del antígeno
son, en su mayoría, originarias del huésped y
producto de una división recicnte; es decir,
unas pocas células presensibilizadas son capa­
ces de reclutar células no sensibilizadas e indu­
cir en ellas mitosis. En algún momento se pos­
tuló la existencia de un factor de transferencia,
obtenido a partir de lisados de linfocitos de un
individuo sensibilizado, pero su real existencia
no pudo ser confirmada. En cambio, se demos­
tró en ratones, que debía haber identidad gené­
tica en los antígenos de histocompatibilidad del
dador y el receptor para obtener una transferen­
cia efectiva.
 Hipersensibilidad tardía y otras reacciones de inmunidad
La definición de los mecanismos de inmuni­
dad mediada por células se logró mediante es­
tudios in vitro. En efecto, primero se demostró
que los linfocitos de un individuo presensibili-
zado se desdiferencian y entran en mitosis al
ser cultivados en presencia de antígenos. Luego
se vio que la adición de antígeno a los macrófa­
gos peritoneales o los leucocitos periféricos de
individuos presensibilizados, empacados en un
capilar y cultivados en una cámara, inhiben la
migración espontánea de dichas células hacia
la periferia de la cámara de cultivo. Esta técni­
ca, la llamada de inhibición de la migración de
los macrófagos, se usó durante bastante tiempo
como diagnóstico de inm unidad mediada por
células, pues se correlaciona muy bien con fe­
nómenos de hipersensibilidad tai'día pero, ade­
más, perm itió que se com enzaran a conocer
muchos de los m ecanism os de las respuestas
inmunes pues sirvió para demostrar que los lin­
focitos T producen y secretan al medio factores
inespecíficos capaces de actuar sobre otras cé­
lulas. En efecto, se demostró que el sobrena­
dante de linfocitos sensibilizados, en contacto
con el antígeno específico, también inhibe la
migración de los macrófagos normales, aun en
ausencia de antígeno. Al factor capaz de produ­
cir esta inhibición se lo llamó MIE (de “macro-
phage migration inhibiting factor”).
A partir de estas observaciones se comenza­
ron a estudiar los efectos demostrables tanto in
vitro como in vivo de los sobrenadantes de lin­
focitos estimulados, pues se comprobó que la
inyección intradérmica de estos sobrenadantes
puede inducir una reacción inflamatoria prácti­
camente idéntica a la de la hipersensibilidad
tardía, sólo que de aparición más precoz. Se
definieron así las linfoquinas y se comprendió
entonces que la hipersensibilidad tardía y los
fenómenos de protección contra patógenos in­
tracelulares tienen dos componentes: uno espe-
cífíco, dado por la interacción entre un linfoci­
to presensibilizado y un antígeno presentado
por un macrófago, y esto induce la producción
de linfoquinas; el otro componente es ine.specí-
fico y está dado por el reclutamiento y la acti­
vación local de los macrófagos, lo que produce
el fenómeno inflamatorio y lítico.
Luego de la descripción del MIE, se siguie­
ron estudiando, casi siem pre in vitro, otros
efectos demostrables en los sobrenadantes de
linfocitos estimulados y se definieron otras lin­
foquinas, a las que se dio nom bre según su
efecto, Se describieron así una serie de factores
reclutadores y mitogénicos para diferentes ti­
pos celulares, factores inhibidores de la mito-
sis, el interferón y (IFNy), que es un importante
mediador inmunógeno, el factor de necrosis tu­
moral (TNF), capaz de disminuir el crecimien­
to de tumores in vitro y de provocar caquexia
301
in vivo, y un cúmulo tal de factores mitogéni­
cos y quimiotácticos para los leucocitos y con
efectos sobre otras células y tejidos no hnfoi-
des, que hizo casi imposible la mera enumera­
ción de todos. Lamentablemente, los factores
fueron estudiados por diferentes grupos de tra­
bajo, que usaron métodos y poblaciones celula­
res distintos, y muchas veces se comprobó des­
pués que varios efectos eran producidos por un
solo factor, o viceversa, que un efecto podía ser
producido por la suma de varios factores. M ás
o menos por ese mismo tiempo, se comenzaron
a analizar los factores que intervienen en la co­
laboración celular para las respuestas hum ora­
les y celulares, a los que se llamó interleuqui­
nas, y se demostró que éstas pueden tener gran­
des similitudes con algunas de las linfoquinas
e, incluso, ser idénticas a ellas (véase cap. 12).
Pese a que la nom en clatu ra sigue sien d o
confusa, actualmente no se admite como in ter­
leuquina ni como factor de activación de ma-
crofagos o de colaboración celular, a ninguno
cuyo gen no se haya aislado y transfectado a
una célula productora, y pueda así ser obtenido
en pureza. Una de las ironías de este rigor cien­
tífico es que el MIE, el primer factor inespecífi-
co producido por hnfocitos T específicos, no
ha podido ser aislado y ya no se admite que
exista como tal, sino que la inhibición de la m i­
gración de los macrófagos se debe a la activa­
ción de esas células.
En resumen, actualmente se entiende que las
reacciones de hipersensibilidad tardía y de la
llamada inmunidad mediada por células, están
mediadas por linfocitos de tipo T h l, es decir,
linfocitos TCD4+ presensibilizados por el antí­
geno que, al ser reestimulados por éste, produ­
cen factores capaces de reclutar y estim ular
otros linfocitos, atraer monocitos y m acrófa­
gos, y activar a éstos aumentando su capacidad
lítica.
Los principales factores producidos por los
linfocitos T hl estimulados, como se indica en
el capítulo 18, son el INFy, el TNEp y las IL2,
IL3, IL6, ILl O y IL l 2, cuyas estructuras y p rin ­
cipales funciones son analizadas en otros capí­
tulos. D e éstos, el principal activador de los
macrófagos parece ser el INEy, mientras que
TNFp tiene efectos citolíticos directos y efec­
tos caquectizantes a distancia.
Sin embargo, debe tenerse en cuenta que es­
tos mismos factores, o por lo menos algunos de
ellos o con efectos muy pai'ecidos, pueden ser
producidos por otras células, muy especialmen­
te por los mismos macrófagos activados, que
secretan grandes cantidades de IL6 y T N F a, los
linfocitos T citotóxicos CD8“^ y las células NK,
que secretan INFy e IL2. A su vez, éstos no tie­
nen efecto sólo sobre los macrófagos sino tam ­
bién sobre las células citotóxicas. Se comprende
302 Aspectos básicos de la Inmunidad
entonces que ambas ramas de la inmunidad me­
diada por células, la activación de los macrófa­
gos y la citotoxicidad celular, pueden estar ínti­
mamente ligadas y la citotoxicidad ejercida por
los macrófagos activados puede verse aumenta­
da por la ejercida por los linfocitos T CD8^' y
las células NK, y viceversa. Si tenem os en
cuenta que los linfocitos CD4+ también pueden
ejercer funciones citotóxicas directas, compren­
deremos una vez más que las diferentes formas
que adopta la respuesta inmune efectora están
íntimamente ligadas entre sí.
Finalmente, si se recuerda que la diferencia­
ción de los linfocitos TCD4+ hacia los fenoti­
pos T hl o Th2 está influida por los factores
presentes en el medio en el momento de su sen­
sibilización, se comprenderá que una reacción
que comienza con la estimulación de células ci­
totóxicas pueda llevar a la modulación del sis­
tema inmune hacia una respuesta de activación
de macrófagos.
IMPORTANCIA FISIOLÓGICA DE LA
INM UNIDAD M EDIADA P O R C ÉLU LA S
Durante mucho tiempo se discutió cuál era el
papel que le cabía a la inmunidad humoral y
celular en la defensa co ntra los patógenos:
M etehnikoff propuso que las bacterias eran
destruidas por los fagocitos, mientras que Ehr-
lich y Bordet mostraban la capacidad defensiva
de los anticuerpos humorales. En realidad, am­
bas propuestas son correctas y ambos sistemas,
el humoral y el celular, actúan en forma com ­
plementaria: prácticamente, no existen reaccio­
nes puras de ninguno de ellos. Pero si bien los
anticuerpos pueden, por sí mismos o en colabo­
ración con sistemas inespecíficos (complemen­
to, fagocitosis, etc), eliminar muchos patóge­
nos extracelulares, no llegan al interior de las
células propias que puedan albergar patógenos
intracelulares. Además, existen otras bacterias
y parásitos que, como se mencionó antes, han
desarrollado durante su evolución la capacidad
de eludir los mecanismos líticos de los fagoci­
tos y sólo los m acrófagos activados pueden
matarlos o, por lo menos, circunscribir su loca­
lización. Entre estos patógenos, considerados
como intracelulares optativos, pueden mencio­
narse varias familias de bacterias (Salmonellae,
Listeria monocytogenes, Brucellae, Mycobac-
teriae), hongos (Candida, Criptococcus, H isto­
plasma, Coccidiodes) y a casi todos los parási­
tos protozoarios (Tripanosomae, Plasmodiae,
Toxoplasma, Leishmaniae, etc). En la infección
por alguno de estos patógenos, la defensa está
basada en la acumulación de linfocitos T sensi­
bilizados y macrófagos activados en ei sitio de
infección.
Para la eliminación de los virus en su etapa
intracelular u otros patógenos intracelulares '
obligados, los linfocitos T citotóxicos CD8+,
que reconocen células propias parasitadas por
virus, tienen un papel fundamental en la elimi­
nación del invasor. La puesta en marcha de este
mecanismo, como ya mencionamos, está ínti­
mamente relacionada con los linfocitos ThL
Por todo esto, se comprende por qué un indi­
viduo con un sistema T deficiente es extrema­
damente sensible a infecciones virales, parasi­
tarias o por microorganismos intracelulares op­
tativos, mientras que puede defenderse relati­
vamente bien contra bacterias extracelulares.
Los mecanismos de defensa contra los diferen­
tes patógenos son analizados en detalle en los
capítulos 24, 25, 26 y 27.
La inmunidad celular en el rechazo
de injertos y tumores
Históricam ente hablando, uno de los datos
que primero contribuyó a la determinación de
la dualidad T-B del sistem a inm une fu e la
com probación cte que los anim ales genética­
mente atfmicos aceptaban injertos de tumores
xenogeneicos, mientras que pollos bursectomi-
zados los rechazaban. Esto hizo que se atribu­
yera al sistema T la función del rechazo de in­
jertos y, a falta de una función fisiológica fá­
cilmente detectable, la de vigilancia contra los
tumores.
En el rechazo de injertos, inducido por dife­
rencias genéticas en los antígenos de h isto ­
compatibilidad, la función efectora de los lin­
focitos T, tanto CD4+ como CD8+, es de im­
portancia fundam ental. En la defensa contra
los tumores, la función del sistema inmune es­
pecífico no es tan clara. Esto se verá en detalle
en el capítulo 33.
PATOLOGIA DE LA RESPUESTA
INMUNE MEDIADA POR CÉLULAS
Infecciones
Como ya se recalcó varias veces, todos los
procesos mediados por linfocitos T efectores,
tanto si activan macrófagos como si son citotó­
xicos directos, implican un daño tisular más o
menos importante; por eso, cualquier alteración
de su regulación puede traducirse en enferme­
dad.
De hecho, las reacciones norm ales contra
cualquiera de los patógenos intracelulares antes
mencionados se acompaña siempre de una le­
sión tisu lar, que puede ser muy p eq u eñ a o
enorme: una infección tuberculosa puede ter­
minar en un pequeño nódulo calcificado o lie-
 Hipersensibilidad tardía y otras reacciones de inmunidad
gar a una caverna; muchas veces deja cicatrices
indelebles.
En otros casos, como en ciertas enfermeda­
des virales, el agente no es muy citopatogénico
p er se, pero la reacción celular puede llevar a
daños tisulares irreversibles. Las lesiones cutá­
neas, propias de la varicela y el sarampión, se
atribuyen en general a reacciones de tipo hiper­
sensibilidad retardada sistémica y en el herpes
simple las lesiones se deben a linfocitos T cito-
tóxicos. En ciertas hepatitis el daño hepático
irreversible puede deberse también a los linfo­
citos T citotóxicos.
Dermatitis de contacto
Además de estas consecuencias de una res­
puesta de protección contra agentes patógenos,
la inmunidad mediada por células puede cons­
tituirse en una verdadera alergia y dar el cuadro
de dermatitis de contacto, que es una reacción
de hipersensibilidad tardía o de tipo IV. Como
en todos los casos de hipersensibilidades o
alergias, existe una enorme variación indivi­
dual, tanto en el establecimiento o no de hiper­
sensibilidad contra distintos antígenos, como
en la magnitud de las reacciones, pero, en ge­
neral, si los antígenos penetran por vía intra­
dérmica se favorece la aparición de este tipo de
respuestas m ientras que, si penetran por vía
oral, se favorece una tolerancia a nivel de reac­
ciones celulares.
Como se mencionó antes, ciertos haptenos
pueden unirse a proteínas propias y desencade­
nar hipersensibilidad de contacto. Estos p ro ­
ductos quím icos pueden presentar problemas
propios de la medicina laboral; además de los
picrilos y los benzenos ya mencionados, ciertos
compuestos de cromo, níquel y berilio liberan
iones de estos metales que, unidos a las proteí­
nas propias, forman neoantígenos capaces de
sensibilizar el sistem a inmune. En las indus­
trias que utilizan estos compuestos, los obreros
que los manipulan sin las debidas precauciones
pueden sensibilizarse y presentar problem as
cutáneos. Es más, hay sustancias como el as­
besto cuya inhalación, luego de la sensibiliza­
ción, puede llevar a daños irreversibles en el
pulmón, siempre por el mismo mecanismo in­
mune.
Otros productos químicos de uso domicilia­
rio, como la p-fenilen diamina, presente en los
colorantes para el cabello, y otros compuestos
presentes en detergentes y cosméticos, también
pueden producir reacciones semejantes. Algu­
nos de estos haptenos se encuentran en la natu­
raleza, en la saliva de insectos hematófagos,
muy especialm ente las pulgas, o en ciertas
plantas, y pueden dai‘ lugar a reacciones de tipo
hipersensibilidad tardía que desemboca en una
303
dermatitis de contacto, tanto en el hombre co ­
mo en los animales domésticos.
En todos estos casos, la desensibihzación es
difícil, pues no se logra mediante la inyección
repetida del antígeno como sucede en la hiper­
sensibilidad de tipo I, y el tratamiento se hace a
base de corticoides y, en lo posible, por la eli­
minación del contacto con el antígeno. Un m é­
todo preventivo sería la inducción de tolerancia
mediante la administración oral del antígeno.
Algunas de los compuestos químicos sintéti­
cos mencionados, como el dinitro o trinitro clo-
robenzeno y el cloruro de picrilo, inducen h i­
persensibilidad tardía en casi todos los indivi­
duos; por eso han sido muy utilizados, tanto
para la investigación básica de la inm unidad
celular, como en la clínica, para estudiar la ca­
pacidad de un paciente para iniciar respuestas
inmunes mediadas por células.
La inmunidad mediada por células es a m e­
nudo un componente importante de las en fer­
medades autoinmunes, muy especialm ente en
aquellas provocadas por la liberación de los lla­
mados antígenos secuestrados (sistema nervio­
so central, testículos, glándulas endocrinas); es­
tas enfermedades se verán en detalle en el capí­
tulo 28.
CONSIDERACIONES FINALES
En resumen, puede decirse que, en un orga­
nismo con un sistema inmune normal y en re­
poso, es decir, en una actividad organizada y
regulada preexistente, producida por el recono­
cimiento constante de lo propio, más las m odi­
ficaciones que puedan haber causado a esta ac­
tividad otros estímulos antigénieos anteriores,
la en trada y reconocim iento de un antígeno
provoca una nueva respuesta, que se traducirá
en una alteración de dicho equilibrio. La res­
puesta se inicia por la estimulación de los lin­
focitos T preefectores y, según la forma en que
se haya presentado el antígeno y otra serie de
circunstancias, puede dar como resultado su di­
ferenciación hacia efectores de tipo Th2 o T h l,
o bien citotóxicos. Los prim eros dirigirán la
respuesta hacia la estimulación de los linfocitos
B, con síntesis de anticuerpos específicos, que
apuntarán hacia el antígeno otros mecanismos
efectores humorales o celulares; activación de
las cascadas del complemento, la coagulación y
las quininas, opsonización, citotoxicidad celu­
lar anticuerpo dependiente, etc. Este tip o de
reacción produce inflamación aguda con sus tí­
picos signos; tumor, rubor, dolor y calor.
La d iferenciación hacia efectores de tipo
T hl dirige la respuesta hacia la estimulación de
mecanismos celulares efectores no dependien­
tes de anticuerpos, principalmente la activación
304 Aspectos básicos de la inmunidad
de los macrófagos. Este tipo de reacción produ­
ce inflamación crónica y es generalmente más
lesiva para los órganos y tejidos propios.
Si bien ambos tipos de reacciones tienden a
autoperpetuarse por la regulación cruzada que
existe entre los linfocitos T h l y Th2, es muy
raro encontrar en la naturaleza respuestas puras
de uno u otro tipo. Además, tanto en la induc­
ción de ambas como en los sistemas efectores
finales, hay factores y mecanismos que son co­
munes, de manera que es imposible hablar de
una respuesta mediada exclusivamente por cé­
lulas o por anticuerpos.
Sin embargo, es im portante el concepto de
que una de las formas en que puede desembo­
car una reacción inmune específica es en la ac­
tivación de los macrófagos inespecíficos y que
esta activación, si bien es peligrosa o directa­
mente lesiva, es también esencial para la defen­
sa contra ciertos patógenos.
APLICACIONES CLÍNICAS
Pruebas para la detección de inmunidad
mediada por células
Pruebas in vivo
Desde un punto de vista práctico se utilizan
las reacciones cutáneas de hipersensibilidad de
tipo IV para conocer si un paciente está o no
sensibilizado hacia un antígeno dado y para co­
nocer su capacidad para m ontar este tipo de
respuestas.
Una de las pruebas más comunes, aún usada,
es la reacción de Mantoux, que se lleva a cabo
mediante la inyección de derivado proteico pu­
rificado (PPD) de bacilos tuberculosos: en este
caso, la presencia de reacciones positivas no
indica enfermedad, sino un contacto previo con
el bacilo y la capacidad del individuo para
reaccionar contra él mediante la activación de
macrófagos que, como ya se vio, tienen un pa­
pel fundam ental contra este patógeno. De la
misma manera, la ausencia de reacción positiva
no indica ausencia de enferm edad, sino que
puede ser de muy mal pronóstico en un indivi­
duo infectado pues indica anergia, es decir in­
capacidad de montar respuestas celulares con­
tra esta enfermedad.
Para la exploración de la capacidad del siste­
ma inm une de un individuo se han utilizado
dos tipos de antígenos: a) los de memoria, co­
munes en la naturaleza, para los cuales la m a­
yoría de los individuos de la región están pre­
sensibilizados, como la misma PPD, o antíge­
nos del sarampión, varicela, micóticos, estrep-
toquinasa-estreptodornasa, etc. y b) antígenos
sintéticos, como el dinitroclorobenzeno, para
los cuáles primero se sensibiliza al paciente y
luego se aplica una segunda dosis para medir la
reacción. La positividad de la reacción contra
los primeros indica que hay una conservación
de la memoria del sistema inmune. La presen­
cia de reacciones contra los segundos, indica
que hay capacidad en el sistema inmune para
activarse contra antígenos nuevos: ésta última
es la que se pierde primero en las inmunodefi­
ciencias adquiridas.
Actualmente, estas pruebas in vivo, que son
bastante desagradables para el paciente, son
reem plazadas por pruebas in vitro y por la
identificación y cuantificación de subpoblacio­
nes linfoides.
Pruebas in vitro
Una de las primeras pruebas utilizada para
medir las respuestas inmunes mediadas por cé­
lulas fue la reacción b lasto-m itogénica que
muestran los linfocitos en cultivo, cuando son
estimulados in vitro por antígenos específicos o
por mitógenos inespecíficos para los linfocitos
T, como la concanavalina A o la fitohemoaglu-
tinina. En efecto, los linfocitos tipo T hl y los T
citotóxicos al ser estim ulados producen IL2,
que es un poderoso mitógeno para los linfoci­
tos T. La respuesta mitogénica de un individuo
frente a un antígeno específico indica su sensi­
bilización previa. El nivel de respuesta a los
mitógenos inespecífico es índice de la capaci­
dad general del sistema T. Existen varios méto­
dos para medir esta respuesta blastogénica que
son detallados en el capítulo 36.
Otra prueba que fue muy usada como índice
de inmunidad mediada por células, que también
fue de gran utilidad para el estudio de sus meca­
nismos, es la inhibición de la migración de los
macrófagos o de los leucocitos periféricos. Para
ella, las células se empaquetan dentro de un ca­
pilar que se corta por su interfase células/medio
y se coloca en una cámara con medio de culti­
vo. Los macrófagos y leucocitos tienden a salir
del capilar y a migrar por el piso de la cámara,
pero, en presencia de un antígeno para el cual el
individuo estaba previamente sensibihzado, la
migración se inhibe y el área cubierta por célu­
las se hace significativamente menor.
Esta reacción mostró muy buena correlación
con la presencia de hipersensibilidad tardía, pe­
ro es poco confiable y de medición subjetiva.
Actualmente, ha sido reemplazada por la medi­
da de la producción de los factores propios de
los linfocitos T h l, muy particularmente la sín­
tesis de IL2 e IFNy, que pueden detectarse en
los sobrenadantes de cultivos de linfocitos esti­
mulados in vitro mediante sistemas biológicos
o, mejor aún, por prácticos sistema preestan-
darizados.
 Hipersensibilidad tardía y otras reacciones de inmunidad
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El sistema inmune de mucosas
PRIMERA PARTE
MARÍA ESTELA ROUX
INTRODUCCIÓN
La superficie de las mucosas está en contac­
to permanente con el medio ambiente externo e
interno y ha desarrollado una gran cantidad de
mecanismos protectores, tanto inmunológicos
como no inm unológicos, para defenderse de
distintos agentes patógenos (virus, bacterias,
etc.) y de la absorción de antígenos foráneos.
Esta protección específica a nivel de la superfi­
cie de las mucosas se realiza por la existencia
de “inmunidad secretoria”. Este término indica
que existen diferencias con las respuestas in­
munes provocadas por exposición sistémica al
antígeno. Trabajos realizados por distintos gru­
pos de in v e stig ació n han d em o strad o que,
cuando el virus influenza es introducido en el
tracto respiratorio, la respuesta inmune local no
va acompañada de anticuerpos séricos; en cam­
bio, la resistencia a este virus estaba correlacio­
nada con la producción de anticuerpos protec­
tores locales. En muchos casos, los antígenos
actuando localmente son más efectivos en la
producción de estos anticuerpos que la inmuni­
zación por vía parenteral.
Por consiguiente, la producción de anticuer­
pos protectores locales puede ser independiente
de la respuesta de anticuerpos séricos, y cuan­
do se producen conjuntamente la respuesta sis­
témica y la local a nivel de mucosa, la inmuni­
dad producida se relaciona mejor con la res­
puesta secretoria local.
E L SISTEM A DE LA IgA SE C R E TO R IA '
La inm unoglobulina A (IgA) constituye la
clase principal de inmunoglobulina de las se­
creciones. La IgA que se va a transformar en
17
IgA secretoria es sintetizada localmente por cé­
lulas plasmáticas que se encuentran en determi­
nadas glándulas (salival, lacrimal, mamaria) y
en las mucosas que tienen contacto con el me­
dio externo (aunque no está excluida la prove­
niente de los vasos sanguíneos). También debe
recordarse que en ratas se ha demostrado que la
IgA es transportada en la bilis por un mecanis­
mo mediado por componente secretorio, y que
en el hombre existe IgA e IgA secretoria en la
bilis. Esta IgA secretoria tiene características
estru ctu rales y antig én icas m uy esp eciales
(véase cap. 5).
La IgÁ secretoria bajo la form a dim érica
(IgA)^, se une al componente secretorio (CS)
en la membrana de las células epiteliales que
sin te tiz a n este p o lip é p tid o , y el co m p lejo
(IgA)2S formado es transportado a través de las
células epiteliales en vesículas y puesto en li­
bertad a nivel de la superficie apical dentro de
la luz intestinal (fig. 17-1). La existencia de
una molécula especializada de IgA secretoria
explica la resistencia inmunológica específica a
infecciones de mucosas que existen en ausen­
cia de anticuerpo sérico de clase IgA demostra­
ble. Es decir, anticuerpos de clase IgA, contra
una gran variedad de virus, bacterias y otros
agentes como componentes de la dieta, se en­
cuentran en las secreciones locales; la resisten­
cia a ellos correlaciona mejor con este anticuer­
po local que con el anticuerpo circulante.
Estudios recientes de Keith E. M ostov han
demostrado la existencia (estructura y el cami­
no celular) de un receptor de inmunoglobulina
polimérico pIgR (véase cap. 5) que interviene
en el transporte transepitelial de inmunoglobu­
linas (trancistosis) y, muy especialmente, para
la IgA (fig. 17-2). El receptor es sintetizado por
el retículo endoplasm ático (paso 1) y luego
 El sistema inmune de mucosas 307

Luz intestinal

(lgA),S (lgA),S

i
i -Uniones estrechas

-Espacio celular
> ^ C S | V -J interepitelial

Célula
'plasmática
OS: Componente secretorio
G: Golgi
N; Núcleo

U g . 17-1. G eneración y transporte epitelial de la IgA secretoria (IgA -S). La IgA dim érica en la lám ina propia p ro v ie n e de
células plasm áticas locales, no excluyéndose una pequeña contribución sérica. La (IgA )j cruza la m em brana b asal entran­
do en el espacio celular intraepitelial. Los m ecanism os que llevan a la form ación de (IgA )jS podrían ser dos: 1) D en tro de
la célula epitelial, el com ponente secretorio (CS), luego de com pactarse en la zona de G olgi, es segregado dentro d el espa­
cio celular interepitelial y allí se com bina con la (IgA )j para form ar extracelularm ente la IgA secretoria. Esta (Ig A )jS por
pinocitosis (?) entra en la célula epitelial y es secretada en la luz intestinal ya que es m uy difícil q ue atraviese directam ente
las uniones estrechas. 2) E l com ponente secretorio sería un receptor de la m em brana celular. Por consiguiente, la (IgA ) 2S
se ensam blaría en la m em brana plasm ática y, luego de entrar a través de la célula epitelial, llegaría a la luz intestinal.

transportado al aparato de Golgi (paso 2). En la
cisterna trans, llamada red trans-Golgi (TGN),
las proteínas destinadas a la superficie celular
son reconocidas y empaquetadas en vesículas
transportadoras que las llevarán directamente a
la superficie celular apical o basolateral. El
pIgR es liberado en la superficie basolateral
(paso 3) donde puede unirse a la IgA o IgM
(paso 4) y a continuación es endocitado (paso
5). En las proteínas del endosoma, el pIgR es
empaquetado en vesículas transcistóticas (paso
6) y transportado a la superficie celular opues­
ta. Luego de la trancistosis a la superficie celu­
lar apical (paso 7), la porción extracelular del
pIgR unida al ligando es clivada y puesta en li­
bertad (paso 8). El fragmento clivado se deno­
mina componente secretorio (CS) y permanece
unido a la IgA en las secreciones extracelula­
res. El pIgR es llamado, algunas veces, compo­
nente secretorio de membrána.
R ecientem ente se ha dem ostrado que IgA
con' actividad anti-virus Sendai, unida al pIgR
y endocitada en la superficie basolateral puede
neutralizar al virus Sendai que está entrando
por la superficie apical de la célula epitelial.
Este nuevo mecanismo de defensa contra la in­
fección viral, sugiere que la IgA puede usarse
para proteger células que ya han sido infecta­
das. Además, el pIgR puede exportar a través
de las células epiteliales, los complejos inmu­
nes que contienen IgA y, de esta forma, contri­
buir a su remoción del cuerpo.
ORIGEN DE LAS CELULAS QUE
SINTETIZAN INMUNOGLOBULINA DE
CLASE IgA. CICLO CELULAR DE LA IgA
La inmunoglobulina preponderante en las se­
creciones intestinales es la IgA y su prevalen­
cia se refleja en la gran proporción de células
plasm áticas, que se encuentran en la lámina
propia del intestino, que producen IgA con res­
pecto a los otros isotipos.
El modelo general de proliferación con cam­
bio a otro isotipo, maduración y migración de
las células B en el sistema inmune de mucosas,
indica que la proliferación y la predetermina-
308 Aspectos básicos de la inmunidad
UE
h
*
IgA
Fig. 17-2. C am ino intracelular .seguido po r el pIgR (véase explicación en el texto) (A daptada de K. E. M ostov, Annu.
Rev. Im m unol., 12:63, 1994).
ción a la producción de IgA se realiza en los
cúmulos linfoides de los tejidos linfoides aso­
ciados a intestino (TLAI) y de los tejidos lin­
foides asociados a bronquios (TLAB).
Los precursores de las células plasm áticas
productoras de IgA son hallados, en su primer
estadio, en las placas de Peyer, como linfocitos
B provenientes de la médula ósea. Es allí donde
estos precursores se encuentran con los antíge­
nos, que entran desde el intestino a través de cé­
lulas epiteliales especializadas, y donde inician
su síntesis de ADN y expresan IgA pudien­
do, en un segundo estadio, migrar a los ganglios
mesentéricos (vía linfáticos aferentes). En estos
ganglios proliferan y maduran, transformándose
en células blásticas que contienen IgA (a^.;,) y, a
continuación, vía linfáticos eferentes, dejan los
ganglios y migran al intestino delgado. Estos
blastos son transportados desde los ganglios me-
sentéricos por los linfáticos eferentes y la linfa
del conducto torácico en el torrente sanguíneo,
emergiendo así en las distintas mucosas.
Este proceso completo mediante el cual las
células B, que se originaron en las placas de
Peyer, vuelven a la lámina propia del intestino
como plasmablastos que contienen IgA, es lo
que se ha llam ado “ciclo celular de la Ig A ”
(fig. 17-3). En el intestino delgado o en otras
mucosas siguen proliferando y maduran com­
pletamente encontrándose células plasmáticas
productoras de IgA. Un ciclo similar es segui­
do, aparentem ente, por los linfocitos B del
TLAB en su migración a los sitios de mucosas
del tracto respiratorio. Existe evidencia de que
muchas de las células plasmáticas de clase IgA
encontradas en el sistema murino provienen de
linfocitos B precursores procesados en la cavi­
dad peritoneal. Por consiguiente, existen dos lí­
neas de células B que contienen a la población
de células plasmáticas sintetizadoras de IgA en
el intestino.
GENESIS Y MANTENIMIENTO
DEL CICLO CELULAR DE LA IgA
Se han postulado dos hipótesis principales
para la génesis y mantenimiento del ciclo celu­
lar de la IgA. Ambas consideran que la prede­
terminación a la producción de IgA no contro-

F ig . 17-3. M odelo de la
circulación de inm unoci-
tos de clase IgA al intes­
Conducto torácico
tino, glándula m am aria y
otro.s s itio s d e m u c o sa .
Los linfocitos que se ori­
ginan en las placas de Pe-
yer m igran a los ganglios
m e s e n té ric o s , d o n d e se
d iv id e n y d if e r e n c ia n .
E llos d ejan los gan g lio s
m esentéricos por el co n ­
d u c to to rá c ic o y p o r el
torrente sanguíneo circu ­
lan hacia su destino final:
lám ina propia del intesti­
no delgado.
Ja, por sí sola, la migración de las células B a
las mucosas. Esta suposición toma sustento en
las siguientes observaciones: 1) los blastos T
migran al igual que los blastos B, 2) la migra­
ción no es inhibida por la inyección por vía en­
dovenosa de IgA monomérica o dimérica o por
antisuero anti-com ponente secretorio; y 3) la
lámina propia de individuos deficientes en IgA
está poblada de células plasmáticas que produ­
cen otros isotipos. Las dos hipótesis asum en
que la migración es antígeno independiente, y
en ambas se incluye la necesidad de la presen­
cia de células T especiales capaces de ayudar a
la producción de IgA.
En la primera hipótesis el ciclo está controla­
do principalmente por mecanismos instructivos
(fig. 17-4). Las células B de la circulación ex­
presan receptores específicos para las paredes
altas del endotelio de las vénulas y llegan a las
placas de Peyer o a los nódulos de los TLAM
(tejidos linfoides asociados a mucosas) donde
reciben una o ambas de las dos clases de ins­
trucción. Una instrucción, que proviene de una
célu la T (c é lu la T co n m u tad o ra o c é lu las
“switch”) regula la conmutación o “switch” de
los linfocitos que expresan IgM a linfoci­
tos que expresan IgA (a^^j). La otra instrucción,
que podría provenir del estroma de las placas
de Peyer o de los nódulos de los TLAM, inicia
una secuencia de diferenciación y proliferación
que permite que los blastos lleguen a un esta­
dio celular de maduración en los ganglios m e­
sentéricos, transform ándose en plasmablastos
que migran a la lámina propia donde son rete­
nidos para transformarse en células efectoras,
llamadas células plasmáticas. En los ganglios
mesentéricos, algunos blastos quedan como cé­
El sistema inmune de mucosas 309
Glándula m am aria
lulas B de memoria que migran y recirculan a
través de las paredes altas del endotelio de las
vénulas, de los nódulos o de las placas de Pe­
yer, y son expuestas a las mismas influencias
inductoras y antígenos como los precursores
primarios. Esto provoca la expansión de la po­
blación de células B de clase IgA predeterm i­
nada a las mucosas.
En la segunda hipótesis, el ciclo es controla­
do principalmente por mecanismos selectivos
(fig. 17-5). Las subclases de células B en la
médula ósea (o hígado fetal) están predeterm i­
nadas a la extravasación de la lám ina propia
del intestino. Cuando llegan al intestino por la
vía sanguínea se extravasan en la lámina propia
en mayor número que en las placas de Peyer e
inmediatamente entran en la linfa que drena en
los ganglios mesentéricos. En éstos, los blastos
precursores de IgA son impactados por el antí­
geno que llega a la linfa proveniente de las pla­
cas de Peyer y a continuación se produce, por
acción conjunta del antígeno y de células T, la
expansión de clones celulares predeterminados
a extravasarse en la lámina propia. Las células
que salen de los ganglios mesentéricos consti­
tuyen una población mixta de plasmablastos y
células de memoria. Cuando llegan a la lámina
propia, los plasmablastos se extravasan y que­
dan retenidos allí porque se convierten en célu­
las plasmáticas productoras de IgA. La capaci­
dad migratoria declina por haberse transforma­
do en células maduras que han alcanzado su di­
ferenciación terminal. Las células B de memo­
ria recirculan a través de varios tejidos linfoi­
des, pero parece que encuentran el antígeno pa­
ra el que ellas son específicas en los tejidos lin­
foides asociados al intestino, que están consti-
310 Aspectos básicos de la Inmunidad

Las células B en la placas

de Peyer reciben dos
instrucciones: 1) Conmutación
a IgA. 2) Predeterminación de Células (5)
dirigirse a las mucosas como de memoria
plasmoblastos
(4 )
Plasmablasto Otras mucosas y
glándulas exocrinas

Ciclo celular
de ia IgA

Células B provenientes
de la circulación llegan a
las placas de Peyer por
selección de las vénulas
de las paredes altas del
endotelio

Proliferación y diferenciación
ocurre en los ganglios
mesentéricos

Fig. 17-4. M odelo hipotético para el control de las m ucosas m ediante el m ecanism o instructivo.

tuidos por las placas de Peyer y los ganglios dominio, en los tejidos linfoides asociados a las
mesentéricos. Además, la expansión de los clo­ mucosas, de clones que están predeterminados
nes por el antígeno acoplado, con la ayuda de para la producción de IgA y tienen la habilidad
células T específicas por IgA, resulta en el pre­ de ir a las mucosas.

Células T colaboradoras
específicas de IgA en las
placas de Peyer o en
nódulo de TLAM

Inmunización de las
células B predeterminadas
ocurre en los ganglios
mesentéricos; la respuesta
secundaria ocurre aquí
o en las placas dePeyer

Fig. 17-5. M odelo hipotético del control de la m igración a las m ucosas por m ecanism os selectivos.

Las dos hipótesis pueden combinarse de va­
rias maneras. Por ejemplo, un mecanismo ins­
tructivo que controle la conmutación de IgA
puede ser acoplado con un mecanismo selectivo
para la expansión de las poblaciones celulares B
que tienen la capacidad de ir a las mucosas.
Debemos hacer hincapié en que solamente
aquellas células de memoria, que expresan re­
ceptores para unirse a las paredes altas del en­
dotelio de las vénulas (específicas de cada m u­
cosa), recircularán a través de los nódulos de
los TLAM.
Tanto los linfocitos efectores como los de
memoria provenientes, por ejemplo, de placas
de Peyer, que es un tejido linfoide secundario,
en respuesta al antígeno: a) migran en forma
efectiva a los tejidos linfoides terciarios (piel,
lámina propia del intestino, etc.) que están in­
flam ados; b) la diferenciación a la subclase
“células de memoria” está acompañada por el
desarrollo de especificidad de migración (a la
piel o a las mucosas). La unión del linfocito al
endotelio es necesaria para el proceso de extra­
vasación.
T E JID O S L IN FO ID E S ASOCIADOS
A LAS MUCOSAS
Las estructuras linfoid es de las m ucosas
exi.sten en los tejidos de los mamíferos, ya sea
com o agregados o com o folículos aislad o s
(ganglios linfoides aislados). En el intestino
delgado, estos folículos se hallan diseminados,
siendo más prominentes en el colon. Los teji­
dos linfoides asociados al intestino (TLAI), los
tejidos linfoides asociados a los bronquios
(TLAB) y los folículos solitarios tienen linfoe-
pitelio y eélulas B y T que sufren una división
y recambio rápido. Se cree que también existen
m acrófagos y células dendríticas, p rin cip al­
mente en los centros germinales. Los macrófa­
gos se encuentran, además, en la lámina propia,
fuera del tejido linfoide organizado.
E L SISTEM A IN M U N E COM UN
A TODAS LAS MUCOSAS
Esta denominación proviene de las similitu­
des morfológicas y funcionales encontradas en
el TLAI y TLAB, N um erosos experim entos
han demostrado que las células provenientes de
TLAB son capaces de repoblar el intestino, el
bazo y los pulmones con linfocitos productores
de IgA; linfocitos provenientes del TLAI pue­
den repoblar no sólo el intestino, sino también
jos bronquios. Asociadas al epitelio existen las
células M, también llamadas FAE (“follicule
associated ep iteliu m ” ), con capacidad p ara
El sistema Inmune de mucosas 311
transportar antígenos y cuya verdadera función
no ha sido aún determinada.
Por otra parte se ha demostrado que:
1) Mujeres embarazadas que habían ingerido
Escheríchia coli no patógeno, poseían en la le­
che células productoras de IgA con actividad
anticuerpo específico contra E. coli.
2) Blastos de ganglios mesentéricos m igra­
ban a la glándula m am aria (lactante) p o r un
mecanismo que está bajo control hormonal.
Además, blastos del ganglios mesentérico se
localizan en forma selectiva en la mucosa bron­
quial y cervical, sintetizando predom inante­
mente IgA. La localización cervical depende
del estado hormonal del individuo, siendo ma­
yor durante el proestro.
Otro tejido linfoide asociado a mucosa es el
TLAN (tejido linfoide asociado a la nasofarin-
ge). El TLAN se diferencia del TLAB y del
TLAI, y es el principal tejido linfoide del tracto
respiratorio alto (véase cuadro 17-1); se desa­
rrolla antes que el TLAB. El TLAN tiene gran
cantidad de células T, a diferencia del TLA I
(placas de Peyer) que contiene gran cantidad de
células B que expresan IgA. Existe separación
entre la respuesta inmune sistémica y la secreto­
ria de mucosas en el tracto respiratorio alto. La
naturaleza del antígeno que llega a la mucosa
nasal y a los TLAN y la vía de entrada determ i­
nan el tipo de respuesta. Los antígenos solubles
penetran todo el epitelio nasal y llegan a los
ganglios cervicales superficiales, induciendo así
una respuesta inmune sistémica o estableciendo
tolerancia. Los antígenos particulados son re­
movidos de la mucosa nasal, tomados p o r las
células M (“M cells”) y llegan a los TLAN sólo
luego de exposiciones repetidas al antígeno y/o
cuando el aparato ciliar está afectado. (Estas
condiciones antigénicas las presentan los pató­
genos viables que son capaces de replicarse.)
FACTORES QUE PUEDEN AFECTAR LA
LOCALIZACIÓN EN LAS MUCOSAS DE
LOS LINFOBLASTOS PRODUCTORES
DE IgA
La localización en las mucosas de los linfo-
blastos productores de IgA puede estar afecta­
da por diferentes factores, entre los que cabe
destacar ciertas características de los linfocitos
y de la vasculatura (cuadro 17-2). No se h a en­
contrado que esta localización pueda ser afecta­
da por un solo factor. Por ejemplo, la remoción
de todas las placas de Peyer del, intestino de la
rata no impide que los blastos productores de
IgA, provenientes de los ganglios m esentéri­
cos, se localicen en el intestino. La acum ula­
312 Aspectos básicos de la inmunidad

C u ad ro 17-1. Características de los PP, TLAN y TLAB en ratas no tratadas (Wistar)

PP TLA N TLAB

O NTO G ENIA
Presencia de tejido A ntes del nacim iento A l nacim iento Al día 4 después del
nacim iento
I^infocitos 1“™* B (IgA ) T B

A reas B y T definidas Al día 10 después del n a­ Al día 10 después del naci- > 21 días después del
cim iento m iento nacim iento

TEJID O AD U LTO
C entros germ inales ++ + +
-H- Lewis + Lew is, BN ND
PVG

Linfocitos intraepiteliales ++ ++ +
Á reas T/B T<B T =B ND
T<B T<B Lewis

R elación T:B 0,2 0,9 0,7

0,2 Lewis 0,7 Lewis ND

Relación CD 4:CD 8 5,0 2,4 2,6

6,6 Lewis 5,1 Lew is ND

C élulas B IgAm -H- + +

M acrófagos + + +
A SP E C T O S FU N C IO N ALES
M igración de PP o células lin­ + Lew is ++ Lewis ND
foides de TL A N en órganos
linfoides

Células linfoides que llegan a + Lewis ++ Lew is ND

PP 0 TLAN

A dhesión de linfocitos a las + Lew is -H- Lew is ND

H EV en PP o TLA N

ción de células productoras de IgA en estos si­
tios especializados se explicaría por la acción
de varios factores. El medio que rodea a las
mucosas es rico en antígenos m icrobianos y
mitógenos, influyendo de esta forma la inmu-
noespecificidad de los linfocitos en las muco­
sas. La superposición de estimulación antigéni­
ca crónica a la modulación que realizan las cé­
lulas T vecinas produciría la predeterminación
de las células B a la síntesis de IgA. También
se ha estudiado y demostrado la regulación de
la producción de IgA por las células T. Se han
aislado clones de células T de las placas de Pe­
yer en los ratones. Estos clones actúan sobre
las células B, estim uladas por lipopolisacári­
dos, que expresan IgM pero no IgA. Las célu­
las B se diferencian y com ienzan a expresar
IgA, convirtiéndose en precursores directos de
las células productoras de IgA. Estas células T
se llaman células T “switch” o conmutadoras.
También se han descrito células T que ac­
túan en un estadio más tardío de la diferencia­
ción. Estas células presentan receptores para la
región Fe de la IgA (células Th). Estas células
Th, que actúan sobre las células B que expre­
san IgA, pueden inducir o suprimir la secreción
de IgA. Estas células T envían señales para la
colaboración o la supresión mediante la pro­
ducción de factores solubles capaces de unirse
a la IgA.
Antígenos del medio ambiente o de la dieta
pueden influir en la localización, tanto en el
tramo intestinal como en el respiratorio, de cé­
lulas productoras de IgA. Se ha dem ostrado
que azúcares simples inhiben in vivo varias ac­
tividades de los linfocitos. También, que la de­
ficiencia de vitamina A causa una migración y
localización defectuosa de los blastos de clase
IgA provenientes de la mucosa y que factores
que se encuentran tanto en el calostro como en
la leche pueden influir en la diferenciación ce­
lular de la IgA o suprimir la capacidad de los
recién nacidos para montar una respuesta in­
mune de clase IgE.
Además se ha establecido que la especifici­
dad por determinado órgano, que existe en la

C uadro 17-2. Factores que pueden afectar la localización de linfoblastos productores de IgA
en las mucosas
C aracterísticas ele los linfoblastos
- IgA en la m em brana celular
- C om ponente secretorio
- R eceptores para antígeno
- R eceptores para factores quim iotácticos
- R eceptores para productos de células T colaboradoras
- M acrófagos
- D eficiencia de vitam ina A
“ G lucoproteínas de la m em brana celular
- y de P, integrina
V ascularización
- R egulación del flujo sanguíneo
- Paredes altas del endotelio de las vénulas poscapilares
- Influencia horm onal
población de linfocitos que es capaz de migrar,
está determinada por la interacción selectiva de
los linfocitos circulantes con las células endo­
teliales. Esta interacción está mediada por “re­
ceptores de migración” en los linfocitos que se
unen a los ligandos endoteliales, que son m olé­
culas de adhesión específicas. Se conoce que la
y la a^P integrinas participan en la unión
de los linfocitos a las paredes altas del endote­
lio de las vénulas (HEV) en las placas de Peyer
que presentan MAdCAM-1 (“mucosal vascular
addresin cell adhesión m olecule-l”). La expre­
sión de M A dCAM -1 ocurre tam bién en las
HEV de los ganglios mesentéricos y en las vé­
nulas de la lámina propia, siendo su ligando la
a^P^ integrina. Funcionalmente, MAdCAM-1
está relacionada con la migración selectiva a
tejidos de mucosa. Trabajos recientes han de­
mostrado la existencia de una integrina
(llam ada an tígeno de lin fo c ito de m u co sa,
ALM o MEA por su expresión selectiva en las
células T asociadas a mucosas) en intestino y
pulm ones, que m edia la unión a un ligando
existente sobre las células epiteliales de las m u­
cosas, contribuyendo a la retención de las célu­
las T asociadas a mucosas en esos sitios. Este
ligando ha sido recientemente caracterizado y
se lo denomina E-cadherina.
Resumiendo, los estudios de migración in vi­
vo e in vitro demuestran que las células B pre­
sentan preferencia por las venas poscapilares
del endotelio. Las células endoteliales de los
tejidos linfoides de mucosas, así como periféri­
cos, expresan determinantes específicos o fac­
tores que median el reconocimiento de los lin­
focitos. Por consiguiente, los modelos de mi­
gración linfocitaria están programados, en m u­
chos casos, por los receptores de Ja superficie
de linfocitos, que son complementarios de di­
chos determinantes endoteliales que, a su vez
El sistema inmune de mucosas 313
son específicos de órgano. Se ha discutido la
probabilidad de que la inducción de receptores
de migración órgano específicos probablemen­
te sea un factor im portante en la distribución
restringida a ciertos tejidos de subpoblaciones
linfocitarias, responsables de las características
tínicas de las respuestas inmunes que ocurren
en la periferia y en las mucosas.
C ELU LA S T EN LAS MUCOSAS
Las células del sistema inmune que se locali­
zan en las mucosas no son solamente las deriva­
das de] linfocito B, productoras de anticuerpos.
La presencia de linfocitos T así como su proce­
dencia y distribución han sido demostradas.
Los inm unoblastos T provenientes de gan­
glios mesentéricos y del conducto torácico se
localizan en la lámina propia del intestino y de
las vellosidades epiteliales. Esto se ha observa­
do no sólo en el intestino delgado normal, sino
también en isoinjertos del intestino fetal ubica­
do bajo la cápsula del riñón. En contraste, los
blastos T provenientes de ganglios periféricos
sólo han sido detectados en los intestinos infec­
tados e inflamados por la Trichinella spiralis;
por consiguiente, normalmente no migran a la
lámina propia del intestino.
Células T se encuentran presentes en el c a -,
lostro y la leche. Estudios realizados en ratas
dem uestran que las células T halladas en la
glándula mamaria provienen tanto de tejidos
linfoides intestinales como de tejidos linfoides
periféricos. Además, dado que se encontró que
en la glándula mamaria de la rata se acumulan
linfocitos B que contienen IgA y linfocitos T
cuyo fenotipo principal corresponde al asigna­
do a las células T colaboradoras (W3/25'^), se
sugirió que estas células T regulan la diferen­
314 Aspectos básicos de la Inmunidad
ciación de las células B dentro de la glándula
mamaria. Se ha dem ostrado en la leche que
puede haber transmisión de resistencia a tum o­
res durante el período de lactancia. Si este he­
cho se debe o no a la transferencia de células T
no está totalmente demostrado, pero se conoce
que en los humanos la reacción de hipersensi­
bilidad retardada puede transferirse al recién
nacido durante la lactancia.
Finalmente recordaremos la existencia de los
linfocitos intraepiteliales, que en su gran mayo­
ría son linfocitos T que presentan el fenotipo
supresor/citotóxico. Esto ocurre tanto en los
animales como en el hombre. La lámina propia
humana contiene células T que presentan prin­
cipalm ente el fenotipo colaborador/inductor.
Una característica única de la población celular
T del intestino delgado es el gran porcentaje de
células que tienen gránulos citoplasm áticos
metacromáticos que contienen histamina. Por
consiguiente, estos gránulos se asemejan a los
gránulos de los mastocitos. Evidencia experi­
mental sugiere que la célula T granulada del in­
testino puede ser una célula de transición pro­
veniente de una línea celular especial para la
cual el estadio de diferenciación terminal es un
mastocito.
Otros investigadores sugieren, como alterna­
tiva, que la célula T del intestino induce a que
otro tipo celular se diferencie a mastocito de
mucosas. Los m astocitos de las m ucosas no
son idénticos a los clásicos mastocitos, como
los aislados de la cavidad peritoneal, puesto
que presentan características morfológicas, bio­
químicas y farmacológicas que son distintas de
las de éstos.
Las células T del intestino, como todas las
células T, provienen de células precursoras del
timo. Las células precursoras más inmediatas
son estimuladas por antígenos y mitógenos en
los tejidos linfoides organizados asociados con
el intestino, como lo son las placas de Peyer. A
medida que los precursores se diferencian, mi-
gran vía los ganglios mesentéricos drenantes,
conducto torácico y torrente sanguíneo y retor­
nan eventualmente a la pared intestinal, tanto a
la lámina propia como al epitelio. El ciclo es
análogo al camino de diferenciación de los pre­
cursores de las células plasmáticas que sinteti­
zan IgA, que también son estimulados en las
placas de Peyer. El número de hnfocitos intrae-
pitehales depende de la estimulación antigéni­
ca; el mecanismo de migración a la mucosa in­
testina] no. Las células intraepiteliales proba­
blemente no entran en gran número en el lu­
men del intestino.
Las propiedades funcionales de las células T
del intestino indican que son capaces de mediar
reacciones de citotoxicidad en ciertas condicio­
nes. Los tipos de reacciones para los que existe
evidencia experimental son; citotoxicidad celu­
lar inducida por mitógeno, actividad “natural
killer” y citotoxicidad celular anticuerpo de­
pendiente.
La funcionalidad de los linfocitos intraepite­
liales (LIE) no está bien definida, y la comple­
jidad de los fenotipos que definen esta poíjla-
ción Iinfocitaria hace pensar que el epitelio in­
testinal constituye un compartimento linfoide
único y distinto dentro del organismo.
Trabajos recientes indican que el epitelio in­
testinal es un órgano linfopoyético T primario
y, por consiguiente, esto confirma en parte el
origen timoindependiente de los LIE. Mientras
el epitelio tímico y el intestinal derivan del en-
dodermo, la maduración funcional, es decir, la
capacidad linfopoyética de células T no se pro­
duce al mismo tiempo. Los LIE, en los ratones
y en las ratas, aparecen recién a las 4 semanas
después del parto y su cinética de aparición es
independiente del antígeno del medio y depen­
de sólo del estadio de desarrollo del intestino.
Las primeras células T que aparecen en el epi­
telio intestinal de ratones singeneicos expresan
el receptor T (y/5) (Rec T I) y conmutan a LIE
que expresan el receptor T (a/p) (Rec T2). El
número de LIE que expresan RecT (oc/P) está
directamente relacionado con la edad del ani­
mal y con la dieta. La m ayoría de los LIE
RecT (y/5)+ expresa CD8 constituido por un
homodímero de cadenas a y no expresa cade­
nas p de esta molécula. Los LIE RecT (a/P)*
expresan en su gran mayoría cadenas a y p de
CD8. Existen distintas poblaciones de células T
RecT (y/5)+ que se definen por su localización
específica en ciertos tejidos y por la expresión
de regiones variables (V) específicas de los ge­
nes que codifican el RecT (y/5).
CÉLULAS RecT (Vy7+)
El gen que codifica el RecT (Vy7+) está fun­
cionalm ente reacom odado y expresado en el
hígado fetal al día 11 de la gestación, es decir
antes de migrar al timo, y se expresa en el timo
en gran cantidad en otros tiempo de su desarro­
llo. Las células que expresan este gen se en­
cuentran principalmente en el intestino y en el
hígado, y tienen la capacidad de desarrollarse
extratím icam ente puesto que los transcriptos
Vy? son encontrados en el intestino de los rato­
nes desnudos (“nude mice”).
FUNCIONALIDAD DE LAS CÉLULAS T
O RIGIN AD A S EN E L IN T ESTIN O
Las células T RecT (y/5)"' provenientes del
intestino ejecutan su función in situ y probable­

mente también lo liacen los LIE RecT (a /p )”^.
Los LIE maduros CD4+ son capaces de funcio­
nar como células T colaboradoras en el proceso
de activación de las células B y de su diferen­
ciación, mientras que los LIE CD8 (a+p") son
menos eficientes en esta capacidad. Los LIE
son capaces de producir citoquinas tales como
IL-5 e INF-y [LIE CD4+ y CD8+; y parece ser
que tanto los RecT (a /p )+ como los (y/5)+ están
involucrados]. A dem ás, ciertos estudios d e­
muestran que los LIE RecT (a/p)^ y (y/5)+ que
expresan Thyl (ThyL) producen 10 veces más
cantidad de lL-2, IL-3 e I,NE-y que los que no
los expresan (Thyl -).
Dada la excepcional y singular función de
los TLAI, como es promover y sostener la pro­
ducción de grandes cantidades de IgA que es
secretada en la luz intestinal, sería interesante
pensar que las células T derivadas del intestino
contribuyen a este proceso. Al menos se puede
suponer que los LIE RecT (a/P )“^ que emigran
a la lám ina propia están involucrados puesto
que ahí están las células B.
Por consiguiente, se considera que el epitelio
intestinal es un órgano linfoide primario y que
el sistema inmune asociado a mucosas aparece
primero en el timo, debido a la carga antigénica
a que este sitio está sometido.
CAM INO H E PA T O B IL IA R DE LA IgA
El hepatocito presenta receptores que asegu­
ran el transporte de la IgA de la sangre a la bi­
lis. Se ha demostrado, en ratón y en rata, que el
hígado interviene en el transporte activo de
grandes cantidades de IgA polímero desde el
plasma a la bilis. Cuando se inyectó por vía en­
dovenosa la IgA polímero, se observó que ésta
era removida rápidamente de la circulación y
transportada a la bilis, como IgA unida al com ­
ponente secretorio. Si se realizaba la obstruc­
ción del conducto biliar se obtenía un aumento
rápido y selectivo en suero, tanto de com po­
nente secretorio com o de la IgA p olím ero.
Además, se demostró que los hepatocitos de la
rata sintetizan y expresan en su membrana el
com ponente secretorio. Por consiguiente, la
unión de la IgA polímero al componente secre­
torio del hepatocito facilita el transporte activo
a través de éste.
Este transporte activo ocurre en conejos, po­
lios, ovejas, pero no puede ser generalizado a
todas las especies animales. En los humanos,
sólo el 2% de una dosis de IgA polimérica se
encuentra en la bilis a las 3 horas de inyectada.
Este escaso transporte de la IgA polimérica del
plasma a la bilis podría estar relacionado con la
incapacidad de detectar componente secretorio
en los hepatocitos hum anos, aunque sí se lo
El sistema inmune de mucosas 315
puede detectar en las células del conducto bi­
liar.
El aumento de IgA y componente secretorio
en plasma humano visto en el curso de distintas
enferm edades hepáticas se debería a un gran
aumento de factores que incluyen:
1. Hallazgo de una mucosa anormal que sin­
tetiza mayor cantidad de IgA.
2. Disminución de la integridad de la m uco­
sa intestinal que provoca el influjo de la IgA en
la circulación.
3. Elim inación alterada de la IgA, d e los
com plejos inm unes que contienen IgA y del
antígeno libre en el hígado.
Por consiguiente, se considera que to d a la
IgA de las secreciones proviene de síntesis lo­
cal, con una contribución mínima de la sangre.
La ventaja de este mecanismo se refleja en el
nivel de secreción que así puede ser regulado
localmente para responder a las necesidades fi­
siológicas, puesto que varía en los distintos pe­
ríodos del ciclo estrual o cuando existe infec-
U TILID A D DE LA PR O D U C C IO N D E IgA
S E C R E T O R IA P O R IN M U N IZ A C IÓ N
POR VIA ORAL Y SU APLICACIÓN EN
LA PROTECCIÓN ESPECÍFICA DE LAS
SUPERFICIES DE LAS MUCOSAS
Se ha demostrado que la inm unización por
vía oral y bronquial conduce a la secreción se­
lectiva del anticuerpo de la clase IgA en las
glán d u las m am arias, sin evidencias d e que
exista anticuerpo de clase IgA en la secreción.
En form a experimental pudo confirmarse que
esto se debe a la migración de células que sin­
tetizan IgA con actividad anticuerpo específica,
desde el intestíno y/o pulmón a ia glándula ma­
maria.
La existencia de memoria en el sistem a in­
munológico secretorio se ha puesto en eviden­
cia, al determinarse que este sistema es capaz
de montar una respuesta inmune rápida secun­
daria a la administración local del antígeno.
En el humano, una sola inoculación subcutá­
nea con vacuna colérica puede inducir anticuer-.
pos específicos de la clase IgA en leche, saliva
y otras secreciones. Se supone que e sta res­
puesta se debe a la previa sensibilización por
exposición natural a la bacteria.
El concepto de un sistema inmune com ún de
mucosas, en el que varios sitios de mucosas es­
tán integrados a través de los movimientos de
las células o de anticuerpos, provee un princi­
pio sobre el que se pueden establecer estudios
para la protección de un sitio de mucosa por in­
316 Aspectos básicos de la inmunidad

munización de otro. La vacunación oral con vi­
rus herpes simple tipo I aumentó la protección
contra la infección intravaginal con virus her­
pes simple tipo n, presumiblemente por reac­
ción cruzada entre estos dos serotipos.
Además, experim entos realizados en doce
niños con doble colecistotomía demuestra que,
si se los inmuniza en el segmento colónico dis­
tal con vacuna de polio viva, se detectan anti­
cuerpos específicos de la clase IgA en el seg­
mento local del colon infectado, pero no en el
otro segmento del colon o en los lavados nasa­
les. Una vez cerrada la colecistotomía, la vacu­
na polio fue administrada por vía oral a tres ni­
ños. Una respuesta significativa de clase IgA
ocurrió en la nasofaringe. La respuesta de estos
tres niños da soporte al concepto de un sistema
común de defensa a nivel de mucosas, pues el
anticuerpo nasal apareció luego de la adminis­
tración por vía oral del virus polio.
No debemos olvidar la existencia de la induc­
ción de tolerancia por la administración de antí­
geno por vía oral, que está influida por una va­
riedad de factores que incluyen la dosis de antí­
geno, la frecuencia de la administración y la
distancia en el tiempo entre la administración
del antígeno por vía oral y la siguiente inmuni­
zación. En esta inducción de tolerancia intervie­
nen células T supresoras antígeno específicas'
que deprimen la habilidad de los linfocitos de
proliferar como respuesta al antígeno. La activi­
dad supresora concomitante que se genera du­
rante el proceso de inmunización cohabita en un
delicado equilibrio que favorece la inmunidad.
Este fenómeno de tolerancia oral puede ser
utilizado para la administración de autoantíge­
nos por vía oral en el tratamiento de enfermeda­
des autoinmunes órgano específicas. La dosis es
muy importante para la estimulación del compo­
nente de supresión activa de la tolerancia oral.
La identificación de las células regulatorias
en los humanos, luego de que se ha realizado la
tolerización por vía oral, es crítica para la de­
mostración de los efectos inmunológicos de la
tolerización oral.
M O D E L O PR O B A BLE PARA
EL SISTEM A INMUNE DE CLASE IgA
En este modelo, que experimentalmente se
representa en la figura 17-6, se intenta estable­
cer la relación entre la respuesta sérica de la
clase IgA y la correspondiente a nivel de las
mucosas (intestinal y bronquial) mediada por
IgA secretoria.

Neocolonización bacteriana / Reintroducción

'S!t( A Parenteral
v P M iy ^
Suero
B Cl IgM 'X / ¿ / / I n m u n o c i t o )
de m emorial riai ^
V > IgA

Ig A -- -IgM Fagocitosis
"Feedb ack"
negativo mediado
por IgG sobre
\ la producción
de IgA mediante
bloqueo de la
Entera! unión a las placas
de Peyer
IgAs
VA
Precursor Cél.plasm ática Espacio
linfoide que contiene subepitelial Intestoo luz
distal y expresa IgA epneiiai ^

Eliminación inmune ( Restricción

por “cross H nkin^’ que ' al muous
impide colonización

- ► Mucosa
secretoria distal

Respuesta de Ig Inducción Pasaje a periferia Secretoria Diversificación Senescencia Eliminación

tiempo ^ y amplificación

Fig. 17-6. S istem a inm une de clase IgA en ei que se presenta la relación entre respuesta sérica de clase IgA y respuesta a
nivel de m ucosas m ediada por IgA secretoria (IgAS).

Se conoce por experimentos realizados con
una cepa de Escheríchia coli que la bacteria se
une primero a las placas de Peyer, y esta unión
ocurre antes de que se una a las vellosidades
del epitelio. Por consiguiente, al unirse la bac­
teria a las placas de Peyer se inducen los pre­
cursores de las células elaboradoras de IgA an-
tígeno-específicas. La IgA es producida antes
del probable tránsito de la bacteria a través de
las vellosidades epiteliales, y es en ese lapso
que los precursores de las células plasmáticas
que sintetizan IgA han migrado a los distintos
sitios de mucosa armando al huésped contra la
bacteria presentadora de este antígeno.
Mientras tanto, la bacteria que ha entrado en
los canales linfáticos o en la circulación va a
ser opsonizada inmediatamente por la IgA, pre­
viniéndose así la activación del complemento y
facilitando su toma por los monocitos y macró­
fagos, particularmente las células de Kupffer.
El exceso de IgA es removido por las células
hepáticas a través de la ruta hepatobiliar descri­
ta, mientras que la IgM permanecerá constante
o aumentará discretamente como un resultado
del procedimiento inmunológico de la bacteria
fagocitada.
SEGUNDA PARTE
Regulación neuroendocrina
de la inmunidad de mocosas:
un sistema interactivo-adaptativo
MARÍA ESTELA ROUX
LILIANA GRACIELA VAUTHAY
GENERALIDADES
El medio ambiente como fuente
de estímulos. Homeostasis y adaptación
Los organismos superiores se comportan co­
mo sistemas abiertos. Esto implica que inter­
cambian perm anentem ente materia, energía e
información con su entorno. Por su parte, el
medio ambiente externo constituye una rica
fuente de estímulos, que incluye circunstancias
estresantes.
Nuestro medio interno también genera estí­
mulos. Su sensibilidad a la realidad le permite
E l sistema Inmune de mucosas 317
En ausencia de una nueva estimulación, las
células plasmáticas productoras de IgA morirán
y los niveles de IgA e IgM sérica declinarán,
dejando espacio para los productores de los
clones de inmunocitos estimulados con poste­
rioridad.
Alternativamente, si el mismo antígeno fue­
se presentado a las superficies de las mucosas
habrá una respuesta breve de IgA secretoria; en
tanto que, si fuese inoculado por vía parenteral,
se producirá IgM y luego IgG, por la influencia
de los macrófagos activados. La IgG suprimiría
el bloqueo de IgA, opsonizaría la bacteria para
su depuración o “clearance” por los polimorfo­
nucleares y suprimiría la inducción de IgA a
nivel del intestino por competición con el antí­
geno dentro del lumen. Esta secuencia de he­
chos tendría lugar para cada presentación enté­
rica de un nuevo antígeno, ocurriendo al mis­
mo tiempo la estimulación del TLAB. De esta
manera, los tejidos linforreticulares asociados
del intestino y bronquios actuarán como centi­
nelas, haciendo el muestreo de los antígenos
del m edio am biente encontrados en la dieta
diaria y en el aire que respiramos, respectiva­
mente.
percibir cambios del mundo psicofisicosocial
en el cual el in d iv id u o v iv e y al q u e debe
adaptarse.
El éxito de adaptación individual frente a es­
tímulos medioambientales está determinado en
gran parte, tanto por las interacciones entre los
componentes de un mismo sistema, com o tam­
bién por la interrelación entre sistemas corpo­
rales. Resulta interesante destacar que las pro­
piedades que surgen de un orden de sistemas
complejos interrelacionados e interconectados
superan la suma de las características de sus
componentes en forma individual.
Los organismos superiores están constituí-
318 Aspectos básicos de ¡a inm unidad

dos por sistemas que tienen capacidad natural
para la interacción funcional modulando res­
puestas biológicas de manera integrada. Esta
interacción entre sistemas adaptativos es funda­
mental para la superviviencia y convivencia del
individuo con el medio externo.
El interjuego entre estímulos y condiciones
del individuo (genéticas, biológicas, psicoso-
cioculturales) da lugar a modificaciones del es­
tado salud-enfermedad. Los estímulos cogniti-
vos (psíquicos, sensoriales, em ociones), no
cognitivos (virus, bacterias, hongos, parásitos,
LPS, células tumorales) y el comportamiento
pueden mantener o reestablecer la homeostasis
con respecto a una variedad de estados de salud
y enfermedad (fig. 17-7).
En condiciones fisiológicas los mecanismos
hom eostáticos, pueden d iferir cu alita tiv a y
cuantitativam ente de aquellos que operan en
condiciones patológicas. En el curso de estos
estados, la regulación de variables biológicas
sufre ajustes en diferentes niveles. Cuando di­
chos ajustes son apropiados, pueden resultar
beneficiosos para el huésped; de lo contrario
generan o agravan el curso de la enfermedad.
La respuesta inmune como mecanismo
homeostático
Las moléculas normalmente presentes sobre
las membranas celulares y en los fluidos corpo­
rales, pueden ser consideradas como marcado­
res biológicos de la constancia e integridad de
las células y los tejidos (homeostasis). El siste­
ma inmune, debido a su capacidad de discrimi­
nar entre antígenos que están siempre presentes
y aquellos que no lo están (lo propio y lo no
propio), y lo propio modificado, percibe una
imagen interna de los componentes moleculares
del cuerpo y reacciona a particulares distorsio­
nes de dicha imagen. Modificaciones de los an­
tígenos propios y/o la presencia de neoantíge­
nos implican alteraciones en los componentes
moleculares/celulares del organismo y por con­
siguiente una perturbación en la homeostasis.
En estas circunstancias la respuesta adaptativa
del sistema inmune es tender a eliminar esa per­
turbación. Esta propiedad permite ubicar a la
respuesta inmune en el contexto de los mecanis­
mos homeostáticos. En estas condiciones la ac­
tivación del sistema inmune constituye una res-

ESTÍMULOS COGNITIVOS
(Psíquicos, emociones, sensoriales, etc.)

F ig. 17-7. In teraccio ­

ESTIMULOS NO COGNITIVOS
(VIRUS, BACTERIAS, PARÁSITOS, ETC.)
nes p o te n ciales en tre
e s tím u lo s m e d io a m ­
b ie n ta le s y s is te m a s
c o r p o r a le s a d a p ta ti­
vos. N ótese la org an i­
zació n co m p artim en -
talizada intrasistem a y
la integración intersis-
tem a a n iv el del m e­
dio interno.
 El sistema inmune de mucosas 319

Cuadro 17-3. Características comunes entre los sistemas homeostáticos mayores

S IS T E M A S H O M E O S T Á T IC O S M AYO R E S. ■ N E R V IO S - E N D O C R IN O - IN M U N E

- C ognitivos
C AR AC T E R IST IC A S C O M U N E S - PR O CESA R ESTÍM U LO S.
-- N o cognitivos

- A U TO N O M ÍA
~ D istribución sistém ica
~ D iversidad celular y m olecular
- Tolerancia
~ M emoria
- M ecanismos: - arco reflejo
- retroalim entación
- condicionam iento

FU N CIO NES. ^ A D A P T A C IÓ N - REG U LA CIÓN - M O D U LA C IÓ N - IN TEG R A C IÓ N

H O M E O STASIS. - R E A C T IV A - PRED ICTIV A

puesta homoestática reactiva, es decir, el estí­
mulo precede a la respuesta.
Así, dependiendo deJ tipo de estímulo anti­
génico, pueden surgir múltiples combinaciones
posibles de productos derivados de subpobla­
ciones de linfocitos y células accesorias activa­
das. En este contexto, se puede concebir un có­
digo basado sobre una combinación de mensa­
jeros solubles que reflejan el tipo de respuesta
inmune puesta en marcha.
Niveles de regulación de la respuesta
inmune
El sistema inmune cuenta con numerosos y
eficientes mecanismos de autorregulación cu­
ya finalidad es m odular su propia respuesta.
Esta diversidad autorregulatoria confiere al sis­
tema cierto grado de autonomía.
Una extensión desde el punto de vista inte­
ractivo incluye la proposición de que, como
ocurre con otros mecanismos homeostáticos, la
respuesta inmune está bajo control neuroen-
docrino. Este nivel externo de regulación re­
presenta uno de los mecanismos de interrela­
ción funcional entre sistemas, a través de in­
fluencias muitidireccionales donde m odifica­
ciones en un sistema producen variaciones en
otros y viceversa.
Dentro de la organización jerárquica de las
funciones corporales los mecanismos de adap­
tación, expresión de la actividad de los siste­
mas hom eostáticos mayores, son esenciales
para la superviviencia del individuo.
Características de los sistemas
homeostáticos mayores
Los sistemas nervioso, endocrino e inmune
comparten una serie de características. Una de
ellas es ia capacidad de recibir, discriminar, in­
terpretar, responder y recordar formas especí­
ficas de estímulos, originados en el medio am­
biente interno y/o externo, desarrollando res­
puestas adaptativas. E sta capacidad perm ite
catalogarlos com o sistem as h om eo stá tico s
mayores. Su delicada percepción frente a estí­
mulos, llega a tal punto que, cuando una m odi­
fic a c ió n del m e d io a m b ie n te se p ro d u c e
periódicam ente (tem peratura corporal, ritm os
hormonales, etc), el sistema prepara con antici­
pación los cambios fisiológicos necesarios para
el estím ulo predecible (hom oestasis predic-
tiva).
Para preservar la constancia e integridad del
medio ambiente interno, los sistemas homeos-
taticos mayores deben interactuar permanente­
mente integrando sus actividades dentro de un
contexto dinámico donde el sinergismo, la re­
dundancia regulatoria y la retroalim entación
son mecanismos esenciales.
Las características comunes a estos sistemas
y sus implicancias funcionales se resumen en el
cuadro 17-3.
Fundamentos de interacción entre
los Sistemas Homeostáticos Mayores
Para establecer un nivel externo de inm uno­
rregulación es un prerrequisito la identificación
de mecanism os responsables del perm anente
estado de integración funcional entre los siste­
mas homeostáticos mayores concebidos como
un sistema interactivo.
Este marco conceptual condujo a que disci­
plinas como la Inmunología, la Endocrinología
y la Neurología, que surgieron y se desarrolla­
ron en forma independiente, se integraran con­
formando un nuevo campo multidiscipJinario:
Inm unoneuroendocrinología. Al igual c]ue la
fase inicial de otros campos científicos, esta
disciplina interactiva enfoca sus investigacio­
320 Aspectos básicos de la inmunidad
nes sobre la base de descripciones, observacio­
nes y comparaciones.
A partir del análisis bibliográfico referido a
las interacciones inmunoneuroendocrinas, sur­
gen ejemplos que pueden ser ordenados en tres
tipos de condiciones: 1) patológicas, 2) experi­
mentales, y 3) fisiológicas.
En situaciones patológicas se observó retar­
do de la maduración sexual en ratones con au­
sencia congénita de timo. Pacientes diabéticos
presentan una mayor susceptibilidad a infeccio­
nes, con respuesta a mitógenos disminuida. La
administración de insulina normaliza dicha res­
puesta. También se observó, en pacientes, en el
curso de procesos inflamatorios y sepsis, inhi­
bición de la secreción de hormona tirotrófica y
gonadotrófica. Se detectó que las endorfinas
participarían en la fisiopatología del shock en­
dotóxico bacteriano. Esta observación está ava­
lada por el hecho de que la naloxona (b lo ­
queante de los receptores de las endorfinas)
anula los cambios fisiopatológicos inducidos
por la administración de endotoxina.
En condiciones experimentales surgen con­
clusiones obtenidas a partir de: administración
de dosis farmacológicas de hormonas, neuro-
transmisores, citoquinas; extirpación de glán­
dulas endocrinas y órganos del sistema inmune,
procedim ientos que pueden ocasionar daños
funcionales temporarios y/o definitivos. Ejem­
plos: la timectomía neonatal en ratones, lleva a
una alteración profunda del sistema endocrino
a nivel hipofisario, adrenal y gonadal; la bur-
sectomía en embriones de pollo de 62 horas
produjo subdesarrollo del oviducto, hipertrofia
de adrenales, aumento de testosterona y dismi­
nución de corticoides. La castración en conejos
da por resultado un significativo incremento de
la masa tímica. La administración de hormona
de crecimiento y proláctica reconstruye la in­
munocompetencia celular en animales hipofi-
sectomizados.
En condiciones fisiológicas, pocos son los da­
tos aportados por la literatura: diferencias en la
respuesta inmune durante el ciclo estral en rato­
nes; modificaciones de la respuesta inmune du­
rante la preñez; inmunidad y dimorfismo sexual;
influencia del sexo en la incidencia de enferme­
dades autoinmunes. Estas observaciones en con­
diciones fisiológicas, avalan el permanente esta­
do de interacción entre los sistemas homeostáti­
cos mayores. Estas mismas observaciones orien­
taron la búsqueda de evidencias fenotípicas inte­
ractivas en los niveles de organización. En este
contexto se describen a nivel funcional, cambios
en la actividad de células del sistema inmune
sincrónicos con las modificaciones hormonales
durante el ciclo estral y menstrual.
El sustrato interactivo a nivel estructural es­
tá representado por la inervación y vasculariza­
ción de los órganos del sistema inmune. El Sis­
tema Nervioso Central (SNC) se relaciona a tra­
vés de sus nervios periféricos con todos los ór­
ganos del sistema inmune. La detección de fi­
bras nerviosas autonómicas en los órganos linfá­
ticos permite que por vía aferente llegue infor­
mación al SNC sobre el estado funcional de di­
chos órganos. Por su parte, la vía eferente cons­
tituye una forma directa de influencia del SNC a
través de productos neuroendocrinos. Estas mo­
léculas también pueden llegar a los órganos del
Sistema Inmune a través de la circulación.
El intercambio de información y por consi­
guiente la posibilidad de interacción con el me­
dio ambiente implica, a nivel celular, la capa­
cidad de recibir (receptores) y emitir (molécu­
las difusibles) señales.
Los aspectos meeanicistas que fundamentan
la capacidad natural de interacción entre siste­
mas adaptativos tiene su máxima expresión en
el nivel de organización molecular. El perm a­
nente intercambio de información entre estos
sistemas se debe a que tienen receptores y m o­
léculas difusibles comunes. Es decir, las célu­
las del sistema inmune tienen receptores para
productos neuroendocrinos y, además, pueden
sintetizarlos. A su vez, el sistema nervioso pue­
de sintetizar y tiene receptores para citoquinas.
Esta reciprocidad molecular perm ite un nivel
externo de regulación de la magnitud de la res­
puesta inmune. Por su parte, el sistema inmune,
por su capacidad de producir sustancias neu-
roendocrinas, también participa en el control de
ajustes n eu ro en d o crin o s y m etab ó lico s del
huésped durante el curso de procesos inflama­
torios y neoplásicos.
En el SNC se identificaron receptores para
IL-1, ÍL-2, IL-3, IL-6, TNF e IFN. Las citoqui­
nas que actúan sobre estos receptores pueden
provenir de células del sistema inmune activa­
das localizadas periféricamente (acción endo­
crina), o que bajo ciertas circunstancias atravie­
san la barrera hem atoencefálica. Otra fuente
son las propias células del SNC. Se demostró la
presencia de ARNm para citoquinas no sólo en
células de la glía sino tam bién en neuronas
(IL-1, IL-6, etc.).
Por su parte, el sistema inmune se comporta­
ría como un “órgano neuroendocrino” ya que
sus células activadas producen hormonas peptí­
dicas (ACTH, PRL, GH, etc.) y neuropéptidos
(VIP, SP, encefalinas, etc). Además existen re­
ceptores en células del SI para productos neu-
roendoainos. La síntesis de novo local de mo­
léculas neuroendocrinas, por el sistema inm u­
ne, y citoquinas, por estructuras neuroendocri­
nas, se produce en células activadas y es de­
pendiente del tipo de estímulo (producción in-
ducible) y m enos frecuentem ente de form a
constitutiva. Además, a esta producción local
 El sistema inmune de mucosas 321

de moléculas recíprocas se le atribuye una fun­
ción regulatoria paracrina/autocrina.
Se comprobó para la mayoría de las molécu­
las y receptores compartidos que sus caracterís­
ticas bioquímicas son similares a las que pre­
sentan los tejidos que son la fuente clásica.
Desde el punto de vista filogénico, la inte­
racción entre los sistemas homeostáticos mayo­
res representa la máxima adquisición evolutiva
alcanzada por los vertebrados superiores. La
pluricelularidad llevó a incrementar la comple­
jidad en la organización y función corporal. Sin
embargo, la comunicación celular es esencial
para el intercambio de información de la célula
con su entorno tanto en organismos unicelu­
lares com o p luricelulares. En estos últim os
constituye un mecanismo ancestral y altamente
conservado.
La reciprocidad m olecular estaría tam bién
avalada desde el punto de vista ontogénico. En
los organismos pluricelulares todas sus células
tienen un origen común: el cigoto, estado uni­

Fig. 17-8. Esquem a sim plificado de las interacciones entre sistem as hom eostáticos m ayores a nivel molecular: 11.-1 y glu­
cocorticoides. E stím ulo no cognitivo con capacidad potencial de p ro d u cir una respuesta inm une sistém ica, activ a a un ma­
crófago. Éste produce IL-1 que p or m ecanism o endocrino llega al cerebro y la hipófisis. En estos órganos se p ro d u ce un
aum ento local de esta citoquina (redundancia). L a producción local a través de efectos paracrinos estim ula la liberación
del factor liberador de A C TH y tam bién directam ente sobre la hipófisis la liberación d e ACTH. Esta horm ona ac tiia sobre
la corteza adrenal liberando glucocorticoides que p or retroalim entación inhiben la producción de IL-1 por los m acrófagos,
contribuyendo de esta m anera a la inm unoespecificidad de la respuesta. Los glucocorticoides tam bién inhiben la produc­
ción de A C TH y su factor liberador. (M odificado de E. Blalock, Im m unology Today 15:11, 1994.)
322 Aspectos básicos de la inmunidad

celular resultante de la fecundación. D,e esta
manera todas las células de un mismo indivi­
duo tíenen la misma información genética. La
diversidad celular es el resultado de la expre­
sión diferencial de genes. Por este motivo el
sistema inmune es efector y fuente de produc­
tos neuroendocrinos. Lo mismo ocurre con el
sistem a nervioso. Los efectos de productos
neuroendocrinos y citoquinas dependerá en
parte de la naturaleza del estímulo, que influirá
sobre la concentración y combinación de molé­
culas y, por otro lado, de las característica fe-
notípicas de las células efectoras (grado de di­
ferenciación, estado metabólico, etc.).
Las bases moleculares de la interacción entre
sistemas homeostáticos mayores y sus implican­
cias funcionales se resumen en el cuadro 17-4.
La figura 17-8 muestra uno de los circuitos
moleculares interactivos mejor conocidos: IL-1
y glucocorticoides.
Ventajas conceptuales e implicancias
prácticas
Considerar a los sistemas inmune, nervioso y
neuroendocrino como sistemas homeostáticos
mayores e integrados funcionalm ente confor­
mando un sistema interactivo-adaptativo es la
resultante de un enfoque holístico. Estos siste­
mas interactúan de tal manera que su funciona­
miento tónico le permite un continuo intercam­
bio de información funcional en condiciones fi­
siológicas. Por esta modalidad funcional frente
a estímulos, independientemente de su natura­
leza (cognitivos, no cognitivos), se activan si­
multáneamente.
En este contexto, el sistema inmune puede
enviar señales moleculares al sistema neuroen­
docrino a través de citoquinas (inmunotransmi-
sores con acción sobre “target” neuroendocri­
nos). La capacidad del sistema inmune de res­
ponder a estímulos específicos y de tener una
vía aferente de información hacia el sistema ner­
vioso central, permite postularlo como un órga­
no receptor sensorial (¿nuestro sexto sentido?).
La magnitud de la respuesta inmune puede
ser considerada como una función del estado
psicofisiológico del huésped, que incluye ade­
más de la autorregulación, un nivel externo de
regulación de dicha respuesta. Este nivel exter­
no establece las bases para los potenciales me­
canismos que pueden mediar alteraciones de la
función inm une inducidas por el com porta­
miento. En este sentido, las reacciones alérgi­
cas pueden ser desencadenadas por estímulos
cognitivos (inmunológicamente neutros, pero
que son potentes emocionalmente). Además el
nivel externo de regulación de la respuesta in­
mune permitió a nivel experimental lograr con­
dicionamiento de dicha respuesta. Estos datos
llevaron a extender la denom inación de este
campo multidisciplinario surgiendo el término:
PSICONEUROENDOCRÍNOINMUNOLOGÍA.
La participación permanente y activa de este
sistema interactivo en los estados de salud y
enferm edad avala su extensión en el terreno
farmacológico y terapéutico. Drogas neurotró-
ficas y psicotrófieas pueden modificar la fun­
cionalidad del sistema inmune actuando sobre
la liberación de hormonas del eje hipotálamo-
hipofisario y/o sobre receptores para benzodia-
zepinas presentes en macrófagos.
REGULACIÓN NEUROENDOCRINA
DE LA INMUNIDAD DE MUCOSAS
Características fenotípicas de las mucosas
en general
D urante el desarrollo em brionario normal,
como resultado de interacciones epitelio-m e-
senquimáticas, surge una organización tisular
que, formando parte de la pared de los órganos

Cuadro 17-4. Bases moleculares para el intercambio de información entre los componentes
del Sistema Interactivo

BASES MOLECULARES DE LA COMUNICACIÓN CELULAR ENTRE LOS SISTEMAS HOMEOSTÁ­

TICOS MAYORES

~ Citoquinas - H orm onas - N européptidos

M O L É C U L A S CO M P A R TID A S:
~ N eurotransm isores - Receptores

E F E C TO S: - Pleitrópicos

M E C A N IS M O S D E A C C IÓ N : - Endocrino - A utocrino - Paracrino

PR O D U C C IÓ N Y “T A R G E T ”: - S istem a Inm unoendocrino

SÍN TE SIS: - C onstitutiva - Inducible

 El sistema Inmune de mucosas 323

huecos, recibe el nombre de mucosa. Toda m u­ cos (neuropéptidos) y no peptidérgicos (acetil­

cosa, independientemente de su origen embrio­ colina) (fig. 17-9).
nario, está constituida básicamente por: Estructuras neuroendocrinas están presen­
tes en el intestino representadas por un conjun­
1) Un tejido epitehal en contacto con la luz to de células, predominantemente intraepitelia-
del órgano que, apoyado sobre una membrana les, especializadas en sintetizar y liberar neuro­
basal, se relaciona con 2) el tejido conectivo péptidos. Estas células conforman el sistem a
subepitelial denominado corion o lámina pro­ neuroendocrino difuso de las mucosas, consi­
pia. El componente conectivo de la mucosa im ­ derado el sistema neuroendocrino corporal más
plica la presencia de vasos sanguíneos y linfáti­ extenso.
cos, nervios, agregados linfáticos y diversos ti­ El sistema inmune de mucosas está consti­
pos celulares fijos y migrantes. Por su parte, el tuido por: 1) tejido linfático asociado: infiltra­
componente epitelial ofrece diversidad celular dos linfáticos relativamente constantes; 2) una
y constituye una barrera biológica que interac- población difusa de células inmunes efectoras
túa permanentemente con la luz del órgano. La (leucocitos, linfocitos, macrófagos, mastocitos)
compartimentalización tisular en las mucosas a nivel de la lámina propia, y 3) una población
establece el sustrato morfológico para una gran de leucocitos intraepiteliales. Los leucocitos
variedad de efectos paracrinos entre sus com ­ activados pueden sintetizar y liberar neuropép­
ponentes. Las diferencias regionales en cada tidos (fig. 17-10).
mucosa dependerán de las hojas germinativas De acuerdo con lo mencionado, las tres es­
de donde derivan sus componentes tisulares. tructuras que representan a nivel intestinal a los
El fenotipo básico de las mucosas sustenta la sistem as nervioso, neuroendocrino e inm une
detección de un nivel externo de inmunorregu­ constituyen fuentes tisulares de neuropéptidos.
lación. La mayor parte de la información sobre Esto es una evidencia de redundancia regulato­
regulación neuroendocrina de la inmunidad de ria a nivel molecular.
m ucosas proviene de estudios que analizan Los neuropéptidos más importantes cuanti­
principalmente la influencia neurohormonal so­ tativamente en la mucosa intestinal son: sustan­
bre varios aspectos de la respuesta inmunoin- cia P (SP), péptido intestinal vasoactivo (VIP)
fiamatoria en la mucosa del aparato digestivo, y somatostatina (SOM). Considerados por al­
fundam entalmente a nivel intestinal. Por este gunos autores com o horm onas in testin ales,
motivo centraremos nuestras descripciones de desem peñan un im portante papel regulatorio
acuerdo con datos bibUográficos referidos a la sobre la mucosa intestinal incluyendo el tejido
mucosa intestinal. linfático asociado. SP, VIP y SOM pertenecen
al grupo de péptidos regulatorios. Dentro de es­
C aracterísticas fenotípicas de la mucosa te grupo conforman un subgrupo denominado
intestinal péptidos integrativos. Estos péptidos están lo­
calizados a nivel central (cerebro) y periférico
La pared intestinal contiene subdivisiones al­ (resto del cuerpo). Pueden funcionar como hor­
tam ente especializadas que representan a los monas y neurotransmisores para integrar fun­
sistemas inmune, endocrino y nervioso. La su­ ciones biológicas y psicológicas.
perficie de la mucosa intestinal está especial­
mente diseñada para permitir interacciones en­ Inervación de la mucosa intestinal;
tre nervios, células neuroendrocrinas y del sis­ distribución de fib ras peptidérgicas
tema inmune.
E l sistema nervioso entérico (SNE), consi­ a) Tejido linfático asociado a mucosa. Las
derado el tercer componente del sistema ner­ placas de Peyer son sitios de inducción de res­
vioso autónomo, está formado por una extensa puesta inmune y también de generación de hi-
red de fibras nerviosas simpáticas, parasimpá- porrespuesta específica a antígenos de las m u­
ticas y nervios aferentes sensitivos. Las fibras cosas (tolerancia oral). Dentro de estos agrega­
parasimpáticas son prolongaciones de neuro­ dos linfáticos se demostró la existencia de ner­
nas cuyos cuerpos están incluidos en la pared vios peptidérgicos (SP, SOM, VIP y péptido
del tubo digestivo. En el tracto gastrointestinal relacionado al gen de la calcitonina [CGRP]).
hum ano se estim a que existen alrededor de Las fibras VIP son abundantes en las áreas que
100 millones de neuronas. Los cuerpos neuro­ rodean a las vénulas de endotelio alto post-ca-
nales se localizan predominantemente confor­ pilares. A través de ellas los hnfocitos T y B
mando el com ponente ganglionar del plexo pasan desde la circulación sistém ica h acia la
m ientérico y subm ucoso. E sta descrip ció n mucosa intestinal. Esto implica que el neuro-
confirma la redundancia del sistema a nivel es­ péptido VIP regularía la migración de linfoci­
tructural. El SNE, regula las funciones intesti­ tos en los tejidos linfoides asociados a intestino
nales a través de neurotransmisores peptidérgi- (fig. 17-10).
324 Aspectos básicos de la inmunidad

F ig. 17-9. R epresentación esquem ática de los tejidos y estructuras que integran la pared del intestino delgado (tom ado de
Junqueiras. H istología Básica. Ed. Salvat.)

Los receptores para VIP dentro de las subpo­ distribuyen en tres áreas principales: 1) una
blaciones de linfocitos T están asociados con la densa red alrededor de las criptas glandulares,
Subpoblación CD4+ más que con la CD8+. 2) a lo largo de los capilares, y 3) red sin rela­
Se considera que la sustancia P induce la ex­ ción con las criptas y capilares, estrechamente
presión de E-selectina en el endotelio alto de vinculada con células inm unes efectoras. La
las vénulas. Esta molécula de adhesión induce microscopia electrónica muestra contactos ínti­
la migración de linfocitos y leucocitos. mos entre la membrana plasmática de los ner­
b) Lámina propia. La mayoría de los estu­ vios y linfocitos.
dios referidos a inervación de mucosa intestinal Los nervios cjue contienen SP muestran un
analizaron las neuronas de los plexos mientéri- modelo similar pero menos denso en la lámina
cos y submucosos y su relación con la motili- propia. Establecen contactos íntimos con m as­
dad gastrointestinal. Dentro del intestino delga­ tocitos que son abundantes en la mucosa intes­
do una minoría de los nervios que provienen tinal. Se conoce que la estimulación de nervios
del plexo mientérico y una mayoría de los que puede inducir degranulación (liberación de
provienen del plexo submucoso contienen neu­ aminas vasoactivas) de m astocitos y edem a
ropéptidos. Dado que la mayoría de las células neurogénico. Esto comprueba que los mastoci­
inmunes efectoras están localizadas dentro de tos pueden degranularse por estímulos inmuno-
la lámina propia de la mucosa, el anáhsis de la lógicos y no inmunológicos. Se comprobó que
inervación de este tejido es fundamental para el epitelio, los nervios y los mastocitos interac-
establecer la influencia de los neuropéptidos cionan en los tractos respiratorio y gastrointes­
sobre la inmunidad de mucosas. tinal promoviendo cambios funcionales especí­
A nivel de la lámina propia de la mucosa in­ ficos, antígeno dependientes.
testinal existe un extenso plexo nervioso. Las Las fibras nerviosas peptidérgicas son uno
fibras nerviosas que contienen VIP son los ner­ de los componentes más abundantes de la mu­
vios más abundantes en la lámina propia y se cosa. La identificación de neuropéptidos regu-

Citoquinas
M }crófago
IL-5
If n
IL-6
F ig . 17-10. R epresentación esquem ática de la m ucosa in testin a l N ótese la localización del tejido linfático asociado a m u ­
cosa, células inm unes efectoras y parte de la distribución de las fibras peptidérgicas en contacto con vénulas de en d o telio
alto y con m astocitos de m ucosa (M M ). SP: sustancia P. M odificado de RH Stead y col. (Im m unological Review , 100:333,
1987 ) y de S. Targan (N etiroim m unophysiology of the G astrointestinal M ucosa. Ann. N ew York A ca d Se., 6 6 4 :6 1, 1992).
Latorios en la mucosa, sugiere que su liberación
local puede afectar directamente la función de
las células epiteliales, endoteliales y leucocitos.
Estos diversos tipos celulares responden de
manera paracrina por la presencia de receptores
de membrana plasmática para neuropéptidos.
Regulación neuroendocrina de la respuesta
inmune a nivel de mucosas
En el microambiente de las mucosas, las cé­
lulas del sistema inmune de mucosas están con­
tinuamente expuestas a señales locales y sisté­
micas derivadas de neuropéptidos. Para respon­
der a estas señales neurofisiológicas expresan
receptores. La demostración de receptores para
neuropéptidos sobre los leucocitos fortalece la
idea de que existe interacción entre las células
inmunes efectoras y los nervios peptidérgicos.
Los neuropéptidos influyen sobre una gran
variedad de reacciones inmunes incluidas proli­
feración linfocitaria y activación, síntesis de
anticuerpos, función NK, activación m acrofá­
gica y puesta en libertad de aminas vasoactivas
por mastocitos.
El sistema inmune de mucosas 325
Luz Antígenos
\ Vénula
endotelio
alto
L-4
IL-2^y
IFN
Eosinófllo Neutrófllo
Capilar
La demostración de receptores para n eu ro ­
péptidos sobre células inmunes efectoras, fun­
damenta el nivel externo de regulación neuro-
horm onal de la respuesta inm une a nivel de
mucosas frente a una gran variedad de antíge­
nos que pueden estar presentes en el medio am ­
biente intraluminal del intestino.
Los efectos específicos de los neuropéptidos
sobre la respuesta inmune intestinal depende­
rán del estímulo desencadenante, de la integri­
dad funcional de las fuentes tisulares de neuro­
péptidos y de la cantidad y condiciones fenotí­
picas de las células efectoras. A normalidades
en la inervación peptidérgica pueden conducir
a perturbaciones de la inm unorregulación y
causar daño e inflamación prolongada.
Podemos concluir que las mucosas en g en e­
ral, y la intestinal en particular, presentan las
características fenotípicas en todos los niveles
de organización (funcional, estructural, celular
y molecular) para el permanente intercam bio
de información entre los sistemas hom eostáti­
cos mayores. La estrecha asociación entre fi­
bras peptidérgicas y mastocitos constituye el
sustrato m icroanatóm ico para in tercam bios
326 Aspectos básicos de la inmunidad
m ultidireccionales entre sistemas adaptativos
(inmunorregulaeión del sistema nervioso enté­
rico).
B IB L IO G R A FIA
(Prim era parte)
E l sistem a inm une de m ucosas
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M u co sal Im m unology: Intra ep h ite lia l L ym phocytes. En,
Adv. in H ost D efense M echanism s, Vol 9. Ed. H K iyono
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A C T U A L IZA C IO N E S
“Im m unoglobulin A: Strategic defense initiative at the m u­
cosal surface” . BJ U nderdow n, JM S chiff. A nnual R e­
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“Thym us Índependent T cell developm ent and selection in
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nión in Im m unology, 6:394, 1994.
(Segunda parte)
R egulación neuroendocrina
LIBRO S
N eurom odulation o f im m unity and hypersensitivity. P ro ­
ceed in g s o f a C onference. V olum e E d ito r E.J. G oetzl.
O rganizing C om m ittee E.J. B lalock, J.D Feldm an, E.J.
G oetzl. S upplem ent to T he Journal o f Im unology. Au-
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nal W orkshop on N euroim m unem odulation. Edited by B.
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New York A cadem y o f Sciencie.s, N ew Y ork, 1987.
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C ytokines and the N ervous System I: E xpression and re-
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2, 83, 1995.
C ytokines and the N ervous System II: A ctions and M ech a­
nism s o f A etion. N.J. R othw ell and S.J. H opkins. TIN S,
1 8 :N ° 3 , 130, 1995.
Im m une N euroendoerine Interactions. W. Savino and M.
D ardenne. Im m unology Today, 16: N °7 , 318, 1995.
Regulación de la respuesta inmune
MARTA BRAUN
IN TR O D U C C IÓ N
El sistema inmune, como tocios los sistemas
fisiológicos, es un sistema regulado. Más aun,
dada la peligrosidad potencial de un sistema es­
pecializado en la homeostasis y en la protec­
ción del individuo mediante la agresión contra
lo externo, es lógico suponer que, junto con la
evolución de cada una de sus funciones efecto-
ras agresivas, hayan desarrollado mecanismos
capaces de regularlas. Sin embargo, en los pri­
meros tiempos de la inmunología, se suponía
que la respuesta inmune frente a los antígenos
externos era “todo o nada” : el antígeno ingresa­
ba a un organismo, era reconocido como “ex­
traño” y esto provocaba una respuesta; una
nueva entrada del mismo antígeno provocaba
una respuesta mayor y más rápida, y así sucesi­
vamente. Pronto se dem ostró que esto no es
así: estímulos repetidos con el mismo antígeno
no provocan respuestas cada vez mayores y
hasta pueden causar- una falta de respuesta a ese
antígeno, o tolerancia.
Esta regulación, de la que aún no se conocen
todos sus mecanismos y muchos de los conoci­
dos aún se discuten, está basada en múltiples
sistemas, en los cuales intervienen las propias
células inm unes y los factores que segregan,
señales provenientes del microambiente donde
se produce la reacción y tam bién señales de
otros órganos y sistemas, muy especialmente,
el sistema nervioso central y el endocrino, co­
nectados po r el eje h ip o tálam o -h ip o fisario
(véase cap. 17, segunda parte). El estudio de la
función de estas células implica dificultades, ya
que son aparentemente idénticas entre sí, cam ­
bian permanentemente de lugar y pueden ejer­
cer funciones muy diferentes y hasta contra­
puestas, como de regulación hacia arriba o ha­
18
cia abajo de otra célula. Muchos de los conoci­
mientos fueron adquiridos mediante el estudio
de células aisladas in vitro, lo que significa que
no se sabe todavía si esos mecanismos funcio­
nan de igual manera o no en un organismo ín ­
tegro.
Uno de los primeros arcos regulatorios que
se conoció fue el de retroalimentación negativa
producida por los propios anticuerpos, que hoy
se sabe que es un típico sistema “feed-back” ,
pues también pequeñas cantidades de un an ti­
cuerpo pueden aumentar la respuesta, como ve­
remos luego.
Para esa misma época, se comenzó a c o n o ­
cer la importancia de los hnfocitos T como co ­
laboradores de los B, indispensables para ini­
ciar y m antener Jas respuestas inmunes, y a
com prender que el sistem a inm une no sólo
puede regular en forma cuantitativa sino tam ­
bién cualitatíva, pues regula tanto el nivel g e­
neral como el tipo de Ja respuesta. En efecto,
según una serie de factores que luego veremos,
la respuesta puede hacerse en el sentido celular
o humoral, pasar de un tipo de respuesta a otro
y dentro de cada uno de ellos, pasar, por ejem ­
plo, de una clase de íg a otra. A esta capacidad
del sistema inmune, que hace a su adaptabili­
dad, se la conoce como modulación de la res­
puesta, y si bien aún quedan muchos puntos
por conocer, está basada en la colaboración en­
tre células inmunes y en las influencias del res­
to del organism o. Se ha dem ostrado que las
mismas células capaces de iniciar una respues­
ta pueden también ejercer su regulación hacia
abajo.
Otro concepto fundam ental, que fue c o m ­
prendiéndose poco a poco y hoy es aceptado
universalmente, fue que el sistema inmune no
reconoce y agrede directam ente lo “extraño” ,
326 Aspectos básicos de la inmunidad
m ultidireccionales entre sistemas adaptativos
(inmunorregulación del sistema nervioso enté­
rico).
B IB L IO G R A FIA
(Prim era parte)
E l sistem a inm une de m ucosas
L IBRO S
A dvances in Im m unology. Vol. 20, 1975 y Vol. 22, 1976.
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A cadem ic Press. 1981
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O gra y J B ienenstoek. 81 R oss C onference on P ediatric
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R ecent A dvances in M ucosal Im m unity. Ed. W S trober,
LA H anson y K W Sell. Raven Press. N ew Y ork, 1982.
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the intestinal epithelium ” . P Poussier, M Julius. A nnual
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“Control o f lym phocyte hom ing” . LJ Picker. C urrent O pi­
nión in Im m unology, 6:394, 1994.
(Segunda parte)
R egulación neuroendocrina
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ceed in g s o f a C onference. V olum e E d ito r E.J. C oetzl.
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B erczi, J. Szélenyi. V olum e 3, 1994.
AC T U A L IZA C IO N E S
T he im portanee o f horm ones in the regulation o f the im m u ­
ne System . C rossm an Ch. Im m unology & A llergy P racti­
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Brain, B ehavior and Im m unity: an Interactive system . D.
R. Rubinow . J.N.C.I. M onographies. 10:79, 1990.
Im m une N euroendocrine Circuits: Integrative R ole o f Cy-
tokines. H.O. Besedovsky, A. del Rey. Erontiers in N eu ­
roendocrinology, 13: N° 1, 61, 1992.
N euroim m une M odulation: Signal T ransduction and Cate-
cholam ines. D.A. C ham bers, R.L. Cohén, R.L. Perlm an.
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N euroendocrin e Im m unology. R egulatory In teractions o f
In fla m m a to ry C y to k in e s an d F Iy p o th a la m o -P itu ita ry
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logist, 1/2,40 , 1993.
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d e n n e M . S p rin g e r S e m in a rs in I m m u n o p a th o lo g y ,
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The Syntax o f Im m une N euroendocrine C om m unication.
E, Blalock. Im m unology Today, 15: N° 11, 504, 1994.
T he Influence o f N euroendocrine P atw ays on L ym phocyte
m igration. C. A. O ttaw ay and A .J. H usband. Im m u n o ­
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The Interaction s B etw een M ast C ells and N erv es in the
G astrointestinal Tract. D. M . M cK ay and J. Bienenstoek.
Im m unology Today, 15: N° 11, 533, 1994.
T he Im m une System . O ur Sixth Sense. T he Im m unologyst,
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C ytokines and the N ervous System I: E xpression and re-
cognition. S.J. H opkins and N .J. Rothw ell. TIN S, 18: N°
2, 83, 1995.
C ytokines and the N ervous System II: A ctions and M ech a­
nism s o f A ction. N.J. R othw ell and S.J. H opkins. TIN S,
1 8 :N ° 3 , 130, 1995.
Im m une N euroendocrine Interactions. W. Savino and M.
D ardenne. Im m unology Today, 16: N °7 , 318, 1995.
Regulación de la respuesta inmune
MARTA BRAUN
INTRODUCCIÓN
El sistema inmune, como todos los sistemas
fisiológicos, es un sistema regulado. Más aun,
dada la peligrosidad potencial de un sistema es­
pecializado en la homeostasis y en la protec­
ción del individuo mediante la agresión contra
lo externo, es lógico suponer que, junto con la
evolución de cada una de sus funciones efecto-
ras agresivas, hayan desarrollado mecanismos
capaces de regularlas. Sin embargo, en los pri­
meros tiempos de la inmunología, se suponía
que la respuesta inmune frente a los antígenos
externos era “todo o nada” : el antígeno ingresa­
ba a un organismo, era reconocido como “ex­
traño” y esto provocaba una respuesta; una
nueva entrada del mismo antígeno provocaba
una respuesta mayor y más rápida, y así sucesi­
vamente. Pronto se dem ostró que esto no es
así: estímulos repetidos con el mismo antígeno
no provocan respuestas cada vez mayores y
hasta pueden causar- una falta de respuesta a ese
antígeno, o tolerancia.
Esta regulación, de la que aún no se conocen
todos sus mecanismos y muchos de los conoci­
dos aún se discuten, está basada en múltiples
sistemas, en los cuales intervienen las propias
células inm unes y los factores que segregan,
señales provenientes del microambiente donde
se produce la reacción y tam bién señales de
otros órganos y sistemas, muy especialmente,
el sistema nervioso central y el endocrino, co­
nectados po r el eje h ip o tálam o -h ip o fisario
(véase cap. 17, segunda parte). El estudio de la
función de estas células implica dificultades, ya
que son aparentemente idénticas entre sí, cam ­
bian permanentemente de lugar y pueden ejer­
cer funciones muy diferentes y hasta contra­
puestas, como de regulación hacia arriba o ha­
18
cia abajo de otra célula. Muchos de los conoci­
mientos fueron adquiridos mediante el estudio
de células aisladas in vitro, lo que significa que
no se sabe todavía si esos mecanismos funcio­
nan de igual manera o no en un organismo ín ­
tegro.
Uno de los primeros arcos regulatorios que
se conoció fue el de retroalimentación negativa
producida por los propios anticuerpos, que hoy
se sabe que es un típico sistema “feed-back” ,
pues también pequeñas cantidades de un an ti­
cuerpo pueden aumentar la respuesta, como ve­
remos luego.
Para esa misma época, se comenzó a c o n o ­
cer la importancia de los linfocitos T como co ­
laboradores de los B, indispensables para ini­
ciar y m antener Jas respuestas inmunes, y a
com prender que el sistem a inm une no sólo
puede regular en forma cuantitativa sino tam ­
bién cualitativa, pues regula tanto el nivel g e­
neral como el tipo de Ja respuesta. En efecto,
según una serie de factores que luego veremos,
la respuesta puede hacerse en el sentido celular
o humoral, pasar de un tipo de respuesta a otro
y dentro de cada uno de ellos, pasar, por ejem ­
plo, de una clase de íg a otra. A esta capacidad
del sistema inmune, que hace a su adaptabili­
dad, se la conoce como modulación de la res­
puesta, y si bien aún quedan muchos puntos
por conocer, está basada en la colaboración en­
tre células inmunes y en las influencias del res­
to del organism o. Se ha dem ostrado que las
mismas células capaces de iniciar una respues­
ta pueden también ejercer su regulación hacia
abajo.
Otro concepto fundam ental, que fue c o m ­
prendiéndose poco a poco y hoy es aceptado
universalmente, fue que el sistema inmune no
reconoce y agrede directam ente lo “extraño” ,
328 Aspectos básicos de ia inmunidad
sino que su funcionamiento está basado en el
reconocimiento constante y no agresivo de lo
“propio” , es decir, de los antígenos de histo­
compatibilidad de Clase I y TI unidos a péptidos
propios, y que sólo reacciona frente a modifica­
ciones de lo propio cuando a una de estas molé­
culas se le une un péptido de origen extraño.
Un concepto que se desarrolló en los años
’70 fue que la regulación del sistema inmune
estaba basada en los linfocitos T supresores y
fue cuando se “nombró” al timo “director de la
orquesta inmunológica”. La función supresora
fue adjudicada a los linfocitos T CD8 positivos,
que pronto fueron encontrados presentes y acti­
vos en prácticamente todas las reacciones inmu­
nes, a tal punto que el mismo investigador que
definió por primera vez a los linfocitos T supre­
sores, el Dr. Gershon, llegó a decir que frente a
tanta supresión le llamaba la atención que pu­
diera haber respuestas inmunes positivas. Hoy,
la existencia de linfocitos T supresores está
muy discutida; ello puede deberse no sólo a que
no se ha encontrado un linfocito identificable
que inhiba siempre a todas las respuestas inmu­
nes, sino a que diferentes subpoblaciones de hn­
focitos T pueden aumentar un tipo de respuesta
mientras que disminuyen otras o bien aumentar
o disminuir una misma respuesta según las se­
ñales que reciben de otros linfocitos o del me­
dio ambiente, como veremos más adelante.
Por todo esto se comprenderá que no se co­
nocen todavía todos los circuitos regulatorios
del sistema inmune y que muchos de los con­
ceptos que siguen pueden estar sujetos a revi­
sión.
LA COLABORACION CELULAR
EN LA RESPU ESTA INMUNE
G eneralidades. Las citoquinas
Desde hace mucho tiempo se conoce que la
respuesta inmune, tanto humoral como celular,
no es llevada a cabo por la intervención de un
solo tipo celular, sino que está dada por la inte­
racción de varios. Puede representarse como
una cascada, altamente regulada en cada uno
de sus pasos, en la que intervienen células con
diferentes funciones y formas de maduración,
esquematizada en la figura 2-8, capítulo 2.
Esta multiplicidad de acción permite al siste­
ma inm une tener una enorm e flexibilidad o
adaptabilidad, que se traduce en una gran efica­
cia cada vez que se le presenta el caso concreto
de la defensa contra algún agente invasor. Al
mismo tiempo, al ser regulable en muchos pun­
tos distintos, esta cascada provee al sistema de
m últiples m ecanism os de reaseg u ro co n tra
reacciones nocivas.
Tiene como contrapartida una cierta lentitud
en la respuesta: en efecto, desde la primera en­
trada de un antígeno desconocido hasta la apa­
rición de una respuesta, por ejemplo, la síntesis
de anticuerpos contra él, pasa cierto tiempo. Si
bien existen clones capaces de reconocer cual­
quier antígeno antes de su entrada, las células
que los componen son pocas en número y, ade­
más, están en estado precursor, no activo, y de­
ben sufrir una serie de mitosis antes de diferen­
ciarse a células efectoras. Además, para que es­
to suceda, deben intervenir otras células cola­
boradoras, que tam bién son pocas y están en
estado de precursoras y también deben sufrir
mitosis y diferenciación. Durante estas diferen­
ciaciones en cadena pasa cierto tiempo, y pue­
de sobrevenir la enfermedad, si los sistem as
inespecífícos de defensa fueron insuficientes
para la protección del individuo.
Muchas de las células específicas que inter­
vienen en cada uno de estos pasos no mueren
después de cumplir con su función, sino que se
retrotraen a un estado de reposo; en este estado,
si bien siguen reconociendo al mismo antígeno,
no son funcionalmente iguales a la célula vir­
gen que les dio origen, y van a reaccionar en
forma diferente al encontrar nuevamente a ese
antígeno. La concentración en que lo recono­
cen y la necesidad de otras señales para ser ac­
tivadas cambian, y cambia también la naturale­
za de la sustancias que segregan al ser activa­
das. Es decir, cada vez que un linfocito es esti­
mulado, entra en mitosis y sufre una diferen­
ciación que implica un cambio en su programa
de activación y respuesta; esto hace que las cé­
lulas resultantes no sólo estén en mayor núme­
ro que antes de la entrada del antígeno (expan­
sión clonal) sino también que sean funcional­
mente diferentes y más aptas. En esta expan­
sión y en este cambio funcional reside la m e­
m oria del sistem a inm une y la facultad para
que las respuestas secundarias sean más rápi­
das y más eficientes que las primarias. Esta es
la razón por la cual un individuo que ya ha co­
nocido al antígeno, ya sea por enfermedad pre­
via o por vacunación, no enferme, pues sus res­
puestas son más rápidas y eficientes.
En líneas generales puede decirse que, para
una respuesta humoral, los hnfocitos B deben
recibir una señal de activación del antígeno, al
que reconocen directamente por sus Igs de su­
perficie; esta señal los hace capaces de recibir
los mensajes que le envían los linfocitos T co­
laboradores. A su vez, estos mensajes induci­
rán en los hnfocitos B mitosis, “switch”, muta­
ciones puntuales y diferenciación a plasmocitos
o linfocitos B de memoria.
Para la activación de los linfocitos T que co­
laboran con ellos, la cosa es más complicada,
pues éstos reconocen al antígeno sólo si está

procesado, es decir, si le es presentado como
péptido unido a una molécula de antígeno del
CMH por una célula especializada en presenta­
ción; ya aquí deben intervenir dos poblaciones
diferentes. Además, debe recibir señales coesti-
mulatorias que le envía la célula presentadora.
Recién entonces, y dependiendo de una serie
de factores del microambiente, el linfocito T se
diferencia a célula efectora de colaboración.
Estos conocimientos fueron muy difíciles de
entender cuando comenzaron a estudiarse los
mecanismos de colaboración celular, mediante
experimentos con células provenientes de indi­
viduos previam ente inmunizados. Primero se
demostró que, para la respuesta humoral, tanto
in vivo como in vitro, eran necesarios linfoci­
tos T y B. Luego se vio que, para la respuesta
mitótica in vitro de linfocitos T sensibilizados,
eran necesarios dos tipos de células; los linfoci­
tos T y una población adherente al vidrio. A si­
mismo, para otras respuestas in vitro, interve­
nían tres poblaciones celulares, una de ellas ad­
herente. Pronto se demostró que esas células
adherentes eran macrófagos, que debían expre­
sar antígenos de histocompatibilidad de clase
II, y que ellos y los linfocitos debían provenir
de un mismo animal, o de dos idénticos en sus
antígenos de histocompatibihdad, para que hu­
biera reacción. Una restricción similar se d e­
mostró con la citotoxicidad; las células “blan­
co” debían tener los mismos alelos que las cé­
lulas que habían pre-sensibilizado a los linfoci­
tos T citotóxicos. La comprobación del recono­
cimiento dual del linfocito T provocó una serie
de polémicas y estudios, que lograron esclare­
cer, en los últim os años, los mecanismos de
presentación del antígeno y su reconocimiento
por el linfocito T (véanse caps. 2 y 13).
La necesidad de contacto o no entre las célu­
las para la colaboración fue otro punto que pro­
vocó tam bién polém icas. En algunos experi­
mentos se demostró la necesidad de contacto
físico entre macrófagos y linfocitos T o entre
linfocitos T y B. Sin em bargo, otros experi­
mentos demostraron que los sobrenadantes de
cultivos de macrófagos y de linfocitos T podían
actuar aumentando la respuesta de linfocitos fí­
sicamente separados. Así se demostró que los
macrófagos y los linfocitos Th sintetizan y se­
cretan factores, llamados citoquinas, capaces
de activar otras poblaciones. En un primer m o­
mento, se pensó que estos factores eran especí­
ficos para el antígeno, pues éste era necesario
para su acción. Luego se comprobó que el efec­
to del antígeno es inducir, en las células especí­
ficas que lo reconocen, la síntesis y expresión
de receptores para las citoquinas, pero que és­
tas no reconocen antígenos, es decir, son ines­
pecíficas. Se comprobó también que las cito-
quinas actúan en forma autocrina y paracrina.
Regulación de la respuesta inmune 329
es decir, sobre la misma célula que las produjo
y sobre células cercanas, y también se dem os­
tró que pueden actuar a distancia, com o las
hormonas, y de esta manera ejercer efectos so­
bre otros órganos y tejidos.
Entre las citoquinas más importantes en la
respuesta inmune, las primeras en ser definidas
fueron las linfoquinas, cuando se estudiaron los
mecanismos de inmunidad celular, y se las des­
cribió como producidas por linfocitos T sensi­
bilizados y con efecto sobre los macrófagos y
otras células. Sus nombres se atuvieron a su
función y durante mucho tiempo hubo una gran
confusión sobre la identidad y realidad de estos
factores. Luego se habló de las m onoquinas,
producidas por los macrófagos, con efectos so­
bre células inmunes. Finalmente se definieron
las interleuquinas (IL), o mensajeros p a ra la
comunicación entre leucocitos, producidas por
los linfocitos Th y con efectos principalmente
sobre los linfocitos B; estas IL fueron n o m ­
brándose por números consecutivos, según se
fueron identificando fehacientemente por aisla­
miento de sus genes.
N inguno de estos nombres se atiene a una
realidad estricta, sino más bien a las circuns­
tancias de su descubrimiento y a la tradición;
por ejem plo, la IL l es producida, p rin cip al­
mente, por los macrófagos y, si bien tiene efec­
tos importantes sobre los linfocitos, tiene efec­
tos sistémicos aun más importantes. Además,
muchas ILs son producidas también por células
no inmunes. Esta falla de la nom enclatura ha
producido y sigue produciendo múltiples con­
fusiones.
A ctualm ente, se siguen aislando genes de
ILs producidas por células comprometidas en
las respuestas inmunes. Para una hsta de las ci­
toquinas hoy conocidas y sus principales efec­
tos, véase el capítulo 12.
Con respecto a las funciones de las ILs, de­
ben tenerse en cuenta varios conceptos. Por
una parte, si bien los linfocitos las producen y
secretan por efecto de un estímulo específico,
sus acción sobre otras células es inespecífica,
es decir, actúan sobre cualquier célula que pre­
sente receptores para ellas en su superficie. Pa­
ra que actúen sobre un linfocito, éste debe de
haber tenido contacto recientemente con el an­
tígeno y expresar así receptores. Por otra parte,
muchas ILs y hnfoquinas pueden ser produci­
das por células no linfoides, como macrófagos
o células dendríticas, comprometidas en la res­
puesta inmune, pero también por otras células
del organismo con funciones no estrictamente
relacionadas, como las del sistem a nervioso
central. Asimismo, sus efectos van más allá de
la respuesta inmune y de la inflamación, pues
son capaces de actuar sobre células que no per­
tenecen al sistem a inm une, desde el h ígado
330 Aspectos básicos de ia inmunidad
hasta el sistema nervioso central. Finalmente, y
la im portancia de este concepto va tom ando
más cuerpo cada día, la mayoría de las TLs no
acttian solas, sino en forma de una red compli­
cada; sobre una célula actúan varias ILs en for­
ma coordinada y el resultado final de su acción
depende de la com binación que actúa, de la
concentración de cada una de ellas y, además,
de otras señales del microambiente.
Dado que la mayoría de los conocimientos
sobre la función de las ILs y de las subpobla­
ciones de linfocitos que las producen, han sido
obtenidos mediante el estudio in vitro de líneas
de linfocitos T, su verdadera función in vivo es
difícil de conocer aún. El resultado final del
efecto de las ILs sobre una célula particular in
vivo, por influencia del m icroam biente y de
otras citoquinas aún no conocidas, puede ser
muy diferente del que puede verse in vitro,
cuando se usan ÍLs puras o en mezclas. Esto se
ve agravado porque aún no se conocen todas y
permanentemente se están aislando nuevos fac­
tores celulares, cuyas funciones deben ser aún
develadas. Todo esto hace que existan todavía
muchas diferencias de opinión sobre los pape­
les individuales de cada una de ellas.
La mayoría de los estudios se han hecho con
líneas in vitro de células T productoras de cito-
quinas de ratones y de humanos. Estas dos es­
pecies muestran grandes homologías, pero no
siempre son idénticas, de modo que se debe ser
cauto en las extrapolaciones. El estudio de
otras especies de vertebrados superiores está
mostrando analogías y diferencias que perm i­
ten adoptar ciertos conceptos generales que, si
bien pueden ser útiles, son a menudo sobresim-
plificaciones.
El descubrimiento de los efectos tan im por­
tantes de las citoquinas en la respuesta inmune
y la posibilidad de aislarlas en pureza, así como
obtenerlas por ingeniería genética, ya que la
mayoría de sus genes han sido clonados, hizo
que se trataran de utilizar en la manipulación
terapéutica del sistema inmune, especialmente
en la inmunoterapia del cáncer y como activa­
dores inespecíficos o específicos del sistema.
Sin embargo, dado que la mayoría de las linfo­
quinas actúan en forma de red, con efectos que
hasta pueden ser contrarios a lo esperado según
las circunstancias, y el hecho de que casi todas
tengan efectos sistémicos que pueden ser tóxi­
cos si la citoquina se usa en dosis terapéuticas,
estos ensayos no dieron Jos resultados espera­
dos.
La posibilidad de transfectar o ehminar ge­
nes de las ILs en animales de experimentación
permitió el estudio in vivo. Actualmente, se es­
tán usando métodos de transfección de estos
genes en células que forman parte o migran a
un tumor, a fin de concentrar su producción en
la zona o para realizar “vacunas” contra ciertos
tipos de tumores. Pero para poder usarlas con
éxito como estimulantes de la respuesta inmu­
ne, deberán conocerse mejor sus interacciones,
tanto entre ellas como con el microambiente en
dónde se produce la respuesta.
Colaboración macrófago/linfocitos T.
Diferenciación de los linfocitos T vírgenes
La activación de los linfocitos Th es un paso
esencial en la iniciación de prácticamente todas
las respuestas inmunes específicas y requiere la
participación de células presentadoras especia­
lizadas, pues los principales colaboradores, los
linfocitos CD4+, sólo reconocen péptidos uni­
dos a antígenos de histocompatibilidad de clase
II. Por ello, la función principal de las células
de la línea monocito-macrófago que expresan
Clase II es Ja presentación de antígeno procesa­
do a Jos linfocitos Th. La forma en que ellas
procesan y presentan el antígeno y el complejo
molecular que usan los linfocitos T para reco­
nocerlo, fueron expuestas en el capítulo 2.
Con los conocimientos actuales se entiende
fácilmente que, en los experimentos in vitro,
deba haber identidad entre los antígenos que
expresa el macrófago y los del individuo del
cual provienen los linfocitos, pues los antíge­
nos de InstocompatibiJidad que reconocen los
linfocitos T son sólo los propios, ya que así han
sido seleccionados en el timo (véase cap. 3).
Por otra parte, la necesidad de reconocer lo
propio por parte del linfocito T explica el apa­
rente gasto de la selección tímica positiva, pues
gracias a ella los órganos linfáticos secundarios
no se ven atorados por linfocitos inútiles.
Los macrófagos que han captado una partí­
cula la digieren y exponen sus péptidos unidos
a las moléculas de Clase II que salen a su su­
perficie; de esa m anera un linfocito TCD4+
puede reconocer el antígeno para el cual está
precom prom etido. Pero este solo re c o n o c i­
miento no es suficiente para activar un linfocito
T virgen o precursor. Para ello es necesario un
contacto íntimo y relativamente prolongado en­
tre ambas células, que está asegurado por una
serie de moléculas de adhesión en ambas su­
perficies, entre las que se cuentan p rincipal­
mente las moléculas CD4, que interactúan con
la parte invariante del antígeno de Clase II, y
otra serie de moléculas que actúan como coac-
tivadoras. En efecto, en estos últimos años se
ha descubierto la necesidad de, por lo menos,
una segunda señal para la activación de los lin­
focitos Th. Estas señales accesorias no sólo
perm iten la activación del linfocito Th, sino
que participarán, como veremos luego, en la
elección del camino de diferenciación que se­
guirá iuego el linfocito Th precursor. Las prin­

cipales moléculas coactivadoras fueron descri­
tas en el capítulo 13. Entre ellas, las que han si­
do identificadas como capaces de intervenir en
la diferenciación futura del linfocito T, están la
IL l y la molécula B7 de la superficie de las cé­
lulas presentadoras de antígenos.
La IL L producida por los macrófagos luego
de estim ulación por diferentes factores, entre
los cuales se cuenta la ingestión de partículas,
fue considerada, durante algunos años, como
una molécula fundamenta] para la activación
de los linfocitos T. Luego se comprobó que, en
muchas situaciones, la IL l no es necesaria ni
suficiente para ello, pero que tiene en cambio
una serie de efectos sistémicos, no relacionados
con la respuesta específica, como la inducción
de fiebre, somnolencia, malestar y caquexia, la
reabsorción del cartílago, etc. Hoy se admite
que la IL l tiene efecto como segunda señal,
que ésta no se ejerce necesariamente a distan­
cia sino que se haría por el contacto célula/cé­
lula y que tiene un papel muy importante en el
camino de diferenciación del linfocito pues, co­
mo veremos luego, induce la función Th2.
Otra segunda señal conocida es la interac­
ción de la molécula B7, que se expresa en la
superficie de las células presentadoras de antí­
geno, con la molécula CD28, que se expresa en
los linfocitos Th. La interacción entre estas dos
moléculas llevaría aJ linfocito Th hacia la inun­
ción T hl.
La existencia de otras moléculas que puedan
actuar como segunda señal explica la discusión
sobre la necesidad o no de IL l en la activación
de los linfocitos T y es posible que existan otras
segundas señales, capaces de influir sobre la di­
ferenciación del linfocito Th que aiín no se co­
nocen. Sean cuales fueren las señales que acom­
pañan al antígeno, el resultado de esta interac­
ción múltiple es que se activan en el linfocito
Th virgen dos fenómenos muy importantes: la
síntesis y expresión superficial de receptores de
alta afinidad para IL2 y la síntesis y secreción
de IL2. Dado que es posible que existan linfoci­
tos presensibilizados que continúen respondien­
do de esta manera, es decir, por secreción de
IL2, muchos autores llaman precursores (pTh) a
este fenotipo funcional de Th.
Además de otras funciones extra-inmunes, la
IL2 tiene como efecto principal la inducción de
mitosis en las células que componen el sistema
inmune específico. Como cualquier IL, la IL2
no es específica para el antígeno, pero su efecto
depende de que existan en la célula receptores
para ella. El hecho de que sólo las células que
están siendo activadas específicamente por el
antígeno expresen estos receptores, lim ita el
efecto policlonal de la IL2.
AJ respecto cabe decir que la síntesis de re­
ceptores se produce cuando hay activación por
Regulación de la respuesta inmune 331
el antígeno, pero se hace en forma explosiva y
corta y, cuando el linfocito se separa de la célu­
la presentadora y com ienza su desdiferencia­
ción y mitosis, deja de sintetizar receptores pa­
ra IL-2 (RIL-2). Como éstos tienen bajo “tur­
nover” en la superficie celular, las células hijas
los expresarán todavía, si bien en la m itad o
menos de la concentración que tenía la célula
madre, y podrán continuar siendo estimuladas
por la IL2 que se produce en la zona. Pero, a
medida que se induzcan más mitosis, la canti­
dad de moléculas descenderá hasta debajo del
umbral y el linfocito volverá al reposo.
Estos linfocitos que vuelven al reposo no son
iguales, como ya se dijo, al que les dio origen.
En general, las mitosis en el sistema inm une
van acompañadas por una diferenciación, por
la puesta en marcha de un nuevo programa. En­
tre los linfocitos Th, pueden ponerse en marcha
dos programas diferentes, que darán com o re­
sultado dos fenotipos distintos, T h l y Th2, que
pueden individualizarse por la cantidad de m o­
léculas CD35RO que expresan en su superficie.
Estos dos fenotipos polares tienen funciones
distintas, pues van a dirigir al sistema inm une
hacia una respuesta de tipo celular o humoral,
respectivamente. Debe tenerse en cuenta que la
división en estas subpoblaciones es una sobre-
simplificación, pues sus funciones no son tan
rígidas como aquí se expresa; además, están
bien descritos y diferenciados en el ratón pero
no tanto en el hombre. En éste y otras especies
se habla de linfocitos tipo Th l o Th2 y se han
encontrado linfocitos con fenotipos in term e­
dios, a los que se llama ThO.
Haciendo esta salvedad, puede decirse que
los Th 1, ya sea un tiempo después de su prim er
contacto con el antígeno (sensibihzación) o en
contactos posteriores con él, pasan a secretar,
adem ás de la IL2, una serie de linfoquinas,
principalmente interferón y (IFNy) y factor de
necrosis tumoral (3 (TNFp) que, como se verá
en el capítulo 12, son las principales activado-
ras de los macrófagos y de los linfocitos citotó­
xicos, es decir, son las efectoras de la inm uni­
dad m ediada por células. Adem ás, secretan
1L12 (que tiene un importante efecto en la dife­
renciación de los linfocitos Th vírgenes en lin­
focitos T hl y su activación), IL6 y probable­
mente ILIO.
Los Th2, en iguales circunstancias, dejan de
secretar IL2 y pasan a producir otras ILs, entre
las que se cuentan las IL4, IL5, IL7, IL9, ILIO
e I L l3. Estas ILs tienen efecto sobre la prolife­
ración y la diferenciación de los linfocitos B y
sobre la secreción de Igs y también actúan so­
bre la diferenciación de los linfocitos vírgenes
en T h l o Th2.
C om o se dijo antes, se han encontrado lí­
neas celulares ThO que producen IL2, IFN (tí­
332 Aspectos básicos de la inmunidad

picos de las T lil) e 1L4 (propia de las Th2) si­
multáneamente, lo cual demuestra que sólo al­
gunas de las células T sensibilizadas están tan
polarizadas como se pensó en un primer m o­
mento.
Si bien la ÍL2 es necesaria para la diferencia­
ción de los linfocitos vírgenes o precursores,
productores de IL2, en linfocitos T h l o Th2,
una serie de factores inclina la balanza hacia la
aparición de uno u otro fenotipo, según puede
verse en la figura 18-1. Estos han sido bien es­
tudiados in vitro en el ratón y son menos cono­
cidos y no siempre iguales en el hombre.
Para que se desarrollen linfocitos T h l, pro­
ductores de IFNy, se ha postulado como impor­
tante que la segunda señal se haga a través de
la interacción del B7 con el CD28; además, la
presencia de IFNy e IL 12 aumenta la diferen­
ciación hacia Th 1. Por el contrario, la presencia
de IL4 inhibe la transformación de los T vírge­
nes en T hl. Es posible que otros factores del
antígeno y de su forma de presentación, así co­
mo del microambiente, tengan también inter­
vención.
De forma similar, hay factores que estimulan
e inhiben la transformación de precursores a
Th2 (fig. 18-1). La presencia de IL4 parece in­
dispensable para la diferenciación a Th2 y tam­
bién se aumenta la transformación hacia Th2,
si la segunda señal es a través de la IL l, mien­
tras que el IFNy y ia IL I2, en algunas circuns­
tancias, la dism inuyen. D eben considerarse
también otros factores provenientes de la forma
de presentación del antígeno y otros muy im ­
portantes del microambiente.
Finalmente debe tenerse en cuenta que no to­
das las citoquinas actúan de la misma forma en
todas las circunstancias: como ya se dijo, en
general actúan en forma de red, su efecto puede
depender de la concentración y las interaccio­
nes entre ellas pueden influir sobre el resultado
final.

IFNy

Activación de
macrófagos

IL-12

Fig. 18-1. Se m uestran las principales interacciones celulares en la activación de los m acrófagos y la relación de los lin fo ­
citos C D 4+ con los CD8+. 1.a función de las interleuquinas puede ejercerse tanto en la diferenciación de los linfocitos v ír­
genes CD + a T h l o Th2, com o en la proliferación y secreción de factores por parte de éstos. Las interacciones que llevan a
un aum ento de la función están dibujadas en azul; las que llevan a una dism inución de la función, en rojo. Los factores
m ás característicos e im portantes de los T h l y Th2 están en “negrita” .

Si bien los linfocitos Th vírgenes podrían es­
tar precom prom etidos para una u otra de las
funciones, se ha demostrado in vitro que líneas
de una u otra clase de Th pueden cambiar su
fenotipo en presencia de los factores antes
mencionados; incluso se ha logrado que una lí­
nea de linfocitos T citotóxicos, secretores de
IL2 e IFNy, pasaran a tener un fenotipo típico
de linfocito Th2, con secreción de IL4, 5 y 7.
Haya precompromiso o no, lo que sí resulta de
estos fenotipos en muchos casos es una autoes-
timulación, con inhibición de la función contra­
ria, por efecto de los mismos factores que ellos
secretan, es decir, una regulación cruzada.
Esto explica el balance que puede verse en
las respuestas inmunes humorales y celulares,
en las que, generalmente, cuando una está au­
mentada la otra está disminuida y viceversa. Un
ejemplo típico de esto es la lepra, en la cual
pueden haber individuos con muy altas respues­
tas celulares, que llevan a importantes datios ti­
sulares pero hacen más fácil la curación (lepra
tuberculoide), o individuos con respuestas casi
exclusivamente humorales, donde la curación
es más difícil (lepra lepromatosa). Explica asi­
mismo la dificultad que se tiene clínicamente en
modular la respuesta en uno u otro sentido. Pero
así como entre las formas polares de la lepra
hay formas intermedias, entre los linfocitos Th
también hay formas intermedias, los ThO.
No obstante que estas consideraciones se
han referido a los linfocitos T CD4+, debe te­
nerse en cuenta que la diferencia funcional en­
tre éstos y los CD8+ no es tan rígida como se
supuso en un primer momento, en que se atri­
buía a estos últimos sólo la función citotóxica/
supresora y sólo a los CD4'' la función colabo­
radora.
En efecto, por una parte, los CD8+ además
de ser citotóxicos, secretan linfoquinas y existe
entre ellos una heterogenicidad similar a la de
los CD4+. En general, los CD8+ citotóxicos
producen factores similares a los de los T h l,
principalmente IL2, IL l O e IFNy, y se han ais­
lado clones “supresores” que secretan IL5 pero
no IL4, y también clones tipo Th2, secretores
de IL4 e IL5. La función de estas células in vi­
vo todavía está por dilucidarse. Por otra parte,
si bien la mayoría de los linfocitos CD4+ ejer­
cen función colaboradora, también pueden ser
citotóxicos y muchos clones T h l lo son. Inclu­
so podrían ser citolíticos contra los propios lin­
focitos B que les presentan antígenos, contribu­
yendo así a la regulación negativa de las res­
puestas inmunes.
Colaboración linfocito T-linfocito B
Los linfocitos B pueden reconocer y ligar a
los antígenos a través de su Ig superficial espe­
Regulación de la respuesta inmune 333
cífica. Pero este reconocimiento no es suficien­
te (salvo en el caso de los antígenos timo-inde-
pendientes) para estimular la respuesta. Frente
a antígenos proteicos, sólo hay una diferencia­
ción del linfocito B, que se traduce en la sínte­
sis y secreción de Igs, cuando hay interacción
entre linfocitos T y B.
La existencia de- esta necesidad de colabora­
ción se conoce desde hace tiempo, cuando se
estudiaron ratones irradiados y repoblados con
poblaciones linfocitarias de diferentes o ríg e­
nes; se vio que para la inducción de síntesis de
anticuerpos era necesario que se repoblaran con
linfocitos de médula ósea (que se sabe son ri­
cos en linfocitos B) y de timo o conducto linfá­
tico (ricos en linfocitos T). Luego se demostró
que los linfocitos derivados de la médula ósea
son los precursores de las células secretoras de
Ig y que los derivados del timo no producen
nunca anticuerpos, pero que aumentan la fun­
ción de aquéllos. Finalmente se demostró que
ambas poblaciones deben reconocer específica­
mente al antígeno para que se desarrolle la res­
puesta de anticuerpos.
Otra serie de experimentos que demostró la
existencia de colaboración entre ambas pobla­
ciones fue la realizada mediante la transferen­
cia a ratones irradiados de células de ratones
preinmunizados con diferentes combinaciones
de haptenos y “carriers”. En ellos se m idió la
síntesis de anticuerpos contra el hapteno y se
demostró que, para que se produjera una res­
puesta secundaria, los ratones dadores debían
ser sensibilizados con el mismo “carrier” que
se usaba luego para reinm unizar los ratones
transferidos. Estos resultados dieron pie a gran­
des polémicas, pero demostraron que los linfo­
citos T podían sensibilizarse con el “carrier” y
actuar sinergísticamente con linfocitos B que
habían reconocido al hapteno. Dado que ahora
sabemos que los linfocitos T y B no reconocen
de la m ism a manera y que las bibliotecas de
ambos son diferentes, estos experimentos son
fáciles de comprender en estos momentos.
Estos y otros resultados demostraron la exis­
tencia de los linfocitos colaboradores. Sin em ­
bargo, el mecanismo íntimo de la colaboración
entre ambas poblaciones, fue más difícil de di­
lucidar y es más complejo de lo que se suponía,
pues implica dos tipos de interacciones: por una
parte, los linfocitos T producen factores que in­
ducen en el linfocito B la síntesis de Igs de se­
creción y, por la otra, el linfocito B puede pre­
sentar al linfocito T el antígeno (para esta fun­
ción, véanse caps. 2 y 13). Además, el linfocito
T no sólo induce la secreción de Ig en el linfoci­
to B, sino que induce mitosis, acompañadas por
“switch” y mutaciones puntuales en la región
variable de la cadena, y diferenciación a plas­
mocitos o a células de memoria.
334 Aspectos básicos de ia inmunidad
Hoy se sabe que la simple interacción entre
el ligando específico con las Igs superficiales
del linfocito B induce una activación que, en la
mayoría de los casos, sólo se manifiesta en la
síntesi.s y expresión en su superficie de recepto­
res de alta afinidad para las lis, especialmente
IL2. Sólo en el caso de antígenos timoindepen-
dientes, capaces de efectos posteriores, por su
mitogenieidad intrínseca o por la presencia de
determ inantes repetitivos, esta activación se
acompaña de mitosis y secreción de Igs, pero
no se produce el “switch”, de modo que sólo se
secreta IgM, y no hay diferenciación a linfoci­
tos B de memoria.
Para que se den estos fenómenos debe haber,
en el medio que rodea al linfocito B, ILs pro­
ducidas por los Hnfocitos Th y éstas podrán ac­
tuar sólo sobre los linfocitos B que hayan reco­
nocido al antígeno y que, por lo tanto, expresen
receptores para ellas. Una vez más, la especifi­
cidad de la acción de las ILs está dada por la
activación previa de los clones específicos para
el antígeno inductor de la activación.
El efecto de las diferentes ILs sobre cada
una de las funciones del linfocito B ha sido
muy discutido y existen diferencias entre las
distintas especies. Nuevamente aquí, debe te­
nerse en cuenta que las ILs actúan sinergística-
mente entre ellas y, de la combinación de ILs
que actúan en el sitio donde se halla el linfocito
B y de otros factores del microambiente, será el
resultado que se obtenga, sobre todo, la clase
de Ig que se secrete.
Desde hace tiempo se conoce que algunos
factores tienen especial efecto mitogénico so­
bre los linfocitos B; éstos fueron llam ados
BCGF (B cell growth factors). Hoy se atribuye
a la IL2, y muy especialmente a la IL4, la fun­
ción de inducir las mitosis en los linfocitos B.
La IL4 tiene un papel fundamental en la res­
puesta de anticuerpos. Si bien esta interleuqui­
na puede ser producida por otras células (linfo­
citos recién emigrados del timo y células de la
línea basófilo-mastocito y tal vez otras no co­
nocidas aún) la principal fuente de IL4 son los
linfocitos tipo Th2. Si se considera que tam ­
bién es necesaria para la inducción de células
Th2 y es mitogénica para ellas, mientras que
inhibe las mitosis de las T h l, su papel no que­
da sólo en la inducción de mitosis en los linfo­
citos B sino que pasa a modular la respuesta en
forma tal que se mantenga como una respuesta
humoral.
Otros factores influyen en la diferenciación
celular. En un primer momento se supuso un
factor único, que fue llamado BCDF (B cell di-
ferenciation factor), pero actualmente se sabe
que en la diferenciación actúan varios de ellos.
Varias ILs pueden inducir el “switch”; entre
éstas se han responsabilizado a la IL4, la IL5 y
tal vez las IL6 y las IL7. Actualmente se co n si-'
dera que la IL5 es la principal inducidora de
“switch”, pero nuevamente aquí lo que parece
determinar el isotipo de Ig que se producirá se­
ría la combinación de varias ILs. Por ejemplo,
se ha visto en linfocitos humanos que la suma
de factores producidos por los linfocitos Th2,
en presencia de antígeno, puede inducir síntesis
in vitro de IgM, IgG, IgA e IgE. También in vi­
tro, los linfocitos T h l, si están en una relación
baja con respecto a los B, pueden inducir en és­
tos síntesis de IgM, IgG e IgA pero no IgE,
mientras que cuando están en en alta propor­
ción, inhiben la respuesta de anticuerpos, tal
vez por citólisis de los linfocitos B que recono­
cieron y le presentan el antígeno.
Una serie de observaciones y experimentos
han demostrado que, para la diferenciación del
linfocito B virgen en un linfocito de B memo­
ria, los linfocitos T son indispensables, pero es
posible que aquí también varias ILs actúen si-
nergísticamente. Si se tiene en cuenta que un
linfocito B de memoria se diferencia de uno vir­
gen en varios aspectos, no sólo en su mayor so­
brevida, sino también en sus patrones de migra­
ción, la presencia de “switch” y su capacidad de
presentar antígenos a los linfocitos T, es posible
suponer que varias ILs tuvieron que actuar.
Por últim o, debe tenerse en cuenta el m i­
croambiente en que se produce la interacción
T-B. En efecto, esta interacción tiene lugar casi
siempre en los órganos secundarios y más es­
pecíficamente en los folículos primarios, cons­
tituidos principalmente por linfocitos B. Luego
de la entrada de un antígeno, las prolongacio­
nes de las células dendríticas, portadoras del
antígeno, penetran en el folículo, y también pe­
netran los linfocitos T que han sido estim ula­
dos en la región timodependiente, convirtién­
dolo así en un folículo secundario. La impor­
tancia del medio ambiente se comprende si se
tiene en cuenta que, si el antígeno ha penetrado
por piel o sangre, de manera que la interacción
se produce en los ganglios aferentes o en el ba­
zo, respectivamente, el resultado es la síntesis
en proporción mayoritaria de Igs de las diferen­
tes subclases de IgG, mientras que, si la pene­
tración del antígeno fue a través de las muco­
sas, de modo que la interacción se hace en el
tejido linfoide asociado a éstas, el resultado es
una síntesis de una gran proporción de IgA y,
en menor medida, IgE, que priman sobre la sín­
tesis de IgG.
Interacción T-T. Regulación
de los linfocitos T
La interacción entre diferentes subpoblacio­
nes de linfocitos T se comenzó a conocer cuan­
do se comprobó que la repoblación de animales

irradiados, con linfocitos T provenientes de di­
ferentes órganos, podía llevar a una acción si-
nergística entre sí. Más tarde, se demostró que
cuando los linfocitos T provenían de animales
hechos tolerantes a un antígeno, podían disnoi-
nuir la respuesta de los linfocitos de un animal
con una reacción positiva a ese mismo antíge­
no, lo que llevó a la postulación de la existen­
cia de linfocitos T supresores. Hoy se tienen
evidencias de que ambas funciones, regulación
hacia arriba o hacia abajo de una respuesta da­
da, pueden ser ejercidas, segiin las circunstan­
cias, por células de una misma subpoblación y
no se han encontrado evidencias de la existen­
cia de linfocitos T con función supresora ex­
clusiva.
Cuando se trata de analizar la regulación de
los linfocitos T, deben tenerse en mente varios
conceptos. El primero es que ésta se hace, co­
mo todas las interacciones entre Hnfocitos, a
través de moléculas no específicas para el antí­
geno producidas por células que sí lo son y que
el estímulo para que se secreten estas molécu­
las es doble; el antígeno y alguna de esas molé­
culas. El segundo es que para que estas molé­
culas actúen deben existir receptores para ellas
en la superficie de la célula a quien va dirigida
la señal, y para que existan estos receptores el
linfocito debe estar contactando o haber con­
tactado recientemente con su antígeno específi­
co. El tercero es que, salvo en casos excepcio­
nales que posiblemente no se den in vivo, las
moléculas no actúan solas sino que actúan si-
nergística o antagónicamente entre sí. Además,
el sistema inmune recibe señales de otros siste­
mas que influyen en su respuesta.
De esto se desprende que, pese a que el sis­
tema inmune está particionado en clones, que
reconocen y reaccionan frente a un solo deter­
minante antigénico, la respuesta a uno de ellos
influye en las respuestas a otros determinantes,
pertenezcan o no a una misma molécula. Así,
las ILs que se producen en respuesta a un antí­
geno de alto poder inm unogénico pueden au­
mentar la respuesta a uno de bajo poder; éste es
el mecanismo de acción de muchos adyuvan­
tes, sobre todo los derivados de bacterias, que
se usaron durante mucho tiempo en forma em ­
pírica.
Las función efectora de los linfocitos T hl
será analizada en el capítulo 16 y la activación
y función de los linfocitos T citotóxicos, en el
capítulo 21.
Entre los linfocitos T h l y Th2 existen meca­
nismos de regulación cruzada; algunos se co­
mentaron antes, al discutir la inducción de su
diferenciación hacia uno u otro de estos fenoti­
pos funcionales.
Se verán aquí las acciones de las citoquinas
cuyos efectos regulatorios mejor se conocen in
Regulación de la respuesta inmune 335
vitro y que parecen tener mayor importancia in
vivo, como lo son la IL2, IL4, ILIO, I L l 2 y el
IFNy.
Función regulatoria de la IL2. La interac­
ción entre linfocitos T es necesaria para todas
las funciones de éstos. En efecto, como ya se
mencionó, los linfocitos T vírgenes están en es­
tado de precursores y para que se conviertan en
efectores, deben recibir señales no sólo del an­
tígeno y de la célula presentadora, sino también
de factores producidos por los propios linfoci­
tos T. Frente a esta situación podría pensarse
que la iniciación de una respuesta es imposible,
pero debe tenerse en cuenta que la activación
del hnfocito T virgen por el antígeno y las se­
ñales accesorias, lleva a la síntesis no sólo de
receptores para IL2, sino también de IL2, y que
ésta puede actuar en forma autocrina sobre el
mismo linfocito que la produjo, induciendo en
él mitosis y diferenciación.
La IL2 tiene así un papel imprescindible en
la iniciación de las respuestas inmunes, pues
induce mitosis y diferenciación en p rá c tic a ­
mente cualquier linfocito que haya reconocido
el antígeno y exprese receptores para ella. Es el
principal factor de crecimiento de los linfocitos
T y es indispensable para el mantenimiento in
vitro de líneas de linfocitos T. Según todos los
experimentos realizados in vitro, sería necesa­
ria para que puedan generarse linfocitos T cito-
tóxicos efectores (véase cap. 12) y linfocitos
colaboradores de tipo Thl o Th2. Si bien los
primeros son capaces de secretar IL2, de modo
que podrían autoactivarse y autom antenerse,
los tipo Th2 no sintetizan IL2, sino IL4 y otras.
In vitro, en ausencia de IL2, no se generan lin­
focitos productores de IL4, incluso si se agre­
gan otros factores de crecimiento T, com o la
IL12.
El papel fundamental de la IL2 en la induc­
ción de linfocitos Th2 ha sido confirm ado in
vivo mediante experimentos que han mostrado
que la eliminación de la función de la IL2 por
anticuerpos dirigidos contra ella, disminuye la
producción de IL4 e induce un aumento de la
función T hl. Sin embargo, ratones “knock o u f’
a los que se les eliminó el gen de la IL2, pue­
den producir IL4, por lo que podría haber otros
factores que permiten la diferenciación de célu­
las precursoras a células Th2.
De todas m aneras, recordem os que es una
sobresimplificación pensar que cada uno de los
linfocitos que actúan en una respuesta inmune
en un organismo está estrictamente polarizado
en alguna de estas funciones dado que puede
actuar en forma intermedia.
Función regulatoria cíe la IL-4. La presencia
de IL4 aumenta la producción de clones que la
producen y estimula sus funciones. En efecto,
la presencia de IL-4 hace que los linfocitos T
336 Aspectos básicos de la inmunidad
vírgenes se diferencien a Th2 y es necesaria pa­
ra la producción de IL5, es decir, en su ausen­
cia no se completa la diferenciación funcional.
En esta función, actuaría directam ente sobre
los linfocitos T vírgenes.
Sobre los linfocitos Th2 ya diferenciados, la
IL4 es un potente mitógeno y aumenta la proli­
feración de Th2 sobre todo en presencia de IL l.
Además, inhibe la diferenciación de los T
precursores a T H I, posiblemente por un efecto
sobre los macrófagos.
Función regulatoria de la ILIO. La ILl O es
un potente inhibidor de la función de los T hl.
Por una parte, inhibe la diferenciación de los T
precursores a Th 1, posiblemente a través de los
macrófagos, en los que reduce la expresión su­
perficial de la molécula B7 que, como ya se
mencionó, es una importante segunda señal pa­
ra su diferenciación. Por la otra, en los T h l
sensibilizados, inhibe la síntesis de IL2 e IFNy.
Función regulatoria del IFNy. El IFNy tiene
una im portante función regulatoria pues au­
menta la función T hl y disminuye la Th2. En
efecto, inhibe la diferenciación de linfocitos T
precursores a Th2, así como la proliferación de
clones Th2 presensibilizados, en los que, ade­
más, limita la producción de IL4. Esto último
tiene a su vez un efecto indirecto por la función
de la IL4 en la diferenciación de Th2.
Además, estimularía la diferenciación a Thl
en presencia de IL2. Si bien estos efectos han
sido demostrados in vitro, su función in vivo
también parece similar, pues anticuerpos anti
IFNy resultan en menos producción de IFNy y
más de IL4, que podría ser directo o indirecto,
a través de la IL4. También se ha visto que el
IF N a produce aumento de IFNy y disminución
de IL4. Sin embargo, experimentos in vitro han
demostrado que pequeñas concentraciones de
IFNy pueden tener efectos opuestos.
Función regulatoria de la 1LI2. La 1L12, es
producida por los linfocitos T hl pero también
por las células NK y las células B. Aumenta la
diferenciación de precursores a células T h l, ac­
tuando directamente sobre aquéllos, aun en au­
sencia de IFNy, y también indirectamente pues
reduce el efecto inhibitorio de 1L4 sobre la sen­
sibilización para T h l. Su efecto final es au­
mentar la síntesis de IFNy al aumentar el nu­
mero de células que lo producen.
El resultado final de la acción combinada de
estas citoquinas es que tienden a aumentar la
polarización de la respuesta hacia el sentido de
síntesis de anticuerpos o respuesta de tipo celu­
lar. Esto puede ser importante desde un punto
de vista clínico, si se tiene en cuenta la falta de
especificidad de las citoquinas; un organismo
que, en el momento de entrada de un antígeno,
está respondiendo a otro con un tipo de res­
puesta va a modular su respuesta en forma di­
ferente a lo que venía haciendo. Este efecto se
ha postulado para explicar, por ejemplo, la di­
ferente evolución de los enfermos de SIDA en
África, pues en esta región la infestación con
parásitos helmintos es muy común y muy alta,
y el sistema inmune responde a ellos con acti­
vación de linfocitos de tipo Th2.
¿Existen los linfocitos supresores?
La creencia en la existencia de los linfocitos
supresores sufrió fuertemente los avalares de
la moda. Luego de que fuera descubierto el
efecto supresor de una reacción dada por linfo­
citos provenientes de animales tolerantes, se
comenzaron a estudiar sus mecanismos de ac­
ción y se describieron varios circuitos, que in­
cluían hasta cinco subpoblaciones supresoras,
que actuaban directa o indirectamente a través
de macrófagos y que podían ser linfocitos idio-
típicos y antiidiotípicos. Más aun, se describió
la existencia de linfocitos contrasupresores,
que no actuaban solos sino inhibiendo la su­
presión causada por los supresores, y de linfo­
citos contra-contrasupresores, que inhibían a
éstos. Todos los experimentos realizados para
definir estas funciones se hicieron por m ez­
clas, ya sea in vitro o por repoblación de ani­
males irradiados, de poblaciones celulares pro­
venientes de ratones que habían recibido dife­
rentes tratamientos inmunizantes. Pero, en ge­
neral, fueron limitados ya que sólo se medía
una reacción dada (proliferación, citotoxici­
dad, síntesis de Igs) y no se podía m edir su
efecto en otras reacciones simultáneas.
Cuando se comenzaron a aislar poblaciones
puras de clones de linfocitos T y se pudo medir
in vitro los factores que producían frente a di­
ferentes estímulos, se comprobó que no existen
poblaciones que tengan siempre efecto supre­
sor y ni siquiera hay factores que tengan efecto
supresor sobre todas las funciones. Los hnfoci­
tos supresores se convirtieron entonces en un
anatema, cuya existencia la mayoría de los in­
vestigadores prefiere no mencionar.
Sin embargo, hay múltiples mecanismos de
supresión de respuestas, pues casi todos los
factores producidos por los linfocitos T pue­
den, directa o indirectamente, disminuir las res­
puestas de otros linfocitos T. Por una parte, los
factores producidos por los T h l, si bien au ­
mentan la función de sí mismos, tienden a dis­
minuir las de los Th2, y viceversa. Pero es más,
muchos factores estudiados in vitro, que en una
concentración tienen efecto de regulación posi­
tiva, en otra concentración pueden tener el
efecto contrario, aun sobre la misma función.
Hasta ahora, no se sabe cual es la concentra­
ción efectiva in situ de cada una de las linfo­
quinas conocidas.

H asta tanto no se aclaren m uchos de los
conceptos actuales, debe admitirse que los lin­
focitos T pueden tener funciones supresoras,
que éstas se ejercen a través de sus factores, y
por lo tanto en forma inespecífica, y que el re­
sultado final de supresión dependerá de la pre­
sencia o ausencia de factores de otras células,
del microam biente en el que se producen las
interacciones y de la condición en que esté el
linfocito que recibe la señal.
Un factor que en los últimos tiempos ha ad­
quirido importancia en los mecanismos de su­
presión es el factor de crecim iento transfor­
mante (transform ing grow th factor) o TGpp.
El TGF fue descubierto como un factor produ­
cido por células cancerosas, capaz de hacer
crecer y transformar in vitro células normales.
Luego se determinó que existían varios com ­
ponentes en este grupo y que células del siste­
m a inm une podían secretar T G E ^ l, que es
producido por varios tipos celulares, entre los
que se cuentan los macrófagos y los linfocitos
T CD8+. In vitro, los efectos de TG pp son muy
pleiotrópicos, pues puede inhibir o estimular el
crecimiento de células, dependiendo ello de las
condiciones del medio.
La función en la respuesta inmune de este
factor fue discutida porque en ésta también sus
efectos son pliotrópicos y hasta antagónicos:
aunque in vitro induce una disminución de la
producción de IL4 con aumento del IFNy, in
vivo inhibe las respuestas defensivas de tipo
T h l, según se comprobó en ratones parasita-
dos. Si bien induce “switch” a IgA en linfoci­
tos B de ratones, también parece ser importan­
te en la inducción de tolerancia por vía oral:
esto fue estudiado en animales con encefalitis
experimental, en los que la enfermedad puede
disminuirse mediante la ingestión del Ag. En
este caso, el efecto es mediado por linfocitos
CD8+, específicos para el antígeno usado, pro­
ductores de TGF(3 y por este factor.
En general, la mayoría de los autores coinci­
den hoy en que el TGFp es una “anti-citoqui-
na”, pues inhibe la acción de otras citoquinas y
linfoquinas. En efecto, se ha demostrado que
inhibe la proliferación de linfocitos T estim u­
lados, la maduración de linfocitos T citotóxi­
cos y la acción de citoquinas proinflamatorias
sobre macrófagos, polimorfonucleares y otras
células de la inflamación. Recientemente se ha
co n firm ad o el efecto su p re so r in vivo del
TGFp, mediante el uso de ratones “knock out”
a los que se suprimió el gen de TGFp: estos
animales desarrollan reacciones inflamatorias
incontroladas y, a los pocos m eses de edad,
una serie de enfermedades autoinmunes.
Otro de los m ecanism os que ha sido p ro ­
puesto como supresor y que podría estar invo­
lucrado en ia regulación hacia abajo de una
Regulación de la respuesta Inmune 337
respuesta en marcha, sería por el efecto citotó­
xico que han dem ostrado muchos linfocitos
Th CD4+, o por los propios linfocitos citotóxi­
cos clásicos CD8+, que podría lisar las células
que le presentan el antígeno.
En ambos casos, las células CD8+ ya sea d i­
rectamente, por eliminación de células reacti­
vas, o bien indirectamente, por producción de
TGFp, tienen un papel importante en la inhibi­
ción o supresión de respuestas. Esto coincide
con todos los primeros trabajos sobre linfoci­
tos T supresores, en los que se atribuyó la su­
presión a los linfocitos T CD8+. Tan es así que
en muchas partes todavía se clasifica a la p o ­
blación CD8+ como citotóxico/supresora.
Sea cual fuere la form a de acción de la su ­
presión, debe tenerse en cuenta que toda re s­
puesta inm une positiva está acom pañada de
fenómenos regulatorios que la limitan. Luego
de una inm unización, aun antes de que se a l­
cance el pico de la respuesta, aparecen fenó­
menos de regulación h acia abajo, ejercidos
por la com binación de factores de linfocitos
T. Estos conceptos tienen aplicaciones prácti­
cas, y una de ellas es en los planes de vacuna­
ción. D ado que todos los factores secretados
por los linfocitos son inespecíficos, la inm uni­
zación con dos o más antígenos sim ultánea­
mente puede aumentar la respuesta hacia uno
de ellos, sobre todo si es poco inm unógeno
p er se, pues “aprovecha” las ILs inducidas p o r
los otros; es la base del efecto de varios adyu­
vantes. Sin embargo, si se vacuna con un an tí­
geno y algunos días después se inyecta un se­
gundo antígeno, la resp u esta a este ú ltim o
puede verse disminuida, por presencia de fa c ­
tores que están regulando hacia abajo la re s ­
puesta al primero.
MECANISMOS
DE RETROALIM ENTACIÓN
POR INM UNOGLOBULINAS
Si bien los linfocitos T son los principales
iniciadores y reguladores de la síntesis de Igs,
éstas tam bién conforman un perfecto sistem a
de regulación por retroalim entación (“feed -
back”); si están en muy baja concentración con
respecto al antígeno, aum entan la resp u esta
mientras que, si están en alta concentración re ­
lativa, la disminuyen.
La capacidad de las Igs específicas de a u ­
mentar o disminuir las respuestas a un antíge­
no es especialm ente notable en las experien-
tiae naturae que nos brinda la naturaleza. Si
bien la mayoría de los vertebrados, incluido el
hombre, nace con su sistema inmune ya m a ­
duro, con sus clones formados y sus órganos
secundarios sembrados con ellos, pasa por un
338 Aspectos básicos de la Inmunidad
período de “inm unodeficiencia fisio ló g ica”
durante el cual su respuesta a una vacunación
es mala. Esto se debe a: 1) en parte, a la falta
de interacción entre sus clones, que no sólo
pueden colaborar por sus ILs no específicas
en respuesta a otros antígenos sino que, como
veremos luego, mantienen entre sí un equili­
brio dado por la red de Jem e, y 2) en parte, a
la presencia de Igs m aternas, que le fueron
transferidas por la madre a través de la p la­
centa y/o el calostro.
Si la madre fue vacunada durante su preñez,
la falta de respuesta es especialmente notable
en su hijo y hasta puede extenderse en forma
de tolerancia, si se lo revacuna cuando los an­
ticuerpos maternos ya han sido consum idos.
Hubo un exceso de anticuerpos específicos lo
que indujo una inhibición de la respuesta.
Pero en aquellas especies cuya placenta es
impermeable a las Igs y reciben toda la Ig ma­
terna a través del calostro, si no maman o ab­
sorben bien el calostro, su respuesta a cual­
quier antígeno, incluso a los microorganismos
ambientales de baja patogenicidad contra los
cuales los recién nacidos se protegen rápida­
mente bien, es mala, y su vida corre serio peh-
gro. Ello es debido a que están ausentes las Igs
que directamente, o por reacción cruzada, pue­
dan reconocer al antígeno y ayudar a la inicia­
ción de la respuesta.
Los mecanismos por los cuales la Ig especí­
fica, en pequeña concentración respecto al an­
tígeno, puede colaborar para iniciar o aumen­
tar una respuesta se basan principalnente en la
formación de complejos. Por una parte, éstos
hacen ai antígeno más fagocitable por los ma­
crófagos, no sólo por su acción opsonizante si­
no porque, al convertir antígenos pequeños o
solubles en precipitados, pueden darles tamaño
suficiente para ser fagocitados. La importancia
de los macrófagos en la iniciación de la res­
puesta inmune ya ha sido analizada. Por otra
parte, la fijación de complemento no sólo au­
menta la fagocitosis por el C3b, sino que las
fracciones C3a, C4a y C5a liberadas producen
inflamación y acumulan células inm unocom ­
petentes en el sitio de ingreso del antígeno.
Otra función importantísima de los comple­
jos en exceso de Ag es a través de las células
dendríticas, pues éstas tienen efectos muy po­
tentes en la estimulación primaria y tal vez son
indispensables, en ciertas circunstancias, para
iniciar respuesta en T vírgenes. Como ya se
mencionó, las células dendríticas ofrecen sus
gránulos de antígeno a las células B y así las
activan. Las células B activadas, pero no en re­
poso, podrían presentarlo a los linfocitos T vír­
genes.
Las Igs tienen tam bién im portancia en el
m antenim iento de una respuesta y lo hacen
principalmente a través del secuestro del antí­
geno sobre las células dendríticas. Cuando la
concentración de Igs desciende, se libera el an­
tígeno y es transferido al linfocito B de mem o­
ria, lo que inicia un nuevo ciclo de estim ula­
ción, con neosíntesis de Ig y reposición de cé­
lulas B de memoria. Por el contrario, cuando
la co ncentración de anticuerpos es alta, su
efecto es disminuir la respuesta. Este fenóme­
no fue uno de los primeros mecanismos regu­
latorios descritos, cuando se comprobó que la
plasmaféresis o las sangrías repetidas pueden
aumentar la síntesis de anticuerpos y, por el
contrario, la inyección de anticuerpos prefor­
mados puede inhibir la respuesta. Tam bién,
fue el prim er conocim iento de inm unología
b á sic a , que lle v ó a un m éto d o in m u n o te -
rapéutico no empírico, como es el tratamiento
preventivo de la sensibilización de madres Rh-
luego del parto de un hijo Rh+. Si inmediata­
mente después del parto se adm inistran a la
madre anticuerpos anti-Rh, no se sensibiliza y
no producirá anticuerpos que pongan en peli­
gro la vida de sus futuros hijos.
Este fenóm eno de inhibición por retro ali­
m entación se hace por varios m ecanism os y
también a través de la formación de complejos
inmunes con el anticuerpo en exceso sobre el
antígeno, y depende en gran parte de que el
anticuerpo sea completo; el efecto de las frac­
ciones Fab es mucho menor.
Una de las primeras consecuencias de la for­
mación de estos complejos es que gran parte
del antígeno es eliminado, generalm ente por
fagocitosis y digestión. Este efecto neutrali­
zante es más evidente si se trata de un organis­
mo vivo, cuando los sistemas efectores inm u­
nes pueden inhibir su replicación.
Pero además existe otro mecanismo, basado
en el ligamiento cruzado de receptores para el
Fe y para el antígeno en la superficie del linfo­
cito B. En efecto, los determinantes antigéni-
cos aún libres de estos complejos pueden ser
reconocidos por los linfocitos B a través de sus
Igs de superficie y, simultánemente, los recep­
tores Fe ligan al complejo por los fragmentos
Fe del anticuerpo. Este entrecruzamiento blo­
quea la fase productiva de la respuesta B indu­
cida por los linfocitos T y lleva a ese linfocito
B a la tolerancia.
Si bien la IgG tiene efecto inhibidor de la
respuesta, la IgM tiene un efecto contrario. Si
se inyecta IgM junto con el antígeno, la canti­
dad de células formadoras de anticuerpos de
clase IgG es mayor mientras que, si se la eli­
mina, la respuesta es menor. El mecanismo por
el cual la IgM aumenta la producción de IgG
no es conocido, pero es evidentemente útil en
la producción de una respuesta de tipo secun­
dario.
 Regulación de la respuesta inmune 339

R EG U LA C IÓ N P O R IN TER A C C IO N ES que reconocerían el idiotipo de ese clon. A su

ID IO T ÍPIC A S
Las moléculas de Igs, en sus regiones hiper-
variables que forman el sitio de combinación
del antígeno, o paratope, presentan característi­
cas individuales que son, en sí mismas, deter­
minantes antigénicos o idiotopos. Cada m olé­
cula individual puede presentar varios idioto­
pos, los que constituyen el idiotipo de esa mo­
lécula (véase cap. 5). Dada la variabilidad de
las Igs de cada organismo, hay muchos miles,
tal vez muchos millones, de idiotipos diferentes
en un individuo.
Jeme postuló que la diversidad de idiotipos
sería como un espejo de la diversidad de antí­
genos en el mundo externo y, si los linfocitos
pueden reconocer todos los determinantes anti­
génicos externos, pueden reconocer tam bién
los idiotipos internos. Formarían así una o va­
rias redes dependientes del reconocim iento
idiotipO/anti-idiotipo, que interconeetarían las
distintas subpoblaciones de células específicas.
Para cada clon de células capaces de reconocer
un antígeno (o más correctamente un epitope),
al que llamó “clon 1”, existirían clones (clon 2)
vez, para estos clon 2, existirían clones (clon 3)
que lo reconocen, y así sucesivamente, hasta
formar una red, que podría ser cerrada o abier­
ta, para incluir todos los clones de la población
celular. Daba por sentado que estos clones re­
conocen también los antígenos externos. Jem e
propuso que la expansión del clon 1, inducida
por un antígeno externo, estimularía al clon 2,
que produciría anticuerpos capaces de neutrali­
zar al clon 1 y disminuir así la producción de
anticuerpos de esa especificidad. A su vez, la
expansión del clon 2 estimularía al clon 3, que
frenaría la acción del clon 2 y perm itiría una
nueva expansión del clon 1. Otra vez, la expan­
sión del clon 3 estimularía al clon 4, que inhi­
biría al 3, y así sucesivamente. Esta red abierta
implicaría una posibilidad para que el sistema
inmune se autorregulase (fig. 18-2).
La geniahdad de Jem e fue postular esta teo­
ría, que luego fue demostrada en gran parte por
múltiples observaciones y experimentos, cuan­
do no se tenían datos aún para ello.
Ya había llamado la atención que, al hiperin-
munizar a un animal, cuando puede observarse
un aumento total de las Igs circulantes, este au­

F ig. 18-2. Esquem a de la red de regulación por antiidiotipo. El clon 1 reconoce a un epitope por el paratope de sus ig s de
superficie, lo cual lo lleva a .su estim ulación y expansión. El clon 2 reconoce al idiotipo del clon I: la expansión d e éste lo
estim ula. Los productos de estim ulación del clon 2 producen, por una parte, la iniiibición del clon I y la estim ulación del
clon .3. É ste a su vez, intiibe al clon 2 y estimula aJ clon 4, etc. D e esta m anera se mim tiene el equilibrio activo del sistem a
inm une. Estos clones no sólo reconocen los idiotipos de otros paratopes .sino que pueden reaccionar, además, contra epito-
pes externos.
340 Aspectos básicos de la inmunidad
mentó no está dado solamente por anticuerpos
dirigidos contra el antígeno usado sino que tie­
nen otras especificidades. A partir de la formu­
lación de la hipótesis, vai'ios investigadores pu­
dieron demostrar la existencia del clon 2 anti-
idiotípico, y la aparición de células productoras
de anticuerpos anti-idiotípicos aun antes de que
la secreción de anticuerpos llegue a su pico
máximo. También se demostró la existencia de
clones 3, 4 y 5.
Cuando se produjeron anticuerpos anti-idio­
típicos, pudo com probarse que su inyección
podía tener efecto inhibitorio de la respuesta B,
o incluso T, al antígeno. Pero también se vie­
ron anticuerpos anti-idiotípicos capaces de au­
mentar la respuesta al antígeno, cuyo efecto se
explica de la siguiente manera. Cada Ig especí­
fica presenta varios epitopes, por lo que puede
estimular la síntesis de varios anticuerpos anti-
idiotípicos. Algunos de estos, pero no todos, se
unen al paratope exactamente de la misma ma­
nera en que se une el antígeno y no sólo compi­
ten con él in vitro sino que, al interactuar con la
Ig superficial del linfocito, inducen una señal
similar a la del antígeno. Esos anticuerpos y los
clones que los producen, que son la imagen in­
terna de un antígeno externo, son estimulantes
de la respuesta. Los que no se unen al paratope
exactamente igual que el antígeno podrían en
cambio producir inhibición del clon, ya sea por
citotoxicidad, fijando complemento que mata a
la célula sobre la que se unieron, ya sea por un
mecanismo similar al de los complejos inm u­
nes, al producir un ligamiento cruzado del re­
ceptor para el Fe y las Igs superficiales.
En la red que postulara Jeme, el clon 1 esti­
mula al clon 2; en este caso, el clon 1 es la ima­
gen interna del antígeno externo para el cual
está predeterm inado el clon 2 (fig. 18-2). La
existencia de anticuerpos anti-idiotípicos ima­
gen interna ha tratado de ser utilizada para la
inmunización con vacunas que no tengan el an­
tígeno, y por lo tanto no obliguen a la produc­
ción de grandes cantidades de m icroorganis­
mos, cuyo escape es siempre potencialm ente
peligroso. Sin embargo, si bien estos anticuer­
po imagen interna pueden actuar aumentando
la respuesta al antígeno convencional, no se ha
logrado una buena inmunización protectora con
ellos en ausencia de éste, por lo que la investi­
gación está siendo reem plazada en el sentido
del uso de vacunas obtenidas por ingeniería ge­
nética, que están mostrando mejores resultados.
Sin embargo, la existencia de redes que in-
terconectan los diferentes clones entre sí tiene
un importante sentido fisiológico. Por una par­
te, interviene en la regulación de las respuestas
y permite moderar las respuestas a cada antíge­
no, como se indicó más arriba. Por otra parte,
contribuye a que las respuestas de los indivi­
duos contra antígenos externos mejoren con el
paso del tiempo, lo que explica parcialmente la
inm unoincom petencia de los recién nacidos.
En efecto, en el m om ento del nacim iento, si
bien los clones existen, están en un estado de
reposo y en un equilibrio a nivel mínimo entre
ellos. La estim ulación de un grupo relativa­
mente pequeño de clones luego de la entrada
de un antígeno induce la estimulación de mu­
chos más, lo que lleva al sistema inmune en ge­
neral a un nuevo equilibrio, a un nivel más alto
que el anterior. Sucesivas estimulaciones lle­
van a aum entos sucesivos del nivel de este
equilibrio, hasta lograr un equilibrio semejante
al del adulto, que se traduce en un nivel de Igs
circulantes propio de esta edad. Además, al es­
timularse clones contra antígenos no relaciona­
dos, se mejora la respuesta inmune a esos antí­
genos, al proveer esa pequeña cantidad de anti­
cuerpos útil para inicial' una respuesta primaria.
La consideración práctica que resulta de esto
es que la estimulación permanente que recibe
el sistema inmune por antígenos ambientales es
la base de su correcto funcionamiento frente a
agresiones por patógenos. Por eso, al criar a los
niños en ambientes excesivamente protegidos,
puede no estimularse suficientemente a su sis­
tema inmune por antígenos externos y, llegado
el caso, su respuesta frente a un patógeno pue­
de ser deficiente.
TOLERANCIA
Concepto
Se entiende por tolerancia la capacidad espe­
cífica y adquirida por el sistema inmune para
no responder a uno o más antígenos, mientras
mantiene su capacidad para responder a todos
los otros. Esta especificidad es lo que distingue
la tolerancia de la inmunodeficiencia, en la que
la respuesta a todos los antígenos está anulada
o disminuida.
La enorme capacidad agresiva del sistema
inmune exigió que, junto con esta función de
agresión, evolucionaran sistemas capaces de
evitar la autoagresión, de manera que pudiera
atacar sustancias externas sin atacar a sus pro­
pios constituyentes. Si la tolerancia contra lo
propio falla, se producen enfermedades autoin­
munes que pueden ser muy graves.
La autotolerancia es un mecanismo propio
de todos los individuos, que se establece duran­
te e l desarrollo fetal y se mantiene durante toda
la vida, pero también existen otros tipos de to­
lerancia que pueden establecerse luego de la
maduración del sistema inmune. Un caso im­
portante de tolerancia de este tipo, indispensa­
ble para la perpetuación de las especies vivípa­

ras, es el de la madre con respecto al feto, al
que tolera durante todo el embarazo pese a que
es semi-alogeneico y debería ser rechazado.
Ambos tipos de tolerancia son diferentes,
llevados a cabo por distintos m ecanism os y
fueron denominados, respectivamente, toleran­
cia neonatal o central y del individuo adulto o
periférica. Estos términos no son correctos y
deberían ser llamados fetal o primaria y del in­
dividuo maduro o secundaria, como veremos
luego.
Tolerancia fe t a l. AutotoLerancia
Se define como tolerancia fetal a la tolerancia
que se establece durante la maduración del sis­
tema inmune, que está basada en la ausencia de
clones reactivos por lo que puede ser rota m e­
diante la transferencia de linfocitos no toleran­
tes normales y que no se transmite de un animal
a otro mediante la transferencia de células.
Esta tolerancia, establecida durante el desa­
rrollo fetal y mantenida durante toda la vida del
individuo, es la base de la autotolerancia, cuya
necesidad ya fue intuida por Ehrlich cuando
postuló la existencia del horror autotoxicus.
La primera observación sobre tolerancia fe­
tal fue hecha por Owen en 1945 cuando estudió
varios casos áe freemartins, es decir, terneros
mellizos no gemelares, que comparten en útero
la misma placenta y que después de nacidos
son quim eras que llevan células sanguíneas
propias de ambos mellizos. Estos freemartins,
pese a que son genéticamente disímiles, no ha­
cen respuestas inmunes contra el otro y hasta
aceptan injertos de piel cruzados. Esta observa­
ción llevó a Brent y Medawar a realizar una se­
rie de experim entos en los que dem ostraron
que, si se inyectan ratones recién nacidos de
una cepa, con células viables-de otra cepa alo­
geneica, los animales así tratados, al hacerse
adultos, aceptan transplantes de la cepa dadora.
Demostraron que esta tolerancia es específica,
pues no aceptan transplantes de una tercera ce­
pa no relacionada. Otro concepto que estable­
cieron es que el antígeno debe permanecer en
el organismo para que la tolerancia se manten­
ga. En efecto, para que los ratones se hicieran
tolerantes y aceptaran injertos de piel al llegar
a adultos, debían ser inyectados con células
viables y no con extractos celulares que indu­
cen sólo una tolerancia pasajera.
El hecho de que se pueda inducir el rechazo
del injerto, si a estos ratones tolerantes se les
inyectan linfocitos de un ratón singeneico no
tratado, llevó a que se postulase que la toleran­
cia dependía de la deleción de los clones que
reconocen antígenos propios.
Este tipo de experimentos fueron realizados
en otras especies animales con resultados simi­
Regulación de la respuesta inmune 341
lares, salvo que para la mayoría de las especies
la inmunización debe hacerse in útero para que
se establezca la tolerancia. También fueron co ­
rroborados por observaciones sobre el efecto
de virus capaces de atravesar la placenta y con­
tagiar al feto. Cuando un virus, aun uno poco
patógeno para los adultos o recién n acidos,
contagia a una hembra gestante, las consecuen­
cias para el feto pueden ser mucho más graves
que para la madre, sobre todo si el contagio se
hace durante el prim er tercio de la gestación.
Así, por ejemplo, la rubéola, que es una enfer­
m edad lev e en los in d iv id u o s de cu alq u ier
edad, puede producir muerte o malformaciones
fetales. En form a parecida, muchas vacunas
por virus vivos atenuados pueden tener conse­
cuencias graves para el feto; en otros casos, c o ­
mo sucedió con una vacuna atenuada contra la
peste porcina, el animal nace sano pero se hace
tolerante al virus vacunal al que continúa alber­
gando toda la vida, de modo que no sólo no
responde a la vacuna sino que, si es infectado
por el virus patógeno, no puede defenderse y
muere.
Todos estos datos llevaron a comprender que
si el sistem a inmune se pone en contacto con
un antígeno durante su maduración, la conse­
cuencia es la tolerancia específica hacia ese an­
tígeno. En la mayoría de las especies, la capa­
cidad para responder a los antígenos externos
com ienza a aparecer durante la gestación, no
así en el ratón que nace aún inmaduro inmuno-
lógicamente, con lo que puede hacerse toleran­
te neonatalmente. Esto hizo llamar tolerancia
neonatal a lo que en realidad es tolerancia fetal.
Los mecanismos que llevan a esta tolerancia
fueron discutidos durante mucho tiempo y al­
gunos son conocidos hoy. Durante un tiempo,
se supuso que había una deleción o aborto clo ­
nal de todos los linfocitos capaces de reconocer
lo propio. Sin embargo, hoy se sabe que es in­
dispensable para los linfocitos T reconocer lo
propio para poder reaccionar contra lo extraño.
Es más, si se estimulan in vitro linfocitos de un
individuo normal, es bastante fácil obtener an­
ticuerpos contra antígenos propios de ese indi­
viduo, lo cual demuestra que existen clones de
linfocitos B potencialmente autorreactivos, que
in vivo no secretan anticuerpos. Además, p u e­
den aparecer autoanticuerpos en ciertas situ a­
ciones de daño o lesión tisular. Por ejem plo,
luego de un infarto o de una operación cardía­
ca, pueden haber anticuerpos antimiocardio cir­
culantes, pero la reacción es efímera y no deja
secuelas. Si la lesión se produce en otros órga­
nos, aquellos a cuyos antígenos se los ha llam a­
do “secuestrados” pues estarían separados por
barreras hemáticas, como las gonadas o el sis­
tema nervioso central, la agresión puede ser au-
toperpetuante. Todo esto indica que ex isten
342 Aspectos básicos de la inmunidad
múltiples factores que inciden en el estableci­
miento de la autotolerancia.
Una serie de experimentos demostraron que
puede establecerse tolerancia tanto a nivel de
los linfocitos T eomo de los B y que en la auto-
tolerancia existen ambas pero, como en todas
las reacciones inmunes, el que manda es el T y
la base de la autotolerancia es la selección nega­
tiva que ocurre en el timo. Esta selección, que
se discutió en el capítulo 3, no elimina los linfo­
citos que reconocen los antígenos propios, sino
a aquellos que, además de reconocer, reaccio­
nan con los antígenos propios. Estos linfocitos
que reaccionan positivamente en presencia de
moléculas de histocompatibilidad de clase I o II
modificadas por péptidos propios, son elimina­
dos por mecanismos que aún se discuten. Las
proteínas plasmáticas penetran en la médula tí­
mica y allí sería el punto donde se produce gran
parte de la selección negativa. Dado que el timo
puede mantener su función luego de la siembra
fetal de clones en los órganos secundarios, es
com prensible que el antígeno deba continuar
presente para que se mantenga la tolerancia.
Por este mecanismo, los clones autorreacti-
vos son ehminados; esto explica que no se ha­
yan encontrado linfocitos supresores contra an­
tígenos propios y que la transferencia de linfo­
citos normales a un ratón hecho tolerante neo­
natalmente provoque la rotura de su tolerancia.
Además de esta tolerancia central, basada en
la eliminación o tolerización de los linfocitos
potencialmente autorreaetivos, existen mecanis­
mos periféricos que también intervienen en el
“horror autotoxieus”, es decir, en el manteni­
miento de un sistema inmune capaz de reaccio­
nar contra lo no propio mientras que reconoce
pero no agrede lo propio. Muchos autores han
postulado diversas teorías para explicar esta to­
lerización periférica de los linfocitos autorreae-
tivos. Ultimamente, la Dra. Matzinger ha pro­
puesto una hipótesis atractiva que explicaría
muchos fenómenos difíciles de entender. Esta
teoría sostiene que el sistema inmune no está
basado en la distinción de lo propio y lo no pro­
pio, sino que distingue lo sano de lo enfermo.
Sostiene que necesitaría una segunda señal para
reaccionar y ésta es la señal de peligro dada por
células enferm as, en estado de “stress” o en
proceso de muerte. La célula que muere por
apoptosis no em ite señales de peligro; pero
aquella que es invadida por un patógeno, o su­
fre lesión o “stress”, o muere no por programa
propio, sí emite señales que son las que activa­
rían a los linfocitos T en reposo. En cambio, los
linfocitos que reciben señales del antígeno sin
la señal de peligro, se tolerarizarían o morirían.
Esta hipótesis parece por lo menos parcial­
mente válida: si bien una célula que muere por
apoptosis no produce factores quim iotácticos
y/o activadores de los linfocitos, toda célula en
“stress” produce estos factores como, por ejem­
plo, las proteínas de “shock” térmico, que sí
son altamente activadoras de los distintos com ­
ponentes del sistema inmune. La hipótesis ex­
plica, además, por qué se pueden producir anti­
cuerpos contra estructuras propias luego de una
lesión, como los ya mencionados Acs antimio­
cardio luego de una lesión cardíaca, y explica
también la desaparición de la reacción al desa­
parecer el daño tisular.
Sea o no válida la hipótesis, es un hecho que
toda reacción inmune se ve aumentada por la
inflamación inespecífica, que se produce en un
lugar de daño tisular, y que, sin inflam ación
inespecífica (p. ej., dando el antígeno como ali­
mento o por introducción de antígenos no parti­
culados por vía endovenosa), es mucho más fá­
cil inducir tolerancia. También es un hecho que
prácticamente todos los adyuvantes conocidos,
en mayor o menor grado, producen inflamación
y daño tisular y éste es uno de sus principales
mecanismos de acción.
También existe tolerancia a nivel B. La sínte­
sis de receptores B se hace al azar, por lo que
pueden aparecer durante toda la vida clones au-
torreactivos; pero, durante el período de madu­
ración de los linfocitos B, cuando éstos expre­
san solamente IgM superficial, el contacto con
el antígeno puede llevarlos a la tolerancia. D u­
rante un período se supuso que la estimulación
dependía de que la interacción con el linfocito
B se hiciera a través de la IgM e IgD, y que el
contacto a través de la IgM superficial llevaba a
la tolerancia de esa célula, pero se ha demostra­
do que depende más bien de la concentración de
los receptores y del establecimiento del entre-
cruzamiento entre ellos. Este entrecruzamiento
puede llevar a la muerte del linfocito en madu­
ración (aborto clonal) o, si el antígeno está en
concentraciones menores, a una tolerización.
Se ha comprobado que en ratones transgéni­
cos, cuando se hace sintetizar al animal una pro­
teína no propia, desde su concepción y en gran­
des cantidades, los clones de linfocitos B capa­
ces de reconocerla prácticamente desaparecen.
La aparición de clones B autorreaetivos tam­
bién puede darse en linfocitos B maduros, pues
éstos sufren mutaciones puntuales luego de ser
estimulados por el antígeno y los factores de co­
laboración T. Pero aun cuando existan linfoci­
tos B autorreaetivos, la ausencia de clones T ca­
paces de colaborar con ellos impide que se esta­
blezca una reacción autoinmune persistente.
Esta ausencia de clones T autorreaetivos ha­
ce que sea muy difícil establecer una reacción
inmune positiva contra antígenos propios, pese
a que existan clones B potencialm ente auto-
rreactivos. Explica también la desaparición de
las respuestas autoinmunes luego de la lesión

de la mayoría de los órganos, pues ha habido
una selección negativa en el timo para los lin­
focitos que reaccionaron contra sus antígenos.
Sin embargo, en aquellos órganos con barreras
hemáticas (retina, testículos, etc) cuyos antíge­
nos estarían “secuestrados” y no establecerían
una perfecta tolerancia T, una lesión puede lle­
var a una enfermedad autoinmune que se auto-
perpetúa, pues los linfocitos B encuentran lin­
focitos T colaboradores específicos, y la reac­
ción inmune agrava la lesión con liberación de
más antígeno; de esta manera el órgano contra-
lateral también puede ser atacado.
Tolerancia del individuo inmunológieamente
maduro
Se define como tolerancia del individuo ma­
duro a aquella que puede establecerse en indi­
viduos de cualquier edad, en la que existen clo­
nes capaces de reaccionar, por lo que no se
rompe por la transferencia de células de indivi­
duos normales y que sí puede ser transferida de
una animal tolerante a otro normal. La induc­
ción de tolerancia en un individuo es mucho
más difícil que en un feto, su duración es más
corta y posiblemente nunca sea total.
Una de las primeras observaciones con res­
pecto a la posibilidad de inducir tolerancia fue
la que estudió la relación entre la dosis de antí­
geno y la respuesta. Si se inyecta un antígeno
en dosis muy altas o muy bajas, no sólo no se
induce una respuesta de anticuerpos, sino que
una inyección posterior en dosis normalmente
inmunogénicas tampoco es seguida de una bue­
na respuesta. Asimismo, las inyecciones repeti­
das de un mismo antígeno no sólo no aumentan
indefinidamente la respuesta de anticuerpos, si­
no que pueden llevar a una caída en su título.
Esto se aprecia no sólo a nivel experimental, si­
no que es observable en enfermedades infeccio­
sas o parasitarias crónicas, en las que el título
de anticuerpos, luego de mantenerse en un “pla­
teau” durante cierto tiempo, cae marcadamente.
La vía de introducción del antígeno también
es importante; es más fácil inducir tolerancia
dándolo por vía endovenosa u oral que dándolo
intradérmica o subcutáneamente. Asimismo, un
antígeno soluble es más tolerogénico que uno
particulado.
Otras maneras de inducir tolerancia es m e­
diante moléculas no metabolizables, por ejem ­
plo, con antígenos proteicos compuestos por D-
aminoácidos. Si se inyecta una de estas proteí­
nas unidas a un hapteno, se induce tolerancia
contra el “carrier” y también contra el hapteno.
En todos los casos, la tolerancia se rompe en
tiempos variables luego de la desaparición del
antígeno y las células de animales tolerizados
pueden dism inuir o anular la reacción de los
Regulación de la respuesta inmune 343
linfocitos de anim ales norm ales, ya sea por
mezclas in vitro o por transferencia a animales
singeneicos, es decir, actúan como los contro­
vertidos linfocitos T supresores.
Los mecanismos que intervienen en este tipo
de tolerancia son los que intervienen en la cola­
boración y regulación de las respuestas inmunes
positivas y puede hacerse a nivel de linfocitos T
o B, o ambos, y de las células presentadoras.
Los antígenos no particulados, los no metaboli­
zables y los que están en muy baja concentra­
ción no pueden ser procesados por los m acrófa­
gos y presentados a los linfocitos Th, por lo que
no pueden iniciar una respuesta positiva. L a for­
ma en que podrían inducir la aparición de linfo­
citos T supresores está tan controvertida como
la existencia misma de los T supresores. Una
dosis excesiva de antígeno podría tolerizar a los
linfocitos B por contacto con ellos durante la
maduración. Asimismo, la presencia constante
de antígeno puede llevar a la tolerización de los
linfocitos B por este mismo mecanismo, que al­
gunos autores llaman de agotamiento clonal. La
presencia de anticuerpos, por el mecanismo de
“fe e d -b ac k ” n egativo que fu era com entado
antes, también puede llevar a la tolerancia. Esto
sucede cuando se inmuniza al individuo por pri­
mera vez, como puede ser el caso de un niño
que se vacuna cuando aún tiene anticuerpos re­
cibidos pasivamente de la madre. En este caso,
no sólo se consumen más rápidamente los anti­
cuerpos maternos, sino que una segunda inyec­
ción del antígeno cuando éstos ya se han reduci­
do provoca una respuesta deficiente pues en­
cuentra a los linfocitos B en estado de toleran­
cia. La respuesta sólo será normal cuando esos
linfocitos tolerantes hayan sido reem plazados
por linfocitos B de reciente m aduración. Un
mecanismo similar a éste interviene en la caída
del título de anticuerpos por inyecciones repeti­
das de un mismo antígeno.
Como se puede comprobar, en la tolerancia
del individuo maduro intervienen todos los nje-
canismos que regulan las respuestas inm unes
positivas normales, sólo que con mayor intensi­
dad y preponderancia. En una respuesta positi­
va, intervienen siempre sistemas de regulación
hacia arriba y hacia abajo; el nivel de dicha res­
puesta depende de la actividad de cada uno de
ellos. Cuando los m ecanism os de regulación
hacia abajo priman sobre los de colaboración,
la resultante es la tolerancia secundaria.
B IB L IO G R A FÍA
G enera!
A bbas, A . K., Lichtm an, A. H., Pober, J. S. C eilu la r and
M o le c u la r Im m u n o lo g y , 2" ed . W . B. S a u n d e r s co.
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prensa.
Anticuerpos no precipitantes, anticuerpos
asimétricos de ias clases IgG
Su relación con los precipitantes
RICARDO MARGNI
INTRODUCCIÓN
La reestim ulación de un vertebrado adulto
con un antígeno T-dependiente induce una res­
puesta inmune en la que prevalecen los anti­
cuerpos de la clase IgG. Durante el curso de esa
respuesta, la capacidad de unión del anticuerpo
al ligando varía, apareciendo incluso anticuer­
pos incapaces de formar complejos Ac-Ag inso­
lubles. En muchos casos, ello se debe a la baja
afinidad de los anticuerpos como consecuencia
de que la constante de unión del sistema anti-
cuerpo-ligando, a equilibrio, es muy baja.
No obstante lo expuesto, hay anticuerpos de
!a clase IgG de relativa alta afinidad, que se
unen firmemente al antígeno, pero que carecen
de la capacidad de formar complejos Ac-Ag in­
solubles. Estos anticuerpos fueron identificados
originariamente por Heidelberger y Kendall en
1935. Ellos mostraron que mediante curva de
precipitación cuantitativa era posible dosar los
anticuerpos preeipitables presentes en el suero
y establecer la zona de equivalencia o cantidad
de antígeno capaz de lograr la máxima precipi­
tación. Pero observaron también que, si la dosis
de antígeno correspondiente a la zona de equi­
valencia era añadida en form a fraccionada, a
repetición, se requerían cantidades m enores
que en el caso anterior para conseguir la sepa­
ración de los anticuerpos preeipitables. R epi­
tiendo la valoración del suero original, con
añadido del sobrenadante de las precipitaciones
seriadas y sin él, comprobaron que en el primer
caso había un incremento del 10-15% en el tí­
tulo de los anticuerpos (fig. 19-1). Ello los lle­
vó a considerar que en el sobrenadante queda­
ban anticuerpos que no precipitaban el antíge­
no, pero con aptitud para incorporarse firm e­
mente a los complejos Ac-Ag formados por los
anticuerpos precipitantes de la misma especifi­
cidad. Los designaron anticuerpos “eoprecipi-
tantes” . La figura 19-2 corresponde a una grafi­
cación de Sips efectuada con valores p ro v e­
n ientes de estudios de interacción p rim aria
Ac-Hp, de anticuerpos precipitantes, eoprecipi-
tantes y no precipitantes de baja afinidad.
Hasta 1970 se hizo muy poco para aclarar el
mecanismo de la no precipitación con el antí­
geno por parte de los anticuerpos coprecipitan-
tes, cuáles eran sus propiedades fisicoquímicas
y biológicas, clase de inmunoglobulina a la que
pertenecían, y la función que cumplían en la
respuesta inmune. En un trabajo cooperativo
desarrollado entre nuestro laboratorio y el deJ
doctor R. A. Binaghi en Francia, iniciamos en
esa época el estudio de esos anticuerpos.
Estudios inmunoquímicos
Los anticuerpos copreeipitantes h a n sido
aislados del suero de diferentes especies ani­
males (conejos, caballo, oveja, ratas, hombre,
vaca, asno, merión, ratón) inoculados con dis­
tin to s antígenos T -d ep en d ien tes (p ro teín a s
haptenadas, gam m aglobulinas y albúm ina de
diferente origen, ovoalbúmina, toxoide tetáni­
co, bacterias, parásitos y otros). En el sobrena­
dante del suero agotado en anticuerpos preci­
pitantes por precipitaciones seriadas, según fue
descrito por H eidelberger y Kendall, quedan
los anticuerpos no precipitantes de baja afini­
dad y los copreeipitantes. Estos últimos fueron
separados de la m ezcla por crom atografía de
afinidad (fig. 19-3).
Los anticuerpos copreeipitantes pertenecen a
la clase IgG y, si el animal elabora varias sub­
clases de esta inm unoglobulina y form a anti­
cuerpos precipitantes en todas ellas, lo mismo
344 Aspectos básicos de la inmunidad
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Anticuerpos no precipitantes, anticuerpos
asimétricos de ias clases IgG
Su relación con los precipitantes
RICARDO MARGNI
INTRODUCCIÓN
La reestim ulación de un vertebrado adulto
con un antígeno T-dependiente induce una res­
puesta inmune en la que prevalecen los anti­
cuerpos de la clase IgG. Durante el curso de esa
respuesta, la capacidad de unión del anticuerpo
al ligando varía, apareciendo incluso anticuer­
pos incapaces de formar complejos Ac-Ag inso­
lubles. En muchos casos, ello se debe a la baja
afinidad de los anticuerpos como consecuencia
de que la constante de unión del sistema anti-
cuerpo-ligando, a equilibrio, es muy baja.
No obstante lo expuesto, hay anticuerpos de
la clase IgG de relativa alta afinidad, que se
unen firmemente al antígeno, pero que carecen
de la capacidad de formar complejos Ac-Ag in­
solubles. Estos anticuerpos fueron identificados
originariamente por Heidelberger y Kendall en
1935. Ellos mostraron que mediante curva de
precipitación cuantitativa era posible dosar los
anticuerpos precipitables presentes en el suero
y establecer la zona de equivalencia o cantidad
de antígeno capaz de lograr la máxima precipi­
tación. Pero observaron también que, si la dosis
de antígeno correspondiente a la zona de equi­
valencia era añadida en form a fraccionada, a
repetición, se requerían cantidades m enores
que en el caso anterior para conseguir la sepa­
ración de los anticuerpos precipitables. R epi­
tiendo la valoración del suero original, con
añadido del sobrenadante de las precipitaciones
seriadas y sin él, comprobaron que en el primer
caso había un incremento del 10-15% en el tí­
tulo de los anticuerpos (fig. 19-1). Ello los lle­
vó a considerar que en el sobrenadante queda­
ban anticuerpos que no precipitaban el antíge­
no, pero con aptitud para incorporarse firm e­
mente a los complejos Ac-Ag formados por los
anticuerpos precipitantes de la misma especifi­
cidad. Los designaron anticuerpos “coprecipi­
tantes” . La figura 19-2 corresponde a una grafi­
cación de Sips efectuada con valores p ro v e­
n ientes de estudios de interacción p rim aria
Ac-Hp, de anticuerpos precipitantes, coprecipi­
tantes y no precipitantes de baja afinidad.
Hasta 1970 se hizo muy poco para aclarar el
mecanismo de la no precipitación con el antí­
geno por parte de los anticuerpos coprecipitan­
tes, cuáles eran sus propiedades fisicoquímicas
y biológicas, clase de inmunoglobulina a la que
pertenecían, y la función que cumplían en la
respuesta inmune. En un trabajo cooperativo
desarrollado entre nuestro laboratorio y el deJ
doctor R. A. Binaghi en Francia, iniciamos en
esa época el estudio de esos anticuerpos.
Estudios inmunoquímicos
Los anticuerpos coprecipitantes h a n sido
aislados del suero de diferentes especies ani­
males (conejos, caballo, oveja, ratas, hombre,
vaca, asno, merión, ratón) inoculados con dis­
tin to s antígenos T -d ep en d ien tes (p ro teín a s
haptenadas, gam m aglobulinas y albúm ina de
diferente origen, ovoalbúmina, toxoide tetáni­
co, bacterias, parásitos y otros). En el sobrena­
dante del suero agotado en anticuerpos preci­
pitantes por precipitaciones seriadas, según fue
descrito por H eidelberger y Kendall, quedan
los anticuerpos no precipitantes de baja afini­
dad y los coprecipitantes. Estos últimos fueron
separados de la m ezcla por crom atografía de
afinidad (fig. 19-3).
Los anticuerpos coprecipitantes pertenecen a
la clase IgG y, si el animal elabora varias sub­
clases de esta inm unoglobulina y form a anti­
cuerpos precipitantes en todas ellas, lo mismo
 346 Aspectos básicos de la inmunidad

2,5

C
O
/3 1,5
Hc

0,5

_i_
100 200 300 400 500

|ig de antígeno añadido
Fig. 19-1. Valoración de los anticuerpos preeipitables en
un suero de oveja y en el m ism o suero adicionado del so­
brenadante carente de anticuerpos precipitantes separados
por precipitaciones a repetición con 1/20 de la dosis total
del antígeno correspondiente a la zona de equivalencia.
---------- Curva de valoración de los anticuerpos anti-D N P
en un suero de oveja (2,1 m g/m l).
---------- C urva de valoración del m ism o suero inm une ad i­
cionado del sobrenadante de las precipitaciones
seriadas (2,4 m g/ml).
ocurre eon los anticuerpos copreeipitantes (fig.
19-4). Cuando ios animales son inoculados con
antígenos en solución, a repetición, los anti­
cuerpos copreeipitantes constituyen el 10% a
15% de la población total y están presentes a lo
largo de toda la respuesta inmune.
Por inmunodifusión no se han detectado di­
ferencias antigénicas entre los anticuerpos pre­
cipitantes y copreeipitantes con la misma espe­
cificidad, ubicados en la m ism a subclase de
Fig. 19-2. C o n stan te de aso ciació n in trín seca p ro m ed io
(Ko e índice de heterogeneidad (a) determ inados según la
graficación de Sips. A ( • - • ) , anticuerpo precipitante (K o =
1,14 X 10'’ L/M , a = 0,72), 15 (□-□ ) anticuerpo copreeipi-
tante (Ko = 3,16 x 10’ L/M a = 0,51). C (B -« ), anticuerpo
no precipitante (Ko = 1,05 x 10-’ L/M , a = 0,69). Los anti­
cuerpos analizad o s fu ero n aislad o s d e su ero in m u n e de
oveja antidinitrofenol (a-D N P). El ligando usado fue d in i­
trofenol .
IgG y provenientes de la m ism a m uestra de
suero. Anticuerpos precipitantes y coprecipi-
tantes de la clase IgG l de oveja, eon especifici­
dad antidinitrofenol (a-DNP), dan bandas que
se fusionan, sin aparición de espolones, cuando
reaccionan con suero de ratas inoculadas con el
anticuerpo precipitante o eoprecipitante. Cuan­
do un suero de rata contra anticuerpo aDNP
precipitante de oveja (IgG l) es adsorbido con
an ticu erp o a-D N P e o p re cip ita n te de oveja
(IgG l), obtenido de la misma muestra de suero
de la que provenía el anticuerpo precipitante,
en el suero no quedan anticuerpos capaces de

.Ag
(1/20 E) (1/20 E) (1/20 E) (1/20 E)

l i l i

u Inmuno-
adsorbente

E: dosis precipitante óptima

a + b -I- o ei anticuerpo de los precipitados es disociado y purificado (anticuerpo precipitante),
q: el anticuerpo fijado al inmunoadsorbente es desorbido y purificado (anticuerpo coprecipitante).

Fig. 19-3. E squem a del m étodo de separación de anticuerpos precipitantes y copreeipitantes.


reconocer el anticuerpo precipitante. El mismo
fenómeno se produce cuando el suero antianti­
cuerpo coprecipitante es adsorbido con anti­
cuerpo precipitante purificado. Estos resultados
indican que es poco probable que el diferente
comportamiento de los anticuerpos precipitan­
tes y coprecipitantes pueda estar relacionado
con diferencias en sus idiotipos.
M apas peptídicos desarrollados con a n ti­
cuerpos precipitantes y coprecipitantes de co­
bayo de la clase IgG2, aislados de la m ism a
muestra de suero, no presentan diferencias. Se
han obtenido resultados similares con anticuer­
pos precipitantes y coprecipitantes de oveja de
la clase IgG l. Estos mismos anticuerpos tam ­
poco mostraron diferencias en los mapas dia­
gonales, ni cuando se hizo la tipificación quí­
mica por eleetroforesis de alto voltaje de los
péptidos de digestión enzimática, previa reduc­
ción con mereaptoetanol y alquilación con io­
doacetamida.
Los coeficientes de sedimentación de todos
los anticuerpos coprecipitantes analizados son
aproximadamente 7S y similares a los de los
anticuerpos precipitantes ubicados en las m is­
mas fracciones globulínicas, al igual que sus
2 1
I
1
C b
Fig. 19-4. A . E leetroforesis en acetato de celulosa de anticuerpo precipitante (a) y coprecipitante (b) de oveja: 1: I g G l; 2:
IgG2. B y C. Inm unoelectroforesis de anticuerpo anti-D N P precipitante (a), y coprecipitante (b) de cobayo
IgG l (B) c IgG 2 (C). I: seroalbúm ina bovina dinitrofenolada; II: suero de conejo anticobayo.
Anticuerpos no precipitantes 347
pesos y volúmenes moleculares determinados
por filtración por geles.
Los estudios de interacción prim aria an ti­
cuerpo coprecipitante-hapteno han mostrado en
todos los casos que estos anticuerpos son biva­
lentes.
El fenóm eno de la copreeipitación es una
propiedad general no restringida a los anticuer­
pos de una misma especie animal. Es posible
obtener copreeipitación con anticuerpos preci­
pitantes y coprecipitantes con la misma especi­
ficidad, provenientes de diferentes especies
animales o ubicados en distintas subclases de
IgG.
En el cuadro 19-1 figuran algunas de las ca­
racterísticas fisicoquímicas e inmunoquímicas
de los anticuerpos precipitantes y coprecipitan­
tes de la clase IgG del hombre y de algunas es­
pecies animales.
Un hecho muy particular, que lu eg o será
analizado en detalle, es que los anticuerpos co­
precipitantes carentes de capacidad para preci­
pitar el antígeno, aglutinan los glóbulos rojos
de carnero y otras especies animales específica­
mente sensibihzados, no así los glóbulos rojos
humanos.
la clase
348 Aspectos básicos de la inmunidad

Cuadro 19-1. Características fisicoquím icas e inmunoquímicas de los anticuerpos precipitantes

y copreeipitantes de algunas especies animales
Anticuerpos

E specie anim al Precipitante Coprecipitcmte

C onejo IgG IgG

C obayo Ig G l,I g G 2 Ig G l, IgG2
Inm unoglobulina en la que se C aballo IgG a, IgG b, IgGc IgG a, IgG b, IgG c
encuentran localizados A sno IgG a, IgG b, IgGc IgG a, IgG b, IgGc
O veja I g 0 1 ,Ig G 2 íg G l,I g G 2
V aca Ig G l,Ig G 2 I g G l,Ig G 2
H om bre” IgG IgG
Proporción en el suero 85% -90% 10% -15%
Precipitación con el antígeno
F ijación a inm unoadsorbente
M ovilidad electroforética Y y
Peso m olecular aproxim ado 150 kD ISOkD
C oeficiente de sedim entación 7S 7S
C onstante de afinidad (K^)*’ 1 X IQo M-' 1 X 10-5 M-'
a 1 X 10’ M-' a 2 x lOí-M-'
V alencia 2
índice de heterogeneidad 0,6-0,7 0,4-0,5

a; los an ticu e rp o s h u m an o s ana liz ad o s son an tito x in a tetán ic a; los d e las re sta n tes especies an im ale s son anti-D N P.
b: corresp o n d e n a los v alores p ro m ed io s o b ten id o s co n los a n ticu e rp o s d e las diferen tes esp e cies anim ales.

Propiedades biológicas de los anticuerpos

copreeipitantes sérica de anticuerpos copreeipitantes pueda ser
superior al 20% de los anticuerpos totales. Este
aspecto será comentado más adelante.
Diferentes propiedades biológieas de los an­ Los anticuerpos precipitantes y coprecipitan-
ticuerpos precipitantes y copreeipitantes de la tes son citofílicos, pero sólo los primeros tienen
clase IgG, aislados de diferentes especies ani­ capacidad para activar la fagocitosis in vitro.
males, han sido analizadas en forma compara­ Los anticuerpos precipitantes son buenos de­
tiva. puradores de antígenos in vivo, no así los eo-
Los anticuerpos precipitantes del hombre, precipitantes. Si se inoculan ratones con un an­
conejo, IgG2 de cobayo e IgG l de oveja, en tígeno isotópicam ente marcado, y cuando la
forma de complejos solubles en ligero exceso marca radiactiva se estabiliza en sangre se les
de antígeno, activan el complemento por la vía inyecta por vía endovenosa un anticuerpo espe­
clásica y por la vía alterna cuando están pre­ cífico, el curso que sigue la radiactividad san­
sentes en forma de precipitados. Los anticuer­ guínea será un índice de la capacidad depura­
pos copreeipitantes no activan el complemento dora inducida por el anticuerpo inoculado.
por ninguna de las dos vías. En ensayos de Ensayos de com petición entre anticuerpos
competición efectuados por fijación del com ­ precipitantes y copreeipitantes en los mecanis­
plemento, mezclando dos dosis mínimas efecti­ mos de depuración, efectuados en forma simi­
vas fijadoras de com plem ento de anticuerpo lar a los indicados para fijación del com ple­
aDNP precipitante de conejo y cantidades va­ mento mostraron que también hay competición
riables de anticuerpo coprecipitante con la mis­ por masa. Los valores del índice fagocítico (K)
ma especificidad, de modo que las relaciones disminuyen a medida que aumenta la propor­
Ac ppte/A c coppte oscilara n entre 90/10 y ción de anticuerpo coprecipitante en la mezcla
10/90, se pudo demostrar que estos anticuerpos (fig. 19-5).
compiten por el antígeno (SAB-DNP) y lo ha­ El poder protector de los anticuerpos preci­
cen por m asa. La capacidad fijad o ra de las pitantes y copreeipitantes no es el mismo. Ra­
mezclas disminuye a medida que se incrementa tones inmunizados pasivamente con anticuer­
la proporción de anticuerpo coprecipitante, pa­ pos aglutinantes y no aglutinantes cinti-Salmo-
ra llegar a anularse cuando la relación es infe­ nella typhimurium, que poseen las mismas ca­
rior a 20/80 (fig. 19-5). Teniendo en cuenta racterísticas fisicoquímicas, inmunoquímicas y
ello, conviene destacar que las reacciones de fi­ propiedades biológicas de los anticuerpos pre­
jación de complemento efectuadas con sueros cipitantes y copreeipitantes, respectivamente,
que pueden contener mezclas de anticuerpos requieren una cantidad cinco veces superior de
precipitantes y copreeipitantes deben ser inter­ anticuerpo no aglutinante para conferir una
pretadas cuidadosam ente, sobre todo cuando protección del 50% cuando los animales son
exista la posibilidad de que la concentración desafiados con 10 DEM de Salmonella typhi-
 Anticuerpos no precipitantes 349

F ig. 19-5. A = variaciones en el consum o de com plem ento po r p arte de diferentes m ezclas de anticuerpos precip itan tes y
copi'ecipitantes. B = depuración antigénica en ratones inoculados con '^^j s.ty p h i-D N P (Ag). D iferentes índices fagocíticos
(K) inducidos por anticuerpos anti-D N P precipitante (1), coprecipitante (4) y m ezclas de anticuerpo precipitante/anticuer­
po coprecipitante en las relaciones 66/33 (2) y 33/66 (3). L a curva (c) corresponde a ratones en los q ue los an ticu erp o s ino­
culados fueron sustituidos por solución salina (control).

murium. Se obtuvieron resultados similares al
determinarse el índice de infección esplénica
(HE) en ratones inmunizados pasivamente con
anticuerpos bovinos aglutinantes y no agluti­
nantes m ú-Brucella abortus y desafiados luego
con B. abortus, cepa 19. A los 7 días de desa­
fío, el niimero de brúcelas vivas, por bazo de
ratón, fue cuatro veces superior cuando el anti­
cuerpo inoculado a los animales era no agluti­
nante.
Anticuerpos anti-toxina tetánica, precipitan­
tes y coprecipitantes, aislados de gammaglobu­
lina comercial específica, mostraron que la ca­
pacidad para neutralizar a la toxina es 5-6 ve­
ces superior para los anticuerpos precipitantes.
Por qué los anticuerpos coprecipitantes
no precipitan el antígeno
Com o ya se indicara, la no form ación de
complejos Ac-Ag insolubles por los anticuer­
pos coprecipitantes no es consecuencia de baja
afinidad, ni parecería estar relacionado con
grandes cambios estructurales respecto de los
anticuerpos precipitantes. Tampoco puede ser
atribuido a repulsión de sus moléculas como
consecuencia de estar muy cargados sus frag­
mentos Fe, ya que los fragmentos F (ab’)^ ais­
lados tienen frente al antígeno el m ism o com­
portamiento de la m olécula entera.
La no precipitación del antígeno por los anti­
cuerpos coprecipitantes no se debe a limitación
del reconocimiento de epitopes múltiples pre­
sentes en una molécula de antígeno, com o se
supuso. Si el número de uno de esos epitopes
fuera muy bajo, los anticuerpos formados ten­
drían muy pocas posibilidades de originar con
éstos complejos insolubles. Este argumento, si
bien puede ser válido en algún caso particular,
no lo es para la generalidad de los anticuerpos
coprecipitantes. Cuando se hicieron reaccionar
anticuerpos precipitantes y coprecipitantes con
especificidad anti-DNP con DNP^,-BSA (alto
número de grupos hapténicos por molécula de
seroalbúmina bovina) y DNP^-OVA (reducido
número de grupos hapténicos por molécula de
ovoalbúm ina), los anticuerpos precipitantes
precipitaron a ambos antígenos, m ientras que
los anticuerpos coprecipitantes no form aron
com plejos Ac-Ag insolubles con ninguno de
ellos.
En los anticuerpos coprecipitantes no existen
puentes S-S intercadenas H-H adicionales que
podrían reducir la flexibilidad de los fragmen­
tos Fab y crear impedimentos estéricos, hacien­
do que sólo uno de los sitios de combinación
350 Aspectos básicos de ia inmunidad
interaccione con el antígeno y, como conse­
cuencia, no se formen com plejos insolubles.
Un argumento de este tipo es poco consistente,
ya que los anticuerpos precipitantes y copreci­
pitantes reducidos en condiciones adecuadas
con 2-mercaptoetanol o ditiotreitol y alquilados
con iodoacetamida, siguen manteniendo su ca­
pacidad inicial de reacción. Por otra parte, no
se han observado diferencias en los mapas dia­
gonales y en la tipificación quím ica de anti­
cuerpos precipitantes y coprecipitantes.
No obstante los argumentos expuestos, exis­
ten hechos experimentales que permiten espe­
cular sobre las causas de la no precipitación del
antígeno por parte de los anticuerpos coprecipi­
tantes. Anticuerpos precipitantes y coprecipi­
tantes anti-DNP de oveja (IgG l) ligados a in­
munoadsorbente tienen distinta capacidad para
fijar ligandos grandes y pequeños. Un nmol de
anticuerpo precipitante fija aproximadam ente
0,6-0,7 nmoles de DNP-BSA (1,3 x lO-’M), en
tanto que el anticuerpo coprecipitante ligado a
inmunoadsorbente fija 0,04 nmoles de antígeno
por nmol de anticuerpo. Para la misma concen­
tración molar de hapteno (DNP-OH), la capaci­
dad de unión para anticuerpos precipitantes y
coprecipitantes ligados a inmunoadsorbente es
de 0,7 nmol y 0,2 nmol de hapteno por 1 nmol
de anticuerpo, respectivamente. Estos resulta­
dos indican que, si bien los anticuerpos precipi­
tantes ligados a inmunoadsorbente fijan antíge­
no y hapteno en solución, en el caso de los an­
ticu erp o s co p recip itan tes esa caplicidad es
prácticamente nula para el antígeno. Esto des­
carta la posibilidad de que la no formación de
complejos insolubles con el antígeno por parte
de los anticuerpos coprecipitantes pudiera de­
berse a un impedimento estético para ligandos
de gran tamaño únicamente, o a que esos anti­
cuerpos se com porten com o m onogám icos
frente al antígeno, como ocurre con la IgG(T)
de caballo. Si se tratara de un impedimento es-
térico exclusivam ente para grandes ligandos,
no tendrían que existir diferencias en la capaci­
dad fijadora de haptenos por los anticuerpos
precipitantes y coprecipitantes; y si los anti­
cuerpos coprecipitantes se comportaran como
m onogám icos, cuando están fijados a inm u­
noadsorbente, además de no fijar moléculas de
antígeno no tendrían que fijar m oléculas de
hapteno. Estos resultados indicarían que los
dos sitios de combinación de la molécula del
anticuerpo coprecipitante tienen un comporta­
miento diferente frente al ligando.
Los estudios de interacción prim aria entre
anticuerpos anti-DNP precipitantes y copreci­
pitantes y el hapteno dinitrofenil-ácido-y-ami-
nocaproico (DNP-EACA) muestran curvas de
Scatchard, resultantes de graficar r/c versus r,
bien diferentes (r = moles de hapteno combina­
do por mol de anticuerpo, y c = moles de hap­
teno libre). Los anticuerpos precipitantes mues­
tran curvas sin marcadas inflexiones cuya pro­
longación intercepta a r = 2, mientras que los
anticuerpos coprecipitantes dan curvas bimoda-
les. En este caso, la extrapolación de la porción
de la curva correspondiente a la más alta con­
centración de hapteno intercepta a r = 2 y la
extrapolación de la otra parte de la curva inter­
cepta a r = 1, lo que indica que cada población
de sitios de combinación constituye aproxima­
damente el 50% del total. Para el caso de los
anticuerpos coprecipitantes anti-DNP de oveja
de la clase IgG l, los valores experimentales de
Ko calculados para ambas ramas de la curva
oscilan entre 100 y 200 veces (fig. 19-6A). Un
hecho similar fue observado cuando se analiza­
ron anticuerpos coprecipitantes de conejo.
Esto podría hacer suponer: a) que hay dos
poblaciones de anticuerpos coprecipitantes, una
de alta afinidad y otra de baja afinidad, hecho
poco probable ya que estos anticuerpos fueron
purificados por inmunoadsorción, que sólo re­
tiene anticuerpos de alta afinidad, y b) que los
anticuerpos coprecipitantes funcionen como
moléculas de IgG con un sitio de combinación
de diferente afinidad en cada uno de los Fab de
la molécula. Los productos de desorción de las
adsorciones sucesivas de anticuerpo coprecipi­
tante anti-DNP de oveja efectuadas con alícuo­
tas de la cantidad de inmunoadsorbente necesa­
ria para la fijación total del anticuerpo, al ser
analizados por estudios de interacción prima­
ria, mostraron en todos los casos gráficos de
Scatchard con curvas bimodales. Estos resulta­
dos hacen presumir una asimetría molecular, y
que muy probablemente en cada molécula de
anticuerpo coprecipitante exista un sitio de
combinación de alta afinidad y otro de baja afi­
nidad. Si las curvas bimodales descritas para
los anticuerpos coprecipitantes fueran conse­
cuencia de una mezcla de dos poblaciones de
anticuerpos, una de alta afinidad*y otra de baja
afinidad, los análisis de los productos de desor­
ción de las adsorciones seriadas tendrían que
haber dado curvas norm ales, con pendientes
variables como consecuencia de la selección
por afinidad, pero nunca curvas bimodales.
Esa presunción se ve reforzada con los resul­
tados obtenidos en los estudios de inmunoad­
sorción y de interacción primaria logrados con
los fragmentos F (ab’)2 de anticuerpo precipi­
tante y coprecipitante, purificados por cromato­
grafía de afinidad, y sus correspondientes frag­
mentos Fab’ obtenidos por reducción con mer-
captoetanol y alquilación con iodoacetamida.
El fragmento Fab’ de anticuerpo precipitante es
retenido en su totalidad por el inm unoadsor­
bente usado en la purificación del fragmento E
(ab’)2, en tanto que sólo es retenido el 50% y

el resto no se adsorbe, si el Fab’ procede de F
(ab’)2 coprecipitante. Los valores de Ko de los
fragmentos Fab* retenidos y no retenidos por el
inmunoadsorbente difieren grandemente, sien­
do mayor para el fragmento que se fijó (fig. 19-
6B). Por otra parte, los gráficos de Scatchard
correspondientes a la interacción de anticuerpo
precipitante y coprecipitante anti-DNP de oveja
de la clase IgG l con un ligando de gran tamaño
(SAB-DNP), analizada por radioinm unoanáli­
sis, muestran curvas normales, sin inflexiones
en ambos casos, pero con r = 2 para los anti­
cuerpos precipitantés y r = 1 para los anticuer­
pos coprecipitantes (fig. 19-6C).
Un hecho que confirma la suposición de la
existencia de dos sitios de combinación o para-
topes de distinta afinidad en cada molécula de
anticuerpo coprecipitante es el correspondiente
a la hibridización al azar de hemimoléculas de
este anticuerpo. En ensayos de este tipo se ha
obtenido 16-17% de anticuerpo precipitante, lo
que está de acuerdo con la posibilidad teórica
del 25%, si los anticuerpos coprecipitantes tu­
vieran en cada hemimolécula sitios de combi­
nación de alta afinidad y baja afinidad, respec­
tivamente.
Los datos experimentales descritos, corres­
pondientes a ensayos efectuados con anticuer­
po precipitante entero, hem im oléculas y los
fragmentos E (ab’)^ y Fab’, sugieren que la m o­
lécula de anticuerpo coprecipitante de la clase
IgG funcionalmente es asimétrica y que en ella
existen dos sitios de combinación con distinta
afinidad por el antígeno. Permiten suponer ade­
más que el com portam iento diferente de los
dos sitios de combinación de este anticuerpo no
es consecuencia de una variación de la afinidad
de uno de los sitios de com binación por un
efecto alostérico negativo originado por la inte­
racción del otro sitio con un ligando, ya que a
partir del fragmento F (ab’)^ de anticuerpo co­
precipitante purificado por inmunoadsoreión es
posible separar dos poblaciones de fragmentos
F ab’, con diferente comportam iento frente al
inmunoadsorbente y distinta afinidad.
La accesibilidad de los sitios de com bina­
ción de los anticuerpos precipitantes y copreci­
pitantes por grandes hgandos ha sido analizada,
haciendo reaccionar para ello anticuerpos an-
tiDNP de conejo y de oveja de la clase IgG l
con se ro a lb ú m in a b o v in a d in itro fe n o la d a
(SAB-DNP) y seroalbúmina bovina dinitrofe­
nolada en la que el grupo DNP estaba separado
del soporte proteico por el espaciador ácido
gammaaminobutírico (SAB-GABA-DNP). Los
anticuerpos precipitantes mostraron el mismo
com portam iento inm unoquím ieo y biológico
frente a los dos antígenos, en tanto que los co­
precipitantes funcionaron como tales frente a
SAB-DNP y como precipitantes frente a SAB-
Anticuerpos no precipitantes 351
GABA-DNP, tanto desde el punto de vista in-
munoquímico como biológico (fijan com ple­
mento, activan fagocitosis, etc.). En ensayos de
radioligando en fase fluida, los anticuerpos co ­
p re c ip ita n te s d iero n cu rv as n o rm ales co n
SAB-DNP, que cortan a r = 1 y curvas bi-
modales con ’^T.SAB-GABA-DNP, en las que
la proyección de cada módulo corta a r = 1 y r
= 2, hecho similar al que ocurre cuando este
anticuerpo interacciona con el hapteno.
Cuando el anticuerpo coprecipitante fue fija­
do a colum na de Sepharosa-SAB-DNP y fue
puesto en contacto con ‘^^I.SAB-DNP en fase
fluida, la radiactividad fijada fue prácticamente
nula (0,4%), en tanto que el porcentaje de re ­
tención de la marca se elevó al 5,4% cuando el
antígeno fijado a la Sepharosa fue SAB-GA-
BA-DNP. En las mismas condiciones experi­
mentales, la radiactividad retenida por el an ti­
cuerpo precipitante fue del 28% para am bos
antígenos. La menor capacidad de fijación de
'^'■’I.SA B-DN P por los anticuerpos coprecipi­
tantes, respecto de los precipitantes, cuando es­
tán unidos a B SA -G A BA -D N P sería c o n se ­
cuencia de que sólo podrán fijar el lig an d o
aquellas moléculas de anticuerpo que se han
unido al inmunoadsorbente por el sitio de com ­
binación de baja afinidad y exponen el de alta
afinidad, y no así cuando la unión es por el si­
tio de alta afinidad.
En ensayos de radioligando por competición
con ‘^^I.SAB-DNP se ha dem ostrado que el
comportamiento del anticuerpo precipitante es
el m ism o fre n te a S A B -D N P y S A B -G A -
BADNP, indicando que la competición por los
sitios de combinación entre estos antígenos y el
trazador ( '“ I.SA B -D N P) es idéntica. P o r el
contrario, con el anticuerpo coprecipitante las
curvas de desplazam iento son distintas con
SA B-DN P y SAB-GABA-DNP. La cantidad
de SAB-GABA-DNP necesaria para desplazar
'^^I.BSA-DNP fue mayor que la correspondien­
te a SAB-DNP. Esto demuestra que la com peti­
ción entre los dos antígenos y el trazador no
fue la misma. Ello puede explicarse asumiendo
que SAB-DNP reacciona con uno solo de los
sitios de combinación de la molécula, mientras
que SA B-GA BA -D NP reacciona con am bos.
Como consecuencia, se necesitará mayor canti­
dad de SA B-GA BA -D NP que de SA B-D N P
para desplazar al trazador.
Los ensayos precedentes muestran c]ue una
accesibilidad diferente de uno de los sitios de
combinación de la molécula del anticuerpo co­
precipitante es la responsable de la variación de
su afinidad, y la causante del peculiar com por­
tamiento de estos anticuerpos, hecho que se re­
vierte con el uso de un ligando en el que el gru­
po hapténico está separado del soporte antigé­
nico por un espaciador.
352 Aspectos básicos de la Inmunidad

66

F ig . 19-6. G ráficos de Scatchard correspondientes a interacciones de anticuerpos anti-D N P precipitantes y copreeipitantes

y sus fragm entos, eon pequeños y grandes ligandos.
A = anticuerpo precipitante; o - o fragm ento F (ab )2 de anticuerpo precipitante; ArA. anticuerpo coprecipitante; A -A
fragm ento F (ab ’)2 de anticuerpo coprecipitante. Ligando: D N P-ácido e-am inocaproico (D NP-EA C A ).
B = ®-® fragm ento F ab ’ de anticuerpo precipitante; fragm ento F a b ’ de anticuerpo eoprecipitante retenido por el in­
m unoadsorbente, fragm ento F ab ’ de anticuerpo coprecipitante no retenido por el inm unoadsorbente. Ligando:
DNP-EA G A .
C = anticuerpo precipitante; A r Á . anticuerpo coprecipitante. Ligando: SA B-D N P.
D = anticuerpo precipitante tratado (®-®) y no tratado o - o con endo-p-glucosam inidasa FI; anticuerpo coprecipitante tra ­
tado A - A y no tratado A -A con la enzim a glucosídica.
Las interacciones con D N P-EA C A fueron analizadas por quenching de fluorescencia. Los correspondientes a SA B -D N P,
po r radioinm unoanálisis.

Los resultados expuestos indican asimetría
molecular en los anticuerpos copreeipitantes,
pero ninguno de ellos está en favor de que las
diferencias entre anticuerpos precipitantes y
copreeipitantes, aislados de la misma muestra
de suero y ubicados en misma clase o subclase
de IgG, sea consecuencia de una diferente in­
formación en el genoma (igualdad en la estruc­
tura antigénica, similitud en los mapas peptídi­
cos, mapas diagonales y tipificación química).
Esas diferencias entre los dos tipos de anticuer­
pos son de origen postraduccional y hoy sabe­
mos que afectan a la parte hidrocarbonada de la
molécula de anticuerpo. Estudios de crom ato­
grafía en fase gaseosa desarrollados con IgG l
de oveja mostraron una diferencia cuantitativa
de 6 mañosas y 2 (?) glucosaminas en favor de
los anticuerpos copreeipitantes. Basados en es­

te antecedente se han desarrollado estudios que
demostraron que en los anticuerpos coprecipi­
tantes hay un resto glucosídico del tipo “rico en
mañosa” que puede ser removido mediante el
em pleo de endo-P-acetilglucosam inidasa H.
Cuando ello ocuire, los anticuerpos coprecipi­
tantes se convierten en precipitantes y expresan
la actividad biológica de estos anticuerpos. En­
sayos efectuados con anticuerpos enteros y sus
fragmentos E (ab ’ ) 2 y Fab muestran que el oli-
gosacárido está ubicado en uno de los fragmen­
tos Fab, el de menor afinidad, y que su rem o­
ción por acción enzim ática hace que el frag­
mento Fab exprese alta afinidad por el ligando
(fig. 19-6D).
M ediante el em pleo de co n can av alin a A
(lectina con especificidad para grupos termina­
les mañosa y glucosa) unida en forma covalen­
te a Sepharosa (Con A-Sepharosa) ha sido po­
sible separar los anticuerpos precipitantes y co­
precipitantes.
De la población de fragmentos Fab obteni­
dos de anticuerpos coprecipitantes purificados
por cromatografía de afinidad con Con A-Se-
pharosa, el 50% es retenida cuando el producto
se pasa por una colum na de afinidad con esa
lectina. La población de Fab que eluye es de
afinidad alta y la retenida, de afinidad baja. E s­
ta última aumenta su afinidad si es tratada con
la enzima glucosídica.
Estos resultados confirman los anteriores y
ponen claramente en evidencia que una gluco-
silación que afecta a uno solo de los fragmen­
tos Fab es la responsable del particular com ­
portamiento inmunoquímico y biológico de es­
tos anticuerpos.
Se ha podido demostrar que el oligosacárido
responsable de este fenóm eno está unido al
fragmento Fd. Este fragmento es el que queda
unido a la Con A -Sepharosa cuando el frag ­
mento Fab, reducido y alquilado, se pasa por
una colum na con esa lectina, y el único que
compite con los glóbulos rojos de cobayo, que
poseen glucoproteínas que se unen a concana­
valina A, por la fijación a esa lectina. Las cade­
nas L provenientes de la misma muestra y los
fragmentos Fd y cadenas L de Fab de alta afini­
dad del anticuerpo coprecipitante y los mismos
fragmentos provenientes de anticuerpos preci­
pitantes no son efectivos.
El conocimiento de la asimetría molecular de
los anticuerpos coprecipitantes y la diferente
afinidad por el ligando de sus paratopes o sitios
de combinación hacen comprensible el hecho
de que estos anticuerpos no formen complejos
insolubles con el antígeno; que coprecipiten
junto con los anticuerpos precipitantes y se
unan firmemente a los complejos formados por
éstos. Además, permiten entender por qué los
anticuerpos coprecipitantes pueden ser purifica­
Anticuerpos no precipitantes 353
dos por inmunoadsorción; el valor relativamen­
te alto de sus K^, que expresa el promedio de
los respectivos valores de cada sitio de com bi­
nación de la molécula y su mayor heterogenei­
dad respecto de los anticuerpos precipitantes.
Teniendo en cuenta estos hechos, y para que
los an ticu erp o s c o p recip itan tes p u ed an ser
identificados de una manera más definida, he­
mos propuesto que sean denominados “a n ti­
cuerpos IgG asimétricos”, ya que ello estaría
indicando la anomalía responsable del particu­
lar comportamiento.
¿Cuáles podrían ser los mecanismos inducto­
res de la glucosilación asimétrica de las m olé­
culas de IgG?
Las moléculas de inmunoglobulinas tienen la
composición H2L2 y resultan de asociación de
dos hemimoléculas (H lL l), cada una de ellas
formada por la asociación de una cadena pesa­
da H y una cadena liviana L. En el citoplasma
de las células plasmáticas han sido detectadas
tam bién, como formas libres, las estrucutrras
H lL l y H2L1. Análisis de IgG sérica han de­
mostrado que cada molécula de inmunoglobuli­
na tiene fijadas 2,8 moléculas de oligosacáridos
0,8 de los cuales, en promedio, están unidos al
fragmento Fab. Se ha propuesto que la frecuen­
cia y localización del sequon de N-glucosila-
ción Asn-X-Ser/Thr es el responsable de esta
glucosilación extra. En ratón se ha demostrado
que genes Vjj contienen sequones de glucosila­
ción, sugiriendo su participación en la genera­
ción de glucosilación del Fab. En fragmentos
Fab de anticuerpos monoclonales hem os de­
mostrado la presencia de olgiosacáridos con es­
tructuras monosialiladas y de alto contenido en
mañosa. Estas diferentes estructuras son las
responsables de la microheterogeneidad obser­
vada en moléculas de IgG, lo que sugiere que
las células B están equipadas con conjuntos de
glucosiltransferasas los que se encuentran en
diferentes proporciones. En determinadas cir­
cunstancias, modificaciones postraduccionales
de un péptido por N-glucosilación pueden lle­
var al incremento de una glucoforma particular.
Glucoformas provenientes de la misma célula
son consecuencia de modificaciones de un pép­
tido simple por la acción de glucosiltransfera­
sas y glucosidasas.
Los mecanismos arriba indicados probable­
mente participen en la glucosilación asimétrica
de las moléculas de IgG, ¿pero quién determina
la modificación? Teniendo en cuenta las dife­
rencias observadas cuando antígenos solubles o
particulados se inoculan en forma repetida por
largos períodos es posible que diferentes célu­
las presentadoras participen en la captura anti­
génica. Estas células podrían sintetizai- diferen­
tes factores (citoquinas) que actuarían inhibien­
do o estimulando la actividad de glucosiltrans-
354 Aspectos básicos de la Inmunidad
ferasas, cambiando los patrones de glucosila­
ción y llevando a la síntesis de diferentes glu-
coformas. Si la célula que reconoce a los antí­
genos solubles y particulados fuera la misma,
su captura por pinocitosis (antígeno soluble), o
fagocitosis (antígeno particulado) podría acti­
var diferentes sistem as internos, los que po­
drían inducir m odificaciones en los patrones
normales de glucosilación.
Cambios en la glucosilación podrían también
ocurrir a través de variaciones en el plegado
del péptido H el que llevaría a la exposición de
nuevos sequones de glucosilación. En expe­
riencias realizadas por nosotros pudo demos­
trarse que, cuando a cultivos de hibridomas se
Jes añade cisteína 10*-“’ M o mecaptoetanol lO -'’
M, la proporción de anticuerpos IgG asimétri­
cos sintetizados varía. Ello podría deberse a va­
riaciones en el plegado de las cadenas H, por
competición entre los grupos sulfidrilos de la
cisteína y del metacaptoetanol y el sulfidrilo de
la cadena H, por la enzima involucrada en la
formación de los puentes di sulfuro intracatena-
rios.
Otra posibilidad es que la célula presentado­
ra de antígeno reaccione de una manera dife­
rente cuando reconoce un antígeno particulado,
induciendo al linfocito B a sintetizar una molé­
cula citosólica que actúe como “chaperona” o
celadora. Hay algunas evidencias que sugieren
que el plegado en el citoplasma de nuevas tra­
ducciones de proteínas precursoras está preve­
nida por la presencia de presecuencias amino-
terminales. Ello permitiría al polipéptido H no
plegado o parcialmente plegado interaccionar
con “chaperones” citosólicos del tipo de la fa­
milia ct-hps 70, lo que retardaría su transporte
a membrana. Como consecuencia podría, en un
estado de plegam iento conform acional poco
consistente, interactuar con glucosiltransfera-
sas, facilitando la glucosilación de sequones
normalmente no funcionales por no estar ex­
puestos adecuadamente.
Por qué los anticuerpos IgG asimétricos
aglutinan eritrocitos específicamente
sensibilizados.
En la membrana de los eritrocitos de un gran
número, de vertebrados existen receptores para
el fragmento Fe de IgG. En los glóbulos rojos
humanos no están expuestos y deben ser libera­
dos por tripsinización previa. Se han efectuado
estudios sobre su evolución filogenética y so­
bre su evolución ontogénica en el pollo. Su nú­
mero por eritrocito varía; ello depende del ta­
maño globular. El receptor ha íjido aislado y
purificado; responde a las características de una
glucoproteína de PM 30 kD. Su capacidad para
interaccionar con ligando en fase fluida tam ­
bién ha sido analizada. Este receptor es especí­
fico para el fragmento Fe de las diferentes sub­
clases de IgG agregadas por interacción previa
con el antígeno (complejos Ac-Ag) o por méto­
dos físicos y químicos. Fija también Fcy y Fc|j,
purificados e IgM .7S no agregada, con una
unión de alta afinidad (K^ = 10* M '); no fija
IgM. 198, Fcix5 e IgA. La interacción óptima li­
gando-receptor tiene lugar a 4°C por 18 horas,
y cuando la reacción se efectúa a 37°C se pro­
duce la movilización o “capping” de los com­
plejos formados. Por ensayos de competición
se ha demostrado la especificidad de la unión
ligando-receptor.
La existencia de este receptor hemático para
Fe, identificado en nuestros laboratorios, ha
permitido interpretar la aglutinación de los eri­
trocitos de carnero específicamente sensibiliza­
dos, por los anticuerpos anti-ovoalbúmina co-
precipitantes, como consecuencia de la forma­
ción de complejos mixtos, constituidos por la
unión del sitio de combinación de alta afinidad
de una molécula con un determinante antigéni­
co existente en la superficie de un eritrocito, y
el fragmento Fe de la misma molécula, activa­
do por esa interacción, con un receptor para Fe
presente en un eritrocito adyacente. En favor
de esta interpretación está el hecho de que sólo
los anticuerpos copreeipitantes y no sus frag­
mentos F(ab ’ ) 2 aglutinan los eritrocitos sensibi­
lizados y que dicha aglutinación se ve inhibida
si los receptores eritrocitarios son previamente
bloqueados con IgG agregada por calor, Fcy,
Fc^oIgM .V S. (fig. 19-7).
El hecho de que los glóbulos rojos humanos
sensibilizados no sean aglutinados por los anti­
cuerpos copreeipitantes, cosa que hacen los
precipitantes, y que los glóbulos rojos de car­
nero sensibilizados sean aglutinados por ambos
anticuerpos, permite la detección de anticuer­
pos precipitantes como contaminantes de una
población de anticuerpos copreeipitantes puri­
ficados. Dada la sensibilidad de la reacción de
hemaglutinación, se han podido poner en evi­
dencia pequeñas cantidades de anticuerpos pre­
cipitantes en muestras purificadas de anticuer­
pos copreeipitantes que daban inmunoprecipi­
tación negativa.
Evolución de los anticuerpos IgG simétricos
precipitantes y asimétricos (copreeipitantes)
en la respuesta inmune
La concentración sérica de anticuerpos pre­
cipitantes y copreeipitantes ha sido investigada
en ovejas inoculadas a repetición, durante un
año, con un antígeno T-dependiente en solu­
ción (GGH-DNP). Los anticuerpos anti-DNP
copreeipitantes están presentes durante todo el
curso de la respuesta inmune, y en todos los ca-
 Anticuerpos no precipitantes 355

F(ab ’)2

m - f \
Fe
G lóbu los rojos
d e carnero Anticuerpo
se n sib iliz a d o s IgG asim étrico

D eterm inan te a n tigén ico Aglutinación

# R ecep to r para Fe

F ig . 19-7. R epresentación esquem ática de la hem aglutinación pasiva m ediada por anticuerpos no precipitantes IgG asim é­
tricos o coprecipitantes, com o un fenóm eno mixto en el c[ue participan los fragm entos Fab y Fe,

SOS su concentración sérica no sobrepasa el gándose a obtener relaciones Ac aglt/Ac no-

10% a 15% de los anticuerpos totales (relación
Ac ppte/Ac coppte, aproximadamente 90/10).
En conejos inoculados en form a similar con
Salmonella typhimurium y vacas infectadas con
Brucella abortus, cepa l9, la concentración de
anticuerpos no aglutinantes capaces de fijarse
al antígeno y detectables por reacción con anti­
gammaglobulina (Coombs) se incrementa, lle­
aglt de 25/75. Este hecho es consecuencia de la
forma de presentación del antígeno (soluble o
particulado), lo que queda demostrado con los
resultados de la fig. 19-8, Como puede verse, la
ovoalbúm ina polimerizada con glutaraldehído
y la ovoalbúmina monomérica covalentemente
fijada a una partícula (bacteria) dan una res­
puesta similar, con un alto contenido en anti-

F lg . 19-8. C urvas de producción de anticuerpos p re c ip i­

tantes y coprecipitantes po r conejos inoculados a re p e ti­
ción con ovoalbúm ina en solución (A), ovoalbúm ina fijada 12 16 20 24
covalentem ente a Brucella abortus (B), y ovoalbúm ina p o ­
Semanas
lim erizada por tratam iento con glutaraldehído (C).
356 Aspectos básicos de la inmunidad
cuerpos coprecipitantes, a diferencia de lo que
ocurre con la ovoalbúmina en solución. Es de
destacar que esos incrementos ocurren cuando
los antígenos particulados son inoculados a re­
petición, por períodos largos. Los resultados
anteriores descartan, además, la participación
de algún componente de la pared o membrana
bacteriana en la modulación de la respuesta in­
mune.
Función de los anticuerpos IgG asimétricos
Los resultados obtenidos en el estudio de los
anticuerpos coprecipitantes en diferentes espe­
cies animales muestran que estos anticuerpos
están constituidos por moléculas asimétricas,
funcionalmente univalentes y, dada la capaci­
dad que tienen para unirse firmemente al antí­
geno por el sitio de combinación de alta afini­
dad, constituyen excelentes anticuerpos de blo­
queo. Considerando este hecho y el particular
comportamiento biológico de los anticuerpos
IgG asimétricos, la existencia de estos anticuer­
pos podrá resultar beneficiosa o perjudicial pa­
ra el huésped según el carácter propio o no
propio de los antígenos involucrados y de la si­
tuación particular en la que actúan.
Si se tienen en cuenta los resultados obteni­
dos en los estudios seriados efectuados en ove­
jas y conejos inoculados con antígenos T-de-
pendientes en solución, cabría suponer que los
anticuerpos IgG asimétricos no tienen signifi­
cación en la respuesta inmune, ya que como se
ha señalado, en el transcurso de la respuesta,
durante un año, la relación anticuerpo IgG si­
métrico/ asimétrico ha sido 90/10 en forma per­
manente, y la eficacia de estos anticuerpos, en
esa relación, es prácticamente nula. No obstan­
te las cosas cambian cuando los inmunógenos
son particulados. En estos casos, a medida que
transcurre el tiempo se incrementan los anti­
cuerpos asim étricos invirtiéndose la relación
anteriorm ente indicada, llegando estos an ti­
cuerpos a constituir el 30-70% del total. Sueros
de estos animales con diferentes relaciones de
am bos anticuerpos han sido an alizad o s en
cuanto a su capacidad opsonizante in vivo, y
los resultados obtenidos muestran similitud con
los logrados cuando se analizaron m ezclas
preestablecidas de anticuerpos IgG simétricos
precipitantes y asimétricos no precipitantes.
En infecciones m icrobianas y parasitarias
crónicas como brucelosis, gonococcia, tripano­
somiasis americana, triquinosis, y las produci­
das por Necator americanus y Fascioia hepáti­
ca, se ha demostrado la presencia de anticuer­
pos bloqueantes de alto título. De sueros de pa­
cientes con enfermedad de Chagas crónica he­
mos aislado anticuerpos que responden a las
características de los anticuerpos IgG asimétri­
cos, que no obstante fijarse firmemente al pará­
sito no son inm unolíticos, lo que dem uestra
que no son protectores del huésped. Un aumen­
to de estos anticuerpos en las infecciones cróni­
cas sería comprensible, teniendo en cuenta que
en estos casos antígenos particulados (bacte­
rias, parásitos) estimulan en forma repetida por
largos períodos.
Anticuerpos no precipitantes han sido d e­
mostrados en tumores. Diferentes mecanismos
podrían estimular células tumorales en reposo
y los neoantígenos expuestos podrían inducir
una respuesta inmune humoral con predominio
de anticuerpos IgG asimétricos. Dada su capa­
cidad bloqueante, al impedir la agresión de los
neoantígenos por los mecanismos efectores de
una respuesta inmune normal, en lugar de indu­
cir surveiliance mejorarían y facilitarían el cre­
cimiento tumoral y las metástasis.
Estudios desarrollados en nuestros laborato­
rios en conejos inoculados con tiroglobulina
homóloga en solución y pohmerizada con glu­
taraldehído mostraron resultados que difieren
entre sí. Sólo la forma soluble del antígeno in­
dujo la producción de anticuerpos IgG precipi­
tantes, fijadores del com plem ento, m ientras
que con el antígeno polimerizado se obtuvieron
anticuerpos no fijadores del complemento, pre­
dominantemente no precipitantes. Los estudios
anatomopatológicos mostraron la existencia de
daño glandular sólo después de la inoculación
de tiroglobulina soluble por largos períodos.
Estos resultados estarían de acuerdo con lo ob­
servado en algunos casos de enferm edad de
Hashimoto, en los que la tiroiditis puede estar
presente o no, aun con los mismos títulos de
anticuerpos anti-tiroglobulina totales.
La misma paradoja ocurre en diabetes, don­
de pacientes con alto título de anticuerpos anti­
insulina pueden presentar hiperglucemia o hi-
poglucemia. El radioinmunoanálisis usado para
la cuantificación de anticuerpos no puede dis­
criminar entre moléculas normales y asimétri­
cas. Es posible que en algunas hiperglucemias
los anticuerpos presentes sean normales, simé­
tricos, capaces de formar complejos Ag-Ac que
fijan complemento, opsonizan y activan la de­
puración antigénica. Estos eventos dism inui­
rían los niveles de insulina. La presencia de an­
ticuerpos anti-insulina asimétricos inhibiría la
rama efectora del sistema inmune por no for­
mar complejos Ag-Ac con la adecuada estruc­
tura, y el antígeno insulina resultaría bloqueado
y protegido por sus propios anticuerpos y man­
tenido en circulación. De acuerdo con la cons­
tante de asociación a equilibrio K, que define la
afinidad antígeno-anticuerpo como la relación
entre los reactivos complejados y libres del sis­
tema, la hipoglucemia observada podría ser de­
bida a la presencia de hormona libre circulante.

La intensidad de la hipoglucem ia dependería
de la relación entre anticuerpos simétricos/asi­
métricos en el suero.
R ecientem ente hem os dem ostrado que el
10-12% de las moléculas de IgG provenientes
de suero hum ano norm al y de otras especies
animales están asim étricam ente glucosiladas.
Muchos de los antígenos propios generalmente
asociados con células podrían actuar como in­
munógenos particulados. Como consecuencia,
gran parte de las moléculas asimétricas “no in­
munes” del huésped podrían ser específicas de
lo propio actuando como anticuerpos protecto­
res, reguladores. Esto estaría de acuerdo con lo
sugerido por Cohén y Cooke de que los anti­
cuerpos naturales podrían actuar bloqueando
epitopes propios o epitopes extraños que mime-
tizan lo propio, previniendo de esta manera la
iniciación de una respuesta de autoinmunidad.
Cálculos efectuados nos permiten decir que
por mi de suero deberían existir 6 x 10'“’ molé­
culas IgG asimétricas, si consideramos que el
10-15% de la IgG total del suero es equivalente
a 1,5 mg.ml ‘ o 10"’’ M. Si este valor se multi-
phca por el número de Avogadro (6,02 x 10^^)
el producto obtenido corresponde al número de
moléculas IgG asimétricas por mi de suero an­
tes indicado. Si admitimos que en un individuo
el número de paratopes capaces de reconocer
distintas especificidades, incluidas las de los
idiotipos puede llegar a 2-5 x 10*, los cálculos
nos dicen que aproximadamente 10’ m ol.m f'
(6 X 10'V2,5 X 10*) reconocerán el mismo epi­
tope. Este número de moléculas sería suficiente
para participar en diferentes funciones inmunes
como el bloqueo de antígenos que podrían esti­
m ular o deprim ir células inm unológicamente
componetentes o en la creación de tolerancia.
Es tentador especular que los anticuerpos IgG
asimétricos, no precipitantes, son capaces de
bloquear antígenos o epitopes, disminuyendo
su concentración y como consecuencia intervi­
niendo en la inducción de tolerancia de baja
dosis.
Podría argum entarse que los anticuerpos
norm ales, b ivalentes, sim étricos, no son el
reactivo ideal para un encadenamiento idiotipo-
antiidiotipo efectivo propuesto por Jem e, ya
que por poseer dos paratopes activos podrían
originar agregados disparando mecanismos in­
munes efectores. Los anticuerpos IgG asimétri­
cos, funcionalmente univalentes, podrían m an­
tener ese encadenamiento, perpetuando además
las células B con m em oria dependientes del
idiotipo. La unión entre moléculas de anticuer­
pos asimétricos sería estable porque, a través
de su paratope de alta afinidad, podría unirse a
idiotipos, exponiendo al mismo tiempo su pro­
pio idiotipo a través del paratope o sitio de
combinación de baja afinidad. Este paratope es
Anticuerpos no precipitantes 357
incapaz de fijar grandes ligandos, pero actuan­
do como epitope (idiotipo) podría ser fijado fir­
mem ente por el paratope de alta afinidad de
otra molécula IgG asimétrica.
Anticuerpos IgG asimétricos pueden además
actuar en forma beneficiosa, cuando son indu­
cidos con el objeto de lograr una terapia antia-
lergénica específica. Hay marcadas evidencias
de que el anticuerpo bloqueante específico IgG
asimétrico funciona como protector en la aler­
gia, y que la eficacia de la inmunoterapia es d e­
pendiente del cambio del balance entre a n ti­
cuerpos “perjudiciales” de la clase IgE y anti­
cuerpos “protectores”, bloqueantes, de la clase
IgG. Cuando con fines terapéuticos se inocula­
ron en form a repetida alérgenos m odificados
por tratamiento con polietilenglicol, se obtuvie­
ron mejores resultados que cuando se usaron
alérgenos solubles. Esto está de acuerdo con la
síntesis preferencial de anticuerpos IgG asim é­
tricos bloqueantes obtenida cuando conejos y
ratas fueron inoculados con antígenos solubles
polimerizados (seroalbúmina bovina) o antíge­
nos particulados (células esplénieas).
En estudios previos demostramos que duran­
te la preñez hay un aumento considerable de
moléculas IgG asimétricas específicas (contra
antígenos paternales) y no específicas, llegando
a valores de 25-30% en suero y 35-60% en los
eluidos de placenta con KCL 4M. La actividad
anti-paternal localizada en la IgG asim étrica,
medida por inmunofluorescencia (IF) y fijación
del complemento, usando linfocitos paternales
como “blanco”, es menor en el suero que en los
eluidos de placenta. En los eluidos la actividad
anti-paternal de la IgG asimétrica es tres veces
superior a la misma actividad detectada en la
fracción IgG simétrica. Este hecho y el efecto
bloqueante de los anticuerpos asimétricos, su ­
gieren que estos anticuerpos con especificidad
para los antígenos de origen paterno deben p a r­
ticipar en la protección del feto en el útero m a­
terno.
En ratas Fischer hembras inmunizadas con
antígenos particulados (células esplénieas) p ro ­
venientes de ratas machos Buffalo, hemos o b ­
servado una síntesis preferencial de anticuerpos
asimétricos. Cuando las ratas Fischer fueron in­
munizadas durante 3 meses previo al aparea­
miento eon machos Buffalo, el peso de los fe ­
tos y la placenta y la sobrevida de las crías fue
mayor que en el grupo control, lo que sugiere
un efecto beneficioso de los anticuerpos asim é­
tricos en la preñez. Esto está de acuerdo con
los resultados obtenidos cuando mujeres que
han padecido abortos espontáneos recurrentes
son inmunizadas con linfocitos paternales. Con
estos tratamientos se ha observado ausencia de
abortos y la gesta de niños de mayor peso y ta ­
maño.
358 Aspectos básicos de la inmunidad
Cuadro 19-2. Estudios serológicos en pacientes con enfermedad de Chagas
Reacciones serológicas
Precipitación H em aglutinación
Sueros en geles GRH
1/512
1/256
1/64
1/64
1/64
1/64
1/64
1/32
La síntesis de factores supresores de la res­
puesta inmune celular, por parte de la placenta,
ha sido descrita. Recientemente hemos demos­
trado que cuando el sobrenadante de cultivos
de placenta es adicionado a un hibridoma, es
posible incrementar la relación anticuerpo asi­
métrico/simétrico de las moléculas IgG sinteti­
zadas. C am bios sim ilares hem os observado
cuando se inm u n izaro n ratas v írg en es con
ovoalbúmina y simultáneamente se les inoculó
por vía intraperitoneal sobrenadante de cultivos
de placenta. En este caso fue detectado un mar­
cado incremento de moléculas IgG asimétricas
con especificidad anti-ovoalbúmina.
Durante la preñez, los linfocitos expresan re­
ceptores específicos para progesterona. Estos
linfocitos, al ser pulsados con la hormona pro­
ducen un factor con actividad inm unológica
que incluye inhibición de la lisis mediada por
células NK (“natural killer”), aumento de célu­
las que expresan fenotipo de supresoras, e inhi­
bición de la proliferación de cultivos mixtos de
linfocitos. Este factor ha demostrado funcionar
de una manera similar a la antes indicada para
los factores placentarios, en especial incremen­
tando la proporción de moléculas IgG asimétri­
cas sintetizadas (véase cap. 34).
Considerando los hechos señalados, en los
que se pone en evidencia que durante la preñez
hay una síntesis preferencial de anticuerpos
IgG asimétricos inducida por factores placenta­
rios, cabe preguntarse si es siempre correcto
vacunar a las madres para lograr transferencia
pasiva de inmunidad. Ello porque estos anti­
cuerpos, cuando están dirigidos contra bacte­
rias o parásitos, son pro tecto res del agente
agresor.
Consideraciones que deben tenerse
en cuenta para la correcta interpretación
de resultados serológicos
Con mucha frecuencia se seleccionan, con
fines de diagnóstico, las reacciones serológicas
más sensibles. G eneralm ente se presta poca
Fijación
G RC ele com plem ento ELISA IFI
1/512 1/512 1/800 1/1.600
1/512 1/64 1/3.200 1/1.600
1/256 1/32 1/800 1/800
1/256 1/32 1/400 1/800
1/512 1 /8 1/800 1/800
1/256 1/16 1/800 1/1.600
1/256 1/8 1/1.600 1/800
1/256 1/4 1/400 1/800
atención al hecho de si se trata de reacciones de
interacción prim aria Ag-Ac o interacción se­
cundaria, y las diferencias en los títulos logra­
dos por dos o más de estas reacciones, para una
misma muestra de suero, se atribuyen a varia­
ciones en su sensibilidad. Los cuadros 19-2 y
19-3 muestran resultados obtenidos cuando se
analizaron sueros hum anos provenientes de
chagásicos crónicos y sueros de bovinos infec­
tados con B. abortas, usando reacciones seroló­
gicas de interacción primaria (ELISA, IFI) y de
interacción secundaria (inm unoprecipitación,
fijación del complemento). Las primeras se ca­
racterizan porque dosan todos los anticuerpos
presentes, sin discriminar tipo o calidad; las se­
gundas, en cambio, sólo dosan anticuerpos fun­
cionalm ente bivalentes o plurivalentes. Los
sueros analizados, que contienen proporciones
variables de anticuerpos simétricos y asimétri­
cos (precipitante/no precipitante; aglutinante-
/n o a g lu tin an te) p re v iam e n te d em o strad o ,
muestran en algunos casos equivalencia entre
ambos tipos de reacciones serológicas, m ien­
tras que en otras hay m arcada discordancia.
Ello se debe a las proporciones relativas de Ac
sim étrico/asim étrico presentes en los sueros,
los que al com petir por masa hacen que las
reacciones serológicas secundarias tengan dis­
tinta positividad para títulos similares logrados
por ELISA y por IFI. En algunos de los casos
es bien notorio que las diferencias observadas
no pueden deberse a diferentes sensibilidades
de las reacciones (véase cap. 9, cuadro 9-4).
El cuadro 19-4 muestra los resultados logra­
dos al cuantificar los anticuerpos séricos anti-r.
cruzi por hemaglutinación pasiva, usando eri­
trocitos de carnero (que poseen receptores para
Fe) y eritrocitos humanos (carentes de recepto­
res para Fe expuestos). Como puede verse, sólo
con eritrocitos de carnero se consigue una bue­
na cuantificación, pues pueden ser aglutinados
por anticuerpos simétricos, bivalentes y anti­
cuerpos asimétricos, univalentes. Con los eri­
trocitos humanos no ocurre lo mismo, siendo
muy frecuente las variaciones de los títulos res-
 Anticuerpos no precipitantes 359

Cuadro 19-3. Estudios serológicos de sueros bovinos infectados con B. Abortus.

R eacciones serológicas

Wright Coom bs
Sueros (Título aglutinante) (Título no aglutinante) IFI

1/640 1/1.280 1/1.600

1/20 1/640 1/800
1/40 1/5.120 1/3.200
1/20 1/320 1/800
1/80 1/640 1/800

pecto de los obtenidos con eritrocitos de carne­
ro, y muy especialmente los fenómenos de pro­
zona, dado el poder bloqueante de los anticuer­
pos IgG asimétricos. Esto hace que sean muy
poco recom endables las hem aglutinaciones
cualitativas, con fines de descarte, cuando el
soporte usado son glóbulos rojos humanos.
Los hechos relatados son de fundam ental
importancia y hacen que para poder efectuar un
buen diagnóstico y pronóstico de un proceso
infeccioso, con discriminación de la calidad de
los anticuerpos presentes, sea necesario selec­
cionar una batería adecuada de reacciones sero­
lógicas, que midan interacción primaria e inte­
racción secundaria Ag-Ac.
A N TIC U ER PO S A N T I-R h
IN C O M PL E T O S
Al comienzo de las isosensibilizaciones por
antígenos Rh aparecen anticuerpos localizados
en la IgM, que no atraviesan la placenta y por
lo tanto no son responsables del daño fetal. En
las sensibilizaciones a repetición se forman an­
ticuerpos IgG, que atraviesan la placenta y que
al reaccionar con los eritrocitos Rh+ del feto
desencadenan el mecanismo que lleva a la ane­
mia hem olítica del recién nacido. Estos anti­
cuerpos, en su mayoría son del tipo “incomple­
to”, caracterizados por no aglutinar los glóbu­
los rojos ORh+ en medio sahno, no obstante es­
tar fijados a los eritrocitos como se demuestra
con los sueros antigamm aglobulina (reacción
de Coombs), cosa que hacen si los eritrocitos
fueron tratados previamente con tripsina, p a ­
paína o bromelina. En medio albuminoso tie­
nen también capacidad aglutinante.
El hecho de que aglutinen glóbulos ro jo s
ORh+ tripsinados y no lo hagan con los no trata­
dos, a diferencia de lo que pasa con los an ti­
cuerpos anti-Rh completos (normalmente IgM )
fue interpretado como una mejor accesibilidad
0 liberación de un mayor número de determ i­
nantes antigénicos Rh, lo que ocurre durante el
tratamiento enzimático. De este modo, los anti­
cuerpos incompletos (IgG) tendrían una m ejor
oportunidad de interaccionar con sus determ i­
nantes específicos y aglutinar los glóbulos ro ­
jos. Los anticuerpos completos, dada la mayor
capacidad reactiva de la molécula, aglutinarían
las células no tratadas, que contendrían un n ú ­
mero reducido de determinantes antigénicos.
Parecería que esta interpretación no está de
acuerdo con algunos resultados experim enta­
les:
a) El número de epitopes Rh por célula no es
tan reducido; oscila, según los autores, entre
1 y 4 X 101
b) En nuestros laboratorios se ha observado
que sólo la molécula entera de IgG anti-Rh (an­
ticuerpo incompleto) aglutina los glóbulos ro ­
jo s 0Rh+ tripsinados, no así sus fragm entos
F(ab ’ ) 2 y Fcy. Las reacciones de Coombs efec­
tuadas con los tubos que no dieron aglutinación
directa, usando sueros anti-Fab y anti-Fcy co ­
mo reactivos indican que, si bien la IgG anti-

C uadro 19-4. Sueros humanos de chagásicos valorados p o r hemaglutinación pasiva.

H emaglutin-üción (Dilución)
Suero Eritrocitos
N" sensibilizados 1/10 1/20 1/40 1/80 J/I6 0 1/320 1/640 I /J .2 8 0

1 carnero hum ano 4- + + + + + -

+ + + + - - - -
2 carnero hum ano + + + + + + + -
- - + + - ,
3 carnero hum ano + + + + + -
- - - + ± - - -
4 carnero hum ano + + + + + + -
+ + + + + + - -
360 Aspectos básicos de la inmunidad
Rh y sus fragmentos F íab’)^ y P cy u c aglutinan
los eritrocitos no tripsinados, los dos primeros
se fijan a su superficie. En cambio, todos se fi­
jan a los eritrocitos tripsinados. En el caso del
fragmento Fcy, la unión no es tan firme como
la del fragmento F(ab’) 2 , deducible del número
de lavados a que pueden ser sometidos los gló­
bulos rojos que han estado en contacto con
él, previo al añadido del antisuero correspon­
diente.
c) El contacto previo del fragmento Fe o in­
munoglobulinas con glóbulos rojos ORh+ tripsi­
nados interfiere en algunos casos en la agluti­
nación por anticuerpos anti-Rh, y en los tubos
de interferencia se ha demostrado que el inhibi­
dor está unido a los hematíes. Esta capacidad
inhibitoria es mínima o nula para la IgG nor­
mal, sin actividad anti-Rh, y su fragmento Fcy
y es muy manifiesta para Fcjj, e IgM monomé­
rica (IgM.7S), los complejos Ac-Ag y la IgG y
Fcy agregados por el método de la bencidina
bisdiazotizada. La IgM (19S) y el fragmento
Fc|i5 no inhiben la reacción.
d) Cuando se tripsinan glóbulos rojos ORh+
previamente sensibilizados por 1 hora a 37°C
con IgG anti-Rh y fragmento Fiah’)^ obtenido
de ésta, los primeros aglutinan espontáneamen­
te, cosa que no ocurre con los segundos. No
obstante, la reacción de Coombs con suero an-
ti-Fab efectuada en estos últimos es positiva, lo
que demuestra que el fragmento F (ab’)j anti-
Rh se encuentra fijado a los glóbulos rojos
ORh+ tripsinados.
Los resultados experimentales indicados no
estarían de acuerdo con la interpretación de que
la aglutinación de los glóbulos rojos ORh+ trip­
sinados por parte de los anticuerpos anti-Rh in­
completos es consecuencia de la liberación de
un mayor número de determinantes antigénieos
Rh, lo que facilitaría la interacción. Todo hace
suponer que el fragmento Fe podría tener algu­
na participación en la reacción de aglutinación.
Ella queda evidenciada por la interferencia en
la capacidad aglutinante de los anticuerpos an-
ti-Rh incom pletos cuando los glóbulos rojos
ORh+ tripsinados son puestos previam ente en
contacto con Fcy agregado. La fijación del
fragmento Fe al eritrocito se haría por unión a
receptores para Fe, cuya existencia ha sido de­
mostrada por nosotros según se expuso en anti­
cuerpos coprecipitantes.
Estos resultados permitirían suponer que los
anticuerpos anti-Rh incompletos funcionan de
manera similar a los anticuerpos coprecipitan­
tes ya descritos. Es posible que por algún impe­
dimento estérico o por variaciones en los valo­
res individuales de de cada fragmento Fab
de la molécula de IgG anticuerpo, sólo uno de
ellos pudiera dar uniones firmes con el antíge­
no. Como consecuencia, la reacción de agluti­
nación sólo tendría lugar cuando el fragmento
Fe de esa molécula, activada por la interacción
previa del Fab con el determinante antigénico
Rh, se fije a su receptor específico oculto en la
membrana de otro hematíe, el que sólo se libe­
raría por la acción de enzimas hidrolíticas.
En un caso de anemia hemolítica de tipo au­
toinmune pudimos demostrar la presencia de
receptores expuestos para Fe. Los hematíes de
ese paciente eran aglutinados, sin tripsinización
previa, por anticuerpos anti-Rh incompletos y
además fijaban complejos Ac-Ag, reacciones
éstas que eran inhibidas por Fcix. Este caso po­
ne en evidencia, desde el punto de vista de la
patología, la significación que tendría la libera­
ción in situ de dichos receptores.
Otro hecho interesante de destacar sobre los
anticuerpos anti-Rh incom pleto es el corres­
pondiente a la capacidad aglutinante en medio
albuminoso de la IgG anti-Rh y su fragmento
F (ab’)2. Utilizando como vehículo albúm ina
bovina al 20%, el anticuerpo entero aglutina
eritrocitos ORh+, no así el fragmento F(ab’) 2 .
Esto hace c]ue la interpretación de que la agluti­
nación en medio albuminoso sea consecuencia
exclusiva de modificaciones del potencial zeta,
lo que facilitaría la aproximación de las molé­
culas de anticuerpo, se vuelva dubitativa. Todo
pareciera indicar un efecto directo o indirecto
de la albúmina sobre el fragmento Fe.
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Inmunización activa
y pasiva
RICARDO MARGNI
Los mecanismos inmunológicos puestos en
marcha por la introducción de un inmunógeno
confieren, en la mayor parte de los casos, pro­
tección contra ese agente agresor. La inmuno-
terapia, en sus formas de inmunización activa
(vacunación) y pasiva (seroterapia), se basa en
ese principio.
V A CUN OTERAPIA
Las vacunas, usadas para prevenir enferme­
dades infectocontagiosas, han sido uno de los
triunfos más significativos de la medicina. Tan­
ta es su eficacia que, gracias a su empleo se ha
podido dominar uno de los flagelos de la hu­
manidad, la viruela, que prácticamente ha sido
eliminada. Otra enfermedad viral, la poliomie­
litis, que produjo gran cantidad de inválidos
durante mucho tiempo, ha disminuido en inten­
sidad como consecuencia de buenas campañas
de vacunación.
Los conocimientos sobre mecanismos de la
respuesta inmune, estructura, biosmtesis y lo­
calización de las diferentes clases de inmuno-
globulinas, han permitido seleccionar métodos
de vacunación. Én efecto, el virus polio inacti­
vado, inoculado parenteralm ente, induce res­
puesta inmune con formación de anticuerpos
de tipo IgG. Una cepa viva atenuada del mismo
virus dada por vía oral, si bien finalmente pro­
ducirá anticuerpos de tipo IgG, inicialm ente
origina anticuerpos locahzados en mucosa, de
tipo (IgA) 2S.
La vacunación por vía oral con virus polio
vivo atenuado hace que los vacunados, además
de elaborar mecanismos defensivos generaliza­
dos eficaces contra la viremia, produzcan a ni­
vel de la mucosa intestinal anticuerpos locali­
20
zados en la IgA secretoria, lo que reduce al mí­
nimo la posibilidad de que los vacunados por
vía oral se transformen en portadores sanos.
En otros casos, la vacunación por vía oral
asegura la protección de la mucosa del árbol
respiratorio contra numerosos agentes infeccio­
sos.
Inmunógenos
El mecanismo de agresión de un microorga­
nismo es el que determina el tipo de inmunóge­
no que se ha de usar para conferir protección
contra él. Si se trata de un microorganismo in­
vasor, capaz de producir directam ente daño
hístico, la vacuna habrá de elaborarse con el
agente agresor en cuestión. En aquellos casos
en que el efecto patógeno se deba a la acción
de exotoxinas elaboradas por el microorganis­
mo, los inmunógenos que se han de usar serán
las toxinas atenuadas. Las vacunas usadas en
las inm unizaciones, en especial del hombre,
forman parte de dos grandes grupos; las virales
y las bacterianas. Últimamente se están elabo­
rando también vacunas contra algunos parási­
tos, entre ellos el paludismo.
Vacunas virales. Los inmunógenos usados
con tal fin pueden ser de tres tipos distintos:
a) Virus atenuados. En estos casos se em ­
plean cepas de virus vivos que han perdido su
virulencia para el hombre como consecuencia
de pasajes prolongados por otros huéspedes o
repiques sucesivos en cultivos de tejidos. Virus
que responden a estas características son los
polio 1, 2 y 3 que componen la vacuna Sabin.
Por este procedimiento los virus experimentan
mutaciones que, si son apreciables hacen que
difícilmente vayan a ocurrir reversiones a la ce­

pa virulenta. No obstante ello, estas cepas de­
ben ser permanentemente controladas.
Puede ocurrir también, como se ha observa­
do en el virus influenza, que, como consecuen­
cia del pasaje por huéspedes no humanos como
el embrión de pollo, la cepa mutada exprese
antigenicidad diferente a la del virus original y
que su poder protector como agente vacunante
sea deficitario.
Otra posibilidad es obtener mulantes tempe­
ratura sensibles que crecen poco a 37°C y lo
hacen satisfactoriamente a 25-28"C. Este tipo
de inmunógeno se ha usado en la vacunación
de animales, pero su uso debe ser muy contro­
lado por las posibilidades de reversiones.
También se emplea, en la vacunación con vi­
rus vivos, especies virales que son patógenas
para otros huéspedes y que no lo son para el
hombre. El ejemplo más representativo es el
virus vaccinia, que cruza con el virus de la vi­
ruela humana y que se lo emplea para vacunar
al hombre con tal fin.
La inmunidad que confieren estas vacunas es
de larga duración, generalmente de por vida y
superior a la lograda con agentes infecciosos
muertos. La mayor duración de la inmunidad
en estos casos probablemente esté más relacio­
nada con los estím ulos de repetición que se
producen como consecuencia de la rephcación
viral en las células del huésped, que con otros
hechos inherentes a las diferentes etapas de la
respuesta inmune.
b) Virus inactivados. En estos casos, los vi­
rus han perdido su capacidad de replicarse por
tratamiento eon agentes físicos o químicos. Va­
cunas que responden a estas características son
la anti-polio elaborada por Salk, la antirrábica
y anti-influenza. Todas ellas han demostrado
ejercer efecto protector en el huésped. La vacu­
na anti-polio de virus inactivado, como ya se
indicara, no confiere protección contra una in­
fección de la mucosa intestinal.
La protección conferida por estas vacunas es
de menor duración que la inducida por los vi­
rus atenuados, y para conseguir efecto positivo
generalmente se necesitan vaiias reinoculacio­
nes del inmunógeno.
c) Sub-m idades virales. Diferentes subunida­
des del virión pueden estar expuestas y ser el
“blanco” de neutralización por los correspon­
dientes anticuerpos. Por consiguiente, vacunas
elaboradas con estas subunidades pueden ser
efectivas. El caso más representativo es el antí­
geno de superficie HbsAg de virus de la hepati­
tis B. Este antígeno se encuentra en el plasma
circulante, material del cual inicialmente se lo
aisló. Con el advenimiento de los péptidos sinté­
ticos y las técnicas de biología molecular (véase
más adelante) el uso de estas vacunas con subu­
nidades virales naturales ha caído en desuso.
Inmunización activa y pasiva 363
Vacunas bacterianas. Las vacunas bacteria­
nas pueden elaborarse con cepas vivas atenua­
das, bacterias muertas o con toxinas inactiva-
das (toxoides) en el caso de ser éstas las re s­
ponsables de la agresión en el huésped.
a) B acterias vivas atenuadas. Sólo se las
emplea en casos muy particulares. Una vacuna
que responde a estas características es la BCG
o vacuna de Calmette y Guerin, elaborada con
una cepa de M. tuberculosis variedad bovina
atenuada en su virulencia por pasajes sucesivos
en papa biliada glicerinada. Si bien ésta es una
vacuna que se encuentra dentro de los progra­
mas de vacunación en niños de la OMS, donde
parecería haber demostrado eficiencia, los estu­
dios efectuados donde la tuberculosis constitu­
ye aún un problema serio, corno la India, m ues­
tran que los resultados obtenidos en adultos va­
cunados han sido variables.
b) Bacterias enteras inactivadas. Las bacte­
rias son inactivadas por calor o por otros agen­
tes físicos como radiaciones ultravioleta, o por
tratamiento con productos químicos con poder
bactericida como form ol, fenol, m erthiolate,
etc. Las vacunas que responden a estas caracte­
rísticas más usadas hasta el momento son la an­
ticolérica, antitífica y antipertussis. D ado que
su eficiencia ha sido cuestionada en algunos
casos, actualm ente hay marcada tendencia a
elaborar vacunas con productos acelulares, en
especial los obtenidos de B. pertussis, donde
algunos productos definidos como la toxina
p ertussis, la hem oaglutinina filam en to sa, la
adenilato ciclasa y otros han demostrado capa­
cidad para inducir en ratón protección a la in­
fección por el microorganismo vivo.
c) Toxoides bacterianos. Hay microorganis­
mos que ejercen su efecto patogénico a través
de toxinas que secretan. Dado que las mismas
son altam ente inm unogénicas, la vacunación
para inducir la síntesis de anticuerpos específi­
cos resulta muy eficiente. Como inmunógeno se
usan las toxinas detoxificadas o toxoides, obte­
nidos por tratamiento de las toxinas con formol.
Los toxoides más empleados en la inm uniza­
ción humana son el diftérico y el tetánico.
d) Polisacáridos bacterianos. Existen num e­
rosas bacterias que presentan cápsula o antíge­
nos de envoltura constituidos por polisacáridos,
los que le confieren al microorganismo una re­
sistencia particular a los mecanismos biológi­
cos de depuración an tig én ica y fa g o cito sis
puestos en marcha por el huésped. Entre estos
microorganismos se encuentran los estreptoco­
cos, meningococos, neumococos, klebsiellas, y
otros.
Las inm unizaciones con p o lisacárid o s no
siempre son efectivas, pues estos antígenos son
T-independientes y cursan respuestas inmunes
con producción de anticuerpos ígM; en algunos
364 Aspectos básicos de la inmunidad
casos, dadas las características y tamaño mole­
cular del poliósido, no inducen respuesta al ser
inoculados. Este inconveniente ha sido subsa­
nado en parte acoplándolos a soportes o “ca­
rrier” como seroalbtimina bovina (SAB) u otras
proteínas de origen bacteriano. Ello hace que
estos inmunógenos induzcan una respuesta T-
dependiente, con la participación de linfocitos
T-cooperadores y producción de IgG, la que es
marcadamente heterogénea como consecuencia
de la antigenicidad del soporte.
Con frecuencia, y con el objeto de disminuir
el número de inyecciones, se utilizan las vacu­
nas poUvalentes. Si bien ésta es una ventaja, no
debe descartarse la posibilidad de que, por con­
currencia de antígenos con diferente inmunoge­
nicidad, haya competición antigénica y la res­
puesta sea efectiva para un número reducido de
ellos. Las estadísticas han mostrado que la va­
cuna triple (difteria, tétanos, pertussis) y la va­
cuna antipolio hechas por separado son más
efectivas en el logro de buena respuesta inmu­
ne para los antígenos mencionados, que cuando
se ha intentado inmunizar con una vacuna cuá­
druple.
Las mezclas antigénicas a veces modifican
los resultados esperados. A quellas vacunas
mixtas en las que participa la B. pertussis, dado
el factor histaminosensibilizante que esta bac­
teria contiene, pueden hacer que se desencade­
nen más fácilmente fenómenos de hipersensibi­
lidad contra los antígenos acompañantes.
Si bien en un comienzo las vacunas prepara­
das con antígenos inanimados se elaboraron en
forma fluida, en la actualidad, por regla gene­
ral, esos antígenos son inoculados mezclados
con adyuvantes, los cuales, como ya se ha visto
en los capítulos 4 y 15, inducen una respuesta
más efectiva. Los agentes de mayor uso en la
inmunización humana, en ese sentido, son los
geles de hidróxido de aluminio y de fosfato de
aluminio. En la inmunización humana se está
intentando con éxito la inoculación de antíge­
nos incorporados en vesículas lipoidales como
los liposomas y los ICCOMS. En las inmuniza­
ciones experimentales el adyuvante de mayor
uso es el de Freund completo.
Vías de introducción del inmunógeno
Durante mucho tiempo la vía principal para
introducir agentes vacunantes ha sido la paren-
teral. La vía subcutánea se utiliza con frecuen­
cia y se la emplea especialmente para la inocu­
lación de vacunas preparadas con microorga­
nismos muertos y toxoides. La vía oral, que fue
dejada de lado en un comienzo, resulta muy
útil en algunas oportunidades. Cuando se usa
esta vía de introducción y no se trata de agentes
infecciosos vivos, es conveniente que ellos es­
tén asociados con productos capaces de modifi­
car las condiciones normales de la barrera in­
testinal, haciendo que por mucólisis y conges­
tión se faciliten las posibilidades de penetra­
ción de los antígenos en la vía general. La hia­
luronidasa y las sales biliares son eficaces en
estos casos. En otras ocasiones, como la ya
mencionada de la vacuna polio preparada con
virus vivo (Sabin), la estimulación de una res­
puesta local en las placas de Peyer, asociada
con una respuesta generalizada, hace que el va­
cunado, además de estar protegido, tenga a ni­
vel de la mucosa intestinal anticuerpos elabora­
dos localmente capaces de neutralizar virus po­
lio, lo que evita que un protegido contra la in­
fección pueda ser un diseminador del virus.
Con el descubrimiento de la IgA secretoria,
su elaboración local y el papel que ella tiene en
los m ecanism os de p ro tecció n de m ucosas
(véase cap. 17), se han comenzado a utilizar
con aparente éxito las instilaciones o pulveriza­
ciones zonales, en especial de la rinofaringe,
con el objeto de incrementar la protección con­
tra agentes agresores que tienen esa vía de pe­
netración. Un hecho alentador en este sentido
es el que antígenos incorporados en ISCOMs
tienen capacidad para inducir buenas respues­
tas inmunes cuando son administrados por vía
parenteral u oral.
En la formulación de una vacuna deben te­
nerse en cuenta una serie de aspectos, que in­
dudablemente no lo fueron, en la elaboración
de las primeras vacunas usadas en inmunotera­
pia.
Es indispensable considerar si la infección
producida por el agente agresor cursa en forma
aguda o crónica; cuál es la vía de penetración
del agente patógeno; si la respuesta inmune a
inducir para lograr un efecto positivo debe ser
preferentemente humoral o celular, cuál es la
evolución inmunopatológica posterior a la in­
fección; si lo que se busca es una neutraliza­
ción de la infectividad o de la replicación del
agente infeccioso, en cvspecial los virus; si es
indispensable o no el añadido de adyuvantes
para lograr la máxima efectividad deseada; si el
agente infeccioso sufre mutaciones durante las
infecciones naturales que modifican su estruc­
tura antigénica, como ocurre con el virus in­
fluenza o algunos parásitos o como el T. bru-
sei, constituyendo esto verdaderos mecanismos
de escape, etc. Todo ello hará que la vacuna a
elaborar esté condicionada para inducir una
buena respuesta de anticuerpos, especialmente
cuando se quiere proteger contra bacterias pió-
genas, o si la estimulación de los linfocitos Th
y Te y la producción de interleuquinas, interfe­
rón, células NK, es también indispensable co­
mo ocurre en las infecciones virales. También
debe considerarse el acondicionamiento y dosis

de las vacunas para que induzcan memoria in­
munológica, a efectos de asegurar una protec­
ción de larga duración, especialmente cuando
se requiere proteger contra bacterias piógenas,
o si la estimulación de los linfocitos Th y Te y
la producción de interleuquinas, interferón, cé­
lulas NK, es también indispensable como ocu­
rre en las infecciones virales. También debe
considerarse el acondicionamiento y dosis de
las vacunas para que induzcan memoria inmu­
nológica, a efectos de asegurar una protección
de larga duración, especialmente cuando la in­
munidad es mediada por anticuerpos.
Por todo ello, para que una vacuna resulte
exitosa debe responder a los siguientes requeri­
mientos:
a) activar células presentadoras de antígeno
(CPA) para que haya un buen procesado del in­
munógeno y presentación adecuada, a las célu­
las inm unológicam ente com petentes, de los
péptidos asociados a los antígenos del CMH
clase I y 11, así como producción de interleu­
quinas y otros factores por los linfocitos en re­
poso al ser estimulados;
b) buena estim ulación de linfocitos T y B
para lograr adecuada memoria inmunológica y
generar linfocitos Th y Te capaces de recono­
cer todos los determinantes antigénicos contra
los cuales quiere inducirse respuesta;
c) persistencia de los inm unógenos en su
conformación nativa en las células dendríticas
foliculares de los tejidos linfoides donde se ori­
ginan las células B con memoria, las que per­
sisten por mucho tiem po para originar final­
mente células secretoras de anticuerpos.
No todas las vacunas responden a estas ca­
racterísticas. No obstante ello, quien determi­
nará su verdadera eficacia serán los ensayos
experimentales de protección in vivo.
Edad para la vacunación
La inmunización de un niño no debe hacerse
antes de que éste haya alcanzado la madurez
inmunológica. Las aplicaciones de inmunóge­
nos pueden iniciarse entre los dos y tres meses
de vida y resultan plenam ente efectivas des­
pués de los seis meses. Inyecciones de antíge­
nos inmediatas al nacimiento pueden crear to­
lerancia parcial al inm unógeno. Adem ás, y
mientras no sean estrictamente necesarias co­
mo consecuencia de posibles infecciones, no
son recomendables las vacunaciones prematu­
ras. No debe olvidarse que es práctica corriente
la vacunación de las mujeres grávidas con el
objeto de asegurar la transferencia congénita de
anticuerpos y por consiguiente la creación en el
recién nacido de una inmunidad pasiva transi­
toria. Ello tiene lugar por la transferencia de
anticuerpos a través de placenta (IgG) y por los
Inmunización activa y pasiva
que se encuentran en el calostro y la leche m a­
terna [(IgA)2S] y que son incorporados por
succión durante la lactancia. La presencia de
estos anticuerpos puede bloquear la inmunoge­
nicidad de antígenos vacunantes y hacer que
éstos resulten poco efectivos inoculados en es­
tas circunstancias. Después de los seis m eses
las inmunoglobulinas maternas han desapareci­
do; de ahí que algunos países europeos rec o ­
mienden iniciar los planes de vacunación en in ­
fantes de esa edad. En otros centros sanitarios
se aconseja vacunar a los 3 meses de vida, con
un plan de vacunación coordinado para evitar
superposición de antígenos y fenómenos de in ­
terferencia, especialm ente cuando se trata de
vacunas antivirales.
Para algunos inmunógenos como las vacunas
BCG y antipolio (Sabin), las vacunaciones sue­
len iniciarse antes, por el hecho de que como
estos microorganismos vivos atenuados necesi­
tan implantarse previamente para poder inducir
una respuesta inmune, se procura lograr la d o ­
sis óptima de antígeno para el momento ade­
cuado.
En todo plan de vacunación es necesario: a)
que el agente vacunante altamente efectivo sea
aplicado lo más tempranamente posible, dentro
de las limitaciones ya indicadas; b) que el nií-
mero de inoculaciones sea el adecuado, de m o ­
do que se consiga el máximo de eficacia, y c)
que las reinm unizaciones se hagan dentro de
los períodos preestablecidos. El cumplimiento
de estos requisitos permitirá que se asegure una
correcta protección a los agentes agresores e x ­
ternos y que la actividad futura del médico esté
dirigida, más que a curar enfermos, a atender
pacientes cuya preocupación es m antener su
salud.
El cuadro 20-1 transcribe uno de los progra­
mas de vacunación recomendados.
Complicaciones de las vacunaciones
Las complicaciones que pueden surgir como
consecuencia de las vacunaciones son varias.
Debemos citar en prim er lugar las reacciones
de hipersensibilidad, que generalmente se desa­
rrollan contra agentes acompañantes del inm u­
nógeno provenientes de los medios de cultivo o
tejidos donde el microorganismo ha prospera­
do. Cabe mencionar en tal sentido las reaccio­
nes anafilácticas observadas en personas sensi­
bilizadas a las proteínas del polio, que fueron
inoculadas con vacunas preparadas por cultivos
de virus inrnunogénicos en embrión de pollo.
A gentes inm unizantes, en especial v iru s,
pueden producir alteraciones en los tejidos del
vacunado, originando antígenos modificados,
que actúan desencadenando reacciones de au-
toagresión, como la encefalitis observada en
366 Aspectos básicos de la inmunidad

Cuadro 20-1. Programa de vacunaciones en cuenta que la estimulación antigénica no só­

lo pone en marcha la producción de anticuer­
Edad Vacuna D osis pos, los métodos de valoración que se han de
usar deben ser aquellos que miden el grado de
l “ mes BCG Ú nica
2° mes Triple (difteria-tétanos- Prim era protección que ellas confieren a animales de
coqtieluclie) experimentación sometidos posteriormente a la
Sabin Prim era infección. Estos métodos a su vez deben ser
3“' mes Triple Segunda evaluados en relación con los resultados obte­
4° mes Triple T ercera
Saláin Segunda nidos en pruebas de campo efectuadas con gru­
6° mes A ntivariólica# Ú nica pos humanos altamente significativos. Estos ti­
Entre 9 y 12 Saram pión Ú nica pos de controles son inchspensables, ya que no
meses siempre la infección que un microorganism o
Paperas Ú nica
R ubéola Ú nica produce en un animal de experimentación cur­
18 m eses Triple C uarta sa de manera similar a la que ocurre en el hom ­
Sabin T ercera bre. La inoculación de B. pertussis en ratón,
Ingreso escolar BCG * por vía intracerebral, origina una infección ge­
D oble (difteria-tétanos) Ú nica
Sabin R efuerzo neralizada; en el niño este microorganismo es
12 años A ntivariólica Refuerzo el responsable de la tos convulsa o coqueluche.
BCG * No obstante este comportamiento distinto en el
18 años A ntivariólica Refuerzo
BCG *
ratón y el hombre, las pruebas de campo han
c/5 años A ntivariólica Refuerzo demostrado que aquellas vacunas que resultan
c /lO a ñ o s A ntivariólica Refuerzo efectivas cuando se mide su potencia en rato­
A ntitetánica R efuerzo nes, son las que proporcionan protección ade­
L a vac u n ac ió n se hará en los in d iv id u o s íubercuJinonegaüvo.s. cuada en los niños. Desafortunadamente, la co­
# En m u ch o s p aíses Ur v ac u n ac ió n an tiv íirió lic a h a d eja d o d e ser rrelación observada en este caso no ocurre con
obligatoria.
E m barazadas: V acu n a a n tip o lio in ielítica (S abin); al 5” y 7° m es de
otros microorganismos.
e m b a raz o en las n o v acu n ad as y al 7° m es en las a n te rio rm en te v a ­ En estos últimos tiempos se está intentando
cunadas.
V a cu n a antitetánica: al 5° m es d e em b arazo .
sustituir algunos de los métodos biológicos de
medición de la potencia de vacunas por méto­
dos inm unoquím icos de alta sensibilidad, en
especial el ELISA cuando la respuesta cursa en
vacunados contra la viruela. Felizmente, dado producción de anticuerpos. En nuestros labora­
que esta enferm edad ha sido p rácticam ente torios se ha observado buena correlación esta­
erradicada como plaga mundial, la vacunación dística entre los métodos biológicos usados pa­
antivariólica tiende a desaparecer. ra valorar vacuna anti-pertussis, anti-tetánica y
Las vasculitis observadas en algunas revacu­ antidifteria con ELISAS diseñados para tales
naciones con antígenos proteicos como el to­ fines.
xoide tetánico, serían consecuencia del depósi­
to de complejos antígeno-anticuerpo. En estos Nuevas estrategias en la elaboración
casos, la reestimulación produciría niveles ele­ de vacunas
vados de IgG que al combinai'se con el antíge­
no específico y fijar complemento desencade­ Han surgido tecnologías modernas para el
naría el fenómeno citado. desarrollo de vacunas para utilizar en la inmu­
nización del hombre y del ganado. Por una par­
Controles para determinar la eficacia te, el uso de péptidos sintéticos ha permitido
de las vacunas disponer de inmunógenos definidos. Por otro
lado, los avances de la biología molecular y las
Toda vacuna debe ser previamente controla­ técnicas de ingeniería genética han facilitado la
da a efectos de establecer su eficacia. Los mé­ clonación de ADN de bacterias y virus, y por
todos usados con tal fin no pueden ser generali­ m ecanism os de recom binación su in co rp o ­
zados. La medida de los niveles de anticuerpos ración a vectores adecuados. Los ADN clona­
alcanzados en los animales inoculados experi­ dos constituyen la parte 'del genoma que codifi­
mentalmente puede en algunos casos expresar ca para determinados epitopes, contra los cua­
el estado inmune, por ser esos anticuerpos los les quiere lograrse protección. Los vectores no
responsables de la protección, como ocurre con patógenos que se han de usar pueden ser dife­
las antitoxinas. Estas determinaciones, no obs­ rentes, y han resultado útiles, entre otros, poxa-
tante, son relativas: deben efectuarse simultá­ virus o virus vaccinia, Escherichia coli y Sac-
neamente, en igualdad de condiciones experi­ charomyces cerevisae. También se han cifrado
mentales, con vacunas de referencia y los re­ esperanzas, sobre todo para agentes inmunizan­
sultados evaluarse estadísticamente. Teniendo tes muy agresores, en las vacunas que utilizan

como inmunógeno anticuerpos contra el idioti-
po del paratope que reconoce al epitope del
agente agresor.
Cualquiera que sea el tipo de vacuna que .se
utilice, para que sea útil debe inducir una res­
puesta sim ilar a la correspondiente al agente
inductor que sustituye. Una vacuna antiviral,
por ejemplo, además de inducir la producción
de anticuerpos protectores y estimular células
efectoras, debe asegurar la síntesis de interfe­
rón, interleuquinas y otros moduladores de la
respuesta inmune. Además, no debe producir
efectos secundarios, debe ser accesible, de
costo aceptable, estable y de fácil administra­
ción.
Vacunas obtenidas por recom binación de
AD N han sido preparadas para diferentes agen­
tes inmunológicos. Así, el gen de V. cholerae
que transcribe la información para la síntesis de
la subunidad (3 de la toxina colérica, ha sido
clonado e incorporado al genoma de E. coli. Lo
mismo ha ocurrido para proteínas de origen vi­
ral y parasitario. El ADN con información para
el antígeno de superficie del virus de la hepati­
tis B humana (HBsAg) ha sido clonado e incor­
porado al Saccharomyce.s serevisae.
El uso de poxavirus como vector para la pre­
paración de vacunas an tivirales presenta la
ventaja de su gran tamaño, que permite la in­
corporación de grandes cantidades de ADN ex­
Idiotipo A
Paratope A
(anti-epitope)
M 1 (ariti-idiotif
Paratope tKjmy
F ig. 20-1. I. R eacción A g (X) - A cl.; II. Reacción A cl (diotipo) - R ecepto r (Ac2) ^ síntesis de A c2 (anti-idiotipo); III.
A c2 (anti-idiotipo) interacciona con R eceptor (Acl portador dei idiotipo A) e induce ia síntesis de A c l (anti-epitope del
AgX).
Inmunización activa y pasiva 367
traño y la posibilidad de obtener un inmunóge­
no múltiple. Además, no es oncogénico, no es
patogénico para el hombre y es fácil de conser­
var y administrar. Sin embargo, su utilización
definitiva depende todavía de varios factores
que deben ser ampliam ente estudiados, entre
ellos, la efectividad de la respuesta inmune in­
ducida y la seguridad de que el producto de re­
combinación no puede originar en el huésped
efectos desfavorables.
Estas vacunas presentan muchas posibilida­
des de futuro, entre ellas la obtención de inm u­
nógenos contra agentes como el virus del sín­
drome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA),
para el que hasta estos momentos no se dispone
de inmunógeno capaz de inducir respuesta es­
pecífica.
Es conveniente tener en cuenta que las p ro ­
teínas o péptidos finalmente traducidos por el
vector no son glucosiladas, dada la inhabilidad
intrínseca de las bacterias y levaduras de gluco-
silar los productos expresados. En ciertos c a ­
sos, ello puede influir significativamente en la
inmunogenicidad del producto obtenido. A fo r­
tunadamente se ha conseguido emplear células
de mamíferos como vectores, lo que evita este
inconveniente.
Las inmunizaciones con péptidos .unté ti cas
han resultado efectivas en algunos casos. Se
conoce la secuencia de proteínas antigénicas y
Céiula productora
de anticuerpo Ac1
idiotipo A
Ac2
368 Aspectos básicos de la inmunidad
la correspondiente a genes que eodifican para
proteínas cuya secuencia puede traducirse. M e­
diante métodos de computación se pudo prede­
cir, fundamentalmente por deducción de la es­
tructura terciaria, qué fragmentos peptídicos de
una proteína pueden constituir determ inantes
antigénicos, teniendo en cuenta especialmente
la hidrofilicidad de d eterm inadas regiones.
Péptidos sintéticos con esas estructuras, aco­
plados a soportes como seroalbúm ina bovina
(SAB) o asociados a adyuvantes como el hidró­
xido de aluminio, adyuvante de Freund incom ­
pleto, etc., han mostrado que son inductores de
la producción de anticuerpos, con resultados
variables. En ocasiones, un mismo péptido bajo
la forma lineal o cíclica ha inducido respuesta
específica, pero generalmente con mayor afini­
dad para el último.
Entre los péptidos sintéticos que han demos­
trado ser efectivos pueden citarse, entre otros,
el péptido cíclico correspondiente a la secuen­
cia 139-147 del determ inante antigénico “a ”
del HBsAg; los residuos 8-20 y 50-64 de la su­
bunidad P de la toxina colérica; los residuos
131-160 de la proteína V P l del virus de la fie­
bre añosa.
Conviene no olvidar que hay determinantes
antigénicos que son topográficos y, como ocu­
rre en el caso de la lisozima, están comprometi­
dos residuos distantes unos de otros, lo que di­
ficulta la posibilidad de la obtención de un pép­
tido restringido que pueda inducir una respues­
ta específica.
La activación de células B y T cooperadoras
para lograr buena colaboración, generalmente
requiere la acción de epitopes diferentes de un
mismo antígeno, no sobrepuestos. Ello ha sido
demostrado en seroalbúm ina bovina y lisozi­
ma. Los linfocitos B pueden reconocer epitopes
estructurales y conformacionales, y los linfoci­
tos T sólo epitopes estructurales.
Todos estos hechos ponen de manifiesto que,
si bien en algunos casos es posible conseguir
protección contra agentes agresores usando
péptidos sintéticos, lamentablemente ello no es
todavía la solución en el campo de la vacuna­
ción. Además, por los métodos de recombina­
ción de ADN y de la preparación de péptidos
sintéticos, no es posible elaborar vacunas con­
tra epitopes antigénicos de naturaleza hidrocar­
bonada.
El empleo como inmunógenos contra deter­
minados agentes de paratopes que reconocen el
idiotipo del sitio de combinación que interae-
ciona con dichos agentes, ha sido oportuna­
mente propuesto. En algunos casos, como ra­
bia, hepatitis B, polio tipo II, Tripanozoma cru-
zi, se han elaborado vacunas de este tipo, utili­
zando anticuerpos monoclonales o policlona­
les. La respuesta inm une lograda es variada.
mostrando efectividad en algunos casos. El uso '
de adyuvantes asociados ha contribuido en for­
ma efectiva.
La similitud en el comportamiento entre los
epitopes antigénicos y los paratopes {antiidioti-
pos) que reconocen a los idiotipos de los sitios
de combinación que reaccionan con el epitope
(imagen interna) se debe a que ambas reaccio­
nes son similares. El epitope y el antiidiotipo,
cuando reaccionan con el idiotipo, tienen la
misma capacidad de proveer contactos simila­
res a causa de los puentes de hidrógeno, fuerzas
de Van der Waals, uniones iónicas y otros tipos
de uniones no covalentes que ellos originan.
Como consecuencia, tanto el epitope antigénico
como el antiidiotipo, al tener capacidad para
reaccionar con el mismo idiotipo llevado por el
paratope que reconoce al antígeno (receptor an­
tigénico), ponen en marcha los mecanismos que
aseguran el incremento de la síntesis de ese pa­
ratope o anticuerpo antiepitope. Los anticuerpos
antiidiotípicos inoculados inducen una respues­
ta similar a la que podría inducir el epitope anti­
génico correspondiente (fig. 20-1), Tienen la
ventaja de que pueden sustituir al antígeno para
conferir inmunidad activa, cuando el agente in­
m unizante es m arcadam ente agresor para el
huésped. Además, estas vacunas podrían em ­
plearse con éxito cuando el epitope del inmunó-
geno es un polisacárido.
Si bien es posible elaborar inmunógenos va­
cunantes m ediante las estrategias descritas,
cuando ello ocurra no debe olvidarse que hay
agentes infectivos que inducen inmunidad hu­
moral y otros inmunidad mediada por células.
Los epitopes reconocidos por los linfocitos B y
T no son los mismos, de allí que es indispensa­
ble saber correctam ente contra qué se quiere
proteger y cuál es el mecanismo de esa protec­
ción, si es que se espera lograr éxito.
Un nuevo tipo de vacunas ha sido propuesta
en los últimos tiempos: las ríbosomales. Están
constituidas por suspensiones de ribosomas ob­
tenidos de bacterias rotas por diferentes proce­
dimientos. A partir de los productos libres de
membranas y pared celular, se procura separar
los contaminantes proteicos y los lipopolisaeá-
ridos que acompañan a los ribosomas, utilizan­
do para ello diferentes metodologías como cen­
trifugación diferencial, filtración por geles, cro­
matografía de afinidad, etc. En algunas oportu­
nidades son indispensables tratamientos enzi­
máticos previos para lograr los fines deseados.
La cromatografía de afinidad con anticuerpos
monoclonales dirigidos contra los contaminan­
tes, especialmente los lipopolisacáridos de las
bacterias gramnegativas, ha demostrado ser efi­
ciente. Pequeñas contaminaciones han sido re­
sueltas por esta metodología. Para algunos ti­
pos particulares de microorganismos, la crom a­

tografía de afinidad con lectinas ha dado bue­
nos resultados.
Cuando se preparan vacunas ribosomales se
recomienda que los ribosomas estén lo menos
contaminados posible, recurriendo para ello a
las metodologías descritas; no obstante, la ad­
sorción de proteínas de membrana a los riboso­
mas, liberadas por los procesos de ruptura bac­
teriana, dificultan m uchas veces la p u rifica­
ción. Hay autores que han recurrido a la forma-
lización de los ribosomas para obtener produc­
tos más estables y efectivos, sobre todo porque
la integridad de los ribosom as puede verse
afectada por los procedim ientos de p urifica­
ción.
Si bien los primeros estudios sobre vacunas
ribosom ales atribuían su eficacia al A RN de
doble cadena que ellos contienen, estudios pos­
teriores demostraron que estaban contaminados
con componentes antigénieos de la superficie
bacteriana. Esto ha hecho que todavía no se ha­
ya dilucidado cuál es el verdadero mecanismo
por el que estas vacunas inducen inmunidad.
Hay quienes sostienen que la protección se de­
be a las contaminaciones con antígenos de su­
perficie, en tanto que otros consideran que los
ribosomas son los responsables de esa función,
aunque la causa de ello no se conoce. Algunos
suponen que los ribosomas sólo ejercerían un
efecto potenciador de los antígenos que conta­
minan las preparaciones usadas como vacunas.
Sea cual fuere el mecanismo, es conveniente
resaltar que la máxima eficiencia se consigue
con ribosomas monoméricos, por lo que duran­
te su procesamiento debe evitarse todo aquello
que pueda llevar a la disociación o fragmenta­
ción de los ribosomas.
Ensayos de seguridad a que deben ser
sometidas las vacunas antes de su uso
definitivo en el hombre
Las vacunas son usadas como profilácticos
para prevenir enfermedades causadas por agen­
tes infecciosos y no deben producir, o deben
estar reducidos al mínimo, los efectos adver­
sos. Es por ello que su aprobación pai'a el uso
definitivo en humanos requiere que, después de
haber cumplido las pruebas de laboratorio de
eficiencia y no toxicidad, hayan aprobado los
ensayos clínicos en el hombre, los que tienen
lugar en tres etapas o fases:
Fase 1: la vacuna administrada a voluntarios
humanos no debe inducir reacciones adversas,
y, de ser posible, debe determinarse su eficien­
cias como vacunante. Estos ensayos deben ha­
cerse preferentemente en lugares con condicio­
nes ambientales y climáticas similares a las co­
rrespondientes a los lugares donde la vacuna va
a ser usada definitivamente (países industriali­
Inmunización activa y pasiva
zados, países no industrializados, zonas tropi­
cales, etc.).
Fase 2: es una extensión de la fase 1, sobre
todo cuando se ha demostrado efecto p ro tec­
tor, y se lleva a cabo en pequeña escala en vo­
luntarios, a los que se desafía con el agente in­
feccioso.
Fase 3: el ensayo se hace en gran escala, ge­
neralmente seleccionando comunidades que vi­
ven en zonas endémicas, en los que se valora el
poder protector contra la enfermedad o las me­
jorías experimentales en los previamente infec­
tados.
Las autoridades sanitarias sólo podrán auto­
rizar, para su uso en el hombre, a aquellas va­
cunas que hayan cumplido satisfactoriam ente
con las 3 fases arriba establecidas.
SEROTERAPIA
La transferencia pasiva de anticuerpos puede
ser congénita y experim ental. La seroterapia
utiliza como agentes inmunizantes pasivos los
inm unosueros que contienen anticuerpos ho­
mólogos o heterólogos experimentalmente ela­
borados.
Antisueros específicos heterólogos
Si bien antes del advenimiento de los anti­
bióticos y quimioterápicos fue frecuente el em­
pleo de sueros antibacterianos heterólogos, en
especial antineumocócico, antimeningocócico,
antitífico, etc., en la actualidad no se usan. Los
antisueros obtenidos por inoculación de gran­
des animales que todavía se siguen usando son
los antitóxicos, en especial antidiftérico, antite­
tánico, antigangrenoso, antibotulínico y los es­
pecíficos para venenos de ofidios y arácnidos.
Su calidad ha sido m ejorada por desespecia-
eión enzimática, mediante tratamiento con pep­
sina, la que al liberar el fragmento Fe de la mo­
lécula de inmunoglobulina permite obtener un
suero rico en F (ab’)2. Este sigue funcionando
como anticuerpo neutralizante muy activo, y
carece del fragmento donde se encuentra ubica­
da la mayor parte de los determinantes antigé-
nicos con especificidad de especie.
El uso de algunos de estos antisueros h a dis­
minuido considerablemente, en especial el del
antidiftérico y del antitetánico, com o conse­
cuencia del grado de inmunización activa con­
tra esos agentes alcanzado por la población, lo­
grado con planes de vacunación eficaces elabo­
rados por las autoridades sanitarias.
Gammaglobulina humana
Se utiliza con fines terapéuticos con el obje­
to de conferir inmunidad pasiva contra nume­
370 Aspectos básicos de la inmunidad
rosos agentes infecciosos, en especial virales.
Se obtiene de placenta hum ana y se purifica
por tratamiento salino o alcohólico. Se conside­
ra que, como consecuencia de inm unización
activa por enfermedad o por vacunación ocurri­
da en las madres de donde dichas placentas
provienen, la gammaglobulina resultante puede
ser efectiva.
Antisueros específicos homólogos
Se obtienen por inmunización activa de vo­
luntarios sanos contra determ inados agentes;
toxina tetánica, B. pertussis, sarampión, pape­
ras, etc. La ventaja que tienen sobre los anti­
sueros heterólogos es que reducen al mínimo
las reacciones de hipersensibilidad.
Gammaglobulinas específicas
Son soluciones en riq u ecid as en fracción
gammaglobulina y obtenidas por precipitación
alcohólica de sueros humanos inmunes, prove­
nientes de personas eficazm ente vacunadas
contra determinados virus, bacterias o sus toxi­
nas. Son productos concentrados con un alto
contenido en anticuerpos. Al igual que los an­
teriores, son muy efectivas cuando los meca­
nismos reguladores de la agresión son los de la
inmunidad humoral.
Complicaciones de la seroterapia
Cuando se usan sueros heterólogos, las pro­
teínas de la especie animal de la que provienen,
actuando como antígenos, pueden inducir res­
puesta inmune con producción de anticuerpos
de clase IgE. Éstos, al sensibilizar a mastocitos,
pueden desencadenar, ante nuevas inoculacio­
nes de esa proteína, un choque anafiláctico.
Cuando se emplean estos antisueros es necesa­
rio efectuar pruebas cutáneas de sensibilización
en todas aquellas personas que hubiesen sido
inyectadas alguna vez con sueros heterólogos.
Otra complicación es la enfermedad del sue­
ro (véase cap. 32), la que se observa a los 8-10
días de la inoculación y es debida a que los an­
ticuerpos no citotrópicos originados contra la
proteína heteróloga, al reaccionar con el exceso
de la misma aún no degradada, forman comple­
jos Ag-Ac en la zona de ligero exceso de antí­
geno. Estos complejos, fijadores del com ple­
mento, se depositan especialmente en piel y ri­
ñón, y son los responsables de las diferentes
manifestaciones clínicas de la enfermedad.
Los sueros homólogos y productos de ellos
derivados no dan enfermedad del suero, pero sí
pueden originar reacciones de hipersensibilidad
debidas a aloantígenos. Otro de los inconve­
nientes es la posibilidad de transmitir el virus
de la hepatitis B y del SIDA (Síndrome de in­
munodeficiencia adquirida). Este último hecho
obliga a seleccionar cuidadosamente a los he-
modadores voluntarios.
Existe información de que se han obtenido
cepas de ratones transgénicos que sintetizan
IgG humana completa, y que cuando son esti­
mulados con inmunógenos inducen la form a­
ción de anticuerpos localizados en dicha inmu­
noglobulina. De confirmarse estos resultados
los mismos serían de valor extraordinario, ya
que las células de bazo de esos ratones inocula­
dos con antígenos convencionales podrían ser
hibridizadas y originar hibridomas sintetizado-
res de anticuerpos monoclonales humanos. Su
uso en terapéutica humana sería fascinante, ya
que permitiría seleccionar la calidad del anti­
cuerpo a usar en cuanto a su afinidad y capaci­
dad protectora, a la vez que se verían minimi­
zados los actuales problemas de transmisión de
enfermedades infecto-contagiosas debidas a in­
munizaciones pasivas.
Control de los antisueros
Los sueros inmunes homólogos y heterólo­
gos y las gammaglobulinas específicas deben
ser controlados antes de su uso para establecer
su eficacia.
La actividad antitóxica se determina midien­
do la capacidad que tienen para neutralizar to­
xinas letales de actividad conocida sobre deter­
m inadas especies anim ales. Los anticuerpos
antimicrobianos se miden por aglutinación, y
los antivirales, por inhibición de efecto, en es­
pecial sobre la capacidad aglutinante que la
mayor parte de los virus tienen sobre los hema­
tíes de pollo, o sobre el efecto citopatogénico
que producen en fibroblastos u otras líneas ce­
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IVIecanismos citotóxicos
mediados por células
MARTÍN ISTURIZ
MIRTA GIORDANO
E! conjunto de fenóm enos que integran la
respuesta inmune se encuentra asociado, por ra­
zones históricas, al concepto de protección o
defensa del individuo contra las agresiones ex­
ternas causadas por diferentes m icroorganis­
mos. En el presente capítulo se analizarán las
características de las células que actúan como
efectoras de los mecanismos citotóxicos, así co­
mo la forma en que reconocen a las diferentes
noxas y cuáles son sus mecanismos de ataque.
Si bien es habitual referirse a estos mecanis­
mos citotóxicos como pertenecientes a la inm u­
nidad celular, esto no es más que una clasifica­
ción académica para facilitar su comprensión.
Más adelante veremos que, muchas veces, las
células efectoras actúan en estrecha relación
con sustancias que corresponden al “comparti­
miento humoral”.
G EN ERA LID A D ES
En todo sistema citotóxico mediado por cé­
lulas existe, por un lado, una célula agresora y
por otro, una bacteria, parásito, célula infectada
por virus o una célula tumoral que es agredida
durante el proceso y que se denomina genérica­
mente célula “blanco” (o “target cell” en la lite­
ratura en inglés).
Hay dos condiciones necesarias, pero no su­
ficientes, para que cualquier mecanismo citotó­
xico mediado por células se lleve a cabo: 1) la
viabilidad de las células efectoras, y 2) el con­
tacto estrecho entre las células efectoras y las
células “blanco”. La lisis de estas últimas es la
fase final de la reacción citotóxica.
C onceptualm ente, debe tenerse en cuenta
que los procesos citotóxicos fisiológicos ejer­
cen su acción lítica en ámbitos muy circuns­
21
criptos y no actúan por la liberación de sustan­
cias al medio, lo que podría destruir células o
tejidos no comprometidos con el proceso.
Cuando se aborda el análisis de un fenómeno
de este tipo es necesario contar, en prim er lu­
gar, con un método apropiado para evaluar la
muerte de la célula “blanco”. Por ejemplo, si se
trata de una bacteria o un parásito, es posible
observar microscópicamente su destrucción o
la inhibición de su capacidad para proliferar en
medios de cultivo adecuados luego de su con­
tacto con la célula efectora. Si, en cambio, la
célula “blanco” es una célula tumoral o normal,
puede utilizarse el colorante azul trypan para
poner en evidencia la lisis, ya que este coloran­
te tiene la particularidad de teñir únicamente a
las células muertas. Asimismo, es posible recu­
rrir a alguna característica metabólica particu­
lar que pueda asociarse con la viabilidad de la
célula “blanco” utilizada en la reacción. Por
ejemplo, si se trata de una célula secretora, me­
dir su capacidad para liberar un determinado
producto de secreción. Estos métodos tienen la
desventaja de ser muy laboriosos y sólo se uti­
lizan para la evaluación de algún sistem a en
particular. El método más difundido para el es­
tudio de los mecanismos citotóxicos es el de la
incorporación de sustancias radiactivas a las
células “blanco” . La destrucción de éstas per­
mite que la sustancia radiactiva se libere al me­
dio y pueda ser cuantificada fácilmente.
Las sustancias radiactivas deben cu m p lir
ciertos requisitos para ser utilizadas:
1) Deben incorporarse a las células “blanco”
en cantidades compatibles con sistem as
de microrreacciones.
2) No deben liberarse al medio espontánea­
mente.
376 Mecanismos efectores de la respuesta inmune
3) Una vez liberadas al sobrenadante, no de­
ben ser reutilizables, en forma significati­
va, por las células restantes.
4) Su liberación al medio debe tener correla­
ción directa con el efecto lítico produci­
do.
Sin lugar a dudas el agente radiactivo más
utilizado es el Na^^'CrO^C'Cr), que tiene la
ventaja adicional de poner de manifiesto rápi­
damente el efecto citotóxico. Para el caso de
bacterias o parásitos que no incorporan el ^‘Cr
o que lo liberan en forma espontánea, se usan
bases nitrogenadas radiactivas como, por ejem­
plo, la ^H-timidina, que se incorporan a los áci­
dos nucleicos.
Este capítulo fue escrito con el objeto de
brindar al lector las características básicas y los
aspectos conceptuales más sobresalientes de
los mecanismos citotóxicos mediados por célu­
las, marcando semejanzas y diferencias entre
ellos, con la finalidad de facilitar el acceso a
publicaciones especializadas en cada uno de
los temas.
Los seis tipos de mecanismos citotóxicos a
los que haremos referencia son funcionales a
nivel fisiológico. C abe señ alar que existen
otros sistemas líticos mediados por células que
han sido desarrollados en forma experimental
para ser utilizados como modelos en el estudio
de las funciones citotóxicas. El ejem plo más
conocido quizá sea el de la citotoxicidad indu­
cida en células linfoides y m onocitarias por
ciertas leetinas mitogénicas como la concana­
v a lin a A (C on A) y la fito h e m a g lu tin in a
(PHA). Estos sistemas artificiales no serán des­
critos.
CITOTOXICIDAD MEDIADA
POR LINFOCITOS T
En el año 1960, A. Govaerts informó que los
linfocitos del conducto torácico de un perro,
que había rechazado un trasplante renal aloge­
neico, eran capaces de lisar células epiteliales
de riñón provenientes del perro dador del órga­
no. Este experimento fue una de las primeras
demostraciones directas de que los linfocitos
pueden actuar como células citotóxicas.
Una década después, Hayry y Defendí, culti­
vando linfocitos normales junto con células tu­
morales, consiguieron obtener linfocitos citotó­
xicos específicos para las células tumorales. El
hecho de haber podido reproducir el fenómeno
totalmente “in vitro” permitió la realización, de
allí en más, de un estudio detallado del sistema,
ya que pudieron hacerse ensayos en condicio­
nes experimentales bien definidas.
Los m ecanism os citotóxicos mediados por
linfocitos T son de gran importancia para la de­
fensa del individuo contra las infecciones cau­
sadas por virus, y ocasionalmente contra algu­
nos parásitos intracelulares. Tienen participa­
ción, además, en el rechazo de los trasplantes y
de ciertos tumores.
Características de las células efectoras
Las células efectoras pertenecen a una sub­
población de linfocitos T, denominados linfoci­
tos T citotóxicos, y que generalmente expresan
en su membrana el antígeno CD8.
Para que la citotoxicidad mediada por linfo­
citos T se lleve a cabo es necesario que las cé­
lulas efectoras hayan sido previamente sensibi­
lizadas contra un antígeno determinado, ya sea
en el curso de una infección natural, o experi­
mentalmente por su inoculación. Es así que los
linfocitos T reconocerán sobre la membrana de
la célula “blanco”, únicamente el antígeno con­
tra el cual fueron sensibilizados, lo que implica
que la citotoxicidad T es un mecanismo especí­
fico.
Mecanismos de generación de linfocitos T
citotóxicos
Tomemos como ejemplo una infección viral.
Al invadir un organismo los virus son capaces
de penetrar activamente en las células permisi­
vas y reproducirse en ellas. Durante el proceso
de multiplicación, muchas proteínas virales, o
más bien pequeños péptidos de entre 8 y 11
aminoácidos, son expresados en la membrana
de la célula infectada, asociados a moléculas de
clase I del complejo mayor de histocompatibi­
lidad (CMH). Esta asociación entre proteínas
virales y moléculas de clase I posibilita el reco­
nocimiento del antígeno por parte de una sub­
población de linfocitos T CD8+, conocidos co­
múnmente como linfocitos T citotóxicos. For
lo tanto, es importante recordar que, a diferen­
cia de lo que ocurre con el receptor antigénico
de los linfocitos B, el receptor (TCR, del in­
glés: T cell receptor) de los linfocitos T CD8+
no reconoce al antígeno en su forma nativa, si­
no únicamente al complejo formado por el antí­
geno y las moléculas de clase I del CMH (fig.
21-la).
Las moléculas de clase I están expresadas en
forma constitutiva en casi todas las células del
organismo. Aparentemente la unión entre el re­
ceptor antigénico del linfocito T y el conjunto
antígeno-molécula de clase I no tiene la sufi­
ciente afinidad como para desencadenar el pro­
ceso lítico por parte de la célula T CD8+. Para
ello son necesarias las moléculas de adhesión,
que interactúan entre células efectoras y células
“blanco” y que perm iten iniciar el fenómeno
 Mecanismos citotóxicos mediados p o r células
F ig. 21-1. R econocim iento del antígeno por p arte de los linfocitos T: a) T citotóxicos; b) T colaboradores.
citotóxico. Las moléculas CDS presentes en los
linfocitos T tienen la particularidad de unirse a
la porción no polimórfica de las moléculas de
clase I en las células “blanco”, lo que significa
que las CDS actúan como moléculas de adhe­
sión en estos sistemas, y permite explicar por
qué los linfocitos T CD8+, y no otros, son los
que intervienen en estos procesos restringidos
por moléculas de clase I (fig. 21-1 a).
En un individuo no sensibilizado, son muy
pocos los clones de linfocitos T CD8+ capaces
de reconocer las proteínas específicas de un vi­
rus determinado y, por ende, son insuficientes
para detener el curso de una infección. La am­
plificación del sistema citotóxico específico es,
por consiguiente, una condición imprescindible
para que se lleve a cabo la total eliminación de
las células infectadas. Este proceso de amplifi­
cación depende de linfocitos T CD4+ y es deta­
llado a continuación.
En el curso de una infección viral se liberan
al medio extracelular una serie de virus infecti­
vos, virus defectivos y proteínas virales, que
van a ser captados por células del sistema mo­
nonuclear fagocítico y otras, como los linfoci­
tos B y las células dendríticas, conocidas gené­
ricamente como células presentadoras de antí­
genos (CPA). Las CPA expresan constitutiva­
mente moléculas de clase II del CMH, y son
capaces de captar antígenos por fagocitosis o
endocitosis, degradarlos parcialmente y expre­
sarlos en su membrana asociados a las m olécu­
las de clase II. Es justam ente esta asociación
entre determinante antigénico y moléculas de
clase II la que es reconocida por los receptores
antigénicos de una subpoblación linfocitaria T
CD4+ conocidos genéricamente como linfocitos
377
CPA
T colaboradores (“helper”). En forma análoga a
la d escrita para los linfocitos T CDS"^, esta
unión no tiene la afinidad suficiente para que la
célula prolifere y son necesarias las moléculas
de adhesión para que ello ocurra; entre ellas, las
moléculas de CD4, que se unen a la porción no
polimórfica de las moléculas de clase II de las
CPA. Hay otras uniones entre moléculas de ad­
hesión que son necesarias para obtener una acti­
vación satisfactoria de las células T. De particu­
lar importancia para iniciar la proliferación pa­
rece ser la unión entre la proteína B7 en las
CPA y la CD28 en la célula T (fig. 21-lb).
Cuando los linfocitos CD4+ reconocen al an­
tígeno expresado con las moléculas de clase II
en las CPA hay tres eventos (no son los únicos)
fundamentales que se producen casi simultánea­
mente a la interacción entre el receptor T y el
antígeno; 1) secreción de la interleu q u in a 1
(IL-1) por parte de las CPA, 2) inducción de la
expresión de receptores para interleuquina 2
(IL-2) en los linfocitos CD4+ y 3) secreción de
IL-2 por parte de las células CD4‘^.
La IL-2 actiía como el mitógeno natural de
las células CD4-h, por lo tanto, estos linfocitos
proliferan a través de un mecanismo autocrino,
ya que “fabricaron” los receptores para prolife­
rar (receptores para IL-2) y el agente que indu­
ce la proliferación (IL-2). De esta m anera se
produce una expansión elonal de linfocitos T
CD4+ restringida, por supuesto, a las células
CD4+ que fueron capaces de reconocer al antí­
geno originalmente (fig. 21-2).
En cuanto a los linfocitos citotóxicos, que
son casi exclusivamente CD8+, también sufren
un proceso de amplificación después de reco­
nocer al antígeno en asociación con las molé­
378 Mecanismos efectores de la respuesta inmune
IL-1
F ig. 21-2. R epresentación de la expansión clonal de los Im tocitos T citotóxicos.
culas de clase I del CMH sobre la célula infec­
tada. Si bien esta interacción induce la expre­
sión de receptores para IL-2 en la membrana de
los linfocitos citotóxicos, éstos son incapaces
de sintetizar IL-2. Por lo tanto, para expandirse
necesitan de la IL-2 producida por las células
CD4+ (fig. 21-2). De aquí se puede deducir la
gran importancia que tienen las células CD4+
en el proceso de generación de las células cito­
tóxicas. En efecto, en ausencia de ellas prácti­
camente no hay desarrollo de mecanismos cito-
tóxicos mediados por células T. Más aún, tam­
poco hay producción de anticuerpos.
Finalm ente cabe señalar que las células T
CD4+ esquematizadas en la figura 21-2 com­
prenden, en realidad, dos poblaciones bien de­
finidas fenotípica y funcionalmente en el ratón
y, por lo menos, funcionalmente en el hombre.
Estas células denominadas T H l y TH2 (TH, de
T “helper”) tienen un patrón muy amplio y de­
finido de secreción de interleuquinas que inter­
vienen en los distintos pasos de activación, ex­
pansión, y maduración de los linfocitos T CD4+
y CD8+. Hoy es conocido que las células THI
son las responsables de la secreción de IL-2,
interferón gamma, factor de necrosis tumoral
(TNF) e IL-12; mientras que las TH2 son las
células encargadas de la secreción de IL-4, IL-
5, IL-t e IL-10 luego del reconocim iento del
antígeno.
C IT O T O X IC ID A D “N ATURA L K IL L E R ”
El sistema inmune de todos los vertebrados
presenta subpoblaciones linfocitarias que tie­
nen la capacidad innata de lisar cierto tipo de
células tumorales y de células infectadas por
virus. Este fenómeno citotóxico, descrito alre­
dedor del año 1970, se conoce como citotoxici­
/A
Lisis
dad “natural killer” o actividad NK. A diferen­
cia de lo que ocurre con la citotoxicidad T, p a­
ra que se lleve a cabo no es necesario que haya
habido sensibilización previa de las células
efectoras; más aún, la actividad NK no se ve
influida por la exposición previa al antígeno.
El hecho de que la actividad NK se ejerciera
in vitro contra células tumorales sin afectar a
las células normales despertó una gran expecta­
tiva entre los inmunólogos clínicos. Sin embar­
go, a pesar de numerosos experimentos realiza­
dos no ha sido posible demostrar que las célu­
las NK tengan un papel relevante en la preven­
ción del desarrollo tumoral. Por ejemplo, la ci­
totoxicidad NK mediada por los linfocitos peri­
féricos de pacientes con cáncer no se ve dismi­
nuida hasta que no se alcanza un deterioro im ­
portante en la condición general del individuo.
Asimismo, no se ha encontrado potenciación
de la actividad NK en aquellos pacientes que
responden positivam ente a la inm unoterapia.
No obstante, algunos autores han argumentado
que el control del crecimiento tumoral por par­
te de las células NK se daría en una etapa tem­
prana de la transformación maligna; siendo los
tumores que se expresan clínicamente resisten­
tes a la lisis por esta vía.
Características de las células efectoras
Las células NK constituyen una subpobla­
ción con variaciones morfológicas respecto de
los linfocitos típicos que comprende entre el 10
y el 20% de los linfocitos periféricos humanos.
Se conocen como linfocitos de gránulos gran­
des (LGL = large granular lymphocytes, del in­
glés), en alusión a la presencia de gran cantidad
de gránulos eosinófilos en su citoplasma
En cuanto a su fenotipo, las células NK se
definen como linfocitos maduros CD2“^, que no
 Mecanismos citotóxicos mediados p o r céluias 379

expresan inmunoglobulinas de superficie ni el Célula normal Célula NK

complejo CD3-TcR que corresponde al recep­
tor antigénico de linfocitos T. Por lo tanto, son
una subpoblación diferente de las células T ci­
totóxicas. Además, ciertas células NK presen­
tan marcadores de monocitos/macrófagos co­
mo los antígenos M I y M A C l, mientras que No-lisis
otras no expresan marcadores de linfocitos T,
B o monocitos. Estas últimas se conocen como
células nulas o linfocitos K y, tal como se verá
más adelante, también son efectoras de la cito-
toxicidad celular dependiente de anticuerpos.
Esta gran heterogeneidad fenotípica de las cé­
lulas efectoras indica que la actividad NK no
está restringida a un determinado tipo celular
sino que, por el contrario, es una función cito­ Célula mutada
tóxica capaz de ser mediada por células de di­
ferente linaje.
Merece destacarse el hecho de que todas las
células NK expresan receptores para el frag­
mento Fe de la IgG, relacionado con el antíge­
no G D I6, no obstante lo cual este receptor no
está involucrado en la inducción de la lisis, ni
es privativo de ellas. La molécula de CD56 es
el marcador más característico de las células
NK maduras, y el CD57 de las inmaduras.
El proceso citotóxico se inicia con la unión
entre la célula efectora y la célula “blanco” . Es­
to supone la existencia de receptores en las cé­
lulas NK, capaces de reconocer ciertas estruc­
turas expresadas sobre la célula “blanco” . H as­ Célula Infectada
ta el año 1994 no habían podido caracterizarse por un virus
el o los receptores responsables del reconoci­
miento de la célula “blanco” por paite de la cé­
lula NK. En poco tiempo, sin embargo, se clo­
naron e identificaron más de 10 moléculas que
están presentes en subpoblaciones de células
NK y que, cuando interactúan con el ligando
correspondiente sobre la célula “blanco” , son
capaces de inducir señales estimulatorias o in­
hibitorias de la lisis. Un subgrupo de estos re­
ceptores pertenece a 1a familia de leetinas de ti­
po C, que unen oligosacáridos presentes en
muchos tipos distintos de glucoproteínás y glu­ F ig. 21-3. M odelo de reconocim iento y activación d e las
colípidos (fig. 21-3). células “natural killer” .
Evidencias recientes indican que las células
NK son capaces, además, de reconocer antíge­
nos de clase I del com plejo mayor de h isto ­ interferón y, aumentan la actividad NK, tal co­
compatibilidad. Este reconocimiento es necesa­ mo lo hacen con la citotoxicidad T. Por su par­
rio para evitar que, una vez producida la unión te, la IL-2 que, como se mencionó anteriormen­
entre células efectora y “blanco”, se ponga en te, juega un papel fundamental en la prolifera­
marcha la maquinaria lítica. Es decir que, cuan­ ción y diferenciación de los linfocitos T citotó­
do los antígenos de clase I están ausentes de la xicos, incrementa la actividad NK.
m em brana de una célula m utada o han sido Por último señalaremos que la actividad NK
modificados por un péptido viral (fig. 21-3), la en eélulas humanas se evalúa comúnmente uti­
célula NK se activa para eliminar las células lizando como “blanco” la línea celular derivada
tumorales o infectadas por un virus. de una eritroleucemia humana, K562, m uy sen­
La capacidad lítica de las células NK está re­ sible a su actividad. En ratones se utiliza la lí­
gulada por distintas linfoquinas. Por ejemplo, nea celular YAC-1 que deriva de una leucemia
se ha visto que los interferones, en especial el murina inducida por el virus de Maloney.
380 Mecanismos efectores de la respuesta inmune
CITOTOXICIDAD CELULAR INDUCIDA
POR INTERLEUQUINA 2
En los últimos años se ha demostrado que el
tratamiento “in vitro” de linfocitos periféricos
humanos con IL-2, además de favorecer la ci­
totoxicidad T y NK, induce una actividad cito-
lítica adicional a la manifestada por las células
NK. Estos linfocitos susceptibles a la IL-2 pa­
recen pertenecer al linaje de los NK aunque es
evidente que presentan características fenotípi­
cas diferentes entre ellos, quizás por su diferen­
te estado de activación, por lo que es imposible
considerarlos como un tipo celular definido. A
estas células capaces de ser activadas por IL-2
se las conoce con el nombre de células LAK
(de “lym phokine activated killer cells”). Las
células LAK son capaces de lisar una gran va­
riedad de células tum orales, incluso muchas
que no son sensibles a las células NK. En expe­
riencias clínicas que se están llevando a cabo,
las células LAK han demostrado ser efectivas
en los tratamientos de melanomas, linfomas, y
en metástasis renales llevados a cabo en pa­
cientes term inales. A ctualm ente, aunque en
forma parcial o limitada, las células LAK cons­
tituyen una herramienta potencial para la inmu­
noterapia del cáncer.
CITOTOXICIDAD CELULAR
DEPENDIENTE DE ANTICUERPOS
En el año 1965, E. Moller describió un fenó­
meno citotóxico por el cual los esplenocitos de
Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos
Célula efectora
(linfocito K, Ty, B,
monocito, PMN, macrófago)
F ig . 21-4. E squem a representativo del reconocim iento entre la célula efectora y la célula “blanco” en la citotoxicidad c e ­
lular dependiente de anticuerpos.
ratones normales no sensibilizados previamen­
te con antígenos eran capaces de lisar células
tumorales reeubiertas con anticuerpos específi­
cos. El proceso citotóxico, que no involucraba
la participación del sistema del complemento,
mostró su eficiencia contra un amplio panel de
células “blanco” . A este sistema lítico, esen­
cialmente extracelular, se lo denominó citoto­
x icidad celular d ependiente de anticuerpos
(ADCC); esta sigla, proveniente del inglés “an­
tibody dependent cell mediated cytotoxicity”,
es la utilizada en la literatura científica para
describir a este mecanismo. Recientemente se
ha demostrado que esta función está compro­
metida en procesos de inmunidad contra tumo­
res, en el rechazo de trasplantes, así como tam­
bién en la destrucción de bacterias, parásitos, y
células infectadas por virus.
La reacción citotóxica se inicia con el reco­
nocimiento, por parte de la célula efectora, de
los anticuerpos que recubren a la célula “blan­
co”, a través de los receptores para el fragmen­
to Ec de las Ig (REc) expresados en la membra­
na (fig. 21-4). En la mayor parte de los casos,
el anticuerpo que participa en la ADCC es de la
clase IgG y, por consiguiente, los receptores
celulares de las células efectoras intervinientes
son los REc de IgG. Sin embargo, ciertos linfo­
citos T con RFc de IgA y los polimorfonuclea­
res neutrófilos son capaces de mediar la ADCC
contra células “blanco” sensibilizadas con IgA.
Asimismo, los monocitos y los polim orfonu­
cleares eosinófilos que expresan RFc de IgE in­
ducen la destrucción de células recubiertas con
IgE. Este sistema parece ser muy importante en
Lisis
Célula “blanco”
 Mecanismos citotóxicos mediados por células
la inmunidad contra parásitos. En cuanto a la
capacidad de los anticuerpos IgM para iniciar
una reacción de ADCC, no se encuentra total­
mente definida. No obstante, está aceptado que
la IgM puede potenciar la ADCC inducida por
anticuerpos de la clase IgG.
Una característica de la ADCC es que la cé­
lula efectora no presenta restricciones en cuan­
to a antígenos de histocom patibilidad. Por lo
tanto, resulta operativa contra células “blanco”
isogeneicas, alogeneicas y xenogeneicas.
A sim ism o m erece destacarse que la ADC
desarrolla su actividad máxima a concentracio­
nes muy bajas de anticuerpos. Por ejemplo, se
ha comprobado que para producir la destruc­
ción de la célula “blanco” por ADCC es sufi­
ciente una concentración de anticuerpos sensi­
bilizantes de 100 a 1.000 veces menor que la
necesaria para inducir la lisis por el sistema de
complemento.
Mediante estudios cinéticos fue posible de­
mostrar que el efecto lítico inducido por la cé­
lula efectora de ADCC es sumamente rápido.
Así, a los 5 minutos de producido él contacto
con la célula “blanco” se observan los primeros
signos de daño que se manifiestan por un au­
mento de la fragilidad osmótica, seguida por la
liberación de los componentes intracelulares.
Esto, sumado al hecho de que los anticuerpos
sensibilizantes pueden ser reutilizados en otro
ciclo citolítico hace de la ADCC el proceso ci­
totóxico conocido más eficaz en presencia de
anticuerpos.
Aún no se ha podido establecer cuáles son
las especies moleculares responsables del daño
celular. En cambio, queda claro que no se pro­
duce la liberación al medio de sustancias citolí-
ticas. Es más, si las células efectoras son en­
frentadas simultáneamente con células “blan­
co” sensibilizadas y no sensibilizadas, sólo se­
rán destruidas las primeras, lo que confirma el
papel fundamental que desempeñan los RFc en
la ADCC. Algunos autores, empleando mono­
citos como células efectoras, han sugerido la
participación de mecanismos dependientes del
oxígeno en la lisis de la célula “blanco” . Sin
embargo, hasta el presente no se ha podido de­
term inar con precisión si los interm ediarios
reactivos del oxígeno, al igual que las enzimas
lisosom ales, están involucradas en la A DCC
mediada por otros tipos celulares.
Características de las células efectoras
Las células efectoras mejor estudiadas han si­
do los linfocitos denominados “killer” (linfoci­
tos K), que se distinguen por no presentar m ar­
cadores propios de células T o B. No obstante,
son muchos otros los tipos celulares que pueden
mediar la ADCC. Entre ellos, podemos nom ­
381
brar a los monocitos, los macrófagos y los p oli­
morfonucleares neutrófilos y eosinófilos, así co ­
mo también a los linfocitos B y algunas subpo­
blaciones de linfocitos T CD16+. La caracterís­
tica común que permite agrupar a todas estas
células efectoras es la de que expresan sobre su
membrana RFc, no como simples marcadores
fenotípicos, sino como unidades de reconoci­
miento e inducción de su actividad citotóxica.
Mecanismos líticos
Los mecanismos líticos de los linfocitos T
sensibilizados, de las células NK y LAK, así
como de las diferentes poblaciones efectoras de
la ADCC no han sido hasta el momento total­
mente clarificados. Se sabe que ninguna de es­
tas células citolíticas libera sustancias tóxicas
al medio que puedan afectar a otras células no
com prom etidas en el evento citotóxico. P o r
otra parte, se ha comprobado que los inhibido­
res de la síntesis de proteínas o de ácidos nu­
cleicos no afectan el desarrollo del fenóm eno
citotóxico propiamente dicho, por lo que se in­
fiere que el mecanismo lítico se encuentra pre-
formado.
Sin embargo, en los últimos años ha habido
un avance notorio en el esclarecimiento de los
mecanismos citotóxicos que, aunque lejano de
una comprensión total de los sistemas, perm ite
ir armando el rompecabezas en un área que ha
sido particularm ente elusiva durante m uchos
años. La mayoría de estos estudios fueron lle­
vados a cabo en ios linfocitos T CD8* y en las
células NK. Algunos autores, con alguna ev i­
dencia experimental, han extrapolado estos da­
tos al m ecanism o de la ADCC y las células
LAK.
Se ha demostrado que el efecto lítico se rea­
liza solamente en el espacio confinado al área
de contacto entre la célula efectora y la célula
“blanco” en donde se libera por exocitosis de la
célula efectora una familia de proteínas conoci­
das genéricamente como “perforinas” (fig. 21-
5). Estas proteínas se hallan localizadas en los
gránulos de las células T y NK. Dichos gránu­
los aislados muestran una actividad citolítica
rápida y potente, que depende de la presencia
de Ca'^'^. Los anticuerpos preparados co n tra
ellos neutralizan la citotoxicidad m ediada no
sólo por los gránulos aislados, sino también por
las células T y NK. El análisis de la formación
de las lesiones revela que éstas se producen por
la polimerización de precursores monoméricos
localizados en los gránulos, generándose un ti­
po de lesión (formación de poros) semejante a
la provocada por el sistema complemento.
La descripción del mecanismo de ruptura ce­
lular por medio de las perforinas planteaba la
“p arad o ja” de que sólo las células “b la n c o ”
382 Mecanismos efectores de la respuesta inmune
Célula citotóxica
Protectina
ü^'C'Vfvr(vr,„
tttT )
1.1w.*-'
Célula “blanco”
eran lisadas, siendo que, como se dijo anterior­
m ente, las perforinas eran liberadas en mi-
croambientes formados por las mernbranas de
las células efectora y “blanco”. Con posteriori­
dad se comprobó que las células citotóxicas tie­
nen en su membrana una proteína, denominada
“protectina” , que es capaz de n eu tralizar el
efecto de las perforinas.
Los gránulos citoplasmáticos de las células
NK fueron estudiados en form a com parativa
con los obtenidos de las células T citotóxicas,
demostrándose que tienen propiedades biológi­
cas y bioquímicas iguales. El hecho de que los
gránulos aislados de ambos tipos de células
efectoras sean citotóxicos contra todas las célu­
las “blanco” estudiadas indica que la diferencia
básica entre los dos sistemas ocurre a nivel del
reconocimiento de la célula agredida.
El tipo de lesión que producen las perforinas
permite la entrada a la célula de otro tipo de
proteínas, las granzimas, proteasas que pene­
tran a la célula “blanco” porque están asocia­
dos a los mismos proteoglicanos que las perfo­
rinas. Las granzimas tam bién pueden acceder
al interior de la célula “blanco” por medio de
procesos endocíticos que éstas llevan a cabo
con el objeto de reparar la membrana celular.
L a absorción de granzim as, prin cip alm en te
granzima B, inicia una cadena de eventos que
culmina en la apoptosis de la célula “blanco”.
M ediante experimentos de ablación génica
que perm itieron generar anim ales deficientes
de perforinas fue posible demostrar categórica­
mente la importancia de estas proteínas en los
eventos líticos. De hecho, estos animales son
incapaces de liberarse de los virus que los in­
F ig . 21-5. Representación e s ­
q uem ática de la lisis por p e r­
forinas.
í tí
°
p |?
I?
? ¿ P e rfo rin a
fectan mientras que todas las otras funciones
inmunes mediadas, sobre todo por linfocitos T,
son normales.
Se ha propuesto otro mecanismo lítico, dife­
rente del de las perforinas y granzimas, que re­
cibe el nombre de apoptosis o muerte celular
programada. En este proceso participan, por un
lado, una proteína conocida con el nombre de
Fas que se encuentra expresada sobre la super­
ficie de las eélulas “blanco” y, por otro, un li­
gando específico presente en la membrana de
las células efectoras denom inado Fasligand.
Cuando se produce la unión entre células efec­
toras y células “blanco”, hay reconocimiento e
interacción de ambas proteínas. Debido a que
la porción intracitoplasm ática de la proteína
Fas tiene un “dominio letal”, esta interacción
conduce a la apoptosis, con el consiguiente cli­
vaje del ADN de la célula “blanco” y, obvia­
mente, su destrucción. Futuros estudios defini­
rán si este mecanismo, que está bastante bien
definido, es funcional o no en los sistemas cito-
tóxicos.
A nivel conceptual, es im portante tener en
cuenta que la coexistencia de varios mecanis­
mos líticos hace casi imposible que un agente
infeccioso escape a la destrucción por parte de
las células efectoras.
F A G O C ITO SIS
La fagocitosis, descrita por Metehnikoff en
el siglo pasado, es uno de los mecanismos de
defensa que aparece más tempranamente en la
escala filogenética. Consiste en la ingestión de
 Mecanismos citotóxicos mediados p o r células
partículas extrañas al organisnio (bacterias, pa­
rásitos, células muertas) por lás células fagocí­
ticas (m onocitos, m acrófagos, polim orfonu­
cleares) y en su posterior degradación intrace­
lular.
No todos los microorganismos son suscepti­
bles de ser fagocitados. Aparentemente, duran­
te el curso de la evolución, muchos de ellos
han adquirido ciertas cara c te rístic a s en su
membrana que les permiten eludir el reconoci­
miento y, por lo tanto, la ingestión por parte de
los fagocitos. Para contrarrestar este sistema de
evasión, los vertebrados, a lo largo de su cam i­
no evolutivo, han desarrollado la propiedad de
sintetizar algunos factores séricos que son ca­
paces de unirse a los microorganismos y de esa
manera facilitar su ingestión. Estos factores,
genéricam ente conocidos con el nombre de
“opsoninas” , están constituidos principalmente
por los anticuerpos y algunas proteínas del sis­
tema Complemento (fig. 21-6). Los anticuerpos
más relevantes que funcionan como opsoninas
pertenecen a las clases IgM e IgG; mientras
que los productos activos que provienen del
clivaje del componente C3 (C3b, C3bi, C3dg
entre otros) son las más importantes opsoninas
aportadas por el sistema del complemento. El
reconocim iento de estas m oléculas que recu­
bren la célula “blanco” de la fagocitosis ocurre
a través de distintos receptores específicos ex­
presados por las células efectoras, y que reco-
FAGOCITOSIS
F ig . 21-6. R econocim iento o ingestión p o r parte de la célula
fagocítica.
383
nocen a los fragmentos Ec de las IgG com o a
los diferentes productos de clivaje del com po­
nente C3. Se ha demostrado que la interacción
entre la porción Fe de las IgG que sensibilizan
a la célula “blanco” es capaz de prom over la
adhesión y la ingestión por macrófagos a través
de los receptores para el fragmento Fe de las
IgG presentes en estas células, mientras que la
interacción a través de los receptores para el
fragmento C3b, y otros, promueve usualmente
sólo la adhesión. No obstante, como las células
fagocíticas tienen los dos tipos de receptores en
sus membranas, generalmente estos acttian en
forma cooperativa (fig. 21-7). Así, se ha visto
que la cantidad de anticuerpos IgG necesarios
para inducir la ingestión de un microorganismo
se reduce alrededor de 100 veces si éste, ade­
más, está recubierto por C3b.
Características de las células efectoras
T an to los fag o cito s m o n o n u cleares, q u e
comprenden a los monocitos y a los inacrófa-
gos, com o los leucocitos polim orfonucleares,
están involucrados en la actividad fagocítica.
Los polimorfonucleares constituyen una b a ­
rrera fundamental frente a una infección b acte­
riana, ya que son los primeros en arribar al fo ­
co infeccioso atraídos por la liberación “in si-
tu” de diferentes sustancias quimiotácticas. Por
su parte, los fagocitos mononuclares no sólo
participan en funciones inmunológicas de d e­
fensa, sino que además cumplen un papel rele­
vante en la depuración de complejos inmunes,
restos celulares, etc. Los monocitos son células
de la circulación que normalmente se extrava­
san y se diferencian en los distintos tejid o s
dando lugar a poblaciones relativamente esta­
bles en el hígado (células de Kupffer), pulmón
(macrófagos alveolares), bazo (macrófagos es-
plénicos) y tejido conectivo (histiocitos). L a
transición de monocito a macrófago im porta
una serie de cambios morfológicos y bioquími­
cos como el aumento en el tamaño celular, en
el ntimero y complejidad de las organelas y en
el contenido de enzimas lisosomales.
Mecanismos líticos en la fagocitosis
Una vez que la célula “blanco” se ha adheri­
do al fagocito se inicia el proceso de ingestión
mediante la extensión de sendópodos que la ro ­
dean y finalmente se fusionan formando la v e ­
sícula fago 9 Ítica o fagosom a primario (véase
fig. 21-6). Éste, posteriormente se fusiona con
los lisosomas dando lugar al fagolisosoma, en
cuyo interior la célula “blanco” queda expuesta
a un conjunto de sistem as m icrobicidas que
pueden ser dependientes, o no, del oxígeno. Es
importante señalar que, en ocasiones, estos sis­

temas microbicidas actúan en forma extracelu­
lar. Por ejemplo, cuando la fagocitosis se ve
im posibilitada por el tam año excesivam ente
grande de una partícula, la interacción del fa­
gocito con un estímulo desencadenante adecua­
do induce la liberación de las especies tóxicas
al medio extracelular. Otro tanto ocurre cuando
los fagocitos son “gatillados” por estímulos so­
lubles, como los péptidos quimiotácticos o los
complejos inmunes. Mecanismos de este tipo
son los responsables del daño tisular que se ob­
serva en las reacciones inflamatorias.
Sistemas microbicidas independientes
del oxígeno
Este sistema está constituido por una serie de
componentes presentes en los lisosom as que
pueden actuar intracelularmente, localizando su
accionar en los fagolisosomas, o extracelular-
mente por efecto de estímulos que induzcan su
liberación.
Entre ellos cabe señalar a las proteínas catió­
nicas conocidas como “fagocitina” y “leucina”,
que atacan las membranas microbianas. Tam­
bién, la lactoferrina, que fija y retiene el hierro
privando así a las bacterias de él. Asimismo, la
lisozima, que ataca a los mucopéptidos de la
pared celular bacteriana. Por último, existe una
amplia variedad de enzimas hidrolíticas, capa­
ces de degradar lípidos, polisacáridos y proteí­
nas, que cumple un papel fundam ental en la
destrucción de los microorganismos en el ám­
bito del fagolisosoma.
Sistemas microbicidas dependientes
del oxígeno
Durante el proceso fagocítico se produce un
marcado cambio en el manejo del oxígeno por
F ig. 21-7. Proceso de opvsonización de mi-
croom anism os.
parte de las células efectoras. Así, la cantidad
de oxígeno consum ido puede llegar a in cre­
mentarse en 50 veces respecto de los valores
normales. Por otra parte, se produce la metabo­
lización de grandes cantidades de glucosa por
la vía de las hexosas monofosfato, con la consi­
guiente producción de NADPH. Debido al no­
table aumento en el consumo de oxígeno a este
fenómeno se lo conoce con el nombre de “esta­
llido respiratorio”. Sin embargo, a pesar de la
denominación, éste consumo de oxígeno no es
utilizado con fines energéticos por las células
fagocíticas. Más bien el propósito de este siste­
ma es utilizar grandes cantidades de oxígeno
molecular para producir sustancias tóxicas de­
rivadas del oxígeno como el anión superóxido,
peróxido de hidrógeno, radicales hidroxilo,
oxígeno singlete, hipocloritos, cloraminas, etc.,
que se conocen genéricamente con el nombre
de intermediarios reactivos de oxígeno o espe­
cies reactivas del oxígeno.
La producción de todas estas especies reacti­
vas del oxígeno comienza con la activación de
la célula fagocítica por un estímulo apropiado
como puede ser, por ejemplo, una célula “blan­
co” sensibilizada. Lo primero que ocurre es la
activación de una enzima denominada NADPH-
oxidasa. Esta enzima está constituida por subu­
nidades que se encuentran en la membrana ce­
lular y en el citosol. El proceso de activación
enzimática involucra la participación de proteí­
nas G en la transducción de señales, moviliza­
ción de calcio y fosforilaciones, que finalmente
conducen al ensamble de las distintas subunida­
des de la enzima en la superficie celular.
De esta manera, y utilizando el NADPH co­
mo cofactor, es como - a través del oxígeno
molecular como sustrato-, la NADPH-oxidasa
genera la primera especie reactiva del oxígeno,
el anión superóxido (O^) según:
 Mecanismos citotóxicos mediados p o r células
NADPH + 2 0 , 2 O 2 ' + NADP+ + H+
El O f puede generar por dismutación peró­
xido de hidrógeno (H 2 O 2 ), ya sea en forma es­
pontánea o a través de la enzim a superóxido
dismutasa (SOD):
2 O^- + 2H+ O,
Existen diferentes mecanismos fisiológicos a
través de los cuales la potencialidad microbici-
da del li^O^ puede ser incrementada de manera
significativa. Uno de ellos involucra la acción
de las peroxidasas, en particular la mielopero­
xidasa (MPO), que se halla presente en altas
concentraciones en monocitos y en polimorfo­
nucleares neutrófilos. La MPO cataliza la oxi­
dación y halogenación de diferentes estructuras
presentes en los microorganismos, por medio
del HjO^ y los haluros (X“). Los compuestos
responsables de ejercer la acción tóxica serían
los hipohalitos (XO“), formados según:
X ■+ H ,0 , XO- + H p
La potencia microbicida de los hipohalitos
resulta, en la mayor parte de los casos, notable­
mente superior a la del HjOj. Así, en distintos
sistemas desarrollados “in vitro” se ha encon­
trado que la concentración de H^O^ necesaria
para ejercer una acción microbicida determina­
da se reduce en aproximadamente 100 veces,
por la adición de MPO y haluros.
La interacción entre X 0 “ y HjOj es capaz de
producir otra especie agresiva como el oxígeno
singlete ('O^),
CIO- + H ,0 , c r -h H p + 'O 2
Por otra parte el O 2 - puede generar especies
aun más agresivas, como los radicales hidroxilo
(H O ) a través de una serie de reacciones, en las
que participa el hierro como cofactor, y que en
conjunto se denomina reacción de Haber-Weiss
O- H ,0 , ^ O, + HO- + OH-
La relevancia fisiológica de los sistemas mi­
crobicidas dependientes del oxígeno ha sido
385
ampliam ente certificada por numerosos estu­
dios. En tal sentido cabe señalar que los indivi­
duos que padecen la enfermedad granulomato­
sa crónica (ECG), cuya característica principal
es la aparición de infecciones graves y recu­
rrentes, poseen leucocitos incapaces de inducir
el estallido respiratorio. El defecto genético de
estos enfermos se localiza en alguna de las su­
bunidades de la NADPH-oxidasa, de tal m ane­
ra que la enzima no se puede ensam blar ade-
cuadainente. Estos enfermos tienen intactos to­
dos los otros, mecanismos humorales y celula­
res de defensa, pero dan negativa la reducción
del “nitro blue tetrazolium”, una prueba clásica
de la determinación de productos del estallido
respiratorio.
PARTE EXPERIMENTAL
Los métodos usados para medición de cito-
to xicidad celular dependiente de anticuerpo
(CC D A ), citotoxicidad NK, citoto x icid ad T
alogeneica y fagocitosis se describen en el ca­
pítulo 36.
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14, 539-546, 1993
Complemento
RICARDO MARGNI
El sistem a com plem ento es un com plejo
proteico polimolecular, constituido por varias
sustancias, algunas precedidas de precursores,
que se encuentran en el plasm a sanguíneo de
los vertebrados y que desem peñan un papel
importante en distintos tipos de reacciones in­
munológicas. Se lo identifica con C. Dar una
definición correcta de él resulta difícil, ya que
cuando ese complejo se fija sobre un sistema
antígeno-anticuerpo y el determinante antigé­
nico está ubicado en una célula, su efecto es
citocida; en otros tipos de reacciones su acción
es diferente. En las reacciones de inmunohe-
mólisis intervienen todos los factores constitu­
tivos del complemento hasta ahora descriptos,
cosa que no es indispensable en otros tipos
de reacciones en las que el complemento parti­
cipa.
La mayor parte de las definiciones del com ­
plemento son hechas sobre la base de su activi­
dad citolítica, y una de las más claras y com ­
pletas es la propuesta por Mayer, quien lo defi­
ne como “un sistema reaccional citocida que es
activado por complejos antígeno-anticuerpo o
agregados de gammaglobulina o algunos otros
m ateriales” . Con esta definición queda claro
que el efecto citocida es la acción de un siste­
ma activado y no un atributo exclusivo del
complemento tal como se encuentra en el to­
rrente sanguíneo. Este tipo de definición es
preferida porque en el mecanismo a que se ha­
ce referencia intervienen todos los factores
constitutivos del complemento descriptos hasta
el momento.
Además de la intervención directa del com ­
plemento en las reacciones citolíticas específi­
cas, se ha demostrado su participación en otros
mecanismos inmunológicos tales como inmo­
vilización de los treponemas, fenómenos de in­
22
munoadherencia, neutralización de los virus,
fagocitosis y algunas reacciones de hipersensi­
bilidad.
La existencia en el plasma sanguíneo de una
sustancia que respondía a las características del
com plem ento surge a fines del siglo pasado
con los trabajos de Buchner, von. Eodor y Nut-
tal, y fue Bordet quien demostró bacteriólisis in
vitro y comprobó que dicha actividad del inm u­
nosuero desaparecía con el calentamiento y que
era recuperada por la adición de suero fresco
normal. Propuso para dicha sustancia, a la que
consideró sim ilar a la alex in a d escrita por
Buchner, el nombre de complemento, por en­
tender que complementaba la acción del anti­
cuerpo sobre el antígeno.
Ehrlich y M orgenroth demostraron que los
hematíes de carnero y su correspondiente he­
molisina, obtenida por inmunización de cone­
jos con glóbulos rojos de carnero, se combinan
en ausencia y en presencia del complemento.
En el prim er caso hay hem oaglutinación en
tanto que en el segundo se produce la hemóli­
sis, lo que indica la necesidad del complemento
para que se produzca daño celular.
El complemento es un sistema de activación
en cascada y está constituido por numerosos
componentes, lo que habla de su complejidad y
lo dificultoso que ha resultado poner en eviden­
cia los mecanismos de enlace y su secuencia en
la reacción de inmunohemólisis.
La nomenclatura usada para la identificación
de los componentes del complemento es la que
figura en el cuadro 22-1.
El sistema complemento, para ejercer su ac­
ción, debe activarse previam ente, cosa que
puede lograrse por dos mecanismos distintos,
designados como vías de activación “clásica” y
“alterna”.
 Complemento 387

Cuadro 22-1. Nomenclatura recomendada p or la Organización Mundial de la Salud p a ra los

componentes del complemento
1. Al sistem a com plem ento se lo identifica con la letra C y a cada uno de sus com ponentes con el núm ero siguiente a C
(C l, C2, C3, C4, C5, C 6, C7, C8 y C9).
2. Cuando un com ponente o grupos de com ponentes del com plem ento han adquirido activW ad enzim ática u otra actividad
biológica, se los identifica colocando una barra sobre los com ponentes afectados (C l, C42, C567, etc.).
3. Los com ponentes que se enum eran después de E A C denotan un estado de reactividad, pero no necesariam ente su p re­
sencia física. EA C 1423 puede escribirse en form a sim plificada E A C l-3 .
4. Cuando en una reacción algún com ponente de com plejo interm edio pierde su actividad, se lo suprim e. Si C l y C 2 ,
com ponentes del com plejo EA C 1423, se inactivaran, se escribe EA C 4,3.
5. La pérdida de una actividad definida por parte de un com ponente del com plem ento se identifica con la letra i (C 4 i, C2i,
C3i).
6. Los fragm entos resultantes de rupturas peptídicas que aparecen durante la activación del com plem ento se iden tifican
con una letra m inúscula siguiendo al com ponente afectado (C3a, C 3b, C5a, etc.).

Por la primera, el complemento se activa por
agregados de inmunoglobulinas IgG e IgM, ge­
neralm ente presentes en form a de com plejos
Ag-Ac, Si no hay agregación de estas inmuno-
globulinas, que podrían im plicar cambios de
conformación del Fe, no fijan el complemento.
En la vía de activación clásica no todos los
componentes cum plen la mism a función; C l
constituye la unidad de reconocimiento, C2, C3
y C4 las de activación, C5, C6, C7, C8 y C9, el
sistema de ataque a las membranas.
La activación por la vía alterna se consigue
por agregados de IgA (Ag-Ac), polisacáridos y
lipopolisacáridos naturales. Intervienen en este
mecanismo cuatro proteínas, una de las cuales,
C3, es operativa también en la vía clásica. Esas
proteínas son las siguientes: C3, componente B
(B), componente D (D), y properdina (P). Ini­
cialmente al componente B se lo designó C3
proactivador (C3PA) y al D C3, proactivador
convertasa (C3PAasa), nombres éstos ya fuera
de uso. La vía alterna ensambla con la vía clá­
sica a nivel de C3, eludiendo C l, C2 y C4, para
continuar con la activación de C5 a C9.
Existen además, asociadas a este sistema, un
conjunto de proteínas reguladoras y de recepto­
res celulares, que cumplen un papel muy im ­
portante en la funcionalidad del complemento.
VÍA DE ACTIVACIÓN CLÁSICA
En la IgG e IgM los sitios de combinación
con C l están ubicados en el fragmento Fe; el
fragmento F (ab’) 2 carece de actividad fijado­
ra. Se ha demostrado que en la IgG de conejo
el dominio de CH2 (PM 17 kD) es el que está
comprometido en la fijación de C l. m ientras
que el CH3 es inactivo. Asimismo se ha puesto
en evidencia que la (32 m icroglobulina, que
muestra cierta homología con el dominio CH2,
fija C l en forma similar a CH2 y Fe. Con res­
pecto a IgM, se ha comprobado que el dominio
C h3 (PM, 6,8 k p ) es el principal responsable
de la fijación de C L Si bien ios dominios cita^
dos son los comprendidos en la fijación de C l,
la capacidad de fijación total sólo se expresa
cuando el fragmento Fe está intacto,
Componentes del complemento
que intervienen en la vía clásica
El orden de descripción no es el numérico si­
no el que ocupa en la secuencia de activación.
P r im e r co m po n en te (C l)
Es termolábil (56®C 30 minutos) y en el suero
fresco se encuentra en forma de complejo poli-
molecular, el que se mantiene como unidad en
presencia de Ca^^, Complejando este catión es
posible separar por cromatografía en DEAE-ee-
lulosa los tres componentes constitutivos, desig­
nados C lq, C lr y C ls, El complejo polimolecu-
lar C l tiene la composición C lq ,C lr 2 • C ls^, Es­
tos tres componentes se fijan a los complejos de
IgG e IgM en forma reversible.
El componente C lq es la unidad de recono­
cimiento, Su peso molecular es de 410 kD , su
coeficiente de sedimentación 1IS, y su m ovili­
dad electroforética de tipo f l . Su concentración
sérica promedio es de 70 |ig • mi '. Es una de
las proteínas más básicas del organism o; el
19% de sus aminoácidos constitutivos son gli­
cina y un 15% de su masa está constituida por
hidratos de carbono. Es una proteína con se­
cuencias en su molécula similares al colágeno
y está compuesta por seis subunidades de PM
67 kD unidas no covalentemente. Cada subuni­
dad está formada por tres cadenas polipeptídi­
cas ligadas entre sí por uniones di sulfuro. Cada
cadena peptídica tiene aproxim adam ente 200
residuos. De ellos, los 3 a 9 residuos N-termi-
nales no tienen relación con el colágeno, los 78
residuos siguientes son similares a los hallados
en la proteína del colágeno, y los 110 residuos
de la zona C -term inal no están relacionados
con aquella proteína. Las tres zonas colágeno-
símiles de cada subunidad form pían un^ tupie
hélice, y las tres zonas C-terminales. u n a re-
388 Mecanismos efectores de la respuesta inmune

unidas por fibrillas a una estructura central (fig.

22-1). En realidad C lq estaría constituido por
la unión de tres unidades diméricas similares
que responderían a la estructura de la figura
22-2. P or tratam iento con colagenasa, C lq
pierde su capacidad para iniciar la actividad he­
molítica, por ruptura de la estructura fibrilar,
pero no tan rápidamente su capacidad de fija­
ción de IgG agregada, lo que sugiere que la zo­
na globular sería la responsable de la fijación.
Mediante estudios de equilibrio de diálisis se
ha dem ostrado que C lq tiene seis sitios de
combinación, cada uno de ellos con una cons­
tante de asociación 5 x 10^ a 1 X 10^ M '. Cuan­
do C lq interacciona con agregados de IgG, su­
fre cambios conformacionales (C lq).
C lr es una (3-globulina con coeficiente de
sedimentación 7,5 S, un PM de 85 kD y con­
centración sérica aproximada de 35 |lg • m l ’.
Los cambios experimentados por C lq durante
su fijación a los agregados de IgG e IgM indu­
cen cambios en la conformación de C lr hacien­
do que este componente, que se hallaba como
F ig . 22-1. M ic ro s c o p ia e le c tró n ic a d e l c o m p o n e n te . C l q . proenzima, se active (C lr) y adquiera capaci­
( T o m a d a d e Europ. J. Inm unol. 19 7 5 .)
dad para continuar con la cascada de reaccio­
nes que llevan a la lisis. Inicialmente una molé­
cula de C lr es clivada por un mecanismo poco
gión globosa. Al microscopio electrónico, C lq conocido, y esta molécula así activada cliva a
purificado aparece como una estructura consti­ la otra C lr y luego a C ls, la que es un precur­
tuida por seis unidades globosas periféricas sor de una proteasa de serina.
C ls tiene una movilidad electroforética de
a2-globulina, una constante de sedimentación
de 4S y un peso molecular de 85 kD. La con­
centración sérica es de 70 ¡ag-ml''. Está como
proenzima y después de interaccionar con C l f
se transforma en C l“s. Los pesos moleculares
de C ls y Cl's son similares pero, en este último
caso, y como consecuencia de la activación por
CIF, se rompe una unión peptídica y se origi­
nan dos péptidos, que se mantienen unidos por
un puente disulfuro. Por reducción y alquila­
ción es posible su separación. A estos péptidos
se los denomina H (PM, 59 kD) y L (PM, 27
kD). El sitio activo de C l^ está localizado en el
péptido L, lo que ha sido demostrado por la fi­
jación al m ism o de diisopropil-fM or-fosfato
(DEP) y por la capacidad para complejarse con
Cl-inhibidor (Clinh). Además del DEP, los és­
teres fosfonados inhiben la acción enzimática
de C ls’. La actividad esterásiea de este compo­
nente puede ponerse en evidencia haciéndolo
reaccionar con TAMe (éster metílico de p-to-
luensulfonil arginina) o ATEe (éster etílico de
N-acetil L-tirosina) y midiendo la cantidad de
aminoácido liberado.
COO; 110 78 _2:í ^ nh3 El componente C l, constituido por las tres
-colágeno sim ili- - no colágeno simili - subunidades indicadas (C lq , C lr, C ls), tiene
un coeficiente de sedimentación de 18S, un pe­
F ig . 22-2. E s tru c tu ra d e C l q {Porter R. R.: B iochem istry so molecular de 750 kD y se mantiene como tal
o f com plem ent. L a R ic h e rc a 7 :1 9 1 , 1977). en presencia de Ca^+.

C ua rto co m po n en te (C 4 )
Es una p-globulina identificada electrofo-
réticamente como (31E. Su coeficiente de sedi­
mentación es IOS, y su peso molecular, 200
kD. Contiene 14% de hidratos de carbono y su
concentración sérica es de 400 |ag • m i E s
termoestable y por acción de C ls sufre m odi­
ficaciones en su actividad y propiedades fisi­
coquímicas. Es inactivado por hidrazina, am i­
nas primarias, amoníaco y éter. Está formado
por tres cadenas polipeptídicas: a (PM , 93
kD), p (PM, 78 kD) y y (PM, 33 kD), hgadas
entre sí por uniones disulfuro y fuerzas no co­
valentes.
C4 es sintetizado como un precursor consti­
tuido por una cadena simple, el que previa se­
creción al plasma sanguíneo es clivado en las
tres cadenas peptídicas indicadas (fig. 22-3).
Cuando C ls actúa sobre C4 d iv a un peque­
ño péptido de la cadena a (PM, 6 kD) al que se
identifica como C4a y expone un sitio de unión
lábil (C4b). Se especula con que la cadena y
podría intervenir en la un ió n jle C4 y C2 para
formar la C42 convertasa (C42).
S egundo co m po n en te (C 2 )
Pl^globulina de PM 117 kD y coeficiente de
sedimentación 5,5S. El parahidroximercuriben-
zoato o el paracloromercuribenzoato^jiisminu-
yen su actividad. El complejo EAC142 que se
Componente del Precursor
complemento (endocitoplasmático)
C4
C3
C5
Fig. 22-3. E structura esquem ática de ios precursores citoplasm áticos y productos secretados al plasm a sanguíneo d e los
com ponentes deí com plem ento C4, C3 y C5,
Complemento 389
forma durante la activación es lábil y su activi­
dad disminuye con el tiempo. Su vida m edia es
de 10 minutos a 37°C, pero se prolonga a 150-
200 minutos si C2 es previamente tratado con
iodo en presencia de ioduro de potasio. Se pre­
sume que ello es consecuencia de la oxidación
de algún grupo crítico existente en la molécula,
probablemente un grupo sulfhidrilo. El C2 oxi­
dado no es inactivado por el paracloromercuri-
benzoato, pero sí por algunos agentes reducto­
res como la ditionita sódica.
Su concentración sérica es de 30 |ig ■rah'.
T e r c e r c o m p o n e n te (C3)
Es una globulina termoestable a la que por
su movilidad electroforética se identifica como
p i e , con un coeficiente de sedim entación de
9,5S. Por envejecimiento se modifica transfor­
mándose en plA , con coeficiente de sedim en­
tación 7S. Su peso molecular aproximado es de
195 kD y su molécula contiene 2,7% de hidra­
tos de carbono. Su concentración sérica es de
1.400 (xg-ml-'.
Estructuralmente está constituido por dos ca­
denas polipeptídicas, a (PM, 120 kD) y P (PM,
75 kD), unidas por puentes disulfuro. Al igual
que C4, éstas se originan por_clivaje de un pre­
cursor (fig. 22-3). Cuando C42 actúa sobre C3,
de la cadena a se separa un péptido (C3a) con
actividad anafilotóxica y C3b, el cual se asocia
con la enzim a que lo activó o rig inan d o un
Producto final
(sérico)
a (93 kD)
p (78 kD)
y (33 kD)
a (120 kD)
(3 (75 kD)
a (124 kD)
|3(76 kD)
390 Mecanismos efectores de la respuesta inmune

complejo trimolecular (C423) llamado C5 con­ Tioéster

vertasa. S - C=0
El fragmento C3a está formado por los últi­ _l_____ I_____
mos 77 residuos de la cadena a y constituye el
40-45% de la estructura a-helicoidal de la mo­
lécula entera. Se conoce su secuencia primaria.
Su peso molecular es de 9 kD y la movilidad OR
electroforética es de a l . Mediante el empleo de
agentes reductores y desnaturalizantes se ha
dem ostrado que la estructura a-helicoidal es C3a C3b
indispensable para su actividad biológica, de (C3a -I- C3b)
igual modo que la arginina C-terminal, ya que
C3a pierde actividad cuando es tratado con car- OR
boxipeptidasa B, la que separa a dicho aminoá­ ^H(|: = 0
cido de la cadena polipeptídica.
C3b tiene un peso molecular de 185 kD y está C3bi
formado por dos cadenas polipeptídicas: a , PM
110 kD y P, PM 75 kD ügadas por uniones disul­
furo. En la cadena a existe un tioéster que juega OR
un papel fundamental en la fijación de C3b a
membranas. Un hecho similar ocurre en C4. SHC = 0
C3d,g
La fijación de C3 y C4 a membrana es de ti­
po covalente. Cuando C3b se inactiva se trans­
forma en C3bi, que se origina por ruptura de la
cadena a en dos péptidos de PM 67 kD y 43
kD respectivamente, los que se mantienen uni­ C3c
dos a la cadena |3 por las uniones disulfuro ori­
ginales. Al escindirse del péptido de 67 kD un OR
fragmento de PM 40 kD (C3d, g), se origina SH C = 0
C3c (P,A). C3dg da origen, por escisión a C3d , — I-------, (C3d -I- C3g)
(a^D) (30 kD) y C3g (10 kD). Por degradación C3g C3d
de C3c se forma un pequeño fragmento acídico
al que se lo denomina C3e (fig. 22-4). F ig . 22-4. Productos de clivaje obtenidos a partir de C3
En la figura 22-5 pueden observarse los pa­ (para detalles véase el texto). Las flechas indican los p u n ­
tos de ruptura.
trones inmunoelectroforéticos con-espondientes
a los productos de conversión de algunos de los
componentes del sistema complemento.
S e x to c o m p o n e n te (C6)
Q u in to c o m p o n e n te (C5)
Se comporta como una Pglobulina de despla­
Es una pjglobulina relativamente termolábil, zamiento electroforético lento (p2), y al igual
la que por su movilidad electroforética se iden­ que C7 y C9 está formado por una sola cadena
tifica como Pjp. Su coeficiente de sedimenta­ peptídica. Tiene un coeficiente de sedimenta­
ción es 8,78 y su peso molecular 200 kD. Con­ ción 5-6S y un peso molecular de aproximada­
tiene 19% de hidratos de carbono y su concen­ mente 130 kD. Su concentración sérica prome­
tración sérica es de 160 |xg • mi '. dio es de 75 |Tg ■m i '.
Es sintetizado com o precu rso r de cadena
simple y está constituido por dos cadenas pep­ S é p tim o c o m p o n e n te (C7)
tídicas resultantes de su escisión. La cadena a ,
PM, 124 kD, y la p, PM, 76 kD. A diferencia Es termoestable, con movilidad electroforéti­
de C3 y C4, no posee tioéster en la cadena a. ca de pjglobulina y coeficiente de sedimenta­
Cuando sobre C5 actúa la C5 convertasa, se ción 5-6S. Su peso molecular se aproxima a los
escinde un pequeño péptido (C5a), de PM 12 120 k D . La concentración sérica promedio es
kD con actividad anafilotóxica similar a la de de 65 |J.g ■m i '.
C3a. Es distinta a esta última, lo que queda de­
mostrado por su capacidad para contraer un tro­ O c ta v o c o m p o n e n te (C8)
zo de músculo liso previamente transformado
en no reactivo por agotamiento con la anafiloto^ Tiene un peso molecular de 155 kD, un coe­
xina C3a. El resto de la molécula (C5b) inter­ ficiente de sedim entación 8S y la movilidad
viene en la formación del complejo citolítico, electroforética es de p-globulina. Es relativa-
 Complemento 391

Fig. 22-5. P a tro n e s in-

m u n o electro fo rético s de C3 Convelías Proteasa
' C3c + C3d
los productos de conver­ (p1-C)
(p1-A)(a2-D)
s ió n d e a lg u n o s de los
c o m p o n e n te s d e l c o m ­
plem ento. El hallazgo de ^Suero fresco
productos de conversión
A C3 nativo C3
en el suero fresco es una
e v id e n c ia s ig n ific a tiv a
(no activado) (+) (-)
d e ac tiv ac ió n in v ivo y
g en e ra lm e n te p rece d e a
B Conversión fA NTI-C3
d escen so s significativos
parcial
d etecta d o s p o r m étodos
(activación)
cuantitativos.
C Conversión C3c
completa
(activación
total)

inactivador de
C4 —
(131-E)
^ C 4 a .C 4 b - - - i^ S
..Suero fresco
D No activado

(+) (-)
- ANTI-C4

E Activado C4bi C4 O

FRAGMENTO (Ba)
^ PEPTÍDICO
Bb
(y) .Suero fresco

F No activado
(+) {-)
ANTI-B

G Activado

mente termolábil. Su concentración en el to­ El cuadro 22-2 contiene las características

rrente sanguíneo es de aproxim adam ente 80
|ig • m i ‘.
Está formado por tres subunidades, dos de
ellas (cadena a , PM, 77 kD y cadena y, PM, 13
kD) unidas covalentemente por puente disulfu­
ro, y una de éstas asociada no covalentemente a
la tercera cadena peptídica (cadena (3, PM, 63
kD).
N o v e n o c o m p o n e n te (C9)
Ha sido aislado en un gran estado de pureza.
Tiene un PM de 79 kD y coeficiente de sedi­
mentación 4,5S. Su m ovilidad electroforética
es de a2globulina. En el suero sanguíneo está
presente en concentraciones de 200 \ig ■ml‘‘.
más sobresalientes de los diferentes componen­
tes del complemento.
Cinética de la inmunohemólisis por acción
del complemento activado por la v ía clásica
Los estudios que han llevado al aislamiento
y purificación de los diferentes com ponentes
del complemento y a la demostración de la ac­
tividad enzimática de algunos de los complejos
formados han permitido considerar que el m e­
canismo de la lisis de los glóbulos rojos de car­
nero sensibilizados con hemolisina anticamero,
cuando sobre ellos actúan los componentes del
complemento activados por la vía clásica es el
indicado en la fig. 22-5bis.
392 Mecanismos efectores de la respuesta inmune
C2d
EAC1423567
+ condiciones, en tanto que SA significa la sensi­
C8
EAC14235678
(daño parcial)
E* + 0°C
LISIS — EAC142356789 -C 9
(hemoglobina, (poros en la
nucleótidos, membrana del
aminoácidos, eritrocito)
potasio, restos
celulares)
F ig . 22-5bis. Esquem a de la activación del com plem ento
p o r la vía clásica.
Para su mejor interpretación se estudiará ca­
da una de las etapas por separado y se discuti­
rán las causas de la inmunohemóhsis.
E t a p a p r e l im in a r
Si bien la fijación de la hemolisina a los gló­
bulos rojos ocurre de una manera simple y sin
inconvenientes en condiciones norm ales, no
hay que olvidar que todas las hemolisinas no
tienen el mismo comportamiento. La curva de
la actividad hemolítica del anticuerpo depende
del antígeno usado en la inmunización -glóbu­
los rojos enteros o estroma celular- y de la po­
sibilidad de la transferencia de moléculas de an­
ticuerpo de sitio a sitio reactivo en un hematíe o
de célula a célula, como se verá más adelante.
En los glóbulos rojos de carnero existen por
célula, aproxim adam ente 5.000 sitios F orss­
man o sitios capaces de interaccionar con el an­
ticuerpo anti-hematíe, y en condiciones ópti­
mas de sensibilización se añaden 1.000 m olé­
culas de anticuerpos por hematíe. De acuerdo
con cálculos efectuados, cada sitio Forssman
de un hematíe debería reaccionar con 2 molé­
culas de anticuerpo de tipo IgG o I molécula
del tipo IgM para fijar el complemento. Si lla­
mamos S al sitio y A al anticuerpo, la esque­
matización sería SA^ y SA, respectivamente.
Sin em bargo, esta hipótesis no se apoya en
pruebas directas y, por este motivo, la combi­
nación de un sitio Forssman de un glóbulo rojo
de camero con la hemolisina se representa
S + A- -^SA
Existiendo en los hematíes numerosos sitios
S, cuando se encuentran en el estado anterior se
los representa
E - h A ----- >EA
EA significa hematíe sensibilizado que pue­
de tener uno o varios sitios Forssman en esas
bilización específica de un solo sitio Forssman.
P r im e r a eta pa
A 0°C, en presencia de Ca^+ y ausencia de
Mg^+ los hematíes sensibilizados fijan C l y C4:
_
EA + C — » E A C 1 4
Ca2+
E sta etapa es ráp id a -a lg u n o s m inutos a
37°C- y va seguida, en presencia de Mg^^, de la
fijación de C2. Si la reacción se hace a 0°C y
en ausencia de Mg^^ (suero previamente tratado
con resinas de intercambio iónico), esta última
fracción_no se l'ija y se obtienen células al esta­
do EAC 14, estables a 0°C y aun a 37°C.
Si bien la descripta es la forma simplificada
de la primera etapa, ella es algo más compleja:
a) Como ya hemos visto el componente del
com plem ento que se fija a los com plejos de
IgG e IgM es C lq . Como consecuencia de esa
fijación, C lq sufre un cambio de conformación
crítico, el que a su vez induce un cambio en la
conformación de C lr. Por este mecanismo la
proenzima adquiere actividad enzimática (C lr)
a través de la cual C ls (proenzima) se convier­
te en C ls, enzima con actividad de serina este-
rasa. En realidad, el complejo C lq rs formado
no es equimolecular sino que responde a la es­
tructura Clqr^s^.
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C1q + C1r + C1s
 Complemento 393

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394 Mecanismos efectores de la respuesta inmune

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 Complemento 395

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396 Mecanismos efectores de la respuesta inmune

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 Complemento 397

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398 Mecanismos efectores de la respuesta inmune

Durante esta conversión, por ruptura de una En presencia de Mg^^ se forma EAC14b2b
unión peptídica en Cl s, se originan las cadenas siendo esta conversión rápida a 37“C y lenta a
H y L, estando localizado el sitio activo en esta 0“C. En el sobrenadante de la reacción puede
última. U sando DFP m arcado con se de­ aparecer un derivado inactivo de C2, el C2i.
mostró que una sola molécula del inhibidor de
serina esterasa se fija por molécula de C ls, y
que ello ocurre en la cadena L. El péptido mar­ E A C l 4b2b
cado fue secuenciado y se encontró que el sitio
(C onvertasa de C3)
activo era similar al de otras serinas esterasas
com o la tripsina, quim otripsina, trom bina y
plasmina. _ ___
T ratando EAC 14 o EAC 142 con EDTA o
diaminas alifáticas de 3 a 8 átomos de carbono, La vida media de EAC 14b2b es muy corta a
en especial 1-4 butano diamina-, es posible se­ 37“C, aproximadam ente 10 minutos, y de 10
parar C l con actividad esterásiea, la que se h o ras a 0 “C. L a e sta b ilid a d del co m p lejo
mantiene a pH 3,3, perdiendo en cambio, en EAC 14b2b depende de la temperatura y ello se
esas condiciones, su capacidad para fijarse a debe a la reversibilidad de la reacción:
EA. Ello se debe a que en el complejo macro­
molecular existen productos que poseen activi­ EAC14b2b ^ EAC 14b -i- C2d
dad diferente, relacionados con C ls y C lq res­
pectivamente. C2d, que es hemolíticamente inactivo, se h a­
b) Inmediatamente después, C l actúa sobre lla en el sobrenadante y puede ser investigado
C4 y C2 activando sitios de unión lábiles en con anticuerpos específicos. Una vez liberado
ambas moléculas, lo que perm ite la unión de del complejo, C2d no vuelve a fijarse.
C2 a C4 formando un complejo C42, el que se Para que C2 se fije a los glóbulos rojos sen­
fija a EA originando EAC 142. Cuando C l ata­ sibilizados (EA) es necesaria la presencia de
ca a C4, libera a partir de sus cadenas a un pe­ C l y la activación previa de C4, la que a su vez
queño péptido de PM 6 kD, denominado C4a, es dependiente de C l. El complejo C4b2b ad­
con actividad algo similar a la de C3a. El resto quiere actividad convertásica catalizando la ac­
de la molécula constituye C4b. La acción de tivación de C3. La actividad de C ls sobre C2
C ls sobre C2 da origen a C2b y C2a, siendo el es más efectiva si éste se ha fijado previamente
primero de ellos el que participa en la secuen­ a C4b.
cia de activación del sistema complemento, y
C2a el pequeño fragmento peptídico que se li­ S e g u n d a e t a p a
bera.
Es im portante hacer notar que hasta hace Para la fijación de C4 y C2 es necesaria la
muy poco, la nomenclatura correspondiente a presencia de C l. El componente C3 no lo nece­
los fragmentos de escisión de C2 estaba inver­ sita; por acción de la C3 convertasa (C4b2b) es
tida, y se designaba C2a al fragmento que al escindido, y parte de él adquiere capacidad pa­
unirse a C4b da origen a la convertasa de C3, y ra fijarse a receptores de la membrana de los
C2b al pequeño péptido que se libera. Esta ,mo­ eritrocitos. Durante el clivado, a partir de la ca­
dificación introducida tiene por objeto identifi­ dena a se forma C3a (anafilotoxina) constitu­
car con el mismo subíndice (b) a todos los frag­ yendo el resto de la molécula C3b, el que en su
mentos que participan en la activación del sis­ forma naciente se une a la enzima que sirvió
tem a complemento, y con el subíndice (a) a los para su activación originando un complejo tri-
pequeños fragmentos peptídicos escindidos. La molecular (EAC14b2b3b) que tiene capacidad
nomenclatura incluida en el texto corresponde para convertir a C5 (C5 convertasa). Hay estu­
a la modificación usada actualmente. dios que demuestran que este complejo, en for­
Para que ocurra la activación de C4 no es ne­ ma relativamente estable y con actividad con­
cesaria la presencia de Mg^+, y ella se produce vertásica de C5, puede formarse además en la
rápidamente, en 1 a 2 minutos a 37°C. Durante la fase Huida. Su coeficiente de sedimentación es
formación de EAC 14b, una fracción de C4 deno­ de 15S.
minada C4i puede aparecer en el sobrenadante.
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eaIc T i ■ E A C l 4b
E A C l 4b2b3b
(C onvertasa de C.5)

C4*

‘ C4i
C4

El C3b libre en la fase fluida se inactiva rá­
pidam ente, transform ándose en C3i. Sólo un
10% del C3 activado se fija a la célula. Un solo
complejo EAC14b2b puede activar numerosas
moléculas de C3.
La convertasa de C5 tiene actividad peptidá-
sica, la que se pone de manifiesto por su capa­
cidad para desdoblar dipéptidos en que uno de
sus aminoácidos constitutivos es aromático, co­
mo glicil-tirosina. Éstos pueden inhibir la lisis
de EAC14b2b3b si son adicionados previamen­
te al agregado de los restantes componentes del
complemento.
T ercera eta pa
El ataque de C5 por EAC14b2b3b inicia el
proceso de autoensamblado por el cual, y sin
ninguna otra acción enzim ática, se form a el
complejo estable de C5b-9. Inicialm ente C5
se une a C3b fijado a m em branas y en esas
condiciones sufre sutiles cambios conform a­
cionales que lo hacen accesible a la acción de
las convertasas de C5. Si no está fijado a C3b,
en condiciones fisiológicas C5 no es clivado
por las enzimas. La C5 convertasa escinde de
C5 un pequeño péptido, C5a, con actividad
anafilotóxica, que al igual que C3a tiene un
alto contenido de estructura a-helicoidal, uno
de los requerim ientos para su actividad bioló­
gica. El resto de la molécula, C5b, es el que
form a con los co m p o n en te s te rm in a le s el
complejo estable con capacidad para producir
el daño. En la fase fluida el complejo C5b-9
se acumula en su form a inactiva. Ha sido ais­
lado de sueros activados, siendo su peso m o­
lecular de 1.000 kD , el coeficiente de sed i­
mentación 23S y su movilidad electroforética
de aglobulina. Las uniones de este complejo
no son covalentes, lo que ha perm itido, por
electroforesis en geles. adicionados de dodecil
sulfato de sodio, lograr su separación. Se han
obtenido siete bandas, las que por análisis an­
tigénico y peso m olecular corresponden, se­
gún la posición que ocupan las bandas: (1)
C5b (PM, 170 kD); (2) C7 (PM, 120 kD); (3)
C6 (PM, 95 kD); (4) C8 (PM, 93 kD); (5) des­
conocido (PM, 88 kD); (6) C9 (PM, 79 kD) y
(7) C8 (PM, 70 kD). Las bandas (4) y (7) re­
presentan dos subunidades de C8, unidas no
covalentemente, las que también han sido h a­
lladas en el C8 nativo y a las que se denomina
C 8 a y C8j3. La banda (5) inicialmente no fué
identificada con ninguna otra proteína conoci­
da y podría constituir un nuevo com ponente
del complemento; actualmente se sabe que es
un inhibidor del complejo C5b-9. Los com po­
nentes C5b, C6, C7 y C8 están presentes en
concentraciones equim oleculares, en tanto que
C9 lo está en una proporción mayor.
Complemento 399
C uando EAC14b2b3b d iv a a C5, el fra g ­
mento naciente C5b, que sirve como centro fo­
cal de ataque a la membrana por parte del com ­
plejo, expone sitios que le permiten la fijación
de C6 y C l. C6 tiene actividad de serina estera-
sa y muy probablemente C5 constituya su sus­
trato. C5b se une a C6 originando un interm e­
diario inestable EAC14b2b3b5b6, el que al fi­
ja r C l se estabiliza (EA C 14b2b3b5b67). El
complejo trimolecular C5b67 aumenta su afini­
dad por las superficies lipofílicas y su inserción
en las membranas probablemente se deba a que
en C l existen sitios ocultos de unión a aqué­
llas, de carácter hidrofóbico. La especificidad
de las células de fijar C8 se inhibe si C5, C 6 y
C7 son adicionados juntamente con suero anti-
C5, lo que demuestra su activa participación en
el proceso.
E A C l I4 b 2 b 3 b i- =*► E A C l 4b2b3b5b
1_____ L^
E A C l 4 b 2 b 3 b l5 b i = ► E A C l 4 b2b3b5b67
C 6 , C7 C (567)i
C8 se fija sobre las células que han adquiri­
do el estado anterior.
E A C l 4 b 2 b 3 b l5 b 6 7 | E A C l 4 b 2b3b5b678
i------ (
Se ha demostrado que la interacción de C5b7
con C8 tiene lugar a través de la cadena C8)3, a
la que sigue la fijación de C9. Que la participa­
ción de C8 es indispensable para la fijación de
C9, puede ponerse en evidencia mediante la in­
hibición de la reacción por el añadido de suero
anti-C8. El daño en las células es inidado por
el C8 fijado y que en la elaboración del canal
transm em bránico que lleva a la lisis celu lar
participa C9. C8 actuaría como una fosfolipasa.
E A C l 4b2b3b5b678 E A C ! 4b2b3b5b6789
Un efecto similar al logrado por e l añadido
de C9 se consigue con la adición de quelantes
de iones F e^+ , como la 1 - 1 0 fenantrolina o l a
bipiridina. La acción de C9 es inhibida p o r los
iones Fe^'*’. Todo parecería indicar que C 9 po­
dría actuar de una manera similar a los quelan­
tes en su mecanismo de activación sobre C8 fi­
jado a células.
400 Mecanismos efectores de ¡a respuesta inmune

Con posterioridad a la fijación del últim o
com ponente del com plem ento ocurren en la
membrana celular una serie de cambios que en
definitiva llevan a la lisis.
C9 contiene dominios hidrobóficos ocultos y
cuando interacciona con C5b-8 polim eriza y
forma estructuras tubulares de carácter anfifíli-
co, las que dan origen a los canales transmem-
bránicos que llevan al daño celular. C5b-8 pro­
mueve la inserción de C9 en el centro hidrocar­
bonado de la membrana, favoreciendo su acce­
so a la bicapa lipídica. Durante este proceso,
C9 polim eriza aumentando su estructura P y
exponiendo neoantígenos C9 específicos. Los
grupos hidrofóbicos se unen a la membrana y
originan un canal central de pasaje de carácter
hidrofílico. El diámetro del canal varía según el
número de moléculas de C9 que polimerizaron.
Se han descrito polímeros con 2, 3, 6, 10, 12 y
16 moléculas de C9, las que incrementarían el
diámetro de los canales transmembránicos ori­
ginados (fig. 22-6). Es a través de esos canales
que los eritrocitos pierden hemoglobina, pota­
sio, nucléotidos, aminoácidos, etc., pérdida ésta
que puede ser bloqueada por albúmina bovina
al 25%, lo que supone la implicancia de una re­
gulación osmótica.
Un hecho interesante ha surgido al analizar
los productos originados por el ataque vía com­
plemento de las membranas de macrófagos y
polimorfonucleares neutrófilos. Cuando la le­
sión de la membrana se produce, hay activa-^
ción de fosfolipasa celular, que inicia el meca­
nismo que lleva a la liberación de prostaglandi­
nas, tromboxanos, hidroxiderivados e hidrope-
roxiderivados del ácido eicosatetraenoico (HE­
TE y HPETEs), leucotrienos y otros productos.
Esto pone en evidencia que además de la ac­
ción inflamatoria de C3a y C5a, ya conocida, el
ataque a membranas por los componentes ter­
minales de la secuencia de activación del com­
plemento inicia el mecanismo inflamatorio ba­
sado en la liberación de ácido araquidónico a
partir de los fosfolípidos de membrana. H^asta
el momento no se tenía conocimiento de que el
ataque a membranas por los componentes ter­
minales del complemento mediaran la libera­
ción de productos que participan en los fenó­
menos de hipersensibilidad inmediata y de la
inflamación (véanse caps. 23 y 32).

C 5 b -8 C 5 b -9 (C 5b-8 ) C 9 n

a)

r.fi re f'Q -------

C5b C6
b)

C8 C7
C9 Qg C9

c)

F ig . 22-6. Representación esquem ática de los poros que se form an en la m em brana de los eritrocitos durante la lisis m e­
diada por com plem ento.
a) Inserción del com plejo C5b-8 en la m em brana celular y fijación posterior de C9. Inicialm ente hay desplegam iento y
activación de C9, seguida de polim erización y form ación com pleta del tubo al participar en el suceso nuevas m oléculas
d e C9.
b) F orm ación del canal transm em bránico, que aum enta su diám etro en función de las m oléculas de C9 que participan.
c) Esquem a de los productos que se observan al m icroscopio electrónico cuando la m em brana de un eritrocito es atacada
por el sistem a com plem ento: I - poros de un trozo de m em brana atacada por com plem ento; II - corte longitudinal de la
m em brana en la zona correspondiente a un poro, donde se observa una form ación infundibuliform e.

La figura 22-7 esquematiza la activación del
sistema complemento por la vía clásica.
Recientemente se ha demostrado que, cuan­
do la proteína fijadora de mañosa (MBP: mari­
nóse binding protein), presente en varios verte­
brados, fija a través de sus dominios de lee ti na-
dpo C estru ctu ras con m añosa o acetilglu-
cosamina presentes en la superficie de varios
p atógenos (b acterias, viru s), se activa una
proenzima denominada (M AS? (MBP-associ-
a ted serin e-p ro tea se). La enzim a a c tiv ad a
actúa sobre C4 y C2 originando C4b y C2d,
poniendo en marcha, de esta manera, la acti­
vación del complemento por la vía clásica sin
la participación de anticuerpos.
VÍA DE A C T IV A C IÓ N A LTERNA
D EL C O M PL E M E N T O
El conocim iento del mecanismo de acción
de la vía alterna, caracterizado por la activación
de C3-9 sin la participación de C142, es recien­
te. Hace ya varios años Pillemer y col. demos­
traron que una proteína sérica llamada proper­
dina (P), en presencia de Mg^+, un factor A hi-
drazina sensible, un factor B termolábil y una
fracción euglobulínica del suero, tenía capaci­
dad para reaccionar con extractos de pared ce­
lular de levadura de cerveza (zimosán) y origi­
nar a 17°C un com plejo capaz de in activ ar
C3-9 a 37°C. Teniendo en cuenta que las carac­
terísticas de los tres factores descritos eran se­
mejantes a las de C4, C2 y C l, se sostuvo que
ello no era más que una reacción clásica de
inactivación de C y que probablemente debía
ocurrir como consecuencia de una interacción
previa del zimosán con anticuerpos naturales.
Posteriormente se demostró que lipopolisacári­
dos bacterianos, al interaccionar con sueros
frescos, inactivaban C3-9 sin consumos apre­
ciables de C l, C2 y C4.
El hecho que sirvió para interpretar este m e­
canismo de acción fue el hallazgo del factor B
o C3PA, descubierto al explorar, no el sistema
de la properdina, sino el mecanismo por el cual
un factor obtenido del veneno de cobra (CVF)
inactivaba a C3. Las aparentes relaciones entre
C3PA o B con el sistema de la properdina han
permitido formular hipótesis sobre el funciona­
miento de la vía alterna.
Si bien hasta hace muy poco existían contro­
versias sobre el mecanismo inicial de la activa­
ción del sistema complemento por la vía alter­
na, en estos momentos el hecho está aclarado.
Durante cierto tiempo se sostuvo que ello era
consecuencia de que sustancias llamadas facto­
res de iniciación (FI), al activarse con ciertos
productos se transformaban en FI el que, al fi­
jarse sobre m em branas celulares, funcionaba
Complemento 401
como unidad de reconocimiento, iniciando el
m ecanismo. Entre esas sustancias activadoras
figuraban especialm ente los lipopolisacáridos
de la pared celular de bacilos gramnegativos.
Actualmente, la existencia de los factores de
iniciación ha sido descartada, y se sabe que la
reacción se pone en marcha por intermedio de
los activadores de superficie (receptores), m o­
léculas particulares generalmente cargadas po­
sitivamente, ricas en grupos OH y muy pobres
en ácido siálico, existentes en membranas celu­
lares, que facilitarían la formación de interm e­
diarios más estables. E ntre esas sustancias,
además de los lipopolisacáridos señalados, fi­
guran productos de la pared celular de levadu­
ras (zimosán), polisacáridos complejos, inulina,
etc., probablemente sin la participación de in­
munoglobulinas. La fijación de C % a esas m o­
léculas lo vuelve menos accesible a la degrada­
ción por los factores I y H.
La remoción de ácido siálico de membranas
disminuye la fijación de H a C3b unido a m em ­
brana y favorece la activación del complemen­
to por la vía alterna. Membranas pobres en áci­
do siálico son buenas activadoras del com ple­
mento por esta vía, como ocurre con los eritro­
citos de conejo. No acontece lo mismo con los
glóbulos rojos de carnero pues sus membranas
tienen un alto contenido de ácido siálico.
El empleo de sueros deficientes en C2, que
carecen de la posibilidad de originar C3b p o r la
vía clásica, ha demostrado que la IgA e IgE hu­
manas y la IgG l de cobayo agregadas bajo la
forma de complejos Ag-Ac o por medios físi­
cos o químicos son también sustancias capaces
de iniciar la activación del complemento por la
vía alterna. Cosa similar ocurre con los agrega­
dos insolubles de IgG.
Las unidades de activación, que llevan final­
mente a la elaboración de la convertasa de C5
de la vía alterna, son las que luego hacen posi­
ble la participación de las unidades de ataque a
las membranas, las mismas que actúan cuando
la activación ocurre por la vía clásica.
Para que la activación de la vía alterna tenga
lugar se requieren cuatro proteínas. Por un me­
canismo no específico C3 nativo y eí factor B
forman un complejo reversible que puede ser
activado por el factor D en presencia de
Como consecuencia de ello se forma C 3B o
C3Bb, enzima que inicia el clivado de C3 dan­
do lugar a la formación de pequeñas cantidades
de C3b el que, si no está protegido, es inactiva­
do por el factor I transformándose en C3bi. Por
acción de proteasas C3b se desdobla en C3c y
C3d. Una proteína sérica conocida como H al
fijarse competitivamente a C3b desaloja a Bb y
facilita la actividad olivante de I.
La segunda etapa requiere que el C 3b na­
ciente se fije a un activador presente en una su­
402 Mecanismos efectores de la respuesta inmune
perficie. Una molécula de C3b puede unirse a la
membrana de la célula o volcarse a la fase flui­
da. Cuando el C3b está unido a membrana fija
el factor B, el que después de la fijación se
vuelve susceptible de ser clivado por el factor D
y Mg2+ originándose C3bB o C3bBb, converta­
sa de C3 y C5 lábil, de rápida inactivación. Para
que esta enzima funcione eficazmente se nece­
sitan no menos de 2 moléculas de C3b unidas a
la superficie celular, ubicadas en forma adecua­
da y ^ probable que críticam ente alineadas
(C3bnB o C3bnBb) (Sitio 1). La vida media de
esta enzim a es muy corta, sólo 2 m inutos a
37°C, de ahí se infiere su reducida eficacia.
Los estudios llevados a cabo con tioéster de­
rivados de C3b son los que han perm itido a
Müller-Eberhard estimar cuál debe ser el meca­
C ir C ir
C ls
Anticuerpo li Fe
Antígeno
IVIembrana eritrocítaria
C4a
ETAPA: C1 + C4 + ■■ V - C4b
CT + C4b + C2 J !'? L c 4 b 2 b
Fig. 22-7. R epresentación gráfica de la cinética de la inm unohem ólisis por acción del com plem ento (vía clásica).
nismo por el que C3 nativo se une a B para for­
mar C3B o C3Bb. Ello se debería a que C3 na­
tivo fijaría agua en la fase fluida y al hacerlo
adquiriría una estructura similar a la de C3b fi­
jado a receptor. La cadena P de C3b, protegida
por la cadena a , estaría bajo una forma metaes-
table, la que se estabilizaría al unirse a un re­
ceptor en la fase sólida, posibilitando de esa
manera su unión al factor B. La unión de C3b a
la fase sóhda se hace a través de tioéster hidra­
tado de la cadena y grupos OH de los hidratos
de carbono o grupos NH2 de proteínas de la su­
perficie receptora. Esta unión de tipo covalente
no es específica (fig. 22-8).
Para que el factor B pueda transformarse en
Bb y participar en el mecanismo de activación
de C3 es necesaria la presencia de iones Mg^+ y
1^ ETAPA: EA + C1q + C1r + C1s CT
 Complemento 403

C6
C 3a C3
C3a O
C6 A
C3 / C7
C3b

C3b [p c f

! ETAPA: C5b + C6 + C7 — ^ C5b67

3® ETAPA: C4b2b + C3 C4b2b3b

C5
OC5a
! ETAPA: C5b67 + C8 —»^C5b678

C9

nC7
48 ETAPA: C4b2b3b + C5 — ► C5b K+, Hb.
C 5bl

poli C9
_i|j^
IN a * . HjO
Fig. 22-7. Continuación.
7® ETAPA: C5b678 + nC9 C5b-C9n -» > |l i SIS|

Caída a forma
inactiva

Cisteína

Ácido
glutámico

Membrana

F ig . 22-8. M ecanism o de fijación de C3b a m em brana a través del tioéster activado de la cadena a.
404 Mecanismos efectores de la respuesta inmune
del factor D. Éste es una serina esterasa capaz
de ser inhibida por el DFP. La enzima (D) tiene
un precursor inactivo (D) que no es afectado,
por el DFP. Su peso molecular es de 25 kD y
está formada por una cadena peptídica simple.
La form a inactiva puede activarse por trata­
miento con pepsina. Ambas formas de la enzi­
ma están presentes en el suero conjuntamente.
El factor D que es olivante y activante del fac­
tor B (PM, 95 kD y movilidad [3) le escinde a
éste un pequeño péptido acídico llamado frag­
mento Ba, de PM, 30 kD y movilidad a , y libe­
ra el factor Bb de PM, 63 kD y movilidad y.
El fragmento Ba, que no participa en la acti­
vación del complemento por la vía alterna, es
un péptido difusible que posee una muy discre­
ta capacidad para inducir co n tractu ra de la
musculatura hsa.
A esta altura de la secuencia de activación
de la vía alterna entra en funciones una nueva
proteína, la properdina (P), de PM 220 kD, for­
mada por 4 subunidades de PM 53 kD unidas
no covalentemente, y de movilidad (3 o y según
las preparaciones usadas para los ensayos por
los diferentes investigadores y que el medio so­
porte para la corrida sea agar o agarosa. El
compuesto C3bnB o C3bnBb fija la properdina
y la activa (P), probablemente por un cambio
c o n fo rm a c io n a l, o rig in á n d o s e C3bnBP o
C3bnBbP (Sitio 2), producto estable con activi­
dad convertásica de C3 y C5 (vida media: 8
minutos a 31°C).
Es interesante hacer notar que la properdina,
considerada como iniciadora de la activación
de la vía alterna en las primeras interpretacio­
nes de este mecanismo, sólo interviene en la
etapa final del proceso funcionando como esta-
bilizadora. Parecería que no sólo aumenta la vi­
da media de la enzima evitando la disociación
de Bb del complejo, sino que también la prote­
ge contra inactivadores como el I.
La vía alterna de activación del complemen­
to puede funcionar en ausencia de properdina
pero con una eficiencia muy reducida. __
La C5-convertasa de la vía alterna (C3bnBP
o C3bnBbP) al actuar sobre C5 lo desdobla en
C5a y C5b. Éste, al fijarse a la membrana celu­
lar capaz de ser lesionada, en un Sitio 3, facilita
la formación de la unidad de ataque C5b-9, que
funciona de manera similar a la descrita en la
vía clásica (fig. 22-9).
El C3b originado por las vías clásica o alter­
na de activación del complemento, al fijarse a
la membrana celular en el Sitio 1 inicia un m e­
canismo de amplificación de esta última vía, ya
que en esas condiciones puede con el compo­
nente B o Bb formar C3bnB o C3bnBb, la que a
su vez puede originar nuevas m oléculas de
C3b. La estabilidad de la enzima por interme­
dio de P lleva a la conversión de C5 y a la
puesta en m archa de las unidades de ataque
(fig. 22-10).
Si los hechos se desarrollaran normalmente
de esta manera, la activación del sistema com ­
plemento por cualquiera de las vías llevaría al
agotamiento de C3. Ello no ocurre porque hay
un inactivador, el factor I que se encuentra nor­
malmente en el suero y que al actuar sobre C3b
lo inactiva. Este inactivador es efectivo sobre
C3b libre o unido a membrana, pero en este úl­
timo caso su accesibilidad es menor. Como ya
se indicara, su actividad se ve facilitada por la
proteína H.
En algunos pacientes con glomerulonefritis
h ip o co m p lem en tém ica se ha encontrado el
C3factor nefrítico (C3NeF = “C3 nefritic fa c ­
tor”) que es un activador endógeno de la vía al­
terna. Es una inmunoglobuhna, la que se une a
C3bnBb formando C3bnBbNeF. Este complejo
funciona como convertasa estabilizada de C3 y
C5, es decir que el NeF cumple una función si­
milar a la properdina. Se ha demostrado que el
NeF es un autoanticuerpo con especificidad p a­
ra C3bnBb que reconoce un neoantígeno que se
expone en Bb.
En el cuadro 22-2 figuran las características
principales y la sinonimia de los componentes
que participan en la activación del complemen­
to por la vía alterna.
R E C E PT O R E S DE C O M PO N EN TES
DEL SISTEMA COMPLEMENTO
R eceptores para C lq y C4
Si bien se ha sugerido la existencia de un re ­
ceptor para C lq unido a complejos inmunes en
la fase fluida, su naturaleza aún no ha sido cla­
rificada. Según algunos autores, la porción co-
lágeno-símil del C lq en las condiciones indica­
das se uniría a la membrana de granulocitos,
monocitos y linfocitos B, hecho que tendría lu­
gar a través de un receptor. La función de este
receptor en esas células es desconocida.
La fijación de C4 nativo a macrófagos peri­
toneales de cobayo mantenidos en m onocapa
ha sido descrita. No obstante existen dudas de
que esa fijación sea a través de un receptor C4-
específico.
Receptores para fragm entos de C3
Receptor de tipo (CRJ), Receptor para C3b
(CD35). Diversos estudios se han realizado p a­
ra identificar un receptor presente en eritrocitos
humanos, macrófagos y hnfocitos B, que fija a
C3b monomérico, dimérico o polimérico inte­
grante de complejos inmunes solubles y parti­
culados. El número de CRl por eritrocito osci­

la entre 5-8 x 10*; 4 x 10“* a 1,4 x 10= en los
granulocitos y 3-4 x 10'* en los linfocitos B.
Cuando C R l fija a C3b lo hace con un valor
del Ko del orden de 2-6 x 10^ M ‘.
E ste receptor tiene un polim orfism o muy
marcado, con cuatro alelos codominantes que
difieren de sus pesos moleculares, oscilando en­
tre 190 y 280 kD según el alelo. Otra caracterís­
tica de este receptor es que presenta, al igual
que otras proteínas del sistema complemento,
múltiples estructuras repetidas, una a continua­
ción de otra, de aproximadamente 60 aminoáci­
dos y conteniendo 10 a 16 residuos muy conser­
vados. Estas unidades son conocidas en la lite­
ratura como “short consensus repeats”.
C R l, al fijar C3b a las células indicadas, faci­
lita distintos mecanismos inmunológicos en los
que C3b participa como la inmunoadherencia,
la fagocitosis, la citotoxicidad complemento de­
pendiente y también, como ha sido demostrado
recientem ente, aum entando la producción de
IL-2 por ciertos grupos de linfocitos T.
El receptor para C3b produce además altera­
ciones en este compuesto, actuando por esa cir­
cunstancia como un excelente cofactor de I en
la transformación d C3b en C3bi. Este efecto es
más acentuado en la fase sólida que en la fase
fluida, siendo su eficiencia, en este último caso,
comparable a la del factor H.
Si bien el ligando preferido de CRl es C3b,
puede fijar también partículas que tienen adheri­
do C4b, con una afinidad (Ko) inferior a la de
C3b.
Receptor de tipo 2 (CR2), Receptor para C3d,
(CD2I). Este receptor ha sido identificado en
linfocitos B, no así en macrófagos, granulocitos
y linfocitos T. La mayor parte de los linfocitos
B tisulares expresan receptores para C3b y C3d.
El receptor CR2, aislado de sobrenadante de
cultivos de células Raji, presenta características
de una glucoproteína de PM 72 kD. No se tiene
conocimiento de su número por célula ni de su
afinidad por el ligando. Este receptor fijaría,
además de C3d, el fragmento C3dg.
La función de CR2 es poco clara. Además de
potenciar la citotoxicidad complemento-depen­
diente en aquellos linfocitos que tienen CR2 y
C R l, parecería que permite a inmunoadheren­
cia y suprimiría la activación linfocitaria en los
cultivos mixtos de linfocitos.
R eceptor de tipo 3 (CR3), R eceptor p a ra
C3hi (G D IIhi 18). Es un heterodímero consti­
tuido por dos cadenas polipeptídicas: a de 170
kD (CD 11 b) y p de 95 kD (CD18), respectiva­
mente. Investigaciones realizadas parecerían in­
dicar que el fragmento C3dg, constitutivo de
C3bi, es el que actuaría como ligando ante el re­
ceptor. No se conoce con seguridad cuál es el
número de CR3 por célula y la afinidad de la
unión al ligando.
Complemento 405
La función de C3bi es similar a la de C3b, y
al unirse al receptor media reacciones de inm u­
noadherencia y fagocitosis entre otras.
CR3 tiene además capacidad de unión similar
a las leetinas, lo que le permite fijar ciertos hi­
dratos de carbono presentes en la superficie de
microorganismos, facilitando la fagocitosis.
Receptor de tipo 4 (CR4), Receptor de C3bi
(G D I Id 18). Constituido por una cadena a de
150 kD (C D l le ) y una cadena P de 95 kD
(CD18), idéntica a la cadena p del CR3. Está
presente en las mism as células que expresan
CR3 y su especificidad es también C3bi.
CR3 y CR4 forman parte de la familia de las
integrinas.
La denominación de C R l, CR2, CR3 y CR4
a los receptores de C3b, C3d y C3bi h a sido
propuesta teniendo en cuenta que los señalados
no son los únicos ligandos de esos receptores.
Con ello se ha procurado poner más atención
en el receptor que en su especificidad para el li­
gando.
Receptores para C4a, C3a, C5a y Ba
El clivaje de C4, C3, C5 y B da lugar a la
formación de los péptidos C4a, C3a, C5a y Ba.
Todos ellos son biológicam ente activos, pro­
m oviendo con m ayor o m enor intensidad la
contracción del músculo liso; los más efectivos
son C3a y C5a.
Todos esos péptidos, al actuar sobre recepto­
res existentes en diferentes células promueven,
además de la contracción de la musculatura li­
sa, la liberación de histamina por los m astoci­
tos y de serotonina por las plaquetas. C5a indu­
ce quimiotaxismo celular y además incrementa
la expresión del número de receptores para C3b
en los granulocitos.
Se ha demostrado que C3a y C5a intervienen
como moduladores de la respuesta inmune. El
primero de ellos suprimiendo ciertas funciones
linfocitarias al actuar presumiblemente sobre
un tipo particular de célula supresora-inducto-
ra, en tanto que C5a ejerce una función poten-
ciadora al inducir la producción de IL-1 p o r los
macrófagos.
Las funciones descritas tienen lugar cuando
los péptidos difusibles C3a y C5a interactúan
con los correspondientes receptores celulares.
En el caso de la unión de C5a con sus recepto­
res presentes en granulocitos -unión que pro­
mueve el quimiotaxismo-, el valor de la cons­
tante de asociación oscila entre 10’ y 10® M"’.
Hasta el momento no se tiene conocimiento
de la naturaleza, características fisicoquímicas
y distribución celular de los receptores de estos
péptidos difusibles originados por fragm enta­
ción de algunos componentes del sistema com ­
plemento.
406 Mecanismos efectores de la respuesta inmune

Receptor para el factor H La unión del factor H polimérico a células

En linfocitos periféricos y en algunas líneas
celulares linfoblastoides B se ha demostrado la
existencia de un receptor para el factor H. Ello
se ha evidenciado por la adherencia a granulo­
citos de partículas que tenían fijado el factor H.
El número de receptores por célula, determi­
nado por estudios de interacción ligante-ligan-
do a saturación es aproxim adam ente de 2 X
1Q5; este valor varía según los autores.
Del receptor purificado no reducido se han
identificado cadenas peptídicas de PM 100 kD
y 50 kD y de 50 kD de la forma reducida.
blastoides y linfocitos de sangre periférica presu­
miblemente induce la liberación de factor I, que
es calcio-dependiente y energía-dependiente.
MECANISMOS REGULATORIOS
DE LA ACTIVACIÓN
DEL COMPLEMENTO
En el suero del hombre y del cobayo han sido
hallados inhibidores e inactivadores del comple­
mento. Ello es consecuencia de una necesidad
biológica derivada de la acción de componentes
activados del complemento y de péptidos acti-

, . . C § !D - C3a

..........L
■ C3 B C3 Bb C3

I
C3c
l/H

proteasa
C3d
C3b

C3b

1- ETAPA: C3 + B + D — ^ C3b (Fijación de C3b a membrana)

C3a

( J g )

C3b B C3b

ETAPA: C3b + B + D G3bBb + n C 3 b ■ -C3bnBb

F ig. 22-9. A ctivación del sistem a com plem ento (vía alterna).

n-íh
3^ ETAPA: C3bnBb + P -» i^C 3 bnB bP
C7
C6
C5b
^Na*, HjO
5^ ETAPA: C5b + C 6, C7, C 8, n C 9 ^ s ^ C5b-C9n
Fig. 22-9 (cont.). A ctivación del sistem a com plem ento (vía alterna).
vos originados de ellos, cuya permanencia po­
dría resultar perjudicial para el organismo.
Uno de ellos es el inhibidor de C l esterasa
(Clinh), denominado también a^-neuraminogli-
coproteína, de PM 104 kD y movilidad electro­
forética de a ,. Tiene un alto contenido de hidra­
tos de carbono, 40%, y su estructura es la de una
cadena peptídica simple según algunos autores,
en tanto que otros admiten que está formado por
subunidades de PM 18,5 kD. Su concentración
sérica es de 180 |i.g • mi '. Este inhibidor actúa
también sobre las plasm a kalicreínas. Form a
parte de la “superfamilia” de las serpinas, inhi­
bidores de proteasas de serina. En pacientes con
edema angioneurótico hereditario hay disminu­
ción de los niveles de C linh y en ellos se obser­
van edemas no inflamatorios en áreas localiza­
das, pudiendo originar la muerte por asfixia si se
localizan en la laringe. Toda esta sintomatología
se debe a la falta de inhibición de la C ls, que
además provoca una disminución de los compo­
nentes C4 y C l, pues éstos son, como ya se ha
visto, sus sustratos naturales.
Complemento 407
kC3a
nC 5a
C5 y
C5b
C3b
I
■ ' ib
Bb
4 ^ ETAPA: C3bnBbP + C5 —»^C5b
C3bnBbP + C3 —► CSb
(El C3b formado puede unirse a
membrana y amplificar la vía alterna)
I
C8
C 9Í
[Q ^
C3b, por acción del factor I, es clivado en
los fragmentos C3c y C3d. El factor I tiene un
peso molecular de 93 kD y movilidad electro­
forética de P 2globulina. Está com puesto por
una cadena a (55 kD) y una cadena p (42 kD)
unidas por puentes disulfuro. Su concentración
sérica aproximada es de 50 |ig • m i '. Su fun­
ción biológica es la de regular C3b, ya que si
así no ocurriera éste actuaría como un am plifi­
cador permanente de la vía alterna, con el con­
siguiente consumo de C5-9. El factor I actúa
también sobre C4b inactivándolo.
El componente C4bp (C4 binding protein),
que más que un inhibidor sería un regulador de
la convertasa de C3 de la vía clásica, es un
multím ero de PM 1.300-1.500 kD, resultante
de la unión no covalente de monómeros de PM
550 kD, que a su vez están constituidos por 8
subunidades de PM 70 kD unidas entre sí pior
uniones disulfuro. El C4bp acelera la disocia­
ción de C4b2b que lleva a la formación de C2i,
actuando a la vez como cofactor en el clivaje
de C4b por I, proceso que da origen a C 4c y
 408 Mecanismos efectores de ia respuesta inmune

V IA C L Á S IC A

► C -q u in in a s-

^ In m u n oa d h ere n oia - 4 F A G 0 C IT 0 S IS k

-■>C3a-anafilotoxina
. ^C 3blN A^, ,
C 3b n B P C 3 b '< ' ^C 3b
M O D IFIC A C IO N
^ (estable) > 'C 3,C 3d D E LA
P P E R M E A B IL ID A D
C 3B „B
________________ _ fQ-gl
(lábil)
fragm ento-B
- C5b
- B f - B + D + Mg2*

C 3 b n 4- - de, .
" y a m p lific a c ió n
C3i Lipo po lisacárid os,
inulina, poliósidos, etc. |
IgA, IgE, lg G 4 h um an as i
C 3a l/H a g re g a d a s (Ac-Ag), i
Ig G l co b a yo (A c-A g) |

B + C 3 + D + Mg2*
FA S E FL U ID A

V ÍA a l t e r n a

V ía de activación c lá sica \ V ía de activación altem a

jiB , Inhibición de activación — Producto de inactivación

F ig. 22-10. In te rre la c ió n e n tre c o a g u la c ió n , f ib rin ó lisis , g e n e ra c ió n d e q u in in a s y a lg u n o s c o m p o n e n te s d e l c o m p le m e n to ,

y a c tiv id a d d e lo s p r o d u c to s o rig in a d o s.

C4d. Su contenido en el suero es de 250 ¡ig ■ y cumple una función similar a la de DAF, ac­
m l'. tuando como cofactor de C4b y C3b para su
El componente H, de PM 150 kD, es una be- clivado por el factor I.
ta-globulina constituida por una sola cadena Ha sido descrito un inactivador de C6, con
peptídica. Su función es la de regular la expre­ movilidad electroforética de p l globulina. Una
sión de la convertasa de C3 de la vía alterna forma inactiva de C8, obtenida a partir de la
(C3bBb). Ello lo consigue inhibiendo competi­ forma hemolíticamente activa, a pH 7,5 y fuer­
tivamente la combinación de B con C3b, au­ za iónica baja, bloquea la capacidad de EACI-7
mentando a su vez el clivaje de C3b por í. La de fijar C8 activo.
actividad de H está regulada por el ácido siáli­ El llamado inactivador de anafilotoxina, una
co de las membranas celulares, el que favorece a globulina de PM 310 kD que responde a las
la unión de H a C3b. Las membranas pobres en características de la carboxipeptidasa N, supri­
ácido siálico facilitan la activación del comple­ me la actividad anafilotóxica de C3a y C5a d i ­
mento por la vía alterna al dificultar la partici­ ván do la arginina C -term inal de estos com ­
pación de H. La concentración sérica de H es puestos. La capacidad leucoquim iotáctica de
de 400 |ig • ml >. los mismos no se modifica.
DAF (“decay acelerating factor”), factor que Algunas enzimas pueden modificar compo­
acelera la caída de la actividad de las converta- nentes del complemento. La plasmina, derivada
sas de C3, es una proteína de 70 kD, conocida de su precursor, el plasminógeno, puede trans­
también como CDS5. Esta proteína no se en­ formar C ls en C ls sin la intervención de C lq y
cuentra en el plasm a, sino que está unida a C lr, e incluso destruye la actividad funcional
membranas celulares por unión fosfatidilinosi­ del factor L Plasmina y tripsina pueden clivar
tol. Decae la actividad de las convertasas de C3 C3 y C5 originando las anafilotoxinas C3a y
de ambas vías, actuando en los tejidos propios C5a.
del huésped. Acttía como cofactor de C3b y Además de los inhibidores e inactivadores
C4b para su clivado por el factor L citados, existe en el plasma la proteína S, que
Otra proteína reguladora de la vía clásica es actúa en la etapa terminal de la secuencia de
MCP (proteína cofactor, de membrana), de 58- activación del sistema complemento durante la
63 kD e identificada como CD46. Se encuentra formación del componente de ataque a m em ­
unida a membrana por unión fosfatidilinositol brana (MAC). Su función es la de restringir la

lisis a aquellas m em branas portadoras de la
convertasa de C5, previniendo la lisis de otras
células existentes en el medio que no se en­
cuentren en esas condiciones. En ausencia de la
proteína de control, células vecinas no sensibi­
lizadas pueden Usarse por fijación de los com ­
plejos C5b-6 o C5b-7 que son liberados al m e­
dio por las células activadoras. Sobre el parti­
cular conviene recordar que algunas bacterias,
en especial salmonelas que han sufrido el ata­
que del complemento, pueden liberar con faci­
lidad los citados intermediarios, que podrían fi­
jarse a nuevas células e iniciar su daño, sobre
todo en focos inflamatorios. Para que ello no
ocurra se necesitan sistemas de control, partici­
pando en ese mecanismo la proteína S, gluco­
proteína monocatenaria de PM 88 kD, que ac-
tiía bloqueando en la fase fluida los sitios de
unión a membrana de los complejos C5b-7. Es­
tos complejos unidos a la proteína S permiten
la fijación de C8 y de sólo 2 o 3 moléculas de
C9 por cada com plejo C5b-9, bloqueando la
polimerización del último componente. Por es­
te mecanismo se evita el consumo inefectivo de
C9 y se convierte al complejo en un producto
C5 — ► C S b
C o n v erta sa
d eC 5
C 5a
t QUE PARTICIPA EL COMPLEMENTO
C 5b
C6
I
C 5b6
M C 5b -7 S C 5 b - 7 (F a s e
I fluida)
(Inserción '
C8
en m em b ran a)
M C 5b-8 S C 5b-8
1 0 -1 6 C 9 2C 9
M C 5b-8 poli-9 S C 5b-9
FORIVIACIÓN DE CANAL CONTROL
TRANSMEIVIBRÁNICO
Fig. 22-11. M ecanism o de control de los com plejos C5b-7
de la fase fluida. P o r com binación con la proteína S dei
p lasm a se inhibe la p o lim erizació n de C9 y su u n ió n a
m em brana.
Complemento 409
soluble en agua. E sta transición antifílica-hi-
drofílica ocurre por fijación de 2 o 3 moléculas
de S a los sitios hid ro fó b ico s de fija c ió n a
membrana de los complejos C5b-7 y C5b-8. La
falta de polimerización de C9 originan com ple­
jos que carecen de estructura tubular, a diferen­
cia de lo que ocurre cuando los componentes
del complemento están unidos a mem branas.
La figura 22-11 esquematiza lo expuesto.
Es un hecho bien conocido que la efectivi­
dad del complemento es mayor cuando su acti­
vidad se ejerce sobre eritrocitos y otras células
hemáticas heterólogas, en tanto que es menor
cuando las células son homólogas. En los últi­
mos años se ha encontrado explicación a este
hecho, al demostrarse que hay dos proteínas de
m embrana localizadas en una variedad de célu­
las que bloquean la formación del “complejo
de ataque a m em brana” (MAC). Estas proteí­
nas son el “factor de restricción ho m ó lo g a”
(HRE) y CD59, las que protegen las células del
propio individuo contra la posible lisis induci­
da por com ponentes hom ólogos del co m p le­
mento. Actúan uniéndose a C8, impidiendo la
unión de C9 y su inserción en la m em brana
plasmática. Sólo bloquean la unión si el com­
plemento y las células a lisar son de la misma
especie.
OTROS MECANISMOS
INM UNOLÓGICOS EN LOS
Si bien en los fenómenos de hemólisis y ci-
tólisis específica intervienen todos los com po­
nentes del complemento descritos, otros, tales
como la conglutinación, inmunoadherencia, fa­
gocitosis, formación de factor leucoquimiotáxi-
co, producción de anafilotoxina, etc., se desa­
rrollan con la participación de sólo algunos de
ellos, los que tienen intervención activa en los
mecanismos de la inflamación.
Formación de anafilotoxina
A partir de C3 y C5 pueden obtenerse dos
sustancias distintas, de bajo peso m olecular,
llamadas anafilotoxinas, las que se caracterizan
por provocar contractura de la musculatura lisa,
m odificaciones de la permeabilidad capilar y
choque anafiláctico generalizado. Este efecto
puede inhibirse con antihistamínicos, lo que in­
dica que las anafilotoxinas son liberadoras de
histamina.
Cuando C3 es tratado con C3 convertasas
(C4b2a, C3bBb), complejo P-globulínico cons­
titutivo del factor aislado del veneno de víbora
cobra (CVF), tripsina o plasmina, se obtiene
C3a, de peso molecular aproximadamente 9 kD
410 Mecanismos efectores de la respuesta inmune
y con actividad anafilotóxica. Los productos
que se obtienen con la C3 convertasa y el CVF
son más activos que los logrados con la tripsi­
na, la que puede no liberar anafilotoxina si pro­
longa su acción sobre C3.
Si so b re C5 se h a c e a c tu a r C 1 4 b 2 a 3 b ,
CSbnBbP, o tripsina, se obtiene un producto
llamado C5a, de peso molecular aproximada­
mente 12 kD que también se comporta como
anafilotoxina. Es distinta de la obtenida a p ar­
tir de C3, lo que queda demostrado por su ca­
pacidad para contraer un trozo de músculo liso
previamente transformado en no reactivo por
agotam iento con C3a anafilotoxina. La C5a
anafilotoxina es 500 veces más activa que la
C3a.
Si bien no ha sido dem ostrado, se supone
que ambas pueden actuar in vivo como libera­
doras de histamina. C3a y C5a están bajo es­
tricto control “in vivo”. Una enzima circulante,
la carboxipeptidasa N, los inactiva al escindir­
les la arginina C-terminal. Si bien C3a des-Arg
y C5a des-Arg no tienen actividad anafilotóxi­
ca, conservan su capacidad para inducir leuco-
quimiotaxismo.
El componente C4a, resultante del clivaje de
C4, tiene una actividad similar a C3a, aunque
m enos efectiva. Una acción sim ilar ha sido
descrita por Ba.
Formación del factor leucocito-
quimiotáctico
Los complejos antígeno-anticuerpo pueden
in vitro, o in vivo si están en presencia de suero
fresco, inducir la formación de sustancias mar­
cadamente quimiotácticas para los neutrófilos.
En su elaboración participa el complemento, lo
que ha sido bien demostrado in vitro mediante
el empleo de cámaras de difusión con membra­
nas de permeabilidad seleccionada. Colocando
polim orfonucleares en uno de los com parti­
mientos de la cámara y en el otro complejos
Ag-Ac a los que se les adicionaron los distintos
com ponentes del com plem ento, se pudo de­
mostrar que C3a y C5a eran quimiotácticos. La
actividad fue establecida sobre la base de la ca­
pacidad para inducir el pasaje de los polimorfo­
nucleares del compartimiento en que se encon­
traban al que tenía el com plejo Ag-Ac y los
componentes del complemento. El mecanismo
de la adquisición de la actividad quimiotáctica
no ha sido investigado. Se supone que actúan
como activadores de una proesterasa presente
en la membrana de los polimorfonucleares neu­
trófilos, proceso que sería indispensable para la
migración.
La atracción de los leucocitos por quimiota-
xismo, que sigue a la fijación del complemento
in vivo a com plejos antígeno-anticuerpo, es
parte esencial del mecanism o que lleva a la
producción del fenómeno de Arthus, el que se
describe en detalle en el capítulo 32.
Inmunoconglutinación
y conglutinación
La inmunoconglutinación (IK) consiste en la
aglutinación de células que tienen fijado com ­
plemento y es originada por anticuerpos contra
determinantes antigénieos ocultos de C3 o C4 y
que quedan expuestos después de su fijación al
complejo antígeno-anticuerpo. Las inmunocon-
glutininas se forman contra el com plem ento
autólogo, pero su formación depende de la apa­
rición de los determinantes de éste que surgen
durante la fijación, C3 y C4 no fijados no for­
man inmunoconglutininas.
La conglutinación (K) es originada por una
sustancia llamada conglutinina, presente en el
suero bovino, y que no es una inmunoglobuli­
na. Su peso molecular es 75 kD y el coeficiente
de sedimentación 7,8S. Cuando a células que
han fijado anticuerpos específicos y com ple­
mento se les añade albúmina bovina al 25% (ri­
ca en conglutinina), se produce aglutinación.
Ello se debe a que dicha sustancia tiene capaci­
dad para fijarse a hidratos de carbono presentes
en C3. La conglutinina se fija también al zimo-
sán (poiisacárido de la levadura de cerveza) y
com o el grupo re a c tiv o del m ism o es u n a
a - 1-2-manotriosa, se supone que dicho grupo
está presente en C3. Para que la reacción se
produzca, es necesaria la presencia de un factor
activante del conglutinógeno (KAF), presente
en el suero fresco, y de Ca^+. Los quelantes in­
hiben la reacción. Se ha demostrado que KAF
y el factor I son una misma sustancia.
Inmunoadherencia y fagocitosis
La inmunoadherencia consiste en la fijación
de complejos antígeno-anticuerpo-complemen-
to a la superficie de partículas no sensibiliza­
das, como hematíes, leucocitos, plaquetas, y
aun partículas inertes como gránulos de alm i­
dón. Para que la reacción tenga lugar, es nece­
saria la fijación de C3, resultando activos los
p ro d u c to s E A C 1 4 b 2 b 3 b , E A C 1 4 b 3 b y
EAC4b3b.
T eniendo en cu enta que este m ecanism o
puede desarrollarse in vivo, se estima que en
las infecciones microbianas y virales, los agen­
tes infecciosos, al ser anclados a la superficie
de los hematíes vía receptor para C3b o C R l,
pueden ser captados más fácilm ente por los
macrófagos. A ello cabe añadir que en los m a­
crófagos hay receptores para C3b. La fagocito­
sis se ve por lo tanto favorecida por el comple­
mento.
 Complemento 411

Fig. 22-1 lA . I n te rre la c ió n e n tre c o a g u la c ió n , f ib r in ó lis is , g e n e ra c ió n d e q u in in a s y a lg u n o s c o m p o n e n te s del c o m p l e ­

m ento.

Quininas IN T E R R E L A C IO N EN TR E
C O M P L E M E N T O Y O TR O S SISTEM A S
Una sustancia sim ilar a las quininas, la C-
quinina, es liberada por acción de C ls sobre Otros sistemas sanguíneos, como la coagula­
C2. El péptido originado, que es diferente de la ción, fibrinólisis y generación de quininas, es­
bradiquinina, es vasoactivo y aumenta la per­ tán interrelacionados con el sistema co m p le­
meabilidad vascular. mento, y algunos de sus componentes pueden

Clase I Clase I Clase I

21-hidroxiíasa

DP, DQ, DR: genes CMH clase II

B, C, A: genes CMH clase I
C2, Bf, C4A, C4B: genes que codifican para los componentes
del complemento C2, B, C4A y C4B
C4A y C4B codifican dos proteínas funcionalmente no diferenciables
C4 y C2 son polimorfos
21A y 21B: genes de la 21 -hidroxilasa
HSP: genes de las proteínas de cíioque térmico (“íieat shock protein”)
tipo 1 y 2
TNF: genes del factor necrosante de tumores, tipo a y p

Fig. 2 2 - l l B . U b ic a c ió n d e los g e n e s q u e c o d if ic a n p a ra a lg u n o s d e lo s c o m p o n e n te s d e l s is te m a c o m p le m e n to .
412 Mecanismos efectores de la respuesta inmune
ser activados o potenciados en su acción como
consecuencia de ello. Cabe señalar la influen­
cia del factor de H agem an activívdo, el que,
además de iniciar la secuencia de la coagula­
ción, interactúa con el plasminógeno originan­
do plasmina, la cual, como ya se ha indicado,
puede activar componentes del complemento.
Además, la plasmina puede clivar el factor de
Hageman activado, originando fragmentos que
actúan en forma activa en la conversión de pre-
calicreína en calicreína, la que a su vez d iv a el
quininógeno originat\do bradiquinina, sustancia
vasoactiva y quim iotáctica que interviene en
los fenómenos de inflamación. En esos proce­
sos también se forma el factor Kf, con capaci­
dad para hacer que CT reaccione más eficaz­
mente con C4 y C2 (fig. 22-11 A).
GENES QUE CODIFICAN
PARA PROTEÍNAS
DEL SISTEM A COMPLEMENTO
Teniendo en cuenta la homología de sus se­
cuencias, los componentes del sistema comple­
mento han sido incluidos en diferentes familias
de genes.
Un grupo de estas proteínas que fijan C4b y
C3b, entre las que se incluyen C4bp, factor H,
C R l, CR2, DAF, MCP y factor B, se caracteri­
zan por presentar repetidas múltiples pequeñas
estructuras, dispuestas una a continuación de la
otra (“short concensus repeats: SCRs”) las que
constituyen una parte significativa de las es­
tructuras totales de esas proteínas. En este sen­
tido cabe m encionar que C R l co n tien e 34
SCRs y que el factor H está constituido por 20
SCRs. Estas estructuras constan de 60 a 70
aminoácidos, con 10 a 16 residuos muy conser­
vados, entre los que se incluyen 4 cisteínas que
forman dos puentes disulfuro intracadena origi­
nando un doble bucle o “loop”, proveyendo la
conformación adecuada para la fijación de C3
y C4. Estas estructuras han sido bien observa­
das en otras proteínas que no forman parte del
sistema complemento, desconociéndose la fun­
ción que pueden cumphr.
Otras proteínas del sistem a com plem ento
son miembros de otras familias de genes, cum­
pliendo funciones similares y presentando se­
cuencias de aminoácidos que son críticas para
el cumplimiento de esas funciones. Las serino-
esterasas factor 1, factor B, Clr, Cls y C2 pre­
sentan secuencias homólogas, incluso con otras
serino-esterasas no integ ran tes del sistem a
complemento como tripsina y quimiotripsina.
Clinh, inhibidor de esterasas de serina, for­
m a parte de la superfam ilia de las serpinas
(“íerine-proteasa-¿«activactor), en las que se
incluyen otras proteínas inhibidoras de estera­
sas de serina como la al-a n titrip sin a y anti-
trombina II. Estas proteínas mimetizan el sitio
reactivo del sustrato, logrando desviar la fija­
ción normal de la proteasa.
C3 y C4 son miembros de una pequeña fami­
lia, que también incluye a la a2-macroglobuli-
na, caracterizadas por presentar uniones tioéster
intemas, las que como ya se indicara, al produ­
cirse su apertura por hid ró lisis, facilitan .la
unión de estos componentes a fases sólidas.
La properdina está constituida por seis m ó­
dulos contiguos, de 60 aminoácidos cada uno,
los que fueron originariamente descritos en la
trombospondina, una proteína de adhesión de
420 kD secretada por las plaquetas. Tres triptó-
fanos y seis cisteínas están presentes, y pare­
ciera que éstas forman tres puentes disulfuro
intramodulares los que originarían una unidad
independientemente plegada.
Varias de las proteínas del sistema comple­
mento presentan un estrecho encadenamiento
crom osóm ico de sus m iem bros. A sí C 4bp,
DAF, CRl y CR2 proteínas de regulación que
contienen SCRs homólogos se encuentran dis­
tribuidos en un segmento de 950 kb de ADN,
ubicado en el brazo largo del cromosoma 1, co­
nocido como grupo de genes reguladores de la
activación del complemento (RAC). En el hom­
bre, los genes que codifican para C2, C4 y fac­
tor B se encuentran ubicados en el cromosoma
6, entre los locus del Complejo Mayor de H is­
tocompatibilidad (CMH) de clase II HLA-DR y
clase I-B (fig. 22-1 IB). A estos genes ligados al
CMH, generalmente se los designa de clase-Ill.
EL COMPLEMENTO EN LAS
DIFERENTES ESPECIES ANIMALES
En los distintos vertebrados adultos ha sido
demostrada la presencia del complejo polimo-
lecular que constituye complemento, aunque
no en todos los casos, según la especie animal,
con la misma actividad. Numerosas investiga­
ciones llevadas a cabo con suero de vaca, palo­
ma, caballo, gato, rana, etc., demuestran un dis­
tinto comportamiento según la especie animal
de que se trate y en especial del sistema que se
utilice para verificarlo. Los resultados varían
según se empleen sistemas hemolíticos consti­
tuidos por glóbulos rojos de diferentes especies
anim ales, sensibilizados con sus corresp o n ­
dientes antisueros o, como ha ocurrido en otros
casos, mediante el estudio de la acción bacteri­
cida sobre ciertos m icroorganism os, como el
Haemophilus influenzae. Para este sistema, el
co m p lem en to de cobayo p rá c tic a m e n te se
m uestra inactivo, cosa que no ocurre con el
suero humano y de conejo.
En las lampreas se ha descrito una sustancia
opsonizante con características similares a C3.

En tiburones se han identificado dos proteínas
análogas a C8 y C9 que participarían en la se­
cuencia de ataque citolítico a membranas. En
este caso, las funciones de C3, C5, C6 y C7 son
ejercidas por un tínico producto similar a C3,
que por interacción con C8 y C9 inducirían las
lesiones. En la trucha arco iris se han identifi­
cado cuatro componentes: C5, un análogo de
C6 o C7 de los m am íferos, y C9, los que al
unirse al complejo C3 originarían el daño en la
membrana celular.
La actividad del complemento, m edida en
función de su actividad hemolítica frente a gló­
bulos rojos de carnero sensibilizados, varía en
las diferentes especies. En el suero fresco de
cobayo se dosan de 300 a 400 unidades hem o­
líticas 50% (CHjg); en el hombre, entre 80 y
100; en el conejo, de 40 a 60 unidades, en tanto
que otras especies, como el ratón y el caballo,
efectuando el dosaje en las mismas condiciones
que en los casos anteriores, prácticam ente se
muestran como inactivas. Ello se debe a que la
concentración de los distintos componentes no
es la misma en todas ellas; así por ejemplo, en
la vaca y en el caballo hay valores bajos de C2,
en tanto que en la oveja hay valores bajos de
C2 y C4. Pero no hay que olvidar tampoco que,
como algunas de las etapas de reacción de fija­
ción del complemento son reversibles, como la
EA14b2b que revierte a EA14b, hecho depen­
diente de la tem peratura y la especie animal,
los resultados obtenidos en las valoraciones del
com plem ento pueden estar influidos por esa
circunstancia. A ello cabe añadir que algunas
líneas endocriadas de animales, especialmente
ratones, son deficientes en com ponentes del
complemento.
Dado que el complemento de cobayo es uno
de los que mejor se comportan para los ensayos
de inmunohemólisis y reacciones de fijación de
complemento, es el que preferentemente se usa
para estos tipos de estudios.
ORIGEN DEL COMPLEMENTO
Numerosos trabajos han sido realizados para
determinar el origen del complemento y ha ha­
bido comunicaciones iniciales en las que se su­
puso que las fuentes de origen eran los leucoci­
tos. Hoy sabemos que el complejo conocido
con el nombre de complemento está constitui­
do por varios com ponentes presentes en el
plasma sanguíneo y que responden a las carac­
terísticas de las globulinas; de ahí que la mayor
parte de los trabajos realizados últim am ente
hayan sido dirigidos en este sentido. En cierto
modo tiene im portancia conocer el origen del
complemento, ya que perm itiría com prender
mejor las modificaciones de sus niveles como
Complemento 413
consecuencia de ciertas enfermedades que pue­
den afectar órganos diversos; saber si la sínte­
sis de las globulinas inmunes en el tejido linfá­
tico corre paralela a la del complemento y, ade­
m ás, ten er conocim iento de si los distin to s
componentes son elaborados por un m ism o sis­
tema o por sistemas diferentes.
Ha habido intentos por parte de distintos in­
vestigadores con el objeto de establecer el o los
órganos que lo elaboran. En su m ayoría han
usado el método que consiste en provocar un
daño en determinado órgano y medir luego los
niveles de complemento circulante. Provocan­
do daños en la célula hepática mediante la ino­
culación de tetracloruro de carbono o clorofor­
mo, se pudo demostrar la disminución del com­
plemento circulante. Estas experiencias no son
concluyentes en este sentido, ni tampoco otras
investigaciones sobre el particular, entre ellas,
ensayos a efectos de demostrar la formación de
complemento in vitro, utilizando para ello cul­
tivos de tejidos. Todas estas operaciones y la
medición del complemento elaborado resultan
sum amente difíciles, sobre todo porque algu­
nos de los componentes no son estables a la
tem peratura del cultivo, o por los inhibidores
de su actividad que puedan paralelamente desa­
rrollarse. En cultivos de tejido de hígado y de
bazo provenientes de cobayo se ha comproba­
do aumento de C2.
Como consecuencia de haberse establecido
que algunos componentes están identificados
com o seroproteínas definidas, fáciles d e de­
m ostrar por inmunoelectroforesis, como C3 =
P,C y C4 = PjF, se han hecho una serie de in­
vestigaciones sobre cultivos de tejidos de coba­
yo, ratón, rata, mono y hombre, en las que se
ha tratado de dilucidar cuáles son los tejidos de
órganos que muestran incremento de estos dos
componentes. La identificación se hizo p o r in­
munoelectroforesis y autorradiografía, m edian­
te el añadido de aminoácidos con '‘‘C a los me­
dios de cultivo, estableciéndose la actividad de
síntesis por la cantidad de P,C y P,E que pre­
sentaban radiactividad. En todas estas investi­
gaciones se ha podido comprobar que el hígado
y los tejidos linfoides, en especial bazo y gan­
glios, son los principales formadores de estos
com ponentes, actividad com partida tam bién
por la médula ósea y algunos otros tipos de te­
jidos. En los macrófagos se ha demostrado ca­
pacidad de síntesis para C2, C4 y C5, y de C lq
y C ls por el epitelio intestinal.
Como corolario de las diferentes investiga­
ciones realizadas, hoy sabemos que las proteí­
nas del sistema complemento son sintetizadas
por el hígado, aunque en otros sitios extrahepá-
ticos también se sintetizan (monocitos, m acró­
fagos, células epiteliales del tejido gastrointes­
tinal y sistema genitourinario, fibroblastos).
414 Mecanismos efectores de la respuesta inmune
EVOLUCIÓN ONTOGÉNICA
Y FILOGÉNICA DEL SISTEMA
COMPLEMENTO
No existen datos precisos sobre la evolución
ontogénica de los diferentes componentes del
complemento. La actividad hemolítica total del
complemento ha sido demostrada en sueros de
fetos de oveja, de cerdo y de vacuno provenien­
tes de muestras de sangre obtenidas lo más pre­
cozmente posible. A las nueve semanas de ges­
tación se ha podido detectar C3 y C4 en el cor­
dón umbilical de fetos humanos. La actividad
hemolítica del suero fetal humano y de recién
nacidos es inferior a la del adulto, alcanzando
los niveles de éste entre los 3 y 6 meses de vida.
En relación con la evolución filogénica del
sistema complemento, no se ha podido demos­
trar actividad hemolítica por el método clásico
en la hemolinfa de invertebrados, crustáceos y
peces gelatinosos. Algunos vertebrados inferio­
res tienen sistemas muy similares al com ple­
mento de los mam íferos. U ltim am ente se ha
sostenido que en algunos invertebrados podrían
existir componentes de ia vía de activación al­
terna del complemento, lo que haría suponer
que esta vía podría ser más prim itiva que la
clásica.
VARIACIONES DE LO^ NIVELES
SÉRICOS DEL COMPLEMENTO
En algunas patologías y en casos de d efi­
ciencias congénitas, los n iveles séricos del
complemento total o de algunos de sus compo­
nentes pueden experimentar variaciones.
En el hom bre se han descrito deficiencias
congénitas de C2 y en ellas las concentraciones
séricas de este componente son ínfimas con re­
lación a los nórmales, lo que hace que la acti­
vación del sistema complemento por la vía clá­
sica sea prácticamente nula. No obstante, la vía
alterna funciona normalmente, por lo que estas
deficiencias, en lo que a resistencia a las infec­
ciones se refiere, no alcanzan mayor trascen­
dencia. Se han descrito también deficiencias de
C3, C5, C6, C7, C ir y de algunos inhibidores e
inactivadores de componentes del sistema com­
plemento, entre ellas las deficiencias de C3b
inactivador (I) y de C l inhibidor (C linh). En el
primero de los casos hay un exagerado catabo­
lismo de C3, y en el segundo, como consecuen­
cia de la falta de inactivación de C ls, hay con­
sumo de C4 y C2 sérico y se producen edemas
no inflamatorios del tejido subcutáneo y de la
m ucosa del tracto respiratorio y alim entario
que pueden llevar a la asfixia. A este cuadro
clínico se lo conoce con el nombre de edema
angioneurótico hereditario.
D eficiencias de com ponentes del com ple­
mento han sido tam bién descritas en cobayo
(C4), ratón (5) y conejo (C6).
En la mayoría de las deficiencias de compo­
nentes del complemento hay una marcada sus­
ceptibilidad a las infecciones microbianas. Para
más información véase capítulo 30.
Los niveles de los componentes del comple­
mento pueden estar modificados en algunas pa­
tologías como el lupus eritematoso sistémico,
la artritis reumatoidea, la glomerulonefritis hi­
pocomplementémica, la nefritis postestreptocó-
cica, la anemia hemolítica autoinmune, etc. Es­
tas variaciones dependen de la vía que se acti­
ve, ya que en alguna de ellas lo está la clásica,
en otras la alterna y en algunos casos, ambas.
LISIS DE GLÓBULOS ROJOS POR
COMPLEMENTO EN AUSENCIA
DE ANTICUERPOS
_Si a glóbulos rojos de carnero se les añade
C l (C l esterasa), esto es, el primer componen­
te activado y luego los restantes componentes
del complemento, añadidos en orden de fija­
ción, al agregar C9 se produce la lisis. Ello se
debe a que C l se añade bajo la forma de estera­
sa activa, que no necesita del anticuerpo para
su conversión. A partir de esa esterasa se pro­
ducirá la activación de C4 y C2, y luego, conti­
nuando con el encadenamiento, se originará el
complejo citolítico C5b-9, que es el que produ­
ce el daño celular y la siguiente hemólisis. Esto
se consigue con C ls, y no es indispensable la
presencia de C lq y C ir.
CURVA DE HEMOLISIS EN FUNCIÓN
DEL COMPLEMENTO
Hasta no hace mucho tiempo, la actividad
complementaria de un suero era determinada
por la menor cantidad suya capaz de producir
el 100% de lisis del sistema hemolítico ensaya­
do. En los últimos años, los estudios sobre ci­
nética de la inmunohemólisis han demostrado
la m ayor sensibilidad de estas valoraciones
cuando se establece el título sobre la base de la
dosis que produce el 50% de lisis de los hema­
tíes del sistema.
Ello tiene una explicación clara si se analiza
la curva que resulta de graficar los porcentajes
de hemólisis en función de la cantidad de com ­
plem ento (fig. 22-12). Puede observarse que
dicha graficación no es una recta, sino una cur­
va sigmoidal, con una marcada pendiente en la
zona que va del 25 al 75% de hemólisis aproxi­
m adam ente, con una depresión inicial y una
marcada caída que se continúa en forma gra-

0,05 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
Suero fresco de cobayo diluido 1:100
Fig. 22-12. Curva obtenida por graficación de los p o rcen ­
tajes de liemólisi.s de un m ism o volum en de sistem a he-
m olítíco frente a cantidades variables de com plem ento. Su
aspecto sigm oidal es característico: m uestra una pendiente
p ronunciada para los valores com prendidos entre 25% y
75% de lisis.
dual en los tlltimos tramos de la curva. De todo
esto se deduce que, cuando se hacen cuantifica-
ciones de C o reacciones de fijación del com ­
plemento con lecturas del 100% y 50% de he­
mólisis, el consumo de pequetias cantidades de
ese complemento acusa una sensibilidad total­
mente diferente en ambos casos.
R EA C TIV O S NECESARIOS PARA LA
VALORACIÓN DEL COMPLEMENTO
Diluyente
A efectos de asegurar una fuerza iónica ade­
cuada, un pH estabilizado y la concentración
ideal de calcio y magnesio para que la fijación
del com plem ento se realice en condiciones
ideales, en todas las operaciones relacionadas
con la valoración del complemento o reaccio­
nes de fijación del complemento no debe em­
plearse solución fisiológica como diluyente o
líquido de lavado para los hematíes de carnero,
sino una solución tam ponada que reúna tales
condiciones; la ideal es la descrita por Mayer.
Para su preparación, disolver 83 g de NaCl y
10,19 g de veronal sódico en aproximadamente
1.500 ml de agua destilada; atiadir HCl N hasta
pH 7,5 (aproximadamente 31 ml) y 5 ml de una
solución que contenga 1 M MgCl^ y 0,3 M
CaClj, completando luego con agua destilada
hasta 2.000 ml.
Para el uso, diluir 1/5 en agua destilada, vi­
gilando el pH que debe ser 7,5. Este diluyente
es el que debe usarse para el trabajo diario y
deberá descartarse el no utilizado. La solución
concentrada se conserva en heladera por cierto
tiem po. T eniendo en cuenta que en algunas
Complemento 415
oportunidades hay lisis espontánea de hema­
tíes, que se reflejan en el blanco, se recomienda
la adición de 0 ,1% de albúmina bovina o de ge­
latina al buffer, la que debe ser añadida des­
pués de la dilución a isotonía.
Preparación de la suspensión de hematíes
Sangre de oveja obtenida por punción yugu­
lar se mezcla por agitación suave con un volu­
men igual de solución de Alsever (glucosa-ci-
trato), siendo recomendable la siguiente:
Glucosa ............................................. 20,5 g
Citrato de s o d io ................................ 8 g
Cloruro de so d io ............................... 4,2 g
A gua destilada.................................. 900 ml
Ácido cítrico al 10%
aproximadamente ......................... 8 ml
para ajustar a pH 6,1; se completa finalmente
con agua destilada hasta 1.000 ml. Esterilizar
por filtración.
La sangre así obtenida y preferentemente es­
tabilizada en heladera a 2-5°C durante una se­
mana, para uniformar el comportamiento de los
eritrocitos para la lisis por el anticuerpo y el
complemento, resulta útil por aproximadamen­
te un mes. Es conveniente también teniendo en
cuenta que no todos los hematíes de carnero se
comportan de la misma manera, seleccionar los
dadores más adecuados.
Es preferible guardar la sangre en heladera
en form a fraccionada, de manera que en cada
recipiente exista la cantidad necesaria para un
día de trabajo.
P ara valorar com plem ento se p rep ara una
suspensión de glóbulos rojos al 5%. P ara ello,
centrifugar la sangre citada y eliminar el plas­
ma sobrenadante; efectuar luego tres lavados
con aproximadamente 5 a 10 volúmenes de so­
lución isotónica tamponada, y desechar las sus­
pensiones que después del tercer lavado aún li­
beren hemoglobina. Ello debe hacerse porque
en estos casos, por excesiva fragilidad, habrá
liberación de hemoglobina que corresponde a
células que no han sufrido el impacto del com­
plemento. El sedimento de glóbulos rojos obte­
n id o s por cen trifu g ació n es su sp en d id o en
aproximadamente 15 a 18 volúmenes de dilu­
yente y, una vez mezclados para homogenei-
zar, son valorados por lectura espectrofotomé-
trica a 530 nm, previo acondicionamiento de la
muestra.
C om o frecuentem ente en el laboratorio se
efectúan determinaciones de niveles de com­
plemento y reacciones de fijación del com ple­
mento, y como en este último caso las concen­
traciones de las suspensiones de hematíes utili­
zados en el sistema hemolítico indicador varían
416 Mecanismos efectores de la respuesta inmune

añaden 9,8 mi de solución de carbonato de so­

dio al 0,1%, y se invierte varias veces para la-
car. Leer al espectofotómetro el porcentaje de
transmisión y, utilizando la curva, calcular el
porcentaje de glóbulos rojos. C onociendo la
concentración de hematíes que tiene dicha sus­
pensión, por simple regla de tres puede calcu­
larse el diluyente que es necesario añadir para
que finalmente la suspensión tenga la cantidad
de glóbulos rojos de carnero al 5%, equivale,
aproximadamente, a 10® células por mililitro,
dato que conviene tener en cuenta, ya que m u­
chas veces la concentración de hematíes se ex­
presa por el número de células presentes.

% de glóbulos rojos
F ig . 22-13. C urva p ara d eterm in ar la co n c en trac ió n de
glóbulos rojos de una suspensión, obtenida graficando %
de transm isión versus % de glóbulos rojos. (Indicaciones
en el texto.)
Hemolisina
El anticuerpo hemolítico se obtiene por in­
m unización de conejos adultos, de 2-3 kg de
peso, pudiéndose emplear como antígeno gló­
bulos rojos enteros o estroma celular. En el pri­
mer caso existen distintos planes de inmuniza­
ción, pero es recomendable el siguiente:

D ía Antígeno Vía D osis

de una técnica a otra, es conveniente tener pre­
parada una curva de calibración, que permitirá 1 Sangre total de oveja S ubcutánea 0,5 mi
obtener un.\ suspensión de hematíes a la con­ 3 Sangre total de oveja S ubcutánea 0,5 mi
centración que se desee, entre dos rangos extre­ 5 Sangre total de oveja Subcutánea 1,5 mi
7 Sangre total de oveja Subcutánea 2 mi
mos determinados. 9 Sangre total de oveja Subcutánea 2,5 mi
Para confeccionarla se lava la sangre de ove­ 12 G lóbulos rojos 20%* Intravenosa 1 mi
ja en diluyente isotónico tamponado, de la mis­ 14 G lóbulos rojos 20%* Intravenosa 1 mi
ma manera que se indicó anteriormente, pero 16 G lóbulos rojos 20%* Intravenosa 1 mi
18 Sangría exploratoria
diluyendo en un volumen del mismo aproxima­
damente igual a 5 veces el volumen de hema­ * G ló b u lo s ro jo s al 20% en solución 0,15 M de N a C l ad ic io n a d a de
tíes. Con dicha suspensión se determ ina m e­ 0 ,01% de M gSO^,

diante el hematócrito el volumen globular, y se

prepara sobre la base de este dato una suspen­
sión de hematíes al 15%. A 0,4 mi de dicha
suspensión se le añaden 19,6 mi de solución de
carbonato de sodio al 0,1%; se obtiene así un
lacado cuyo tenor en hemoglobina equivale al
de una suspensión de hem atíes al 15%; 8 mi
del lacado anterior son diluidos con 8 mi de so­
lución de carbonato de sodio al 0,1% y 5 mi de
esta solución son diluidos con 5 mi del mismo
diluyente. De esta manera se tienen preparadas
tres soluciones que corresponden a lacados he-
máticos cuyas concentraciones son, respectiva­
mente, 15%, 7,5% y 3,75%. Cada una de ellas
es leída al espectrofotómetro a 530 nm, en por­
centaje de transmisión, y con los datos obteni­
dos se traza la gráfica en papel semilogarítmico
en función de la concentración de hem atíes
(fig. 22-13).
Para determinar la concentración de hem a­
tíes de una suspensión dada, preparada de la
misma manera que la suspensión obtenida para
la curva de calibración, se procede del siguien­
te modo: a 0,2 mi de dicha suspensión se le
Si el título de anticuerpos es conveniente se
efectúa el sangrado definitivo.
El suero obtenido después de la coagulación
es mezclado con un volumen igual de glicerina
y se lo conserva en heladera a 2-4“C, previa ti­
tulación definitiva.
El otro método de preparación de hemolisina
consiste en inocular conejos con estrom a de
glóbulos rojos de carnero, que se prepara de la
siguiente manera: recoger un litro de sangre de
oveja en 250 mi de solución de citrato de sodio
(2 mol. HjO) al 3,8%, agitando continuamente.
Después de filtrar por gasa para eliminar coá­
gulos, centrifugar y lavar el sedimento de gló­
bulos rojos dos veces con solución salina.
Efectuada la última centrifugación, el sedimen­
to de glóbulos es volcado en 10 litros de agua
destilada fría, a la que se le han añadido 4 mi
de ácido acético, y se continúa la agitación du­
rante 10 minutos.
Se deja la mezcla en heladera hasta el día si­
guiente, con lo cual se logra la separación del
estroma.

Se aspira la mayor cantidad posible del so­
brenadante y el sedimento se centrifuga en frío
durante 15 minutos a 2.000 revoluciones por
minuto; el sobrenadante se elimina por aspira­
ción. El estroma se lava 4 a 6 veces con buffer
de acetato 0,001 M, pH 5 y se centrifuga en
frío a 2.000 revoluciones por minuto durante
15 minutos. El estroma así obtenido se suspen­
de en un volumen igual de NaCl 0,15 M, frío, y
se centrifuga a 0°C y 4.000 revoluciones por
minuto durante 20 minutos. Se hacen dos nue­
vos lavados con NaCl 0,15 M en las mismas
condiciones que el ensayo anterior con el obje­
to de eliminar todo el acetato y se lo suspende
en aproxim adam ente 300 a 400 mi de N aCl
0,15 M. Esta suspensión así preparada se colo­
ca en un Erlenmeyer y se calienta durante una
hora a 100°C por inmersión en un baño de agua
hirviendo. Enfriar y agitar hasta obtener una
suspensión hom ogénea. T ransferir asép tica­
mente el contenido a un recipiente estéril, de­
terminar por micro-Kjeldahl el contenido en ni­
trógeno, y por dilución con solución de NaCl
0,15 M estéril llevar a un contenido final de
1 mg de nitrógeno por mi, usando como con­
servador Merthiolate al 0,01%. Esta suspensión
así preparada es la que sirve para la inmuniza­
ción de los animales, los que son inoculados
por vía intravenosa con una inyección de 0,1
mi de suspensión, 5 inyecciones de 1 mi y 5 in­
yecciones de 2 mi cada una. El total de las ino­
culaciones debe hacerse en un período de apro­
ximadamente dos semanas pero sin dejar pasar
más de dos días entre inoculación e inocula­
ción. Cuatro o cinco días después de la última
inyección los animales son sangrados y el sue­
ro, una vez separado, es calentado a 56°C du­
rante 30 minutos y conservado a -2 0 “C. Para
su uso o mediciones de su actividad, hacer una
dilución madre 1:100 que puede ser conservada
por muchísimo tiempo a ~20°C.
Cuando se preparan hemolisinas por los m é­
todos indicados, el producto final obtenido di­
fiere en cuanto a calidad. Ello se debe a que los
glóbulos rojos del carnero tienen dos grupos de
antígenos; los isófilos, termolábiles y destrui­
bles por calor a 100°C, y los heterófilos, ter­
m oestables, correspondientes al antígeno de
Eorssman. En el caso de la inmunización con
glóbulos rojos intactos se obtienen anticuerpos
contra los antígenos isófilos y heterófilos, lo
que dificulta la estandarización, mientras que
cuando la inmunización se hace con estroma,
los anticuerpos formados son anti-Forssman.
Cuando se inmunizan conejos, los anticuer­
pos anti-Forssm an que se producen g en eral­
mente son de alto peso molecular, ubicados en
la IgM de constante de sedimentación 198.
Se ha observado que en los sueros de cone­
jos indistintamente inmunizados con glóbulos
Complemento 417
rojos intactos o con estroma globular, se en­
cuentran anticuerpos IgM de alto peso molecu­
lar (198) e IgG de bajo peso m olecular (7S).
Ambos anticuerpos pueden separarse por dife­
rentes procedimientos, habiéndose demostrado
que los anticuerpos IgM son aproximadamente
100 veces más activos que los IgG.
Cuando interese la obtención de hemolisinas
en las que predom inen los anticuerpos de la
clase IgG, una vez finalizado el plan de inmu­
nización indicado para glóbulos rojos enteros,
conviene dejar los animales en reposo p o r 2 a 3
meses. Transcurrido ese tiempo hacer una ino­
culación endovenosa de 1 mi de glóbulos rojos
al 2 0 % en N a C l 0 ,1 5 M , a d ic io n a n d o de
SO^Mg 0,01%, seguida de una reinoculación
similar 10 días después. Sangrar a los 7-8 días
de la última inoculación.
P ara los estudios de inm unohem ólisis, las
hemolisinas que deben utilizarse son aquellas
que contienen únicam ente anticuerpos anti-
Forssm an (19S) obtenidas por inm unización
con estroma de glóbulos rojos previamente ca­
lentados. En estos casos la dosis hem olítica
eficaz varía entre 1/20 a 1/50 de la dosis m íni­
ma aglutinante, lo que explica por qué los gló­
bulos rojos sensib ilizad o s nunca p resen tan
aglutinación.
El dosaje de la hemolisina puede hacerse mi­
diendo directamente la hemólisis provocada so­
bre los correspondientes hematíes adicionados
de com plem ento, m idiendo el n itrógeno del
p recip itad o o btenido cuando el h a p te n o de
Eorssman es enfrentado con la hem olisina, o
determinando la actividad hemolítica del sobre­
nadante anterior, para establecer su título sobre
la base de la inhibición producida.
Para medir hemohsina por el método hem o­
lítico directo se efectúan diluciones convenien­
tes de la misma, generalmente 1/400, 1/800, 1/
1600, 1/3200 y 1/6400. A 5 mi de cada una de
ellas se les añade 5 mi de suspensión de glóbu­
los rojos de carnero al 5%, agitando continua­
mente; 1 mi de cada una de estas m ezclas es
distribuido en una serie de tubos, a los que se
les añade 5,5 mi de diluyente isotónico tampo-
nado seguido de una dilu ció n ad ecu ad a de
complemento (1 mi de dilución 1/20 a 1/50 de
suero fresco de cobayo es la que responde a es­
tas exigencias).
Los tubos son incubados a 37°C durante 90
minutos y sometidos a agitación periódica con
el objeto de m antener las células en suspen­
sión, y finalmente se centrifugan a efectos de
establecer el grado de lisis producido en cada
uno de los tubos, estimación que se hace con el
espectrofotómetro de manera similar a la que
se emplea para titulación del complemento, que
luego se verá. En todos los casos es necesario
colocar un blanco preparado con 1 mi de sus­
418 Mecanismos efectores de la respuesta inmune
pensión de glóbulos rojos lavados al 2,5% y
6,5 ml de dilución del complemento 1/50, co­
rrespondiendo esta lectura al 0% de hemólisis.
El tubo cuya lectura corresponde al 100% de
hemólisis se prepara con 0,5 ml de suspensión
de glóbulos rojos al 5%, 0,5 ml de hemolisina
1/400 y 6,5 mi de complemento diluido. El tí­
tulo se expresa en unidades AcH^^ y se deter­
mina por el mismo método indicado para cal­
cular CHjp (unidades del com plem ento 50%
hemolíticas). Puede trabajarse con volúmenes
menores de muestra, manteniendo las propor­
ciones indicadas.
Cabe señalar que cualquiera que sea el méto­
do de valoración utilizado, la curva que expre­
sa la concentración de anticuerpos es sigmoi­
dal, similar a la indicada para la inmunohemó­
lisis del complemento.
Cuando con una hem olisina titulada de la
manera ya indicada quiere prepararse una sus­
pensión de hematíes óptimamente sensibiliza­
dos, la dilución de hemolisina elegida es verti­
da con agitación constante sobre la suspensión
de hematíes y no en sentido contrario, lográn­
dose así una sensibilización homogénea de los
eritrocitos. Los hematíes así sensibilizados se
conservan en la heladera hasta el momento de
su uso, debiendo ser utilizados en el día y pre­
parárselos toda vez que se los necesite.
Obtención de la muestra de suero
y su conservación para los dosajes
de complemento
Se obtiene de sangre extraída asépticamente
y conservada en refrigeradora hasta el momento
de su uso. Mantenido el suero a 2-4"C, su valo­
ración debe efectuarse en el día, en tanto que a
-40°C conserva su título por varias semanas.
Teniendo en cuenta que en las reacciones de
inmunohemólisis se utiliza como fuente suero
fresco de cobayo, conviene en estos casos em­
plear una mezcla obtenida del mayor número
posible de animales, con el objeto de lograr un
producto homogéneo y sin deficiencias en nin­
guno de los componentes, lo que podría afec­
tar los resultados, como se vio en cinética de la
inmunohemólisis. El suero puede conservarse
congelado a -4 0 “C o liofilizado. Si previamen­
T ubo I 2
S uero diluido 1:30 0,05 0 ,!0
Solución salina tam ponada
(diluyente) hasta 1 1
S istem a hem olítico* 1 1
Incubar a 37®C durante 30 m inutos
^ S istem a c o n stitu id o p o r p arte s ig u ales de gióbuJos ro jo s ai 5% y iiernolisina (5A cH,Qyrnl)
te se le añaden 70 mg de cloruro de sodio por
ml o se mezcla con un volumen igual de una
solución que contenga 12 g de acetato de so­
dio, 4 g de ácido bórico y agua hasta 100 ml,
puede conservarse en heladera a 2-4'‘C por 3-4
días.
VALORACIÓN DEL COMPLEMENTO
Los métodos más utilizados para la valora­
ción del complemento son los que se basan en
la determinación de su efecto citotóxico sobre
glóbulos rojos específicamente sensibilizados,
determinación que se hace en función de la he­
moglobina liberada.
El esquema simplificado de la reacción es el
siguiente:
E -h A EA
Ca2+
EA -h C
Mg2
Como el com plem ento puede m edirse en
unidades CH,oo y CH„, y existen num erosos
factores que modifican los resultados, antes de
describir los métodos de valoración es conve­
niente definir correctamente ambas unidades.
La unidad de complemento hemolítica 50%
(CHjo) corresponde a los m ililitros de suero
fresco que lisan 2,5 x 10® hematíes óptimamen­
te sensibilizados sobre un total de 5 x 10* eri­
trocitos, en presencia de cantidades óptimas de
calc io y m ag n esio , a una fu erza ió n ica de
0,147, a pH 7,4 y durante una incubación de
una hora a 37”C en un volumen total de 7,5 ml.
La unidad de complemento hemolítica 100%
equivale a la cantidad de suero fresco capaz de
hemolisar 1 ml de un sistema hemolítico cons­
tituido por partes iguales de glóbulos rojos al
5% y hemolisina a la concentración óptima, en
presencia de calcio y magnesio durante 30 mi­
nutos a 37°C y en un volumen final de 2 ml.
Valoración del complemento determinando
el 100% de hemólisis
El esquema que sigue corresponde a una va­
loración de este tipo:
i 4 5 6 7 8 9 10
0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50
1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1
 Complemento 419

La dosis mínima iiemolítica corresponderá al Esquema de valoración

tubo de la serie que contiene la menor cantidad 4
Tubo 1 2 3 5 6 7
de suero capaz de producir la lisis completa de
los glóbulos rojos sensibilizados. Suponiendo H em atíes sen sib i- l 1 1 ,1 l 1 1
que dicho tubo fuera el N” 5 de la serie que lizados'*'
contiene 0,25 mi de suero fresco diluido 1/30, S olución s alin a 5,5 4,5 3,5 2,5 1,5 6,5
tam p o n ad a
el número de unidades de complemento 100% S u ero fre sc o d i­ 1 2 3 4 5
hemolíticas (CH|,)(,) que contiene dicho suero luido 1:400 en
so lu ció n s alin a
30 tam ponada*^'
resulta de d iv id ir------ = 120 S uero fresco d i­ 6,5
0,25 luido d e 1:40
D ilu ció n final 1 :4 0 0 1:200 1:133 1:100 1:80 -
Valoración dei complemento
In c u b a r 6 0 m inutos a 3 7 'C ag itan d o perió d ic am en te
en dosis hemolíticas 50% (CH,^)
* S istem a h em o lític o c o n stitu id o p o r p arte s ig u ales de s u s p e n s ió n
Hemos visto que la curva de hemólisis en d e hem atíes d e ca rn ero (5 x 10^ c e ll./m l) y h e m o lisin a (4A cH ^ ,/m l).
L a d ilu c ió n in d icad a es p a ra su ero d e co b a y o . P ara suero h u m a ­
función de la cantidad de complemento es sig- no co n v ie n e em p le a r dilución 1 :.100 a 1:150.
moidal y que su parte central corresponde a la Los tu b o s 6 y 7 co rresp o n d e n a O y 100% de h em ólisis, r e s p e c tiv a ­
m ente.
dosis que produce el 50% de hemólisis.
Por lo común se emplea la ecuación de von
Un Centrifugar rápidamente y medir oxihem o-
Krough X = K como expresión m a­ globina en el sobrenadante, a 541 nm, utilizan­
do para ello un espectrofotómetro.
temática de dicha curva. En ella, j: es la canti­ Para facilitar las operaciones conviene v alo­
dad de complemento expresada en mi de dilu­ rar en tubos de centrífuga, tapándolos durante
ción; y corresponde al grado de lisis como frac­ la incubación para evitar evaporación.
ción de 1 , 0 multiplicando x 100 el % de hemó- Si el complemento que se valora es para em ­
Usis; K es una constante que equivale a la dosis plearlo luego en trabajos de investigación o en
de complemento que produce el 50% de hem ó­ reacciones de fijación del com plem ento, es
lisis; Un es el valor de la pendiente, que varía conveniente, antes de su titulación, absorberle
según las condiciones del ensayo, y que para los anticuerpos líticos naturales. Para ello m ez­
los indicados en la unidad hem olítiea 50% clar aproximadamente 100 mi de suero fresco
(CHju), ya definida, es 0,2 + 0,02. El número con 5 mi del paquete correspondiente a glóbu­
de células por mililitro y la concentración de los rojos de carnero lavados, mantenerlo en b a ­
Ca^+ son los factores que más influyen; debe ño de hielo durante 15 minutos y centrifugar,
respetarse el volumen final de la reacción para repitiendo la absorción nuevamente. A lm ace­
no modificar la relación hematíes/ml. narlo convenientemente. No conviene prolon­
La transform ación logarítm ica de la ecua­ gar los tiempos pues a 0“C, según el período de
ción de von Krough sum inistra una fórm ula incubación, puede haber menor o mayor fija ­
muy útil para la valoración del complemento, ción del complemento.
ya que su representación es una recta. El cálculo de las unidades CHj^ por mililitro
que corresponden a la inversa de la dilución se
log X = log K + 1/n log hace graficando los valores de log j: y
l-y
log
I-y
Cuando y = 50%, será 1 y log X será
J~y¡ Si se dispone de papel logarítmico de tres c i­
igual a log K, esto es, la dosis de complemento clos, la operación se simplifica, ya que no será
que produce el 50% de hemólisis. Por lo tanto,
graficando los valores de log x en función de necesario determinar los log de x y de
l ú )
log en el punto que la curva corta a Un ejemplo de cómo calcular dichas unida­
/ -y des en ambos casos facilitará la comprensión.
Los valores de v son calculados por sim ple
regla de tres tomando el valor de la DO del tu ­
log = O, esa cantidad de suero corres- bo N“ 7 como la correspondiente al 100% de
]^y, hem ólisis. Cuando los valores del tubo N" 6
(0% de lisis) son significativos es necesario h a ­
ponderá a la unidad CH^^,. cer las correcciones pertinentes.
420 Mecanismos efectores de la respuesta inmune

sustituyendo los mismos en la ecuación de von

Krough queda x = y 1 - y la que relaciona a
Tubo DO y ¡~ y X, cantidad de suero capaz de producir una he­
mólisis “y ” como fracción de 1 con la dosis del
1:80 0,434 98.6 70,428
1:100 0,355 80.7 4,181 suero necesaria para obtener 50% de hemólisis.
1:133 0,270 60.7 1,545 El cuadro 22-3 contiene dichos valores. Para
1:200 0,168 36,3 0,567 su uso se procede de la siguiente manera; reto­
1:400 0,099 22,5 0,289 mando como ejemplo el de las valoraciones an­
0% H 0,080 O
100% H 0,440 100 teriores, la dilución 1:133 produce 60,7% de
hemólisis. Si dicha dilución se multiplica por el
correspondiente factor tabulado para 61% de
Marcando en el papel logarítmico los valores hemóhsis, en este caso 1,091 obtenido por ex­
trapolación, resulta 133 x 1,091 = 146, m ien­
de para cada valor de x y uniendo esos tras que el hallado experimentalmente fue 150.
Para estos cálculos los valores utilizados deben
puntos, se obtiene una recta. ser aquellos que más se aproximan al 50% de
El valor de x para el punto de la recta en que hemólisis.
La determinación de la dosis de complemen­
= 1 corresponderá al número de unida- to CH50 puede hacerse también transformando
\]^y} la curva sigmoidal en recta, relacionando los
des CH que contiene el suero analizado (fig. logaritmos de la dosis de complemento con los
22-14).' porcentajes de hemólisis transformados en p ro­
Si no se dispone de papel logarítmico el cál­ hits, teniendo en cuenta que el probit 5 corres­
culo se hace como lo ilustra la fig. 22-15. ponde a 50% de hemólisis. Para ello, pueden
En todas las valoraciones de CH^g, teniendo em plearse las tablas de Fischer y Yates que
en cuenta la forma sigmoidal de la curva de he­ permiten tal conversión o, más fácilmente aun,
mólisis, los valores inferiores a 20% y superio­ utilizando papel especial probit/logaritmo.
res a 75% de hemólisis deben desecharse para
los cálculos.
El método se aphca igualmente para la valo­
ración de la hem olisina en dosis hem olíticas C u ad ro 22-4. Para la transformación de los
50%, correspondiendo en este caso los valores % de hemólisis en probits
de X a las unidades de anticuerpo hemolítico.
Con el objeto de facilitar los cálculos pueden % de hem ólisis Prohits
confeccionarse tablas, las que están en función
de 1/n, igual a 0,2 en este caso. Cuando se las 5 3,3551
10 3,7184
utilice es necesario respetar estrictamente las 15 3,9636
condiciones de la prueba; en caso contrario de­ 20 4,1584
ben elaborarse nuevas tablas para los diferentes 22 4,2278
valores de 1/n. 25 4,3255
27 4,3872
Estos factores de conversión se calculan de 30 4,4756
la siguiente manera: si a la dosis de com ple­ 32 4,5323
mento necesaria para producir el 50% de he­ 35 4,6147
mólisis se le asigna el valor 1 y a 1/n el de 0,2, 37 4,6681
40 4,7467
42 4,7981
45 4,8743
C uadro 22-3 47 4,9247
50 5
% de tisis Factor % de lisis F actor 52 5,0502
55 5,12.57
10 0,644 55 1,041 57 5,1764
12 0,671 60 1,084 60 5,2533
14 0,696 65 1,132 62 5,3055
16 0,718 70 1,185 65 5,3853
18 0,738 75 1,246 67 5,4399
20 0,758 80 1,320 70 5,5244
25 0,803 82 1,354 72 5,5828
30 0,844 84 1,393 75 5,6745
35 0,884 86 1,438 77 5,7388
40 0,922 88 1,490 80 5,8416
45 0,961 90 1„552 85 6,0364
50 1 90 6,2816
95 6,6449
 Complemento 421

1 2 4 8 16 32 64 128 256 512

F ig. 22-14. D eterm inación de la dosis CHj,., utilizando papel logarítm ico de tres ciclo

La figura 22-16 corresponde a la valoración En la figura 22-17 puede verse que la curva
de un suero de cobayo diluido 1/10. correspondiente al % de hemólisis en relación
En el cuadro 22-4 se encuentran los probits con la concentración de hemolisina no es siem­
correspondientes a diferentes % de hemólisis. pre del mismo tipo. En algunos casos, com o la
I, hay un aumento progresivo de dicha actividad
Factores que pueden modificar los resultados para estabilizarse dando una curva en form a de
meseta; en tanto que otras veces, como la curva
Diversos factores pueden influir en la deter­ II, se observa un aumento progresivo al aum en­
minación de la actividad hemolítica del com ­ tar la concentración. El tipo III de curva es muy
plemento. Merecen destacarse entre ellos: raro, pero puede observarse. El tipo I co rres­
a) La concentración de la Itemolisina. Es ponde a hemolisinas obtenidas por inm uniza­
fundamental, sobre todo para trabajos de inm u­ ción con estroma de glóbulos rojos calentados,
nohemólisis y de cinética de la actividad del o sea sueros hem olíticos que contienen a n ti­
complemento, sensibilizar óptimamente a los cuerpos anti-Forssman, en tanto que las restan­
glóbulos rojos con hemohsina. A veces esto re­ tes corresponden a conejos inm unizados con
sulta tarea difícil por las características de los glóbulos rojos intactos, los que indudablemente
anticuerpos obtenidos al inmunizar los conejos, elaboran anticuerpos contra antígenos isófiios y
las que dependen de diversos factores y en es­ heterófilos, siendo esta mezcla la responsable
pecial del tipo de antígeno utilizado. del comportamiento de esas hemolisinas.
422 Mecanismos efectores de la respuesta inmune

log
Tubo Logx DO y -V í I ~y j
5 1:80 1,90 0,434 98,6 70,428 1,85
4 1:100 2 0,355 90,7 4,181 0,62
3 1:133 2,12 0,270 60,7 1,545 0,19
2 1:200 2,30 0,168 36,3 0,567 -0 ,2 5
1 1:400 2,60 0,099 22,5 0,289 -0 ,5 4
6 0% H - 0,08 0
7 100% H - 0,440 100

-2,60

-2,50

2,40

.o 2,30

2,20

2,18
2 ,10 'B '
- 2 ,00

-1,90

-1 ,0 -0 ,9 -0 ,8 -0 ,7 -0 ,6 -0 .5 -0 ,4 -0 ,3 -0 .2 -0,1 O 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0.7 0.8 0.9 1.0
y
Log
Log 2.18 = = dil 1/150 = 150 dosis CH j/m l 1 -y

y
Fig. 22-15. D eterm inación de la dosis m ediante graficación de log x versus lo g -------. (Elaborada con los datos del
ejem plo anterior.) 1- y

Cuando se trabaja con los sueros del tipo I, c) Importancia del volumen fin a l de la reac­
la sensibilización de los hematíes puede conse­ ción. Cuando se valore complemento o se mida
guirse correctamente con la dosis adecuada de su actividad como parte de un sistema hemolí­
hemolisina, cosa que no ocurre en los otros dos tico en una reacción de fijación de complemen­
casos; y muchas veces por el empleo de hemo­ to, es necesario respetar en forma estricta el vo­
lisinas de este tipo pueden sensibihzarse inade­ lumen final previamente fijado, ya que la acti­
cuadamente los glóbulos rojos y requerir dosis vidad hemolítiea del complemento disminuye
de complemento superiores a las reales. al aumentar el volumen final. Si el mismo se
b) Número de hematíes. Al duplicar la con­ duplica, la actividad del complemento descien­
centración de hematíes por mi, con respecto a de aproximadamente en un 25%, descenso que
los requeridos para que una determinada dosis alcanza al 50% si el volumen final es el cuá­
de complemento produzca el 50% de hem óli­ druple del inicial. La causa fundamental de es­
sis, los mi de complemento necesarios para lo­ tas modificaciones son las variaciones de las
grar este mismo efecto no corresponden al do­ concentraciones de C2 y C3, las que inciden en
ble de la dosis de complemento inicialm ente la reversibilidad de la reacción EAC14b2b
utilizada. Tampoco estos valores se correspon­ EAC 14b -HC2d.
den si se triplican o cuadruplican las concentra­ d) Fuerza iónica. La fuerza iónica del dilu­
ciones de hematíes. Al duplicar dicha dosis, se yente es importante en la determinación de la
requiere aproxim adam ente un 25% m ás de actividad del complemento. La del buffer clo­
complemento que la establecida para el número ruro de sodio-veronal sódico, ya indicada, es la
inicial de glóbulos rojos sensibilizados. Esto es ideal e igual a 0,147. Cuando ésta aumenta, la
muy importante y es necesario recordarlo cuan­ actividad del complemento disminuye.
do se trabaja en dosaje de complemento y prin­ e) Temperatura. Las valoraciones de com ­
cipalmente en reacciones de fijación del com­ plemento generalmente se hacen a 37“C, pero
plemento. cuando se realizan a tem peraturas inferiores.
 Complemento 423

alrededor de 30“C, los títulos de complemento

pueden a veces aumentar. Ello se debe a que el
complejo EAC14b2b es más estable a esa tem­
peratura y por lo tanto habrá más sitios en esas
condiciones para la conversión de C3. Un he­
cho evidente sobre este particular es que, cuan­
do se valora complemento de caballo, el mismo
debe ser dosado a 30°C, en que la estabilidad
del complejo anterior alcanza a 8-10 minutos y
permite la interacción de los restantes compo­
nentes. A 37“C la m ism a es de aproxim ada­
mente un minuto, razón por la cual las medidas
hechas a esta temperatura arrojan valores muy
bajos. Los ensayos hechos con complemento
de cobayo demuestran que entre 28°C y 37”C
hay una disminución paulatina de su título a
medida que la temperatura aumenta.
f) Acción del pH. El aumento del pH en el
tubo de reacción provoca una caída del título
del com p lem en to , de ap ro x im ad am en te un
25% cuando el pH varía de 7,2 a 8,5.
g) Los iones calcio y magnesio. Generalmen­
te se observan variaciones en los títu lo s del
com plem ento cuando se emplean com o dilu­
Dosis de C (escala logarítmica) yentes del sistema solución fisiológica o buffer
1,699 2,000 2,301 2,602 2,903 veronal-salino. Ello se debe a que en el primer
caso no existen cantidades adecuadas de calcio
Log dosis de C y m agnesio, cosa que ocurre en el segundo.
Ca^+ 0,00015 M y Mg^+ 0,0005 M constituyen
Fig. 22-16. D eterm inación de la dosis CH jo po r grafica­ las concentraciones óptimas. Ello se debe a que
ción de probits versus log de C. El em pleo de papeles espe­
ciales probits/iog, los que a su vez tienen tabulados ios por­
estos dos iones son Ixindamentales para la acti­
centajes de hem ólisis en escala proporcional a los probits, v ació n de algunos de los co m p o n en tes del
facilita los cálculos. complemento durante la dinámica de la reac-

Diluciones de hemolisina

Fig. 22-17. D istinto com portam iento de hem olisinas de conejo anti-glóbulos rojos de carnero. La tipo I fue obtenida por
inm unización con estrom a de glóbulos rojos, y las de tipo II y III, p o r inoculación d e glóbulos rojos lavados. D e la gráfica
se deduce que, cuando se em plean hem olisinas del tipo I, un exceso de la m ism a no m odifica los resultados. E s por esto
que en los sistem as hem olíticos se utiliza más de 1 dosis AcH,,,, sin que ello incida en la calidad del reactivo.
424 Mecanismos efectores de la respuesta inmune
ción y es la causa por la que la presencia de
quelantes como citrato de sodio, EDTA, etc.,
inhibe la actividad hem olítica de los sueros
frescos. La presencia de calcio y magnesio no
sólo es indispensable para la fijación del com­
plemento a glóbulos rojos sensibilizados, sino
también para su fijación a precipitados especí­
ficos. La acción del calcio es altamente especí­
fica e insustituible y otros cationes bivalentes,
como cobalto, bario, cinc, manganeso, cadmio,
níquel o magnesio, no pueden reemplazarlo. En
cambio el cobalto y el níquel pueden sustituir
al magnesio, aunque indudablemente su efica­
cia es inferior.
CINETICA DE LA HEMOLISIS
POR COMPLEMENTO LIMITADO
Y POR ANTICUERPO LIMITADO
Los estudios sobre cinética de la hemólisis
por anticuerpos y complemento realizados du­
rante los últim os años, llevados a cabo con
concentraciones óptimas de calcio y magnesio
y lecturas espectrofotométricas de la hemoglo­
bina liberada, han permitido comprender mejor
el mecanismo de la acción hemolítica del com­
plemento. Para estos estudios pueden emplear­
se los llamados sistemas de complemento limi­
tado o de anticuerpo limitado.
En el primer caso, las células o glóbulos ro­
jos están en presencia de la dosis de comple­
mento necesaria para producir el 50% de he­
F ig . 22-18. Curvas de hem ólisis en función del tiem po obtenidas con diferentes diluciones de suero de cobayo, com para­
das con las logradas con suero hum ano. El com plem ento de cobayo da curvas que adquieren la típica form a de m eseta, co ­
sa difícil de lograr con el de origen hum ano.
mólisis y son las distintas concentraciones de
anticuerpos las que actúan sobre esos glóbulos
rojos así tratados, estudiándose su acción he­
molítica en función del tiempo. En los sistemas
de anticuerpo limitado, los glóbulos son ópti­
mamente sensibilizados con el anticuerpo y lo
que varía es la dosis de complemento. Para es­
tos estudios se prepara una suspensión de célu­
las a una concentración adecuada, generalmen­
te 2%, y se la mantiene en agitación constante
en un baño term orregulado para que esté en
contacto íntimo con los reactivos al ser añadi­
dos. Para establecer el grado de lisis se extraen
volúmenes determinados a intervalos preesta­
blecidos. Un hecho muy importante es que la
reacción debe ser detenida bruscamente para
que no haya aumento de hemólisis durante el
proceso de centrifugación, y esta detención se
consigue, en el caso de sistemas de com ple­
mento lim itado, m ediante dilución y enfria­
miento; en tanto que los casos de sistemas de
anticuerpo limitado, la inhibición se hace con
EDTA. En el primer caso, la reacción no puede
detenerse con EDTA porque esta sustancia, que
es complejante del calcio y magnesio, resulta
inefectiva después de pasado cierto tiempo, ya
que las etapas de fijación del complemento en
las que estos iones intervienen, tienen lugar en
los primeros minutos de la reacción. El proce­
dimiento indicado de dilución y enfriamiento
no es del todo adecuado pero, si se procede a
centrifugar rápidamente y en frío, los resulta­
dos son aceptables.
Minutos

La figura 22-18 muestra un comportamiento
similar de las curvas de hemólisis en función
del tiem po para distintas concentraciones de
complemento de cobayo; que todas ellas tienen
un incremento inicial para luego tomar el aspec­
to de mesesa; y que la reacción se ha completa­
do a los 90 minutos, cuando se analiza suero de
cobayo, en tanto que si es humano la curva que
se obtiene es brusca al comienzo y contintía con
un discreto ascenso, aun hasta las 4 o 5 horas.
Ello indica que, cuando se valore complemento
de distinto origen, el tiempo de incubación para
determinar su actividad indudablemente deberá
ser establecido previamente a efecto de que los
resultados puedan ser comparados.
En los sistemas de complemento limitado,
las curvas de hemólisis pueden tener distintas
características, las que dependen del tipo de an­
ticuerpo. Cuando las hemolisinas son prepara­
das por inmunización de conejos con estroma
de glóbulos rojos hervidos (anticuerpos heteró­
filos anti-Forssm an) habitualm ente m uestran
un incremento que llega al máximo alrededor
de los 90 minutos, y luego la curva se aplana y
mantiene constante su actividad. Otras hemoli­
sinas, sobre todo las preparadas por inmuniza­
ción de animales con glóbulos intactos lavados
(mezcla de anticuerpos isófilos y heterófilos),
tienen características distintas, ya que muestran
una marcada actividad en los primeros momen­
tos y continúan luego una curva ascendente que
se prolonga por un tiempo bastante largo (fig.
22-19). Se supone que ese com portam iento
puede ser debido a la disociación de complejos
F ig. 22-19. D istinto com portam iento de hem olisinas de conejo anti-carnero obtenidas: a, por inm unización con estro m a
de glóbulos rojos; b, por inoculación de glóbulos rojos lavados.
Complemento 425
hematíe-anticuerpo, seguida de una nueva reac­
ción con otros sitios antigénicos en la m ism a o
en otra célula, lo que originaría una continua
transferencia de sitio a sitio o de célula a célula
durante la reacción.
Como corolario de estas observaciones con­
viene recordar que en todos los ensayos de in-
munohemólisis deben utilizarse preferentemente
hemolisinas obtenidas por inmunización de co­
nejos con esti'oma de glóbulos rojos calentados
(anti-Forssman), ya que los mismos se caracteri­
zan porque su actividad hemolítiea es marcada­
mente superior a su capacidad aglutinante.
La cantidad óptima de hemolisina para utili­
zar en la reacción debe ser establecida por en­
sayos previos, y han de elegirse preferentem en­
te aquellos sueros hemolíticos que se caracteri­
zan por dar curvas que presentan una m eseta
terminal. Estos hechos conviene tenerlos p re ­
sentes, ya que permitirán reducir en parte los
múltiples factores que pueden variar los resu l­
tados cuando se efectúen reacciones de fijación
del complemento con fines diagnósticos o de
identificación.
VALORACIÓN DE LA ACTIVIDAD
FUNCIONAL DEL COMPLEMENTO ■
POR LA VÍA ALTERNA
El dosaje de esta actividad puede hacerse, al
igual que para la vía clásica, en unidades 100%
h e m o lític a s (V A H ,„„) y 50% h e m o lític a s
(VAH,„).
Minutos
426 Mecanismos efectores de la respuesta inmune
El método es similar al de la vía clásica. La
diferencia fundamental radica en que el sistema
revelador está constituido por glóbulos rojos de
conejo no sensibilizados por anticuerpos. Estos
eritrocitos, por su bajo contenido en ácido siáli­
co, son capaces de activar el complemento por
la vía alterna. Si a un suero fresco (fuente de
complemento), conteniendo EGTA (ácido eti­
lenglicol amino etil tetraacético) 10 mM, sus­
tancia quelante de Ca^'' y no de Mg^^ a esa con­
centración, ya que el EGTA es 100 veces mejor
complejante de Ca^+ que de Mg^+, se lo mezcla
con una suspensión de glóbulos rojos de cone­
jo, al estar bloqueada la capacidad de actividad
de la vía clásica, cualquier hemoglobina libera­
da será un índice de la actividad funcional del
complemento por la vía alterna.
El método de dosaje que se describirá es el
que mide actividad en unidades VAHjg, y las
precauciones que se deben tener son las m is­
mas que las indicadas para la determinación de
las unidades CH^g por la vía clásica.
Materiales necesarios
a) Buffer. El diluyente que se usa para los
ensayos de activación del sistema complemen­
to por la vía alterna se prepara añadiendo a 83
voMmenes de buffer de veronal-cloruro de so­
dio, pH 7,2 de Mayer libre de Ca^+ y Mg^+, 10
volúmenes de EGTA 0,1 M, pH 7,2 y 7 volú­
menes de MgClj 0,1 M (DFC-VA).
Antes de su uso añadir 0,1% de gelatina.
b) Suero para valorar. Se lo obtiene por coa­
gulación de sangre extraída por punción veno­
sa. El suero separado por centrifugación se
conserva congelado. A -20°C resulta útil hasta
una semana, y hasta 3 meses si se lo mantiene a
-70°C . Inm ediatamente antes de su uso se le
añade EGTA y MgCI^ hasta una concentración
de 10 mM y 7 mM, respectivamente.
c) Eritrocitos de conejo. Se los obtiene a
partir de sangre recogida por punción de la ve­
na marginal de la oreja, que se mezcla con 20%
v/v de solución de AIsever. Los eritrocitos se­
parados por centrifugación se lavan tres veces
con DFC-VA y finalmente se los súspende al
1% en este diluyente.
Método
Efectuar con ei suero conteniendo EGTA 10
mM y M gC lj 7 mM diluciones en razón 2,
usando como diluyente DFC-VA. En pequeños
tubos de hemólisis mezclar 0,2 mi de cada dilu­
ción con 0,2 mi de DFC-VA y 0,2 mi de glóbu­
los rojos de conejo al 1%. Incubar a 37°C por
30 minutos y detener la reacción mediante el
añadido a cada tubo de 2 mi de buffer de Ma­
yer libre'de Ca^+ y Mg^+, adicionado de EDTA
0,01 M. Centrifugar a 2.000 rpm durante 1 mi­
nuto y leer la absorbancia de los sobrenadantes
a 413 nm. Esto da la medida de la hemoglobina
liberada por hsis, con la que puede calcularse
“y” y mediante la aplicación de la ecuación de
von Krogh x = K (y/100-y)‘^"; en forma similar
a la indicada en determinación de las unidades
de CHjg, establecer las VAH.^(, del suero.
Los controles que se deben incluir en este
ensayo son los siguientes: 1) suero conteniendo
EDTA 10 mM para inhibir la activación del
complemento por ambas vías, la clásica y la al­
terna (control negativo, 0% de lisis); 2) control
de 100% de lisis preparado con 0,2 mi de sue­
ro, 0,2 mi de glóbulos rojos de conejo, 0,2 mi
de DFC-VA y 2 mi de agua destilada, y 3) si
los sueros para analizar contienen hemoglobina
liberada durante la separación debe prepararse
un blanco constituido por una serie paralela de
diluciones del suero (0,2 mi) a los que se le
añaden 2,4 mi de buffer de Mayer libre de Ca*'^
y Mg^+, adicionado de EDTA 0,01 M. En este
caso, el cálculo del valor de “y ” para cada dilu­
ción del suero se hace de acuerdo con la si­
guiente fórmula:
DO tubo de reacción - DO blanco
correspondiente a ese tubo
“y” = ----------- ^
----------------
DO testigo 100% lisis - DO testigo
0% lisis
M EDIDA DE LA CAPACIDAD
DE DIFERENTES SISTEMAS
PARA ACTIVAR EL COMPLEMENTO
POR LA VÍA ALTERNA
Existen numerosos métodos para ello. Algu­
nos usan técnicas muy sofisticadas y difíciles de
llevar a cabo. El método que se describe se fun­
da en la característica particular de los glóbulos
rojos de conejo de activar el complemento por
la vía alterna. Si la sustancia o complejo que se
ha de ensayar se mezcla con suero fresco (fuen­
te de complemento) conteniendo EGTA, al es­
tar bloqueada la capacidad para activar el com­
plemento por la vía clásica, cualquier consumo
de complemento que ocurra por la vía alterna
dará como resultado una disminución de éste en
el suero. Si a ese sistema se le añaden eritroci­
tos de conejo no sensibilizados con anticuerpo,
una reducción en la hemólisis, comparada con
controles en los que el sistema activador en en­
sayo ha sido eliminado, será proporcional a la
concentración del sistema activador.
Materiales necesarios
Los descritos en valoración del complemen­
to por la vía alterna.

M étodo
Conociendo la actividad VAH,g de un suero,
d ilu irlo en D F C -V A h a sta '25 u n id a d e s
VAHjp/ml (0,2 ml = 5 VAHjp). A 0,2 ml de esa
dilución añadirle 0,2 ml del sistema que se ha
de ensayar (disuelto o suspendido en DFC-VA)
e incubar a 37“C durante 30 minutos. Frenar la
reacción por el añadido de 2 ml de buffer de
Mayer libre de Ca^^ y Mg*+, adicionado de ED ­
TA 0,01 M. Centrifugar a 2.000 rpm durante 1
minuto y en los sobrenadantes medir la hem o­
globina liberada como se indicó para dosaje de
VAHjg. Incluir en la reacción controles de 0%
y 100% de lisis.
El porcentaje de complemento consumido se
calcula aplicando la siguiente fórmula:
% de complemento consumido
Am - At
= ----------------- X 100
Am - Ab
siendo Am: absorbancia a 413 nm del control
de 100% de lisis; Ab: absorbancia a 413 nm
del control negativo (0% lisis); y At: absorban­
cia a la m ism a longitud de onda del sistem a
analizado.
Si se sospecha que el sistema para analizar
puede causar autólisis de los eritrocitos de co­
nejo, es necesario incluir un control constituido
por ese sistema y eritrocitos de conejo en au­
sencia de suero (fuente de complemento).
El método puede transformarse en cuantitati­
vo desarrollándolo en una batería de tubos con
cantidades crecientes del sistema a ensayar.
V A LO R A CIO N DE LOS
C O M PO N EN TES
DEL C O M P L E M E N T O
Inicialmente se utilizaron métodos que em ­
pleaban un reactivo constituido por todos los
componentes del complemento, excepto el que
se quería valorar, el cual era adicionado a una
serie de diluciones del suero cuyo componente
interesaba medir. A cada uno de los tubos de la
serie, igualados en volumen, se le adicionaba
un volumen igual de glóbulos rojos sensibiliza­
dos. Previa incubación a 37“C se determinaba
cuál era la máxima dilución del suero que pro­
ducía 100% de lisis, correspondiendo la inversa
de dicha dilución al número de unidades por ml
del componente que se valoraba. Los reactivos
utilizados para la valoración de C l, C2, C4 y
C3 global (C3-C9), se denominan, respectiva­
mente, R l, R2, R4 y R3.
Mejor información suministran aquellos m é­
todos que miden la actividad de cada com po­
Complemento 427
nente del complemento haciendo actuar al sue­
ro sobre glóbulos rojos sensibilizados que ya
han fijado óptim am ente a las fracciones del
complemento que interaccionan antes del com ­
ponente a valorar, y modificándolo de tal modo
que los restantes no se fijen. Para valorar C4 se
utilizará E A C l, y para C2 EAC 14b.
C onsiderando que en alguna oportunidad
puede interesar la dosificación de C l, C2, C4 y
C3 global con R l, R2, R4 y R3, respectiva­
mente, se describirá dicho método previo a la
valoración de los componentes del complemen­
to mediante las correspondientes células inter­
medias.
P re p a ra c ió n d e Rl y R2
Para su obtención es necesario preparar “p ie­
za m edia” y “pieza terminal”, ya que esta últi­
ma está constituida por C2 y C4 y la pieza m e­
dia por C l y C3. Si ambas son enriquecidas
con suero calentado a 56°C durante 30 minutos
(C3 y C4), se obtendrán dos reactivos en los
que estarán ausentes C l y C2 respectivamente,
en tanto que los restantes com ponentes del
com plem ento se hallarán a concentraciones
normales. La pieza media puede prepararse por
dilución o diáhsis, de acuerdo con técnicas in­
dicadas por distintos investigadores.
Un método recomendado es el descrito por
M ayer, el que puede ser utilizado tanto p ara
suero humano como de cobayo: añadir un v o lu ­
men de suero fresco helado, con a g itac ió n
constante, sobre 10 volúmenes de fosfato mo-
nopotásico 0,02 M enfriado. Mantener a 0°C y
después de 20 a 30 minutos centrifugar rápida­
mente en frío, separando el sobrenadante del
precipitado. El precipitado, en el caso de suero
de cobayo, es lavado con solución de fosfato de
pH 5,4 y fuerza iónica 0,02 (este lavado no de­
berá efectuarse en el caso de suero hum ano,
por su menor contenido de C2). El precipitado
se disuelve en cloruro de sodio 0,15 M y se
ajusta a pH 6,5-7 con bicarbonato de sodio 0,1
N, diluyendo a un volumen cinco veces supe­
rior al del original. Esto constituye la pieza m e­
dia, rica en C l y C3. Para ser transformada en
R2 debe añadírsele, en el momento del uso, un
volumen igual de suero calentado a 56“C du­
rante 30 minutos y diluido 1/5 eon el objeto de
enriquecerla en C3 y C4.
El sobrenadante de la operación anterior o
pieza terminal se lleva a isotonía con cloruro
de sodio al 10% y rápidamente a pH 7,5 con bi­
carbonato de sodio 0 ,1 N, ya que a pH inferio­
res a 6,5 este reactivo resulta inestable. Su dilu­
ción final es 1:2 y para transformarlo en R l, al
igual que se describió en R2, es necesario m ez­
clarlo en el momento del uso con volúm enes
iguales de suero calentado diluido 1/5.
428 Mecanismos efectores de la respuesta inmune
P r e p a r a c ió n d e R 3
La inactivación de C3 puede lograrse de dis­
tintas maneras, siendo la más corriente la que
emplea zimosán, un poliósido insoluble obteni­
do de la levadura de cerveza. Tiene la particu­
laridad de combinarse a 37“C, fuerza iónica no
superior a 0,15 y pH entre 6,8 y 8,6 con la pro­
perdina; activa la vía alterna consumiendo C3,
no así C l, C2 y C4. Las cantidades de zimosán
necesarias para inactivar 1 ral de suero humano
varían entre 1 mg y 1,35 mg, requiriéndose
cantidades mayores para inactivar el mismo
volumen de suero de cobayo. Para preparar R3
por este procedimiento es necesario activar pre­
viamente el zimosán, para lo cual 10 mg del
mismo se suspenden en 1 mi de NaCl 0,15 M y
se calientan en baño de agua a ebullición du­
rante media hora.
Se centrifuga, y al sedimento que contiene
el zimosán activado se le añaden 10 mi de sue­
ro fresco humano, el que es incubado a 37°C
por una hora, agitando periódicam ente con el
objeto de suspender el zimosán. Se centrifuga,
repitiendo una segunda adsorción del sobrena­
dante con zimosán, si fuera necesario y se lo
diluye finalmente con solución de cloruro de
sodio 0,15 M a un volumen cinco veces mayor
que el original. E ste reactivo así preparado
constituye R3.
P r e p a ra c ió n de R4
Se lo obtiene por tratamiento de suero fresco
con amoníaco. Para ello a 1 mi de suero se le
añade 0,25 mi de amoníaco 0,15 N. Se deja en
contacto a 37°C durante 1 hora y m edia y se
n eutraliza con 0,25 mi de ácido clorhídrico
0,15 N. Para su uso se lo diluye en el quíntuplo
del volumen inicial.
R l, R2, R3 y R4 deben ser probados a efec­
tos de establecer que no tienen actividad anti­
complementaria. Si la tuvieran, debe ser titula­
dos, y el reactivo, diluido a concentración con­
veniente para que no interfiera en la reacción.
De todos ellos R2 es el que con más frecuencia
presenta actividad anticomplementaria.
C u ad ro 2 2 - 5 . Valoración de C l
Tubos 1 2
S uero fresco diluido 1:10 0,05
R eactivo R 1 0,25
B uffer-barbital salino 0,45
S istem a hem olítico* 0,50
* G ló b u lo s ro jo s de carnero 5 x 10^ céí/m ¡ y 4 A cH |„p/m í e n p arte s ig u ales
El método de valoración para C l, C2, C3 y
C4 es el mismo en todos los casos; la diferen­
cia consiste en el empleo de R l, R2, R3 y R4
según el componente a valorar. El cuadro 22-5
corresponde a un dosaje de C 1 y puede ser to­
mado como tipo para la valoración de los otros
componentes.
Estos métodos de valoración, si bien fueron
utilizados inicialmente, no son correctos para
establecer la actividad lítica del complemento,
ya que la misma depende, no de las cantidades
absolutas de cada uno de los componentes pre­
sentes, sino de ciertas relaciones entre ellos. Lo
más acertado es hacerlo mediante la determina­
ción de la capacidad que cada uno de ellos tie­
ne para transformar células en el estado ante­
rior a su intervención, en células activadas por
su presencia. La actividad de C2, por ejemplo,
se establece determinando la cantidad de célu­
las que en estado EAC 14b se transforman en
EAC14b2a.
P re p a ra c ió n d e c é l u la s EAC 1
Puede hacerse m ezclando glóbulos rojos
sensibilizados (EA) con R4, lo que permite, en
presencia de Ca^+ y ausencia de Mg^+, única­
mente la fijación de C l. Para ello en un reci­
piente de vidrio adecuado se colocím 100 mi de
éter etílico no anestésico, los que son calenta­
dos a 30”C en un baño de agua. Se los agita con
la ayuda de un agitador magnético y se añaden
4 mi de suero fresco de cobayo, continuando
con la agitación durante cinco minutos. Se de­
canta rápidamente el éter y se eliminan los res­
tos con aire comprimido. El suero así obtenido
se diluye 1/10 con buffer barbital salino añadi­
do de Ca^+ 0,001 M y se lo conserva en baño de
hielo hasta el momento del uso.
Para la preparación de células E A C l, 1,5 mi
de EA a la concentración de 5 x 10* células ' y
suspendidas en buffer con Ca^+ 0,001 M, pre­
viamente calentadas a 37°C, son mezclados con
5 mi de la dilución 1/10 del suero-éter, también
calentados a 37°C. La mezcla es incubada a esa
temperatura durante diez minutos, centrifugada
3 4 5 6 7 8 9
0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45
0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05
0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50
Incubar I hora a 37°C
Lectura de los resultados

luego y lavada dos veces con 10 mi de buffer
adicionado de Ca^+ 0,001 M; finalmente las cé­
lulas se suspenden a 10"^ células/ml. Deben ser
conservadas a 0“C.
P re p a ra c ió n d e c é lu la s
EAC14b
Se utiliza el método descrito por Mayer, el
que se basa en el hecho de que a 0“C y en pre­
sencia de Ca^+ sólo se fijan a células sensilíili-
zadas C l y C4. Teniendo en cuenta que a 37°C
EAC14b2b revierte a EAC14b, el pasaje previo
del suero de cobayo por columna de intercam­
bio, para ehminar magnesio, no es indispensa­
ble. Por lo tanto, para obtener las células desea­
das, se mezclan 10 mi de EA a la concentra­
ción de 10‘^ cél ■ mi *, suspendidas en buffer
adicionado de Ca^+ 0,001 M, con 0,5 a 1 mi de
suero fresco de cobayo, los que son incubados
a 0"C, con agitación periódica, por un tiempo
que oscila entre 30 y 90 minutos, el que debe
ser correctamente establecido, en ensayos pre­
vios, para cada lote de complemento. Este debe
ser tal que las células E* formadas no excedan
del 5%.
Después de la incubación se centrifuga, se
elimina el sobrenadante, se lavan las células
dos veces con buffer enfriado, se suspenden
en 20 mi del mismo y se incuban a 37°C du­
rante 90 minutos. Se centrifuga, se elimina el
sobrenadante y las células E A C Í4b se suspen­
den en b u ffer con Ca^“" 0,00015 M y Mg^+
0,005 M a la concentración deseada. Se con­
servan a 0°C durante varios días, siendo con­
veniente hacer un lavado con el mismo buffer
antes de su uso.
P re p a ra c ió n d e c é lu la s
EAC14b2b
Un método muy utilizado es el de Levine y
colaboradores, para lo cual a 10 mi de células
EA (10‘^ cél • m f') suspendidas en buffer adi­
cionado de Ca^+ y Mg^+ se les añade 1 mi de
suero fresco de cobayo y se incuban a 0°C du­
rante 30 a 40 minutos. Se centrifugan, se elim i­
na el sobrenadante y se suspenden en buffer
con Ca^+ y Mg^+ a la concentración deseada.
Antes del uso, mantenerlas a 0“C durante 4 ho­
ras para que todas las células E* que pudieron
formarse se destruyan, centrifugando luego en
frío y suspendiendo finalmente en buffer.
Otra manera de preparar EAC14b2b es tra­
tando EA con suero adicionado de floridzina,
la que actúa como inhibidor de C3.
A 1 volumen de EA al 5% (10^» EA • m f )
añadir 1 volumen de floridzina (10,6 mg de flo­
ridzina • mi ’ de buffer de veronal adicionado
de Mg2+ y Ca^+) y 0 ,1-0,2 volúmenes de suero
Complemento 429
humano normal (fresco). Después de mantener
a 37“C por 90 segundos, interrumpir la reac­
ción por el añadido de buffer de veronal frío;
lavar dos veces con el mismo buffer y resus­
pender, llevando las células a la concentración
inicial (buffer de veronal adicionado de Mg^+ y
Ca2+).
En lugar de EAC142 puede prepararse el de­
rivado EAC142oxy, el que resulta mucho más
estable pues el componente C2 previo a su fija­
ción es oxidado con iodo, y como ya se indica­
ra, la vida media del complejo que se form a es
superior (62 minutos a 32°C). Además, la acti­
vidad hemolítica se incrementa 5 a 6 veces.
El método de preparación es similar al arriba
indicado, con la diferencia de que el tiem po de
contacto a 37“C de la m ezcla constituida por
EA, floridzina y suero iodado es de 13 minutos
en lugar de 90 segundos.
El suero iodado se prepara añadiéndole al
suero fresco una solución de 12 en IK hasta
concentración final en I^ de 5 x 1 0 '•M.
Conviene tener preparada una solución ma­
dre de L lO ^M en IK 5 X lO 'M. (Disolver 0,25
g de Ij y 8,3 g de IK en 4 mi de buffer de fosfa­
tos 0,1 M, pH 7,6. Completar a 100 mi con el
m ism o buffer.) Para cualquier dilución de la
solución concentrada utilizar el buffer de fosfa­
tos indicado.
Se han descrito numerosos casos de inmuno-
deficiencias asociadas a déficit genético de al­
gunos de los componentes del sistema com ple­
mento. Deficiencias de C2 y C4 han sido detec­
tadas en casos de glomerulonefritis y lupus eri­
tematoso sistémico; de C3 en infecciones gra­
ves por bacterias piógenas; así como de los
constituyentes del MAC (C5-C9) detectadas en
pacientes con infecciones por microorganismos
de lo calizació n in tracelu lar, esp ecialm en te
Neisserias. (Para mayor información véase cap.
30.) Disponiendo de sueros de estos pacientes,
es posible usarlos como excelentes reactivos
que sustituyen a los antes indicados en la pre­
p aració n cíe células EA sensibilizadas (Ej.:
E A C l; EAC14b; EAC14b2b; etc) para la valo­
ración en sueros desconocidos de domponentes
individuales del complemento. Sueros deficien­
tes en C2 o C3, por ejemplo, resultan útiles pa­
ra la preparación de células a usar en la titula­
ción en sueros de los componentes C2 y C3,
respectivamente.
V a lo ra c ió n de C l, C4, C2 y C3 g lo b a l
(C3C9)
Valoración de C l
Transformar el suero a valorar en R4 por tra­
tamiento eon NH3 y HCl para eliminar C4.
430 Mecanismos efectores de la respuesta inmune

Tubos / 2 3 4 5 6 7

EA 5% en buffer con Ca^+ .sin 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Suero a valorar (R4) en buffer con 1;2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128
Ca^+ sin Mg^*' (0,5 ml diluido)

Incubar 10 m inutos a 37‘^C

C en trifu g a r, lav a r y su sp en d e r e n b uffer c o n y iVlg^^ (0,5 m l p o r liibo). E n esta p rim era in cubación las cé lu la s E A se tran sfo rm aro n en
E A C l (B).

Tubos / 2 3 4 5 6 7

E A C l (B) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0.5

Rl 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Incubar I hora a 37°C
N aC I 0,15 M , helado 5 5 5 5 5 5 5

C en trifu g a r, v alo r liem o g lo b in a en el so b re n ad an te por lec tu ra esp e ctro fo to m étric a a 541 nm y c a lcu lar la in v ersa de la d ilución que da 50%
d e lisis. L a m ism a c o rresp o n d e a las un id ad e s de C l p o r m l de suero.
E n la re acc ió n deb e n incluirse testig o s d e 0% y 100% d e hem ólisis.

Valoración de C4
El suero a valorar debe ser previamente calentado a 52“C durante 30 minutos para destruir C l
yC2.

Tubos 1 2 i 4 5 6 7

E A C l 5% en buffer con Ca^+ sin 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
M g 2-^
D iluciones suero a valorar calenta­ 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128
do, en buffer con Ca^'^ sin Mg^+
(0,5 ml)

Incubar 10 m inutos a 37“C

Centrifugar, lavar y suspender en buffer con Ca^+ y (0,5 ml por tubo). En esta primera incubación las células EACl se transformiiron
en EACI4b (B).

Tubos 1 2 3 4 5 6 7

EA C 14b (B) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

R4 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Incubar 1 hora a 37°C
N aC I 0,15 M , helado 5 5 5 5 5 5 5

C entrifugíir, v alo r h e m o g lo b in a en el so b re n ad an te p o r lectura esp e ctro fo to m étric a a 541 nm y c a lcu lar la in v ersa d e la d ilu ció n q u e d a 50%
d e lisis. L a m ism a co rresp o n d e a las u n id ad e s de C 4 p o r m l de suero.
E n la reacción deb e n in clu irse testig o s de 0% y 100% d e hem ólisis.

Valoración de C2
Transformar el suero a valorar en R4 por tratamiento con NH3 y HCl para destruir C4.

Tubos 1 2 3 4 5 6 7

E A C l4 b 5% en buffer con Ca^* y 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Mg^t
D iluciones suero a valorar (R4) en 1:4 1:8 1:16 1:2 1:32 1:64 1:128
buffer con Ca^+ y Mg^+ (0,5 ml/dil.)

incubar 30-60 m inutos a 0*’C*

C en trifu g a r, lav a r y su sp en d e r en b u ffer sin Ca^'" ni Mg^'" (0,5 m l p o r tubo). E n esta p rim era eta p a d e cé lu la s E A C 1 4 b se tran sfo rm aro n en
E A C 1 4 b 2 b (B ).
 Complemento 431

Tubos

E A C U b lb (B) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Suero ED TA (suero fresco de co ­ 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
bayo 1:3() en ED T A 0,005 M )
Incubar 1 hora a 37‘’C
N aC I 0 ,15 M, helado 5 5 5 5 5

CevUvvfv\gaY, valovar h e m o g lo b in a a n los 'iobvemtlanVeíi p o r le c tu ra especlrofotom éV rica a 541 nm y c a lc u la r la in v ersa de la dilución q u e da

el 50% de iisis. L a m ism a c o rre s p o n d e a las iinidacies de C 2 p o r m i d e suero analizado.
E n la re acc ió n deb e n in clu irse testig o s de 0% y 100% de hem ó lisis.
* E l tiem po ex a c to d eb e d e te rm in a rs e p re v ia m en te por tanteo. D e b e n se r tal q u e n o p e rm ita la fo rm a ció n de m ás d e un 5% d e células E .*

Valoración de C3-global (C3-C9)

Tubos 2 3 5

EA C 14b2a 5% en buffer sin Ca^+ 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
ni
Suero a valorar-ED TA . D ilucio­ 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512
nes del suero en EDTA 0,005
]M en buffer sin Co^+ ni IVIg^’"
(0,5 m l/dil.)
Incubar 1 hora a 37°C
N aCI 0,15 M , helado 5 5

C entrifugar, v a lo r h em o g lo b in a en los so b re n ad an te s y c a lcu lar las un io n es del C 3 g lo b al C 3-C 9 co m o se in d icó p a ra lo s otros co m p o n e n te s

del com piem eirto.

Valoración de otros componentes Por inmunodifusión radial pueden cuantifí-

del complemento c a rs e C 3 ,C 4 ,C lq y B .

La valoración de los restantes componentes

del complemento resulta difícil en los laborato­ VALORACIÓN DE PROPERDINA*
rios corrientes, ya que para ello son necesarios
componentes purificados y sueros con deficien­ El método que se describe resulta muy útil
cias en algunos de los componentes. Como ya para valorar properdina, proteína no anticuerpo
se ha indicad o, se conocen fam ilias cuyos presente en el suero humano y de otros verte­
miembros presentan deficiencias de C2, coba­ brados, la que tiene la particularidad de com-
yos con deficiencias de C4, ratones con defi­ plejarse con Zimosán y fijar C3, constituyendo
ciencias de C5 y conejos con deficiencias de un sistema con poder bactericida inespecífico.
C6. Sus sueros son muy útiles para la prepara­ Su contenido sérico se expresa en unidades.
ción de células intermedias y de los reactivos La unidad constituye “la mínim a cantidad de
que actúan sobre éstas. suero que en presencia de Zimosán inactiva d u ­
rante 1 hora a 37°C 120 unidades de C3 conte­
Componentes del complemento valorados nidas en 1 mi de RP”. La inversa de dicha can ­
como antígenos tidad constituye el número de unidades por mi
que contiene la muestra analizada.
Los métodos anteriormente descriptos p er­
miten medir la actividad funcional de los com­ M aterial necesario
ponentes del complemento.
Teniendo en cuenta que son proteínas anti­ a) Zimosán: debe ser de buena calidad, y uno
génicas, mediante el empleo de antisueros m o­ de los más utilizados el de Fleichsmann L abo­
n o esp ecífico s algunos de ello s pueden ser ratories. Quince mg de Zimosán suspendidos
cuantificados por inm unodifusión radial. Por en 2 mi de NaCl 0,15 M se calientan durante
este método se tiene conocimiento de la con­ una hora en baño de agua hirviendo. Se centri­
centración sérica del componente del comple­ fuga, se elimina el sobrenadante y el sedimento
mento cuantificado, pero no de su actividad. se resuspende en 1 mi de buffer Veronal-sali-
Además, está limitado por la concentración en no. Cada 0,1 mi contiene 1,5 mg de Zimosán.
que ellos se encuentran en el plasma, ya que
hay algunos en que ésta es inferior a los límites * M argni, R. A. L aboratorio (G ranada - España) p. 5 0 1 ,
de resolución del método. 1967.
432 Mecanismos efectores de ia respuesta inmune

Tubos

RP a valorar (0,5 m l/tubo) dil. 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256

S istem a hem olítico 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
B uffer veronal-salina 0,5
A gua destilada 0,5
Incubar a 37"C durante 30 minutos
Solución frenadora citrato-salina 4 4 4 , 4 4
C entrifugar a 3.500 rpm durante 5 minutos

b) Buffer Veronal-salino: se utiliza el indi­ de unidades CH^^ que contiene el RP anali­

cado en reacciones de fijación del com ple­ zado.
mento. Para la valoración de properdina conviene
c) Reactivo RP: se lo obtiene tratando suero ajustar el RP a 100-120 unidades CH,g/mf'.
fresco humano o de cobayo con Zimosán. Para d) Reactivo R3: consiste en un suero despro­
preparar 3 ml de reactivo se procede de la si­ visto de properdina y C3. Se prepara de igual
guiente manera: se suspenden 20 mg de Zim o­ manera que RP, pero incubando a 37°C en lu­
sán en 4 ml de NaCl 0,15 M y se los hierve du­ gar de 17“C. Contiene cofactores. Para su pre­
rante una hora. Se los reparte en voMmenes paración conviene usar suero humano, ya que
iguales en dos tubos de hemólisis, se centrifu­ el de cobayo, por su bajo contenido en proper­
ga, se elim ina el sobrenadante y se añade a dina y alto título de C, resulta difícil de agotar
uno de ellos 3 ml de suero fresco humano o de en C3.
cobayo, manteniéndolo con agitación periódi­ La valoración del reactivo se hace previa­
ca a 17 + 1“C durante una hora. Se separa el mente a su preparación, enfrentando 1 ml de
sobrenadante por centrifugación, se lo vierte diluciones crecientes de suero fresco con 1 ml
sobre el segundo tubo que contiene Zimosán y de sistema hemolítico y determinando cuál es
se vuelve a repetir el tratamiento anterior. El la máxima dilución que produce 100% de lisis
sobrenadante de centrifugación constituye el después de 30 minutos de incubación a 37“C.
reactivo RP. Su conservación es precaria, por El reactivo debe contener 2 unidades en 0,05
lo que conviene prepararlo para su uso inm e­ ml. Se conserva como el RP.
diato y mantenerlo en baño de hielo. Congela­ e) Sistema hemolítico: se lo prepara comp
do,a - 4 0 “C se conserva por algunos días. se indicó al hablar de valoración de com ple­
Consiste en suero fresco desprovisto de pro- mento. La mezcla final debe contener partes
perdin" y se lo valora en unidades hemolíticas iguales de glóbulos rojos de carnero al 5% y
50% (CH jq). La valoración se hace de acuerdo hem olisina a la concentración de 5 unidades
con el siguiente esquema, utilizando como di­
luyente de RP buffer Veronal-salino.
La hemoglobina liberada se lee en el espec­
A c H j/m f.
f) Solución frenadora de hemólisis: citrato
de sodio al 4% en NaCl 0,15 M.
S
trofotómetro a 565 nm, en DO, utilizando el tu­ g) Pipetas de 0,2, 1 ml y 5 ml.
bo 6 como blanco. El tubo 7 corresponde al h) Gradillas, baño termorregulado, centrífu­
100% de lisis y con él se calculan los otros por­ ga.
centajes de hemólisis, por relación directa entre i) Espectrofotómetro.
su DO y la de los tubos restantes. Con esos va­
lores se determ inan las unidades CH50 del
reactivo RP, mediante cualquiera de los méto­ C u ad ro 22-6
dos descriptos al hablar de valoración de com­
plemento. Para las condiciones del ensayo, el % de Usis Factor % de Usis Factor
valor de 1/n en la ecuación de von Krough es i
20 0,68 53 1,03 5p
0,28. A partir de x = se ha calculado
23
25
0,71
0,73
55
58
1,06
1,09 1
28 0,77 60 1,12 ei
30
33
0,79
0,82
63
65
1,16
1,19
li
el cuadro 22-6 con el que directamente pueden 35 0,85 68 1,23
determinarse las unidades CH,„. Para ello sólo 38
40
0,88
0,90
70
73
1,26
1,31
II
es necesario multiplicar la inversa de la dilu­ 43 0,93 75 1,35
ción que más se aproxime al 50% de lisis por 45 0,95 78 1,43
el factor indicado en el cuadro para ese grado 48
50
0,98
1
80 1,49 1
de lisis. El resultado corresponderá al ntimero i

I
 Complemento 433

Método Para establecer las unidades de properdina se

La properdina se valora de acuerdo con los
esquemas indicados (Primera y Segunda etapa).
Las valoraciones de hemoglobina en las se­
ries de diluciones correspondientes a los tubos
A y B se efectúan al espectrofotómetro, a 565
nm, leyendo en DO.
Las unidades de complemento residual (C3)
se calculan de manera similar a la indicada en
valoración de RP, correspondiendo los tubos
11 y 12 al O y 100% de lisis respectivamente.
La serie del tubo A indica el complemento
(C3) existente en RP, no fijado por el sistema
properdina-Zimosán, más el C3 propio del sue­
ro a valorar. La serie del tubo B corresponde a
la suma del C3 existente en RP y el del suero
en valoración.
P rim era etapa
Tubos A B
Suero a valorar 0,1
Reactivo RP 1 1
Suspensión de Zim osán 0,1
(0,15 m g/ 0,1 mi)
B ufer V eronal-salina 0,8
Incubar una hora a 37°C
C entrifugar a 3,500 rpm durante 5 minutos
aplica la siguiente ecuación;
[CHjo (tubo B) - CH 50 (tubo A)] x 4 x 10
120
por mi, o en su forma simplificada;
[CHjo (tubo B) - CH 5Q(tubo A)]
------------------------------------------------: U de properdina p o r m i
3
En la ecuación los valores indicados corres­
ponden a:
4; V o lu m en de v a lo ra c ió n 0,5 m i de
un v o lu m en in ic ia l 2 m i. D ilu c ió n
2/0,5 = 4.
10; La cantidad de suero a valorar que se
enfrenta con 1 mi de RP es 0,1 mi. D i­
lución 1/0,1 = 10.
120: Como 1 unidad de properdina co rres­
ponde a la inactivación de 120 unida­
des de C3, es necesario dividir por 120
a las unidades de C3 consumidas para
0,1 establecer las unidades de properdina
por mi.
-
0,9
Los sueros a valo rar deben ser fre sc o s y
mantenidos en baño de hielo hasta su uso. En
caso contrario debe conservárselos congelados
a -4 0 “C no más de una semana.

Segunda etapa

Tubos I 0 i 4 5 6 7 S 9 10 II 12

Sobrenadante A (0,5 m i) diluc. 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 - _

S obrenadante B (0,5 m i) diluc. - - - - - 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 - -

R eactivo R3 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05
B uffer V eronal-salina 0,45 0,45 0,45 0,45 0,45 0,45 0,45 0,45 0,45 0,45 0,95
A gua destilada 0,95
Sistem a hem olítico 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
In cu b ar 30 minutos a 37»C
Solución frenadora (citrato-salina) 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

Centrifugar a 3. 500 rpm durante 5 m inutos y leer

en el fíobrenadante la hem oglobina liberada

DOSAJE DE LA ACTIVIDAD Mg^+. A 0,95 mi de suero dializado añadir 0,05

FUNCIONAL DE PROPERDINA
El método se funda en la determinación de
las unidades VAH^p en un suero, utilizando un
reactivo al que se le ha eliminado el com po­
nente B.
mi de una solución constituida por MgCl^ 100
nM, EGTA 100 mM, pH 7,2 (reactivo RBM g-
EGTA).
Otros reactivos. Son los indicados en la va­
loración de la actividad funcional del com ple­
mento en unidades VAtL„.

Materiales
R eactivo carente del com ponente B (RB).
Mezclar 9 volúmenes de suero humano fresco
con un volumen de EDTA 0,086 M. Calentar a
50“C por 20 minutos y dializar a 4°C contra ex ­
ceso de buffer de M ayer carente de Ca^+ y
Método
P reparar diluciones de suero en D FC-V A
como se indicó para VAH^q.
En una batería de tubos colocar 0,2 mi de las
diluciones del suero que se ha de ensayar, 0,2
mi de RB-Mg-EGTA y 0,2 mi de glóbulos ro­
434 Mecanismos efectores de la respuesta inmune
jos de conejo al 1% en DFC-VA, continuando
la reacción com o se indicó para dosaje del
complemento en unidades VHAjp.
Los resultados son expresados por compara­
ción con la lisis obtenida en presencia de dilu­
ciones de una mezcla de sueros normales de re­
ferencia.
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385-452. A cadem ic P ress Inc., 1983.
Inflamación
NORMA SPEZIALE
M EC A N ISM O S BÁSICOS
DE LA INFLAMACIÓN
1. CARACTERÍSTICAS DEL PROCESO
INFLAMATORIO
La inflamación es un proceso cjue ocurre lue­
go de la injuria a un tejido. Puede ser descripta
como una respuesta de irritación a la injuria. Se
caracteriza por presentar movimiento de fluido,
proteínas plasmáticas y leucocitos a los tejidos
en respuesta a la injuria, invasión microbiana o
antígenos.
El propósito de esta respuesta es la de conte­
ner o destruir la injuria patógena y retirar del
tejido los desechos que resultaron de la re s­
puesta inflamatoria.
La inflamación se caracteriza por la presen­
cia de calor, rubor, edema, dolor y pérdida de
la función celular. Todos estos signos ocurren
como consecuencia directa de cambios en la
permeabilidad vascular que permite el escape
de electrólitos, macromoléculas y células desde
los vasos sanguíneos al espacio extravascular.
La inflamación es un proceso complejo que
involucra a num erosos mediadores de origen
celular y plasmático con efectos biológicos in-
terrelacionados.
Las fases de la inflamación se han definido
como aguda, crónica y de resolución. En la in­
flamación aguda, los vasos sanguíneos se dila­
tan, razón por la cual se presenta calor y rubor
en el área. El edema es producido por el escape
de fluidos y células al tejido extravascular. El
dolor y la pérdida de función que acompañan a
la inflamación se deben a la presión ejercida en
las terminales nerviosas por la acumulación de
líquido extravascular y a la liberación de m e­
diadores químicos.
23
La reacción inflam atoria es un iliecanismo
vital de defensa, que provee el medio p o r el
cual factores protectivos tales como anticuer­
pos, com plem ento y células fagocíticas, que
norm alm ente se encuentran confinadas en el
torrente circulatorio, puedan penetrar en el teji­
do y ganar el acceso a los sitios de invasión por
elementos extraños. Por lo tanto, la inflamación
es considerada como un medio destinado a fo­
calizar los mecanismos inmunológicos protecti­
vos en una región localizada dentro del tejido.
El proceso inflamatorio en su fase aguda se
inicia con la liberación local de mediadores que
aum entan el flujo sanguíneo de los capilares
cercanos e inducen trasvasación de plasm a al
tejido. Posteriorm ente, se produce activación
de los sistemas de complemento y de coagula­
ción. Asimismo, las células inflamatorias circu­
lantes y las endoteliales liberan mediadores so­
lubles de la inflamación y productos biológica­
mente activos. Estos mediadores tam bién tie­
nen efectos sistémicos, provocando fiebre, neu-
trofilia y la respuesta de fase aguda (APR).
En las inmediaciones del sitio de la injuria,
los neutrófilos se acumulan en los’capilares y
en las vénulas poscapilares, cruzan la capa en-
dotelial y se mueven hacia la fuente de los m e­
diadores inflamatorios. En el sitio de inflam a­
ción, los neutrófilos fagocitan el material extra­
ño, liberan enzimas digestivas, proteínas bacte­
ricidas y potentes oxidantes.
Siguiendo a la fase aguda, se produce un re­
clutamiento de monocitos, macrófagos y linfo­
citos en el sitio de la injuria. Los monocitos y
macrófagos ingieren y/o matan a los agentes in­
fecciosos o al material extraño que fue resisten­
te a la acción de los neutrófilos. Además, estas
células digieren y retiran el tejido dañado que
no ha sobrevivido a la respuesta inflamatoria.
434 Mecanismos efectores de ia respuesta inmune
jos de conejo al 1% en DFC-VA, continuando
la reacción com o se indicó para dosaje del
complemento en unidades VHAjp.
Los resultados son expresados por compara­
ción con la lisis obtenida en presencia de dilu­
ciones de una mezcla de sueros normales de re­
ferencia.
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Inflamación
NORMA SPEZIALE
M EC A N ISM O S BÁSICOS
DE LA INFLAMACIÓN
1. CARACTERÍSTICAS DEL PROCESO
INFLAMATORIO
La inflamación es un proceso cjue ocurre lue­
go de la injuria a un tejido. Puede ser descripta
como una respuesta de irritación a la injuria. Se
caracteriza por presentar movimiento de fluido,
proteínas plasmáticas y leucocitos a los tejidos
en respuesta a la injuria, invasión microbiana o
antígenos.
El propósito de esta respuesta es la de conte­
ner o destruir la injuria patógena y retirar del
tejido los desechos que resultaron de la re s­
puesta inflamatoria.
La inflamación se caracteriza por la presen­
cia de calor, rubor, edema, dolor y pérdida de
la función celular. Todos estos signos ocurren
como consecuencia directa de cambios en la
permeabilidad vascular que permite el escape
de electrólitos, macromoléculas y células desde
los vasos sanguíneos al espacio extravascular.
La inflamación es un proceso complejo que
involucra a num erosos mediadores de origen
celular y plasmático con efectos biológicos in-
terrelacionados.
Las fases de la inflamación se han definido
como aguda, crónica y de resolución. En la in­
flamación aguda, los vasos sanguíneos se dila­
tan, razón por la cual se presenta calor y rubor
en el área. El edema es producido por el escape
de fluidos y células al tejido extravascular. El
dolor y la pérdida de función que acompañan a
la inflamación se deben a la presión ejercida en
las terminales nerviosas por la acumulación de
líquido extravascular y a la liberación de m e­
diadores químicos.
23
La reacción inflam atoria es un iliecanismo
vital de defensa, que provee el medio p o r el
cual factores protectivos tales como anticuer­
pos, com plem ento y células fagocíticas, que
norm alm ente se encuentran confinadas en el
torrente circulatorio, puedan penetrar en el teji­
do y ganar el acceso a los sitios de invasión por
elementos extraños. Por lo tanto, la inflamación
es considerada como un medio destinado a fo­
calizar los mecanismos inmunológicos protecti­
vos en una región localizada dentro del tejido.
El proceso inflamatorio en su fase aguda se
inicia con la liberación local de mediadores que
aum entan el flujo sanguíneo de los capilares
cercanos e inducen trasvasación de plasm a al
tejido. Posteriorm ente, se produce activación
de los sistemas de complemento y de coagula­
ción. Asimismo, las células inflamatorias circu­
lantes y las endoteliales liberan mediadores so­
lubles de la inflamación y productos biológica­
mente activos. Estos mediadores tam bién tie­
nen efectos sistémicos, provocando fiebre, neu-
trofilia y la respuesta de fase aguda (APR).
En las inmediaciones del sitio de la injuria,
los neutrófilos se acumulan en los’capilares y
en las vénulas poscapilares, cruzan la capa en-
dotelial y se mueven hacia la fuente de los m e­
diadores inflamatorios. En el sitio de inflam a­
ción, los neutrófilos fagocitan el material extra­
ño, liberan enzimas digestivas, proteínas bacte­
ricidas y potentes oxidantes.
Siguiendo a la fase aguda, se produce un re­
clutamiento de monocitos, macrófagos y linfo­
citos en el sitio de la injuria. Los monocitos y
macrófagos ingieren y/o matan a los agentes in­
fecciosos o al material extraño que fue resisten­
te a la acción de los neutrófilos. Además, estas
células digieren y retiran el tejido dañado que
no ha sobrevivido a la respuesta inflamatoria.
436 Mecanismos efectores de la respuesta inmune
Finalmente, se produce la etapa de resolu­
ción. Ésta comienza cuando las células viables
del sitio de inflamación, o cercanas al mismo,
comienzan a proliferar con el objeto de restau­
rar la arquitectura normal del tejido y su fun­
ción. Según la magnitud y la naturaleza de la
injuria, puede ocurrir: retorno a la estructura y
función normal del tejido; formación de cica­
triz y función tisular alterada; form ación de
absceso o bien persistencia del proceso infla­
matorio crónico.
Para su mejor comprensión, analizaremos en
primer término los elementos que participan de
la respuesta inflamatoria y luego estudiaremos
la dinámica del proceso inflamatorio.
2. ELEMENTOS QUE INTERVIENEN
EN LA RESPU ESTA INFLAMATORIA
2.1. Factores plasmáticos
El plasma contiene factores que aumentan la
función de las células inflamatorias.
El complejo proceso inflamatorio es, en pri­
mer término, iniciado y propagado por compo­
nentes del sistema del complemento, el sistema
de coagulación (factores de contacto), las quini­
nas y los componentes del sistema fibrinolítico.
2.1.a E l sistema de complemento
El sistem a de com plem ento es uno de los
importantes mediadores de la inflamación. La
acción del com plem ento incluye destrucción
celular, inflamación y efectos inmunológicos.
La activación del complemento produce pép­
tidos que median la quimiotaxia, la anafilaxia,
la vasodilatación y la secreción celular de cito-
quinas. Los componentes C3a y C5a actúan co­
mo anafilotoxinas, causando degranulación de
células mastoideas y de basófilos, liberando
histamina y otros mediadores. De este proceso
resulta la producción de vasodilatación, enroje­
cimiento, hinchazón y otros efectos que inclu­
yen la contracción del miísculo liso y la secre­
ción de mucus por las células de las vías respi­
ratorias.
El componente C5a es un potente estímulo
químico para la migración de neutrófilos, mo­
nocitos y eosinófilos al área de la inflamación.
Además, unido a la superficie de los neutróñ-
los estimula su adherencia, degranulación y es­
tallido respiratorio. El C5a también induce la
liberación del factor de necrosis tumoral (TNF)
e interleuquina 1 (IL-1), incrementando de esta
forma la respuesta inflamatoria.
El C3b, que proviene del clivaje de C3, cu­
bre a las células blanco (opsonización). Las cé­
lulas fagocíticas poseen receptores específicos
para C3b (CR3) y pueden unirse a las células-
opsonizadas preparando la ingestión. La fija­
ción del componente C3b a las células blanco
también incrementa la lisis por células NK a
través de la citotoxicidad mediada por células
dependiente de anticuerpos.
El resultado de la interacción de estos facto­
res es la habilidad de la activación local del
complemento a inducir aumento del flujo san­
guíneo al tejido afectado, qujmiotaxismo, acti­
vación de fagocitos neutrófilos y mononuclea­
res, secreción de citoquinas, amplificación del
efecto del complemento y aumento de las de­
fensas inmunológicas.
2.1.b Sistema de activación p or contacto
Existen una serie de proteínas que se activan
por contacto con sustancias naturales, tales co­
mo cristales de urato de sodio, cristales de piro-
fosfato de calcio, sulfato de colesterol y homo-
cisteína. Estas proteínas conforman lo que se
conoce como “sistem a de contacto”. F unda­
mentalmente son cuatro las proteínas que com­
ponen este sistema: el factor XII (factor Hage-
man), la pre-calicreína, el factor XI (anteceden­
te plasmático de tromboplastina) y un quininó-
geno de alto peso molecular.
El factor XII, como iniciador de la vía de
contacto, sufre cambios conformacionales lue­
go de la unión a superficies cargadas negativa­
mente. Además, la autoactivación del factor
XII provee una pequeña concentración de fac­
tor XII activado (factor Xlla) que convierte a la
pre-calicreína en calicreína (fig. 23-1). Esta ca­
licreína activa al factor XII en presencia de qui-
ninógeno de alto peso molecular. En ausencia
de una superficie sólida, la activación del fac­
tor XII por calicreína puede ocurrir en fase flui­
da, aunque la velocidad es mucho menor. El
factor XII tam bién puede ser activado por el
factor XI o por la plasmina, pero estos activa­
dores tiene una potencia diez veces menor. Los
sustratos para la forma activada del factor XII
incluyen a: la pre-calicreína (HK), el factor XI,
el primer componente del complemento (Cl), el
quininógeno de alto peso molecular y el factor
VII. Por lo tanto, el factor XII es el responsable
de la activación no inmunológica de la vía clá­
sica del complemento.
La pre-calicreína plasmática humana (factor
Fletcher), es una y-globulina, que circula en el
plasma en un 75% formando un complejo con
el quininógeno de alto peso molecular, mientras
que el 25% restante circula en forma libre. La
enzima activa, calicreína, se forma por clivaje
de la pre-calicreína (zimógeno) por acción del
factor X lla o los fragmentos del factor XII.
El factor XI humano es activado a factor
X la por clivaje producido por el factor X lla.

Los sustratos para este factor activatio incluyen
a: el quininógeno de alto peso m olecular, el
plasminógeno y el factor IX (fig. 23-1). Vir-
tualrnente todo el factor XI forma un complejo
con el quininógeno de alto peso molecular que
de esta forma lo protege de su inhibidor.
Para la activación por contacto se requiere el
quininógeno de alto peso m olecular humano
(HK), razón por la cual se lo denomina “cofac-
tor de la activación por contacto”. Existen dos
tipos de quininógeno en el plasma humano: una
forma de alto peso molecular (120 kD) que es
rápidamente clivada por la calicreína plasmáti­
ca humana, y una de bajo peso molecular (67
kD) que es más rápidamente proteolizada por
la calicreína tisular. El quininógeno de alto pe­
so molecular es una y-globulina que existe en
el p lasm a y p o see una cad en a liv ia n a (56
kD)(D5-D6) que le confiere la actividad coagu­
lante. El quininógeno de bajo peso molecular
también existe en el plasma y contiene una ca­
dena liviana diferente (5 kD), cuya función no
se conoce. Ambos tipos de quininógeno contie­
nen bradiquinina (D4) y dos regiones de cade­
nas pesadas idénticas (D1-D3) (fig. 23-2). El
quininógeno de alto peso molecular es sinteti­
zado en el hígado y se encuentra presente en
plaquetas humanas, neutrófilos y en las células
endoteliales.
El quininógeno de alto peso molecular incre­
menta directamente la formación y función del
factor XII, de la pre-calicreína y del factor XI.
De esta forma la activación ocurre en forma
óptima. El dominio D5 contiene cargas positi­
vas debido a la presencia de residuos de histidi­
nas y Usinas que facilitan la interacción con su­
perficies negativas. El dominio D6 posee una
secuencia de aminoácidos específica que une
tanto pre-calicreína como factor XI, brindando
así estos zimógenos a la superficie para el cli­
vaje por el factor X lla.
La calicreína plasm ática hum ana cliv a al
quininógeno de alto peso molecular en tres eta­
pas secuenciales. En el segundo clivaje se libe­
ra bradiquinina, m ediadora de la inflam ación
(fig. 23-2).
Interacción entre el sistema de contacto
y los neutrófilos
Considerando el im portante papel que ju e­
gan los neutrófilos en la inflamación es intere­
sante describir su interacción con la vía de las
proteínas de contacto.
El factor X lla humano estimula la agrega­
ción y degranulación de los neutrófilos. La es­
pecie activa de la calicreína humana, pero no
su forma zimógeno inactiva, es quimiotáctica
para los neutrófilos. La exposición de los neu­
trófilos a niveles quim iotácticos de calicreína
Inflamación 437
plasmática aumenta la glicólisis aeróbica y la
actividad del cam bio de vía (“shunt”) de las
pentosas. Los neutrófilos, en presencia de ca­
tiones divalentes (calcio y magnesio), se agre­
gan en repuesta a calicreína plasmática huma­
na. Esta interacción está asociada con la esti­
mulación del estallido respiratorio de los neu­
tró filo s, como se indica por el aum ento del
consumo de oxígeno. La calicreína plasmática
también induce, en los neutrófilos, la liberación
de la elastasa de sus gránulos azurófilos.
El quininógeno de alto peso m olecular se
une a los neutrófilos en forma específica, rever­
sible y saturable. Se requiere dicha unión para
la óptima estimulación de los neutrófilos por la
calicreína.
2.1.C Sistema de las quininas
La bradiquinina es generada por el clivaje
del quininógeno de alto pesQ molecular por ac­
ción de la calicreína. La bradiquinina es un no-
napéptido con la secuencia de aminoácidos:
Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg.
De todos los mediadores de la inflamación,
la bradiquinina juega un papel muy importante.
Todos los síntomas y signos cardinales de la
inflamación se observan cuando la bradiquini­
na se inyecta en piel humana. En prim er térmi­
no hay dolor, debido a la estimulación de las
terminales sensoriales de las fibras C y luego la
liberación de sustancia P, la cual adhiere a la
inflamación el componente neurogénico.
Posteriormente, estalla el reflejo axonal cau­
sado por la vasodilatación y el edema creado
por el aumento de permeabilidad vascular y la
extravasación de proteínas y fluidos. E n segui­
da, la liberación de citoquinas desde los mono­
citos, inducida por la bradiquinina, atrae a los
leucocitos al sitio de inyección. Es de particu­
lar importancia la capacidad de la bradiquinina
de liberar citoquinas tales como IL-1 y TNF, y
otros mediadores, de los cuales las prostaglan­
dinas y los leucotrienos, ambos form ados por
estimulación de la fosfolipasa A^, son los más
frecuentemente formados.
La mayoría de los efectos de la bradiquinina
son mediados por receptores conocidos como
BK,. Distinto a cualquier otro péptido, la bradi-
quiñina prom ueve todas las señales de trans­
ducción a nivel celular: a) movilización de cal­
cio, b) transporte de cloruro, c) activación de la
fosfolipasa específica para fosfatidilinositol, d)
síntesis de óxido nítrico, cuyo resultado es la
formación de GMPc, e) estimulación de la fos­
folipasa A,, la cual form a prostaglandinas y
leucotrienos, f) estimulación de la adenil cicla-
sa que produce aumento de AMPc.
Como parte de la respuesta inflamatoria, los
neutrófilos, luego de recibir la señal quimio-
438 Mecanismos efectores de la respuesta inmune

^ hkJ

Xil Pre-cai

X lla

H K '\ cal

HK

■Conversión 01
■Activación

3
_C5 / Ccia .

F ig. 23-1. A ctivación del sistem a de contacto.

táctica, se marginan y adhieren a la pared del La reciente descripción de la presencia de

endotelio vascular. Luego de la adhesión de los
neutrófilos a las células del endotelio, la próxi­
ma etapa es la apertura de las uniones endote­
liales cjue permiten la migración de los neutró­
filos hacia el espacio del tejido intersticial. En
esta etapa se torna importante la presencia de la
bradiquinina (fig. 23-3).
F ig . 23-2. Estructura del quininógeno de alto peso m ole­
cular.
calicreína tisular y la de quininógeno de alto y
bajo peso molecular en los neutrófilos, así co­
mo la de pre-calicreína en su superficie, provee
un nuevo mecanismo para la diapédesis de los
neutrófilos entre las células de los capilares.
Los neutrófilos tienen receptores para quininó­
geno de alto peso molecular y debido a que la
pre-cahcreína plasmática se localiza con el qui­
ninógeno de alto peso molecular en la superfi­
cie de la membrana, se produce la activación
de esta enzima generando bradiquinina en las
inmediaciones. La bradiquinina tiene un poten­
te efecto sobre las células endoteliales, causan­
do retracción de las mismas y permitiendo, por
lo tanto, ia migración de los neutrófilos y la
exudación de constituyentes del plasma. Simul­
táneamente, los neutrófilos secretan pro-gelati-
nasa y procolagenasa, las cuales son activadas
por la calicreína tisular. La acción de la gelati-
nasa y de la colagenasa facilita el movimiento
de los neutrófilos a través de la membrana ba­
sal y el pasaje a través de las uniones al espacio
del tejido intersticial.
La función de generar bradiquinina cerca de
las uniones endoteliales puede no estar restrin­
gida a la calicreína tisular. Los neutrófilos tie­
nen una serie de enzimas con capacidad de for­
mar quininas. Son quininogenasas que se en-
 Inflamación 439

Fig. 23-."?. P a r ti c ip a ­
ción de la bradiquinina.

' Señales quimiotácticas

c a l. ' Injuria

¿ y'fPK

BK __ /

-Colagenasa

( _ < ss>

Diapédesis

cal

;<Flbrinógeno

PIgn -H. Pin ^♦■Fibrina

FIBRINÓLI5‘S
Fig. 23-4. F ibrinólisis,
440 Mecanismos efectores de ia respuesta inmune
cuentran depositadas intracelularm ente en los
gránulos citoplasmáticos. Los mecanismos que
movilizan los gránulos que contienen las enzi­
mas hacia la membrana plasmática y los facto­
res que controlan la írisión no se han dilucida­
do, aunque se ha demostrado la existencia de
exocitosis durante el proceso de adherencia y
de diapédesis de los neutrófilos.
2.1.d SistemafibrinoUtico
El sistema fibrinolítico regula la deposición
de fibrina en los vasos sanguíneos y en los teji­
dos.
Siguiendo a la formación de la placa hemos­
tática, o del trombo, se inicia un período de di­
solución de la fibrina depositada. Esta reacción
incluye una secuencia de activación de precur­
sores del plasm inógeno por activadores del
mismo.
C uando describim os las accio n es de los
miembros de la vía del “sistema de contacto”,
mencionamos al plasminógeno como sustrato
del factor X lla, fragmentos del factor XII, cali­
creína y del factor Xla. El plasminógeno es ac­
tivado para formar plasmina y, de esta forma,
el sistema fibrinolítico sería iniciado por la vía
del sistema de contacto.
Una de las vías por la cual el plasminógeno
es activado a plasmina, para iniciar la fibrinóli-
sis, es por acción de la uroquinasa. La pro-uro-
quinasa (ProUK), es convertida a uroquinasa
(UK) por la calicreína (Kal), de esta forma, se
poi.c en evidencia el papel iniciador de la vía
de contacto de la coagulación intrínseca en la
fibrinólisis. Por lo tanto, el mismo mecanismo
que inicia la coagulación también da comienzo
a la fibrinólisis.
El componente clave de la vía fibrinolítica es
el plasm inógeno (Plgn). El plasm inógeno es
una cadena polipeptídica simple (80 kD), que
es activada a plasm ina por clivaje producido
por la acción de la uroquinasa. Posteriormente,
son sustrato de la plasmina, la fibrina y el fibri-
nógeno, iniciándose la fibrinólisis (fig. 23-4).
La fibrinólisis tam bién puede ser iniciada
por un mecanismo dependiente de los neutrófi­
los. Las proteasas liberadas de los neutrófilos,
luego de la migración al sitio de inflamación,
degradan al fibrinógeno. Los neutrófilos unen
específicamente fibrinógeno y fibrina y pueden
estar involucrados en la disolución de las pla­
cas.
2.2 M ediadores lipídicos
Introducción
Muchas evidencias sugieren que los signos
cardinales de la inflamación (rubor, dolor, ede­
ma y calor) son producidos, por lo menos en
parte, por mediadores lipídicos tales como los
eicosanoides y el factor activador de plaquetas
(PAE), que son sintetizados “de novo” desde
los fosfolípidos de las membranas de las célu­
las inflamatorias.
Los eicosanoides son productos oxigenados
de 20 átomos de carbono que derivan, en la
mayoría de los casos, del ácido araquidónico, y
son generados por la acción de tres clases de
en zim as in tra c elu la re s: la c ic lo -o x ig e n a sa
(COX) que genera prostaglandinas y tromboxa-
no; las lipoxigenasas que generan leueotrienos,
lipoxinas e hidroxiácidos, y la epoxigenasa,
que genera epoxiácidos. En el cuadro 23-1 se
resumen las acciones pro-inflamatorias de estos
mediadores.
Señales para la liberación del precursor
Los mediadores lipídicos no se encuentran
depositados en las células sino que su síntesis
es iniciada por diversos estím ulos. El ácido
araquidónico deriva de la dieta o bien de la
transformación del ácido graso esencial linolei-
co. Se deposita en la bicapa lipíd ica de las
membranas celulares esterificando a fosfolípi­
dos tales como fosfatidilcolina, fosfatidiletano-
lamina y fosfatidilinositol. Así, la etapa lim i­
tante en la síntesis de eicosanoides es la libera­
ción del ácido araquidónico por la acción de la
fosfolipasa A 2. Esta fosfolipasa, en particular,
degrada la unión éster del ácido araquidónico
al glicerol del fosfolípido precursor. En m u­
chos tejidos, la fosfolipasa A^ es una enzima
asociada a membranas, dependiente de calcio y
es activada por aumento de la concentración
del calcio intracelular. Así, la biosíntesis de ei­
cosanoides puede ser iniciada por una gran va­
riedad de estím ulos con capacidad de in cre­
mentar la concentración del calcio intracelular.
Esto puede ocurrir a través de la transducción
de señales mediadas por la interacción de hor­
monas o neurotransmisores con sus receptores
específicos, o a través de alteraciones de la in-
C u a d ro 23 - 1 . A cciones pro-inflam atorias
de los mediadores lipídicos
Signo cardinal M ediadores lipídicos
D olor PGE2, LTB4, PAF
R ubor PGE2, PGI2, LTB 4
LXA4, PAF
Calor PGEj, PGI2, LXA4, PAF
Edem a PGE2, LTB4, LTC4. LTD4
LTE4, PAF

tegridad de la membrana mediada por agentes
físicos, químicos, o el trauma. Por ejemplo, la
trombina, un potente agonista plaquetario, esti­
mula la liberación de tromboxano por las
plaquetas, debido a su interacción con los re­
ceptores de la membrana. La interacción de la
hormona con el receptor, a través de la activa­
ción de una proteína que une GTP y que tiene
propiedades de GTPasa (proteína G), inicia una
cascada de reacciones que culminan con un au­
mento del calcio intracelular, la activación de
la fosfolipasa A 2 y la liberación del ácido ara­
quidónico, seguida por la biosíntesis y libera­
ción de eicosanoides en las inmediaciones del
tejido.
Transform ación del precursor
El destino del ácido araquidónico (20:4) li­
berado de su depósito en los fosfolípidos de la
membrana, es específico de las células en cues­
tión y depende de la presencia de las enzimas
que transform an al ácido araquidónico, tales
como las ciclo-oxigenasas (COX) y las lipoxi-
genasas y luego de la presencia de sintetasas
específicas que convierten a los productos del
ácido araquidónico en eicosanoides biológica­
mente activos (fig. 23-5). El ácido araquidóni­
co es convertido a prostaglandinas por la ac­
ción inicial de la ciclo-oxigenasa, mientras que
los leucotrienos y las lipoxinas son formadas
por la acción in icial cíe las lip o x ig en asas.
M ientras que la ciclo-oxigenasa se encuentra
presente en todas las células de los mamíferos
excepto en los eritrocitos, la lipoxigenasa se
encuentra principalmente expresada en los neu­
trófilos, eosinófilos, monocitos, macrófagos y
células mastoideas.
Otros ácidos grasos pueden ser sustrato de la
ciclo-oxigenasa y las lipoxigenasas, com o el
ácido di-homogamahnolénico (20:3) y el ácido
eicosapentaenoico (20:5) formando productos
con propiedades biológicas de diferente poten­
cia pero del mismo tipo que los eicosanoides
derivados del ácido araquidónico. Este hecho
dio origen a los estudios sobre la importancia
de la dieta de grasas en la salud hum ana, ya
que el ácido graso 20:3 es de origen vegetal, el
20:4 de origen animal y los pescados son ricos
en ácido graso 20:5 (fig. 23-6).
H istóricam ente se consideraba a la ciclo-
oxigenasa como el único sistema enzim ático
expresado constitutivamente en la mayoría de
los tejidos e involucrado en la producción de
prostaglandinas pro-inflamatorias en el sitio de
inflamación. Sin embargo, además de la bien
conocida forma constitutiva de la ciclo-oxige­
nasa (CO X-1), se ha descrito recientem ente
una segunda form a (COX-2), la cual no se en­
cuentra constitutivamente expresada sino que
Inflamación 441
es inducida en macrófagos, fibroblastos o célu­
las endoteliales por agentes pro-inflamatorios
incluido lipo-polisacárido e in terleu q u in a-1.
La inducción de COX-2 y su posterior activa­
ción es la responsable de la producción exage­
rada de PGEj observada en los procesos infla­
matorios.
Es sabido que existen sitios para la produc­
ción de prostaglandinas, que contribuyen a la
función fisiológica normal. En la actualidad se
propone que mientras la COX-1 es constituti­
vamente expresada en los diversos tejidos don­
de las prostaglandinas ejercen función fisioló­
gica, la COX-2 es inducida por m ediadores
pro-inflamatorios en el sitio de la inflamación
y contribuye al curso fisiopatológico de la in­
juria.
Los glucocorticoides son potentes agentes
antiinflamatorios que inhiben la producción de
prostaglandinas por inhibición selectiva de la
expresión de COX-2 inducida por citoquinas,
m ien tras que no afectan la ex p resió n de la
CO X -1. Por el contrario, los analgésicos no es-
teroideos del tipo de la aspirina o indometacina
inhiben indiscrim inadam ente ambos tipos de
ciclo-oxigenasas.
Las células mononucleares responden, en el
sitio de inflamación, a endotoxinas o factores
endógenos con la liberación de citoquinas pro-
inflamatorias como, IL-1 y TNF y aumentando
la síntesis de prostaglandinas. La dexametaso-
na ejerce su efecto anti-inflamatorio a través de
la selectiva inhibición de la COX-2 inducida
por las citoquinas. Por lo tanto, los glucocorti­
coides endógenos pueden, por lo menos en par­
te, regular la producción de prostaglandinas a
través de la inhibición crónica de la form a in-
d ucible de ciclo-oxigenasa, la C O X -2, para
m antener la fisiología normal (fig, 23-7).
El factor activador de las plaquetas (PAF),
se sintetiza “de novo”, teniendo como precur­
sores a los fo sfo líp id o s de las m em branas.
También en este caso la fosfolipasa A 2 juega
una papel crucial. La fosfolipasa A^, p o r hidró­
lisis de un fosfolípido de la membrana, la al-
quil-acil fosfatidilcolina, produce la liberación
de una molécula precursora del PAF, llamada
hso-PAF (fig. 23-5).
Debido a la complejidad que presenta el sis­
tem a de m ediadores lipídicos de la inflam a­
ción, se tratarán por separado las vías de sínte­
sis como así también las acciones biológicas de
cada clase.
2.2.a Las prostaglandinas y el trom boxano
L a vía de las prostaglandinas y del trombo­
xano se inicia cuando 1a enzima ciclo-oxigena-
sa convierte al ácido araquidónico en endope-
róxido cíclico (PGG2) por introducción de oxí-
442 Mecanismos efectores de la respuesta inmune
Ácido araquidónico
15-LO
15-HETE 5-LO
5-LO 5-HETE
''
Lxs LTs 12-HETE
F ig. 23-5. M ediadores lipidiaos de la inflam ación.
geno molecular (fig. 23-8). Esta etapa enzimá­
tica puede ser bloqueada irreversiblemente por
aspirina y en forma reversible por compuestos
antiinflamatorios no esteroideos tales como la
indometacina.
El segundo endoperóxido cíclico (PGH^) es
generado enzim áticam ente a partir de PGG2
por reducción del grupo peróxido del C,j a gru­
po hidroxilo. Como producto de esta reacción
se originan grupos oxidantes que regulan la ac­
ción de la cicloxigenasa y además poseen im­
portancia en el proceso inflamatorio.
Las prostaglandinas endoperóxido PG G 2 y
PGIÍ 2 poseen vida media muy corta y son rae-
tabolizadas rápidamente para dar origen a sus
productos. Cuatro de ellos son prostaglandinas
(PGE^, PGF^a, PGD^ y PGI^), un compuesto
de 17 átomos de carbono(ácido 12-L heptae-
noico o HHT) que es acompañado por malonil
aldehido (MDA) y tromboxano A^.
La etapa de transformación del ácido araqui­
dónico a prostaglandina endoperóxido (PGHj)
es común a todos los sistem as celulares. La
Fosfolípidos V W
Fosfolipasa A2
LIso-PAF
COX
PGG2 Acetil-transferasa
12-LO
PGs
; TxA2 ! PAF
metabolización posterior del PGH2 depende de
la característica de cada célula en particular, de
las enzimas que contenga y del balance en co-
factores. Así, las plaquetas sanguíneas son ri­
cas en trom boxano sintetasa y producen una
cantidad mayor de tromboxano; mientras que
en las células del endotelio vascular predomina
la prostaciclina sintetasa, formando PGI2. El
resto de las prostaglandinas (PGE,, PG F jtt y
PGD^) se encuentran difundidas rñás am plia­
mente y en mayor o menor proporción son sin­
tetizadas en casi todas las células del organis­
mo (excepto glóbulos rojos y linfocitos).
Las prostaglandinas interactúan con recepto­
res de superficie presentes en las células de di­
versos tejidos. Por ejemplo, los linfocitos peri­
féricos de sangre humana unen reversiblemente
PGEj con una = 2 x 1 0 M. Se calculó que
los linfocitos poseen un máximo de 200 sitios
de unión por célula. El efecto de las prostaglan­
dinas se prolonga a través de los nucleótidos
cíclicos (fig. 23-9). Las PGE^, PGA^, PGD, y
PGL incrementan los niveles intracelulares de
 Inflamación 443

Fig. 23-6. Precursores de eicosanoides. COOH .PG,-

TxA,

LT,
Ácido di-homo y linolénico

COOH

Ácido araquidónico

COOH
A /"

< i/V
TXA3
LT,
Ácido eicosapentaenoico

AMP cíclico, que actúa como segundo mensa­
jero. Este mecanismo es similar al que opera en
la acción de agonistas adrenérgicos, histamina,
leetinas, enzimas proteolíticas y hormonas po-
lipeptíáicas. Las prostaglandinas, además, pue­
den influir en el comportamiento celular a tra­
vés de cambios de la función de la membrana,
a causa de alteraciones en lípidos, proteínas,
composición de glicoproteínas y por alteracio­
nes en la captación de nutrientes esenciales y
iones por la célula (particularmente calcio). El
aumento de AMP cíclico en los linfocitos está
asociado con inhibición de mitogénesis, reduc­
ción en la formación de linfoquinas e inhibi­
ción de citólisis mediada por linfocitos y la for­
mación de la roseta de linfocito T.
Otro prostanoide, como la PCF^a, afecta la
síntesis de GMP cíclico. Por lo tanto, prom ue­
ve funciones como proliferación celular, citoxi-
cidad, producción de linfoquinas y formación
de rosetas de linfocitos T.
Los productos de la oxidación del ácido ara­
quidónico están involucrados en la producción
de todos los signos cardinales de la inflamación.
La vasodilatación y el enrojecimiento son cau­
sados por la liberación en los tejidos de PGí^,
PGEj, PGE, y PGDj. El efecto de estos com ­
puestos es antagonizado por el tromboxano A^.

Ácido araquidónico

CCX ' ■^Glucocorticoides

Efectos fisiológicos Efectos inflamatorios

F ig . 23 -7. Inhibición de riñón macrófagos
cicloxigenasas. estómago sinoviocitos
444 Mecanismos efectores de ia respuesta inmune
Aunque las prostaglandinas vasodilatadoras
son poco activas en el increm ento de la per­
meabilidad vascular, tienen la habilidad de au­
m entar el edema producido por bradiquinina e
histamina. La cantidad de proteínas plasm áti­
cas exudada de la red m icrovascular depende'
de la extensión de la perm eabilidad venular y
de la magnitud de la dilatación arteriolar. Las
prostaglandinas vasodilatadoras dilatan arte­
riolas, dando como resultado una dilatación
pasiva de las vénulas por un incremento en la
presión hidrostática en la luz de la vénula. El
incremento del área de la pared venular y el in­
cremento de la presión hidrostática contribu­
yen a la potenciación del edema. Así, la acción
com bin ada de los agente s v a so d ila ta d o re s
(prostaglandinas) y de aquellos que incremen­
tan la perm eabilidad (bradiquinina e histam i­
na) aumenta la cantidad de proteínas exudadas.
Las prostaglandinas más c'omprometidas con
este fenóm eno son la PGE^ y la PGI^. Las
prostaglandinas, particularm ente la PGI^, ac­
túan en form a sinérgica en la form ación de
edema con péptidos derivados del complemen­
to (C5a). A diferencia de la bradiquinina y la
histamina, el C5a no actúa directamente en la
vénula, sino que el aumento de permeabilidad
inducido por C5a depende de la interacción
entre los polimorfonucleares y el endotelio de
las vénulas.
No se conoce con certeza la función de las
prostaglandinas en la producción de fiebre, ya
que el ácido araquidónico no es por sí mismo
pirogénico. Sin embargo, los antiinflamatorios
no esteroideos como indom etacina o aspirina
tienen efecto antipirético.

Con respecto al dolor, las prostaglandinas
E j , e 1^ p roducen dolo r de m odo sin érg ico
con la bradiquinina e histam ina. La PG Ij es
más efectiva que la POE^ en la inducción de
dolor.
Esta capacidad se encuentra relacionada con
la propiedad que poseen estas prostaglandinas
de aumentar el AMPc.
Las prostaglandinas que producen aumento
de AMPc participan de la expresión del quinto
signo cardinal de la inflamación, o pérdida de
la función celular, a través de la inhibición de
la respuesta inmune.
La concentración de prostaglandinas se en ­
cuentra aumentada en la lesión inflamatoria. Si
bien los polimorfonucleares son, en condicio­
nes basales, pobres productores de estos eico­
sanoides, es probable que durante el proceso
inflamatorio se encuentre activa la COX-2, in­
ducida por mediadores de la inflamación, pro­
moviendo el aumento de la síntesis de eicosa­
noides.
COOH
W r= y \A Z Ácido araquidónico
5-LO
OOH
COOH
COOH
Leucotrieno A4
CO O H
OH
LTB,
Fig. 23-9. B iosíntesis de leucotrienos.
Inflamación 445
2.2.b L os leucotrienos
Las lipoxigenasas son enzimas que inician la
vía de la conversión del ácido araquidónico en
hidroperóxidos no cíclicos, los ácidos hidrope-
roxitetranoicos (HPETE).
En los distintos sistemas celulares existen li­
poxigenasas específicas que dan origen a diver­
sos mediadores lipídicos. Por ejemplo, la 5 li­
poxigenasa predomina en basófilos, polim orfo­
nucleares y macrófagos, dando origen al hidro-
peróxido 5-HPETE; la 12 lipoxigenasa d a ori­
gen a 12-HPETE en plaquetas, páncreas y glo­
m érulo renal. En reticulocitos, eosinófilos y
linfocitos T predomina la 15-lipoxigenasa dan­
do origen a 15-HPETE.
Los leucocitos, a partir exclusivam ente del
5-HPETE, forman una familia de ácidos 5-hi-
droxieicosatetraenoicos llamados leucotrienos.
La form ación de un grupo epoxi en posición
5-6 da origen al leucotrieno A^ el cual se trans­
forma en el leucotrieno B, (fig. 23-9).
OH
COOH
C 3H,, S-cisteína-glicina
ác. glutámico
LTC ,
OH
COOH
C 5H,, 5-cisteína
\ = /
LTE,
446 Mecanismos efectores de la respuesta inmune
U na vía alternativa de transform ación del
leucotrieno es mediada por la acción de la
glutatión-S-transferasa, que cataliza la adición
de glutatión, para dar origen al leucotrieno C^.
La pérdida posterior de ácido glutámico, es en­
zimáticamente mediada por la glutamil trans­
peptidasa formando leucocitrieno D^. En forma
secuencial, también el leucotrieno D4 es con­
vertido en leucotrieno por acción de una cis-
tenilglicinasa (fig, 23-9).
Es interesante destacar que, en la transfor­
mación secuencial del leucotrieno Q , los pro­
ductos originados poseen propiedades biológi­
cas cualitativamente comparables, pero la po­
tencia de acción se incrementa con la metaboli­
zación, llegando el leucotrieno E^ a constituirse
en el más activo.
Los leucotrienos C^, y E^ son potentes
agentes estim ulantes de la contracción de la
musculatura lisa y de los vasos sanguíneos, sin­
tetizados en diversos tejidos, el pulm ón los
produce en cantidades considerables, actuando
como agentes broncoconstrictores y participan­
do en forma preponderante en la patología del
asma. Los leucotrienos C^, y E^ son los prin­
cipales constituyentes de la sustancia de libera­
ción lenta de la anafilaxis (SRS-A), término in­
troducido en 1938 por Eeldberg y Kellaaway.
En el análisis del efecto biológico de los leu­
cotrienos, debemos distinguir las acciones del
leucotrieno y los efectos biológicos de los
leucotrienos que conforman la SRS-A.
El leucotrieno B^ es un potente activador de
la funcfón y comportamiento del leucocito. Sus
actividades biológicas principales residen en la
producción de agregación de los leucocitos y
estimulación de la función leucocitaria. Es el
factor quimiotáctico más potente conocido has­
ta el momento. En este contexto ejerce una se­
rie de efectos citotácticos. Estos comprenden
acumulación de neutrófilos en las zonas donde
se producen cantidades ligeram ente aumenta­
das de leucotrieno B^ (25-100 ug), neutropenia,
adherencia y diapédesis de leucocitos desde los
vasos sanguíneos pequeños e incremento de la
perm eabilidad vascular en p resen cia de las
prostaglandinas vasodilatadoras.
El leucotrieno B^ es un mediador natural de
la inflamación. Es sintetizado por los leucoci­
tos presentes en el exudado que se produce en
el proceso inflam atorio en desarrollo, y sus
efectos se asemejan y suplementan a los produ­
cidos por el péptido que deriva del complemen­
to C5a, el cual es formado en fase fluida. La in­
teracción posterior es con las prostaglandinas,
causando aumento en la permeabilidad vascu­
lar y formación local de edema. Así las prosta­
glandinas, el C5a, y el leucotrieno B^ pueden
actuar en forma secuencial y en combinación
para producir la permeabilidad vascular y la in­
filtración celular que caracteriza a la respuesta
inflamatoria.
Existen otros efectos del leucotrieno B^ so­
bre los leucocitos, tales como expresión de re­
ceptores de superficie, aumento de la expresión
de los receptores de C3b en eosinófilos e incre­
mento de los niveles de GMP cíclico intracelu­
lar. También, y como parte del mecanismo ac­
tivador de leucocitos, incluye la estimulación
en la captación de Ca^“^ extracelular y D-fucosa.
Sin embargo, ejercen un efecto mínimo en la
producción de aniones superóxido y liberación
de enzimas lisosomales.
La importancia biológica de los leucotrienos
constituyentes de la SRS-A (leucotrienos C, D,
E) reside principalmente en los efectos sobre
las vías respiratorias y, por lo tanto, como m e­
diadores de los fenómenos de hipersensibilidad
y asma. También funcionan como importantes
mediadores químicos de la inflamación por su
acción en el lecho microvascular. Así, los leu­
cotrienos C 4, y E^ producen exudación del
plasma de las vénulas poscapilares con una efi­
cacia 100 veces mayor que la histamina. El au­
mento de perm eabilidad producido por estos
leucotrienos es directo sobre las células endote­
liales, ocurre rápidamente y no requiere libera­
ción de histamina, prostaglandinas, ni presen­
cia de polimorfonucleares. Por lo tanto, la p re­
sencia única de leucotrienos C, D y E origina
edema, contribuyendo a la m anifestación de
uno de los signos cardinales del proceso infla­
matorio. Un análisis en compendio de la parti­
cipación de los derivados del ácido araquidóni­
co en la expresión de los signos cardinales de
la inflamación nos permite deducir que algunos
efectos de productos de la cicloxigenasa son
complementarios del efecto de los leucotrienos.
Las prostaglandinas, el trom boxano y los
leucotrienos son parte de un sistema más gene­
ral de control biológico basado en el ácido ara­
quidónico como precursor. Este compuesto se
encuentra norm alm ente depositado en la e s­
tructura de las membranas biológicas y puede
ser liberado por activación de un sistema hidro-
lítico (fosfolipasa A^) por una serie de estímu­
los. Con dependencia de la disponibilidad de
krs enzimas activas (cicloxigenasa o lipoxige­
nasas) en la célula estimulada, el ácido araqui­
dónico es convertido en uno o más compuestos
biológicam ente activos. Así, una variedad de
estímulos pueden ser convertidos en múltiples
compuestos, los cuales pueden ser usados para
regular o mediar distintas funciones biológicas.
2.2.c Las lipoxinas
Mientras que la síntesis de leucotrienos se
inicia con la inserción de una molécula de oxí­
geno molecular en el carbono en posición 5 del

ácido araquidónico, por acción de la 5-lipoxi­
genasa, para la formación de lipoxinas se re­
quiere la oxigenación secuencial en el carbono
15 y luego en el carbono 5 por las 15 y 5 lipo­
xigenasas, respectivamente (fig. 23-10). Estos
compuestos son ios que se han incorporado a la
familia de los eicosanoides recientemente. D i­
fieren marcadamente de los leueotrienos tanto
en su estructura como en sus propiedades bio­
lógicas. La oxigenación dual produce un inter­
mediario epóxido, 5-6 epoxitetraeno, el cual es
rápidamente convertido en lipoxina A4 o lipo-
xina B4 por epoxi-hidrolasas (fíg. 23-10).
Recientemente se ha demostrado que las li­
poxinas también pueden generarse por oxige­
nación del leucotrieno derivado de los leu­
cocitos por acción de la lipoxigenasa plaqueta­
ria en un proceso de interacción céiula-céluia.
Estructuralmente las lipoxinas se caracteri­
zan por tener cuatro dobles ligaduras, lo cual
HO OH
COOH
Fig. 23-10. B iosíntesis de lipoxinas.
Inflamación 447
les confiere la característica de poder ser detec­
tadas por espectroscopia ultravioleta. Parece
existir una relación inversa entre la cantidad de
leueotrienos y lipoxinas sintetizadas, lo que su­
giere algtín tipo de autorregulación del sistema,
cuyo mecanismo se desconoce.
Las lipoxinas muestran importantes efectos
biológicos en diversas células inflamatorias. A
diferencia del leucotrieno B^, la administración
de la lipoxina in vivo, no provoca adhesión de
los neutrófilos al endotelio vascular, ni m igra­
ción al espacio extracelular. Por el contrario, la
lipoxina A^ inhibe la migración de los neutrófi­
los inducida por el LTA^. Por lo tanto, las ¡ipo-
xinas tendrían un efecto an ti-inflam atorio o
bien regulador negativo de la inflamación.
Además de sus efectos en los neutrófilos, las
LXA^ y LXB^ inhiben el efecto citotóxico de la
células NK, lo que sugiere otros efectos regula­
dores de la respuesta inmune.
COOH
Ácido araquidónico
COOH
5-fiidroperoxi-15 hidroxi ETE
OH
COOH
HO OH
Lipoxina
448 Mecanismos efectores de la respuesta inmune
Las lipoxinas también ejercen efectos sobre
los vasos sanguíneos. La LXA^ es vasodilata­
dora, mientras que la LXB^ es vasoconstrictora.
El efecto vasodilatador de la LXA_^ está m edia­
do por la síntesis de PGIj y/o FGE^ ya que, en
presencia de inhibidores de la síntesis de pros­
taglandinas, la LXA^ tiene efecto vasoconstric­
tor. Por lo tanto, las lipoxinas regulan la pro­
ducción de otros eicosanoides por estimulación
de la síntesis de prostaglandinas.
Se observó que las lipoxinas atenúan los
efectos de los LTC^ y LTD^ en la musculatura
lisa bronquial y en la m icrocirculación renal,
sugiriendo que estos compuestos pueden servir
como antagonistas endógenos de los leucotrie­
nos. Asimismo, las lipoxinas también poseen la
capacidad de actuar en sus propios sitios de re­
conocimiento.
Las lipoxinas se encuentran involucradas
tanto en la inflamación aguda como en el con­
trol de la inmunidad. Se han hallado en concen­
traciones elevadas en el lavado broncoalveolar
de pacientes con sarcoidosis y neumonía. El
papel exacto que tienen las lipoxinas, en este
contexto, no se conoce exactamente. En este
momento se considera que las lipoxinas repre­
sentan a los moduladores endógenos de la res­
puesta inflamatoria de los leucotrienos.
2.2.d Factor activador de plaquetas (PAF)
El nombre “factor activador de plaquetas” se
utilizó en 1970, para describir la actividad de
un compuesto de naturaleza lipídica que se li­
beraba de los basófilos durante la anafilaxis in­
ducida por IgE. Se trata de un lípido complejo
cuya estructura es 1-0-alquil-2-acil-glicero-3
fosfocolina. Los diferentes compuestos difieren
en el número de átomos de carbono en el grupo
alquilo.
Al igual que los eicosanoides, el PAF deriva
de los fosfolípidos de la membrana por la ac­
ción de la fosfolipasa A^. Luego de la activa­
ción celular, la fosfolipasa A^ efectúa la deaci-
lación de la 1-0-alquil fosfatidilcolina, gene­
rando liso-PAF, el cual es luego acetilado por
acetil-CoA transferasa generando PAF. El áci­
do graso liberado por acción de la fosfolipasa
Aj es principalmente el ácido araquidónico, por
lo que el aumento de la síntesis del PAF en las
células inflamatorias se encuentra generalmen­
te acompañado por un aumento de la síntesis
de eicosanoides (fig. 23-11). El PAF puede ser
sintetizado por los leucocitos, incluidos neutró­
filos, eosinófilos y basófilos, por células mas-
toideas, por macrófagos y por plaquetas. Tam­
bién pueden generar PAF las células endotelia­
les y las epitehales.
La fuente del PAF en el riñón es el 1-0-al-
quil-2-acetil-glicerol, el cual por acción de la
fosfocolina transferasa origina PAF. La impor­
tancia de esta vía de síntesis es que, en este ca­
so, la síntesis de PAF no va acompañada por la
liberación de eicosanoides.
La síntesis del PAF por los neutrófilos es es­
timulada por los factores que producen eleva­
ción del calcio intracelular y activan a la fosfo­
lipasa A2. Sin embargo, el estímulo para la sín­
tesis del PAF presenta especificidad celular ya
que, por ejemplo, la trombina, la angiotensina
2 y la vasopresina no generan aumento de sín­
tesis del PAF en las células inflamatorias, pero
son efectivas en producir PAF en las células
del endotelio vascular.
El PAF se encuentra comprometido con la
patogénesis tanto de la inflamación aguda co­
mo en los desórdenes de la hipersensibilidad.
Adicionalmente, el PAF es un importante m e­
diador inflamatorio en el shock endotóxico, en
la vasculitis y en la trombosis vascular.
El PAF es un potente activador de los neu­
trófilos humanos, ya que estimula la adhesión,
la liberación de enzimas lisosomales, la genera­
ción de especies reactivas del oxígeno y de ei­
cosanoides. Además produce marginación de
los neutrófilos en la pared del endotelio vascu­
lar y promueve su migración al espacio extra-
vascular. Produce activación y agregación pla­
quetaria. Por lo tanto, la inyección intradérmica
del PAF en humanos o animales de laboratorio
se encuentra asociada con marginación de neu­
trófilos y la trombosis intravascular. También
se encuentra aumentada la permeabilidad vas­
cular, edem a e hiperalgia. Como vem os, el
PAF causa la mayoría de los signos cardinales
de la inflamación.
La inyección intravenosa de PAF provoca
profundos efectos en el tono de la musculatura
lisa bronquial y en la función cardiovascular en
los animales de laboratorio, provocando un sín­
drome muy similar al de la anafilaxis aguda. El
PAF produce contracción bronquial y vascular,
incluyendo contracción de las arterias corona­
rias. A dicionalmente se presenta un aumento
importante de la permeabilidad vascular y exu­
dación de plasma al espacio extra vascular, in­
clusive en pulmón (edema pulm onar). Como
resultado, los animales desarrollan insuficien­
cia respiratoria, dism inución de la eficiencia
cardíaca e hipotensión.
El PAF también es regulador de la función
de los linfocitos, tanto directa como indirecta­
m ente, a través de la generación de p ro sta­
glandinas y leucotrienos. El PA F inhibe la
proliferación Iinfocitaria en repuesta a m itóge­
nos. Además, los linfocitos generan PAF en
repuesta a agentes que elevan el calcio intra­
c e lu la r. L a im p o rta n c ia de esto s fe n ó m e ­
nos es, en la actualidad, motivo de investiga­
ción.

Interacción célula-célula y síntesis
de eicosanoides
La inflam ación aguda se caracteriza por la
acumulación de células inflamatorias en el sitio
de la injuria donde ellas funcionan en yuxtapo­
sición mientras se encuentran adheridas al en­
dotelio, al epitelio, a células mesenquimales y a
otras células inflamatorias (fig. 23-12).
El ácido araquidónico y los productos deri­
vados de la acción de las lipoxigenasas pue­
den pasar de un tipo celular a otro y los distin­
tos tipos celulares pueden cooperar entre ellos
para generar eicosanoides. De esta manera, ti­
pos celulares que, por sí mismos, no son capa­
ces de generar un tipo particular de eicosanoi-
de (por ejemplo, células que no poseen lipoxi­
genasa), pueden form ar eicosanoides a partir
de intermediarios generados en otros tipos ce­
lulares, si ellas poseen las enzimas para con­
vertir al intermediario en el producto biológi­
cam ente activo. L a figura 23-12 ilustra este
fenómeno. En este ejemplo ni los neutrófilos
solos ni las plaquetas solas pueden generar
LTC^, ya que los neutrófilos no poseen la sin-
tetasa de LTC^ y las plaquetas no poseen acti­
vidad de 5-lipoxigenasa. Sin embargo, cuando
estos dos tipos celulares interactúan, se sinte­
tiza LTC^ en abundancia, ya que las plaquetas
pueden convertir LTA^ derivado de los neu­
trófilos en LTC,^. De manera similar, el LTC^
puede ser generado por células endoteliales
a partir del LTA^ que proviene de los neutró­
filos.
También se forman lipoxinas durante la in­
teracción de las plaquetas con los neutrófilos.
Las plaquetas por sí mismas no generan lipo­
xinas. Sin em bargo, cuando interactúan con
los neutrófilos, las plaquetas generan lipoxi­
nas a partir de interm ediarios que provienen
de los neutrófilos. Así, el fenómeno de inte­
racción célula-célula no sólo expande la bate­
ría de eicosanoides que pueden ser sintetiza­
dos en los sitios de inflamación sino que, ade­
m ás, am plifica la cantidad de eicosanoides
producidos.
2.3. Óxido nítrico
El Oxido nítrico (N =0), es un radical libre
gaseoso inestable, potencialm ente tóxico, que
puede difundir libremente a través de las m em ­
branas celulares, con efecto vasodilatador. T ie­
ne una vida media de 3-5()s y su labilidad es
debida a su rápida conversión a nitritos y nitra­
tos por el oxígeno.
El NO se sintetiza por acción de la NO-sin-
tasa que actúa sobre la L-arginina. Se han des­
crito dos formas distintas de la enzima, una for­
ma constitutiva y la otra forma inducible.
Inflamación 449
L a form a constitutiva de la NO sintasa es
calcio-calmodulina dependiente. Es la respon­
sable del aumento transitorio de NO, en peque­
ñas cantidades, del orden de los pmoles, por el
endotelio vascular, plaquetas, tejido nervioso,
células mesangiales de la médula adrenal y de
las células de la mácula densa. Puede ser acti­
vada por amoniácidos excitatorios, por la ace­
tilcolina, bradiquinina y calcio.
La forma inducible no es dependiente de cal-
cio-calmodulina, y produce una liberación pro­
longada de NO en concentraciones del orden
de nmoles por los macrófagos, neutrófilos, en­
dotelio vascular y células m icrogliales. Los
más importantes inductores de la forma induci­
ble de la NO-sintasa son, el lipopolisacárido o
endotoxina, el TNF, la IL-1 y el interferón-y.
Esta form a enzimática puede ser regulada ne­
gativamente por los glucocorticoides, la inter-
leuquina-4, el PAF, y el TGF.
Funciones del óxido nítrico
El NO activa a las formas constitutiva e in­
ducible de las cicloxigenasas. El efecto citotó­
xico de los macrófagos sobre las células tumo-
rales se encuentra asociado a la liberación del
NO. El óxido nítrico daña a enzimas mitocon-
driales tales como la cis-aconitasa y N AD H-
succinato oxidoreductasa. La interacción del
NO con enzimas m icrobianas que contengan
Fe-S puede ser la causa del efecto bactericida
del NO. Otro mecanism o de citotoxicidad se
debe a la nitrosilación de los ácidos nucleicos
causando la ruptura del ADN.
El NO provoca daño tisular debido a la ac­
ción de los aniones peroxinitrilo (ONOO-) ge­
nerados por la interacción del NO con el anión
superóxido 02-.
El efecto fisiológico más importante del NO,
es el de comportarse como un potente vasodila­
tador. Esta propiedad, y su capacidad de induc­
ción de la COX-2 hacen que el NO sea un im ­
portante mediador del proceso inflamatorio. Es
importante hacer notar que las citoquinas pro-
inflamatorias activan a la forma inducible de la
NO sintasa, im plicando al mecanismo p o r el
cual el tono de NO se encuentra elevado en la
reacción inflamatoria.
Al NO se lo indica como el más im portante
agente responsable de la hipotensión arterial
presente en el shock séptico.
2.4. H istam ina
Es una amina natural producida por decarbo-
xilación de la histidina. La histam ina se en­
cuentra depositada en forma de gránulos en las
células mastoideas y en los basófilos. También
se encuentra en los tejidos en distintas concen-
450 Mecanismos efectores de la respuesta inmune

Estímulo

OQOOQ OOOQQQ OOQQO

1-alquil-2-acetil ■ ■ 1-alquil-2-acil
, ' glicerofosfocolina , ' glicerol

OÓOÓO .... ÓÓOóÓÓ " OÓOÓO

Fosfolipasa A2 Fosfocolina-
Acido transferasa
araquidónico

Liso PAF
Fosfocolina

Acetil-
transferasa

PAF

F ig. 23-11. Biosíntesis del PAF.

Estímulo

Plaqueta

F ig . 23-12. Interacción célula-célula y la síntesis de eicosanoides.


traciones, la mayor parte de ellos la proveen en
cantidad suficiente como para producir efectos
fisiológicos o patológicos. Si la liberación local
de histamina es suplementada por la provenien­
te de basófilos circulantes, sus efectos biológi­
cos se ven incrementados.
La histamina induce la clásica respuesta vas­
cular de la inflamación aguda, incrementando
el flujo sanguíneo, la permeabilidad vascular y
produciendo edema. También produce dolor y
picazón. Aunque no posee efecto quimiotáctico
general, puede ejercer quimiotactismo específi­
co para eosinófilos y también facilitar el egreso
de células de la serie blanca al espacio extra-
vascular por increm ento de la perm eabilidad
microvascular. Sin embargo, el efecto movili-
zador de células de la serie blanca producido
por la histamina es poco relevante si se lo com­
para con la movilización tota! de dichas células
en la respuesta inflamatoria.
Existe la teoría de que la respuesta inflama­
toria deriva de la acción combinada de agentes
vasodilatadores y agentes que producen au ­
mento de la permeabilidad vascular. La impor­
tancia potencial de la interacción de mediado­
res se desarrolló sobre la base del sinergismo
entre prostaglandinas vasodilatadoras y los fac­
tores que incrementan la permeabilidad micro-
vascular y, posteriormente, se extendió inclu­
yendo a vasodilatadores no prostaglandínicos.
En la inflamación aguda existen evidencias
que prueban la importancia de la histamina co­
mo mediador químico. Sin embargo, no parece
que se encuentre involucrada en la inflamación
crónica.
La acción más importante de la histamina se
presenta en la respuesta inicial a la injuria y es
irrelevante en las etapas posteriores.
El análisis farmacológico de los receptores
de histamina comprometidos en la respuesta in­
flam atoria dem uestra que ambos receptores,
H1 y H2, se encuentran involucrados.
2.5. L as citoquinas
Las citoquinas son señales intercelulares no
específicas, por las cuales, las células activadas
pueden atraer otras células y, en algunas situa­
ciones, controlar procesos fisiológicos. Las ci­
toquinas desempeñan un papel vital en la coor­
dinación de las respuestas inmunes e inflama­
torias. En este capítulo se describirán las cito-
quinas comprometidas con el proceso inflama­
torio. Estas citoquinas incluyen: factor de n e­
crosis tumoral (TNF), interleuquina-1 (IL-1),
interleuquina-6 (IL-6).
Estos mediadores se diferencian de la m ayo­
ría de los mediadores inmunológicos, tales co­
mo inmunoglobulinas, en que no presentan es­
pecificidad por los antígenos y en que operan a
Inflamación 451
muy bajas concentraciones. Por ejemplo, para
IL-1 la concentración es de 10^*' M, la cual se
encuentra dentro de las concentraciones de las
hormonas endocrinas. Pero, a su vez, se dife­
rencian de las hormonas clásicas en que acttían
localmente y en células vecinas de un tejido,
como los neurotransm isores. A diferencia de
los neurotransmisores, no se encuentran prefor-
madas, sino que son sintetizadas cuando ocurre
la estimulación.
Todas las citoquinas son péptidos, en general
de entre 70 y 190 am onoácidos. La m ayoría
pueden ser producidas por varios tipos celula­
res, con acciones múltiples y, también, la m a­
yoría presenta actividades sobrepuestas. La ac­
tividad de cada cito q u ina sobre las célu la s
blanco está mediada por la unión a distintos re­
ceptores de la superficie celular con alta afini­
dad (Kp= 10“’® -1 0 M ). Los receptores de cada
citoquina son generalmente productos de genes
diferentes.
2.5.a In te ríe uq ulna-1
La interleuquina-1 es un producto de diver­
sos tipos celulares. Tiene un amplio espectro
de actividades biológicas, generalmente esti-
mulatorias sobre las células inmunes, así como
sobre las células que no pertenecen al sistema
inmune, y es considerada como un importante
mediador de la inflamación. El más importante
regulador de la actividad de la interleuquina-1,
es el poderoso inhibidor natural de su receptor,
IL-IRA.
Se han detectado dos genes que codifican
para dos tipos de IL-1, la IL-1 alfa y la lL-1 be­
ta; y un tercer gen de la familia, que codifica
p a ra el a n ta g o n is ta d el re c e p to r de IL -1
(IL -lR A ). Diversos tipos celulares expresan
los dos genes que codifican para ambas IL-1,
pero las relaciones entre alfa y beta, varían se­
gún los tipos celulares. Por ejemplo, monocitos
humanos expresan predominantemente la fo r­
ma beta, mientras que los queratinocitos expre­
san la forma alfa. La expresión del IL -IR Á es
inducida por diversos estímulos en monocitos y
se encuentra constitutivam ente expresada en
neutrófilos, queratinocitos y células epiteliales.
Diversos tipos de células normales y tran s­
formadas son capaces de producir IL-1 in vitro,
incluyendo monocitos/macrófagos, queratino­
citos, células mesangiales del riñón, epitelio de
la córnea, células T, linfocitos granulares gran­
des, astroeitos, células endoteliales, células de
Langerhans, neutrófilos y células del músculo
liso. Sin embargo, probablemente los m acrófa­
gos y los queratinocitos son los mayores p ro ­
ductores de IL-1. Los monocitos no producen
IL-1 constitutivamente sino que requieren estí­
mulo para transcribir el gen. Diversos agentes
452 Mecanismos efectores de la respuesta inmune
endógenos y exógenos pueden proveer tal estí­
mulo. Los productos microbianos, como endo­
toxinas, exotoxinas, restos de pared celular de
hongos y hemoaglutininas virales, inducen la
producción de IL-1 por monocitos. Los agentes
endógenos que inducen la producción de IL-1
por m onocitos incluyen, C5a, C SF-1, TNF,
TGpp, la propia IL-1 y linfoquinas provenien­
tes de linfocitos T que aún no han sido clona­
das. Las células T también pueden inducir a los
macrófagos a producir IL -1, durante el contac­
to celular dependiente de antígeno. Otros facto­
res que inducen producción de IL-1 por varios
tipos celulares incluye a la injuria producida
por radiación ultravioleta y cristales de urato y
sílica.
Los monocitos y queratinocitos también pro­
ducen IL-IRA. En los monocitos diferentes es­
tímulos controlan el balance entre la IL-1 y el
IL-lRA . Así, el lipopolisacárido (LPS) induce
la formación de más IL-1 que de IL -lR A , y la
inversa ocurre para los complejos inmunes, que
inducen más a IL-lRA que a IL-1.
Diversos factores inhiben la producción de
IL-1. Las prostaglandinas inhiben la produc­
ción de IL-1 de los macrófagos mientras que
no afectan a la transcripción. La IL-10 inhibe
fuertemente la transcripción de IL-1 alfa y beta,
así como el TNF-alfa e IL-6. La interleuquina-
4 también inhibe la producción de IL-1 y ade­
más induce la producción de IL-lRA .
La IL-I es considerada un importante m edia­
dor de la inflamación. Este concepto está basa­
do en que induce muchas de las respuestas in-
flam atCiias. La IL-1 induce, in vitro, la libera­
ción de PGEj por diversos tejidos, la produc­
ción de proteasas, el catabolismo del cartílago
y del hueso y el crecimiento de los fibroblastos.
Todos estos hechos contribuyen a la patogéne­
sis de la inflamación crónica tales como las que
afectan a las articulaciones en la artritis reuma­
toidea o la inflamación de la gingiva.
In vivo, la IL -1 lleva a cabo reacciones infla­
matorias sistémicas, tales como la fiebre y la
fase aguda de respuesta del hígado, reduce el
hierro, el cinc, y aumenta el cobre plasmático.
Localmente, la IL-1 lleva a cabo reacciones
inflamatorias inmediatas que están caracteriza­
das por promover la unión de los neutrófilos
sanguíneos a las células endoteliales de la pa­
red de los vasos sanguíneos, seguida de infil­
tración y edema. Contrariam ente, una libera­
ción lenta de IL-1, produce una típica reacción
de hipersensibilidad tardía con infiltrado de
mononucleares, fibroplastia y angioplastia.
Los neutrófilos son liberados de la médula
ósea al torrente circulatorio en repuesta a la
IL-1. Los efectos de la IL-1 en la médula ósea
incluyen la inducción de factores estimulantes
del crecimiento de colonias (CSF) y la capaci­
dad de actuar sinérgicamente con estos factores
como estímulo para el crecimiento y diferen­
ciación celular durante la hematopoyesis.
Los efectos neuroendocrinos de la IL-1 in­
cluyen acción en el hipotálamo lo que resulta
en fiebre, y también producción del factor libe­
rador de corticotrofina, el cual estimula la libe­
ración de hormona adrenocorticotrófica desde
la hipófisis, la que, a su vez, induce la produc­
ción de corticosteroides por las glándulas adre-
nales.
Los efectos de la IL -1 in vivo se encuentran
com plicados por la inducción de un núm ero
considerable de mediadores químicos que in­
cluyen al factor activador de plaquetas, IL-6,
TNF, CSF, y aun la inducción de más IL-I.
La IL-1 produce un efecto positivo sobre las
células T. Sin embargo, esos efectos varían se­
gún se trate de células T maduras o inmaduras.
Los efectos positivos de IL-1 pueden ser direc­
tos sobre las células T, o indirectos, a través del
aumento de la temperatura corporal y mejoran­
do la función de las células presentadoras de an­
tígenos (APC). Los efectos sobre las APCs pue­
den estar mediados por la inducción de molécu-
las de a d h e sió n p o r el en d o te lio v a sc u la r
(ICAM-1), a las que pueden unirse las células
T. Los efectos positivos de la IL -1 sobre las cé­
lulas T pueden ir acompañados de efectos nega­
tivos. Así la PGE2 y los corticoesteroides, am­
bos inducidos por la IL-1, son poderosos inhibi­
dores de la replicación de los linfocitos T. Por
lo tanto, si se inyecta IL -1 predominará el efec­
to negativo, produciéndose una pérdida de célu­
las T, presumiblemente por los efectos de los
glucocorticoides inducidos por la propia IL-1.
La IL-1 afecta a las células B en dos etapas.
Sobre pre-células B, induce maduración y la
expresión com pleta de la Ig en la m em brana
plasmática. Luego, durante la activación anti­
génica, la IL-1 sinergiza con la IL-2 la prolife­
ración de células B y la producción de Ig. A di­
cionalmente, IL -1 induce a diversos tipos celu­
lares al producir IL-6, la cual promueve la se­
creción de células B activadas. La IL-1 aumen­
ta el crecimiento de las células T y la secreción
de citoquinas tales como,IL-2, IL-4 e IL-5,las
cuales controlan varias etapas de la activación
de las células B.
Otras células del sistema inmune, como los
macrófagos, responden a la IL-1 aumentando la
síntesis de IL-1, IL-6, IL-8, TNF, prostaglandi­
nas y activador de plasm inógeno. Las APCs
pueden también responder a IL-1, aumentando
la capacidad de inducir la proliferación de célu­
las T.
Se han evaluado los efectos de la administra­
ción de IL-1 a humanos, fundamentalmente por
su potencial efecto como agente anti-tumoral.
Administrada en bajas dosis presenta efectos

no deseables comparables a los beneficiosos.
Induce un cuadro de hipotensión arterial debi­
do a la vasodilatación periférica producida por
la síntesis de prostaglandinas, factor activador
de plaquetas, TNF y óxido nítrico.
La actividad inmunoactivadora de la IL -1 en
humanos está reflejada por el aumento de los
niveles de los receptores de IL-2, coincidente
con la activación de las células T. El tratamien­
to con IL-1 también produce aumento de la acti­
vación de monocitos. Este aumento de la activi­
dad inmunitaria de la IL-1 puede constituir el li­
mitado efecto antitumoral observado en pacien­
tes con melanoma con metástasis no visceral.
Se puede concluir que la IL -1 puede prom o­
ver defensa, restauración y reparación, espe­
cialmente de la hem atopoyesis, pero tam bién
tiene considerables efectos laterales tóxicos.
Bajas dosis de IL-1 pueden ser administradas
sin riesgo en pacientes con cáncer, produciendo
efectos terapéuticos beneficiosos.
2.5.b Factor de necrosis tum oral (TNF)
El TNF es considerado uno de los más im ­
portantes mediadores de la inflamación. Ha si­
do descubierto por su acción inductora de ne­
crosis hemorrágica en ciertos tumores. El TNF
es producido por macrófagos activados y otros
tipos celulares y tiene un amplio espectro de
efectos biológicos en diversos tipos celulares,
tanto inmunes como no inmunes.
Una verdadera malla de citoquinas controla
a la inducción de TNF y su acción, incluyendo
a la IL -1, que induce la producción de TNF por
los m acrófagos. El TNF a su vez, induce la
producción de IL-1 por los macrófagos, la pro­
ducción de interferón (31 por los fibroblastos, y
la producción de GM -CSF por diversos tipos
celulares.
Las células que responden al TNF tienen re­
ceptores de alta afinidad. Han sido clonados
dos tipos de receptores en humanos, uno de 55
kD y otro de 75 kD. Los receptores de TNF son
parte de una familia de proteínas de membrana,
que poseen cuatro regiones ricas en residuos de
cisteína en su dominio extracelular. El dominio
intracelular no es homólogo en los dos tipos de
receptores de TNF. Aunque la mayoría de las
células expresan ambos receptores, se conside­
ra que cada receptor media respuestas diferen­
tes. Las respuestas atribuidas al receptor de 55
kD son de citotoxicidad, actividad anti viral y
proliferación de fibroblastos. En cam bio, la
proliferación de células T está mediada por el
receptor de 75 kD.
La acción del TNF puede ser poderosamente
aumentada en diversos sistemas celulares por
el interferón-y a través, por lo menos parcial­
mente, del incremento del niimero de recepto­
Inflamación 453
res de 75 kD. Las células T expresan receptores
de TNF luego de la activación, y el incremento
posterior es inducido por la IL-2. Una rápida
regulación negativa ocurre por activación de la
proteína quinasa C (PKC), posiblemente debi­
do al rápido clivaje del receptor, el cual puede
ser luego encontrado intacto en los fluidos bio­
lógicos, reteniendo la capacidad de unir TN F y
actuando de esta forma como un inhibidor.
La vía de segundos mensajeros para el TNF,
como para el resto de la citoquinas, no se en­
cuentra totalmente aclarada. Sin em bargo, se
ha encontrado recientemente la temprana libe­
ración de diacilglicerol (DAG) de fosfatidilco-
Mna, lo cual indicaría que la vía de transduc­
ción estaría mediada por una fosfolipasa C que
hidrolizaría a la fosfatidilcolina. El D AG for­
mado activaría luego a la PKC, la cual es acti­
vada por TNF. Una vía similar a sido inform a­
da para la IL-1.
El TN F induce la fosforilación de diversas
proteínas, entre ellas la hsp27, posiblemente in­
volucrada en la protección celular al efecto de
TNF.
El efecto intracelular directo del TNF ha si­
do evaluado por microinyección celular; es ci­
totóxico. Sin embargo, parece que más que un
efecto directo del TNF, los receptores, tanto in­
tracelulares como extracelulares, estarían m e­
diando a la señal citotóxica, ya que anticuerpos
anti receptor de TNF mimetizan la toxicidad
del TNF.
La necrosis hem orrágica y la regresión de
ciertos tumores en ratón fueron las propiedades
que perm itieron descubrir al TNF, y fueron
tam bién la base de su nombre. Ciertas líneas
celulares de tumores humanos son matadas por
el TNF in vitro. Las líneas sensibles al T N F in­
cluyen dos carcinomas de mama, un carcinoma
de pulm ón y un carcinoma de colon. In vivo se
ha observado efecto citostático en un carcino­
ma de mama, un carcinoma de vejiga y un fi-
brosarcoma. Las células normales no son afec­
tadas por el TNF. El mecanismo por el cual el
TNF m ata a las células tumorales in vitro no
está totalm ente dilucidado, sin em bargo, se
cree que lo hace por un mecanismo sim ilar a la
apoptosis, en el cual se produce fragmentación
de ADN, precedida por la generación de radi­
cales libres del oxígeno o enzimas lisosomales.
La muerte celular se encuentra aum entada
por inhibición de la síntesis de proteínas, lo
cual puede aun provocan la muerte de células
normales, no transformadas inducida por TNF.
Por lo tanto, se sugiere que la síntesis continua
de ciertas proteínas protegen a las células nor­
males del efecto citotóxico del TNF, mientras
que las células tumorales no poseerían este me­
canismo de defensa o reparación. Un producto
que parece proteger del efecto letal de T N F es
454 Mecanismos efectores de ia respuesta inmune
la superóxido dism utasa m anganeso depen­
diente.
Ei TNE es un muy importante mediador de
la inflamación. La purificación bioquímica de­
mostró que el TNF tiene actividad de “catexi-
na”, una citoquina tóxica letal que m edia el
desgaste (caquexia) durante la infección parasi­
taria o bien luego de la inyección de lipopolisa-
carido (LPS). Este desgaste ocurre en parte por
la habilidad del TNF de suprimir la actividad
de la lipoproteína lipasa de los adipocitos,
EL TNF tiene otras propiedades inflam ato­
rias sistémicas. Al igual que la IL-1 induce fie­
bre, promueve respuesta de los hepatocitos pro­
duciendo diversos reactantes de la fase aguda
(la fase aguda se discute al tratar IL-6). Tam ­
bién se presenta neumonitis intersticial aguda,
con infiltración de polim orfonucleares, sugi­
riendo efecto del TNF en el síndrome de daño
respiratorio agudo observado en el “shoclc”
séptico y no séptico.
En el sitio de inflamación se pueden predecir
ciertos efectos basados en lo que se conoce in
vitro. Los neutrófilos responden al TNF, au­
mentando su capacidad de unión a las células
del endotelio producen estallido respiratorio y
degranulación. Las células endoteliales expre­
sando más ICAM -1, tam bién increm entan la
capacidad de adhesión de los neu tró filo s y
otros elementos formes sanguíneos, etapa que
debe preceder a la extravasación de estas célu­
las a los sitios de inflamación. También local­
mente, las células endoteliales vasculares pue­
den reaccionar al TNF presentando un perfil
trombogénico por producción de procoagulan­
tes, supresión de actividades anticoagulantes y
culminando en un bloqueo del aporte de sangre
y por ello producir necrosis tisular. El TNF
también presenta actividad sobre los macrófa­
gos, incluyendo inducción de la IL-1 y de pros­
taglandinas. Administrado localmente (intracu-
táneo), el TNF presenta una actividad inflama­
toria mediana, con una acumulación leucocita­
ria transitoria y sin edema.
La destrucción de la matriz extracelular in­
ducida por el TNF se asemeja a la presentada
por la IL-1. La reabsorción del hueso se produ­
ce vía la activación de los osteoclastos y la in­
hibición de la síntesis del hueso. El TNF indu­
ce actividad de la colagenasa en los sinovioci­
tos en el cartílago. Ja reabsorción de los proteo-
glieanos e inhibición de su síntesis. Estos m e­
canismos de destrucción tisular están implica­
dos en la patogénesis de la artritis reumatoidea.
Tanto el TNF, como la IL-1, se encuentran au­
mentados en los fluidos de las articulaciones
afectadas.
El TNF, al igual que la IL-1, induce proUfe-
ración de los fibroblastos, propiedad que se en­
cuentra involucrada con el proceso de repara­
ción, pero con potencial efecto patológico en
los procesos de fibrosis observados en la infla­
mación crónica.
Diversas moléculas de superficie inmunoló-
gicamente relevantes son inducidas por el TNF.
En células endoteliales, el TNF así com o la
IL-1, inducen ICAJVI-1, VCAM-1, y Selectina-
E, que son moléculas de adhesión involucradas
en la unión de las células T al endotelio vascu­
lar y de las células presentadoras de antígenos
(APC). Estos efectos sobre estructuras compro­
metidas con la presentación de antígenos a las
células T, junto con la inducción de la produc­
ción de la IL-1 por el TNF, pueden tener efec­
tos positivos sobre la migración y activación de
las células B y T.
Las células B en reposo, no expresan recep­
tores de TNF.
EL TNF presenta efectos protectores no es­
pecíficos contra patógenos. La actividad antivi­
ral del TNF ha sido demostrada en fibroblastos.
Las infecciones por Píasmodium chahaudi en
ratones es suprimida por el TNF liberado por
bomba osmótica intraperitoneal. La muerte de
la Leishmania mayor, del Tripanosoma cruzi y
de la Shistosoma masoni ocurren vía la activa­
ción de los macrófagos por el TNF. Algunas de
estas actividades tóxicas ocurren vía produc­
ción de óxido nítrico por los m acrófagos lo
cual puede a su vez mediar alguna toxicidad
del TNF in vivo.
El uso clínico del TNF se encuentra hmitado
debido a que presenta efectos tóxicos más im ­
portantes que la IL-1. La hipotensión es la m a­
yor causa de la limitación del uso de la dosis
que provoca toxicidad. El TNF tiende a produ­
cir más extravasación capilar y recam bio de
proteínas que la IL-1. La diferencia más impor­
tante entre ambas citoquinas es que, aunque
ambas poseen efecto radioprotector, la IL-1 es
hematopoyétiea, mientras que el TNF reduce
los niveles periféricos de neutrófilos, monoci­
tos, linfocitos y plaquetas. A unque el trata­
miento sistémico del cáncer con TNF en hum a­
nos se encuentra vencido por los problemas tó­
xicos, el TNF puede ser útil usado localmente
para el tratamiento de melanomas o sarcomas.
En un esfuerzo por evitar la amputación de ex­
tremidades, se ensayó la perfusión aislada de la
extremidad para administrar TNF junto a IFN-y
y melfalan, en condiciones de hipertermia. Este
ensayo dio como resultado un 80% de respues­
ta positiva.
Las enfermedades neoplásicas no son la úni­
cas aplicaciones del TNF. D iversos estudios
han encontrado respuesta positiva en el trata­
miento de la Psoriasis vulgar. Un paciente tra­
tado por un proceso maligno muy avanzado,
presentó coincidentemente una total reversión
de un cuadro de psoriasis severa refractaria.

La administración de anticuerpos anti-TNF
también lia sido ensayada en clínica. Si bien no
se ha encontrado efecto beneficioso para el tra­
tamiento del shock séptico en humanos, a dife­
rencia del tratamiento con IL -lR A el cual re­
sultó efectivo, se observó algún mejoramiento
de la función ventricular izquierda en pacientes
en shock.
O tra condición inflam atoria que puede ser
eventualmente controlada por bloqueo del TNF
son el síndrome de enfermedad respiratoria agu­
da, la artritis reumatoidea, la malaria cerebral,
la caquexia de la tuberculosis y el cáncer.
2.5.c Interleuquina-6
La IL-6 ha sido descubierta por su actividad
antiviral, activadora del crecimiento de hibri­
domas y plasmocitomas y estimulante de hepa­
tocitos y células B. Sin embargo, la IL-6 posee
un amplio espectro de efectos, algunos de los
cuales se sobreponen a los de la IL -1 y el TNF.
Similarmente, por lo tanto, la IL-6 es conside­
rada un im portante mediador inmune e infla­
matorio. Además de los macrófagos, diversos
tipos celulares producen lL-6.
Se ha descrito que células B transformadas
producen IL-6 como factor co-autocrino y tam­
bién las células B normales pueden producirlo.
Las células de mielom a producen IL-6 como
un factor de crecimiento autocrino, como lo ha­
ce el sarcom a de Kaposi, el cual puede usar
IL-6 como factor co-autocrino secundario a la
respuesta a oncostatin M. Otras células B trans­
formadas que producen IL-6 incluye a glioblas-
tos, osteosarcoma, mixoma y células del carci­
noma cervical y de vejiga.
El líquido sinovial de pacientes con artritis
reumatoidea contiene IL-6, así como la mayo­
ría de las otras citoquinas discutidas en este ca­
pítulo, que parecen ser producidas por las célu­
las T. La osteoporosis po.smenopáusica parece
comprometer a la IL-6, ya que la misma es su­
primida por los estrógenos.
Sitios de unión para IL-6 han sido detectados
en diversas líneas celulares. El mecanismo que
opera luego de la interacción con el receptor no
se encuentra completamente dilucidado.
La IL-6 se encuentra relacionada a la IL-1 y
al TNF en el sentido de que estas tres citoquinas
pueden ser coordinadamente liberadas por los
monocitos. También se encuentran relacionadas
porque una puede inducir la liberación de la
otra: la IL-1 o el TNF, pueden inducir a la IL-6,
el TNF puede inducir a la IL -L y la IL-1 puede
inducir a la IL -1. Sin embargo, la IL-6 no indu­
ce ni a la IL-1 ni al TNF sino que, más bien, su­
prime su producción por los macrófagos.
Las tres citoquinas son transportadas por el
torrente circulatorio a sitios distantes, inducien­
Inflamación 455
do procesos inflamatorios llamados “fase agu­
da de respuesta”. Este término se refiere a la
respuesta global del organismo a agentes extra­
ños, tales como endotoxinas microbianas. Con­
siste en fiebre e importantes cambios en los ti­
pos de proteínas séricas sintetizadas por los he­
patocitos. Así, en humanos, una m edida de la
inflamación es la velocidad de eritrosedimenta-
ción, la cual refleja principalmente la concen­
tración de fibrinógeno. Tanto la fiebre como
las proteínas de la fase aguda son inducidas por
la tres citoquinas. Los glucocorticoides, que
generalm ente tienen efecto anti-inflam atorio,
potencian la acción de las citoquinas en inducir
la respuesta hepática.
Los efectos hematopoyéticos de la IL-6, son
sinérgicos con los de la lL-3. La IL-6 produci­
da endógenamente es aparentemente requerida
para la resistencia a la radiación.
La caquexia, originalmente atribuida al TNF,
ha sido también descrita para la IL-6. El meca­
nismo propuesto involucra infiltración del tu­
mor por los macrófagos huésped que a su vez
producen IL-1. Esta induce al tumor a producir
grandes cantidades de IL-6, lo cual es un ele­
mento necesario en los efectos caquéxicos.
Conclusión
Las citoquinas inflamatorias tienen efectos
sobre el crecimiento y diferenciación celular.
Algunos de estos efectos son indirectos y basa­
dos en la capacidad de las citoquinas de inducir
la producción de una cascada de otras citoqui­
nas. Por ejemplo: aunque el TNF y la lL-1 ex­
hiben efecto antiviral, éste es mediados por el
IFN-(3. Las citoquinas no sólo interactúan se-
cuencialmente (induciendo una a otra) sino que
se refuerzan mutuamente. Por ejemplo: el TNF
no sólo induce a las IL-6 e IL-1, sino que am­
bas, IL-6 e IL-1, pueden incrementar los efec­
tos biológicos del TNF. Además, la IL-1 puede
aun inducir a la propia IL-1. Las interacciones
se tom an aun más complejas cuando se consi­
deran las observaciones de que la IL -I y el
TNF modulan no sólo la producción de otras
citoquinas sino que también modulan la expre­
sión de los receptores funcionales de las cito-
quinas.
El uso terapéutico de las citoquinas y sus in­
hibidores es un área de estudio en continuo cre­
cimiento, aunque se aprecia la dificultad de la
administración sistémica.
2.6 Q uim ioqum as
M iem bros de la fam ilia de citoquinas qui-
m iotáxicas, llam adas quim ioquinas, han sido
identificadas como mediadores y promulgado-
456 Mecanismos efectores de la respuesta inmune
res vitales de la inflamación. Tienen un rango
de peso molecular que oscila entre 8 y 12 kD,
son activas en una concentración de 1 a 100
ng • m i ' y son producidas por una gran varie­
dad de tipos celulares. Son inducidas por irri­
tantes exógenos y por mediadores endógenos
tales como IL-1, TNF, PDGF e IFN-y. Las qui-
mioquinas se unen a receptores específicos de
la superficie de las membranas con una Kp de
0.4 a 4.0 nM.
Estas quimioquinas pueden ser consideradas
como citoquinas de “segundo orden”. Parecen
ser menos pleiotrópicas que las citoquinas pro-
inflamatorias de “primer orden” porque no son
potentes inductores de otras citoquinas y exhi­
ben funciones más específicas en la inflam a­
ción y la reparación.
Algunas quimioquinas se han asignado como
subgrupo “quimioquina alfa”, basados en el he­
cho de que dos de sus cuatro grupos cisteínas
se encuentran separados por un aminoácido (C-
X-C). Este grupo de quimioquinas incluye a la
IL-8, al activador del crecimiento de melanoma
(MGSA/GRO), al factor plaquetario 4 (PF-4),
P-tromboglobulina (pTG).
En el segundo subgrupo, o (3, no intervienen
aminoácidos entre las dos primeras cisteínas e
incluyen el factor quimiotáxico y activador de
m acrófagos (M C A F/M C P-1), R A N TES así
como aLD-78.
2.6.a La interleuquina 8
LA IL-8 es producida por diversos tipos ce­
lulares, incluidos las células N K y los linfoci­
tos T en repuesta a estím ulos exógenos tales
como mitógenos policlonales, injuria, y agentes
infecciosos, así como citoquinas proinflamato-
rias tales como lL-1 y TNF. La lL-8 es un qui­
mioatractante de neutrófilos, basófilos, y una
pequeña proporción ( 10% o menos) de linfoci­
tos CD4-h y CD8-I-. Adicionalmente, la IL-8 ac­
tiva la liberación de enzimas de los neutrófilos
activados.
La IL-8 promueve la adherencia de los neu­
trófilos a las células endoteliales y lo hace in­
duciendo la producción de “integrinas” por los
neutrófilos. De esta manera los neutrófilos su­
fren extravasación por m ovim iento entre la
uniones de las células endoteliales y a través de
la membrana basal se acumulan en los tejidos.
La inyección subcutánea de IL-8 causa rápida
infiltración local de los neutrófilos con un m á­
ximo a las tres horas. La administración sisté­
mica de IL-8 no provoca fiebre ni elevación de
proteínas de la “fase aguda”, pero sí induce
neutrofilia.
Han sido clonados dos tipos distintos de re­
ceptores para IL-8. Son miembros de la familia
de la rodopsina y tienen siete dominios trans­
membrana. Los receptores están probablemente,
acoplados a una proteína G. Al interaccionar
con la IL-8 se produce hidrólisis del fbsfatidih-
nositol, se libera rápidamente el diacilglicerol
(DAG) y se eleva el nivel de calcio citosólico,
lo cual lleva a la activación de la quinasa C
(PKC). Los receptores de IL-8 se encuentran
expresados en neutrófilos. Los neutrófilos m a­
duros expresan 20.000 receptores por célula.
La IL-8 se ha encontrado en pacientes con
reacciones inflamatorias sistémicas y en trauma
severo. Ha sido también detectada en sitios in­
flamatorios tales como en fluido sinovial en ar­
tritis reumatoidea, extractos de piel de psoriasis
y en circulación en pacientes con “shock” sép­
tico. Por lo tanto, la IL-8 se encuentra implica­
da como un participante mayor en reacciones
inflamatorias agudas así como en las más pro­
longadas.
2.6.b Rantes
R AN TES p ertenece al segundo grupo de
quim ioquinas (tipo beta). Es moderadam ente
quimioatractante para monocitos. Es producido
por linfocitos T activados y por plaquetas. Las
células T activadas responden más a RANTES
que las no estimuladas. Promueve la adhesión
de las células T a las células endoteliales vas­
culares, este efecto es más notable cuando el
endotelio ha sido previam ente activado por
IL-1 o bien por anti-CD3.
Ha sido detectado en los sitios de inflam a­
ción ateromatosa. Además, RANTES causa rá­
pida degranulación de los basófilos, liberación
de histamina y puede participar en la fase tar­
día de las reacciones alérgicas.
Los miembros de la familia de las quim io­
quinas parecen ser potentes quimioatractantes y
activadores de las células inflamatorias y fibro­
blastos. Sin em bargo, su contribución a las
reacciones inm unes no ha sido caracterizada
completamente.
2.7. Sistem a celular de defensa
Erente a la presencia de un elemento extraño
se pone en funcionam iento, un sistem a que
atrapa, ingiere, y destruye a las partículas en un
proceso conocido como fagocitosis.
Las células fagocíticas pertenecen a dos sis­
temas. Un primer sistema está constituido por
células del sistema mieloideo, que actúan rápi­
da y eficientemente, fagocitan, pero son incapa­
ces de efectuar un segundo esfuerzo. Estas célu­
las constituyen lo que se conoce como “prim e­
ra línea de defensa”. Se trata fundamentalmen­
te de los polimorfonucleares neutrófilos, aun­
que en ciertos casos participan otras células
(eosinófilos, basófilos, células ma.stoideas).

El segundo sistem a, el sistem a fagoeítieo
mononuclear está formado por eélulas fagocíti­
cas más lentas. Estas células son capaces de re­
petir la fagoeitocis y pueden procesar a los an­
tígenos con el objeto de iniciar la repuesta in­
mune. El sistema fagocítico mononuclear cons­
tituye la “segunda línea de defensa".
2.7.a Primera línea de defensa
Neutrófilos
Los neutrófilos son células fagocíticas cuya
función principal es la de atrapar y destruir mi­
croorganismos, particularmente bacterias. Para
ello deben poseer la habilidad de migrar al sitio
de localización del organismo invasor, y una
vez allí participar en el proceso de la elimina­
ción del invasor.
El movimiento de migración al sitio de in­
fección o de injuria se conoce con el nombre de
quim iotaxismo. Se produce en repuesta a un
gradiente químico positivo de quimioatractan-
tes producidos en ese sitio. Los quimioatractan-
tes son producidos o liberados por la bacteria
(fMLP), o bien por otras células inflamatorias
o por las células del tejido dañado involucradas
en la reacción inflamatoria.
Ejemplos específicos de quimioatractantes lo
constituyen: los formil-metionil-péptidos de la
bacteria (fMLP), los componentes del sistema
de complemento activados C3 y C5a, y los pro­
ductos de la lipoxigenación del ácido araquidó­
nico como el LTB^.
Los neutrófilos humanos poseen receptores
específicos para los quimioatractantes. Una vez
que los quimioatractantes se unen a sus recep­
tores de las membranas se inicia una serie de
reacciones que incluyen: interacción con pro­
teínas G; activación de las fosfolipasas C eon
subsecuente activación de la proteína quinasa
C y aumento de la concentración del calcio in­
tracelular, activación de fosfolipasas y la
consecuente movilización del ácido araquidó­
nico para la síntesis de eicosanoides. Como
consecuencia de la activación de las señales de
transducción antedicha se produce la liberación
de gránulos secundarios y terciarios y la preac-
tivación del estallido respiratorio.
Los primeros cambios morfológicos que se
producen cuando los neutrófilos se preparan
para moverse hacia sitios de mayor concentra­
ción de quimioatractantes involucra la polariza­
ción u orientación. Los gránulos se ubican en el
frente de la célula mientras el núcleo se ubica
en la parte posterior y los sendópodos se hacen
prominentes, facilitando el movimiento.
La m igración de los neutrófilos com ienza
con la marginación de los mismos y la adhe­
sión a la superficie del endotelio, seguido de
Inflamación 457
procesos de profundización de la adhesión y
m igración, cuyo fundam ento bio q u ím ico se
discutirá más adelante. Los leucocitos, luego
de migrar a través de los tejidos llegan al sitio
de inflamación. Una vez que los neutrófilos sa­
lieron del torrente circulatorio, no pueden re­
tornar a la circulación, permanecen en el tejido
por varias horas, mueren y son removidos lue­
go por los macrófagos.
D espués de la llegada al sitio de inflam a­
ción, los neutrófilos se unen al microorganismo
y lo fagocitan. Luego de la fagocitosis ocm-re la
degranulación al espacio extracelular que cons­
ta de dos etapas secuenciales: la liberación de
gránulos secundarios seguida por la liberación
de gránulos primarios. La liberación del conte­
nido de los gránulos puede causar daño tisular
como el observado en la artritis reumatoidea.
Durante la fagocitosis se produce el “estalli­
do respiratorio”, que es el mecanism o por el
cual los neutrófilos participan de la m uerte del
microorganismo. Inicialmente una oxidasa de
m em b ran a oxida (N A PH -O X I) N A D P H o
NADH para formar un radical O j, y N AD P o
NAD (fig. 23-13).
El superóxido (0^0 reacciona con iones hi­
drógeno espontáneamente o por acción de la
superóxido dismutasa para formar peróxido de
hidrógeno. El NADP y el estim ulan al
“shunt” de las hexosas (HMP) lo cual aumenta
la disponibilidad de N ADPH. C onsecuente­
m ente aumenta la utilización de glucosa y la
producción de lactato. La d etoxificación va
acompañada por las siguientes reacciones que
incluyen a¡ glutatión oxidado (GSSG) y reduci­
do (GSH).
2GSH -HH p ^ ---------------GSSG + H p
GSSG + N A D PH ---------------2GSH + NADP"
La catalasa también puede detoxificar catali­
zando la reducción del H^O^ por cationes diva-
lentes a agua y oxígeno. En la figura 23-13, se
puede observar un resumen de estas vías meta-
bólicas.
La muerte de las bacterias también se puede
producir por vías no dependientes del oxígeno.
La muerte de la bacteria ocurre cuando se for­
man especies más reactivas, como el radical hi­
dróxido e hidroxilo. La lisozima, es una enzima
catiónica que destruye al ácido murámico de la
pared de la bacteria. La catepsina G, es una
proteasa de serina eon actividad de tripsina,
que se encuentra localizada en los gránulos pri­
marios y que tiene actividad antimicrobiana y
anti fungicida. Existe otra proteína que aumen­
ta la perm eabilidad de las bacterias y posee
propiedades bactericidas contra los gérmenes
gram negativos. Se ha descrito una fam ilia de
péptidos eatiónicos de 30 aminoácidos llama­
458 Mecanismos efectores de la respuesta inmune
dos “defensinas” que juegan un papel im por­
tante en la m uerte de microorgani,smos tales
como bacterias, hongos y virus. Adicionalmen­
te, muchas de las enzimas que se encuentran en
la vacuola fagocítica contribuyen a la digestión
completa del microorganismo muerto.
Eosinófilos
Los eosinófilos se forman en la médula ósea
a partir de precursores, los cuales a su vez deri­
van de un precursor comtín de neutrófilos y ba­
sófilos (“stem cell”); maduran en 2 a 6 días,
luego entran al torrente circulatorio y poseen
una vida media de 6 a 12 horas. El porcentaje
de eosinófilos circulantes es bajo si se compara
con la cantidad de eosinófilos tisulares. Se esti­
m a que por cada eosinófilo circulante existen
200 en la médula ósea y 500 en la submucosa
tisular. Por lo tanto estas células residen prima­
riamente en los tejidos y en la mayoría de los
casos se encuentran en los mismos sitios que
las células m asto id eas, frec u en te m e n te en
aquellos tejidos que están en contacto con el
exterior.
Los eosinófilos, basófilos, células m astoi­
deas e IgE son componentes de la inmunidad
que se encuentran en las superficies. Los eosi­
nófilos tienen mucho en comiin con los basófi­
los y las células mastoideas, aunque también
presentan diferencias importantes con ellas.
En la superficie de la membrana, los eosinó­
filos poseen receptores para IgE, IgA e IgG.
También tienen receptores para los componen­
tes del complemento C3b y C4. El niimero de
receptores aumenta luego de la exposición de
los eosinófilos a mediadores inflamatorios deri­
vados de los basófilos, tales como histamina, y
factor quimiotáxico de eosinófilos. La superfi­
cie de los eosinófilos también contiene lisofos-
folipasa. Cuando un niimero grande de eosinó­
F ig. 23-13. Estallido respiratorio y m e ­
tabolism o de neutrófilos.
filos se encuentran involucrados en un proceso
inmunológico y mueren, se libera lisofosfolipa-
sa, la cual puede coalescer formando partículas
llamadas cristales de Charcot-Leyden,
Los eosinófilos poseen gránulos característi­
cos a los cuales le deben su nombre. En cada
célula hay 200 gránulos de tres tipos diferentes:
los “gránulos pequeños” , que se encuentran só­
lo en los eosinófilos maduros, contienen fosfa­
tasa ácida y arilsulfatasa, la que modula la pro­
ducción de la sustancia de liberación lenta de la
anafilaxis que hoy se sabe son los leucotrienos;
los “gránulos primarios" que son prominentes
sólo en promielocitos; el tercer tipo de gránulo,
llamado “gránulo secundario” que provee la
mayor parte del poder de los eosinófilos.
El “gránulo secundario” está formado princi­
palmente por cristales de una proteína conocida
como proteína básica mayor (MBP), Es quími­
camente una proteína básica (punto isoeléctrico
11.6), que posee un 16% de residuos de argini­
na y constituye el 55% de las proteínas de los
gránulos y el 25% del total de las proteínas del
eosinófilo. La MBP genera la liberación de his­
tamina de lós basófilos y de las células mastoi­
deas, se une a la heparina y neutrahza su activi­
dad anticoagulante. La MBP juega un papel
muy importante en la destrucción de parásitos,
aunque también se encuentra involucrada en
otros procesos. En el “gránulo secu n d ario ”
también se encuentran otras proteínas como la
proteína catiónica del eosinófilo (ECP), la neu-
rotoxina derivada de eosinófilos (EDN) y la p e­
roxidasa del eosinófilo (EPO).
La EDN es una potente neurotoxina y hel-
mintotoxina. La EDN, posee homología de se­
cuencia eon la ECP en el dominio N-terminal.
Posee propiedades de RNasa, es tóxica para
helmintos pero su nombre se debe a que tiene
propiedades de inducir daño en la neuronas
mielinizadas en animales de laboratorio.

La EPO es muy activa en provocar la muerte
de microorganismos, incluyendo bacterias, m i­
coplasma, virus, hongos, helmintos y otros pa­
rásitos así como otras células como la neoplási­
cas y las células mastoideas. Esto ocurre cuan­
do la EPO, el peróxido de hidrógeno y el iodu-
ro interactúan para iodinar y matar a las célu­
las. La EPO y el peróxido de hidrógeno pueden
oxidar a otras moléculas, por ejemplo, oxidan e
inactivan a los leueotrienos.
La degranulación de las células mastoideas
puede ser inducida por la EPO. La EPO puede
unirse a la superficie de la células mastoideas y,
a niveles no tóxicos para la célula mastoidea in­
ducir degranulación y liberación de histamina.
Existen evidencias que le permiten atribuir
otras funciones a los eosinófilos. Los eosinófilos
son capaces de inactivar a ciertos mediadores de
la inflamación producidos por las células m as­
toideas. De esta manera disminuyen la severidad
de los fenómenos mediados por la IgE, que in­
cluyen a la respuesta a parásitos así como tam­
bién algunas reacciones alérgicas (anafilaxis).
Los eosinófilos juegan un papel muy impor­
tante en la defensa contra los parásitos. Se han
observado niveles altos de eosinófilos en plas­
ma (eosinofilia), en pacientes con diversos ti­
pos de desórdenes. Se encuentra aceptado que
los eosinófilos juegan un papel en la patogéne­
sis del fenómeno de hipersensibilidad tales co­
mo asma, dermatitis atópiea y anafilaxia.
Un gran número de compuestos pueden ser
quimiotáxicos para los eosinófilos o modificar
su función. Las células T producen factores de
crecimiento que inducen diferenciación de los
eosinófilos en la médula ósea y factores quimio-
táxieos que provocan la infiltración de los eosi­
nófilos a los tejidos. Las células mastoideas pro­
ducen histamina y otros péptidos que atraen eo­
sinófilos y potencian su acción destructora. El
factor estimulante de colonias de macrófagos y
monocitos y el llamado factor de diferenciación
de eosinófilos (lL-4), tienen efecto en ia activa­
ción y maduración de los eosinófilos. El TNE y
el LTB^ también aumentan la capacidad citotó­
xica de los eosinófilos. Los complejos inmunes
y los fragmentos de complemento C5a son tam­
bién quimiotácticos para los eosinófilos y neu­
trófilos. Asimismo, los eosinófilos pueden fago-
citar complejos inmunes. Finalmente, moléculas
derivadas de los parásitos sirven como factores
quimioatractantes, atrayendo a las células efec­
toras al sitio mismo donde son necesarias.
Basófilos y células mastoideas
Los basófilos provienen del precursor de la
línea de los neutrófilos y monocitos. Maduran
en la m édula ósea y luego entran en circula­
ción, representando el 0.5% del total de los
Inflamación 459
granulocitos. En general, la cinética del recam ­
bio de los basófilos es similar a la de los eosi­
nófilos, lo cual no es sorprendente ya que am ­
bas células se encuentran involucradas en los
procesos alérgicos y provienen de un m ism o
precursor. Como los eosinófilos, los basófilos
pueden ser reclutados en un tejido luego de que
se ponga en evidencia una señal apropiada que
los convoque.
Los células mastoideas, a diferencia de los
basófilos, no se encuentran normalmente en cir­
culación, sino que conforman una porción fija
de células del tejido conectivo. Virtualmente to­
dos los órganos poseen células mastoideas. Así,
son particularmente abundantes en el pulmón y
la piel, en el sistema gastrointestinal, en los alre­
dedores de los vasos sanguíneos y linfáticos, en
los nervios o en la proximidad de los fibroblas­
tos. El origen de las células mastoideas también
es la médula ósea pero se sabe poco de su proli­
feración, maduración y reclutamiento. El hecho
de que las células mastoideas puedan sintetizar
y secretar citoquinas específicas, reconocidas
como productos de linfocitos y monocitos, su­
giere origen monocítieo para estas células.
Tanto los basófilos como las células m astoi­
deas, se encuentran unidas a la respuesta alér­
gica a través de su capacidad de unir IgE.
La respuesta alérgica es m ediada por una
compleja red de reacciones que empiezan en la
mem brana celular. La reacción comienza con
la unión de dos moléculas de IgE a la m em bra­
na, las cuales interactúan con sus receptores y
luego transmiten la señal al interior de la célula
culminando en la degranulación con liberación
de mediadores. La liberación de los mediadores
sigue a un aumento del calcio intracelular. A
pesar de que existe cierta controversia acerca
de la transducción de la señal de activación,
hoy se encuentra aceptada la mediación de la
liberación de inositol-fosfato, movilización del
calcio y activación de la vía de la quinasa C.
Adicionalmente, se produce la movihzación de
ácidos grasos poliinsaturados asociados a la
membrana (ácido araquidónico). El m etabolis­
mo de dicho ácido graso permite la formación
de productos de la ciclo-oxigenasa, de la lip o ­
xigenasa y del PAF.
Por otro lado los basófilos y las células m as­
toideas se encuentran plenas de sustancias que
pueden m odificar la m icrocirculación, o rig i­
nando cambios en la perm eabilidad vascular.
La liberación masiva de productos de las célu­
las mastoideas y de los basófilos puede m ediar
la reacción violenta de la hipersensibilidad, que
puede llevar a la muerte en un período breve.
Este tipo de respuesta se denomina anafilaxis.
Por conveniencia, a los mediadores de las
células mastoideas se los clasifica en tres gru­
pos (cuadro 23-2);
460 Mecanismos efectores de la respuesta inmune
C u a d ro 23-2. M ediadores de las células
mastoideas
Pre form ados y eluidos
H istam ina
A nión superóxido
Enzim as depradativas de m atriz
extracelular
C alicreína
Interleuquinas 3, 4, 5, 6 y 8
Pre form ados y asociados a los gránulos
Proteasas
C arboxipeptidasas
H eparina- C ondrotin sulfato
Triptasa
A ril sulfatasa
G enerados recientem ente
Leucotrienos (LT C ,, D ,, E.)
PA F
Prostaglandinas (Dj)
a) preformados y fácilmente liberados
b) preformados y asociados a gránulos
e) generados recientemente
(Para mayor información véase eap. 32.)
2.7.b Segunda línea de defensa
Monocitos y macrófagos
Los m onocitos y los m acrófagos son e le ­
mentos fundam entales del sistem a fagocítico
mononuclear (MPS). Los monocitos constitu­
yen el com ponente sanguíneo del sistem a,
mientras que los macrófagos residen en lugares
específicos de los tejidos tales como hígado
(eélulas de Kupffer), pulmones (macrófagos al­
veolares), bazo, nódulos lin fático s, m édula
ósea, útero y cerebro (mieroglia). Los monoci­
tos m aduran a m acrófagos cuando entran al
compartimiento tisular. Durante la maduración,
estas eélulas adquieren diversas funciones, al­
gunas de ellas relacionadas eon la actividad fa-
goeítica incluyendo: defensa contra los m i­
croorganismos, capacidad para iniciar respues­
ta inmune, secretar mediadores que regulen la
proliferación y producción de factores linfoei-
tarios.
Una de las funciones más importantes de los
monocitos y de los macrófagos es su capacidad
para ingerir material extraño, conocida como
fagoeitocis.
Los monocitos poseen la capacidad de pro­
ducir mediadores solubles de amplia actividad
biológica. La producción de estos mediadores
se encuentra bajo control de los linfocitos T.
Los mediadores más importantes son: la inter­
leuquina - 1 , factores estimulantes de colonias,
la interleuquina- 6 , y el factor de necrosis tu ­
moral.
Otro aspecto del papel de los macrófagos en
la respuesta inmune es el desarrollo del estado
de activación. El término “activado” se refiere
al aumento de la capacidad bactericida del ma-
erófago y se debe fundamentalmente a la pro­
ducción de aniones superóxido (O ^) y peróxido
de hidrógeno. Esta activación se produce por la
interacción de los monocitos con productos de
las células T activadas.
Los macrófagos secretan enzimas que juegan
un papel importante en diversos estados patoló­
gicos. Entre ellas las más importantes son: acti­
vador del plasminógeno, colagenasa, elastasa,
y proteasas activas a pH neutro. También son
secretados por los macrófagos componentes del
sistema de complemento tales como, C l, C4,
C2, C3, C5, factor B, factor D y properdina así
como los fragmentos activados C3a y C5a por
la acción de proteasas de los macrófagos. Los
m acrófagos tam bién sintetizan eicosanoides
(PGEj, TXA^, leucotrienos B y C, 5-HETE y
15-HETE).
2.7.C Plaquetas
El papel de las plaquetas en la inflamación no
ha sido muy mencionado. Sin embargo las pla­
quetas son las segundas en abundancia en el to­
rrente circulatorio (le anteceden los eritrocitos) y
hay 20 a 50 plaquetas por cada leucocito en cir­
culación. Muchas de las condiciones que produ­
cen activación de los leucocitos se encuentran
asociadas con la agregación plaquetaria.
Durante la respuesta inflamatoria los leuco­
citos y las plaquetas se encuentran en íntimo
contacto lo cual aumenta la posibilidad de in­
tercambio de los mediadores.
El papel de las plaquetas abarca cuatro áreas:
1 ) homeostasis, 2 )modulación de la respuesta
inflamatoria, 3) toxicidad directa como célula
efectora, 4) reparación.
La cascada de coagulación y la agregación
plaquetaria son dos armas im portantes en la
respuesta a la injuria.
La agregación plaquetaria otorga un contacto
directo con otras células vecinas, permitiéndole
a las plaquetas modular la función de las célu­
las endoteliales e inflamatorias. Las plaquetas,
en forma similar a las células endoteliales y los
leucocitos, poseen moléculas de adhesión espe­
cíficas en su superficie, las cuales promueven
contacto intercelular. La glucoproteína Ib, en
combinación con el factor vWF (factor de von
Willebrand), es responsable de la adhesión de
las plaquetas a la superficie sub-endotelial. La
interacción con los monocitos se produce vía la
trombospondina presente en la superficie de las

plaquetas y los receptores de trombospondina
de los monocitos. Las plaquetas se unen simi­
larmente a los neutrófilos, pero no se conoce la
naturaleza exacta de esa interacción. La agre­
gación plaquetaria expone a las células endote­
liales, a las células del músculo liso y a los leu­
cocitos a concentraciones altas de los produc­
tos liberados de los gránulos de las plaquetas y
los sintetizados “de novo”. Estos productos tie­
nen actividad predominantemente pro-inflama-
toria e incluyen: metabolitos del ácido araqui­
dónico, proteasas, ADP, y factores de creci­
miento. Las plaquetas son capaces de modular
a los neutrófilos en todas las fases de la res­
puesta inflamatoria.
Las plaquetas, a través de la inducción de la
adherencia, la agregación, y la quimiotaxis, re­
clutan a los neutrófilos al sitio de inflamación.
Adicionalmente, los productos de las plaquetas
inician o potencian la respuesta de los neutrófi­
los sobre sus células blanco. Las plaquetas pue­
den tener el mismo efecto sobre los monocitos
y los eosinófilos.
La tercera función de las plaquetas es como
efector en la infecciones parasitarias. Si bien
no poseen la posibilidad de generar anión supe­
róxido, sin embargo las plaquetas presentan ac­
tividad citotóxica, aunque el mecanismo por el
cual transcurre no se conoce.
Las plaquetas completan su cuarta función
promoviendo la respuesta celular asociada a la
reparación. El factor de crecimiento derivado
de las plaquetas y el factor de transformación
beta (TG F-p) son estím ulos potentes para la
Injuria
Reacción local
- vasodilatación
transudación
- Agregación plaquetaria
formación de coágulos Mediadores
- Acumulación de neutrófilos -Interleuquinas 1 y 6
y macrófagos -Eicosanoides
-H istam ina
- Liberación de proteasas -Serotonina
y otras enzimas -T N F
-Q uininas
- Formación de mediadores
- Estimulación de fibroblastos
Respuesta de fase aguda
Muerte celular
Necrosis
F ig. 23-14. D esarrollo y efectos de la APR.
Inflamación 461
migración, proliferación y estimulación de fi­
broblastos y del músculo liso y juegan un im ­
portante papel en la reparación y cicatrización.
2.8 La respuesta de fase aguda
de la inflamación
La respuesta de fase aguda (APR), tam bién
conocida como reacción aguda, representa una
respuesta rápida, compleja, no específica a di­
versos tipos de daño tisular. Se caracteriza por
presentar modificaciones locales y sistém icas
de la fisiología normal, todo lo cual sirve para
controlar el daño, producir la limpieza de los
desechos, y comenzar la reparación tisular (fig.
23-14). Estas funciones se llevan a cabo m e­
diante la alteración de la síntesis de proteínas
por el hígado, que acompañan a la inflamación.
Las proteínas que están reguladas positiva­
mente durante la inflamación, se llaman reac-
tantes positivos de la fase aguda. Las proteínas
cuya síntesis es disminuida se denominan reac-
tantes negativos de la fase aguda.
Inducción de la respuesta de fa se aguda
En la fase muy temprana de la inflamación
los macrófagos tisulares reclutados de la sangre
comienzan a producir citoquinas. Las citoqui­
nas más claramente implicadas en la APR son:
la IL-1, el TNF, y la IL- 6 .
En la inflam ación temprana, aumentan los
niveles de cortisol, llegando a un máximo a las
6 horas. El número de células de la serie blanca
Reacción sistémica
-Fiebre y dolor
-Leucocitosis
-Segregación de hormonas
-Activación del complemento
y cascadas de coagulación
-Disminución de Fe y Zn
-Transferencia de aminoáci­
dos del músculo al hígado
-A um ento de proteínas de
fase aguda
Reparación
462 Mecanismos efectores de ia respuesta inmune
circulantes com ienza a aum entar llegando al
máximo a las 10 horas. Un gran número de cé­
lulas blancas se encuentran débilmente asocia­
das a las células del endotelio vascular. Estas
células se liberan a la circulación durante la in­
flamación en un proceso conocido como de-
marginación. Este proceso se ve favorecido por
el cortisol. Otro mecanismo por el cual se pro­
duce leucocitosis es por la liberación de neutró­
filos de la médula ósea, inducido por la IL-1.
Las citoquinas alteran la función hepática.
Como consecuencia de ello se producen cam ­
bios en el metabolismo de las grasas con au­
m ento de la síntesis de las lipoproteinas de
muy baja densidad (VEDE) y disminución de
las lipoproteinas de alta densidad (HDL). Los
aminoácidos liberados del músculo son capta­
dos por el hígado y también se encuentra modi­
ficado el perfil de proteínas sintetizadas. Existe
una disminución de los niveles de enzimas in­
volucradas en la gluconeogénesis y un aumento
de las que participan en las vías m etabólicas
que proveen energía y de las que participan de
la glucosilación de proteínas.
Existen evidencias de que la APR tiene dife­
rentes características en los distintos tipos de
inflamación. Los cambios en la velocidad de
síntesis de las diferentes proteínas de la APR, y
del tipo de proteína glucosilada varían según
los distintos procesos patológicos.
La función que cumple la APR, depende de
la función que cum ple cada proteína. C ono­
ciendo el papel que cumple la proteína se eva­
lúa el propósito de su cambio durante la infla­
mación.
2.8.a Respuesta de fa se aguda negativa
A lbúm ina. El hecho de que la albúmina no
presentara función específica, hizo que los in­
vestigadores la consideraran como un “adapta­
dor metabólico”. La albúmina conserva un pro­
ceso de síntesis activo que, en caso de que sea
necesario el aumento de síntesis de otras pro­
teínas, disminuye su propia síntesis, preservan­
do de esta forma la presión oneótica.
T ran sferrin a. Es otra proteína regulada ne­
gativamente durante la APR. Pertenece al gru­
po de las beta-globulinas. Es la mayor respon­
sable del transporte de hierro. El hierro es ne­
cesario para el crecimiento de la células de los
mamíferos y de las bacterias. La disminución
de la transferrina circulante con el aumento
concomitante de la ferritina intrahepática dis­
minuyen ia disponibilidad del hierro en el sitio
de la infección.
Transtiretina. Conocida como pre-albúmi-
na. Es la proteína transportadora de la hormona
tiroidea. Su disminución es útil para disminuir
los niveles de hormona tiroidea en la periferia,
modificando el metabolismo en el sitio de la
inflamación.
2.8.b Respuesta de fase aguda positiva
G rupo/
Ceruloplasmina. Es una aj-globulina. Es la
más im portante para el transporte de cobre.
Tiene la propiedad de actuar en la eliminación
de radicales libres del oxígeno de forma no ca­
talítica y estequiométrica y tiene actividad de
superóxido dismutasa, protegiendo del daño ti­
sular.
Componentes del complemento B, C , y C^.
Este grupo de proteínas posee capacidad de op­
sonizar, propiedades quimiotáxicas, vasodilata­
doras y eitolíticas por lo que resulta evidente la
importancia de su aumento durante la fase agu­
da de inflamación.
Grupo II
AGP. Conocida como orosomucoide. C on­
forma el 30% de las a|-globinas. Se encuentra
glucosilada en un 50% lo cual le confiere pro­
piedades para interactuar con una gran variedad
de membranas celulares. Inhibe la interacción
de los parásitos de la malaria con las membra­
nas de los glóbulos rojos, inhibe la agregación
plaquetaria, actúa como antiproteasa y se une a
una heparina inactivante.
H aptoglobina. Es el 25% del total de las
fracción a^-globinas. Une hemoglobina y cum­
ple funciones en el aporte de hemoglobina al
sitio de inflamación, pudiendo modificar la sín­
tesis de prostaglandinas ya que la cicloxigenasa
es una hemo-proteína. También posee activi­
dad de antiproteasa y poder bacteriostático na­
tural. La haptoglobina también puede ser inmu-
nomoduladora, puede suprimir la blastogénesis
linfocitaria y la quimiotaxis de los monocitos.
Fibrinógeno. Es una p-globulina y es la pro­
teína clave de la coagulación. También actúa
como una opsonina aum entando el agrupa-
miento de ciertos microorganismos, como esta­
filococos y estreptococos. El fibrinógeno blo­
quea la reactividad mitogénica da las células T
y la quimiotaxis de los macrófagos.
Inhibidor de proteasas. La a ,-P I es el más
im portante inhibidor de proteasa del plasm a
humano. El 55% de la actividad es extravascu-
lar, lo cual denota su papel en el control de la
actividad de proteasas tisulares.
Grupo III
Componente amiloideo A (SSA). Su nivel
aumenta de 1 0 0 a 1 .0 0 0 veces durante la infla­
mación. SAA se encuentra asociada a las lipo-

Cuadro 23-3. Proteínas de APR
APR N ivel en plasm a
A PR -positiva
G rupo 1 T 50% C eruloplasm ina
C om plem ento C |-C , B,
G rupo II t 2-4 X al-g lo b in a s
H aptoglobina
Fibrinógeno
Inhibidor de proteasas
G rupo III t l O O - 1000 X Proteína
reactiva
com ponente
am iloideo A
APR negativa i A lbúm ina
T ransferrina
T ranstiretína
proteínas de alta densidad (HDL), lo que le
atribuiría propiedades de ayudar a la elim ina­
ción de derivados lipídicos de los microorga­
nismos o toxinas que formen complejos con las
lipoproteínas.
Proteína C reactiva (CRP). Debe su nom ­
bre a su capacidad de precipitar al poiisacárido
de microorganismos. La CRP se puede unir a
polisacáridos, fosfolípidos y policationes. El
resultado final de la unión de la CRP a bacte­
rias es producir la precipitación y aglutinación
de los microorganismos. La CRP, unida a los
microorganismos, a los fosfolípidos o a los po­
licationes, aumenta la opsonización y causa la
generación de factores quimiotácticos. La CRP
se une a tejido necrótico y de ese modo puede
aumentar la velocidad de su remoción por fa­
gocitosis (cuadro 23-3).
La medida más común de la APR es la eri-
trosedimentación. Los glóbulos rojos poseen en
su superficie residuos de ácido siálico que pro­
voca la repulsión de las células entre sí. La pre­
sencia de proteínas séricas con carga positiva
neutraliza las cargas del ácido siálico, facilitan­
do que las células se empaqueten y sedimenten
juntas. El fibrinógeno está cargado positiva­
mente y es la proteína plasmática más asimétri­
ca, por lo que es el mayor responsable del au­
mento de la eritrosedimentación que se presen­
ta en la inflamación.
3. DINAMICA DE LA RESPUESTA
INFLAMATORIA
En el sitio de la inflamación ocurren im por­
tantes cambios. Estos cambios y el influjo de
células que toman parte en la inflamación es
lo que se conoce como “la respuesta inflam a­
toria”.
En la respuesta inflamatoria aguda se pueden
distinguir dos etapas que denominaremos;
Inflamación 463
1. Iniciación de la respuesta inflamatoria.
2. Movilización de las células inflamatorias.
3.1. Iniciación de la respuesta inflamatoria
La iniciación de la respuesta inflamatoria es
un proceso dinámico que involucra a la interac­
ción de mediadores solubles derivados del teji­
do con la pared vascular, las células inflam ato­
rias y los componentes plasmáticos.
De los cuatro signos cardinales de la infla­
mación, el calor y el rubor son debidos a un in­
cremento del flujo sanguíneo en el sitio de la
inflamación. Luego de la injuria tisular, poten­
tes m ediadores vasoactivos liberados p o r las
células mastoideas de los tejidos y por com po­
nentes de la pared vascular inducen un episodio
breve de vasoconstricción (3 a 5 segundos), se­
guido por dilatación de las arteriolas pre-capi-
lares y aumento del flujo sanguíneo en la red
vascular. La manifestación clínica de este pro­
ceso es el rubor.
El aumento del flujo sanguíneo va acom pa­
ñado de aumento de la perm eabilidad en las
vénulas poscapilares, debido a la retracción de
las células endoteliales y de la form ación de
espacios en las uniones célula endotelial- célu­
la endotelial. El aum ento de perm eabilidad
permite al fluido y a las proteínas salir del es­
pacio intravascular, generando edema e h in ­
chazón. Este proceso también genera una con­
centración relativa de glóbulos rojos en la vas-
culatura con retardo del flujo sanguíneo en las
vénulas, lo cual facilita la marginación de los
leucocitos y fom enta la adhesión de los m is­
mos al endotelio.
La formación de edema y la redistribución
sanguínea por las arteriolas es también afectada
por factores neurogénicos liberados en el sitio
de injuria.
En el cuadro 23-4 se encuentra un resumen
de los mediadores, los mediadores vasoactivos
y de su fuente de origen.
3.2. M ovilización de las células
inflamatorias
La movilización de las células inflamatorias
se encuentra comprendida en dos fenóm enos
fundamentales:
a. leucocitosis.
b. migración celular
3.2.a Leucocitosis
Los neutrófilos, eosinófilos y monocitos son
producidos en la médula ósea donde perm ane­
cen depositados por un corto período y luego
son liberados al torrente circulatorio. Los m a ­
crófagos derivan fundamentalmente de los mo-
 Mecanismos efectores de la respuesta inmune

la población total de neutrófilos del torrente

C u ad ro 23-4. Mediadores vasoactivos circulatorio, el 45% son circulantes y el 55%
M ediador Fuente son neutrófilos m arginados. Los neutrófilos
pueden ser rápidamente movilizados y son los
V asoconstricción
responsables del aumento de neutrófilos perifé­
N eurogénicos N ervios ricos asociados al ejercicio intenso o al uso de
LTC4, LTD4, LTE4 C élulas m astoideas, basófilos esteroides.
Vasodilatación
El depósito en médula ósea está constituido
por células maduras o que se encuentran en las
PG12 C élulas endoteliales
últimas etapas de maduración, las cuales están
PGE2, PG D 2 M onocitos, m acrófagos, cé lu ­ normalmente retenidas antes de ser liberadas al
las m astoideas torrente circulatorio. El número de células en
esta situación es 2 0 veces mayor que el de cir­
H istam ina C élulas m astoideas, basófilos culación. En respuesta a mediadores inflamato­
S erotonina Plaquetas rios como la IL-1, el TNF y la endotoxina estas
células son liberadas al torrente circulatorio. El
Bradiquina Plasm a (sist. celular de co n ­ aporte del compartimiento de la médula ósea a
tacto) la reacción inflamatoria se hace evidente por el
NO C élulas endoteliales núm ero de neutrófilos en cayado que se en­
A um ento de perm eabilidad vascular
cuentran en el torrente circulatorio.
Los monocitos, por el contrario, se encuen­
Histam ina C élulas m astoideas, basófilos tran depositados en muy escasa cantidad en la
S erotonina P laquetas médula ósea y su movilización requiere divi­
sión de la “stem cell” al responder a la deman­
C3a, C 5a Plasm a (sistem a de contacto) da periférica.
Bradiquinina P lasm a (sistem a de contacto)
3.2.b Reclutamiento celular
LTC4, LT D 4, LTE4 Eosinófilos, células m asto i­
deas, m onocitos
3.2.b.l Factores que regulan
PAF C élulas m astoideas, basófi­ el reclutamiento celular
los, m onocitos, m acrófagos,
neutrófilos, eosinófilos, La extravasación de los leucocitos es un de­
plaquetas, células m asto i­ terminante crucial de la reacción inflamatoria.
deas La IL-1 y el TNF, inyectados localmente, cau­
san infiltración leucocitaria en los tejidos. Las
células endoteliales participan en el reclu ta­
miento de leucocitos provocado por las citoqui­
nocitos circulantes, pero poseen una habilidad nas inflainatorias, produciendo quimioatractan­
limitada de presentar mitosis en los tejidos. tes que activan y atraen leucocitos, por expre­
La vida media de los neutrófilos, eosinófilos sión de moléculas de adhesión y por la altera­
y fagocitos m ononucleares es relativam ente ción del flujo sanguíneo.
corta. Por lo tanto para mantener su ntimero en Las estructuras de adhesión inducidas por
el sitio de inflamación requiere un influjo cons­ IL-1 y TNF pertenecen a dos grupos estructura­
tante de nuevas células. les: el gen de la superfamilia de las inmunoglo­
En la inflamación aguda el ntimero de leuco­ bulinas (Ig) y la familia de las selectinas. Las
citos asciende de 5000 a 30.000/mL. Este au­ células endotehales expresan constitutivamen­
mento es debido al movimiento de neutrófilos te, a bajos niveles, tres moléculas del tipo Ig;
al torrente circulatorio desde dos sitios de de­ ICAM-1, ICAM-2, y VCAM-1. El tratamiento
pósito; las células marginadas intravasculares y eon IL-1 y T N F in c rem e n ta la sín te sis de
las de la médula ósea. IC A M -1 y V C A M -1 , m ie n tra s q u e la de
El depósito de células marginadas representa ICAM-2 no es afectada.
una población de neutrófilos que se encuentran Los ligandos de estas Ig son miembros de
adheridos tem porariam ente a la pared de los los receptores de adhesión de la familia de las
vasos sanguíneos y que de esta manera perm a­ integrinas: LFA-1 y Mac-1 ( que pertenecen a
necen fuera del torrente circulatorio principal. la subfamilia de integrinas ¡32, C D l 1/18 o Leu
Esta marginación ocurre en los vasos donde la C A M ) q u e a c tú a n co m o re c e p to re s p a ra
dinámica del flujo sanguíneo hace que los gló­ ICAM-1 mientras que VLA-4 ( o alfa4|3l)es el
bulos rojos ocupen el torrente central, despla­ receptor para VCAM - 1 .
zando a los leucocitos a la periferia, en contac­ La activación de los leucocitos por ciertos
to eon el endotelio de los vasos sanguíneos. De estímulos aumenta intensamente la afinidad de

LFA-1 y Mac-1 por ICAM-1, posiblemente de­
bido a cambios conformacionales de las molé­
culas de integrinas mediadas por el dominio ci-
toplasmático de la cadena P2. Por otro lado, la
afinidad y especificidad de ICAM-1 para los
receptores-integrinas es modificada por el gra­
do de glucosilación.
La otra proteína de adhesión inducida por el
tratamiento con citoquinas en las células endo­
teliales es la selectina -E. Los tres componentes
de este grupo comparten una estructura similar,
con un dominio lectina dependiente del calcio
en el terminal amino. Los otros dos componen­
tes de este grupo son: la selectina -P o GMP-
14 0 /P A D G E M y la s e le c tin a -L o M E L -
14/LAM -l. Diversos trabajos demuestran que
los carbohidratos son ligandos para las selecti­
nas a través del reconocim iento del dominio
lectina de estas m oléculas. Un azúcar de es­
tructura simple, Slex, fue identificada para la
unión de ia selectina-E en las células de origen
mieloide. El mismo azúcar puede unir también
selectina-P. Sin em bargo, otro grupo azúcar,
Slea, presente en las células del carcinoma de
colon, pero no en polimorfonucleares neutrófi­
los o monocitos, puede unir ávidamente selecti­
na-E y promover adhesión de las células tumo-
rales. Además, la selectina-L, presente en linfo­
citos y polimorfonucleares, puede unirse a la
selectina-E.
La inducción de la selectina-E en células en­
doteliales por IL-1 es de corta duración, llega
al máximo en 4h y luego cae en 8-12h, por lo
que tiene un papel importante sólo en la prime­
ra fase del reclutamiento leucocitario.
Los monocitos, eosinófilos y los linfocitos
T, reconocen las tres moléculas de adhesión in­
ducidas por la IL-1. Los neutrófilos se unen a
lCA M -1 y a ELA M -1, pero no reconocen a
V CAM -1. Las células NK se unen esencial­
mente a ICAM-1 y a VCAM-1 y sólo en menor
proporción a la selectina -E.
Aparentemente, una acción concertada de es­
tas moléculas de adhesión inducibles de las cé­
lulas del endotelio son requeridas para la m i­
gración celular a través del endotelio. En térmi­
nos generales, la selectina-E juega el pape) de
permitir la primera adhesión de los leucocitos
en vénulas, mientras que el mecanismo de re­
conocim iento de ICAM-1 y Mac-1 dominan
los sucesos posteriores. La interacción de los
monocitos y neutrófilos con las selectinas E y
P, median el “rodamiento” a lo largo de la su­
perficie del endotelio. La activación leucocita­
ria con citoquinas quimioatractantes (quimio­
quinas), promueve su unión a ICAM-1, la cual
es entonces responsable de una adhesión más
fuerte y de la migración a las capas sub-endote-
liales.
La adhesión de los leucocitos a los recepto­
Inflamación 465
res de adhesión del endotelio, los activan. La
interacción de los linfocitos T con VCAM-1 e
ICAM -1, pero no con selectina E, es co-esti-
mulatoria con el receptor de células para indu­
cir proliferación y expresión del receptor de
IL-2.
La expresión de las proteínas de adhesión de
las células endoteliales se ha observado en dis­
tintas patologías en seres humanos, incluyendo
la fase tardía de las reacciones alérgicas, artritis
reumatoidea y linfoma.
Las m oléculas de adhesión inducidas por
IL-1 y TNF no son reconocidas específicamen­
te por los leucocitos, sino que pueden unir otras
células invasivas. Por ejemplo, IC A M -I, puede
unir a la mayoría de los rinovirus y pro-eritro-
citos infectados por Plasmodium falciparum-, la
Candida albicans puede expresar receptores de
adhesión homólogos a M ac-1, por lo que se su­
giere que puede unirse a ICA M -1.
VCAM-1 es reconocida por células tumora­
les tales como las de melanoma y las de osteo­
sarcoma, mientras que la selectina-E es unida
por células del carcinoma de colon. Este fenó­
meno está acompañado por un aumento de la
adhesividad de las células tumorales a las célu­
las endoteliales activadas y es, por lo tanto, la
causa del incremento de la incidencia de metás­
tasis artificial o espontánea en los animales tra­
tados con IL-1.
3.2.b.2 Migración celular
La migración de los leucocitos a los tejidos
involucra una secuencia coordinada de fenóme­
nos de adherencia, mediados por la interacción
entre los leucocitos y las moléculas de adhe­
sión de la superficie de las células del endotelio
vascular. Esta cascada de fenóm enos se en­
cuentra ilustrada en la figura 23-15 y puede ser
dividida en cuatro etapas.
1. La primera etapa involucra la generación de
mediadores (incluyendo citoquinas) y la ac­
tivación inicial del endotelio en el sitio de
inflamación para inducir la expresión de se­
lectinas y ligandos de selectinas. E sto oca­
siona el debilitam iento del contacto entre
los leucocitos y el endotelio vascular, indu­
ciendo de esta form a el “rodam iento” de
los leucocitos a lo largo del endotelio.
2. En la segunda etapa de la cascada, la de
“activación”, los leucocitos que se encuen­
tran “rodando” son activados por citoquinas,
quimioquinas y quimioatractantes, que son
producidos localmente. La activación de los
leucocitos produce entonces un aumento de
la afinidad de la unión de las integrinas de
los leucocitos a sus ligandos endoteliales,
llevando a una adhesión firme.
466 Mecanismos efectores de la respuesta inmune

Etapa R odam iento A ctivación Adhesión M igración transendotelial

Carbotiidratos Receptores de LFA-1 LFA-1

sialilados y quimioquinas y Mac-1 Mac-1
Leucocitos glucosllados quimioatractantes MLA-4 VLA-4
Selectina L PECAM-1

Endotelio

Selectlna-P Citoquina ICAM-1

Selectina-E Quimioquinas ICAM-2
LIg. seiectina-L PAF VCAM-1
Selectina-E

F ig. 23-15. M igración leucocitaria.

3. La tercera etapa es de “adhesión firm e ”, previa a la firme adhesión al endotelio. Es me­

mediada por la unión de una integrina del diada por distintos tipos de selectinas. La selec-
leucocito a un ligando tipo superfamilia tina-P se encuentra preformada, depositada en
de las inmunoglobulinas (Ig). las células endoteliales, y es movilizada a la su­
4. En la cuarta etapa de la cascada, la “m i­ perficie celular cuando el endotelio es estimu­
gración trans-endotelial”, los leucocitos lado por mediadores de las células mastoideas,
adheridos migran entre las uniones de las por ejemplo, histam ina y factor activador de
células endoteliales. La migración trans­ plaquetas (PAF). La selectina-E es inducida en
endotelial involucra a integrinas leucoci- las células del endotelio vascular por citoqui­
tarias y ligandos endoteliales tipo Ig, así nas tales como IL -1 y TNF.
como a moléculas de adhesión de leuco­ Las selectinas P y E del endotelio vascular
citos y plaquetas del endotelio vascular luego interactúan con oligosacáridos sialilados
(PECAM-1). de los leucocitos del torrente circulatorio (véa­
se cuadro 23-5) causando a su vez “rodamien­
Rodamiento leucocitario to” leucocitario.
La selectina- L de los leucocitos tam bién
El “rodamiento” de los leucocitos en el sen­ contribuye al “rodamiento leucocitario” a tra­
tido del flujo sanguíneo es la prim era etapa vés de su interacción con oligosacáridos del en-

C uadro 23-5. Moléculas de adhesión en leucocitos

M oléculas de adhesión
en leucocitos D istribución Ligando endotelial

C ontraparte para .selectinas

C arbotiidratos sialilados Todos los leucocitos Selectinas - P y E

C arbohidratos fucosilados T odos los leucocitos Selectinas Pg y E

Selectina-L Todos los leucocitos N o determ inado

Integrinas - B lC A M -L IC A M -2
L F A -1 (CD lla /C D 1 8 ) Todos los leucocitos ICAM-1
M A C -1 (CD rib /C D 1 8 ) E, B ,N , M N o determ inado
p l5 0 (C D tlc /C D 1 8 ) E, B ,N ,M

Integrinas B, E, B, L, M VCAM -1
V LA -4 (CD 49d/CD 29)

R eferencias: B: b asó filo s, E: eo sin ó filo s; L: lin fo cito s; M : m o n o cito s; N: n e u tró ü io s .

 Inflamación 467

dotelio (ligando de seleetina -L) que son a su mioatractantes producidos localmente y la dis­
vez inducidos por eitoquinas. tribución celular de sus receptores. Además las
citoquinas, el factor de necrosis tumoral alfa
Activación (TNF-alfa), el factor estimulante de crecim ien­
to de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), la
La aetivaeión de los “leucocitos rodantes” interleucjuina 3 (IL-3) y también la interleuqui­
por quim ioatractantes resulta en un aumento na 5 (IL-5) incrementan la adhesividad de las
rápido de la adhesividad de las integrinas. Este integrinas leucocitarias.
aumento de adhesividad ha sido demostrado en
neutrófilos, eosinófilos, monocitos y células T. Adhesión
En este sentido, además del PAF y del leuco­
trieno B^, han sido identificados como im por­ La adhesión firme de los leucocitos al endo­
tantes factores activadores a quimioquinas que telio es mediada por la unión de las integrinas
además determinan la especificidad de activa­ de los leucocitos a los ligandos endoteliales ti­
ción (véase cuadro 23-6). po Ig. Cada integrina consiste en cadenas hete-
Basados en la homología de la secuencia pri­ rodímeras alfa y beta. Existen dos tipos de in­
maria y en la secuencia de las dos primeras cis- tegrinas, llamadas integrinas Pj e integrinas P,.
teínas, se distinguen dos familias de quimioqui­ Dentro de las integrinas se distinguen a
nas: las alfa q u im io q u in as, eon se c u e n c ia su vez tres tipos: LFA-1; Mae-1 y p l5 0 ,9 5 .
C-X-C, que actúan sobre neutrófilos y las beta Las distintas integrinas P2 se diferencian en el
quimioquinas con secuencia C-C, que actúan so­ tipo de cadena alfa las cuales se encuentran no
bre monocitos, y en algunos casos eosinófilos y covalentemente asociadas a dos cadenas p. La
células T (cuadro 23-6). Estas quimioquinas son expresión de integrinas p 2 está restringida a
producidas en grandes cantidades por células T leucocitos, sin embargo la distribución de las
activadas, m onocitos, células endoteliales y cadenas p difiere en los distintos tipos de leu­
otros tipos celulares. Por ejemplo: la lL -8 dispa­ cocitos. LFA-1, es expresado en todos los leu­
ra la adhesión de neutrófilos a los ligandos en­ cocitos, mientras que Mac-1 y pl50,95 están
doteliales ICAM -1 e ICAM-2 a través de las in­ expresados en todos los leucocitos excepto lin­
tegrinas [32, en cambio la quimioquina MIP-1(3 focitos. Las integrinas leucocitarias p2, unen
induce adhesión de hnfocitos T al ligando endo- específicamente los ligandos endoteliales tipo
telial VCAM-1 a través de las integrinas (31. Ig: LFA-1 une a ICAM-1 y a ICAM-2; Mae-1
Los receptores de quim ioatractantes se en­ une a ICAM-1. Así la adhesión de los neutrófi­
cuentran acoplados eon proteínas que unen los, eosinófilos, basófilos y monocitos al endo­
GTP. Luego de la unión del ligando al recep­ te lio v a sc u la r d e p en d e p rin c ip a lm e n te de
tor, las señales son transducidas para generar LFA-1 y Mae-1 y en menor grado de pl5 0 ,9 5 .
conformaciones activas de los heterodím eros La adhesión de los linfocitos involucra sólo a
de las integrinas. Así, la especificidad de la ac­ LFA-1.
tivación leucocitaria está determinada por qui­ La integrina p l, VLA-4, se expresa en todos
los leucocitos excepto en neutrófilos y une
VCAM-1 expresada en células endoteliales ac­
tivadas por eitoquinas. Así, VLA-4 está involu­
crada en la adhesión de linfocitos, monocitos,
C uadro 23-6. Quimioatractantes ele leuco­ eosinófilos, y basófilos a células endoteliales
citos a c tiv a d a s a tra v é s de la in te ra c c ió n con
VCAM -1. Como los neutrófilos no expresan
Q uim ioíractantes Fuentes Célula blanco VLA-4, ellos no pueden usar esta vía para ad­
LTB4 M C ,N E ,B ,N ,M herirse al endotelio estimulado.
PAF E C ,E E, B ,N , M La expresión de ICAM-1 y VCAM-1 en las
C5 Com plem ento E ,B ,N ,M células del endotelio vascular es regulada por
citoquinas: IL-1, T N F -a y TNF-p inducen la
Q uim ioquinas
C-X -C expresión de lCAM-1 y VCAM-1. El interfe-
IL -8 T,M ,EC, N, B rón-y reg u la positiv am en te la e x p resió n de
N AP-2 fibroblastos N, B, fibroblastos ICAM-1, pero no de VCAM-1. La IL-4 induce
Plaquetas la expresión de VCAM -1, pero no IC A M -1.
Q uim ioquinas C-C Por el contrario ICAM-2 está constitutivamente
MCP-1 T, M, EC, B ,M expresada en el endotelio vascular y no es afec­
M CP-3 fibroblastos E ,B ,M tada por las citoc¡uinas.
M T P - la M , T ,B E ,B ,M Por lo tanto, la unión específica de las inte­
M T P -lp M, T, B T, M
Rantes T, plaquetas E, B, T, M grinas leucocitarias a los ligandos tipo Ig del
endotelio y la regulación de la expresión de los
468 Mecanismos efectores de la respuesta inmune
ligandos por las citoquinas contribuyen a la se­
lectividad de adhesión de los distintos subtipos
de leucocitos, mediando así un reclutam iento
selectivo de leucocitos al sitio de inflamación.
Migración trans-endotelial
Finalmente, los leucocitos se arrastran sobre
la superficie del endotelio a la unión intercelu­
lar y luego se deslizan entre las células endote­
liales al tejido extravascular. Se ha demostrado
que la migración de los leucocitos a través de
monocapas endoteliales in vitro es inducida por
la activación de los leucocitos por quimioatrac­
tantes y por la estimulación de las células en­
doteliales con citoquinas, totalm ente d epen­
diente de CD11/CD18. Sin embargo, la adhe­
rencia al endotelio es un requisito previo para
la subsecuente migración trans-epitelial. Así,
bloqueando cualquier etapa de adherencia, se
conseguirá reducir la migración trans-endote-
hal.
Además de los mecanismos involucrados en
la adhesión firme, hay por lo menos dos meca­
nismos diferentes para la migración trans-endo­
telial, llamados quimiotaxismo y haptotaxismo.
En el quimiotaxismo, los leucocitos adherentes
se mueven en el sentido de la concentración de
un quimioatractante. Éstos son importantes tan­
to en la migración trans-endotelial de los leuco­
citos como en la activación de las integrinas de
adherencia. En el haptotaxismo, los leucocitos
migran a lo largo de un gradiente de los ligan-
dos de adhesividad de las células endoteliales a
la región de máxima densidad de ligando. En
este sentido, una molécula de adhesión tipo Ig,
PECAM -1, puede cumplir alguna función en la
m igración trans-endotelial de leucocitos. AI
contrario de ICAM-1, la cual es expresada so­
bre toda la superficie de las células endotelia­
les, PECAM-1 está localizada en las uniones
intercelulares por lo que presenta un gradiente
hapotáxico que posibilita la migración trans-
endotelial.
Mecanismo selectivo para la acumulación
de eosinófilos
Las tres selectinas y sus tres carbohidratos li­
gandos, junto a las cuatro integrinas y sus li­
gandos tipo Ig, proveen suficiente diversidad
com binatoria como para perm itir el reclu ta­
m iento de los subtipos de leucocitos. Por lo
tanto, existen tres componentes clave para se­
leccionar el tipo de leucocito reclutado;
1. La expresión selectiva de las selectinas y
sus ligandos en las células epiteliales (selec-
tina-P, selectina-E , selectina-L ) inducida
por citoquinas y mediadores inflamatorios.
2. La activación selectiva de las integrinas leu-
cocitarias (LFA-1, Mac-1 y VLA-4) induci­
da por citoquinas, quimioquinas y quimioa­
tractantes.
3. La expresión selectiva de las moléculas de
adhesión del tipo de Ig en las células endo­
teliales inducida por citoquinas.
Estudios in vitro demostraron que en la etapa
de “rodamiento”, existen diferencias entre los
carbohidratos sialilados del ligando de la selec­
tina-E de la superficie de los neutrófilos y eosi­
nófilos. Esto puede explicar la menor adhesivi­
dad de los eosinófilos a la selectina-E.
También se ha demostrado activación selec­
tiva de los eosinófilos por citoquinas, quimio­
quinas y quimioatractantes específicos para eo­
sinófilos, que prom ueven su adherencia y la
migración trans-endotelial.
La IL-5, una citoquina derivada de las célu­
las T, que activa eosinófilos específicamente e
induce eosinopoyesis, aumenta la adherencia
de los eosinófilos y poten cia su m igración
trans-endotelial. GM -CSF, que es producido
por células T y también por células endoteliales
activadas, también estimula la migración trans-
endotelial de los eosinófilos, sin afectar la m i­
gración trans-endotelial de los neutrófilos aun­
que induce la adherencia de arabas especies
sub-leucocitarias.
La quimioquina específica para eosinófilos,
RANTES, induce selectivamente la migración
trans-endotelial de los eosinófilos pero no de
los neutrófilos y lo hace sin afectar a la etapa
de adherencia. El PAF también induce selecti­
vamente la migración trans-endotelial de los
eosinófilos, aunque en la etapa de adherencia
no presenta selectividad entre los eosinófilos y
los neutrófilos.
En las'etapas de adhesión firme y migración
trans-endotelial, la interacción entre VLA-4 y
VCAM-1 media la migración de los eosinófilos
selectivamente, ya que los eosinófilos, y no los
neutrófilos, expresan VLA-4 en la superficie
celular y pueden por lo tanto unir al ligando en­
dotelial VCAM-1 el cual es específicam ente
regulado por las citoquinas. La IL-4 induce se­
lectivamente VCAM-1 pero no ICAM-1 o se­
lectina-E. Contrariamente, TNF e IL-1 inducen
la expresión de ICAM-1 y de VCAM-1 en cé­
lulas endoteliales, por lo que tam bién incre­
mentan la adhesión de los eosinófilos por esti­
mulación de las células endoteliales.
Existen evidencias de que la infiltración de
eosinófilos causa daño tisular en tejidos como
el de las vías respiratorias e hiperreactividad
del mismo debido a la liberación de gránulos
citotóxicos y de mediadores lipídicos.
Además de la infiltración de eosinófilos, se
ha demostrado un aumento de células T CD4+

y de su citoquina IL-5 en los sitios de reacción
alérgica tardía, lo que sugiere la intervención
de ambos factores en el reclutamiento de eosi­
nófilos inducido por la citoquina de las células
Th2, IL-5 y la IL-4; también las quimioquinas
RANTES y M T P -la inducen selectivamente la
acumulación de eosinófilos. La IL-5 activa a
los eosinófilos para que aumenten su adhesivi­
dad a integrinas. También induce eosinopoye-
sis y la liberación de eosinófilos de la médula
ósea. La IL-4, induce selectivamente la expre­
sión de VCAM-1 en el endotelio, por lo tanto
la activación de las células Th2 es un pre-re-
quisito para la acumulación selectiva de eosi­
nófilos (véase fig. 23-16).
4. FUNCIÓN DEL ENDOTELIO
VASCULAR EN LA IN FLA M A C IÓ N
Introducción
Las células del endotelio vascular han sido,
por m ucho tiem po consideradas un re v e sti­
miento pasivo de los vasos sanguíneos dotado
de propiedades negativas, siendo la más im por­
tante la de representar un sustrato no trombogé-
nico para la sangre.
Sin embargo, las células del endotelio vas­
cular se encuentran estratégicamente localiza­
das en la interfase entre la sangre y el tejido.
Por lo tanto no es sorprendente que estas célu­
las, las cuales disparan el tráfico de las m olé­
culas y de las células a través de los vasos san­
guíneos, juegan un papel activo en la hom eos­
tasis, las reacciones inflamatorias y ia inm uni­
dad. Además de responder rápidamente, en tér­
minos de segundos, a agonistas tales como his­
tamina y trombina, las células vasculares, lue­
go de ser expuestas a las citoquinas, sufren
profundas alteraciones de la función que inclu­
ye expresión genética y síntesis de proteínas,
lo que requiere horas para desarrollarse y son
relativamente duraderas. Esta reprogramación
funcional de las células endoteliales se ha de­
nominado “activación”, en analogía con el tér­
mino ampliamente usado para la línea monoei-
tos/macrófagos.
Las células vasculares son tanto “blanco”,
como fuente de citoquinas, y estos mediadores
polipeptídicos operan como señales de comuni­
cación con leucocitos (productores principales
de citoquinas), así como con diversos tejidos y
órganos. En este capítulo analizaremos sólo las
respuestas llevadas a cabo por las citoquinas en
las células vasculares y analizaremos la forma
en que los elementos de los vasos sanguíneos
participan en la cascada de citoquinas, produ­
ciendo grandes cantidades de estos mediadores
polipeptídicos.
Inflamación 469
Respuesta de las células endoteliales
a las citoquinas
Respuesta a la IL-1 y al TN F
Estas citoquinas pro-inflam atorias y pleio-
trópicas así como el lipopolisacárido (LPS) de
las bacterias, orientan la función de la células
endoteliales en un sentido trombogénico e in­
flamatorio.
A m bas citoquinas inducen la síntesis del
PAF por las células endoteliales. Este fosfolípi­
do es un potente activador de las plaquetas y de
los leucocitos y es vaso constrictor. Se ha suge­
rido que el PAF liberado es el responsable de la
capacidad inmunosupresora de las células del
endotelio vascular activadas. Además, las célu­
las asociadas al PAF activan a los polimorfonu­
cleares, los cuales se adhieren a las células en­
doteliales y las condicionan para la posterior
respuesta estimulatoria.
Luego de la activación, las plaquetas expre­
san IL-1, la cual, asociada a las plaquetas actúa
sobre el endotelio vascular induciendo la p ro ­
ducción de moléculas de adhesión y la produc­
ción de citoquinas. Así, en los sitios de infla­
m ación ocurre un interjuego entre las células
endoteliales y las plaquetas am plificando la
reacción inflamatoria.
La inducción de NO por la IL-1 puede ser
vista en la misma perspectiva de repuesta vaso­
dilatadora local o sistémica a esta citoquina in­
flamatoria. La exposición del tejido vascular al
LPS, lo vuelve refractario a la acción v a so ­
constrictora de las drogas adrenérgicas. Este
efecto se produce a través de la inducción de
NO vía la IL-1 y cL TNF. La resistencia adre-
nérgica es también un hecho que se presenta en
el síndrome del “shock” séptico. El significado
de la alteración del flujo vascular en la infla­
mación todavía no ha sido establecido.
El TNF altera la permeabilidad vascular, pe­
ro su acción depende de la presencia de neutró­
filos. Así, la alteración vascular alterada p o r ci­
toquinas inflamatorias probablemente depende
de la interacción directa con el endotelio como
del reclutamiento y activación de los leucocitos
circulantes.
R espuesta al interferón-y
El IF N - 7 es la prim era citoquina d efin id a
molecularmente que se demostró tiene acción
sobre el endotelio vascular.
El IFN-Y aumenta la producción de IL-1 esti­
mulada por el LPS. También amplifica la ac­
ción del TNF sobre las células endoteliales,
causa un aumento lento de la producción de
IC A M -I, tornando al endotelio vascular más
adhesivo para los linfocitos T.
470 Mecanismos efectores de la respuesta inmune
Etapa R odam iento Activación
Lig. seiectina-P Receptores de
Eosinófilos Lig. selectina-E quimioquinas y
Seleetina L quimioatractantes
Endotelio
Selectina-P
Selectina-E
Lig. selectina-L
Selectina-E
F ig. 23-16. M ecanism o selectivo de acum ulación de eosinófilos.
La inform ación disponible sugiere para el
INF-y una acción única, distinta del resto de las
eitoquinas, que es la de inducir a las células a
actuar como células accesorias sin presentar
por ellas mismas efecto pro-inflamatorio, trom­
bótico, proliferativo o migratorio.
Respuesta a la interleuquina-4
La IL-4 es un factor de crecimiento y dife­
renciación linfocitaria que ha emergido recien­
temente como modulador de la función de las
células endoteliales. La exposición de las célu­
las endoteliales a la IL-4, sola o en combina­
ción con IL-1 y TNF, produce aumento de la
unión de linfocitos pero no de neutrófilos, de­
bido a que aumenta la expresión de VCAM-1,
pero inhibe la expresión de ICAM-1 y selecti-
na-E. Adicionalmente, la IL-4 es un inductor
débil de la IL - 6 en las eélulas endoteliales, pero
amplifica su producción en combinación con
otros estímulos.
La IL-4 es un factor de crecimiento para la
mierovaseulatura, pero no de los grandes vasos.
Colectivamente, los efectos de la IL-4 pueden
ser interpretados como favoreciendo el recluta­
miento de linfocitos y la activación de elementos
linfoeíticos y monocíticos, cruciales para la in­
flamación sub-aguda y crónica y las reacciones
inmunes. Aunque este punto de vista es atracti­
vo, resulta iiitrigante que esta misma citoquina
posea una acción inhibitoria sobre la adhesión
de los monocitos a las células endoteliales.
Respuesta al factor de permeabilidad
vascular
Células tumorales de diferente origen y célu­
las del m úsculo liso vascular, producen una
A dhesión M igración transendotelial
LFA-1
Mac-I
VLA-4
proteína de 46 kD denominada factor de per­
m eabilidad vascular (VPF) tam bién llainado
factor de crecimiento vascular (VEGF). El VPF
promueve pérdida de líquido vascular por inte­
racción con receptores específicos a alta afini­
dad, a través de cambios en la homeostasis del
calcio. Posee acción sinérgica con el TNF en la
inducción de factores pro-coagulantes en el en­
dotelio vascular y en promover la migración de
monocitos a través del endotelio vascular. Así,
el VPF afecta la función del endotelio relacio­
nada con la angiogénesis y con la trombosis e
inflamación.
Producción de quimioquinas
Las células vasculares producen diversos
m iem bros de la fam ilia de las cito q u in a s,
muchas de las cuales son quimiotácticas para
la población de leucocitos, son las quim ioqui­
nas.
Por exposición a señales inflamatorias como
IL-1, TNF y LPS, las células endoteliales pro­
ducen una proteína quimiotáctica de inonocitos
(MCP), que pertenece a la familia de las C-C y
es importante para la regulación de la infiltra­
ción de monocitos en ciertos tumores.
La IL-1, el TNF y el LPS, también inducen
IL -8 y gro-alfa, dos quimioquinas de la familia
de las C-X-C. Ambas son activos quimioatrac­
tantes para neutrófilos, pero además afectan a
los basófilos (con IL-3), linfocitos y células de
melanoma.
A sí, las células vasculares producen q u i­
mioatractantes (IL -8 y MCP), que atraen y acti­
van a diferentes sub-poblaciones de leucocitos.
Estos mediadores actúan concertadamente con
el aumento de la expresión de las moléculas de
adhesión, así como con las alteraciones reoló-

gicas determinadas por la inducción de la sínte­
sis de las prostaglandinas y del NO para provo­
car extravasación de leucocitos, así como célu­
las tumorales metastásicas a los tejidos. La pro­
ducción de los quim ioatractanes por los ele ­
mentos vasculares puede ser importante en la
patogénesis de las enfermedades que afectan
directamente a los vasos sanguíneos. La infil­
tración de monocitos es un hecho temprano en
la historia de la ateroesclerosis y es prominente
en la vaseulitis.
Tono y permeabilidad vascular
La lL-1 y el TNF aumenta la producción de
PGI2 a través de la inducción de la COX-2.
La inducción del óxido nítrico (NO) por la
IL-1 puede ser vista en la misma perspectiva
de repuesta vasodilatadora local o sistémica a
esta citoquina inflamatoria. La exposición del
tejido vascular al LPS, vuelve refractario al
mismo a la acción vasoconstrictora de las dro­
gas adrenérgicas. Este efecto se produce a tra­
vés de la inducción de NO vía IL-1 y TNF. La
resistencia adrenérgica es también un hecho
que se presenta en el síndrom e del “ sh o ck ”
séptico.
El TNF altera la permeabilidad vascular, pe­
ro su acción depende de la presencia de neutró-
füos. Así, la alteración vascular alterada por ci­
toquinas inflamatorias probablemente depende
de la interacción directa con el endotelio como
del reclutamiento y activación de los leucocitos
circulantes.
5. R ESPU ESTA IN FLA M A TO R IA .
R ESU M EN Y CON CLU SIO NES
5.1. Inflamación aguda
La etapa inicial de la respuesta inflamatoria
clásica a la injuria tisular, está caracterizada
por la liberación de m ediadores vasoactivos
desde las células mastoideas de los tejidos (por
ejemplo, histamina y leueotrienos), plaquetas y
componentes plasm áticos (bradiquinina), que
producen vasodilatación y formación de ede­
ma. Esta etapa es seguida por la activación de
los componentes de la coagulación y del siste­
ma de complemento y la generación de factores
quimiotácticos para neutrófilos y para otras cé­
lulas inflamatorias derivados del plasma (C5a)
y de eélulas (IL-8). Los factores quimiotácticos
funcionan reclutando células inííam atorias en
el sitio de inflamación y promueven su migra­
ción a los tejidos. Una vez presentes en el teji­
do, las células inflamatorias (neutrófilos) pue­
den ser estimuladas para liberar productos bac­
tericidas, inclusive m etabolitos reactivos del
Inflamación 471
oxígeno y proteasas, como así también m edia­
dores lipídicos como leucotrieno y factor ac­
tivador de plaquetas (PAF).
Adicionalm ente, y según la naturaleza del
daño patogénico, las células fagocíticas mono-
nucleares pueden ser estimuladas por vías in­
m unes o no inm unes para generar productos
del ácido araquidónico y potentes citoquinas,
que luego modulan la evolución de la respuesta
inflamatoria.
R ecientem ente, se ha puesto en evidencia
que las células del endotelio vascular son parti­
cipantes activos de la modulación de la repues­
ta inflamatoria, secundaria a la habilidad que
poseen de expresar en su superficie y secretar
potentes mediadores que regulan no sólo el to­
no vascular y su permeabilidad, sino tam bién la
coagulación, la vía fibrinolítica y la función de
células inflamatorias.
El sello morfológico de la “inflamación agu­
da” es la formación de edema, deposición de
fibrina y presencia de neutrófilos en el sitio de
injuria. Dependiendo del tipo de injuria, el nú­
mero de neutrófilos en el sitio de injuria puede
disminuir en la respuesta inflamatoria crónica.
La “inflamación crónica” se caracteriza por el
aumento del número de macrófagos, linfocitos,
células plasmáticas y eosinófilos. En este punto
puede haber distintas posibilidades. Primero,
puede haber eliminación del elemento patogé­
nico y el tejido injuriado comienza a repararse
y a retornar a su estructura y función normal.
Segundo, puede haber persistencia del agente
patogénico, con o sin activación del m ecanis­
mo inmunológico, llevando al desarrollo de la
inflamación granulomatosa. Tercero, puede ha­
ber injuria irreversible del tejido, seguido de
una activa proliferación de capilares, fibroblas­
tos y de elementos mesenquimatosos que lleva­
ría a la pérdida de la función del tejido. L a evo­
lución de la repuesta inflamatoria depende de
la naturaleza de la agresión, de la extensión de
la injuria y del grado de activación inm unológi­
ca que se presenta.
La fase inflamatoria aguda tiene una exten­
sión limitada de 5-12 horas, la que luego puede
ser seguida por la fase crónica.
5.2. Inflamación crónica
Siguiendo a la repuesta inm ediata aguda,
existe un influjo subsecuente de monocitos, eo­
sinófilos y linfocitos. En la medida de que la
agresión inicial es controlada o contenida no se
produce más reclutamiento de neutrófilos, los
neutrófilos presentes degeneran y se acumulan
las células mononucleares. En el m om ento en
que en el sitio de inflamación predominan los
m onocitos, linfocitos, m acrófagos y células
plasmáticas comienza la inflamación crónica,
472 Mecanismos efectores de la respuesta inmune
La función que cumplen ios monocitos y ma­
crófagos es doble: por un lado, la de fagocitar,
ingerir o degradar microbios, desechos celula­
res y neutrófilos degenerados y, por el otro la­
do, la de modular la respuesta inmune y la fun­
ción de las células T a través de la presenta­
ción del antígeno y la secreción de citoquinas
específicas. Posteriorm ente, los m onocitos y
los macrófagos tienen la función de modular la
etapa de cicatrización y reparación secundaria
a la secreción de citoquinas que afectan a las
células parenquimales y a la función de las cé­
lulas inflamatorias. Mientras el proceso infla­
matorio transita la fase crónica, los monocitos
y los macrófagos contintían fagocitando dese­
chos celulares y material que no ha sido ade­
cuadamente removido por los neutrófilos. De­
pendiendo de la extensión de la injuria, el teji­
do dañado puede retornar a la estructura y fun­
ción normal o transitar hacia la reparación ac­
tiva con fibrosis llegando a una estructura y
función alterada.
Alternativamente, si existe persistencia de la
injuria, los macrófagos pueden cambiar la res­
puesta hacia un tipo de reacción de hipersensi­
bilidad demorada que incluye al perfil comple­
to de respuesta linfocitaria. Así, la inflamación
crónica puede ser vista como un punto de infle­
xión en la respuesta inflamatoria y a los mono­
citos y macrófagos como pivotes que dirigen el
curso de la respuesta.
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INMUNOPATOLOGÍA

III
inmunología de las infecciones
bacterianas
MIRTA A. FRANCO
IN FE C C IÓ N Y EN FER M ED A D
Cuando un microorganismo es capaz de es­
tablecerse en un huésped, se habla de in fec­
ción. Si, además, le produce daño a ese hués­
ped el proceso se denomina enfermedad infec­
ciosa. La capacidad potencial de un microorga­
nismo de causar enfermedad se denomina pa­
togenicidad y es un atributo de especie. De es­
ta m anera, puede decirse de ciertas especies
bacterianas que son patógenas para un huésped
determinado. Sin embargo, cepas individuales
pertenecientes a una especie considerada pató­
gena pueden variar ampliamente en su capaci­
dad para dañar al huésped, y esta patogenicidad
relativa se conoce como virulencia. La vira-
lencia es así un atributo de cepa, no de especie,
por lo que pueden encontrarse cepas altamente
virulentas, poco virulentas y aun avirulentas
dentro de una misma especie patógena. G ene­
ralmente, la virulencia se relaciona con el nú­
mero de bacterias necesarias para producir en­
fermedad.
Es obvio que una infección per se no condu­
ce invariablemente a una enfermedad infeccio­
sa, sino que esta última es la resultante de una
serie de interacciones complejas entre el hués­
ped susceptible y el agente infeccioso (rela­
ción huésped-parásito).
El huésped constituye un sistema cerrado,
separado del ambiente externo por la piel y las
membranas mucosas. Por ello, todas las infec­
ciones bacterianas comienzan en la superficie
corporal, con excepción de aquellas transm iti­
das intrauterinamente.
La piel intacta raram ente es penetrada por
las bacterias, por lo que regiones ubicadas po­
cos micrones por debajo de ella son norm al­
mente asépticas. Cuando se rompe la integridad
24
de la superficie epitelial, a menudo se desarro­
llan infecciones subcutáneas provocadas por
bacterias del género Staphyloccoccus, que ha­
bitan en folículos pilosos y glándulas sudorípa­
ras. También se ha señalado que discontinuida­
des de la piel constituyen la ruta inicial de in­
fección en algunas enfermedades infecciosas.
Otras vías de entrada para bacterias patóge­
nas son; a través de mordeduras de animales o
por introducción de materiales contam inados
en heridas. Con algunas excepciones, la inocu­
lación intradérmica directa con bacterias viru­
lentas requiere un elevado número de organis­
mos viables para producir enfermedad.
A diferencia de la piel, las membranas mu­
cosas del ojo y de los tractos respiratorio, gas­
trointestinal y genitourinario pueden ser atrave­
sadas por la m ayoría de las bacterias patóge­
nas. Esto es particularmente cierto cuando es­
tán expuestas a un elevado número de bacte­
rias, como ocurre en la penetración de salmo-
nelas a través de la mucosa gastrointestinal, en­
tre muchos otros ejemplos. La superficie espe­
cíficam ente involucrada depende de la forma
en que las b acte rias p ató g en as a lca n z an al
huésped (inhalación de aerosoles, ingestión de
sustancias contam inadas o transm isión vené­
rea).
Las infecciones se inician con la coloniza­
ción de las membranas mucosas, y pueden per­
manecer localizadas en la superficie de las mu­
cosas o pueden avanzar a los tejidos subepite-
liales. En las primeras, las toxinas producidas
por las bacterias pueden actuar localm ente o
bien difundir a través del huésped para ejercer
su acción sobre las células específicam ente
susceptibles. Especies patógenas tales como
Bordetella pertussis y Vibrio cholerae, produ­
cen toxinas de acción localizada, mientras que
476 Inmunopatología
la exotoxina de Corynehacterium diphtheriae
es diseminada por la circulación sanguínea y
produce daños a varios tejidos. En las infeccio­
nes de los tejidos subepiteliales, las bacterias
invasoras que han atravesado las mem branas
mucosas deben ser capaces de multiplicarse en
el medio ambiente que le proveen los fluidos y
tejidos del huésped. Es decir, que su sobrevi­
vencia depende del balance entre los factores
que promueven su desarrollo y los que lo inhi­
ben, que incluyen los mecanismos de defensa
del huésped. Las variaciones de estos factores
entre diferentes especies animales y entre di­
versos tejidos de una misma especie, determi­
nan las especificidades del huésped y tejido de
cada bacteria patógena.
Una infección bacteriana produce alguno de
los siguientes efectos: 1) daño debido al m i­
croorganism o, 2) daño debido a la respuesta
del huésped frente al microorganismo (reaccio­
nes inmunopatológicas), o 3) ningún daño apa­
rente.
Los determinantes de virulencia de las bacte­
rias y los mecanismos con que el huésped res­
ponde a una infección bacteriana, incluidas las
reacciones inm unopatológicas, se describen
más adelante.
Entre las infecciones que no producen enfer­
medad se incluyen las infecciones subclínicas.
Ojos (conjuntivas)
Staphyíococcus epídermídís
Ncr iz y nasofaringe
Staphyíococcus epídermídís
Staphyíococcus aureus
Streptococcus spp.
Boca y orofaringe
S. epídermídís,
Streptococcus pneumoníae,
Strepcoccus mítís,
Streptococcus saíívarís,
estreptococos no grupo A,
Neisseria, Haemophiíus,
Veiííoneíía, Bacteroídes,
Fusobacenum, Treponema.
Lactobacíííus
Tracto genitourinario
Corynebacteríum, S. epídermídís,
Enterococcus, Lactobacíííus,
Mycobacteríum smegmatíc,
Bacteroídes, Fusobacteríum,
estreptococo alfa y no hemolítico,
Enterobacteriaceae
F ig. 24-1. F lora bacteriana predom inante en distintas regiones del cuerpo hum ano norm al.
También, de algún modo, la colonización de u n .
huésped por la flora microbiana residente cons­
tituye una infección. Estas bacterias se estable­
cen sobre la piel y las membranas mucosas po­
co después del nacimiento y se mantienen, con
algunas variaciones, durante toda la vida del
huésped (fig. 24-1). Constituyen una barrera
que se opone a la colonización por bacterias
patógenas, ya sea compitiendo por nutrientes o
por sitios receptores en las células epiteliales, o
produciendo sustancias inhibitorias. Por ello, la
eliminación de la flora habitual específica fa­
vorece la infección por bacterias patógenas. Es
conocido que la terapia antibacteriana produce
una alteración de la flora habitual específica,
que lleva a una selección de cepas resistentes
de la misma especie o a su reemplazo por espe­
cies patógenas. Excepcionalmente, cuando las
defensas del huésped están dism inuidas, las
bacterias de la flora habitual pueden invadir al
huésped y causar enfermedad.
EL AGENTE INFECCIOSO
En general, la virulencia de una cepa bacte­
riana de una especie patógena está determinada
por; 1) su capacidad para proliferar en los teji­
dos del hué.sped, o invasividad, y 2) su capaci-
Piel
Staphylococus epidermidis,
Corynebacteríum,
Propíoníbacteríum, Mícrococcus
Intestino delgado
Lactobacíííus, Streptococcus spp,
Enterococcus, Veíííoneíía
Intestino grueso
Bacteroídes, Cíostrídíum, Fusobacteríum,
Eubacterium, Bifidobacteríum,
Lactobacíííus, Peptostreptococcus,
Enterococcus, Enterobacteriaceae
 Inmunología de las infecciones bacterianas
dad para producir sustancias químicas tóxicas
para las células del huésped, o toxigenicidad.
El papel de la invasividad en la producción
de daño al huésped es variable. Las bacterias
fuertemente toxigénicas que causan infecciones
localizadas pueden producir daño a distancia, a
través de la difusión de productos tóxicos (por
ejemplo, Corynebacterium diphtheriae). Otras,
en cambio, deben invadir al huésped y m ulti­
plicarse en él para que las toxinas producidas
puedan actuar sobre los tejidos susceptibles
(por ejemplo, Bacillus anthracis).
Determinantes de virulencia
Varias propiedades de las células bacterianas
les confieren la capacidad potencial de sobrevi­
vir y multiplicarse en los tejidos del huésped.
En general, se asocian con la posibilidad de in­
terferir con los m ecanism os defensivos del
huésped y de disponer de nutrientes para su de­
sarrollo. Dichas propiedades constituyen facto­
res o determinantes de virulencia y se relacio­
nan, principalm ente, con componentes de las
envolturas bacterianas (fig. 24-2) y con la pro­
ducción de m etabolitos tóxicos. A lgunas de
ellas se tratan a continuación.
Adherencia
Como fuera señalado, la mayoría de las in­
fecciones bacterianas se inician con la coloni­
zación de las membranas mucosas. Las bacte­
rias que son capaces de colonizar las m em bra­
nas mucosas parecen tener la propiedad común
Polisacárido
específico
Ácido teicoico
Ácido
lipoteicoico
Peptidoglicano
/
rmw
in
mu'
F ig. 24-2. E squem a de las estructuras principales de las envolturas de A: bacterias gram positivas. B: bacterias gram n eg a­
tivas. (D e Zinsser, M icrobiology, m odificado.)
477
de adherirse a los epitelios superficiales, sugi­
riendo que esa adherencia constituye un deter­
minante de virulencia.
Existen evidencias sobre la existencia de si­
tios receptores, tanto en las células del huésped
como en la superficie de las bacterias, com pro­
metidos en la fijación del microorganismo a las
células que subyacen en el sitio de contacto.
En este proceso de fijación han sido im plica­
das estructuras filam entosas (fimhriae o píli),
las cjue han sido demostradas en diferentes es­
pecies bacterianas (enterobacterias, N eisseria
gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Bordete-
lla pertussis y varias otras). En Escheríchia co­
li se han descrito varios p ili antigénicam ente
diferentes. La capacidad de adherencia de estas
cepas es un importante factor de selección que
determ ina que estos componentes de la flora
intestinal sean capaces de colonizar el tracto
urinario. Neisseria gonorrhoeae se adhiere a la
superficie de la mucosa del tracto genitourina­
rio a través de sus pili, y posiblem ente de la
proteína II de la membrana externa. Bordetella
p ertussis m uestra un marcado trofismo hacia
las células ciliadas del tracto respiratorio, y la
primera etapa de la infección es necesariamente
su unión a esas células. Se ha sugerido que las
fim brias serotipo 2 (aglutinógeno 2) tendrían
propiedades adhesivas.
Otros componentes de la superficie bacteria­
na involucrados en la adherencia son: antíge­
nos de superficie, mucopolisacáridos asociados
a la superficie y ácidos lipoteicoicos. U na de
las pi'oteínas superficiales asociadas a la adhe­
rencia más estudiadas es la hemaglutinina fila-
Antígeno D
Core ►LPS
KDO
Lípido A
Porina
Peptidoglicano
Periplasma
Lipoproteína
Proteína OMPA
l\/lembrana
citoplasmática
Fosfolípidos
Proteína
478 Inmunopatología
mentosa (FHA) de Bordetella pertussis. Los re­
sultados de estudios in vitro de adhesión a una
variedad de células eucarióticas ciliadas y no
ciliadas, sugieren que la FHA es la adhesina
más im portante que m edia la interacción B.
pertussis-célula huésped. Además de su fun­
ción como adhesina, la FFIA estimula una res­
puesta inmune en humanos que sufrieron enfer­
medad (tos convulsa) y actúa como antígeno
inmunoprotector en ratones. Esas propiedades
han llevado a utilizarla como uno de los com ­
ponentes de vacunas acelulares para prevenir la
tos convulsa.
Resistencia a la fagocitosis
Además de perm itir la unión a las células
del huésped, la superficie bacteriana desem pe­
ña un papel importante en la resistencia a la fa­
gocitosis.
La resistencia a la unión e ingestión por fa­
gocitos está usualmente asociada a la presencia
de eapas mucosas o cápsulas de naturaleza po-
lis a c a ríd ic a { S tr e p to c o c c u s p n e u m o n ia e ,
F ig . 24-3. R epresentación esquem ática de la m olécula de
p ro te ín a M de la p a re d c e lu la r de e s tre p to c o c o s . (D e
Z insser, M icrobiology, m odificado.)
N eisseria m eningitidis, etc.) o polipeptídiCa
{Bacillus anthracis). Experiencias realizadas en
ratón con Streptococcus pneumoniae demostra­
ron que las cepas S (lisas, eneapsuladas) son
virulentas, mientras que las cepas R (rugosas,
no eneapsuladas) son rápidamente fagocitadas
y, por lo tanto, avirulentas. La remoción de la
cápsula transforma una cepa S en una cepa R.
También el tratamiento de una cepa encapsula­
da con anticuerpos específicos para esos antí­
genos de superficie elimina la resistencia a ia
fagocitosis. Tales anticuerpos se denom inan
opsoninas y, en presencia de com plemento y
granulocitos, constituyen el mecanismo de de­
fensa más importante contra las bacterias que
se comportan como parásitos extracelulares. La
encapsulación es un aspecto importante no sólo
de la virulencia sino también de la inmunogeni-
cidad. En efecto, se com ercializan vacunas
compuestas por polisacáridos capsulares para
la prevención de enfermedades producidas por
bacterias eneapsuladas, tales como meningoco-
cos y neumococos.
También proteínas de superficie actúan co­
mo moléculas antifagocíticas. El ejemplo me­
jor estudiado es la proteína M de Streptococcus
pyogenes grupo A, que es el principal factor de
virulencia de este grupo. Hay un gran número
de variantes serológicas de esta proteína, pero
el aspecto invariable es su organización global
que se muestra en la figura 24-3. Los estrepto­
cocos que carecen de la proteína M son fácil­
mente fagocitados y muertos, mientras que los
que la producen no son ingeridos a menos que
estén presentes anticuerpos opsonizantes (con­
tra la porción N-terminal de la molécula). Aun­
que los anticuerpos anti-proteína M son capa­
ces de neutralizar su capacidad antifagocítica,
esa actividad opsónica es específica de tipo.
En bacilos gramnegativos, los antígenos so­
máticos O, pueden inhibir la fagocitosis.
También puede ser inhibida la destrucción
intracelular de bacterias fagocitadas. Además,
muchas bacterias patógenas excretan sustancias
llamadas leucocidinas, que matan a los fagoci­
tos.
Actividad IgA proteásica
Frente a muchas infecciones que se inician
sobre las superficies mucosas, el huésped ofre­
ce una respuesta inmune mucosal mediada por
IgA secretorias (IgA)2S. Luego, la hidrólisis de
la (JgA)2S por determinadas bacterias podría
contribuir a la virulencia potencial de las bacte­
rias que la producen. En varias especies bacte­
rianas ha sido detectada actividad IgA l proteá­
sica (que hidroliza las cadenas pesadas de las
IgA l humanas). Dichas especies no están rela­
cionadas entre sí por criterios taxonómicos pe-
 Inmunología de las infecciones bacterianas 479

C u a d ro 24-1. Especies bacterianas que p o ­ Toxinas

seen actividad IgA^ proteasa y sus asociacio­
nes principales con enfermedades infecciosas* La producción de toxinas como determinan­
tes de virulencia fue sugerida por prim era vez
E nferm edad E specie bacteriana por Loeffier, en 1884, al comprobar la capaci­
dad tóxica de filtrados estériles de cultivos de
M eningitis Neisseria m eningitidis Corynehacterium diphtheriae. Aunque actual­
H aem ophiíus influenzae mente se conocen muchas sustancias tóxicas de
Streptococcus pneum oníae
G onorrea N eisseria gonorrhoeae origen bacteriano, el papel de varias de ellas en
Enferm edades perio- B acteroídes assacharolytícus** la producción de enfermedades permanece sin
dontales destructivas B . m elaninogenicus aclarar. Las toxinas bacterianas son de dos ti­
Capnocytophaga ochracea pos: 1) las que pueden separarse fácilmente de
C. sputígena
C. gingivalis las células productoras, de naturaleza proteica,
F orm ación de placas Streptococcus mítior* * sensibles al calor o exotoxinas, y 2) las que for­
dentales (?) lS", sanguis** man parte de la estructura celular, de naturaleza
* D e K ilian , M ., en R o b b in s, J. B ., H ill, J, C. y SadolT, J. C. (eds.):
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Seminar.^ in infection.^ disease.';. V ol. 4, Bacterial Vaccines. Thie- toxinas.
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Sólo algunas cepas de la especie producen IgA proteasa.

EXOTOXINAS (toxinas extracelulares)

ro sí por las enfermedades infecciosas en las Las exotoxinas bacterianas son proteínas que
que están implicadas. Como se muestra en el tienen la propiedad de transloearse en células
cuadro 24-1, los tres principales agentes de las de mamíferos. Muchas de ellas, que responden
m eningitis bacterianas, los gonococos y los al modelo de dos componentes A-B, tienen ac­
agentes que se supone causan enferm edades ción directa sobre las células susceptibles. En
periodontales destructivas, elaboran IgA pro­ ellas, el com ponente B es responsable de la
teasa. También la producen algunas cepas de unión específica a la superficie de la célula re­
Streptococcus sanguis y Streptococcus mitior. ceptora y el componente A posee la actividad
Ninguna otra bacteria, incluidas las especies no enzimática que actiia sobre los componentes o
patógenas de Haemophyius y Neisseria, parece funciones celulares específicos. Algunas de es­
poseer esta actividad. tas toxinas y sus sitios de acción se describen
en el cuadro 24-2.
Competencia por nutrientes O tras exotoxinas bacterianas, denominadas
su p e ra n tíg e n o s, actiían induciendo u n a res­
M uchas bacterias patógenas deben penetrar puesta exagerada en el huésped, ya que tienen
los tejidos del huésped y multiplicarse en ellos la propiedad de activar un alto porcentaje de
para expresar su patogenicidad. Se trata de ce­
pas invasoras y la capacidad de proliferar m vi­
vo constituye, por lo tanto, un determinante de C u a d ro 24-2. Principales exotoxinas bacte­
virulencia. Es probable que el desarrollo de las rianas de dos componentes (A-B) y sus meca­
bacterias dependa de sus requerimientos nutri­ nismos de acción
cionales y de la posibilidad de que sean aporta­
dos por el huésped. Por ejemplo, entre los re­ Toxina M ecanism o d e acción
querimientos de iones metálicos, el de hierro es
de particular importancia en la relación hués­ B ordetella pertussis
ped-parásito. En el huésped animal, el hierro T o x in a pertussis A D P ribosilación d e proteí­
n a fijadora G
forma complejos con proteínas, como la trans­ C lostridium botulinum
ferrina, y no está disponible para las bacterias T o x in a botulínica B loquea uniones n eu ro -
invasoras. Por esto, para satisfacer sus requeri­ musculares
mientos de hierro, las bacterias deben competir C lostridium tetcmi
T oxina tetánica Inhibe la liberación de GA~
con el huésped. Las micobacterias producen B A y glicina en la s si-
una sustancia llamada micobactina que libera napsis inhibidoras
el hierro de la transferrina, haciéndolo disponi­ C orynebacteríum diphtheriae
ble para las bacterias. Las micobactinas consti­ T o x in a diftérica A D P ribosilación del factor
de elongación 2
tuyen así uno de los determinantes de la viru­ P seudom onas aeruginosa
lencia del bacilo de la tuberculosis. De manera E xotoxina A A D P ribosilación d el factor
semejante, células de Escherichia coli secretan de elongación 2
caíecoles que compiten con la transferrina por Vibrio cholerae
T o x in a colérica A ctivación de h orm onas
el hierro.
480 Inmunopatología
células T. Estas toxinas se unen sim ultánea­
mente a moléculas clase II del complejo mayor
de histocom patibilidad (MHC) de las células
antigénicas y a la región VP del receptor en las
células T, produciendo la activación de las m is­
mas. La alta proporción de células T activadas
se explica porque diferentes toxinas reconocen
diferentes regiones Vp. Existen evidencias de
que al menos parte de la respuesta a estas toxi­
nas, si no toda, se debe a la hiperproducción de
citoquinas que resultan de la activación de cé­
lulas T.
Estreptococos grupo A y estafilococos ex ­
cretan varias toxinas superantígenos. E ntre
ellas se encuentran las enterótexinas A, B, C L
C2, D y E producidas por Staphylococcus au­
reus, responsables de intoxicaciones alimenta­
rias y “shock” sistém ico. Los estafilococos
también excretan las toxinas exfoliativas A y
B que originan el síndrome de la piel escalda­
da y la toxina 1 del síndrome del “shock” tóxi­
co (TSST-1), asociado a tam pones. Más del
90% de la cepas aisladas de estreptococos gru­
po A producen exotoxinas pirogénicas (eritro-
génicas). Se conocen al m enos tres serotipos
diferentes. A, B y C, que causan la fiebre es­
carlatina.
Como factor de virulencia, una toxina debe
cum plir ciertos requisitos; 1) producir uno o
más síntomas de la enfermedad, 2) debe existir
correlación entre la virulencia de diferentes ce­
pas de una especie bacteriana y la producción
de toxinas, 3) el sitio de acción y la concentra­
ción efectiva deben ser alcanzables durante una
infección natural, y 4) el suero antitóxico debe
proteger al huésped de la infección.
Algunas toxinas como las exotoxinas clási­
cas (botulínica, tetánica, diftérica), cum plen
con todos los requisitos de un factor de virulen­
cia. También han sido establecidas las propie­
dades patogénicas de la enterotoxina estafilo-
cócica, la toxina eritrogénica de Streptococcus
pyogenes, la toxina pertussis, la toxina letal de
Bacillus anthracis, la toxina alfa de Staphylo­
coccus aureus, la neurotoxina de Shigella dy-
senteriae, las exotoxinas de Vibrio cholerae y
Yersinia pestís, la exotoxina A de Pseudomo-
nas aeruginosa, etc.
Otras toxinas extracelulares no han sido cla­
ramente relacionadas con la producción de en­
fermedades. Forman parte de este grupo num e­
rosas toxinas eitolíticas producidas por bacte­
rias grampositivas pertenecientes a los géneros
Streptococcus, Staphylococcus y Clostridium.
Estas toxinas incluyen hem olisinas, enzim as
hidrolíticas, etc.
La producción de algunas exotoxinas está
codificada en genes localizados en plásmidos
(toxinas de Escheríchia coli) o en profagos (to­
xina diftérica, enterotoxina y toxina alfa de
Staphylococcus aureus, etc.). En estos casos, la
pérdida del plásmido o del profago transforma
a las bacterias en no toxigénicas. Además, la
síntesis de algunas exotoxinas bacterianas está
fuertem ente influida por la concentración de
ciertos iones metálicos.
Entre las exotoxinas se encuentran los vene­
nos más potentes que se conocen. Su potencia
es análoga, en general, a su eficiencia como an­
tígeno. El tratam iento de algunas exotoxinas
con formaldehído ha permitido eliminar su to­
xicidad fisiológica, dejando mucha de la anti­
genicidad original. Estas toxinas alteradas se
denominan toxoides, y en algunos casos, como
el tetánico y el diftérico, se utilizan para indu­
cir inmunizaciones activas.
ENDOTOXINAS
Son com plejos lipopolisacáridos-proteínas
extraíbles de las membranas externas de las en­
volturas de bacterias gramnegativas. Han sido
aisladas de todas las bacterias gramnegativas
patógenas y de muchas no patógenas. Las en­
dotoxinas mejor estudiadas son las de las ente­
robacterias pertenecientes a los géneros Salmo-
nella, Shigella y Escheríchia. Se identifican
con el antígeno somático (O) de las células en­
teras.
Las endotoxinas son poco específicas, ya
que aquellas de distinto origen tienen activida­
des semejantes. Las endotoxinas purificadas de
enterobacterias virulentas y no virulentas cau­
san muchos de los síntomas de la enfermedad
cuando se inyectan en animales. Poseen propie­
dades pirogénicas (producen fiebre), además de
ser tóxicas. Su toxicidad es relativamente baja
y se neutraliza parcialmente por acción de anti­
cuerpos específicos.
Las moléculas de lipopohsacáridos (LPS) de
las bacterias gram negativas actúan indirecta­
mente, promoviendo una autointoxicación del
huésped. En el suero, los LPS liberados por las
bacterias se unen, a través del lípido A (estruc­
turalm ente conservado en todas las bacterias
gramnegativas), a una proteína reactiva de fase
aguda. Este complejo se une a las moléculas
CD14 de m acrófagos, activándolos y pro d u ­
ciendo factor de necrosis tumoral alfa (T N Fa e
interleuquina 1 (IL-1). La excreción de estas
citoquinas desencadena la producción de cito-
quinas por otras células del sistema inmune y
causa la sintomatología de la intoxicación por
LPS (leucocitosis, shock, coagulación intra-
vascular disem inada y m uerte). T am bién es
posible que los LPS puedan activar caminos
independientes del CD14 induciendo la p ro ­
ducción de TNF por células no macrofágicas.
La importancia del TNF en la toxicidad indu­
 Inmunología de las infecciones bacterianas
cida por LPS ha sido probada, ya que anticuer­
pos anti-TNF revierten el síndrome. Además,
tanto TNF como IL-1 actúan sobre el endotelio
vascular promoviendo la actividad anticoagu­
lante y disminuyendo la presencia de trombo-
modulina. Estos efectos contribuyen a los dis­
turbios en la coagulación sanguínea que ocu­
rren en respuesta a LPS o a sepsis por bacte­
rias gramnegativas.
Otro constituyente de las envolturas bacte­
rianas, como el peptidoglicano de la pared ce­
lular, también produce inducción de citoquinas.
El conocimiento de que una respuesta exage­
rada del huésped puede tener efectos nocivos
en las enfermedades bacterianas, ha producido
avances importantes en el tratamiento de algu­
nas enfermedades infecciosas, como ocurre en
las meningitis bacterianas.
DEFENSAS DEL HUESPED FRENTE
A LAS INFECCIONES BACTERIANAS
Durante su evolución, los organismos verte­
brados han desarrollado numerosos m ecanis­
mos para mantener bajo control a las bacterias
patógenas. Algunos de estos mecanismos son
constitutivos, es decir, propiedades del hués­
ped normal; otros aparecen sólo luego de la ex­
posición a un agente infeccioso, por lo que se
denominan inducibles o adaptativos. Entre los
últimos se incluyen aquellos que derivan de la
exposición previa a bacterias com ensales y
otros patógenos o sustancias que presentan an­
tígenos comunes con el agente en cuestión.
Las reacciones específicas inducidas se co­
nocen genéricamente como respuesta inmune.
Como ha sido dicho, hay dos clases de r e s ­
puesta inmune: 1) la producción de anticuer­
pos circulantes y secretados, y 2) la producción
de célu las e sp e c íficam e n te sen sib iliza d as.
Usualmente, la respuesta inmune reduce la in-
vasividad y toxigenicidad bacterianas al punto
de poder ser controladas por las defensas cons­
titutivas del huésped. Sin embargo, como se se­
ñalara oportunam ente, en algunos casos las
bacterias patógenas poseen factores de virulen­
Cuadro 24-3. Barreras físicas contra la infección bacteriana
Sistem a u órgano Tipo de células
Piel Escam osas
M ucosas Colum nares no ciliadas (tracto gastrointestinal)
C olum nares ciliadas (tráquea)
C uboideas ciliadas (nasofaringe)
Secretoras
(D e J.K . S pitm agel.)
481
cia que interfieren en la respuesta inmune o le
confieren resistencia a ella. Por otra parte, en
algunas enfermedades infecciosas la respuesta
inm une produce daños severos en los tejidos
del huésped por reacciones de hipersensibili­
dad.
M ecanismos de defensa en la superficie
del huésped
Entre los mecanismos constitutivos, aquellos
que posibilitan la eliminación de las bacterias
en el sitio de contacto inicial con el huésped
desem peñan un papel muy im portante en la
prevención de infecciones. Factores físico s,
químicos y biológicos contribuyen a esta fun­
ción, y limitan la colonización de las superfi­
cies del cuerpo por las bacterias patógenas.
Factores físicos
L a p iel y las m em branas m ucosas d e los
tractos respiratorio, gastrointestinal y genitouri­
nario están ampliam ente expuestas a m uchas
bacterias patógenas y constituyen la prim era lí­
nea de defensa contra la invasión bacteriana
(cuadro 24-3). La piel ofrece una barrera física
eficaz contra la penetración de bacterias, capaz
de eliminar patógenos a través de la descam a­
ción del epitelio estratificado.
Otros factores físicos que ayudan a proteger
las superficies epiteliales de las mucosas son:
1) la acción de lavado que ejercen lágrim as y
saliva, 2) la capacidad adhesiva del m oco que
recubre las vías aéreas superiores y el intestino,
3) el movimiento ciliar de las células del tracto
respiratorio y la expulsión de bacterias p o r me­
dio de la tos y el estornudo, y 4) el flujo de ori­
na por la uretra.
Alteraciones de estos factores aum entan la
susceptibilidad a las enfermedades infecciosas.
Es conocido el alto riesgo de sobreinfecciones
en quemados, la alta incidencia de infecciones
urinarias debidas a obstrucciones que provocan
retención urinaria o de neumonías por daños en
las células del epitelio respiratorio.
M ecanism o de depuración
D escam ación
F eristaltism o
M ovim iento m ucociliar
Lágrim as, saliva, m oco, su doración
F lujo de líquidos
482 Inmunopatología
Factores químicos
La piel y las m em branas m ucosas no se
comportan como superficies inertes que actúan
simplemente como barreras físicas. Las secre­
ciones y excreciones son de gran importancia
en cuanto proveen factores químicos que con­
tribuyen a la resistencia del huésped.
Los factores quím icos incluyen la produc­
ción de sustancias antibacterianas y de otras
que inhiben la adherencia bacteriana.
En la piel se comprueba actividad bacterici­
da sobre microorganismos que no se encuen­
tran habitualmente sobre ella. Ha sido atribui­
da a los ácidos grasos no saturados, principal­
mente ácido oleico, presentes en las secrecio­
nes sebáceas, Esta actividad es inhibida por la
albúmina del suero, lo que puede tener im por­
tancia en el caso de la piel que rodea una que­
madura.
T am bién ejercen acción antibacteriana la
acidez gástrica, como se demuestra por las fre­
cuentes colonizaciones de mucosa gástrica que
acompañan casos de hipocloridia; la lisozima
presente en la saliva, lágrim as y secreciones
nasales; la lactoperoxidasa de la saliva, etc.
Por otra parte, la adherencia bacteriana a
ciertos epitelios puede ser inhibida por gluco-
péptidos.
En el cuadro 24-4 se resumen las sustancias
que actúan como barreras químicas frente a la
infección bacteriana.
Factores biológicos
Los factores biológicos están dados funda­
mentalm ente por el antagonism o que ejercen
las bacterias componentes de la flora residente
(fig. 24-1). Las acciones antagónicas de la flora
normal fueron mencionadas al hablar de infec­
ción y enfermedad.
C uadro 24-4. Barreras químicas contra la infección bacteriana
Sistem a u órgano O rigen
Piel G lándulas sudoríparas y sebáceas
M ucosas C élulas parietales del estóm ago
S ecreciones
N eutrófilos
A parato digestivo alto G lándulas salivales
N eutrófilos
Intestino delgado y más adelante A rbol biliar
B iota intestinal
Algunos ejemplos ayudarán a comprender kv
importancia de estos factores. Si la flora bacte­
riana normal de las vías respiratorias superiores
es muy reducida como consecuencia de un tra­
tamiento a base de penicilinas, los hongos co­
mo Candida albicans, pueden fijarse y coloni­
zar las mucosas de la boca y la faringe, produ­
ciendo infecciones severas. De igual forma, la
reducción de la flora intestinal producida por
las tetraciclinas puede llevar a una invasión es-
tafilocócica, acompañada de una afección exu­
dativa grave, que puede ser mortal.
Mecanismos inmunológicos
A los efectos físicos, químicos y biológicos,
no inmunológicos, que protegen al huésped en
el sitio de contacto inicial con una bacteria pa­
tógena, se suma la inhibición inmunológica de
la fijación de la bacteria a la superficie epite­
lial. Las secreciones mucosas contienen niveles
significativos de inmunoglobulinas de diferen­
tes clases. En la orofaringe, el tracto respirato­
rio superior y el intestino, p redom ina IgA ,
mientras que en el tracto respiratorio inferior y
en el tracto genital femenino predomina IgG.
Las secreciones mucosas tam bién contienen
pequeñas cantidades de IgM, que puede alcan­
zar altos niveles en pacientes con deficiencias
selectivas de IgA. La producción local y la se­
creción de anticuerpos IgA constituyen tal vez
el medio más importante de defensa inmunoló­
gica a nivel de las superficies m ucosas. Se
acepta que los anticuerpos (IgA)2S mantienen
la integridad de las membranas mucosas inhi­
biendo su colonización por los m icroorganis­
mos, neutralizando toxinas y previniendo la pe­
netración de bacterias a través de sus superfi­
cies. La unión de (IgAj^S a una bacteria puede
activar el complemento por la vía alternativa,
producir opsonización y, en algunos casos, in­
Sustancias
A cidos orgánicos
Á cido clorhídrico, pH bajo
C om puestos antim icrobianos
Lisozim a, lactoferrina, peroxidasa
T iocianato
M ieloperoxldasa
P roteínas catiónicas
Lactoferrina
Lisozim a
Á cidos biliares
Á cidos grasos de bajo peso m olecular
 Inmunología de las infecciones bacterianas
ducir lisis. Sin embargo, este mecanismo sería
poco relevante por la baja concentración de
componentes del complemento en las secrecio­
nes. Además, se ha sugerido que la (IgA)2S
puede inducir una actividad antibacteriana m e­
diada por células.
Existen numerosas evidencias de los efectos
antibacterianos de la (IgA)jS presente en secre­
ciones. Ha sido demostrado que la inyección
subcutánea de un hibridoma productor de IgA
contra el LPS de Vibrio cholerae en ratones re­
cién nacidos, produce la excreción de anticuer­
pos en el intestino y protege al ratón contra un
desafío letal con bacilo colérico.
Es conocido que en las secreciones que ba­
ñan las mem branas mucosas, la (IgA) 2S está
expuesta a una serie de enzimas proteolíticas
del huésped y de origen microbiano. Sin em ­
bargo, la molécula de IgA está protegida contra
algunas enzimas proteoJíticas por la pieza se­
cretoria (S) que se sintetiza en células epitelia­
les. A dem ás las subclases de IgA secretoria
((IgA,)2S e (IgA 2)2S) poseen diferentes suscep­
tibilidades a productos proteolíticos de varias
bacterias, aumentando así su poder protector,
ya que todas las IgA proteasas bacterianas de­
tectadas hasta ahora son específicas para la
subclase IgA de la (IgA)2S humana. La activi­
dad IgA proteásica es considerada por algunos
autores un factor de virulencia y, como tal, ha
sido tratada en párrafos anteriores.
Todos estos mecanismos de defensa deben
ser superados por una bacteria patógena para
establecerse sobre el epitelio mucoso. Como
hemos dicho, la alteración de cualquiera de
ellos resulta en un aumento de la susceptibili­
dad a las infecciones bacterianas.
Mecanismos de defensa a nivel tisular
Las defensas constitutivas principales que
encuentran las bacterias invasoras que penetran
más allá de las capas epiteliales son las células
fagocíticas (que engloban y digieren a las célu­
las bacterianas); ciertas sustancias an tib a cte ­
rianas presentes en los tejidos y fluidos circu­
lantes, y una serie de reacciones que dan lugar
a la inflamación.
Fagocitosis
La fagocitosis es el principal mecanismo por
el que se destruyen las bacterias patógenas ex­
tracelulares. Como ha sido descrito en el capí­
tulo 3, las células fagocíticas se encuentran tan­
to en el sistema circulatorio como en los teji­
dos. Entre las células blancas sanguíneas, son
activam ente fagocíticos los m onocitos y los
leucocitos polimorfonucleares. Si bien estos úl­
timos son todos capaces de llevar a cabo la fa­
483
gocitosis, solamente los neutrófilos tienen un
papel significativo en las defensas del huésped.
Los macrófagos también existen como células
fijas en ciertos órganos (hígado, bazo, médula
ósea y nódulos linfáticos), y forman el sistema
retíeuloendotehal.
La fagocitosis comprende varias etapas, que
van desde la atracción de fagocitos h asta la
muerte y digestión del organismo fagocitado,
las que han sido explicadas detalladamente en
el capítulo 21.
D ado que m uchas bacterias patógenas po­
seen estructuras de superficie que impiden su
unión al fagocito, existen varias opsoninas que
al unirse a la bacteria aumentan su susceptibili­
dad fagocítica. Normalmente, diversas sustan­
cias sirven como opsoninas. Entre ellas, los an­
ticuerpos y el com ponente C3b del co m p le­
mento. El C3b se une covalentemente a la su­
perficie de las bacterias proporcionando un li­
gando que es reconocido por los receptores de
los neutrófilos, los monocitos y los m acrófa­
gos. Los microorganismos recubiertos con C3b
quedan anclados en la superficie de los fagoci­
tos, lo que facilita su captación (fig. 24-4). Los
niños con deficiencia de receptor leucocitario
CR3 (el receptor de C3bi, producto del clivage
de C3b) son altamente vulnerables a las infec­
ciones bacterianas.
La unión de la bacteria al fagocito desenca­
dena el proceso de ingestión. Una vez que en el
fagocito se ha formado la vacuola fagocítica,
ésta se fusiona con los lisosomas, quedando la
bacteria expuesta al contenido lisosomal. H a si­
do demostrado que muchas bacterias son inca­
paces de multiplicarse cuando son transferidas
a medios adecuados pocos minutos después de
ser ingeridas. En los leucocitos esta acción bac­
tericida se debe a los constituyentes lisosom a­
les y a productos metabólicos. Entre los pro­
ductos del metabolismo con actividad antilaac-
teriana pueden citarse el ácido láctico, que pro­
duce una disminución del pH suficiente como
para provocar la pérdida de viabilidad de algu­
nas bacterias patógenas, y la formación de pe­
róxido de hidrógeno por mecanismos d ep en ­
dientes del O^. La actividad bactericida del
H jO j parece deberse a la oxidación de iones
haluros (principalmente cloruros) para form ar
radicales hipohalitos en una reacción catalizada
por la enzima mieloperoxidasa. La deficiencia
en el sistema de mieloperoxidasas resulta en fa­
gocitosis poco eficiente para destruir bacterias
ingeridas y los individuos son altamente sus­
ceptibles a las enfermedades infecciosas. A de­
más, el H^Oj en altas concentraciones puede
actuar directamente como agente letal y tam ­
bién interactuar con radicales superóxidos para
formar radicales hidroxílicos tóxicos.
Otras sustancias bactericidas, cuya actividad
484 Inmunopatología
oE
l 'S
^ 03
Tiempo en días
Fig. 24-4. Evolución de L isteria m onocytogenes en bazo de ratones infectados experim entalm ente con dosis letales. UFC
en listeriosis prim aria (-o— o-) y en listeriosis secundaria en ratones vacunados (-«— ®-), En la escala de Protección se
grafica la diferencia de U D C entre ratones vacunados y ratones sin inm unizar (-o~ -o-). (De Stefan H. E. K aufm an, m o d ifi­
cado. Fundam ental Im m unology, 3“ ed.)
es independiente de m ecanism os oxidativos,
son también producidas por los fagocitos. Estas
incluyen lisozima (muramidasa), proteínas ca­
tiónicas y lactoferrina. La lisozima es una enzi­
ma cappz de hidrolizar los componentes muco-
p eptídicos de la pared celu lar de bacterias
grampositivas susceptibles, haciéndolas sensi­
bles al “shock” osmótico. Las proteínas catió­
nicas presentes en los gránulos de leucocitos
alteran la barrera de permeabilidad de bacterias
grampositivas y gramnegativas. La lactoferri­
na, una proteína que se une al hierro, posee ac­
tividad bacteriostática.
Estudios con bacterias marcadas radiactiva­
mente permitieron demostrar que en los fagoli-
sosomas las bacterias muertas son rápidamente
degradadas a componentes de bajo peso m ole­
cular por enzimas hidrolíticas (proteasas, pepti-
dasas, nucleasas, fosfatasas, lipasas, carbohi-
drasas) con actividad óptima a pH ácido.
La importancia de la fagocitosis como meca­
nismo de defensa contra las infecciones bacte­
rianas se refleja en la incrementada susceptibili­
dad en pacientes con desórdenes primarios y se­
cundarios de la función fagocítica. Entre los pri­
meros el más serio es la enfermedad granulo-
matosa crónica. Los secundarios comprenden
efectos colaterales de inmunosupresores y corti-
coesteroides sobre la función fagocítica, y defi­
ciencias de complemento o inmunoglobulinas.
ü®
Las bacterias han desarrollado estrategias
efectivas para escapar de la fagocitosis, princi­
palmente relacionadas con la composición de
sus envolturas que fueron descritas al tratar los
determinantes de virulencia.
La cápsula produce dos efectos: 1) interfiere
la unión del complemento a la superficie bacte­
riana, y 2) previene la unión de los receptores
de complemento presentes en los fagocitos con
el C3b unido a la superficie bacteriana. Este
mecanismo adicional adquiere importancia par­
ticular en el caso de bacterias grampositivas, en
las que su superficie puede representar un ex­
celente blanco para la unión de C3b por la vía
alternativa. Otra molécula con actividad antifa-
gocítica, ya mencionada, es la proteína M de
los estreptococos. Se cree que dicha actividad
se debe a su capacidad de unir factor H de con­
trol de complemento a la región repetida C de
la m olécula (fig. 24-3), que elim inaría cual­
quier C3b unido a la proteína M, aunque esto
no está aún aclarado.
Una estrategia singular está relacionada con
la producción de componentes bacterianos de
superficie que, por su semejanza con com po­
nentes del huésped, son difíciles de reconocer
por su sistema inmune Por ejemplo, el ácido
hialurónico de la cápsula de los estreptococos
es químicamente indistinguible del ácido hialu­
rónico humano. Otros ejemplos son la estructu­
 Inmunología de las Infecciones bacterianas
ra hidrocarbonada de la cápsula de meningoco­
cos del grupo B y de Escheríchia coli K l. No
es sorprendente que estos componentes sean
entonces, inmunógenos pobres.
No ha sido descrita en bacterias la capacidad
de enmascarar sus propios antígenos por adsor­
ción de componentes del huésped, como ocurre
en algunos parásitos.
Sustancias antibacterianas
Desde hace tiempo se reconoce la presencia
de sustancias antibacterianas en tejidos y flui­
dos corporales. Sin embargo, la relación de ca­
da una de estas sustancias, individualm ente,
con la resistencia a las infecciones no ha sido
bien establecida. Es posible que contribuyan a
la resistencia total del huésped cuando actúan
en conjunto y asociadas a otros mecanismos de
defensa. En diversos tejidos se han encontrado
sustancias como lisozima (que también se en­
cuentra en lágrimas, saliva, moco y secreciones
nasales), y polipéptidos básicos ricos en lisina,
arginina y poliaminas. Además, el suero nor­
mal contiene sustancias antim icrobianas ter-
m oestables (diferencia con el complem ento)
denominadas p-lisinas que se forman por coa­
gulación de plaquetas. Son activas contra una
cantidad de bacterias grampositivas, principal­
mente bacilos aerobios formadores de esporos
y algunos M icrococcus. Tam bién se extraen
sustancias bactericidas de leucocitos (leuqui-
nas), de plaquetas (plaquinas) y de glóbulos ro­
jos (hematina y mesohematina). Indudablemen­
te, muchos otros constituyentes químicos de los
tejidos y fluidos pueden inhibir el crecimiento
de bacterias patógenas.
Inflamación
Una respuesta inespecífica, como lo es la in­
flamación, es producida por diferentes agentes,
entre ellos una infección bacteriana. La respues­
ta inflamatoria posibilita la acción de varios m e­
canismos de resistencia constitutivos en el sitio
de la infección por proveer: 1) una alta concen­
tración de fagocitos y 2) un aumento de la con­
centración local de factores antibacterianos séri­
cos y liberados de células muertas y, en anima­
les inmunes, de anticuerpos. Además, la dismi­
nución de la tensión de oxígeno y la acumula­
ción de ácido láctico en el centro del área necró-
tica podrían constituir condiciones adversas para
el desarrollo bacteriano (véase cap. 23).
Respuesta inmune
Además de los mecanismos constitutivos ya
señalados, el huésped animal posee la capaci­
dad de responder a las infecciones bacterianas
485
mediante una serie de reacciones específicas,
inducidas por el agente infeccioso, que consti­
tuyen la respuesta inmune. Se ha dicho que la
complejidad del sistema inmune en seres hu­
m anos es un reflejo de la diversidad de los
agentes infecciosos a los que está expuesto. Si
se tiene en cuenta el número de microorganis­
mos potencialmente patógenos, la cantidad de
antígenos que puede expresar cada uno de ellos
y la constante evolución de las especies, resulta
explicable que la respuesta inmune del huésped
posea un alto grado de versatilidad. Este aspec­
to fue considerado en el capítulo 2.
Los mecanismos inmunes de defensa que se
inducen en un huésped animal frente a una in­
fección bacteriana deben protegerlo de la viru­
lencia de las bacterias, es decir, evitar su proli­
feración in vivo y la acción de las toxinas rela­
cionadas con su patogenicidad. Con respecto a
estos m ecanism os, debe hacerse una prim era
distinción entre las bacterias que se comportan
como parásitos extracelulares y aquellas que lo
hacen como parásitos intracelulares facultati­
vos.
BACTERIAS EXTRACELULARES
Las bacterias que se comportan como parási­
tos extracelulares son capaces de provocar da­
ño a los tejidos sólo mientras permanecen fuera
de las células fagocíticas. Generalmente produ­
cen enfermedades agudas y de corta duración.
Su presencia en los tejidos estimula la produc­
ción de anticuerpos específicos de distintas cla­
ses. Estos anticuerpos confieren resistencia a
las infecciones por diferentes mecanismos, pro­
duciendo: 1)opsonización (fagocitosis facilita­
da); 2) neutralización; 3) muerte y Usis m edia­
da por complemento, y 4) incremento de la res­
puesta inflamatoria.
Opsonización
La producción de anticuerpos opsonizantes
constituye el mecanismo de defensa específico
más importante en las enfermedades bacteria­
nas agudas; particularmente en aquellas que re­
conocen como agente causal a bacterias encap-
suladas que basan su virulencia en la resisten­
cia a la ingestión fagocítica, como ocurre en la
neum onía neumocócica. Las opsoninas reac­
cionan con los componentes antigénicos de las
bacterias que impiden su ingestión por las célu­
las fagocíticas. De esta manera facilitan la fija­
ción de las bacterias a los fagocitos y aumentan
su susceptibilidad a la fagocitosis. T anto los
macrófagos como los leucocitos polim orfonu­
cleares poseen receptores de superficie para las
porciones Fe de las IgGj, IgG., o C3b. D e esta
486 Inmunopatología
forma la opsonización puede ocurrir cuando; 1)
se producen suficientes anticuerpos específicos
IgGl o IgG3 que se unen a las bacterias; 2) la
respuesta de anticuerpos por sí misma es insu­
ficiente para la opsonización, pero se puede fi­
jar suficiente complemento sobre la superficie
de las bacterias, y 3) los distintos componentes
de las bacterias, por ejemplo endotoxinas, acti­
van directamente el complemento utilizando la
vía alternativa.
Los anticuerpos inductores de aglutinación
también promueven la fagocitosis al formar un
cúmulo o “clump” de células.
Neutralización
La neutralización representa una respuesta
humoral particularmente eficiente como meca­
nismo de defensa contra la acción de toxinas
bacterianas, las cuales, para ejercer su efecto,
deben u n irse in ic ia lm e n te a re c ep to re s de
membrana de las células susceptibles. La m a­
yoría de las exotoxinas estimulan la producción
de anticuerpos específicos, a n tito x in a s, que
neutralizan su efecto. Estos anticuerpos se unen
a las toxinas, produciendo una modificación es­
tética que im pide su unión a la células del
huésped.
Las antitoxinas específicas son altam ente
protectoras contra las enfermedades causadas
por bacterias que producen exotoxinas como
único o principal factor de virulencia, como
son difteria y tétanos. La prevención de estas
enfermedades por medio de vacunaciones con
toxoides (toxinas tratadas con formaldehído),
ha probado ser eficientes. También se practica,
con fines terapéuticos, la inmunización pasiva
con antitoxinas homólogas o heterólogas.
Por otra parte, anticuerpos n eutralizantes
preexistentes pueden prevenir la fijación de
bacterias a los receptores celulares. También
pueden red u cir la in fectiv id ad p ro vocando
agregación física, e inhibir la movilidad bacte­
riana reaccionando con pili y flagelos.
Muerte y lisis bacteriana mediada
por complemento
En 1884, R. Pfeiffer y sus colaboradores de­
mostraron que ciertas bacterias gramnegativas
eran lisadas por antisueros preparados contra
ellas, y que esa actividad lítica se perdía por
calentamiento a 56‘- C, sugiriendo la participa­
ción del complemento. Estudios más recientes
permitieron demostrar que la muerte se produ­
ce por acción de las proteínas terminales de la
cascada del complemento. A menudo, pero no
invariablemente, la muerte bacteriana va acom­
pañada por lisis, que depende de que las canti­
dades de lisozima sean las adecuadas.
La susceptibilidad al sistema bactericida del
suero es una característica muy difundida entre
las bacterias gramnegativas.
La activación del com plem ento por la vía
clásica usualmente requiere el reconocimiento
de antígenos bacterianos de superficie por cier­
tas clases de anticuerpos, sobre todo IgM y, en
menor grado, IgG. También se ha sugerido la
activación por IgA, en Escherichia coli. Estos
anticuerpos estarían dirigidos al core de lipopo­
lisacáridos y otros antígenos comunes, en ente­
robacterias, y a proteínas de membrana exter­
na, en Neisseria spp.
Por otra parte, las endotoxinas de las bacte­
rias gramnegativas pueden inducir la lisis acti­
vando el complemento por la vía alternativa.
Debido a las dificultades para distinguir los
fenómenos bactericidas y bacteriolíticos m e­
diados por complemento de otros sistemas de
defensa específicos e inespecíficos, resulta difí­
cil evaluar el rol in vivo de este m ecanism o
bactericida contra bacterias gramnegativas. Es
probable que los distintos componentes defen­
sivos del huésped actúen en forma concertada
ante un desafío con bacterias potencialm ente
patógenas y que los m ecanism ds hum orales
mediados por complemento sean más im por­
tantes en la patogénesis de algunas enfermeda­
des que en la de otras.
La resistencia a la acción bactericida de los
sistemas anticuerpo-com plem ento parece de­
sempeñar un papel importante en la patogéne­
sis de algunas infecciones debidas a bacterias
gram negativas. Por ejemplo, en endocarditis
por bacterias gramnegativas, en las que las bac­
terias invasoras colonizan un sitio aparente­
mente inaccesible para las células fagocíticas,
la resistencia a los factores bactericidas del
suero parece ser un importante factor de pato­
genicidad. Varios polímeros de la cubierta ce­
lular, tales como proteínas de membrana exter­
na, lipopolisacáridos y exopolisacáridos, han
sido considerados como mediadores de esta re­
sistencia, cuyo mecanismo no ha sido aún defi­
nitivamente aclarado.
La susceptibilidad al sistema bactericida del
suero parece ser también decisiva en la patogé­
nesis de infecciones debidas a Neisseria spp.
Los gonococos que causan infecciones genita­
les locales son generalm ente susceptibles al
suero humano, mientras que los que invaden el
torrente sanguíneo y producen infecciones di­
seminadas son resistentes a la muerte por sue­
ro. Por otra parte, la falta de niveles adecuados
de anticuerpos y complemento en líquido cefa­
lorraquídeo puede contribuir al mantenimiento
de altas concentraciones de bacterias en casos
de meningitis no tratadas. Las evidencias qui­
zás más importantes en favor de la importancia
de esta actividad bactericida in vivo surgen de
 Inmunología de las Infecciones bacterianas
observaciones realizadas en pacientes con defi­
ciencias congénitas de proteínas del com ple­
mento. Deficiencias de C5, C6, C l y C8 están
asociadas con episodios de bacteriemia gono-
cócica y m eningocócica, y meningitis. Dado
que la ausencia de estos componentes no im pi­
de las funciones opsónicas y quimiotácticas del
complemento se sugirió un papel directo de la
actividad bactericida del suero. Además, es
probable que en individuos deficientes en C l,
C4 y C2, el camino alternativo sea el que actúa
en la prevención de infecciones recurrentes de
características serias.
Las bacterias gramnegativas disponen de un
número de estrategias para obviar los efectos
de ambas vías de activación del complemento.
Uno de los mecanismos más comunes para im ­
pedir la unión del complemento es la capacidad
de las bacterias de sintetizar cápsulas que, con
la única excepción de la del Bacillus anthracis,
son de naturaleza polisaearídica. Como ya se
ha dicho, la producción de cápsula está clara­
mente relacionada con la patogenicidad de m u­
chas especies bacterian as, g ram positivas y
gramnegativas, tales como Streptococcus spp,
Neisseria meningitidis, Salmonella typhi, Hae-
mophilus influenzae, Klebsiella spp, etc. Existe
un gran número de antígenos capsulares, pero
sólo un reducido número de ellos está asociado
con bacterias que causan enfermedades invasi­
vas. En Escherichia coli se han definido, sero-
lógicamente, más de 80 antígenos capsulares,
denominados K. Sin embargo, la mayoría de
las cepas de Escherichia coli aisladas de sangre
poseen antígenos de tipo K1 y sólo unos pocos
tipos de K causan las restantes enfermedades
invasivas producidas por Escherichia coli.
Se cree que el mecanismo molecular de la
inhibición del efecto bactericida del suero por
los polisacáridos capsulares es la restricción de
la difusión de anticuerpos y componentes del
complemento a las superficies de células sub­
yacentes. Probablemente más importante es la
capacidad de las cápsulas de inhibir la fijación
de complemento por la vía alternativa al pro­
veer una superficie que potencia la degradación
del C3b unido, de manera similar a lo que pro­
duce el ácido siálico de la superficie de células
eucarióticas. De hecho, algunas cápsulas con­
sisten exclusivamente de ácido siálico {Neisse­
ria m eningitidis grupos B y C y Escherichia
coli K 1) o lo contienen {Streptococcus agalac-
tiae tipos la, 11 y III). Además, en Haemophilus
influenzae tipo b, la resistencia puede ser feno-
típicamente modulada por condiciones ambien­
tales, confirm ando el rol de la cápsula en la
evasión de la muerte bacteriana mediada por el
complemento.
Al igual que Hemophilus influenzae, cepas
de N eisseria gonorrhoeae sensibles al suero
487
muestran un fenotipo resistente al suero cuando
son preincubadas en suero o extractos de teji­
dos, demostrándose que el componente activo
es el ácido eitidin 5 ’-monofosfo-N acetilneura-
mínico (CMP-NANA), el nucleótido activado
de ácido siáhco. El CMP-NANA actúa com o
dador para una sialotransferasa que agrega este
azúcar al lipooligosacárido (LOS) del organis­
mo. Con ello no sólo se enmascaran los epito­
pes antigénieos del LOS que normalmente sir­
ven como blancos bactericidas, sino que tam ­
bién se inhibe la muerte por anticuerpos a otros
antígenos, tales como moléculas de porinas.
Otro mecanismo que permite evadir la m uer­
te m ediada por com plem ento, especialm ente
im portante en especies de enterobacterias, in­
volucra a los LPS. Estos organismos sintetizan
LPS con largas cadenas laterales O, que im pe­
dirían estéricam ente el acceso del com plejo
C5b-9 a la m em brana externa de la bacteria.
Las bacterias tam bién evaden el sistem a del
com plemento presentando al sistema inm une
antígenos que estimulan la formación de anti­
cuerpos bloqueantes. Estos anticuerpos b lo ­
quean la depuración de bacterias por la reac­
ción bactericida del suero. Se ha propuesto que
los anticuerpos bloqueantes tienen dos efectos:
1) desvían la localización molecular del com ­
plemento fijado a sitios que no resultan en le­
siones bactericidas y 2) interfieren con la fija­
ción de anticuerpos normalmente bactericidas.
Un mecanismo usado por Brucella y meningo-
cocos es la estimulación de altos niveles de an­
ticuerpos IgA séricos no fijadores de com ple­
mento que parecen competir con los anticuer­
pos IgG bactericidas. En el caso de Neisseria
gonorrhoeae, el suero humano normal puede
co n ten e r anticuerpos bloqueantes d irig id o s
principalmente contra una proteína de superfi­
cie expuesta denominada PIII o rmp que es ca­
paz de bloquear el fuerte efecto bactericida del
suero de pacientes que se han recuperado de
una infección gonocóeica diseminada.
Incremento de la respuesta
inflamatoria
A través de la activación del complemento,
complejos antígeno-anticuerpo incrementan la
intensidad de la respuesta inflamatoria inducida
por el agente infeccioso.
BACTERIAS INTRACELULARES
Las bacterias intracelulares comprenden al­
gunas especies patógenas de importancia m édi­
ca reconocida y otros patógenos emergentes y
oportunistas que cobran importancia con el au­
mento de pacientes inmunodeficientes.
488 Inmunopatología
Con respecto a su hábitat, las bacterias intra­
celulares pueden ser de dos tipos; facultativas y
obligadas. Las primeras son capaces de multi­
plicarse y persistir dentro de fagocitos mono-
nucleares y, en algunos casos, dentro de otras
células del huésped. Estas incluyen Mycobacte-
rium spp, Salmonella spp, Brucella spp, Legio-
nella pneumophila y Listeria monocytogenes.
Las segundas, que no pueden sobrevivir fuera
de la célula huésped, prefieren los fagocitos no
profesionales (células epiteliales y endotelia­
les), y sólo a veces se encuentran en fagocitos
m onocelulares. Estas incluyen R ickettsiae y
Chlamidiae,
Debido a su localización intracelular están
protegidas de la inmunidad humoral. Sin em ­
bargo, proteínas bacterianas son procesadas y
los p éptidos expresados en el contexto del
CMH promueven interacciones con linfocitos
T. Tanto la patogenicidad de bacterias intrace­
lulares como la resistencia adquirida a dicha in­
fección dependen de los linfocitos T, La activa­
ción de macrófagos por linfocitos T CD4 que
producen interferón gamma (lEN-y) se conside­
ra crucial en la resistencia adquirida.
Las bacterias intracelulares presentan cinco
características principales; 1) están obligadas a
explotar mecanismos de evasión que le perm i­
tan sobrevivir en ambientes tan hostiles; 2) po­
seen baja toxicidad, y la patogenicidad no es
consecuencia directa de los factores de virulen­
cia bacterianos sino de la respuesta del huésped
por la estimulación de linfocitos T; 3) las reac­
ciones tisulares son típicamente granulomato-
sas; 4) ¡as enfermedades tienden a la cronici­
dad, y 5) la protección contra las infecciones
producidas por bacterias intracelulares está m e­
diada por células T, las que no interactúan di­
rectamente con la bacteria sino con la célula in­
fectada.
Sólo unas pocas especies bacterianas patóge­
nas cumplen con estos criterios y, dependiendo
de cuál o cuáles de ellos se consideren, el con­
cepto de bacterias intracelulares puede variar.
Entre las bacterias que cumplen todos los crite­
rios m encionados se encuentran especies de
Mycobacterium. La listeriosis experimental en
ratones, causada por Listeria monocytogenes
cumple casi todos los criterios, pero es una en­
fermedad aguda. Otras enfermedades, tales co­
mo fiebre tifoidea (causada por Salm.onella ty-
phi o Salmonella thyphimurium), o la enferme­
dad de los legionarios, causada por Legionella
pneumophila, son sólo parcialmente intracelu­
lares, ya que la respuesta del huésped es influi­
da por anticuerpos. La tuberculosis y la liste­
riosis experim ental en ratones, son m odelos
importantes de infecciones por bacterias intra­
celulares, a los que nos referiremos en este ca­
pítulo. La primera por su implicancia en salud
pública y la segunda por ser el modelo mejor
estudiado,
Mycobacterium tuberculosis es una bacteria
ácido alcohol resistente, de crecimiento lento,
cuya cubierta celular es rica en lípidos, glucolí­
pidos y ceras, que son responsables de su hidro­
fobicidad, su adyuvanticidad y su persistencia
intracelular. Es agente causal de la tuberculosis,
enfermedad que afecta a numerosos individuos.
Sin embargo, estos representan no más del 10%
de los infectados, ya que el aproximadamente
90% restante permanece saludable al mantener
un equilibrio entre la respuesta inmune del hués­
ped y el desarrollo de la bacteria persistente.
Fagocitos profesionales
Los fagocitos profesionales constituyen los
principales efectores de las defensas antibacte­
rianas. Estos com prenden a los granulocitos
polimorfonucleares (PNGs) y fagocitos mono-
nucleares (MPs). Los PNGs juegan un rol espe­
cial en la infección intracelular aguda, aunque
su corta vida los hace inapropiados como hábi­
tat intracelular. Más bien actúan como células
letales para bacterias intracelulares como Liste­
ria monocytogenes. El rol de los MPs es doble,
ya que representan un hábitat esencial y los
principales efectores de las defensas.
La fagocitosis se induce de dos maneras; 1)
Los fagocitos profesionales expresan glucopro-
teínas lectin-like con especificidad por azúcares
comúnmente expuestos en la superficie bacte­
riana. La unión a estos receptores induce la fa­
gocitosis por los fagocitos profesionales, 2) La
unión de ligandos a las bacterias (IgG, produc­
tos del clivaje de C3 o fibronectina) promueve
la fagocitosis vía receptores específicos (FcR,
C R l y CR3 o EnR),
Las funciones efectoras de los fagocitos pro­
fesionales incluyen; 1) generación de interme­
diarios del oxígeno reactivos (ROIs); 2) pro­
ducción de intermediarios del nitrógeno reacti­
vos (RNIs); 3) limitación de la disponibilidad
del hierro intracelular; 4) producción de defen-
sinas; y 5) acidificación de fagosomas y fusión
fagosomas-lisosomas. La mayoría de estos me­
canismos son solamente inducidos por una ac­
tivación apropiadíi- En el caso de MPs murinos
por estimulación de IFNy, aunque también par­
ticipan otra interleuquinas. El sistema humano
es más complejo y es probable que se requiera
la co-estimulación de diferentes factores.
Producción de ROIs
Los RO Is son tóxicos para todos los m i­
croorganismos, incluyendo las bacterias intra­
celulares. Sin embargo, su contribución para
combatir la tuberculosis no es clara.
 Inmunología de las infecciones bacterianas
Producción de RNIs
Los RNIs han demostrado estar involucrados
en la actividad tubercuiostática de MPs m uri­
nos. Estos interm ediarios son producidos no
sólo por los fagocitos profesionales sino tam ­
bién por otras células, incluyendo los hepatoci­
tos, una de las células blanco de L. monocyto-
genes. Por lo tanto, es posible que los RNIs
participen en la protección de fagocitos no pro­
fesionales contra las bacterias intracelulares.
También se ha sugerido que los RNIs participa­
rían en la inhibición del crecimiento de mico-
bacterias en MPs humanos.
Requerimiento de hierro
El hierro es un requerimiento crucial para la
sobrevivencia de bacterias intracelulares, entre
ellas h is te ria m ono cyto g en es y L eg io n eila
pneumophila. Por otra parte, los MPs requieren
hierro para activación de los mecanismos anti­
b acte rian o s que inclu y en la g en eració n de
ROIs y RNIs. De esta manera, la competencia
por el hierro representa un factor decisivo para
la acción de los MPs como hábitat o efectores.
Producción de defensínas, acidificación
de fagosom as y fusión fagosoma-lisosoma
Durante la fagocitosis, el pH endosomal au­
menta a niveles básicos por un corto período y
luego disminuye a valores ácidos. El medio bá­
sico crea condiciones óptimas para las defensi-
nas, mientras que el pH ácido es óptimo para
las enzimas lisosomales.
Las defensinas son polipéptidos básicos que
abundan en los PNGs y están presentes en al­
gunos, aunque no todos, los MPs. Ha sido de­
m ostrado que defensinas purificadas poseen
una fuerte actividad bactericida y pueden jugar
un rol defensivo contra ciertas bacterias intra­
celulares, tales como S. typhimurium y L. m o­
nocytogenes. Además, mulantes de S. typhimu­
rium phoP-, por inserción de un transposón,
que son avirulentas para ratón e incapaces de
sobrevivir en MPs murinos, son altamente sen­
sibles a las defensinas.
La contribución de las enzimas lisosomales a
la muerte bacteriana es poco importante; su rol
principal es la degradación de bacterias m uer­
tas. Estas enzimas residen en los lisosomas y
llegan al fagosoma a través de la fusión fagoso­
ma-lisosoma.
Estrategias bacterianas de sobrevivencia
intracelular
Las bacterias intracelulares explotan diferen­
tes estrategias para multiplicarse dentro de las
489
células huésped: 1) invasión de fagocitos no
profesionales; 2) evasión desde el fagosom a
hacia el compartimento citoplasmático; 3) in­
terferencia con los ROIs; 4) inhibición de la fu­
sión fagosom a-lisosom a y neutralización del
pH fagosomal; 5) resistencia a las enzimas liso-
somales; y 6) inducción de “heat-shock p ro ­
teins ”(hsp)-
L isteria m onocytogenes y M ycobacterium
tuberculosis presentan diferentes estrategias de
sobrevivencia, probablemente relacionadas con
la duración de las enfermedades que causan.
L. monocytogenes, que causa una infección
aguda, es relativam ente sensible a la m uerte
por fagocitos y sólo puede sobrevivir en el in­
terior de fagocitos no profesionales y aquellos
pocos MPs insuficientem ente calificados. M.
tuberculosis habita principalmente en M Ps y
raramente en fagocitos no profesionales.
En L. monocytogenes la invasión activa de
fagocitos no profesionales es mediada p o r una
invasina, llam ada internalina y una pi'oteína
extracelular, p60. Por este mecanismo L. mo­
nocytogenes atraviesa las células epiteliales in­
testinales. En el hígado, las células de K upffer
captan L. monocytogenes de la sangre y algu­
nas bacterias pueden salir del fagosoma y en­
trar en en citoplasma. En esta etapa la sobrevi­
vencia celular se debe, principalmente, a liste-
riolisina, aunque otros factores de virulencia
(fosfolipasas C, lecitinasa y m etaloproteasa)
también contribuirían. Luego, L. monocytoge­
nes se mueve hacia la membrana desde donde
se disemina a los hepatocitos, sin exposición al
medio extracelular ni intervención de invasi-
nas. Con posterioridad a la estimulación de los
MPs por IFN-y, L. monocytogenes no puede
escapar de los fagosomas, donde es m uerta fá­
cilmente por acción de los ROIs, RNIs y/o de­
fensinas. Aun en ausencia de células T, las cé­
lulas NK controlan la listeriosis bastante efi­
cientem ente, aunque no c o m p leta m en te. El
compartimento endosom al de los hepatocitos
es m ucho m enos hostil que el de lo s MPs,
constituyendo un nicho propicio para la sobre­
vivencia bacteriana.
En M. tuberculosis no se conocen invasinas
y la entrada al huésped se produce por medio
de la fagocitosis por MP alveolares. G eneral­
m ente no ocurre evasión en el citoplasm a y
existe una alta resistencia a los mecanism os
efectores que operan en MP activados. A pesar
de su im portancia clínica, los conocim ientos
sobre los factores de virulencia que perm iten
la sobrevivencia intracelular de Ai. tuberculo­
sis son poco conocidos. La fagocitosis ocurre
por dos mecanismos: 1) las micobacterias se­
cretan abundante cantidad de moléculas que se
unen a fibronectina, las que promueven la fa­
gocitosis por receptores de fibronectina, y 2)
490 Inmunopatología
M. tuberculosis induce la activación de C3 se­
guida por fijación de productos de C3 y capta­
ción vía CR; esta entrada no produce induc­
ción de ROIs. Además, M. tuberculosis produ­
ce enzimas que detoxifican los ROIs e inhiben
la fusión fagosoma-lisosoma. También los glu-
colípidos participan en la sobrevivencia del
bacilo de la tuberculosis. El lipoarabinomana-
no interfiere con la activación de MPs y los
sulfolípidos inhiben la fusión fagosoma-lisoso-
ma e interfieren con la producción de ROIs.
Por último, en virtud de su pared celular rica
en lipoides, su actividad metabólica reducida y
su replicación retardada, M. tuberculosis pare­
ce estar equipado adecuadamente para su so­
brevivencia intraendosomal.
R ol central de las células T
Como ya se mencionó, los linfocitos T son
elem entos indispensables para la patogénesis
de infecciones producidas por bacterias intra­
celulares. Por una parte, la expansión de gra­
nulomas dificulta las funciones tisulares, ocu­
pando espacio y afectando a las células que lo
rodean. Por otra parte, los linfocitos T especí­
ficos pueden afectar la fisiología de las células
del huésped infectadas.
La adquisición de resistencia contra bacte­
rias intracelulares también depende principal­
mente de los linfocitos T. En el caso de bacte­
rias susceptibles, como histeria monocytoge-
nes, la depuración bacteriana es llevada a cabo
rápidamente, mientras que en el caso de pató­
genos resistentes, como M. tuberculosis, la de­
puración es generalmente incompleta, quedan­
do focos con bacterias controladas. La presen­
cia de bacterias y su erradicación se localizan
en las lesiones granulomatosas, donde las cito-
quinas prom ueven la acción de linfocitos T,
MPs y Otras células.
En la década del 60, G. B. Mackanes reveló
que la resistencia contra bacterias intracelula­
res podía ser transferida por medio de linfoci­
tos viables obtenidos de animales inmunes, y
posteriormente realizó estudios sobre el m ode­
lo de listeriosis experimental en ratones.
Se infectaron ratones intravenosamente con
dosis subletales de L. monocytogenes. A varios
tiempos post-infección se mataron los ratones,
se extrajeron sus bazos e hígados y se determi­
nó el número de bacterias viables (por recuento
de unidades formadoras de colonias en placa)
en homogenatos de esos órganos. Más del 95%
de las bacterias fueron eliminadas de la circula­
ción durante los primeros 15 minutos, y se en­
contraron en los órganos, donde se multiplica­
ron continuamente hasta los 4-6 días. Luego, el
número de bacterias dism inuyó rápidam ente
hasta niveles no detectables, alrededor de los
8-10 días. El cambio ocurrido en los días 5-6 se
correlaciona con la aparición de linfocitos T es­
pecíficos, capaces de transferir protección a re­
ceptores com unes. La infección con L. m o ­
nocytogenes induce inmunidad protectora, y ra­
tones que sufrieron la infección subletal, fueron
capaces de tolerar una segunda dosis, mucho
mayor, normalmente letal (fig. 24-4).
Subpoblaciones de células T involucradas
Células T a/(3 CD4 (principalmente T H l) y
células T a /p CD8 participan en la resistencia
adquirida contra bacterias intracelulares, como
surge de algunas observaciones reahzadas en
ratones infectados con L. monocytogenes que
demuestran que: 1) la transferencia adoptiva
de inmunidad antilisteria depende de la histo­
compatibilidad entre las células T transferidas
y los ratones receptores, en sus loci para m olé­
culas clase I y clase II del CMH; 2) la elimina­
ción in vitro de células T CD4 y CD8 de la po­
blación de lin fo cito s inm u n es, d ific u lta la
transferencia de protección contra L. monocy­
togenes-, 3) se han aislado clones de células T
CD4 y CD8 específicos para L. m onocytoge­
nes capaces de transferir protección adoptiva­
mente y 4) las lesiones de ratones infectados
consisten de células T CD4 y CD8.
Se ha dem ostrado que en la listeriosis, la
protección depende principalmente de células
T CD8, con alguna participación de células T
CD4,
También existen evidencias que indican la
participación de células T CD4 y CD8 en in­
fecciones por otras bacterias intracelulares, in­
cluidas m icobacterias, Salm onella typhim u-
rium y Brucella abortus.
La residencia primaria de las bacterias intra­
celulares es el compartimento endosómico de
los MPs y desde aquí tienen acceso a la vía de
presentación de CMH clase II. Sin embargo,
las bacterias intracelulares también invaden fa­
gocitos no profesionales, algunos de los cuales
no expresan constitutivamente moléculas clase
II del CMH. En consecuencia, esas células no
son reconocidas por los linfocitos T CD4 y
brindan un sitio adecuado para la bacteria in­
tracelular, influyendo en el curso de la enfer­
medad.
Varias líneas circunstanciales de evidencias
indican que las células T y/5 están involucra­
das en la inmunidad contra bacterias gramne­
gativas.
Citoquinas
Las citoquinas juegan un rol central en la re­
sistencia contra las bacterias intracelulares.
Actúan en las siguientes etapas:
 Inmunología de las infecciones bacterianas
infiltración temprana de fagocitos
inflamatorios
En la acumulación temprana de fagocitos in­
flamatorios en el sitio de multiplicación bacte­
riana están involucradas IL-1, lL-6 y TNF. E s­
tas citoquinas proinflamatorias son producidas
por MPs y/o células epiteliales muy pronto des­
pués de la infección.
Formación de lesiones granulomatosas
Participan TNF e IL-4. Sin embargo, debido
a que los granulomas son indispensables para
la protección contra M. tuberculosis, la form a­
ción de granuloma inducido por TNF es prim a­
riamente un mecanismo protector, A diferencia
de ello, la protección contra L. monocytogenes
no depende estrictamente de la formación de
granulomas, y lesiones excesivas son perjudi­
ciales para el huésped.
Activación de funciones antibacterianas
en los M Ps (activación de macrófagos)
Esta etapa ha sido extensamente estudiada in
vitro usando macrófagos murinos. En este sis­
tema, el IFN-Y ha sido identificado com o la
principal citoquina de activación de MPs. Los
m acrófagos activados son capaces de m atar
bacterias susceptibles, como L. monocytogenes,
y, aunque no hacen lo propio con M. tuberculo­
sis, son capaces de inhibir fuertemente el creci­
miento de estas bacterias. El IFN-y es produci­
do por diferentes células que infiltran secuen-
cialmente la lesión (células NK, células T y/5 y
células T a /p CD4 y CD8. (fig. 24-5).
La producción de IFN-y por las células NK y
T y/6 favorece la difei'enciación de células T
CD4 en el tipo T H l, durante las tiltimas fases
de la activación de macrófagos.
Mecanismos citolíticos
Mecanismos citolíticos parecen estar involu­
crados tanto en la patogénesis de las bacterias
intracelulares como en la protección contra las
mismas. En la patogenia, ya que la lisis de fa­
gocitos no profesionales afecta las funciones fi­
siológicas de los órganos afectados. En cuanto
a su función en la protección, la lisis de células
infectadas libera bacterias que mueren fác il­
mente al ser fagocitadas por monocitos sanguí­
neos, constituyendo así un prerrequisito para la
depuración de bacterias. Las células potencial­
mente eitolíticas incluyen PNGs, NK, y células
T y/5 y a/p. Células T a /p CD4 y CD8 de rato­
nes inmunes contra M. tuberculosis o L. m o­
nocytogenes expresan actividad citolítica des­
pués de su re-estimulación in vitro. Tam bién
491
células T CD4 y CD8 obtenidas de lesiones de
pacientes con tuberculosis expresan m arcado­
res fenotípicos característicos de actividad cito­
lítica. Si bien las células T CD4 aisladas de pa­
cientes tuberculosos generalmente expresan ac­
tividad citolítica específica luego de su re-esti­
mulación in vitro, esto rara vez ocurre con las
células T CD8.
La lesión granulomatosa
En general, la respuesta inmune que protege
contra bacterias intracelulares es un evento lo­
cal centrado en los g ran u lo m as, que no sólo
restringen la multiplicación bacteriana sino que
confinan a las bacterias en un espacio físico de­
finido.
La lesión granulomatosa está compuesta por
MPs (en diferentes estados de maduración y di­
ferenciación) y células T de diferentes fenoti­
pos. Las bacterias se encuentran en el interior
de los MPs.
La formación del granuloma se inicia con un
proceso inflamatorio. Este proceso es desenca­
denado por productos bacterianos (péptidos
conteniendo N-formil metionina), componentes
del complemento (C5a) y citoquinas produci­
das por los MPs infectados (IL-1, lL-6, IL-8 y
T N F -a ). Las citoquinas producidas p o r los
MPs estimulan a las células endoteliales loca­
les y a fagocitos sanguíneos. Las células endo­
teliales activadas que rodean a la lesión prim a­
ria expresan selectinas e integrinas, prom ovien­
do la adhesión y extravasación de los fagocitos
inflam atorios que, a su vez, liberan enzim as
proteolíticas con el consiguiente daño tisular.
Esta lesión es, a menudo, exudativa. En una se­
gunda etapa, los linfocitos T y los macrófagos
interacttian entre sí. Las células T producen ci­
toquinas (que incluyen IFN-y e IL-2) que esti­
mulan a los linfocitos T recirculantes en la san­
gre, producen su interacción con las células en­
doteliales activadas (vía selectinas e integrinas)
y migran hacia el foco infeccioso. Gradualmen­
te, las células infiltradas se organizan y forman
un granuloma, en el que predominan los MPs.
Al interactuar con los MPs infectados, los lin­
focitos T producen IFN-y y activan las funcio­
nes antibacterianas de los macrófagos.
La imposibilidad de desarrollar granulomas
o la ruptura de granulomas organizados suele
estar asociada con una evolución desfavorable
de la enfermedad infecciosa debida a bacterias
intracelulares.
CARACTERÍSTICAS DEL HUÉSPED
QUE MODIFICAN LA RESPUESTA INM U NE
La susceptibilidad y el tipo de respuesta ante
muchas infecciones bacterianas depende de las
492 Inmunopatología
Fig. 24-5. P r jducción secuencial de IFN-"y en el sitio de m ultiplicación bacteriana, en la listeriosis experim ental en ratón.
(D e Stefan HE K aufm an, m odificado. F undam ental Im m unology, W . Paul, 3® ed.)
características del huésped. Las más importan­
tes a tener en cuenta incluyen edad, factores
genéticos y factores nutricionales.
Edad
La evolución del sistema inmune durante el
desarrollo fetal, neon atal y adulto p ro d u ce
cambios en la susceptibilidad del huésped a di­
ferentes tipos de infección. Durante el desarro­
llo fetal la susceptibilidad está limitada a aque­
llos organismos que pueden ser transm itidos
por la circulación materna (el agente productor
de la sífilis, entre las bacterias). Entre los neo­
natos, un factor importante, aunque no el úni­
co, es la falta de una respuesta inmune humo­
ral. Esta se compensa en parte por los anticuer­
pos maternos, sobre todo de la clase IgG, aun­
que también se transfieren IgM e IgA, estos úl­
timos fundam entalemnte en leche y calostro.
Como consecuencia de los bajos niveles de
IgM hay una mayor susceptibilidad frente a las
bacterias gramnegativas. Además, la desapari­
ción de los anticuerpos IgG va acompañada de
un aumento en la susceptibilidad a infecciones
por estafilococos, estreptococos, Haemophiíus
influenzae Neisseria meningitidis.
Fothergill y Wright realizaron estudios sobre
la respuesta de anticuerpos en meningitis cau­
sadas por H. influenzae y demostraron que la
incidencia de la enfermedad aumenta a medida
que disminuye el nivel de anticuerpos. Los ni­
ños nacen con anticuerpos m aternos y están
protegidos m ientras estos anticuerpos están
presentes. Entre los 3 meses y los 2 años de
edad los niños son altamente susceptibles a la
enfermedad por ser naturalmente deficientes en
anticuerpos dirigidos contra la cápsula de tipo
b. Después de los 2 años, los títulos de anti­
cuerpos aumentan y la enfermedad se vuelve
menos frecuente. Además, cuanto mayor es la
capacidad de la sangre para destruir al agente
causal, menos son los casos de enfermedad. En
la figura 24-6 se muestra la relación entre la
 Inmunología de las infecciones bacterianas
Edad (años)
F ig. 24-6. Relación entre edad, incidencia de m eningitis por H. influenzae y títulos bactericidas en sangre. (De S m ith ,
A .L., m odificado. M icrobiología. M ecanism os de la enferm edad infecciosa, 2“ ed.)
edad, la incidencia de m eningitis por H. in­
fluenzae y los títulos bactericidas en sangre.
La inmunidad mediada por células aparece
prácticamente intacta en neonatos.
Es importante destacar que los procesos in­
fecciosos de la infancia pueden provocai' altera­
ciones perdurables al interferir en el desarrollo
y el crecimiento.
Factores genéticos
E ntre los facto res gen ético s se in clu y en
aquellos relacionados con la resistencia de es­
pecie, raza, etc. Además, muchos estudios su­
gieren que existe un componente hereditario en
la susceptibilidad a la tuberculousis. También se
han hecho observaciones sobre otros sistemas
microbianos, no bacterianos. Uno de los casos
mejor establecido de control hereditario de re­
sistencia a una infección específica es el de la
ausencia relativa de susceptibilidad al paludis­
mo asociada con algunos tipos de anemia.
Factores nutricionales
Existen evidencias de que dietas cualitativa­
mente o cuantitativamente inadecuadas pueden
predisponer a las infecciones bacterianas. Esta
disminución de la resistencia ha sido asociada,
al menos, con deficiencias proteicas, vitamíni­
cas o de iones metálicos. U na dieta proteica
inadecuada produce depresión de la respuesta
inmune celular y humoral. Las vitaminas A y D
aparecen como esenciales para la funcionalidad
493
E
lo
de las membranas lisosomales y la deficiencia
de vitamina A parece disminuir la resistencia a
la tuberculosis, al afectar la función fagocítica
normal. Por otra parte, una disminución de h ie­
rro parece estar asociada con un incremento de
la susceptibilidad a infecciones por bacterias
gramnegativas.
R EA C C IO N ES
INM UNOPATOLÓGICAS
Hemos dicho anteriormente cjue una in fec­
ción bacteriana es capaz de provocar daño en
un huésped susceptible por acción directa de
los microrganismos y también por los m ecanis­
mos de defensa que pone en juego el huésped
frente a esa infección.
También hemos visto que la respuesta infla­
matoria es uno de los mecanismos de defensa
que un huésped susceptible opone a una infec­
ción. Sin embargo, la inflamación en sí m ism a
es una condición patológica y, en algunos ca­
sos, el daño debido al proceso inflamatorio es
mayor que el producido por el agente infeccio­
so, tal como ocurre, por ejemplo, en la tubercu­
losis y la lepra. En infecciones por M ycobacte­
rium tuberculosis, las células T activadas p o r el
antígeno no sólo activan macrófagos, sino que
los atraen e inmovilizan. Puesto que, a su vez,
las células son atraídas ai foco de infección, el
resultado neto es la concentración de células
activadas y macrófagos en el sitio de infección.
La liberación de linfotoxinas y enzimas lisoso-
494 Inmunopatología

filocócica podría reducir las defensas del hués­

Célula epitelial ped contra otros microorganism os invasores.
También se ha demostrado que un extracto de
poUsacáridos de Bordetella pertussis disminu­
:^MBG
C é lu la ^ ®rzr® f Célula ye la respuesta de hipersensibilidad tardía a la
endotelial^ jm mi— m>\ endotelial tuberculina, probablemente por inhibición de la
proliferación o de la actividad de linfocitos o
de ambas.
mm '
A n tíg e n o * * , Complejos 5=1 Anticuerpo Los complejos inmunes que se forman du­
antígeno-anticuerpo rante las infecciones bacterianas usualmente no
solubles provocan un daño importante. Sin embargo, al­
gunas infecciones pueden producir enfermeda­
Giba
des debidas a la formación de complejos inm u­
<^3 ¿2> ^
nes. Uno de los ejemplos más conocidos es la
glom erulonefritis aguda post-estreptocóccica.
03 C3
En eUa, los complejos antígeno-anticuerpo de­
m um mrum sencadenan varios mecanismos locales secun­
Célula \ ©im® darios que contribuyen a la formación de lesio­
endotelial
(PiC) Activación del sistema nes glomerulares, que se presentan al m icros­
[ del complemento copio electrónico como depósitos electrónica­
mente densos. Mediante técnicas histopatológi­
cas se demostró que estos depósitos contienen
-Proteinuria
comiánmente IgG, C3 y properdina. Aun cuan­
do no esté definido el antígeno específico que
provoca la glomerulonefritis post-estreptocóc-
cica, su patogenia parece semejante a la forma
Célula aguda de la enfermedad del suero en conejos,
endotelial segtín se esquem atiza en la figura 24-7. Se
^Polimorfonucleares piensa que las lesiones glomerulares de la en­
docarditis bacteriana subaguda, la bacteriemia
quimiotáctica' estafilocócica y la neumonía neumocócica obe­
de 05, 0 6 y 07 decerían a mecanismos similares.

F ig. 24-7. R epresentación esquem ática del desarrollo de

lesiones glom erulares por los com plejos solubles de antí-
geno-anticuerpo. (De Fish y col.: en -Strauss, M. B. y W elt,
L. G. (eds.). D iseases o f the kidney, 2“ ed. Boston, Little,
Brown & C o „ 1971.)
males por las células T y los macrófagos, res­
pectivamente, produce la necrosis de los teji­
dos, originando una reacción de hipersensibili­
dad mediada por células.
Otras reacciones inm unopatológicas causa­
das por infecciones bacterianas incluyen las de­
nominadas enfermedades autoinmunes y la for­
mación de complejos inmunes.
En el caso de las enfermedades autoinmunes
han sido implicados varios productos del meta­
bolism o bacteriano, como lipopolisacáridos,
proteínas, etc. Estos productos inducen reaccio­
nes inmunes no específicas que pueden supri­
mir las respuestas específicas involucradas en
la capacidad protectora. A lgunos ejem plos
aclararán este concepto. La p ro teín a A de
Staphyíococcus aureus tiene la propiedad de
combinarse con la porción Ec de la IgG huma­
na. Así, el complejo formado reacciona con el
complemento del suero, produciendo su agota­
miento; por este mecanismo una infección esta-
B IB L IO G R A F IA
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Inmunología de las micosis
RICARDO NEGRONI
INTRODUCCIÓN
Se agrupan dentro de las micosis sistémicas
todas aquellas afecciones cuyo agente etiológi­
co es capaz de diseminarse por vía linfohemáti-
ca en algún momento de su evolución, provo­
cando la agresión simultánea a diversos órga­
nos con serio riesgo para la vida del pacien-
^e_26,39 Estas m icosis deben dividirse en dos
grandes c a t e g o r í a s , a q u e l l a s ocasionadas
por hongos patógenos primitivos como el His-
toplasm a capsulatum o el P aracoccidioides
brasiliensis, y las producidas por hongos de ba­
ja virulencia, llamadas micosis oportunistas, a
causa de que su presentación depende de la
existencia en el huésped de una patología pre­
via que disminuye sus defensas, ya sea en el
orden local o en el general.
Estos dos tipos de afecciones son muy dife­
rentes en lo que atañe a las relaciones huésped-
parásito y conviene tratarlas separadamente.
I. MICOSIS SISTÉMICAS
Caracteres de las micosis sistémicas
Generales
Reservaremos el nombre de micosis sistémi­
cas para aquellas producidas por hongos pató­
genos primitivos. Éstos viven normalmente en
el mundo exterior, donde desarrollan una vida
saprofita en el suelo o sobre deyecciones de
animales y pueden infectar al hombre y otros
vertebrados por medio de sus esporas. La vía
de penetración es generalm ente inhalatoria,
producen cuadros de primoinfección pulmonar
25
habitualmente benignos que, en su mayor parte
curan en forma espontánea. Un reducido nú­
mero de sujetos infectados, uno de cada 500 o
1.000, según la micosis, no se defiende ade­
cuadam ente; su afección pulm onar se torna
progresiva y, por último, el agente etiológico
se disemina por vía linfohemática y ataca di­
versos órganos llevando al paciente, de no me­
diar un tratamiento adecuado, a la muerte en
un lapso variable.
A este grupo pertenecen 5 enferm edades:
coccidioidomicosis, histoplasmosis, paracocci-
dioidomicosis, blastomicosis y criptococosis.
Se designa con el nombre de micosis-infec­
ción a las formas respiratorias benignas, subclí-
nicas o asintom áticas que curan espontánea­
mente y con el de m icosis-enferm edad a las
evolutivas y graves.
Una característica importante de estas mico­
sis es que cada una de ellas posee una distribu­
ción geográfica peculiar. Todas son más fre­
cuentes en el continente americano y, salvo la
blastomicosis (antes conocida como blastom i­
cosis norteamericana), todas han sido halladas
en la Argentina.>3‘->33-'«
Otro rasgo distintivo de importancia es que,
eon excepción del Cryptococcus neoformans,
todos los agentes productores de micosis sisté­
micas son dimorfos, es decir, que se presentan
como hongos filamentosos con producción de
distintos tipos de esporas en su vida saprofítica
y como elementos levaduriformes o esporan­
gios en la parasitaria. Ello se debe probable­
mente a que en el seno de los tejidos parasita-
dos el hongo debe adaptarse a las defensas del
huésped y a condiciones de desarrollo constan­
tes en lo que atañe a temperatura y humedad.
Este proceso fue llamado “animalización” .'^®

Epidemiológicos y relaciones
huésped-parásito
Los estudios realizados sobre la coccidioido-
micosis-infección'^''’-’®permitieron establecer una
serie de hechos fundamentales que más tarde
fueron comprobados en otras micosis sistémi­
cas. Éstos pueden resumirse así: 1 ) la primoin-
fección pulmonar origina un complejo primario
similar al de la tuberculosis; 2 ) los animales do­
mésticos y silvestres de las zonas endémicas se
infectan espontáneamente de la misma forma
que el hombre; 3) la fuente de infección común
para ambos es el suelo; 4) la primoinfección es,
en la mayoría de los casos, asintomática o sub-
clínica, cura espontáneamente, deja una sólida
inm unidad frente a las reinfecciones y como
únicas secuelas produce la alergia cutánea fren­
te a los antígenos del agente causal y, en ocasio­
nes, focos de calcificación pulmonar. Estas m i­
cosis no son contagiosas de hombre a hombre
ni de los animales al hombre; sólo se producen
pequeñas epidemias cuando un grupo de suje­
tos, por razones diversas, se expone simultánea­
mente a una fuente de infección masiva.
Las encuestas realizadas mediante intrader­
morreacciones han demostrado que la micosis-
infección es extrem adam ente com ún en las
áreas endémicas, en particular en el continente
americano.
Se calcula que en el sudoeste de los Estados
Unidos existen 10 millones de sujetos infecta­
dos por el C. immitis,^^^ y las encuestas realiza­
das en nuestro país acusan un índice de infec­
ción en la población infantil que varía entre el
10,6 y 19,72%.'2s-‘3o
En lo referente a histoplasmosis, la población
de la zona estadounidense del valle del Missis-
sippi-Missouri presenta un índice de infección
del 90% y se calcula que el número total de in­
fectados es de 40 millones. En la pampa húm e­
da argentina el porcentaje de infección es del 33
al 35%,*'^^ lo cual hace suponer la existencia de
6 millones de personas infectadas.
Las encuestas similares realizadas con antí­
genos del P. brasiliensis han demostrado, se­
gún las zonas endémicas, índices de positividad
de las pruebas cutáneas que varían entre el 9,2
y el
Desde hace poco tiempo se cuenta con un
reactivo eficaz para reacciones intradérmicas
del C ryptococcus neoform ans’,'^'^ un estudio
realizado en Oklahoma demostró 19% de reac­
tores positivos entre 477 personas sanas,*
14,1% en Córdoba (Argentina) y 2% en la ciu­
dad de Sao Paulo (Brasil).
En contraste con la alta frecuencia de la in­
fección, los casos clínicos evolutivos de estas
micosis sistémicas son relativamente raros; por
ejemplo, la prevalencia de la paracoccidioido-
Inmunología de las micosis 497
micosis en la zona endémica de la Argentina ha
sido calculada en uno de cada 1 0 0 . 0 0 0 habitan­
tes por año.*'”’ Esta desproporción indica, por
una parte, deficiencias de diagnóstico y de de­
nuncia y, por otra, la existencia de numerosas
infecciones subclínicas.
La edad, el sexo, la profesión, la raza y los
hábitos constituyen factores predisponentes p a­
ra la presentación de las formas progresivas de
m icosis-enferm edad. Es más frecuente en la
edad media, entre 30 y 60 años. El sexo m ascu­
lino es más atacado que el femenino; la d ife­
rencia varía según la micosis y las zonas endé­
micas. En la Argentina, la incidencia en el sexo
masculino en relación con el femenino es m á­
xima en la paracoccidioidomicosis (70:1), le si­
guen la histoplasmosis (40:1), la coccidioido-
micosis (4:1), y la criptococosis (2 : 1 ),
La diferente susceptibilidad según el sexo
fue atribuida a razones profesionales, pero esta
explicación resulta poco plausible ya q u e la
proporción de infectados es aproximadamente
igual en ambos sexos. Mucho más lógico resul­
ta aceptar la existencia de factores hormonales;
al respecto se ha demostrado que los estróge­
nos inhiben el desarrollo del P. brasiliensis y
del H. capsulatum, aunque en concentraciones
más elevadas que las presentes en los tejidos
humanos,'^® Se ha comprobado que en el cito­
plasma de la fase filamentosa del P. brasilien­
sis existen receptores para estrógenos que im­
piden su transformación a la fase levadurifor-
me, que los fagocitos provenientes de animales
hembras son más eficaces,'^'’ y que los hám ster
hembras son más resistentes que los machos a
la infección por el Blastomyces derm a titid isy
Las tareas rurales, por su m ayor contacto
con la fuente de infección, constituyen un fac­
tor predisponente, pero cabe destacar la exis­
tencia de casos urbanos de histoplasm osis y
criptococosis.
La importancia de la raza ha sido señalada
en la coccidioidomicosis,*^'' ya que los indivi­
duos de piel oscura presentan formas disem ina­
das con mayor frecuencia; en la histoplasmosis,
por el contrario, las formas pulmonares evoluti­
vas son 24 veces más frecuentes en los blancos
que en los negros,*^* Aún no han sido confirm a­
do que haya una mayor incidencia de la para­
coccidioidomicosis entre los eslavos y sajones.
En relación con los hábitos, cabe destacar
una elevada frecuencia de alcohólicos entre los
pacientes con micosis sistémicas graves.
Ciertas enfermedades preexistentes pueden
actuar favoreciendo la diseminación de la his-
toplasm osís o la aparición de formas m e n ín ­
geas en la criptococosis, como sucede con los
lin fo m a s, la e n fe rm e d a d de H o d g k in y el
SIDA, La criptococosis es la micosis sistémica
asociada al SIDA que se observa con mayor
498 Inmunopatología
frecuencia. A ctualm ente en el Hospital F. J.
Muñiz de la ciudad de Buenos Aires, se inter­
nan 90 nuevos casos por año, en tanto que an­
tes de la pandemia sólo se observaban 3 o 4 ca­
sos en igual lapso. En el mismo nosocomio se
diagnosticaron en 1994, 48 casos de histoplas­
mosis progresiva diseminada, de los cuales 40
se asociaron al SIDA. Se ha comprobado que la
administración de corticoides y drogas citotóxi­
cas pueden exacerbar m icosis laten tes, por
ejemplo, histoplasmosis, coccidioidomicosis y
criptococosis.’'’
Aspectos inmunológicos de las micosis
sistémicas
Las pruebas cutáneas; su valor pronóstico
y diagnóstico
Las pruebas cutáneas en las micosis sistémi­
cas son realizadas en form a sem ejante a la
reacción de Mantoux en la tuberculosis. Los
antígenos empleados: histoplasmina, eoccidioi-
dina, paracoccidioidina, se preparan según téc­
nicas estandarizadas que han sido descritas por
diversos a u t o r e s . Recientemente, se ha
insistido en la mayor sensibilidad de los antíge­
nos obtenidos a partir de la fase parasitaria de­
sarrollada in vitro, tanto en C. immitis como en
H. capsulatum y P. brasiliensis?'^-'^^’''^'^''^'^'^
La potencia antigénica de cada lote debe ser
probada en animales infectados experimental­
mente y en humanos cuya capacidad reactiva
sea conocida, ya que se carece por el momento
de métodos químicos útiles para tal fin.''^*
Las intraderm orreacciones son leídas a las
24, 48 y 72 horas y su resultado se expresa en
milímetros del área de induración. Actualmente
se aconseja realizar una primera lectura entre
las 2 y 6 horas, para excluir cualquier posibili­
dad de fenómeno de Arthus que podría falsear
el resultado;’'* asimismo, hay casos raros en que
estas pruebas se tornan positivas 4 o 5 días des­
pués de su realización.'®'’
Estas reacciones de hipersensibilidad retar­
dada se hacen presentes entre los 15 y los 40
días siguientes a la infección, se mantienen po­
sitivas muchos años, habitualmente toda la vi­
da, pero con frecuencia declinan después de los
60 años. La reacción cutánea positiva indica,
por lo tanto, infección actual o pasada. Es de
gran utilidad para el estudio de las áreas endé­
micas, pero su valor diagnóstico de infección
actual se limita a los siguientes casos: 1 ) cuan­
do se com prueba en lactantes; 2 ) cuando se
asiste al viraje de la reacción de negativa a po­
sitiva, y 3) cuando aparece en una persona que
no ha habitado anteriormente en zona endémi­
ca y que no presenta reacciones fuertem ente
positivas con otros antígenos fúngicos.^
Se pueden com probar reacciones cruzadas
entre los diversos agentes causales de micosis
sistémica a causa de la existencia de antígenos
semejantes. Sin embargo, las pruebas son más
intensas con el antígeno homólogo; por lo tan­
to, es aconsejable realizar las intradermorreac­
ciones con todos ellos y considerar positivo só­
lo a aquel que proporciona la pápula más ex­
tensa. La frecuencia de las reacciones cruzadas
disminuye con el empleo de antígenos diluidos;
por ello se aconseja utilizar la dilución óptima,
que es la m ínim a concentración del reactivo
que p ro p o rc io n a un elevado p o rc en taje de
pruebas cutáneas positivas en sujetos que su­
frieron la infección y en animales infectados
experimentalmente.
Los estudios histológicos de las pruebas cu­
táneas positivas han demostrado que el infiltra­
do está constituido por cúmulos de células mo­
n onu cleares, en esp ecial lin fo cito s, que se
agrupan alrededor de los vasos sanguíneos y
los anexos cutáneos, tanto en la dermis como
en la hipodermis; se observa, además, vasodila­
tación y edema. Con la paracoccidioidina''’®y,
en algunos casos, con la c o c c i d i o i d i n a , s e
comprobó eosinofilia.
En las formas evolutivas de las micosis sisté­
micas, el resultado de las intradermorreaccio­
nes tiene gran interés pronóstico, pues su nega­
tividad es índice de gravedad y de tendencia a
la diseminación hematógena.
En la coccidioidomicosis se ha demostrado
que el empleo de diversas diluciones de cocci-
dioidina hace de la reacción cutánea una prue­
ba, en cierta form a cuantitativa, que perm ite
m edir la hipersensibilidad, la cual guarda un
estrecho paralelismo con la capacidad del suje­
to para resistir la infección.^^'
Se ha podido demostrar que el 30% de las
histoplasmosis*'*'’ y el 51% de las paracocci-
dioidomicosis diseminadas graves*” presentan
intraderm orreacciones negativas con la dilu­
ción óptima del antígeno homólogo. La mayo­
ría de estos pacientes viraron hacia la positivi­
dad, muchas veces intensa, después de la cura­
ción merced a un tratamiento adecuado.
En los casos asociados al SIDA, en los cua­
les este viraje de negativo a positivo es im posi­
ble por la ausencia de un número adecuado de
células TCD^ positivas, debe instituirse un tra­
tamiento supresivo para evitar las recaídas. Es­
ta misma conducta se debería adoptar en otros
enfermos que sean incapaces de recuperar la
positividad de la prueba cutánea específica.
La inmunidad mediada por células
Se han establecido numerosas alteraciones
de la inmunidad mediada por células en los en­
fermos que padecen micosis sistémicas; la gra­
 Inmunología de las micosis 499

vedad de aquéllas es proporcional a la severi­ d o s . S e observa, en las formas graves y di­

dad de la afección. seminadas, una declinación de los niveles de
Las anormalidades comprobadas son las si­ linfoquinas en respuesta a la interleuquina 2
guientes: 1 ) pruebas cutáneas de hipersensibili­ (IL-2), así como una menor producción del fac­
dad retardadas negativas, tanto con el antígeno tor de necrosis tumoral (FNT) y del interferón-Y
específico como con otros a los cuales gran (IFN-y), este último es un importante activEidor
parte de la población reacciona positivamente, de los macrófagos^'^“ Se piensa que la dism inu­
como candidina, PPD y tricofitina;^-*’^'"''''*^’ 2) ción de células CD^ en la sangre circulante es,
ausencia de respuesta cutánea a la fitohemaglu- al menos en parte, debida a que estas células
tinina;'^'*-'^'’ 3) incapacidad para adquirir sensi­ quedan atrapadas en los granulomas.
bilización frente al dinitroclorobenzeno;"''''^'* ’^’' Entre las células que actúan como m ecanis­
4) disminución de la transformación linfoblás- mos defensivos naturales deben destacarse las
tica y captación de timidina tritiada frente al asesinas naturales (NK). Estas se unen a la pa­
antígeno específico, la candidina y la fitohema- red celular de algunos hongos patógenos por
glutinina;*^-^-"’'''*’ 5) presencia en el plasma de medio de microvellosidades y producen citoli-
un factor inhibidor de la transformación blásti­ sina y perforinas que destruyen las células fún-
ca que no está relacionado con los anticuerpos gicas. Estas interacciones han sido particular­
esp ecífico s, se tra ta ría de una a.2 globuli- mente bien estudiadas entre las NK y el C. neo-
na;i24,i6i 5 ^ ausencia del factor inhibidor de la formans."'^’''
migración de monocitos en tubo capilar (MIF) Los macrófagos parecen desempeñar un pa­
frente al antígeno específico y la candidina;’^'* pel relevante en la defensa contra la m icosis.
7) disminución del porcentaje de linfocitos T Se ha comprobado que los macrófagos del exu­
en sangre periférica, determinado por la técnica dado peritoneal de ratones inmunizados con H.
de form ación de rosetas en casos capsulatum poseen una fagocitosis mucho más
graves puede haber una inversión de la propor­ activa que los de animales no inmunes y que
ción de linfocitos T cooperadores CD^supreso- dicha propiedad es mediada por los linfocitos T
res CDg, y 8 ) prolongación del tiempo de su­ sensibilizados.®’ ® Estos actúan por m edio de
pervivencia de los injertos cutáneos no autólo- algunas citoquinas, particularm ente el IFN -y
gos,‘- disminución del numero de linfocitos T que es un potente activador de los maerófago-
en el área paracortical de los ganglios linfáticos s 212a Lqj, mononucleares inhiben el desarrollo
y reducción del tamaño de sus folículos."'’ del H. capsulatum al provocar alteraciones en
La pérdida de funciones de los linfocitos T la síntesis de sus proteínas, pero el mecanismo
parece seguir un orden progresivo. Inicialmen­ íntimo por el cual actúan es desconocido.’®Por
te se pierde la capacidad de sensibilización al el contrario, es sabido que los polimorfonuclea­
dinitroclorobenzeno; más tarde se tornan nega­ res ejercen su acción deletérea sobre estos gér­
tivas las pruebas cutáneas de hipersensibilidad menes mediante diversos elementos: pH ácido,
retardada con antígenos microbianos, en parti­ lisozima, mieloperoxidasa, fagocitina, histona
cular con el específico de la micosis que aqueja y otras proteínas catiónicas. El estudio de la ca­
al paciente; luego se comprueba depresión de pacidad fagocitaria y lítica de los leucocitos de
la transformación linfoblástica frente a la fito- sangre periférica obtenidos de 17 pacientes con
hemaglutinina, y la última función en alterarse paracoccidioidomicosis frente al P. hrasiliensis
es la capacidad para rechazar injertos heterólo- y R hodotorula spp., dem ostró que aq u éllas
gos.'*-^-'^^ eran adecuadas y que el suero de los enfermos
Algunos pacientes pueden modificar su esta­ poseía opsoninas estim ulantes de dicha fun­
do inmunológico desde una inmunodeficiencia ción.'*-"’ El estudio de la capacidad fagocitaria y
acentuada a una inmunocompetencia satisfac­ lítica de los macrófagos y leucocitos polim or­
toria por medio del tratamiento adecuado. T o­ fonucleares de sangre periférica en pacientes
das las alteraciones de la respuesta celular, tan­ portadores de formas graves de paracoccidioi­
to in vivo como in vitro, son más acentuadas domicosis e histoplasmosis, ha perm itido ob­
con el antígeno específico’'"* y la recuperación servar que estas funciones están deterioradas
de la reactividad cutánea frente a éste se asocia durante la progresión activa de la enfermedad y
con la remisión de la enfermedad. que se recuperan parcialm ente con el trata­
Todo parece indicar que el déficit de la inm u­ miento exitoso de estas micosis."-*’
nidad mediada por células se debe a varios fac­
tores: formación de com plejos antígeno-anti- La inmunidad humoral,
cuerpo-complemento; exceso de antígeno libre las inmunoglobulinas y las reacciones
que estimula las poblaciones de linfocitos T su­ serológicas
presores CDg y aumento de las globulinas a que
actúan como un factor inhibidor de la transfor­ Los estudios de la inmunidad humoral han
mación blástica de los linfocitos T sensibiliza­ demostrado que los pacientes con micosis sis-
500 Inmunopatología
témicas no exhiben deficiencias en cuanto a la
producción de anticuerpos y que la realización
de pruebas serológicas presenta un importante
valor diagnóstico y pronóstico en estas enfer­
medades.
Las reacciones serológicas más frecuente­
mente empleadas son la precipitación en tubo,
la aglutinación de partículas de látex sensibili­
zadas con antígenos fúngieos, la fijación de
complemento, la inmunodifusión, la contrain­
m unoelectroforesis y las pruebas de ELISA
(enzimoinmunoensayo); el empleo conjunto de
dos o más de estas técnicas permite el diagnós­
tico serológico de más del 90% de los procesos
evolutivos.
Los antígenos empleados son diversos: fil­
trados del desarrollo en medios líquidos, des­
pués de 6 a 9 meses de incubación estática"®® o
de 4 semanas en agitador mecánico,'® sobrena­
dante de células levaduriformes rotas por ultra­
sonidos o procedimientos mecánicos de ruptu­
r a , U s a d o s de m icelio joven con toluol al
3%,"’'* exoantígenos, que son extractos acuosos
de levaduras o hifas sin romper, obtenidos des­
pués del contacto de agua destilada con mertio-
lato de sodio l/1 0.000, durante 24 horas con
las colonias fúngicas, o fracciones parcialmen­
te purificadas por precipitación con alcohol,
acetona u otras técnicas, que consisten por lo
general en polisacáridos n i t r o g e n a d o s . E n
realidad, estos preparados son un mosaico del
cual pueden separarse numerosas parcelas por
eleetroforesis, algunas de ellas dotadas de gran
e s p e c i f i c i d a d . P o r ejemplo, de la paracoc­
cidioidina pudo purificarse una glucoproteína
de 43kD que ha sido exitosamente empleada en
varias pruebas serológicas, incluso en una de
unión inmunológica en gota (“dot immunobi-
ding assay”) que resultó muy económica y efi­
caz,220a
De la histoplasmina se han obtenido 2 gluco­
proteínas de gran especificidad, la M posee
55% de carbohidratos y su PM es de 150 kD,
en tanto que la H pesa 120 kD y contiene 32%
de carbohidratos.
En las prim oinfecciones sintom áticas, las
reacciones de precipitación en tubo (PT) se tor­
nan positivas 4 a 7 días después del contacto
infectante. Alcanzan su título máximo a las 2 o
3 semanas y se negativizan entre 1 y 5 meses
más ta rd e .G e n e ra lm e n te no tienen valor pro­
nóstico pues se tornan negativas en el plazo in­
dicado, aun en aquellos casos que evolucionan
hacia la diseminación.’^'*
En la paracoccidioidomicosis la PT es positi­
va en el 1 0 0 % de los casos con menos de 1 año
de evolución; es la primera reacción serológica
en negativizarse después de la curación clínica
y la más precoz en tornarse positiva en las reci­
divas.^'’ Su principal inconveniente lo constitu­
ye la difícil lectura a causa del fino precipitado-
producido.
Las reacciones de aglutinación de partículas
de látex (AL), sensibilizadas con antígenos fil­
trados (histoplasmina y coccidioidina), son más
sensibles y de lectura más fácil que la PT. Se
las ha empleado como sustituto de la precipita­
ción, pero producen con mayor frecuencia re­
sultados falsos positivos.’^
Las pruebas de fijación de com plem ento
(PFC) se positivizan más tardíamente, después
de. 1 mes o más del contacto infectante. En las
primoinfecciones leves, la PFC permanece ne­
gativa y se torna positiva sólo en las moderadas
o graves. En las formas diseminadas, su título
aumenta en proporción a la severidad de la en­
fermedad y cae gradualmente al producirse la
curación clínica por el tratamiento adecuado,
hasta negativizarse varios meses o un par de
años después.^®' En general, estos anticuerpos
son persistentes y pueden quedar cicatrices se­
rológicas, con títulos bajos, en pacientes clíni­
camente c u r a d o s . E n los casos no controla­
dos por el tratamiento, los anticuerpos aumen­
tan hasta alcanzar niveles muy elevados y, fi­
nalmente, descienden en forma brusca poco an­
tes de la muerte.*'*^
La técnica de esta prueba ha sido estandari­
zada, **° y para confeccionar curvas serológicas
se aconseja su repetición cada 8 semanas.
En algunas oportunidades, la interpretación
de los resultados de la PFC es difícil a causa de
la existencia de reacciones cruzadas con antíge­
nos de otros hongos; también se pueden obser­
var pruebas positivas en sujetos sanos que han
sido sometidos recientemente a pruebas cutá­
neas, en especial con histoplasmina.**"” En es­
tos casos, los títulos son habitualmente bajos,
1 /8 o 1/16, y casi siempre se los com prueba
con los antígenos de la fase levaduriforme.®^
En la p a ra co ccid io id o m ico sis in fa n til la
prueba de fijación de complemento suele ser
negativa, aun en casos muy graves.
La inmunodifusión en gel de agar (ID) es el
método serológico más empleado en las mico­
sis a causa de su técnica sencilla y resultados
específicos;®^'’*' ha sido estandarizada por la
Oficina Sanitaria Panamericana.
Sus resultados coinciden con los de la PFC,
y el empleo simultáneo de ambas reacciones es
aconsejable ya que la ID está dotada de una
mayor especificidad a causa de su menor sensi­
bilidad, en tanto que la PFC permite una mejor
cuantificación. La frecuencia de reacciones
cruzadas con otros antígenos fúngieos en la ID
es sólo del 1 o
Los sueros de pacientes con histoplasmosis
presentan dos bandas de precipitación con la
histoplasmina, llamadas H y M cuyas caracte­
rísticas fisicoquímicas ya han sido comentadas.

La banda H indica actividad lesiona! y no es in­
fluida por la prueba cutánea, en tanto que la M
puede aparecer en el suero de personas sanas
que hayan tenido recientemente una prueba cu­
tánea positiva con histoplasmina.®^’*’-
La paracoccidioidina presenta 3 bandas de
precipitación con los sueros de enfermos con
paracoccidioidomicosis, una de ellas de reac­
ciones cruzadas con la banda M de la histoplas-
mina.'**"* Como ya señalamos el principal com ­
ponente antigénico es una glucoproteína de 43
kD (gp 43).
La ID ha permitido separar 4 componentes
antigénicos en la eoccidioidina, la banda 1 co­
rresponde al antígeno que es responsable de la
aglutinación del látex y la 2 al que produce la
fijación del complemento.'"* Pudo demostrarse
que calentando la coccidioidina a 60°C durante
30 minutos, se elimina la fracción 2 responsa­
ble de la fijación de complemento y que tam ­
bién da resultados positivos frente a IgG espe­
cífica en reacciones de inmunodifusión en gel
de agar. E m pleando esta últim a técnica con
coccidioidina sin calentar puede ponerse en
evidencia la IgM e s p e c í f i c a . S e demostró
que la ID puede ser cuantificada mediante el
empleo de diluciones de suero y que sus títulos,
aunque inferiores, son proporcionales a los de
la PFC.'3s.'35.i‘*8
La contrainm unoelectroforesis es una v a ­
riante de la ID que ha sido empleada en el sero-
diagnóstico de las micosis a causa de la facili­
dad que otorga su rápida lectura.^’''’®-'’''
Su utilización se ha generalizado en los últi­
mos años en virtud de su mayor sensibilidad y
gran e s p e c i f i c i d a d . P u e d e utilizársela aisla­
damente o combinada con la inm unodifusión
secundaria, lo cual permite demostrar la exis­
tencia de parcelas antigénicas de migración ca-
tódica.’-^^^ El agregado de 1% de polietilengli­
col 6 . 0 0 0 al gel de corrida torna a esta reacción
muy s e n s i b l e . L a realización de pruebas de
inmunodifusión en gel de agar o contrainm u­
noelectroforesis con el empleo de sueros patro­
nes positivos o sueros m onoespecíficos que
reaccionan contra parcelas antigénicas de apa­
rición frecuente, ha dotado a estas técnicas de
una gran especificidad.
Recientemente se han ensayado nuevas téc­
nicas serológicas dotadas de mayor sensibili­
dad, como el ELISA. También en esta micosis
se han ensayado la inmunodifusión radial y la
aglutinación de partículas de látex.*’®'**’
El radioinm unoensayo para detectar a n ti­
cuerpos antiantígeno M en histoplasmosis ha
sido empleado con éxito.*''*
Se necesita aún una mayor experiencia para
valorar la utilidad definitiva de estas pruebas.
La inmunodifusión radial y la inmunodifusión
com parativa con antisueros m onoespecíficos
Inmunología de las micosis 501
parecen destinados a tener una amplia aplica­
ción en el serodiagnóstico de estas micosis.
Los resultados de las pruebas de ELISA y
RIA en las micosis sistémicas son aún difíciles
de interpretar debido a que su mayor sensibili­
dad va en desmedro de su especificidad.
Los resultados de las reacciones serológicas
en la criptococosis han sido bastante equívocos
a causa de la existencia de un estado de no res­
puesta inmunológica, producido por exceso de
antígeno polisacárido liberado por C. neofor-
m ans.'^' M ediante una com binación de tres
pruebas se ha conseguido alcanzar el diagnósti­
co serológico del 92% de los casos comproba­
dos por cultivos.*'’•**■**•*-'’ Para detectar la p resen­
cia de anticuerpos circulantes se emplean la in­
munofluorescencia indirecta y la aglutinación
en tubo; la primera es más sensible y la últim a
más específica. La presencia de polisacárido
capsular en el suero, líquido cefalorraquídeo u
otros fluidos se demuestra por la aglutinación
de partículas de látex sensibilizadas con suero
de conejo anticriptococo.*^ También se puede
utilizar con este propósito un ELISA cuyos re­
sultados coinciden con los de la aglutinación
del látex en más del 95% de las muestras.
En los casos en los cuales la investigación de
anticuerpos es negativa y la de polisacárido
capsular positiva, el pronóstico es malo; p o r el
contrario, la negativización de la prueba del lá­
tex para polisacárido capsular es índice de m e­
joría. Se han podido demostrar antígenos espe­
cíficos en el suero y la orina concentrada de en­
fermos graves con histoplasmosis y paracocci­
dioidomicosis. Para la primera se emplea un ra­
dioinmunoensayo con anticuerpos m onoclona­
les contra una glucoproteína de la pared del H.
capsulatum, esta reacción es positiva en el 90%
de los casos asociados al SIDA^^*“ En la para­
coccidioidom icosis se comprobó la presencia
de la gp 43 en el suero de enfermos graves, m e­
diante el empleo del “Western blott”.**'>''
Las micosis sistémicas graves muestran alte­
raciones del proteinograma, que consisten en
dism inución de la albúm ina y aum entos del
porcentaje de globulinas a expensas de las a ,,
y y-globulinas, en tanto que las ¡3-globulinas
y la cifra total de proteínas séricas se m antie­
nen norm ales. Estas alteraciones son p ro p o r­
cionales a la gravedad y la extensión de la en-
ferm edad.7'‘>-«-**>3.*s«>,i38,)58
Los niveles de IgM determinados por medio
de inmunodifusión radial están elevados en las
primoinfecciones moderadas o graves de histo­
plasmosis y su tenor guarda relación con los tí­
tulos de la PT y la AL.^^ La positividad de estas
reacciones depende de un anticuerpo específico
19 S. En un estudio realizado en B rasil por
Mota y Franco"’ no fue posible demostrar va­
lores elevados de IgM en la paracoccidioidomi-
502 Inmunopatología
cosis y no hubo relación entre el nivel de esta
inmunoglobulina y la forma clínica presentada
por el paciente. Por lo tanto, el significado de
anticuerpos IgM en esta afección necesita aiín
ser establecido.
Por el contrario, el anticuerpo responsable de
la ID y la PFC es una IgG; los niveles de esta
inmunoglobulina están elevados en las formas
crónicas y guardan correlación con los títulos
de las re a c c io n e s s e r o l ó g i c a s m e n c i o n a ­
d a s . E n las histoplasm osis crónicas,
particularmente las que presentan participación
pulmonar, hay aumento de la IgA.^^
Aspectos histopatológicos vinculados
a la reacción huésped-parásito
Los estudios histopatológicos realizados en
la paracoccidioidomicosis, tanto experimental
como humana, han demostrado que las carac­
terísticas del proceso inflamatorio, así como la
morfología del parásito, están influidos por el
estado inmunoalérgico del huésped.’-'**’'^^-'-’* *®
En la fase aguda, cuando aún no se ha instala­
do la inmunidad adquirida, y en los procesos
evolutivos graves, predominan las lesiones su­
purativas y necróticas, y no existe una adecua­
da barrera conjuntivo-histiocitaria. En estos
casos, el P. hrasiliensis se m ultiplica lib re ­
mente y se observa la brotación múltiple acele­
rada (criptoesporulación) que le confiere el as­
pecto típico de rueda de timón. Por el contra­
rio, en las formas crónicas cuando el huésped
ofrece una mayor resistencia, predominan los
procesos productivos con formación de granu­
lomas foliculares, de células epitelioides y gi­
gantes, con los que pueden coexistir áreas de
supuración. Las células gigantes y los macró­
fagos engloban al hongo y retardan su evolu­
ción o lo destruyen: se comprueban en estos
casos formas catenuladas o de brotación sim ­
ple y aun parásitos con alteraciones morfológi­
cas visibles y sin brotes. La etapa final de este
proceso es la cicatrización fibrosa y, más rara­
mente, la calcificación.'’
Hace poco tiempo se comprobó la presencia
de IgG y C3 en los granulomas productivos. Lo
que parece indicar que la formación de comple­
jos antígeno-anticuerpo-compleraento desem ­
peña un papel im portante en la formación de
estos granulomas. En realidad el papel desem­
peñado por las inmunoglobulinas y el comple­
mento, así como el de ia inmunidad humoral en
general, ha dado lugar a varias hipótesis. Po­
drían cooperar con la destrucción de los hongos
in situ al opsonizar las eélulas fúngicas y po­
drían im pedir el escape de antígenos h acia
afuera de los granulomas.
En la coccidioidom icosis experim ental se
han comprobado las mismas alteraciones infla­
matorias en relación con el estado defensivo
del huésped.
El C. immitis form a esporangios grandes,
con endosporos pequeños, am eboides y d is­
puestos en una franja de citoplasma periférico
(esporangio de primoinfección), en el seno de
las lesiones supurativas, cuando las defensas
son nulas. A la inversa, cuando se encuentra
dentro de un proceso inflamatorio productivo
con células gigantes y macrófagos, el esporan­
gio es más pequeño, posee una pared celular
más gruesa, y todo su interior se encuentra ocu­
pado por endosporas menos numerosos pero de
mayor tamaño (esporangio quístico); también
puede verse una corona de radiaciones acidófi-
las que rodea el esporangio y cuya aparición
coincide con la de los anticuerpos circulan­
tes.
En la histoplasmosis, los casos graves con
escasas defensas presentan una hiperplasia his-
tiocitaria simple con numerosos parásitos o hay
necrosis caseosa masiva. Como en las afeccio­
nes anteriores, en los procesos más defensivos
aparece el granuloma tuberculoide, disminuye
el número de hongos y hay una tendencia a la
cicatrización fibrosa.’'-'^’’'’^
Inmunógenos vacunantes e inmunoterapia
en las micosis sistémicas
No se dispone en la actualidad de vacunas
para uso humano, pero todo parece indicar que
se contará con ellas en un futuro no muy leja­
no. En la coccidioidomicosis se han ensayado
diversos tipos de inmunógenos: los esporangios
muertos poseen un poder protector satisfacto-
rio.‘^-’ Recientemente se ha comprobado que los
ribosomas de la fase levaduriforme del H. cap­
sulatum aumentan la tasa de sobrevida en los
ratones som etidos a la infección experim en­
tal.'*'’
Los efectos del factor de transferencia obte­
nido de leucocitos de sujetos coccidioidina-po-
sitivos sobre las pruebas de hipersensibilidad
retardada, realizadas tanto in vivo como in vi­
tro, demostraron que es capaz de transmitir el
estado de sensibilización a sujetos vírgenes de
i n f e c c i ó n . H echos sim ilares fueron
comprobados en histoplasm osis y paracocci­
dioidomicosis
Una revisión de los efectos de la aphcación
del factor de transferencia en la coccidioidomi­
cosis disem inada-" mostró que, sobre 40 pa­
cientes tratados, 80% recuperó la capacidad de
producir linfoquininas, 75% adquirió respues­
tas blastogénicas norm ales de sus linfocitos,
50% presentó pruebas cutáneas que viraron ha­
cia la positividad y 60% exhibió mejorías clíni­
cas. El factor de transferencia dejó de producir­
se por el peligro de transmitir el HIV.

La aplicación de inmunoestimulantes como
el levamizol ha demostrado que puede recupe­
rarse la capacidad reactiva de los linfocitos T
tanto in vivo como in vitro, pero su efecto so­
bre la evolución de la enfermedad necesita aún
más pruebas.
El mayor interés se ha centrado en el IFN-y
que ha demostrado su utilidad en el tratam ien­
to de varias infecciones debidas a microorga­
nismos intracelulares con patogenia y m eca­
nismos defensivos semejantes a los de las m i­
cosis sistémicas endémicas. Su eficacia en va­
rias micosis experim entales ha sido com pro­
bada, pero resta aún por establecer en forma
definitiva su acción en las micosis humanas,
así como la dosis y la frecuencia de su aplica-
C i0 n .1 4 ii.2 1 2 a
La inmunoterapia de las micosis sistémicas
constituye pues un promisorio campo de inves­
tigación clínica que debe ser más explorado.
Conclusiones
De lo expuesto se deduce que el principal
mecanismo defensivo contra las micosis sisté­
micas lo constituye una adecuada inmunidad
celular, ya que la depresión de ésta condiciona
la aparición de m icosis-enferm edad. Por el
contrario, la inmunidad humoral no parece con­
tribuir en forma clara como mecanismo defen­
sivo, pues los pacientes portadores de formas
clínicas severas presentan niveles normales o
aumentados de inmunoglobulinas y la produc­
ción de anticuerpos se encuentra exaltada; por
otra parte, los sujetos con agam m aglobuline­
mia pero con inmunidad celular normal no es­
tán más predispuestos que los normales a pade­
cer micosis diseminadas.
La depresión de los linfocitos T puede pro­
ducirse por diversos factores, en especial por la
carga antigénica excesiva en primoinfecciones
severas; causas individuales como edad, sexo,
profesión, raza, condiciones socioeconómicas y
hábitos del paciente parecen también influir.
Ciertas enfermedades que producen depresión
de la inmunidad celular, como los linfomas, la
enfermedad de Hodgkin y el SIDA, favorecen
la aparición de micosis diseminadas graves. De
la misma forma actúan los corticoides, citostá­
ticos y las radiaciones.
Pese al avance de los conocimientos inm u­
nológicos, se ignora la razón por la cual se pro­
duce la falla de los mecanismos defensivos só­
lo en uno de cada 1 .0 0 0 infectados.
El sistem a de linfocitos tim odependientes
actúa sensibilizando a los macrófagos y tornán­
dolos más aptos para la fagocitosis; éstos, a su
vez, interfieren en la síntesis de proteínas por
parte del parásito, retardan su crecimiento y fi­
nalmente lo destruyen.
Inmunología de las micosis 503
El pronóstico de las micosis sistémicas p u e­
de establecerse sobre la base de cuatro elem en­
tos de juicio: 1 ) histopatología de las lesiones;
2 ) pruebas cutáneas con antígeno homólogo y
otros antígenos microbianos de uso común, co ­
mo PPD y candidina; 3) reacciones serológicas,
y 4) proteinograma. En las formas graves, la
histopatología muestra predominio de los p ro ­
cesos exudativo-necróticos con abundantes p a ­
rásitos, las pruebas cutáneas son negativas, las
reacciones serológicas se presentan positivas
con títulos elevados y el proteinograma m ues­
tra aumento de la proporción de globulinas, a ,,
y y. Lo inverso sucede en las formas más b e ­
nignas.
Resulta interesante consignar que estas alte­
raciones dependen, sobre todo, de un exceso de
antígeno, así como el atrapado de las células
CD^ en los granulomas epitelioides, ya que es
posible que el sujeto, al ser tratado adecuada­
mente, retorne a una inmunocompetencia n o r­
mal con la disminución de los hongos parásitos.
Seguramente la utilización de vacunas en la
profilaxis de esas afecciones, y el empleo de
inmunoterapia para favorecer el control de las
formas diseminadas, son las metas que ofrecen
para el futuro los estudios inmunológicos de las
micosis sistémicas.
IL MICOSIS OPORTUNISTAS
Se conocen con el nombre de micosis o por­
tunistas las afecciones producidas por hongos
que se comportan como saprófitos o com ensa­
les del hombre y forman parte de su flora n o r­
mal en el intestino, boca o árbol traqueobron-
quial o que integran la flora m icótiea del ai­
r e . E s t o s hongos aprovechan las oportunida­
des que les ofrece el huésped al disminuir su
capacidad defensiva, para invadir los tejidos y
producir alteraciones patológicas que pueden
llegar a provocar la muerte.
Esta definición lleva implícitos los siguien­
tes conceptos; 1 ) los hongos productores de m i­
cosis oportunistas poseen una amplia distribu­
ción en la naturaleza y pueden ser cultivados
frecuentem ente de materiales de personas sa­
nas; 2 ) su aislam iento no im plica de p o r sí
diagnóstico de enferm edad m icótiea, y 3) la
disminución de las defensas del huésped, que
se transform a prácticam ente en un medio de
cultivo, y no el aumento de la virulencia del
microorganismo constituye la causa principal
que determina la aparición de la enfermedad.'*®
Las micosis oportunistas presentan caracte­
rísticas que las diferencian de las micosis sisté­
micas producidas por hongos patógenos prim i­
tivos; son cosmopolitas. La edad, el sexo y la
profesión no constituyen causas predisponentes
504 Inmunopatología
de importancia; no existe un estado de micosis-
infección sin enfermedad, y sus agentes causa­
les son hongos monomorfos que poseen carac­
teres semejantes en Los cultivos y en los tejidos
parasitarios.'3'“’
Los factores predisponentes más frecuentes
son: diabetes, acidosis m etabólica (urém ica,
diabética, etc.), linfomas, leucemias, agranulo-
eitosis, SIDA, anem ias graves, tratam ientos
con antibióticos antibacterianos, corticoides,
inm unosupresores, c ito stático s y rad iacio -
26 ,1 35 ,17 4
Las m icosis oportunistas de presentación
más común son: candidiasis, aspergillosis y
mucormicosis (cigomicosis);^' mucho menos
habituales son las micosis producidas por Can­
dida glahrata'''-''^^''^'^, Nocardia asteroides^'
Trichosporon beigelii,'^'^\ Fusarium spp., Geo-
trichum candidium'^^^-'^'''’ y varias especies de
hongos negros.
Sólo nos referiremos a las tres primeras por
ser las de mayor importancia y las mejor estu­
diadas.
Micosis oportunistas más comunes
Candidiasis
Los hongos del género Candida son comen­
sales habituales de la superficie de la piel y las
mucosas. La especie más patógena, C. albicans,
es habitante frecuente de las mucosas del hom­
bre sano. Ha sido cultivado de las secreciones
de sujetos normales, en la boca y el intestino
(20 a 50%), en la vagina de la mujer no gestante
(10 a 17%) y de las embarazadas (25 a 34%). Ei
simple hecho de tomar antibióticos eleva el nú­
mero de portadoras vaginales de C. albicans de
10 a 34%."®''^^ Las otras especies de! género,
como C. tropicalis y C. parapsilosis, son culti­
vadas a partir de piel y uñas sanas.'**
Como consecuencia de causas predisponen­
tes locales, como humedad, maceración y tem­
peratura próxima a los 37“C, estos hongos son
capaces de producir micosis superficiales como
el muguet, estomatitis crónicas atróficas o hi­
pertróficas del adulto por el uso de prótesis
dentarias, boqueras, intertrigos de grandes y
pequeños pliegues cutáneos, onixis con perio-
nixis, onicolisis, vulvovaginitis, etc.
A lgunas causas de orden general pueden
también facilitar la aparición de estos procesos;
en primer término la diabetes subclínica, el uso
de anticonceptivos, de antibióticos de amplio
espectro y de dosis moderadas de corticoides.
En estos casos, y a pesar de las causas predis­
ponentes generales mencionadas, el huésped no
es un inmunodeficiente, tiende a limitar su in­
fección y responde al tratam iento local satis­
factoriamente.
Tanto en los individuos sanos como en los
que presentan candidiasis superficiales, están
intactos los mecanismos defensivos que perm i­
ten confinar las inspecciones producidas por
estos hongos a la superficie de los tegumentos.
En tal sentido, ha sido demostrado un factor
anticándida en el suero humano normal, cuyo
tenor es escaso o nulo en los pacientes afecta­
dos por linfomas, leucemias o neoplasias.'**^-''’'^
La transferrina,''® y en particular la relación
entre el hierro plasmático y ia transferrina li­
bre,^'* desempeñan un importante papel defensi­
vo. Shiraishi y col.™ demostraron que la acti­
vidad anticándida de la transferrina está rela­
cionada a su capacidad de unirse al hierro no
saturado y es estimulada por un factor sérico.
Se consideran además indispensables una
buena formación en cantidad y calidad de in­
munoglobulinas, tanto séricas como secreto­
rias, una adecuada respuesta inflam atoria, un
sistema de inmunidad celular íntegro, la pre­
sencia de factores quim iotácticos en el suero
(fracciones del complemento C3 y C4), opsoni­
zación satisfactoria y buena capacidad candici-
da de los polimorfonucleares neutrófilos'’'-'** y
los macrófagos.* Más recientemente se ha des­
tacado el papel desempeñado por las citoquinas
producidas por las células CD^ en respuesta a
la ÍLj, estas son especialmente el F N T -a y el
IFN -7 , el último un poderoso estimulante de la
actividad fungicida de los m acrófagos y los
neutrófilos.' 22“
Una de las afecciones de este grupo que ha
sido objeto de numerosos y detenidos estudios
inmunológicos es la candidiasis mucocutánea
crónica. El granuloma candidiásico fue la pri­
mera forma clínica reconocida de esta enferme­
dad.'’' Su aspecto clínico difiere del resto de las
candidiasis cutaneomucosas ya que las lesiones
se presentan como pápulas vascularizadas, cu­
biertas de gruesas escamocostras ubicadas en
las partes salientes del cuerpo (uñas, cuero ca­
belludo, región frontal, pómulos, etc.). Los pa­
cientes son habitualmente niños, con diversos
defectos inmunológicos y la muerte se produce
como consecuencia de infecciones sobreagre-
gadas.
Las otras candidiasis mucocutáneas crónicas
predominan también en la infancia, las lesiones
son extensas, miíltiples, de curso crónico y res­
ponden pobremente a los tratamientos locales.
Su aspecto clínico es idéntico al de una candi-
diasis común en cada una de las localizaciones,
excepto por su persistencia, extensión y falta
de respuesta al tratamiento,*'^ Se locahza en las
mucosas de boca, faringe, laringe y vagina, en
los pliegues cutáneos y en las uñas; no hay ata­
que visceral, ni se produce sepsis. Las candi­
diasis mucocutáneas crónicas han sido dividi­
das en los siguientes grupos,"®

C a n d id ia s is m u c o c u t á n e a c r ó n ic a
ASOCIADA A INMUNODEFICIENCIAS
1. A gam m aglobulinem ia de tipo suizo; es
una alteración hereditaria, ligada al cromosoma
X, de tipo autosómico recesivo. Presenta defec­
tos de la inmunidad celular y ausencia de for­
mación de inm unoglobulinas. Los pacientes
mueren muy pronto presa de infecciones seve­
ras.
2. Síndrome de Di George; falta de form a­
ción del 3®' arco branquial con agenesia dei ti­
mo y las paratiroides. Se producen signos de
ausencia de inmunidad celular e hipoparatiroi-
dismo.
3. Síndrom e de N ezelof-A llibone; es una
displasia tímica hereditaria con carácter autosó­
mico recesivo.
4. Enferm edad granulom atosa crónica; es
una afección hereditaria ligada al cromosoma
X, se presenta con carácter autosómico recesivo
y se traduce en defectos funcionales de los leu­
cocitos polimorfonucleares.^'* ( Para más deta­
lles véase cap. 23.)
Podrían incluirse aquí a los pacientes con
SIDA, que presentan con frecuencia candidiasis
orales y esofágicas muy severas, recidivantes y
que retroceden lentam ente con antimieóticos.
Igualmente ha podido comprobarse que las can­
didiasis vaginal recurrente, afección muy co ­
mún entre la menarca y la menopausia y que
consiste en al menos cuatro episodios documen­
tados de candidiasis vaginal por año, es debida
a una alteración de la inmunidad mediada por
células. Esta parece consistir en una deficiente
capacidad fagocitaria y lítica de los macrófagos
de sangre periférica producida por la formación
insuficiente de IFN -a en las células CD^.*"
C a n d id ia s is m u c o c u t á n e a c r ó n ic a ,
COMO e n f e r m e d a d PREDOMINANTE
1. C andidiasis m ucocutánea crónica fam i­
liar; afecta a ambos sexos, predominan las m a­
nifestaciones orales y ungueales, y se encuen­
tran alteraciones de la inmunidad celular.
2. Candidiasis mucocutánea crónica difusa;
presenta las típicas alteraciones del granuloma
candidiásico; los pacientes padecen con fre­
cuencia infecciones por otros gérmenes tales
como tiñas por Microsporum catiLs y procesos
piógenos de las vías aéreas superiores y del oí­
do.
3. Síndrome endocrino-moniliásico; es una
afección hereditaria con carácter autosómico
recesivo y los defectos endocrinos son hipopa-
ratiroidism o, hipotiroidism o e hipocorticalis-
mo, que se presentan ya sea en forma aislada o
en conjunto.
Inmunología de las micosis 505
4. Candidiasis mucocutánea crónica de p re­
sentación tardía; son los casos que aparecen
después de los 35 años; ias causas predisponen­
tes son diabetes, corticoterapia, inm unosupre­
sores o tumores malignos. Se ha destacado par­
ticularmente su asociación con timomas.^^'* E s­
tos enfermos no presentan una falla de la inm u­
nidad celular selectiva sino global y se co m ­
prueba con frecuencia la presencia de autoanti­
cuerpos.
En la mayor parte de los casos de candidiasis
mucocutánea crónica, la iniciación se produce
antes de los 20 años. Los enfermos presentan
diversas alteraciones de la inmunidad celular,
pero la formación de inmunoglobulinas es nor­
mal; es común la aparición de infecciones bac­
terianas del árbol traqueobronquial, displasias
dentarias, enfermedad poliquística del pulmón,
esteatorrea, hepatitis crónica, queratoconjunti-
vitis, defectos ectodérmicos diversos, endocri-
nopatías y la presencia de autoanticuerpos, en
particular factor reumatoideo.*^’ Cón frecuencia
la muerte se produce antes de los 30 años, y si
bien se consiguen remisiones importantes con
la aplicación de anfotericina B por vía venosa y
la 5-fluorocitosina o el ketoconazol p o r vía
oral, las recidivas son muy comunes y las cura­
ciones definitivas son raras.
Los defectos inmunológicos deben ser per­
fectamente diagnosticados a fin de proporcio­
nar al paciente la terapéutica sustitutiva ade­
cuada. Para ello se debe seguir el p lan que
enunciam os a continuación; 1) pruebas cutá­
neas con candidina, PPD, estreptoquinasa-es-
treptodornasa (Varidasa), antígeno de saram ­
pión e histoplasmina;^^-^^’’^'’'^^® 2) prueba de sen­
sibilidad al dinitroclorobenceno; 3) recuento de
linfocitos periféricos (número total) y porcenta­
je de linfocitos T determinado por el m étodo de
las rosetas E,^^” así como de las subpoblaciones
de linfocitos T por inm unofluorescencia con
anticuerpos monoclonales CD^ y CD^; 4) inhi­
bición de la migración de macrófagos en tubo
capilar frente a candidina (MIF); 5) prueba de
transformación linfoblástica con timidina mar­
cada frente a fitohemaglutinina, candidina y
PPD, y 6) estudio de la función fagocitaria y
candicida de los leucocitos polimorfonucleares
y m a c r ó f a g o s . R e s p e c t o a estos últimos
hay que estudiar su número total, movilidad en
cámara de Rebuck, fagocitosis de partículas de
látex, Staphylococcus aureus y Candida alhi-
cans, reducción del nitroazultetrazolium, efecto
candicida y quim iotaxis. Los defectos de las
enzimas intracelulares, como la mieloperoxida­
sa, pueden producir candidiasis crónica.
La mayor parte de los defectos inmunológi­
cos encontratlos en 26 casos de candidiasis mu­
cocutánea crónica^^^ se ajusta a cuatro patrones
 Inmunopatología
fundam entales: tipo I, buena transform ación
linfoblástica, pruebas cutáneas negativas y au­
sencia de MIF; tipo II, aceptable secreción de
MIF in vitro por parte de los linfocitos del pa­
ciente, pero pruebas cutáneas negativas posi­
blemente por una falla de los macrófagos y co­
mo consecuencia del sistema amplificador que
hace posible la visualización in vivo de la reac­
ción; tipo III, el suero de los pacientes posee un
factor inhibidor de la transformación blástica,
en especial para cándidas, las pruebas de trans­
form ación linfoblástica y M IF son negativas
así como las intradermorreacciones con candi­
dina, y pueden ser positivas las practicadas con
otros antígenos; tipo IV, sin déficit de su inmu­
nidad celular deteetable. En la enfermedad que
nos ocupa se han señalado éxitos terapéuticos
con tratamientos sustitutivos como transfusión
de leucocitos con antígenos de histocompatibi­
lidad comunes entre el dador y el receptor,^^2
aplicación del factor de t r a n s f e r e n c i a * ® ' y
trasplante de timo.*® Se prefieren los dos prim e­
ros por ser habitualmente mejor aceptados por
el receptor. Estos tratamientos han conseguido
remisiones prolongadas de 5 años o más, im po­
sibles de obtener con drogas antimicóticas.^^^
Aunque las alteraciones de la inmunidad hu­
moral son menos frecuentes en la candidiasis
mucocutánea crónica, no se debe descuidar su
estudio. Es aconsejable efectuar un proteino­
grama electroforético, dosaje de inmunoglobu­
hnas por inmunodifusión radial y dosaje de an­
ticuerpos específicos por inmunofluorescencia
i n d i r e c t a . C o n esta última técnica se ha podi­
do demostrar que, por lo general, los enfermos
portadores de este tipo de candidiasis presentan
aumento del título de anticuerpos específicos;
los ligados a la IgM están incrementados du­
rante la fase aguda seudomembranosa, los vin­
culados a la IgA, en las formas crónicas hiper­
tróficas, y los relacionados con la IgG, en cual­
quiera de las form as clínicas de candidiasis
mucocutánea.'^'
La frecuencia de las candidiasis diseminadas
graves, como sepsis, endocarditis, meningoen-
cefalitis e infecciones urinarias altas, aumentó
desde la aplicación de los antibióticos de am ­
plio espectro, citostáticos y corticoides; otro
factor predisponente ha sido la cirugía cardio­
vascular, particularm ente las operaciones de
válvulas. Con todo, su aparición continúa sien­
do esporádica, pero su pronóstico es muy serio
ya que, con frecuencia, conducen a la muerte
sin tratamiento a d e c u a d o . La puerta de en­
trada suele ser el aparato digestivo o directa­
mente el sistema venoso periférico, como suce­
de en los sujetos canalizados y en los toxicó-
manos. Se considera que para que se produzca
sepsis es necesaria la presencia de un déficit de
ios mecanismos defensivos pues, aun en casos
de trombosis venosas colonizadas por cándi­
das, no se produce la septicemia si el estado in-
munitario del enfermo es normal. Las afeccio­
nes del grupo linfomas-leucemias,’’'* la toxico­
manía (morfina o heroína) y las causas favore­
cedoras mencionadas anteriormente alteran los
mecanismos defensivos contra Candida.
Los estudios serológicos han sido de notable
valor como elemento auxiliar de diagnóstico en
las c a n d i d i a s i s d i s e m i n a d a s . 3 5 . > i s . i « , i 7 9 .2o s . 2 w ,2 1 5
La reacción de h em o ag lu tin ació n p asiv a
puede dar resultados positivos en casi todos los
sujetos adultos normales y es negativa en el re­
cién nacido o en personas con defectos de la in­
munidad humoral;®” los anticuerpos que inter­
vienen son del tipo IgM. Las pruebas de inm u­
nofluorescencia indirecta es positiva en un nú­
mero apreciable de portadores sanos de candi­
da o en pacientes con micosis superficiales, pe­
ro sus títulos se elevan por encima de 1:1.280
en los casos de sepsis o endocarditis.'"’
La aglutinación en tubo presenta resultados
semejantes a los de la inmunofluorescencia y
se considera que los títulos superiores a 1:160
representan un índice de diseminación; en estos
pacientes el anticuerpo producido es de tipo
IgG.2>®
Las pruebas de inm unodifusión en gel de
agar y de fijación de complemento, que utilizan
como antígenos el sobrenadante de seudomice-
lios rotos, proporcionan resultados positivos
sólo en pacientes con candidiasis visceral o sis-
témiea que no presenten alteraciones de la in­
munidad humoral primitiva o producida por el
em pleo de c o rtico id e s, in m u n o su p reso res,
gtc.'«.'79
También se han observado reacciones débil­
m ente positivas en el granulom a candidiási-
co.60.215 En la aetuahdad se considera que la es­
pecificidad de estas reacciones para el diagnós­
tico de las candidiasis sistémicas es del 90%.^®
El empleo simultáneo de la contrainmunoelec­
troforesis y eoncavalina A, que excluye las fal­
sas reacciones producidas por los polisacáridos
de la pared celular, aumenta el valor diagnósti­
co de las pruebas serológicas en las candidiasis
profundas.*’-^"*
Las principales causas de error son: 1) prue­
bas falsas negativas por incapacidad para for­
mar anticuerpos en los inmunodeficientes o en
los estadios muy tempranos de la afección, an­
tes de que ellos aparezcmi; 2) reacciones falsas
positivas en sujetos con canalizaciones venosas
infectadas por cándida y con reiteradas funge-
mias, pero sin sepsis ni metástasis infecciosas
viscerales. La electrosinéresis es un sustituto de
la inmunodiñisión que permite obtener resulta­
dos en 2 horas-’^®’” '^ y posee mayor sensibilidad.
Todo parece indicar que gran parte de los su­
jetos normales posee anticuerpos naturales an-

licándida que son del tipo IgM y que la gran
producción de anticuerpos observada en las
candidiasis sistémicas depende de la acelerada
síntesis de IgG específica."*
En ciertas circunstancias las pruebas seroló­
gicas en busca de anticuerpos resultan poco efi­
caces, éstas son; las etapas muy tempranas de
la infección, en pacientes inmunocomprometi-
dos o cuando las micosis son producidas por
agentes endógenos contra los cuales existe,
normalmente, una determinada producción de
anticuerpos. En las candidiasis estas circuns­
tancias se producen con cierta frecuencia obli­
gando a la búsqueda de antígenos específicos
en los fluidos orgánicos (suero y orina) como
reemplazante de las pruebas serológicas clási­
cas. Se han detectado galactomananos y enola-
sa como antígenos dominantes en los fluidos
orgánicos. Las pruebas más utilizadas son las
aglutinación de partículas de látex sensibiliza­
das con anticuerpos específicos. Existen actual­
mente dos equipos com erciales, el Pastorex-
Candida'^ con anticuerpo monoclonal antima-
nano y el Cand-Tec, con anticuerpos policlona-
les de conejo. La sensibilidad de estas reaccio­
nes es del 47 al 52% y su especificidad es muy
elevada. La búsqueda de enolasa posee una
sensibilidad mayor, cercana al El
mayor problema son los falsos negativos, origi­
nados en el hecho que, tanto la antigenemia co­
mo la antigenuria, son transitorias en las candi­
diasis sistém icas. También se ha utilizado la
determinación de los niveles sanguíneos de D-
arabinitol, como una evidencia indirecta de
candidiasis invasiva. R equiere el em pleo de
crom atografía gas-ííquido y debe tenerse en
cuenta, especialm ente, la relación arabinitol/
creatinina, ésta aumenta en las candidiasis sis­
témicas y disminuye con el tratamiento. El va­
lor definitivo de estos dosajes necesita aún ser
establecido.
Aspergilosis
La mayor parte de los autores coinciden en
clasificar las aspergilosis broncopulmonares en
tres grupos; alérgicas, intracavitarias e invasi-
Vas.26.188
Aun cuando las esporas de ios hongos del
género Aspergillus forman parte de la flora del
aire, y los hombres de todas partes del mundo
inhalan diariamente miles de ellos, no contraen
la enfermedad salvo en circunstancias especia­
les. Algunos sujetos atópicos pueden presentar
la afección de tipo alérgica por inhalación rei­
terada de esporas, en particular de la especie A.
fumigatus.
Cuando se presenta la forma asmática, parti­
cularmente en los casos crónicos, además de
las crisis disneicas periódicas, suelen aparecer
Inmunología de las micosis 507
lesiones radiológicas de fibrosis pulmonar e in­
filtrados transitorios con predominio en ambos
vértices. Son frecuentes, además, febrícula in­
termitente, cefaleas, estornudos, tos y eosinofi­
lia, tanto sanguínea como en la expectoración.
El hongo se detecta reiteradamente en el esputo
y estos pacientes poseen anticuerpos específi­
cos de tip o IgE, d em o strab les m ed ia n te la
transmisión pasiva de la sensibilidad (fenóm e­
no P-K), empleando como receptores a seres
humanos o a p r i m a t e s , o por radioinmunoen­
sayo,
Se ha podido demostrar que la presencia de
esporas de A. fumigatus en las vías aéreas dei
hombre es un potente estímulo para la produc­
ción de IgE específica e inespecífica.'''2.
El dosaje de IgE posee un valor pronóstico
pues su elevación permite anticipar la aparición
de las crisis asmáticas.
Las aspergilosis broncopulmonar alérgica o
bronquitis mucomembranosa es otra de las for­
mas clínicas que presentan los sujetos atópicos.
Se caracteriza por crisis de asma, neumonitis o
atelectasias migratrices y recurrentes, aparecen
tapones o moldes bronquiales, expectoración
purulenta, a veces hem optoica, y eosinofilia
sanguínea. El examen del esputo muestra cris­
tales de Charcot-Leyden, espirales de Cursh-
m an, eosinófilos y filam entos del A sp ero i-
llusf'^’^
Esta forma clínica presenta simultáneamente
dos tipos de anticuerpos, los precipitantes del
tipo IgG y los responsables del fenómeno P-K,
a los extractos de A. fum igatus, que son el tipo
lgE.S7.205
Mediante la inoculación por vía venosa del
suero no calentado de paciente con aspergilosis
alérgica se ha conseguido hipersensibilizar pa­
sivamente a primates, obteniendo luego la re­
producción de la crisis asmática al hacerles in­
halar esporas del hongo. Este anticuerpo reagí-
nico es menos específico que el precipitante,
presenta reacciones cruzadas entre los hongos
del género Aspergillus, es termolábil y deja de
producirse el fenómeno P-K cuando el suero es
tratado con anticuerpos anti-IgE.^®®
El tenor de IgE en el suero de estos pacientes
está aumentado considerablemente. Esta altera­
ción tiene valor diagnóstico, pues estaría rela­
cionada con el estado atópico de los enfermos,
la producción de reacciones cutáneas de tipo
inmediato hacia los antígenos del hongo, la eo­
sinofilia y el b ro n co sp asm o .'’2 En las crisis
agudas de esta afección, el nivel sérico de IgE
llega a 6-30 fig • m f '.'’’
Los anticuerpos precipitantes del tip o IgG
son más específicos, termoestables, pueden de­
m ostrarse por pruebas de inm unodifusión en
gel de agar, contrainmunoelectroforesis y fija­
ción de complemento, y serían los que deterrni-
508 Inmunopatología
nan la aparición de infiltrados pulm onares y
reacciones cutáneas que se tornan positivas en­
tre las 6 y 12 horas después de haber inyectado
el a n t í g e n o . E n las dos formas clínicas de as-
pergilosis alérgica es posible demostrar la exis­
tencia de hipersensibilidad mediante la inocula­
ción intradérmica de antígenos de A. fum iga-
to';'®’*se observa una reacción de tipo inmediata
y, en oportunidades, otra más demorada que se
hace evidente, como ya fue señalado, entre las 6
y 12 horas de la inyección. Esta última reacción
sólo se presenta en sujetos con abundantes anti­
cuerpos precipitantes, e histopatológicamente es
idéntica a un fenómeno de Arthus.
Se realizan también pruebas de sensibilidad
bronquial, nebulizando extractos liofilizados de
A. fumigatus; dicho estímulo produce en el en­
fermo una marcada disminución del volumen
respiratorio máximo.
En las formas intracavitarias, los hongos del
género Aspergiílus desarrollan en el interior de
una cavidad preform ada, sea ésta bronquial,
pulmonar o pleural, formando una masa fúngi-
ea, a veces en forma de bola, que ocupa total o
parcialmente su luz y provoca una reacción in­
flamatoria pericavitaria, pero el hongo no inva­
de el parénquima pulmonar vecino. La mayor
parte de las cavidades preformadas correspon­
den a tuberculosis curadas y en menor propor­
ción a bronquiectasias, quistes congénitos, mi­
cosis pulmonares,
Los enfermos presentan tos con expectoración
mucopuruíenta y hemoptisis, a veces tan intensa
que conduce a la muerte por hipovolemia.
Las alteraciones clínicas son ocasionadas por
la liberación de diversas toxinas que posee el
A.spergiHus fum igatus, unas obtenidas de ex­
tractos endocelulares y otras, de productos de
secreción del micelio. Dichas sustancias tienen
efectos citotóxicos, hemohlicos, fibrinolíticos e
inactivadores del complemento.
Gran cantidad de antígenos de la masa fúngi-
ca pasan la pared cavitaria y provocan la for­
mación de anticuerpos específicos. Las reac­
ciones serológicas practicadas con esos antíge­
nos dan resultados intensam ente positivos en
pacientes afectados por esta forma clínica y su
realización reviste un gran interés para el diag­
nóstico y el control de la curación del proce-
8,38,149
Las pruebas serológicas que se emplearon
son las siguientes: inmunoelectroforesis en gel
de a g a r o s a , inmunodifusión en gel
de a g a r , f i j a c i ó n de c o mp l eme n -
t o , 8 9 ,1 4 3 ,149,I7Ü,22.S contrainmunoelectToforesis,'*'^-^''
precipitación en tubo con dosaje de proteínas
precipitadas,^' inm unofluorescencia indirec-
ta^36.78,2i7 aglutinación de partículas de látex
sensibilizadas con glucom ananos de la pared
celular del Aspergillus,^^^-'^''^ y ELISA. Los antí­
genos utilizados han sido: celulares, obtenidos
del sobrenadante de miceho roto, y metabóli-
cos, constituidos por el filtrado de desarrollo en
medios lícjuidos o fracciones ricas en polisacá­
ridos, parcialm ente purificados por precipita­
ción con acetona de dichos filtrados.
La realización sistemática de las pruebas se­
rológicas ha perm itido extraer las siguientes
conclusiones: 1) más del 95% de los pacientes
eon aspergilosis intracavitaria presenta an ti­
cuerpos precipitantes contra una o varias parce­
las antigénicas del A. fum igatus, detectables
por las pruebas de inmunodifusión, inm unoe­
lectroforesis o contrainmunoelectroforesis;'''^"^''
2) estas reacciones son negativas en los contro­
les normales así como en los sujetos afectados
por otras micosis profundas; su especificidad
es tan estricta que presenta resultados negciti-
vos en pacientes eon aspergi lomas producidos
por otras especies de Aspergiílus, haciendo ne­
cesario el empleo de una batería de antígenos
que incluyan A. niger, A. flavus, A. nidulans y
A. terreus;^^ 3) estas pruebas presentan como
causa de error la precipitación de una proteína
C existente en el contenido celular de los hon­
gos del género Aspergiílus; estas falsas reac­
ciones se eliminan tratando las placas de inmu­
nodifusión con una solución estabilizada de ci­
trato de sodio pH 8,2;“’'* 4) la aparición de 3 o
más bandas de precipitación en el inmunoelee-
troforetograma en gel de agarosa permite afir­
mar el diagnóstico de aspergilosis pulm onar
activa;^^® 5) se ha establecido que uno de estos
arcos tiene actividad catalásica y otro quimio-
trípsica, su demostración posee un valor diag­
nóstico casi a b s o l u t o ; 6) existe una evidente
relación entre los resultados de las pruebas de
inmunodifusión en medios gelificados y los de
ia reacción de fijación de complemento, con la
ventaja para esta última de ser más fácil su
cuantificación; 7) las pruebas de inm unofluo­
rescencia indirecta y de aglutinación de partí­
culas de látex no están dotadas de la especifici­
dad necesaria para tener valor diagnóstico; 8)
la extirpación quirúrgica de la cavidad afectada
o, más raras veces, la muerte espontánea del
aspergiloma, va seguida de la pérdida progre.si-
va de anticuerpos y, finalmente, la negativiza-
ción de las reacciones serológicas; si por el
contrario éstas continúan positivas después de
6 meses del acto quirúrgico, es índice de infec­
ción residual en los bronquios vecinos,'*” y 9)
los anticuerpos que intervienen en las pruebas
de precipitación en medios gelificados son del
tipo lg G .'‘’‘^-22®
Los extractos endocelulares de los hongos de
diversas especies del género Aspergiílus produ­
cen inactivación del complemento actuando so­
bre C3;^" en el caso de A. fum igatus se ha podi­
do observar descensos de la complementemia

in vivo, utilizando cobayos; este efecto va
acompañado de una acción citotóxica y hemo­
l í t i c a . A la inversa de lo que se podrá esperar,
los pacientes eon aspergilosis intracavitaria
presentan complementemia normal o elevada,
en general tanto más alta cuanto más extensa
sea la infección y cuanto más próximo esté el
paciente a sufrir una hemoptisis grave.
Las pruebas cutáneas son habitualmente ne­
gativas en este tipo de aspergilosis; sólo en al­
gunos casos se observa reacción de tipo inm e­
diato, como consecuencia de estar sensibiliza­
do el enfermo a los antígenos del hongo. La
mayor parte de los sujetos que presentan aler­
gia inmediata sufre de broncospasmo y la inter­
pretación de la prueba cutánea es en este caso
idéntica a la ya mencionada para el asma asper-
gilar.
Se ha podido demostrar en esta forma clínica
que la presencia de A. fum igatus en el aparato
respiratorio actiia como un importante estímulo
para la producción de IgE específica e inespe­
cífica, tal como sucede en las formas alérgicas.
En las aspergilosis invasivas, los filamentos
del hongo penetran en el parénquima pulm o­
nar, invaden y lesionan ía pared de los vasos
sanguíneos, provocan trombosis e isquemia, así
como lesiones metastásicas en otros órganos.
Clínicamente es un proceso subagudo o cróni­
co, de tipo neumónico con tos, expectoración,
catarro purulento, hemoptisis, fiebre, disnea y
leucocitosis.7»-'3»'2'»-»«.2i3
La frecuencia de este proceso ha aumentado
intimamente, en particular como infección so-
breagregada en enfermos con leucemias o lin­
fomas que reciben tratam ientos eon corticoi­
des, antimitóticos, inmunosupresores, suero an-
tilinfocitario y radiaciones.'** En su mayor par­
te son enfermos con leucopenia (< 500 leucoci­
tos por mm^).
El estudio histopatológieo de las piezas de
autopsia muestra la presencia de abundantes hi­
fas del hongo, dispuestas en forma radiada y ro­
deadas de una extensa zona de necrosis y supu­
ración. Se ha sugerido que este cuadro es pro­
ducido por la falta total de respuesta inmunita-
ria por parte del huésped y por la acción nceró­
tica de las endotoxinas del A. fumigatus.
El mecanismo defensivo normal contra estos
hongos necesita de factores séricos opsonizan-
tes que favorecen la fagocitosis de las esporas
por os neutrófilos; aquéllos, una vez fagocita-
dos, son destruidos por ia mieloperoxidasa, el
peróxido de hidrógeno y el ioduro de potasio.*'^
Uno o varios de estos mecanismos se encuen­
tran alterados en los enfermos que padecen las
graves hemopatías que actúan como factores
predisponentes.
Las investigaciones serológicas realizadas en
los pacientes que presentan esta forma clínica
Inmunología de las micosis 509
han demostrado con frecuencia reacciones ne­
gativas, especialmente si se trata de sujetos con
inm unodeficiencias producidas ya sea p o r la
enfermedad de base (leucemia o linfoma) o por
los tratamientos recibidos.’*
Se han realizado varias pruebas experim en­
tales para efectuar el diagnóstico serológico de
esta form a clínica mediante la demostración de
antigenem ia con el radioinm unoensayo y la
técnica de ELISA.9“-“ 3.22*
En la actualidad se están empleando con ma­
yor frecuencia técnicas de aglutinación de látex
y ELISA sandwich o inhibición de ELISA. Es­
tas pruebas permiten detectar una glucoproteí­
na de 18 kD, tanto en suero como en orina. La
reiteración de las muestras incrementa la sensi­
bilidad de estos métodos.'**'
Zigomicosis
Las zigomicosis son micosis profundas que
poseen la característica común de ser produci­
das por hongos de micelio filamentoso conti­
nuo. Dentro de ellas se incluyen las mucormi-
eosis, producidas por Mucorales de los géneros
Rhizopus, Absidia, M ucor y M oríierella, que
p resen tan las características de las m icosis
oportunistas. Son afecciones de distribución
geográfica universal, de curso grave y que con­
ducen frecuentem ente a la muerte de lo s pa­
cientes; la mayor parte de los diagnósticos son
realizados por estudios histopatológicos de las
piezas de autopsia.'-"’^
Desde el punto de vista clínico, las mueor-
mieosis se dividen en: 1) formas sinuso-órbito-
cerebrales, cuyas causas predisponentes más
frecuentes son la diabetes acidótica, la uremia
y las grandes quemaduras; 2) formas pulm ona­
res o diseminadas que se asocian por lo común
con leucemias, linfomas, anemias graves, en
pacientes que reciben corticoides, citostáticos e
inmunosupresores; 3) formas abdominales, cu­
yo punto de partida es intestinal y presentan
como factor predisponente la desnutrición gra­
ve y las poliparasitosis, y 4) la mucormicosis
cutánea, de presentación menos frecuente y cu­
ya aparición es favorecida por las acidosis me­
tabólicas y los traumatismos.
El examen histopatológieo de las mucormi­
cosis m uestra las alteraciones propias de las
micosis graves, en las cuales las defensas del
huésped están seriamente deterioradas. Se ob­
servan abundantes filamentos no tabicados, an­
chos, de diámetro algo irregular, que tienden a
invadir los vasos sanguíneos, producen trom­
bosis y necrosis isquémica de los tejidos veci­
nos. Junto a las lesiones -necróticas puede haber
supuración y se comprueba una total ausencia
de granulom as defensivos que tiendan a cir­
cunscribir el proceso.
510 Inmunopatología
Los estudios inmunológicos han sido esca­
sos. Se han preparado antígenos solubles, obte­
nidos del sobrenadante del micelio roto por ul­
trasonido, a partir de cultivos de Absidia, Mu-
cor y Rhizopus. Dichos antígenos han demos­
trado su utilidad diagnóstica en pruebas de in­
munodifusión. Esta reacción da resultados ne­
gativos en estadios tempranos o cuando la en­
fermedad es controlada muy rápidamente, pero
es intensamente positiva en los casos avanza­
dos y se observan reacciones cruzadas entre los
tres géneros de hongos p roductores de esta
afección.'’O
INMUNIDAD EN LAS DERMATOFITIAS
Las dermatofitias son micosis superficiales
producidas por un grupo de hongos llamados
derm alófitos, que pertenecen a tres géneros,
Microsporum, Blpidermophyton y Trichaphyton
y numerosas especies. Estos microorganismos
atacan la capa córnea de ia piel y sus faneras;
producen lesiones inflamatorias en la piel lam­
piña, barba, bigote, cuero cabelludo y otras re­
giones pilosas del cuerpo, y en las uñas deter­
minan hiperqueratosis. A causa de su condición
de parásitos de la capa córnea, los derrnatófitos
son incapaces de invadir otros tejidos vivos;
por lo general su único mecanismo para produ­
cir enfermedad es actuar por medio de sus antí­
genos. Estos son captados por las células de
Langerhans de la epiderm is, las que m igran
hasta ponerse en contacto con los tejidos linfoi­
des inm unocompetentes; allí los linfocitos T
son sensibilizados y desencadenan un proceso
de hipersensibilidad mediada por células, con
exteriorización principalmente cutánea. Puede
decirse, pues, que las dermatofitias son derma­
titis de contacto producidas por los antígenos
de los dermatófitos.'"
Ha sido reiteradamente señalado que existen
dos tipos polares de dermatofitias desde el pun­
to de vista clínico e inmunológico. Unas son
producidas por hongos procedentes del suelo
(geófilos) o de los animales (zoófilos) y que
por lo tanto están poco adaptadas al parasitis­
mo de la capa córnea de la piel del hombre. Es­
tos agentes determinan una intensa reacción in­
flam atoria con vesículas y pústulas, con fre­
cuencia hay infiltración inflamatoria de la der­
mis e hipodermis y los ganglios satélites están
infartados. Este cuadro clínico va acompañado
de reacciones cutáneas a la tricofitina intensa­
mente positivas y, en oportunidades, se obser­
van erupciones cutáneas deshabitadas llamadas
dermatofítides. Esta intensa reacción inflama­
toria elimina gran cantidad del estrato córneo
afectado y, por lo tanto, también de dermatófi-
tos; como consecuencia, luego de un tiempo
tienden a la curación espontánea y habitual- '
mente no se cxo n iñ c m }'’™'^^'
La otra forma clínica es causada por agentes
antropófilos como el Trichophyton ruhrum,
Epiderm ophyton floccosum , T. Schoenleinii,
etc., muy adaptados al parasitismo de la capa
córnea humana y que despiertan escasa reac­
ción inflamatoria. Las lesiones son descamati-
vas, hiperqueratósicas y con frecuencia com ­
prometen las uñas; desde el punto de vista sub­
jetivo, casi no producen prurito y su curso es
muy crónico. La prueba de la tricofitina da re­
sultados frecuentemente negativos y jamás cu­
ran espontáneamente. Por lo general su cura­
ción es difícil aun con tratam ientos adecua-
dos.41.127.231
Se considera que la quinta parte de la pobla­
ción mundial padece micosis superficiales, de
las cuales la mayoría son dermatofitias y piti-
riasis versicolor. La aparición de una de estas
micosis superficiales depende de una serie de
factores. Algunos actúan en forma local como
la humedad y el grosor de la capa córnea; en
general es más frecuente la im plantación de
una dermatofitia en zonas húmedas y de capa
córnea gruesa. La transpiración excesiva, el
uso de calzado cerrado y de suela gruesa, la ro­
pa ajustada, la maceración de la piel, las m ar­
chas prolongadas y la obesidad son factores
predisponentes para la aparición de estos pro­
cesos en los pies y los pliegues inguinales. El
uso de cabellos largos protege mecánicamente
a las niñas contra ios hongos productores de ti­
ñas del cuero cabelludo.^^* La edad es un factor
de suma importancia, así las tiñas de cuero ca­
belludo son casi exclusivas de la infancia, en
tanto que las dermatofitias de ios piel y el plie­
gue inguinocrural son propias del adulto. El se­
xo masculino presenta estas micosis con una
frecuencia discretamente mayor que el femeni­
no, El contacto con animales favorece la im ­
plantación de tiñas inflamatorias y micosis tri-
cofítica y las prácticas deportivas, en particular
la natación, predisponen a contraer dermatofi­
tias de los pies.
Existe además una acentuada tendencia ge­
nética, en particular para padecer aquellas der­
matofitias crónicas poco inflamatorias; éstas se
transmiten dentro de la misma familia siguien­
do una línea genética y no contagian a otros in­
tegrantes del grupo familiar no predispuestos.
Por ejemplo, la existencia de contagio m atri­
monial es rara y, por el contrario, es frecuente
de padres a h ijo s o en tre otros c o n san g u í-
neos.'".23‘
Se ha comprobado que el suero normal con­
tiene componentes que frenan el desarrollo de
los dermatófitos. Ayres y Anderson (1934)® de­
m ostraron que el agregado de 8% de suero,
procedente de pacientes con tiñas inflam ato­

rias, al medio de Sabouraud, impedía el creci­
miento de estos hongos. Posteriormente, los es­
tudios de Lorincz y Roth'*''-''*^ comprobaron que
el suero fresco de la mayor parte de las perso­
nas posee una actividad fungostática frente a
los dermatófitos. Estas sustancias condiciona­
rían el ataque restringido a la capa córnea de la
piel y sus faneras por tratarse de tejidos no irri­
gados. Se han reconocido dos sustancias plas­
máticas que actúan como factores contrarios a
la invasión de los dermatófitos, la transferrina
no saturada y una a 2-macroglobulina inhibi­
dora de la queratinasa.^®"
En las células sanguíneas tienen importancia
los neutrófilos, los mastocitos, los linfocitos y
los macrófagos. Ciertas condiciones de la salud
general pueden influir en la aparición de las
dermatofitias y especialmente en su extensión
y cronicidad. La diabetes, el empleo de corti-
coesteroides, el síndrome de Cushing, los tras­
plantados y los linfomas coexisten con tricofi-
tias extensas y rebeldes al tratamiento causadas
por el T.
En pacientes jóvenes con defectos de la in­
munidad mediada por células se ha comproba­
do la aparición de tricofitias extensas que afec­
tan uñas, cuero cabelludo y piel, presentando
esta última una descamación difusa, ictiosifor-
me, con escasa o nula reacción inflamatoria.
Esta forma clínica ha sido denominada recien­
temente enfermedad dermatofítica'*’ y es produ­
cida habitualmente por Trichophyton antropófi-
los (T. tonsurans, T. vioíaceum o T. rubrum).
Un hecho frecuente que aún aguarda expli­
cación es la tendencia que presentan ciertas tri­
cofitias a permanecer localizadas en una mano
o un pie sin afectar el otro. Wilson atribuye es­
te fenómeno a alteraciones locales en el meta­
bolismo de los hidratos de carbono.
Otro factor im portante es la velocidad de
reemplazo de la capa córnea. Para que un der-
matófito pueda sobrevivir e invadir nuevas zo­
nas, su velocidad de crecimiento debe ser m a­
yor que la de eliminación del estrato córneo,
pues de lo contrario es expulsado de la piel.
Por lo tanto, si la tiña se expande es porque su
agente etiológico es capaz de desarrollarse aun
contra la corriente de renovación epidérmica.
Esto explica las curaciones espontáneas que se
producen cuando es eliminada una gran masa
de capa córnea, tal como sucede en las tiñas
muy inflamatorias, por factores mecánicos co­
mo la depilación (manual o radioterápica) o la
extirpación quirúrgica de las uñas enfermas.
Plato y Neisser (1902) obtuvieron un antíge­
no de cultivos de dermatófitos por medio de un
procedimiento similar al utilizado para preparar
la tuberculina vieja de Koch. Este extracto fue
llamado tricofitina. La inyección de esta sus­
tancia por vía intravenosa produce en los pa­
Inmunología de las micosis 511
cientes portadores de derm atófitos un cuadro
general con fiebre, escalofríos, esplenomegalia
y cefaleas. La inyección intradérmica produce
una reacción tem prana con urticaria a los 15
minutos y otra tardía con eritema y pápula a las
24 o 48 horas.
El estado de hipersensibilidad a la tricofitina
se instala a los 7 u 8 días de producida la infec­
ción y persiste por lo general en forma indefi­
nida. Se ha establecido que la aplicación reite­
rada de tricofitina no vuelve positiva esta prue­
ba. En algunos casos, la prueba de tricofitina
desencadena fenómenos focales, como aum en­
to de la reacción inflamatoria de la tiña, o ge­
nerales con discreta hipertermia y aparición de
erupciones cutáneas a distancia del foco der-
matofítico conocidas como “ides”.
Desde el punto de vista histológico, la reac­
ción se caracteriza por infiltrados dérmicos de
células linfoides y monocitos; éstos se acum u­
lan en torno a los vasos sanguíneos y los ane­
xos cutáneos. En los casos más intensos puede
haber necrosis y aflujo de polimorfonucleares.
Como ya fue señalado, hay especies que pro­
ducen una mayor sensibilización a la tricofitina
como el Microsporum canis, Microsporum. gyp-
seum, Trichophyton mentagrophytes var. yeso­
sa, Trichophyton verrucosum, etc., en tanto que
otras parecen no sensibilizar a sus portadores,
como sucede con el Epiderm ophyton flo c c o -
sum , T richophyton rubrum y T rich o p h yto n
mentagrophytes var. vellosa. Lewis y Hopper**’
demostraron la especificidad de esta reacción,
de tal forma que una prueba de tricofitina posi­
tiva indica infección actual o pasada por un der-
matófito. La especificidad es de grupo y en ge­
neral los reactivos que se preparan son poliva­
lentes, con una especie de cada género.
Los sujetos atópicos, con altos n iveles de
IgE, suelen ser más susceptibles a las derm ato­
fitias crónicas y no desarrollan pruebas tardías
de trico fitin a positivas."*' Neves*®® enco n tró
23% de reacciones positivas a la tricofitina leí­
da a las 48 horas en 571 individuos que no pa­
decían derm atofitias en el momento del exa­
men. Esta prueba fue positiva en el 41% de los
170 pacientes con derm atofitias y el 97% de
los pacientes tenían tiñas con signos de infla­
mación.
La tricofitina es un polisacárido nitrogenado,
dializable y que da glucosamina por hidrólisis,
así com o enzimas queratinasas. Se considera
cjue los componentes dominantes de la tricofiti­
na son los glucopéptidos y la queratinasa, la
porción proteica de los primeros y la queratina­
sa estimulan en el huésped la inmunidad me­
diada por células, en tanto que los polisacári­
dos incrementan la actividad de la inmunidad
humoral.^’-'*". Con él se han estudiado reaccio­
nes de hipersensibilidad retardada in vitro de
512 Inmunopatología
las cuales la inhibición de la migración de m a­
crófagos (MIF) parece la más eficaz.'*'
Las dermatofitias inflamatorias generan con
cierta frecuencia la aparición de erupciones
“segundas” llamadas dermatofítides. Éstas pue­
den presentarse espontáneamente o después de
una inyección de tricofitina; igualmente, toda
medicación que irrite el foco primario facilitará
su aparición. Las tiñas del cuero cabelludo o
las tricofitias supurativas de la barba producen
dermatofítides liquenoides, foliculares o papu-
lovesiculosas y raramente eritema nudoso, en
tanto que las dermatofitias de los pies determi­
nan lesiones vesiculares dishidrosiform es en
las manos. Estas manifestaciones cutáneas cu­
ran espontáneamente una vez que el foco pri­
mario es tratado con éxito.
Las reacciones serológicas dan resultados
poco útiles para el diagnóstico de estos proce­
sos, ello parece deberse a la existencia de antí­
genos com unes entre los derm atófitos y los
hongos saprófitos y al escaso poder invasivo de
estos microorganismos.'®' Cabrita y Estévez^'
comprobaron, sin embargo, que un número sig­
nificativamente elevado de pacientes con tiñas
supuradas (querion) presentaban anticuerpos
precipitantes demostrables por la reacción de
inmunodifut ión en gel de agar. Recientemente
se han incorporado reacciones de fijación de
complemento y técnicas de ELISA con antíge­
nos más depurados. Por lo general se observan
anticuerpos detectables en casos inflamatorios,
de larga duración y acompañados de tricofíti-
des. Los anticuerpos corresponden a IgG, y con
menor frecuencia a IgM o IgE.
Un interesante fenómeno observado en la in­
munidad adquirida en las dermatofitias es el de
Bloek. Este autor, y luego otros investigadores,
comprobaron que, cuando se inocula un derma-
tófito por primera vez a un cobayo, éste presen­
ta una tiña experimental después de una sema­
na de incubación; los síntomas alcanzan el m á­
ximo a los 14 a 19 días y luego cura en el plazo
de un par de meses. Si este animal es reinocu­
lado con el mismo hongo, la reacción es com­
pletamente diferente; el período de incubación
se acorta a 24 o 48 horas, la descamación e in­
flamación van en aumento hasta los 4 o 7 días
siguientes y alcanza la curación a los 20 días.
Los exámenes micológicos revelan la ausencia
de hongos en la reinoculación. Esta tríada del
fenóm eno de Block con reacción tem prana,
evolución acortada y ausencia de hongos es
muy similar al fenómeno de Koch en la tuber­
culosis experimental. Se ha podido comprobar
que las reinoculaeiones en el hombre presentan
tam bién una evo lu ció n aco rtad a y p reco z,
Louste y col.'^’ demostraron un cierto grado de
inmunidad a la reinfecciones aun en pacientes
portadores de tiñas no inflamatorias.
Se han realizado numerosos estudios para
producir inmunógenos contra las dermatofitias.
Casi todas las tentativas exitosas emplearon las
células fúngicas com pletas, incluyendo los
componentes de su pared celular, y casi todos
los intentos fallidos usaron extractos de los
hongos o subproductos de su desarrollo. Debe
señalarse que la técnica de Warton, que utiliza
una suspensión de dermatófitos en coadyuvan­
te, resultó ser la más eficaz en cuanto a su efec­
to protector.’' Estos compuestos son inoculados
por escarificación cutánea y producen hiper­
sensibilidad e inmunidad locales cuyo grado
decrece a medida que se aleja del foco de ino­
culación.
INMUNOLOGÍA
DE LAS CROMOMICOSIS
Las cromomicosis son afecciones de la der­
mis e hipodermis producidas por hongos pig­
mentados (Dematiaceae) pertenecientes a los
géneros P hialophora, Fonsecae y Cladospo-
riiim, caracterizadas por el aspecto verrugoso de
las lesiones cutáneas, que habitualmente están
ubicadas en las partes descubiertas del cuerpo,
en particular en los miembros inferiores.
Se ha podido comprobar la presencia de anti­
cuerpos fijadores del complemento tanto en pa­
cientes afectados de cromomicosis como en co­
nejos inm unizados con las diversas especies
productoras de esta a f e c c i ó n . E s t a s reac­
ciones presentan títulos elevados con el antíge­
no homólogo y, por el contrario, éstos son ba­
jos o la reacción es negativa con los extractos
procedentes de otros hongos productores de la
m ism a enferm edad. P rácticam en te, no hay
reacciones cruzadas entre los antíg en o s de
Phialophora y Fonsecae^-^'^ No se ha estableci­
do aún si existe relación entre el título de las
pruebas de fijación de complemento y la seve­
ridad del proceso que aqueja al paciente.'*'^*'
En sueros de pacientes con cromomicosis'* se
ha obtenido igualmente un alto porcentaje de
resultados positivos eon la prueba de inmunodi­
fusión en gel de agar. Se comprobaron reaccio­
nes cruzadas entre antígenos de F. pedrosoi y F.
compactum, en tanto que éstas fueron mucho
menores entre F. pedrosoi y Ph. verrucosa.'^'’^
Biguel y col.'* y Cooper y Sehmeideu"* estu­
diaron las relaciones antigénicas de los agentes
etiológicos de cromomicosis por medio de la
inmunodifusión en gel de agar y la microinmu-
noelectroforesis. Pudo comprobarse que existe
cierto grado de reacciones cruzadas entre las
tres especies más comunes: Ph. verrucosa, F.
pedrosoi y CL carrionii, pero se demostraron
algunas diferencias antigénicas que permiten su
ubicación en géneros separados.

Gordon y Al-Doory'’-^^ estudiaron las relacio­
nes antigénicas de diversos hongos pigmenta­
dos, tanto patógenos como saprófitos, mediante
pruebas de inm unofluorescencia directa con
conjugados específicos preparados a partir de
F. pedrosoi, F. compactum y F. dermatitidis.
Son muy escasos los datos acerca de la hi­
persensibilidad m ediada por células en esta
afección. Se han realizado algunos estudios en
Cuba y en la República Dominicana, pero sus
resultados no son aún concluyentes. Las prue­
bas cutáneas son positivas en todos los casos
de cromomicosis confirmada y en el 25% de
los habitantes de zonas endémicas. Este último
dato ha hecho pensar a algunos autores'* en la
existencia de una cromomicosis-infección asin­
tomática.
IN M U N O LO G ÍA
DE LAS E SPO R O T R IC O S IS
Los estudios inmunológicos en esta afección
han perm itido establecer un comportam iento
diferente del sistema inmune de acuerdo con la
form a clínica de la enferm edad, realizar en ­
cuestas epidemiológicas, determinar la existen­
cia de una infección asintomática y estudiar los
antígenos del Sp. schenckií así como sus rela­
ciones con antígenos de hongos vecinos o vin­
culados a él.
Las pruebas cutáneas tienen importancia tan­
to en el diagnóstico de casos clínicos de espo-
rotricosis como en la realización de encuestas
epidemiológicas. Se han utilizado dos tipos de
antígenos; uno de ellos consiste en una suspen­
sión de células levaduriformes muertas por ca­
lor, en solución fisiológica fenicada, en la pro­
porción de 1/1.000 vol/vol y el otro es un poli­
sacárido obtenido por alcohol-acetato de sodio
a partir de filtrados del desarrollo en medios lí­
quidos de la fase filamentosa del Sp. schenckii.
La técnica de realización y la lectura son sem e­
jantes a las pruebas intradérm icas realizadas
con otros a n t í g e n o s . “ .53,54,io5.i.-i4
La suspensión de elementos levaduriformes
da resultados positivos tanto en pacientes con
esporotricosis com o en personas sin historia
clínica de enfermedad que habitan zonas endé­
micas. Al parecer esto se debe a la existencia
de una infección asintomática. Por este motivo
este antígeno es el preferido en las encuestas
epidemiológicas.
Por el contrario, el polisacárido de González
Ochoa que sólo da resultados positivos en la
esporotricosis clínica, constituye un elemento
de gran utilidad diagnóstica, pues su negativi-
dad permite excluir el diagnóstico de este pro­
ceso, salvo en casos diseminados que presentan
a veces anergia. 52,53,54
Inmunología de las micosis 513
De Britos y col.'"’'* estudiaron las m odifica­
ciones histopatológicas producidas por la espo-
rotriquina y comprobaron la formación de infil­
trados histiocitarios perivasculares, pequeños
granulomas y áreas de supuración.
La especificidad de esta prueba cutánea es
muy grande ya que presenta sólo un débil gra­
do de reacciones cruzadas en los cobayos in­
fectados con N. capsulatum. Flan sido utiliza­
das diversas pruebas serológicas en esta enfer­
medad: aglutinación en tubo de una suspensión
de elem entos levaduriformes, aglutinación de
partículas de látex sensibilizadas con un antíge­
no obtenido por filtración del desarrollo del Sp.
schenckii en medio líciuido, inmunofluorescen­
cia indirecta, fijación de complemento e inm u­
nodifusión en gel de agar. Las principales con­
clusiones que pueden extraerse es que las reac­
ciones dotadas de m ayor sensibilidad son la
aglutinación en tubo y la aglutinación de partí­
culas de látex; la primera de ellas es poco espe­
cífica ya que pueden observai'se reacciones po­
sitivas con títulos de hasta 1/80 en personas sin
antecedentes de esporotricosis. Las pruebas
más específicas son la inmunodifusión en ge!
de agar y la fijación de complemento, éstas son
constantemente positivas en los pacientes con
formas viscerales; sólo dan 60% de positividad
en los portadores de esporotricosis cutánea, los
títulos son proporcionales a la extensión de la
enfermedad y tienden a negativizarse después
que cura el proceso.'’’’’’*®'"’’'*^-^^^^
Recientemente hemos preparado dos antíge­
nos, uno obtenido del sobrenadante de células
l e v a d u r i f or me s rotas, y el se g u n d o es un
exoantígeno de la fase filamentosa (en form a
de extracto acuoso). Con estos reactivos fueron
practicadas diversas reacciones serológicas en
cobayos y ratones infectados experimentalmen­
te, así como en humanos con esporotricosis cu­
táneas. Las pruebas m ás sensibles fueron la
contrainm unoelectroforesis con inm unodifu­
sión secundaria y la aglutinación de células le­
vaduriform es enteras; la especificidad de la
contrainmunoelectroforesis fue absoluta cuan­
do se estudió frente a sueros de cobayos sanos,
personas sin micosis y pacientes con diversas
micosis profundas.^’
IN M U N O LO G ÍA D E LOS M IC E T O M A S
Los métodos inmunológicos, en especial las
reacciones serológicas aplicadas al diagnóstico
de ¡os micetomas, han constituido una valiosa
ayuda por la simplicidad de su realización, la
especificidad y la rapidez de sus resultados. Su
empleo, sin embargo, no se ha generalizado.
Murray y Moghraby*^^ emplearon antígenos
obtenidos de filtrados de cultivos y antígenos
514 Inmunopatología
polisacáridos de diversos agentes productores
de m icetom as, tanto A ctin o m yceta les com o
Eumycetes. Estos preparados fueron ensayados
en pruebas cutáneas practicadas a pacientes
portadores de micetomas. Los resultados com ­
probados fueron relativam ente satisfactorios
para los actinomicetomas y malos en los madu-
romicetomas.
B ojalil y M agnusson'*’’'-’ prepararon “ una
sensibilizina” por medio de un procedimiento
similar al de PPD, a partir de cultivos de No-
cardia hrasiliensis y Nocardia asteroides. Es­
tos autores comprobaron que las intraderm o­
rreacciones realizadas con 0,002 mg del extrac­
to, en 0,1 mi de volumen, daba resultados fran­
camente positivos (14-35 mm de infiltrado) en
los pacientes portadores de micetomas debidos
a estos microorganismos. Las pruebas eran es­
pecíficas y no se observaban reacciones cruza­
das entre ambas especies de Nocardia. Con do­
sis diez veces mayores se obtuvieron reaccio­
nes inespecíficas en pacientes tuberculosos o
con actinomicosis. Se realizaron ensayos simi­
lares con Actinomadura y Streptomyces sin re­
sultados satisfactorios.
Murray y Mahgoub'^^ introdujeron el empleo
de la inm unodifusión en gel de agar para el
diagnóstico serológico de los micetomas. Co­
mo antígeno se utiliza el sobrenadante de mice­
lio homogeneizado y roto, que luego es dializa­
do y liofilizado. Los resultados obtenidos per­
miten separar con facilidad los actinom iceto­
mas de los maduromicetomas, esto tiene gran
importancia pues los primeros responden al tra­
tamiento médico en tanto que en los segundos
la terapéutica es siempre quirúrgica. Existen
reacciones cruzadas entre microorganismos ta­
xonómicamente relacionados, pero la reacción
es siempre mayor con el antígeno homólogo,
ya sea por presentar mayor número de bandas
de precipitación o por ser éstas más nítidas.
Los sueros que presenten pocos anticuerpos
pueden ser concentrados por PVP o se puede
realizar electrosinéresis cuya sensibilidad es
mayor. Otras pruebas serológicas, como la he­
moaglutinación pasiva'® con antígenos polisa­
cáridos de P. hoydii, no han sobrepasado aún la
fase experimental al igual que las técnicas in-
munoenzimológicas (ELISA).
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Inmunología de las infecciones
parasitarias
STELLA M. GONZÁLEZ CAPPA
ELVIRA L. DURANTE DE ISOLA
GERARDO A. MIRKIN
Debido a su gran difusión y alta frecuencia
las enferm edades parasitarias constituyen un
problema médico importante que se acentúa en
los países tropicales y subtropicales. Estas in­
fecciones son producidas por protozoarios y
helmintos y presentan, como una de las carac­
terísticas más relevantes, tendencia a la cronici­
dad. El parásito rara vez desencadena la muerte
del huésped y en general establece con éste una
relación de equilibrio. Como consecuencia de
la infección crónica la estimulación antigénica
es muy prolongada en el tiempo y los estímulos
varían desde complejos productos metabólicos,
como los antígenos de excreción-secreción de
los helmintos y las mudas que eliminan los ne-
matodos en su progresión a diversos estadios
larvales, hasta péptidos y proteínas de la super­
ficie parasitaria. La respuesta inmunológica re­
sultante de la interacción huésped-parásito está
también condicionada por la localización de los
parásitos ya que éstos pueden ser intracelula­
res [T rypanosom a cruzi, L eish m a n ia spp.,
Plasmodium spp., Toxoplasma gondii, Trichi-
nella spiralis), intratisulares (Cysticercus ce-
llulosae, Echinococcus granulosas), de cavida­
des (parásitos de localización intestinal), o ex­
ternos (artrópodos). Estas localizaciones pue­
den además ser permanentes o temporarias de­
pendiendo del ciclo evolutivo del parásito.
Otra condición que influye en la com pleji­
dad de la estimulación antigénica es que los pa­
rásitos pasan por sucesivos estadios durante su
ciclo biológico y cada uno de éstos puede pre­
sentar antígenos distintivos. Los nematodos tie­
nen por lo menos 4 estadios larvarios y uno
adulto, y algunos protozoarios presentan dife­
rentes estadios en ei insecto vector y en el
huésped mamífero y, dentro de éste, varían de
acuerdo a su localización intra o extracelular
26
(por ej., T. cruzi). Además, y para aumentar la
complejidad, algunos parásitos varían sus antí­
genos en el tiempo, aun para el mismo estadio
(plasm odios y tripanosom as africanos). Esta
p erm an en cia p ro lo n g ad a del parásito , cuya
consecuencia es la exposición progresiva del
huésped a sus diferentes estímulos antigénieos,
conduce a una respuesta inmune que, en gene­
ral, lim ita la infección aunque no la erradica.
En ocasiones, el proceso de daño es consecuen­
cia de la misma re.spuesta inmune (esquistoso-
miasis, filariasis, paludismo, etc.). Sin em bar­
go, el hecho de que el parásito sobreviva en el
huésped y a sus expensas a pesar de la respues­
ta inmune, señala la existencia de mecanismos
que le permiten evadir in vivo la acción de los
anticuerpos y de las células sensibilizadas.
RELACIÓN H U É SP ED -P A R Á S ITO
Para estudiar esta relación deben considerarse
diversos factores, que se señalan a continuación.
1 - Inmunidad natural del huésped
Determina que, dentro de un número de indi­
viduos, algunos sean m ás su sce p tib le s que
otros a ciertas infecciones p arasita rias. Por
ejem plo, Plasmodium vivax no penetra en los
glóbulos rojos de individuos con grupo Duffy
negativo y se ha detectado una asociación sig­
nificativa entre HLA-B53 (molécula de clase I)
y resistencia a desarrollar formas severas de
paludismo. Experimentalmente se ha com pro­
bado que en leishmaniasis murina la resistencia
es regida por un gen dominante, Lsh, no ligado
al MHC, que controla la activación de macró­
fagos; esto determina las diferencias en la sus­
ceptibilidad de distintas cepas de ratones.
520 Inmunopatología
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Inmunología de las infecciones
parasitarias
STELLA M. GONZÁLEZ CAPPA
ELVIRA L. DURANTE DE ISOLA
GERARDO A. MIRKIN
Debido a su gran difusión y alta frecuencia
las enferm edades parasitarias constituyen un
problema médico importante que se acentúa en
los países tropicales y subtropicales. Estas in­
fecciones son producidas por protozoarios y
helmintos y presentan, como una de las carac­
terísticas más relevantes, tendencia a la cronici­
dad. El parásito rara vez desencadena la muerte
del huésped y en general establece con éste una
relación de equilibrio. Como consecuencia de
la infección crónica la estimulación antigénica
es muy prolongada en el tiempo y los estímulos
varían desde complejos productos metabólicos,
como los antígenos de excreción-secreción de
los helmintos y las mudas que eliminan los ne­
matodos en su progresión a diversos estadios
larvales, hasta péptidos y proteínas de la super­
ficie parasitaria. La respuesta inmunológica re­
sultante de la interacción huésped-parásito está
también condicionada por la localización de los
parásitos ya que éstos pueden ser intracelula­
res [T rypanosom a cruzi, L eish m a n ia spp.,
Plasmodium spp., Toxoplasma gondii, Trichi-
nella spiralis), intratisulares {Cysticercus ce-
llulosae, Echinococcus granulosas), de cavida­
des (parásitos de localización intestinal), o ex­
ternos (artrópodos). Estas localizaciones pue­
den además ser permanentes o temporarias de­
pendiendo del ciclo evolutivo del parásito.
Otra condición que influye en la com pleji­
dad de la estimulación antigénica es que los pa­
rásitos pasan por sucesivos estadios durante su
ciclo biológico y cada uno de éstos puede pre­
sentar antígenos distintivos. Los nematodos tie­
nen por lo menos 4 estadios larvarios y uno
adulto, y algunos protozoarios presentan dife­
rentes estadios en ei insecto vector y en el
huésped mamífero y, dentro de éste, varían de
acuerdo a su localización intra o extracelular
26
(por ej., T. cruzi). Además, y para aumentar la
complejidad, algunos parásitos varían sus antí­
genos en el tiempo, aun para el mismo estadio
(plasm odios y tripanosom as africanos). Esta
p erm an en cia p ro lo n g ad a del parásito , cuya
consecuencia es la exposición progresiva del
huésped a sus diferentes estímulos antigénieos,
conduce a una respuesta inmune que, en gene­
ral, lim ita la infección aunque no la erradica.
En ocasiones, el proceso de daño es consecuen­
cia de la misma re.spuesta inmune (esquistoso-
miasis, filariasis, paludismo, etc.). Sin em bar­
go, el hecho de que el parásito sobreviva en el
huésped y a sus expensas a pesar de la respues­
ta inmune, señala la existencia de mecanismos
que le permiten evadir in vivo la acción de los
anticuerpos y de las células sensibilizadas.
RELACIÓN H U É SP ED -P A R Á S ITO
Para estudiar esta relación deben considerarse
diversos factores, que se señalan a continuación.
1 - Inmunidad natural del huésped
Determina que, dentro de un número de indi­
viduos, algunos sean m ás su sce p tib le s que
otros a ciertas infecciones p arasita rias. Por
ejem plo, Plasmodium vivax no penetra en los
glóbulos rojos de individuos con grupo Duffy
negativo y se ha detectado una asociación sig­
nificativa entre HLA-B53 (molécula de clase I)
y resistencia a desarrollar formas severas de
paludismo. Experimentalmente se ha com pro­
bado que en leishmaniasis murina la resistencia
es regida por un gen dominante, Lsh, no ligado
al MHC, que controla la activación de macró­
fagos; esto determina las diferencias en la sus­
ceptibilidad de distintas cepas de ratones.
522 Inmunopatología

2 - Especificidad de huésped rante este lapso la defensa recae en una serie de

Los parásitos presentan en mayor o menor
grado especificidad con respecto a su huésped
por lo que algunos los seleccionan dentro de
determinadas especies de una manera muy res­
tringida, como por ejemplo el Enterobius ver-
rnicularis, especie de nerriatodo exclusivo del
humano. Otro ejemplo de huésped restringido
corresponde a las especies del género Plasmo-
dium, dentro del cual 4 parasitan exclusiva-
miente al hombre, existiendo otras con especifi­
cidad particular para otras especies de mamífe­
ro y de aves. Hay otros parásitos menos especí­
ficos que pueden infectar una amplia gama de
huéspedes, como por ejemplo el T.gondii, pará­
sito de mamíferos y aves, o el T.cruzi que pro­
gresa en diferentes especies de mamíferos in­
cluido el hombre, pero que es incapaz de hacer­
lo en las aves.
Una vez alcanzado su huésped,, los parásitos
en algunos de sus estadios pueden presentar
también alta especificidad por el sitio en que se
ubican (por ej. los esporozoítos de las especies
de Plasmodium que parasitan al hombre sólo
ingresan en el hepatocito, las larvas de esta­
dio de 'Trichinella spiralis, después de una m i­
gración inicial, se alojan intracelularmente en
músculo esquelético, los estadios adultos de
Cestodes sólo se ubican en la luz del intestino
delgado). Esto está en general determ inado
porque en ese hábitat particular los parásitos
encuentran las señales adecuadas para su desa­
rrollo y/o porque poseen receptores para ingre­
sar a un determinado nicho.
3 - Mecanismos de defensa no específicos
Después de una primera exposición al agente
infeccioso transcurre un tiempo hasta que se
monta una respuesta antígeno específica. D u­
mecanismos locales y sistémicos mediados por
factores humorales y fagocitos.
En el sitio de ingreso de los parásitos, sobre
todo si penetran por piel, se registra una reac­
ción local que sirve para lim itar la disem ina­
ción, y a la vez facilita el acceso de células in­
flamatorias y el gatillado de una serie de reac­
ciones sistém icas com o fiebre, leucocitosis,
producción de proteínas de fase aguda, activa­
ción de mecanismos microbicidas por los fago­
citos. Entre las proteínas de fase aguda la pro­
teína C reactiva actúa como opsonina colabo­
rando en la fagocitosis del patógeno. El com ­
plemento puede también favorecer la fagocito­
sis de algunos parásitos; además, en algunos de
ellos (o en algunos de sus estadios) existen en
su membrana externa factores activadores de la
vía alterna del complemento que conducen a su
destrucción sin requerir anticuerpos.
La llave que conecta la respuesta inespecífi­
ca con la específica es la secreción de lÉN-y e
IL-4, que inducen y modulan la actividad de
los linfocitos T hl y Th2.
4 - Mecanismos efectores de inmunidad
El huésped pone en marcha diferentes meca­
nismos para protegerse y limitar la masa parasi­
taria (cuadro 26-1). En la mayoría de los casos
se requiere de la acción combinada de diversos
eslabones de la respuesta inmune. En este pro­
ceso pueden participar m acrófagos, com ple­
mento, anticuerpos, mecanismos de citotoxici­
dad directos o mediados por anticuerpos, cito-
quinas, etc., y predominará la acción de unos
sobre otros dependiendo del parásito, del perío­
do de la infección y de las características gené­
ticas del huésped. Sin embargo, todos los esla­
bones de la respuesta inmune serán insuficien­
tes para erradicar las parasitosis en las que la

C u ad ro 26-1. Ejemplos de mecanismos inmunes de control de las parasitosis

M ecanism o efector Parasitosis E stadio/célula blanco

A nticuerpo,s lítico,>> E n f e rm e d a d d e i s u e ñ o T r ip o m a s tig o te

P a lu d is m o
E n fe rm e d a d d e C h a g a s
T o x o p la s m o s is
A nticuerpo.s n e u ti'a iiz an te s P a lu d is m o
E n fe rm e d a d d e C h a g a s
T o x o p la s m o s is
C ito to x ic id a d c e lu la r a n tic u e rp o - E n fe rm e d a d d e C h a g a s
d e p e n d ie n te P a lu d is m o
T riq u in o s is
Linfocito.s c ito tó x ic o s E n fe rm e d a d d e C h a g a s
E ritro c ito p a ra s ita d o
T rip o m a s tig o te
Z o ito c irc u la n te
E s p o ro z o ilo -M e ro z o ito
T rip o m a s tig o te
Z o ito c irc u la n te
T r ip o m a s tig o te
E ritro c ito p a ra s ita d o
L a rv a re c ié n n a id a
M io c ito p a ra s ita d o

M a c ró fa g o s a c tiv a d o s L e ish m a n ia s is A m a s tig o ie

T o x o p la .sm o sis Z o ito
D e g ra n u la c ió n c e lu la r d e b a s ó filo s H e lm in tia s is in te s tin a le s L a rv a s - A d u lto s
(Ig E )
 Inmunología de las infecciones parasitarias
multiplicación del parásito se perpetúa en el
mismo huésped. Hasta hace poco se afirmaba
que la leishmaniasis cutánea, producida por L.
trópica, en pacientes con reactividad inmunoló­
gica normal para el parásito, era una excepción;
sin embargo, el hecho de que en casos de SIDA
se hayan detectado reactivaciones en pacientes
supuestamente curados de la parasitosis, hace
que deban reverse estos supuestos.
El control efectivo es difícil de alcanzar en
parte por el complejo ciclo de vida de los pará­
sitos que en los sucesivos estadios pueden pre­
sentar antígenos propios, algunos de ellos nece­
sarios para el reconocimiento del huésped, teji­
do o célula donde el parásito se ubicará y por
los diversos mecanismos de escape de la res­
puesta inmune que los parásitos han desarrolla­
do. De la interacción entre la respuesta inmune
del huésped y los mecanismos de escape del p a­
rásito surge el estado de equilibrio que lleva a la
cronicidad de la mayoría de las parasitosis; si el
equilibrio se rompe puede producirse la enfer­
medad parasitaria y aun la muerte de la persona
parasitaria y esto dependerá tanto del parásito
(tamaño del inóculo, virulencia, etc.) como del
huésped (capacidad de respuesta inmune).
Los anticuerpos pueden favorecer el control
de la masa parasitaria de variadas maneras, por
ejem plo, bloqueando receptores parasitarios
(proteína CS del esporozoito en diversas espe­
cies de Plasm.odium), destruyendo al parásito o
a la célula infectada por activación del comple­
m ento o por A D CC (form as circulantes de
T. cruzi o eritrocitos infectados con P lasm o­
dium), opsonizando al parásito y promoviendo
su destrucción por fagocitosis (T.gondii, T.cru­
zi), activando mecanismos de degranulación en
mastocitos y basófilos, y secreción de mucus
por parte de las células caliciformes que, en el
caso de los verm es ubicados en el intestino,
contribuirían a su deterioro y eliminación.
En el hombre, un ejemplo de la participación
de los anticuerpos en los mecanismos de pro­
tección se evidencia en la infección por plas­
modios ya que, en área endémica y durante los
primeros meses de vida, los hijos de mujeres
infectadas presentan resistencia a la infección
malárica.
Sin embargo, los linfocitos T son las células
fundamentales para el control de la masa para­
sitaria; así, en ratones atímicos se ha demostra­
do un empeoramiento del transcurso de algunas
enferm edades, como por ejem plo en m alaria
murina y enfermedad de Chagas. El tipo de cé­
lula T involucrada depende de la naturaleza del
patógeno, de la ubicación del parásito, de las
características genéticas del huésped y del esta­
dio de la infección. Además, pueden actuar de
manera directa o mediante la secreción de cito-
quinas.
523
En el paludismo, por ejemplo, los linfocitos
T C D 8 son células efectoras de citotoxicidad
directa cuyo blanco es el hepatocito parasitario;
pero además, mediante la secreción de IFN-y,
inhiben la multiplicación del parásito en esta
célula. La falta de moléculas de clase II en el
hepatocito, y la ausencia de expresión de antí­
genos parasitarios en la membrana de estas cé­
lulas, hace que los linfocitos T CD4 sean ine­
fectivos. Éstos, sin embargo, participan en el
control de la fase eritrocítica por mecanismos
de ADCC, Usando glóbulos rojos que expresan
antígenos parasitarios en su superficie.
D entro de las células CD4 se reconocen 2
subpoblaciones; Thl y Th2, las que se diferen­
cian por las citoquinas que producen. El tipo
de subpoblación estimulada por un parásito es
producto de sus características, entre ellas el
modo de interacción con su huésped. En fun­
ción de que predomine una u otra población,
se estim ulará más eficientem ente un tip o de
respuesta que conducirá a una efectiva activa­
ción m acrofágica (T h l), con producción de
TNF e IFN-y, o deficitaria en activación m a­
crofágica (Th2) con producción de IL-4, IL-5
e ÍL-IO, inducción de la proliferación de LB,
producción exacerbada de IgE, activación de
mastocitos y eosinófilos. En general, la resis­
tencia contra parásitos intracelulares está aso­
ciada a T hl y la de parásitos extracelulares, a
Th2. Sin embargo, en la mayoría de las parasi­
tosis se estimulan ambos mecanismos, aunque
con diferente preponderancia, y la relación en­
tre ambos puede variar con el progreso de la
infección, ya que ambas poblaciones se inte-
rregulan negativamente. El concepto básico de
esta respuesta polarizada se extiende a b acte­
rias {IVlycobacteriun'i tuberculosis y iVI.leprae),
a virus y a hongos, pero las evidencias de este
fenómeno fueron presentadas en principio por
investigadores que trabajaban en modelos pa­
rasitarios. En ausencia de señales claram ente
polarizadas, puede aparecer una subpoblación
ThO con un perfil de citoquinas menos diferen­
ciado.
L a p articipación de estos subtipos d e LT
CD4 se ha estudiado muy bien en leishm ania­
sis, donde se ha demostrado experimentalmen­
te que para L.major la resistencia se asocia a la
producción de IFNry y que, si se transfieren cé­
lulas Th2 productoras de IL-4, se agrava el cur­
so de la parasitosis. En el caso de leishmaniasis
visceral, la estimulación antigénica in vitro de
linfocitos de pacientes produce secreción de
IL-10, la cual se inhibe después del tratamiento
antiparasitario. Una linfoquina probablemente
determ inante del subtipo celular que vaya a
predominar en una parasitosis dada es la IL-12
que junto con el IFN-y favorecería la diferen­
ciación de Thl.
524 Inmunopatología
Las células Thl al activar al macrófago, esti­
mulan el estallido respiratorio y la producción
de NO, lo ciue favorecerá el control de los pará­
sitos ubicados en el interior de estas células.
Los macrófagos activados secretan citoquinas;
una de ellas es el TNF que puede reforzar los
mecanismos inmunológicos tendientes a con­
trolar al parásito (¡eishmanias, esquistosómu-
las), pero tam bién puede ser responsable de
parte del daño producido en el huésped, como
sucede en malaria cerebral.
En las infecciones por helmintos una carac­
terística bastante generalizada es la eosinofilia,
consecuencia de la estimulación de eosinófilos
por un factor estimulador de colonias y que se
asocia con niveles elevados de IgE y mastoci-
tosis, todo ello como consecuencia de una res­
puesta inmune polarizada hacia Th2 por los an­
tígenos parasitarios. Se ha sugerido que la pre­
sentación de antígenos en el contexto de pro­
teasas, que son usadas por los vermes migran­
tes para pasar a través de los tejidos, mediaría
la maduración de las CD4 al fenotipo Th2.
La participación de las células NK como m e­
canismo efector de control de parasitosis está
menos explorada. Sin em bargo, se sabe que
funcionan en infecciones por Theileria parva,
un protozoario de linfocitos del ganado vacuno.
También se ha descrito su acción mediadora de
ADCC contra helmintos.
5 - Mecanismos de evasión de la respuesta
inmune utilizados por los p arásitos
Algunos de los mecanismos que utilizan los
parásitos para evadir las defensas del huésped y
asegurar así su persistencia, se resumen en el
cuadro 26-2.
a. Hábitat intracelular
Los parásitos de localización intracelular es­
tán protegidos de la acción directa que anti­
cuerpos o linfocitos puedan ejercer sobre ellos,
aunque éstos eventualmente puedan actuar so­
bre la célula huésped. Por lo tanto, una adecua­
da y rápida internalización celular les facilita la
evasión de la respuesta inmune del huésped.
El T. gondii y el P. falciparum secretan pro­
teínas que facilitan su internalización en célu­
las nucleadas y en eritrocitos, respectivamente.
El T. cruzi acelera su penetración tisular in vi­
tro en presencia de inmunosueros.
Cuando la célula invadida es un fagocito, los
parásitos deben desarrollar estrategias que les
posibiliten evadir la muerte por fagocitosis. El
T.cruzi y el T.gondii son capaces de invadir,
además de otras células nucleadas, a los fagoci­
tos, y las leishmanias sólo invaden macrófagos.
En estas células estos tres parásitos activan di-
Cuadro 26-2. M ecanism os p a ra sita rio s de
evasión de la respuesta inmune
M ecanism os Parásitos en ei que es efectivo
V a ria c ió n a n tig é n ic a Plasrnodium falciparum
Trypatiosonta rhoclesiense
M im eti.sm o Shistosom a m ansoni
Trypanosom a brucei
Trypanosom a vivax
“ C a p p in g ” L eishm ania donovani
Trypanosom a cruzi
E ntam oeha histolytica
E v a s ió n d e la a c tiv id a d mi- T oxopiasm a gondii
c i'o b ic id a d e l m a c ró fa g o Trypanosom a cruzi
L eishm ania sp p
In ra u n o d e p re s ió n d e l h u é s ­ P íasm odium fa lcip a ru m
p ed T rypanosom a cruzi
L eislim ania m exicana pifanoi
L o c a liz a c ió n in tra c e lu la r Trypanosom a cruzi
Toxopiasm a gondii
P íasm odium .spp
L ib e ra c ió n d e a n tíg e n o s T oxocara canis
R e s is te n c ia a la a c c ió n del Leishm ania sp p
c o m p le m e n to Trypanosom a sp p
versos m ecanism os que los protegen de los
efectores normales de la fagocitosis. El T.cruzi,
en su estadio intracelular o amastigote, secreta
una hemolisina activa a pH 5,5 que actuaría li-
sando la vacuola parasitófora y permitiendo el
escape del parásito al citoplasma. Estas vacuo­
las son acídicas. Existe una analogía entre la
acción de esta hemolisina y la lisis por comple­
mento. El T.gondii al contactar a una célula,
primero se orienta y luego sus roptrías secretan
diversos componentes entre ellos el PEF (“Pe-
netration enhancement factor”) que facilita la
penetración, mientras que una vez en el interior
de la célula, proteínas de los micronemas y de
los cuerpos densos contribuyen a form ar la
m em brana de la vacuola parasitófora que lo
protege de la acidificación y de la fusión con
los lisosomas, con permeabilidad selectiva que
permite la nutrición del parásito.
Las leishm anias entran pasivamente en las
células macrofágicas y se multiplican en la va­
cuola fagocítica resistiendo a la digestión. Los
componentes que actuarían protegiendo al pa­
rásito son un lipofosfoglicano (LPG) que inhi­
be el estallido respiratorio, una superóxido dis-
mutasa que degrada el radical anión superóxido
de los peroxisomas del fagocito, una proteasa
(GP63) que degrada las enzimas lisosomales, y
una fosfatasa ácida.
En todos los casos estos parásitos pueden ser
fagocitados y destruidos más eficientemente si
los macrófagos están activados, lo que explica
que en general, con la progresión de la infec­
ción, los m acrófagos puedan participar en el
control de la parasitosis.
 Inmunología de las infecciones parasitarias
h. Variación antigénica
Fue descrita como “un fenómeno que se pro­
duce durante la infección de un huésped por
una especie única de protozoario patógeno, a
partir del la cual se origina una sucesión de po­
blaciones parasitarias, cada una de ellas reco­
nocida como antigénicam ente distinta por la
respuesta inmune del huésped.
Esto determina la formación de anticuerpos
específicos para cada población, los que pueden
evidenciarse m ediante pruebas de reconoci­
miento de los antígenos de superficie del parási­
to o de las células parasitadas (aglutinación, Ji-
sis, etc.)” (Doyle, 1975). Este fenómeno que
ocurre en un único huésped y en un corto perío­
do (semanas o meses) ha sido comparado con lo
que ocurre con el virus de la influenza a nivel
de la población mundial y en períodos de años.
La capacidad de variación antigénica ha sido
probada para diversas especies de tripanosomas
africanos y plasmodios. Los antígenos varia­
bles son glucoproteínás de superficie (VSGs)
que determinan el tipo de variable antigénica
(VATs). El número de genes capaces de codifi­
car VSGs en tripanosomas africanos es extenso
(teóricamente más de 1 0 0 0 ), pudiendo expre­
sarse a partir de una infección clonal cientos de
VATs; además, el repertorio de VSGs puede
variar para diferentes poblaciones parasitarias.
En e] caso del género Plasmodium, los eritroci­
tos parasitados expresan la variante antigénica
en la superficie. Además se ha demostrado que
la CSP (“circum sporozoite surface protein” ,
proteína de superficie del esporozoito) de algu­
nas especies de este género también manifies­
tan variabilidad clonal.
El fenóm eno de variación antigénica debe
ser considerado cuando se intenta desarrollar
una vacuna, ya que la neutralización de un antí­
geno variable puede ser sumamente ineficiente
contrastando con la elevada eficiencia de este
mecanismo de escape.
c. Mimetismo
Consiste en la adquisición o síntesis por par­
te del parásito de com ponentes propios del
huésped que lo harán pasar inadvertido para ei
sistema inmune o interferirán por acción mecá­
nica en la interacción entre los anticuerpos y/o
células y el parásito. Así, en el Trypanosoma
vivax, parásito de caprinos y bovinos, se han
descrito globulinas alfa y beta, cuyo reconoci­
miento se realizó por lisis del parásito em ­
pleando inmunosueros antiglobulinas de ratón
en presencia de complemento. Esto también ha
sido descrito para T.brucei.
Este fenómeno ha sido observado no sólo en
protozoarios sino también en metazoarios. En
525
el caso de los esquistosomas se ha demostrado
que el parásito en su estadio adulto es capaz de
estimular la respuesta inmune sin ser afectado
por ella (inmunidad concomitante) ya que es
capaz de evadirla enmascarando su superficie
con antígenos provenientes del huésped o codi­
ficados por él a semejanza del huésped. E xperi­
mentalmente se ha demostrado que estos antí­
genos suelen presentarse como glucolípidos
(grupos sanguíneos, antígenos de Forssm an,
etc.) y excepcionalmente como glucoproteína
(MHC). También se ha demostrado la presen­
cia de inmunoglobulinas, las que se adherirían
por el fragm ento Fe a receptores específicos
presentes en la superficie del parásito.
d - “Capping"
La membrana de la célula eucariota es una
estructura dinámica y fluida y, en consecuen­
cia, las proteínas pueden redistribuirse m odifi­
cando su posición. La movilidad de estas p ro ­
teínas puede ser inducida o acelerada por anti-
cuei-pos o por otras sustancias (por ej., conca­
navalina A) constituyendo complejos que tien­
den a agruparse formando un casquete o “cap ”,
generalmente cerca del aparato de Golgi; estos
complejos luego serán exocitados o endocita-
dos por la célula.
El fenómeno, denominado “capping”, se ha
descrito para algunos protozoarios como Enta-
moeba histolytica, T.cruzi, L.donovani, T .gon­
dii, etc. Una rápida redistribución de los co m ­
plejos antígeno-anticuerpo en la superficie de
un parásito puede determinar que las inmuno-
globulinas que participan de dichos complejos
presenten una distribución espacial que im pida
la adecuada fijación del complemento, evitán­
dose así la lisis del parásito. El recambio de an­
tígenos de superficie puede también evitar que
se e je c u te n otro s m e c a n ism o s eom o el de
ADCC o citotóxicos por linfocitos T CD 8 +.
í? - Elem.entos distractores
de la respuesta inmune
En esta categoría podemos considerar la li­
beración de antígenos al medio y la existencia
de antígenos inmunodominantes (¿superantíge­
nos?) carentes de la funcionalidad requerida
para la sobrevida del parásito.
i - Liberación de antígenos
Algunos de los mecanismos por los que es­
tos antígenos pueden interferir en la respuesta
inmune son;
• Combinación con anticuerpos neutralizando
su acción.
526 Inmunopatología
» Bloqueo de las células efectoras, directamen­
te, o por formación de inmunocomplejos.
“ Inducción de tolerancia T o B.
® Activación policlonal en respuesta a compo­
nentes mitogénicos del parásito.
” Activación de células supresoras.
Este mecanismo es importante para la persis­
tencia de algunos nematodos, como por ejem­
plo el Toxocara canis, que es capaz de secretar
elevadas cantidades de antígeno y cuya larva
de segundo estadio puede permanecer viable en
el ser humano por largos periodos. En S. man-
soni se alcanza la inhibición de los LT citotóxi­
cos por inmunocomplejos, y en la mayoría de
las infecciones por protozoarios tisulares se ge­
neran activación policlonal e inmunodepresión
relativa (paludism o, enferm edad de Chagas,
enfermedad del sueño, etc.).
ii - Antígenos inmunodominantes
como distractores
En el caso del T.cruzi la trans-sialidasa es
una proteína que ha sido relacionada con el
proceso de invasión celular. Está formada por
dos dominios, uno altamente antigénico consti­
tuido por unidades repetitivas y denominado
SAPA, y el otro catalítico. El antígeno SAPA
genera altos títulos de anticuerpos que no son
capaces de inhibir la actividad enzimática. Esta
actividad sería requerida por el parásito para
transportar sobre su superficie ácido siálico,
molécula requerida para interaccionar con las
células hospedadoras iniciando así el proceso
de internalización. La respuesta inmune al antí­
geno dom inante durante la infección aguda
protegería al sitio catalítico permitiendo así la
internalización celular del parásito. Pasado el
período agudo de la infección por T.cruzi, se
detectan anticuerpos anti-trans-sialidasa que
podrían participar en el control de la infección.
f - Preadaptación y resistencia al complemento
El término preadaptación se aplica para defi­
nir el proceso de diferenciación de vm parásito,
dentro del insecto vector, que lo habilita para
sobrevivir y establecer la infección en el hués­
ped mamífero. Una de las estrategias más im ­
portantes de la preadaptación es el desarrollo
de la resistencia al complemento. Este proceso
es de gran im portancia en T.cruzi, tripanoso­
mas africanos y leishmanias.
El estadio epimastigote de T. cruzi, replicati-
vo y no infectivo, que se encuentra en el intes­
tino de la vinchuca, es sensible al complemen­
to. El estadio tripomastigote metacíclico, no re-
plicativo e infectivo, que se elimina con las de­
yecciones del vector, es resistente al com ple­
mento. Este último es semejante en sus caracte­
rísticas al tripomastigote circulante y al tripó-
mastigote obtenido en cultivos celulares y axé-
nicos. Las evidencias experimentales sugieren
claramente que la serorresistencia de este esta­
dio es una consecuencia de la pobre activación
del complemento por parte de los estadios in­
fectivos. A diferencia de lo que ocurre en los
estadios no infectivos que fijan C3 a un recep­
tor de su mem brana convirtiéndolo luego en
C3b. El C3 fijado a los estadios tripomastigotes
(infectivos), además de depositarse entre 7 a 8
veces menos, se convierte principalm ente en
C3bi, fallando en consecuencia en el gatillado
de la cascada que conduce a la formación de
C5b-9 y a la lisis del parásito. La ineficacia del
C3 fijado al estadio infectivo de este parásito
es el resultado de la producción de una molécu­
la funcionalm ente símil al Factor A celerador
del Decaimiento (DAF) presente en los huma­
nos. Esto en última instancia es una modalidad
de mimetismo ya que el parásito está produ­
ciendo proteínas homólogas a las del huésped
para restringir la acción del complemento.
En el caso de las leishmanias, se ha demos­
trado que el promastigote en la fase de creci­
miento logarítmico de un cultivo, cuando aún
no es infectivo, es sensible a la acción del com­
plemento, mientras que en la fase estacionaria
(promastigotes maduros) es infectivo y resis­
tente al complemento. El promastigote maduro,
al ser inoculado en el huésped mamífero, activa
la vía alterna del complemento con dos conse­
cuencias : a) atrae macrófagos al sitio de entra­
da y, b) facilita la adhesión del parásito a los
receptores RC3 del macrófago y su posterior
fagocitosis; ambos hechos favorecen la sobre­
vida del parásito ya que su hábitat exclusivo es
esta célula.
Este parásito tiene sobre su superficie un li-
po fosfoglicano (LPG) y una glucoproteína,
GP63, ambos implicados en la unión del pará­
sito al macrófago y a su posterior internaliza­
ción; como ya se mencionó, ambos participan
en los mecanismos de resistencia a las enzimas
lisosomales e inhibición del estallido respirato­
rio de estas células. Los promastigotes maduros
fijan C3 que se transforma en C3b, con la con­
siguiente activación de C5b-9; sin embargo, la
elongación del LPG impediría la inserción de
C5b-9 y produciría su liberación impidiendo la
lisis del parásito.
6 - Mecanismos de patogenicidad
En ausencia de un patógeno, la respuesta in ­
mune específica está limitada por mecanismos
supresores que operan a nivel clonal (redes
idiotipo-antiidiotipo) o policlonal (citoquinas
supresoras como IL-IO), pero persisten meca­
 Inmunología de ¡as infecciones parasitarias
nismos de memoria inmunológica, asociados a
la presencia de células de memoria en sangre
periférica. Las infecciones parasitarias, como ya
se ha mencionado, tienen habitualmente evolu­
ción crónica, a diferencia de la mayoría de las
infecciones bacterianas y virales. Como resulta­
do de la cronicidad se manifiesta persistencia
antigénica, que da lugar a dos fenómenos dife­
rentes desde el punto de vista inmunológico.
Por un lado, se desarrollan los mecanismos de
inmunidad concomitante y, por otro, se pueden
presentar reacciones de hipersensibilidad. En
relación a esta liltima posibilidad, debemos con­
siderar que en algunos casos existe, además,
identidad antigénica entre macromoléculas del
huésped y el parásito (mimetismo molecular)
dando lugar a fenómenos autoinmunes. Por otra
parte, ciertos antígenos son capaces de activar
en forma diferente subpoblaciones de linfocitos
T cooperadores (linfocitos Thl y Th2) que pro­
ducen distintas linfoquinas dando lugar a las
reacciones de hipersensibilidad por activación
de determinadas células efectoras (macrófagos,
eosinófilos, mastocitos, etc.).
Algunas parasitosis inducen reacciones in-
munológicas las cuales, a su vez, desempeñan
un papel primordial en la patogenia de la enfer­
medad parasitaria. A continuación describire­
mos algunos ejemplos.
Los adultos del helm into S. mansoni viven
en las vénulas m esentéricas inferiores. Las
hembras ovipositan y los huevos son arrastra­
dos por la circulación portal hacia el hígado,
quedando retenidos en el endotelio vascular
merced a la presencia de una espíenla y al pe­
queño calibre de algunos capilares. Los huevos
poseen gran diversidad de antígenos, que en
conjunto se denominan antígenos solubles del
huevo (SEA, soluble egg antigens), de carácter
proteico con pesos m oleculares desde m enos
de 21 kD a más de 200 kD. Algunas de estas
proteínas tienen capacidad linfoestimulatoria,
com o la p ro teín a m ayor lin fo e stim u lato ria
(LMP), cjue es una proteína acídica. Los SEA
promueven, además, la formación de un granu­
loma periovular, debido a que desencadenan
una reacción de hipersensibilidad retardada. El
desarrollo y mantenimiento del granuloma está
bajo control de distintas subpoblaciones de lin­
focitos T, que modulan el tamaño del mismo
mediante citoquinas. Además de las citoquinas
clásicamente descritas, otras más recientemente
caracterizadas tienen un papel importante en el
desarrollo del granuloma. Por ejemplo, el fa c ­
tor estimulante del los fibroblastos-1 (E sF - 1 ,
PM 60 kD, pl 6,2), producido por linfocitos T
CD4, promueve la multiplicación de fibroblas­
tos y la síntesis de hialuronanos y fibronectina.
Esta última es, además, un quimioatractor de
fibroblastos. Este factor sería el responsable de
527
la fibrosis hepática observada en el curso de la
infección. Se ha comunicado que los linfocitos
de pacien tes con fibrosis severa responden
fuertemente a antígenos del huevo de S. nmn-
soni en la fase crónica. Existen evidencias que
indican que la intensidad de la resp u esta es
controlada por el MHC: individuos con haplo­
tipos HLA-A2 y B12 responden fuertemente y
manifiestan fibrosis severa con mayor frecuen­
cia, en tanto que pacientes con haplotipo HLA-
DR2 tienen escasa reactividad y menor in ci­
dencia de fibrosis severa.
El análisis de clones de linfocitos T CD4 hu­
manos de pacientes con esquistosomiasis revela
que estos pueden ser de tipo ThO, T hl, T h2 y
Th3 (estos últimos producen IL-5 disociada de
la producción de IL-4). Se ha observado que las
distintas poblaciones de Th reconocen antíge­
nos de diferente peso molecular. Los linfocitos
Th2 serían responsables de la producción de an­
ticuerpos y de la eosinofilia periférica observa­
das en la fase crónica de esta parasitosis. Los
SEA tam bién prom ueven la proliferación de
clones CDS supresores (CDllb-h) y citotóxicos
(C D llb -), productores de IFN-y, con capacidad
regulatoria de la formación del granuloma. Es­
tudios in vitro e in vivo demuestran que esta ci­
toquina es activa en la fase de inducción y cre­
cimiento del granuloma, en tanto que las IL -2 e
lL-4 son activas en la fase de mantenim iento
del mismo, probablemente mediante m ecanis­
mos de retroalimentación negativa entre los lin­
focitos CD4 Thl y Th2, respectivamente. A es­
tos mecanismos de retroalimentación mediados
por citoquinas se agregarían mecanismos de re­
gulación específica mediados por linfocitos T
autoantiidiotípicos y la acción de macrófagos
in trag ra n u lo m ato so s los cuales pro m u ev en
anergia de linfocitos T h l a SEA in vitro. La
causa de la anergia sería la modulación de ia
molécula B7 en las células presentadoras de an­
tígeno (CPA), con lo cual la señal coestimulato­
ria para la activación de los linfocitos T h l, ejer­
cida a través de la unión de CD28 (o CTLA-4)
a B7, no sería posible. Otras citoquinas que ten­
drían un papel preponderante en la generación
de la anergia son e\ factor de crecimiento trans-
form ante-p (TGF-p), producido por los m acró­
fagos activados presentes en el granuloma, y la
IL-10, producida por linfocitos T CD4 Th2, lin­
focitos B y macrófagos. De hecho, esta citoqui-
ma es la responsable de la modulación de B7 en
Jas CPA. Por último, se ha observado que pro­
teínas de choque térmico, que serían traducidas
durante la inflamación granulomatosa, inhiben
la actividad de macrófagos como CPA m edian­
te el mismo mecanismo.
Otra parasitosis en la cual se han observado
fenóm enos inm unopatogénicos es el p alu d is­
mo. Establecida la invasión de los eritrocitos.
528 Inmunopatología
los posteriores fenómenos que llevan a la pato­
logía están ligados con algunos de los siguien­
tes mecanismos: lisis inmune de eritrocitos pa­
rasitados y no parasitados, glom erulonefritis
por deposición de inmunocomplejos y, en palu­
dismo por P . falciparum, malaria cerebral.
Las propiedades adhesivas de los eritrocitos
parasitados, responsables del secuestro de eri­
trocitos parasitados por P. falciparum a nivel
visceral y cerebral, están relacionadas con la
presencia de receptores específicos en el endo­
telio vascular, conocidos como moléculas de
adhesión celular (CAM); gp CD36 en plaque­
tas (formación de un puente entre eritrocitos
parasitados y el endotelio vascular), ICAM-1,
tro m b o sp o n d in a, E -se le c tin a (E L A M -1) y
VCAM-1, entre otros.
En la infección por P. falciparum, se ha iden­
tificado un antígeno presente en eritrocitos pa­
rasitados (PfEMP-1) el cual está asociado a la
unión de eritrocitos al endotelio. Esta molécula
sería la responsable de la form ación de los
“knobs”, pequeñas protuberancias en el eritroci­
to, de los cuales depende la adhesión de los
mismos al endotelio vascular. La presencia de
diversas CAM que promueven la unión de eri­
trocitos parasitados al endotelio es de funda­
mental importancia al considerar la malaria ce­
rebral y su patogenia. La formación de micro-
trombos que originan focos de isquemia, hipo-
glucemia y necrosis, daría lugar a un proceso
inflamatorio en el que los macrófagos juegan un
papel fundamental. La liberación de citoquinas
(ÍL-1 y TNF) por estas células induce la pro­
ducción NO. Este factor es producido, además,
por los neutrófilos atraídos al foco necrótico,
por las células endoteliales y por el mtísculo li­
so vascular. El pasaje del NO desde el torrente
circulatorio al parénciuima cerebral sería posible
merced al carácter no polar de la molécula. El
NO, identificado actualmente como el Factor
relajante del endotelio vascular (EDRF) daría
lugar, como consecuencia de su liberación lo­
cal, a un aumento del volumen sanguíneo cere­
bral y, por consiguiente, a hipertensión endocra-
neana. Paralelamente, el aumento sistémico de
este mediador sería responsable de la hipoten­
sión sistémica observada en algunos pacientes.
Cuadros similares se han comunicado en pa­
cientes sometidos a terapia antineoplásica con
TNF, lo que apoya lo observado sobre la acción
de esta citoquina en la malaria cerebral.
Las parasitosis precedentes presentan como
rasgo característico un evidente sesgo hacia m e­
canismos inmunes celulares de daño tisular si
bien, como se enunció en el caso de paludismo,
los mecanismos pueden ser mixtos, con compo­
nentes tanto humorales como celulares. En con­
traposición, las helmintiasis intestinales presen­
tan como rasgo característico un componente
inmunopatológico primariamente desencadena;-
do por la respuesta humoral. En las infecciones
por nematodos se observa frecuentemente hi­
perproducción de IgE y eosinofilia periférica. Si
bien arin no se comprende totalmente la rela­
ción entre la identidad estructural de los antíge­
nos parasitarios y los mecanismos que determi­
nan el “switch” de isotipo de IgM a IgE en los
linfocitos B, lo cierto es que esos antígenos pre-
.sentan algunas características com unes con
alérgenos ambientales, responsables de proce­
sos atópicos: punto isoeléctrico acídico y bajo
peso molecular (generalmente en el rango de 1 0
kD a 70 kD). Una característica pecuhar de los
alérgenos de nematodos es que estos se sinteti­
zan com o proteínas de alto peso m olecular
(200-400 kD) formadas por unidades repetiti­
vas, que son olivadas por enzimas proteolíticas.
Estas proteínas muestran homología secuencial
entre sí pero no con otras proteínas. Sus propie­
dades alergénicas dependerían de la estructura
primaria, ya que el sometimiento de las mismas
a calor no afecta estas propiedades. Estos alér­
genos serían tanto componentes somáticos co­
mo proteínas de excreción-secreción de los ne­
matodos. Aparte de las características estructu­
rales particulares de estos alérgenos, las caracte­
rísticas genéticas del huésped parecen tener
gran importancia: en modelos experimentales se
ha demostrado que ratones endocriados con di­
ferente haplotipo de histocom patibilidad res­
ponden generando IgG o IgE contra el mismo
alérgeno. Aun más, estudios realizados con ad­
yuvantes demuestran que el sesgo hacia la pro­
ducción de IgE estaría relacionado con diferen­
cias en el procesamiento y presentación antigé­
nicos que determinaría la expansión clonal de
células Th2, con la consiguiente producción de
citoquinas inductoras del “switch” IgM/IgE.
Los ejemplos precedentes ilustran la comple­
jidad de mecanismos inmupatogénicos desen­
cadenados en las parasitosis (cuadro 26-3). La
importancia de su conocimiento, a nivel celular
y molecular, reside en la posibilidad, a partir de
ello, de interferir en el desencadenamiento de
la patología sobre la base de terapias racional­
mente fundadas.
INMUNODIAGNÓSTICO
En parasitología, la detección de anticuerpos
específicos es tradicional y se utiliza con fines
diagnósticos mientras que la respuesta mediada
por células, si bien se ha encontrado positiva pa­
ra muchas de las infecciones parasitarias, sólo
ha sido empleada para diagnóstico de unas po­
cas (por ej., toxoplasmosis y leishmaniasis). La
incorporación de antígenos definidos, de mayor
especificidad, es útil en el diagnóstico diferen­
cial de especies y/o géneros relacionados, como
 Inmunología de tas infecciones parasitarias 529

Cuadro 26-3. Mecanismos patogénicos dependientes de la respuesta Inmune en algunas infec­

ciones parasitarias

Parásito M ecanism o P atología

S. m ansoni H ip e rs e n s ib ilid a d re ta rd a d a a S E A G ra n u lo m a s h e p á tic o s e in te s tin a le s

Plasm odium s p p L is is d e e ritro c ito s p a ra s ita d o s y n o p a ra sita rio s A n e m ia
P. fa lcip a rum P ro d u c c ió n a u m e n ta d a d e T N F y N O M a la ria c e re b ra l, h e m a tu ria se v e ra (“b la c lt-
w a te r f e v e r ”)
P. m alariae D e p o s ic ió n d e co tB p lejo s in m u n e s G lo m e ru lo n e fritis , s ín d ro m e n e fró tic o
A sca ris lum hricoides y H ip e rs e n s ib ilid a d tip o I a a n tíg e n o s d e excreción- “R iis h ” e rite m a to s o , s ín d ro m e de L o e f fle r,
o tro s n e m a to d o s s e c re c ió n e n te ritis a lé rg ic a

es el caso de T.cruzi y Leishmania spp. En algu­ VACUNAS

nos casos también se realiza la búsqueda de an­
tígenos en sangre, orina, materia fecal y material La manera ideal de realizar profilaxis en en­
de biopsias, por técnicas inm unoenzim áticas, fermedades infecciosas es contar con una vacu­
utilizando anticuerpos monoclonales o policlo­ na segura, que estimule la respuesta de m odo
nales. Todos estos métodos tienden a lograr una persistente, brindando protección duradera a un
mayor especificidad y sensibilidad diagnóstica y alto porcentaje de la población que la recibe.
pueden ser sumamente útiles especialmente en En la infección natural por virus, en general se
los pacientes inm unocom prom etidos. Con el adquiere esta inmunidad duradera, que brinda
mismo propósito, recientemente se han incorpo­ resistencia a reinfecciones. En el caso de los
rado técnicas diferentes del inmunodiagnóstico, parásitos, salvo excepciones, la resistencia a in­
como la detección de ADN por sondas específi­ fecciones se relaciona con el fenómeno de in­
cas (PCR e hibridación). munidad concom itante y se sospecha fu e rte ­
Para el inm unodiagnóstico de rutina deben mente que desaparecida la persistencia del estí­
seleccionarse una o más pruebas según su obje­ mulo antigénico los mecanismos efectores de
tivo. Este puede ser esclarecimiento del diag­ defensa disminuirían hasta hacerse inefectivos.
nóstico individual, prevalencia de la enferme­ Este fenómeno llega a su máxima expresión en
dad en una población dada, discriminación en­ los casos de paludismo, donde la resistencia se
tre dadores de sangre reactivos y no reactivos, adquiere después de años de infecciones recu­
etc. En el cuadro 26-4 se resumen las pruebas rrentes y se extingue rápidamente a menos que
más utilizadas en el diagnóstico de diversas p a­ la persona esté expuesta a reinfecciones fre­
rasitosis. cuentes.

C uadro 26-4. Métodos de inmunodiagnóstico utilizados en parasitología

In m unidad hum oral

Inm unidad c e lu la r
Parasitosis D etección de antígeno Serología ID R IDR

Protozoarios

A m e b ia s is C I E (su e ro ), E L IS A F C , FIA I, lE F , IP , E L IS A No No
( m a te ria fec a l)
P a lu d is m o E L IS A E C , H A I, IF I, E L I S A . R IA No No
L e ish m a n ia s is IF I, P A P F C , IF I, H A I, A D , E L IS A No Sí
T r ip a n o s o m ia s is a m e ric a n a IP , P A P F C , H A I, IF I, A D , E L IS A No No
T r ip a n o s o m ia s is a fric a n a F C , IF I, IP , H A I, A D , E L IS A No No
T o x o p la sm o s is E L IS A ( a g u d o s o r e a c ti­ E L IS A , D T , IF I, H A I, ■N o N o*
v a c io n e s ) IS A G A (Ig M )
H elm intos

T riq u in o s is H A I, IF I, IP , T F , T E Sí No
T o x o c a ria s is E L IS A , H A I No
A s c a rid ia s is E L IS A , H A I No
E squi.stosom iasi,s E L IS A , I F I F C , IF I, IP , T F , E L IS A No No
H id a tid o s is F C , H A I, lE F , IP , T F , T L No No
C is tic e rc o s is C IE , H A I, E L I S A No

A D : a g lu tin ac ió n d irec ta, C IE : c o n tra in m u n o e lectro fo resis, D T : d y t-test (S ab i-F cld m an ), FC; fijación d e co m p lem e n to , H A I: h e m o a g lu tin a ­
ción in d irec ta , ID R : in trad e rm o rre acc ió n , lE F : in m u n o elec tro fo re sis, IP: in m u n o p rec ip itac ió n , IS A G A : te s t de in m u n o ag lu tin a ció n e n fase
só lid a , P A P : p ero x id a sa-a n ti-p ero x id a sa , R ÍA : ra d io in m u n o an á lisis, T L : test d e látex .
* S ólo e x c ep c io n a lm e n te en alg u n o s países.
530 Inmunopatología
En el desarrollo de una vacuna también debe
considerarse la seguridad de la misma. Esto
implica que no pueda revertir en su virulencia
(riesgo de las vacunas de microorganismos ate­
nuados ) y que no contenga moléculas nocivas
para quien será vacunado. Si consideramos que
en numerosas enfermedades parasitarias el da­
ño es de carácter inmunológico, deberá descar­
tarse el riesgo de producir daño con los antíge­
nos parasitarios que compongan la vacuna. Si a
estas dificultades le agregamos ios mecanismos
de escape de la respuesta inmune que pueden
poner en marcha los parásitos y los cambios
antigénicos que los mismos sufren durante sus
sucesivos estadios evolutivos, entendemos por
qué aún no se han desarrollado vacunas efecti­
vas contra parásitos de interés humano.
Sin embargo, el conocimiento molecular de
los parásitos está abriendo uno de los caminos
posibles para el desarrollo de inm unógenos
efectivos. Este conocimiento está permitiendo
determinar qué moléculas están implicadas en
la selección del huésped y, dentro de él, la se­
lección del tejido o célula en que el parásito se
instalará, las señales que se inician desde la
membrana del parásito y que son indispensa­
bles para que se gatille su diferenciación a un
nuevo estadio (sin esta diferenciación se inte­
rrumpe el ciclo), las moléculas distractoras de
la respuesta inmune que se constituyen en antí­
genos mayores y que protegerían a otros de
menor antigenicidad pero cuya funcionalidad
es indispensable para la sobrevida del parásito.
Como los parásitos tienen un ciclo complejo
y como en cada parte del ciclo pueden variar
las moléculas im plicadas en cada uno de los
procesos antes mencionados, es muy probable
que para alcanzar una vacuna efectiva deba
considerarse el uso com binado de antígenos
destinados a interrumpir el ciclo en úna suma­
toria de blancos. Un ejemplo podría ser una va­
cuna anti-palúdica que interfiera tanto con la
CSP*** a un receptor del hepatocito, iniciando
así su invasión, como en el establecimiento del
parásito en el eritrocito, disminuyendo la carga
parasitaria y la incidencia de formas clínicas.
La eficiencia parcial, por separado, se ha pro­
bado en ambos casos, por lo que hoy ya se pue­
de hablar de vacuna antim.alaria, aunque toda­
vía falten estudios para que la misma se apli­
que sistemáticamente a la población en riesgo,
y aunque, por el momento, no se haya pensado
en el uso de ambas moléculas para lograr una
vacuna combinada.
Actualmente, se está trabajando en diversos
laboratorios del mundo con el objeto de identi­
ficar moléculas con capacidad de inducir pro­
tección contra diferentes parásitos tales como
Schistosoma spp., T.cruzi, Leishmania spp. y
T.spiralis, entre otros.
BIBLIOGRAFÍA
A s h C , G a tla g h e r R B (E d s ): I m n u n o p a r a s ito lo g y to d a y .
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In c. N e w Y o rk , 1993.
Inmunología en las infecciones
virales
RAMÓN A. DE TORRES
JUAN ANGEL BASUALDO
MARTA C. MINVIELLE
1. Introducción
Las características biológicas de los agentes
virales, su difícil visualización por microscopía
electrónica y el necesario desarrollo de m ode­
los vacunales aplicados al control de las infec­
ciones humanas y anim ales, han generado la
necesidad de un estudio profundo de la re s­
puesta inmune en el campo de la virología.
Aiin hoy la caracterización de una población
viral se basa fundamentalmente en la capacidad
de estos viríones de infectar células suscepti­
bles y su reconocimiento posterior está relacio­
nado siempre, en forma directa o indirecta, con
cualquiera de las muchas técnicas que se basan
en principios inmunológicos.
A través de la historia, las vacunas han sido
las formas más efectivas e importantes de con­
trolar las infecciones virales.
El gran desarrollo científico en los campos
de la virología y de la inmunología ha perm iti­
do comprender los mecanismos de protección
por los cuales algunas vacunas desarrolladas
casi empíricamente hace muchos años, han ser­
vido en el control de las enfermedades virales
de alta incidencia en seres humanos y anim a­
les. Este avance, sin embargo, es aún insufi­
ciente para explicar muchos fenómenos de ia
relación virus-huésped en infecciones agudas,
crónicas, degenerativas y oncogénicas, lo que
mantiene la necesidad de una profunda y conti­
nua investigación de estos problemas.
El estudio de la respuesta inmune en la in­
fección viral de un individuo incluye fu n d a­
mentalmente los siguientes aspectos;
a) establecer la cinética de síntesis de antí­
genos virales y su localización en las células en
las que se inicia la infección y los blancos en
tejidos secundarios, cuando los hay;
b) establecer cualitativa y cuantitativamente
las características de la respuesta inmune h u ­
moral, informando sobre la cinética de síntesis
de inmunoglobulinas. Este estudio se completa
correlacionando su aparición con mecanismos
específicos de reacción con los antígenos vira­
les, como formación de complejos inmunes, in­
ducción de citotoxicidad mediada por com ple­
mento, fenómenos de bloqueo, etc.;
c) detectar y cuantificar las modificaciones
que se producen en las células inmunocompe­
tentes, en función de la agresión viral, con es­
pecial referencia a la capacidad de células lin­
foides tipo T de reconocer e interaccionar con
células infectadas (inmunidad mediada por cé­
lulas);
d) estudiar la respuesta general inespecífica,
analizando la participación del interferón en el
curso de la infección u otros mediadores (linfo­
quinas) asociados al fenómeno de respuesta in­
flamatoria. En este nivel inespecífico la im por­
tancia de células con capacidad citotóxica natu­
ral (NK, natural killer) y células con funciones
endocíticas es cada vez más evidente en el con­
trol del inicio de la infección viral.
Cuando esta información se correlaciona es­
tadísticam ente con la evolución clínica y los
estudios citoanatomopaíológicos, recién enton­
ces se puede construir un cuadro descriptivo
completo de la enfermedad, que es la base ne­
cesaria para establecer la correcta aplicación e
interpretación de técnicas de laboratorio en
función diagnóstica. De una manera fundam en­
tal, la integración de un sólido estudio inmuno-
lógico perm itirá com prender los mecanism os
530 Inmunopatología
En el desarrollo de una vacuna también debe
considerarse la seguridad de la misma. Esto
implica que no pueda revertir en su virulencia
(riesgo de las vacunas de microorganismos ate­
nuados ) y que no contenga moléculas nocivas
para quien será vacunado. Si consideramos que
en numerosas enfermedades parasitarias el da­
ño es de carácter inmunológico, deberá descar­
tarse el riesgo de producir daño con los antíge­
nos parasitarios que compongan la vacuna. Si a
estas dificultades le agregamos ios mecanismos
de escape de la respuesta inmune que pueden
poner en marcha los parásitos y los cambios
antigénieos que los mismos sufren durante sus
sucesivos estadios evolutivos, entendemos por
qué aún no se han desarrollado vacunas efecti­
vas contra parásitos de interés humano.
Sin embargo, el conocimiento molecular de
los parásitos está abriendo uno de los caminos
posibles para el desarrollo de inm unógenos
efectivos. Este conocimiento está permitiendo
determinar qué moléculas están implicadas en
la selección del huésped y, dentro de él, la se­
lección del tejido o célula en que el parásito se
instalará, las señales que se inician desde la
membrana del parásito y que son indispensa­
bles para que se gatille su diferenciación a un
nuevo estadio (sin esta diferenciación se inte­
rrumpe el ciclo), las moléculas distractoras de
la respuesta inmune que se constituyen en antí­
genos mayores y que protegerían a otros de
menor antigenicidad pero cuya funcionalidad
es indispensable para la sobrevida del parásito.
Como los parásitos tienen un ciclo complejo
y como en cada parte del ciclo pueden variar
las moléculas im plicadas en cada uno de los
procesos antes mencionados, es muy probable
que para alcanzar una vacuna efectiva deba
considerarse el uso com binado de antígenos
destinados a interrumpir el ciclo en úna suma­
toria de blancos. Un ejemplo podría ser una va­
cuna anti-palúdica que interfiera tanto con la
CSP*** a un receptor del hepatocito, iniciando
así su invasión, como en el establecimiento del
parásito en el eritrocito, disminuyendo la carga
parasitaria y la incidencia de formas clínicas.
La eficiencia parcial, por separado, se ha pro­
bado en ambos casos, por lo que hoy ya se pue­
de hablar de vacuna antim.alaria, aunque toda­
vía falten estudios para que la misma se apli­
que sistemáticamente a la población en riesgo,
y aunque, por el momento, no se haya pensado
en el uso de ambas moléculas para lograr una
vacuna combinada.
Actualmente, se está trabajando en diversos
laboratorios del mundo con el objeto de identi­
ficar moléculas con capacidad de inducir pro­
tección contra diferentes parásitos tales como
Schistosoma spp., T.cruzi, Leishmania spp. y
T.spiralis, entre otros.
BIBLIOGRAFÍA
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V /y le r D J. W h y d o e s liv e r fib ro s is o c c u r in S c h isto s o in ia -
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In c. N e w Y o rk , 1993.
Inmunología en las infecciones
virales
RAMÓN A. DE TORRES
JUAN ANGEL BASUALDO
MARTA C. MINVIELLE
1. Introducción
Las características bioíógicas de los agentes’
virales, su difícil visualización por microscopía
electrónica y el necesario desarrollo de m ode­
los vacunales aplicados al control de las infec­
ciones humanas y anim ales, han generado la
necesidad de un estudio profundo de la re s­
puesta inmune en el campo de la virología.
Aiin hoy la caracterización de una población
viral se basa fundamentalmente en la capacidad
de estos viríones de infectar células suscepti­
bles y su reconocimiento posterior está relacio­
nado siempre, en forma directa o indirecta, con
cualquiera de las muchas técnicas que se basan
en principios inmunológicos.
A través de la historia, las vacunas han sido
las formas más efectivas e importantes de con­
trolar las infecciones virales.
El gran desarrollo científico en los campos
de la virología y de la inmunología ha perm iti­
do comprender los mecanismos de protección
por los cuales algunas vacunas desarrolladas
casi empíricamente hace muchos años, han ser­
vido en el control de las enfermedades virales
de alta incidencia en seres humanos y anim a­
les. Este avance, sin embargo, es aún insufi­
ciente para explicar muchos fenómenos de la
relación virus-huésped en infecciones agudas,
crónicas, degenerativas y oncogénicas, lo que
mantiene la necesidad de una profunda y conti­
nua investigación de estos problemas.
El estudio de la respuesta inmune en la in­
fección viral de un individuo incluye fu n d a­
mentalmente los siguientes aspectos;
a) establecer la cinética de síntesis de antí­
genos virales y su localización en las células en
las que se inicia la infección y los blancos en
tejidos secundarios, cuando los hay;
b) establecer cualitativa y cuantitativamente
las características de la respuesta inmune h u ­
moral, informando sobre la cinética de síntesis
de inmunoglobulinas. Este estudio se completa
correlacionando su aparición con mecanismos
específicos de reacción con los antígenos vira­
les, como formación de complejos inmunes, in­
ducción de citotoxicidad mediada por com ple­
mento, fenómenos de bloqueo, etc.;
c) detectar y cuantificar las modificaciones
que se producen en las células inmunocompe­
tentes, en función de la agresión viral, con es­
pecial referencia a la capacidad de células lin­
foides tipo T de reconocer e interaccionar con
células infectadas (inmunidad mediada por cé­
lulas);
d) estudiar la respuesta general inespecífica,
analizando la participación del interferón en el
curso de la infección u otros mediadores (linfo­
quinas) asociados al fenómeno de respuesta in­
flamatoria. En este nivel inespecífico la im por­
tancia de células con capacidad citotóxica natu­
ral (NK, natural killer) y células con funciones
endocíticas es cada vez más evidente en el con­
trol del inicio de la infección viral.
Cuando esta información se correlaciona es­
tadísticam ente con la evolución clínica y los
estudios citoanatomopaíológicos, recién enton­
ces se puede construir un cuadro descriptivo
completo de la enfermedad, que es la base ne­
cesaria para establecer la correcta aplicación e
interpretación de técnicas de laboratorio en
función diagnóstica. De una manera fundam en­
tal, la integración de un sólido estudio inmuno-
lógico perm itirá com prender los mecanism os
532 Inmunopatología
íntimos de patogenia de la infección, con lo
cual se podrán desarrollar racionalmente mode­
los de inmunización preventiva o ensayar trata­
mientos con drogas, ya sean antivirales directos
o moduladores de la respuesta inmune.
En forma general, puede decirse que los sig­
nos y los síntomas de las enfermedades virales
son la culminación de una serie de interaccio­
nes entre los virus y el huésped. Entre muchos
otros aspectos quizá ahora sea necesario llamar
la atención sobre la gran diferencia que existe
en la infección por virus que, una vez que ata­
can a un individuo, son eliminados (polio, sa­
rampión, paperas) y las que producen virus que
persisten en el infectado (herpes, HBV, HIV y
otros).
De manera simple, podemos mencionar que
diversos factores participarán en la defensa del
huésped.
1) Defensas constitutivas
• La edad del huésped. Los neonatos, por
ejemplo, son particularmente susceptibles
a las infecciones diseminadas severas por
el virus herpes simple (HSV). En contras­
te, muchas de las enfermedades exante-
matosas, la infección por poliovirus y la
infección por el virus de E p stein -B arr
(EBV) típicamente son más severas en los
individuos más viejos que en los niños.
® Estado nutricional. Si el huésped posee un
estado nutricional inadecuado tiene mayor
susceptibilidad a diversas infecciones vi­
rales, por ejemplo, en el sarampión existe
una mayor morbilidad en niños desnutri­
dos.
2) Defensas inducidas
Inmunoglobulinas. La mayor parte de los vi­
rus actúan como buenos antígenos, y generan
una respuesta de inmunoglobulinas que, por lo
común, no desempeñan un papel primario en la
terminación de las infecciones virales agudas
aunque son muy importantes para prevenir las
reinfecciones. Especialmente, la actividad de
anticuerpos neutralizantes que pueden inhibir
diversos pasos del ciclo de replicación, como la
adherencia, la penetración o el desnudamiento
de los virus. Además, estos anticuerpos pueden
producir la agregación de los viriones, lo que
facilita su fagocitosis.
Complemento. Los virus pueden desencade­
nar la activación del complemento por vía al­
terna y por vía clásica, aun en ausencia de la
respuesta de anticuerpos. Los componentes del
com plem ento activado pueden actuar in cre­
mentando la inflamación y pueden producir la
lisis de los virus envueltos o de las células in­
fectadas por virus. No es probable que este sis­
tema desempeñe un papel tan importante en la
defensa contra las infecciones virales como,
contra las infecciones bacterianas, pues en los
estados de hipocomplementemia no se asocian
con un aumento de la frecuencia o de la severi­
dad de las enfermedades virales.
Inmunidad mediada por células. Es el prin­
cipal factor en la terminación de las infecciones
virales y en la patogenia de estas enfermeda­
des.
D ebido a que los virus son intracelulares,
son susceptibles a la acción de los linfocitos
que reconocen antígenos virales en la superfi­
cie celular. Estas células infectadas pueden ser
lisadas por linfocitos por vía de la citotoxicidad
independiente y dependiente de anticuerpos.
De forma independiente de los anticuerpos,
la acción de las células “natural killer” (NK)
proporciona una de las defensas más tempranas
del huésped contra las infecciones virales (2-3
días) y precede a la aparición de anticuerpos
(5-7 días). Estas células son activadas inespeeí-
fieamente por los interferones.
La cito to x icid ad an ticu erp o -d ep en d ien te
(ADCC) está mediada por anticuerpos específi­
camente unidos a los antígenos virales expresa­
dos en la superficie de las células infectadas.
Estas inmunoglobulinas interactúan por su por­
ción Ec con los receptores Fe de las células “ki­
ller” (LK) y esta interacción da como resultado
la activación de las células LK y la posterior
destrucción de la célula “blanco”. Los macrófa­
gos, los linfocitos y los neutrófilos también po­
seen receptores Fe y colaboran en la ADCC,
Se agregan los linfocitos T citotóxicos con
capacidad lítica específica para destruir células
infectadas por virus. Además, como veremos
más adelante, se suma la actividad de los linfo­
citos T de hipersensibilidad (L T jJ, especial­
mente en las infecciones virales persistentes,
Interferones. Además de la respuesta hum o­
ral y celular, las infecciones virales provocan
un mecanismo de defensa inducible: los inter­
ferones, Estos inhiben la replicación viral de
forma indirecta, por inducción de la síntesis de
proteínas celulares que reducen o bloquean la
multiplicación de los virus.
La cantidad de interferón producida varía
con los diferentes virus. Todos los interferones
actúan en concentraciones muy bajas y, en ge­
neral, son muy activos en las células de la es­
pecie en la cual son inducidos (“específicos de
especie”) supuestamente, debido a la variación
evolutiva de la naturaleza de los receptores de
los interferones.
Los interferones son producidos por la des­
represión de genes celulares inducida por la
presencia de ácido nucleico viral en el citoplas­
ma de la célula huésped. Esto provoca la pro­
ducción de ARN, para los interferones y la p os­
terior síntesis de éstos.
 Inmunología en las infecciones virales
Los interferones neoproducidos son libera­
dos hacia el líquido extracelular y allí se unen
con los receptores específicos en las células ad­
yacentes. Por esto, los interferones tienden a
actuar de forma local más que sistémica.
Además de bloquear la replicación viral, los
interferones aumentan la actividad de las célu­
las NK, de los linfocitos T citotóxicos y de
las célu las in v o lu crad as en las reaccio n es
ADCC.
Como resumen podemos indicar que el m e­
canismo de defensa inducido más im portante
contra las infecciones virales es la inmunidad
mediada por células. Los pacientes con buena
respuesta m ediada por anticuerpos, pero con
defectos en su inmunidad celular generalmente
se recuperan mal de las infecciones virales. La
inversa, buena respuesta celular y anormal res­
puesta humoral, no trae graves consecuencias
para el paciente en las enfermedades virales.
En el último cuarto de siglo se ha ampliado
el concepto de la respuesta inmune en las en­
fermedades virales, individualizando un com ­
plejo repertorio de problem as que deben ser
analizados individualmente. Respuestas como
las asociadas a polio o viruela, contrastan con
las inducidas por rubéola congénita, coriome-
ningitis, hepatitis B, infección por agentes del
grupo herpes o aquellas inducidas por retrovi­
rus humanos.
Es necesario entonces revisar conceptos es­
tructurales de algunos virus para comprender
su grado de diversidad y, sobre todo, analizar
los problemas que se generan cuando algunos
agentes infectan a un individuo y su acción no
culmina con la destrucción de las células infec­
tadas, sino que se establece un tipo de equili­
brio con subsistencia de la célula huésped y del
material genético viral. En estos casos, la per­
sistencia viral se traduce en un número grande
de variables que inducen respuestas inm unes
altamente complejas.
En este capítulo trataremos de dar un pano­
rama general del problema asociado a las res­
puestas inmunes en infecciones virales y m os­
trar sólo algunos ejemplos de relaciones virus-
huésped en humanos, que derivan de la persis­
tencia de la infección viral. Se procurará poner
en evidencia cómo tm mismo agente infeccioso
puede condicionar en el mismo huésped enfer­
medades (patologías) muy diferentes, lo cual
depende de la relación que se establezca entre
el virus y la respuesta inmune.
Con la excusa form al de que no son virus
verdaderos, pero honestamente por la poca cla­
ridad que existe sobre el problema, aun para
quienes trabajan directamente en el tema, no se
hace referencia ampliada sobre la respuesta in­
mune en las infecciones por agentes “virales”
no convencionales (priones, viroides).
533
2. Complejidad estructural de los agentes
virales
El nivel de conocimiento actual permite re­
conocer que, en el conjunto de los virus, están
incluidos agentes infecciosos que difieren n eta­
mente entre sí, no sólo en lo estructural sino
también en el ejercicio de sus funciones. C ons­
tituye un objetivo de este trabajo hacer resaltar
las diferencias estructurales de algunos m ode­
los, para reforzar el concepto de heterogenei­
dad en virología. Se intenta de esta forma supe­
rar poco a poco la interpretación inexacta con
que a veces se engloba a los virus en un grupo
taxonómico poco diferenciado.
En las figuras 27-1 a 27-5, se presentan dia­
gramas de los modelos estructurales de los vi­
rus de poliomielitis, rubéola, herpes simple h e­
patitis B (HBV) y HIV (Virus de la Inmunode-
ficieneia Humana).
Es de importancia resaltar las diferencias de
tamaño de las partículas y las diferencias cuali­
tativas (ARN o ADN) y cuantitativas (funda­
mentalm ente el peso molecular) de los geno-
mas respectivos. El HBV tiene como genom a
ADN de doble cadena circular de peso m olecu­
lar 1, 6 X 10® daltons. El herpes, cuyo genoma
es ADN, es lineal y tiene un peso molecular de
100 X 10® daltons. El genoma de poho y de ru­
béola es ARN, pero de 2 x 10® daltons el p ri­
mero y de 3,6 x 10® el de rubéola.
Esto indica que la capacidad genética de in­
formación de estos agentes varía desde la posi­
bilidad de codificación de unas pocas proteínas
estructurales y no estructurales, como es el ca­
so de poliovirus, a la de promover la síntesis de
más de 30 polipéptidos distintos como en el ca­
so de herpes virus.
La rubéola puede plantearse como un caso
cuantitativamente similar a la polio, pero cua­
litativam ente más com plejo (proteínas co m ­
plejas), y la información de que se dispone so­
bre hepatitis indica una capacidad m ayor que
la de la rubéola en cuanto a diversidad de po­
lipéptidos.
Al final del capítulo se indica la capacidad
génica del retrovirus HIV, agente etiológico del
Síndrom e de In m unodeficiencia A dquirida.
Nótese en este agente la presencia de una enzi­
ma que sintetiza ADN a partir de ARN y que le
permite una estrategia infectiva muy compleja.
Para el caso del virus de la Hepatitis B, se ha
logrado una aproximación muy importante.
En la actualidad se conoce en form a muy
precisa la secuencia del ADN viral, sus genes y
los productos de expresión de éstos. Se identi­
fican perfectamente los polipéptidos de los an­
tígenos de superficie y sus secuencias lim itan­
tes, al igual que aquellos pertenecientes a la in­
formación para core.
534 Inmunopatología

Fig. 27-1. D ia g ra m a d e p o lio v iru s c o n sii

f o r m a ic o s a é d ric a d e s n u d a . L a s p r o te ín a s
p rin c ip a le s n o p o s e e n re s id u o s g lu c o s ila d o s .

G enom a P r o te ín a s e s tru c tu ra le s p rin c ip a le s

N" de unidades Peso m olecular

P roteína p o r virión en daltons

VP, 34 3 5 .0 0 0

VPj 53 2 8 .0 0 0

A R N m o n o c a te n a ria VP, 68 2 4 .0 0 0
2 X 10'’ d a lto n s 41
VP., 8 .0 0 0

Tomando simplemente un concepto estructu­ ta en cada caso. Distinta en función del tamaño
ral, en función del total de proteínas que están del antígeno particulado inicial y de la calidad
asociadas a los viriones completos de los agen­ antigénica; 4 a 5 polipéptidos en el caso de po­
tes mencionados, podemos asegurar que la in­ liovirus, 4 a 5 en el de rubéola virus, 8 a 9 en el
yección de virus inactivado en un huésped in- de hepatitis y 33 en el caso de herpes virus. En
munocompetente inducirá una respuesta distin­ este último, así como en rubéola y hepatitis, se

Nucleoproteína interna

ARN monocatenario 3,6 x

10®daltons
Firmemente unido a VP,
(proteína interna) de
35.000 daltons

Envoltura
Sensible a detergentes
y solventes de lípidos
Contiene glucoproteínas
VP, (62.000 daltons)
VP^ (47.500 daltons)
Un complejo de la
envoltura
de la capacidad
hemoaglutinante

Proteínas principales

Genoma VP, 35.000 daltons

a.I;»- 3
VP, 62.000 daltons
ARN monocatenario
3,6 X 10® daltons Ovo, 47.500 daltons
Fig. 27-2. D ia g ra m a d e v irió n c o n -e s p o n d ie n te a ru b é o la en el q u e c ie rta s p ro te ín a s d e la e n v o ltu ra s o n g lu c o p ro te ín a s . L a
e s tru c tu ra d e la e n v o ltu ra e s s e n s ib le al tra ta m ie n to c o n d e te rg e n te s y s o lv e n te s d e líp id o s.
 Inmunología en las infecciones virales 535

Envoltura
Tegumento

Nucleocápside

Capsómero

F ig . 2 7 -3 . D ia g ra m a d e l v irió n d e h e rp e s q u e m u e s tra su g ran c o m p le jid a d . E l A D N tie n e u n p e s o m o le c u la r d e 1 0 0 x 10^’,

uno d e lo s m a y o re s g e n o m a s v ira le s , a p ro x im a d a m e n te 3 0 p ro te ín a s e s tru c tu ra le s . U n p é p tid o in te rn o f irm e m e n te a s o c ia ­
d o a A D N r ic o e n a rg in in a . G lu c o p ro te ín a s a so c ia d a s a u n a e n v o ltu ra . U n p é p tid o c a p s o m é ric o , re p e tid o 3 v eces p o r c a d a
c a p só m e ro . L a e n v o ltu ra es se n sib le a d e te rg e n te s y s o lv e n te s lip id íe o s , Jo q u e re d u c e en fo rm a im p o rta n te la in fe c tiv id a d .

alcanza un alto grado de complejidad cualitati­ plejidad de mecanismos y una cinética también
va, especialmente en algunas glucoproteínas y distintas.
lipoproteinas que no han sido detectadas en po­ Existen agentes virales, como el poliovirus,
liovirus. que cu an d o in fe c ta una c é lu la su sc e p tib le
Hay proteínas antigénicas asociadas al virión cumple con un ciclo de replicación que culm i­
(estructurales) y otras que se sintetizan sólo na con la lisis celular. Este tipo de infección se
cuando el virus se multiplica (no estructurales); llama genéricamente infección lítica. L a pato­
esto marca la diferencia entre vacunas de virus genia y la respuesta inmune que genera están
“muertos” (antígenos estructurales) y vacunas en función de este mecanismo que define esta
de virus “vivos” en las que el individuo respon­ clá sic a evolu ció n den o m in ada en ferm ed ad
de a la constelación total (estructurales y no es­ aguda.
tructurales). El virus de rubéola puede inducir una infec­
Así la inoculación de un virión de herpes ción de tipo lítico, pero con facilidad puede re­
sim ple inactivado, inoculado prom ueve una plicarse en células que no evolucionan en for­
respuesta a 30-33 polipéptidos mientras que, ma inmediata a la lisis y que pueden continuar
cuando replica en células humanas, el indivi­ produciendo virus por largos períodos. Obvia­
duo se ve expuesto a un nitmero mayor de antí­ m ente, en este tíltimo caso la patogenia y la
genos (alrededor de 59). respuesta inmune son mucho más com plejas
que en el caso de polio. En la rubéola del adul­
3. Breve consideración sobre los distintos to los mecanismos generales de respuesta pue­
tipos de infección viral y su relación con den ser explicados por un tipo de infección de
la patogenia resolución aguda, parecido al que genera polio
en la enfermedad paralítica. En cambio, en la
Hemos planteado antes ejemplos de diversi­ rubéola congénita, se observa la persistencia de
dad estructural. Es fácil comprender que estos producción de virus por ciertas células del feto
agentes también tengan diferentes mecanismos y el recién nacido, durante largos períodos, y
de replicación, lo cual nos indica que, cuando una respuesta inmune muy particular en la que
infectan a un huésped susceptible inmunocom- se ha llegado a manejar la expresión de “tole­
petente, la respuesta inmune tendrá una com ­ rancia pasajera”.
536 Inmunopatología

P artícula de Dañe 20 nm

F ig . 2 7 -4 . D ia g ra m a d e la e s tru c tu ra d e l a g e n te d e la h e p a titis B . L a e n v o ltu ra H B s A g ( a n tíg e n o d e s u p e rfic ie ) e s e n r e a li­

d a d u n a m e z c la d e e s p e c ific id a d e s a n tig é n ic a s d e v a rio s p o lip é p tid o s .

Para ampliar el concepto de distintos tipos
de infección viral y su compleja relación con la
respuesta inmune y la patogenia, hemos toma­
do las infecciones humanas con el virus herpes
simple (HSV) y con el HBV en las que existe
una gama de variables en los síndromes que in­
ducen (agudos y crónicos). Se incluye además
una brevísim a referencia a la infección con
HIV (SIDA) para incorporar un modelo en que
la evolución de la enfermedad depende de la
relación directa del virus con células del siste­
ma inmune. Es relativam ente fácil asociar la
diversidad de la respuesta inmune en función
de virus estructuralmente distintos.
Se debe tener en cuenta que en el caso de
herpes, rubéola, hepatitis y HIV, los diferentes
tipos de infección viral que condicionan varia­
das patogenias y, obviamente, distintas cinéti­
cas de respuestas inm une, no son originados
por distintas especies virales, sino por diversas
relaciones virus-célula, originadas por un mis­
mo tipo de virus, incluso en un mismo hués­
ped. Es bien conocido que el virus herpes sim­
ple (tipo 1 y tipo 2 ), produce enfermedades pri­
maria y recurrente, las que tienen relación con
el tipo de infección lítica y el fenómeno de la­
tencia, respectivamente. Esto nos permite reco­
nocer que habrá una infección en la cual el m e­
canismo de replicación inducirá la muerte celu­
lar o alteraciones profundas como formación
de sincitios, cariorrexis, inclusiones, etc., y,
asociada, una respuesta inflamatoria e inmune
localizada que genera las típicas lesiones de la
enfermedad herpética aguda.
Habrá, además, otro tipo de infección que
no termina con las funciones celulares, pero en
el que la producción de viriones está regulada
por distintos mecanismos, y este proceso que­
da interrumpido por períodos variables. Efec­
tores físicos o químicos, variaciones en el esta­
do inmune del huésped, reestablecen la síntesis
viral y se produce la recurrencia. Esto ocurre
en presencia de anticuerpos circulantes neutra­
lizantes y la paradoja se explica en función de
que el virus puede invadir nuevas células sus­
ceptibles, pasando de célula a célula, sin salir a
los espacios intercelulares. El virus se aloja en
neuronas de ganglios del trigémino o sacros y
desde éstas alcanza los sitios periféricos, via­
jando por los espacios intraaxonales. Factores
emocionales, irradiación, fiebre, etc., producen
las típicas recurrencias herpéticas. Los meca­
nismos de latencia, las características de las
células donde el virus se acantona, el proceso
de reactivación, son motivo de estudio.
En los casos anteriores, infección prim aria
y recurrencia, el individuo produce anticuer­
pos contra el total de las proteínas inducidas
por herpes, las estructurales y las no estructu­
rales.
Sobre este problema de la infección herpéti­
ca se brinda más información al final del capí­
tulo.
La hepatitis B puede evolucionar bajo for­
mas clínicas anictéricas inaparentes, agudas,
crónicas o fulminantes, con lo cual puede su­
ponerse que distintos tipos de infección o res­
puestas las están condicionando. Lamentable­
 Inmunología en las infecciones virales
F ig . 2 7 -5 . V ir u s de l S ID A . E l g e n o ­
m a es A R N , p e ro Ja e n z im a tra n s c rip ­
ta s a in v e rs a s in te tiz a A D N v ira l a p a r ­
tir d e a q u é l, y e s te A D N p u e d e in te ­
g ra rs e al genom a ceJular. D e e s ta f o r ­
m a p u e d e n e s ta b le c e r s e s is te m a s p r o ­
d u c tiv o s (líric o s o n o ) d e v iru s o la in ­
te g ra c ió n determ ina el e s ta d o d e p r o ­
v irus.
m ente, el tínico m odelo v iab le fu era de la
in f e c c ió n h u m a n a es el c h im p a n c é , en
consecuencia muchos estudios resultan ¡imita­
dos.
Es un hecho demostrado que un número de
enfermos evoluciona de forma que el antígeno
asociado a la hepatitis B persiste en el indivi­
duo por tiempos variados, llegando a años, lo
que plantea obviamente una respuesta inmune
de alta complejidad. Este modelo será analiza­
do más adelante.
En los últimos años se han reconocido infec­
ciones virales cuya característica principal es
que las células en las cuales el virus se replica
son células del sistema celular inmunocompe-
tente.
Es de interés reconocer que dentro de este ti­
po de infección, en una generalización muy
elemental, tenemos dos tipos de respuesta dife­
rentes:
1. Virus -f célula; generalmente resulta en
proliferación celular limitada o que puede re­
sultar en cierto tipo de anomalías permanentes
(caso de citomegalovirus CMV y linfocitos).
2. Virus + célula: destrucción celular (caso
de virus HIV, célula T4+ [helper]).
En todos estos casos, mediado por m ecanis­
mos bioquímicos diferentes para los virus EBV
y CMV con respecto al HIV, la infección se
perpetúa en el individuo que queda sujeto a va­
riaciones dei equilibrio que pueden dar diferen­
537
te s s ig n o s y s ín to m a s , e n f o rm a p e rm a n e n te o
c o n re c u iT e n c ia s in te r m ite n te s .
La persistencia vira! parece ser un factor que
asocia las funciones genéticas virales con la
evolución degenerativa o proliferativa de teji­
dos infectados.
La asociación de la infección viral con dis­
plasias severas, carcinoma in situ de cuello de
útero y sus variantes invasoras, carcinoma pri­
mario de hígado, leucemias y linfom as, etc.,
parece reconocer una relación necesaria pero
no suficiente. En todos los casos, complejas in­
terrelaciones con el sistema inmune son las que
definen la evolución.
El objetivo fundamental de introducir la va­
riante “distintos tipos de infección viral” es dejar
claros dos aspectos muy generales pero altamen­
te prácticos: a) diferentes tipos de virus inducen
distintos mecanismos de infección y obviamente
patogenia y respuesta inmune diferentes cuando
infectan al hombre u otro huésped. No es posi­
ble hablar de un solo tipo de respuesta inmune
en todas las infecciones virales, y b) un mismo
tipo de virus en un mismo huésped puede, en
función de los mecanismos de relación virus-cé­
lula, inducir distintos tipos de infección que se
traducirán en modelos de patogenia diferentes y
en respuestas inmunes cuya calidad y cantidad
serán función del tipo de infección.
Inversamente, puede pensarse que luego de
una infección viral primaria la respuesta inmu­
ne será la que condicione el tipo de infección,
persistente o no, que se establezca.
 Inmunopatología

Debemos fijar el concepto de que todos los 4. Sumario de los síndromes inducidos
aspectos relacionados con la respuesta inespe­ por infecciones virales en humanos,
cífica, la cinética de síntesis de las distintas in­ y breves consideraciones válidas para
munoglobulinas y los procesos de diferencia­ el diagnóstico serológico de laboratorio
ción celular asociados, no son iguales para todo
el conjunto de los virus, y que en la infección En el cuadro 27-1 se presenta un ordena­
de un mismo huésped, por un mismo tipo de miento práctico de las enfermedades virales que
virus, pueden obtenerse respuestas distintas se­ nos revela la necesidad de ubicar el panorama
gún la relación de equilibrio que se establezca. general, pero teniendo en cuenta los factores
De lo expuesto surge como conclusión que particulares que se plantean en los distintos gru­
para efectuar el diagnóstico de laboratorio fun­ pos, con especial referencia a las posibilidades
dado en estudios de exploración inmunológica de persistencia del agente viral infectante.
debemos analizar y conocer todas las respuestas Al tener claro el concepto de complejidad
posibles que las infecciones con un virus deter­ real asociado con la respuesta del individuo a
minado pueden originar. Ello plantea una per­ los distintos tipos de infecciones virales, es po­
manente búsqueda de nuevos sistemas de estu­ sible formular un enfoque general que nos per­
dio, que incluyen el mejoramiento y el desarro­ mita desarrollar actitudes prácticas frente al es­
llo de nuevos reactivos (sueros y antígenos) y tudio de los individuos infectados.
técnicas de detección de fácil aplicación y clara En el cuadro 27-2 se presenta en forma es­
interpretación. La toma de muestras apropiadas, quemática la secuencia general de hechos que
en función del tipo de antígeno o inmunoglobu­ ocurren durante una infección viral aguda. En
linas que se desee detectar, es una exigencia ella se ve claramente el período de ataque y di­
esencial, sobre todo teniendo en cuenta el perío­ seminación del virus, del que resulta, luego de
do de evolución de la enfermedad. un tiempo variable, una patogenia dada que ge­
Obviam ente, el diseño de un inm unógeno neralmente se traduce en alteraciones morfoló­
destinado a prevenir una enfermedad determi­ gicas y bioquímicas objetivables por métodos
nada exige conocer todas las variedades posi­ de laboratorio. Este período agudo, rico en sín­
bles de la relación virus-célula en el individuo. tomas y signos, es por lo general el más propi-

Cuadro 27-1. Agrupamiento de algunas enfermedades virales

H e p a titis v ira les

P o lio p a ra lític a
V e rriig a s
L o c a liz a d a s
R e s fria d o c o m ú n
M olluscuin contagiosum
S ID A
S e g ú n la e x te n s ió n d e lo s te jid o s y /u ó r g a ­
n o s a fe c ta d o s
S a ra m p ió n
V iru e la
D is e m in a d a s V a ric e la
F ie b re h e m o rrá g ic a

A gudas
In a p a i'e n te s o su b c lín ic a s
S e g ú n el c u rs o d e e v o lu c ió n c lín ic a L a te n te s re c u rre n te s
L a te n te s a s o c ia d a s a la rg o p e río d o d e in c u b a c ió n
C ró n ic a s

In fe c c io n e s c u y a p a to g e n ia e s tá re la c io n a d a co n
el e fe c to lític o v ira l
S e g ú n el m e c a n ism o d e p a to g e n ia
I n fe c c io n e s c u y a p a to g e n ia e s tá a s o c ia d a c o n la
in m u n o rre s p u e s ta

E ste ag ru p am ien to es m uy e m p íric o y d eb e an a liz arse ca d a c a so . Npte.se q u e se re fiere a los sín to m a s y signos m ás im p o rtan tes d e l a e n fe r­
m ed a d y no siem p re a la io ca ü zac ió n d e las células que re p lic a n el virus. E l S ID A re su lta p rin cip a lm e n te de la d estru c ció n de cé lu la s T
C D^' p o r ei H ÍV , p ero la en ferm e d ad es un c u a d ro g e n e ra d o p o r la in m u n o d cficic n cia con una variada .signo-sinlojíiatoJogía genem lm enlc
en c u ad ra d a en in fec cio n es o p o rtu n istas.
 Inmunología en las infecciones virales 539

Cuadro 27-2

In fe c c ió n

R e s p u e s ta in e s p e c ífic a
In fla m a c ió n
T e jid o d e a ta q u e I n te rfe ró n
P rim e ra a m p lific a c ió n F ie b re
d e m a te ria l v ira l y
v irio n e s lib re s

V ire m ia p r im a ria c o m o d ise m in a c ió n c o n ­ R e s p u e s ta e s p e c ífic a

v e n c io n a l a p a rtir d e l á re a d e a ta q u e a P ro c e s o d e a n tíg e n o s
o tra s á re a s. D ife re n c ia c ió n c e lu la r lin fo id e
T ra n s p o rte n o c o n v e n c io n a l: P ro life ra c ió n c e lu la r
C a n a le s a x ó n ic o s
m a c ró fa g o s b r o n c o a s p ira c ió n B io s ín te sis d e in m u n o g lo b u lin a s e s p e c ífic a s

C o n d ic io n e s e s p e c ia le s p u e d e n c o rta r
el d e s a rro llo d e l p e río d o a g u d o —
A lc a n c e d e tejid o s s u s c e p tib le s se c u n d a rio s o d is m in u ir d r á s tic a m e n te lo s
ll s ín to m a s
I“{ S e g u n d a a m p lific a c ió n d e m ate ria l v ira l
G e n e ra lm e n te p a rtic ip a en los s ín ío - __
m a s , la p a to g e n ia y la re c u p e ra c ió n

V ire m ia s e c u n d a ria
S u p re s ió n d e c é lu la s in fe c ta d a s . F in
d e l p e río d o a g u d o . R e s o lu c ió n
A ta q u e d e l ó rg a n o b la n c o

P e rs is te n c ia d e c lo n e s c e lu la re s p ro d u c to re s
•o o a S o b re p a s o d e la r e s p u e s ta in m u n e. M u e rte .
'o 2 3
o E q u ilib rio d e c é lu la s p ro d u c to ra s y re s p u e s ta
§ 'S
in m u n e . M o d u la d o c o n p a to g e n ia v a ria b le .
P e rs is te n c ia

c ío p a ra in te n ta r e l a is la m ie n to d e l a g e n te in ­ estudio cinético de las modificaciones cualitati­

fe c c io s o y la d e te c c ió n p o r
p a to ló g ic o s d e le s io n e s tis u la r e s
A partir de la infección y de los fenómenos
primarios se desarrolla la reacción del huésped
sobre la base de las llamadas respuestas inespe­
cíficas y la respuesta inmune específica. La pri­
mera se caracteriza por la aparición del fenó­
meno de inflamación, con la participación de
células con capacidad de endocitosis, de las
cuales los m acrófagos p arecen ser los m ás
conspicuos, y de linfocitos con capacidad cito­
tóxica inespecífica “natural killers”, síntesis de
interferón, fiebre, etc,, y la segunda por activi­
dad de células presentadoras de antígeno y la
posterior proliferación de células inmunocom­
petentes, seguida de síntesis de inmunoglobuli­
nas específicas.
Con esto queda justificado el tríptico en que
se basa la estrategia general del diagnóstico de
laboratorio de las enfermedades virales: a) in­
tento de aislam iento y/o caracterización del
agente etiológico, fundamentalmente durante el
período prodrómico y el episodio agudo de en­
ferm edad; b) observació n en m ateriales de
biopsias o necropsias, obtenidos para estudios
citológicos o histopatológicos de lesiones, y c)
e s tu d io s c ito h is to - vas y cuantitativas de la respuesta inespecífica
o c e lu la re s . y de la inmune específica. Esta liltima requiere
el estudio comparativo de muestras biológicas
obtenidas en el transcurso de la enferm edad
(período agudo y convaleciente), sobre todo,
estudios en suero.
En la figura 27-6 se presenta el esquem a de
J. M. Vanella, válido para enfocar el tipo de
técnicas aplicables al estudio de laboratorio en
virología. Del análisis de éste surge cjue la base
operativa más im portante para el diagnóstico
etiológico se fundam enta en el estudio de la
respuesta inmune específica, que se realiza de­
tectando los cambios cualitativos y cuantitati­
vos de las inm unoglobulinas presentes en el
suero del paciente durante la evolución de la
enfermedad.
Las bases fundamentales del diagnóstico de
laboratorio de la infección viral p u ed en ser
analizadas de acuerdo con la llamada cadena de
Márquez, relacionada con los pasos que deben
cumplirse. Éstos son; a) decisión de realizar el
estudio de laboratorio; b) toma y transporte de
la muestra; c) procesamiento de la muestra; d)
informe, y e) interpretación.
Analizaremos en conjunto los puntos a y b.
540 Inmunopatología
Límite del
primer suero
i
Area crítica
para la decisión
de iniciar un estudio
de laboratorio
Tiempo en días
Período de Período
incubación
agudo
F ig . 2 7 -6 . D ia g ra m a d e e v o lu c ió n d e m a rc a d o re s esp ecifico .s en u n a in fe c c ió n v ira l a g u d a p rim a ria .
a y b) Decisión de realizar el estudio de labo­
ratorio, toma y transporte de la muestra
En función de limitarnos al estudio de la res­
puesta inmune, no analizamos aquí la toma de
otros materiales destinados a aislamiento de vi­
rus, análisis citológicos, biopsias, etc.
Ante la sospecha de una enfermedad de etio­
logía viral, nunca se dejará de tomar una mues­
tra de suero del paciente en el primer examen
del individuo. Si la decisión de iniciar el estu­
dio no se toma a tiempo, todo intento posterior
será fatuo.
Se deberá asegurar que en el período que
abarca de 15 a 2 0 días de iniciada la enferme­
dad, se tome una nueva muestra de suero. La
base del estudio de la respuesta inmune humo­
ral es poder demostrar cambios cualitativos y
cuantitativos en función del tiempo y relacio­
narlos con la evolución clínica.
La mayor cantidad de muestras posible obte­
nidas durante la evolución, sean ellas destina­
das a estudios de la respuesta humoral, celular
u otros objetivos, permitirá construir una infor­
mación mucho más precisa acerca del perfil de
respuesta y relacionar fehacientem ente estos
datos con los mecanismos de patogenia.
c) Procesado de la muestra
Los sueros recibidos en el laboratorio se pro­
cesarán de acuerdo con las técnicas apropiadas
según las sospechas que se desprendan de la fi­
Segundo
suero
Tercer
suero
1
T i Posibilidad de
establecer datos sobre
Período de
convalecencia
cha epidemiológica, y se tomarán precauciones
elementales como la inclusión de todos los sue­
ros que se dispongan del paciente en una mis­
ma prueba de laboratorio, analizados con los
mismos reactivos, operador, equipo, etc.
La inclusión de sueros y antígenos controles
de referencia no deberá obviarse bajo ningún
concepto.
La incorporación de la actividad diagnóstica
a un serio y continuo programa de acreditación
y de control de calidad son mandatorios.
Se deberán establecer y respetar normas ele­
mentales de bioseguridad ya que todo suero de­
be considerarse de alto riesgo independiente­
mente de una presunción particular.
d y e) Informe e interpretación
No comentaremos ahora estos puntos ya que
se trata de un enfoque general. Sim plem ente
diremos que el informe debe ser claro y llevará
un comentario sobre los resultados que ayude a
la interpretación posterior.
Como corolario, queremos condicionar al in­
dividuo que encara la investigación de forma
que este concepto operativo del estudio seroló­
gico sea un verdadero dogma inamovible; la to­
ma de una muestra de suero del período de co­
mienzo de la enfermedad y, por lo menos, otra
entre 15 y 20 días más tarde. Así se cubrirá con
una gran eficiencia la posibilidad de efectuar
un diagnóstico preciso de laboratorio, cualquie­
ra que sea el tipo de infección viral en estudio
 Inmunología en las infecciones virales
y la técnica usada. Diremos, además, que toda
vez que se pueda agregar una tercera muestra o
más eon intervalos de 30 días, esta serie de
sueros ampliará las posibilidades de arribar a
un diagnóstico seguro y a un estudio consciente
de la evolución de la respuesta inmune que, co­
mo en el caso de la hepatitis B, SIDA y otras,
es de absoluto valor pronóstico.
La conservación de los sueros permitirá que
en un futuro, cuando por distintos adelantos
técnicos se disponga de los reactivos, aquéllos
puedan ser reestudiados y establecer un diag­
nóstico correcto retrospectivo. Al referirnos a
que no se disponen reactivos estamos indican­
do dos posibilidades: que el agente sea desco­
nocido aún, o que sea muy difícil preparar antí­
genos por sus características biológicas.
Otro aspecto que tiene que ver con lo ante­
rior es el relacionado con la detección de nue­
vos tipos de infección, en los que es necesario
explorar respuestas inmunes con una gama de
antígenos purificados, como en el caso de in­
fecciones abortivas, persistentes, etc.
Quedan así planteados los problemas de va­
riación de respuesta inmune y un enfoque ge­
neral de cómo abordarlos, que deberá ser usado
teniendo en cuenta las limitaciones de toda ge­
neralización.
5. Concepto general de la respuesta inmune
en la infección viral aguda
Una vez alcanzadas las células susceptibles
por un agente viral, éste inicia un ciclo de re­
plicación que culm ina con la producción de
nuevos viriones, los que, de disponerlas, atacan
nuevas células susceptibles. En ciertos casos
este proceso del ciclo de replicación viral pro­
duce la muerte celular. De esta forma se induce
en el organismo una cantidad creciente de m a­
teria] antigénico viral, suficiente para provocar
una respuesta de los mecanismos inespecíficos
y de los sistemas inmunes específicos del indi­
viduo. Éste, m ediante la actividad de células
com petentes, procesa en los sitios de activa
síntesis de material viral, los distintos antíge­
nos que reconoce como extraños y pone en
marcha la diferenciación de clones celulares es­
pecíficamente informados para reconocer estos
antígenos y la biosíntesis de inmunoglobulinas
específicas.
En forma general, y siempre en el ciclo lítico
asociado con infección que define a una enfer­
medad aguda, el sistema de información inm u­
nológica toma contacto con la totalidad de los
antígenos del virus; antígenos de la superficie
viral, porque hay en circulación viriones ente­
ros, y antígenos de las nucleocápsides de los
viriones (proteínas internas), porque de las cé­
lulas rotas salen estos antígenos, que siempre
541
son sintetizados en exceso. Además, en virtud
de la lisis celular, también el sistema de detec­
ción inmunológica se informa sobre antígenos
virales no estructurales, es decir, aquellos que
no forman parte del virión.
Se produce así, sucediendo o acompañando a
toda la respuesta inflam atoria local, la induc­
ción de producción de inmunoglobulinas espe­
cíficas de distribución sistém ica. Estos an ti­
cuerpos estarán dirigidos cualitativamente con­
tra cada una de las especificaciones antigénicas
virales (epitopes). Cuantitativamente depende­
rán de factores propios de los antígenos como
antigenicidad, cantidad relativa de ellos, rela­
ción y forma de exposición a las células de pro­
cesamiento, mecanismos generales de reg u la­
ción, etc.
Los macrófagos son células que procesan el
m aterial viral y expresan en sus m em branas
plasmáticas los epitopes; por eso se los consi­
dera como células procesadores y presentado­
ras de antígenos. Además de ellos, se encuen­
tran las células dendríticas (CeD en), q u e si
bien no procesan al antígeno, tienen la capaci­
dad de fijar epitopes en su superficie, am plifi­
cando así la presentación del antígeno. Se las
encuentra en los tejidos linfoides, sobre todo en
bazo, nódulos linfáticos y en la piel se denom i­
nan células de Langerhans.
Tanto los macrófagos, como las células den­
dríticas, secretan una importante citoquina, la
Interleuquina 1, considerada como la segunda
señal estimuladora de los linfocitos T (la pri­
mera señal la constituye la presentación del an­
tígeno).
El macrófago o la CeDen presentan el antí­
geno viral estrechamente relacionado a las pro­
teínas de clase I o II del CMH (Complejo Ma­
yor de Histocompatibilidad) en sus membranas
plasmáticas. Este complejo antigénico (m olé­
cula del CMH + epitope viral) es identificado
por los receptores de los linfocitos T, que solo
reconocen al antígeno viral si está asociado a
una molécula del CMH.
Las moléculas del CMH de clase I se enla­
zan con epitopes virales presentes en el com­
partimiento citosólico de la célula infectada y
los exponen en la superficie celular. D e esta
manera será reconocido por una célula T que
pase. Si esta célula porta el m arcador C D 8 -
CD28 (linfocito T citotóxico) en su superficie,
pondrá en marcha una respuesta inmune contra
las células infectadas, liberando diferentes sus­
tancias químicas que las destruyen porque es­
tán programadas para destruir células que ex­
presan antígenos virales. Esta respuesta consti­
tuye una forma eficaz de evitar la creación de
más virus por las células infectadas.
Los linfocitos T citotóxicos son los efectores
más importantes en la eliminación de células
542 Inmunopatología
infectadas por virus. Sin embargo, es necesario
recalcar que en el caso de virus que no produ­
cen lisis celular manifiesta, por ejemplo, hepa­
titis B, el daño hepático que genera la insufi­
ciencia está dado por el ataque de linfocitos ci­
totóxicos al hepatocito. Como ya se mencionó,
estos linfocitos tienen una restricción manifies­
ta para células que exhiben el antígeno viral y
antígenos de la clase 1 del CMH, lo que abre
una permanente necesidad de búsqueda sobre
la posible asociación de diferentes patologías
inducidas por virus, que estuvieran condiciona­
das por el perfil de antígenos de histocompati­
bilidad del individuo infectado.
Si la m olécula del CMH que acompaña al
epitope viral es de clase II, será reconocida co­
mo extraña por las células T CD4+ (T helper-
Th) que pueden ser T h l, llamadas también cé­
lulas T inflamatorias pues secretan mediadores
químicos que atraen células inflamatorias al si­
tio de multiplicación viral. Además secreta in­
terferón y, que intentará bloquear la replicación
del virus. Las células Th2, llamadas células co­
laboradoras, también son CD4+ y su rol funda­
mental es aumentar la respuesta B dependiente
mediante la secreción de Interleuquina 2 (cito-
quina que amplifica la respuesta de Linf. B).
De esta última respuesta, dependerá la calidad
y cantidad de inmunoglobulinas que intentarán,
por diversos mecanismos (neutralización, opso-
nización, fijación de complemento, etc.), des­
truir los viriones extracelulares.
Las células T supresoras (CD 8 +), tienen una
probable relación con los estados de tolerancia
a antígenos extraños y también con la toleran­
cia a autoantígenos. Por ello, se asocia una de­
ficiencia de las células T supresoras con el de­
sarrollo de síndromes autoinmunes.
En la práctica podemos identificar anticuer­
pos dirigidos contra antígenos de la estructura
externa, que se reconocen por la propiedad de
unirse a viriones enteros y de disminuir o abo­
lir su capacidad infectiva in vitro y a los que se
llam a “neutralizantes” . La estructura externa
depende de que se trate de virus desnudos, en
los cuales esta “estructura externa” está inte­
grada por los polipéptidos que forman los cap-
sómeros (p. ej., poho), o que sean virus envuel­
tos, en los que esta “estructura externa” está in­
tegrada por glucoproteínas, lipoproteínas de la
envoltura, o ambas.
También se forman anticuerpos contra las
estructuras proteicas internas virales (nucleo-
eápsides). La actividad de estos anticuerpos no
puede ser medida por su capacidad de abolir la
infectividad viral in vitro; por lo general, se es­
tudian por otros sistemas de detección inmuno-
lógica, utilizando como antígenos las partes in­
ternas de virus. Se los llama por ello anticuer­
pos contra antígenos internos o “core”.
Una vez puesta en marcha la respuesta inm u­
ne se pueden integrar los siguientes fenómenos
que condicionan el escjuema clásico de una in­
fección viral aguda:
a) Células infectadas que producen virus,
eon lisis celular, respuesta inmune funcional
integral contra el virus y partículas subvirales.
b) Virus que son liberados al torrente extra-
celular están ahora expuestos a la acción de an­
ticuerpos neutralizantes, los que, obviamente,
contribuyen a reducir el riesgo de infección de
nuevas células susceptibles. Los inm unocom ­
plejos formados son rápidamente captados por
los sistemas de depuración.
Los anticuerpos contra otras estructuras tam­
bién actúan formando complejos inmunes y los
mecanismos de eliminación de éstos forman un
capítulo aparte en inmunopatogenia.
c) La célula que se encuentra infectada e ini­
cia un ciclo de replicación está sometida a esta
altura a acciones directas: interferón, tempera­
tura y, si en el ciclo de replicación incluye la
síntesis de antígenos virales en la superficie ce­
lular, esta célula es pasible de ataque lítico, por
parte de sistem as com o an ticuerpo-com ple­
mento y el de linfocitos capaces de adosarse a
ella e inducir su lisis, antes de producir virio­
nes.
d) La acción conjunta de los sistemas m en­
cionados culmina con la abolición de la exis­
tencia de células infectadas productoras de an­
tígenos de superficie, las cuales son destruidas.
Todo antígeno viral libre será complejado con
sus anticuerpos respectivos y seguirá distintos
caminos de eliminación según las característi­
cas del inmunocomplejo formado.
e) El período agudo de la replicación viral
estará terminado y la enfermedad, sus sínto­
mas y sus signos estarán determinados por el
daño que este proceso haya inducido; éste se
halla relacionado con el tipo de células blanco
alteradas o destruidas en el ataque inicial y
con las células que se hayan infectado en la
diseminación secundaria. En este caso el daño
celular está dado por la acción lítica viral per
se y la acción lítica asociada a la respuesta in­
mune.
El resultado de una infección de este tipo se
analiza más adelante, al hablar del virus de la
polio.
Conviene resaltar aquí que en estos casos, en
el tiempo que media entre la infección en los
tejidos de ataque en que se inicia la respuesta
inmune y el ataque a otros órganos, hay gene­
ralmente un período de viremia. La amplifica­
ción de la replicación viral de los órganos ge­
nera un nuevo episodio de viremia secundaria,
que es tan extensa o im portante como pobre
 Inmunología en las infecciones virales
haya sido la respuesta inmune humoral. Estas
infecciones inducen una respuesta inmune ge­
neralmente “de por vida” con persistencia de
anticuerpos neutralizantes detectables.
6 . R espuesta inmune en infecciones virales
con persistencia de virus
Cabe aclarar que el efectuar esta distinción
entre infecciones agudas y aquellas con persis­
tencia de virus tiene un carácter didáctico y el
lector deberá tomarlo como un paso necesario
hacia la comprensión del problema y deberá es­
tar alertado de que existen variables tan com ­
plejas que no pueden sintetizarse en una apre­
ciación tan simple como la propuesta.
Lo que interesa plantear aquí es que, a dife­
rencia de lo detallado en el punto 5, en ciertas
infecciones virales el agente alcanza las célu­
las susceptibles, inicia la amplificación de m a­
terial antigénico viral, pero en este caso las cé­
lulas productoras de virus no son destruidas
debido al mecanismo de replicación viral y los
viriones emergen de ellas por procesos diver­
sos, entre los cuales el de brotación a través
de mem branas citoplasm áticas es el más co-
mtín.
Veremos cómo es la respuesta en estos ca­
sos, que generalmente corresponden a infeccio­
nes con virus envueltos:
a) Al no haber destrucción celular, el proce­
so inflamatorio local es mucho menor.
b) El virus liberado, que en su envoltura lle­
va ciertas especificidades antigénicas del hués­
ped, inicia la respuesta. Al ser tomado por ma­
crófagos, si éstos lo procesan, se informan de
sus antígenos externos. Recordemos que, al no
haber destrucción celular inicial, el organismo
no tiene contacto con antígenos internos y me­
nos con los no estructurales, intracelulares. La
respuesta inmune es lenta y parcial,
c) Se forma escasa cantidad de anticuerpos
neutralizantes, que generalmente forman inm u­
nocomplejos con el virus producido, tendiendo
a un equilibrio.
d) La respuesta inmune celular genera célu­
las que son capaces de reconocer a los clones
celulares que están produciendo virus. Si en es­
te caso la respuesta celular y la inmune hum o­
ral condicionan que estos clones sean destrui­
dos, el proceso se comportará como una infec­
ción aguda o mixta.
Puede ocurrir que por ambas variables, de­
fectos en las células T o en otros efectores del
sistema de inmunidad celular y/o la presencia
de anticuerpos bloqueadores que tapicen las
membranas de células infectadas y las exclu­
yan del reconocimiento de los linfocitos T, las
células infectadas no sean eliminadas y conti-
543
niien produciendo virus. En este caso estamos
en presencia de una infección con persistencia
de clones celulares productores y la instalación
de una etapa de cronicidad del proceso.
e) La patogenia que ese estado general de
equ ilib rio pueda inducir depende del tejid o
afectado, la modulación de producción viral,
que puede ser perm anente o interm itente, los
complejos inmunes que se forman, etc.
Un caso particular de este tipo de problema
es el que se plantea en células infectadas que
no producen virus, porque parte del genoma es­
tá integrado (infección abortiva) y sólo se sin­
tetizan antígenos virales “muy débiles”. En este
caso, el organism o no produce anticu erp o s
“neutralizantes” de la infectividad viral, pero sí
contra estos antígenos que pueden modular es­
tados celulares tales como proliferación celular
(oncogénesis).
Vemos entonces con claridad cómo u n a in­
fección viral con un mismo tipo de virus podrá,
en individuos de la misma especie, establecer
infecciones agudas o crónicas según sean la
respuesta de este individuo y el equilibrio que
se establezca. En esto influyen fundam ental­
m ente estados fisiológicos, tratam ientos con
drogas, enfermedades concomitantes, factores
psicológicos, etcétera.
7. Concepto de fenómenos
de autoinmunidad asociados
a infecciones virales
Se desprende de lo anterior que ciertos virus
no citocidas modifican las membranas de las
células del huésped, induciendo especificidades
antigénicas mixtas. Se pueden exponer, además
de los nuevos antígenos del virus, antígenos
propios del huésped, secuestrados durante el
proceso embrionario y que resultarán nuevos
para el adulto. El huésped puede reconocer es­
tas m odificaciones, por pequeñas que ellas
sean, como extrañas y en un proceso lento pro­
ducir ataque directo a estas estructuras desen­
cadenando un fenómeno autoinmune.
La relación de un tipo definido de infección
viral con cualquiera de los estados autoinm u­
nes detectados en humanos es algo aún no defi­
nitivam ente demostrado. En algunos modelos
experimentales la relación de infecciones vira­
les y el ulterior desarrollo de un estado inmu-
nopatoíógico autoinmune es real.
En general, existe la posibilidad de que mu­
chos de los fenómenos clasificados com o au­
toinmunes inducidos por virus resulten de un
mecanismo de inmunopatología secundaria a la
formación y evolución de complejos inmunes
generados por antígenos virales o virus-hués­
ped compartidos y anticuerpos del huésped.
544 Inmunopa tología
8. Inmunocomplejos en infecciones virales
Hemos visto eómo durante la infección lítica
se induce la formación de anticuerpos neutrali­
zantes de la infectividad viral y aquellos capa­
ces de reconocer antígenos internos del virión
o, en el caso particular de virus envueltos, con­
tra antígenos de envoltura, asociados general­
mente a las membranas de células infectadas
(células productoras de virus pero que no se li-
san).
Los anticuerpos y antígenos circulantes en
fase líquida forman com plejos inm unes, que
estarán listos para interactuar con otros siste­
mas efectores, de los cuales el complemento es
el mejor conocido. Una vez formado el com ­
plejo antígeno-anticuerpo-eom plem ento, au ­
m enta de tam año y puede lleg ar a o rig in ar
agregados, por entrecruzamiento de varias uni­
dades con participación de C3 y otras fraccio­
nes de complemento. En el caso de la infección
del ratón con virus polioma se ha podido deter­
minar que el complejo virus-anticuerpo tiene
un coeficiente de sedimentación de 270S, que
aumenta a 450S cuando reacciona con el com­
plemento.
En el caso de virus muy complejos como los
R etroviridae, el com plejo virus-anticuerpo-
complemento, induce daño de la superficie lipí­
dica del virión. Este daño origina la ruptura del
virión y la liberación de antígenos internos del
virus que inducen, en cadena, la producción de
nuevos anticuerpos contra este tipo de estructu­
ra interna, además de aquellos dirigidos contra
la envoltura. Esto es compatible con la secuen­
cia de aparición de anticuerpos en la infección
con HIV (SIDA).
En infecciones persistentes, con producción
permanente o intermitente de viriones, la for­
m ación de inm unocom plejos es frecuente y
constituye un factor importante de los fenóme­
nos patológicos que condicionan fundamental­
mente depósitos en tejidos donde producen res­
puestas flogógenas. Los síndrom es más fre­
cuentes son nefritis, arteritis y coroiditis.
Los complejos virus-antieuerpo-complemen-
to pueden actuar sobre células que tienen re­
ceptores para la fracción Fe, como importantes
agentes de daño de membrana.
Complejos inmunes de estructuras variables
pueden formarse en la superficie de células que
están sintetizando antígenos y actúan bloquean­
do factores necesarios para que aquéllas pue­
dan ser eliminadas por fenómenos de inmuni­
dad mediada por células T.
Este m ecanism o ha sido observado en las
formas crónicas que suceden a la infección sa-
ram pionosa (panencefalitis esclerosante suba-
guda), en las que se ha demostrado un factor
que bloquea la inmunidad mediada por células.
la actividad MIE e inclusive la linfoprolifera­
ción.
Inmunocomplejos del tipo antes descrito han
sido claramente detectados en una serie de in­
fecciones virales en animales. En humanos, és­
tos han sido relacionados con aspectos patoló­
gicos en hepatitis viral tipo B, en infecciones
producidas por el agente Epstein-Barr, princi­
palm ente en su asociación eon el linfom a de
Burkitt, en el dengue y en la ya m encionada
forma encefalítica crónica postsarampionosa.
De acuerdo con datos provenientes de algu­
nos modelos experimentales, en especial el de
inducción de enfermedad del suero, en las in­
fecciones virales, los síntomas como mialgias,
artralgias, “rash”, disturbios de conducta y le­
targía, pueden asociarse al aumento de la res­
puesta inmune humoral y del período de supre­
sión del virus circulante. Esta patogenia puede
compatibilizarse con el mecanismo que resulta
del depósito de complejos inmunes y la actua­
ción de mecanismos efectores en los que parti­
cipan basófilos recubiertos de IgE, aminas va­
soactivas, perm eabilidad capilar y daño en la
trama sinusoide.
Por último, conviene recordar que reciente­
mente se han encontrado factores genéticos que
pueden influir en las distintas respuestas del
huésped a la infección viral, de las cuales tene­
mos, por una parte, una producción de alto títu­
lo de anticuerpos de alta afinidad que facilita la
eliminación total del virus generando una sola
onda de depósito de complejos inm unes y la
eliminación de los clones productores de virus,
y, por otro lado, una respuesta con baja canti­
dad de anticuerpos o de baja afinidad que lleva
a una prolongada evolución de los fenómenos
induciendo una continua circulación de com ­
plejos inmunes.
9. Respuesta inmune en poliomielitis
En la figura 27-1, hemos planteado detalles
de la estructura del virus de la poliom ielitis.
R ecordem os que inm unológieam ente se han
demostrado tres tipos de virus diferentes, lla­
mados poliovirus tipo 1, 2 y 3. Si bien difieren
en la especificidad antigénica, las característi­
cas morfológicas y funcionales de replicación
son prácticam ente idénticas. Por ello, si bien
pueden admitirse diferencias, los comentarios
sobre respuesta inmune se realizarán en gene­
ral, sin especificar el tipo de virus.
Las partículas virales están integradas por
cuatro polipéptidos V P l, VP2, VP3 y VP4.
Una serie de moléculas proteicas interm edia­
rias son sintetizadas en la célula infectada, cu­
yas características inmunológicas no son cono­
cidas, pero obviamente participan en la conste­
lación de la respuesta inmune productiva. Entre
 Inmunología en las Infecciones virales
ellas las principales son N C V P l A (non capsid
viral protein), que es precursora de las proteí­
nas de la cápside, y la NCVP2 de 77 kD.
La P63 (única proteína con actividad poli-
merásica netamente viral) deriva de NCVP2.
Todas ellas contribuyen en la respuesta in ­
mune cuando se produce la infección natural o
la inducida con vacunas de virus atenuado. O b­
viamente, en la vacunación con virus inactiva­
do la respuesta está limitada a los polipéptidos
estructurales solamente.
En la figura 27-7 se presentan diagramas de
la respuesta inmune en una infección natural en
su tipo de localización faringoentérica y la
complicación paralítica. En la figura 27-8 se
incluyen los correspondientes a la respuesta in­
ducida por vacuna inactivada y por virus ate­
nuado.
Es obvio que la localización faríngea e intes­
tinal constituye la fase inicial de la infección,
que genera una sintomatología local de curso
variable, desde casi asintomático hasta episo­
dios de faringitis y enteritis agudas.
En el individuo virgen de inmunización pre­
via, su estado de defensa general condicionará
la intensidad de producción de virus, el cual po­
drá alcanzar el espacio extracelular e inducir vi­
remia. El virus tendrá así posibilidades de con­
tactar todas las células del organismo. Recepto­
res muy particulares, mecanismos de replica­
ción condicionantes, virulencia de la cepa viral,
hacen que algunas células del asta motora de la
médula sean atacadas y destruidas por proceso
lítico. Cuando una cantidad considerable de es­
tas neuronas pierden funcionalidad se estable­
Tiempo en días
F ig . 2 7 -7 . E v o lu c ió n d e m aix a d o re s e n la in fe c c ió n p o lio m ie lític a c o n c o m p lic a c ió n p a ra lític a .
545
cen los signos de parálisis fláccida típica de la
complicación de la infección poliomielítica.
Este mecanismo, en especial la viremia co­
mo factor necesario para el ataque a las células
del sistema nervioso, explica la eficacia rotun­
da de la vacunación poliomielítica con vacuna
inactivada. Esta vacuna, aunque sólo induce
una respuesta de anticuerpos del tipo IgM e
IgG neutralizantes, poca respuesta inmune ce­
lular o ninguna y “nada” de IgA secretoria (no
deteetable), es suficiente para complejar el vi­
rus que invade el espacio intersticial y circula
en la sangre. El éxito individual de cada caso
dependerá de la cantidad de anticuerpos dispo­
nible en el momento de la entrada del virus. Es
importante recalcar que la inmunidad que con­
fiere la vacuna inactivada es pobre o nula para
prevenir la replicación viral en mucosa intesti­
nal y faríngea.
En el caso de la infección natural o la induci­
da por vacuna atenuada, la producción de anti­
cuerpos de tipo IgM, IgG e IgA circulantes es
mayor y se agrega la síntesis de IgA secretoria
en íos tejidos expuestos. La respuesta de inm u­
nidad celular es deteetable también en estas cir­
cunstancias.
Reiteramos además que los anticuerpos for­
mados son inducidos por una variedad de antí­
genos mayor que la que tiene la vacuna inacti­
vada.
A pesar de todo, la vacuna inactivada tiene
un éxito indiscutido en el control epidemiológi­
co de polio y un riesgo menor que la atenuada
en casos de niños deficientes en su respuesta
inmune.
546 Inmunopatología

tos durante la evolución de la infección prima­

VIRUS
F ig . 2 7 -8 , R e s p u e s ta a la v a c u n a c ió n c o n tr a p o lio .
10. Respuesta inmune en rubéola
En la figura 27-9 se presentan datos sobre la
evolución de la excreción de virus, la viremia y
la cinética de síntesis de anticuerpos de distin­
tos tipos en la infección primaria del adulto y
en la infección del feto en títere por virus de la
rubéola.
Estos datos refuerzan algunos de los concep­
tos que ya hemos expresado. Queda indicado el
corto período a partir de la aparición de los sín­
tomas, en el cual se pueden obtener aislamien­
ria del adulto, contrastando con el extenso pe­
ríodo en que puede detectarse virus en el niño
infectado durante la gestación y el período pos­
parto, cuando nace con vida.
La variación de la cinética de evolución de
los distintos anticuerpos que se detectan según
el tipo de técnica y los antígenos que se utili­
cen, nos brinda un claro ejemplo de la necesi­
dad de elegir con conocimiento el sistema sero­
lógico que se empleará para llegar a un diag­
nóstico de certeza, según sea el período de evo­
lución de la enfermedad y el tipo de infección
que se desarrolla.
Fijem os brevem ente la atención en lo que
ocurre durante la infección del adulto con los
anticuerpos inhibidores de la hemaglutinación
(IHA), que son los que pueden ser estudiados
por técnicas más comunes y que son compati-
bilizables con los neutralizantes. Si la primera
muestra de suero es tomada correctamente den­
tro de los 3 días de iniciada la enferm edad,
cualquiera que sea la época de toma de la se­
gunda (10, 20 o 30 días), permitirá su estudio
com parado con la técnica de IHA o con las
otras y se podrá demostrar un aumento signifi­
cativo del título de anticuerpos, hecho básico
que permite hablar de una infección específica
reciente. Sin embargo, si la prim era toma se
efectúa entre 5 a 10 días después de la inicia­
ción de los síntomas (decisión tardía), no se p o ­
drá demostrar, mediante la técnica de inhibi­
ción de la hemaglutinación (IHA) común, un
aumento significativo de anticuerpos; en este
caso se necesitaría obtener nuevas muestras de
suero, más adelante, para objetivar la caída del
título que ocurre normalmente, o recurrir a la
titulación específica de IgG e IgM. No obstan­
te, el mismo tipo de muestras, tomadas entre
los 5 o 10 días y otra de 30 días, permite de­
mostrar el aumento de anticuerpos si se utiliza
la reacción de fijación de complemento.

INFECCIÓN
DEL ADULTO Anticuerpos inhibidores
de la hemaglutinación
Virus en (IgG + IgM)
fa rin g e /
Anticuerpos
fijadores de complemento
Virus en / /
sa n g re /' j

- too -10 10 100 1000

INFECCIÓN
c FETAL
"O
igiVI del niño / IgG del niño
'8 V I g G m a te rn a ,/
CD

1
N a c im ie n to 'V Í

- 100 -1 0 1 10 100
F ig . 2 7 -9 . E v o lu c ió n d e m a rc a d o re s d e te c ­
Tiempo en días ta b le s e n la in fe c c ió n r u b e ó lic a .
 Inmunología en las infecciones virales
En el caso p articu lar de la infección del
adulto por virus de rubéola, si se dispone de
una muestra de 5 a 10 días, luego del inicio de
los síntomas y se pueden efectuar técnicas de
estudio de título de inm unoglobulinas 7S y
19S, con una sola m uestra en la que se detecte
un alto títu lo de an ticu erp o s IH A del tipo
19S se podrá inferir una posible infección re­
ciente.
La técnica que permite evaluar las globuli­
nas 19S y 7S ha sido la base de la información
que hoy se dispone sobre la infección congéni­
ta de rubéola y la evaluación de la respuesta del
niño, la cual puede observarse al pie de la figu­
ra 27-9. Se demuestra que durante la persisten­
cia de síntesis de virus en el recién nacido, éste
produce IgM específica de rubéola, lo cual in­
dica que el niño es inmunológicamente compe­
tente, pero evoluciona con una lenta madura­
ción, para eliminar finalmente los clones celu­
lares productores de virus. Mientras esto ocu­
rre, en el suero aumenta lentamente el tenor de
IgG inmune propia del niño. La detección en
este caso de un título alto de IgM específico en
los primeros días y durante los primeros meses
de vida en presencia de concentraciones muy
inferiores de IgG, constituye fuerte evidencia
en favor de una infección en útero.
En beneficio del tiem po y la claridad no
ofrecemos aquí detalles operativos de las prue­
bas de laboratorios desarrolladas. Sólo diremos
que la técnica de inhibición de la hemaglutina-
ción puede ser llevada a cabo en laboratorios
periféricos, ya que pueden distribuirse antíge­
nos inactivados y sueros apropiados de referen­
cia.
R ecientemente se han introducido técnicas
de investigación de anticuerpos por inm uno-
fluorescencia y enzim oinm unoensayo de alto
valor diagnóstico que prácticam ente han des­
plazado la IHA.
La demostrada peligrosidad de la infección
por rubéola en el curso de las primeras sema­
nas de embarazo, hacen necesario que en todos
los casos de dudas se solicite la información
que el laboratorio puede brindar a los efectos
de fijar una conducta más racional sobre la in­
dicación médica. Esto justifica que la disponi­
bilidad de este recurso de laboratorio sea exten­
dida a toda la población.
11. Respuesta inmune en la infección
herpética humana
a) Generalidades
Dentro de la familia herpes viridae hay siete
agentes que producen infección natural en hu­
manos:
547
Herpes simples tipo 1 (facial), HSV I
Herpes simples tipo 2 (genital), HSV2
Citomegalovirus, CMV
Epstein-Barr, EBV
Varicela zoster, VZV
Herpes virus humano tipo 6 (HHV 6 )
Herpes virus humano tipo 7 (HHV7)
Los dos primeros, H SV l y HSV2, son res­
ponsables de infecciones humanas, cuya form a
más común es la inducción de patología en m u­
cosas tanto oral como genital. Otras localiza­
ciones como el ataque a tejidos oculares, piel,
sistem a nervioso central, form as sistém icas,
etc. son menos frecuentes aunque obviamente
de mucho mayor riesgo, sobre todo en recién
nacidos. A estos agentes nos referiremos con
alguna extensión más adelante.
La infección citomegálica es muy frecuente
en seres humanos y, en todos los lugares donde
se ha explorado, se demuestra que alrededor de
un 80% de individuos adultos tienen anticuer­
pos circulantes que revelan una infección p re­
via en algún momento de su vida. La mayoría
de las infecciones generalm ente asociadas a
distribución sistémica pasan como formas in a­
parentes. Cuando existen, uno de los signos
más frecuentes es la inducción de un síndrome
ictérico leve, con inflamación hepática.
La infección in útero induce variadas r e s ­
puestas que van desde el nacimiento de un niño
que excreta virus sin ningún síntoma o signo de
enfermedad hasta severas alteraciones acom pa­
ñadas de malformaciones, que pueden ocasio­
nar la muerte fetal. La infección in útero o p o s­
parto induce un estado de persistencia que p u e­
de, en función del estado inmunitario del indivi­
duo, tener reactivaciones a lo lai-go de su vida.
Las correlaciones entre el tipo de anticuerpos
y su modulación en el estado de actividad de
esta infección p ersistente de] hom bre y sus
reactivaciones es aún objeto de estudio.
El virus de Epstein-Barr ha cobrado una gran
importancia en los últimos años. Se lo encuen­
tra asociado a una serie de síndromes, en m u ­
chos de los cuales su etiología directa aún re­
quiere confirmación.
Se presum e con fundam ento que el agente
EBV tiene un papel etiológico en la m ononu­
cleosis infecciosa. Es frecuente que en la ev o ­
lución de esta infección se induzca una m ode­
rada ictericia que, junto con otros aspectos del
síndrome, hacen en ciertos casos relativamente
difícil establecer un diagnóstico clínico d ife ­
rencial con las hepatitis virales clásicas.
Para enfatizar el problema (tipo de infección
viral, estado inmunitario del huésped, reacción
del huésped, distintas enfermedades) verem os
una serie de síndromes a los cuales se asocian
distintos tipos de marcadores antigénieos del
548 Inmunopatología
virus EBV y en los cuales la respuesta inmune
humoral revela reacción contra determinados
antígenos en especial.
Está relacionado con la mononucleosis infec­
ciosa, ya sea en sus formas clínicas convencio­
nales benignas o sus complicaciones a formas
fatales, a las agammaglobulinemias posmono-
nucleosis infecciosa y al sarcoma de células B
posmononucleosis infecciosa.
Su estrecha relación con el linfoma america­
no de Burkitt, el linfoma africano de Burkitt, el
carcinoma nasofaríngeo, y una entidad carac­
terizada por un síndrome linfoproliferativo, li­
gado recesivamente al gen, nos ejem phfica la
gran variabilidad de estados patogénicos que
dependen de distintos equihbrios inmunológi­
cos a los que se llega.
Se ha demostrado que el genoma del virus
EBV puede integrarse en cromosomas de las
células que infecta, induciendo persistencia de
fracciones genéticas virales.
De todos estos casos de enfermedades distin­
tas originadas por un solo agente viral podemos
inferir que las diferentes respuestas que se in­
ducen en individuos determinados son las que
condicionan la evolución.
El virus varicela zoster es el agente causal
de la varicela en su infección primaria, clásico
síndrome de amplia distribución en la especie
humana, especialmente en niños. Como regla
general de los virus de esta familia, establece
un estado de persistencia en el individuo infec­
tado.
El herpes zoster, forma clínica cuya mayor
frecuencia se presenta en individuos de edad
avanzada o adultos condicionados, consiste en
una reactivación viral en un huésped parcial­
mente inmune. Se explica este fenómeno como
asociado a defectos de equilibrio fisiológico de
la respuesta inmune integral y es frecuente aso­
ciar la aparición de herpes zoster en individuos
con enfermedades neoplásicas, disturbios meta-
bólicos severos y enfermedades degenerativas.
Los herpesvirus humanos de los tipos 6 y 7
infectan hnfocitos T. El HHV 6 causa una leve
infección eruptiva de la infancia conocida co­
mo roséola o exantema súbito. Ambos (HHV 6
y HHV7) han sido asociados a trastornos linfo­
proliferativos, pero restan aún mayores estu­
dios para confirmar esta asociación.
Como hecho general podemos decir que este
tremendo nivel de complejidad que se plantea
en la infección herpética humana es la causa por
la cual aún no se ha podido desarrollar ninguna
vacuna eficiente que perm ita controlar cual­
quiera de los síndromes a que hemos hecho re­
ferencia. Por el contrario, la idea general que
existe es la de alertar enérgicamente contra la
utilización de cualquier tipo de inmunógeno, sin
haber comprendido previamente su real acción
en el individuo, aunque una vacuna con virus '
Varicela vivos atenuados es casi inminente.
Se sospecha, con muchas probabilidades de
certeza, que el camino que separa una infección
con HSVI que induce una enfermedad banal de
mucosas, su complicación con un estado recu­
rrente y la infección abortiva que genera clones
proliferativos pasibles de formar un tumor, son
fenómenos en los cuales la modulación del tipo
y la cantidad de inmunoglobulinas, células in­
m unocom petentes y toda la constelación de
mediadores del sistema inmune desempeñan un
papel decisivo y quizá determinante.
En distintos grados de complejidad ocurre lo
mismo en la infección con el agente de EBV y
con el HBV.
b) Sumario de aspectos de la respuesta inmune
en la infección con virus herpes simple
Una serie de evidencias epidemiológicas, in-
munovirológicas y de estudios de biología mo­
lecular muestran una estrecha asociación del
agente HSV^ (infección genital) y el carcinoma
de cuello uterino. Estos estudios en el gran
contexto de la inducción de malignidad por in­
fecciones virales, han hecho que en el sistema
de la infección herpética humana en general, y
para el caso particular de herpes simple, se ha­
ya acumulado una cantidad considerable de in­
formación.
Las consideraciones y Jos diagramas que a
continuación se presentan tienen un objetivo
didáctico de introducción al problema y no el
de hacer una presentación exhaustiva y crítica.
Es necesario repasar las características es­
tructurales del virus herpes simple, con el obje­
to de tener presente su capacidad genética por
la cual es capaz de inducir la síntesis de cerca
de 30 polipéptidos codificados por el genoma
viral. Esto, cuando el virus produce una infec­
ción productiva, es decir, cuando los mecanis­
mos bioquímicos funcionan de tal manera que
se producen nuevos viriones infectivos.
Recordemos que el agente del herpes simple
(tanto su tipo 1 o 2 ) puede inducir una infec­
ción primaria, de la cual el individuo puede re­
cuperarse y no tener un nuevo problema en el
resto de su vida. Otros individuos, con frecuen­
cias y causahdades diversas, repiten periódica­
mente la enfermedad, en el mismo sitio con in­
tensidades variables. A este fenómeno se llama
recurrencia.
Existen algunos problemas de nomenclatura,
pero podemos aceptar recurrencia sin incurrir
en ningún error.
El problema se genera porque existe pasaje
del ganglio a la superficie de la piel (vía axóni-
ca), que puede producir excreción de virus con
síntomas y signos o sin ellos. Alguien ha pro­

F ig . 2 7 -1 0 . E v o lu c ió n d e m arcad o re.s d e ­
te c ta b le s en la in fe c c ió n h e rp é tie a p r im a ­
r ia d e m u c o s a s (fa c ia l y /o g e n ita l).
puesto llamar en forma diferente a la excreción
viral sin lesiones y a fa excreción vira! con le­
siones, a la que reconocemos como recurrencia.
Lo que importa es aceptar que tanto en in­
fecciones primarias como en reactivaciones a
partir del ganglio puede haber excreción de vi­
rus con enfermedad manifiesta o sin ella.
Desde el punto de vista de la respuesta in­
mune es de interés hacer algunas consideracio­
nes. En la figura 27-10 se presenta la respuesta
inmune clásica de la infección primaria, en la
que se ve un aumento típico de anticuerpos.
En la figura 27-11 se diagrama lo que ocurre
en el estado recurrente. El virus, por un meca­
nismo de traslado por el canal intraaxónico,
viaja desde los terminales nerviosos hasta neu­
ronas de los ganglios del trigémino (infección
facial) o sacros (en la infección genital). En la
neurona, célula que no se divide, se aloja en un
estado particular de latencia y fenómenos aún
no definitivamente aclarados producen el viaje
inverso del virus, desde el ganglio a los term i­
nales nerviosos del sitio original de infección.
A llí alcanza células susceptibles y se induce
una multiplicación viral que se transmite en su
mayor parte por mecanismos de formación de
síncicios y fusión de membranas, alcanzando
células vecinas. Consecuentemente, se produce
el fenómeno de inflamación y una nueva esti­
mulación del sistema inmune (fig. 27-12).
Es de gran importancia resaltar que este fe­
nómeno representa una verdadera paradoja in­
munológica. Esto es, la reactivación de la re­
F ig . 2 7 -1 1 . E v o lu c ió n d e
m a r c a d o re s d e te c ta b le s e n la
i n fe c c ió n h e r p é t ie a p r im a r i a
d e m u c o s a s ( fa c ia l y /o g e n i ­
ta l) y r e c u r r e n c ia s p e rió d ic a s
an u ales.
Inmunología en las infecciones virales 549
Aislamiento y/o
caracterización de
virus a partir de
lesiones externas
Anticuerpos contra antígenos
internos virales demostrados
por fijación de complemento
-10 10,000
Tiem po en días
plicación viral con inducción de la patología
local o sin ella, se produce en individuos que
tienen en su sangre un título importante de an­
ticuerpos neutralizantes contra virus HSV. Las
explicaciones que pueden aportarse en función
de dar una interpretación de este fenóm eno
son:
1. El tránsito del virus en el canal intraaxó­
nico se realiza en ausencia de anticuerpos n eu ­
tralizantes en este compartimiento.
2. El virus a nivel de los terminales nervio­
sos, y antes de acceder a las células suscepti­
bles, interaccionaría con cierto tipo de inmuno-
globulina IgG, a la cual bloquearía, protegien­
do los receptores virales que harían a este virus
insensible a anticuerpos neutralizantes. El virus
así “protegido” por cierto tipo de IgG podría
ingresar a las células susceptibles e infectarlas.
3. Una vez que el virus ha penetrado en las
células susceptibles y amplificado el número de
nuevos viriones infecciosos, el mecanismo de
traspaso de célula a célula puede hacerse por
mecanismo de fusión de membrana con células
contiguas, que lo pone fuera del alcance de los
anticuerpos presentes en el espacio extracelular.
4. La inmunidad dependiente de células y el
m ecanism o de inflam ación actúan, y nuevas
células se informan con antígenos procedentes
de las células infectadas destruidas por m eca­
nismos de citotoxicidad dependiente de linfoci­
tos. Ello mantiene una producción casi p erm a­
nente de células B productoras de anticuerpos
Anticuerpos Recurrencias
neutralizantes virales
-1 0 10 100 10.000
Tiempo en días
550 Inmunopatología
Ganglio trigémino
Viaje intraaxónico de ganglio
i receptores periféricos, donde
alcanza células de piel y/o mucosas
sacros, se ha aislado virus herpes.
Neurona
ganglionar que
alberga el virus
Represión y/o inducción
de la replicación viral. Puede
participar IgG inmune pegada
a antígenos de superficie
en la neurona
circulantes, del tipo neutralizante, y contra to­
dos los otros antígenos virales que se producen
en cantidad suficiente.
En este fenómeno intervienen una serie de
factores concomitantes, contra los cuales la in­
tegridad de la habilidad de respuesta T depen­
diente a nivel de inmunidad celular, la síntesis
de inteferón, la IgA secretoria inmune, etc., de­
sempeñan papeles críticos.
Es de importancia, refiriéndonos aJ tema de
respuesta inimine en infecciones virales, inser­
tar aquí un refuerzo del concepto de inmuniza­
ción. Obviamente, una vacuna clásica de virus
herpes inactivado sólo será capaz de inducir efi­
cientemente anticuerpos contra antígenos de su­
perficie viral (neutralizantes) y muy poco o na­
da contra estructuras antigénicas internas. Una
vacuna de este tipo será inútil, como lo ha de­
mostrado la experiencia, para producir un cam­
bio en el fenómeno de recurrencia, ya que estos
individuos tienen un alto título de anticuerpos.
12. R espuesta inmune en hepatitis B
Se conoce perfectamente la constelación de
pruebas de laboratorio inespecíficas (desde el
punto de vista de los agentes etiológicos), apli­
cadas al diagnóstico y seguimiento de los en­
fermos con hepatitis infecciosa.
Desde el punto de vista epidemiológico, po­
demos reconocer la llamada hepatitis viral in­
fecciosa epidémica o hepatitis A, y la asociada
fundamentalmente a transfusiones de sangre y
aplicaciones parenterales o hepatitis B.
F ig . 2 7 -1 2 . D ia g ra m a d e l
p o s ib le m e c a n is m o de
t r a n s p o r te v ira l e n la re-
cuiTencia h e rp é tic a .
ganglio sacro
De ganglio trigémino 3° o 4-
Siempre que se cultive como
explanto y en presencia de
células permisivas (cocuitlvo)
A fines de la década de 1970, científicos ita­
lianos describieron el virus de la hepatitis D
(HDV) o Delta c¡ue sólo afecta a pacientes que
también estén infectados con el HBV, existien­
do la co-infección y la sobreinfección.
A fines de los años ’80, se describen los vi­
rus de la hepatitis C (HCV) y de la hepatitis E
(HEV), ambos ARN virus, pero de diferente
vía de transmisión = fundamentalmente paren-
teral para HCV y oral para HEV.
En 1965, Blumberg evidenció la presencia,
en la sangre de ciertos individuos, de un antíge­
no al que llamó Australiano. En la actualidad
se acepta que este antígeno está asociado a la
infección con el agente etiológico de la hepati­
tis B y se trata de la presencia, en la sangre de
individuos infectados, de partículas completas
(DAÑE) o partículas subvirales de este com­
plejo antigénico (véase fig. 27-4).
La era del antígeno de Blumberg, como ha
sido dado en llamarse al importante trabajo de
investigación desarrollado en los últim os 1 0
años, ha permitido disponer de técnicas de la­
boratorio de discreta simplicidad, que brindan
un enfoque específico al estudio de diagnóstico
de las hepatitis infecciosas virales. La posibili­
dad de investigar en grandes grupos de pobla­
ción la presencia del antígeno asociado a la he­
patitis producida por el virus de la hepatitis B
(HBV) ha permitido establecer la existencia de
portadores de antígenos por períodos diversos
que pueden alcanzar desde más de seis meses a
años.
Estudios epidem iológicos bien controlados
han demostrado que la transfusión o los contac­

tos parenterales con la sangre de portadores es
capaz de transmitir la hepatitis B a los recepto­
res. El control de la sangre de los donantes, que
permite eliminar a aquellos en los que se detec­
ta el antígeno asociado a hepatitis, disminuye
drásticamente los casos postransfusionales.
Esto justifica ampliamente la aplicación ruti­
naria de técnicas de detección en todos los ca­
sos de transfusión. Es necesario recordar que
otros m ecanism os, adem ás de las p rácticas
transfusionales y algunas de carácter yatrogéni-
co (prácticas dentales, endoscopias, acupuntu­
ra, etc.), ayudan a mantener la endemia natural
del virus en la naturaleza (ritos rehgiosos, ho­
m osexualidad m asculina, heterosexualidad,
etc.).
Antes de presentar un breve comentario so­
bre los aspectos relacionados con la respuesta
inmune en hepatitis B conviene repasar los as­
pectos estructurales del agente (véase fig. 27-4).
Recordemos que la infección humana con el
HBV puede inducir distintos síndromes (véase
gráfico en esta página).
Veamos ahora algunos de los aspectos gene­
rales de la respuesta inmune en estos casos:
a) Individuos refractarios
Se conoce que un reducido número de indi­
viduos han recibido transfusiones de sangre
provenientes de personas infectadas con HBV
y no han respondido con desarrollo de enfer­
medad ni con la producción de una respuesta
inmune detectable. El margen nulo de experi­
mentación en humanos, ya que estas com pro­
N a d a d e te c ta b le
( In d iv id u o s re fra c ta rio s )
H e p a titis v ira l a g u d a
fu lm in a n te (m u e rte )
H e p a titis v i r a l '
aguda
R e c u p e ra c ió n con
e lim in a c ió n d e fin itiv a
d e m ai-cadores de
r e p lic a c ió n v ira l
Inmunología en las infecciones virales 551
baciones provienen de interpretaciones fra g ­
mentarias de casos de accidentes, no perm ite
ningún comentario para dar explicación de este
hecho. Sin embargo es lícito pensar que, por
problemas de receptores u otra causa, el agente
no infecta células susceptibles y es degradado
por mecanismos del huésped antes de que al­
cance a inducir una respuesta inmune detecta-
ble. En otros casos no hay enfermedad, pero sí
resp u esta de anticuerpos fundam entalm ente
contra HBsAg.
b) Hepatitis viral aguda
Uno de los hechos que caracteriza esta enfer­
medad por virus B es el largo y variable perío­
do de incubación, que media desde la exposi­
ción hasta la aparición de los síntomas. L a se­
cuencia de la cinética de los principales m arca­
dores se presenta en la figura 27-13. Antes de
la aparición de los síntomas clínicos y de la
elevación significativa en el suero del paciente
de las aminotransferasas, puede detectarse en él
HBsAg. Esto, junto con un alto título de ADN
polimerasa viral en suero, son indicadores fe­
hacientes de una im portante síntesis de virus
por parte de la célula hepática.
El virus obviamente se replica en el hepato­
cito sin producir daño celular (Usis) “per se” y
en la sangre de este individuo se encuentran
partículas de DAÑE (42 nm) y una gran canti­
dad de HBsAg en su forma particulada de 20
nm y agrupaciones filamentosas. La aparición
de síntomas clínicos y la elevación de las ami­
notransferasas coincide con la brusca aparición
HBV
P o rta d o r o lig o s in to m á tic o
o a s in to m á tic o
H u m a n o s s u s c e p tib le s
t
I n fe c c ió n in a p a re n te
a n ic té ric a
S in s in to m a to lo g ía
c lín ic a su b je tiv a
H e p a titis p e rs is te n te
P e r s is te n c ia d e uno
o m á s m a rc a d o re s
d e r e p lic a c ió n v iral
H e p a titis viral
en e l in d iv id u o
c ró n ic a a g re s iv a
(d e fin itiv a o
i n te rm ite n te )
D is p la s ia d e las c é lu la s -< * - . C irro sis
h e p á tic a s , h e p a to m a
552 Inmunopatología
y el eJevado aumento en suero de anti-HBc, el
anticuerpo contra la m asa antigénica interna
del virión (core). En un tiempo poco definido y
siempre que la recuperación general del enfer­
mo sea un hecho clínico, cae la concentración
de HBsAg en suero.
Sigue a esto un perío d o sin antig en em ia
(HBsAg) detectable que puede extenderse por
semanas y luego comienza a detectarse con una
elevación muy lenta el anticuerpo anti-H Bs
contra el antígeno de superficie.
En una hepatitis viral aguda resuelta, no se
detectan marcadores fehacientes de la replica­
ción del virus (ADN polimerasa y HBeAg en
suero), y sí se observa una caída del anticuerpo
anti-core y un mantenimiento del título de anti­
cuerpos anti-HBs. Este cuadro indica un buen
pronóstico de la infección. Los anticuerpos an-
ti-HBc son primero IgM y luego del tipo IgG y
los anti-HBs son, en el caso de detectarse, del
tipo IgG.
El silencio serológico de HBsAg y anti-HBs
durante el período de transición no se debe en
realidad a una ausencia absoluta, sino a la falta
de sensibilidad de las técnicas empleadas en su
detección, ya que gran parte de la masa de cada
uno de ellos se encuentra formando complejos
inmunes.
Es muy importante plantear la categórica di­
ferencia de la respuesta de anticuerpos anti-
HBc y la de anti-HBs. Cada vez se tiene más
evidencia de que los antígenos de la estructura
del core son realmente nuevos en el organismo
humano, mientras que la constelación de poli­
péptidos que constituyen el antígeno HBsAg
tendrían especificaciones tanto del virus como
de algunas de las proteínas del hepatocito.
El antígeno “e” del virus de la hepatitis B
(HBeAg) se encuentra en el core de la partícula
de DAÑE en forma críptica; es detectable en
suero sim ultáneam ente con la aparición del
HBsAg o poco tiempo después. El HBeAg per­
siste menos tiempo que el HBsAg en la mayo­
ría de los pacientes. El HBeAg es un marcador
de infectividad y su presencia sugiere la conti­
nua actividad del HBV. Además, los inmuno-
F ig . 2 7 -1 3 . E v o lu c ió n d e m a rc a d o re s d e te c ta b le s en
la in fe c c ió n c o n v iru s d e la h e p a titis B . (C a s o d e h e ­
p a titis v ira l a g u d a re s u e lta .)
complejos HBeAg-IgG se consideran inducto­
res de glomerulonefritis membranosa. La desa­
parición del HBeAg es seguida por la aparición
de su anticuerpo, el anti-HBe. Esta seroconver-
sión, que ocurre alrededor del pico de síntomas
clínicos, indica que la enfermedad evoluciona
favorablemente, pudiendo ser interpretada co­
mo probable recuperación y elim inación de
clones productores de virus en el hígado del
huésped (fig. 27-13).
E stas co n sid eracio n es serán n uevam ente
evaluadas al tratar las otras variables de la in­
fección con virus B.
Es de importancia trabajar sobre el concepto
de que la patología que desencadena el síndro­
me de hepatitis no es inducida por la replica­
ción viral “p er se”, sino por la serie de m eca­
nismos que siguen a la respuesta del individuo
y que generan el daño celular del hepatocito.
La imagen microscópica de la biopsia hepá­
tica se caracteriza predominantemente por in­
filtración m ononuclear linfocitaria. Los estu­
dios de la respuesta de inmunidad celular en la
hepatitis viral aguda no arrojan resultados uni­
formes, pero orientan hacia la comprensión de
su importante papel en la inducción de patolo­
gía. Algunos autores han encontrado una pro­
ducción aumentada del factor inhibitorio de la
migración de macrófagos, cuando linfocitos de
pacientes tomados entre la iniciacióti y el pico
de tra n sa m in a sa s fu e ro n e n fre n ta d o s con
HBsAg purificado. Otros autores han hallado
un aumento de la respuesta celular específica
en la iniciación de la convalecencia, cuando el
antígeno HBsAg deja de detectarse en suero.
Existen resultados que indiean, en enfermos
agudos, una respuesta linfocitaria activa contra
HBeAg. Esta tuvo una intensidad de aproxima­
damente el doble eon relación a cuándo se estu­
dió la inducida en los mismos pacientes contra
HBsAg. Otros autores han relatado que durante
la fase aguda y la convalecencia temprana se
produce un aumento del número relativo de cé­
lulas hiporreactivas (mull cells) que pueden al­
canzar un valor del 25% del total de linfocitos
periféricos en el máximo período de supresión.
 Inmunología en las infecciones virales
La interpretación de todos estos datos, no
siempre discrepantes, semeja un rompecabezas,
en el que faltan piezas y el juego consiste en
armar lo más posible y diseñar los estudios fal-
tantes para completar la imagen final.
c) Hepatitis viral aguda fulminante
Algunas hepatitis virales agudas inducidas
por virus B, con desenlace fatal, siguen ei cua­
dro general ya planteado con la sola e im por­
tante excepción de que en forma muy tempra­
na, y precediendo a la instalación de los graves
signos y síntomas que preceden a la muerte, se
detecta un aumento marcado de anti-HBs. El
reducido número de casos estudiados no perm i­
te aún correlacionar este aumento de anti-HBs
y el desenlace fatal, pero obviamente abre aun
más el camino a la hipótesis de que el daño he­
pático estaría relacionado con la exclusión por
citóli.sis de células hepáticas nobles afectadas
por mecanismos inmunes y no por acción di­
recta del virus.
En cuanto a si ese mecanismo es dependien­
te o no de anticuerpo circulante es materia de
estudio.
d) Infección con persistencia de uno o más
marcadores de replicación viral en el
individuo
Un porcentaje no conocido de los individuos
que se infectan (independientemente de que de­
sarrollen o no una hepatitis aguda o una infec­
ción con sintomatología en niveles que no lle­
van al individuo a requerir atención médica)
pueden evolucionar en forma que la respuesta
inmune y otros parámetros involucrados deter­
minen la no ehminaeión de hepatocitos persis­
tentemente infectados, los que continúan, prp-
duciendo virus completos y partículas suf)yira-
les, como la partícula de 2 0 nm correspondien­
te a HBsAg.
C asuísticas efectuadas m ediante estudios
controlados indican que un 5% de las hepatitis
agudas tipo B evolucionan a la persistencia.
Este dato es para áreas epidemiológicas deter­
minadas y no puede generalizarse, pero da una
idea del problema.
Como se presentó en el diagrama, el estado
de persistencia viral en el hígado puede estar
acompañado de una gama de otros hechos que
condicionan polos didácticos de clasificación,
y cuya definición es muchas veces imposible.
Estos son;
dj) Portador oligosintomático o asintomático.
d^) Hepatitis persistente.
d,) Hepatitis viral crónica agresiva.
553
d ,) P o r t a d o r o l ig o s in t o m á t ic o o a s in t o m á t ic o
Este individuo está definido como aquel que
sin sentir ninguna sintomatología, o síntom as
muy ligeros que no obligan a la consulta espe­
cífica, y que por razones diversas, pero funda­
mentalmente por su intento de donar sangre, es
detectado como portador de HBsAg en su san­
gre. Es necesario añadir, para ampliar la defini­
ción, que no debe ser alcohólico ni drogadicto,
y que se demuestre que tiene antígeno HBsAg
detectable en sangre por un período mayor de 6
meses. Además del estudio completo deberá te­
nerse en cuenta que una punción biopsia de h í­
gado no revele ningún tipo de patología defini­
ble. Los estudios referentes a otros parámetros
como aminotransferasas, otras enzimas, facto ­
res de coagulación, etc. deberán corresponder a
límites de normalidad.
En la figura 27-14 planteamos el perfil de n i­
veles de antigenemia y otros datos relacionados
con la respuesta inmune en un portador. En él
se ve como elemento definitorio un alto y con­
tinuo título de anticuerpos anti-HBc, acom pa­
ñando la presencia de HBsAg. Es prácticam en­
te nula la posibilidad de detectar en estos indi­
viduos anti-HBs.
Estudios de inmunidad celular han dem ostra­
do que los linfocitos no tienen ninguna re s ­
puesta activa cuando se utiliza HBsAg p u rifi­
cado como antígeno inductor en las pruebas in
vitro.
En nuestro seguimiento de una serie de p o r­
tadores asintomáticos detectada en el banco de
sangre, 80% de los casos estudiados con evolu­
ción favorable presentaron detección de anti-
HBe y no pudo demostrarse HBeAg.
d^ y dj) H e p a titis p e r s is te n te y h e p a titis v ir a l
CRÓNICA a g r e s i v a
A quí conviene introducir un concepto que
tiene que ver con el armado del rompecabezas
inmunológico de la infección con virus B.
Resulta, como hemos visto, que la infección
puede causar una hepatitis viral que va desde el
síndrome fulminante, con altos y abruptos te­
nores de bilirrubinemia pre mortem, a formas
agudas severas eon franca bilirrubinemia, altos
niveles de aminotransferasas y aguda presencia
de síntom as subjetivos (anorexia, cansancio,
etc.) y, por último, formas muy leves hasta ne­
tamente anictéricas.
El concepto a que hacíamos referencia es el
que perm ite aceptar que cuanto más leve sea e]
cuadro y preferentemente las formas anictéri­
cas, más tendencia tienen estas infecciones a
generar el estado de persistencia.
La diferencia entre un cuadro de hepatitis vi­
ral p ersisten te y una h epatitis viral cró n ica
554 Inmunopatología

F ig . 2 7 -1 4 . E v o lu c ió n d e m a rc a d o re s d e te c ta b le s e n la in fe c c ió n co n v iru s d e la h e p a titis B , e n in d iv id u o s o lig o s in to m á ti-

co s o a s in to m á tic o s (p o rta d o re s).

agresiva tiene que ver con las imágenes de pa­ el radioinmunoensayo sí detecta a ambos. Esto
tología del tejido hepático y, en obvia relación habla claro de la eficiencia de la CIE para de­
con ella, la sintomatología y la signología que tección de HBsAg en portadores. La contrain­
se acompaña. Aproximadamente el 5 al 10% de munoelectroforesis, en el seguimiento de pa­
los pacientes con hepatitis viral aguda tipo B cientes, muestra una eficiencia con respecto al
desarrollan formas crónicas. RIA que no pasa del 40%, mientras que en da­
El HBeAg y la ADN polim erasa viral en dores de sangre llega al 75% de lo que se de­
suero (no incluidas en la figura 27-15 por razo­ tecta con RIA.
nes de claridad) también son francamente de­ El cuadro de complejidad de la respuesta in­
tectados en el período de enfermedad asinto­ mune en la hepatitis crónica agresiva explica
mática, y en realidad es probable que en canti­ “per se” cómo estos casos, en un gran número,
dades no detectables se sinteticen en forma per­ evolucionaron a la fibrosis y culm inan como
manente en este tipo grave de infección. síndromes cirróticos.
Siempre, en estos casos, altos títulos de anti- Como indicador adicional de replicación vi­
HBc acompañan la evolución. ral también encontraremos aquí un alto nivel de
La incapacidad de desairollar una respuesta anti-HBc.
policlonal eficiente de anti-HBs en este tipo de
pacientes puede ser interpretada como un m e­ e) C o r o la r io
canismo de “tolerancia” sobre el que no dispo­
nemos de evidencias experimentales. Q ueda así aclarado que la p ato g en ia que
En cuanto al perfil de la respuesta inmune, y acompaña a la hepatitis viral inducida por el vi­
con referencia especial a la hepatitis viral cró­ rus tipo B tíene un componente fundamental en
nica agresiva, vemos en la figura 27-15 un dia­ la respuesta inmune. El agente tiene una acción
grama de la evolución de los marcadores más citopática muy limitada o nula y es común en­
importantes, a manera de ejemplo que refleja contrar hepatocitos productores de virus (reve­
los resultados de algunos casos estudiados por lados por inmunofluorescencia o microscopia
nuestro grupo. Lo importante es que la presen­ electrónica) perfectamente conservados citoló-
cia de HBsAg y anti-HBs se alternan de forma gicamente.
que se fluctúa entre la formación de inmuno- En portadores asintom áticos, una cantidad
complejos en exceso de antígeno y la situación de material viral se vuelca al torrente sanguí­
inversa, con la formación de inmunocomplejos neo, sin indicios de daño celular hepático.
en exceso de anticuerpos. Las lesiones hepáticas pueden estar modula­
Esta es la razón por la cual es necesario utili­ das por la respuesta inmune celular y humoral.
zar técnicas apropiadas para su detección. Por Daño hepático:
ejemplo la contrainm unoelectroforesis (CIE)
no detecta ni antígeno ni anticuerpo en los pe­ e,) Ataque a antígenos virales en la superfi­
ríodos de cantidades equivalentes, mientras que cie de las células infectadas.
 Inmunología en las infecciones virales
F ig . 2 7 -1 5 . E v o lu c ió n d e m a rc a d o re s d e te c ta b le s en
l a in fe c c ió n c o n v iru s h e p a titis B co n p e rs is te n c ia d e
s ín te s is v ira l y s in t o m a t o lo g í a p e r i ó d i c a (h e p a titis
c ró n ic a a c tiv a ).
e^) A taque a antígenos modificados (hués­
ped-virus) de la superficie celular.
Daño extrahepático: Acción mediada por in-
munocompiejos.
Existe marcada evidencia de que la respuesta
humoral mediada a través de interacciones di­
rectas antígeno-anticuerpo, activación de com ­
plem ento y citotoxicidad anticuerpo-depen­
diente, no .son causa primíiria de lesión de he-
patocitos. Este concepto se apoya en datos en­
tre los cuales los más relevantes incluyen el he­
cho de que la inoculación de anticuerpos an-
tiHBs a portadores de HBsAg no induce nin­
gún daño detectable del hepatocito, explorado
por técnicas convencionales de laboratorio y un
estudio clínico minucioso.
Si bien el anti-H Bc aparece concom itante
con el daño hepático, el anti-HBs aparece en la
convalecencia, en total ausencia de HBsAg, y
es sign o de re c u p e ra c ió n del p acie n te. El
abrupto aumento de anti-HBs en la hepatitis
fulm inante resulta paradójico y aún no tiene
explicación.
Otro dato que apoya una patogenia no de­
pendiente de anticuerpos lo constituye la obser­
vación de que pacientes con agammaglobuline­
mia que desarrollan hepatitis B, tienden a dar
formas más severas, a menudo fatales, cuando
se com paran con la evolución de individuos
normales.
La clara infiltración monocitaria linfocítica
de las lesiones hepáticas abre ya camino a pen­
sar en una dependencia de la actividad inmune
celular en la destrucción del hepatocito. Ha sido
demostrado que individuos con defectos en la
inmunidad mediada por células desarrollan he­
patitis inducidas por infección con virus B m u­
cho más leves que las personas normales. La in­
munosupresión resulta en una disminución de la
sintomatología en los procesos crónicos.
555
Por último, linfocitos o factor de transferen­
cia obtenidos de individuos convalecientes de
hepatitis B, administrados a pacientes que so­
brellevan una hep atitis crónica, inducen un
agravamiento temporal de la severidad del cua­
dro de hepatitis en todos sus parámetros.
Lesiones extrahepáticas
Durante la hepatitis viral aguda tipo B, y no
en la A, los síntomas que siempre acompañan
el cuadro general son aquellos derivados de la
formación y el procesamiento de inmunocom-
plejos. Se hacen evidentes en piel con peque­
ñas petequias, exantema, dolores articulares y
alteración de los pequeños capilares. También
se ha descrito una breve reacción sistém ica
comparable con el síndrome de la enfermedad
del suero, que es prodróm ico, y que precede
hasta en seis semanas a la aparición de los sín­
tomas.
La importancia de los inm unocomplejos en
el desarrollo de la evolución hacia la persisten­
cia viral o no, es material de estudio.
Apéndice de aplicación
práctica
Existen equipos de laboratorio, fundamental­
mente basados en enzimoinmunodetección, con
los cuales se pueden explorar cualitativamente
la presencia o la ausencia de los distintos m ar­
cadores.
Un estudio completo de una hepatopatía que
se sospecha de origen viral incluiría la lógica
a p licació n de una can tid ad de p ru eb as. En
nuestra experiencia, resulta muy práctico el uso
de solamente tres para el inicio de un estudio
serológico de un paciente.
En el cuadro 27-3 se expone la interpreta­
ción más probable.
556 Inmunopatología
Cuadro 27-3
H BsAg Aníi-H Bc Ig M anti-H A V
1 )+
2 )+
3)^
4 )-
5 )-
6 )+
13. Respuesta inmune en la infección
con HIV (agente desencadenante
del síndrome de inmunodeficiencia
adquirida - SIDA)
El SIDA (AIDS, notación inglesa) está ca­
racterizado por una deficiencia básica de la in­
munidad celular, sin otra causa primaria cono­
cida que la infección viral, y es acompañado
por un conjunto de anormalidades inmunológi­
cas y neurológicas que culminan con un dete­
rioro del sistema linfoide y que, generalmente,
puede conducir a la m uerte del paciente por
aparición de infecciones oportunistas o neopla­
sias.
Agente etiológico
El virus causante del SIDA (véase fig. 27-5)
fue descubierto en forma casi simultánea por
el grupo de Montagnier, en el Instituto Pasteur
de París (Francia) bajo la denom inación de
LAV (“lymphoadenopathy-associated-virus”),
por el equipo de Gallo, en el Instituto Nacional
de Cáncer (EE.UU.), con el nombre de HTLV-
III (“H uman-T cell lym photropic virus, type
III”), y por Levy en San Francisco (EE.UU.),
como ARV (“AIDS-related virus”), habiéndo­
se adoptado a partir de junio de 1986 en la n o ­
menclatura internacional las siglas VIH (virus
de la inmunodeficiencia humana) o HIV (nota­
ción inglesa), que es la reconocida en todo el
mundo.
Recientemente se ha aislado un nuevo retro-
virus de pacientes con SIDA que viven en el
oeste de África. Este nuevo virus, denominado
HIV-II, tiene una glucoproteína de envoltura
relacionada con el SIV (virus de la inmunodefi­
ciencia de los simios). Existen grandes diferen­
cias de secuencias entre los dos tipos de HIV.
Los anticuerpos contra la glucoproteína de su­
perficie del HIV tipo I tienen una reactividad
parcial cruzada con el HIV tipo II. Lo mismo
ocurre con los anticuerpos dirigidos contra las
Interpretación
H e p a titis v ira l a g u d a tip o B en in cu b a c ió n
H e p a titis v iral a g u d a tip o B p o rta d o r c ró n ic o o h e p a to p a tía c ró n ic a
H e p a titis v ira l a g u d a tip o B en la c o n v a le c e n c ia , p e rio d o d e s ile n c io
s e ro ló g ic o d e l s is te m a d e s u p e rfic ie o iie p a titis tip o B d e la rg a d a ta
H e p a titis v ira l a g u d a tip o A
H e p a titis n o A n o B
H e p a titis v iral a g u d a tip o A c o n las v a ria n te s d e 2)
proteínas del core de ambos virus. Por lo tanto,
se ha concluido que el SIDA es un síndrome
que puede ser causado por uno o más virus di­
ferentes, pero relacionados entre sí.
Taxonóm icam ente pertenecen a la fam ilia
Retroviridae, género Lentivirus y están consti­
tu id o s por ácido rib o n u cleico (A R N ), una
transcriptasa reversa, proteínas estructurales y
glucoproteínas de envoltura. Las partículas ma­
duras tienen un diámetro de 1 1 0 a 1 2 0 nm.
Se reconocen en el genoma del HIV diferen­
tes genes, gag, que codifica para las proteínas
de la n u cleo cáp sid e: p ro teín a de la m atriz
(MA), proteína de la cápside (CA) y núcleo
proteína (NC); el gen pro codifica para la pro-
teasa (PR); el p o l codifica para la integrasa
(IN) y para la transcriptasa reversa (TR) y el
env que codifica la glucoproteína de transmem­
brana (TM) y las glucoproteínas de superficie
(SU).
Además, contiene por lo menos seis genes
adicionales que codifican proteínas con funcio­
nes reguladoras, es decir, funciones que afectan
ei grado de expresión del HIV y la naturaleza
de las partículas virales que se producen. Estos
genes se traducen en diversas proteínas, de las
cuales las más estudiadas son “tat” y “Rev” . La
proteína tat (activador-trans) se une a una se­
cuencia de ARN (elemento tar) y, junto con
otras proteínas, incrementa en unas cien veces
la cantidad de transcriptos de HIV que se for­
man.
La proteína “R ev” se une a otra secuencia y
promueve el transporte al citoplasma de canti­
dades crecientes de aquellas especies de ARN
mensajeros que codifican las proteínas estruc­
turales del HIV. Las funciones de las proteínas
reguladoras son menos claras.
El conocimiento alcanzado en la estructura y
la biología moleculares del virus, desde su ais­
lamiento a la actualidad, revela la tremenda po­
tencialidad de los científicos para dar respuesta
a un problema que emerge a principio de la dé­
cada del ‘80.
 Inmunología en las infecciones virales
Respuesta inmune humoral a la infección
p or H IV
Obviaremos datos de epidemiología y trans­
misión que no encuadran en esta presentación y
haremos una brevísima referencia a la evolu­
ción de la respuesta inmune. Ésta nos ayuda a
rescatar un nuevo modelo y a tener inform a­
ción que permita orientar diagnóstico y pronós­
tico de la infección.
Cuando un virus como el HIV penetra en la
célula, una enzima exclusiva de los Retrovirus,
llam ada transcriptasa inversa, transform a en
ADN el material genético (ARN) que éstos p o ­
seen. Ese ADN se integra al material genético
celular y a partir de ese momento cada vez que
la célula huésped se divida, las células hijas
contendrán también genes virales. Estos genes
virales, según su estado de expresión, codifican
para proteínas virales. En el máximo estado
permisivo (replicación viral) inducen la síntesis
de: a) proteínas estructurales internas o del core
(gag) identificadas como p24, p25, (CA), p. 17
(MA), p7 (NC) y el precursor del gag p55; b)
enzim as com o la transcrip tasa reversa (TR,
p 6 6 ) y la integrasa (IN, p32); c) proteínas de la
envoltura que con diversos azúcares configuran
las g lu c o p ro te ín á s id e n tific a d a s co m o
SU (gpl20) y TM(tp 41), y d) otras poteínas cu­
yo papel aún se desconoce.
Cuando se efectúa el seguimiento de la in­
fección por HIV, el primer marcador serológi-
co detectable es el antígeno p24 (CA) del HIV
generado por amplificación viral en las células
blanco (fundamentalmente linfocitos TCD^+).
La antigenemia aparece de dos a cuatro se­
manas después de la infección y persiste duran­
te ocho a diez semanas como se observa en la
figura 27-16.
Serología del HIV
Fig. 27-16. N iveles séricos de antígenos y anticuerpos en la infección por HIV.
557
Los anticuerpos contra el core son los p ri­
meros en aparecer, aproximadamente cinco se­
manas a partir de la infección por HIV, y fu e­
ron detectados en el 75-95% de los enfermos
con SIDA o síndromes relacionados. Los an ti­
cuerpos contra la envoltura se detectarían a
partir de la 5- a 1- semanas posinfección; su
declinación constituye signo evidente de d ete­
rioro del estado general del paciente. Junto con
la disminución de la concentración de los anti­
cuerpos core, el antígeno vuelve a ser detecta­
do y esta inversión serológica generalm ente
precede al comienzo de los síntomas clínicos
del SIDA.
La interpretación del papel de los anticuer­
pos, inmunocomplejos y el resto de la constela­
ción de hechos asociados a la respuesta inmune
son aún difíciles de ordenar.
Puede haber individuos portadores del virus
con serología negativa, tratándose de portado­
res o enfermos con déficit inmunológico. Este
hecho, sin embargo, es excepcional.
Durante la fase asintomátiea de la infección
por HIV se detectan en suero anticuerpos con­
tra el core y anticuerpos contra la envoltura
(fig. 27-16).
Anom alías inm unológicas en la infección
por H IV
El trastorno inmunitario de esta infección se
caracteriza por anomalías cuantitativas y cuali­
tativas de la población linfocitaria, esp ecial­
mente en los linfocitos que expresan en su su­
perficie el receptor CD^“^, denominados ta m ­
bién linfocitos T4 (linfocitos cooperadores).
Si bien se han comunicado alteraciones fun­
cionales en los distintos componentes del siste­
ma inmune y en otros sistemas del organismo,
558 Inmunopatología
la anomalía básica de la infección por HIV es
la destrucción de la población linfocitaria T4
ocasionada por el HIV.
Además de infectar las células T se ha
demostrado que el HIV puede infectar: mono­
citos de sangre periférica, líneas celulares mo-
nocíticas, diversos macrófagos tisulares, célu­
las dendríticas, células microgliales del cere­
bro; todos tipos celulares que expresan el re­
ceptor CD^ en sus membranas plasmáticas.
Los mecanismos de la Inmunodeficiencia in­
ducida por el HIV están relacionados con la
particularidad de estos virus de reducir la capa­
cidad funcional de los linfocitos T periféricos y
de las células presentadoras de antígenos, e in­
hibir la producción y maduración de precurso­
res de las células T, por lo que afectaría en can­
tidad y calidad el número de células T periféri­
cas.
A n o m a lía s c u a n ti ta t iv a s d e l o s T 4
En los casos que concuerdan con la defini­
ción aceptada de SIDA, la anomalía más evi­
dente es la linfopenia, en contraste con el nú­
mero absoluto de los linfocitos TCD 8 + que es
normal o aumentado. Se utiliza el cociente en­
tre el número absoluto de TCD4+ y el número
absoluto de TCD 8 + como indicador de la alte­
ra c ió n . E s te c o c ie n te o re la c ió n T C D 8 “"
TCD4+ debe ser menor que 1 para tener signi­
ficación.
Tanto la linfopenia como el descenso de la
relación TCD4+n’CD8^, varían según el tiempo
de evolución y la gravedad del caso. Por lo ge­
neral, la anom alía se va acentuando, y llega
paulatinamente a su expresión más intensa en
los pacientes de fase terminal.
En los pacientes con SID A los linfocitos
TCD4+ casi desaparecen de la sangre circulan­
te. En los pacientes con “complejo relacionado
con el SIDA”, la alteración no es siempre tan
evidente, y en algunos casos oscila en períodos
de mayor o menor intensidad.
Conviene destacar que estas anom alías no
son específicas de la infección por HIV, y pue­
den encontrarse en otros procesos infecciosos o
no.
Existe generalmente anergia cutánea a diver­
sas intradermorreacciones, especialmente a la
candidina y tuberculina. Como otras anomalías
descritas, su presentación se hace con grado
variable de intensidad a lo largo de la evolu­
ción, pero en los pacientes con formas termina­
les de la enfermedad, las pruebas cutáneas no
detectan ninguna reacción.
O t r a s a n o m a l ía s in m u n e s
Se atribuyen generalmente a las anomalías
de la población T CD^+. Se han descrito: a) un
aumento policlonal de las inmunoglobulinas; b)
una disfunción de la actividad macrofágica y
de eitotoxicidad, y c) un aumento de la (32-mi-
croglobulina sérica. Esto ha sido comunicado
como indicador de evolución a formas graves.
Nunca antes había sido producida en tan cor­
to tiempo tal cantidad de publicaciones científi­
cas sobre una enfermedad humana como ha su­
cedido en la actualidad con el SIDA. Los datos
obtenidos sobre la biología molecular, la clíni­
ca, los posibles tratamientos, el desarrollo de
eventuales microorganismos y el problema so­
cial son el resultado de una extraordinaria deci­
sión del hombre para vencer el problema.
Como norma para cerrar este capítulo, pode­
mos decir que es necesario conocer aun más la
patogenia y la respuesta inm une para actuar
con drogas y/o inmunógenos en un desequili­
brio tan complejo como el que genera el HIV.
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Autoinmunidad
CLELIA RIERA
JULIANA LEON!
NORA YRANZO-VOLONTÉ
AUTOINMUNIDAD
Se denomina autoinmunidad a la respuesta
inmune contra componentes propios, y es debi­
da a la presencia de linfocitos T o B autorreac-
tivos. En condiciones normales, los m ecanis­
mos de tolerancia a lo propio protegen al indi­
viduo de estas células potencialm ente auto-
rreactivas.
Hasta la década del ’60 se creía que los lin­
focitos autorreactivos eran eliminados durante
el desarrollo del sistema inmune y que, por una
falla en su eliminación, se implantaba la enfer­
medad autoinmune. A fines de los años ’70 nu­
m erosos hallazgos han contribuido a revelar
que no todos los linfocitos T y B autorreactivos
son eliminados durante su maduración. Por en­
de, individuos normales poseen en su circula­
ción linfocitos autorreactivos, cuya presencia
no indica necesariamente un estado patológico
autoinmune ya que su actividad seguramente es
regulada mediante clones anérgicos o supreso­
res. Una ruptura de esta regulación puede lle­
var a la activación de las células autorreactivas
T o B, generando una respuesta humoral o ce­
lular contra antígenos propios. Estas reacciones
pueden causar serios daños a células u órganos,
que a veces tienen consecuencias fatales.
En este capítulo se describirán algunas en­
fermedades autoinmunes humanas y modelos
en animales de experimentación, como también
los mecanismos que pueden contribuir al de­
sencadenamiento de la autoinmunidad.
Las enfermedades autoinmunes se caracteri­
zan por la presencia de autoanticuerpos y/o lin­
focitos T sensibilizados contra diferentes ma­
cromoléculas del organismo, que en individuos
normales son reconocidas como propias y por
lo tanto no desencadenan respuesta. El recono­
28
cimiento de lo propio es el principio central del
funcionamiento del sistema inmune que no se
contrapone al desarrollo de enfermedades au­
toinmunes, sino que permite explicar su apari­
ción a través de disturbios en el equilibrio in­
mune, el que se autorregula constantemente en
respuesta a señales internas y externas.
La capacidad del sistema inmune para discri­
m inar entre lo propio y lo extraño es adquirida
en primer lugar en el timo, durante la m adura­
ción de los linfocitos T. Los tim ocitos auto­
rreactivos específicos para antígenos expresa­
dos intratímicamente y presentados en asocia­
ción con moléculas del complejo mayor de his­
tocom patibilidad (MHC) son elim inados du­
rante el desarrollo y maduración del timo. Esto
se m anifiesta en la elim inación de clones de
linfocitos T que reconocen antígenos propios
expresados sobre la superficie de linfocitos T y
B, m acrófagos, células dendríticas y células
epiteliales. Las células T que reconocen antíge­
nos propios que no están presentes en el timo
no son eliminadas y permanecen en el organis­
mo, siendo un peligro potencial para el mismo.
L a respuesta inm une a antígenos propios
puede observarse en individuos normales, pero
la potencialidad para desarrollar autoinm uni­
dad está controlada por diferentes mecanismos:
linfocitos T supresores, interacciones idiotipo-
antiidiotipo, bloqueo de receptores celulares
por antígenos circulantes, etc.
Debe diferenciarse, por lo tanto, la respuesta
autoinmune de la enfermedad autoinmune. La
respuesta autoinmune es la demostración de la
existencia de autoanticuerpos que reconocen
antígenos propios o la reactividad de linfocitos
sensibihzados contra un antígeno propio; esta
respuesta puede estar asociada o no con una en­
fermedad autoinmune. En medicina clínica hay
558 Inmunopatología
la anomalía básica de la infección por HIV es
la destrucción de la población linfocitaria T4
ocasionada por el HIV.
Además de infectar las células T se ha
demostrado que el HIV puede infectar: mono­
citos de sangre periférica, líneas celulares mo-
nocítieas, diversos macrófagos tisulares, eélu­
las dendríticas, células microgliales del cere­
bro; todos tipos celulares que expresan el re­
ceptor CD^ en sus membranas plasmáticas.
Los mecanismos de la Inmunodeficiencia in­
ducida por el HIV están relacionados con la
particularidad de estos virus de reducir la capa­
cidad funcional de los linfocitos T periféricos y
de las células presentadoras de antígenos, e in­
hibir la producción y maduración de precurso­
res de las células T, por lo que afectaría en can­
tidad y calidad el número de células T periféri­
cas.
A n o m a l ía s c u a n t it a t iv a s d é l o s T 4
En los casos que concuerdan con la defini­
ción aceptada de SIDA, la anomalía más evi­
dente es la linfopenia, en contraste con el nú­
mero absoluto de los linfocitos TCD 8 + que es
normal o aumentado. Se utiliza el cociente en­
tre el número absoluto de TCD4+ y el número
absoluto de TCD 8 + como indicador de la alte­
ra c ió n . E s te c o c ie n te o re la c ió n T C D 8 “"
TCD4+ debe ser menor que 1 para tener signi­
ficación.
Tanto la linfopenia como el descenso de la
relación TCD4+n’CD8^, varían según el tiempo
de evolución y la gravedad del caso. Por lo ge­
neral, la anom alía se va acentuando, y llega
paulatinamente a su expresión más intensa en
los pacientes de fase terminal.
En los pacientes con SID A los linfocitos
TCD4+ casi desaparecen de la sangre circulan­
te. En los pacientes con “complejo relacionado
con el SIDA”, la alteración no es siempre tan
evidente, y en algunos casos oscila en períodos
de mayor o menor intensidad.
Conviene destacar que estas anom alías no
son específicas de la infección por HIV, y pue­
den encontrarse en otros procesos infecciosos o
no.
Existe generalmente anergia cutánea a diver­
sas intradermorreacciones, especialmente a la
candidina y tuberculina. Como otras anomalías
descritas, su presentación se hace con grado
variable de intensidad a lo largo de la evolu­
ción, pero en los pacientes con formas termina­
les de la enfermedad, las pruebas cutáneas no
detectan ninguna reacción.
O t r a s a n o m a l ía s in m u n e s
Se atribuyen generalmente a las anomalías
de la población T CD^+. Se han descrito: a) un
aumento policlonal de las inmunoglobulinas; b)
una disfuneión de la actividad macrofágica y
de citotoxicidad, y c) un aumento de la (32-mi-
croglobulina sérica. Esto ha sido comunicado
como indicador de evolución a formas graves.
Nunca antes había sido producida en tan cor­
to tiempo tal cantidad de publicaciones científi­
cas sobre una enfermedad humana como ha su­
cedido en la actualidad con el SIDA. Los datos
obtenidos sobre la biología molecular, la clíni­
ca, los posibles tratamientos, el desarrollo de
eventuales microorganismos y el problema so­
cial son el resultado de una extraordinaria deci­
sión del hombre para vencer el problema.
Como norma para cerrar este capítulo, pode­
mos decir que es necesario conocer aun más la
patogenia y la respuesta inm une para actuar
con drogas y/o inmunógenos en un desequili­
brio tan complejo como el que genera el HIV.
BIB L IO G R A FIA
1. C o to , C y d e T o rre s , R A: N a tu ra le z a y e s tru c tu ra de
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M é d ic a P a n a m e ric a n a , 1994.
Autoinmunidad
CLELIA RIERA
JULIANA LEON!
NORA YRANZO-VOLONTÉ
AUTOINMUNIDAD
Se denomina autoinmunidad a la respuesta
inmune contra componentes propios, y es debi­
da a la presencia de linfocitos T o B autorreac-
tivos. En condiciones normales, los m ecanis­
mos de tolerancia a lo propio protegen al indi­
viduo de estas células potencialm ente auto-
rreactivas.
Hasta la década del ’60 se creía que los lin­
focitos autorreactivos eran eliminados durante
el desarrollo del sistema inmune y que, por una
falla en su eliminación, se implantaba la enfer­
medad autoinmune. A fines de los años ’70 nu­
m erosos hallazgos han contribuido a revelar
que no todos los linfocitos T y B autorreactivos
son eliminados durante su maduración. Por en­
de, individuos normales poseen en su circula­
ción linfocitos autorreactivos, cuya presencia
no indica necesariamente un estado patológico
autoinmune ya que su actividad seguramente es
regulada mediante clones anérgicos o supreso­
res. Una ruptura de esta regulación puede lle­
var a la activación de las células autorreactivas
T o B, generando una respuesta humoral o ce­
lular contra antígenos propios. Estas reacciones
pueden causar serios daños a células u órganos,
que a veces tienen consecuencias fatales.
En este capítulo se describirán algunas en­
fermedades autoinmunes humanas y modelos
en animales de experimentación, como también
los mecanismos que pueden contribuir al de­
sencadenamiento de la autoinmunidad.
Las enfermedades autoinmunes se caracteri­
zan por la presencia de autoanticuerpos y/o lin­
focitos T sensibilizados contra diferentes ma­
cromoléculas del organismo, que en individuos
normales son reconocidas como propias y por
lo tanto no desencadenan respuesta. El recono­
28
cimiento de lo propio es el principio central del
funcionamiento del sistema inmune que no se
contrapone al desarrollo de enfermedades au­
toinmunes, sino que permite explicar su apari­
ción a través de disturbios en el equilibrio in­
mune, el que se autorregula constantemente en
respuesta a señales internas y externas.
La capacidad del sistema inmune para discri­
m inar entre lo propio y lo extraño es adquirida
en primer lugar en el timo, durante la m adura­
ción de los linfocitos T. Los tim ocitos auto­
rreactivos específicos para antígenos expresa­
dos intratímicamente y presentados en asocia­
ción con moléculas del complejo mayor de his­
tocom patibilidad (MHC) son elim inados du­
rante el desarrollo y maduración del timo. Esto
se m anifiesta en la elim inación de clones de
linfocitos T que reconocen antígenos propios
expresados sobre la superficie de linfocitos T y
B, m acrófagos, células dendríticas y células
epiteliales. Las células T que reconocen antíge­
nos propios que no están presentes en el timo
no son eliminadas y permanecen en el organis­
mo, siendo un peligro potencial para el mismo.
L a respuesta inm une a antígenos propios
puede observarse en individuos normales, pero
la potencialidad para desarrollar autoinm uni­
dad está controlada por diferentes mecanismos:
hnfocitos T supresores, interacciones idiotipo-
antiidiotipo, bloqueo de receptores celulares
por antígenos circulantes, etc.
Debe diferenciarse, por lo tanto, la respuesta
autoinmune de la enfermedad autoinmune. La
respuesta autoinmune es la demostración de la
existencia de autoanticuerpos que reconocen
antígenos propios o la reactividad de linfocitos
sensibihzados contra un antígeno propio; esta
respuesta puede estar asociada o no con una en­
fermedad autoinmune. En medicina clínica hay
560 Inmunopatología

C u a d ro 28-1. E n ferm ed a d es auto in m u n es nes de autoinmunidad desaparecen. En cambio,

más comunes
Ó rgano-específicas T iro id itis d e H a s h im o to
M ix e d e m a p rim a rio
T iro to x ic o s is
A n e m ia p e rn ic io s a
G a s tritis a tró fic a a u to in m u n e
E n fe rm e d a d d e A d d is o n
D ia b e te s m e llitu s in s u lin o d e p e n d ie n te
U v e ítis fo e o a n a filá c tic a
S ín d ro m e d e G o o d p a s tu re
M ia s te n ia g rav is
M e n o p a u s ia p r e m a tu r a (p o c o c o m ú n )
In fe rtilid a d m a s c u lin a (p o c o c o m ú n )
P é n fig o v u lg a r
P e n fig o id e
O f ta lm ía s im p á tic a
E s c le ro s is m iiltip le
A n e m ia h e m o lític a a u to in m u n e
P ú rp u ra tro in b o c ito p é n ic a id io p á tic a
L e u c o p e n ia id io p á tic a
C irro s is b ilia r p rim a ria
H e p a titis c ró n ic a a c tiv a c o n a n tíg e n o
H B s n e g a tiv o
C irro s is c rip tó g e n a (p o c o c o m ú n )
C o litis u lc e ro s a
S ín d ro m e d e S jo g re n
A rtritis re u m a to id e a
D e rm a to m io s itis
E s c le ro d e rm ia
L E cUscoide
N o órgano-especí- L u p u s e rite m a to s o s is té m ic o (L E S )
fic a s (sistém icas)
numerosos ejemplos de producción de autoan­
ticuerpos sin que estén relacionados con una
enfermedad autoinmune. Ciertos desórdenes de
origen infeccioso y que tienden a la cronicidad,
drogas o envejecimiento pueden estar asocia­
dos a una forma controlada de autoinmunidad.
Luego de la eliminación del agente infectivo o
de la suspensión de la droga las manifestacio­
en las enfermedades autoinmunes, la presencia
de autoanticuerpos o linfocitos T sensibilizados
producen lesión tisular y disfunciones de los
órganos blanco, mecanismos totalm ente des­
controlados y generalmente irreversibles.
Existe una am plia gama de enferm edades
autoinmunes (cuadro 28-1), en cuyos extremos
se encuentran las enfermedades órgano-especí-
ficas y no órgano-específicas, y las que quedan
comprendidas entre estos dos tipos poseen ca­
racterísticas de ambos.
1. E T IO L O G ÍA
Los desórdenes autoinmunes han sido am ­
pliam ente estudiados en seres humanos y en
m odelos anim ales. E stas enferm edades son
multifactoriales y en cada una de ellas puede
estar comprendido más de un mecanismo de in­
ducción. Se conocen numerosos factores que
pueden contribuir a la eclosión de las enferme­
dades autoinmunes:
1.1. F actores genéticos
Estudios poblacionales realizados en fam i­
lias o hermanos gemelos han revelado clara­
mente que los factores genéticos tienen una in­
fluencia significativa sobre la predisposición a
adquirir enfermedades autoinmunes. Los facto­
res genéticos más importantes involucrados en
estas enfermedades son los relacionados con
los genes del complejo mayor de histocompati­
bilidad (MHC), los genes del receptor de los
linfocitos T y los genes del receptor de los lin­
focitos B (Inmunoglobulinas).

C uadro 28-2. Alelos del complejo mayor de histocompatibilidad asociados con el incremento del
riesgo en varias enfermedades autoinmunes

E nferm edad A lelo del C M H R iesgo relativo*

E s p o n d ilitis a n q u ilo s a n te B27 80

S ín d ro m e d e G o o d p a s tu re DR2 16
E n fe rm e d a d d e G ra v e s B 8 /D R 3 3 -4
D ia b e te s m e llitu s D R 4 /D R 3 20
in su lin o -d e p e n d ie n te D R 3 /D Q W 8 100
A rtritis r e u m a to id e a D w l4 Al
ju v e n il B 2 7 /D R 5 4
E s c le ro s is m ú ltip le DR2 5
M ia s te n ia g rav is DR3 10
A n e m ia p e rn ic io s a DR5 5
A rtritis p s o riá tic a B27 11
S ín d ro m e d e R e its r B27 37
A rtritis re u m a to id e a D w 4 /D R 4 10
S ín d ro m e d e S jo g re n Dw3 6
L u p u s e rite m a to s o sis té m ic o DR3 5
C o litis u lc e ro s a B5 4

* P ro b ab ilid ad d e que u n a p erso n a h ete ro cig o ta q u e p o rta el ale lo in d icad o d esa rro lle la e n ferm e d ad , co m p a rad a c o n la p ro b a b ilid ad de la
p o b lac ió n general a la cual se le asig n ó un riesg o ig u al a 1.
 Autoinmunidad 561

1.1.1. Relacionados con los genes al lupus eritem atoso sistémico que presentan
del complejo mayor de histocompatibilidad los ratones NZB/NZW. La mutación bm i2 d i­
fiere de la secuencia convencional H-2b LA en
La asociación genética más estudiada y más sólo tres aminoácidos en las posiciones 67, 70
claramente establecida es la relacionada con los y 71. Los resultados sugieren que estos re si­
antígenos del MHC (cuadro 28-2). Esta asocia­ duos, localizados en la zona del MHC, respon­
ción no es sorprendente ya que las enfermeda­ sable de la unión con el péptido, son importan­
des autoinmunes son dependientes de los linfo­ tes en la inducción de enfermedad autoinmune
citos T y las respuestas inmunes que dependen en el contexto del baekground genético del
de los linfocitos T están restringidas por el NZB. Entre los casos más conocidos se puede
MHC. Por tal motivo, el MHC puede afectar la citar el de la diabetes mellitus insulinodepen-
predisposición a adquirir enfermedades autoin­ diente (IDDM) observada en humanos donde el
munes por varios mecanismos que no son m u­ cambio de un único aminoácido en la secuencia
tuamente excluyentes, e incluyen el haplotipo de la molécula DQ 1 del MHC de clase II p u e­
del receptor del linfocito T (TCR) y la selec­ de inducir protección o susceptibilidad a la en ­
ción, presentación y transporte de los péptidos fermedad. Esta molécula, en individuos norm a­
antigénicos. Entre los modelos animales estu­ les o resistentes a la enfermedad contiene ácido
diados hay uno que es muy interesante y es la aspártico en la posición 57, en cambio, en p a ­
introducción de la mutación (bm \2) en la cade­ cientes de poblaciones causásicas afectados de
na LA en ratones NZB; estos animales sufrie­ IDDM esa posición está ocupada por la valina,
ron una enfermedad autoinmune severa, similar serina o alanina (fig. 28-1). El cambio por un

La posición 57 del DQ (o 1-A) de ia cadena (3 modifica ia susceptibiiidad para enfermarse de

diabetes mellitus insuiinodependiente (IDDIVI)

Asociado con ia resistencia Asociado con ia susceptibiiidad

a la IDDM a la IDDM

Fig. 28-1. E l cam bio de un am inoácido en la secuencia de un C M H de clase II está relacion ad o con la su scep tib ili­
dad de adquirir diabetes. L a s e c u e n c ia d e l C M H -D Q |3 l d e la m a y o ría d e ia p o b la c ió n tie n e a s p á rtic o en la p o s ic ió n .57.
L a p o b la c ió n c o n d ia b e te s m e llitu s p r e s e n ta se rin a , v a lin a o a la n in a en d ic h a p o s ic ió n . E l c a m b io d e u n a m in o á c id o c a r g a ­
d o p o r u n o n o c a rg a d o r o m p e el p u e n te sa lin o a lte rn a d o la e s ta b ilid a d d e la m o lé c u la . T o m a d o d e J e n e w a y y T ra v ers.
562 Inmunopatología
residuo no cargado rompe el puente salino alte­
rando la estabilidad de la molécula de DQ. En
otros modelos animales de enfermedades au­
toinmunes específicas de órgano o sistémicas,
que tienen un defecto en los genes I-E, la pro­
tección a la enfermedad se pudo inducir por la
introducción de genes lE a o IE(3.
1.1.2. Relacionados con los genes
del receptor de los Linfocitos T (TCR)
Se ha estudiado la asociación de los genes
del TCR con las enferm edades autoinm unes
dado que estas enfermedades, como ya dijimos,
son dependientes de linfocitos T. Sin embargo,
hasta el momento, y con muy pocas excepcio­
nes, no hay evidencias claras en animales o hu­
manos que indiquen una relación entre haploti­
pos particulares de TCR y predisposición a ad­
quirir enfermedades autoinmunes. Sin embar­
go, hallazgos interesantes que, aunque necesi­
tan mayores estudios, indican por ejemplo que
la respuesta a péptidos encefalogénicos, prove­
nientes de la pro teína básica de mielina en rato­
nes y ratas, tiene una utilización restringida del
TCR V p/V a. Algunos investigadores preten­
dieron aphcar este conocimiento a la produc­
ción de vacunas sintéticas Vp o anticuerpos an-
ti-Vp. Sin embargo, cuando en enfermedades
autoinmunes se demostró la existencia de res­
tricciones del gen del TCR, el gen o los genes
V dominantes, diferían en los distintos indivi­
duos con la m ism a enferm edad autoinm une,
aunque se pudo observar algunos elem entos
conservados en ciertos V/D/J.
La importancia de determinadas citoquinas
en el control del balance de linfocitos T h l y
Th2 puede ser un factor importante en la pato­
génesis de enfermedades autoinmunes. Los de­
fectos en la estructura del gen, la transcripción
y la función de citoquinas y sus receptores han
sido detectados en varias enfermedades autoin­
munes. Además se ha demostrado, en modelos
animales, que las citoquinas o sus inhibidores
afectan el desarrollo de la autoinmunidad, ya
que se observaron signos de autoinmunidad o
inflamación en ratones transgénicos para una
determinada citoquina o con defectos genéticos
para su inducción.
1.1.3. Relacionados con genes
de las InmunoglobuUnas
Cómo se desencadenan las enfermedades au­
toinmunes es uno de los enigmas de la Inmuno­
logía moderna. El marco principal de la enfer­
medad autoinmune es la presencia de anticuer­
pos circulantes que reaccionan con algunos
componentes u órganos del cuerpo. Si estos an­
ticuerpos causan los síntomas de la enferme­
dad, o son el resultado de ésta, depende de cada
patología.
La asociación de enfermedades autoinmunes
con alotipos e idiotipos de inmunoglobulinas
fue observada por muchos investigadores, sin
em bargo los resultados obtenidos por todos
ellos aún son contradictorios.
Una cuestión fundamental en este tema es la
relacionada al origen de los autoanticuerpos, o
sea: si éstos provienen o no de genes de la línea
germinal, si son el reordenamiento de genes di­
ferentes de aquellos que codifican para anti­
cuerpos de una respuesta inmune normal, o si
son el resultado de mutaciones som áticas de
genes de la línea germinal. Muchos investiga­
dores han tratado de resolver estas preguntas a
través del estudio de los idiotipos presentes en
autoanticuerpos. Estas investigaciones han re­
velado, en autoanticuerpos con diferente espe­
cificidad, la existencia de idiotipos con reacti­
vidad cruzada (cross-reactive idiotypes'. CRI),
lo que dem ostraría que todos estos autoanti­
cuerpos provienen de un mismo gen o de genes
similares y, por ende, la existencia de una res­
tricción idiotípica. Que la respuesta inmune es
altamente restrictiva también fue demostrado
en anticuerpos inducidos por polisacáridos y
haptenos. Se cree que la restricción idiotípica
es el resultado de la respuesta a la estimulación
antigénica de un número limitado de clones B.
Los estudios de restricción en anticuerpos anti-
ADN en pacientes con Lupus eritematoso sisté­
mico (LES), prototipo de las enfermedades au­
toinmunes sistémicas, han indicado que estos
autoanticuerpos presentan un alto grado de
CRL Diamond y Solomon mostraron en sus es­
tudios que el 80% de los pacientes con LES,
que presentan en su suero anticuerpos anti-
ADNds (ADN de doble cadena), expresan un
idiotípo denominado 3L Este idiotipo fue aso­
ciado con la oligoclonalidad de los anticuerpos
que unen ADN.
Para determinar si los autoanticuerpos pro­
vienen de un determinado grupo de genes de la
línea germinal, varios autores han estudiado la
secuencia del idiotipo involucrado en la restric­
ción y la compararon con la secuencia de los
respectivos genes. Recién en los últimos años
se ha comenzado a conocer la secuencia de las
regiones variables de algunos autoanticuerpos;
gracias a ello ha comenzado a surgir informa­
ción con respecto a la restricción idiotípica en
la síntesis de estos anticuerpos.
Es claro que el reconocimiento a lo propio es
normal, hecho demostrado por la existencia de
la red idiotipo-antíidiotipo y la presencia de au­
toanticuerpos naturales. Los autoanticuerpos
naturales aparentemente son de tipo IgM, poli-
reactivos y de baja afinidad. Fundamentalmen­
te difieren de los IgG monoespecíficos en que

estos últim os son de alta afinidad y general­
mente están asociados con la patología autoin­
mune. Los autoanticuerpos naturales también
exhiben un alto grado de reacción idiotípica
cruzada y son el producto de la estimulación de
las células B CDS’^. También se sabe que los
autoanticuerpos naturales son el producto de
genes no mutados de la línea germinal, m ien­
tras que los asociados a enfermedades autoin­
munes presentan gran número de mutaciones,
tanto en el segmento como en el V^. El in­
cremento de mutaciones en los autoanticuerpos
patogénicos hace que se incremente su afinidad
por el autoantígeno, y por lo tanto presentan
una mayor selectividad antigénica. En contras­
te, los anticuerpos polirreactivos naturales son
la expresión de genes no mutados de la línea
germinal. Es importante destacar que la m ayo­
ría de los investigadores opinan que, tanto los
autoanticuerpos patogénicos como los autoanti­
cuerpos naturales y los anticuerpos contra antí­
genos extraños, se originan por el reordena­
miento de los mismos genes, ya que no se ha
demostrado de manera fehaciente la existencia
de una restricción genética para la síntesis de
autoanticuerpos. Sin embargo, en el caso de los
autoanticuerpos presentes en la anemia hemolí­
tica denominada crioaglutinemia, se ha obser­
vado una restricción en el uso del gen V,:,4-21,
perteneciente a la fam ilia de genes Vjj4 (ver
más adelante).
La pregunta que cabe hacer es si los autoan­
ticuerpos naturales son o no los precursores de
los autoanticuerpos patogénicos y cómo apare­
cen. La respuesta aún no existe. El estado ac­
tual de los conocimientos indica que autoanti­
cuerpos naturales y autoanticuerpos que causan
patologías se originan a partir de diferentes lí­
neas celulares, por lo menos en el sistema m u­
rino. Aún no se sabe si las células CD5^ se ori­
ginan a partir de las CD5+; tampoco si los au­
toanticuerpos IgG sintetizados por las células
CDS'" son patogénicos. Por lo tanto, ¿qué fun­
ción cumplen las células CD5"' y los autoanti­
cuerpos naturales que ellas producen? Algunos
autores han sugerido una función de defensa
prim aria que, debido a su polireactividad, se
unirían a un vasto repertorio de organismos in­
vasores. Otros autores han postulado que los
autoanticuerpos son parte de la red idiotipo-an-
ti-idiotipo que contribuye a la homeostasis del
organismo. Por ejemplo, se vió que estos anti­
cuerpos unen a autoanticuerpos de tipo IgG in­
hibiendo su reactividad, lo que sugiere que la
red idiotípica es responsable de la regulación y
mantenim iento de la m em oria inmune de las
células en ausencia del antígeno.
La pregunta crucial, aún sin respuesta, es có­
mo se producen los autoanticuerpos patogéni­
cos, ya que el estímulo para su formación no se
Autoinmunidad 563
conoce. El evento inicial parece ser la activa­
ción policlonal de las células B o su estim ula­
ción por un organismo invasor que da reacción
cruzada con un componente propio (similitud
antigénica). En ambos casos, la producción de
un autoanticuerpo de alta afinidad, monoespecí-
fico y patológico puede ser debida a una selecti­
vidad antigénica a través de un proceso rauta-
cional que no puede ser iniciado o exacerbado
por inm unización exógena de antígenos p ro ­
pios, aunque algunos casos de autoinmunidad
experimental parecerían demostrar lo contrario.
Es evidente que la respuesta autoinmune es
un complicado proceso que requiere una serie
de factores, que incluyen activación de células
T, pérdida de la supresión, efectos hormonales
y factores genéticos.
1.2. Liberación de antígenos secuestrados
o ubicados en sitios privilegiados
Los antígenos asociados con tejidos periféri­
cos, especialmente aquellos secuestrados detrás
de barreras anatómicas, no se ponen en contac­
to con el repertorio de linfocitos T que se está
desarrollando, por lo tanto, la tolerancia central
para estos antígenos no puede ser inducida. La
inducción de enfermedades autoinmunes d es­
pués del contacto con antígenos ubicados en
los llamados “sitios privilegiados” ha sido bien
documentada y ejemplo de ello son la oftalm ía
simpática observada después de la injuria tisu­
lar y la orquitis que se induce después de la va-
sectomía. Recientemente se ha demostrado que
los antígenos asociados a tejidos periféricos
pueden causar tolerancia cuando se introducen
experimentalmente en el timo. Algunos autores
pudieron observar que la inyección intratímica
de células pancreáticas puede prevenir la diabe­
tes autoinmune en ratas Bio-hreeding (B B ) y
en ratones non-obese diabetic (NOD), y que la
inyección intratímica o intravenosa de glutamic
acid decarboxylase (GAD) que parece se r el
principal autoantígeno de la diabetes autoinm u­
ne, puede prevenir la enfermedad en ratones
NOD. Resultados similares se pudieron obser­
var en otros modelos experimentales de autoin­
munidad, como encefalitis alérgica experimen­
tal (EAE) y gastritis experimental autoinmune,
donde la enfermedad se pudo prevenir p o r la
expresión en el timo en animales transgénicos,
de antígenos responsables de la autoinmunidad.
En varias enfermedades autoinmunes se ob­
servó que la liberación de un antígeno secues­
trado induce enfermedad. En la oftalmía sim pá­
tica, el trauma en un ojo induce la liberación al
medio de antígenos que estaban secuestrados,
haciendo que dichos antígenos sean accesibles
para las células T. Las células efectoras induci­
das atacan al ojo traumatizado y además infil­
564 Inmunopatología

A B
Fig. 2 8 -2 . F i daño a un órgano inm u n ológicam ente p rivilegiado p uede causar una respuesta autoinm une. E n la of-
ía h n ía s im p á tic a , el Ira u m a e n un o jo , p u e d e lib e ra r a n tíg e n o s s e c u e s tra d o s y lib e ra rlo s al m ed io . L as c é lu la s e le c to ra s a ta ­
c a n ta n to al o jo d a ñ a d o c o m o al s a n o . A : E l tra u m a e n un o jo p u e d e c a u sa r ia lib e ra c ió n d e a n tíg e n o s in tra o c u la re s s e c u e s ­
tra d o s. B: E l a n tíg e n o in tra o c u la r lib e r a d o e s lle v a d o a lo s n ó d u lo s lin fá tic o s y a c tiv a r a lo s L T . C ; L T e fe c to re s v u e lv e n
p o r v ía s a n g u ín e a y e n c u e n tra n al a n tíg e n o en a m b o s o jo s.

tran y atacan el ojo sano (fig. 28-2). Por lo tan­ ra la presentación de antígenos. Elson y col.,
to, aunque los antígenos no indueen una res­ han sugerido la existencia de una estrecha aso­
puesta inmune por sí mismos, si una respuesta ciación entre los epitopes crípticos y los linfo­
inmune se inicia en otro sitio, ellos pueden ser­ citos T h l. Estos linfocitos liberan citoquinas
vir como blanco para el ataque. Las evidencias entre las que se encuentran el IFN-y y otras que
indiean que la liberación de autoantígenos se­ producen alteración de las enzimas lisosom a­
cuestrados puede ser una causa de autoinmuni­ les, con los consiguientes cambios en la ruptura
dad, que posiblem ente se com plem ente con de proteínas durante el procesamiento antigéni-
otros factores para mantener la respuesta inmu­ eo. Se ha observado además la homología entre
ne, eomo por ejemplo una injuria tisular indu­ determinantes dominantes en una molécula ex­
cida por un virus puede ser un mecanismo libe­ traña y determinantes crípticos de las molécu­
rador de autoantígenos y además proveería fac­ las propias, así eomo también la inducción de
tores eoestim ulatorios que coadyuven en el eélulas T y B autorreactivas después de la in­
proceso de autoinmunidad. munización con una molécula propia y con una
molécula extraña que presentan reacción cruza­
1.3. Epitopes no accesibles o subdominantes da. Recientemente se ha postulado que una vez
que se inicia una respuesta contra un determi­
Los principios de esta teoría se basan en que nante críptico se inducirían posteriores respues­
cada proteína propia presenta un número p e­ tas contra determinantes adicionales.
queño de determinantes antigénicos dominan­
tes que están involucrados en la selección ne­ 1.4. Desconocimiento de lo propio
gativa, siendo el organismo tolerante a ellos.
Por otra parte hay determinantes que, por no Para que las células T se activen en la perife­
ser dominantes no inducen tolerancia, y son los ria se necesitan dos señales: la primera está da­
denominados epitopes crípticos o subdominan­ da por el antígeno asociado a las moléculas del
tes, lo que permite la existencia de un gran nú­ c o m p le jo m ay o r de h is to c o m p a tib ilid a d
mero de células T potencialmente autorreaeti- (MHC) y la segunda por la coestim ulación a
vas. La falta de tolerancia hacia los epitopes través de moléculas accesorias no polimórfieas
crípticos puede deberse a un procesam iento presentes en las eélulas presentadoras de antí­
inefectivo del antígeno o porque están cerca de geno (APCs). Si se da la primera señal pero es­
un epitope dominante con el que compiten por tá ausente la segunda habrá falta de respuesta o
la unión a las moléculas del MHC o del recep­ anergia. Por ejemplo; los linfocitos T que no
tor de linfocitos T (TCR). El rol de los determi­ fueron eliminados intratímieamente y que son
nantes crípticos en la patogénesis de la autoin­ específicos para péptidos propios que no están
m unidad ha sido observ ad o en los ratones expresados en las APCs se harán tolerantes.
NOD, posiblemente porque los virus dan el es­ Posteriormente, si los linfocitos T potencial­
tímulo inicial a través de una incrementada pre­ mente autorreaetivos no se activan no tendrán
sentación del determinante críptico o subdomi­ acceso a tejidos no linfoides. Por lo tanto, la
nante, ya sea por similitud molecular o por la presencia de clones de linfocitos T específicos
regulación inducida por el interferón y (IFN-y) para antígenos propios que no son expresados
para la expresión de genes entre los que se in­ sobre la superficie de APCs no representan un
cluyen las moléculas del MHC, importantes pa­ daño importante en una situación fisiológica.
 Autoinmunidad 565

1 í ' '' ...

Sóio señal del ! ' ' -- ' ' ' Sólo señal
coestimulador específica
i 1 ' ' ■ ■' '

CPA

RLT

Inactivación de LT
Sin efecto en LT
(anergia)

Fig. 28-3. Los LT toleran tes a antígenos expresados sobre células pueden producir reconocim iento en a u se n c ia de
co-estim ulación. L a s c é lu la s p re s e n ta d o ra s de a n tíg e n o s (A P C ) n o p u e d e n re c o n o c e r lo s L T a c tiv a d o s o in a c tiv a d o s si no
e s tá p r e s e n te so b re la s u p e rfic ie d e la c é lu la el a n tíg e n o e s p e c ífic o , e n c a m b io , si e x p re s a n u n a m o lé c u la c o -e s tim u la d o r a
p u e d e n p ro d u c ir la se ñ a l 2. S in e m b a rg o , c u a n d o ias c é lu la s re c o n o c e n a n tíg e n o s en a u s e n c ia d e m o lé c u la s c o -e s tim u la d o ^
ras, e lla s a c e p ta n la se ñ a l 1 y son in a c tiv a d a s.

Se ha postulado que células T maduras espe­ (LCMV) y para el TCR específico. Los resulta­
cíficas para antígenos extratímicos sufren aner­ dos indican que las células T específicas para
gia cuando estos antígenos son presentados por el virus no fueron eliminadas ni anergizadas,
células presentadoras de antígeno no profesiona­ ya que se demostró que había un número gran­
les (distintas a células dendríticas y m acrófa­ de de las mismas que eran funcionales in vitro
gos). Esto se debería a la ausencia de una segun­ dando respuesta proliferativa y citotoxicidad,
da señal apropiada o de factores coestimulato- aunque no fueran eficientes in vivo para reco­
rios (fig. 28-j). Una posibilidad alternativa es nocer y atacar al virus presente en las células
que no haya inducción de anergia, pero que las pancreáticas. Sin embargo, después de la infec­
células T maduras no puedan recibir señales ción con la cepa viral apropiada se observó in­
apropiadas y/o ayuda. Esto daría como resultado filtración celular y daño del páncreas. Estos ha­
que las células T simplemente ignoren a estos llazgos fueron interpretados como una indica­
antígenos. Si posteriormente hay una adecuada ción de que las células T autorreactivas del teji­
presentación a través de células profesionales, do están presentes pero no fueron activadas o
las células autorreactivas que están silenciosas se volvieron anérgicas porque las células que
pueden ser activadas y causar daño tisular. expresan autoantígeno (por ej. islotes ¡3) pue­
O sahi y col., realizaron experimentos con den tener niveles bajos de moléculas del CMH
animales doblemente transgénicos, para la pro­ de clase L no expresar moléculas del CM H de
teína del virus de la coriomeningitis linfocítica clase II y no tener señales coestimulatorias.
566 Inmunopatología

Sin embargo, los resultados obtenidos con
animales transgénicos, aunque de gran signifi­
cación, deben ser tomados con gran precaución
para formular conceptos generales en autoin­
m unidad ya que, por ejem plo, los anim ales
TCR-transgénicos son anim ales inm unocom-
prometidos y muy susceptibles a las enferme­
dades infecciosas.
1.5. Sim ilitud m olecular
La sim ilitud m olecular, tam bién conocida
como mimetización molecular, se puede definir
como la homología en una secuencia de am i­
noácidos entre moléculas propias y extrañas.
Las teorías de epitopes crípticos o de falta de
segunda señal son compatibles con las hipóte­
sis de similitud molecular entre antígenos pro­
pios y extraños, particularmente si estos lilti-
mos son agentes infecciosos. Es bastante fre­
cuente encontrar polipéptidos muy similares o
idénticos en proteínas no relacionadas, y se ha
observado que muchos fragmentos peptídicos
de agentes infecciosos son homólogos con pro­
teínas del huésped inclu id as m o léculas del
MHC (cuadro 28-3). Entre los antígenos micro­
bianos involucrados en autoinmunidad, los más
estudiados son las proteínas del estrés (Hsps),
encontradas en prácticamente todas las formas
vivas. Cuando se compararon las secuencias dC'
aminoácidos de la HspóO con las bases de da­
tos de secuencias de péptidos humanos conoci­
dos se observó que 8 6 péptidos humanos tienen
regiones similares a la HspóO y de éstos, 19 es­
tán asociados a autoantígenos involucrados en
enferm edades autoinm unes. Sin em bargo, la
importancia de la similitud molecular en la pa­
togénesis de enfermedades autoinmunes espon­
táneas no está muy bien definida, como tam po­
co está definido por qué las respuestas inmuno-
lógicas a las Hsps, que son expresadas en todas
las células, pueden llevar a una enfermedad au­
toinmune específica de órgano.
En un estudio muy interesante, utilizando ra­
tones transgénicos que expresan una proteína
del LCM V en células de los islotes del pán­
creas, se pudo observar que no responden a la
proteína y que no enferman de IDDM. Sin em­
bargo, si los ratones transgénicos son infecta­
dos con LCMV se induce una potente respuesta
de células T citotóxicas anti-virus y esto mata
las células llevando a la IDDM (fig. 28-4). Se
debe tener en cuenta que, si bien hay varios
ejemplos de inducción de autoinmunidad, des­
pués de la infección por algunos microorganis­
mos (miocarditis por streptococos del grupo A,
artritis por micobacterias, etc.) para la mayoría
de las enfermedades autoinmunes humanas no

C u ad ro 28-3. Sim ilitud molecular entre proteínas de organismos infecciosos y proteínas del
huésped humano

Proteína* R esiduo’ Secuencia^

C ito m e g a lo v iru s h u m a n o 79 PD PLG R PD ED

M o lé c u la H L A -D R 60 VTELG RPD A E

P o lio v iru s V P 2 70 STTKESRGTT

R e c e p to r d e a c e tilc o lin a 176 T V IK E S R G T K

Viru.s d e p a p ilo m a E 2 76 SLH LESLKDS

R e c e p to r d e in su lin a 66 V Y G LESLK D L

G lu c o p ro te ín a d e l v iru s d e la ra b ia 147 T K E S L V II S
R e c e p to r d e in su lin a 764 N K E S L V IS E

K lebsiella pneum oiae n itro g e n a s a 186 SR Q TD R ED E

M o lé c u la H L A -B 2 7 70 KAQTDREDL

A d e n o v iru s 12 E l B 384 LRRGM QTDREQCN

a -g lia d in a 206 LG QG SQTD REQ QN

P ro te ín a p 2 4 d e l v iru s del S ID A 160 GV ETTTPS

R e g ió n c o n s ta n te d e la IgG 466 GV ETTTPS

P ro te ín a P 3 del v iru s d e s a ra m p ió n 13 L E C IR A L K
C o rtic o tro p in a 18 L E C IR A C K

P ro te ín a P 3 del v iru s d e s a ra m p ió n 3] E IS D N L G Q E
P ro te ín a b á s ic a d e m ie lin a 61 ELSFKLG QE

* E n cada par, la p ro le/n a h u m a n a es lista d a segunda. S e h a o b serv ad o q u e las p ro leín a s de cada p a r p re sen tan re activ id ad cruzada.
^ C ada n ú m ero indica la p osición a m in o -term in a l del p ép tid o in d icad o , en la p ro teín a nativa.
2 La sec u en cia es re p rese n ta d a con el có d ig o d e una sola letra.

se ha determinado un agente patógeno que esté
totalmente identificado con un determinado ór­
gano. No se puede descartar que el microorga­
nismo haya estado en contacto con el organis­
mo antes de la manifestación de la enfermedad
y que los órganos que tengan el epitope de
reacción cruzada puedan estar afectados sin es­
tar presente el microorganismo.
Es interesante destacar que los agentes infec­
ciosos pueden participar en la inducción de las
enfermedades autoinmunes no sólo por la simi­
litud molecular con un autoantígeno sino que
además producen daño tisular y liberación de
antígenos secuestrados, disponibilidad de epi­
topes crípticos a través de una increm entada
expresión de moléculas MHC, cambios en el
espectro de la producción de citoquinas, activa­
ción aberrante de linfocitos T, etc.
1.6. Teoría de lo “propio modificado”
Esta teoría postula que la autoinmunidad se
puede inducir como consecuencia de una res­
puesta inmune contra determinantes antigéni­
cos propios modificados. Aunque no hay una
demostración clara de esta teoría, han sido pu­
blicados varios ejemplos, entre ellos, aquellos
que indican que pueden aparecer nuevos deter­
minantes antigénicos en anticuerpos que sufrie­
ron alguna mutación somática durante la m adu­
ración de la respuesta inmune. También se pos­
tula que la modificación de la IgG al form ar
complejos inmunes o los defectos en la gluco-
silación de la IgG podrían inducir la formación
de los denominados factores reumatoideos (ver
en Artritis reumadoidea), o que el C3 del com­
plemento podría exponer nuevos determinantes
durante su activación. Por otra parte, hay una
gran lista de drogas a las que se han relaciona­
do con la inducción de LES por la posibilidad
de que se unan a epitopes de moléculas pro­
pios, induciendo una modificación molecular.
1.7. Defectos en la tolerancia central
o periférica
Los defectos en la tolerancia central o periféri­
ca como inductores de autoinmunidad tienden a
inducir, fundamentalmente, enfermedades autoin­
munes sistémicas y pueden ser debidos a proble­
mas de los linfocitos T o de los linfocitos B.
1.7.1. Defectos en la tolerancia
de linfocitos T
Existen varios modelos experim entales de
autoinmunidad inducida por falta de tolerancia
de linfocitos T. Uno que está bastante desarro­
llado es la inducción de enfermedades autoin­
munes órgano-específicas en ratones irradia­
Autoinmunidad 567
dos, reconstituidos con médula ósea y tratados
con ciclosporina; el efecto posiblemente es de­
bido a la interferencia de esta droga en la apop-
tosis durante la selección negativa de clones
autorreactivos. Otro ejemplo bastante estudiado
es el desarrollo de manifestaciones autoinmu­
nes en distintos órganos en animales que fue­
ron timectomizados los primeros días de vida.
Parecería que hay una correlación entre el esca­
pe a la periferia de clones V de superantígenos
(SAg) propios y el daño tisular. Sin embargo,
otros hallazgos no apoyan esta hipótesis. Se ha
observado que ratones susceptibles al LES, in­
cluidos los ratones Ipr y glcl, que tienen defec­
tos en el Fas (CD95) y en el ligando del mismo
(Fas L), tienen las proteínas endógenas del
SAg, que serían las mediadoras de la elimina­
ción del clon V. Se observó que este proceso
no se altera con la edad ni con el desarrollo de
la enfermedad. Sprent sugirió que la autoinmu­
nidad en anim ales neonatos tim ectom izados
puede ser causada por deficiencias cuantitati­
vas de linfocitos T, así como también la sus­
ceptibilidad a la infección y la posterior libera­
ción de antígenos propios desde el sitio de la
infección. Los hallazgos relacionados a elimi­
naciones intratímicas mediadas por el SAg no
excluyen la posibilidad de que haya defectos en
la tolerancia central a linfocitos T por antíge­
nos convencionales en la patogénesis de au­
toinmunidad.
1.7.2. Defectos en la tolerancia
de linfocitos B
No hay evidencias claras que indiquen que un
defecto en este proceso pueda contribuir marca­
damente a la inducción de una enfermedad au­
toinmune. Sin embargo, hay varios estudios rea­
lizados con animales transgénicos donde se ob­
serva falta de tolerancia a linfocitos B, lo que se
trató de explicar diciendo que habría antes una
activación de linfocitos T, los que sacarían de la
anergia a los linfocitos B. Otra posibilidad para
explicar esta falta de tolerancia sería que haya
sido inefectiva la muerte de linfocitos B auto­
rreactivos por tener deficiencias del Fas y no ha­
ber podido ser eliminados por los linfocitos T ci­
totóxicos CD4+ que expresan Fas.
1.8. Activadores polielonales
La activación policlonal de linfocitos T y B
es considerada un mecanismo importante en la
inducción o mantenimiento de las enfermeda­
des autoinmunes, especialmente las enfermeda­
des sistémicas. Se ha demostrado la existencia
de linfocitos B autorreactivos y de células aner­
gizadas que se pueden activar después de un
estím ulo apropiado. Hay un gran núm ero de
568 Inmunopatología

B
Páncreas

Promotor Nucleoproteína
de insulina LCMV (NP)

Fig. 28-4. U na infección viral p uede rom per la toleran cia por una proteína transgénica viral expresada en células
pancreáticas p . R a to n e s q u e e x p re s a n u n a p ro te ín a d e l L C M V en las c é lu la s p a n c re á tic a s (3 n o r e s p o n d e n a la p ro te ín a y
p o r lo ta n to n o se e n fe rm a n . S in e m b a rg o , si ra to n e s tra n s e g é n ic o s so n in fe c ta d o s c o n el L C M V , se p ro d u c e u n a p o te n te
re s p u e s ta a n ti-v ira l c o n p ro d u c c ió n d e L T c ito tó x ic o s q u e d e s tru y e n las c é lu la s p a n c re á tic a s (3, p ro d u c ié n d o s e la e n fe r m e ­
dad. A lg u n o s a g e n te s in fe c c io s o s p u e d e n d e s e n c a d e n a r u n a re s p u e s ta a c é lu la s T , y p ro d u c ir u n a re a c c ió n c r u z a d a co n
p é p tid o s p ro p io s, p ro c e s o c o n o c id o c o n el n o m b re d e m im e tiz a c ió n m o le c u la r o s im ilitu d a n tig é n ic a , p u d ie n d o c a u s a r e n ­
fe rm e d a d m e d ia n te u n a v ía sim ila r. A : G e n h íb rid o p ro d u c id o p o r in se rc ió n del g e n d e la n u c le o p ro te ín a (N P ) del L C M V
al p r o m o to r d e in su lin a . B : R a tó n tra n s g é n ic o q u e e x p re s a s ó lo la N P s o b re las c é lu la s p d e l p á n c re a s , p o r lo n o se p ro d u c e
re s p u e s ta a L T . C: L o s L T C D 8 e s p e c ífic o s p a ra N P so n a c tiv a d o s p o r in fe c c ió n c o n el v iru s L C M V . L o s L T C D 8 in fil­
tra n a los islo te s y d e s tru y e n las c é lu la s p q u e e x p re s a n la N P , p ro d u c ié n d o s e d iab e te s.

moléculas, especialmente de origen microbia­ mecanism o es el que estaría presente en p a­

no, que tienen capacidad para activar polielo- cientes afectados de artritis reumatoidea donde
nalmente linfocitos B e inducir autoanticuer- se observa un enriquecimiento en la sinovia de
pos. Sin embargo, es discutible la patogenici- linfocitos T que expresan V[3l4, y una dismi­
dad que estos activadores pueden originar en nución de éstos en linfocitos T de sangre peri­
las enfermedades sistémicas ya que, por ejem­ férica. Se ha postulado además que las eélulas
plo, los anticuerpos que inducen son general­ activadas por el SAg (incluyendo las que ex­
mente de tipo IgM y de baja afinidad, mientras presan V pl4 ) son expandidas y luego elimina­
que el daño más importante en el LES está da­ das, pero que algunas son atraídas a la sinovia
do por los anticuerpos tipo IgG. Por otra parte, porque expresan TCRs que dan reacción cruza­
en animales de experimentación, aunque se ob­ da con una molécula propia presente en este si­
serven títulos altos de anticuerpos, las manifes­ tio. Los ensayos realizados para inducir experi­
taciones histológicas se observan sólo en los mentalm ente enferm edades autoinm unes por
animales con predisposición genética a adquirir activación de linfocitos T con SAg in vitro e in
la enfermedad. También es interesante tener en vivo son poco promisorios, aunque se ha podi­
cuenta que la im plantación de enferm edades do inducir artritis por un SAg producido por el
autoinmunes requiere, en la mayoría de los ca­ micoplasma, al igual que algunas manifestacio­
sos, la participación de linfocitos T. nes autoinmunes se asociaron con infecciones
Estudios llevados a cabo para determinar la estreptocócicas. Sin embargo, estas manifesta­
activación de linfocitos T por los superantíge­ ciones generalm ente estuvieron relacionadas
nos (SAgs), demostraron que SAgs bacterianos con la similitud m olecular entre epitopes del
o virales unidos a moléculas del MHC sobre microorganismo y del huésped.
los linfocitos B llevan a la producción policlo­
nal de inmunoglobulinas y en algunos casos de 1.9. A lteraciones de los mecanismos
autoanticuerpos. Alternativamente, los linfoci­ de inmunorregulación
tos T activados pueden inducir por sí mismos
daño tisular a través de reacciones cruzadas La ausencia de una inmunorregulación ade­
con moléculas propias. Se ha inferido que este cuada ha sido considerada una de las principa­

les causas de la inducción de autoinmunidad,
aunque estos mecanism os no han sido clara­
m ente d efin id o s. Sin em bargo, hay v ario s
ejemplos de modelos experimentales de enfer­
medades autoinmunes donde sub-poblaciones
de linfocitos T pueden inducir o inhibir el desa­
rrollo de las enfermedades. Por ejemplo, si se
eliminan células T RT6.1+ de una sublínea de
ratas BB resistentes a la diabetes, se revierte el
proceso y las ratas enferman. Por el contrario,
la enfermedad se puede inhibir por transferen­
cia de células T CD4+CD45RC (low) en cepas
de ratas linfopénicas (timectomizadas e irradia­
das). Se ha postulado que estas células proveen
IL4 e ILIO, que disminuyen la producción de
IFNy disminuyendo las células citotóxicas in-
ductoras de diabetes.
2. CO N CLU SIO N ES
Con respecto a las enfermedades autoinmu­
nes específicas de órgano, se puede concluir
que son causadas por respuestas inmunes con­
vencionales contra antígenos propios hacia los
que no se indujo tolerancia. La ausencia de to­
lerancia para antígenos específicos de determi­
nados tejidos puede ser atribuida a antígenos
que no estaban presentes o disponibles en con­
diciones norm ales como consecuencia de un
secuestro anatómico, una presentación inade­
cuada debido a la naturaleza críptica del deter­
m inante, etc. En caso de que hubiera algún
trauma tisular o inflamación por un microorga­
nismo o reacción cruzada con algún epitope del
elemento patógeno, se podría iniciar una enfer­
medad autoinmune específica de órgano.
Con respecto a las enfermedades autoinmu­
nes sistémicas tales como el LES, la situación
es menos clara, ya que ni la activación policlo­
nal de linfocitos T o B ni los elementos que al­
teran los mecanismos inmunorregulatorios pa­
recerían ser suficientes para inducir la enferme­
dad. Sin embargo, la inducción de LES en ce­
pas de anim ales susceptibles, independiente­
mente de las condiciones del bioterio, sugiere
que un elemento patógeno, exógena o endóge­
no, podría estar involucrado. El hecho de que
en el LES haya respuesta autoinmune contra
una vasta variedad de autoantígenos estaría en
contra de la similitud molecular con un antíge­
no externo. Estos argumentos no excluyen los
efectos precipitantes de una variedad de facto­
res físicos, químicos e infecciosos. Esta enfer­
medad heterogénea podría estar causada por el
compromiso de un gran numero de linfocitos T
no tolerantes que reconocen varios péptidos
propios presentados por moléculas del CMH de
clase II a distintos niveles. Otra posibilidad, co­
mo está ejemplificada en los modelos murinos
Autoinmunidad 569
Ipr/gld de LES, puede ser que defectos en la
apoptosis lleven a una inadecuada tolerancia de
linfocitos T y linfocitos B.
3. PA TO G E N IA
Cada enfermedad autoinmune tiene una ca­
racterística inm unopatogénica que involucra
uno o más mecanismos de daño tisular. L a pa­
tología de la enfermedad está determinada por
el antígeno o el grupo de antígenos contra los
que está dirigida la respuesta inmune y el m e­
canismo por el cual el tejido que presenta dicho
antígeno es dañado. Una clasificación m uy di­
fundida de las enfermedades autoinm unes se
basa en el mecanismo inm unopatogénico res­
ponsable de la lesión observada en las mismas
(cuadro 28-4).
La interacción antígeno-anticuerpo puede
producir diferentes tipos de lesión tisular según
que los anticuerpos estén dirigidos contra antí­
genos de la célula o estén formando parte de
complejos inmunes. El primer caso se observa
frecuentemente en anemia hemolítica, neutro­
penias, linfopenias y trombocitopenias asinto-
máticas debido a la presencia de anticuerpos
contra células de la sangre. En el síndrome de
Goodpasture, cuya lesión principal es debida al
prim er mecanismo descripto, se observa glo-
m erulonefritis debida a la presencia de an ti­
cuerpos contra antígenos de la membrana basal
del glomérulo y fijación de complemento. En
otras ocasiones el daño tisular es producido por
anticuerpos que median la citotoxicidad celular
C u a d ro 28-4. Clasificación de las enfermeda­
des autoinmunes de acuerdo al mecanismo in­
munopatogénico involucrado
1. LESIÓN MEDIADA POR ANTICUERPOS
L L A n tic u e rp o s d irig id o s c o n tra a n tíg e n o s d e la m a tr iz o
d e la s u p e rfic ie c e lu la r
A n e m ia h e m o lític a a u to in m u n e
P iírp u ra tro m b o c ito p é n ic a a u to in m u n e
S ín d ro m e d e G o o d p a s tu re
P é n fig o v u lg a ris
F ie b re r e u m á tic a a g u d a
1.2. L e s ió n p ro d u c id a p o r c o m p le jo s in m u n e s
G lo m e ru lo n e fritis p o s e s tr e p to c ó c ic a
P o lia r te r itis n o d o sa
L u p u s e rite m a to s o s is té m ic o
2. LESIÓN MEDIADA POR LINFOCITOS T
D ia b e te s m e llitu s in s u lin o d e p e n d ie n te
A r tritis re u m a to id e a
E n c e fa lo m ie litis
570 Inmunopatología
dependiente de anticuerpos; por ejemplo, la ti­
roiditis autoinmune espontánea de pollos obe­
sos.
Sin embargo, existen otras situaciones donde
la combinación del antígeno (ligado a la célula)
y el anticuerpo no produce daño de la membra­
na celular sino estimulación de la célula. Este
es el caso de la detección de anticuerpos que se
fijan al receptor de la hormona estimulante de
tiroides (TSH) y activan la glándula (enferme­
dad de Graves) estimulando la producción ex­
cesiva de hormona tiroidea (fig. 28-5). La pro­
ducción de horm ona tiroidea en condiciones
normales es controlada por un fenómeno de re­
troalimentación, ya que altos niveles de hormo­
na tiroidea inhiben la liberación de TSH por la
glándula pituitaria; este mecanismo de retroali-
mentación no tiene efecto cuando el receptor es
estimulado de manera patológica, como es el
caso de autoanticuerpos anti-receptor. En la en­
fermedad de Graves, se producen estos autoan­
ticuerpos que estimulan al receptor, por lo tan­
to el fenómeno de retroalimentación no funcio­
na y los pacientes presentan hipertiroidism o
(véase más adelante).
La presencia de autoanticuerpos contra re­
ceptores celulares se ha detectado en diversas
enfermedades o estados autoinmunes así, por
ejemplo, se observan anticuerpos antagonistas
contra el receptor de insulina induciéndose hi-
perglucemia y quetoaeidosis con resistencia a
la insulina. Si por el contrario el anticuerpo es
un agonista del receptor de la insulina, se ob­
serva hipoglucemia. En la miastenia gravis se
detectan anticuerpos contra el receptor de la
acetilcolina; tam bién se han observado anti­
cuerpos contra receptores de la prolactina, de la
hormona de crecimiento y p-adrenérgicos. En
la miastenia gravis los anticuerpos contra la ca­
dena a del receptor de la acetilcolina bloquean
la transmisión neuromuscular normal (fig. 28-
6 ). Se ha postulado que los anticuerpos colabo­
ran en la internalización y degradación intrace­
lular de los receptores de acetilcolina. Los pa­
cientes con miastenia gravis tienen un debili­
dad progresiva y eventualmente mueren como
consecuencia de esta enfermedad autoinmune.
Varios autores han estudiado enfermedades au­
C u ad ro 28-5. Enfermedades mediadas por anticuerpos contra receptores celulares
Enferm edad Antígeno
E n fe rm e d a d d e G ra v e s R e c e p to r d e la T S H
M ia s te n ia g rav is R e c e p to r d e a c e tilc o lin a
D ia b e te s m e llitu s A n ta g o n is ta d e l re c e p to r
toinmunes en las que se detectaron anticuerpos
contra receptores de la prolactina y de la hor­
mona de crecimiento, los que bloquean princi­
palmente la unión de la hormona homóloga. En
el cuadro 28-5 se detallan algunas de las enfer­
medades en las cuales los autoanticuerpos con­
tra receptores celulares tienen un rol importan­
te pudiendo actuar como agonistas o antagonis­
tas de las hormonas.
En el caso de la lesión producida por com­
plejos inmunes, los anticuerpos tipo IgG e IgM
se combinan con el antígeno y forman comple­
jos inmunes que fijan complemento. Los com­
plejos inmunes pueden estar formados por antí­
genos solubles o antígenos que forman parte de
la estructura de un tejido o una célula. Los
complejos inmunes solubles pueden producir
vaseulitis y nefritis por su depósito en los en-
dotehos de los vasos o en el glomérulo renal.
Los factores del complemento, además de los
granulocitos y monocitos, son atraídos a los si­
tios de depósito de los complejos inmunes, pro­
vocando muerte celular. Este mecanismo es el
principal responsable de las lesiones observa­
das en el LES, y es muy importante también en
la patogenia de los ratones NZB/NZW.
Las reacciones inm unitarias m ediadas por
células ocurren eomo resultado de las acciones
recíprocas de linfocitos T activamente sensibi­
lizados y sus antígenos específicos, y son m e­
diadas por linfoquinas o son debidas a citotoxi­
cidad directa. Es posible clonar líneas celulares
T que transfieren la enfermedad a un animal
del m ism o haplotipo. Esto ha hecho posible
identificar los autoantígenos involucrados en
muchas enfermedades autoinmunes experimen­
tales. Los antígenos son péptidos que se unen a
moléculas determinadas del MHC. Por ejem ­
plo, líneas T clonadas pueden causar una enfer­
medad desmielinizante del cerebro, la encefalo-
m ielitis alérgica experim ental (EAE), que se
asemeja a la esclerosis mtíltiple del ser huma­
no. Estas líneas celulares clonadas son estimu­
ladas por péptidos de la proteína básica de mie-
lina. La identificación de péptidos autoantigé-
nicos es particularmente difícil en el caso de
enfermedades autoinmunes mediadas por célu­
las T CD 8 +.
M ecanism o Sintonías
E s tim u la n te H ip e rtiro id is m o
B lo q u e a n te D e b ilid a d p ro g re s iv a
B lo q u e a n te H ip e rg iu c e m ia
 Autoinmunidad 571

Cuadro 28-6. Modelos experimentales de autoinmunidad espontánea

Posible contrapartida Antígeno E nferm edad

M odelo anim al de enferm edad en hittrumos inductor transm itida p o r L T

R a to n e s d ia b é tic o s n o -o b e s o s D ia b e te s m ellitu s in su lin o -d e - N o c o n o c id o Sí

(N O D ) p e n d ie n te (IDDIVI)

R a to n e s F l L u p u s e rite m a to s o s is té m ic o N o c o n o c id o Sí
(N Z B X N Z U ') (L E S )

C e p a d e p o llo s o b e so s T iro id itis d e H a s h im o to T iro g lo b u lin a Sí

A l realizar una prueba de la actividad de cé­ gónico de las células T hl y no de las Th2, es­
lulas de los nodulos linfáticos sobre monocapas pecíficas para la proteína básica de mielina, ya
de células de tiroides provenientes de ratones que la enfermedad pudo ser transferida por cé­
inm unizados con tiroglobulina homóloga, se lulas T h ly no por Th2.
detectaron células citotóxicas efectoras. La ci­
totoxicidad se produjo después de la estim ula­
ción in vitro con tiroglobulina durante 5 o 6 4. MODELOS EXPERIMENTALES
días. Sin embargo, en esta enfermedad no se DE A UTOINM UNIDAD
excluye el papel de los autoanticuerpos en el
agravam iento de la lesión tiroidea, especial­ Los modelos animales de autoinmunidad es­
mente en el ser humano, donde las células B pontánea o experim entalm ente inducida son
activas se encuentran en número elevado. útiles para tratar de dilucidar la etiopatogenia
En algunas enferm edades autoinmunes es­ de estas enfermedades.
pontáneas como la IDDM observada en ratones
NOD, el 60-80% de las hembras se vuelven hi- 4.1. M odelos de autoinmunidad espontánea
perglucémicas a las 30 semanas de edad y to­
dos los ratones presentan infiltración linfocita­ Diferentes cepas de animales que presentan
ria de los islotes de Langerhans. Estos infiltra­ alteraciones en el sistema inmune han sido m o­
dos están constituidos principalmente por linfo­ delos útiles para estudiar enfermedades autoin­
citos T CD4+ y CD 8 +, linfocitos B y m acrófa­ munes (cuadros 28-6 y 28-7). Entre los anim a­
gos pero, por experim entos de transferencia les más utilizados para estudiar enfermedades
adoptiva, se demostró que los linfocitos T son autoinm unes sistém icas podem os citar a un
los principales responsables de la enfermedad. gran número de cepas de ratones, y entre ellas,
Existen evidencias que demuestran que las cé­ a la cepa NZB/NZW. En estos animales se ob­
lulas T hl tienen un rol patogénico en la IDDM; serva nefritis autoinm une con p rese n c ia de
por ejemplo, se pudo prevenir el desarrollo de complejos inmunes, y son ampliamente utiliza­
diabetes en ratones NOD por la aplicación de dos como modelo experimental para el estudio
anticuerpos anti-IFN-y. Es posible que este an­ del lupus eritematoso sistémico (LES) en hu­
ticuerpo actúe sobre el IFN-'y producido por los manos. El LES murino es una enfermedad que
linfocitos T h l o el producido por las células está determinada genéticamente y es muy simi­
NK. En la EAE se pudo demostrar el rol prota- lar a la enfermedad humana. Las anormalida-

Cuadro 28-7. Modelos de autoinmunidad experimentalmente inducidos’'^

IVIiastenia g ra v is a u to in m u n e M ia s te n ia g rav is R e c e p to r d e a c e til-e o lin a Si

e x p e rim e n ta l (E A M G )

E n c e fa l itis e x p e rim e n ta l a u ­ E s c le ro s is m ú ltip le (M S ) P r o te ín a b á s ic a d e la m ie lin a Si

to in m u n e (E A E )

A rtritis a u to in m u n e (A A ) A r tritis re u rn a to id e a M . tuberculosis ( p ro te o g lic a n o s ) Si

T iro id itis e x p e rim e n ta l au- T iro id itis de H a s h im o to T iro g lo b u lin a Si

to in m u n e (E A T )

E stas e n ferm e d ad es p u e d e n s e r in ducidas en anim ales a p ro p ia d o s, por in y ec ció n del antígeno con a d y u v a n te co m p leto de F reu n d . E x ce p to
para la íirtritis a u to in m u n e, el a n tíg en o usad o co rresponde al au to a n tíg e n o a so c ia d o con la en ferm e d ad h u m ana. L a artritis re u rn a to id e a está
asociada a re acc io n es co n tra p ro teo g lica n o s, q u e son au to a n tíg e n o s asociados c o n el tejido conectivo.
572 Inmunopatología

Pituitaria

Tiroides

A □

F ig. 28-5. E n la enferm edad de G raves, la regulación de la producción de horm ona tiroidea se halla interrum pida.
L a e n fe rm e d a d d e G ra v e s es c a u s a d a p o r a n tic u e rp o s a n ti-re c e p to re s d e la T S H . E n c o n d ic io n e s n o rm a le s , las h o rm o n a s t i ­
ro id e a s se p ro d u c e n c o m o r e s p u e s ta a la T S H la q u e p o r a u to rre g u la c ió n lim ita su p ro d u c c ió n p o r la g lá n d u la p itu ita ria . E n
la e n fe rm e d a d d e G ra v e s , los a u to a n tic u e rp o s s o n a g o n is ta s d e la T S H y p o r lo ta n to e s tim u la n d e m a n e ra d e s c o n tro la d a la
p ro d u c c ió n d e h o rm o n a s tiro id e a s , p ro d u c ié n d o s e h ip e rtiro id is m o . A: L a g lá n d u la p itu ita r ia s e c re ta T S H q u e a c tú a so b re
la tiro id e s p a ra in d u c ir la lib e ra c ió n d e h o rm o n a s tiro id e a s . B : L a s h o rm o n a s tiro id e a s a c tú a n s o b re la p itu ita ria , p o r d is m i­
n u c ió n d e la p ro d u c c ió n d e T S H , lo q u e p o r fe e d b a c k s u p rim e la sín te s is d e las h o rm o n a s . C : L o s L B a u to in m u n e s p r o d u ­
c e n a n tic u e rp o s a n ti-re c e p to r d e la T S H , q u e e s tim u la n ta m b ié n la p ro d u c c ió n d e h o rm o n a s . D: L a p ro d u c c ió n d e h o n n o -
ñ a s p o r e s tim u la c ió n de l re c e p to r a tra v é s d e la u n ió n d e a u to a n tic u e rp o s n o p u e d e a u to rre g u la rs e , lo q u e c a u s a e x c e s iv a
p ro d u c c ió n d e h o rm o n a s .

des inmunológicas iniciales en cada cepa de ra­ anti-ADN de cadena doble y simple. Cada una
tón pueden variar pero la patogenia es similar de las características autoinmunes de los rato­
en todas las cepas y se caracteriza por hiperfun- nes NZB/W se halla bajo un control genético
ción de las células B,. producción de autoanti­ específico y múltiples genes están involucrados
cuerpos, formación de \complejos inmunes cir­ en las alteraciones autoinmunes observadas en
culantes, desarrollo de 'glomerulonefritis y en­ estos ratones. Se demostró que determinados
ferm edad cardiovascular. Las anorm alidades genes están comprometidos en la aparición de
serológicas primarias comunes incluyen: con­ anticuerpos anti-ADN, nativo y desnaturaliza­
centraciones elevadas de inmunoglobulinas sé­ do, pero no en la aparición de autoanticuerpos
ricas, gran cantidad de autoanticuerpos entre naturales timocitotóxicos, anti-eritrocitarios e
los que se Incluyen anticuerpos antinucleares y IgG m onoclonal. En otro grupo de ratones
 Autoinmunidad 573

Receptores de M l isc u Io Flujo de Na+

acetilcolina Contracción muscular

Los receptores No flujo de Na+

de acetilcolina No contracción muscular
son endocitados
y degradados

Fig. 28-6. A utoan ticuerp os dirigidos contra el recep tor de la acetilcolin a inhiben su función. L a m ia s te n ia g r a v i s es
c a u sa d a p o r a n tic u e rp o s d irig id o s c o n tr a la su b u n id a d a d e l r e c e p to r d e a c e tilc o lin a , q u e e s tá r e la c io n a d o co n la t r a s m i ­
s ió n n e u ro m u s c u la r. A: P o r im p u ls o s n e u ro n a le s se lib e r a a c e tilc o lin a q u e se u n e a su s r e c e p to re s , p r o d u c ie n d o c o n tr a c ­
c ió n m u sc u la r. B : E n la m ia s te n ia g ra v is , lo s a n tic u e rp o s a n ti-re c e p to r d e a c e tilc o lin a se u n e n a lo s r e c e p to re s , p r o d u c i é n ­
d o s e e n d o c ito s is y d e g ra d a c ió n d e lo s re c e p to re s , p o r e n d e la a c e tilc o lin a n o p u e d e ac tu a r.

MRL/lpr el gen Ipr produce linfoproliferación y la mayoría de los animales diabéticos mueren
de linfocitos T y es un modelo bastante utiliza­ de cetoacidosis dentro de la semana de apari­
do para estudiar la artritis reurnatoidea. ción de la enfermedad, a menos que se les ad­
Los animales más empleados en el estudio ministre insulina. Un pequeño número de ani­
de enfermedades autoinm unes específicas de males manifiesta sólo hiperglucemia y no re­
órgano son los ratones diabéticos no obesos quiere insulina exógena. En ambos modelos la
(NOD) y ratas bio-breeding (BB), que se utili­ genética es compleja, pero estudios de entre-
zan en el estudio de la diabetes mellitus insuli- cruzamiento permitieron demostrar en am bos
nodependiente (IDDM ). En ambas cepas de casos que la susceptibilidad a la diabetes está
animales se observa reacción autoinmune con­ relacionada con el complejo mayor de h isto ­
tra células del páncreas. En estos animales hay compatibilidad.
aparición espontánea de IDDM con destrucción Hay también varios modelos espontáneos de
de células e insulitis. Inicialmente sólo el 10% enfermedad tiroidea, en los que se observa de­
de las crías de ratas BB eran diabéticas, pero sarrollo de tiroiditis autoinmune; esto se puede
los cruzam ientos selectivos incrementaron la ver especialm ente en ratas Búfalo, y en los de­
frecuencia de diabetes en forma significativa. nom inados “pollos obesos” . La tiroiditis au­
La aparición de diabetes en ratas BB es abrupta toinmune espontánea observada en pollos obe­
574 Inmunopatología
sos es una enfermedad autoinmune espontánea
eon earaeterístieas de órgano-específica, que se
asemeja a la tiroiditis de Hashimoto del ser hu­
mano. En estos pollos se observan autoanti­
cuerpos contra antígenos de tiroides y la glán­
dula experim enta destrucción progresiva por
lesión inflam atoria crónica. Este m odelo es­
pontáneo tiene varias ventajas; por ejem plo,
que en las aves, la bursa y el timo están anató­
micamente separados, que el embrión se desa­
rrolla en un huevo accesible y que m uchas
crías pueden ser derivadas de un par de padres.
4.2. Modelos de autoinmunidad
experimentalmente inducidos
Un modelo muy empleado en la inducción
de autoinmunidad en determinadas cepas de ra­
tones es realizar timectomía en animales de tres
a cinco días de edad. Cuando estos animales
son adultos desarrollan enfermedades autoin­
munes caracterizadas por la presencia de au­
toanticuerpos e infiltrados de linfocitos T en
los órganos afectados. En ratones BALB/c la
principal enfermedad que se induce es la gastri­
tis, aunque también pueden estar presentes la
orquitis, ooforitis, pancreatitis, prostatitis y ti­
roiditis. Es poco probable que el m ism o au-
toantígeno sea el blanco en los diferentes órga­
nos. Se pudo observar que diferentes poblacio­
nes de células efectoras inducen diferentes en­
fermedades, ya que la expresión intratímica de
antígenos responsables de la gastritis elimina el
desarrollo de gastritis en animales timectomi-
zados pero no el de ooforitis. Se cree que la en­
fermedad está mediada por linfocitos T CD4+
porque pudo ser transferida por este tipo de cé­
lulas obtenidas de animales timectomizados.
Sin em bargo, para obtener autoinm unidad
experimental es necesario, en la mayoría de los
casos, incorporar al material inmunizante sus­
tancias adyuvantes. El uso de adyuvantes tiene
importancia no sólo en la inducción sino tam­
bién en la regulación del tipo de respuesta in­
mune; por ejemplo, el tejido cerebral inyectado
en animales de experimentación induce encefa-
lomielitis alérgica experimental (EAE) (cuadro
28-7). En esta enfermedad se demostró que el
antígeno responsable es la proteína básica de
m ielin a, que in c o rp o rad a al ad y u v a n te de
Freund completo e inyectada en ratas singenei­
cas induce EAE. Por el contrario, el tratamien­
to de ratas con proteína básica de mielina en
adyuvante de Freund incom pleto previene el
desarrollo de EAE. Ratas no tratadas y ratas
pretratadas con albúmina bovina o proteína bá­
sica de ratón en solución fisiológica no fueron
protegidas al ser posteriormente inmunizadas
con proteína básica incorporada a adyuvante de
Freund completo. Los síntomas que se m ani­
fiestan en ratas enfermas son falta de tonicidad
de la cola y debilidad definida de las patas tra­
seras, que ev o lu cio n a a p arálisis com pleta
acompañada por incontinencia. Se ha demos­
trado que las células T son responsables de las
lesiones observadas en la médula espinal y de
la desmielinización producida en estos anima­
les, la mayoría de los cuales se recupera espon­
táneamente y se vuelve resistente a posteriores
intentos de inducir la enfermedad. Se ha de­
mostrado que esto es debido a la presencia de
células T supresoras. Algunas de las manifesta­
ciones de esta enfermedad experimental se ase­
mejan a una enfermedad desm ielinizante del
hombre, la esclerosis múltiple, lo que ha hecho
suponer su origen inmunológico.
5. ENFERMEDADES AUTOINM UNES
ORGANO-ESPECÍFICAS Y SISTÉMICAS
Las enfermedades autoinmunes afectan entre
el 5 y 7% de la población mundial, pudiendo
causar desde afecciones crónicas leves hasta al­
teraciones muy severas que pueden llevar a la
muerte al individuo que la padece. En general,
las enfermedades autoinmunes que se observan
en humanos pueden ser divididas en dos cate­
gorías: específicas de órgano y sistémicas (cua­
dros 28-8 y 28-9). En las enfermedades órga­
no-específicas, la respuesta autoinmune prima­
ria es dirigida contra un único órgano, glándula
o tejido, por tal motivo a esta categoría de en­
fermedades también se la puede dividir tam ­
bién tomando en cuenta el órgano blanco invo­
lucrado (cuadro 28-10).
5.1. Enfermedades autoinmunes
órgano-específicas
En las enfermedades órgano-específicas, la
inmunidad humoral y/o la inmunidad mediada
por células inducidas, están dirigidas contra au­
toantígenos localizados en un solo órgano. Es­
tas patologías también pueden ser clasificadas
según la enfermedad sea debida principalmente
a la inmunidad humoral, celular o a ambas. En
algunas ocasiones se presenta más de una en­
fermedad autoinmune en un mismo individuo,
especialmente cuando están implicadas glándu­
las de secreción endocrina. En el cuadro 28-8
se detallan las principales enfermedades englo­
badas en este grupo.
Enfermedades autoinmunes tiroideas
Las hormonas secretadas por la glándula ti­
roides, 3,5,3’,-5’-tetraiodotironina (T^, tiroxi-
na) y 3,5,3’-triiodotironina (Tj), regulan la sín­
tesis de proteínas por acción sobre la transcrip-

Cuadro 28-8. Enfermedades autoinmunes órgano-específicas
Enferm edad
E n fe rm e d a d d e G ra v e s
T iro id itis d e H a s h im o to
D ia b e te s m e llitu s in s u lin o d e p e n d ie n te
M ia s te n ia g ra v is
E s c le ro s is m iíltip le
E n fe rm e d a d d e A d d is o n
A n e m ia h e m o lític a a u to in m u n e
S ín d ro m e d e G o o d s p a s tu re
P ú rp u ra tro m b o c ito p é n ic a id io p á tic a
A n e m ia p e rn ic io s a
ción y estabilización del ARN. El 65% del peso
de la es iodo y su forma desiodada (Tj), es la
forma activa de la hormona. La acción de la
es mediada a través de su receptor, una nucleo-
proteína que une ADN. La principal proteína
intratiroide es la tiroglobulina, glucoproteína
de 660 kD, rica en tirosinas, que tiene la capa­
cidad de atrapar iodo ionizado dentro de la
glándula. La incorporación de T y su posterior
oxidación dentro de la glándula requiere la pre­
sencia de peroxidasa (TPO); esta enzima es una
proteína de 107 kD y se halla ubicada en la
fracción microsomal del citoplasma de las cé­
lulas tiroideas. La tiroglobulina iodada es alm a­
cenada en los espacios foliculares de la glándu­
la. La secreción de las hormonas tiroideas, y diactivo.
Tj, se produce por acción de enzimas proteolí­
ticas que las liberan de la proteína almacenada
y un sistema de feedbaclc regula la función de
la glándula. Las células del hipotálamo sinteti­
C uadro 28-9. Enfermedades autoinmunes sistémicas más comunes
Enferm edad
L u p u s e rite m a to s o s is té m ic o
A rtritis re u m a to id e a
D e rm a to m io s itis y p o lio m io s itis
E s c le ro d e rm ia
S ín d ro m e d e S jo g re n
Autoinmunidad 575
Autoantígeno involucrado Respuesta inm une
R e c e p to r d e la h o r m o n a d e tiro id e s A u to a n tic u e rp o s (e s tim u la n te s )
C é lu la s y p ro te ín a s d e tiro id e s A u to a n tic u e rp o s y L T q u e m e d ia n h i ­
p e rs e n s ib ilid a d re ta rd a d a
C é lu la s p a n c re á tic a s tip o b e ta A u to a n tic u e rp o s y L T q u e m e d ia n h i ­
p e rs e n s ib ilid a d re ta rd a d a
R e c e p to re s d e a c e tilc o lin a A u to a n tic u e rp o s (b lo q u e a n te s )
M a te ria g ris o b la n c a d e c e re b ro C é lu la s T c ito tó x ic a s y m e d ia d o ra s d e
h ip e rs e n s ib ilid a d re ta rd a d a
A u to a n tic u e rp o s
C é lu la s a d re n a le s A u to a n tic u e rp o s
P ro te ín a s d e m e m b r a n a d e g ló b u lo s ro jo s A u to a n tic u e rp o s
C é lu la s b a s a le s d e riñ ó n y e s tó m a g o A u to a n tic u e rp o s
P ro te ín a s d e m e m b r a n a d e p la q u e ta s A u to a n tic u e rp o s
C é lu la s g á s tric a s p a rie ta le s ( fa c to r in tr ín ­ A u to a n tic u e rp o s
se co )
zan la thyroid releasing hormone (TRH), que
estimula a la glándula pituitaria a producir y li­
berar la tyhyroid stimulating hormone (TSH).
La TSH estimula al tiroides para que sintetice y
libere T 4 y Tj, que finalmente suprimen la ac­
ción de la TSH por competición con la TRH en
la pituitaria. De esta manera se cierra el ciclo.
Los tests para evaluar la función de la glán ­
dula tiroides miden la concentración sérica de
T^, Tj y TSH. El tratamiento de hipotiroidismo
se realiza mediante el empleo de tiroxina. E n el
caso de hipertiroidismo requiere el uso de dro­
gas que inhiban la síntesis de tiroxina, tra ta ­
miento quirúrgico del total o parte de la glán ­
dula o destrucción de la glándula con iodo ra­
Las principales enfermedades autoinm unes
tiroideas humanas (tiroiditis de Hashimoto, h i­
potiroidismo autoinmune priinario y enferm e­
dad de Graves) se caracterizan por una reactivi-
A utoantígeno involucrado Respuesta inmune
A D N , p ro te ín a s n u c le a re s ( rib o n u c le o - A u to a n tic u e rp o s , c o m p le jo s i n m u n e s
p ro te ín a s ) m e m b r a n a d e p la q u e ta s
T e jid o c o n e c tiv o Ig G A u to a n tic u e rp o s , c o m p le jo s i n m u n e s
I n fla m a c ió n d e m ú s c u lo y p iel A u to a n tic u e rp o s
C o ra z ó n , r iñ o n e s , tra c to g a s tro in te s tin a l A u to a n tic u e rp o s
G lá n d u la s s a liv a le s , h íg a d o , r iñ o n e s , t i ­ A u to a n tic u e rp o s
ro id e s
576 Inmunopatología

C uadro 28-10. Clasificación de las principales En la Tiroiditis de Hashimoto el daño princi­

enfermedades autoinmunes órgano específicas pal está relacionado con la inmunidad mediada
humanas según el órgano o sistema afectado por células ya que se encuentran infiltrados de
células plasiTiáticas, macrófagos, linfocitos B y
Sistem a endocrino linfocitos T, principalmente CD4+. Estas célu­
T iro id itis d e H a siiim o to
las pueden, en algunos casos, reemplazar com­
E n fe rm e d a d d e G ra v e s (h ip e rtiro id is m o , tiro to x ic o s is )
D ia b e te s m e llitu s tip o I ( in s u lin o d e p e n d ie n te o d ia b e te s pletamente la arquitectura normal de la glándu­
ju v e n il) la tiroides. Las células epiteliales tiroideas pue­
In su fic ie n c ia a d re n a l (e n fe rm e d a d d e A d d is o n ) den interaccionar directamente con las células
O rq u itis a u to in m u n e
T que expresan tanto antígenos de clase I como
Sistem a hem atopoy ético antígenos de clase IL La expresión de estos líl-
A n e m ia h e m o lític a a u to in m u n e (c o n a u to a n tic u e rp o s ti­ timos por parte de las células tiroideas es indu­
p o “c a lie n te s ”) cida por el lEN-y liberado por la célula T y di­
A n e m ia h e m o lític a a u to in m u n e (co n a u to a n tic u e rp o s
cho efecto es incrementado por el factor de ne­
“ frío s ” o c río a g lu tin in a s )
T ro m b o c ito p e n ia a u to in m u n e crosis tum oral (TNF). Recíprocamente, estas
A n e m ia p e rn ic io s a células tiroideas pueden presentar antígenos a
C o a g u lo p a tía s a u to in m u n e s ( a n tic o a g u la n te s c irc u la n te s las células T aumentando de esta forma la libe­
o s ín d ro m e fo sfo lip íd ic o )
ración de citoquinas. El INF-y y T N F a también
Sistem a neurom uscular inducirían la expresión de algunas moléculas
M ia s te n ia g rav is de adhesión sobre las células tiroideas como,
P o lin e u ritis a u to in m u n e por ejemplo, la molécula de adhesión intercelu­
E s c le ro s is m ú ltip le
lar (ÍCAM -1). Adem ás, IL -ip y T N F -a son
P o lim io s itis
sintetizados por las células epiteliales tiroideas,
Piel creando la posibilidad de un control autocrino
P é n fig o y o tra s e n fe rm e d a d e s a m p o lla re s por estas citoquinas. Otras moléculas de adhe­
Sistem a cardiopulm onar
sión expresadas sobre la célula tiroidea inclu­
M io c a rd itis re u m á tic a yen al CD56 y CD58.
S ín d ro m e d e G o o d p a s tu re ( h e m o rra g ia p u lm o n a r y n e fr i­ El 95% de los sueros de los pacientes con ti­
tis) roiditis de Hashimoto contienen anticuerpos di­
rigidos contra la tiroglobulina y la peroxidasa.
Estudios realizados con anticuerpos m onoclo­
nales anti-tiroglobulina humana han contribui­
dad hacia antígenos tiroideos propios, la que do a dem ostrar que los epitopes reconocidos
puede estar expresada como una respuesta au­ por los autoanticuerpos presentes en el suero de
toinm une de tipo inflam atorio destructivo o estos pacientes se encuentran en la región cen­
una respuesta autoinmune anti-receptor. tral (no hormonogénica) de la molécula de tiro-
globulina, es decir que esta zona estaría ex ­
Tiroiditis de Hashimoto puesta sobre la superficie de la molécula de ti­
roglobulina nativa. El clonado de los genes de
La tiroiditis de Hashimoto es una de las en­ los antígenos involucrados en la tiroiditis de
fermedades más comunes que causan hipotiroi- Hashimoto permitió conocer la autoantigenici-
dismo en adultos. Generalmente afecta a muje­ dad de los mismos, definiendo cuáles son los
res de mediana edad y su principal manifesta­ epitopes específicos para las células T y cuáles
ción es el hipofuncionamiento de la glándula, para las células B.
produciendo severas complicaciones metabóli- Los autoanticuerpos anti-tiroglobulina quizás
cas, debido a la hipoproducción de la hormona tengan un rol patogénico limitado, pero se obser­
por tumefacción de la glándula tiroides. El hi- vó que el reconocimiento de esta porción central
potiroidism o com ienza con una variedad de por autoanticuerpos en pacientes con el Síndro-
signos y síntomas como por ejemplo la apatía iTie de Sjogren (ver más adelante) se correlacio­
por disminución del metabolismo. El mixede- naría con la severidad de la lesión tiroidea.
ma es una manifestación muy comiin del hipo- En el modelo animal de tiroiditis autoinmu­
tiroidismo y se caracteriza por la tumefacción ne experimental inducido por la inmunización
del tejido subcutáneo, especialmente alrededor de ratones con tiroglobulina, se demostró que
de los ojos. En la tiroiditis de Hashimoto, coino los determinantes iodados son los responsables
en la mayoría de las enfermedades autoinmu­ de la patogenicidad de la enfermedad, ya que
nes, podría estar involucrado un componente son reconocidos por las células T autorreacti­
genético, ya que se ha observado, que mieiTi- vas y forman parte de los dominios hormono-
bros asintomáticos de una familia tienen mayor génicos de la tiroglobulina.
incidencia a padecer la enfermedad, si en dicha Tanto la tiroglobulina como la peroxidasa ti­
familia existen antecedentes de la enfermedad. roidea pueden ser expresadas sobre las células

foliculares de la tiroides, por lo tanto pueden
ser reconocidas por células inmunes y anticuer­
pos. Por otra parte, los LB aislados de sangre
de pacientes con tiroiditis de Hashimoto son
capaces de producir in vitro anticuerpos anti-ti-
roglobulina, cuando son co-cultivados con cé­
lulas T antologas y tiroglobulina.
Los anticuerpos anti-TPO aparentemente tie­
nen mayor importancia patogénica que los anti-
tiroglobulina. Esto se basa en las siguientes ob­
servaciones: 1) la mayoría de los pacientes con
tiroiditis de Hashimoto presentan anticuerpos
anti-TPO mientras que los anticuerpos anti-ti-
roglobulina están a veces ausentes o presentes
en pequeña cantidad; 2) los niveles séricos se
correlacionan con los estadios activos de la en­
fermedad; 3) a diferencia de los anticuerpos an-
ti-tiroglobulina, los anti-TPO producirían daño
directo a las células tiroideas por fijación de
complemento; in vitro se observó que dañan las
células tiroideas por ADCC con células natural
killer.
La tiroiditis experimental autoinmune (EAT)
puede ser inducida en ratones H-2b por inm u­
nización con TPO porcina purificada o por
transferencia adoptiva de células T sensibiliza­
das. En general, los epitopes reconocidos por el
receptor de las células T involucrados en la pa­
togénesis de la enfermedad son poco conoci­
dos.
Enfermedad de Graves
La manifestación clínica más importante es
la hiperactividad de la glándula tiroides, con
excesiva liberación de hormonas tiroideas (tiro-
toxicosis). Esta anorm alidad funcional causa
hiperactividad con temblores, insomnio y alte­
raciones en el ritm o cardíaco. Un im portante
aspecto del hipertiroidismo es la exoftalmia, un
peculiar agrandamiento de los globos oculares,
que, si es severo, puede causar su daño. Los
pacientes con hipertiroidismo tienen anticuer­
pos de tipo IgG contra el receptor de la TSH.
Estos anticuerpos m im ifican la acción de la
TSH, estimulando inapropiadamente a las célu­
las tiroides a producir excesivas cantidades de
tiroxina; las anticuerpos anti-TSH también pue­
den estimular in vitro el crecimiento de las cé­
lulas tiroideas, efecto que podría correlacionar­
se con el agrandamiento de la glándula tiroidea
que se observa en la enfermedad de Graves.
Existen evidencias de una respuesta inmune
dentro de la glándula, ya que se han encontrado
LT CD4+ y en menor grado, LT CD8+. Por otro
lado, se ha observado in vitro que, LB prove­
nientes de glándulas de pacientes con la enfer­
medad, producen anticuerpos anti-TSH. Tam ­
bién se ha visto que estos anticuerpos están res­
tringidos a una única cadena liviana ( k o X), su­
Autoinmunidad 577
giriendo que provienen de una restringida po­
blación de clones B, a pesar de que no ha sido
posible detectar LB específicos. Que en el de­
sencadenamiento del hipertiroidismo sean res­
ponsables los anticuerpos anti-TSH ha sido do­
cumentado por el éxito del tratamiento, en al­
gunos pacientes, con methamazole, compuesto
con actividad antitiroidea, que reduce la pro­
ducción de anticuerpos. Pero más convincente
aun es la inducción de hipertiroidismo en niños
recién nacidos, debido al pasaje placentario de
dichos anticuerpos.
El receptor de la TSH ha sido objeto de estu­
dios debido a su importancia fisiológica e im­
plican cia en la enferm edad de G raves. E stá
compuesto por una subunidad extracelular de
unión a la hormona y una subunidad de m em ­
brana, unidas por puentes disulfuro. L os pa­
cientes con enfermedad de Graves presentan
autoanticuerpos estim ulantes dirigidos contra
el receptor de la TSH mientras que pacientes
con hipotiroidismo autoinmune primario pre­
sentan anticuerpos que bloquean la unión de la
TSH y que no son estimulantes. Ambos tipos
de anticuerpos se unirían a distintos sitios del
receptor. Los anticuerpos estimulantes activan
la adenilciclasa elevando los niveles intracelu­
lares de AMPc y los niveles de ARNm para la
tiroglobulina y TPO.
La oftalmopatía en la enfermedad de Graves
está asociada con anticuerpos dirigidos contra
una proteína de 64 kD, específica de la m em ­
brana del músculo del ojo. No se sabe cuál es
el origen de estos anticuerpos y por qué no to­
dos los pacientes con enferm edad de G aves
presentan daño ocular.
Diabetes mellitus
La diabetes m ellitus es un desorden en el
metabohsmo de la glucosa, debido a una dism i­
nución o falta total de insulina. La deficiencia
de insulina produce hipergiucemia, causando
aumento de la osmolaridad plasmática, lo que
increm enta la producción de orina, que es el
primer síntoma de diabetes.
Existen dos formas principales de la enfer­
medad: diabetes tipo I, en la que los pacientes
dependen de insulina exógena para el m anteni­
miento del metabolismo normal de la glucosa,
y diabetes tipo II, donde el tratamiento es fre­
cuentemente innecesario, ya que es suficiente
una dieta sin carbohidratos. La diabetes tipo II
es debida a disturbios bioquímicos del receptor
de la insulina, mientras que la diabetes de tipo 1
es una enfermedad autoinmune que destruye
las células p de los islotes de Langerhans del
páncreas, células productoras de insulina. Las
lesiones específicas de la enfermedad se cono­
cen como insulitis, infiltrado de los islotes de
578 Inmunopatología
Langerhans con células mononucleares, espe­
cialmente LT CD8+ y en menor cantidad LT
CD4+.
La diabetes tipo I, tam bién conocida como
diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM)
afecta aproximadamente al 0,2-0,5% de la po­
blación y el pico de aparición de la enfermedad
es a los 11-12 años de edad, por lo que a la dia­
betes tipo I también se la conoce con el nombre
de diabetes juvenil insulinodependiente. Se ha
observado una mayor incidencia de la enferme­
dad según el grupo étnico o raza, lo que indica
su estrecha relación con los antígenos del com ­
plejo mayor de histocompatibihdad. La IDDM,
si no se trata tempranamente, puede llevar al
paciente a un desenlace fatal, debido a la total
destrucción de las células de los islotes de Lan­
gerhans del páncreas. La retinopatía diabética,
daños renales, y un tipo acelerado de arteriees­
clerosis, que puede llevar a la amputación de
las piernas o pies, son las complicaciones más
severas de esta enfermedad.
La IDDM es considerada una enferm edad
autoinmune específica de órgano debido a la
presencia de anticuerpos contra distintos com ­
ponentes de las células de los islotes y a la
morfología que presenta el páncreas. Además,
se ha visto que está frecuentem ente asociada
con otras enfermedades autoinmunes específi­
cas de órgano, como enfermedades autoinmu­
nes tiroideas, anemia perniciosa y la enferme­
dad idiopática de A ddison. Los anticuerpos
contra las células de los islotes son una caracte­
rística de esta enfermedad; algunos se unen a
componentes del citoplasma; otros, a proteínas
de la membrana de las células [3. Un hecho im­
portante de estos anticuerpos es que pueden ser
un m arcador im portante de la enferm edad, y
predecir si un individuo es susceptible o no. Se
ha observado que el 80% de los pacientes pre­
sentan anticuerpos contra una proteína de 64
kD localizada en el citoplasma de las células [3.
Estos anticuerpos se han detectado antes de la
aparición de la enfermedad, por lo tanto, pue­
den servir como marcadores predictivos. Esta
proteína de 64 kD ha sido identificada como la
ácido glutámico decarboxilasa (GAD), enzima
presente en una gran variedad de tejidos que
cataliza la síntesis del ácido y-aminobutírico.
Se han encontrado dos isoterm as, de 65 y 67
kD respectivamente, pero ambas contienen una
secuencia peptídica homóloga a un péptido de
la proteína P2-C del virus Coxsackie B4, lo que
hace suponer que la IDDM se gatillaría por es­
ta infección viral, aunque todavía no ha sido
demostrada reacción cruzada entre el G AD y la
molécula P2-C. Los anticuerpos anti-GAD en
la IDDM son un enigma, debido a la distribu­
ción de esta enzima en los diversos tejidos del
organismo.
En el suero de pacientes, tanto diabéticos co­
mo prediabéticos, se ha detectado la presencia
de anticuerpos anti-GAD. Los autoanticuerpos
detectados en sujetos en un estadio pre-clínico
y en pacientes en quienes la enfermedad es de
reciente aparición, están dirigidos contra célu­
las de los islotes (ICA) y autoanticuerpos anti­
insulina (lAA). Durante años se ha tratado de
encontrar un marcador sérico en personas sus­
ceptibles a la diabetes antes de la aparición clí­
nica de la misma. Sin embargo, no se han en­
contrado diferencias significativas en el riesgo
a desencadenar diabetes entre personas con al­
tos y medianos títulos de anti-GAD.
La respuesta autoinmune que se genera tiene
bases genéticas, es decir que está relacionada
con la presencia de determinados haplotipos de
los antígenos del complejo mayor de histocom­
patibilidad de ciase II (especialm ente DR3-
DR4). El riesgo de un individuo, cuando uno
de los progenitores presenta la enfermedad es
del 8-10%, y aumenta al 25 % si ambos la pa­
decen. También los factores ambientales pue­
den ejercer efectos moduladores profundos so­
bre dicha predisposición genética; si estos fac­
tores gatillan o protegen de la enfermedad aún
no se sabe. Ciertos virus han sido implicados
en la inducción de IDDM en humanos, como
virus de rubéola, Coxsackie y citomegalovirus.
Sin embargo, las evidencias que la IDDM en
hum anos resulte de una infección viral que
afecte directa o indirectamente a través del sis­
tema inmune a las células, son poco claras.
Aún no existen evidencias claras respecto al
gatillado de la destrucción celular por algún ti­
po especial de anticuerpo o por algún particular
autoantígeno. El argumento en contra de la hi­
pótesis que sugiere que los autoanticuerpos son
la causa primaria de la enfermedad es que los
LT son las células mayoritarias que se obser­
van en el infiltrado de los islotes.
La cepa de ratón NOD es un modelo animal
de IDDM ampliamente estudiado. Muchas lí­
neas de trabajo apuntan hacia la importancia de
los hnfocitos T en el proceso de destrucción de
las células de los islotes dando como resultan­
do el desarrollo de diabetes. Sin embargo, no
ha sido fácil la purificación de las células auto­
rreactivas. También se ha comprobado que di­
ferentes citoquinas, liberadas por las células del
sistema inmune, juegan un rol muy importante
en la patogénesis de IDDM y en el daño celu­
lar. Estudios in vitro han demostrado que cier­
tas citoquinas (IL-1, TN F-a, lEN-y) pueden ser
citotóxicas para las células, inhibir la secreción
de insulina y, generalmente en combinación,
dañar y destruir a las células. La expresión de
las mismas se encontró en las lesiones de insu-
litis en ratones NOD y en ratas BB. El IFN -yha
sido detectado en infiltrados de islotes hum a­

nos diabéticos con la presencia de linfocitos.
También se observó que la administración de
IL-2, IL-4, e IL-10 a ratones NOD y ratas BB
in vivo pueden prevenir el desarrollo de diabe­
tes. Englobando los resultados mencionados se
sugiere que, dada la importancia del IFN-y co­
mo mediador en la destrucción de las células
de los islotes in vitro y de la insulitis y diabetes
in vivo, las células T hl productoras de IFN-y
participarían en el proceso de destrucción de
las células de los islotes. Por otro lado, los
efectos protectores contra insulitis y diabetes
producidos por la ÍL-4 e IL-10, sugieren que
las células Th2 productoras de estas citoquinas
serían las responsables de prevenir la respuesta
autoinmune. Por lo tanto, la respuesta autoin­
mune en IDDM involucraría algún tipo de des­
balance en los circuitos inm unorregulatorios
que llevarían a un dominio en la función y pro­
ducción de citoquinas de la población T h l so­
bre la Th2.
Miastenia gravis
La miastenia gravis (MG) es una enferm e­
dad autoinmune en la que se observa bloqueo
de la trasmisión neuromuscular, por la produc­
ción de autoanticuerpos contra el receptor de la
acetil colina (AChR). La enfermedad es más
frecuente en m ujeres que en hombres; en las
mujeres la enfermedad aparece generalmente
durante la tercera década de vida y en los hom­
bres, a partir de los 60 años. El sistema m uscu­
lar más afectado es el ocular, laríngeo y respi­
ratorio. Es muy común la asociación entre MG
y otras enferm edades autoinmunes, especial­
mente hipertiroidismo. El timo juega un papel
muy importante, ya que se ha visto que la ti-
mectomía puede curar a pacientes jovenes. El
90% de los enfermos presentan anticuerpos an-
ti-AChR y las madres pueden trasmitir la enfer­
medad a sus hijos, muy probablemente por pa­
saje por placenta de dichos autoanticuerpos.
La MG es una enfermedad poco común, pe­
ro es muy estudiada debido a que el autoantíge­
no involucrado en la enfermedad está muy bien
caracterizado, lo que permite un excelente sis­
tema para investigar las interacciones molecu­
lares que ocurren en la respuesta autoinmune
en humanos. Los anticuerpos contra el AChR
son la principal causa de los síntomas que se
observan en la enfermedad, la que puede ser in­
ducida en animales sanos por tratamiento con
suero o IgG de pacientes con MG o con anti­
cuerpos anti-ACliR. En la MG también hay an­
ticuerpos contra otros epitopes presentes en
músculo, contra proteínas sinápticas y contra
una proteína de membrana del sarcoplasma in­
volucrada en la liberación del Ca^^. Estos anti­
cuerpos pueden tener un rol en Ja patogénesis
Autoinmunidad 579
de la enfermedad, especialmente en casos don­
de los anticuerpos contra la AChR no son de-
tectables.
El AChR es una proteína compleja formada
por cuatro subunidades homólogas a , (3, y y (e)
6. En el músculo em brionario el A C hR está
compuesto de subunidades a , [3, y y 5; después
de la inervación, la subunidad y es reemplazada
por la subunidad homóloga.
No se conoce si la respuesta contra el AChR
es iniciada por el mismo receptor o por una pro­
teína de reacción cruzada. Se ha postulado que
en pacientes con miastenia gravis, el tim o sería
el órgano donde se inicia la inducción contra el
AChR. En estos pacientes es común la hiperpla­
sia del timo y en algunos casos se observa la
presencia de un timoma y hay presencia de lin­
focitos T y B con receptores anti-AChR. Por lo
tanto la timectomía, en estos pacientes es consi­
derada en algunos casos un tratamiento benefi­
cioso. Diferentes proteínas similares al AChR
han sido descritas en el timo. Una de estas pro­
teínas es expresada en timomas pero no es un
verdadero AChR porque, aunque si bien algu­
nos anticuerpos contra el receptor se unen a ella
no se unen a Ja a-bungaroto.xina (péptido de ví­
bora, antagonista colinérgico que reconoce es­
pecíficamente el AChR muscular).
El AChR em brionario parece ten er un rol
importante en la patogénesis de la MG, lo que
explicaría en parte el hecho de que algunos pa­
cientes reconocen solamente AChR embriona­
rio. Se ha propuesto que los anticuerpos contra
el AChR en MG reconocen epitopes únicos del
AChR embrionario o comunes a ambas formas,
em brionaria y adulta, pero nunca reconocen
epitopes pertenecientes solamente a la forma
adulta del AChR.
Los anticuerpos anti-AChR de pacientes con
M G causan degradación acelerada del AChR
por entrecruzamiento o por lisis m ediada por
complemento de la membrana post-sináptica y
raramente bloquean el sitio de unión colinérgi-
ca. Estos anticuerpos son polielonales y hay
poca correlación entre el título de anticuerpos y
la severidad de los síntomas, sugiriendo que
sólo ciertas subpoblaciones de anticuerpos con­
tra AChR son patogénicas, quizás debido a su
capacidad de degradar el AChR y/o de activar
el complemento. Algunos pacientes con MG no
tienen anticuerpos detectables contra el AChR,
y otros pueden producir anticuerpos contra epi­
topes del AchR que no están relacionados con
de la unión neuromuscular.
L a mayoría de los anticuerpos anti-AChR
están dirigidos contra una porción extracelular
de la subunidad denominada MIR (principal re­
gión inmunogénica) y que está conservada en
diferentes especies animales. Los anticuerpos
anti-MIR jugarían un rol muy im portante en la
580 Inmunopatología
patogenicidad de la enferm edad, ya que su
transferencia pasiva en ratas Lewis puede des­
encadenar MG; en cambio la enfermedad no se
desencadena si se inoculan anticuerpos dirigi­
dos contra otras porciones de la misma subuni­
dad y contra otras subunidades del receptor.
Por otro lado, los anticuerpos anti-MIR, cuan­
do se añaden a cultivos de células musculares
son capaces de inhibir la expresión del AChR,
causando el mismo efecto los sueros de pacien­
tes con MG.
Se puede concluir que los anticuerpos son
los principales responsables de los síntom as
observados en MG y que los anticuerpos anti-
MIR pueden tener un rol predom inante en la
enfermedad. Los anticuerpos anti-MIR tienen
diferentes idiotipos y parecería que la activa­
ción de los anticuerpos anti-idiotipos del cir­
cuito inm unorregulatorio podrían ser de uso
práctico en el tratam iento de la enferm edad.
Los síntomas de la MG pueden ser disminuidos
por el uso de toxinas unidas a AGhR ya que
pueden llevar la toxina a los linfocitos B anti-
AGhR.
Esclerosis múltiple
La esclerosis m iiltiple es una enferm edad
desm ielinizante del sistem a nervioso central,
siendo los linfocitos T importantes mediadores
de la misma. En la actualidad se están realizan­
do numerosos estudios sobre esta enfermedad y
las investigaciones se basan fundamentalmente
en un modelo experimental de encefalitis au­
toinmune (EAE) inducido en ratas Lewis. Estos
animales, cuando son inyectados con mielina o
proteína básica de mielina (MBP), al cabo de
14 días desarrollan una parálisis ascendente de
la cola seguida por debilidad de las patas trase­
ras o parálisis de las mismas. En los estudios
histológicos se observa inflamación de las m e­
ninges asociada a desmielinización primaria de
la médula espinal. Por microscopía electrónica
se observan células apoptóticas presentes en el
sistema nervioso central desde el día de la apa­
rición de la enfermedad hasta el momento en
que comenzó la recuperación del animal. Los
linfocitos CD4+ que reaccionan contra la pro­
teína básica de mielina son los factores patogé­
nicos en la EAE. Si se inyectan linfocitos T
que reaccionan con MBP, en animales norma­
les en form a endovenosa, estos linfocitos se
acumulan en el sistema nervioso central y cau­
san EAE. Su patogenicidad involucra procesos
complejos tales como localización, extravasa­
ción de células que inducen EAE e inducción
de daño en el sistema nervioso central. La hi­
persensibilidad de tipo retardada es uno de los
procesos patogénicos de los linfocitos T ence-
falogénicos. Los linfocitos T-MBP pueden in­
terferir en la conductividad o ser citolíticos. Se
ha observado que los astrocitos que presentan .
MBP pueden ser Usados por células específicas
para MBP. La actividad lítica está restringida a
las m oléculas del CM H -II, es específica de
MBP y está asociada con la encefalogenicidad
de las células T.
5.1.1. Clasificación de las enfermedades
autoinm unes según el sistema involucrado
Como se puede ver en el Cuadro 28-10, las
enfermedades autoinmunes específicas de ór­
gano se pueden clasificar también según el sis­
tema involucrado. Aquí mencionaremos algu­
nas de ellas.
E nferm edades autoinm unes del sistema
hematopoyétieo
Síndrome antifosfoUpídico
En 1963 Bowie y col. describieron que un
grupo de pacientes con LES presentaban una
extraña sintomatología clínica: trombosis recu­
rrente, y el plasma contenía un factor que era
capaz de inhibir la coagulación in vitro, por lo
que años más tarde se lo llamó anti-coagulante
lúpico. En el año 1987, se agrupó a estos pa­
cientes bajo el término de síndrome antifosfo-
lipídico (APS), ya que sus sueros presentaban
anticuerpos anticardiolipina y anti-fosfolípi-
dos. Por otro lado, este síndrome ocurría gene­
ralm ente en ausencia de m anifestaciones de
LES.
El APS puede presentarse con diferentes ma­
nifestaciones, pero siem pre depende de una
trombosis primaria. La trombosis comienza en
las venas de las piernas, continúa con embolis­
mo pulmonar e infarto placentario con abortos
espontáneos recurrentes.
Los anticuerpos anti-fosfolípidos tienen pre­
ferencia por los lípidos cargados, clasificados
como cardiolipinas, uniéndose al grupo polar
del fosfato. Se pueden encontrar dos formas de
fosfolípidos: la forma laminar, que es el mayor
componente fosfolipídico de la bicapa de las
m em branas celulares, m ientras que la form a
hexagonal es componente menor. Los anticuer­
pos anti-fosfolípidos preferentemente se unen a
la forma hexagonal. Por otro lado, éste es el
fosfolípido inmunogénico para ratones, sin ne­
cesidad de adyuvantes, mientras que la forma
laminar no es inmunogénica, aunque se inyecte
con adyuvante. Por lo tanto, los anticuerpos an-
ti-fosfolípidos pueden ser el resultado de una
respuesta inmune contra la forma hexagonal,
que por alguna causa se exprese de m anera
anormal sobre la membrana celular. Algunos
investigadores creen que el cofactor P^-gluco-

proteína, componente normal del plasma, pue­
da ser fundamental para la unión de los anti­
cuerpos a la cardiolipina.
Algunos anticuerpos anti-fosfolípidos pue­
den reaccionar con ADN, vía el fosfato del áci­
do nucleico. Más aun, ratones normales inmu­
nizados con cardiolipina conjugada a una pro­
teína, producen anticuerpos que reaccionan con
cardiolipina y ADN. Estos resultados estarían
explicando la reactividad cruzada de los anti­
cuerpos anti-fosfolípidos en el LES.
Aún se desconocen los mecanismos median­
te los cuales los anticuerpos anti-fosfolípidos
producen trombosis. Dos grupos de investiga­
dores han dem ostrado que la adm inistración
endovenosa de anticuerpos anti-fosfolípidos en
ratones preñados causa la muerte fetal. A pesar
de ello, la patogenicidad de estos anticuerpos
no está universalmente aceptada.
Vasculitis
Los síndromes vasculíticos son un grupo de
desórdenes heterogéneos, en los cuales la ma­
nifestación principal es la inflamación de las
paredes de los vasos sanguíneos. Pueden afec­
tar los vasos grandes, medios y pequeños de to­
do el organismo, pero con mayor frecuencia,
los vasos de la piel, riñones, pulmones y cere­
bro.
El hallazgo de anticuerpos contra componen­
tes del citoplasm a de neutrófilos (ANCA) ha
sido una importante contribución para dilucidar
los mecanismos de estos síndromes. Uno de los
ANCA se une específicamente a una serin-pro-
teasa (m ieloblastina) que se encuentra dentro
de los gránulos azurófilos de los neutrófilos.
Estos anticuerpos son característicos de la gra-
nulom atosis de W egener y su concentración
tiende a correlacionarse con el período activo
de la enfermedad. Un segundo tipo de ANCA
se une a mieloperoxidasa, otra enzima neutrófi-
la. Los anticuerpos anti-mieloperoxidasa apare­
cen en diferentes tipos de vasculitis, principal­
mente poliartritis nodosa y glom erulonefritis
necrotizante. Se vio que los dos tipos de AN-
CAs eran capaces de activar a los neutrófilos in
vitro, causando la degranulación y producción
de radicales libres, y estos efectos eran incre­
mentados por efecto del TNF. Estos hallazgos
estarían indicando que los ANCA tienen un rol
patogénico en los diferentes tipos de vasculitis.
No se conoce aún si estos anticuerpos son el re­
sultado de una primera injuria que causa libera­
ción de antígenos potencialmente inmunogéni­
cos a partir de neutrófilos, o a través de algún
otro mecanismo.
Muchas agentes infecciosos tienen la capaci­
dad de activar neutrófilos, pero no inducen vas­
culitis o la producción de ANCAs, por lo tanto
Autoinmunidad 581
la v asculitis m ediada por ANCA es aún un
enigma, como la mayoría de las enfermedades
autoinmunes.
Anemia hemolítica autoinmune (AHAI)
La AHAI comprende un grupo de enferme­
dades que se caracterizan por la presencia de
autoanticuerpos contra glóbulos rojos, causan­
do una severa disminución de la vida m edia de
dichas células.
Se conocen dos tipos de autoanticuerpos an-
ti-glóbulos rojos, IgG e IgM, ambos con dife­
rente especificidad y asociados a diferentes
AHAI. Los autoanticuerpos de tipo IgG , aun­
que se unen a eritrocitos, no son capaces de
aglutinarlos y sólo pueden ser evidenciados
m ediante el uso del suero anti-Y-globulinas
(test de Coombs). Los antígenos a los cuales se
unen estos autoanticuerpos han sido difíciles de
caracterizar. Hoy se sabe que se hallan dentro
del altamente polirtiórfico sistema Rh. L a ca­
racterística de esta enfermedad es la anem ia he­
molítica por la depuración de eritrocitos unidos
a los anticuerpos, vía receptor Fe de m acrófa­
gos. Estos autoanticuerpos no son fijadores de
complemento, por lo tanto, la hsis intravascular
es poco común. La AHAI asociada con anti­
cuerpos de tipo IgG puede ser idiopática o estar
asociada a LES u otras enfermedades autoin-
inunes.
Los anticuerpos de tipo IgM asociados a ia
AHAI a son capaces de aglutinar a los glóbulos
rojos, por lo se los conoce con el nom bre de
crioaglutininas (CA), ya que lo hacen a bajas
temperaturas (4-22°C). Las CA reconocen un
sistema de antígenos llamado I/i, cuyo epitope
está formado por unidades repetidas de N-ace-
til-lactosam ina de manera lineal o ram ificada
respectivamente. El antígeno i se h alla sobre
los glóbulos rojos fetales y de recién nacidos;
el antígeno I aparece luego de los tres m eses de
vida.
E stos anticuerpos norm alm ente se hallan
presentes en el sitero de individuos normales,
en títulos muy bajos, pero en la enfermedad se
incrementan enormemente, pudiéndose obser­
var aglutinación con sueros diluidos hasta 1:
10''. La enfermedad crónica por CA es debida
generalmente a anticuerpos monoclonales de ti­
po IgM producidos por células B neoplásicas.
Un hecho llamativo de estos autoanticuerpos
es que, hasta el presente, son el único modelo
de autoanticuerpos con restricción en el uso de
un determinado gen Vj^. La asociación es con
el Vj^4-21, gen da la familia V h4. Este gen es
altamente representado en el repertorio de LB
normales. Si un antígeno extraño o propio se­
lecciona una célula B V h4-21+ y, si esta célula
sufre una transformación maligna, el resultado
582 Inmunopatología
puede ser la producción de un alto nivel de an­
ticuerpos monoclonales patogénicos y con es­
pecificidad de CA.
Enferm edades autoinm unes de la piel
Antes de hablar de las enfermedades autoin­
munes de la piel es importante hacer una intro­
ducción, aunque breve, de cómo está constitui­
do este órgano.
La piel es el órgano más extendido del cuer­
po. Está formado por un epitelio (epidermis),
una matriz de tejido conectivo (dermis) y tejido
adiposo (hipodermis) y muchas de las estructu­
ras de la piel han sido clasificadas en función
de su composición bioquímica.
La epidermis está constituida por un epitelio
estratificado, células pigm entarias (melanoci-
tos), células dendríticas (células de L an g er­
hans), y linfocitos residentes. Los queratinoci-
tos, componente mayoritario de la epidermis,
contienen un citoesqueleto form ado por fila­
mentos de queratina. Dichos filamentos se in­
sertan en la placa de desmosomas y hemides-
mosoraas estableciendo uniones con las células
adyacentes. Los queratinocitos se distribuyen
formando diferentes capas con distinto grado
de diferenciación.
La dermis está formada por tejido conectivo,
sistema de fibras, filamentos y un sistema co­
nectivo amorfo, que acomoda la red de nervios
y vasos. Las células más características son los
fibroblastos y macrófagos. En la dermis, en res­
puesta a diferentes estímulos, pueden aparecer
células derivadas de la sangre como linfocitos,
células plasmáticas y leucocitos. La dermis pro­
tege al cuerpo de injurias mecánicas externas.
La adhesión célula-célula de la epidermis es
mantenida por la unión de las proteínas de la
membranas celulares y reforzada por diferentes
tipos de adhesiones intercelulares. En estos di­
versos tipos de adhesiones participan diferentes
proteínas especializadas como microfilamentos
de actina, filamentos intermedios (tonofi lamen­
tos de queratinas), vinculinas, placoglobina, a -
actinina, etc.
Los desmosomas son placas epiteliales que
unen los tonofilamentos y son los que mantie­
nen la resistencia mecánica de la piel y las m u­
cosas. Por otro lado, las proteínas desmosoma-
les son las reconocidas por los autoanticuerpos
presentes en la m ayoría de las enfermedades
ampollares. Las principales proteínas que com ­
ponen las placas desmosomales son: desmopla-
quina, desmogleína, placoglobina y desmoglo-
bina.
Las diversas enfermedades autoinmnes que
atacan a la piel se caracterizan por la presencia
de autoanticuerpos dirigidos contra diferentes
componentes proteicos de las diversas capas de
la piel. La mayoría de estas enfermedades sé
conocen también con el nombre de enfermeda­
des am pollares, siendo las más com unes las
que se hallan bajo la denominación de Pénfigo.
Los autoanticuerpos que se encuentran en el
suero de pacientes con enfermedades ampolla­
res han sido de gran importancia para identifi­
car las diferentes moléculas de la piel responsa­
bles de las adhesiones epiteliales célula-célula
y de las adhesiones dérmicas/epidérmicas.
Enferm edades ampollares (Pénfigo)
El pénfigo (del griego pemphix, ampolla) es
una enfermedad autoinmune de la piel y mem­
branas de mucosas.
Se conocen diferentes tipos de pénfigos, en­
tre los cuales podemos nombrar: el P. vulgaris
(con ampollas orales y cutáneas, por la presen­
cia de IgG intracelular), el P. vegetans (con le­
siones orales y verrugas que simulan erupción,
por la presencia de IgG intracelular), P. folia-
ceus (con ampollas superficiales en piel, por la
presencia de IgG en la epidermis), el P. brasi­
leño (con ampollas superficiales en piel, por
anticuerpos en la epidermis). El más comiín es
el P. vulgaris.
Posteriormente a la formación de las ampo­
llas aparece la acantolisis debida a la pérdida
de la conexión entre las células epidérmicas de
la piel por desaparición de puentes intracelula­
res. La lesión acantolítica puede contener un
exudado inflamatorio, pero un hecho más ca­
racterístico de estas patologías es la presencia
de autoanticuerpos contra importantes sustan­
cias que mantienen la estructura rígida de las
células de la piel. El suero de los pacientes
también contiene estos autoanticuerpos, cuyo
título tiende a fluctuar, según la actividad de la
enfermedad.
Los anticuerpos que aparecen en todos los ti­
pos de pénfigo están dirigidos contra antígenos
conservados del epitelio estratificado. La carac­
terización de estos autoantígenos es muy com­
pleja. Los autoanticuerpos presentes en el P.
foliaceus inmunoprecipitan un complejo poli-
peptídico de epidermis de 269 kD, 160 kD y 85
kD. El polipéptido de 85 kD es la placoglobina,
un componente del desmosoma, que media la
adhesión celular de la epidermis. La proteína
de 160 kD es la desmogleína, una glucoproteí­
na de transmembrana que se extiende en el in­
terior del desmosoma. En el P. vulgaris, el au-
toanticuerpo une un autoantígeno epidérmico
de 210 kD, conformado por dos cadenas poli­
peptídicas de 130 kD y 85 kD (placoglobina),
unidas por puentes disulfuros. El componente
de 130 kD es un miembro de la familia de la
caderinas, que median la adhesión célula-célula
y son Ca^+ dependiente.

La desmogleína es el autoantígeno reconoci­
do por los anticuerpos presentes en el P. folia-
ceus. La glucoproteína de 210 kD se halla en la
región baja de la epidermis, sitio relacionado
con el P. vulgaris, mientras que la proteína de
160 kD identificada por los anticuerpos presen­
tes en el P .foliaceus se localiza en la región al­
ta de la epidermis, zona afectada en este tipo de
pénfigo.
Los anticuerpos involucrados en estas pato­
logías también producen liberación del activa­
dor de plasminógeno a partir de las células epi­
dérmicas. Esta enzima proteolítíca es capaz de
participar en los mecanismos que causan pérdi­
da de adhesión entre las células epidérmicas,
quizás por degradación de la sustancia intrace­
lular.
Una dramática demostración que la actividad
patogénica de los autoanticuerpos es el desa­
rrollo de lesiones ampollares en un niño recién
nacido, cuya madre padece de pénfigo vulgaris
activo.
La susceptibilidad de contraer algunos de los
tipos de pénfigo se halla ligada al HLA-DR4 y
al HLA-DRw6 y específicamente al HLA-DR4
variante cadena-¡3 (DwlO DR(3I).
5.2. Enferm edades autoinmunes
no órgano-específicas (sistémicas)
La enfermedades autoinmunes no órgano-es-
pecíficas, también llamadas sistémicas, se ca­
racterizan por la presencia de autoanticuerpos
circulantes que pueden ser patogénicos o no y
están dirigidos contra autoantígenos presentes
en todo el cuerpo, no siendo específicos de un
órgano en particular (cuadro 28-9).
La presencia de uno o más autoanticuerpos
circu lan tes co n tra autoan tíg en o s n u cleares
(ANAs) es la característica de las enferm eda­
des reumáticas sistémicas. Este grupo de enfer­
medades no presenta manifestaciones clínicas
homogéneas, sino graduaciones en la variedad
y severidad de los multisistemas involucrados.
El lupus eritematoso sistémico (LES) es el pro­
totipo de enfermedad autoinmune que involu­
cra una variedad de órganos y tejidos, como
ser, articulaciones, piel, riñones, sistem a ner­
vioso central, pulmones, corazón y músculo es­
quelético. Otras enfermedades de este grupo,
como la enfermedad mixta del tejido conectivo
(M CTD), síndrom e de Sjógren (SS), artritis
reum atoidea (AR) y esclerodermia (Sel), son
de un orden intermedio en el rango y variedad
de órganos involucrados. Finalmente se halla la
dermato/polimiositis, donde los órganos blanco
son piel y músculo.
Las enfermedades autoinmunes como LES,
SS, escleroderm ia y polimiositis se caracteri­
zan por la presencia de anticuerpos antinuclea­
Autoinmunidad 583
res (ANAs). Estudios realizados m ediante la
técnica de inm unotransferencia y clonado de
ADN han revelado que los autoantígenos rela­
cionados con este multisistema de enfermeda­
des autoinmunes son importantes proteínas re­
lacionadas con el metabolismo de ácidos ribo­
nucleicos, que incluyen ARNt, ADN y cofacto-
res de la RNA polimerasa.
Entre esta gran variedad de autoantígenos in­
volucrados en el reconocimiento de los autoan­
ticuerpos relacionados con las enferm edades
autoinmunes sistémicas se hallan las partículas
ribonucleoproteicas (RNP) altamente conserva­
das, como las SSA/Ro, SSB/La y uRNP. Su es­
trecha vinculación con enferm edades autoin­
munes ha permitido un estudio profundo sobre
su naturaleza molecular y la caracterización de
su secuencia; esto ha permitido la identifica­
ción de homologías estructurales y de secuen­
cia con proteínas no relacionadas, así como la
localización de secuencias RNP consenso, que
se han relacionado con la propiedad de estos
autoantígenos de unir ARN. Debido a que estos
motivos (estructuras repetidas) se hallan alta­
mente difundidos, se ha postulado que el siste­
ma inmune puede reconocer antígenos simila­
res presentes en un amplio número de organis­
mos, y mediante reactividades cruzadas ser res­
ponsables del desencadenamiento autoinmune.
Como se ha podido hallar una eficiente reacti­
vidad por parte de los autoanticuerpos contra
estos motivos, se ha sugerido que pueden fun­
cionar como epitopes para los LT.
Clark y col. en el año 1969 describieron por
primera vez el antígeno SSA/Ro en un paciente
con LES. Estudios posteriores, utilizando sue­
ros pacientes con SS, revelaron que los mismos
eran capaces de precipitar tres antígenos dife­
rentes provenientes de un extracto de linfocitos
humanos. Estos anticuerpos fueron designados
como A, B y C y con el prefijo SS, indicando
que estaban involucrados en el SS. A ños más
tarde Alspaugh y Maddison demostraron que el
Ro y SS-A eran el mismo antígeno y que no
eran específicos del SS, ya que los sueros de
pacientes con LES también contenían estos au­
toanticuerpos, aunque con menor frecuencia.
Estos autoanticuerpos reconocen partículas ri­
bonucleoproteicas pequeñas, cuyo componente
proteico varía entre 50 y 150 kD. Estudios rea­
lizados por diversos autores han llegado a la
conclusión de que el principal componente del
sistema Ro es un polipéptido de 60 kD que se
asocia a pequeños ARN de 83-112 nucleótidos.
Esta proteína es común a muchos tipos celula­
res, y el análisis de extractos de linfocitos y eri­
trocitos ha perm itido identificar otra proteína
de 52 kD en linfocitos y de 54 kD en eritroci­
tos, ambas antigénicamente diferentes, ya que
se han encontrado sueros que son capaces de
584 Inmunopatología

reconocer una y no la otra. La disociación de la 10 kD). Los autoantígenos nRNP Sm fu n cio -'
respuesta inmune hacia distintas proteína de Ro nalmente están relacionados con el splicíng del
sugiere la posibilidad de diferentes procesos pre-ARNm.
autoinmunes en las patologías en las que se ha­ Cada síndrome está asociado con una restric­
llan involucrados estos autoanticuerpos. ta variedad de ANAs, coino ser: anti-La con
A comienzos de la década del ’70 Mattioli y SS, anti-Sm con LES, enzimas anti-sintetasas
Reichlin observaron que el extracto citoplas- con miositis, anti-topoisomerasa I (Sel 70) con
mático de timo de ternera presentaba un antíge­ esclerodermia y anti-centrómero con CREST.
no precipitable por el suero de un paciente con Debido a ello, la precisa caracterización de un
LES, al que denom inaron La, in iciales del determinado ANA es de gran valor de diagnós­
nombre del paciente. Estudios posteriores de­ tico y pronóstico (cuadro 28-11 y fig. 28-7).
mostraron identidad entre los antígenos SS-B y La inm unotransferencia (immunoblotting o
La. Este autoantígeno es una fosfoproteína alta­ W estern-blot) es la técnica más utihzada en la
mente conservada y se han descrito por lo m e­ actualidad para determinar la especificidad de
nos seis isoformas, siendo el polipéptido mayo- un particular autoanticuerpo. Esta técnica se
ritario de 46-48 kD. Los autoanticuerpos anti- basa en la separación, por eleetroforesis en gel
La se detectan casi exclusivamente en pacien­ de acrilamida, de las diferentes proteínas con
tes con SS y LES, aunque con mayor frecuen­ distinto peso molecular, presentes en un extrac­
cia en el SS. to celular soluble, y después transferidas a una
En el año 1959, Holman y col. describieron m em brana de nitrocelulosa. La mem brana es
en el suero de pacientes con LES, la presencia luego incubada con sueros de pacientes; de es­
de anticuerpos que reaccionaban con un antíge­ tar presente algún autoanticuerpo específico, se
no nuclear diferente al ADN y ribonucleopro- unirá a su autoantígeno. Esta unión podrá vi­
teínas que, años más tarde. Tan y Kunkel deno­ sualizarse con un anticuerpo anti-y-globulina
m inaron Sm (iniciales del nom bre de un p a­ humana marcado con una enzima. La visualiza­
ciente). Mattioli y Reichlin observaron que este ción de una banda de 47 kD sugiere la presen­
antígeno era lábil al tratamiento con ARNasa, cia de autoanticuerpos SS-B, mientras que la
por lo tanto lo definieron como una ribonucleo- unión con una pro teína de 60 kD indica la pre­
proteína, que denominaron U1 RNP. Los anti­ sencia de autoanticuerpos SS-A. Por medio de
cuerpos anti-Sm reconocen pequeñas partículas las técnicas de biología molecular se han podi­
ribonucleicas presentes en todas las células eu- do clo n ar algunos au to an tíg en o s com o ser
cariotes. Una importante caracterización de es­ RNP, Sm, SS-A, y SS-B, lo que ha permitido el
te autoantígeno o sistema de autoantígenos es desarrollo de técnicas mucho más sensibles co­
el hecho de que los anticuerpos anti-Sm son ca­ mo el enzimoinmunoanálisis (ELISA).
paces de precipitar pequeñas partículas de ribo-
nucleoproteínas diferentes (U l, U4, U5 y U6), Lupus eritematoso sistémico (LES)
en cambio los anticuerpos anti-U l sólo reac­
cionan con la partícula nRNP U l . A su vez, ca­ El LES es una enfermedad que afecta princi­
da una de las nRNP U está asociada a diferen­ palm ente a m ujeres jóvenes adultas aunque
tes polipéptidos, por lo que este complejo siste­ también se presenta en niños y ancianos de am­
ma de autoantígenos se conoce de acuerdo al bos sexos.
peso molecular del péptido al cual los nRNP U Clínicamente, el LES se presenta con fiebre
están asociados; Sm B ’ (27 kD), SmD (13 kD), alta, artralgia, erupciones de piel, problemas
SmE/F (un duplete de 11 kD) y SmG (menor a cardíacos, pulmonares y renales. Se observan

C u ad ro 28-11. Anticuerpos antinucleares y patologías autoinmunes sistémicas asociadas

A utoantígeno E nferm edad asociada Técnica usada

d s -A D N L E S (7 0 -9 0 % ) C rith id ia L u c ilia e (lE t)

E L IS A
S m (S m ith ), R N P L E S (3 0 % ) ID -W B
H is to n a L E S , L E S in d u c id o p o r d ro g as E L IS A -W B
S S -A (R o) L E S , SS ID -W B
S S -B (L a) L E S , SS ID , W B
S c i-70 E s c le ro d e rm ia ID , W B
C e n tró m e ro E s c le r o d e rm ia IFI
Jo-1 P o lio m io s itis ID

IFI; inm u n o flu o resc en cia ; E L IS A : e n z im o in m u n o an á lisis; W B : in m u n o tran sfe ren c ia ; ID : in m u nodifusión.
ds-A D N : A D N de do b le ca dena.
 Autoinmunidad 585

Fig. 28-7. Perfiles de inm unofluorescencia ob ten id os en fren tan d o células H ep-2 con diferentes a u toanticu erp os. A:
p e rfil h o m o g é n e o o b te n id o con un s u e ro d e L E S q u e contiene p r in c ip a lm e n te anticuerpos a n ti-A D N d e d o b le c a d e n a . B:
p e rfil d e p u n te a d o f in o /n u c le o la r, d a d o p o r a n tic u e rp o s a n ti-S c l-7 0 . C : p e rfil d e p u n te a d o g ru e s o , o b te n id o c o n a n tic u e rp o s
an ti-S m , a n ti-R N P , S S -B u o tro s. D: p e rfil p e rifé ric o p ro d u c id o p o r a n tic u e rp o s p o r a n tic u e rp o s a n ti-A D N d e d o b le c a d en a
o a n tic u e rp o s a n ti-m e m b ra n a n u c le a r. E : p erfil d e p u n te a d o fin o p r o d u c id o p o r a n tic u e rp o s a n ti-S S -A , e ste p e rf il p u ed e
d a rse ta m b ié n c o n o tro s a u to a n tic u e rp o s. F: p e rfil n u e le o la r, q u e c o n fre c u e n c ia se o b s e rv a c o n s u e ro d e p a c ie n te s c o n es-
c le ro d e rm a . T a m b ié n se o b s e rv a la r e g ió n n u e le o la r d e s o rg a n iz a d a d e u n a c é lu la en d iv is ió n .

autoanticuerpos contra distintos antígenos del do, sólo se demostró compromiso de piel, arti­
organisiTio, variaciones en el nivel de comple­ culaciones y células sanguíneas. Por otra parte,
mento sérico, presencia de complejos inmunes, los pacientes con LES severo presentan gene­
ininunidad mediada por células ligeramente al­ ralmente lesiones renales, pleuritis, pericarditis
terada e importantes lesiones en distintos órga­ y compromiso del sistema nervioso central; en
nos. estos casos es poco comtin la presencia sola­
En el cuadro 28-12 se detallan los autoanti­ mente de anticuerpos anti-ADN desnaturaliza­
cuerpos más característicos presentes en LES. do. Por lo tanto, la detección de anticuerpos an-
A nticuerpos antinucleares. Aunque no to­ ti-ADN nativo es de gran importancia para el
dos estos anticuerpos son específicos del LES, pronóstico de esta enfermedad. Existe una gran
su presencia es un factor importante en el diag­ variedad de técnicas que utilizan ADN nativo,
nóstico diferencial de las enfermedades del te­ de distinto origen, como material antigénico.
jido conectivo.
Una técnica muy eiTipleada en la detección
de los ANAs es la inmunofluorescencia indi­
recta utilizando como material nuclear hepato- C u a d ro 28-12. P rincipales autoanticuerpos
citos de ratón obtenidos m ediante cortes al presentes en LES
crióstato u homogeneizado del órgano. Se ob­
servó que los resultados obtenidos con el uso 1) A n tic u e r p o s a n tin u c le a re s (A A N )
a) c o n tra n u c le o p ro te ín a s
de este material eran de baja especificidad y b ) c o n tra á c id o d e s o x irrib o n u c le ic o (A D N )
sensibilidad, por tal motivo fue reem plazado c ) c o n tra á c id o r ib o n u c le ic o (A R N )
por células H ep-2 en m etafase, línea celular d ) c o n tr a h isto n a
e ) c o n tra a n tíg e n o s n u c le a re s e x tra c ta b le s ( E N A )
proveniente de un epitelioma humano.
2) A n tic u e rp o s c o n tra a n tíg e n o s R o y La.
Existe una clara correlación entre la presen­ 3) A n tic u e r p o s a n ti-Ig G y a n ti-lg A (fa c to r r e u m a to id e o ).
cia de anticuerpos circulantes contra ADN nati­ 4) A n tic u e r p o s a n ti-c ito p la s m á tie o s
vo y glom erulonefritis de tipo lúpico, ya que 5) A n tic u e rp o s a n ti-e ritro c ito s
6) A n tic u e r p o s a n ti-fa c to re s d e la c o a g u la c ió n
cuando la afección renal entra en remisión, el
7) A n tic u e rp o s c o n tra a n tíg e n o s ó r g a n o -e s p e c ífic o s
nivel de anticuerpos anti-ADN desciende nota­ 8) A n tic u e rp o s a n ti-c o lá g e n o ’
blem ente. En pacientes que padecen LES y 9 ) A n tic u e rp o s c o n tra m e m b ra n a b a sal g lo m e ru la r (M B G )
presentan anticuerpos anti-ADN desnaturaliza­
586 Inmunopatología
La técnica de inm unofluorescencia indirecta,
utilizando como sustrato Crithidia lucilliae fue
introducida por Aarden y col. en 1975. El uso
de este microorganismo se fundamenta en que
posee un cinetoplasto de gran tamaño, rico en
ADN nativo. Es una técnica simple y se pensó
que era específica para anticuerpos anti-ADN
nativo. Sin embargo, Deng y col. demostraron
que ocasionalm ente anticuerpos anti-histona
pueden unirse al cinetoplasma. Estudios adicio­
nales indicaron que la expresión de histona era
función del ciclo de vida del microorganismo y
es detectada con más facilidad dos días después
de la iniciación del cultivo. Este detalle debe
tenerse presente al utilizar esta metodología p a­
ra investigar anticuerpos anti-ADN nativo. Sin
embargo hay una buena correlación entre esta
metodología y la técnica de Farr cuando ios tí­
tulos de anticuerpo están relativamente eleva­
dos.
Otras técnicas utilizadas para la detección de
anticuerpos anti-ADN nativo son la hemagluti-
nación de células tañadas, fijación de comple­
mento, contrainmunoelectroforesis, unión espe­
cífica del antígeno marcado (método de Farr),
etcétera.
A lgunos autores observaron poca correla­
ción entre ensayos utilizando técnicas diferen­
tes, en la determinación de anticuerpos anti-
ADN; esto se debería a que, en cada ensayo se
miden anticuerpos de distintas afinidades y a la
posibilidad de reacciones cruzadas. La princi­
pal diferencia se encuentra entre ensayos de fa­
se sólida, como el ELISA, que detecta una am­
plia gama de anticuerpos de reacción cruzada,
y ensayos de fase líquida, como la técnica de
Farr, que detecta principalmente anticuerpos de
alta especificidad y afinidad. A lgunas de las
reacciones cruzadas son probablem ente debi­
das a la estructura polianiónica del ADN que
reaccionaría con proteínas cargadas positiva­
mente como inmunoglobulinas. Por otra parte,
es interesante observar que anticuerpos anti-
ADN reaccionan con moléculas que presentan
grupos aniónicos repetidos como heparán sul­
fato y dextrán sulfato. La unión con el primero
sería de interés ya que es el principal protéogli-
cano constituyente de la membrana basal glo-
merular.
La detección de anticuerpos anti-Sm tiene
gran importancia en el diagnóstico de LES ya
que este anticuerpo es considerado un m arca­
dor de dicha enfermedad. Los antígenos Sm y
RNP forman parte del antígeno nuclear extrac-
table (ENA). La detección de estos antígenos
se realiza mediante técnicas de inm unoprecipi­
tación. La técnica de inm unotransferencia ha
mejorado la identificación y caracterización de
los antígenos nucleares y perm ite una defini­
ción más precisa de la especificidad de anti­
cuerpos para epitopes de los antígenos RNP y
Sm.
O tros anticuerpos detectados en LES. La
presencia de anticuerpos contra antígenos Ro y
La fue demostrada en pacientes con LES y Sín­
drome de Sjógren. Ambos antígenos se encuen­
tran en el citoplasma y el ntícleo celular. Los
anticuerpos contra estos antígenos parecen par­
ticipar en la lesión renal de algunos pacientes
con LES.
Es frecuente encontrar anticuerpos anti-lgG,
y con menor frecuencia anticuerpos que reac­
cionan con otros IgS.
En la actualidad se ha comenzado el estudio
de los anticuerpos contra antígenos de la mem­
brana basal glomerular (MBG). Estos anticuer­
pos serían inducidos como consecuencia de la
liberación de antígenos del glomérulo, debido a
la lesión renal producida por el depósito de
complejos inmunes. Bemstein y colaboradores
realizaron estudios en pacientes con LES, de­
mostrando la relación directa entre la presencia
de anticuerpos contra MBG y nefritis.
Niveles de complemento sérico y alteracio­
nes inmunológicas. En los casos más severos
de esta enfermedad es frecuente la aparición de
glom erulonefritis, la que suele estar asociada
con títulos elevados de anticuerpos anti-ADN
nativo y niveles muy disminuidos de com ple­
mento sérico, pudiendo estar comprometidos
C l, C4, C2 y C3. Se observó que cuando los ni­
veles de complemento total se normalizan, el
C4 perm anece ligeram ente dism inuido. M e ­
diante antisueros marcados se detectó la presen­
cia de complemento en los inm unocomplejos
depositados en el glomérulo. En esta enferme­
dad, el complemento se puede activar también
por vía alterna. Por otra parte, los niveles de
complemento sérico son útiles para determinar
una presunta lesión renal en ausencia de mani­
festaciones de glomerulonefritis, y son de ayuda
en el control del tratamiento ya que sus niveles
tienden a normalizarse al entrar en remisión la
enfermedad. Los glomérulos afectados reaccio­
nan con diversas formas de compromiso histo­
lógico, que pueden abarcar fenómenos prolife-
rativos ya sea de tipo focal o difuso.
Las lesiones producidas se extienden a las
arteriolas renales y pueden comprometer los tú-
bulos. Ocasionalmente se observan cuerpos de
hematoxilina en las zonas de lesión. Mediante
elución de los anticuerpos comprometidos se
determinó que son específicos para ADN nati­
vo y modificado y ARN. En pacientes con alte­
raciones neurológicas y altos títulos de anti­
cuerpos anti-ADN se suele encontrar disminui­
do el complemento sérico con degeneración del
colágeno y proliferación de tejido elástico en la
dermis. En las lesiones de piel se detectaron
depósitos de inmunoglobulinas.

En un 30% de los casos se presentan ade­
más, alteraciones a nivel de articulaciones, con
artritis deformante en las manos.
Inm unidad m ediada po r células. Al estudiar
los receptores linfocitarios se detectó disminu­
ción en número y proporción de linfocitos T en
LES activo, y en algunos casos fue notable
también una disminución de linfocitos B. Ama-
saki y col sugirieron que la expresión aumenta­
da del antígeno Fas (CD95) en linfocitos T na­
tivos y de memoria en sangre periférica, sería
un posible mecanismo para explicar la linfope-
nia observada en pacientes afectados de LES.
Artritis reumatoidea
La artritis reumatoidea (AR) es la enferme­
dad autoinmune más común; se halla am plia­
mente distribuida tanto en adultos como en ni­
ños. En adultos el pico de incidencia se m ani­
fiesta entre los 30 y 50 años de edad y es entre
2 a 3 veces más com ún en m ujeres que en
hombres. Es una enfermedad crónica que afec­
ta principalmente las articulaciones, con infla­
mación, dolor, calor y tumefacción de las m is­
mas; los casos agudos están acompañados de
aumento de la temperatura corporal. La AR es
un claro ejem plo de enfermedad autoinmune
sistémica, y es fácilmente reconocida como tal.
En contraste a las artralgias que aparecen en el
LES, puede culminar con deformación y des­
trucción de las articulaciones. La AR no está
confinada sólo a las articulaciones, ya que nor­
malmente está acompañada de una variedad de
alteraciones sistémicas como, por ejemplo, la
vasculitis. La vasculitis es causada por comple­
jos inmunes formados por factor reumatoideo e
IgG y puede causar daños en piel, ojos y pul­
món. El curso de la enferm edad es variable,
pudiéndose dar casos de rem isiones espontá­
neas que persisten por varios tmos. Como en la
mayoría de las enfermedades autoinmunes no
existe cura para la AR. El único rol de los m e­
dicamentos es reducir la inflamación y, por en­
de, el dolor y preservar la función de las articu­
laciones para prevenir la invalidez. Los antiin­
flamatorios no-esteroides como la aspirina son
las drogas más comunes, aunque se han utiliza­
do y se continúan usando tratamientos con cor-
ticoides, sales de oro, penicilamina, metotrexa-
te, etc. con diferentes resultados. Debido a la
toxicidad de estas drogas, sólo se recu rre a
ellas en casos extremos.
La artritis es el resultado de una compleja in­
teracción entre las células sinoviales y leucoci­
tos que infiltran desde la circulación. La causa
principal de la lesiones en las articulaciones no
es conocida, ya que no son claros los m ecanis­
mos que inician la inflamación aguda de la si­
novia. Se han identificado péptidos y m olécu­
Autoinmunidad 587
las de adhesión en las células sinoviales que
producen quimiotaxis de linfocitos y monocitos
a los espacios sinoviales. Las células sinoviales
en proliferación expresan moléculas de clase II
del M CH y co-estim ulan m oléculas que au­
mentan la activación e infiltración de LTh, con
la consiguiente estimulación de LB del líquido
sinovial que finalmente sintetizan y liberan in­
munoglobulinas. Algunos de estos anticuerpos
producidos localmente son de tipo IgG y tienen
actividad de factor reum atoideo y unen otras
moléculas de IgG y forman complejos inmunes
que se depositan en las articulaciones. Estos in­
munocomplejos activan la cascada del com ple­
mento, iniciando de este modo el proceso infla­
matorio. Las células responsables de la in fla­
mación liberan proteasas lisosomales, radicales
de oxígeno y prostaglandinas que producen in­
juria del colágeno y la matriz del cartílago de
las articulaciones. No todos los pasos de esta
secuencia han sido rigurosamente demostrados.
Si el factor reumatoideo contribuye a la lesión
y si la sinovitis depende de la activación de LT,
son puntos que aún deben ser aclarados.
El autoanticuerpo característico de esta enfer­
medad es el llamado factor reumatoideo (FR).
Generalmente es de tipo IgM y reacciona con el
Fe de la IgG. Por tal motivo este autoanticuerpo
puede unirse a la IgG normal circulante y for­
mar complejos IgM-IgG, depositándose en las
articulaciones. Estos inmunocomplejos pueden
activar la cascada del complemento, producien­
do una inflamación crónica de las articulacio­
nes. Debido a que el factor reumatoideo se halla
presente en el suero del 80 % de los pacientes,
su detección es muy útil para el diagnóstico de
la enfermedad y se lo considera un marcador de
la enfermedad, aunque se lo ha encontrado sólo
en un 5-10% en pacientes jóvenes y por otro la­
do también se lo ha encontrado en pacientes con
infecciones bacterianas o parasitarias crónicas.
Investigaciones recientes han permitido hallar,
en pacientes con artritis reumatoidea, anticuer­
pos típicos del lupus eritematoso sistémico, in­
clusive anti-ADN y anticuerpos anti-histona, sin
que presenten signos de esta enfermedad. Tam ­
bién se han encontrado anticuerpos anti-querati-
na y anti-perinuclerares.
Los inmunocomplejos que producen el FR,
por la unión con la IgG causan serios proble­
mas de vasculitis sistémica, que ha sido asocia­
da con la expresión homocigota del antígeno
del com plejo m ayor de h istocom patibilidad
H LA -D R pl. Se ha postulado que una deficien­
cia en la actividad de la galactosil transferasa
de los linfocitos puede reducir la glucosilación
de la región C \ de la IgG. Esta glucosilación
deficiente podría rendir a la molécula de IgG
inmunogénica y estimular la producción de an­
ticuerpos anti-Cy (es decir producción del FR).
588 Inmunopatología
La asociación de la artritis reurnatoidea con
el MHC está dada con las m oléculas HLA-
DR 1, HLA-DRw6 y HLA-DR4, y con algunos
subtipos particulares en determinados grupos
étnicos. Estudios moleculares han demostrado
una fuerte relación entre la susceptibilidad por
esta enfermedad y la molécula D R pl. Los tres
alelos conocidos de esta m olécula, que están
asociados a la susceptibilidad, presentan una se­
cuencia común de Gln-Lys-Arg-Ala-Ala o Gln-
Arg-Arg-Ala-Ala en la tercera región de varia-
bihdad de la cadena (3 (residuos 67-71). Esta re­
gión puede constituir la región de la molécula
del MHC que interactúe con el TCR y por lo
tanto influenciar al LT a una particular selec­
ción o reconocimiento. La tercera zona variable
de la cadena (3 de las moléculas de clase II de
las ratas BB endocriadas también presentan una
secuencia característica (motif); la inm uniza­
ción de estos animales con colágeno humano
provoca una intensa respuesta inmune y artritis
severa, lo que estaría demostrando la importan­
cia de esta secuencia en esta región para el de­
sencadenamiento de la patología en cuestión.
Dermatomiositis y polimiositis
Es una enferm edad que afecta a niños y
adultos; clínicamente se presenta con debilidad
muscular a veces precedida de fiebre y puede
estar afectado cualquier músculo esquelético,
aunque los involucrados más comúnmente sue­
len ser los músculos proxim ales de brazos y
piernas. Los dolores musculares, las manifesta­
ciones cutáneas con eritema y descamación so­
bre los nudillos de manos y pies y erupciones
papilares en la cara y párpados son característi­
cas comunes de esta enfermedad. Se desconoce
la relación, pero hay evidencias de carcinoma,
en aproximadamente el 20% de los adultos, an­
tes o después de la aparición de la dermatomio­
sitis.
Los autoanticuerpos presentes en el suero de
pacientes con m iositis reaccionan p rin cip al­
mente con antígenos citoplasmáticos, razón por
la que la tradicional determinación de ANA en
estos pacientes es generalm ente negativa. Si
hay sospecha de miositis se deben realizar am­
bos tests; ANA y ENA. Más del 90% de pa­
cientes con miositis presentan algún autoanti-
cuerpo detectable. El autoanticuerpo más cono­
cido asociado con miositis, es el anti-Jol, que
reacciona con la enzima citoplasmática histidil
ARNt sintetasa (HRS), enzima que cataliza la
unión de histidina a su ARNt específico. El au­
toanticuerpo anti-Jol pertenece a una fam ilia
característica de autoanticuerpos, presentes en
el suero de pacientes con miositis, que reaccio­
nan con diferentes ARNt sintetasas; por ejem­
plo han sido detectados autoanticuerpos que
reaccionan con 5-am inoacil A RN t sintetasas,
para histdina, treonina, glicina, isoleucina y
alanina. Todos ellos sólo han sido detectados
en pacientes con miositis y todos asociados con
una alta incidencia de alteraciones en pulmón.
En el suero de pacientes con miositis tam ­
bién pueden encontrarse autoanticuerpos contra
proteínas relacionadas con factores de transla­
ción, como ser anticuerpos anti-KJ, mientras
que otros autoanticuerpos parecen estar dirigi­
dos contra la partícula de reconocim iento de
señales, un complejo macromolecular que diri­
ge la secreción de proteínas del retículo ende-
plasmático.
Autoanticuerpos específicamente asociados
con miositis son: Anti-histidil ARNt sintetasa
(Jo- 1), anti-treonil ARNt sintetasa (Pl 7), anti-
alanil ARNt sintetasa (Pl 12), anti-glicil ARNt
sintetasa (EJ), anti-isoleucina ARNt sintetasa
(OJ), anti-Partícula de señal de reconocimiento
(SRP) y anti-Eactor de traslación de elongación
(KJ).
Ciertos síndromes que se superponen poseen
m arcadores específicos, por ej. los autoanti­
cuerpos PM/Scl y Ku, están asociados con la
superposición de los síndromes miositis y es-
cleroderm ia. La m io sitis puede acom pañar
otras alteraciones del tejido conectivo, como
ser escleroderma, artritis reumatoidea, LES, SS
y síndrome mixto del tejido conectivo, pero en
estos casos la miositis es generalmente suave y
los autoanticuerpos presentes son los marcado­
res del síndrome primario.
Los autoanticuerpos asociados a la miositis,
particularmente los anti-sintetasas parecen de­
finir subgrupos de miositis. El 66% de pacien­
tes que presentan en su suero anticuerpos anti-
Jol son HLA-DR3+, comparados con el 22%
de los pacientes que no presentan a n ti-Jo l.
Aquellos pacientes también presentan altera­
ciones respiratorias típicas, artritis y fenómeno
de Raynaud (desorden circulatorio secundario
asociado a un desorden vascular primario).
Hasta tanto no haya datos acerca de los m e­
canismos por los que, algunos autoanticuerpos
específicos de la miositis son patogénicos para
las fibras musculares, la detección de estos an­
ticuerpos provee información valiosa para el
diagnóstico y pronóstico de la enfermedad. El
anti-Jol en particular es importante ya que pue­
de predecir el desarrollo de la enfermedad. Los
niveles de anti-Jol son independientes de los
n iv eles de IgG total y pueden d e sap arecer
cuando la enfermedad entra en remisión. Los
tradicionales ensayos de inmunodifusión sólo
detectan el 25% de anti-Jol en suero de pacien­
tes con m iositis, m ientras que el ensayo de
ELISA detecta el 44%.
La asociación específica entre miositis y au­
toanticuerpos contra proteínas relacionadas con
 Autoinmunidad 589

factores de elongación y traslación ha generado pos anti-centrómero y anticuerpos anti-nucleo-

una serie de hipótesis relacionadas con algunos
virus y las enzim as antes m encionadas. Hay
evidencias de la estrecha relación entre la mio­
sitis y algunos enterovirus en especial infec­
ción por Coxsackie B. Estos virus pueden tener
estructuras ARNt similares en su genoma. Una
hipótesis para la inducción de anticuerpos anti-
sintetasas sugiere que puede formarse un com­
plejo macromolecular de sintetasa-aminoácido-
virus y actuar como neoantígeno y rom per la
tolerancia a lo propio con la siguiente produc­
ción de autoanticuerpos anti-sintetasa. Una se­
gunda hipótesis sugiere que los anticuerpos an-
ti-Jo 1 actúan como anticuerpos antiidiotipo
para los anticuerpos anti-virus, los que podrían
unirse a la enzima. Una tercera hipótesis sugie­
re que las proteínas virales podrían mimetizar a
la enzima y los anti-Jo 1 unirse a ésta.
Esclerodermia
La esclerodermia es una enfermedad que se
manifiesta por el depósito excesivamente anor­
mal de colágeno en la piel. Afecta a personas
de edad media, en especial mujeres, y se pre­
senta inicialmente con problemas vasculares en
la punta de los dedos de manos y pies, luego
continúan en la cara, cuello, la parte superior
del tórax, difundiéndose hacia las extrem ida­
des. Se produce engrosamiento de la dermis y
el tegumento resulta invadido; también son fre­
cuentes los cambios degenerativos con fibrosis
e inflamación de piel, sinovia y algunos órga­
nos. En más del 50% de los pacientes el fenó­
meno de Raynaud precede el comienzo de la
enfermedad; cuando va asociado a calcinosis,
dismotilidad esofágica, esclerodactiha y telan­
giectasia, suelen detectarse anticuerpos anti-
centrómero.
Los tres autoanticuerpos más caracterizados
asociados a esclerodermia son Scl-70, anticuer­
lares (cuadro 28-13). Más del 90% de los pa­
cientes con ecleroderma, presentan en el suero
anticuerpos anti nucleares.
A nticuerpos anti-Scl-70. Estos anticuerpos
son llamados así porqué reconocen una proteí­
na nuclear de 70 kD; actualmente se sabe que
es la enzima nuclear topoisomerasa L Aproxi­
madamente el 20-50% de los pacientes con es­
clerodermia presentan en el suero anticuerpos
Scl-70, cuando son detectados por el ensayo
tradicional de inm unoprecipitación. C uando
fue utilizado el ensayo de ELISA con la topoi­
somerasa purificada, la detección de autoanti­
cuerpos se incrementó al 70%. Los pacientes
con escleroderm ia que presentan anticuerpos
Scl-70, tienden a tener un curso más severo de
la enfermedad. Estos anticuerpos son raram en­
te hallados en otras enfermedades, por lo tanto
su detección es altamente significativa.
La importancia de la identificación de la to­
poisomerasa I como autoantígeno en la esclero­
dermia difusa promueve a interesantes hipóte­
sis. El anormal funcionamiento de esta enzima
podría incrementar la expresión de genes del
colágeno de piel, ya que aparentemente la to­
poisomerasa I se une frecuentemente a cuatro
genes de colágeno fibrilar y tres de ellos están
relacionados con la expresión del colágeno de
piel. Por lo tanto este podría ser un mecanismo
de patogénesis de la enfermedad. Por otro lado,
dentro de la secuencia de la topoisom erasa I
existe un epitope de seis aminoácidos sim ilar a
varias proteína retrovirales, sugiriendo una mi-
metización molecular.
A nticuerpos anticentróm ero (ACA). Estos
autoanticuerpos producen un perfil característi­
co en inm unofluorescencia indirecta p o r su
unión con la región centromérica del crom oso­
ma. L a más fuerte asociación de los A CA y
con títulos más elevados es con el fenómeno de
Raynaud. La inm unotransferencia rev ela que

C uadro 28-13. Anticuerpos antinucleares y antinucleolares en esclerodermia y métodos ele de­

tección

Inm unofluorescencia Inm unodifusión N aturaleza del cmtígeno

N ucleares
G ra n u la d o d ifu s o
C e iilró m e ro /k in e to c o re
P u n te a d o fin o
S c l-7 0 A s o c ia d o a c ro m o s o m a
( p ro te ín a d e 7 0 kD )
d e n tro o f u e r a d e k in e to c o re
- -

P u n te a d o g ru e s o - -
H om ogéneo - -
M a n ch a s - P ro b a b le m e n te c e n trío lo

N ucleolares
H om ogéneo 4 S -6 S A R N P ro b a b le m e n te U3 A R N
G ru m o s - ....

P u n te ad o - -
590 Inmunopatología
los sueros con ACA reconocen tres polipépti-
dos cromosomales de 17 kD, 80 kD y 140 kD.
Los anticuerpos contra la proteína de 80 kD,
llamada CENP-B están presentes en todos los
sueros ACA positivos, mientras que aparecen
con título y frecuencia baja los anticuerpos di­
rigidos contra las moléculas de 17 kD (CENP-
A )y 140kD (CENP-C).
Anticuerpos anti-nucleolares. La designa­
ción de anticuerpos anti-nucleolares puede es­
tar referida a diferentes antígenos nucleolares
(ADN, histonas, Sm, Scl-70 etc.); el término de
anticuerpos anti-nucleolares describe un grupo
heterogéneo de autoanticuerpos característicos
de la escleroderm ia. Los más caracterizados
son los anti-fibrilarina, anti-P M /S cl y anti-
ARN polimerasa 1. Cada uno de ellos tiene una
asociación clínica con diferentes subgrupos de
pacientes con esclerodermia. Anticuerpos anti-
fibrilarina unen una proteína de 34 kD rica en
dimetilarginina (fibrilarina), parte del complejo
nucleolar U3 RNP. Estos anticuerpos parecen
estar asociados con pacientes del sexo masculi­
no que p resentan esclero d erm ia con lig ero
compromiso articular. Los anticuerpos contra
el complejo PM/Scl aparecen en pacientes con
esclerodermia asociada a miositis, con un com ­
promiso renal incrementado. Los anticuerpos
anti-ARN polímera 1 están asociados a un pe­
queño subgrupo de pacientes con escleroder­
mia que envuelve órganos internos, incluyendo
desórdenes renales. La detección y caracteriza­
ción de autoanticuerpos asociados con esclero­
dermia es de importante diagnóstico y pronós­
tico y deben ser determinados en forma tem ­
prana cuando los pacientes presentan una su­
gestiva sintomatología, en particular el fenó­
meno de Raynaud.
Síndrome Primario de Sjógren (SS)
El concepto clínico de Síndrome primario de
Sjógren es confuso, por lo tanto necesita ser
clarificado antes de hablar de los autoanticuer­
pos relacionados. Se debe diagnosticar el SS
cuando no hay un claro compromiso del tejido
conectivo como ser AR, LES o esclerodermia.
El SS puede aparecer como una simple seque­
dad ocular o bucal hasta un severo desorden
con infiltrado linfocítico de piel, intestino y
músculo, con incremento de incidencia de lin­
fom a y vaseulitis sistém ica. Los anticuerpos
antinucleares SS-A/Ro y SS-B/La son m arca­
dores característicos del SS primario.
Anticuerpos SS-B. Los autoanticuerpos SS-
B reconocen a una proteína nuclear de 48 kD
(SS-B) que actúa como cofactor para la ARN
polimerasa III. El antígeno está asociado tam­
bién con todas los ARN transcriptos por ARN
polim erasa III, incluyendo tARNs, ARNs 5S
ribosomal y ARNs viral codificado por la ARN
polimerasa III del huésped, incluyendo el virus
de Epstein-Barr 1 y 2.
La detección de la presencia de los anticuer­
pos SS-B en los sueros de pacientes con SS pri­
mario es muy variado y oscila entre el 40 y
96%. Estos autoanticuerpos tam bién fueron
descritos en una población de pacientes con
SLE.
Como otros autoanticuerpos, los anti-SS-B
constituyen una variedad de anticuerpos que re­
conocen diferentes moléculas SS-B, algunas de
las cuales han sido mapeadas y se conocen los
sitios de unión para el anticuerpo. Recientemen­
te se ha demostrado que la formación de anti­
cuerpos anti-SS-B parece estar dirigida, en un
comienzo hacia la porción amino-terminal de la
molécula SS-B, desarrollándose finalmente una
respuesta autoinmune contra la molécula entera.
Se ha postulado que una infección viral podría
originar una reacción cruzada dirigida inicial­
mente hacia un simple epitope, con la posterior
diversificación de la respuesta autoinmune.
A n ticu erpos SS-A. E xisten por lo m enos
cuatro anticuerpos que constituyen una com ­
pleja serie de autoanticuerpos que reaccionan
con cuatro proteínas d iferentes. La técn ica
usualmente utilizada en laboratorio para la de­
tección de estos anticuerpos, como es la doble
difusión en agar (Outcherlony) no puede distin­
guir este conjunto de anticuerpos SS-A. La in­
m unotransferencia con extractos solubles de
células nucleadas puede poner en evidencia dos
proteínas SS-A de peso m olecular diferente,
una de 60 kD y otra de 53 kD. Cuando se utili­
zan eritrocitos como fuente antigénica los sue­
ro de pacientes que presentan anticuerpos anti-
SS-A reconocen dos proteínas de peso molecu­
lar de 54 kD o 60 kD, y son antigénicamente
diferentes de los antígenos SS-A provenientes
de las células nucleadas. En el cuadro 28-14 se
enumeran las diferentes patologías asociadas a
los antígenos SS-A y SS-B.
Bonfa y col. han mostrado que pacientes con
psicosis secundaria a LES tenían anticuerpos
anti-ribosomales, pero la mitad de los pacientes
con LES, y que formaban anticuerpos anti-ri-
bosomales no tenían psicosis; esto claramente
demuestra que dichos anticuerpos no son sufi­
cientes para producir la enfermedad. Sin em ­
bargo la precisa medición de los anticuerpos
anti-ribosomales es clínicamente necesaria para
poder distinguir entre eventos psicóticos no re­
lacionados, psicosis inducida por drogas y lu­
pus-psicosis. Estudios longitudinales de anti­
cuerpos anti-ribosomales han revelado que es­
tos anticuerpos aparecen antes y durante la fase
activa de la psicosis. Anticuerpos anti-riboso-
males han sido detectados en el líquido espinal
de pacientes con lupus-psicosis. Otros investí-
 Autoinmunidad 591

Cuadro 28-14. Asociación de los autoanticuerpos Ro/SS-A y LaJSS-B con enfermedades autoin­
munes sistémicas
Anti-Ro/SS-A Anti-La/SS-B
% %

D esórdenes clínicos ID ELISA ID E L IS A

S ín d ro m e d e S jo g re n
P rim a rio 60 95 20 90
S e c u n d a rio 20 5
LES 25 10
L E S c o n A N A n e g a tiv o 62 32
L E c u tá n e o s u b a g u d o (S C L E ) 62 90 25
su p e rp o s ic ió n d e SS y S C L E 100 100 10 50
L E d isc o id e (D L E ) 3
L E n e o n a ta l (N L E ) 90 50
B lo q u e c a rd ía c o n e o n a ta l 80
D e fic ie n c ia d e C 2 y C 4 80 10
C irro sis b ilia r p rim a ria raro
H e p a titis c ró n ic a a c tiv a raro
C o n tro le s n o rm a le s 0,1 10 0,1

ID : in m u n o d ifu sió n , E L IS A : en z im o in m u n o an á lisis

gadores no han hallado una relación entre estos
anticuerpos y psicosis, pero recientes hallazgos
soportan fuertemente esta asociación. El lupus
cerebral, es un desorden heterogéneo con m ani­
festaciones locales y difusas, con la probable
presencia de autoanticueipos no solo ribosoma-
les sino de otros tipos como por ejemplo anti-
cardiolipina. Concluyendo, los anticuerpos an-
ti-ribosomales pueden ser de importancia para
el seguimiento de un grupo específico de lupus
cerebral.
6. CLONADO MOLECULAR
DE A UTO A N TÍG EN O S
Para los ensayos de inmunodifusión se utili­
zan mezclas crudas de antígenos provenientes
de tejidos (timo de conejo o bazo humano) o lí­
neas celulares. Estos ensayos generalmente son
de poca sensibilidad y no detectan todos los au­
toanticuerpos. Autoantígenos bioquímicamente
purificados pueden estar contaminados con tra­
zas de otros autoantígenos, particularm ente
cuando los mismos existen naturalmente como
complejos macromoleculares como ser RNP y
Sm o SS-A y SS-B.
En la actualidad existe ADN clonado de al­
gunos de los autoantígenos más importantes re­
lacionados con escleroderm ia, miositis y SS.
Estos incluyen (U l) RNP proteínas 70kD; las
proteínas Sm B /B ’, D, E y N; el autoantígeno
de la esclerodermia. Sel 70 y centrómero B; el
autoantígeno de la miositis Jo-1 y los autoantí­
genos de la SS, SS-B y tres de SS-A. Estos an­
tígenos clonados están siendo utilizados en en­
sayos de ELISA para detección de ANAs espe­
cíficos.
Teóricamente una preparación de un autoan­
tígeno obtenido por clonación puede garantizar
la pureza del mismo y por lo tanto eliminar fal­
sos positivos. Sin embargo experiencias in d i­
can que aíin existen problemas no resueltos en
el uso de autoantígenos recombinantes utiliza­
dos en técnicas de ELISA. Es muy frecuente el
reconocimiento de epitopes conformacionales,
especialm ente en el caso de anticuerpos anti-
RNP y SS-A que reaccionan sólo con antígenos
que presentan la estructura tridimensional nati­
va, por lo tanto no reconocerán antígenos re-
com binantes. En ensayos de inm unodifusión
que usan extractos crudos, están presentes los
autoantígenos en su estado nativo, por tal m oti­
vo, a pesar de ser una técnica poco sensible, se
sigue utihzando como control de los otros m é­
todos.
7. T R A T A M IE N T O DE LAS
ENFERMEDADES AUTOINM UNES
La mayor parte de la investigación básica y
aplicada que se realiza en las enfermedades au­
toinmunes está orientada a la inmunoterapia de
las mismas. La tolerancia inducida por aplica­
ción del antígeno específico puede ser utilizada
para prevenir la inducción de una enfermedad
autoinmune y para tratar un estado autoinmune
previamente establecido. Esto ha sido am plia­
mente utilizado en modelos experimentales. En
ratones SJL/ y en ratas Lewis la EAE, experi­
mentalmente inducida y donde se habían pro­
ducido fenómenos de parálisis, pudo ser total­
mente inhibida por aplicación de esplenocitos
u n id o s a h o m o g e n a to de c o rd ó n e s p in a l
(MSCH) y parcialmente inhibida si los espíe-
592 Inmunopatología
nocitos se unían a la proteína básica de mielina
(MBP), ya que la remisión observada en este
último caso fue temporal. Esto se podría expli­
car pensando que la inhibición se debería a la
aplicación de MBP y que las posteriores mani­
festaciones se podrían deber a otros neuroantí-
genos tales como el PLP (poli-lipoproteína),
MAG y MOG (glucoproteínas asociadas a la
mielina). Estos serían expuestos al sistema in­
mune periférico como consecuencia del daño
de la mielina y de la apertura de la barrera he-
matoencefálica por las linfocitos T CD4-t-, du­
rante el período agudo de la enfermedad. Se
puede pensar que estos son determinantes críp­
ticos y que son inhibidos por el MSCH ya que
tiene MBP y los otros neuropéptidos.
Un tratamiento que se está estudiando mu­
cho es la inducción de resistencia a la enferme­
dad por administración de dosis subpatogénicas
de células T autoinmunes (vacunación con lin­
focitos T). En estudios tem pranos la vacuna­
ción con linfocitos T fue obtenida utilizando
linfocitos T activados que se atenuaban por
irradiación, por presión hidrostática o por com­
puestos químicos. Estos métodos de atenuación
causan cambios cuahtativos en las células T y
aunque se administre un gran número de linfo­
citos T no se induce enfermedad. Se pudo ob­
servar que la vacunación con dosis bajas de lin­
focitos T anti-MBP activa las células T anti-
idiotipo de ambos fenotipos: CD4+ y CD8+. E s­
to también fue demostrado en pacientes con es­
clerosis múltiple.
Una estrategia muy utilizada en el tratamien­
to de enfermedades autoinmunes es la aplica­
ción de anticuerpos contra determinadas cito-
quinas. En algunas enfermedades como la artri­
tis reum atoidea hay citoquinas consideradas
pro-inflamatorias en la articulación reum atoi­
dea, entre las que se incluyen del TNE-a, IL-1,
IL-6, IL-8 y el GM-CSF. Estas citoquinas ac­
tuarían en cascada y la estrategia inmunotera-
péutica es tratar de bloquear alguna de las cito-
quinas para evitar el efecto de todas ellas. Un
tratamiento muy utilizado es la aplicación de
anticuerpos contra el T N F-a en algunos casos
asociado a anticuerpos anti-IL-10 o anti-CD4
para lograr una acción sinérgica.
B IB L IO G R A F ÍA
1. A m a sak i Y ., K o b a y a sh i J., T a k e d a T ., O g u ra N ., Jo d o
S., N a k a b a y a s h i T ., T s u tsu m i A ., F u jis a k u A , a n d K o i-
re T. U p -re g u ia te d e x p re s ió n o f F a s a n tig e n (C D 9 5 ) by
pe rip h e ra l n a ív e an d in e m o ry T ceí) .subsets in p a tie n ts
w itii s y s te m ic lu p u s e ry th e m a to s iis (S L E ), a p o s s ib le
m e e h a n ism fo r ly m p h o p e n ia . C lin . E x p . Im m u n o l. 99:
2 4 5 -2 5 0 , 1995.
2, B e r n s te in K .A ., B o ls h o u n D . a n d L e fk o w ith . S e ru m
g lo m e ru la r b in d in g a c tiv ity is h ig ly c o rre la te d w ith r e ­
n a l disea.se in M R L /lp r m ic e . C lin .E x p . T tninunol. 9 3 :
4 1 8 -4 2 3 , 1993.
3, D ia m o n d B . a n d S o lo m o n . A m o n o c lo n a l a m ib o d y re-
c o g n iz e s a n ti- D N A a n ti b o d i e s w ith s y s te m ic lu p u s
e r y t h e m a t o s u s . A n n . N Y . A c á . S c i. 4 1 8 : 3 7 9 - 3 8 5 ,
1983.
4, G a r c ía L e rn a J .G .; S e q u í N a v a rro J. y V e la O lm o C .
C a ra c te rís tic a s m o le c u la re s d e los a u to a n tíg e n o s S S A /
R o , S S B /L a y n R N P (S m y U 1 R N P ). I m u n o lo g ía .
1 3 :8 5 -1 0 1 , 1994,
5, tta r r is E, N . a n d P ie ra n g e li S. A n tip h o sfo lip id a n tib o ­
d ie s a n d th e a n tip h o s p h o lip id s y n d ro tn e , S p in , S e m ,
Im m u n o p th , 1 6 :2 2 3 -2 4 5 , 1994,
6, J e n e w a y , C h a rle s A , Jr. a n d T ra v e rs Paul, Im m u n o b io -
lo g y , T h e im m u n e s y s te m in h e a lth a n d d ise a s e , C u ­
rre n t B io io g y G a rla n d , 1994.
7, K u b y J a n is , I m m u n o lo g y , W , H, F re e m a n an d C o ra -
p a n y , N e w Y o rk , 1992,
8, IVIargni R ic a rd o A , Im n u n o lo g ía e In m u n o tiu ím ic a , 4 a,
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9, M c N e il H ,P ,, C h e s te rm a n C . N , a n d K rilis S ,A , Im m u -
n o lo g y an d c lin ica l itn p o rta n c e o f a n tip h o s p h o lip id a n ­
tib o d ie s. A d v Im m n u n o l, 4 9 : 19 3 -2 8 0 , 1991,
10, M e ilo f J E, A u to a n tib o d ie s a g a in s t s m a ll c y to p la s m ic
rib o n u c le o p ro te in s : th e a n ti-R o /S S -A a n ti-L a /S S -B au -
to im m u n e re s p o n s e , R h e u to m a to l, In t. 12: 1 2 9 -1 4 0 ,
1992.
1 1, N a p a rs te k Y , a n d P ltz P, T h e ro le o f a u to a n tib o d ie s in
a u to im m u n e d ise a s e , A n n , R e v , Im m u n o l. 1 1 :7 9 -1 0 4 ,
1993,
12, P a u l W illia m , F u n d a m e n ta l Im m u n o lo g y , T h ird E d i-
tio n , R a v e n P re ss. 1993,
13, P ro v o s t T. a n d W e sto n W . B u llo u s d ise a se s. F irs t E d i-
tio n . M o s b y Y e a r B o o k , 1993.
14, R o k e a c h L an d H o c h S, B -c e ll e p ito p e s o f S m a u to a n ti-
g e n s. M o l, B io l, R ep , 1 6 :1 6 5 -1 7 4 , 1992,
15, S ilb e rste in L. E ., J e ffrie s L, C ,, G o ld m a n J,, F rie d m a n
D ,, M o o re J.S ,, a n d N o w e ll P ,C . V a ria b le r e g ió n g e n e
a n a ly s is o f p a th o lo g ic h u m an a u to a n tib o d ie s to th e r e la ­
te d i a n d I red b lo o d c e ll a n tig e n s , B lo o d , 7 8 :2 3 7 2 -
2 3 8 6 , 1991.
16, S in g e r K, H ., H a s h im o to K „ J e n se n P ,J,, a n d M o rio k a
S, P a th o g e n e s is o f a u to im m u n ity in p e m p h ig u s , A n n ,
R e v , Im m u n o l. 3 :8 7 - 1 0 3 , 1985.
17, S o n th e iin e r R .D ,, M c C a u liffe D ,P , Z a p p i E, a n d T a r -
g o ff I. A n tin u c le a r a n tib o d ies: C lin ic a l c o rre la tio n s an d
b io lo g ic s ig n ific a n c e , A d v , D e rm a to l, 7: 3 -5 3 , 1 9 9 L
18, S tu rg e s s A . R e c e n tly c h a ra c te riz e d a u to a n tib o d ie s an d
th e ir c lin ica l s ig n ific a n c e , A u st, N ,Z , J M e d , 22: 2 7 9 -
2 8 9 , 1992,
19, T a la l N o r m a n , M o le c u la r A u to im m u n ity , A c a d e m ic
P re ss, 1991,
2 0, T h e o filo p o u lo s A ,N , T h e b a sis o f a u to im m u n ity , P a rt I,
Im m u n o l, T o d a y 16: 9 0 -9 8 , 1995,
2 1, T h e o filo p o u lo s A ,N . T h e b a s is o f a u to im m u n ity . P a rt
II, Im m u n o l, T o d a y 16: 15 0 -1 5 8 , 1995,
2 2, V e r h e ije n R , B - c e ll e p ito p e s o f s c le r o d e r m a - s p e c if ic
a u to a n tig e n s. M o l. B io l, R e p , 16: 1 8 3 -1 8 9 , 1992,
2 3, U y td e h a a g F ,, V a n d e r H e y d e n R, a n d O s te rh a u s A ,
M a in te n a n c e o f im m u n o lo g ic a l m em o ry : rol fo r C D 5*
c e lls? im m u n o l. T o d a y . 12: 4 3 9 -4 4 1 , 1991,
2 4, Y a n n i G ., W h e la n A ,, F e ig h re y C ,, Q u in la n W ,, S y -
mon.s J,, D u f f G , a n d B re s n ih a m B, Contrasúng le v e ls
o f in v itro c y to k in e p ro d u c tio n b y r h e u m a to id s y n o v ia l
tis s u e s d e m o s tra tin g d iffe re n t p a tte rn s o f m o n o n u c le a r
ce ll in filtratio n . C lin , E x p , Im m u n o l, 9 3 :3 8 7 -3 9 5 , 1993,
2 5, Z a p p i E . a n d S o n th e im e r R ,D . C lin ic a l re le v a n c e o f a n ­
tib o d ie s to R o /S S - A a n d L a /S S - B in s u b a c u te c u ta -
n e o u s lu p u s e ry th e m a to s u s a n d re la te d c o n d itio n s. C lin ,
D e rm a to l. 1 0 :4 3 1 -4 4 1 , 1993,
 Estructura y función del complejo
mayor de histocompatibilidad
M. LEONARDO SATZ
LEONARDO FAINBOIM
Antecedentes históricos
Como hemos visto en el capítulo 10, las mo-
. léculas de histocompatibilidad (MHC) cumplen
un papel crucial en la presentación de antíge­
nos para la activación de las células T. Sin em ­
bargo, la secuencia de sucesos que condujeron
a este descubrimiento estuvieron enmascarados
por su “seudo función”, que es la de servir co­
mo barrera principal al trasplante de órganos y
tejidos.
La disponibilidad de cepas endocriadas faci­
litó el rápido conocimiento del complejo mayor
de histocompatibilidad (CMH) murino o H-2.
En el caso del CMH humano, denominado sis­
tema HLA, la situación fue diferente. A partir
del descubrimiento de las moléculas HLA, los
estudios de genética de población fueron los
que permitieron definir el polimorfismo del sis­
tema.
El primer antígeno HLA fue descubierto en
1958. Dausset identificó en el suero de un pa­
ciente politransfundido, anticuerpos leucoaglu-
tinantes, cuyo patrón de reactividad perm itió
identificar el antígeno denominado Mac. Este
antígeno corresponde al hoy conocido com o
HLA-2. En el mismo año 1958, los laboratorios
de Payne y van Rood, comprobaron que m uje­
res con em barazos miiltiples producían an ti­
cuerpos contra aloantígenos del padre expresa­
dos codom inantem ente por el feto. En 1963,
van Rood y van Leeuwen describen el “sistema
4 ” , form ado por 2 alelos, el 4a y el 4b. En
1964, Payne y col. describen una serie de antí­
genos denominados LA. Esta serie LA y el sis­
tema 4 corresponden a los loci hoy conocidos
como HLA-A y HLA-B, respectivamente.
El paso sig u ien te que p rovocó el ráp id o
avance en el conocim iento del HLA fue la
29
creación de los Talleres Internacionales de H is­
tocompatibilidad. En ellos, cientos de laborato­
rios intercambian reactivos (células, anticuer­
pos, etc.) y realizan estudios colaborativos con
protocolos estandarizados, que permiten identi­
ficar nuevos alelos HLA. El primero de ellos se
realizó en Durham en 1964, el XI en Y okcha­
ma en 1991 y se trabaja actualmente p a ra el
XII Taller, que finalizará en 1996.
Estructura y distribución de las moléculas
de histocompatibilidad
M oléculas de clase I
Estructura: Tal como se escribió en el capí­
tulo 10, las MHC de clase I están constituidas
por dos cadenas, una pesada, a , unida no cova­
lentemente a una cadena llamada }32Tmicroglo-
bulina. Sólo la cadena a está codificada dentro
del sistema HLA.
Productos de clase 1. En el hombre existen
tres M HC de clase I distintas, denom inadas
HLA-A, HLA-B y HLA-C, que cumplen la fun­
ción de presentación de péptidos a los linfoci­
tos T CD8. Las tres se expresan sim ultánea­
mente en la superficie de casi todas las células,
con excepción de los glóbulos rojos y el sinci­
tio trofoblasto. Estas moléculas poseen diferen­
tes cadenas pesadas pero comparten la mism a
cadena-p2 microglobulina. Las cadenas están
codificadas por sendos loci A, B y C localiza­
dos dentro del sistema HLA (fig. 29-1).
Una de las características más salientes de
estas moléculas es su enorme polimorfismo po-
hlacional. Se estima que existen más de 40 ale­
los distintos para la molécula HLA-A, m ás de
80 alelos diferentes para HLA -B y más de 30
para HLA-C. Teniendo en cuenta que la expre-
592 Inmunopatología
nocitos se unían a la proteína básica de mielina
(MBP), ya que la remisión observada en este
último caso fue temporal. Esto se podría expli­
car pensando que la inhibición se debería a la
aplicación de MBP y que las posteriores mani­
festaciones se podrían deber a otros neuroantí-
genos tales como el PLP (poli-lipoproteína),
MAG y MOG (glucoproteínás asociadas a la
mielina). Estos serían expuestos al sistema in­
mune periférico como consecuencia del daño
de la mielina y de la apertura de la barrera he-
matoencefálica por las linfocitos T CD4-t-, du­
rante el período agudo de la enfermedad. Se
puede pensar que estos son determinantes críp­
ticos y que son inhibidos por el MSCH ya que
tiene MBP y los otros neuropéptidos.
Un tratamiento que se está estudiando mu­
cho es la inducción de resistencia a la enferme­
dad por administración de dosis subpatogénicas
de células T autoinmunes (vacunación con lin­
focitos T). En estudios tem pranos la vacuna­
ción con linfocitos T fue obtenida utilizando
linfocitos T activados que se atenuaban por
irradiación, por presión hidrostática o por com­
puestos químicos. Estos métodos de atenuación
causan cambios cuahtativos en las células T y
aunque se administre un gran número de linfo­
citos T no se induce enfermedad. Se pudo ob­
servar que la vacunación con dosis bajas de lin­
focitos T anti-MBP activa las células T anti-
idiotipo de ambos fenotipos: CD4+ y CD8+. E s­
to también fue demostrado en pacientes con es­
clerosis múltiple.
Una estrategia muy utilizada en el tratamien­
to de enfermedades autoinmunes es la aplica­
ción de anticuerpos contra determinadas cito-
quinas. En algunas enfermedades como la artri­
tis reum atoidea hay citoquinas consideradas
pro-inflamatorias en la articulación reum atoi­
dea, entre las que se incluyen del TN F-a, IL-1,
IL-6, IL-8 y el GM-CSF. Estas citoquinas ac­
tuarían en cascada y la estrategia inmunotera-
péutica es tratar de bloquear alguna de las cito-
quinas para evitar el efecto de todas ellas. Un
tratamiento muy utilizado es la aplicación de
anticuerpos contra el T N F-a en algunos casos
asociado a anticuerpos anti-IL-10 o anti-CD4
para lograr una acción sinérgica.
B IB L IO G R A F ÍA
L A m a sak i Y ., K o b a y a sh i J., T alceda T ., O g u ra N ., Jo d o
S., N a lía b a y a s h i T ., T s u tsu m i A ., F u jis a k u A , a n d K o i-
re T. U p -re g u ia te d e x p re s ió n o f F a s a n tig e n (C D 9 5 ) by
pe rip h e ra l n a ív e an d in e m o ry T caí) .subsets in p a tie n ts
w itii s y s te m ic lu p u s e ry th e m a fo s u s (S L E ), a p o s s ib le
m e c h a n ism fo r ly m p h o p e n ia . C lin . E x p . Im m u n o l. 99:
2 4 5 -2 5 0 , 1995.
2. B e r n s te in K .A ., B o ls h o u n D . a n d L e fk o w ith . S e ru m
g lo m e ru la r b in d in g a c tiv ity is h ig ly c o rre la te d w ith r e ­
n a l d ise a s e in M R L /lp r m ic e . C lin .E x p . IiTiinunol. 9 3 :
4 1 8 -4 2 3 , 1993.
3. D ia m o n d B . a n d S o lo m o n . A m o n o c lo n a l a n tib o d y re-
c o g n iz e s a n ti- D N A a n ti b o d i e s w ith s y s te m ic lu p u s
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1983.
4. G a r c ía L e rn a J .G .; S e q u í N a v a rro J. y V e la O lm o C .
C a ra c te rís tic a s m o le c u la re s d e los a u to a n tíg e n o s S S A /
R o , S S B /L a y n R N P (S m y U 1 R N P ). I m u n o lo g ía .
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5. Flarris E. N . a n d P ie ra n g e li S. A n tip h o sfo lip id a n tib o ­
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10. M e ilo f J E. A u to a n tib o d ie s a g a in s t s m a ll c y to p la s in ic
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12. P a u l W illia m . F u n d a m e n ta l Im m u n o lo g y . T h ird E d i ­
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14. R o k e a c h L an d H o c h S, B -c e ll e p ito p e s o f S m a u to a n ti-
g e n s. M o l, B io l, R ep , 1 6 :1 6 5 -1 7 4 , 1992,
15. S ilb e rste in L, E ., J e ffrie s L. C ., G o ld m a n J., F rie d m a n
D ., M o o re J.S ., a n d N o w e ll P .C . V a ria b le r e g ió n g e n e
a n a ly s is o f p a th o lo g ic h u m an a u to a n tib o d ie s to th e r e la ­
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2 3 8 6 , 1991,
16. S in g e r K, H ., H a s h im o to K „ J e n se n P .J., a n d M o rio k a
S. P a th o g e n e s is o f a u to im m u n ity in p e m p h ig u s . A n n .
R e v . Im m u n o l, 3 :8 7 - 1 0 3 , 1985,
17. S o n th e iin e r R ,D ,, M c C a u liffe D ,P , Z a p p i E, a n d T a r -
g o f f I, A n tin u c le a r a n tib o d ies: C lin ic a l c o rre la tio n s an d
b io lo g ic s ig n ific a n c e . A d v , D e rm a to l, 7: 3 -5 3 , 1 9 9 L
18. S tu rg e s s A , R e c e n tly c h a ra c te riz e d a u to a n tib o d ie s an d
th e ir c lin ica l s ig n ific a n c e , A u st, N ,Z , J M e d , 22: 2 7 9 -
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2 2. V e r h e ije n R , B - c e ll e p ito p e s o f s c le r o d e r m a - s p e c if ic
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2 3. U y td e h a a g F ., V a n d e r H e y d e n R. a n d O s te rh a u s A .
M a in te n a n c e o f im m u n o lo g ic a l m em o ry : rol fo r C D 5*
c e lls? im m u n o l. T o d a y . 12: 4 3 9 -4 4 1 , 1991.
2 4. Y a n n i G ., W h e la n A ., F e ig h re y C ., Q u in la n W ., S y -
m o n s J., D u f f G . a n d B re s n ih a m B. C o n tra s tin g le v e ls
o f in v itro c y to k in e p ro d u c tio n b y r h e u m a to id s y n o v ia l
tis s u e s d e m o s tra tin g d iffe re n t p a tte rn s o f m o n o n u c le a r
ce ll in filtratio n . C lin . E x p . Im m u n o l, 9 3 :3 8 7 -3 9 5 , 1993,
2 5. Z a p p i E , a n d S o n th e im e r R .D , C lin ic a l re le v a n c e o f a n ­
tib o d ie s to R o /S S - A a n d L a /S S - B in s u b a c u te e u ta -
n e o u s lu p u s e ry th e m a to s u s a n d re la te d c o n d itio n s. C lin ,
D e rm a to l, 1 0 :4 3 1 -4 4 1 , 1993,
 Estructura y función del complejo
mayor de histocompatibilidad
M. LEONARDO SATZ
LEONARDO FAINBOIM
Antecedentes históricos
Como hemos visto en el capítulo 10, las mo-
. léculas de histocompatibilidad (MHC) cumplen
un papel crucial en la presentación de antíge­
nos para la activación de las células T. Sin em ­
bargo, la secuencia de sucesos que condujeron
a este descubrimiento estuvieron enmascarados
por su “seudo función”, que es la de servir co­
mo barrera principal al trasplante de órganos y
tejidos.
La disponibilidad de cepas endocriadas faci­
litó el rápido conocimiento del complejo mayor
de histocompatibilidad (CMH) murino o H-2.
En el caso del CMH humano, denominado sis­
tema HLA, la situación fue diferente. A partir
del descubrimiento de las moléculas HLA, los
estudios de genética de población fueron los
que permitieron definir el polimorfismo del sis­
tema.
El primer antígeno HLA fue descubierto en
1958. Dausset identificó en el suero de un pa­
ciente politransfundido, anticuerpos leucoaglu-
tinantes, cuyo patrón de reactividad perm itió
identificar el antígeno denominado Mac. Este
antígeno corresponde al hoy conocido com o
HLA-2. En el mismo año 1958, los laboratorios
de Payne y van Rood, comprobaron que m uje­
res con em barazos m últiples producían an ti­
cuerpos contra aloantígenos del padre expresa­
dos codom inantem ente por el feto. En 1963,
van Rood y van Leeuwen describen el “sistema
4 ” , form ado por 2 alelos, el 4a y el 4b. En
1964, Payne y col. describen una serie de antí­
genos denominados LA. Esta serie LA y el sis­
tema 4 corresponden a los loci hoy conocidos
como HLA-A y HLA-B, respectivamente.
El paso sig u ien te que p rovocó el ráp id o
avance en el conocim iento del HLA fue la
29
creación de los Talleres Internacionales de H is­
tocompatibilidad. En ellos, cientos de laborato­
rios intercambian reactivos (células, anticuer­
pos, etc.) y realizan estudios colaborativos con
protocolos estandarizados, que permiten identi­
ficar nuevos alelos HLA. El primero de ellos se
realizó en Durham en 1964, el XI en Yok cha­
ma en 1991 y se trabaja actualmente p a ra el
XII Taller, que finalizará en 1996.
Estructura y distribución de las moléculas
de histocompatibilidad
M oléculas de clase I
Estructura: Tal como se escribió en el capí­
tulo 10, las MHC de clase I están constituidas
por dos cadenas, una pesada, a , unida no cova­
lentemente a una cadena llamada }32Tmicroglo-
bulina. Sólo la cadena a está codificada dentro
del sistema HLA.
Productos de clase 1. En el hombre existen
tres M HC de clase I distintas, denom inadas
HLA-A, HLA-B y HLA-C, que cumplen la fun­
ción de presentación de péptidos a los linfoci­
tos T CD8. Las tres se expresan sim ultánea­
mente en la superficie de casi todas las células,
con excepción de los glóbulos rojos y el sinci­
tio trofoblasto. Estas moléculas poseen diferen­
tes cadenas pesadas pero comparten la mism a
cadena-p2 microglobulina. Las cadenas están
codificadas por sendos loci A, B y C localiza­
dos dentro del sistema HLA (fig. 29-1).
Una de las características más salientes de
estas moléculas es su enorme polimorfismo po-
hlacional. Se estima que existen más de 40 ale­
los distintos para la molécula HLA-A, m ás de
80 alelos diferentes para HLA-B y más de 30
para HLA-C. Teniendo en cuenta que la expre-
594 Inmunopatología

Clase I Clase I

DP DQ DR
I I
—>
OJ
<
CVJ
Centrómero _J << CQ < CD < ^
o Q . D- cc cr I - T - Li-
-«S----------- ü Q Q o Q C\j CNJ CD < CD

1.000 CD <
OJ 2.000
OO Ü

Distancia (kb)

Clase I

A H G F
Telémetro
----------►

2000 3000 4000

Distancia (kb)

F ig , 2 9 -1 . O rg a n iz a c ió n g e n é tic a d e l s is te m a H L A . S e in d ic a n las re g io n e s d e c la s e L II y III. E n la re g ió n d e c la s e I, v e ­

c in o s al lo c u s H L A -A e x is te n s e u d o g e n e s d e c la s e I n o m o stra d o s . E n la r e g ió n d e c la s e 111, el g e n G 7 a c o d ific a p a ra v a lil-
t-R N A s in te ta sa . L a c o m p le jid a d d e la r e g ió n d e c la s e II (re fe rid o a g e n e s D R B ) v a ría s e g ú n el h a p lo tip o (v é a s e fig . 2 9 -2 ).
L a s fle c h a s s o b re c a d a g e n in d ic a n la o rie n ta c ió n d e tra n s c rip c ió n 5 ’ - ^ 3 ’.

sión de estas moléculas es codominante (vale tes de las moléculas HLA, a las que se llama
decir se expresan simultáneamente las molécu­ “especificidades serológicas”.
las codificadas por el crom osom a m aterno y Nótese en el cuadro 29-1 que las distintas es­
paterno), el multialelismo determina que la ma­ pecificidades serológicas HLA-A y HLA-B son
yoría de los individuos sean heterocigotas y ex­ d esig n ad as por n úm eros, por ej. H LA -A 1,
hiban en la superficie celular seis productos de HLA-B7, etc. Todas las especificidades del lo­
clase I diferentes: dos moléculas HLA-A, dos cus HLA-C se numeran consecutivamente e in­
HLA-B y dos HLA-C. cluyen una “w ” para distinguirlos de los pro­
Polimorfism o. El principal método que ha ductos C2 y C4 del sistema complemento, cu­
permitido la identificación de las diversas va­ yos genes m apean dentro del sistem a HLA
riantes alélicas ha sido la serología, esto es, la (véase más adelante).
identificación en estas m oléculas de epitopes Además de los métodos serológicos, los pro­
diferentes por medio de anticuerpos. Las MHC ductos aléhcos de las moléculas HLA pueden
de clase 1, independientemente del alelo o del ser distinguidos por otros métodos: clones de
locus al que pertenecen, poseen una gran ho­ linfocitos T citotóxicos, isolectroenfoque de las
mología estructural. Esto determina la existen­ proteínas, patrones de restricción en el ADN
cia de numerosos epitopes comunes en las di­ (RFLP) y secuencia nucleotídica de los genes
versas m oléculas; debido a esta reactividad aislados. Esto ha revelado la existencia de ale­
cruzada, al comienzo resultó difícil distinguir los no distinguibles por serología: por ejemplo
los productos aléhcos derivados de un mismo existen trece subtipos del HLA-A2, ocho va­
locus, de los codificados por los diversos loci riantes alélicas del HLA-B27, etc. La determi­
A,B y C. nación de la secuencia nucleotídica de los res­
Los aloanticuerpos presentes en el suero de pectivos genes demostró que las diversas va­
individuos politransfundidos y en mujeres lue­ riantes difieren entre sí en unos pocos aminoá­
go de múltiples embarazos siguen siendo utili­ cidos, lo que exphca la dificultad de distinguir­
zados hoy para identificar a las diversas varian­ los por anticuerpos.
 Estructura y función del complejo mayor de histocompatibilidad 595

La presencia de estos verdaderos nuevos ale­ se refieren a la especificidad serológica original

los HLA de clase I, indica que la serología re­
fleja la “punta de un iceberg” de un sistema de
mucha mayor complejidad. La posibilidad de
distinguir estos alelos por linfocitos T CD8, in­
dica que se detectan diferencias en residuos que
juegan un papel importante en la funcionalidad
de estas moléculas; esto tiene implicaciones clí­
nicas, ya que se pueden generar respuestas in­
munes indeseadas contra dichos alelos en el ca­
so de trasplante de órganos. El Comité de N o­
menclatura de la O.M.S. para el Sistema HLA
ha decidido asignar la categoría de alelo HLA a
aquel de cuyo gen se conoce la secuencia nu-
cleotídica. A estos verdaderos alelos se les asig­
na la letra del locus correspondiente seguido de
un asterisco (ej. HLA-B*) y luego un número
de tres o cuatro dígitos, donde los primeros dos
y los otros dos al número de variante hallada.
Por ejemplo: HLA-B*3501 se refiere a la pri­
mer variante HLA-B35 (véase cuadro 29-1).
Se conoce la secuencia aminoacídica de más
de 130 moléculas HLA de clase I distintas. To­
das ellas poseen una homología global de apro­
xim adam ente el 75-99% en su secuencia. La
mayor variabilidad se observa en los dominios
1 y 2, con diferencias de 7-15 residuos de los
90 que posee cada dominio, mientras que el do­
minio 3 (que interactúa con la p2-microglobuli-
na) es el más conservado. En los dominios 1 y
2 hay 20 posiciones de gran variabilidad entre
las distintas moléculas. La estructura cristalo­
g ráfica de los alelos H LA -A 2, H LA -A 68 y
HLA-B27, muestra que la mayor parte de estos
residuos variables están localizados en regiones

C uadro 29-1. Designación de los alelos HLA de clase I

Alelos Especif. A lelos Especif. Alelos E.specif.

HLA-A serológica H LA -B serológica H LA -C sero ló g ic

A*010l al 0102 Al B *0701 al 0 7 0 4 B7 C w *010l al 0102 Cwl

A *0201 al 021 3 A2 B * 0 8 0 1 al 0 8 0 2 B8 C w *020l al 0202 Cw2
A*0301 al 0302 A3 B * 1 3 0 l al 1 302 B13 C w *0301 al 0304 Cw3
A *1101 al 1102 AH B*1401 B I4 C w *040l al 0402 Cw4
A *2301 A 2 3 (9 ) B*1402 B 6 5 (I4 ) C w *050l Cw5
A *2401 al 240 3 A 2 4 (9 ) B n50I B 6 2 (1 5 ) Cw *0601 al 0602 Cw6
A *2501 A 2 5 (1 0 ) B *1502 B 7 5 (1 5 ) C w *0701 al 0703 Cw7
A *2601 al 2 6 0 4 A 2 6 (1 0 ) B *1503 B 7 2 (7 0 ) C w *080l al 0803 Cw8
A *2901 al 2 9 0 2 A 2 9 (1 9 ) B* 1 5 0 4 al 1508 B 6 2 (I5 ) C w * l2 0 l al 1203 —

A *3001 al 3003 A 3 0 (1 9 ) B*1509 B 70 Cw *130l —

B*1510 B 71 C w * l4 0 l al 140 2 —
A *3101 A 3 1 (1 9 )
A *3201 A 3 2 (1 9 ) B * 1 5 l1 B 15 C w * l5 0 1 al 1504 —

B * 1 5 1 2 y 1514 B 76(1.5) C w * l6 0 l al 160 2 —

A *3301 al 3 3 0 2 A 3 3 (1 9 )
B*1513 B 7 7 (I5 ) C w *170l . —
A*3401 al 3 4 0 2 A 3 4 (1 0 )
A *3601 A 36 B *1801 al 1 8 0 2 B18
A *4301 A43 B * 2 7 0 1 al 2 7 0 8 B 27
A *6 6 0 1 al 6 6 0 2 A 6 6 (1 0 ) B * 3 5 0 1 al 3 5 0 8 B 35
A *680) al 6 8 0 2 A 6 8 (2 8 ) B *3701 B 37
A *6901 A 6 9 (2 8 ) B *3801 8 3 8 (1 6 )
A *7401 A 7 4 (1 9 ) B * 3 9 0 1 al 3 9 0 4 839
A *8001 — B * 4 0 0 1 al 4 0 0 6 840
B *4101 841
B*4201 B42
B *4401 al 4 4 0 4 8 4 4 (1 2 )
B*4501 B 4 5 (1 2 )
B *4601 846
B *4701 847
B * 4 8 0 1 al 4 8 0 2 848
B *4901 8 4 9 (2 1 )
B*5001 B 5 0 (2 1 )
B * 5 I0 1 al 5 1 0 5 8 5 1 (5 )
B *5201 8 5 2 (5 )
B *5301 853
B *5401 8 5 4 (2 2 )
B*5.501 al 5 5 0 2 8 5 5 (2 2 )
B * 5 6 0 1 al 5 6 0 2 8 5 6 (2 2 )
B * 5 7 0 1 al 5 7 0 2 B 5 7 (1 7 )
B *5801 8 5 8 (1 7 )
B *5901 859
B *6701 867
B*7301 873
B *7801 B 7801

El listad o se b asa en la últim a p u b licac ió n del C om ité d e N o m en c latu ra de la Q M S para factores d e l siste m a H L A (1994) y a ig u n o s nucvos
' e s p e cificid
alelos to m ad o s de la lite ratu ra m ás re cien te. En las ific id aa d e s sero ló g ic as, se indica entre parén tesis la e s p e cificid ad am plia o rig in a l.
596 Inmunopatología

de la molécula que son críticas en la unión de fieren entre sí en sólo 13 aminoácidos, 6 locali­
péptidos antigénicos o en la interacción con el zados en el dominio 1, 6 en 2 y uno en 3. Cuan­
receptor T (ver más adelante). do se comparan las estructuras tridimensionales
En los dominios externos (1, 2 y 3), se han de estas dos moléculas se observa que 10 de es­
identificado 183 residuos conservados entre las tas sustituciones están concentradas en la base y
distintas m oléculas HLA-A,B y C, m ientras lados de la fosa de presentación; por las diferen­
que sólo 6 aminoácidos muestran un patrón es­ cias de tamaño y polaridad de los aminoácidos,
pecífico de cada locus: las metioninas 138 y estos cambios afectan profundamente el tipo de
189 son específicas del locus A, la arginina 239 péptidos que uniría uno y otro alelo de clase L
es específica del locus B y la valina 52 y glutá­ Esto fue confirmado por los estudios que eluye-
m ico 183 y 268 son específicos del locus C. ron y caracterizaron los péptidos unidos a los
Este tipo de análisis ha perm itido tam bién la diversos alelos HLA de clase I.
identificación de los residuos involucrados en
epitopes comunes a varias moléculas de clase I, Ligandos peptídicos de las MHC de clase I
como los llamados epitopes supertípicos Bw4 y
Bw6. Se demostró que los aminoácidos presen­ M ediante m étodos bioquím icos ya se han
tes en las posiciones 79, 80 y 83 son críticos en analizado los ligandos peptídicos de más de
la definición de estos dos epitopes. Bw4 y Bw6 diez alelos de clase I diferentes (cuadro 29-2).
están presentes en todos los alelos del locus B Al igual que en otras especies, las MHC extraí­
y en algunos alelos del locus HLA-A. das de células no infectadas, poseen en su sitio
de unión péptidos derivados de proteínas celula­
Estructura tridimensional res. El 80% de los péptidos eluidos son de 8-9
residuos y el 20% restante pueden ser más lar­
Como hemos visto en el capítulo 10, en los gos (hasta 10-12 aminoácidos). Los péptidos
últimos cinco años se ha determinado la estruc­ unidos a cada alelo HLA poseen patrones o mo­
tura cristalográfica de los alelos de clase I tivos estructurales conservados, que definen las
H LA-A2, HLA-A68 y HLA-B27 humanos y características de los residuos que interactúan
varios alelos murinos. Los dominios 1 y 2 se firmemente con los bolsillos del sitio de presen­
combinan para ensamblar una estructura de tipo tación. El cuadro 29-2 muestra los motivos es­
fo sa acanalada, localizada en la porción más tructurales conservados de los péptidos especí­
externa de la molécula, y que constituye el sitio ficos para diversas MHC clase I humanas. Con­
de unión de péptidos. HLA-A2 y HLA-A68 di­ siderando la flexibilidad que permiten ciertas

Cuadro 29-2. Residuos aminoacídicos críticos hallados en péptidos específicos de ciertos alelos
HLA de clase I
PO SICIÓ N:

A lelo de clase I: P2 P3 P51P6 P9

H L A - A 1 (A * 0 1 0 1 ) T /S /M D /E Y
H L A -A 2 (A * 0 2 0 1 ) L /M V /L /I/A /M /T
H L A -A 3 (A * 0 3 0 1 ) L /M /V /I F R /K /Y /H /F /A
H L A - A l l (A * 1 1 0 1 ) V /T /M /L /I K /R /F I/Y
H L A -A 2 4 (A * 2 4 0 1 ) Y /F/W /M L / F /I / W
H L A -A 3 3 (A * 3 3 0 1 ) A /I/L R
H L A -A 6 8 (A * 6 8 0 1 ) V /T R /K

H L A -B 7 (B * 0 7 0 1 )
H L A -B 2 7 (B * 2 7 0 5 )
H L A -B 3 5 (B * 3 5 0 1 )
H L A -B 3 7 (B * 3 7 0 1 )
H L A -B 5 1 (B * 5 1 0 1 )
H L A -B 5 3 (B * 5 3 0 1 )
P R /K L /I/A
R L /I/V R /K /tV l/V /M
P Y /F /W
D /E L /I/M /F
F V /L V/L/I
P L /I/V /M

H L A -C w 4 (C w * 0 4 0 1 ) Y /P NUIL L/F/M
H L A -C w 6 (C w * 0 6 0 2 ) L/I/V L
H L A -C w 7 (C w * 0 7 0 2 ) Y /P V/I/Y Y
H L A -C w 3 (C w * 0 3 ()l) V F L

P l (p o sició n 1) in d ica el p rim er a m in o ác id o del p ép tid o y c o rresp o n d e al ex tre m o N -term inal. P9 co rresp o n d e al ex tre m o C -term in al. P ara
los alelo s in d icad o s con (*), u n 20% d e los p é p tid o s elu id o s son de 10-12 am in o ác id o s de lai'go; en estos ca so s, se o b serv a el m ism o residuo
esp e cífico en la P 1 0 -P 1 2 , en lu g ar d e P 9. L o s am in o ác id o s se in d ican p o r el có d ig o d e una letra y lo s m arc ad o s en n eg rita se co n sid eran
re sid u o s d o m in an tes o d e an claje; los otros son a m in o ác id o s m uy frecu e n tem en te h allad o s en esa p o sició n .
 Estructura y función del complejo m ayor de histocompatibilidad
posiciones de los péptidos, resulta claro que un
alelo HLA dado tendrá la capacidad de unir
múltiples péptidos (se refiere a uno por vez).
Ya hemos mencionado que estos péptidos se
ensamblan con la cadena pesada y la (32-micro-
globulina como un heterotrím ero, durante la
síntesis en el retículo endoplasmático rugoso.
M oléculas de clase II
E stru ctu ra . T am bién son g lucoproteínas
transmembránicas de tipo I, constituidas por un
heterodímero, con una cadena a de 229 am i­
noácidos (32-34 kD) y una p de 237 aminoáci­
dos (28-29 kD ), unidas no covalen tem en te
(véase cap. 10). Cada cadena posee dos dom i­
nios globulares externos, con puentes disulfuro
intracatenarios en ambos dominios de la cade­
na p y en el dominio más próximo a la m em ­
brana en la cadena a.
Recuérdese que durante su síntesis y trans­
porte intracelular, el dímero a P se halla asocia­
do a una cadena de 31 kD llamada cadena in­
variante, (li) codificada genéticamente fuera
del sistema HLA. El complejo a p li, m igra a
través del Golgi y luego hacia endosomas, en
donde el pH ácido y ciertas proteasas liberan la
cadena li y permiten la unión de péptidos gene­
rados por la vía exógena de procesamiento y
presentación antigénica (véase cap. 2).
Distribución. Las moléculas de clase II po­
seen una distribución tisular muy restringida,
expresándose constitutivamente en la superfi­
cie de linfocitos B, monocitos, células dendrífi-
cas, precursores eritroides, células de Langer­
hans, epitelio tímico, células de Kupffer y lin­
focitos T activados. Su expresión puede indu­
cirse por la acción de interferón gama en linfo­
citos T, células NK, células del endotelio vas­
cular, queratinocitos, melanocitos, astrocitos y
fibroblastos. También se los halla en la superfi­
cie de células tumorales, en leucemias, linfo­
mas, melanomas, carcinomas renal, de pulmón,
de ovario, de vejiga, de colon y mama.
Productos de clase II. Existen varios produc­
tos de clase II diferentes, que se expresan si­
multáneamente en la superficie celular. Todos
los individuos expresan las moléculas HLA-DR,
HLA-DQ y HLA-DP, cada una de ellas consti­
tuidas por un dímero: D Ra/D R p, DQa/DQP y
D Pa/D Pp. Cada cadena está codificada por un
gen respectivo en el sistema HLA, denomina­
dos DRA/DRBl, D Q A l/ DQBl y D PA l/D PB l
(véase fig. 29-1). Algunos individuos expresan
además un cuarto producto denominado DR52,
DR53 ó D RB51, donde la cadena DR es la m is­
ma a la presente en las moléculas HLA-DR y la
cadena p es producto de un gen denominado
DRB3, DRB4 ó DRB5, respectivamente (véan­
se figs. 29-1 y 29-2).
597
P o lim o rfism o . L as m oléculas de cla se II
también son muy polimórficas. Por serología se
identifican 14 alelos diferentes para HLA-DR
(que se numeran consecutivamente D R l, DR2,
etc.; véase cuadro 29-3), y 9 para HLA-DQ; los
productos HLA-DP (6 especificidades) se iden­
tifican en reacciones de cultivo mixto linfocita­
rio secundario (véase más adelante). Aquí tam ­
bién los productos maternos y paternos se ex­
presan codominantemente, por lo que, junto al
multialelismo del sistema, la mayoría de los in­
dividuos exhibe al menos seis productos de cla­
se II distintos. Más aún, en determinadas oca­
siones, las cadenas D Q a de origen materno (o
paterno) se asocian a las cadenas DQP de ori­
gen paterno (o materno), en un fenómeno lla­
mado trans-asociación, por lo que el núm ero
de moléculas superficiales diferentes puede ser
aun mayor.
A diferencia de los productos de clase I, la
homología entre las diversas cadenas a y P de
los diferentes loci de clase II (por ej. D R vs.
DQ vs. DP ) es moderada, en el orden de un
50-65%.
Los distintos alelos HLA-DR y DQ fueron
identificados por reacciones serológicas y defi­
nidos a lo largo de once Talleres Internaciona­
les. Sin embargo, estas moléculas poseen tam ­
bién numerosos epitopes capaces de estim ular
la proliferación de linfocitos T CD4 histoin-
compatibles, en un fenómeno denominado cul­
tivo m ixto linfocitario (véase más adelante).
Estos epitopes, están presentes en las m olécu­
las DR y DQ y no necesariamente son los m is­
mos a los identificados por anticuerpos. La
identificación de estos determinantes tiene gran
importancia por la funcionalidad de estas m olé­
culas y obvias implicancias clínicas en el re ­
chazo de trasplantes. H istóricam ente se ha
identificado a estos epitopes previo al a isla ­
miento, caracterización bioquímica y serológi-
ca de las moléculas de clase II y se los h a 11a-
. mado alelos del locus D. Hasta el presente se
han identificado unos 40 alelos diferentes. Los
estudios de aislamiento y determinación de la
secuencia nucleotídica de los respectivos genes
demostró que se trata de sustituciones c¡ue afec­
tan la presentación de péptidos y el reconoci­
miento T. Por lo tanto, la especificidad seroló-
gica no necesariam ente correlaciona con un
alelo del locus D. Más aun, una misma especi­
ficidad (ej. DR4) puede agrupar a varios alelos
HLA-D (ej. Dw4, DwlO, etc.). Por ello, se ha­
bla de subtipos alélicos, por ej. subtipos aléli-
cos del DR4. Se trata en realidad verdaderos
alelos, que no se distinguen por serología. Los
subtipos aléhcos de cadenas HLA-DRB difie­
ren entre sí en pocos aminoácidos, lo que expli­
ca en parte que los productos no sean distingui­
bles por serología; sin em bargo los residuos
598 Inmunopatología

GENES REGION DR

DRB 6 DRA1
DR1, DR 10

DRB1 DRB 6 DRB5 DRA1

DR2

DRB1 DRB2 DRB3 DRA1

DR3, DR5, DR 6 — [

DRB1 DRB7 DRB 8 DRB4 DRA1

DR4, DR7, DR9

DRB1 DRA1
DR 8

t » í f
CADENAS: DRB1 DRB4 DRB5 DRA1

t .
PRODUCTOS: DR1
DR2 DR52 DR53 DR51

ETC

Fig. 29-2. R e p re se n ta c ió n e s q u e m á tic a d e l d ife re n te d o s a je g e n é tic o D R B en d istin to s lia p lo tip o s. L a s d ista n c ia s e n tre los
g e n e s y el ta m a ñ o d e lo s m is m o s n o e s tá e n e s c a la . L o s g e n e s so m b re a d o s n o so n fim c io n a le s . L a s c a d e n a s D R |3 p ro d u c to
d e lo s g e n e s f u n c io n a le s D R B 1, D R B 3 , D R 4 y D R B 5 , se a s o c ia n c o n la m is m a c a d e n a D R a .

afectan la unión de péptidos y la interacción que han sido denominadas regiones de hiper-
con el receptor T. variabilidad alélica, localizadas entre los ami­
Por lo tanto, al igual que en las moléculas de noácidos 9-13, 26-33 y 61-1 A. En cada una de
clase I, la complejidad alélica en las moléculas estas regiones, los alelos difieren entre uno y
de clase II es mucho mayor que la estimada por seis residuos. Hay además variabilidad concen­
serología. Así por ejemplo, hoy conocemos 19 trada en otras posiciones, pero que involucra a
variantes del H LA -D R4, diez variantes del uno o dos residuos solamente. Los epitopes que
DR2, etc. Como se observa en el cuadro 29-3, estimulan a los linfocitos T en el cultivo mixto
actualmente se designan los alelos de cada lo­ linfocitario, se hallan fundamentalmente en las
cus, con las mismas pautas que las usadas para moléculas HLA-DR.
las MHC de clase I. Como veremos más ade­ En las moléculas HLA-DQ, tanto la cadena
lante, hay m étodos m oleculares que pueden DQA como la cadena DQB contribuyen al po-
usarse de rutina para identificar todos los alelos Hmorfismo. Se conocen hoy 11 alelos DQA y
de clase II. 22 alelos DQB diferentes (véase cuadro 29-3).
En las moléculas HLA-DR todas las varia­ El polimorfismo en las moléculas HLA-DP
ciones polimórfieas residen en la cadena DRp. no se identifica por métodos serológicos, sino
La cadena D R a, en cambio, es esencialmente por linfocitos T que proliferan en un cultivo
idéntica. Los cambios en la cadena DR(3 se lo­ mixto secundario (véase más adelante). Se han
calizan en el dominio más externo ((31), siendo identificado así seis alelos. Sin embargo, el ais­
el dominio proximal de membrana mucho más lamiento y caracterización de genes DP(3, reve­
conservado. Hasta el presente se dispone de la ló un mayor polimorfismo, habiéndose identifi­
secuencia aminoacídica del dominio pi de 100 cado más de 55 alelos diferentes, con las susti­
alelos distintos. Se observan entre 1 y 18 susti­ tuciones concentradas en las regiones: 8-11,
tuciones de aminoácidos entre los diversos ale­ 33-36, 55-57 y 84-87. Se han identificado hasta
los. Estos cambios no se distribuyen al azar si­ el presente ocho alelos para la cadena D P a
no que aparecen concentrados en tres zonas (cuadro 29-3).
 Estructura y función del complejo mayor de histocompatibilidad 599

Cuadro 29-3. Designación de los alelos HLA de clase II

E sp ec ifi-
d a d es b p
A lelos Especif. A lelos Especif. Alelos a so cia d a s
H LA -D R serológica H LA -D Q serológica H LA -D P (*)
D R A * 0 1 0 1 al 0 1 0 2 DQ A 1*0101 D PA 1*0101
D Q A 1*0102 D PA 1*0102
D Q A 1*0103 DPA 1*0103
D R B 1 * 0 I 0 1 al 0104 DRl DQ A 1*0104 D P A I* 0 1 0 4
D R B 1 * I 5 0 1 al 1 504 D R 1 5 (2 ) D Q A 1*0201 D P A 1*0201
D R B 1 * I 6 0 1 al 1606 D R l 6 (2 ) D Q A 1*0301 D P A 1*0202
D R B 1*0301 D R 1 7 (3 ) D Q A 1*0302 D P A 1 *0301
D R B 1 * 0 3 0 2 al 0304 D R l 8 (3 ) D Q A 1*0401 D P A 1*0401
D R B 1*0401 al 0419 DR4 D Q A 1*0501
D R B 1 * 1 1 0 1 al 1113 D R l 1(5) D Q A 1*0502
D R B 1*1201 al 1203 D R l 2 (5 ) D Q A 1 * 0601 D PB1*0101 DPwl
D R B 1 * 1 3 0 1 al 1313 D R 1 3 (6 ) D P B 1*0201 al 202 DPw2
D R B 1 * 1 4 0 1 al 1417 D R l 4 (6 ) D Q B 1 * 0501 al 5 0 4 D Q 5 (1 ) D P B 1*0301 DPw3
D R B 1*0701 DR7 D Q B 1* 0 6 0 1 al 6 0 9 D Q 6 (1 ) D P B 1 * 0401 al 40 2 DPw4
D R B 1*0801 al 0811 DRB D Q B 1*0201 al 2 0 2 DQ2 D P B 1*0501 DPw5
D R B 1*0901 DR9 D Q B 1*0301 D Q 7 (3 ) D P B 1*0601 DPw6
D R B 1 *01001 D R IO DQ B 1*0302 D Q 8 (3 ) D P B 1*0801
D Q B 1* 0 3 0 3 D Q 9 (3 ) D P B 1 * 0901
D Q B 1*0304 D Q 7 (3 ) D PB1*1001
D R B 3*0101 D R 52 D Q B 1*0305 D PB1*1101
D R B 3 * 0 2 0 I al 0 2 0 2 D R 52 D Q B1*0401 al 4 0 2 DQ4 D PB1*1301
D R B 3*0301 D R 52 D P B I* 1 4 0 1
D P B I* 1 5 0 1
D PB1*1601
D R B 4 * 0 1 0 1 al 0 1 0 3 D R 53 D P B 1*1701
D PB1*1801
D PB 1*190I
D R B 5 * 0 1 0 1 al 0 1 0 2 D R 51 D P B 1*2001
D R B 5 * 0 2 0 1 al 0 203 D R 5I D PB1*2101
D P B 1*2201
DPB1*230I
DPB1*2401
D P B 1*2501
D P B 1*2601
D P B 1*2701
D P B 1*2801
D P B 1*2901
D P B 1*3001
D PB1*3101
D P B 1 *3201
D P B I* 3 3 0 1

D P B 1*5501

E l listado se b asa en la ú ltim a p u b licac ió n del C om ité de N o m e n c la tu ra de la O M S para factores dei sistem a H L A (1994). E n las especifici»
dades sero ló g ic as, se in d ic a e n tre p arén tesis la esp e cificid ad am p lia original. (* ) L as esp e cificid ad e s D P w aso c ia d as son aq u e lla s dete rm i­
nadas p o r c u ltiv o m ix to lin fo citario sec u n d ario .

E structura tridim ensional. Recientem ente
fue establecida la estructura cristalográfica de la
molécula HLA-DRl. Los dominios a l y [31 (de
las cadenas D R a y DR(3, resp ectiv am en te)
adoptan en el espacio una estructura con una fo­
sa similar a la presente en las moléculas de cla­
se L La diferencia más significativa lo constitu­
ye el hecho de que en las MHC de clase II, los
extremos “izquierdo” y “derecho” del sitio de
unión (que unen los extremos N y C del pépti­
do, respectivam ente) estén más abiertos y no
tan ocluidos como en las MHC de clase I. Esto
determina que las MHC de clase II pueden unir
habitualmente péptidos más largos (en prom e­
dio son de 12 a 18 aminoácidos), que se extien­
den por fuera de los extremos. En un análisis
cristalográfico de HLA-DRl unido a un péptido
viral de 13 aminoácidos, se estableció que las
cadenas laterales de cinco residuos estaban hun­
didas en cinco “bolsillos” polim órficos en la
molécula HLA-DR; en otras cinco posiciones
apuntaban hacia el solvente y por lo tanto eran
accesibles al TCR. Estas últimas eran consis­
tentes con estudios funcionales previos, donde
se h ab ía evaluado la respuesta de célu las T
frente a variantes del péptido antigénico.
Ligandos peptídicos de las M H C de clase
II. También fueron estudiados por purificación
600 Inmunopatología
de las MHC de clase II y posterior eluido y se­
cuenciación de los péptidos. En células no in­
fectadas, la mayor parte de los ligandos provie­
ne de proteínas de la membrana plasmática o
de com partim entos lisosom ales, tales como
transportadores iónicos, receptores hormonales,
MHC de clase I y II, proteasas lisosomales, etc.
Se trata de productos del catabolismo de proteí­
nas del sistema de endomembranas, procesados
por la llamada vía exógena de presentación an­
tigénica (véase cap. 2). A diferencia de los h-
gandos de MHC de clase I, los péptidos son
más largos y de tamaños más variables, con 12-
20 am inoácidos en prom edio (con algunos
ejemplos de hasta 28 am inoácidos de largo).
Esta variedad en su longitud hace difícil identi­
ficar patrones o motivos estructunúes específi­
cos. Los hallados hasta el presente (cuadro
29-4) fueron confirmados mediante ensayos de
“binding” de péptidos sintéticos a MHC de cla­
se II purificadas. Como regla general, los pépti­
dos poseen menores constricciones estructura­
les comparados con los de clase I; además, se
han descrito péptidos “prom iscuos” que, inde­
pendientemente de su estructura, pueden unirse
a varios alelos de clase II distintos.
O rganización genética del sistem a HLA
El sistema HLA está localizado en el brazo
corto del cromosoma 6 en las regiones 6p21.31
6p21.33. Está limitado por los genes HLA-
DP hacia el centrómero y los genes de clase I
hacia el telómero, con una longitud estimada
en 4 millones de nucleótidos y unos 3 cM (fig.
29-2). Se lo ha dividido en regiones que contie­
nen a los loci de clase I, II y III (véase más
adelante). Se denomina haplotipo HLA al con­
junto de genes presentes en esta región del cro­
mosoma 6. Debido al enorme polimorfismo del
sistema, la información presente en los diver­
sos haplotipos varía, no sólo en los alelos que
C u ad ro 29-4. Residuos aminoacídicos conservados en péptidos unidos a determinados alelos
HLA de clase II
Pl
ALELO :
H L A -D R 1 Y /F
H L A -D R 3 I /L /F /M
H L A -D R 4 Y /F /W /M
H L A -D R 5 1 F /Y
H L A -D R 16 L /V
H L A -D Q 7 F /Y /I/M
L o s am in o ác id o s se in d ican p o r el có d ig o d e una letra y los m a rc a d o s en n eg rita se co n sid eran re sid u o s d o m in an tes o de anclaje; los otros
son am in o ác id o s m uy frecu e n tem en te h allad o s en esa p o sició n .
posee cada locus, sino también en el número de
genes y la distancia física entre los mismos.
Loci de clase I
La cadena pesada para los tres productos
HLA-A, -B y -C está codificada por sendos ge­
nes localizados hacia el extremo telomérico del
sistema HLA. Los loci HLA-B y -C están muy
próximos entre sí, a una distancia estimada de
80 kb. El locus HLA-A está a su vez a unas
1000 kb del locus HLA-C. Los estudios de bio­
logía molecular revelaron la presencia de otros
genes de clase I dentro del sistema HLA. Los
genes de clase I constituyen una familia multi-
genética, de 17-20 miembros, que poseen una
secuencia nucleotídica muy homóloga entre sí.
Se han caracterizado parcialmente algunos de
estos genes adicionales aunque se desconoce la
función biológica de los mismos.
H LA -E está localizado a unas 900 kb de
HLA-C (orientación telomérica), se expresa en
altos niveles en linfocitos T en reposo, eosinó­
filos, hnfocitos B, piel, y en menor proporción
en hígado y placenta. HLA-H está localizado a
unas 100 kb en orientación telomérica a HLA-
A y constituye un seudogen. HLA-G se locali­
za a unas 150 kb de HLA-A y parece tener una
expresión restringida a placenta (células del ci­
to trofoblasto); se sospecha que juega un papel
importante en los fenómenos inmunes que re­
gulan la gestación. HLA-E se halla a unas 200
kb de HLA-A y se expresa en niveles bajos o
moderados en linfocitos T, B, timo fetal y piel.
A diferencia de los genes HLA-A,B y C, los
genes E,F,G y H exhiben poco polimorfismo
poblacional. Vecinos a HLA-A, H, G y F, hay
al menos cinco seudogenes de clase I, Estos úl­
timos podrían desempeñar un papel importante
en la evolución de esta fam ilia m ultigenética
(véase más adelante). A unas 50 kb en posición
centromérica de HLA-B, se localiza un grupo
P O SIC IÓ N RE LA TIV A:
P4 P5P6 P7 P9
M /L A /G L
D K /R Y /L /F
sin c a rg a + T /S sin c a rg a + sin c a rg a
V /Q /I R/K
F /Y F /V /M /L /I
A /V /L /I Y /F /M /L /V
 Estructura y función del complejo m ayor de histocompatibilidad
de genes, denominados MIC, con organización
génica y homología ancestral (20-35% a nivel
proteico) a las MHC de clase I. Se predice que
poseen una estructura espacial sim ilar a las
mismas y que eventualmente podrían unir pép­
tidos. Se expresan diferencialmente en fibro­
blastos y células epiteliales y se desconoce aiin
su papel biológico.
Organización y expresión de los genes H L A
de clase L Como se ha descrito en el capítulo
10, un gen de clase I está constituido por siete
exones, que se corresponden con los dominios
proteicos de la cadena pesada. Se expresan
constitutivamente en casi todos los tejidos, con
niveles altos en células linfoides, moderados en
la mayoría de las células y bajos en otros como
el hepatocito. El nivel de expresión puede in­
crementarse por efecto de interferón (IFN) a , [3
o y. Las secuencias regulatorias de las regiones
5 ’ flanqueantes son similares a las halladas en
otras especies.
Loci de clase III
Esta región del sistema HLA codifica para la
expresión de moléculas que no cumplen con la
función de presentación antigénica, aunque al­
gunos de ellos intervienen en otros aspectos de
la respuesta inmune (fig. 29-1).
Hacia el centrómero, a unas 300 kb del locus
HLA-B, se hallan los genes que codifican para
dos citoquinas; TNFfi (o linfotoxina) y T N F a
(factor de necrosis tumoral), secretados en las
respuestas inflamatorias por linfocitos T y m a­
crófagos, respectivam ente. Los genes m iden
unas 3 kb, están próximos entre sí y no exhiben
un im portante polimorfismo poblacional. Las
proteínas poseen un 35% de homología y se
sospecha que los genes pudieron generarse a
partir de un ancestro común.
Hacia el centrómero se ubica luego un gen
denominado G7a que codifica para valil- tRNA
sintetasa, una molécula que no cumple funcio­
nes inmunológicas. Se hallan luego, vecino, a
este locus, los genes que codifican para p roteí­
nas de estrés térmico de la familia de las HSP-
70. Este tipo de moléculas, muy conservadas
en la escala filogenética, parecen tener un papel
muy im portante en la inducción de m ecanis­
mos primitivos de defensa por el sistema T.
Siguiendo hacia el centrómero, a unas 350
kb de T N Fa, se localiza el gen que codifica pa­
ra C2, el segundo componente de la vía clásica
del complemento y &\ factor B de la vía alterna­
tiva de activación del complemento. Estas glu­
coproteínas poseen actividad de serina-proteasa
(cap. 22), con una homología del 67% entre sí.
Los genes para C2 y factor B son de 18 kb y 6
kb respectivamente y están separados por tan
601
sólo 0.5 kb. Existe escaso polimorfismo en es­
tos genes. Las deficiencias hereditarias de C2
parecen deberse a defectos que im p id en la
transcripción del gen, más que a grandes dele­
ciones estructurales.
A unas 30 kb del gen para el factor B, existe
un tramo de ADN que posee los genes para C4,
el cuarto componente del sistema complemen­
to. Existen dos variantes no-alélicas (isotípicas)
de C4, que, según su movilidad electroforética
se denominan C4A (rápida) y C4B (lenta), y
que están codificadas por sendos genes en esta
región. Estos genes, de 22 kb para C4A y 16 kb
(o 22 kb) para C4B, son muy homólogos, con
sólo 14 nucleótidos (12 aminoácidos) de dife­
rencia entre sí. Hay a su vez siete variantes alé-
hcas para cada uno de ellos, con la presencia
también de alelos nulos, es decir, ausencia de
la proteína, con una frecuencia del 10% para
C4A y 20% para C4B. La ausencia total de C4
es una condición muy rara.
Los genes para C4 se alternan con dos genes
que codifican para la 27 hidroxilasa. Esta enzi­
ma es una m onooxigenasa con grupo hem o,
con actividad de citocromo P450, que participa
en la biosíntesis de esteroides en la co rteza
adrenal. Existen dos genes que son 98% hom ó­
lo g o s , de 3.1 kb c a d a u n o , d e n o m in a d o s
21 CHA y 2 I0 H B . Cada uno está inm ediata­
mente contiguo a cada uno de ¡os genes para
C4. 21 OH A es un gen no funcional (seudogen).
La deficiencia de 21 OH resulta en el síndrome
de hiperplasía adrenal congénita. Esta enfer­
medad está causada en algunos haplotipos por
una com pleta deleción de 210H B y C4B; en
otros, ocurre una introducción de m utaciones
deletéreas al gen 210H B por un mecanismo de
conversión génica que transfiere tram o s de
ADN no funcionales del seudogen 21 O K A al
gen funcional 21OHB.
Loci de clase II
H a c ia el c e n tró m e ro , a unas 400 k b de
210H B , comienza la región de clase II, donde
se hallan los genes para HLA-DR, -DQ y -DP,
con todos los genes localizados en un segmento
de 1000 kb (fig. 29-1). En primer lugar, se ha­
lla el gen DRA, que codifica para la cadena
D R a. A una distancia variable de 50-150 kb si­
gue lu e g o un gen llam ad o DRB3, D R B 4 o
DRB5, presentes el primero en los haplotipos
DR3, DR5 y DR6, el segundo en los haplotipos
DR4, DR7 y DR9, y el tercero en el haplotipo
DR2. El producto de estos genes, ju n to a la
m ism a cad en a D R a , gen era las m o lé cu la s
HLA-DR52, DR53, o DR51, presentes en los
haplotipos correspondientes. Para DR52 se han
id en tificad o cu atro varian tes alélicas, para
DR53 tres alelos, y para DR51, cinco. Se han
602 Inmunopatología
mapeado en estas m oléculas DR51, DR52 y
DR53 epitopes reconocidos por linfocitos T
(lo c u s D). Los h a p lo tip o s D R l, D R w 8 y
DRwlO parecen carecer de los respectivos ge­
nes DRB3, DRB4 y DRB5 (fig. 29-2).
A raenos de 100 kb de DRB3 (o DRB4), to­
dos los haplotipos (excepto DRwB) poseen un
seudogén DRB. El presente en los haplotipos
D R l, DR2 y DRwlO parece estar evolutiva­
mente más conservado entre estos tres haploti­
pos. Los individuos DR4, DR7 y DR9 poseen
además otro seudogén DRB. Finalmente, se ha­
lla a continuación el gen D R B l, el más poli-
mórfico del sistema (ver secuencias al final del
capítulo) y el responsable de las especificida­
des D R l, DR2, etc. En resumen, hay un solo
gen DRA cuyo producto es compartido por las
m o lécu las H L A -D R , H L A -D R w 52, H LA -
DRw53 y HLA-DRB5.
Le sigue hacia el centrómero la región DQ,
que dista de los genes DR recién descritos a
una distancia variable de 80-240 kb,según el
haplotipo. En primer lugar se hallan los genes
D QAI y D Q B l, que codifican para las molécu­
las HLA-DQ. Como se mencionó antes, ambos
genes exhiben un marcado polimorfismo. En la
misma región, se halla otro par de genes, deno­
minado DQA2 y DQB2, que no parecen tener
defectos estructurales, pero cuyos productos
aún no han sido hallados. Entre ambos pares de
genes DQ, a unas 10 kb de DQA2, se ha locali­
za un seudogén para una cadena beta, denomi­
nado DQB3, que carece del primer dominio p l .
Hacia el centrómero, a unas 70 kb de DQB2
se halla un gen llamado DOB, cuyo ARN se ex­
presa en muy bajos niveles en hnfocitos B y se
desconoce el producto proteico. A unas pocas
kb de DOB, se ha hallado recientemente una se­
rie de.genes cuyos productos están involucrados
en el procesamiento citoplásmico de antígenos
proteicos (LMF2 y LMP7) y con el transporte
de péptidos del citosol hacia el retículo endo-
plásmico (TAPl y TAP2) (véase cap. 2).
Hacia el centrómero, a unas 60 kb de LMP2,
se hallan los genes DMB y DMA, que poseen
una hom ología ancestral (25-35% ) con otros
genes de clase II. Se expresan constitutivamen­
te en linfocitos B y otras células presentadoras
de antígeno y se inducen con IFN en otros tipos
celulares. Sus productos participan en la vía
exógena de presentación antigénica (cap. 2).
A 65 kb de DMA se halla el gen DNA, cuyo
producto no se conoce, aunque no parece for­
mar un dímero con DOB. Este gen se halla in­
mediatamente vecino a los genes de la región
DP. En un tramo de 65 kb están localizados
dos pares de genes: D PAI y DPB I, que codifi­
can para el producto HLA-DP, y otro par de
genes llamados DPA2 y DPB2 que no son fun­
cionales.
Organización y regulación de la expresión
de los genes de clase IL Los genes para las ca­
denas p están constituidos por cinco exones,
que se corresponden con los dominios del pép­
tido señal, p l y P2, transmembrana, intracito-
plásmico y 3 ’ no traducido. Los genes de cade­
na a poseen cuatro exones, ya que la informa­
ción para la porción transmembrana e intracito-
plasm ática está fusionada. Los genes poseen
una longitud aproximada de 8 kb.
Los genes de clase II se expresan en un nú­
mero restringido de tejidos y su expresión en
otros puede inducirse con IFNy. Los promoto­
res de los genes de clase II poseen las secuen­
cias responsables de esta respuesta a IFNy (cap.
10). Se han identificado al menos ocho proteí­
nas que se unen a estas regiones conservadas
de los genes de clase II humanos. En algunos
pacientes portadores del síndrome de los linfo­
citos “desnudos”, que cursan con una severa
inmunodeficiencia, no existe expresión de m o­
léculas HLA de clase II y la falla reside en la
falta de alguno de estos factores que regulan su
transcripción.
Evolución de las moléculas
de histocompatibilidad
Como se mencionó antes, las moléculas de
clase I y de clase II exhiben un enorme poli­
morfismo. Las variaciones de un alelo a otro se
concentran en determinadas regiones de la mo­
lécula, especialmente involucradas en la inte­
racción con péptidos antigénicos o con el recep­
tor T. No son alotipos simples, como los pre­
sentes en la globina por ejem plo, donde hay
cambios puntuales de am inoácidos, sino que
generalmente involucran a 4-8 nucleótidos pre­
sentes en un tramo de ADN de 15-30 bases.
Más aun, los tramos sustituidos no incluyen
cambios al azar, sino que revelan secuencias
presentes en el mismo sitio en otras moléculas
HLA. Esto es sugestivo de la existencia de fe­
nómenos “tipo” conversión génica para la gene­
ración de nuevos alelos. Se describieron en el
capítulo 10 ejemplos para moléculas murinas, y
se muestran a continuación dos ejemplos (de
los numerosos existentes) para graficar esto:
a) Los alelo s de clase I H L A -B *2705 y
HLA-B*2702 difieren entre sí por cuatro susti­
tuciones en un tramo de 14 nucleótidos, que
determinan cambios en los aminoácidos 77, 80
y 81 de la cadena pesada. Esta secuencia pre­
sente en B*2702 en esos residuos,.es idéntica a
la p re s e n te en H L A -A * 2 4 0 1 y en H LA -
B*5801.
b) Los alelos de clase II HLA-DRB*1301 y
HLA-DRB*1401, difieren en el dominio |3l de
sus genes D R B l en 10 nucleótidos. Seis de
 Estructura y función del complejo m ayor de histocompatibilidad
ellos están ubicados en un tramo de 14 nucleó­
tidos y exactamente su misma secuencia se ha­
lla presente en el alelo HLA-DRB*0101.
En la conversión génica, se copian tramos de
información de DNA (durante la replicación
del mismo) a partir de genes homólogos. Los
genes que interactúan pueden estar en el mismo
crom osom a o en crom osomas distintos. Para
seg u ir con el p rim er ejem p lo m en cio n ad o
antes, durante la espermatogénesis en un indi­
v id u o h e te r o c ig o ta H L A -B * 2 7 0 5 /H L A -
B*5801, se pudo haber copiado una parte de la
secuencia de B*5801 en reemplazo de la exis­
tente en B*2705 entre los 14 nucleótidos de los
codones 77 a 81; esto sería un ejemplo de la in­
teracción de dos genes homólogos presentes en
cromosomas distintos, que pudo haber genera­
do el alelo B*2702. La interacción pudo haber
ocurrido, también, entre dos genes no alélicos
HLA-B*2705 y HLA-A*2401, presentes en un
mismo cromosoma.
Como consecuencia de estos mecanismos de
diversificación, todas las moléculas de un tipo
(ej. clase 1) son parecidas pero no idénticas en­
tre sí. Los genes no funcionales presentes en
esta familia (por ej. HLA-H, HLA-DRB2) pue­
den jugar un papel im portante como “donan­
tes” de secuencias para la diversificación de los
genes funcionales.
Por otro lado, los diversos haplotipos poseen
diferencias en el número total de genes, o en la
separación de los mismos. Esto sugiere que el
sistema sufre expansiones y contracciones por
mecanismos del tipo del cross-over desigual.
Respuesta inmune contra moléculas
de histocompatibilidad
Si se trasplanta un órgano entre dos indivi­
duos histoincom patibles (que poseen alelos
HLA diferentes), los linfocitos T CD4 y CD8
reconocen como extrañas a las moléculas HLA
del donante, producen una intensa reacción in­
flamatoria y destruyen a las células extrañas.
Las células T CD4 y CD8 reconocen a las m o­
léculas de clase II y clase 1 extrañas, respecti­
vamente. La respuesta inmune contra las MHC
extrañas se denomina re.'ipuesta alogeneica. In
vivo, la respuesta incluye además la síntesis de
anticuerpos contra las MHC ajenas {aloanti-
cuerpos).
Esta reacción puede evidenciarse y reprodu­
cirse in vitro, en el llamado cultivo mixto linfo­
citario el que, como veremos más adelante, es
muy útil para garantizar la identidad entre un
donante y un receptor previo al trasplante de
órganos. Si se mezclan en un sistema de culti­
vo células mononucleares de sangre periférica
de dos individuos histoincompatibles, en 5-7
días las células T CD4 responden con una in­
603
tensa proliferación y liberación de mediadores
al reconocer m oléculas de clase II extrañas,
presentes sobre la superficie de células que es­
timulan (linfocitos B, monocitos). Las células
T CD8 se activan al reconocer moléculas de
clase I extrañas sobre la superficie de todas las
células ajenas. Además de este reconocimiento
directo de las MHC extrañas por el TCR, se ha
dem ostrado que las MHC ajenas pueden ser
procesadas y presentadas (cap. 10) por M H C
propias: esto se denomina reconocimiento in­
directo de aloantígenos. En ambos casos el
TCR reconoce MHC con péptidos en su sitio
de presentación.
Tipificación del sistema HLA
Se denomina tipificación a la determinación
del fen o tip o HLA que porta un individuo. La
identificación de los alelos se realiza habitual­
mente por reacciones serológicas, fundamental­
mente de citotoxicidad m.ediada por anticuer­
pos y complemento. Se debe disponer de una
colección muy amplia de aloantisueros (obteni­
dos de multíparas o de individuos politransfun-
didos) previamente caracterizados en lo refe­
rente a las especificidades HLA que ellos reco ­
nocen. Se han obtenido también numerosos an­
ticuerpos monoclonales, a partir de hibridomas
murinos o humanos. Para la tipificación de los
alelos HLA se utilizan linfocitos de sangre p e­
riférica (o de bazo o ganglios, en donantes ca­
davéricos) purificados por gradientes de Eicoll-
H ypaque, ya que estas células expresan altos
niveles de moléculas HLA superficiales.
Para tipificar los alelos de clase 1, las célu­
las se incuban con los antisueros en policiibe-
tas, donde cada fosita posee un suero distinto;
luego se agrega com plem ento y, después de
otra incubación, se evalíia la viabilidad celular
al microscopio. Si se detecta muerte en las fo­
sas que contienen anticuerpos contra dos alelos
del locus A, dos alelos del locus B y dos alelos
del locus C, el individuo será heterocigota para
las moléculas de clase I. Si se detecta sólo un
alelo para alguno de los loci, podrá eventual­
mente ser homocigota (lo que se podría verifi­
car si se puede tipificar a sus padres) o portador
de un alelo contra el cual se carece de reactivos
apropiados.
P ara tipificar a las m oléculas H LA -D R y
HLA-DQ también se realiza una citotoxicidad
mediada por anticuerpo y complemento, pero
sobre linfocitos B purificados, ya que sólo re­
presentan el 10-20% en sangre periférica. A l­
ternativamente, en una población total se los
puede identificar al microscopio por flu o res­
cencia (con un antisuero fluoresceinado anti-in-
m unoglobulina humana) y, sim ultáneam ente,
realizar la reacción citotóxica. Por ciertas ca­
604 Inmunopatología
racterísticas propias de la técnica, la tipifica­
ción serológica para HLA-DR tiene un margen
de error del 5 al 20%. La introducción en ios
últimos años de técnicas moleculares mejoró
sustancialmente este inconveniente (véase más
adelante).
La identificación de los alelos del locus D
(epitopes que estimulan el cultivo mixto linfo­
citario) se realiza m ediante un panel (colec­
ción) pre-caracterizado de células homocigotas
para cada uno de los alelos conocidos de locus
D. Estas células (irradiadas para evitar su mito-
sis) se usan para estimular la proliferación en
cultivo de los linfocitos a tipificar: responderán
ante los alelos diferentes y no responderán ante
los alelos idénticos.
Las moléculas HLA-DP poseen epitopes que
estimulan débilmente la proliferación de linfo­
citos T, por lo que se los debe preestimular in
vitro y realizar una suerte de cultivo mixto lin­
focitario secundario. Aquí se debe disponer de
un panel criopreservado de linfocitos preesti-
mulados en un cultivo mixto primario; estas cé­
lulas se enfrentarán a las células (irradiadas)
del paciente para evaluar su respuesta. Se ob­
tendrá un cultivo positivo en aquellas células
del panel que responden al mismo alelo DP que
las pre-estimuló.
Ya habíam os mencionado la existencia de
numerosos alelos HLA-DR que no pueden ser
distinguidos por las técnicas de tipificación se­
rológica (cuadro 29-3). Existen actualmente téc­
nicas moleculares, basadas en la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR), que en muchos
laboratorios ya han reemplazado a las técnicas
serológicas. Existen procedimientos que permi­
ten realizar una tipificación molecular de baja
“resolución”, que brinda información equiva­
lente a las especificidades serológicas (D R l,
DR2, etc.) y que para muchas aplicaciones de
rutina (ej. estudios de histocompatibilidad para
trasplante renal) son muy adecuadas. Existen
además, técnicas de tipificación molecular de
alta “resolución”, que perm iten definir con
precisión qué alelos DRB posee un individuo
(ej. DRB1*1602, DRB1*1311, etc.). Estas últi­
mas son útiles para estudios de histocompatibi­
lidad para trasplante de médula ósea. Nótese
que una reacción de cultivo mixto linfocitario
positiva entre dos individuos definidos por sero­
logía como HLA-idénticos, se debe a la presen­
cia de subtipos alélicos que serán discernibles
por estas nuevas técnicas moleculares de alta
resolución. Por otra parte, estas técnicas tam ­
bién son útiles para tipificar individuos inmuno-
deficientes portadores del síndrome de los linfo­
citos “desnudos”, cuya única posibilidad de so­
brevida depende de un trasplante de m édula
ósea. También son útiles en medicina forense
para la tipificación de muestras biológicas don­
de no se ha preservado la viabilidad celular, pe­
ro sí se dispone de ADN de las mismas.
HLA y genética poblacional
Los diversos alelos de clase I y clase II están
distribuidos en la población con cierta frecuen­
cia, que varía según los grupos étnicos; un ale­
lo muy poco frecuente en caucásicos norteame­
ricanos podrá ser muy común en orientales y
viceversa. Asimismo, la identidad definida por
serología de un alelo dado en dos individuos
pertenecientes a grupos étnicos distintos, no
necesariam ente indica la presencia de genes
idénticos; se han identificado variantes étnicas
por cultivo mixto linfocitario y por estudios de
ADN.
Para calcular en una población la frecuencia
con que aparecen simultáneamente un alelo de
un locus junto a otro alelo de otro locus, se
multiplican las frecuencias que cada uno de los
alelos posee individualmente. Por ejemplo, el
H LA-B8 está presente en el 15% de blancos
caucásicos y el HLA-DR3 está presente en un
20%. La proporción de individuos que simultá­
neamente son HLA-B8, DR3 debiera ser: 0.15
X 0.20 = 0.03, o sea 3%. Sin em bargo, esta
combinación se halla en un 7% de la población.
En otro ejemplo, el 70% de los individuos por­
tadores de HLA-B35, también son HLA-Cv^4.
Este fenómeno se denomina d esequilibrio de
ligam iento y refleja la existencia de loci en el
genoma que segregan juntos con más frecuen­
cia que la esperada por simple azar. Esto puede
deberse a la presencia de genes cercanos, que
por algún motivo (ventajas evolutivas?) aún no
han sido separados por suficientes Crossing
overs. Cuando este desequilibrio involucra a
varios genes, uno se refiere a ellos como haplo­
tipos e xten d id o s, ej. H LA-A1,B8,DR3 es un
haplotipo frecuente.
HLA y enferm edad
Se han descrito más de 500 patologías que se
desencadenan más frecuentem ente en indivi­
duos portadores de determinados alelos HLA.
Muchas de estas patologías, aunque no todas,
involucran la participación de respuestas inmu­
nes: enfermedades infecciosas, oncológicas o
de naturaleza autoinmune. Por ejemplo, el 95%
de los individuos que desarrollan enfermedad
celíaca son HLA-DQ2, mientras que este alelo
está presente en el 35% de un a población sana.
Se dice, entonces que HLA-DQ2 predispone o
da más riesgo de padecer esta enfermedad. No
en todos los ejemplos descritos, el alelo asocia­
do está presente en un porcentaje tan alto de
pacientes; se habla en estos casos de asocia­
ción incompleta.
 Estructura y función del complejo m ayor de histocompatibilidad
Es obvio que la “fuerza” de la asociación de­
penderá de la frecuencia del alelo HLA en el
grupo de enfermos comparada con la población
normal. Si se tiene en cuenta que la frecuencia
de los alelos varía según las diversas poblacio­
nes, se calcula un número, llamado riesgo rela­
tivo (estrictamente llamado '"odds ratio”), que
indica cuántas veces más riesgo de padecer la
enferm edad poseen los portadores del alelo
respecto de los que no lo portan. Se calcula a
partir de las llamadas tablas de 2 x 2, que com­
putan el número de pacientes y sanos poseedo­
res o no del alelo en cuestión:
A le lo H L A
ENFERM OS b R ie s g o rela tiv o
SA NOS d defectuosos. Para otras patologías con base in­
Hay algunas asociaciones con riesgo relativo
muy alto (> 20): por ejemplo la enfermedad ce-
líaca y el HLA-DQ2; la espondilitis anquilosan­
te y HLA-B27; narcolepsia y HLA-DR2; diabe­
tes tipo I (insulinodependiente) y ciertos alelos
HLA-DQ, etc. A veces se observan asociacio­
nes negativas, es decir, la frecuencia de un alelo
está significativamente disminuida entre los pa­
cientes; se los denomina alelos protectores.
Muchas de las enferm edades asociadas al
HLA son m ultifactoriales, donde hay varios
factores genéticos y am bientales implicados.
Esto se observa al estudiar la incidencia de la
e n ferm ed ad en p a re ja s de h erm an o s. P o r
ejemplo, la diabetes de tipo I, afecta a ambos
herm anos H LA -idénticos en un 10% de los
casos, pero afecta a ambos herm anos si son
gemelos univitelinos en un 30-40% de los ca­
sos. E sta discordancia indica que hay otros
facto res g en ético s im p lic a d o s adem ás del
HLA y que también hay factores ambientales.
En la población, una muy pequeña proporción
de los portadores de los genes de riesgo desa­
rrollará la enferm edad, lo que se denom ina
baja penetrancia.
En los últimos años, la posibilidad de tipifi­
car más precisamente los alelos HLA, hizo ree-
valuar muchas de las asociaciones descritas co­
mo incom pletas. Q uizá el m ejor ejem plo lo
constituye la diabetes de tipo I, históricamente
asociada a HLA-DR3 y DR4, con riesgos rela­
tivos modestos, entre 4 y 6. Hoy conocemos
que la asociación p rim aria es con el lo cu s
HLA-DQ, con alelos DQA que poseen residuo
Arg en la posición 52 y alelos DQB que no po­
seen Asp en posición 57. La presencia en DQB
605
de Aspj.^, posee un efecto protector, que es do­
minante, esto es un heterocigota A sp„V A sp„“
posee riesgo mínimo; asimismo el riesgo con­
ferido por los alelos DQB que poseen reem pla­
zado el A sp„, se ejerce en forma recesiva (se
m anifiesta en hom ocigosis). Nótese que esta
asociación sólo puede estudiarse por técnicas
de tipificación molecular, las que se están apli­
cando para replantear muchas de las asociacio­
nes descritas por serología.
Para la inmensa mayoría de las asociaciones,
se desconoce el mecanismo de acción y si son
efectivamente las MHC las involucradas en la
patogénesis o si son meros marcadores genéti­
cos. Los mecanismos postulados incluyen:
1) Genes ligados dentro del HLA. Una enfer­
m edad m etabólica hereditaria, la hiperplasia
suprarrenal congénita, se asocia a portadores
aJc de HLA-B47 y se explica por la presencia en
b /d los portadores de este alelo, de genes 2 10H B
mune, se sospecha del papel de los genes C2,
C4, Bf, TNF, TAP, LMP, etc.
2) Alelos HLA en selección tímica. La idea
es que sólo determinados alelos permiten una
eficiente deleción de clones autorreactivos. Su
efecto sería dom inante (se ejercería en h o ­
mocigosis o heterocigosis) y el caso de DQB
Asp,^ y diabetes de tipo I mencionado antes
podría ser un ejemplo. Otros alelos HLA per­
mitirían la selección positiva de ciertos clones
autorreactivos o de clones capaces de respon­
der a ciertos epitopes inm unodom inantes de
patógenos.
3) Alelos HLA en la presentación antigénica.
Se refiere a una incapacidad de ciertos alelos
de unir o presentar adecuadam ente p éptidos
microbianos, con falta de respuesta o inducción
de anergia o supresión.
4) Reacción cruzada de MHC con antígenos
microbianos. Se han documentado homologías
de secuencia entre ciertas proteínas de estrés
térmico y moléculas HLA. Este mimetismo m o­
lecular afectaría el reconocim iento adecuado
de ciertos antígenos.
5) Reacción cruzada de antígenos m icrobia­
nos con autoantígenos. C iertos alelos H LA
unidos a péptidos m icrobianos, asem ejan la
presentación de péptidos propios.
Hay evidencias experimentales en un solo m o­
delo, de un papel directo de las MHC. Se trata de
la generación de ratas transgénicas que expresan
los genes para HLA-B27 (cadena pesada y ¡32-
microglobulina humana), que espontáneamente
desarrollan una patología similar a las espondi-
loartropatías humanas. Sin duda estos modelos
animales contribuirán a un mejor conocimiento
del mecanismo de estas asociaciones.
606 Inmunopatología

HLA Y TRA SPLA N TE posible que la plasmaféresis pueda ser una tera­
pia útil para evitar el rechazo hiperagudo.
Existen diversos tipos de injertos:
a) Injerto autóiogo: de y al mismo individuo, II) El rechazo agudo se debe a linfocitos T
no se produce rechazo (piel, médula ósea). CD4+ inductores, macrófagos y linfocitos T-ci-
b) Injerto singeneico o isólogo: entre melli­ totóxicos. En todas las combinaciones donante-
zos idénticos, tampoco se produce rechazo. receptor que no sean meUizos idénticos un re­
c) Injerto alogeneico; entre individuos de la chazo agudo letal comenzará a los 5-7 días del
misma especie. Si el donante comparte con el trasplante. Se utilizan tres estrategias para com­
recipiente sólo uno de los haplotipos (ej. padres batir el rechazo agudo;
hijos), se llama haploidéntico.
d) Injerto xenogeneico: entre individuos de a) Transfusión sanguínea. Por alguna oscura
diferentes especies. razón, la tran sfu sió n sanguínea parece que
mantiene a los linfocitos T más tolerantes a
T rasp lan te de riñón subsecuentes aloinjertos, de manera que el re­
chazo agudo es menos severo. Sin embargo, és­
Los trasplantes de riñón generalmente se di­ ta es un arma de doble filo, porque puede cau­
viden en dos categorías; donante familiar vivo, sar la fo rm ació n de an ticu erp o s, dando un
o donante cadavérico no fam iliar. Todos los cross-match positivo contra el próximo donan­
trasplantes de riñón deben ser compatibles para te de riñón e inducir un rechazo hiperagudo si
los antígenos sanguíneos del grupo ABO. El el trasplante sigue su curso. En realidad, se ha
rhesus carece de importancia. El rechazo del ri­ sugerido que el “efecto de la transfusión” es un
ñón puede ser de tres clases; I) hiperagudo, II) artificio producido al seleccionar a todos aque­
agudo y III) crónico. llos con sistemas inmunes agresivos, inducien­
do tantos anticuerpos en ellos que nunca pue­
1) El rechazo hiperagudo es causado por an­ den ser trasplantados y no aparezcan en las es­
ticuerpos preexistentes que reaccionan (gene­ tadísticas de seguimiento. Sin embargo, gene­
ralmente) contra moléculas de clase I sobre la ralmente se acepta que hay un efecto beneficio­
superficie de las células de riñón injertadas. Es­ so misterioso de la transfusión sanguínea sobre
tos anticuerpos son el resultado de una inmuni­ el rechazo agudo de un aloinjerto siguiente.
zación previa; transfusión sanguínea, embarazo Hay una controversia acerca de cuánta sangre
o un injerto anterior. Estos pueden ser detecta­ se debería dar: los norteamericanos creen que
dos, y el trasplante ser cancelado, haciendo un tanta como sea posible, los europeos piensan
cross-match entre las células del donante (lin­ que una o dos unidades son suficientes. En este
focitos) y el suero del receptor. Se mezclan las último caso, el peligro de inducir la formación
células y el suero durante 60 minutos, luego se de anticuerpos es muy reducido.
le agrega el com plem ento, y las células son A dem ás de la selección se han postulado
examinadas para ver si son viables después de otros dos posibles mecanismos para explicar el
otras 2 horas, con una técnica similar a la des­ misterioso efecto de la transfusión sanguínea:
crita anteriormente. Se toman muestras de sue­ a) los linfocitos T inductores y citotóxicos se­
ro de los pacientes renales luego de cada trans­ rían activados previo al trasplante, por lo que
fusión y se guardan para cuando se realiza el serían más vulnerables a la terapia antirrechazo
cross-match. Los niveles de anticuerpos pue­ y b) se activan células T supresoras.
den elevarse y luego caer hasta niveles no de­ Se han utilizado transfusiones sanguíneas del
tectables. De esta manera, el tener muestras se­ donante previas al trasplante de riñón de do­
riadas permite determinar con mayor seguridad nante vivo con, aparentemente, buenos resulta­
los niveles de Acs y células de memoria para dos.
los aloantígenos del donante potencial. b) Compatibilidad. 1) Donantes vivos fa m i­
Si la prueba de cross-match es positiva y si liarmente relacionados. Existe una clara dife­
de todas maneras se realiza el trasplante, el ri­ rencia en la sobrevida del injerto entre mellizos
ñón morirá en minutos. Si la prueba con suero idénticos, o combinaciones entre donantes y re­
reciente es negativa, pero con un suero viejo es ceptores que comparten 2 haplotipos, 1 haploti­
positiva, el riñón puede mantenerse en buenas po o ninguno, siendo los primeros los de mejor
condiciones, pero existe el riesgo de un recha­ pronóstico. Es incierto en los trasplantes entre
zo hiperagudo levem ente demorado (algunas individuos relacionados, si los antígenos de
veces denominado rechazo acelerado) en los clase I o clase II son más importantes, ya que
primeros tres días. Si la prueba es positiva, el no se han comparado hermanos donantes con
trasplante no se realiza; de esta manera, rara recombinaciones dentro del HLA; siempre se
vez se ve un rechazo hiperagudo. Si por alguna elige a los que comparten haplotipos enteros.
razón efectivamente se produce el trasplante es Todos estos pacientes reciben corticoides y
 Estructura y función del complejo m ayor de histocompatibilidad 607

azatioprina, como terapia antirrecliazo, trata­ Tiempo de isquemia fría (TIF): es el tiempo
miento que no alcanza a obtener los valores de entre la perfusión con fluidos fríos y la cone­
sobrevida de los gemelos idénticos. Si no reci­ xión a la sangre oxigenada caliente del recep­
bieran terapia, la diferencia en la sobrevida tor, Máximo permitido para el TIF: 60 horas, si
comparada con los mellizos idénticos sería m a­ el TIC es corto.
yor. 2) Injerto cadavérico no relacionado. H as­
ta ahora el criterio ha sido tratar de compatibi- Trasplante de corazón
lizar el donante y el receptor tanto como sea
posible, para los alelos de los loci de clase I co­ Obviamente sólo se realiza con donantes ca­
mo los DR. Aun las mejores compatibilidades davéricos, Deben ser ABO co m p atib les. La
no se comportan tan bien como lo hacen los compatibilidad HLA por lo general es im posi­
donantes vivos relacionados, que comparten 2 ble que ocurra, pero el cross-match es im por­
haplotipos. En la práctica, es estadísticamente tante, a causa de que puede ocurrir rechazo hi-
imposible compatibilizar para todos los loci en peragudo. La ciclosporina ha mejorado las ci­
forma simultánea y, aun si se pudiera hacer, só­ fras de supervivencia.
lo las definiciones serológicas de los alelos es­
tán disponibles. Ya hemos dicho que las célu­ Trasplante de hígado
las T pueden encontrar, por ejemplo, diferen­
cias entre dos alelos del HLA-A2 en dos indi­ Sólo se realiza a partir de donantes cadavéri­
viduos no relacionados que aparecen idénticos cos para adultos. En pediatría puede realizarse
en la tipificación serológica, o identificar alelos una resección parcial hepática de un donante fa­
del locus D, que no concuerdan con los DR. miliar adulto. A unque originalmente se creía
Dada la efectividad de ciertas terapias antirre- que la compatibilidad HLA no era importante,
chazo, hay consenso en que se debe lograr al hoy hay suficientes estudios con largos períodos
menos una tipificación de especificidades sero­ de supervivencia que muestran mejor evolución
lógicas correctamente, ya sea por técnicas se­ en situaciones donde se com parte dos alelos
rológicas o moleculares. DR, vs. un alelo y vs. ninguno. Los alelos de
c) Terapéutica antirrechazo. La terapéutica clase I parecen tener menor importancia. De to­
convencional es con corticoides y azatioprina. dos modos, el hígado es rechazado menos agre­
Otras drogas y regímenes usados son la globu­ sivamente que otros órganos, pero los rechazos
lina antitimocítica, ciclofosfamida, esplenecto- afectan en forma adversa las anastomosis, por
mía, y la irradiación linfoidea total. La ciclos­ lo que aquí también la ciclosporina es muy útil.
porina A es un agente inm unosupresor alta­
mente efectivo que ha mejorado todas las cifras Injertos de piel (queratinocitos)
de sobrevida al injerto. De acuerdo con algunas
publicaciones, una complicación que acompaña Los queratinocitos alogeneieos cultivados
a esta droga es la aparición de linfomas espon­ (provenientes de donantes jóvenes), injertados
táneos y otros tumores. en lechos crónicam ente dañados, a m enudo
La mayor parte de los episodios de rechazo promueven una cicatrización que los autoinjer-
agudo tienen lugar dentro de los 3 meses del tos no producen. También es útil en grandes
trasplante; se caracterizan por un súbito m ales­ quemaduras, donde la piel autóloga es insufi­
tar con fiebre, dolor en la zona del injerto y ciente pai'a autoinjertos. Todos los leucocitos y
brusca caída de la función. El tratamiento usual células de Langerhans (dendríticas) se pierden
es de 1 g de prednisolona; por lo general fun­ en el cultivo. Los queratinocitos cultivados no
ciona. expresan moléculas de clase II.

ril) Rechazo crónico. Es una caída gradual Injerto de córnea

en la función a lo largo de meses o años. La
causa es incierta, pero podría deberse en parte a
tipificaciones HLA mal realizadas. No hay tra­
tamiento efectivo. Hay conceptos críticos que
deben ser considerados:
Tiem po de isquem ia caliente (TIC). Es el
tiempo entre el corte de suministro de sangre
oxigenada caliente del donante y la perfusión
del riñón con fluidos de perfusión fríos. Este
tiempo es de alrededor de 2 minutos en donan­
tes vivos y cadavéricos con corazón latente. El
máximo permitido: alrededor de 30 minutos.
En la córnea hay células epiteliales en la par­
te externa, endoteliales (interna) y queratocitos
(fibroblastos) en el estroma. La córnea es avas-
cular, pero los linfocitos penetran en ella, por
lo cual podría ocurrir un rechazo. En la prácti­
ca, la mayor parte de los injertos no se recha­
zan (no se da terapéutica antirrechazo ni se
busca histocompatibilidad). Razones posibles:
muerte de algunas células durante el alm acena­
miento; ausencia de moléculas de clase II en
los queratocitos; una penetración lenta de las
células defensivas del huésped en un tejid o
608 Inmunopatología
avascular. Sin embargo, algunos pacientes re­
chazan injertos en forma recurrente; por lo ge­
neral aquellos que tienen un lecho vasculariza-
do para el injerto vascularizado. En estos casos,
la compatibilidad para clase II es útil.
Trasplante de médula ósea
Las principales indicaciones son; 1) inmuno-
deficiencias congénitas; 2) anemia aplásica y 3)
reconstitución luego de una irradiación total del
cuerpo por leucemias u otros tumores malignos.
La compatibihdad para los grupos sanguíneos
ABO y Rh no importa, lo mismo que el cross-
match serológico, pero la compatibihdad HLA
es vital. Si el sistema inmune del huésped está
intacto, como en el caso de ia aplasia de glóbu­
los rojos, el huésped puede rechazar el injerto
(huésped contra injerto). Si el sistema inmune
del huésped es deficiente (la situación usual en
leucemias, por ej.), el injerto puede rechazar al
huésped: enfermedad aguda de injerto contra
huésped. Esto se debe a que la m édula ósea
siempre contiene un gran número de linfocitos T
maduros que atacarán al recipiente histoincom-
patible. Sin controlar esta variable, ocurren los
siguientes sucesos: rash cutáneo, pérdida del ca­
bello, diarrea profusa, daño hepático, infeccio­
nes y muerte. Actualmente se intenta la elimina­
ción de los linfocitos T maduros de la médula
ósea del donante mediante Ac monoclonales di­
rigidos contra moléculas de diferenciación pre­
sentes exclusivamente en los hnfocitos T. Ade­
más se administra ciclosporina al receptor.
La única combinación rcahiiente exitosa es
la de los gem elos idénticos y herm anos que
comparten 2 haplotipos. La compatibilidad de
2 haplotipos requiere tratam ien to co n tra la
reacción de injerto contra huésped. No muchos
pacientes tienen hermanos con los que compar­
ten 2 haplotipos. Si se pudiera usar un haploti­
po compatible, mejoraría radicalmente el pro­
nóstico en leucemias e inmunodeficiencias. En
caso de donantes no-relacionados (de bancos
de donantes de médula), es crucial una correcta
tipificación molecular de los alelos HLA.
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S. S h a w y co l. F a m ily s tu d ie s d e fin e a n e w h is to c o m p a tib i-
lity lo c u s , S B , b e tw e e n H L A -D R a n d G L O . N a tu re 2 9 3 :
7 4 5 -7 4 7 . 1981.
J .S . L e e y c o l. S e q u e n c e s o f a n H L A - D R a p lh a c h a in
c D N A c lo n e a n d in tro n -e x o n o rg a n iz a tio n o f th e c o rre s -
p o n d in g g e n e . N a tu re 2 9 9 :7 5 0 , 1982.
E .O .L o n g y c o i. C o m p le te s e q u e n c e o f a n H L A -D R b e ta
c h a in d e d u c e d fro m a c D N A c lo n e a n d id e n tific a tio n o f
m ú ltip le n o n -a ile lic D R b e ta c h a in g e n e s. E M B O J o u rn a l
2 :3 8 9 , 1983.
G .H .A .S e e m a n y c o l. G e n e c o n v e rs ió n lik e m e c h a n is m s
m a y g e n é ra te p o ly m o rp h is m in h u m a n c la s s I g e n e s. E M ­
B O J o u rn a l 5 :5 4 7 , 1986.
L .P .C h e rfk o ff y c o l. C o m p le te n u c le o tid e s e q u e n c e o f a g e -
n o m ic c lo n e e n c o d in g H L A -B 3 5 iso la te d fro m a C a u c a -
sia n in d iv id u a l o f h isp a n ic o rig in : Id e n tific a tio n o f a n e w
v a ria n t o f H L A -B 3 5 . H u m a n Im m u n o lo g y 3 1 :1 5 3 -1 5 8 ,
1991.
D .R .M a d d e n y c o l. T h e stru c tu re o f H L A -B 2 7 re v e á is n o -
n a m e r s e lf p e p tid e s b o u n d in an e x te n d e d c o n fo rm a tio n .
N a tu re 3 5 3 :3 2 1 -3 2 5 , 1991.
T .S .J a rd e tz k y y c o l. I d e n tific a tio n o f se lf-p e p tid e s o u n d to
p u rifie d H L A -B 2 7 . N a tu re 3 5 3 : 3 2 6 -3 2 9 , 1991.
R .G ly n n e y c o l. A p r o te a s o m e - re la te d g e n e b e tw e e n th e
tw o A B C t ra n s p o n e r lo ci in th e c la s s II re g ió n o f th e h u ­
m a n M H C . N a tu re 3 5 3 : 3 5 7 -3 6 0 , 1991.
T S p ie ss y R D e m a rs. R e s to re d e x p re s s io n o f M H C c la s s 1
m o le c u le s b y g e n e tra n s fe r o f a p u ta tív e p e p tid e tra n s p o r ­
te n N a tu re 3 5 1 : 3 2 3 -3 2 4 , 1991.
A P K e lly y c o l. A n e w h y m a n H L A c la ss I l-re la te d lo c u s ,
D M . N a tu re 3 5 3 : .571-573, 1991.
K T su ji y c o i. (E d s.). H L A 1991: P ro c e e d in g s o f th e E le -
v e n th I n te r n a tio n a l H is to c o m p a tib ility W o rk s h o p . O x ­
fo rd U n iv . P re ss . 1992.
R D C a m p b e ll y L T ro w s d a le . M a p o f th e h u m a n m a jo r h is ­
to c o m p a tib ility c o m p le x . I m m u n o lo g y T o d a y 14: 3 4 9 -
3 5 2 , 1993.
K F a lk y c o l. A lle le -s p e c ific p e p tid e lig a n d m o tifs o f H L A -
C m o le c u le s . P r o c . N a ti. A c a d . S c i. U S A 9 0 : 1 2 0 0 5 -
1 2 0 0 9 ,1 9 9 3 .
J H B ro w n y c o l. T h re e -d im e n s io n a l stru c tu re o f th e h u m a n
c la ss c la s s II h is to c o m p a tib ility a n tig e n H L A -D R 1. N a tu ­
re 3 6 4 : 3 3 -3 9 , 1993.
J D T a u ro g y c o l. S u s c e p tib ility to in fla m m a to ry d ise a s e in
H L A -B 2 7 tra n s g e n ic rat lin e s c o rre la te s w ith th e lev e l o f
B 2 7 e x p re s s io n . J. I m m u n o l. 150: 4 1 6 8 -4 1 7 8 , 1993.
L J S te r n y c o l. C r y s ta l s tr u c tu r e o f th e h u m a n c la s s II
M H C p ro te in H L A - D R l c o m p le x e d w ith an in flu e n z a v i ­
ru s p e p tid e . N a tu re 3 6 8 :2 1 5 -2 2 1 , 1994.
J G B o d m e r y c o l. N o m e n c la tu re f o r f a c to rs o f th e H t^A
sy s te m , 1994. T is s u e A n tig e n s : 44 : 1-18, 1 9 9 4 . E R a d le y
y c o l. G e n o m ic o r g a n iz a tio n o f H L A - D M A a n d H L A -
D M B . C o m p a ris o n o f th e g e n e o r g a n iz a tio n o f a ll six
c la ss II fa m ilie s in th e h u m a n M H C . J. B io l. C h e m . 2 6 9 :
1 8 8 8 4 -1 8 8 3 8 , 1994.
V S te im le y co l. R e g u la tio n o f M H C c la ss II e x p re s s io n b y
IF N m e d ia te d b y th e tra n s a c tiv a to r g e n e C U T A . S c ie n c e
2 6 5 : 1 0 6 -1 0 9 , 1994.
O R o tz s c h k e y K F a lk . O rig in , stru c tu re a n d m o tifs o f n a -
tu r a lly p r o c e s s e d c la s s II lig a n d s . C u rr. O p . Im m u n o l,
6 :4 5 -5 1 , 1994.
V H E lg e lh a rd . S tru c tu re o f p e p tid e s a s so c ia te d w ith M H C
c la s s I m o le c u le s . C u rr. O p . I m m u n o l. 6: 1 3 -2 3 , 1994.
J S id n e y y c o l. S ev e ra ] H L A a líe le s s h a re o v e rla p p in g p e p ­
tid e s p e c ifíc itie s. J, I m m u n o l. 154: 2 4 7 -2 5 9 , 1995.
Inmunodeficiencias
MARTA ZELAZKO
MARÍA RIVAS
IN M U N O D E FIC IE N C IA S P R IM A R IA S
G eneralidades
Las in m u n o d eficien cias prim arias (ID P )
constituyen un grupo lieterogéneo de enferme­
dades producidas en general por defectos gené­
ticos.
La frecuencia de estas afecciones es baja y
no ha sido definitivamente determinada en m u­
chos países. Estadísticas de Japón de 1981 y de
Australia de 1983, sugieren una incidencia de
1:10.000, excluyendo la deficiencia de IgA
asintomátiea. En el estudio australiano determi­
nan una frecuencia de 1:103.000 para la agam ­
m aglobulinemia ligada al X (ALX), 1:66.000
para la inm unodeficiencia combinada severa
(IDCS), 1:83.000 para la inm unodeficiencia
común variable (IDV) y 1:66.000 para el Sín­
drome de DiGeorge.
En otros países, como Francia, se ha señala­
do un aumento en la incidencia, probablemente
por mejor diagnóstico, de la IDCS, siendo su
frecuencia actual de 1:25.000 nacidos vivos.
En Latinoamérica no hay estadísticas, y en
nuestro país se ha comenzado recientemente un
sistema de registro nacional con este fin.
Los defectos inmunológicos en las IDP pue­
den involucrar a cualquiera de los componentes
del sistema inmune: linfocitos, células fagocíti­
cas, proteínas del sistema complemento. Estos
defectos producen una pérdida de protección o
defensa contra agresiones externas causadas
por distintos microorganismos, dando lugar a la
m anifestación clínica característica de estos
síndromes, que es la exagerada susceptibilidad
al desarrollo de procesos infecciosos bacteria­
nos, virales y micóticos, recidivantes o cróni­
cos. La gravedad de los procesos infecciosos
30
depende del grado y tipo de defecto presente en
cada caso.
Es importante destacar que, siendo las IDP
enfermedades relativam ente poco frecuentes,
deben tenerse en cuenta siempre otras causas
de infección recidivante o crónica, com o son
las enferm edades m etabólicas, desnutrición,
diabetes, las malformaciones del tracto urina­
rio, del aparato respiratorio, el tratamiento con
drogas citostáticas, etc. Otro hecho que debe
considerarse, ya que dificulta el diagnóstico de
IDP, es la compleja relación existente entre in­
fección e inmunidad. La infección puede cau­
sar inmunodeficiencia y puede ser la resultante
de la misma. Muchos agentes infecciosos, par­
ticularmente los virales, determinan estados de
inmunodeficiencia, difíciles de diferenciar de
síndromes de IDP. El ejemplo más claro de es­
ta situación es la infección por HIV en recién
nacidos o lactantes, que plantea dificultades de
diagnóstico diferencial con deficiencias prim a­
rias de la inmunidad celular.
Es im portante reconocer que en la década
del ’50, cuando comenzaron a describirse estas
enfermedades, el análisis de las alteraciones in-
m unológicas halladas en estos p acientes ha
contribuido a la comprensión de muchas de las
funciones del sistema inmune normal y ha per­
mitido delinear las anomalías inmunológicas de
otras deficiencias mucho más frecuentes como
son las secundarias a tumores, tratamientos in­
munosupresores, desnutrición, etc.
En los últimos años la biología molecular ha
hecho aportes fundamentales para la com pren­
sión de la etiopatogenia de muchas de estas en­
fermedades, a través del estudio de dos tipos de
animales genéticamente modificados:
1) Animales transgénicos, capaces de expre­
sar un producto génico humano.
608 Inmunopatología
avascular. Sin embargo, algunos pacientes re­
chazan injertos en forma recurrente; por lo ge­
neral aquellos que tienen un lecho vasculariza-
do para el injerto vascularizado. En estos casos,
la compatibilidad para clase II es útil.
Trasplante de m édula ósea
Las principales indicaciones son: 1) inmuno-
deficiencias congénitas; 2) anemia aplásica y 3)
reconstitución luego de una irradiación total del
cuerpo por leucemias u otros tumores malignos.
La compatibiUdad para los grupos sanguíneos
ABO y Rh no importa, lo mismo que el cross-
match serológico, pero la compatibilidad HLA
es vital. Si el sistema inmune del huésped está
intacto, como en el caso de la aplasia de glóbu­
los rojos, el huésped puede rechazar el injerto
(huésped contra injerto). Si el sistema inmune
del huésped es deficiente (la situación usual en
leucemias, por ej.), el injerto puede rechazar al
huésped: enfermedad aguda de injerto contra
huésped. Esto se debe a que la m édula ósea
siempre contiene un gran número de linfocitos T
maduros que atacarán al recipiente histoincom-
patible. Sin controlar esta variable, ocurren los
siguientes sucesos: rash cutáneo, pérdida del ca­
bello, diarrea profusa, daño hepático, infeccio­
nes y muerte. Actualmente se intenta la elimina­
ción de los linfocitos T maduros de la médula
ósea del donante mediante Ac monoclonales di­
rigidos contra moléculas de diferenciación pre­
sentes exclusivamente en los linfocitos T. Ade­
más se administra ciclosporina al receptor.
La única combinación realmente exitosa es
la de los gem elos idénticos y herm anos que
comparten 2 haplotipos. La compatibilidad de
2 haplotipos requiere tratam ien to co n tra la
reacción de injerto contra huésped. No muchos
pacientes tienen hermanos con los que compar­
ten 2 haplotipos. Si se pudiera usar un haploti­
po compatible, mejoraría radicalmente el pro­
nóstico en leucemias e inmunodeficiencias. En
caso de donantes no-relacionados (de bancos
de donantes de médula), es crucial una correcta
tipificación molecular de los alelos HLA.
BIBLIOGRAFÍA
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2 2 5 , 1980.
S. S h a w y co l. F a m ily s tu d ie s d e fin e a n e w h is to c o m p a tib i­
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7 4 5 -7 4 7 . 1981.
J .S . L e e y c o l. S e q u e n c e s o f a n H L A - D R a p lh a c h a in
c D N A c lo n e a n d in tro n -e x o n o rg a n iz a tio n o f th e c o rre s -
p o n d in g g e n e . N a tu re 2 9 9 :7 5 0 , 1982.
E .O .L o n g y c o l. C o m p le te s e q u e n c e o f a n H L A -D R b e ta
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2 :3 8 9 , 1983.
G .H .A .S e e m a n y c o l. G e n e c o n v e rs ió n lik e m e c h a n is m s
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B O J o u rn a l 5 :5 4 7 , 1986.
L .P .C h e rfk o ff y c o l. C o m p le te n u c le o tid e s e q u e n c e o f a g e -
n o m ic c lo n e e n c o d in g H L A -B 3 5 iso la te d fro m a C a u c a -
sia n in d iv id u a l o f h isp a n ic o rig in : Id e n tific a tio n o f a n e w
v a ria n t o f H L A -B 3 5 . H u m a n Im m u n o lo g y 3 1 :1 5 3 -1 5 8 ,
1991.
D .R .M a d d e n y c o l. T h e stru c tu re o f H L A -B 2 7 re v e á is n o -
n a m e r s e lf p e p tid e s b o u n d in an e x te n d e d c o n fo rm a tio n .
N a tu re 3 5 3 :3 2 1 -3 2 5 , 1991.
T .S .J a rd e tz k y y c o l. I d e n tific a tio n o f se lf-p e p tid e s o u n d to
p u rifie d H L A -B 2 7 . N a tu re 3 5 3 : 3 2 6 -3 2 9 , 1991.
R .G ly n n e y c o l. A p r o te a s o m e - re la te d g e n e b e tw e e n th e
tw o A B C tra n s p o rte r lo ci in th e c la s s II re g ió n o f th e h u ­
m a n M H C . N a tu re 3 5 3 : 3 5 7 -3 6 0 , 1991.
T S p ie ss y R D e m a rs. R e s to re d e x p re s s io n o f M H C c la s s I
m o le c u le s b y g e n e tra n s fe r o f a p u ta tív e p e p tid e tra n s p o r ­
ter. N a tu re 3 5 1 : 3 2 3 -3 2 4 , 1991.
A P K e lly y c o l. A n e w h y m a n H L A c la ss I l-re la te d lo c u s ,
D M . N a tu re 3 5 3 : .571-573, 1991.
K T su ji y c o l. (E d s.). H L A 1991: P ro c e e d in g s o f th e E le -
v e n th I n te r n a tio n a l H is to c o m p a tib ility W o rk s h o p . O x ­
fo rd U n iv . P re ss . 1992.
R D C a m p b e ll y L T ro w s d a le . M a p o f th e h u m a n m a jo r h is ­
to c o m p a tib ility c o m p le x . I m m u n o lo g y T o d a y 14: 3 4 9 -
3 5 2 , 1993.
K F a lk y c o l. A lle le -s p e c ific p e p tid e lig a n d m o tifs o f H L A -
C m o le c u le s . P r o c . N a ti. A c a d . S c i. U S A 9 0 : 1 2 0 0 5 -
1 2 0 0 9 ,1 9 9 3 .
J H B ro w n y c o l. T h re e -d im e n s io n a l stru c tu re o f th e h u m a n
c la ss c la s s II h is to c o m p a tib ility a n tig e n H L A - D R l. N a tu ­
re 3 6 4 : 3 3 -3 9 , 1993.
J D T a u ro g y c o l. S u s c e p tib ility to in fla m m a to ry d ise a s e in
H L A -B 2 7 tra n s g e n ic rat lin e s c o rre la te s w ith th e lev e l o f
B 2 7 e x p re s s io n . J. I m m u n o l. 150: 4 1 6 8 -4 1 7 8 , 1993.
L J S te r n y c o l. C r y s ta l s tr u c tu r e o f th e h u m a n c la s s II
M H C p ro te in H L A - D R l c o m p le x e d w ith an in flu e n z a v i ­
ru s p e p tid e . N a tu re 3 6 8 :2 1 5 -2 2 1 , 1994.
J G B o d m e r y c o l. N o m e n c la tu re f o r f a c to rs o f th e H t^A
sy s te m , 1994. T is s u e A n tig e n s : 44 : 1-18, 1 9 9 4 . E R a d le y
y c o l. G e n o m ic o r g a n iz a tio n o f H L A - D M A a n d H L A -
D M B . C o m p a ris o n o f th e g e n e o r g a n iz a tio n o f a ll six
c la ss II fa m ilie s in th e h u m a n M H C . J. B io l. C h e m . 2 6 9 :
1 8 8 8 4 -1 8 8 3 8 , 1994.
V S te im le y co l. R e g u la tio n o f M H C c la ss II e x p re s s io n b y
IF N m e d ia te d b y th e tra n s a c tiv a to r g e n e C U T A . S c ie n c e
2 6 5 : 1 0 6 -1 0 9 , 1994.
O R o tz s c h k e y K F a lk . O rig in , stru c tu re a n d m o tifs o f n a -
tu r a lly p r o c e s s e d c la s s II lig a n d s . C u rr. O p . Im m u n o l,
6 :4 5 -5 1 , 1994.
V H E lg e lh a rd . S tru c tu re o f p e p tid e s a s so c ia te d w ith M H C
c la s s I m o le c u le s . C u rr. O p . I m m u n o l. 6: 1 3 -2 3 , 1994.
J S id n e y y c o l. S ev e ra ] H L A a líe le s s h a re o v e rla p p in g p e p ­
tid e s p e c ific itie s. J, I m m u n o l. 154: 2 4 7 -2 5 9 , 1995.
Inmunodeficiencias
MARTA ZELAZKO
MARÍA RIVAS
IN M U N O D E FIC IE N C IA S PRIM A R IA S
G eneralidades
Las in m u n o d eficien cias prim arias (ID P )
constituyen un grupo lieterogéneo de enferme­
dades producidas en general por defectos gené­
ticos.
La frecuencia de estas afecciones es baja y
no ha sido definitivamente determinada en m u­
chos países. Estadísticas de Japón de 1981 y de
Austraha de 1983, sugieren una incidencia de
1:10.000, excluyendo la deficiencia de IgA
asintomática. En el estudio austrahano determi­
nan una frecuencia de 1:103.000 para la agam ­
m aglobulinemia ligada al X (ALX), 1:66.000
para la inm unodeficiencia combinada severa
(IDCS), L 83.000 para la inm unodeficiencia
común variable (IDV) y 1:66.000 para el Sín­
drome de DiGeorge.
En otros países, como Francia, se ha señala­
do un aumento en la incidencia, probablemente
por mejor diagnóstico, de la IDCS, siendo su
frecuencia actual de 1:25.000 nacidos vivos.
En Latinoamérica no hay estadísticas, y en
nuestro país se ha comenzado recientemente un
sistema de registro nacional con este fin.
Los defectos inmunológicos en las IDP pue­
den involucrar a cualquiera de los componentes
del sistema inmune: linfocitos, células fagocíti­
cas, proteínas del sistema complemento. Estos
defectos producen una pérdida de protección o
defensa contra agresiones externas causadas
por distintos microorganismos, dando lugar a la
m anifestación clínica característica de estos
síndromes, que es la exagerada susceptibilidad
al desarrollo de procesos infecciosos bacteria­
nos, virales y micóticos, recidivantes o cróni­
cos. La gravedad de los procesos infecciosos
30
depende del grado y tipo de defecto presente en
cada caso.
Es importante destacar que, siendo las IDP
enfermedades relativam ente poco frecuentes,
deben tenerse en cuenta siempre otras causas
de infección recidivante o crónica, com o son
las enferm edades m etabólicas, desnutrición,
diabetes, las malformaciones del tracto urina­
rio, del aparato respiratorio, el tratamiento con
drogas citostáticas, etc. Otro hecho que debe
considerarse, ya que dificulta el diagnóstico de
IDP, es la compleja relación existente entre in­
fección e inmunidad. La infección puede cau­
sar inmunodeficiencia y puede ser la resultante
de la misma. Muchos agentes infecciosos, par­
ticularmente los virales, determinan estados de
inmunodeficiencia, difíciles de diferenciar de
síndromes de IDP. El ejemplo más claro de es­
ta situación es la infección por HIV en recién
nacidos o lactantes, que plantea dificultades de
diagnóstico diferencial con deficiencias prim a­
rias de la inmunidad celular.
Es im portante reconocer que en la década
del ’50, cuando comenzaron a describirse estas
enfermedades, el análisis de las alteraciones in-
m unológicas halladas en estos p acientes ha
contribuido a la comprensión de muchas de las
funciones del sistema inmune normal y ha per­
mitido delinear las anomalías inmunológicas de
otras deficiencias mucho más frecuentes como
son las secundarias a tumores, tratamientos in­
munosupresores, desnutrición, etc.
En los últimos años la biología molecular ha
hecho aportes fundamentales para la com pren­
sión de la etiopatogenia de muchas de estas en­
fermedades, a través del estudio de dos tipos de
animales genéticamente modificados;
1) Animales transgénicos, capaces de expre­
sar un producto génico humano.
610 Inmunopatología

2) Animales “knockout”, donde la precisa que de acuerdo a la hipótesis de Lyon, todas las
delación de genes ofrece la posibilidad del aná­ células somáticas de las mujeres tienen un sólo
lisis minucioso de sus funciones. cromosoma X activo; como la inactivación del
Paralelamente, los avances en el estudio del X ocurre al azar, el 50% de células de cada li­
genoma humano y el mapeo de genes relevan­ naje tendrá un X activo y el 50% restante el
tes, permitieron entender las bases moleculares otro. Se ha demostrado, por ejemplo, en muje­
de diversas inmunodeficiencias. res portadoras obligadas de agammaglobuline­
mia, que todos sus linfocitos B tienen el cro­
G enética mosoma X normal y ninguno el que porta el
defecto; es decir que no se produjo la inactiva­
La mayor parte de las IDP son hereditarias, ción al azar del X. En todas las otras células so­
resultante de distintos defectos genéticos. Hasta máticas estudiadas (linfocitos T, monocitos) se
hace pocos años el defecto molecular y genético encontró inactivación al azar. Este estudio per­
básico sólo se conocía para un número muy li­ mitió concluir que el gen normal en el cromo­
mitado de IDP [deficiencia de adenosina desa- soma X es esencial para la diferenciación B, ya
minasa (ADA), purinonucleótido fosforilasa que los precursores que inaetivaron el gen nor­
(PN P), enferm edad g ran u lo m ato sa cró n ica mal y sólo expresan el defectuoso, no conti­
(EGC)]. En los últimos dos años, gracias a los núan su diferenciación. Además, se concluye
adelantos de la genética y biología molecular, se que el defecto primario está sólo en el linaje B
describieron estas alteraciones en tres IDP liga­ y no afecta mecanismos regulatorios T, como
das al cromosoma X (ALX, inmunodeficiencia había sido postulado por algunos autores.
con hiper IgM, IDCS ligada al X) y se ha aisla­ Finalmente, estos datos explican la respuesta
do un nuevo gen denominado WASP, mutado inmune normal en portadoras del defecto.
en pacientes con síndrome de Wiskott-Aldrieh,
proponiéndose la alteración de este gen como Etiología y patogenia
responsable del síndrome. Las técnicas de biolo­
gía molecular que usan sondas para fragmentos En lo que respecta a su etiología, como diji­
polimórficos en el ADN, han contribuido al es­ mos, la mayor parte de las IDP son enfermeda­
tudio de familias informativas, con uno o más des hereditarias producidas por distintos defec­
miembros afectados y con ello han permitido, tos genéticos.
por un lado conocer la localización cromosómi- La patogenia de estos variados síndrom es
ca de los genes afectados y, por otro, al diagnós­ responde a distintos mecanismos. Mencionare­
tico prenatal y de portadores. En el cuadro 30-1 mos algunos de ellos, que serán ampliados al
se mencionan algunos de estos ejemplos. T e­ describir cada una de las enfermedades.
niendo en cuenta que las IDP son en general en­
fermedades graves para las que las conductas te­ 1) Defectos madurativos (véase fig. 30-1)
rapéuticas son escasas en la actualidad, el diag­ 2) Déficit enzimáticos, como la deficiencia
nóstico de portador y el diagnóstico prenatal ad­ de ADA y PNP.
quieren importancia para el consejo genético. 3) Alteraciones regulatorias, como se ha pro­
Muchas de las IDP son enferm edades con puesto para la deficiencia de IgA y el síndrome
transmisión genética ligada la sexo (agamma­ de hiper-IgE.
globulinem ia, IDCS, etc.). En estos casos el 4) Fallas en la activación del linfocito T co­
diagnóstico de portadoras puede realizarse tam­ mo en el déficit de expresión de CD3y y CD3e.
bién estudiando la distribución de los cromoso­ 5) A lteraciones en la producción de linfo­
mas X activos en distintos linajes celulares. Pa­ quinas.
ra entender este concepto, debemos recordar 6) Fallas en las vías metabólicas. Ej. EGC.

C uadro 30-1. Localización genética de algunas inmunodeficiencias p or sondas de ADN

Enferm edad L ocalización genética Sonda ligada al defecto

A g a n im a g lo b u lin e ra ia lig a d a al X X q 2 l.3 - q 2 2 DX S17

ID C S lig a d a al X X q U - q l3 D X S159

S ín d ro m e d e W is k o tt-A ld ric h X p l 1-pl 1.3 D X S7

D e fic ie n c ia c o n h ip e r X q 2 4 -q 2 7 D X S42
Ig M lig a d a al X

Di George
Serie Piaquetas
mieioide
F ig . 3 0 -1 . L o c a liz a c ió n d e lo s d e fe c to s m a d u r a tiv o s en las d ife re n te s in m u n o d e fic ie n c ia s p rim a ria s.
Manifestaciones clínicas generales
La manifestación clínica fundamental es la
exagerada susceptibilidad a la infección. Los
pacientes con IDP presentan infecciones recidi­
vantes y prolongadas, en general graves y com ­
plicadas, así como infecciones por microorga­
nismos no patógenos para la población normal.
Siendo éstas generalm ente enferm edades
congénitas o hereditarias, se presentan con m a­
yor frecuencia (60%) en lactantes o niños. El
antecedente de familiares con infecciones seve­
ras o muerte temprana constituye un dato im­
portante de la historia clínica. Las inmunodefi­
Inmunodeficiencias 611
Déficit de interieuquinas
Déficit de componentes de CD3
ciencias predominantes de anticuerpos son las
más frecuentes, constituyendo aprox.imada-
mente el 50% de todas las IDP. En cuanto a la
distribución por sexo, la incidencia es m ayor
en varones, hecho que se explica por la trans­
misión ligada al cromosoma X en muchas de
ellas.
El aparato respiratorio es el más comprome­
tido por los procesos infecciosos, siendo los
pacientes especialmente propensos a la sinusi­
tis, otitis supuradas, bronquitis y neum onía.
Las infecciones recidivantes del parénquim a
pulmonar conducen con frecuencia al desarro­
llo de bronquiectasias. Otras localizadtmes de
612 Inmunopatología

procesos infecciosos recidivantes son la piel, el B. IN M U N O D E FIC IE N C IA S P R E D O M I­

aparato digestivo y sistema nervioso central. La NANTES DE ANTICUERPOS
diseminación de las infecciones puede conducir
a sepsis. Las vías urinarias se comprometen só­ B l. Agammaglobulinemia ligada al X (ALX)
lo excepcionalmente en las IDP. B2. Agammaglobulinemia ligada al X con dé­
Los microorganismos responsables de las in­ ficit de hormona de crecimiento
fecciones dependen del sector de la respuesta in­ B3. Inmunodeficiencia con hiper IgM
mune predominantemente alterado. En las inmu­ B4. Deleción del gen de cadenas pesadas
nodeficiencias de anticuerpos los agentes res­ B5. Deficiencia de cadenas kappa
ponsables suelen ser gérmenes piógenos encap­ B6. Deficiencia de IgA
sulados, extracelulares, como estreptococo, Hae- B7. Deficiencia de subclases de IgG
mofilus influenzae, estafilococo. En las deficien­ B8. Inmunodeficiencia común variable
cias celulares se producen infecciones por virus B9. Hipogammaglobulinemia transitoria de la
(citomegalovirus, hei-pesvirus, etc.), hongos co­ infancia
mo la Cándida albicans y agentes de baja pato­
genicidad como el Pneumocistis carinii. En los C. INMUNODEFICIENCIAS ASOCIADAS A
defectos de fagocitosis, las bacterias catalasa po­ OTRAS ANOMALÍAS BIEN DEFINIDAS
sitivas, fundamentalmente el Staphyíococcus au­
reus y en las deficiencias de los componentes C 1. Síndrome de Wiskott-Aldrich
tardíos del sistema complemento (C5-C9), los C2. Ataxia telangiectasia
gérmenes gram negativos tipo Neisseria. C3. Síndrome de Di George
Los síntomas clínicos del tracto gastrointes­
tinal, diarrea crónica y/o malabsorción son re­ D. OTROS SÍNDROM ES ASOCIADOS A
lativamente frecuentes así como el retraso pon- INMUNODEFICIENCIA
do-estatural en los niños. Otras m anifestacio­
nes menos frecuentes son la hepatoesplenome­ D I. Síndrome de hiper IgE
galia, derm atitis seborreica, eccema, anemia, D2. Candidiasis mucocutánea crónica
neutropenia. Algunos signos clínicos se presen­ D3. Inmunodeficiencia con respuesta inadecua­
tan asociados a síndrom es bien definidos y da al virus de Epstein Barr.
contribuyen a su diagnóstico; así, por ejemplo, D4. Síndromes de albinismo parcial
se encuentra hemorragia por trombocitopenia, D5. Enanismo de miembros cortos
y eccema en el síndrome de W iskott-Aldrich y E. DEFECTOS EN LA FUNCIÓN DE LOS
tetania por hipocalcem ia y cardiopatía en el FAGOCITOS
síndrome de Di George y telangiectasias y ata­
xia en la ataxia-telangiectasia. E l . Enfermedad granulomatosa crónica (EGC)
La clínica de las IDP no es claramente dis­ a) ligada al X
tintiva y permite sólo orientar el diagnóstico. b) autosómica recesiva
En todos los casos, el diagnóstico definitivo E2. Deficiencia de adhesión leucocitaria
deberá establecerse mediante procedim ientos E3. Deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidro-
apropiados de laboratorio que permitan evaluar genasa en neutrófilos
la competencia inmunológica. E4. Deficiencia de mieloperoxldasa
E5. Deficiencia de gránulos secundarios
Clasificación de las IDP
F. D EFIC IEN C IA S D EL SISTEM A C O M ­
El Comité de Expertos en Inm unodeficien­ PLEMENTO
cias Primarias de la Organización Mundial de
la Salud (OMS, 1992) clasificó a las IDP en: F l. C lq F6. C5 F ll . C l inhibidor
F2. C lr F7. C6 F12. Factor I
A INMUNODEFICIENCIAS COMBINADAS F3. C4 F8. C7 FI3. Factor H
F4. C2 F9. C8 F14. Factor D
A l. Combinada severa (IDCS) F5. C3 FIO. C9 F15. Properdina
a) ligada al X (LX)
b) autosómica recesiva (AR) Se describirán los síndromes más importan­
A2. Deficiencia de ADA tes dentro de cada categoría.
A3. Deficiencia de PNP
A4. Deficiencia en la expresión de moléculas Inmunodeficiencia combinada severa
HLA clase II (IDCS)
A5. Disgenesia reticular
A6. Deficiencias de expresión de CD3 o CD3 Constituyen las enferm edades más graves
A7. Deficiencia de células CDS dentro de las IDP. Se presentan en los primeros

meses de vida y son un conjunto de síndromes
con transmisión genética autosómica recesiva o
ligada al sexo. Sólo la reconstitución del siste­
ma inm une m ediante trasplantes de m édula
ósea perm ite la sobrevida de estos enfermos
que, de no ser tratados, mueren como conse­
cuencia de infecciones severas antes del segun­
do año de vida. Los pacientes presentan fre­
cuentes episodios de otitis, neumonías, infec­
ciones cutáneas y sepsis severas, asociadas a
diarrea incontrolable y pérdida progresiva de
peso. Predominan las infecciones por agentes
micóticos (candidiasis severas), virales (herpes
virus, varicella, enterovirus), parasitarios y gér­
menes oportunistas.
Las IDCS son un grupo heterogéneo de sín­
dromes alguno de los cuales son considerados
típicos o clásicos, porque invariablemente pre­
sentan linfopenia marcada, agammaglobuline­
mia y ausencia de función inmune humoral y
celular. Estos son:
1. IDCS autosómica recesiva (AR), conocida
como tipo Suizo, que abarca aproxim ada­
mente el 25% de las IDCS clásicas.
2. IDCS ligada al X (LX), la más frecuente,
comprende el 50% de las clásicas, caracteri­
zada por ausencia de linfocitos T y valores
normales o elevados de linfocitos B.
3. D eficiencia de ADA, com prende 20-25%
del total, caracterizada por ausencia o nive­
les muy bajos de linfocitos T. Los linfocitos
B pueden estar ausentes o normales.
4. Deficiencia de PNP.
5. D isgenesia reticular, síndrom e muy poco
frecuente, cjue asocia a la deficiencia inm u­
ne trombocitopenia y granulocitopenia.
Los otros síndromes de IDCS, algunos re­
cientemente descritos, pueden ser considerados
como atípleos, ya que pueden presentarse con
recuentos linfocitarios normales, grados varia­
bles de hipogam m aglobulinem ia, en algunos
casos, valores normales y sólo alteraciones fun­
cionales. En las IDCS atipicas, además, la gra­
C uadro 30-2. Características Inmunológicas diferenciales de la AR y LX
Caracterí.s'tica:
Ligada al X
lin f o c ito s /m m - ’
C é lu la s T/m m -’
C é lu la s B /m m ’
C é lu la s N K /m m ’ fu n cio n a l
R e s p u e s ta a m itó g e n o s, a n tíg e n o s y a lo a n tíg e n o s
I n m u n o g lo b u lin a s
D e fe c to g e n é tic o
D: dism inuido; M D : m uy d ism in u id o ; A; a u se n te ; E: elevado; N: n o rm al.
Inmunodeficiencias 613
vedad del cuadro clínico puede ser variable aun
en varios miembros de una misma familia con
el mismo defecto molecular. En estos síndro­
mes atípicos se incluyen: la deficiencia de m o ­
léculas del Complejo Mayor de Histocompati­
bilidad (CMH) de clase II, la deficiencia de e x ­
presión de moléculas del complejo CD3, la d e ­
fic ie n c ia de tiro sin a q u in asas aso ciad as al
CD3/1’CR (ZAP-70), que fenotípicamente p re ­
senta ausencia de células CD8, a la que pueden
agregarse los raros casos de IDCS asociados a
enanismo de miembros cortos, así como el sín­
drome de Ommen (véase más adelante).
IDCS típicas o clásicas. La forma autosóm i­
ca recesiv a (AR) es indistinguible desde el
punto de vista clínico de la LX. Existen sin
embargo diferencias inmunológicas que perm i­
ten distinguirlas (véase cuadro 30-2). En lo re ­
ferente al defecto genético y molecular, se sa­
be hoy t|ue el gen mutado en la LX, correspon­
de al que codifica para la cadena y del IL-2R.
Esta cadena es esencial para la formación de
un receptor de alta afinidad y la transducción
de señales de activación T. En los pacientes
con la form a LX se han documentado distintas
mutaciones puntuales en los exones de dicho
gen. La anomalía de cadena y en estos pacien­
tes explica la ausencia de respuesta T. La ca ­
dena Y del receptor IL~2R también forma parte
del IL-7R, y de otros receptores de citoquinas.
La IL-7 es crítica para los estadios tem pranos
de la diferenciación tímica; esto explicaría la
ausencia de linfocitos T maduros en este sín­
drome.
En la forma AR no se conoce aún el defecto
genético básico, pero existen evidencias que
sugieren un defecto en alguno de los com po­
nentes del sistema recombinasa distintos a los
genes RAG, presumiblemente los asociados a
reparación del ADN con particular sensibilidad
a las radiaciones ionizantes.
Estudios recientes sostienen el concepto de
que esta deficiencia es equivalente al m odelo
m u rin o de in m u n o d e fic ie n c ia c o m b in a d a
“SCID”. En el ratón se documentó el defecto
Autosóm ica recesiva
MD D
MD 0 A MDo A
MDoA NoE
N oE A lte ra c ió n
MDo A MDo A
p a n h ip o g a m m a g lo b u lin e m ia
re c o m b in a s a ? c a d en a y I L -2 R
e n z im a s r e p a r a d o ra s A D N ?
614 Inmunopatología
en la recombinación V(D)J, tanto para el recep­
tor de células T (TCR) como para los genes de
inmunoglobulinas.
Deficiencias enzimáticos. La deficiencia de
ADA y la deficiencia de PNP son formas clási­
cas de IDCS. La enzima ADA participa en el
metabolismo de las purinas y está distribuida
en todos los tejidos del organismo, con la ma­
yor actividad en el timo. La deficiencia de esta
enzima determina la acumulación de los sustra­
tos y metabolitos dATP y S-adenosil-homocis-
teína, que inhiben la proliferación celular y sín­
tesis de ADN por inhibición de la ribonucleóti-
do reductasa (fig. 30-2). Estos metabolitos pro­
ducen además efecto tóxico que genera ruptu­
ras cromosómicas. Se han identificado recien­
temente numerosas variantes de deficiencia de
ADA, muchas de las cuales se deben a muta­
ciones puntuales del gen, que dan lugar a una
forma inactiva o inestable de la enzima y for­
mas clínicas moderadas o leves de la enferme­
dad. Excepcionalmente se han descrito delecio-
nes del gen en la región catalítica de la enzima,
que producen las deficiencias clínicas más se­
veras, clásicamente descritas.
En la deficiencia de PNP se produce acumu­
lación de dGTP y la inactivación de ribonu-
cleótido reductasa, con inhibición de síntesis de
ADN que sería la causa de la inmunodeficien­
cia. Por razones no bien conocidas, la deficien­
cia es predominantemente celular con células B
ADN
RR
dATP
ADP dADP
AMP
Ácido úrico
F ig . 3 0 -2 . P a rtic ip a c ió n d e las e n z im a s A D A y P N P e n el m e ta b o lis m o d e las p u rin a s.
e inmunoglobulinas normales. En estos pacien­
tes se observa aumento de inosina y guanosina
en plasma y de deoxiguanosina en orina.
IDCS atipicas. La deficiencias de MHC de
clase II se incluye en esta categoría. Clínica­
mente, es una forma grave de IDCS y los datos
actuales sugieren que la deficiencia está causa­
da por defectos de genes reguladores y no es­
tructurales, ocasionando un defecto en la trans­
cripción de los genes que codifican las molécu­
las de clase II. La mayoría de los pacientes con
este síndrome tiene una reducción variable de
células CD4+. Esto sugiere la existencia de al­
gún tipo de CMH clase II en el timo o bien que
la selección de estas células CD4 no es absolu­
tamente dependiente de CMH clase II clásicas.
Otros síndromes de esta categoría son las de­
ficiencias de expresión de moléculas del com ­
plejo CD3. Se han descrito mutaciones en los
genes para la cadena CD3y y CD3 e . Esto deter­
m ina un defecto parcial en la expresión del
complejo CD3. Las moléculas CD4 y CD8 se
expresan normalmente, por lo que el estudio de
fenotipo linfocitario contribuye al diagnóstico
de esta entidad (valores norm ales de células
CD4/CD8 con valores descendidos de CD3).
La expresión clínica es variable aun en dis­
tintos miembros de una misma familia, con pa­
cientes graves que requieren trasplante de m é­
dula ósea (TMO) y otros que presentan sólo in­
fecciones recidivantes moderadas.
RR
dGTP
dGDP. . GDP
GMP
RR: Ribonucleotidii-Reductasa

El Síndrome de Ommen se caracteriza por
manifestaciones clínicas y de laboratorio d is­
tinguibles de las otras IDCS hasta ahora descri­
tas. Presentan alteraciones derm atológicas y
diarrea severas, hepatoesplenomegalia y adeno-
patías, linfocitosis, eosinofilia y aumento de
IgE. Se postula que esta patología tendría un
defecto molecular similar pero menos severo
que la IDCS-AR, ya que los pacientes presen­
tan linfocitos T oligoclonales (que exhiben po­
cas familias V(3). La expansión de clones T con
infiltración en ciertos tejidos como piel e intes­
tino podría ser el resultado de la especificidad
autoinmune de algunos de estos clones, en el
contexto de una selección tímica negativa alte­
rada.
R ecientem ente se han com unicado IDCS
producidas por defectos en la transcripción de
genes que codifican distintas citoquinas (IL-2,
IL-4, IL-5). Los estudios in vitro, sugieren que
el defecto primario sería de las proteínas nu­
cleares reguladoras de la expresión de dichos
genes. Se han descrito, asimismo, déficit espe­
cíficos en la producción de IL-2, con ausencia
de ARNm para IL-2 por defecto en la trans­
cripción de su gen, pero con expresión normal
del IL-2R.
Deficiencias predominantes
de anticuerpos
Agammaglobulinemia ligada al X
Se presenta en varones y las manifestaciones
clínicas comienzan entre los 9 y 12 meses. El
pasaje transplacentario de anticuerpos m ater­
nos confiere protección y evita la expresión de
la enfermedad más tempranamente. Las infec­
ciones que presentan estos pacientes incluyen:
sinusitis, otitis, bronquitis, neumonías y en oca­
siones formas más graves como meningitis y
sepsis. Las infecciones recurrentes conducen
con frecuencia a bronquiectasias e insuficiencia
respiratoria. Las infecciones por agentes virales
son bien controladas con excepción del virus
de hepatitis y los enterovirus. Se han descrito
Dominio N-terminal
Función
desconocida
Fig. 30-3. Esquem a de la estructura de la btk. Las flechas señalan los puntos de mutación conocidos.
Inmunodeficiencias 615
parálisis por vacunación con poliovirus atenua­
dos, así como infecciones severas progresivas y
fatales por echovirus en el sistem a nervioso
central. En el examen físico se destaca la hipo-
plasia linfática con ausencia de tejido adenoi­
deo y amigdaUno. La concentración sérica de
todas las inmunoglobulinas se encuentra fran­
camente descendida. La IgG suele ser inferior a
200 mg/dl y la IgM e IgA están ausentes. La
ausencia de linfocitos B maduros y la presencia
de células pre-B en médula ósea es característi­
ca de este síndrome, indicando un freno m adu­
rativo a este nivel.
El defecto genético fue hallado en el año
1993 y se trata de la mutación de un gen del
crom osom a X que codifica para una tirosina
quinasa llamada atk o btk que se expresa en to­
das las células del linaje B y mieloides pero no
en células T. Esta enzim a posee hom ologías
con la familia de tirosina quinasas src, con se­
cuencias únicas a esta atk. Se sugiere que la atk
tiene la función de iniciar las señales en la cé­
lula preB para rearreglar las cadenas livianas,
después que las cadenas pesadas se expresan en
la superficie.
El clonado del gen de la atk permitió corre­
lacionar las variaciones moleculares específi­
cas con alteraciones fenotípicas y funcionales.
Dicha enzim a tiene un dominio N-term inal de
función desconocida y otro dominio quinasa
con función catalítica (fig. 30-3). En este últi­
mo se encontraron todas las mutaciones en los
p acie n tes con ALX típicas. Es posib le que
form as m enos severas de A LX se d e b a n a
m utaciones en las porciones no quinasa del
gen.
El descubrim iento del atk permite el d iag ­
nóstico de ALX en pacientes sin historia fam i­
liar de la enfermedad y posiblemente en el fu­
turo su tratamiento con terapia génica.
El pronóstico de estos pacientes es bueno si
se hace el diagnóstico precoz y se instituye el
tratam iento sustitutivo con gam m aglobulina
preventivo de las infecciones recurrentes. La
complicación más frecuente es la enfermedad
pulmonar crónica e insuficiencia respiratoria.
ALX ALX
atípica típica
ISH3 SH2 Dominio quinasa
\ Región de inter- \ Función
I acción entre ' catalítica
; proteínas I
616 Inmunopatología
Deficiencia de inm unoglobulinas
con hiper IgM
Al igual que los pacientes con agammaglobu-
linemia, las infecciones piógenas del aparato
respiratorio comienzan en el 1“' o 2-’ año de vi­
da. Se diferencian clínicamente por presentar hi-
perplasia del tejido linfoideo, con adenomega-
lias, amígdalas hipertróficas y esplenomegalia.
El hallazgo inmunológico característico es el
aumento de IgM, con valores que superan los
1.000 mg/dl y concentraciones muy bajas de
IgG, IgA e IgE. La inmunidad celular suele ser
normal, pero se encuentran casos con alteración
numérica y funcional de las células T. In vitro,
las células de estos pacientes estimuladas con
PW M sintetizan IgM pero son incapaces de
producir IgG o IgA, sugiriendo un defecto en el
estadio de cambio de isotipo de inmunoglobuli­
nas. La enfermedad es ligada al X, si bien se
han descrito algunos pacientes del sexo femeni­
no como formas esporádicas o adquiridas.
El gen responsable es el que codifica para el
ligando de CD40 (véase cap. 10). Esta proteína
gp39, que se expresa normalmente en células T
activadas, es imprescindible como señal para el
cam bio isotípico de inm unoglobulinas. Este
descubrimiento permitió establecer claramente
que la deficiencia con hiper IgM es un defecto
primario T y no B como se pensó siempre. Se
ha comprobado que el agregado in vitro de an­
ticuerpos anti CD40 e IL-4, permite la diferen­
ciación de linfocitos B de estos pacientes, lo
que abre una posibilidad terapéutica futura.
Deficiencia selectiva
de inmunoglobulina A
Es la más frecuente de las IDP. Se caracteri­
za por la variabilidad en la forma de presenta­
ción y severidad clínica. La deficiencia selecti­
va de IgA puede ser asintomática y su inciden­
cia en la población normal es de 0,1 a 0,2%.
Este hecho puede vincularse a la existencia de
mecanismos compensatorios, tales como la sín­
tesis local de IgM capaz de com binarse con
pieza secretoria en las mucosas.
Cuando la deficiencia de IgA tiene manifes­
taciones clínicas, las más frecuentes son las in­
fecciones recidivantes del aparato respiratorio
y el compromiso del tracto digestivo, con dia­
rrea crónica o síndrome de malabsorción. Estas
manifestaciones son las esperables si se tiene
en cuenta que la IgA es la inm unoglobulina
fundamental de las secreciones. La deficiencia
de IgA puede asociarse además, y presentarse,
con las manifestaciones clínicas características
de enfermedades autoinmunes (artritis reuma­
toidea, lupus eritem atoso sistém ico, etc.) y
alérgicas. Los pacientes presentan con frecuen­
cia anticuerpos contra proteínas de la leche de
vaca y autoanticuerpos.
La mayoría de los pacientes presentan m ar­
cada disminución de IgA sérica (< de 5 mg/dl)
y ausencia de IgA secretoria; sólo excepcional­
mente se han descrito casos con IgA sérica nor­
mal y deficiencia de IgA secretoria. El defecto
básico en la deficiencia de IgA no se ha aclara­
do aún. Sin embargo, la presencia de linfocitos
con IgA de superficie que coexpresan IgM e
IgD sugieren una falla en la diferenciación ter­
minal de estas células. También se han descrito
alteraciones regulatorias T.
Adem ás, aproxim adam ente el 20% de los
pacientes con deficiencia de IgA presentan aso­
ciado, deficiencia de subclases de IgG. En pa­
cientes pediátricos, se ha docum entado tam ­
bién, deficiencia parcial o transitoria de IgA
(los valores de IgA se hallan por debajo de dos
d esv ío s e stá n d a r del v alo r n o rm al p ara la
edad). Es decir, que la deficiencia de IgA es en
realidad una inmunodeficiencia más compleja
que lo que sospechábamos hace algunos años y
podría tratarse en realidad, como proponen al­
gunos investigadores, de una forma de expre­
sión clínica menos grave de la IDCV que, co­
mo se sabe, es una pan-hipogammaglobuline-
mia. Apoyan esta hipótesis el hecho de que am­
bas pueden ocurrir en miembros de una misma
familia y que ambas se asocian con los mismos
haplotipos HLA, es decir, podrían tener la mis­
ma susceptibilidad genética. Dentro del sistema
HLA, los genes de susceptibilidad parecen es­
tar más asociados a los genes de complemento
(C4) que a las moléculas HLA clásicas.
Es importante señalar, por la relevancia clí­
nica y el posible rol patogénico, que un porcen­
taje elevado (40-50%) de pacientes con defi­
ciencia de IgA tienen anticuerpos anti-IgA cir­
culantes y pueden presentar reacciones anafi-
lácticas severas si reciben productos que con­
tienen IgA. Por esta razón está contraindicada
la administración de sangre, plasma o gamma-
globulina endovenosa o intramuscular. El pro­
nóstico de estos enfermos es el de las enferme­
dades asociadas.
Deficiencias de subclases de IgG
Se han descrito en los últimos años deficien­
cias selectivas de subclases de IgG (IgG,, IgG^,
IgG j, IgG^) que se m anifiestan clínicam ente
con infecciones respiratorias recidivantes. En
los niños por debajo de los 15 años predomina
la deficiencia de IgG^ y en los adultos la de
IgG,,. Los niveles de IgG total pueden ser nor­
males, debido a la producción aumentada de
las subclases no comprometidas o bien a que la
co ncentración norm alm ente b aja de alguna
subclase (IG2, IgG3 o IgG4) no modifica signi-

ficalivamente el valor total de inmunoglobuli­
nas. Como dijimos anteriormente, la deficien­
cia de subclases de IgG puede asociarse a defi­
ciencia de IgA.
La tínica forma de establecer el diagnóstico
de la deficiencia de subclases es mediante su
cuantificación. Debemos señalar que las técni­
cas actualmente en uso no están bien estandari­
zadas, y son muy pocos los centros que cuentan
con valores normales propios. En los niños por
debajo de los 2 años de edad, la ontogenia nor­
mal del sistema inmune, hace aun más difícil el
diagnóstico de deficiencia de subclases de IgG.
Teniendo en cuenta que las diferentes subcla­
ses responden preferentemente a diversos tipos
de antígenos (por ej. IgGl e IgG3 a Ags protei­
cos como toxoide tetánico y diftérico; IgG2 a
Ags polisacáridos como el neumococo), es im ­
portante evaluar la funcionalidad de los anti­
cuerpos en todos los casos.
A dem ás, estas deficiencias pueden variar
con el tiempo y un paciente con deficiencias de
una subclase puede agregar otra o bien cambiar
a otra subclase. Este diagnóstico debe hacerse
con cautela hasta que se reúna más experiencia
que aclare los mecanismos de su producción y
la importancia clínica de esta deficiencia.
Inm unodeficiencia com ún variable (ICV)
Se incluye bajo esta denominación no a una
sola enfermedad sino a un conjunto de síndro­
mes cuya etiología y mecanismos patogénicos
no están bien definidos. Se caracterizan por la
pan-hipogammaglobulinemia, con recuentos de
linfocitos B normales.
Clínicamente, es similar en muchos aspectos
a la agammaglobulinemia ligada al sexo. Se di­
ferencia de ella fundam entalmente por el co ­
mienzo más tardío de los síntomas (mayor fre­
cuencia en la segunda década de la vida), la
distribución igual en ambos sexos y la hiper-
p lasia del tejido lin fátic o (ad en o m eg alias,
amígdalas hipertróficas, esplenomegalia).
C uadro 30-3. Estudios de laboratorio para el diagnóstico diferencial de los síndromes de ID P
Niveles
inm unoglobulinas
Síndrom e IgG IgM
A g a m m a g lo b u lin e m ia lig a d a u ií
al c ro m o s o m a X
I n m u n o d e fic ie n c ia c o m ú n u ii
v a ria b le
H ip o g a m m a g lo b u lin e m ia 4 a U N N
tra n s ito ria
D e fic ie n c ia s e le c tiv a d e Ig A N N
N: valores n o rm ale s, i ; v alores d ism in u id o s. valores m a rc a d a m e n le d ism in u id o s. * L infocitos B p o r inm u n o g lo b u lin as de s u p e r tic ie ,
linfocitos T p o r ró se la s E a 4 “C.
Inmunodeficiencias 617
Si bien el defecto fundamental es la produc­
ción deficiente de anticuerpos, la mitad de los
pacientes presentan además anormalidades de
la respuesta inmune celular.
La manifestación clínica más frecuente es la
infección piógena del aparato respiratorio. Es
común asimismo el compromiso del tracto d i­
gestivo, presentando los pacientes diarrea cró ­
nica o síndrome de malabsorción asociado o no
a hiperplasia nodular linfoide. Es frecuente la
infección del intestino con Giardia iamblia.
Los pacientes con ÍCV suelen desarrollar e n ­
fermedades autoinmunes particularmente púr­
pura trombocitopénica, anemia hemolítiea, ar­
tritis reumatoidea y síndrome de Sjógren. En es­
tos casos, si los síntomas iniciales son los de la
enfermedad autoinmune, el diagnóstico de in­
munodeficiencia suele ser difícil y más tardío.
La incidencia de tumores malignos del tejido
linfoide y aparato digestivo se encuentra au ­
mentada. Este hecho debe tenerse en cuenta en
el seguimiento clínico de estos pacientes.
Las anormalidades inmunológicas que carac­
terizan a la inmunodeficiencia común variable
se señalan en el cuadro 30-3; el defecto básico
en esta IDP no está aún definido. A pesar del
número normal de linfocitos B que presentan la
mayor parte de pacientes, éstos no responden
normalmente a la estimulación y no se diferen­
cian a células plasmáticas, sugiriendo una falla
en la diferenciación de la progenie B. En otros
casos, la alteración más importante radica en el
déficit de función cooperadora o bien exceso
de función supresora T. Finalmente, la presen­
cia de anticuerpos contra linfocitos B o T p u e ­
de estar involucrada en la patogenia de este
síndrome.
Como hemos mencionado antes para la d efi­
ciencia pura de IgA, algunos individuos con
ICV muestran asociación a determinados ha-
plotipos FILA.
El pronóstico depende en gran medida del
diagnóstico temprano y tratamiento preventivo
con gam m aglobulina. Las causas de m u erte
R e sp u e sta
N° linfocitos p r o li-
Anticuerpos Relación fe ra tiva
IgA p reexistentes B* T* C D 4IC D8 ' a P H A
il A u s e n te s A u se n tes N N N
i i A u s e n te s N o i N o i N o i N o i
N N N N N
i i se ^ N N N N o i
618 Inmunopatología
más frecuentes son la insuficiencia respiratoria
secundaria a enfermedad pulm onar crónica y
los tumores malignos.
Hipogammaglobulinemia transitoria
de la infancia
Este síndrome es considerado como una pro­
longación de la hipogammaglobulinemia fisioló­
gica que se observa en los lactantes normales
entre los 3 y 6 meses de vida. Esta hipogamma­
globulinemia es la resultante del catabolismo de
la IgG materna adquirida por pasaje transplacen­
tario, no compensada aún por la síntesis propia.
Los pacientes con hipogam maglobulinemia
transitoria presentan niveles descendidos de IgG
hasta los 12 a 24 meses de edad. Los niveles
normales de IgM e IgA, el número normal de
linfocitos B circulantes y la capacidad de res­
puesta a las inmunizaciones, permiten diferen­
ciarla de los otros síndromes de deficiencia pre­
dominante de anticuerpos (cuadro 30-3). Esta
diferenciación es importante ya que no está indi­
cado el tratamiento sustitutivo con gammaglo-
buUna en la deficiencia transitoria, exceptuados
aquellos casos con infecciones severas.
INMUNODEFICIENCIAS ASOCIADAS A
OTRAS ANOMALÍAS BIEN DEFINIDAS
Síndrome de Wiskott-Aldrich
Síndrome hereditario, ligado al cromosoma
X, caracterizado por eccema, trombocitopenia y
otitis recidivantes. Los pacientes presentan sus­
ceptibilidad aumentada a la infección por neu­
mococo y otros gérmenes encapsulados así co­
mo incidencia aumentada de enfermedades lin­
foproliferativas. Suele encontrarse descenso de
IgM y aumento de IgE y en algunos casos de
IgA. La respuesta inmune celular puede ser nor­
mal al comienzo, sufriendo luego un deterioro
progresivo con la evolución de la enfermedad.
Las plaquetas de estos pacientes son peque­
ñas y los linfocitos tienen vellosidades dismi­
nuidas, vistos por m icroscopia electrónica de
barrido. Asociado a estas anomalías morfológi­
cas, se detectó en estas células un déficit en la
expresión de CD43, molécula probablemente
involucrada en la activación de linfocitos T
(véase cap. 2, Apéndice). Aunque este déficit
contribuye a la patología, no constituye el de­
fecto fundamental, ya que esta enfermedad está
ligada al X y CD43 está codificado en cromo­
soma 16. En agosto de 1994 se ha aislado un
gen denominado WASP (proteína del Síndro­
me de W iskott Aldrich) propuesto como res­
ponsable del síndrome. Este gen se encontró
mutado en tres pacientes no relacionados, por­
tadores de este síndrome. C odifica para una
proteína de 501 aminoácidos, rica en Pro; se
postula que esta pro teína tendría un papel regu-
latorio de la íimción de hnfocitos y plaquetas.
Síndrome de Di George
Este síndrome se produce por un defecto en
la embriogénesis del 3“ y 4° arcos faríngeos,
que determina hipoplasia o aplasia tímica y pa-
ratiroidea, cardiopatía y facies características
(micrognatia, hipertelorismo, implantación baja
de pabellones auriculares).La presencia en va­
rios miembros de una misma familia y la pre­
sencia frecuente de alteraciones cromosómicas
(fundamentalmente en el cromosoma 22) su­
gieren una base genética productora de anoma­
lías en la embriogénesis.
El defecto tímico determina un aumento en
la susceptibilidad a infecciones micóticas y vi­
rales. Los casos con hipoplasia tímica y parati-
roidea son más frecuentes que los que presen­
tan aplasia y se denominan: Di George parcia­
les. El grado de compromiso de la respuesta in­
mune celular es variable: normal, deprimida o
ausente. Las células B así como los niveles de
inmunoglobulinas son normales, pudiendo en­
contrarse IgE elevada. Incrementos en los nive­
les de IgE se han encontrado en ésta y otras in-
m unodeficiencias con compromiso predom i­
nante de la inm unidad celular. Este hallazgo
dem uestra el im portante rol regulador de las
células T en la biosíntesis de IgE.
Ataxia telangiectasia
Es una enfermedad de herencia autosómica
recesiva caracterizada por inm unodeficiencia
progresiva de células T, asociada usualmente a
deficiencia de IgA e IgG2 e IgE. El ADN pre­
senta marcada fragilidad, observándose traslo-
caciones y rupturas cromosómicas que en los
linfocitos involucra a los loci del receptor T y
de las inmunoglobulinas.
Las células anormalmente sensibles a las ra­
diaciones ionizantes tienen alta frecuencia de
rupturas de ADN con defectos en la reparación.
Las alteraciones del ciclo celular pueden con­
ducir a rearreglos aberrantes y enfermedades
linfoproliferativas.
OTROS SÍNDROMES ASOCIADOS
A INMUNODEFICIENCIA
Síndrome de hiper IgE
Cursa con niveles excepcionalmente eleva­
dos de IgE (2.000 a 40.000 U/ml) asociados a
infecciones estafilocócicas severas, recidivan­

tes y eosinofilia. Si bien el defecto básico de
esta entidad es desconocida, se han encontrado
alteraciones en la respuesta inmune celular y la
función reguladora T, con déficit de la subpo­
blación T h l y predom inio de la Th2 (véase
caps. 2 y 18). También se ha encontrado aso­
ciación con déficit de subclases de IgG y de
respuesta específica a antígenos polisacáridos.
Inmunodeficiencia con respuesta
inadecuada al virus de Epstein-Barr
Es una enfermedad hereditaria ligada al cro­
mosoma X, conocida también como síndrome
de Duncan. Los individuos con este síndrome,
son varones aparentem ente sanos hasta que
contraen la infección con el virus de Epstein
Barr y desarrollan mononucleosis infecciosa.
La evolución de la in fecció n es fatal en el
60-70% de los pacientes. La mayoría de los
que sobreviven desarrollan, en distintos tiem ­
pos, linfomas B o hipogammaglobulinemia.
La característica de este síndrome es la inca­
pacidad de producir anticuerpos contra el antí­
geno nuclear del virus (EBNA) siendo normal
la respuesta al antígeno de la cápside (UCA).
Se encuentra además deficiencia en la respues­
ta celular específica contra el virus de Epstein-
Barr y déficit de la función citotóxica anticuer­
po dependiente (ADCC). El estudio de las po­
blaciones linfocitarias muestra un incremento
significativo de la población CD8.
Síndromes de albinismo parcial
Comprende el Síndrome de Chediak-Higashi
y el Síndrome de Griscelli. Ambos síndromes
posee un patrón de herencia AR, con albinismo
parcial oculocutáneo. En ambos la clínica se
caracteriza por infecciones piógenas frecuentes
y por presentar las llamadas crisis aceleradas
con gran compromiso sistémico, fiebre, panci-
topenia, hepatoesplenomegalia por infiltración
linfohistiocitaria y altos niveles de citoquinas
(IL-l, lE N a , TNF, IL-6) circulantes. Se postu­
la una activación macrofágica inadecuada vin­
culada a la patogenia de la fase acelerada de es­
tos síndromes. El síndrome de Chediak Higashi
se caracteriza por la presencia de gránulos cito-
plasmáticos gigantes lisosomales en los neutró-
filos. En ambos síndrom es se encuentra una
disminución importante de función NK así co­
mo de la quimiotaxis.
Deficiencias de la respuesta inmune
inespecífica
Son deficiencias poco frecuentes y constitu­
yen en su conjunto aproximadamente el 20%
del total de las IDP.
Inmunodeficiencias 619
Deficiencias del sistema complemento
Se han descrito deficiencias genéticas de to­
dos los componentes del sistema complemento
pero sólo algunas de ellas (deficiencia de C3,
C5, C7 y C8) se asocian con una mayor sus­
ceptibilidad a las infecciones y deben diferen­
ciarse de otras IDP. El tipo de procesos infec­
ciosos que presentan los pacientes con d e fi­
ciencia de C3 es similar al que se encuentra en
las deficiencias predominantes de anticuerpos,
mientras que los pacientes con deficiencias de
componentes tardíos presentan infecciones por
gérmenes gram negativos del género Neisseria
(gonococo, meningococo). La normalidad de la
actividad hem olítica total (CH50) p erm itiría
excluir prácticamente todas las deficiencias p ri­
marias del sistema complemento. Estas en fer­
medades se transmiten como autosómicas rece­
sivas y puede detectarse al portador heterocigo-
ta porque su suero contiene el 50% de los nive­
les normales del componente deficiente.
C uando el CH50 se encuentra dism inuido
deberá realizarse la evaluación de los distintos
componentes del sistema. El estudio funcional
de estos com ponentes u tiliza m eto d o lo g ías
complejas realizadas sólo por laboratorios alta­
mente especializados.
La deficiencia del inhibidor de la C l-estea-
rasa presenta manifestaciones clínicas bien de­
finidas de edema angioneurótico. El diagnósti­
co puede realizarse valorando directam ente al
inhibidor o bien a los componentes C3 y C4.
Aun en ausencia de manifestaciones clínicas se
encontrará descenso marcado de C4 con v alo ­
res normales de C3.
Las deficiencias de componentes tempranos
del sistema complemento, C2 y C4 tienen m a­
nifestaciones clínicas similares a diversas e n ­
fermedades autoinmunes, especialmente lupus
eritematoso sistémico.
Deficiencias de la fagocitosis
Las deficiencias pueden ser cuantitativas
(granulocitopenias) o funcionales. Las granulo-
citopenias son importantes y frecuentes en las
deficiencias secundarias a enfermedades linfo-
prohferativas, tratamientos inmunosupresores,
etc.; o bien pueden ser el resultado de excesiva
destrucción por anticuerpos antileucocitarios.
Las neutropenias primarias, hereditarias, son en
cambio, poco frecuentes. Las deficiencias fu n ­
cionales incluyen una variedad de síndrom es
bien caracterizados, que se mencionan en el
cuadro 30-4.
En algunos de los síndromes la alteración
predom inante se encuentra en la movilidad y
adherencia, con células fagocíticas que no re s­
ponden apropiadamente a los estímulos leuco-
620 Inmunopatología
Cuadro 30-4. Defectos de la función de fagocitos
D esignación
E l E n fe rm e d a d g ra n u lo m a to s a
c ró n ic a
a) L ig a d a al X
b) A u to s ó m ic a re c e s iv a
E 2 d e fic ie n c ia d e a d h e sió n le u c o -
c ita rla (def. d e c a d e n a b e ta d e
L F A -1 M a c l , p . 1 5 0 ,9 5 )
E 3 D e fic ie n c ia d e g lu c o s a 6 fo s f a ­
to d e s h id ro g e n a s a
E 4 D e fic ie n c ia d e m ie lo p e ro x id a -
E 5 D e fic ie n c ia d e g rá n u lo s s e c u n ­
d a rio s
citarios. En otros, se encuentra deficiencia en la
capacidad de ingestión de microorganismos y
muerte intracelular determinada por la incapa­
cidad de las células fagocíticas para usar el oxí­
geno molecular y generar radicales de oxígeno
microbicidas (peróxido de hidrógeno, anión su­
peróxido).
Enfermedad granulomatosa crónica (EGC)
C onstituye el síndrom e prototipo de d efi­
ciencia de ingestión y muerte intracelular. La
manifestación clínica fundamental es la infec­
ción recidivante de piel y tejido subcutáneo por
gérm enes catalasa positivos {Staphylococcus
aureus, Nocardia, etc.), con la formación de
granulomas asociados a hnfadenopatías y hepa-
toesplenomegalia. Comienza en la primera in­
fancia y es de evolución grave, aun con trata­
miento antibiótico adecuado.
Es una enfermedad hereditaria debida a de­
fectos moleculares heterogéneos en el sistema,
de la NADP-oxidasa (fig. 30-4). Esta enzima,
que cataliza el estallido respiratorio, está com­
puesta por al menos 4 subunidades: una gluco­
proteína de alto PM, gp91-phox (oxidasa de los
fagocitos), y la p22-phox, ambos componentes
del citocromo b; y las subunidades p47-phox y
p67-phox, componentes citosólicos. La EGC
puede resultar de la alteración de cualquiera de
estas subunidades, con lo que se explica la he­
terogeneidad molecular y genética de esta en­
fermedad. Sobre la base de estos conocimien­
tos se ha propuesto recientemente una clasifi­
cación de la EGC en 4 tipos: 1) mutaciones o
deleciones en el gen que codifica la gp91, con
herencia LX, siendo éste el más frecuente de
los defectos (50-60% de los casos de EGC); 2)
defecto del gen que codifica p22 del citocromo
b; es de herencia AR; 3) y 4) corresponden a
C élulas afectadas D efecto fu n cio n a l H erencia
fa g o c ito s In c a p a c id a d d e d e s tru ir los m ic ro b io s fag o - LX
c ita d o s c o n a lte ra c ió n e n la p ro d u c c ió n d e AR
a n ió n su p e ró x id o p o r d e fe c to d e N A D H -
o x id a s a
f a g o c ito s D e fe c to s d e la m o v ilid a d , a d h e re n c ia , qui- AR
lin fo c ito s m io ta x is y e n d o c ito s is
NK
n e u tró filo s D e fe c to d e la a c tiv id a d m ic ro b ic id a AR
fa g o c ito s D e fe c to d e la a c tiv id a d m ic ro b ic id a AR
n e u tró filo s D e fe c to d e la a c tiv id a d m ic ro b ic id a . A u s e n ­ AR
c ia d e g rá n u lo s d e la c to fe rrin a
deficiencias de las proteínas citosólicas p47 y
p67, ambas con herencia AR.
Se ha demostrado in vitro que el lEN es ca­
paz de estimular el estallido respiratorio. Los
ensayos clínicos han dem ostrado beneficios
con el uso de IFN en esta patología.
La incapacidad de los neutrófilos de los pa­
cientes de reducir el nitroazul de tetrazolio, es
un examen sencillo y títil para su diagnóstico.
Deficiencia en la expresión de proteínas
de adhesión: LFA-1, C3bi, pl50-95
Esta deficiencia autosómica recesiva resulta
de un defecto en la biosíntesis de una glucopro­
teína de membrana de 95 Kd (cadena (3) que es
común al receptor para complemento C3bi, al
antígeno LFAl y a la proteína p 150-95. La ca­
dena P se encuentra ligada por uniones cova-
lentes a distintas cadenas a (véase cap. 11) p a­
ra constituir los antígenos m encionados. Las
proteínas de adhesión tienen amplia distribu­
ción en distintos tipos celulares. El receptor
C3bi se expresa en neutrófilos, monocitos, m a­
crófagos, eosinófilos y células NK. El antígeno
L F A l, en células B, T y NK.
Esta IDP es compleja y, si bien ha sido in­
cluida por la QMS entre los defectos de fagoci­
tosis (cuadro 30-4), presenta alteraciones de la
función linfocitaria que permiten considerarla
un síndrome de deficiencia más amplio, de cé­
lulas linfocitarias y fagocíticas. Los pacientes
presentan como característica, el antecedente
de separación tardía del cordón umbilical, con
onfalitis. Son frecuentes las infecciones recidi­
vantes de piel, otitis, abscesos perianales y de­
fectos en la cicatrización de heridas.
Las anomalías inmunológicas incluyen: alte­
raciones en la adherencia, quimiotaxis y fago­
citosis de granulocitos y macrófagos así como
 Inmunodeficiencias 621

C uadro 30-5. Estudio de la respuesta in­ C u a d ro 30-6. Estudio de la respuesta in ­

mune humoral mune celular
N IV E L I N IV E L I

1. D e te rm in a c ió n c u a n tita tiv a d e las in m u n o g lo b u li­ 1. D e te rm in a c ió n d e l v a lo r a b s o lu to d e lln fo ci-

n a s s é ric a s Ig G , I g M , Ig A , Ig E e Ig A se cre to ria.
2. A n tic u e rp o s p re -e x is te n te s : Iso h e m a g lu tin in a s
(an ti A y B ), A n ti-e s tr e p to lis in a O (A S T O ), A n ti-
te tá n ic o , A n ti-d ifté ric o .
3. R e c u e n to d e L in fo c ito s B p o r in m u n o g lo b u lin a s
d e su p e rfic ie ,
4. D e te rm in a c ió n c u a n tita tiv a d e s u b c la s e s d e IgG :
l g G l ,I g G 2 , I g G 3 , Ig G 4 .
N IV E L H
1. R e s p u e s ta d e a n tic u e rp o s a la in m u n iz a c ió n a c tiv a
c o n p o lis a c á rid o n e u m o c ó c ic o .
2. P ro d u c c ió n d e in m u n o g lo b u lin a s in v itro m e d ia n te
e s tim u la c ió n c o n m itó g e n o s (P W M ).
3. O n to g e n ia d e las c é lu la s B p o r la e x p re s ió n d e a n ­
tíg e n o s d e d ife re n c ia c ió n (C D 1 9 , C D 2 0 , C D 2 1 ) y
e x p re s ió n d e iso tip o s d e in m u n o g lo b u lin a s.
4 . C o o p e ra c ió n T -B (c o -c u ltiv o s).
5. B io p s ia rectal y /o g a n g lio n a r.
to s /m m ^
2. R e c u e n to d e lin fo c ito s T y su b p o b la c io n e s T p o r la
e x p re s ió n d e a n tíg e n o s d e d ife re n c ia c ió n ( C D l ,
C D 2 , C D 3 , C D 4 , C D S , C D 3 8 ).
3. P r u e b a s d e h ip e rs e n sib ilid a d ta rd ía a d isü n to s a n tí ­
g e n o s : P P D , c a n d id in a , e s tr e p to q u ln a sa -e stre p to -
d o rn a s a .
4. R e s p u e s ta p ro life ra tiv a in v itro a in itó g e n o s (P H A ,
C o n A ).
N IV E L II
1. R e s p u e s ta p ro life ra tiv a a a n tíg e n o s (c a n d id in a ,
P P D ) y c é lu la s a lo g e n e ic a s (C M L ).
2. D o s a je d e p ro d u c c ió n d e in te rle u q u in a s : IL -1 , lL - 2 ,
In te rfe ró n .
3. E s tu d io s e n z im á tic o s: A D A , P N P .
4. T ip if ic a c ió n H L A .
5. B io p s ia g a n g lio n a r.

mecanismos involucrados en la producción de

defectos en la presentación antigénica y funcio­ los distintos síndromes de IDP y deberán ser
nes citotóxicas linfocitarias. La falta de expre­ seleccionados en cada caso.
sión de los antígenos mencionados puede d e­
tectarse por marcación con los anticuerpos m o­
noclonales: CD18 (cadena p), C D lla , CDl Ib C u a d ro 30-7. Estudio de la respuesta in ­
y C D llc . En muchos casos la expresión es par­ mune inespecífica
cial, lo cual dificulta este análisis.
F A G O C IT O SIS

Estudios de lab o rato rio inm unológico N IV E L I

p a ra el diagnóstico de las ID P
1. D e te rm in a c ió n c u a n tita tiv a y m o rfo ló g ic a de g r a n u ­
lo c ito s y m o n o cito s.
La definición de inmunocompetencia requie­ 2. E s tu d io d e m e c a n ism o s m ic ro b ic id a s o x íg e n o d e ­
re no sólo del análisis cuantitativo de los dife­ p e n d ie n te s .
rentes componentes del sistema inmune, sino a) P r u e b a d e r e d u c c ió n d e l n itro a z u l d e tetraz o lio
también de la evaluación funcional de los m is­ ( N B T ).
b) Q u im io lu m ln is c e n c ia .
mos.
Es lítil considerar los estudios que permiten N IV E L / /
evaluar la respuesta inmune humoral, celular e
inespecífica (fagocitosis y com plem ento) en 1. E s tu d io d e la e x p re s ió n d e p ro te ín a s d e ad h e sió n
(a n tíg e n o s L F A l, C 3 b l).
dos niveles (cuadros 30-5 a 30-7). En el primer 2: L e u c o ta x is ,
nivel se incluyen los estudios de “screening”, 3. A c tiv id a d b a c te ric id a.
sencillos y c]ue no requieren laboratorios de al­ 4. E s tu d io s e n z im á tic o s: m ie lo p e ro x ld a s a , g lu c o s a 6
ta complejidad. Con ellos es posible en general fo s f a to d e h ld ro g e n a sa .
definir el tipo y grado de inmunodeficiencia y COM PLEM ENTO
orientar la conducta terapéutica. En el cuadro
30-3 se muestran las diferencias en los estudios N IV E L I
inmunológicos de un grupo de inmunodeficien­
cias con formas de presentación clínica simila­ 1. A c tiv id a d lític a d e l c o m p le m e n to (C H 5 0 ).
2. D e te rm in a c ió n c u a n tita tiv a d e C 3 y C 4.
res que tienen, como se verá más adelante, in­
dicaciones terapéuticas distintas. N IV E L II
Los estudios del segundo n ivel son m ás
1. D e te rm in a c ió n c u a n tita tiv a y f u n c io n a l d e to d o s lo s
complejos, de resorte del especiahsta en su rea­ c o m p o n e n te s d e c o m p le m e n to ( C l a C 9).
lización e interpretación. Algunos son im pres­ 2. D e te rm in a c ió n c u a n tita tiv a y fu n c io n a l d e in h ib id o ­
cindibles para el diagnóstico, como es la deter­ res.
m inación de ADA, frente a una deficiencia 3. C a p a c id a d de g e n e ra r fa c to re s leu c o tá c tic o s .
combinada severa; otros perm iten aclarar los
622 Inmunopatología
Oxígeno
Membrana
AR: autosómica recesiva
LX: ligada al sexo
La edad del paciente en el momento del es­
tudio es una de las principales consideraciones
a tener en cuenta. Dado que la mayoría de las
inmunodeficiencias se diagnostican en la infan­
cia, debe recordarse que, de acuerdo a la onto­
genia del sistema inmune normal, en los prime­
ros años de la vida hay deficiencias que son fi­
siológicas y transitorias.
En diagnóstico temprano en las IDP es fun­
damental a fin de instaurar la terapéutica apro­
piada antes de que se produzcan lesiones cróni­
cas e irreparables de órganos vitales. En este
sentido es importante señalar que la mayor par­
te de los estudios m encionados en el nivel I
pueden ser realizados en sangre de cordón.
El reconocimiento de portadores sanos, co­
mo hemos visto, puede hacerse actualmente en
las deficiencias de A DA, PN P, enferm edad
granulom atosa crónica, agam m aglobulinem ia
ligada al sexo, síndroine de W iskott-Aldrich, y
en alguna de ellas es posible el diagnóstico pre­
natal, mediante estudios realizados en cultivos
de células de líquido amniótico. Ambas infor­
m aciones pueden ser de gran v alo r para el
diagnóstico temprano y el consejo genético.
Estudios para valorar la competencia
inmunológica
Cuantificación de inmunoglobulinas
Las inm unoglobulinas séricas IgG , IgM ,
IgA, por lo general se miden por inmunodifu­
sión radial o métodos turbidimétircos como la
nefelometría. La eleetroforesis e inm unoelec­
troforesis no son apropiados a los fines del
diagnóstico de IDP.
Agua oxigenada F ig . 3 0 -4 . R e p re se n ta c ió n e s ­
H „0„ q u e m á tic a d e lo s c o m p o n e n ­
tes d e la N A D P H y las a n o r ­
m a lid a d e s e n la E G C .
O,-,
, '"Oa'
; Superóxido
La IgE por su baja concentración se mide
por métodos de RIA o ELISA.
La concentración sérica de inm unoglobuli­
nas varía con la edad, debiendo contar todo la­
boratorio con valores de referencia normales
para cada grupo etario,
Las subclases de IgG se cuantifican por téc­
nicas de inmunodifusión radial y ELISA. No
hay reproducibilidad entre ambos m étodos,
además los resultados pueden variar segiln se
utilicen anticuerpos monoclonales o policlona­
les. Estas variaciones junto con los amplios
rangos de normalidad para esta inmunoglobuli­
na, dificultan el diagnóstico de deficiencia de
subclases de IgG, especialmente en los prime­
ros años de vida.
Valoración de la producción de anticuerpos
específicos:
La inmunidad humoral puede medirse por la
respuesta de anticuerpos a antígenos a los que
la población está comúnmente expuesta o si­
guiendo una inmunización activa.
Los tests recomendados son:
1. Anticuerpos naturales: medición de isohe-
maglutininas anti-A y anti-B.
2. Respuesta a inmunizaciones habituales: la
respuesta a toxoide tetánico, diftérico, polisacá­
ridos de neumococo y meningococo; se valora
por técnicas de heinaglutinación o ELISA. Se
valoran 2 muestras: la primera pre-inmuniza-
ción y la segunda, entre los 15 y 20 días poste­
riores al estímulo. El estudio puede realizarse
después de un esquema de inmunización com­
pleta o de la aplicación de una dosis de refuer­
zo en los previamente vacunados.
 Inmunodeficiencias 623

3. Inmunizaciones adicionales; bacteriófago Determinaciones de AD A y PNP

OX 174. Es un potente y seguro antígeno, con
el que la población no ha tenido contacto pre­ Se realizan en general en Usados de glóbulos
vio, que permite valorar respuesta primaria y rojos del paciente. Existen diversas técnicas pe­
secundaria. Dado que en nuestro país no se dis­ ro todas se basan en ofrecer el sustrato (adeno-
pone regularmente del antígeno, no existe ex­ sina para ADA, e inosina para PNP) y valorar
periencia local con el mismo. la generación final de ácido úrico. Una cinética
enzim ática convencional es la generalm ente
Cuantificación de linfocitos utilizada para ambas determinaciones.
B yT
Evaluación del sistema fagocítico
Las células de sangre periférica son cuantífi-
cadas con anticuerpos monoclonales específi­ 1) Análisis cuantitativo y estudio m orfológi­
cos para distintos antígenos celulares. Se utili­ co.
zan técnicas de inmunofluorescencia directa e 2) Estudios funcionales: a) quimiotaxis
indirecta. La lectura se realiza por microscopía b) evaluación del m etabolism o oxidativo:
o citometría de flujo. NBT, quemiluminicencia, muerte intracelular.
Los linfocitos T se valoran con anticuerpos
para CD3, CD4, CD8. Para los linfocitos B se Quimiotaxis
utiliza anti-CD 19 y anti-CD20.
Iguales técnicas se utilizan para cuantificar El test que utiliza la cámara de Boyden es el
monocitos y células NK. más utilizado. Consiste en dos cámaras separa­
das por un filtro millipore. En una de ellas se
Pruebas cutáneas coloca la sustancia atractante y en la otra los
neutrófilos separados del paciente. La m ig ra­
Las pruebas de hipersensibilidad tardía cons­ ción específica se compara con la migración al
tituyen un excelente método para valorar la res­ azar (sin quimioatractante).
puesta m ediada por linfocitos T, in vivo. El
prototipo, es la prueba de tuberculina. Se acon­ Test del nitroblue-tetrazolio (NBT)
seja el uso de varios antígenos purificados
(candidina, tricophyton, toxoide diftérico, etc.). Permite valorar funcionalmente el sistema de
Consiste en la inyección intradérmica de 0 ,1 mi la N ADPH oxidasa en los granulocitos. C onsis­
del antígeno en dilución apropiada, seguida de te en la reducción del NBT, a través de esta vía
la medición del diám etro máximo de indura­ metabólica, con la formación de gránulos azul
ción a las 48hs. violáceos (formazán) dentro del citoplasma de
las células.
Estimulación de linfocitos
in vitro (cultivo) Muerte intracelular
Los linfocitos pueden ser activados por: a) La lisis intracelular de los microorganismos
mitógenos como la PHA, con A, PWM. b) A n­ fagocitados es el paso fínal de la activación de
tígenos como la PPD, candidina etc. c) Células los polimorfonucleares en respuesta a la infec­
alogeneicas. d) Anticuerpos para receptores de ción.
células T com prom etidos en las señales de La muerte celular puede valorarse utilizando
transducción: CD3, CD2, etc. e) Estimulantes bacterias (estafilococo) u hongos (cándida).
de PTK e ionóforos de calcio: PMA e ionomi- La técnica consiste en incubar bacterias op-
cina. La activación T puede valorarse por: a) sonizadas con una suspensión de granulocitos
Medición de la proliferación celular, b) Expre­ del paciente por distintos intervalos. Luego de
sión de antígenos de activación (CD25). c) Li­ desechar las bacterias no fagocitadas, las célu­
beración de citoquinas (IL2, IL4). las son Usadas y las muestras resultantes incu­
Se cultiva un número fijo de células mono- badas en medios de cultivos para determinar el
nucleares en presencia de los diferentes estímu­ número de gérmenes sobrevivientes.
los. Luego de 3 a 5-7 días se marcan con ^H-ti-
midina y se cosechan. La incorporación de ti­
midina es proporcional a la proliferación celu­ T R A T A M IE N T O DE LAS ID P
lar. Los resultados se expresan en emp y son
comparados con controles sin estímulo (basa- La terapéutica específica de las IDP se apoya
les) y con la respuesta de células de individuos fundamentalmente en los tratamientos sustituti-
normales. vos: gammaglobulina para las deficiencias p re­
624 Inmunopatología
dominantes de anticuerpos y TMO y timo fetal
para las deficiencias combinadas y algunas de­
ficiencias asociadas a otros defectos. La trans­
fusión de plasma fresco puede ser útil en las
deficiencias de componentes del sistema com ­
plemento. Los procesos infecciosos deben ser
tratados rápidam ente y con dosis apropiadas
del antibiótico seleccionado según antibiogra-
ma. El uso de antibióticos como tratam iento
profiláctico no se recomienda ya que aumenta
el riesgo de infección con organismos resisten­
tes, hongos, etc.
En todo paciente con deficiencia de la res­
puesta inmune celular, las transfusiones, si son
necesarias, deben realizarse con sangre irradia­
da por el riesgo de reacción injerto contra hués­
ped. Las inmunizaciones con gérmenes vivos y
la BCG están formalmente contraindicadas.
T ratam iento sustitutivo
con gammaglobulina
El tratam iento de reem plazo con gamm a-
globulina ha demostrado ser beneficioso para
los pacientes con deficiencia de la inmunidad
hum oral. Son indicación absoluta de tra ta ­
m iento perm anente con gam m aglobulina: la
agammaglobulinemia ligada al sexo y autosó­
mica recesiva, la deficiencia con hiper IgM, la
deficiencia con timoma y la inm unodeficien­
cia común variable. En la hipogam m aglobuli­
nemia transitoria de la infancia, el tratamiento
sustitutivo está indicado sólo en las infeccio­
nes graves. La deficiencia asintom ática o aso­
ciada a procesos infecciosos leves no es indi­
cación de tratamiento. En la deficiencia selec­
tiva de IgA, está contraindicado el tratamiento
con gammaglobulina y en las deficiencias de
subclases de IgG, asociadas o no a deficiencia
IgA, los resultados obtenidos hasta el presente
sugieren un efecto beneficioso en la preven­
ción de infecciones recidivantes del aparato
respiratorio.
Las deficiencias combinadas severas y otras
deficiencias como el síndrome de Wiskott-Al-
drich, pueden beneficiarse con el reemplazo de
gammaglobulina como tratamiento auxiliar, pe­
ro deben implementarse otros tratamientos para
corregir los defectos subyacentes.
Actualmente se dispone de preparaciones co­
merciales de gammaglobulina para uso por vía
intram uscular (IM) y endovenosa (EV). Para
ninguna de estas preparaciones se ha estableci­
do aún la dosis óptima de tratamiento. En gene­
ral, para la vía IM, la dosis mínima recomenda­
da es de 100 mg/kg cada 21-25 días, conside­
rando que la vida media de la IgG es de tres se­
manas aproximadamente. Para la gammaglobu­
lina endovenosa, trabajos recientes sugieren
mayor eficacia en la prevención de procesos in­
fecciosos con dosis de 300 a 500 mg/kg/mes,
que permitan mantener niveles séricos de IgG
superiores a los 400 mg/dl.
En todos los casos, las dosis de gammaglo­
bulina requeridas para el tratamiento de las IDP
son elevadas. Las inoculaciones de estos volú­
menes por vía IM son dolorosas y constituyen
el mayor inconveniente de esta vía. Los prepa­
rados para uso EV permiten la inyección de do­
sis elevadas sin inconvenientes y con buena to­
lerancia del paciente.
Efectos adversos, como son las reacciones
de tipo anafiláctico, se producen con poca fre­
cuencia y por mecanismos no bien aclarados.
Con los preparados por vía EV, la infusión len­
ta reduce o elimina estos efectos. Excepcional­
mente es necesario el uso de corticoides o anti-
histamínicos.
Trasplante de médula ósea
Una variedad de síndromes de IDP han podi­
do ser reconstituidos inmunológicainente me­
diante TMO. Fundamentalmente las inmunode­
ficiencias combinadas severas asociadas o no a
déficit enzimáticos (ADA, PNP), el síndrome
de Wiskott-Aldrich, los defectos de expresión
de L A F l, C3bi y defectos de fagocitosis como
la enfermedad granulomatosa crónica y el sín­
drome de Chediak-Higashi.
El TMO es sin duda actualm ente el trata­
miento de elección para las inmunodeficiencias
combinadas severas, siempre que se disponga
de una dador HLA idéntico. Aun con compati­
bilidad sólo a nivel del locus D, se han logrado
reconstituciones satisfactorias. Sin embargo, el
uso de dadores no HLA idénticos, da lugar a
una complicación importante, la reacción injer­
to versus huésped, que conduce al fracaso del
trasplante. A ctualm ente, se utilizan distintos
métodos (aglutinaciones selectivas, separacio­
nes celulares por gradientes de densidad, cito-
toxicidad con anticuerpos monoclonales) apli­
cados in vitro a la médula ósea del dador que
permiten depurarla de las células T responsa­
bles de la reacción injerto versus huésped, po­
sibilitando el TMO de dador no compatible.
La recuperación inmunológica post-trasplan-
te puede evaluarse por la m ejoría clínica, la
presencia de quimerismo celular, la detección
de linfocitos T y B circulantes, la recuperación
de la actividad enzim ática en los deficientes
previos, la presencia de inmunoglobulinas séri­
cas, etc.
En los casos en los que el TMO es impracti­
cable, resultados satisfactorios se han obtenido
en algunos casos, especialmente en el síndrome
de Di George con trasplantes de timo fetal o
epitelio tímico, y en otras deficiencias con tras­
plante de hígado fetal.

Ya hemos mencionado la terapia génica para
la deficiencia de ADA. Otras deficiencias co ­
mo las de PNP podrían ser curadas en el futuro
próximo con el mismo tratamiento.
Para las inmunodeficiencias celulares menos
severas, el tratamiento con hormonas tímicas,
interleuquina 2 y otros inmunomoduladores es
promisorio, pero se requieren más ensayos con­
trolados que confirmen su utilidad terapéutica.
IN M U N O D E FIC IE N C IA S SECUNDARIAS
O ADQUIRIDAS
Son m ucho más frecuentes que las ID P y
responden a causa que permiten agruparlas en
dos categorías fundamentales: 1) Las que son
consecuencia de distintas enfermedades capa­
ces de alterar cualitativamente o cuantitativa­
mente al sistem a inm une. 2) Las provocadas
por el uso de drogas citostáticas e inmunosu-
presoras, llamadas en general, inmunodeficien­
cias iatrogénicas.
Inm unodeficiencia.s asociadas
a otras patologías
Una de las causas más frecuentes de IDS en
nuestro medio y principalmente en la infancia,
es la desnutrición calórico-proteica, que deter­
mina alteraciones fundamentalmente en la res­
puesta inmune celular. Las inmunoglobulinas
no están cuantitativam ente afectadas, pero la
respuesta específica a antígenos bacterianos
suele encontrarse disminuida. Las infecciones
recidivantes son la mayor causa de morbimor-
talidad en estos pacientes.
Los tumores malignos en etapa avanzada y
especialmente las enfermedades linfoprolifera-
tivas y linfomas, también presentan inmunode­
ficiencia. Las leucemias linfáticas crónicas, por
ejemplo, suelen asociarse a hipogammaglobuli­
nemia, déficit de la respuesta humoral e infec­
ciones recidivantes por gérm enes encapsula-
dos. Los pacientes con linfoma de Hodgkin, en
cambio, presentan alteraciones de la respuesta
celular. El mecanismo productor de esta defi­
ciencia no se conoce aún, habiéndose postulado
efectos supresores por exceso de prostaglandi-
na E y también, disminución en la producción
de IL-2.
Las enfermedades asociadas a pérdida de
proteínas séricas conducen a inmunodeficien­
cias secundarias humorales. Ejemplos de estas
patologías son: el síndrome nefrótico y las en-
teropatías perdedoras de proteínas. Entre estas
últimas, vale la pena mencionar a la linfangiec-
tacia intestinal, que produce además de la pér­
dida proteica, pérdida de linfocitos T por apa­
rato digestivo, provocando una inm unodefi­
Inmunodeficiencias 625
ciencia combinada, en ocasiones difícil de dife­
renciar por la clínica y el laboratorio inm unoló­
gico, de las IDP.
Distintas infecciones, especialmente las v ira­
les (sarampión, EBV, CMV) producen altera­
ciones de la respuesta inmune que posibilitan el
desarrollo de infecciones por otros microorga­
nismos. En el individuo normal, el compromiso
inmunológico determinado por estas infeccio­
nes es transitorio y se recupera con la convale­
cencia de la enfermedad viral. Otros agentes
virales, como el HIV (virus de la inm unodefi­
ciencia humana), como se indica en el capítulo
27, se caracterizan por infectar a células del
sistema inmune y producir un deterioro progre­
sivo y permanente de su función.
Inm unodeficiencias por drogas
Es secundaria al uso de citostáticos e inm u­
nosupresores para el tratam iento de tum ores
malignos, enfermedades autoinmunes o com o
prevención del rechazo en el trasplante de ór­
ganos.
Las drogas utilizadas para el tratamiento del
cáncer, son citotóxicas para linfocitos y células
fagocíticas (monocitos y granulocitos) maduros
y sus precursores. Por lo tanto, la quimioterapia
se acompaña siempre de un período de inm u­
nodeficiencia con alto riesgo de morbimortali-
dad por infecciones. Otros inm unosupresores
son más específicos y actúan inactivando fu n ­
cionalmente a las células inmunocompetentes.
La ciclosporina A, por ejemplo produce inm u­
nosupresión inhibiendo la transcripción del gen
que codifica para la IL-2 y con ello la produc­
ción de esta citoquina. Son también potentes
inmunosupresores los anticuerpos monoclona­
les d irig id o s co n tra m o lécu las CD3, C D 7 ,
CD25, utilizados en la clínica fundam ental­
mente para prevenir el rechazo de órganos en el
trasplante.
El uso de tratamientos inmunosupresores ca­
da vez más agresivos para tratar enfermedades
graves como el cáncer ha dado lugar a un au­
mento importante del número de pacientes con
inmunodeficiencias iatrogénicas. Actualmente,
la posibilidad de producir citoquinas y factores
estimuladores de colonias (G-CSF, GM -CSF)
por ingeniería genética, ha permitido su uso en
protocolos de tratamiento que tienen como ob­
jetivo acortar el período de inmunodeficiencia
que acompaña a la quimioterapia.
B IB L IO G R A F ÍA
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Gammopatías monoclonales
MARCO PIZZOLATO
El término gammopatía monoclonal (GM),
descrito por Waldenstrom en 1961, implica la
aparición en sangre u otros líquidos biológicos
de una inm unoglobulina (Ig) constituida por
una sola clase y subclase de cadena pesada:
gamma (yl, y2, y3, y4); alfa ( a l , a l); mu (ju.l,
(x2); delta (51, 52?); épsüon y/o por un solo ti­
po de cadena liviana (kappa o lambda). Existen
distintos sinónimos para identificar a las GM
tales como: componentes “M ”; discrasia plas-
mocítica; paraproteinemia, tan sólo por nom ­
brar los términos más frecuentes.
Las Ig tienen su origen en los linfocitos B y
sobre todo en el estadio de mayor diferencia­
ción de ellos, las células plasmáticas o plasm o­
citos. Si consideramos una línea celular consti­
tuida por plasmocitos agrupados en clones ce­
lulares de acuerdo con la teoría de la selección
elonal de B urnet, verem os que cada uno de
ellos dará lugar a una clase, subclase y tipo de
Ig y la gran diversidad de éstas se traducirá a
nivel humoral por la aparición de la típica zona
de elevada heterogeneidad a la electroforesis y
el correspondiente arco de precipitación a la in-
munoelectroforesis (fig. 31-1 A). Por el contra­
rio, cuando se produce la proliferación descon­
trolada de un solo clon celular se evidenciará
su hipertrofia e hiperplasia con la consiguiente
hiperproducción de la Ig específica sintetizada
por él. En este caso, el perfil electroforético se
caracterizará por la aparición de una banda es­
trecha característica (componente “M”) y en la
inmunoelectroforesis se observará un arco de
precipitación con heterogeneidad restringida
que resulta típico de este tipo de anomalías co­
nocidas como GM (fig. 31-lB).
En un principio se consideró a estos com po­
nentes como proteínas anómalas y se les dio el
nombre de “paraproteínas”. Esto fue así duran­
31
te largo tiempo hasta que en la década del ’60,
gracias a los trabajos de los grupos de Porter,
Edelman y Nisonoff sobre estructura de las Igs,
se demostró fehacientemente que estos com po­
nentes de tipo monoclonal no diferían en forma
estructural de las Igs normales. Es más, a causa
de su extremada homogeneidad estructural fue­
ron el sustrato ópümo para los estudios sobre
dilucidación de estructura de las distintas Igs.
La aparición de una GM se interpreta enton­
ces como el producto de la desrepresión de ¡a
síntesis de una Ig que, en condiciones normales,
se sintetiza en muy baja cantidad, a partir de un
solo clon celular. Se trata en realidad de una al­
teración cuantitativa y no cualitativa corno se
creyó en un principio al considerar a las GM
como proteínas estructuralmente anómalas.
El estudio de las GM ha resultado de funda­
mental importancia, no sólo desde el punto de
vista estructural sino además desde un punto de
vista fisiopatológico, ya que ofrecen un modelo
experimental ideal y constituyen, prácticam en­
te, el único caso en que la proliferación neoplá-
sica de un clon celular se acompaña de la pre­
sencia de una “proteína marcadora” específica,
secretada por el propio tumor. En este sentido,
pueden ser consideradas como un verdadero
“experimento de la naturaleza” y como tal per­
mitieron obtener hallazgos de trascendental im-,
portancia, a lo largo de la evolución de la in­
vestigación biomédica en este campo, tales co­
mo: a) la formulación de la hipótesis elonal de
la respuesta inmune; b) la caracterización de la
estructura y función de las Igs; c) el descubri­
miento de la técnica de hibridomas para la pro­
ducción de anticuerpos monoclonales.
Desde el punto de vista clínico, las G M pue­
den observarse en enfermedades m alignas co­
mo ciertos trastornos linfoproliferativos o, en
626 Inmunopatología
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Gammopatías monoclonales
MARCO PIZZOLATO
El término gammopatía monoclonal (GM),
descrito por Waldenstróm en 1961, implica la
aparición en sangre u otros líquidos biológicos
de una inm unoglobulina (Ig) constituida por
una sola clase y subclase de cadena pesada:
gamma (yl, y2, y3, y4); alfa ( a l , a l); mu (ju.l,
(t.2); delta (51, 52?); épsüon y/o por un solo ti­
po de cadena liviana (kappa o lambda). Existen
distintos sinónimos para identificar a las GM
tales como: componentes “M ”; discrasia plas-
mocítica; paraproteinemia, tan sólo por nom ­
brar los términos más frecuentes.
Las Ig tienen su origen en los linfocitos B y
sobre todo en el estadio de mayor diferencia­
ción de ellos, las células plasmáticas o plasm o­
citos. Si consideramos una línea celular consti­
tuida por plasmocitos agrupados en clones ce­
lulares de acuerdo con la teoría de la selección
clonal de B urnet, verem os que cada uno de
ellos dará lugar a una clase, subclase y tipo de
Ig y la gran diversidad de éstas se traducirá a
nivel humoral por la aparición de la típica zona
de elevada heterogeneidad a la electroforesis y
el correspondiente arco de precipitación a la in­
munoelectroforesis (fig. 31-1 A). Por el contra­
rio, cuando se produce la proliferación descon­
trolada de un solo clon celular se evidenciará
su hipertrofia e hiperplasia con la consiguiente
hiperproducción de la Ig específica sintetizada
por él. En este caso, el perfil electroforético se
caracterizará por la aparición de una banda es­
trecha característica (componente “M”) y en la
inmunoelectroforesis se observará un arco de
precipitación con heterogeneidad restringida
que resulta típico de este tipo de anomalías co­
nocidas como GM (fig. 31-lB).
En un principio se consideró a estos com po­
nentes como proteínas anómalas y se les dio el
nombre de “paraproteínas”. Esto fue así duran­
31
te largo tiempo hasta que en la década del ’60,
gracias a los trabajos de los grupos de Porter,
Edelman y Nisonoff sobre estructura de las Igs,
se demostró fehacientemente que estos com po­
nentes de tipo monoclonal no diferían en forma
estructural de las Igs normales. Es más, a causa
de su extremada homogeneidad estructural fue­
ron el sustrato óptimo para los estudios sobre
dilucidación de estructura de las distintas Igs.
La aparición de una GM se interpreta enton­
ces como el producto de la desrepresión de ¡a
síntesis de una Ig que, en condiciones normales,
se sintetiza en muy baja cantidad, a partir de un
solo clon celular. Se trata en realidad de una al­
teración cuantitativa y no cualitativa corno se
creyó en un principio al considerar a las GM
como proteínas estructuralmente anómalas.
El estudio de las GM ha resultado de funda­
mental importancia, no sólo desde el punto de
vista estructural sino además desde un punto de
vista fisiopatológico, ya que ofrecen un modelo
experimental ideal y constituyen, prácticam en­
te, el único caso en que la proliferación neoplá-
sica de un clon celular se acompaña de la pre­
sencia de una “proteína marcadora” específica,
secretada por el propio tumor. En este sentido,
pueden ser consideradas como un verdadero
“experimento de la naturaleza” y como tal per­
mitieron obtener hallazgos de trascendental im-,
portancia, a lo largo de la evolución de la in­
vestigación biomédica en este campo, tales co­
mo: a) la formulación de la hipótesis clonal de
la respuesta inmune; b) la caracterización de la
estructura y función de las Igs; c) el descubri­
miento de la técnica de hibridomas para la pro­
ducción de anticuerpos monoclonales.
Desde el punto de vista clínico, las G M pue­
den observarse en enfermedades m alignas co­
mo ciertos trastornos linfoproliferativos o, en
628 Inmunopatología

2 Trastornos inmunoproliferativos
í .l Las GM, tanto las malignas como las benig­
& nas, pertenecen al grupo de los trastornos linfo-
proliferativos de las células B. En el hombre,
estas patologías presentan cierta complejidad
sobre todo en lo que respecta al cuadro citomor-
fológico y al distinto grado de proliferación. A
pesar de estas diferencias cabría preguntarse si
responden, o no, a un mismo estímulo desenca­
denante que actuaría a distintos niveles de dife­
renciación de una misma línea celular.
Los trastornos linfoproliferativos en general
pueden dividirse en dos grupos: 1) aquellos que
muestran una proliferación progresiva de la po­
POLICLONAL blación celular, que incluye los procesos neo-
plásicos malignos y 2) aquellos que luego de
un estadio de actividad linfoproliferativa se su­
ceden de una fase estacionaria.
De acuerdo con esto cabría preguntarse: a) si
el proceso controlado es de naturaleza benigna
y b) si un mismo estímulo puede desencadenar
en primer lugar un estadio estacionario primario
y, en un segundo tiempo, transformarse en una
neoplasia maligna. Esto dependerá de dos fac­
tores principales: por una parte, del tipo de cé­
lulas comprometidas y, además, de los factores
que regulan su proliferación. Actualm ente se
acepta que dentro de la categoría 1) se incluye
el MM, la macroglobulinemia de Waldenstrom,
la leucemia linfática crónica y linfomas, mien­
tras que en el grupo 2) se ubicaría la GMB. Sin
embargo, hasta el momento no ha resultado po­
sible otorgar un lugar preciso a los distintos ti­
pos de enfermedad de las cadenas pesadas.
Una clasificación clínica de las distintas GM
que responde en general a la propuesta por Mi-
MONOCLONAL chaux y Heremans (1969), y que sobre la base
de nuestra experiencia es la que goza de mayor
Fig. 31-1. E s q u e m a s o b re la s ín te s is d e in m u n o g lo b u lin a s
predicamento en la actualidad entre las distin­
(Ig) y la d ife re n c ia c ió n e n tre su o rig e n p o lic lo n a l y m o n o ­ tas clasificaciones comunicadas en la bibliogra­
clo n a l. fía sobre el tema, divide a las GM en tres gru­
A , y A j: L ín e a c e lu la r d e p la s m o c ito s a g ru p a d o s en c lo n e s. pos principales (véase cuadro 31-1).
Bj y Bj! Ig p ro d u c id a s y se c re ta d a s p o r lo s d istin to s c lo n e s
d e p la s m o c ito s .
c B a n d a d e e le v a d a h e te r o g e n e id a d e le c t r o f o r é t ic a al GM MALIGNAS
p ro te in o g ra m a d e b id o al p o lim o rf is m o m o le c u la r del
c o m p le jo in m u n o g lo b u lín ic o .
D A rc o d e p r e c ip ita c ió n a la in m u n o e le c tro f o r e s is c o ­ M ieloma múltiple (MM)
r re s p o n d ie n te a u n a p ro d u c c ió n p o lic lo n a l d e Ig.
Cj! P re se n c ia d e u n g ra d ie n te “M ” d e o rig e n m o n o c lo n a l Es una proliferación neoplásica sistémica de
al fra c c io n a m ie n to e le c tro fo ré tic o . células plasmáticas caracterizada por la infiltra­
Dj! A rc o d e p re c ip ita c ió n c o n la típ ic a h e te r o g e n e id a d r e s ­ ción en forma difusa de la médula ósea (MO),
trin g id a d e u n c o m p o n e n te “M ” .
e incluso de otros órganos, y por la formación
de tum ores óseos. El diagnóstico de MM se
efectúa sobre la base de tres elementos princi­
pales: a) una infiltración plasmocitaria en MO
ausencia de ellos, constituir las GM secunda­ u otro órgano; b) presencia de una Ig monoclo­
rias o las que se ha convenido en denominar nal en sangre (S) u orina (O); c) presencia de
GM idiopáticas o “benignas” (G.M.B.) y que imágenes osteolíticas no explicables por otras
últimamente R. Kyle propone identificar como causas, fractura o aplastamiento vertebral, u os-
“GM de significado indeterminado” (MGUS). teoporosis generalizada. Para el diagnóstico de

Cuadro 31-1
1) M alignas p rim arias
a) M ie lo m a m ú ltip le
1. S e c re to r (Ig G , IgA , Ig D , Ig M , Ig E , c a d e n a s L )
2. N o se c re to r
3. E x tra m e d u la r ( p la s m o c ito m a so lita rio )
4. L e u c e m ia d e c é lu la s p la s m á tic a s
b) M a c r o g lo b u lin e m ia d e W a ld e n s tro m (Ig M )
c) E n fe rm e d a d d e la s c a d e n a s p e s a d a s (g am m a, a lfa ,
m u)
d) O tra s a fe c c io n e s m a lig n a s d e l te jid o h e m o p o y é tic o
(le u c e m ia s y lin fo m a s )
2) Secundarías o asociadas
a) N e o p la sia s d e te jid o s n o p ro d u c to re s de in m u n o g lo ­
b u lin a s
b C irro s is h e p á tic a y o tra s h e p a to p a tía s c ró n ic a s
c) C o la g e n o p a tía s
d) D iv e rs o s c u a d ro s c lín ic o s q u e c u rs a n h a b itu a lm e n te
con G P
3) Idiop áticas o “benignas p rim arias”
a) D e te rm in a d a s g e n é tic a m e n te
b) T r a n sito ria s
MM resulta imprescindible el estudio del me-
dulograraa obtenido por aspiración o biopsia.
La punción se efectúa habitualmente en ester­
nón o cresta ilíaca, pudiéndose reahzar incluso
en otros huesos. La proporción de células plas­
máticas puede oscilar entre un 10 y un 90%.
Con respecto a la m orfología pueden encon­
trarse form as m aduras, inm aduras y células
multinucleadas.
En el 98 a 99% de los pacientes con M M se
detecta una GM en sangre u orina. D esde el
punto de vista inmunológico, las más frecuen­
tes son las de tipo IgG, luego las IgA, las GM
de cadenas livianas o de Bence Jones, las IgD y
una muy baja incidencia de IgE e IgM.
Las GM de cadenas livianas o de Bence Jo­
nes conforman un tipo muy especia! ya que son
aquellas que se asocian con los denominados
mielomas micromoleculares. A causa del bajo
peso molecular de las cadenas üvianas (22 kD),
éstas filtran a través del glomérulo, incluso en
ausencia de daño renal y, a pesar de no mostrar
GM en sangre (a excepción de los casos con in­
suficiencia renal grave), cursan en forma cons­
tante con un cuadro urinario de tipo mieloma-
toso caracterizado por una excreción acentuada
de fragmentos livianos de origen monoclonal,
en diversos grados de polimerización.
Existe un grupo de MM muy poco frecuente,
denominado “no secretor”, caracterizado por no
presentar GM en sangre ni en orina. En las dis­
tintas casuísticas no superan generalmente el
1 al 2% del total de casos. Mediante estudios de
inmunofluorescencia con antisueros monoespe­
cíficos anticadenas pesadas y livianas pudo de­
mostrarse, en la mayor parte de estos casos, una
síntesis adecuada de la Ig monoclonal, o sea
que la alteración estaría localizada a nivel de la
Gammopatías monoclonales 629
secreción de ella hacia el espacio extracelular.
Existe, no obstante, un muy pequeño número de
M.M. “no productores” de Ig.
Origen celular
El sustrato celular de todas estas GM es el
linfocito y específicam ente el linfocito B. El
lin fo cito proviene de una célula p recu rso ra
(stem cell) de MO la que a su vez tam bién da
origen a las series eritroide, mieloide y mega-
cariocítica.
Si bien una célula B normal bajo estímulos
apropiados puede proliferar y diferenciarse has­
ta célula plasmática, una célula B neoplásica es­
taría cap acitad a solam ente p ara p ro life ra r.
Aceptando esta hipótesis y de acuerdo con la fi­
gura 31 -2, podemos demostrar que las distintas
enfermedades incluidas dentro de las GM ma­
lignas poseen un sustrato celular específico, de
acuerdo con lo propuesto por Salmón y Selig-
mann. Cabe hacer notar que, si bien la función
principal de ia célula plasmática es la de produ­
cir y secretar grandes cantidades de Ig, no me­
nos importante resulta la secreción de otros fac­
tores solubles por parte de ella, tales com o el
factor activador de los osteoclastos (FAO), el
factor inhibidor de los osteoclastos (FIO) acti­
vados por interleuquina 1-beta (ILl-p) y el fac­
tor de necrosis tumoral beta (FNT-P) que serían
los responsables de las lesiones osteolíticas en
el MM ; además, la liberación de mediadores
que estimulados por los linfocitos T supresores
y a través del macrófago, provocan la inhibi­
ción del proceso madurativo de los linfocitos B
con la consiguiente disminución de las Igs nor­
males, produciendo el típico cuadro de inmuno-
deficiencia humoral asociado con las GM.
Etiopatogenia
Las causas que provocan la proliferación
neoplásica de las células B aún no están aclara­
das. N o obstante, se sabe que estim ulaciones
antigénicas reiteradas pueden provocar en cier­
tos casos (depende del tipo de antígeno y del
sistema inmune del receptor) un desarrollo mo­
noclonal de linfocitos B. Este clon puede invo-
lucionar como en el caso de las GM “transito­
rias” o puede transformarse en un clon maligno
bajo la acción de un agente mutagénico como
por ejemplo un oncoARN-virus o diferentes ti­
pos de oncogenes (c-myc; H y Lras). En algu­
nos casos pudo demostrarse que el producto de
estos clones poseía actividad anticuerpo especí­
fica contra ciertos Ags a los que el paciente ha­
bía estado expuesto años antes de la aparición
de un proceso maligno, dando lugar a la hipóte­
sis del doble estímulo. Así, por ejemplo, se de­
mostró actividad antiestreptolisina de la G M en
630 Inmunopatología

■-Stem Cell
(MO)

IL6 IL6

CP

Retroalimentación
negativa

Ig IL1-P
FNT-p

F ig . 3 1 -2 . D ife re n c ia c ió n n o rm a l d e las c é lu la s B .
A breviaturas. M O : M é d u la ó se a; L B : L in fo c ito B; A g : A n tíg e n o ; Ig: In m u n o g lo b u lin a s ; F A O : F a c to r a c tiv a d o r d e lo s o s ­
te o c la sto s ; F IO : fa c to r in h ib id o r d e lo s o s te o b la sto s ; L I: L in fo q u in a s in m u n o rre g u la d o ra s ; IL: in te rle u q u in a s (1 ,4 ,6 ); C P :
C é lu la p la s m á tic a ; FNT-(3: fa c to r d e n e c ro s is tu m o ra l p

un paciente con fiebre reumática recurrente; ac­ Factores genéticos. Existe poca información
tividad anti a^-m acroglobulina de caballo en con respecto a los factores genéticos que po­
otro paciente que había recibido inyecciones drían intervenir en la etiología del MM en el
sucesivas de suero de caballo hiperinmunc, tan hombre. Aberraciones comunes a los distintos
sólo por nombrar algunos casos (fig. 31-3). tipos de GM han sido relatadas, aunque el valor
En la actualidad, sin embargo, la hipótesis de este hallazgo aún hoy se discute y no se ha
con mayor predicam ento es la que considera logrado establecer una correlación entre los ha­
que la GM responden a una alteración en la re­ llazgos citogenéticos y el estado clínico de los
gulación del sistem a inm une vinculado a la pacientes. Han sido descritos varios casos de
edad del paciente. Avala esta hipótesis la cre­ GM en miembros de una misma familia.
ciente incidencia de G M transitorias postras­ Virus. A diferencia de otros tumores malig­
plantes, tanto renal como de médula ósea, cuya nos del sistema linforreticular no se ha demos­
frecuencia aumenta con la edad. trado asociación aparente entre MM y virus.
Sobre un estudio realizado en 122 pacientes
Factores predisponentes con MM, en los que se determinó el título de
Ac contra el Ag del cápside del virus de Eps-
Edad, sexo y raza. Se observa una incidencia tein Barr, no se obtuvieron resultados significa­
acentuada a partir de los 50 años y hasta los 70 tivos con respecto a los controles normales.
aproximadamente. Con respecto a la distribu­ Radiaciones. Se ha demostrado una inciden­
ción en función del sexo no se han observado cia mayor de MM, así como de otros trastornos
diferencias significativas. En un estudio realiza­ linfoproliferativos en individuos expuestos a
do en los EE.UU., en 1971, se encontró el doble radiaciones ionizantes, sobre todo en un estu­
de incidencia en la población blanca con rela­ dio poblacional realizado en Hiroshima y Na-
ción a la negra. Esta experiencia fue válida so­ gasaki. Asimismo, en estudios realizados en ra­
lamente para ese estudio local, no resultando diólogos se observó una incidencia mayor de
extrapolable al resto de la población. En un tra­ MM que la esperada.
bajo realizado diez años después por los mis­ Cuadros clínicos asociados. Procesos infec­
mos investigadores, se obtuvieron resultados ciosos e inflam atorios crónicos, así como tu­
opuestos a los anteriores ya que, en la actuali­ mores no reticulares, se observan con frecuen­
dad, el MM sería la enfennedad hematológica cia en los antecedentes clínicos de estos pa­
maligna más frecuente entre la población negra. cientes.

N- células
F ig . 3 1 -3 E tio lo g ía p r o b a ­
ble d e las G M .
R espuesta inm une normal
A breviaturas:
1 = A g = a n tíg e n o
1012 -
2 = M g = a g e n te m u ta g é n ic o
3 = D ia g n ó s tic o (D ) y c o ­
m ie n z o d e l tr a t a m i e n ­
to (T)
P L : P e río d o d e 'la te n c ia
G M : G a m m o p a tía m o n o c lo n a l
Alteraciones humorales asociadas
Anem ia. Es una de las características del
MM. Se presenta habitualmente en el momento
del diagnóstico o sobreviene durante el curso
de la enfermedad. Generalmente es de tipo nor-
inocítico normocrómica, aunque puede ser ma-
crocítica. La anemia del MM es refractaria al
hierro, vitamina y ácido fólico. Los factores
que contribuirían a provocar la anemia serían
invasión medular por parte de los plasmocitos,
aumento de la destrucción de los eritrocitos,
pérdida de sangre, insuficiencia renal, factores
asociados con procesos infecciosos y con fac­
tores nutricionales.
Alteración de la hemostasia. Responde a dife­
rentes causas y generalmente se observa en los
componentes monoclonales de tipo IgA e IgM y
inuy rara vez en los IgG. A pesar de que se han
descrito anticuerpos contra los distintos factores
de coagulación en el MM, la alteración de la h e­
mostasia no sería causada por una verdadera
reacción Ag-Ac sino que existiría un impedi-
inento en la formación del coágulo por un fenó­
meno previo de “gelación”, que estaría provoca­
do por la interferencia del componente “M ” en
el proceso de polimerización de la fibrina.
Hipercalcemia. Es otro elemento caracterís­
tico, aunque no constante, del MM. En algunos
casos se ha descrito el “ shock” hipercalcémico
como causa de óbito en pacientes con MM. Las
lesiones osteolíticas dan una típica imagen en
sacabocado y provocan en el paciente una sin-
tom atología característica y en muchos casos
son las responsables de fracturas patológicas.
En lo que respecta a la destrucción ósea y a
la movilización del calcio por las células mie-
Gammopatías monoclonales 631
700 T ie m p o
(d ía s )
lomatosas, su posible mecanismo ha sido des­
crito recientem ente. E stim ulando lin fo cito s
normales con Ag o mitógenos se observó que
liberaban una sustancia movilizadora de calcio
denominada “factor activador de los osteoclas-
tos” (FAO). La actividad del FAO ha sido de­
mostrada incubando hueso fetal de rata m arca­
do con calcio radiactivo y el factor. Flasta el
momento se ha demostrado que el FAO no se­
ría la parathormona ni dihidrocalciferol o una
prostaglandina sino que se trataría de un p o li­
péptido con un peso m olecular com prendido
entre 10 y 100 kD.
Sobrenadantes de cultivos de MO de pacien­
tes con MM mostraron que contienen el FAO.
Cultivos del mismo tipo con MO de pacientes
con otras heraopatías malignas o benignas no
secretan este factor. Cortes de hueso de pacien­
tes con MM mostraron la presencia de osteo-
clastos activos en las áreas de reabsorción ósea.
Uremia. Otra de las alteraciones humorales
importantes del MM la constituye el aumento de
la urea circulante que revela el grado de insufi­
ciencia renal que muestran estos pacientes. La
insuficiencia renal junto con los cuadros de in­
fección generalizada es una de las causas más
frecuentes de muerte en ios pacientes con MM.
Existen dos elementos principales que confluyen
en la producción de la insuficiencia renal y del
denominado “riñón mielomatoso”: la hipercal­
cemia y la proteinuria de Bence Jones (BJ). La
relación entre el metabolismo del calcio y la in­
suficiencia renal es muy importante. Algunos
autores consideran a la hipercalciuria com o el
factor principal en la producción de la insufi­
ciencia renal, mientras que otros, en cambio, ad­
judican a la proteinuria de BJ tal consecuencia.
632 Inmunopatología
Inmunodepresión. O tra alteración humoral
que acompaña al MM es la hipogammaglobuli­
nemia generalizada. En los distintos tipos de
MM se observa una discreta o acentuada hipo­
gammaglobulinemia que provoca el estado in-
munodeficitario típico de estos pacientes, que
padecen infecciones recurrentes y en los que
las neumonías y septicemias son frecuentemen­
te el cuadro terminal de la enfermedad. Uno de
los mecanismos para explicar la hipogam m a­
globulinemia sería que la proliferación del clon
celular que sintetiza el componente “M ” inhibi­
ría el desarrollo de otros clones celulares. Zoila
y col., trabajando con plasmocitomas trasplan-
tables, demostraron que poseían un efecto in-
munodepresivo sobre la respuesta prim aria y
secundaria frente a diferentes antígenos. La hi­
pótesis que sostienen es que deprimirían la ma­
duración de los precursores de las células pro­
ductoras de anticuerpos.
Macroglobulinemia
Se denomina macroglobulinemia a la presen­
cia de un componente monoclonal sérico de ti­
po IgM. Se clasifican en primarias y secunda­
rias. La macroglobulinemia primaria se conoce
tam bién com o enferm edad de W aldenstróm
(MW). Para el diagnóstico de MW, además de
la GM de tipo IgM, debe demostrarse prolifera­
ción anormal de células atipicas de estirpe lin­
foide en MO y en otros órganos del sistema re-
ticuloendotelial.
A causa del elevado PM de la IgM, y sobre
todo cuando se encuentra en alta concentra­
ción, los pacientes con macroglobulinemia sue­
len presentar síndrome de hiperviscosidad co­
mo cuadro asociado. La presencia de crioglo-
bulinemia también es frecuente.
A diferencia de lo que ocurre en el MM, en
la MW no se observa destrucción ósea.
En la mayor parte de los casos resulta muy
difícil diferenciar entre m acroglobulinem ias
primarias y secundarias. Las GM de tipo IgM
se asocian preferentem ente con MW, aunque
en menor escala suelen encontrarse en neopla-
sias reticulares como linfomas y leucemias (so­
bre todo LLC) e incluso en un muy escaso nú­
mero de mielomas.
Enfermedad de las cadenas pesadas (ECP)
En estos casos, la GM es estructuralm ente
semejante al fragmento Fe de las Ig. Hasta el
momento se han descrito tres clases de ECP:
E C P tipo gam m a (y). El prim er caso fue
descrito en 1964 por Franklin y col, y los casos
publicados con posterioridad son relativamente
escasos.
Se presenta con preferencia en individuos de
sexo m asculino por encim a de ios 40 años,
aunque también se han descrito casos en p a ­
cientes más jóvenes. Clínicamente se observan
Unfoadenopatías, hepatomegalia y esplenome­
galia. Suelen presentar anemia hipocróm ica,
eosinofilia y un edema característico en el pala­
dar. Los episodios infecciosos son frecuentes
(pulm onías, bronquitis, etc.) y, en la m ayor
parte de los casos, constituyen la causa princi­
pal de muerte de estos pacientes.
En MO se observa un incremento de células
plasm áticas con regular grado de atipicidad,
linfocitos y células reticulares. Habitualmente
no se observa compromiso óseo ni renal como
sucede en el MM.
Desde el punto de vista proteico se observa
una GM estructuralm ente sem ejante al frag ­
mento Fe de la IgG. Por su bajo peso molecular
(53 kD) se excreta, al menos parcialmente, por
la orina. La movilidad electroforética es de be-
ta 2-globulina y presenta un aspecto de menor
heterogeneidad que las IgG tetrapeptídicas nor­
males.
Para su detección inmunoquímica debe efec­
tuarse la inmunoelectroforesis, primero frente a
anti-gamma y luego con anti-Fc, anti-Fab, anti-
kappa y anti-lambda. Frente a anti-gam m a y
anti-Fc debe obtenerse un arco de precipitación
paraproteico característico, m ientras que la
reacción con anti-Fab, anti-kappa y antilambda
debe ser negativa. Por la posible existencia de
determ inantes antigénicos “ ocultos” se reco­
mienda repetir las determinaciones con los dis­
tintos antisueros luego de la reducción y alqui-
lación de la proteína aislada.
ECP tipo alfa ( a). Fue descrita inicialmente
por Sehgman y col. Se ha comunicado hasta el
momento un m ayor número de casos que de
enfermedad de Franklin (tipo gamma).
El cuadro clínico se presenta como un lin­
foma maligno del intestino, con fuertes dolo­
res abdominales, síndrome de malabsorción y
pérdida de peso acentuada, aunque se han des­
crito ECP tipo alfa sin aparente compromiso
intestinal. Generalmente no se observa linfa-
denopatía, hepatom egalia ni esplenomegalia.
Esta enferm edad afecta en general a ind iv i­
duos jóvenes, incluso en edad pediátrica, y
presenta una incidencia mayor en países del
Mediterráneo.
En suero se detecta una GM a expensas de
cadenas a que no reacciona con antisueros an-
ti-kappa ni anti-lambda. Suele presentarse en
distintos grados de polimerización, razón por la
cual no siempre se detecta en orina. El PM del
monómero es del orden de los 39 kD. En los
análisis electróforéticos muestran una m ovili­
dad variable entre la zona alfa^ y gamma,.

ECP tipo m u (fl). Dentro de las ECP, es la
menos frecuente. La mayor parte de los casos
descritos hasta el momento, luego del primero
publicado en 1969, presentaba un cuadro clíni­
co de leucem ia linfática crónica con anemia,
elevada susceptibilidad a las infecciones, hepa-
tom egalia y esplenom egalia. En MO se e n ­
cuentra un cuadro caracterizado por infiltración
linfoplasmocitaria (alrededor de un 45% de lin­
focitos y 25 a 30% de células plasmáticas). Las
células plasm áticas suelen presentar grandes
vacuolas intracitoplasmáticas.
Desde el punto de vista proteico se observa
una GM constituida por cadenas (l la que, a di­
ferencia de los casos anteriores, presenta una
pronunciada heterogeneidad electroforética y
no siempre puede detectarse mediante el sim­
ple proteinograma. Presenta un PM de alrede­
dor de 55 kD y tendencia acentuada a la form a­
ción de agregados. También, a diferencia de las
ECP de tipo gamma y alfa, en las de tipo mu
((l) se sintetizan cadenas livianas, de ahí que en
la mayor parte de los casos se acompañan por
presencia de proteinuria de Bence Jones, gene­
ralmente de tipo kappa. Estudios por inmuno-
fluorescencia demostraron la síntesis intraeito-
plasmática de cadenas |J. y K dentro de una m is­
ma célula con lo cual se concluye que, a dife­
rencia de lo que ocurre en la ECP de tipo gam ­
ma y alfa, en las de tipo mu existiría, más que
un problema de déficit de síntesis de cadenas
livianas, un defecto de ensamble entre las cade­
nas H y L para constituir la estructura tetrapep-
tídica completa.
G M SECUNDARIAS
O ASOCIADAS
Tal como muestra el cuadro 31-1, dentro de
este grupo se incluyen patologías que habitual­
mente cursan con una GP y en un muy bajo nú­
mero de casos pueden asociarse con una GM.
En estos casos resulta fundamental precisar
el origen secundario de la GM, ya que en m u­
chos de ellos puede coexistir incluso un MM u
otra GM maligna primaria con la enfermedad
de base.
Gammopatía monoclonal
benigna (GMB)
Se conoce también como GM idiopática o
esencial (W aldenstrom, 1961). Habitualmente
se observa en individuos de edad avanzada, ge­
neralmente entre los 55 y los 75 años de edad,
que no presentan una sintomatología atribuible
a la GM y en los que la presencia del com po­
nente monoclonal aparece como la única alte­
ración humoral. Si bien no existe una diferen­
Gammopatías monoclonales 633
cia cualitativa entre el MM y la GMB en cuan­
to al tipo de inmunoglobulina comprometida,
ya que es semejante en ambos casos, se o bser­
va en cambio una neta diferencia cuantitativa.
En el MM, sobre todo si no se trata en form a
adecuada, existe una rápida proliferación del
clon celular con la consiguiente hiperproduc­
ción del componente monoclonal; en cambio,
la característica p rin cip al de la GMB es la
constancia en los niveles circulantes del C9 m-
ponente monoclonal a través del tiempo. E sta
es justam ente la diferencia más importante en ­
tre la forma benigna donde existe una “prolife­
ración controlada” de un clon de células p las­
máticas con relación a la proliferación progre­
siva de la form a m aligna. La incidencia de
GMB fue determ inada por distintos autores,
encontrándose una frecuencia variable entre el
1 al 3% en la población normal por encima de
los 50 años de edad. En virtud del distinto ori­
gen de las investigaciones se descartaría la in­
fluencia de un posible factor geográfico.
De acuerdo con la descripción de distintos
autores, aún no queda claro si la GMB es nece­
sariamente una primera etapa del proceso de ti­
po mielomatoso; es decir, si constituiría o no
un “estadio prem aligno”. Estadísticam ente se
ha comprobado que un bajo número de pacien­
tes portadores de una GMB desarrollan con el
tiempo un MM; no obstante, a pesar de que es
poco probable, no resultaría imposible, ya que
hay autores que han descripto la eclosión de
MM en pacientes con GMB luego de m ás de
18 años de seguimiento (Kyle 1976, 1986).
Sobre la base de todos estos elementos y de
los aportados por otros autores se puede con­
cluir que la GMB representaría un estadio p re­
maligno potencial de alto riesgo que, frente al
estímulo de distintos agentes mutagénicos, po­
dría experimentar una transformación neoplási­
ca del clon de células B.
No obstante, si bien la posibilidad de ex p e­
rim entar una transformación maligna estad ís­
ticamente es mayor para este clon que p ara la
población policlonal que le dio origen, a la luz
de los conocimientos que poseemos hasta hoy
no podem os afirm ar que se trate n e c e sa ria ­
mente de un estadio prem aligno y ello d ep en ­
dería, tal como acontece en la etio lo g ía de
otros procesos neoplásicos, de la interrelación
entre el huésped, sobre todo de su sistema In­
munológico, y los distintos agentes am bienta­
les, naturales y sintéticos, a los que se encuen­
tra expuesto.
Por otra parte, se cree que esta proliferación
controlada de células plasmáticas normales que
constituyen la GMB estaría favorecida por un
estado de inmunodeficiencia ligado a la edad.
No es casual t^ue en los distintos estudios esta­
dísticos realizados en diferentes poblaciones
634 Inmunopatología
normales se haya descrito un incremento en la
frecuencia del componente “M ” a medida que
aumentaba el rango etario de los individuos es­
tudiados. En este sentido, una de las posibles
teorías para explicar la aparición de las GM se­
ría la producción espontánea o inducida de una
mutación somática, cuya incidencia sabemos
que aumenta proporcionalmente con la edad,
tanto en hum anos como en m odelos experi­
mentales en ratón.
INMUNORREGULACIÓN
EN MM
Los problemas infecciosos son la causa prin­
cipal de mortalidad en los pacientes con MM.
Si bien ello también sucede con otros tipos de
cánceres, y en especial en los del sistema linfo-
rreticular, el MM es el caso donde los episo­
dios infecciosos son más frecuentes y graves,
mostrando un típico, y prácticamente linico, ca­
so de déficit inmunológico, principalmente de
la respuesta inmune humoral.
El paciente con MM muestra una tendencia
acentuada a contraer infecciones bacterianas
recurrentes, no así con respecto a virus y hon­
gos. Si bien el tratamiento habitual con antibió­
ticos puede ser efectivo, existe una resistencia
notable en el caso del Streptococcus pneumo-
niae, de ahí justamente que la neumonía sea la
causa principal de muerte en la mayor parte de
estos pacientes.
Estudios preliminares han permitido demos­
trar que existe no sólo un déficit en los niveles
de Ig circulantes, sino que incluso los pacientes
con MM presentan una producción menor de
Ac como respuesta a la estim ulación con Ag
habituales (vacunas: tifoidea, diftérica, neumo-
cócica, etc.)
Otros autores, ensayando la respuesta de pa­
cientes con MM al estímulo con vacuna neu-
mocócica en relación con controles normales, y
m idiendo los niveles de Ac antineum ococos
seis semanas después de la inmunización, en­
contraron que en los pacientes la respuesta es­
taba deprimida en forma significativa. No obs­
tante, observaron una diferencia notoria en lo
que respecta a la respuesta individual llegando
a establecer una relación entre buena respuesta
y niveles de leucocitos mayores de 5.000/mm^
y mala respuesta en los casos con leucocitos
menores de 5.000/m m \
Con respecto a los niveles de las distintas Igs
fisiológicas en nuestros pacientes con MM, he­
mos observado una reducción de las 3 Igs prin­
cipales (IgG, IgA e IgM) en el 70% de los ca­
sos, de sólo 2 Igs en el 20% y, en alrededor del
10%, sólo una Ig se encontraba deprim ida.
Comparando asimismo la relación entre el défi­
cit de Igs, como parámetro que expresa el gra­
do de inmunosupresión del paciente, y la gra­
vedad pronóstica de la enfermedad, evaluada a
través de los correspondientes estadios clíni­
cos, se pudo observar que a mayor gravedad
del cuadro clínico se corresponde un marcado
grado de inmunodeficiencia.
Estudios de Spitler y col. demostraron que,
además de los bajos niveles de Igs circulantes,
en los pacientes con MM existe una deficiencia
en la función de los neutrófilos, es decir que
existiría también un compromiso de los meca­
nismos inespecífícos de defensa. Esta deficien­
cia en la actividad leucocitaria no sería un de­
fecto intrínseco de las células en sí, ya que re-
suspendiendo leucocitos normales en plasma
de pacientes se observa una disminución de la
fagocitosis, lo cual demostraría que existe una
relación directa entre concentración del compo­
nente “M ” en el plasma del paciente y activi­
dad leucocitaria.
En lo que respecta a la inmunidad celular se
vio que no se encuentra comprometida en MM,
lo que explicaría la baja incidencia de infeccio­
nes virales y fúngicas en estos pacientes. En
nuestro caso, el estudio de la re.spuesta celular
se efectuó a nivel clínico in vivo evaluando la
hipersensibilidad retardada mediante pruebas
cutáneas. Estos resultados coinciden con los
obtenidos por otros autores mediante pruebas
in vitro de proliferación de linfocitos periféri­
cos por estímulo con Ag y mitógenos. Se ob­
servó que los linfocitos periféricos de pacientes
con MM mostraban una respuesta normal al ser
estim ulados con fitohem oaglutinina o poke-
weed mitógeno (PWM).
Teniendo en cuenta que en el MM no existe
una deficiencia generalizada de la respuesta in­
mune sino que se encuentra específicam ente
deprimida la inmunidad humoral, en los ú lti­
mos años la investigación se orientó hacia los
mecanismos por los cuales se encuentra reduci­
da la producción de Ig. Existen tres m ecanis­
mos principales que regulan la respuesta inmu­
ne en el MM: 1) el hipercatabolismo de las Ig,
2) la presencia de células supresoras circulantes
derivadas de LT y 3) la red idiotípica (véase
cap. 18).
El valor del catabolismo de las IgG en p a­
cientes con MM de tipo IgG se encontró dupli­
cado con respecto al normal. Esto fue demos­
trado años atrás por Waldmann y Strober y se
debe a una relación directa entre la concentra­
ción de IgG y el grado de catabolismo. Los pa-
ratopes de Ac sintetizado neutralizaban epito­
pes antigénieos. No obstante, a pesar de que es­
to explicaba los bajos niveles de las IgG poli­
clonales, no servían para explicar el déficit del
resto de Igs.
Un trabajo fundamental que mostró el papel
de células supresoras en el mecanismo de in-

munodepresión en pacientes con MM fue reali­
zado por Broder y col. en 1975. Estimulando
linfocitos de pacientes con MM con PWM, ob­
tenían un bajo índice de secreción de Ig com­
parado con los controles normales. Cuando rea­
lizaban un cultivo mixto de linfocitos de MM
con linfocitos norm ales y luego estim ulaban
con PWM, la respuesta de los linfocitos norm a­
les se suprimía. Esto perm itió demostrar que
una o más células supresoras actuaban en el
m ecanism o del inm unodepresión. E studios
posteriores permitieron establecer que se trata­
ba de monocitos macrófagos. La contraprueba
se realizó, por una parte, removiendo los fago­
citos mononucleares de los linfocitos periféri­
cos (LP) y observando la respuesta al PWM de
los LP de pacientes con MM. Inversam ente,
agregando fagocitos mononucleares de MM a
LP de individuos normales se lograba inhibir la
respuesta al PWM.
A la luz de los conocimientos actuales, que
consideran como dubitativa la existencia de
clones celulares que cumplan exclusivamente
esa función, la actividad supresora observada
podría estar relacionada con la calidad de las
interleuquinas que sintetizan linfocitos y m a­
crófagos, de algunas de las cuales se sabe que
pueden ejercer efecto estimulativo o supreso-
rio según el “blanco” celular sobre el que ac­
túan. En el capítulo 18 se exponen en form a
más detallada estos m ecanism os de re g u la ­
ción.
En modelos experimentales en ratón se ob­
servó que, incluso los plasmocitomas que no
producen componente “M ”, poseen efecto inhi­
bitorio en la producción de Igs normales. La
expresión clínica de este modelo en el humano
son los denominados mielomas “no secretores”
que cursan generalm ente con marcada h ip o ­
gammaglobulinemia. De esta forma se demos­
traría que los mediadores de la inmunodepre­
sión serían completamente independientes del
tipo inm unológico y de la concentración del
componente “M ”.
Resumiendo, podemos decir que el síndrome
de inmunodeficiencia en MM, tanto en anim a­
les como en el hombre, se caracteriza por: 1)
depresión de la respuesta inmune humoral, en
especial la primaria, 2) está deprimida la res­
puesta humoral tanto con Ag T-dependientes
(GR de carnero) como T-independientes (poli­
sacárido de neumococo) y 3) la respuesta in ­
mune celular no está alterada. No obstante, San
M iguel y col. m uestran que las células T y
otras poblaciones celulares accesorias pueden
desempeñar un papel clave en la inmunorregu-
lación del M.M. Estos autores encontraron un
m a rcad o d e s e q u ilib rio en el c o c ie n te
CD4/CD8, tanto por un aumento de las células
DC8 como por descenso de las CD4.
Gammopatías monoclonales 635
En tanto que tradicionalmente se consideró
la célula plasmática (CP) como la célula term i­
nal en la diíérenciación del linfocito B, la cual
no participaba así como tampoco era m ay o r­
mente influida por el complejo mecanismo que
regula la respuesta inmune, los nuevos conoci­
m ientos en materia de inm unorregulación en
MM permiten determinar que las células plas­
máticas malignas son funcionalmente pluripo-
tenciales y son capaces de deprimir la respuesta
inmune normal, pero a su vez el sistema inm u­
nológico del portador puede alterar su c re c i­
miento celular y función. Es decir que existiría
una interrelación tal entre el tumor y la re s­
puesta inm une que, m ientras a través de sus
m ediadores hum orales y celulares el tu m o r
provocaría la inmunodepresión, el sistema in­
mune del paciente actuaría regulando el desa­
rrollo y crecimiento del propio tumor. Sabemos
desde tiempo atrás que el producto principal de
la CP, los Acs o Igs, son los encargados del
mecanismo de regulación de su propia síntesis.
Existen, sin embargo, otros factores producidos
por el clon mahgno de CP, como el factor plas-
mocitoma (PC), que es una linfoquina inmuno-
moduladora cuya función sería la regulación de
la producción de Ig por células B (IL4 ?), ade­
más del interferón, que influiría tam bién en
forma aún no aclarada sobre la respuesta in m u ­
ne del paciente, y otro no relacionado con la re­
gulación de la respuesta inmune que son el fac­
tor activador de los osteoclastos (FAO) y el
factor inhibidor de los blastos (FIO), que serían
los responsables de las lesiones óseas caracte­
rísticas del MM.
El mecanismo descrito anteriormente sobre
lá regulación del sistema inmune en MM, que
pudo dem ostrarse en el modelo experim ental
de plasmocitoma en el ratón, sería extrapolable
a lo que observamos en humanos.
EL L A B O R A T O R IO EN E L ESTU D IO
DE IN M U N O G LO BU LIN A S
M O N O C LO N A LES
La importancia clínica de las inmunoglobuli­
nas monoclonales (Igm) radica en su valor co­
mo marcadores tumorales.
Su identificación, tipificación y cuantifica­
ción correcta resulta de fundamental im portan­
cia en el diagnóstico, pronóstico y monitoreo
de los procesos malignos de las células B, entre
los cuales el mieloma múltiple es el más fre­
cuente.
El estudio de estas Igm en el laboratorio se
realiza siguiendo una marcha analítica descrita
en el cuadro 31 -2 y en la figura 31 -4.
La detección de Igm o componentes “M ” se
realiza habitualm ente m ediante el fracciona-
636 Inmunopatología
F ig. 31-4. Cuadro analítico básico para la cíiracterización
de la Ig m onoclonales.
En 1 se observa la presencia de un com ponente “M ” ca ra c­
terístico con m ovilidad electroforética en la zona y lenta.
En 2, in m u n o ele ctro fo resis con suero an tih u m an o total
(aT) donde se observa un arco de precipitación anóm alo de
tipo IgG (flecha). En 3, se confirm a con un suero antiin-
m unoglobulinas (a Ig). En 4, se m uestra el proteinogram a
electroforético de orina (OP) en relación con el suero del
paciente (SP) con una banda hom ogénea posbetaglobulinas
(proteinuria de Bence Jones). E n 5, se observa la inm unoe­
lectroforesis de SP y O P con suero antikappa (a K) donde
se m uestra que las cadenas livianas, tanto del com ponente
“M ” tetrapeptídico (IgG ) com o las libres (proteína de B en ­
ce Jones), son de tipo kappa.
miento electroforético de las proteínas séricas
y/o urinarias en gel de agarosa o acetato de ce­
lulosa. Mediante esta técnica pueden detectarse
C uadro 31-2. Caracterización de Igm
Suero
- Identificación de la Igm
- Tipificación y confirm ación de nom onoclonalidad
- C uantificación de la Igm
- C uantificación de Igs norm ales y álbum inem ia
- D eterm inación de beta, m icroglobulina
O rin a
D eterm inación de proteínas totales
- C oncentración de orina de 24 h
-- Investigación de proteína de B ence Jones (B J)
- Tipificación y confirm ación inm unológica de proteína
deB J
Investigación de beta, m icroglobulina
alrededor del 95% de los casos de gammopatía
monoclonal (GM). El porcentaje restante está
constituido por mielomas “no secretores”, cier­
to número de mielomas micromoleculares y de
baja secreción y por los casos de Igm “ocultas”
dentro de fracciones normales del electrofore-
grama sérico. La inspección visual (evaluación
cualitativa) es el método recom endado para
identificar Igm, ya que la elución o el registro
densitográfico se prestan a interpretaciones
erróneas.
Luego de la detección de la Igm corresponde
efectuar su tipificación inmunológica; es decir,
determinar la clase de cadena pesada (y, a , ¡t , 5
o e) y el tipo de cadena liviana ( k o X) para
confirmar su origen monoclonal. Las técnicas
utilizadas son la inmunoelectroforesis y la elec-
troinmunofijación (figs. 31-5, 31-6 y 31-7).
La cuantificación de la Igm así como de las
Ig normales o fisiológicas no sólo es importan­
te desde el punto de vista diagnóstico, sino que
resulta imprescindible en el seguimiento de los
distintos tipos de GM para estimar evolución, y
sobre todo respuesta terapéutica en el caso de
las de origen maligno.
La cuantificación de las Ig se realiza habi­
tualmente por inmunodifusión radial. En cier­
tos laboratorios de alta complejidad se utiliza la
inmunonefelometría. En el caso específico de
la Igm se recom ienda efectuarla m ediante la
cuantificación de la respectiva banda del pro­
teinograma electroforético, ya que los métodos
inmunológicos suelen sobreestimar el valor a
causa de una diferente reactividad de los anti­
sueros contra las distintas subclases de Ig. Ac­
tualm ente, los laboratorios que procesan un
elevado número de muestras complementan la
investigación de Inmunoglobulinas (Igm) me­
diante la determ inación del cociente kappa/
lambda ( kJX) sérico y/o urinario en autoanali-
zadores, con técnicas inmunoturbidimétricas o
inmunonefelométricas.
La investigación de proteinuria de Bence Jo­
nes (BJ) debe efectuarse en orina de 24 h, pre­
viamente concentrada, mediante al menos un
fraccionamiento electroforético.
En el caso de observar una banda homogé­
nea entre las zonas alfa^ y gamm aglobulinas
debe realizarse una inm unoelectroforesis y/o
electroinmunofijación con antisueros anti-kap-
pa y anti-lambda para confirmar la presencia de
proteína de BJ.
En caso de obtener reacción negativa frente
a ambas podría tratarse de beta^ microglobuli­
na, proteína que se sintetiza en gran cantidad
en curso de procesos linfoproliferativos y que
por su bajo peso molecular (22 kD) se excreta
por orina aun en ausencia de daño renal.
Las pruebas de termosolubilidad para la in­
vestigación de proteína de BJ deben ser defini-
 Gammopatías monoclonales 637

Fig. 31-5. Electroforesis e inm unofijación con antisuero m onoespecífico antilam bda, d e orina perteneciente a un p acien te
con m ielom a de tipo m icrom olecular.
C ondiciones de trabaje. A y B fraccionam iento electroforético sim ultáneo durante 2 0 ’ en buffer veronal; pH: 8,5; 0,05
seguido en B de inm unofijación con 40 |-il de antisuero m onoespecífico antilam bda durante 5 minutos.
Es im portante destacar la sensibilidad, especificidad y elevada resolución de la E lF en la identificación de co m ponentes
m onoclonales con m ovilidad electroforética muy sem ejante.

— Hp

a.ATr

Alb Std

ita
Fig. 31-6. Patrón sérico obtenido m ediante inm unoelectroforesis bidim ensional en un caso con com plicación renal. T o m a­
do de: P izzolato, M Clin C him A cta, 45: 207, 1973.
C ondiciones de trabajo: 1 |al de m uestra. Electroforesis en la prim era dim ensión 250 V; en buffer tris-glicina pH : 9 ,2 , du­
rante 4 0 ’. Segunda dim ensión: EID en 90° con respecto a la prim era corrida, 150 |il de antisuero hum ano total d u ran te 12
horas.
638 Inmunopatología
TLG + IF
WM PS NS
a ' a'
F ig . 31-7. D eterm inación sim ultánea del tipo ininunológi-
co y el peso m olecular de Igs m onoclonales y sus fragm en­
tos m ediante TL G -IF (gel filtración-inm unofijación). T o­
m ado de: Pizzolato, M y col R ev A BA , 46: 11, 1982.
/ a 3: TLG (gel filtración en capa fin a )
1. Suero de un paciente con m acroglobulinem ia de W a l­
denstrom (W M ).
2. Suero de un paciente (PS) con GM de tipo IgG-K.
3. Suero norm al (NS).
4 y 5. TLG + IF (G el filtra ció n - inm unofijación)
4. M uestra 2 con antisuero antigam m a (ay).
5. M uestra 2 con antisuero antialfa (aa).
tivamente descartadas a causa de su baja sensi­
bilidad.
B IB L IO G R A F IA
A lexanian R, B alcerzak S, B o n n et J, G ehan E, H aut A,
H ew lett J y M onto R: P ro g n o stlc F acto rs in m ú ltip le
m yelom a. Cáncer, 36: 1192, 197.5.
D urie B y Salm ón S: A clinical Staging System for M últi­
ple M yelom a. Cáncer, 36: 842, 1975.
K yle R y Bayrd E: The M onoclonal G am m opathies, M ú lti­
p le M y e lo m a a n d R e la te d P la s m a - C e ll D is o r d e r s .
S pringfield III, C harles C. Thom as, pp. 159, 1976.
K yle R: M onoclonal G am m opathy o f undeterm inated sig ­
nificance; natural hlstory o f 241 cases. Am J M ed, 64:
184, 1978.
K yle R: M yelom a and related disorders. C linics in Flema-
tology, 11: m , 1982.
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Vol. 32, 1995.
K yle R y G arton I P: Laboratory m onitoring o f m yelom a
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M edical R esearch C o u n cil’s W orklng Party for Therapeu-
tic Triáis in L eukem ia: R eport on the first M yelom atosls
T rial. I. A naly sis o f p resen tin g featu res o f p ro g n o stic
im portance. B r J H aem at, 24: 123, 1973 y Br. J. C áncer,
48:841, 1980.
N ational C áncer Institute, C om m ittee o f the C hronic L e u ­
kem ia, M y elo m a T ask F orcé: P roposed gu id elin es for
protocol studies, II Plasm a Cell M yelom a. C áncer Che-
m other. Rep, 4: 145, 1973.
O sserm ann E: Plasm a Cell D yscrasias: A current Perspec-
tive. A cta H aem at, 68: 167, 1982.
P avlovsky S, D upont J y Pizzolato M: M ielom a m últiple.
D iagnóstico, factores pronósticos y tratam iento. M ed ici­
ne, 7: 367, 1982.
Pizzolato M , Torquatti S, S toliar A, Pizzolato M C y W i-
kinski R: P araproteínas idiopáticas ¿B enignas? In cid en ­
cia en individuos aparentem ente sanos. Revista ABA, 40:
96, 1975.
Pizzolato M , B echerini I, C avagnaro F y Pavlovsky S: P a ­
rám etros pronósticos en M ielom a M últiple. M edicina, 6:
569, 1976.
Pizzolato M , Goñi F y S alvarezza R: linm unoflxation on
ce llu lo se acetate: An im p ro v ed screen in g m e th o d fo r
m onoclonal im m unoglobulins. J Im m unol M ethods, 26:
365, 1979.
Pizzolato M , G oñi F, V illa N, G asparini S y B resciani P:
D iagnóstico de enferm edad de las cadenas pesadas. D es­
c rip c ió n de un n u ev o m é to d o . R e v is ta A B A , 46: 11,
1982.
P izzolato M: Screening o f M on o clo n a l Im m un o g lo b u lin s
by Im m unofixation o f cellulose acetate. On “M ethods in
É nzim ology". V ol 92. E d S P C olow ick y N O Kaplan.
“Im m unochem ical T echniques” P art E C oEd H V an V u ­
nakis y J J Langone. A cadem ic Press, N. Y. 1983, pág.
220 .
Pizzolato M y Goñi F: Thin layer gel filtration im m unofi­
xation: Identification o f abnorm al m olecular w eight im ­
m u n o g lo b u lin s or related frag m en ts. J Im m u n o l M e t­
hods, 72: 91, 1984.
P izzolato, M. Vifflo J. “G am m opaties esen ciale s” . E n c i­
clopedia Iberoam ericana de H em atología. A . López B o ­
rrasca y col. Ed. U n iversidad de S alam an ca (E spaña).
V ol. II, 521, 1992.
Salm ón S y Seligm ann M : B -eell neoplasia in m an. Lcm-
cet, 2: 1230, 1974.
San M iguel, J. p., G o nzález, M . G ascón, A. “I.ym p h o id
s u b se ts and p ro g n o s tic fa cto rs in m ú ltip le m y e lo m a .
B lo o d 74; 379, 1989.
W a ld e n s tro m J: D ia g n o s is a n d T re a tm e n t o f M ú ltip le
M yelom a. N ew Y ork, G ruñe & Stratton, 1970.
W hicher J, C alvin J, R iches P, W arren C; T he laboratory
investigation o f paraproteinem ia. A n n CU Biochem , 24:
119, 1987.
Manifestaciones de hipersensibilidad.
Alergia
RICARDO MARGNI
Al comienzo de este libro, al hablar de inm u­
nidad, decíamos que la inoculación de un antí­
geno producía un efecto beneficioso pues los
anticuerpos elaborados por el huésped, como
consecuencia de la penetración de ese antígeno,
tenían la capacidad de neutralizar la acción del
agente agresor. Pero no siempre las cosas ocu­
rren de esa manera ya que, segtín las caracterís­
ticas del antígeno, su vía de penetración, el tipo
de anticuerpo formado o las características ge­
néticas del huésped, puede desencadenar un
efecto desfavorable caracterizado por una m a­
nifestación de hipersensibilidad conocida con
el nombre de alergia.
Alergia fue definida originalmente por von
Pirquet como “modificación de la respuesta de
un organismo a sustancias a las cuales ha sido
precedentemente sensibilizado”. Esta definición
amplia incluye también la inmunidad; hoy se la
ha restringido a “efecto perjudicial de hipersen­
sibilidad”, pero no por variaciones cuantitativas
de la sensibilidad, sino cualitativas. De esta m a­
nera, se engloba dentro de alergia a toda mani­
festación de hipersensibilidad desencadenada
como consecuencia de la inoculación de un an­
tígeno y diferente de cualquier acción que el an­
tígeno podría tener por sí mismo. Esta defini­
ción perm ite diferenciar la dism inución del
efecto tóxico de una toxina diftérica, por ejem ­
plo, en un animal previamente inoculado con
ella (variación cuantitativa, fenómeno de tipo
inmunitario), de un choque anafiláetico desen­
cadenado en un animal de experiencia reinocu­
lado con albúmina de huevo, como consecuen­
cia de la liberación de mediadores químicos.
Las manifestaciones de hipersensibilidad se
agrupan en dos capítulos fundamentales: el de
las manifestaciones específicas, originadas por
la penetración de un antígeno, y el de las no es­
32
pecíficas. Dentro de las primeras, las llamadas
de tipo inm ediato se producen como c o n se ­
cuencia de la interacción de antígenos y anti­
cuerpos séricos, y las retardadas son originadas
por antígenos y células específicamente sensi­
bilizadas (cuadro 32-1).
Si bien lo de inmediato o tardío está relacio­
nado con el tiempo de aparición del fenómeno,
en las primeras, aun cuando la formación de los
inmunocomplejos es rápida, la expresión clíni­
ca puede ser tardía, como ocurre en la reacción
de Arthus.
HIPERSENSIBILIDAD ESPECÍFICA
Para entender las interrelaciones entre hiper­
sensibilidad e inm unidad, el ejemplo clásico
del neumococo quizá pueda aclarar m ejor las
cosas. Si se vacunan cobayos mediante varias
inoculaciones de neum ococos muertos, estos
anim ales se hacen resistentes a la infección
neum ocócica, y demuestran por lo tanto que
han adquirido inmunidad. Si a esos cobayos se
les inyecta el poliósido de la cápsula d e los
neumococos, en la misma dosis con la cual es
inactivo en el cobayo normal, pero m ediante
inoculación intravenosa, se d esencadena un
choque anafiláctico. Si los cobayos tienen un
buen título de anticuerpos precipitantes y se les
inocula intradérmicamente el poliósido neum o­
cócico, en el punto de inoculación se producirá
una necrosis por desencadenamiento de un fe­
nómeno de Arthus. Si lo que se inyecta a los
cobayos por vía intradérmica es la proteína del
neumococo, se produce una inflamación local
debida a una alergia retardada. Se ha elegido
para la experiencia el neumococo por las carac­
terísticas de su estructura antigénica, pero otras
638 Inmunopatología
TLG + IF
WM PS NS
a ' a'
F ig . 31-7. D eterm inación sim ultánea del tipo ininunológi-
co y el peso m olecular de Igs m onoclonales y sus fragm en­
tos m ediante TL G -IF (gel filtración-inm unofijación). T o­
m ado de: Pizzolato, M y col R ev A BA , 46: I I , 1982.
/ a 3: TLG (gel filtración en capa fin a )
1. Suero de un paciente con m acroglobulinem ia de W a l­
denstrom (W M ).
2. Suero de un paciente (PS) con GM de tipo IgG-K.
3. Suero norm al (NS).
4 y 5. TLG + IF (G el filtra ció n - inm unofijación)
4. M uestra 2 con antisuero antigam m a (ay).
5. M uestra 2 con antisuero antialfa (aa).
tivamente descartadas a causa de su baja sensi­
bilidad.
B IB L IO G R A F IA
A lexanian R, B alcerzak S, B o n n et J, G ehan E, H aut A,
H ew lett J y M onto R: P ro g n o stic F acto rs in m ú ltip le
m yelom a. Cáncer, 36: 1192, 197.5.
D urie B y Salm ón S: A clinical Staging System for M últi­
ple M yelom a. Cáncer, 36: 842, 1975.
K yle R y Bayrd E: The M onoclonal G ainm opathies, M ú lti­
p le M y e lo m a a n d R e la te d P la s m a - C e ll D is o r d e r s .
S pringfield III, C harles C. Thom as, pp. 159, 1976.
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nificance; natural history o f 241 cases. Am J M ed, 64:
184, 1978.
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tology, 11: m , 1982.
K yle, R. “T he g am m opathies” . Sem inara in H em atology,
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K yle R y G arton J P; Laboratory m onitoring o f m yelom a
proteins. Seminar.': in O ncology, 13: 310, 1986.
M edical R esearch C o u n cil’s W orking Party for Therapeu-
tic Triáis in L eukem ia: R eport on the first M yelom atosis
T rial. I. A naly sis o f p resen tin g featu res o f p ro g n o stic
im portance. B r J H aem at, 24: 123, 1973 y Br. J. C áncer,
48:841, 1980.
N ational C áncer Institute, C om m ittee o f the C hronic L e u ­
kem ia, M y elo m a T ask F orcé: P roposed gu id elin es for
protocol studies. II Plasm a Cell M yelom a. C áncer Che-
m other. Rep, 4: 145, 1973.
O sserm ann E: Plasm a Cell D yscrasias: A current Perspec-
tive. A cta H aem at, 68: 167, 1982.
P aviovsky S, D upont J y Pizzolato M: M ielom a m últiple.
D iagnóstico, factores pronósticos y tratam iento. M ed ici­
ne, 7: 367, 1982.
Pizzolato M , Torquatti S, S toliar A, Pizzolato M C y Wi~
kinski R: P araproteínas idiopáticas ¿B enignas? In cid en ­
cia en individuos aparentem ente sanos. Revista ABA, 40:
96, 1975.
Pizzolato M , B echerini J, C avagnaro F y Paviovsky S: P a ­
rám etros pronósticos en M ielom a M últiple. M edicina, 6:
569, 1976.
Pizzolato M , Goñi F y S alvarezza R: Im m unofixation on
ce llu lo se acetate: An im p ro v ed screen in g m e th o d fo r
m onoclonal im m unoglobulins. J Im m unol M ethods, 26:
365, 1979.
Pizzolato M , G oñi F, V illa N, Ga,sparini S y B resciani P:
D iagnóstico de enferm edad de las cadenas pesadas. D es­
c rip c ió n de un n u ev o m é to d o . R e v is ta A B A , 46: 11,
1982.
P izzolato M: Screening o f M on o clo n a l Im m un o g lo b u lin s
by Irnrrmnofixation o f cellulo.'ie acetate. On “M ethods in
É nzim ology". V ol 92, E d S P C olow iek y N O Kaplan.
“Im m unochem ical T echniques” P art E C oEd H V an V u-
nakis y J J Langone. A cadem ic Press, N. Y. 1983, pág.
220 .
Pizzolato M y Goñi F: Thin layer gel filtration im m unofi­
xation: Identification o f abnorm al m olecular w eight im ­
m u n o g lo b u lin s or related frag m en ts. J Im m u n o l M e t­
hods, 72: 91, 1984.
P izzolato, M. V inio J. “G am m opaties esen ciale s” . E n c i­
clopedia Iberoam ericana de H em atología. A . López B o ­
rrasca y col. Ed. U n iversidad de S alam an ca (E spaña).
V ol. II, 521, 1992.
Salm ón S y Seligm ann M : B -eell neoplasia in m an. Lcm-
cet, 2: 1230, 1974.
San M iguel, J. F’., G o nzález, M . G ascón, A. “L ym phoid
s u b se ts and p ro g n o s tic fa cto rs in m ú ltip le m y e lo m a .
Blood, 74: 379, 1989.
W a ld e n s tro m J: D ia g n o s is a n d T re a tm e n t o f M ú ltip le
M yelom a. N ew Y ork, G ruñe & Stratton, 1970.
W hicher J, C alvin J, R iches P, W arren C: T he laboratory
investigation o f paraproteinem ia. A n n CU Biochem , 24:
119, 1987.
Manifestaciones de hipersensibilidad.
Alergia
RICARDO MARGNI
Al comienzo de este libro, al hablar de inm u­
nidad, decíamos que la inoculación de un antí­
geno producía un efecto beneficioso pues los
anticuerpos elaborados por el huésped, como
consecuencia de la penetración de ese antígeno,
tenían la capacidad de neutralizar la acción del
agente agresor. Pero no siempre las cosas ocu­
rren de esa manera ya que, segtín las caracterís­
ticas del antígeno, su vía de penetración, el tipo
de anticuerpo formado o las características ge­
néticas del huésped, puede desencadenar un
efecto desfavorable caracterizado por una m a­
nifestación de hipersensibilidad conocida con
el nombre de alergia.
Alergia fue definida originalmente por von
Pirquet como “modificación de la respuesta de
un organismo a sustancias a las cuales ha sido
precedentemente sensibilizado”. Esta definición
amplia incluye también la inmunidad; hoy se la
ha restringido a “efecto perjudicial de hipersen­
sibilidad”, pero no por variaciones cuantitativas
de la sensibilidad, sino cualitativas. De esta m a­
nera, se engloba dentro de alergia a toda mani­
festación de hipersensibilidad desencadenada
como consecuencia de la inoculación de un an­
tígeno y diferente de cualquier acción que el an­
tígeno podría tener por sí mismo. Esta defini­
ción perm ite diferenciar la dism inución del
efecto tóxico de una toxina diftérica, por ejem ­
plo, en un animal previamente inoculado con
ella (variación cuantitativa, fenómeno de tipo
inmunitario), de un choque anafiláctico desen­
cadenado en un animal de experiencia reinocu­
lado con albúmina de huevo, como consecuen­
cia de la liberación de mediadores químicos.
Las manifestaciones de hipersensibilidad se
agrupan en dos capítulos fundamentales: el de
las manifestaciones específicas, originadas por
la penetración de un antígeno, y el de las no es­
32
pecíficas. Dentro de las primeras, las llamadas
de tipo inm ediato se producen como c o n se ­
cuencia de la interacción de antígenos y anti­
cuerpos séricos, y las retardadas son originadas
por antígenos y células específicamente sensi­
bilizadas (cuadro 32-1).
Si bien lo de inmediato o tardío está relacio­
nado con el tiempo de aparición del fenómeno,
en las primeras, aun cuando la formación de los
inmunocomplejos es rápida, la expresión clíni­
ca puede ser tardía, como ocurre en la reacción
de Arthus.
HIPERSENSIBILIDAD ESPECÍFICA
Para entender las interrelaciones entre hiper­
sensibilidad e inm unidad, el ejemplo clásico
del neumococo quizá pueda aclarar m ejor las
cosas. Si se vacunan cobayos mediante varias
inoculaciones de neum ococos muertos, estos
anim ales se hacen resistentes a la infección
neum ocócica, y demuestran por lo tanto que
han adquirido inmunidad. Si a esos cobayos se
les inyecta el poliósido de la cápsula d e los
neumococos, en la misma dosis con la cual es
inactivo en el cobayo normal, pero m ediante
inoculación intravenosa, se d esencadena un
choque anafiláctico. Si los cobayos tienen un
buen título de anticuerpos precipitantes y se les
inocula intradérmicamente el poliósido neum o­
cócico, en el punto de inoculación se producirá
una necrosis por desencadenamiento de un fe­
nómeno de Arthus. Si lo que se inyecta a los
cobayos por vía intradérmica es la proteína del
neumococo, se produce una inflamación local
debida a una alergia retardada. Se ha elegido
para la experiencia el neumococo por las carac­
terísticas de su estructura antigénica, pero otras
640 Inmunopatología
Cuadro 32-1
Inm ediata
(anticuerpos
séricos)
Específica
H ipersensi­
bilidad
Retardada
(células especí­
ficam ente sensi­
bilizadas)
' Tipo S annarelli-S chw artzm ann
Inespecífica
A gentes físicos
bacterias como las salm onelas, brúcelas, e s­
treptococos, en las que es posible separar fácil­
mente los constituyentes antigénicos poliosídi-
cos y proteicos, pueden ser utilizadas ig u al­
mente para desencadenar los fenóm enos que
acabamos de indicar.
Esta experiencia muestra claramente que el
mismo complejo antigénico puede originar un
estado de inmunidad o predisponer para reac­
ciones de hipersensibilidad. Todo depende del
tiempo transcurrido entre la prim era inocula­
ción y la desencadenante, de las características
del antígeno, de la vía de inoculación utilizada
y del tipo de anticuerpo interviniente. De lo
que no quedan dudas es que tanto la inmunidad
como la alergia son la resultante de la interac­
ción de los antígenos con los anticuerpos o cé­
lulas específicainente sensibilizadas, que se
han formado como consecuencia de la estim u­
lación previa con esos antígenos.
Gell y Coombs han implementado un siste­
ma para clasificar las reacciones de hipersensi­
bilidad específica, que incluye cuatro formas
reaccionantes. La clasificación resulta útil en
medicina, ya que permite encuadrar cada grupo
en un tipo particular de manifestación de hiper­
sensibilidad. No obstante, la ubicación de un
paciente en uno u otro grupo a veces no es ta­
rea fácil ya que puede haber superposición de
fenómenos.
La reacción de tipo I o anafilaxia es mediada
por anticuerpos citotrópicos. La IgE se une a
receptores de los mastocitos y basófilos sanguí­
neos y, cuando en esas condiciones interaccio­
na con el antígeno, pone en marcha los m eca­
nismos que llevan a la hberación de los m edia­
dores químicos responsables del fenómeno.
La reacción de tipo II o de eitotoxicidad an­
ticuerpo dependiente, con participación del sis­
A nticuerpos 1ro-
A ctiva
m ocitotrópicos
A nafilaxia
y lieterocitotró^
Pasiva
Por anticuerpos picos (experi­
fijados a células m ental)
A nticuerpos ho- A ctiva
m ocitotrópicos { A lergia atópica
(espontáneo) Pasiva
P or anticuerpos f Fenóm eno de A ctivo
circulantes 1 IArtiius (local) Pasivo
T ipo tuberculínico
T ipo alergia de contacto
R echazo de hom oinjertos
í G eneral
Local
tem a com plem ento o sin ella, se caracteriza
porque el anticuerpo hace de puente entre un
epitope antigénico localizado en una célula
“lílanco”, a través de su paratope, y un linfocito
citotóxico. La unión a esta célula ocurre por fi­
jación del fragmento Fe de la inmunoglobulina
a un receptor para Fe presente en la célula efec­
tora.
La reacción de tipo III coiTesponde a las ina-
nifestaciones de hipersensibilidad que ocurren
cuando se forman complejos Ag-Ac fijadores
del complemento. La activación de este sistema
libera péptidos (C3a, C5a) que por quimiotac-
tismo atraen polimorfonucleares a la zona, que
fagocitan los agregados forixiados. Durante este
proceso se liberan productos que contribuyen
al daño tisular local. La reacción típica de este
tipo es la de Arthus.
La reacción de tipo IV tiene lugar sin la par­
ticipación de anticuerpos. Los linfocitos T son
los responsables, dando lugar a las llam adas
reacciones de hipersensibilidad retardada, que
se consideran en el capítulo 16.
ALERGIA INMEDIATA
Manifestaciones de hipersensibilidad
de tipo anafiláctico
Las primeras experiencias de este tipo se de­
ben a Portier y Richet, quienes trabajando con
extractos de tentáculos de anémona y usando al
perro como animal receptivo, comprobaron que
las inoculaciones del material a repetición le
producían la muerte. En un principio se creyó
que era una consecuencia del cúmulo de sus­
tancias tóxicas presentes en los tentáculos de
anémona. Luego pudo verse que dosis globales

de ese material, u otros, como proteínas séri­
cas, albúmina de huevo, etc., inoculadas en una
sola vez no producían ningún trastorno, en tan­
to que la inoculación de dosis fraccionadas del
mismo antígeno en cantidades muy pequeñas y
cuya suma no llegaba a superar la dosis global
provocaba la muerte del animal. Portier y Ri-
chet designaron a ese fenóm eno “anafilaxia”
[de ana (contrario, negativo) y phylaxia (pro­
tección)], ya que se caracterizaba por la pérdida
de protección contra el agente agresor.
La anafilaxia, conocida también como reac­
ción de tipo I de Gell y Coombs, al igual que la
inmunidad, puede ser de dos tipos: activa y pa­
siva. La activa se caracteriza porque en ella el
animal que experimenta el choque anafiláctico
ha sido sensibilizado previamente con tal fin
mediante la inoculación de antígeno, en tanto
que en la anafilaxia pasiva el animal que expe­
rimenta el choque anafiláctico no ha sido sensi­
bilizado con antígeno, pero se le ha inyectado,
previo al desencadenam iento del fenóm eno,
suero de un animal específicamente sensibiliza­
do con el antígeno que se ha de ensayar.
A n a f il a x ia a c t iv a
Puede tener manifestaciones generales o lo­
cales.
Anafilaxia activa general
El animal presenta una serie de m anifesta­
ciones de hipersensibilidad o choque anafilácti­
co cuyas características pueden diferir en parte
según la especie. Para conseguirlo es indispen­
sable sensibilizar previamente al animal con el
mismo antígeno con que habrá de desencade­
narse el choque anafiláctico.
Si a un cobayo se le inoculan 10 m g de
ovoalbúmina por vía subcutánea e intraperito­
neal y tres semanas después se repite la inocu­
lación (este segundo estímulo se hará por vía
intravenosa y con una dosis aun inferior a la
utilizada en la sensibilización), se consigue
provocar un choque anafiláctico caracterizado
por la contractura de la musculatura lisa, sobre
todo intestinal y bronquial y una serie de fenó­
menos vasógenos. De acuerdo con el grado de
sensibilización previa, el choque anafiláctico
desencadenado podrá tener mayor o menor in­
tensidad, y llegará en algunos casos, como con­
secuencia de la exagerada contractura de la
m usculatura bronquial, a provocar la m uerte
por asfixia.
Este tipo de manifestación de hipersensibili­
dad se debe a que al inyectar la dosis sensibili­
zante de antígeno se originan anticuerpos séri­
cos circulantes, parte de los cuales tienen capa­
cidad para fijarse a células especiales, entre las
Manifestaciones de hipersensibilidad 641
que se encuentran los mastocitos o células gra­
nuladas basófilas y los basófilos sanguíneos.
Al inocular la segunda dosis de antígeno
(dosis desencadenante), éste reacciona con los
anticuerpos fijos, interacción que desencadena
el mecanismo que lleva a la liberación p o r par­
te de dichas células de mediadores químicos,
cuyo principal representante es la histamina, y
que son los que provocan las alteraciones a re­
sultas de las cuales tendrá su expresión clínica
el fenómeno anafiláctico.
La intensidad del choque depende en gran
parte de la vía utilizada para desencadenarlo.
La vía intravenosa es mucho más efectiva que
la subcutánea, intramuscular o intraperitoneal.
Por estas vías, el choque anafiláctico general­
mente no es fatal y, si ello ocurre, se produce
después de algunas horas. La vía intravenosa es
más activa porque la formación de los inmuno-
complejos es rápida y como consecuencia de
ello la cantidad de mediadores químicos que se
liberan es mayor para una m ism a u nidad de
tiem po. Por las otras vías el proceso es más
lento y los compuestos vasoactivos liberados
son más fácilmente degradados por sus inhibi­
dores específicos, disminuyendo la intensidad
de su actividad farmacológica.
Las características del choque anafiláctico
difieren según la especie animal y es conse­
cuencia, principalm ente, de los m ediadores
químicos liberados y de la ubicación de las cé­
lulas fijadoras de los anticuerpos.
En el caso del cobayo, pocos minutos des­
pués de la inoculación de la dosis desencade­
nante el animal se aquieta, eriza su pelo, espe­
cialmente el que rodea la nariz, expande sus fo­
sas nasales, hace inspiraciones violentas no se­
guidas de expulsión del aire, experimenta con­
v u lsio n es, se p o stra, generalm ente o rin a , y
muere si estaba muy sensibilizado. La autopsia
revela pulmones pálidos, enfisem atosos, que
llenan totalm ente la cavidad to rácica como
consecuencia del aire retenido, y serosas con­
gestionadas. Al iniciarse el choque anafiláctico,
la presión aumenta para descender luego. Se
observan además leucopenia, trombocitopenia
y aum ento del tiem po de coagulación, como
consecuencia de la heparina liberada.
La sintomatología es debida a la liberación
de histamina por los mastocitos en zonas loca­
lizadas del pulmón, en especial próximas a los
bronquiolos que al actuar produce edem a de
las membranas mucosas, aumento de secreción
m ucosa y contractura de la m usculatura lisa,
desencadenando los fenóm enos respiratorios
descritos.
El perro, que también libera como principal
mediador químico histamina, presenta una sin­
tomatología diferente de la descrita en el coba­
yo. A quí las m anifestaciones son hepáticas.
642 Inmunopatología
con congestión del órgano y todo el sistem a
portal, siendo las venas hepáticas las que su­
fren el mayor impacto como consecuencia del
choque. Hay una marcada hipotensión y hemo­
rragia visceral. Al iniciare el choque anafilácti­
co, que es más tardío en aparecer y en provocar
el desenlace fatal, el animal experimenta vómi­
tos, diarrea, disnea, hipotermia y finalmente el
colapso que lo lleva a la muerte.
El ratón presenta síntomas un poco diferen­
tes de los descritos en el cobayo y el perro, de­
bido sobre todo a que el principal m ediador
químico liberado por este animal es serotonina,
que se encuentra en las células enterocromafí-
nicas del tracto intestinal. El choque se produce
entre los 20 y 60 minutos de inoculada la dosis
desencadenante. El animal presenta cianosis,
paresia y reducción del volum en sanguíneo.
Como consecuencia de ello el hematócrito au­
menta, por la extravasación de plasma provoca­
da por el incremento de la permeabilidad capi­
lar desencadenada por el mediador químico.
Otros animales, como el conejo, que liberan
histamina y serotonina, presentan síntomas pul­
monares y vasculares asociados.
El choque anafiláctico en el hombre, gene­
ralmente es un hecho casual y se desencadena
por la inoculación de algún antígeno al cual
previamente estaba sensibilizado. Puede ocurrir
por la inyección de sueros antítóxicos (proteí­
nas séricas de caballo), antibióticos, drogas, va­
cunas, etc.; sus consecuencias llegan a ser fata­
les si su sensibilización era grande. Es tan sen­
sible a este fenómeno, que se han descrito ca­
sos de muerte por absorciones de pequeñas do-
sis-antigénicas al efectuar pruebas cutáneas pa­
ra diagnóstico de alergia. El tracto respiratorio
es el más afectado pero se comienza con pica­
zón en las palmas de las manos, enrojecimiento
de la piel, y sigue edema de glotis, disnea y co­
lapso. Por regla general ocurre edema obstruc­
tivo del árbol respiratorio superior, seguido de
hipotensión y enfisema.
M e d ia d o r e s q u ím ic o s
Forman parte de dos grupos definidos; los
"‘prefarmados” o primarios y los “sintetizados
durante el proceso” o secundarios. En el pri­
mer grupo están los mediadores químicos que
existen en las células como tales y cuya libera­
ción no im plica una transform ación quím ica
previa. Pueden ser de acción vasógena acentua­
da o nula. En este grupo se incluye la heparina,
que, si bien es un mediador químico liberado
como con.secuencia del choque anafiláctico, no
es responsable de los fenómenos vasógenos y la
contractura muscular que caracteriza a la anafi­
laxia. Entre los mediadores químicos “prefor-
mados” con acción vasógena hay dos aminas
primarias, la histamina y la serotonina o 5-hi-
droxitriptamina. Se liberan además enzimas y
factores quimiotácticos para polimorfonucleares
neutrófilos y eosinófilos, que participan en me­
canismos de regulación homeostática.
Los mediadores químicos “que se sintetizan”,
entre los que figuran la bradiquinina y las cali-
dinas, son polipéptidos básicos y se caracterizan
porque en el organismo sólo existen como pre­
cursores, y para ejercer su acción deben sufrir
una transformación previa. Entre éstos se en­
cuentran también los leucotrienos, productos de
matabolización del ácido araquidónico, vía de
la lipoxigenasa, englobados dentro de lo que an­
teriormente se designaba sustancia de reacción
lenta (SRS-A), y las prostaglandinas provenien­
tes de la metabolización del mismo ácido graso
no saturado, vía de la cicloxigenasa.
M ediadores químicos preformados
a) Histamina. Es un producto resultante de
la decarboxilación de la histidina, que tiene la
p a rtic u la rid a d de p ro d u cir co n tracció n del
músculo liso, vasodilatación y aumento de la
permeabilidad capilar. Al actuar sobre las cé­
lulas endoteliales de los vasos, éstas se con­
traen y, al exponer a la sangre zonas desnudas
de la pared vascular, aumentan la perm eabili­
dad para macrom oléculas. Se localiza prefe­
rentemente en las células cebadas o m astoci­
tos, presentes en el peritoneo, la pleura, en ia
piel que rodea la nariz, en la lengua, la cápsula
hepática, los pezones, y su concentración es de
1 a 4 X 10 |J.g por célula. La heparina también
se encuentra en estas células y, cuando como
consecuencia de la desgranulación de éstas,
pior acción del choque anafiláctico, se produce
liberación de histamina, hay liberación de he­
parina. En los gránulos, la heparina y la hista­
mina se encuentran combinadas a un complejo
proteico. Cuando los gránulos son expulsados
de las células basófilas, por un mecanismo de
intercam bio iónico hay penetración de Na+,
que da lugar a la formación de proteinato sódi­
co y liberación de histam ina. Generalm ente,
los gránulos basófilos se vuelven amorfos y se
solubitizan. La histam ina está presente tam ­
bién en los basófilos sanguíneos y en muy pe­
queñas cantidades en las plaquetas, y se calcu­
la que es del orden de lO '® \xg por plaqueta.
Los pulmones del hombre y cobayo contienen
2 a 25 |0,g de histamina por gramo de órgano.
Se estima que 0,2 |.tg son suficientes para ejer­
cer su actividad farmacológica sobre los bron-
quiolos. La histamina es específicamente inhi­
bida por los antihistam ínicos, sustancias que
por su composición química actúan por com­
petición con la histamina sobre los receptores
de ¡as células efectoras.
 Manifestaciones de hipersensibilidad 643

Se conocen dos tipos distintos de receptores vidad farmacológica (sensibilidad bronquiolar)

para histamina, los H1 y los H2. Los primeros sólo ocurre a mayores dosis. Para el prim ero
intervienen en la mayor parte de los procesos son superiores a 20 |lg. Es inhibida por el ácido
desencadenados por la histamina sobre el miis- lisérgico.
culo liso y los vasos, en tanto que los segundos c) Factores quimiotácticos. Se conocen fac­
participan en la puesta en marcha de los fenó­ tores que ejercen una acción quimiotáctica so­
menos que aumentan la frecuencia cardíaca y bre granulocitos eosinófilos (FQE-A) y neutró­
la secreción gástrica. filos (FQN-A). El primero de ellos es de bajo
En el organismo la histamina es rápidamente peso molecular, en tanto que el segundo es de
inactivada por oxidación, mecanismo en el que peso molecular alto. Estos factores, que están
participa la histaminasa. La metilación también preformados, son liberados por las células ba-
la inactiva (fig. 32-1). sófiJas junto con la histamina. Ejercen un tac-
b) Serotonina (5-hidroxitriptamina). Se ori­ tismo positivo sobre los granulocitos, y en el
gina a partir del triptófano, el que por acción de caso particular de FQE-A, los eosinófilos re­
la triptófano monoxigenasa da lugar al 5-hidro- clutados ejercen acción fagocítica sobre los
xitriptófano. Sobre éste actúa la 5-hidroxitrip- complejos Ag-Ac, a la vez que una función re­
tófano decarboxilasa originando 5-hidroxitrip­ guladora. Esta tiene lugar a través de la arilsul-
tamina o serotonina (fig. 32-2). fatasa liberada por los eosinófilos, enzima que
Se caracteriza porque provoca contractura inactiva a los leucotrienos (LT). El FQE-A in­
del músculo liso, vasoconstricción y aumento duce además un aumento de los receptores para
de la permeabilidad capilar. Se localiza princi­ C3b en los eosinófilos.
palmente en las plaquetas, que en el caso parti­ Un factor derivado de los eosinófilos (EDI)
cular del conejo son muy ricas en esta sustan­ también se libera durante el proceso, que inter­
cia. En la rata, cuyo contenido en pulmón es de fiere en la síntesis de la histamina.
aproximadamente 2 jig por gramo de órgano, d) Enzimas. Durante la desgranulación, junto
sólo son necesarios 0,01 fig para que su acción con los factores nombrados las células basófi-
farmacológica sobre los bronquiolos se ponga las liberan enzimas, principalmente proteasas
de manifiesto. En el hombre y en otros anim a­ neutras como triptasas, quimasas y carboxipep-
les las concentraciones son menores y su acti­ tidasas. El tipo y proporción de estas enzim as

HC = C — C H ,-C O O O H
I I I
HN N H j,
\c ^
I

H istid ina

H istidina decarb o xila sa y piridoxal 6-fosfato (cotactor)

H istam ina N -M etil transferasa - H istam inasa

HISTAMINA

-C H ,-C H ,- N H , (D----- C H ^-C O O H

Hp'
N,
CH, \C '

N-m etil histam ina (inactiva) Ácido im idazoiacético (inactivo)

Fig. 32-1. Mecanismo.s de síntesis e inactivación de la histam ina.

644 Inmunopatología

CHj'CH-COOH
^^CH^-CH-COOH
NH,
NH,
Triptófano m onoxigenasa

5-hidroxitriptófano

5 -hidroxitriptófano decarboxilasa

5-H idroxitriptam ina (S E R O TO N IN A)

M onoam inoxidasa

CH,-COOH

Á cido 5 -hidroxiindolacético (inactivo)

Fig. 32-2. M ecanism os de síntesis e inactivación de la serótina.

liberadas depende de la localización del masto- ción en los fenómenos anafilácticos e inflama­
cito comprometido. En el hombre, las células torios.
cebadas de la mucosa intestinal expresan acti­ Cuando el ácido araquidónico es metaboliza­
vidad de triptasa pero no de ciuimasa. do a través de la 5-lipoxigenasa, la acción tiene
Otras enzimas contenidas en los inastocitos lugar sobre el carbono 5, originándose el ácido
son hidrolasas ácidas como (3-exosaminidasa y 5 -h id ro p ero x ieico satetraen o ico (5H PE TE ),
enzimas oxidativas, pero su rol en la reacción producto inestable que por reducción'puede dar
anafiláctica o alérgica es desconocida. el alcohol correspondiente o ácido 5-hidroxiei-
cosatetraenoico (5-HETE), o convertirlo por
M ediadores que “ se sintetizan” acción de una deh id rasa en leu co trien o A^
(LTA^). Por acción de epoxidohidrolasa, el
a) Derivados del ácido araquidónico. Desde LTA^ se convierte en el leucotrieno (LTB^);
hace tiempo se tiene conocimiento de la exis­ y a su vez el LTA^ por acción de la glutatión-S-
tencia de una sustancia de carácter lipídico, que tra n sfe ra sa se co n v ierte en leu co trien o C^
se liberaba junto con la histamina, y que ejercía (LTC^). Por acción de y-glutamil transpeptida-
una acción vasógena y contracturante del inús- sa, el LTC^ libera ácido glutámico y origina el
culo liso, de aparición más tardía que la hista­ cisteinil-glicil-leucotrieno LTD^. Este leuco­
mina y productora de un efecto de tnayor dura­ trieno puede ser escindido por varias peptida-
ción. Se identificó como sustancia de reacción sas liberando glicina y originando el cisteinil
lenta (SRS-A). Hoy se sabe que la SRS-A no es leucotrieno LTE^ (fig. 32-3). De los productos
una sustancia única, sino que constituye una originados, el LTB^ constituye uno de los qui­
mezcla de productos derivados del ácido ara­ miotácticos de neutrófilos más potentes que se
quidónico, los leueotrienos. conoce; en tan to que LTC^, LTD^ y LTE^
El ácido araquidónico, ácido graso no satura­ (componentes de la SRS-A) inducen una acen­
do con cuatro enlaces dobles, se encuentra es- tuada contractura de la musculatura lisa, en es­
terificado al glicerol de los' fo sfolípidos de pecial del tejido pulmonar, siendo este efecto
membrana. En presencia de fosfolipasa A^ y 100 (LTC^) y 1000 (LTD^) veces superior al de
Ca^+ se libera y puede ser metabolizado a tra­ la histainina.
vés de dos vías, la de la lipoxigenasa, que en Los leueo trien o s aparecen en cantidades
definitiva origina leueotrienos, y la de la ciclo- apreciables, sobre todo en el pulmón del coba­
xigenasa que origina prostaglandinas y trombo- yo que ha sufrido un choque anafiláctico. Su
xanos, productos con actividad biológica. Leu- acción sobre el músculo liso, en especial en los
cotrienos y prostaglandinas tienen participa­ bronquiolos humanos, es lenta. La contractura
 Manifestaciones de hipersensibiiidad 645

,C O O H
A.A

5-Lipoxigenasa
O H
t /OOH cooh
/= V 7 - X ^ ^ ^ 5-H P E TE
5-H ETE —

D ehidrasa HO H
COOH
C OOH
G luta tió n-S - Tra n sfe ra sa
í C ys-G iy
G lutatión
y-glu
COOH , yG lu ta m il
G lutám ico Transpe p tid asa

LTB.

G licina

C ys-G iy

y-Glutam i! tran sp ep tid asa iGlutámico

^ , COOH

H” "S

Fig. 32-3. M etabolización del ácido araquidónico vía de la lipoxigenasa. O btención de leucotrienos.

se produce a los pocos minutos, pero es de ma­
yor duración que la originada por la histamina.
Tienen la capacidad de modificar la perm eabi­
lidad capilar y, cuando son liberados com o
consecuencia de una reacción anafiláctica, su
eliminación es más tardía. Se los considera co­
mo posibles responsables de la contracción
bronquial en el caso del asina humano insensi­
ble a los antihistamínicos.
Los leucotrienos producidos por la célula
“blanco” son inactivados por la arilsufatasa
elaborada por los tejidos locales y el infiltrado
de eosinófilos, que se origina como consecuen­
cia del tactismo ejercido por el factor FQE-A
liberado simultáneamente por la células basófi-
las “blanco” (fig. 32-4).
En pulmón se ha demostrado que los leuco­
trienos son sintetizados por las células basófi-
las y por los macrófagos alveolares, descono­
ciéndose la participación que cada uno de los
productos sintetizados por ambas células tiene
en las reacciones anafilácticas.
Es interesante señalar también que, cuando
una meiTibrana celular es atacada por el sistema
complemento con fijación de C5b-9, hay libe­
ración de ácido araquidónico. Esto estaría indi­
cando una posible participación de los com po­
nentes terminales del complemento en los fe­
nómenos de inflamación.
Cuando el ácido araquidónico es raetaboliza­
do a través de la cicloxigenasa se origina otra
familia de compuestos, la de las prostaglandi­
nas y tromboxanos, con diversas acciones bio­
lógicas.
Las prostaglandinas constituyen un grupo de
ácidos grasos no saturados, estrechamente rela­
cionados, derivados de un coiTipuesto hipotéti­
co de 20 carbonos con un anillo ciclopentano
(ácid o p ro stan o ico ). Los tro m b o x an o s son
compuestos no prostaglandínicos con un átomo
de oxígeno insertado en el anillo. Los m ecanis­
mos que llevan a la síntesis de las diferentes
prostaglandinas y tromboxanos están indicados
en la figura 32-5.
 Inmunopatología

Inactivación

F ig. 32-4. Inactivación de los leucotrienos po r la arilsiilfatasa.

Ácido araquidónico

COOH

F ig . 32-S. M etabolización del ácido araquidónico vía de la cicloxigenasa. O btenció

ión de pro.staglandinas y trom boxanos.

Algunos de estos com puestos son de vida
media muy corta, como la PGIj o prostaciclina
(5 minutos a 37“C); el tromboxano A^ (TXA^)
que produce agregación de plaquetas y vaso­
constricción es inestable, tiene una vida media
inferior al minuto y se transforma en TXB^ más
estable, pero menos activo.
En las reacciones de tipo anafiláctico, los
m astocitos producen grandes cantidades de
PGDj broncoconstrictora. La PGE, puede inhi­
bir la desgranulación del mastocito, es un rela-
jador muscular e inhibidor de la liberación de
mediadores químicos. Parecería que más que
mediadores químicos algunas de ellas fueran
potenciadoras de la acción de la histamina. T e­
niendo en cuenta que hay prostaglandinas con
acción antag ónica (PG D j v asoconstrictora;
PG Ej vasodilatadora), hay quienes suponen
que estos productos podrían tener un papel
muy importante como reguladores. La prosta-
glandina PGI^, por su actividad desagregante
de plaquetas, y los tromboxanos TXA^ y TXB^,
favorecedores de la agregación plaquetaria, po­
drían ser reguladores homeostáticos de la coa­
gulación sanguínea.
b) Bradiquinina. Es un nonapéptido compues­
to por aminoácidos de tipo L, que ha sido sinteti­
zado (Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-ProPhe-Arg).
Al principio se obtenía por acción de la trip­
sina o venenos de serpientes sobre seudoglobu-
linas (a globulinas), experiencias éstas que lle­
varon a Rocha da Silva a su descubrimiento.
Existe como precursor en forma de bradiquini-
nógeno y es liberado como bradiquinina activa
cuando los anticuerpos fijos reaccionan con sus
correspondientes antígenos. Es muy activa, y
provoca marcada contracción de Ja musculatura
lisa, vasodilatación y aumento de la permeabi­
lidad capilar. Es destruida por peptidasas. El
plasma sanguíneo, algunos tejidos y ios neutró­
filos contienen quininasas, enzimas que inacti-
van rápidamente la bradiquinina.
c) Calidinas o plasmaquininas. Son productos
que se obtienen por acción de enzimas llamadas
calicreínas, presentes en glándulas apocrinas, so­
bre las proteínas plasmáticas. Su actividad bioló­
gica es similar a la de la bradiquinina.
d) Factor de agregación plaquetaria. Se su­
pone que este factor (PAF) deriva de los lípi­
dos de membrana. Es uno de los mediadores de
la anafilaxia activa en el conejo. Ha sido identi­
ficado estructuralmente y sintetizado como el
acetil glicerol éter de fosforilcolina. También
se ha hallado en el hombre. Este factor, además
de producir la agregación de plaquetas, es un
potente vasoconstrictor, inductor de contrac­
ción del músculo liso y de quimiotactismo de
eosinófilos.
e) Citoquinas. Algunas citoquinas, principal­
mente las sintetizadas por los linfocitos coope­
Manifestaciones de fiipersensibilidad 647
radores del tipo TH2 parecen ser importantes
mediadores de las reacciones alérgicas, en es­
pecial los componentes asociados con la fase
inflamatoria de la reacción. Entre estas citoqui­
nas se encuentran:
¡L-4. La que se libera 1 hora después de la
interacción IgE-Ag y que parecería estar conte­
nida en los gránulos basófilos de los m astoci­
tos. E sta citoquina estim ula a los linfocitos
TH2 e inhibe a los TFH; induce en los liníbci-
tos B el cambio de clase de inmunoglobulina o
“switch” a IgE, y estimula al endotelio a produ­
cir moléculas de adhesión relacionadas con la
fijación de basófilos y eosinófilos, mecanismo
muy importante sobre todo en la primera fase
de los fenómenos inflamatorios alérgicos.
TNF-a. Citoquina producida por las células
murinas T H l y TH2 y por las células cebadas
humanas localizadas en piel y en pulmón. Esta
citoquina juega un rol importante en la in fla­
mación mediada por células cebadas, activando
a las células endotehales e induciéndolas a ela­
borar moléculas de adhesión comprometidas en
el reclutamiento de polimorfonucleares neutró­
filos sensibilizados con IgE, como lo son las
moléculas ICAM-I y otras.
IL-5, IL-3, GM-CSF. Estas citoquinas son
activadoras de eosinófilos y basófilos y han si­
do identificadas principalmente en la fase final
de la reacción alérgica.
T odos los m ediadores quím icos d escrito s
han sido identificados en fenómenos alérgicos.
En el hom bre, la histam ina, PGD2, L T C 4 y
triptasa han sido detectados in vivo en piel,
m ucosa nasal y pulm ón, después de la fase
aguda de una reacción Ag-IgE fijada a m astoci­
tos. Es por este motivo que histamina, PG D 2 y
triptasa son considerados como marcadores ú ti­
les de este fenómeno.
M e c a n is m o d e l a l ib e r a c ió n
DE LOS MEDIADORES QUÍMICOS
Experiencias sobre anafilaxia pasiva h eteró­
loga realizadas con híbridos preparados con
hemimoléculas de anticuerpos y hemimolécu-
las de IgG normal muestran que ellos, que en
definitiva son anticuerpos univalentes, son ca­
paces de desencadenar el choque anafiláctico.
Con relación al desencadenante, sólo son acti­
vos los antígenos y haptenos bivalentes o mul-
tivalentes, no así los haptenos m onovalentes
(fig. 32-6).
Otros tipos de experimentos demuestran que
para lograr inducir la desgranulación del m as­
tocito es indispensable ia agregación del recep­
tor de membrana para IgE (RIF ce), mecanismo
iniciador de los eventos bioquímicos responsa­
bles del proceso. Ello teniendo en cuenta que
se ha conseguido la hberación de los gránulos
648 Inmunopatología

Ag

G ránulos que contienen

h istam ina y heparina

F ig . 32-6. Esquem atización de la desgranulación de un m aslocito, con liberación de histam ina, causada por interacción
A g-A c. D e acuerdo a datos experim entales, es necesaria la interacción de dos m oléculas de anticuerpo con una de antígeno
p ara que la liberación de los m ediadores quím icos tenga lugar. Los anticuerpos pueden ser univalentes. Los haptenos m o ­
novalentes no desencadenan el fenóm eno. Resultados sim ilares se han logrado cuando el antígeno fue sustituido por an ti­
cuerpo anti-IgE, anticuerpo antiidiotipo, o cuando los m astocitos interactuaron con dím eros de IgE obtenidos por m étodos
quím icos o con anticuerpos anti F ce RI). Todo ello indica que el com ponente fundam ental para que se inicie la d esgranula­
ción es la agregación de los receptores para IgE (FceR l) presentes en la m em brana del m astocito. D espués de la liberación
de los m ediadores quím icos las células desgranuladas no m ueren, se recuperan. Ello significa una diferencia fundam ental
con las reacciones citotóxicas inducidas por otros tipos de anticuerpos.

basófilos cuando las células cebadas sensibili­
zadas con IgE fueron puestas en contacto con
el antígeno específico, con anticuerpo a n ti­
idiotipo o con anticuerpo anti-IgE. También se
ha conseguido desgranulación si mastocitos no
sensibilizados son puestos en contacto con dí­
meros de IgE obtenidos por unión química, con
anticuerpo anti-RIFce o si los mastocitos son
tratados con ionóforos de Ca^+ los que facilitan
el influjo de este ion al interior de la célula, fa­
se inicial del mecanismo que lleva a la activa­
ción celular. La IgE fijada puede interaccionar
también con leetinas como fitohem aglutinina
(PHA) o concanavalina A (Con A), vía hidra­
tos de carbono presentes en el Fe. Esto explica­
ría algunas reacciones de tipo alérgicas a frutas
ricas en leetinas, como las frutillas, que pueden
experimentar algunas personas.
Se ha analizado el mecanismo por el cual los
inmunocomplejos fijos inician la liberación de
los mediadores químicos descritos.
Pocos minutos después de la agregación de
los RIFce se produce la activación de una enzi­
m a asociada a la membrana del mastocito, la
metiltransferasa (MT) la que induce un signifi­
cativo aumento en la metilación de los fosfolí­
pidos de membrana. El entrecruzamiento de los
RIFce activa una serina proesterasa en serina
esterasa, la que convierte la fosfatidilserina en
fosfatidiletanolamina (PE), la que por metila­
ción forma fosfatidilcolina (PC). El acumulo de
esta enzima en la superficie de la membrana
plasmática facilita la formación de canales de
Ca-+, favoreciendo el influjo de Ca^+, el que tie­
ne una activa participación en la desgranula­
ción celular.
El mayor influjo de Ca^" activa a la fosfoli­
pasa A^ la que promueve la liberación de ácido
araquidónico a partir de los fosfolípidos de
membrana, el que segíin la vía enzimática se­
guida es convertido en prostaglandinas o leuco­
trienos, dos potentes mediadores de la reacción
alérgica (fig. 32-7).
El influjo de Ca^+ promueve además el agre­
gado de los microtiíbulos y la contracción de
los m icrofilam entos, indispensables para la
movilización de los gránulos hacia la membra­
na citoplasmática.
Se ha observado que, además de la metila­
ción de fosfolípidos de membrana e influjo de
Ca^^, hay un aumento de la actividad de la ade-
nil-ciclasa fijada a m em brana, caracterizada
por un aumento rápido de AMPc, el que a su
vez activa proteinquinasas dependientes de
A M Pc(PK A ). Estas enzim as intervienen en
procesos de fosforilación de las proteínas de
los gránulos de membrana, modificando su per-
me-abilidad para Ca^+ y agua, lo que facilita la
hinchazón de los gránulos y su fusión a mem­
brana durante el proceso de la liberación de
histamina por exocitosis de los gránulos.
En este proceso interviene energía, en cuya
regulación participa el AMPc. Se ha observado
que cuando hay liberación de histamina, en los
mastocitos disminuye el AMPc y aumenta el
GMPc.
No se conoce plenamente el mecanismo de
la transducción de señales intracelulares en el
m astocito. Teniendo en cuenta los adelantos
logrados en este campo en otros tipos celula­
res, especialm ente en el linfocito T y B, los
que parecen tener patrones comunes que se re­

piten, es opinión bastante generalizada de que
algo sim ilar debe ocurrir en la activación de
los m astocitos. P roteinq u in asas de tiro sin a
(PKTs) participarían en la etapa inicial de la
transducción. Al igual que en las otras células
estas PKTs fosforilarían y activarían fosfolipa­
sa C (PLC), hecho demostrado recientemente
al analizar productos obtenidos con posteriori­
dad al entrecruzam iento de RIFce. Es lógico
suponer que la fainilia de la .svc-proteinquina­
sas de tirosina, que han evidenciado activa
participación en otros tipos celulares, como los
linfocitos B y T, la tengan también en los m as­
tocitos.
La PCL generaría, a partir de PIP2, DAG (el
cjue activa PKC) e 1P3 que moviliza Ca^"‘ intra­
celular.
Todos estos eventos serían los c|ue induci­
rían la síntesis de algunos productos y la des­
granulación de las células basófilas para que se
produzca la liberación de los mediadores quí­
micos que habrán de poner en marcha la reac­
ción alérgica.
Estudios bioquímicos han permitido demos­
trar la activa participación del AMPc y GMPc
en los mecanismos que llevan a la liberación de
histamina y otros mediadores por los mastoci­
tos y basófilos, con la consecuente contracción
de la musculatura lisa y los fenómenos vasóge­
nos. Se ha propuesto en tal sentido un estado
de equilibrio entre AMPc y GMPc para el m an­
tenimiento de los controles homeostáticos de la
activación celular, regulado a su vez por el sis­
tema nervioso simpático y parasimpático.
En la mayoría de las células existen dos re­
ceptores adrenérgicos antagónicos denomina­
dos a y p, y un receptor colinérgico llamado y.
Diferentes estudios realizados sugieren que los
receptores adrenérgicos son enzimas, siendo la
ATPasa el receptor a y la adenilciclasa el p.
Catecolaminas como el isoproterenol o la epi-
nefrina transformarían a la adenilciclasa de su
forma inactiva en activa, la que tiene capacidad
para catalizar, en presencia de Ca^+ y Mg"“", la
formación de AMPc a través del ATP citoplas-
mático. Este nucleótido cíclico, constituido por
ácido adenílico con un grupo fosfato diesterifi-
cado en las posiciones 3 ’ y 5 ’ de la ribosa uni­
da, se comporta como un mediador intracelular
induciendo m odificaciones de las actividades
enzimáticas y de las barreras de la permeabili­
dad.
La ATPasa o receptor a puede competir por
el ATP con la adenil-ciclasa en la formación de
5 ’ AMP inactivo. Esta desviación del ATP pre­
cursor provocaría una disminución del AMPc
celular, lo que llevaría a la liberación de hista­
mina. La norepinefrina puede estim ular a la
ATPasa a form ar 5 ’AMP inactivo a partir de
ATP.
Manifestaciones de hipersensibilidad 649
El AMPc puede ser destruido por la adenil-
fosfodiesterasa, con lo que se consigue un efec­
to similar al anterior. Las metilxantinas (teofili-
na, teobromina, cafeína) inhiben esta enzim a
manteniendo la concentración de AMPc y evi­
tando la liberación de histamina.
El receptor colinérgico o receptor y parece
ser la guanilatociclasa. La enzima, que se en ­
cuentra en forma inactiva, al ser activada trans­
forma al GTP en el nucleótido cíclico 3 ’5 ’ mo-
nofosfato de guanosina (GMPc). El aumento en
las células basófilas del GMPc lleva a un au­
mento en la liberación de histamina, que puede
ser bloqueada por atropina. El GMPc es d e s­
truido por la guanilfosfodiesterasa, pero esta
enzima es 10 veces menos activa que la adenil-
fosfodiesterasa.
Se considera que en la reacción alérgica la
liberación de histamina y otros mediadores está
regulada por la fluctuación de los valores del
AMPc y GMPc. Aumento de GMPc con dism i­
nución de AMPc lleva a la liberación de h ista­
mina, ocurriendo lo contrario cuando los v alo­
res se invierten (fig. 32-8).
En síntesis, la musculatura lisa y el endotelio
vascular de los tejidos sensibilizados por anti­
cuerpos citotrópicos originan respuestas que
son moduladas por el sistema nervioso autóno­
mo. La estimulación de un receptor colinérgico
o la administración de acetilcolina (aumento de
GMPc y disminución de AMPc) lleva a la co n ­
tractura de la musculatura lisa y aumento de la
perm eabilidad capilar por liberación de h ista­
mina, en tanto que la estimulación de receptor
p-adrenérgico o la adininistración de epinefrina
o isoproterenol (aumento de AM Pc) provoca
relajam iento muscular antagonizando la re a c ­
ción anterior.
El choque anafiláctico es de corta duración
porque norm alm ente existen en el organism o
de los animales y del hombre inhibidores de los
mediadores químicos, que impiden su acum u­
lación.
Anafilaxia activa local
Si bien los fenómenos anafilácticos descritos
son de tipo general, la presencia de anticuerpos
fijos a células puede ponerse en evidencia lo­
calmente. Ello puede hacerse in vitro mediante
la clásica experiencia descrita inicialmente por
Sehultz-Dale, por la técnica de la desgranula­
ción de los mastocitos o in vivo por la prueba
de la anafilaxia cutánea activa.
Método de Sehultz-Dale: Si se toma un trozo
de intestino delgado (íleon) o útero virgen de
cobaya sensibilizada, y previa fijación a un
quimógrafo se lo introduce en un baño term os­
tatizado que contenga una solución salina b a ­
lanceada, como el líquido de Tyrode, se puede
650 Inmunopatología

i
J 9 E // \ V 9E // Histaminasa

Ariisufaltasa
Histamina J

P/ ^ I Leuootrineos

Prostaglandinas Tromboxanos Leucotrienos/ / /

(PGD2) (Tx) LTB4. LTC4, / i
¡ i lt d ^ lt e / : /
, I ' ( ,
t 1.__ ___________ / /

F ig . 32-7. Al interaccionar la IgE unida a la m em brana del m astocito, hay agregación del R IFce y se activan distintos sis­
tem as enzim áticos que llevan a la activación y desgranulación celular y secreción de m ediadores quím icos. La activación
de fosfolipasa C (PLC) hace que ésta, al actuar sobre fosfatidil-inositoldifo sfato (PIP2), lo desdoble en diacilglieerol
(D A G ) e inocitoltrifosf'ato (IP3). Éste m oviliza Ca^+ de los depósitos en el retículo endoplasm ático y activa u na proteinqui-
nasa dependiente de Ca^+ y calm odulina (PKCa^VCaM ) la que participa en la fosforilación de proteínas. A su vez el D A G
en presencia de Ca^'^ activa una proteinquinasa de serina (PK C)* la que fosforila proteínas que intervienen en la exocitosis
de los gránulos. La activación de la adenilciclasa genera aum ento de A M Pc, el que activa una una PK dependiente de
AiVIPc (PKA ), la que fosforila proteínas que tienen activa participación en el hinchado d e los gránulos y contracción de los
m icrofilam entos, m ecanism os éstos indispensables para la fusión a m em brana y exocitosis de los gránulos. M etíltransfera-
sas (M T) m etilan fosfatidiletanolam ina (PE) originando fosfatidilcolina (PC), esencial para el influjo de Ca^* y activación
de fosfolipasa A^ (P L A ,), la que actúa sobre los fosfolípidos de m em brana originando ácido araquidónico, el que puede ser
m etabolizado vía de la cicloxigenasa o lipoxigenasa, originando en el prim er caso prostaglandinas (PG) y trom boxanos
(Tx), y leucotrienos (LT) en el segundo. La histam inasa y la arilsulfatasa son enzim as que inhiben en la fase fluida, des­
pués de la secreción por los m astocitos, la histam ina y los leucotrienos, respectivam ente, participando en m ecanism os de
regulación hom eostática. (A daptado y m odificado de K ubi, J. “Im m unology” . W . H. Freem an and Co. N ew Y ork, 1992.

observar una in.scripción normal sin contractura
del músculo liso en ensayo. Si se añade una pe­
queña cantidad del antígeno que sirvió para la
sensibilización del animal y el no es de muy al­
to peso molecular, de modo que permita su rá­
pido pasaje a través de la serosa, la contracción
muscular se produce en pocos segundos. Ello
es consecuencia de la liberación de histamina
por parte de los mastocitos del tejido conectivo
del músculo uterino o intestinal, la que provoca
la contractura muscular.
Si producida la contractura se añade una
nueva dosis de antígeno, el m úsculo puede
contraerse nuevamente, pero con una intensi­
dad menor, llegando a ser nula en estimulacio­
nes posteriores. Se estima que ello se debe a la
saturación de los anticuerpos fijos por parte del
antígeno. Es específico, ya que sólo se eviden­
cia con el antígeno que sirvió para la sensibili­
zación del animal. No se produce daño muscu­
lar, lo que puede demostrarse mediante el aña­
dido al baño de pequeñas cantidades de hista­
m ina, las que provocarán la contractura del
músculo (fig. 32-9).
Desgranulación de mastocitos. Es una técni­
ca bastante simple y que consiste, en líneas ge­
nerales, en colocar sobre portaobjetos serosa
peritoneal de cobayos sensibilizados, la que es
cubierta con una adecuada dilución de antíge­
no y mantenida a 4“C durante 20-30 minutos.
Después del lavado y fijación, el material es
coloreado con tionina y observado al micros­
copio.
Si el animal estaba sensibilizado, se observa­
rá un gran porcentaje de células basófilas des­
granuladas (fig. 32-10). La liberación de hista-
 Manifestaciones de hipersensibilidad 651

S istem a colinérgico
Sistem a P-adrenérgico
o parasim pático
o sim pático
(receptor y) (receptor jj)

A cetilcolina Epinefrina

C élu la basófila

F ig. 32-8. R egulación hom eostática de la liberación de m ediadores quím icos a través del A M Pc y GMPc.

mina y lieparina por elidías células ocurre co­
mo consecuencia de ese fenómeno y, en este
caso particular, ello ha sido posible si previa­
mente ha habido una interacción antígeno-anti­
cuerpo.
Anafilaxia cutánea activa. La presencia local
de anticuerpos fijos puede demostrarse fácil­
mente si se recuerda que los mediadores quím i­
cos, en especial la histam ina liberada por los
inm unocom plejos, producen aum ento de la
permeabilidad capilar. Si a un animal sensibili­
zado se le inyecta intradérmicamente el antíge­
no usado en la sensibilización y por vía in tra­
venosa solución de azul de Evans, en el punto
de la inoculación del antígeno aparecerá entre
los 15 y 30 minutos una mancha azul. Ello se
debe a la extravasación del colorante por au ­
mento local de la permeabilidad capilar produ­
cida por las sustancias farmacológicamente ac­
tivas liberadas.

F ig. 32-9. Reacción de Schultz-D ale. Intestino delgado de cobayo inm unizado con ovoalbúm ina. La gráfica muestra q u e
la reacción e.s específica (la seroalbúm ina bovina no produce contractura del m úsculo liso), q ue hay agotam iento de a n ti­
cuerpos fijos (los estím ulos con ovoalbúm ina a repetición term inan por no contraer el trozo de intestino) y que no hay le ­
sión m uscular (la histam ina provoca contractura m uscular cuando el m ism o y a no responde a la ovoalbúm ina).
652 Inmunopatología
,
ANAFILAXIA PASIVA
Es importante no solamente porque sirve pa­
ra demostrar que la anafilaxia es mediada por
anticuerpos, sino también porque por este me­
canismo puede estudiarse mejor la dinámica de
la reacción, ya que los anticuerpos pueden re­
gularse al ser inoculados. La anafilaxia activa
depende, en cambio, de los anticuerpos que se
formen, hecho no regulable experimentalmen­
te, ya que es privativo de cada animal.
La anafilaxia pasiva puede tener una expre­
sión general o local pero, en ambos casos, para
que se produzca, es indispensable que exista un
período de latencia entre la inoculación de los
anticuerpos y la dosis de antígeno desencade­
nante, período durante el cual los anticuerpos
séricos inoculados habrán de fijarse a células
para interaccionar luego con el correspondiente
antígeno y desencadenar un fenómeno idéntico
al descrito en Anafilaxia activa.
Anafilaxia pasiva generalizada
Pueden ser homóloga o heteróloga, según se
utilice para la transferencia un anim al de la
misma especie o de especie diferente. Para lo­
grarla es necesario inocular al receptor suero
proveniente de un animal sensibilizado, y luego
de un período de latencia, suficiente como- para
que los anticuerpos se fijen a células, se inyecta
por vía intravenosa el mismo antígeno utilizado
para sensibilizar. Si la cantidad de anticuerpos
F ig . 3 2 -1 0 . M asto cito s
de la s e ro s a p e rito n e a l
de cobayo en los que se
o bservan diferentes g ra ­
dos de desgranuiación.
i
inoculada inicialmente fue suficientemente al­
ta, a los pocos minutos se desencadena un cho­
que anafiláctico con características similares al
que se produce en la anafilaxia activa.
El período de latencia varía según la canti­
dad de an ticu erp o in yectado. E x p erien cias
efectuadas en cobayos sensibilizados con anti­
cuerpo antiovoalbúm ina de conejo, m uestran
que, si la cantidad usada para sensibilizar es 6-
7 mg por animal, se obtiene una respuesta posi­
tiva desencadenada 30 minutos después. Cuan­
do se utilizan 750 )xg, dicho período se amplía
a 2 horas, y es de 5 horas si se sensibiliza con
375 |0,g de anticuerpo. Cuando las dosis utiliza­
das son inferiores a los 200 p,g, la muerte de los
animales, si ocurre, nunca se produce antes de
las 48 horas. Estas experiencias son importan­
tes, pues muestran que para sensibilizar correc­
tamente en forma pasiva a un cobayo con anti­
cuerpos heterólogos, de modo que el choque
anafiláctico pueda ser desencadenado antes de
los 30 minutos de la sensibilización, es necesa­
rio inocular dosis de anticuerpos del orden de
los 5-10 mg.
Anafilaxia pasiva local
Los tres métodos descritos para.demostrar la
an afilaxia activa local, o sea, la técnica de
Sehultz-Dale, la desgranulación de los mastoci­
tos y la reacción cutánea, pueden ser emplea­
dos para poner de manifiesto la anafilaxia pasi­
va local. Para la técnica de Sehultz-Dale, un
 Manifestaciones de hipersensibilidad
trozo de intestino o útero de cobaya normal es
puesto en contacto previamente con una solu­
ción que contiene anticuerpo. Luego se lava
con solución Tyrode, se fija a un quimógrafo y
se procede como se indicó en la anafilaxia acti­
va. Para conseguir la sensibilización, experi­
mentalmente se ha demostrado que el tiempo
de contacto no debe ser inferior a una hora.
Cuando el método empleado es la desgranu­
lación de los mastocitos, la serosa peritoneal de
un animal normal es puesta en contacto durante
30 minutos a 4°C con el anticuerpo en ensayo.
Después de lavar se añade el antígeno, sigue
una nueva incubación, lavado, fijado y teñido,
para finalmente proceder a la observación m i­
croscópica a efectos de verificar la desgranula­
ción. Con soluciones de anticuerpos de 50 |ig ■
m f' se obtienen muy buenas sensibilizaciones.
Lfno de los métodos más empleados para la
anafilaxia pasiva local, es la prueba de la anafi­
laxia cutánea pasiva o PCA, inicialmente des­
crita por Ovary. Para llevarla a cabo es necesa­
rio inocular al animal receptivo (cobayo, ratón)
el anticuerpo por vía intradérmica. Transcurri­
do el período de latencia, que varía según la
concentración de anticuerpo y la especie ani­
mal, se inyecta por vía intravenosa el antígeno
mezclado con azul de Evans. La interacción
antígeno-anticuerpo a nivel de la pared de los
capilares lleva a la liberación de sustancias far­
macológicamente activas, que provocan altera­
ción de la permeabilidad capilar. Como conse­
cuencia de ello el azul de Evans extravasa, apa­
reciendo 15-30 minutos después de la inyec­
ción una mancha azul en el punto de inocula­
ción del anticuerpo, si la reacción era positiva
F ig . 3 2 -1 1 . A n a fila x ia c u tá n e a
pasiva (PCA). a, b y c, reacciones
positivas efectuadas con anticuer­
po precipitante. A , B y C, reaccio­
nes positivas efectuadas con an ti­
cuerpo no precipitante (coprecipi-
tante), a ’, h ’, c ’, A ’, B ' y C ’: reac­
ciones negativas. Especificidad de
los anticu erpos: an tid in itro fen o l.
A ntígeno desencadenante: sero al­
búm ina bovina dinitrofenolada.
653
(fig. 32-11). En experiencias realizadas en co ­
bayos con anticuerpos antiovoalbúmina de co ­
nejo, se demostró que con 0,02 ).tg se consigue
la sensibilización a las 3 horas de contacto.
El PCA ha servido también para establecer
qué anticuerpos se fijan a piel y cuáles son las
dosis mínimas y las óptimas sensibilizantes. El
hombre, cobayo, conejo, ratón y rata elaboran
anticuerpos capaces de fijarse a piel de cobayo.
En todos los animales indicados las dosis de
anticuerpo necesarias para sensibilizar son in ­
feriores a 1 ¡xg. Para otras especies animales las
dosis varían.
Un hecho cjue también ha sido evidenciado
con esta metodología es la competición e x is­
tente entre la gammaglobulina anticuerpo con
capacidad para fijarse a piel y la gammaglobu­
lina normal de la misma clase. Si se determina
en cobayo, por ejemplo, cuál es la mínima d o ­
sis de anticuerpo antiovoalbúm ina de conejo
(IgG) capaz de sensibilizar, efectuando p ara
ello diluciones en solución sahna, se ve que és­
tas son inferiores a las necesarias cuando se re ­
pite la experiencia anterior, pero efectuando las
diluciones en una solución de IgG normal (1
mg • m l ')• Ello se debe a que la gammaglobuli­
na normal compite con la gammaglobulina an ­
ticuerpo interfiriendo en los sitios de fijación
de este último. Que la gammaglobulina normal
puede fijarse se demuestra por la prueba de la
anafilaxia cutánea pasiva reversa. Si se inyec­
ta un cobayo por vía intradérmica con IgG n o r­
mal de conejo y después de un período de la ­
tencia se le inocula por vía intravenosa suero
anti-IgG m ezclado con azul de Evans, en el
punto de inoculación aparecerá una m ancha
654 Inmunopatología
azul. La que se fija es la IgG normal de conejo,
ya que la reacción es positiva aunque los anti­
cuerpos antigammaglobulina de conejo proce­
dan de especies que elaboran anticuerpos que
no se fijan a piel de cobayo.
En la anafilaxia pasiva verdadera intervienen
anticuerpos citotrópicos segtin se fijen a células
homólogas o heterólogas. En cualquiera de los
dos casos es indispensable un período de laten-
cia antes de la inoculación del antígeno para
permitir la “fijación” de los anticuerpos.
Se ha descrito otro tipo de m anifestación
anafiláctica, lograda por la inoculación de com­
plejos antígeno-anticuerpo, que no requiere pe­
ríodo de latencia. Para que ésta ocurra, es nece­
sario que el complejo se haya formado en lige­
ro exceso de antígeno, esto es, que sea del tipo
Agj Ac^, siendo inefectivos los complejos Ag^
Ac formados en presencia de grandes cantida­
des de antígeno.
Como los primeros son fijadores del comple­
mento, no así los segundos, se supone que por
ese m ecanism o tenga lugar la form ación de
anafilotoxina (véase cap. 22), que provoca la li­
beración de histamina.
Dado que el mismo efecto se logra inoculan­
do por vía intradérmica cobayos con gamma-
globulina desnaturalizada por calentam iento,
que a su vez tiene capacidad para fijar el com ­
plemento, se estima que la función de los anti­
cuerpos es la de form ar con el antígeno los
agregados que fijan el complemento. Por tal
circunstancia a este fenómeno se los denomima
anafilaxia agregada o por agregados. Si bien
la expresión clínica es debida a la liberación de
histam ina, probablem ente su m ecanism o sea
distinto del de la anafilaxia verdadera.
Es conveniente recordar que sustancias como
el ionóforo de calcio, morfina, codeína, el com­
puesto 48/80 y otras sustancias pueden activar
directamente a los mastocitos e inducir la libe­
ración de histamina. Ello se debe a que todos
esos productos causan un influjo de iones Ca^^.
Linfoquinas sintetizadas por los linfocitos T
pueden interaccionar con basófilos y liberar
histam ina. D icho facto r se id en tifica com o
HRF (histamine releasing factor). Por contacto
con antígeno, los linfocitos T pueden excretar
un factor antígeno-específico liberador de his­
tamina (TCF), que puede armar mastocitos, los
que, al contactar nuevamente al antígeno, libe­
ran mediadores químicos. Este factor sólo sen­
sibiliza por pocas horas, a diferencia de lo que
ocurre con IgE que lo hace por varios días.
A n t ic u e r p o s a n a f il á c t ic o s
La identidad del anticuerpo anafiláctico ha
sido aclarada al comienzo de los estudios sobre
anafilaxia. Muchos de los errores cometidos se
debieron a que, especialmente en anafilaxia pa­
siva, se utilizan sistemas heterólogos constitui­
dos por el cobayo como animal receptivo y el
conejo como productor de anticuerpos. Y ocu­
rre que de las inmunoglobulinas identificadas
en el hombre y otros animales (véase cap. 5),
que se fijan a piel homóloga no se fijan a hete­
róloga, y viceversa. Como consecuencia de lo
expuesto, si bien mucho de lo realizado ha ser­
vido para aclarar el mecanismo de la reacción
anafiláctica, sólo en los últimos años se ha lo­
grado una información clara sobre el anticuer­
po responsable.
Siendo la IgG una inmunoglobulina con ca­
pacidad para fijarse a piel heteróloga, es la res­
ponsable de la anafilaxia pasiva cuando el fe­
nómeno se desencadena en un animal de otra
especie. Pero en nada participa en el choque
anafiláctico activo, manteniéndose como anti­
cuerpo circulante.
En el hombre se ha demostrado que el anti­
cuerpo anafiláctico es la IgE, que también se
encuentra presente en algunos animales como
la rata, conejo, ratón, oveja y aun en el cobayo,
del que ha sido aislado por nosotros. Esta in­
munoglobulina se encuentra a muy bajas con­
centraciones como anticuerpo circulante. Si
bien en el plasma sanguíneo su vida media es
de 60 horas, cuando se encuentra fijada a m as­
tocitos ella no es menor de dos semanas. Cuan­
do los anticuerpos IgE son calentados a 56°C
por 1-3 horas, conservan su capacidad para in­
teraccionar con el antígeno, pero pierden su ca­
pacidad para unirse a m astocitos porque el
fragmento Fe de la molécula experimenta cam­
bios conformacionales que le impiden unirse al
receptor específico. Para mayor inform ación
sobre esta inmunoglobulina véase el capítulo 5.
En algunos animales como el ratón y el coba­
yo existen dos tipos de IgG, las llamadas IgGl
e IgG2 o y, y Esta última presenta las propie­
dades biológicas de la IgG normal, entre las que
cabe señalar su capacidad para fijarse a piel he­
teróloga. La IgG l, por el contrario, difiere, ya
que no fija el complemento y sólo se fija a piel
homóloga. Por tal motivo, hasta el momento, ha
sido considerada como un anticuerpo anafilácti­
co homólogo. La IgGl es un anticuerpo que se
encuentra en cantidades apreciables en el to­
rrente circulatorio y se diferencia de la IgE, o
anticuerpo reagínico, en algunos aspectos de su
comportamiento. Entre ellos merecen destacar­
se la capacidad para precip itar el antígeno,
mantener su actividad después de la reducción
con mereaptoetanol, fijarse rápidamente a piel y
persistir en ella no más de 48 horas.
Su capacidad para fijarse a células parece di­
ferente ya que, si mastocitos aislados que han
sido puestos en contacto con IgG l anticuerpo
son lavados una sola vez con solución salina.

se desensibilizan, cosa que no ocurre con la
IgE anticuerpo, aun después de cinco lavados.
Parecería que los anticuerpos heterocitotrópi-
cos (IgG de conejo) y homocitotrópicos (IgG l)
se unen al mismo receptor en los mastocitos de
cobayo. La IgG normal de conejo compite con
los anticuerpos IgG de conejo e IgGl de coba­
yo, ocurriendo lo mismo con la IgG l normal de
cobayo. Ninguna de ellas inhibe la fijación de
IgE, lo que indica que los receptores para esta
inmunoglobulina y los de la IgG son diferentes.
Hay autores que sostienen que los anticuer­
pos de tipo IgG 1 sólo interaccionan con la
membrana del mastocito o basófilo para desen­
cadenar la liberación de histamina, después de
haberse unido al antígeno en la fase fluida, de
ahí que puedan ser eliminados fácilmente por
lavados. En favor de ello está el hecho de que
la desgranulación de los mastocitos por estos
anticuerpos puede conseguirse por el método
directo (añadiendo primero el anticuerpo y lue­
go el antígeno) o reverso (invirtiendo el orden).
Además, para que la desgranulación del masto­
cito tenga lugar, es necesario que antígeno y
anticuerpo estén en relaciones óptimas (ligero
exceso de antígeno). Ello quizá puede deberse
a c[ue el agregado formado necesita una confi­
guración espacial determ inada para unirse al
receptor de la membrana. Si el anticuerpo es de
tipo IgE, que se fija directamente al receptor, el
añadido de exceso de antígeno o anticuerpo no
incide en los resultados.
Otro hecho que indica una sensibilización
diferente por los anticuerpos IgE e IgG es el
observado al añadir mastocitos normales a una
suspensión de mastocitos sensibihzados. En el
caso de los mastocitos sensibihzados por IgE el
añadido de mastocitos normales no produce au­
mento de la liberación de histamina, hecho que
ocurre, y es proporcional a la cantidad de m as­
tocitos añadidos, si la sensibilización es por
IgG l.
C om o en el co bayo y rató n , que p o seen
IgG l, se ha demostrado también la presencia
de anticuerpo reagínico (IgE), queda aiin por
dilucidar cuál es la verdadera función que la
IgGl o y, cumple en estos animales.
Las otras inmunoglobulinas conocidas, IgM,
IgA e IgD, no participan en el choque anafilác­
tico ya que carecen de capacidad homocitotró-
pica y heterocitotrópica, que está dada por el
fragmento Fe de la inmunoglobulina. Un análi­
sis comparativo de las propiedades de IgG l e
IgE se encuentra en el cuadro 32-2.
Metzger y col. han aislado y caracterizado el
receptor para IgE existente en células basófilas
(RIFce). Está compuesto por 3 subunidades: a
(PM 27,8 kD), cuya fracción extracelular N-
terminal de 181 residuos y 7 sitios potenciales
de glucosilación, presenta dos dominios de 40
Manifestaciones de hipersensibiiidad 655
Cuadro 32-2
In m unoglobulina
P ropiedades IgG , Ig E
Pe.so m olecular 150JsD 18.5 k D
C onstante de sedim entación 15 7,8.5
T erm olabilidad (1 hora a 56 “C) .. + (+)
Inactivación por m ercaptoetanol - +
Tiem po m ínim o de fijación a la 2-3 hora 24 h o ras
piel
P ersistencia en piel Horas S em an as
P ersistencia en m astocitos des­ - +
pués de varios lavados
P asaje placentario + -
C apacidad para precipitar el an tí­ -1- -
geno
C oncentración sérica m g/m l
y 52 aminoácidios respectivamente, con hom o­
logía para los dominios de las inm unoglobuli­
nas y que son los comprometidos en la unión a
los dominios CH2/CH2 de la IgE; p (PM 32
kD) que sobrepasa cuatro veces la mem brana
citoplasmática, que es muy sensible a las enzi­
mas proteolíticas, y que actuaría como elem en­
to de unión al homodímero de cadena y. Éste
tiene un PM de 9 kD y resulta de la unión de
dos cadenas y por un puente disulfuro, presen­
tando estas cadenas considerable hom ología
con la cadena ^ del componente CD3 del re­
ceptor del linfocito T (RcT). Al igual que CD3
el homodímero y estaría involucrado en la
transducción de señales, las que tendrían lugar
después de la unión de la IgE a la cadena a del
RIFce (fig. 32-8).
No obstante que el hidrato de carbono cons­
tituye el 30% de la masa molecular del recep­
tor, parecería que este componente no intervie­
ne en la unión al ligando. La unión RIFCe-IgE
es de alta afinidad (10® a 10’° M ‘). (Para más
detalles véase cap. 5).
El número de RIFce en los basófilos oscila
entre 40 x 10^ y 90 x 10^ por célula.
Se ha descrito un receptor para IgE de baja
afinidad (RlIFce) que requiere mayores canti­
dades de IgE para su unión. Este receptor es es­
pecífico para los dominios CH3/CH3 de IgE y
se lo conoce tam bién como CD23. H a sido
identificado en linfocitos B, macrófagos y eosi­
nófilos y se considera que interviene en la re­
gulación de la síntesis de IgE.
Además de los mastocitos y basófilos san­
guíneos, la presencia de repector para IgE ha
sido dem ostrada en plaquetas, m acrófagos y
granulocitos eosinófilos. En estas células, los
receptores servirían para que pudieran actuar
como células efectoras citotóxicas frente a pa­
rásitos sensibilizados con IgE. Esto m ostraría
que la IgE no siempre desencadena fenómenos
que pueden ser perjudiciales para el huésped.
656 Inmunopatología
A l e r g ia a t ó p ic a
H asta hace muy poco tiem po, ia llam ada
alergia atópica en el hombre, con sus expresio­
nes clínicas como el asma, fiebre del heno, u r­
ticaria, etc., era considerada un tipo particular
de manifestación de hipersensibilidad, que li­
beraba mediadores químicos, siendo responsa­
bles de ella ciertos anticuerpos denominados
“reagínicos”, termolábiles, no precipitantes y
sólo con capacidad para transmitir pasivamente
el fenómeno de hombre a hombre.
El descubrimiento de la IgE y su exclusiva
capacidad homocitotrópica, así como la identi­
dad entre ella y los anticuerpos reagínicos, han
servido para aclarar el problema y demostrar
que la atopia no es más que una manifestación
anafiláctica, generalmente localizada.
A los antígenos responsables de las alergias
atópicas se los designa alergenos. Los más co­
munes son los provenientes de pólenes, proteí­
nas de los pelos, plumas, polvillo de habita­
ción, etc.
La magnitud de la respuesta IgE a los alerge­
nos depende de la ruta de su penetración en el
huésped y de las características genéticas de és­
te (véase más adelante). El motivo por el cual
los alergenos dan respuesta a IgE en los pa­
cientes atópicos, y otros tipos de respuestas in­
munes en los no atópicos, es un hecho aún no
totalmente clarificado.
Los alergenos más importantes pertenecen a
cuatro grupos;
a) Alergenos aéreos. Forman parte de este
grupo los pólenes de diferentes orígenes espo­
ros de hongos, en especial los de Aspergillus y
Alternaría, todos ellos con alto contenido en
glucoproteínas; y los provenientes de ectopará-
sitos como los Dermatophagoides, presentes en
el polvillo de habitación. Todos estos alergenos
producen, por regla general, reacciones alérgi­
cas de tipo asmático y/o rinitis. A partir de es­
tos materiales se han aislado y purificado dife­
rentes alergenos, los que han demostrado ser
los responsables de la reacción inducida por el
producto global.
b) A lergenos de origen alim entario. Una
gran variedad de alimentos como la leche, hue­
vo, pescado, maní, nueces, mariscos, cacao y
otros contienen alergenos capaces de inducir
reacciones de hipersensibilidad mediadas por
IgE, de tipo cutáneo, gastrointestinal y aun sis-
témicas. Estas alergias son muy comunes en
los niños de corta edad, especialmente las indu­
cidas por leche de vaca, las que generalmente
desaparecen después de los 2-3 años de vida.
En los adultos predominan las manifestaciones
inducidas por pescados y mariscos,
c) Alergenos provenientes de venenos de in­
sectos. Los venenos de avispas, abejas y escor­
piones tienen sustancias alergénicas, general­
mente relacionadas con enzimas como fosfoli­
pasa y hialuronidasa las que con frecuencia
presentan actividad proteolítica. Estos alerge­
nos inducen reacciones locales, las que pueden
llegar a ser de carácter sistémico si son desen­
cadenadas en individuos muy sensibilizados
como consecuencia de picaduras anteriores.
d) Alergia a drogas: productos químicos de
bajo peso molecular, actuando como haptenos,
pueden acoplarse a proteínas propias del hués­
ped y transformarse en antígenos, sensibilizán­
dolo. Drogas como la penicilina, cefalosporina
y sulfamidas inducen con frecuencia reacciones
alérgicas, al igual que algunos anestésicos loca­
les como la novocaína, lo que obliga a un inte­
rrogatorio previo del paciente o sometimiento a
alguna prueba cutánea específica para conocer
su estado de sensibilización. La penicilina es
uno de los fármacos que con más frecuencia in­
duce alergia, habiéndose producido casos fata­
les como consecuencia de una reacción de hi­
persensibilidad sistémica aguda, cuando fue in­
yectada en individuos sensibilizados.
La alergia ectópica se caracteriza porque es
espontánea y ocurre principalmente como con­
secuencia de estimulaciones en la mucosa na­
sofaríngea, bronquial, gástrica e intestinal.
Nuevas penetraciones de antígeno desencade­
nan reacciones anafilácticas localizadas en el
“órgano efector” que sufre el impacto (mucosa
nasal; fiebre de heno; mucosa bronquial; asma;
piel; urticaria, etc.). Las personas normales ha­
bitualm ente no sufren estas m anifestaciones
porque, aun estando sensibilizadas, poseen un
título significativo de anticuerpos circulantes
de tipo IgG no homocitotrópicos, que actuando
sobre el antígeno lo bloquean e impiden la for­
mación de los inmunocomplejos a nivel celu­
lar, que son los liberadores de ias sustancias
vasoactivas.
Una forma de determinar si un individuo es­
tá sensibihzado a un antígeno es haciendo apli­
caciones locales de éste, ya sea por escarifica­
ción o por inoculaciones intradérmicas. Estas
pruebas deben ser efectuadas con cuidado, ya
que en personas muy sensibilizadas la respues­
ta puede ser un choque anafiláctico generaliza­
do, con todas sus consecuencias.
Se puede trasmitir pasivamente la alergia ató-
pica, pero en este caso, siendo el anticuerpo res­
ponsable homocitotrópico, el único receptor po­
sible es el hombre. Esto no es absoluto, ya que
se ha demostrado que la piel de algunos monos
tiene capacidad para fijar la IgE humana.
La prueba de transferencia pasiva en el hom ­
bre se denomina de Prausnitz-Küstner o PK, y
consiste en inyectar en la piel de una persona
no sensibilizada el suero del paciente en estu­
dio, inoculando el antígeno en la misma área

24 a 48 horas después. Si el material inicial­
mente inoculado contenía anticuerpos reagíni-
cos, se produce una pápula con eritema en el
punto de inoculación. Una idea aproximada del
título de anticuerpos puede lograrse mediante
inoculaciones de diferentes diluciones del sue­
ro en ensayo, determinando cuál es la máxima
dilución que da reacción positiva.
La desensibihzación, especialmente por for­
mación de anticuerpos de bloqueo, da buenos
resultados en la mayor parte de los casos (véa­
se más adelante). Es indispensable también el
aislamiento del paciente de las zonas de con­
tacto con los antígenos sensibilizantes (póle­
nes, polvos de habitación, plumas, medicamen­
tos), a efectos de evitar la producción de cho­
ques anafilácticos localizados y nuevas sensibi-
hzaciones.
Algunas sustancias simples, en especial m e­
dicamentos y productos químicos, pueden sen­
sibilizar, ya que, si bien por sí solos no tienen
capacidad inmunogénica, la adquieren al com­
binarse con proteínas propias del individuo, las
que actúan como soportes.
El asma bronquial, proceso con característi­
cas comunes de la alergia atópica, es una forma
clínica que puede verse influida por diferentes
manifestaciones psicosomáticas, las que pue­
den incidir en la liberación de mediadores quí­
micos.
En el asmático, la estimulación cohnérgiea a
través de la acetilcolina sobre la guanilatocicla-
sa provoca un aumento del GMPc en las célu­
las basófilas, con liberación de histamina y leu­
cotrienos y contractura de la musculatura lisa
bronquial. Este efecto es bloqueado por la atro­
pina. La manifestación asmática puede aumen­
tar aun más por intermedio de la norepinefrina,
que al estimular los receptores a-adrenérgicos,
disminuye la concentración de AMPc, con la
consecuente liberación de los mediadores quí­
micos. Esta acción puede ser inhibida por blo-
queadores a-adrenérgicos como la fentolamina.
Cuando el isoproterenol o la epinefrina acti­
van la adenilciclasa, que transforma al ATP en
AMPc, la liberación de histamina y otros me­
diadores es inhibida y la relajación muscular se
produce. Las metilxantinas magnifican el efec­
to al aumentar el AMPc por inhibición de la
adenilfosfodiesterasa, que destruye al AMPc
con formación de 5 ’AMP inactivo (fig. 32-8).
Conociendo este mecanismo de regulación ho­
meostática a través del AMPc y GMPc y los
agonistas y antagonistas del sistema nervioso
autónomo, es posible actuar con éxito en el as­
ma bronquial mediante el empleo de productos
farmacológicos eficaces.
Se ha considerado la existencia de una pre­
disposición hereditaria a la alergia atópica, que
podría estar caracterizada principalmente por
Manifestaciones de hipersensibilidad 657
una aptitud para la elaboración exagerada de
anticuerpos localizados en la IgE.
El descubrimiento de los antígenos del siste­
ma mayor de histocompatibilidad o HLA (véase
cap. 29) ha permitido comprobar asociaciones
estadísticamente significativas entre algunas en ­
fermedades y estos antígenos. En el caso de la
atopia existen asociaciones entre la sensibiliza­
ción a algunos componentes de pólenes y los
antígenos HLA de los que son portadores esas
familias. Se ha demostrado, entre otras, una aso­
ciación significativa entre personas que son por­
tadoras de los antígenos HLA Dw2, B7 yA2,
A28 con los antígenos Ra5 y Ra3, respectiva­
mente, procedentes del polen de hierba carmín.
Del mismo modo, entre B8, Dw3, Al y Dw3, B
con Rye I y Rye II (polen de gramíneas).
Los mecanismos de regulación de la produc­
ción de IgE han sido objeto de numerosas in ­
vestigaciones, sobre todo si se tiene en cuenta
que la síntesis de esta inmunoglobulina gene­
ralmente se desarrolla en forma independiente
de la correspondiente a las otras clases de in ­
m unoglobulinas. Es un hecho bien conocido
que antígenos asociados a adyuvante de Freund
completo inducen síntesis de anticuerpos IgG,
en tanto que hay aumento de la síntesis de IgE
si el antígeno se inocula mezclado con una sus­
pensión de Bordetella pertussis. Hay investiga­
dores que en uno y otro caso han aislado facto­
res supresores o estimuladores de la síntesis de
esa inmunoglobulina.
Ishizaka y col. analizaron la producción de
IgE en ratas infectadas previamente con Nip-
postrongylus brasiliensis. En los ganglios lin­
fáticos encontraron linfocitos T que sintetiza­
ban un factor potenciador de la síntesis de IgE,
de P M 25 kD, y un factor inhibidor de la sínte­
sis de IgE, de PM 16 kD. El primero estaba
glucosado, tenía grupos terminales y se unía a
Con A. Cuando esos linfocitos fueron estimula­
dos con Con A en presencia de un inhibidor de
la glucosilación proteica (tunicamieina) y sin
este antibiótico en un cultivo paralelo, encon­
traron que el producto sintetizado en presencia
de tunicam ieina tenía actividad supresora, no
así el control. La lipomudulina, proteína cito­
plasmática inhibidora de la fosfolipasa, induce
la producción del factor supresor. P osterior­
mente los mism os investigadores aislaron un
factor inhibidor de glucosilación (FIG), consti­
tuido por un fragmento de lipomodulina fosfo-
rilada, y an factor estimulador de la glucosila­
ción (FEG), que tiene características de protea-
sa similar a la calicreína. Teniendo en cuenta
que la calicreína y la bradiquinina activan fos­
folipasa en una variedad de células, se puede
especular que el factor aumentaría la glucosila­
ción del factor de unión a las células B con IgE
de m em brana, a través de la activación de la
658 Inmunopatología
fosfolipasa. Se estima que los linfocitos T esti­
mulados producen los dos factores en pequeñas
cantidades los que podrían ponerse en contacto
con los linfocitos con IgE de membrana, man­
teniendo el control normal de la síntesis de IgE,
que podría desnivelarse por el predominio de
uno u otro factor.
Recientemente se ha demostrado que la IL-8
y la IL-12 inhiben selectivam ente la produc­
ción de IgE inducida por IL-4.
M edición de IgE
Dados Jos niveles extremadamente bajos de
IgE sérica (~ 250 ng ■ m i '), hasta hace poco
tiempo rio se disponía de métodos que perm i­
tieran su cuantificación, y menos aun de la IgE
con actividad específica. Con el advenimiento
del radioinmunoanáhsis ello ha sido posible, ya
que esta metodología es capaz de detectar hasta
1 ng de anticuerpo.
Para el dosaje de IgE humana total, un anti­
cuerpo anti-IgE humana se fija covalentemente
a discos de papel de filtro previamente tratados
con bromuro de cianógeno. Diluciones del sue­
ro estándar y del suero a valorar son puestos en
contacto con los discos de papel, en dos series
paralelas. Luego de incubar y lavar los discos
son cubiertos con '^^IgG anti-IgE (hum ana).
Después de incubar y lavar, se determina la ra­
diactividad de los discos (combinada), usando
para ello un contador de radiaciones gamma.
Con los datos obtenidos se efectúan las grafica-
ciones y cálculos correspondientes. A esta m e­
todología se la designa habitualmente con ia si­
gla RIST, de) inglés “radioimmunosorbent test-
” (Para mayores detalles véase cap. 38.)
El dosaje de IgE específico se hace fijando a
los discos de papel el correspondiente alergeno,
y poniéndolos a reaccionar con diluciones del
suero que se ha de valorar. Se procede de igual
manera con un suero testigo. Después de incu­
bar y lavar se añade a cada disco ‘^'’I-IgG anti-
IgE (humana), se incuba, lava, lee y cuantifica
como en el caso anterior.
Cuando lo que se dosa es la IgE específica,
e l radioinm unoanálisis se lo designa RAST
(“radioallergosorhent test”).
Actualmente, y dada la sensibilidad del m é­
todo, los inmunoanálisis que emplean reactivos
marcados con enzimas van sustituyendo cada
vez más el radioinmunoanálisis. Tienen la ven­
taja de que se pueden realizar en cualquier la­
boratorio y no se manipulan materiales radiac­
tivos (cap. 37).
D e s e n s ib il iz a c ió n
Por diferentes procedimientos es posible de-
sensibilizar tem porariam ente con respecto al
choque anafiláctico. Si a un animal sensibiliza­
do, en lugar de inocularle la dosis de antígeno
mínima desencadenante en una sola vez, se le
inyecta ésta en forma fraccionada (1/10 de la
dosis total) y a intervalos de 20-30 minutos, el
animal no experimenta choque anafiláctico. Se
considera c]ue el antígeno inoculado en estas
condiciones produce neutralizaciones parciales
del anticuerpo fijado y no llega a formar la can­
tidad de inmunocomplejo necesaria para liberar
las dosis farm acológicam ente activas de los
mediadores químicos. Si inmediatamente des­
pués se inyectan al animal dosis de antígeno
iguales o aun superiores a la mínima desenca­
denante, el animal no reacciona. Parecería que
todo el anticuerpo fijo hubiese sido bloqueado
e incapacitado para reaccionar con el antígeno
últimamente introducido.
Es posible desensibilizar también mediante
inoculaciones subcutáneas, repetidas cada 4-5
días, de pequeñas cantidades del antígeno espe­
cífico, pero en este caso el mecanismo es dife­
rente, ya que como consecuencia de la estimu­
lación antigénica se originan anticuerpos séri­
cos bloqueantes de tipo IgG. heterocitotrópi-
cos, que al unirse al antígeno que puede pene­
trar con posterioridad impiden su interacción
con los anticuerpos fijos a células.
Estos resultados son más efectivos si los an­
tígenos usados son particulados o previamente
polimerizados con glutaraldehído si son solu­
bles. Par mayor información véase el capítulo
19, anticuerpos no precipitantes o IgG asimétri­
cos y las correspondientes curvas de produc­
ción de anticuerpos cuando se hacen inmuniza­
ciones a repetición con antígenos que respon­
den a las características señaladas.
Fenómeno de A rth u s
Es un fenómeno de hipersensibilidad que, a
diferencia de la anafilaxia, no se debe a la libe­
ración de mediadores químicos. Fue descrito
inicialmente por Arthus en 1903, quien observó
que inoculando suero de caballo por vía subcu­
tánea a conejos que habían sido previam ente
inmunizados con el mismo antígeno, aparecía a
las pocas horas, en el punto de inoculación, una
tumefacción difusa, que podía llegar a la hipe­
rem ia. Pueden aparecer tam bién petequias y
pequeñas hemorragias. Generalmente el proce­
so retrogada pero, si el título de anticuerpos es
suficientemente alto, puede producirse necro­
sis. Este fenómeno puede desencadenarlo cual­
quier antígeno soluble capaz de engendrar la
elaboración de anticuerpos precipitantes fijado­
res del complemento.
Es un fenómeno inflamatorio; se inicia con la
aparición de anticuerpos precipitantes y se in­
tensifica con su aumento. Es específico, ya que

sólo lo desencadena el antígeno con especifici­
dad para los anticuerpos que posee el animal.
Si bien la reacción de Arthus incluida entre
las de tipo III del Gell y Coombs generalmente
se desencadena en piel, puede producirse tam­
bién en otros órganos. Es un fenómeno local en
que las lesiones hísticas se inician por la for­
mación y depósito de agregados antígeno-anti­
cuerpo. Los complejos más efectivos son los
solubles que se forman en la zona de ligero ex­
ceso de antígeno, con capacidad para fijar el
complemento. Como ya se ha indicado en el
capítulo 22, es indispensable la formación de
C3a y C5a, compuestos que provocan por qui-
miotactismo un aflujo de leucocitos, en espe­
cial polimorfonucleares neutrófilos. Éstos en­
globan los inmunocomplejos formados en los
espacios texturales y en la pared de los vasos,
degradándolos. Los leucocitos necróticos libe­
ran proteínas catiónicas y enzimas lisosomales,
en especial catepsina D y E, que son las que
provocan focos de necrosis en la pared de los
vasos y otros procesos inflamatorios, con cú­
mulos de plaquetas y trombos de fibrina en las
pequeñas arteriolas que rodean, provocando la
obliteración de las mismas y en definitiva la
necrosis hística.
Se ha podido seguir la evolución del proceso
in vivo, especialmente en el conejo, mediante la
colocación en la oreja de pequeñas cám aras
transparentes que permiten la observación m i­
croscópica. Se ha visto que en las primeras ho­
ras hay cúmulo de polimorfonucleares neutrófi-
los y muy pocos linfocitos, macrófagos y eosi­
nófilos. Después de las 24 horas, los polinuclea­
res comienzan a degenerar, aumentando la pro­
porción de macrófagos, eosinófilos y linfocitos,
los que se mantienen varios días hasta que tiene
lugar la reparación hística. Mediante el empleo
de antígenos o anticuerpos marcados se ha podi­
do observar que los inmunocomplejos desapare­
cen en su mayoría a las 24-48 horas, los que son
fagocitados por los polimorfonucleares neutrófi­
los y en menor proporción por los macrófagos.
En algunas especies animales, como la rata, los
eosinófilos intervienen activamente en ¡a fagoci­
tosis. Esto hace suponer que el fenómeno de
Arthus debe participar en los mecanismos de
eliminación de inmunocomplejos, en especial
los presentes en los vasos sanguíneos.
La presencia de leucocitos es indispensable
para que la reacción de A rthus se produzca.
Cualquier proceso que lleve a su depresión co­
mo el empleo de mostaza nitrogenada y sus de­
rivados o sueros antipolimorfonucleares neu­
trófilos, reduce al mínimo el fenómeno.
La reacción de Arthus puede desencadenarse
en forma pasiva. A diferencia de la anafilaxia
cutánea pasiva (PCA) no necesita período de
latencia. Sólo los anticuerpos bivalentes lo ori­
Manifestaciones de hipersensibilidad 659
ginan y las dosis de los m ism os necesarias,
muy superiores a las del PCA, varían entre 30
y 60 p,g.
El Arthus pasivo puede ser directo o reverso.
En el primer caso, el antígeno es inoculado por
vía intradérmica, y el anticuerpo, intravenosa.
En ambos casos, antígeno y anticuerpo pueden
ser inoculados a un mismo tiempo por tratarse
de una reacción inicial entre antígeno y an ti­
cuerpos circulantes.
Siendo un fenóm eno puram ente vascular,
desencadenado por la formación de trom bos,
los anticoagulantes como la heparina, Trom e-
xán, etc., inhiben o disminuyen la intensidad de
la reacción.
El Arthus pasivo difiere del PCA en que no
requiere período de latencia; las dosis de anti­
cuerpo necesarias para desencadenar el fen ó ­
meno son superiores; la reacción se hace evi­
dente, al igual que en el fenómeno activo, entre
las 5 y 18 horas y no es inhibida por los anti­
histamínicos.
R e a c c ió n d e a r t h u s s is t é m ic a
o ANAFILAXIA ALARGADA
Se ha observado que ia inoculación de antíge­
nos a cobayos que contienen un alto título de
anticuerpos específicos, no por vía intravenosa
sino subcutánea, intramuscular o cualquier otra
que determine una lenta absorción de él, produ­
ce la muerte de los animales después de 4-5 ho­
ras, pero con una sintomatología diferente de la
anafilaxia verdadera. Presentan hipotensión,
leucopenia, trombocitopenia, aumento del tiem­
po de la coagulación sanguínea. En las necrop­
sias no hay enfisema pulmonar. Se observa lí­
quido peritoneal, petequias y pequeñas hemorra­
gias en mucosas, serosas y pulmones y frecuen­
temente grandes hemorragias en el tracto gas­
trointestinal.
Este fenómeno no es inhibido por los antihis-
tamínicos, y en los animales que lo experimen­
tan se observa una disminución del complemen­
to circulante. Siendo el complemento fijado por
los anticuerpos de tipo ígG2 de cobayo y no por
los de tipo igO l responsables del choque anafi­
láctico, todo esto hace suponer que la llamada
anafilaxia alargada no sea más que un fenómeno
de Arthus sistémico. Al no inocularse el antíge­
no por vía intravenosa el choque anafiláctico se
reduce al mínimo, pero ello no impide la forma­
ción de inmunocomplejos entre el antígeno y
anticuerpos lgG2 capaces de desencadenar una
reacción de Arthus generalizada.
E n ferm ed a d del su ero
Es una enfermedad que fue descrita inicial­
mente en el hombre, pero que puede lograrse
660 Inmunopatología
experimentalmente en los animales. Se produce
cuando se inoculan altas dosis de antígeno en
una sola vez (sueros antitóxicos elaborados en
animales de otras especies, proteínas purifica­
das concentradas). En el hombre se observa hi-
pertermia, tumefacción ganglionar, hipertrofia
del bazo, urticaria, dolores articulares y postra­
ción. Los polinucleares neutrófilos y eosinófi­
los están aumentados y puede aparecer albumi­
nuria. El complemento sérico está disminuido.
Mediante el empleo de antígenos marcados
se pudo observar que, con posterioridad a la
inoculación de la alta dosis de antígeno, los
síntomas de la enfermedad del suero se inicia­
ban cuando aún había antígeno circulante, y
muy poco antes de la aparición de anticuerpos,
y que los síntomcis desaparecerían cuando no se
detectaba antígeno y los anticuerpos circulantes
estaban a alta concentración. Todo esto indica­
ba que esta enfermedad estaba relacionada con
la formación de anticuerpos séricos, pero que
la aparición de los síntomas clínicos no coinci­
día con la aparición de anticuerpos circulantes
libres. En realidad, la enfermedad se inicia con
la aparición de los anticuerpos. Lo que ocurre
es que, dada la presencia de grandes cantidades
de antígeno circulante, se originan complejos
solubles. Los inm unocom plejos son norm al­
mente eliminados de la circulación por el siste­
m a reticuloendotelial en correspondencia con
las características de los mismos. Los formados
en exceso de antígeno son pequeños y lenta­
mente eliminados. Los elaborados en la zona
de equivalencia constituyen grandes agregados
y son rápidamente fagocitados. Lo mismo ocu­
rre con los formados en la zona de exceso de
anticuerpo, pero éstos no fijan el complemento.
Teniendo en cuenta esto y el hecho de la dismi­
nución de los niveles del complemento durante
la enfermedad del suero, se supone con razón
que la misma sea desencadenada por complejos
antígeno-anticuerpo form ados en la zona de
moderado exceso de antígeno.
ALERGIA RETARDADA
Este tipo de manifestación de hipersensibili­
dad, mediada por células, ya ha sido considera­
da en detalle en el capítulo 16 y en su puesta en
m archa intervienen los linfocitos T del tipo
T H l, CD4+ productores de IL-2 e INF-y.
Hipersensibilidad de tipo Jones-Mote
Cuando se inoculan antígenos proteicos apa­
rece en los primeros estadios de la formación
de los anticuerpos, y antes de que ellos estén
presentes en circulación, un estado de sensibi­
lidad capaz de dar reacciones cutáneas de ex­
presión tardía, similares a las observadas en la
alergia retardada verdadera. Aparentemente, es
m ediada por las células productoras de anti­
cuerpos que aparecen tempranamente. Es tran­
sitoria, se presenta a los pocos días de la ino­
culación del antígeno y se mantiene hasta la
aparición de anticuerpos circulantes, instante
en que es reemplazada por una manifestación
de tipo Arthus. Mientras no pueda demostrarse
que la sensibilidad de Jones-Mote es transmiti­
da por células, no puede considerarse como
una manifestación tardía. Difiere de la hiper­
sensibilidad retardada en algunos aspectos de
la dermorreacción y especialmente porque du­
rante ésta hay acumulación de células plasmá­
ticas.
HIPERSENSIBILIDAD INESPECÍFICA
Se conocen algunas manifestaciones de h i­
persensibilidad que, si bien desde el punto de
vista clínico de la reacción producida se aseme­
jan grandemente a las desencadenadas por al­
guno de los mecanismos específicos descritos,
no pueden incluirse dentro del capítulo de aler­
gia por carecer de una base inmunológica. M e­
recen mencionarse el choque anafilactoideo, el
fenóm eno de Sannarelli-Schw artzm ann y las
llamadas “alergias físicas”.
Choque anafilactoideo. Se produce por ino­
culaciones intravenosas de algunas sustancias
como la peptona, extractos de órganos (en es­
pecial los pulmonares de vaca y caballo), agar,
almidón, hierro coloidal, tinta china, etc. Se lo­
gra mediante inoculación por la vía indicada, y
la reacción producida se asemeja a un choque
anafiláctico agudo. Se diferencia de este últi­
mo en que se produce por una única inocula­
ción del material y, además, en que varias de
las sustancias desencadenantes no son antigé­
nicas.
Las investigaciones efectuadas parecen indi­
car que las sustancias mencionadas inyectadas
por vía intravenosa pueden provocar la libera­
ción de histamina, la que al actuar sobre los va­
sos y musculatura lisa produce manifestaciones
similares a las desencadenadas por el choque
anafiláctico. Si bien el desencadenante de la
reacción es el mismo producto farmacológica­
mente activo, el mecanismo que lleva a su libe­
ración es diferente en ambos casos.
Fenómeno de Sannarelli-Schwartzmann. Es­
te fenómeno con forma de reacción generaliza­
da, fue descrito inicialm ente por Sannerelli,
quien observó que, si inoculaba conejos con
dosis subletales de vibrión colérico y horas
después con pequeñas cantidades de colibaci-
los, los animales morían con una marcada ne­
crosis de la mucosa intestinal.
 Manifestaciones de hipersensibiiidad 661

Schwartzmann, unos años después, observó
que, si se inoculaban conejos por debajo de la
piel con un filtrado de bacilos tíñeos, y a las 24
horas, por vía intravenosa, se inyectaba el m is­
mo filtrado o el procedente de otros microorga­
nismos, como colibacilos y aun meningococos,
la zona de la piel inicialmente inoculada tom a­
ba, entre las 2 y las 5 horas posteriores, un as­
pecto purpureo, y llegaba a la necrosis algunas
horas más tarde. En los exámenes histológicos
se observaban necrosis textural, trombosis, ro­
tura de vasos y hemorragia.
Schwartzmann pudo demostrar que este fe­
nómeno hemorragíparo, al que Sannarelli había
denominado “alergia hemorrágica”, era inespe­
cífico, ya que podía lograrse con la inoculación
de sustancias desencadenantes de naturaleza
muy diferente de la de las usadas para la sensi­
bilización inicial, como agar y almidón. A de­
más, no podía admitirse una base inmunológica
similar a la del fenómeno de Arthus por cuanto
el tiempo transcurrido entre la primera y la se­
gunda inoculación era mínimo, lo que no podía
explicar la elaboración de anticuerpos.
La interpretación de este fenómeno ha p reo ­
cupado a los inmunólogos. Estudios de tejidos
efectuados en conejos han aportado algunos
conocimientos al respecto. La inoculación in i­
cial .del filtrado produce un cúmulo local de
polimorfonucleares neutrófilos, especialm ente
en m anguito, a nivel de los pequeños vasos.
Estos polinucleares, mediante glucólisis an ae­
robia, producen cantidades anormales de ácido
láctico, al tiem po que lesiones histo ló g icas
inaparentes comienzan a presentarse en los en-
doteUos de los vasos circundantes. Al hacer la
segunda inoculación intravenosa este fenóm e­
no se intensifica, hay cúmulo de leucocitos y
plaquetas en los vasos lesionados, y se o rig i­
nan trom bos oclusivos que llevan a la rotura
de los vasos y necrosis de los tejidos, todo lo
cual configura el fenóm eno descrito inicial-

C uadro 32-3. Manifestaciones de hipersensibilidad

H ipersensibilidad
H ípersensibilidad específica inespecífica

Inm ediata R etardada

i l[JV
Tipo anafiláctico Tipo Arthus Tipo tuberculínico Sannarelli-Schw artzm ann

A gente res- A nticuerpos séri­ A nticuerpos cir­ C élulas específicam ente sensibi­ A usencia de anticuerpos
Donsable cos fijos a cé­ culantes lizadas. A usencia de anticuer­ séricos y células e sp e c ífi­
lulas pos séricos cam ente sensibilizadas

A gente A nticuerpos pre­ Anticuerpos p re­ C élulas sensibilizadas A usencia de transferencia

cipitantes y no cipitantes pasiva
73 precipitantes

C obayo (y l) Sí Sí
(/i Conejo (IgG ) Sí Sí
'iu ou H om bre (IgG ) Sí Sí
ü o
V aca No Sí
WJ'Z3 Pollo No Sí
P n ^
_o
P eríodo de la- Sí No No
tencia

Liberación de Complejos A g-A c, Acción citotóxica directa e in-

m ediadores fijadores de 0.5, filtración po r células linfo-
Causa quím icos (his­ C 6 , C7 (factor rreticulares sensibilizadas y
tam ina y otros) quim iotáctico) no sensibilizadas
M ecanism o
Contracción de Lesión del endote- Necrosis Lesión del endotelio v a s c u ­
la mu,sculatura lio vascular. D e ­ lar. D epósito de fibrina,
lisa pósito de fibrina, plaquetas y leucocitos.
Efecto plaquetas y le u ­ Trom bosis, hem orragia,
cocitos. T rom bo­ necrosis
sis, hem orragia,
necrosis

Inhibición A ntihistam ínicos A nticoagulantes Cortisona A nticoagulantes (heparina).

(heparina) D estrucción o reducción
D estrucción o re­ de los leucocitos y p la q u e ­
ducción d e los tas
leucocitos y p la ­
quetas
662 Inmunopatología
mente por Schwartzrnann. Para que todo esto
ocurra, es indispensable la presencia de los po­
lim orfonucleares neutrófilos. Todos aquellos
fármacos capaces de producir su depresión, así
como los sueros antipolimorfonucleares neu­
trófilos, disminuyen o anulan la reacción. Los
anticoagulantes tienen también un efecto bene­
ficioso.
Dada la comunidad antigénica existente en­
tre algunos antígenos bacterianos y poliósidos
de naturaleza distinta, y puesto que se ha de­
mostrado la frecuente presencia de anticuerpos
antimicrobianos de origen natural, en especial
contra los antígenos R de enterobacterias, sería
prudente efectuar una revisión del fenómeno.
Existiendo anticuerpos naturales, una estim u­
lación antigénica podría producir una reacción
secundaria con una concentración de anticuer­
pos suficiente para originar complejos Ag-Ac
y desencadenar un fenómeno de Arthus.
En estos momentos en que se conoce un nii-
mero apreciable de linfoquinas, algunas de las
cuales pueden tener participación en los fenó­
menos inflamatorios, y cuyos niveles se incre­
mentan por estimulación con lipopolisacáridos
bacterianos (LPS), hay autores que suponen
que a la IL-1 sintetizada por los macrófagos y
muy especialmente al interferón gamma (IF-y)
sintetizado por los linfocitos T les cabría gran
parte de la responsabilidad del fenóm eno de
Schwartzrnann.
Alergia física. Si bien numerosas personas
manifiestan tener alergia a algunos agentes físi­
cos como la luz solar, el frío, las irritaciones
mecánicas, etc., caracterizada por una urticaria
de las partes expuestas, estas manifestaciones
de hipersensibilidad en la mayor parte de los
casos no tienen una base inmunológica como
para considerarlas alergias. Lo que ocurre es
que los agentes físicos, al actuar sobre la piel,
provocan la liberación de histamina u otras sus­
tancias vasoactivas, como acontece en la etapa
final de la anafilaxia. Las características de am­
bos fenómenos son similares, pero en su origen
difieren totalmente.
En algunas oportunidades los agentes físicos
pueden modificar proteínas corpóreas las que,
al no ser reconocidas como propias, pueden
dar lugar a una reacción anafiláctica v erd a­
dera.
Factores psicogénicos, disturbios emociona­
les, pueden provocar rubor y simular reaccio­
nes alérgicas. Existen autores que consideran
que ellos son predisponentes para una reacción
alérgica verdadera. En qué modo los factores
emocionales pueden predisponer a un indivi­
duo norm al para una reacción alérgica, o en
qué medida su corrección puede incidir en la
mejoría de un alérgico, son hechos que hasta el
momento no están bien aclarados.
El cuadro 32-3 resume las principales carac­
terísticas de los fenómenos de hipersensibilidad.
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Inmunología tumoral
SILVIA E. HAJOS
IN TRO D U C CIÓ N
Los tumores malignos proliferan de una m a­
nera descontrolada, invaden los tejidos norma­
les, frecuentemente dan metástasis y crecen en
sitios distantes del tumor primario que les dio
origen.
A pesar de que generalmente se manifiestan
como una masa tumoral constituida por un gru­
po de células, ésta es consecuencia de una serie
de cambios producidos en una o unas pocas cé­
lulas normales, que han sufrido un lento proce­
so de transformación maligna. El cáncer no es
restrictivo del hombre o de Jos mamíferos sino
que afecta a todos los organismos multicelula­
res, vegetales y animales.
Es imposible definir una célula tumoral en
términos absolutos. Generalmente los tumores
se reconocen por su crecimiento descontrolado.
Por consiguiente, se podría decir que una célu­
la tumoral difiere de una célula normal porque
es incapaz de responder a los mecanismos que
controlan el crecim iento celular. En algunos
casos, especialm ente en una etapa tem prana
luego de su transformación, estas células pue­
den no proliferar.
Los tumores se pueden dividir en tres grupos
en función de su comportamiento:
a) Tumores benignos, que pueden aparecer
en cualquier tipo de tejido, crecen localmente y
producen daño por lesión local u obstrucción.
Estos tumores no se diseminan a otros sitios
distantes.
b) Tumores in-situ, que generalmente se de­
sarrollan en epitelios y son pequeños. Las célu­
las presentan una morfología característica pe­
ro permanecen en la capa epitelial. No produ­
cen invasión de la membrana basal ni del me-
sénquima.
33
c) Tumores malignos totalmente desarrolla­
dos, que poseen una capacidad específica para
invadir y destruir el tejido mesenquimatoso cir­
cundante.
Las células tumorales se proveen de nutrien­
tes del torrente sanguíneo. Algunas producen
una sustancia denominada factor de angiogéne-
sis tumoral (TAE) que estimula el crecimiento
de los vasos sanguíneos hacia el tumor. De esta
manera se favorece su crecimiento continuo.
Los nuevos capilares son fácilmente dañados y
el tum or invasor puede continuar su penetra­
ción. Fragmentos del tumor son vehiculizados
a través de ia circulación hacia nódulos linfáti­
cos u órganos distantes originando tumores se­
cundarios o metástasis.
C arcinogénesis
La carcinogénesis es un proceso que tiene
lugar en etapas (cuadro 33-1). La administra­
ción de un agente carcinogénico no lleva a la
aparición iniriediata de un tumor. Luego de la
etapa de iniciación se producen una serie de
modificaciones inducidas por el carcinógeno.
Las etapas siguientes pueden ser inducidas por
el carcinógeno o por otras sustancias (agentes
estimulantes) que por sí solas no inducen el tu­
mor.
La in iciación, que es la etapa p rim aria y
esencial en el proceso, es muy rápida, pero una
vez que se ha producido el prim er cambio la
célula modificada puede persistir quizás duran­
te toda la vida del individuo. El sitio ideal para
este p rim er ev en to es el m aterial g en ético
(ADN) aunque no siempre ocurre a este nivel.
Las células que han sido modificadas permane­
cen en un estado latente hasta que son estimu-

C u ad ro 33-1. Factores que influencian, el
sarrollo tumoral
Factores F actores Factores
iniciadores promotores' inhibidores
C arcinógenos quí- P rom otores espe- Diferentes ho rm o ­
m icos cíficos nas terapéuticas
o fisiológicas
V irus Inflam ación
Factores descono- H orm onas Inhibidores n o rm a­
ciclos les del creci­
miento
R adiación, luz P rom otores nor­ Edad, cirugía, ra­
u.v. m ales del creci­ diaciones
m iento
Errores de replica­
ción
ladas por agentes promotores. Éstos no son car­
cinógenos per se pero inducen la división de
las células que han sido iniciadas previamente.
Muchas sustancias inducen la división celu­
lar pero sólo los promotores producirán el de­
sarrollo tumoral, por consiguiente, también de­
berá haber otros factores involucrados.
Se supone que los agprites promotores inter­
fieren en el proceso de diferenciación celular
que nonnalmente tiene lugar cuando las células
pasan de la etapa de células progenitoras en di­
visión hacia células funcionales en reposo.
A pesar de que estos agentes prom otores
ejercen su efecto sobre las células, éstas a su
vez deberán ser sensibles a los efectos de los
factores inhibidores del crecimiento celular que
actúan normalmente. De esta manera, el balan­
ce entre ambos decidirá su evolución. Esto ex­
plica por qué se pueden encontrar células pre-
neoplásicas o aun tumores transformados que
no desarrollan y en algunos casos entran en re­
gresión.
Toda la secuencia de eventos que tiene lugar
durante el proceso de formación de un tumor es
consecuencia de cambios producidos a nivel
genético, sin em bargo la expresión genética
puede estar influenciada por el huésped.
El descubrimiento de que los oncogenes de
virus productores de tumores están relaciona­
dos con protooncogenes que se encuentran en
células normales y tumorales llevó a investigar
la relación entre estos genes y el crecimiento
de las células normales y tumorales. Estos ge­
nes han sido locahzados en ciertos crom oso­
mas específicos y en algunos casos en sitios de
aberraciones cromosómicas.
A ctualm ente se especula si la in iciación,
progresión y mantenimiento de algunos tum o­
res depende de una sobre-expresión a través de
la amplificación génica, de la expresión inade­
cuada (por ejemplo en el tiempo incorrecto) de
genes normales, o si es necesario que existan
Inmunología tumoral 665
m utaciones en una región crítica de un gen.
Una hipótesis probable sugiere que la m utación
sería necesaria para la etapa de iniciación pero
las otras etapas dependerían de una expresión
inadecuada o de una sobre-expresión genética.
Se ha postulado que serían necesarias p o r lo
menos dos mutaciones diferentes para que los
tumores se puedan desarrollar. En el caso de las
predisposiciones genéticas (familiares) la p ri­
mera mutación estaría presente en la línea ger­
minal (esperma u óvulo) y de esta forma sería
heredada. Sólo se necesitaría otra mutación. En
los otros casos serían necesarias dos mutaciones
en la misma célula y, por consiguiente, las pro­
babilidades de que esto ocurra son menores.
Actualmente se cree que estos cambios deben
tener lugar en el mismo sitio en cada uno de los
pares de cromosomas homólogos y en algunos
casos ya se ha identificado el cromosoma.
Una hipótesis interesante aplicable a ciertos
tumores es que los genes alterados o deleciona-
dos producen normalmente una sustancia que
suprime la expresión de los factores transfor­
madores del crecimiento por otro par de genes.
De esta forma, se utiliza el término anti-onco-
genes para denominar las secuencias de ADN
(genes) que actúan como supresores de la m a­
lignidad.
RESPUESTA INMUNE ANTI-TUM ORAL
La respuesta inmune inducida por antígenos
tumorales es esencialmente similar a la obteni­
da con antígenos de trasplante o antígenos glu-
coproteicos. La activación de los linfocitos T
(LT) implica la participación de LT colabora­
dores, LT citotóxicos y LT supresores.
Los LT citotóxicos reconocen al antígeno tu­
moral asociado a antígenos del CMH de clase
1. Este proceso requiere la activación de L T co­
laboradores y la producción de linfoquinas que
son fundam entales para la activación d e los
macrófagos, células NK y células LAK (lym-
phocyte activated killer).
Durante este proceso se liberan fundam ental­
mente las siguientes citoquinas:
a) Interleuquina I ( IL-1): esta citoquina es
indispensable para la proliferación de los LT y
para la diferenciación de los LB en célu las
plasmáticas. También es importante en la am­
plificación de las células NK y en la produc­
ción de células LAK a partir de las células pre­
cursoras. Estas últimas son capaces de destruir
células de una amplia variedad de tumores.
b) Factor inhibitorio de la migración de ma­
crófagos (MIE): tiene la función de atraer los
macrófagos próximos al sitio donde está el tu­
mor. Este factor se une a los receptores presen­
tes sobre la membrana de los macrófagos y au­
menta los niveles de AMP cíclico intercelula­
666 Inmunopatología
res, hecho que produce la poUmerización de los
microtúbulos y disminuye la migración.
c) Interferones (INFs): El interferón gamma
es el inmunomodulador más potente. Los INFs
aumentan la eitotoxicidad de las células NK y
aumentan la expresión de antígenos del CMH
de clase I y II sobre la superficie celular. Tam­
bién producen activación de los m acrófagos
aumentando su actividad tumoricida.
d) Linfotoxina (LT): esta linfoquina es capaz
de lisar ciertas células tumorales in vitro y es ci­
totóxica cuando se la inocula in situ en un tu­
mor. No se conoce su función in vivo.
e) Factores quimiotácticos: reclutan células
fagocíticas hacia el sitio tumoral.
f) Factores mitogénicos; estimulan a los lin­
focitos aumentando su actividad.
Función de los antígenos del CMH
en la inmunidad anti-tumoral
La expresión de antígenos del CMH sobre
las células tumorales puede ser importante para
el reconocimiento antigénico y posterior des­
trucción de las células tumorales. Éste es el ca­
so de los LT que son necesarios para la res­
puesta anti-tumoral, ya que éstos sólo pueden
reconocer al antígeno dentro del contexto de
las moléculas del CMH propias. Sin embargo,
no existe una correlación entre la expresión de
estos antígenos y la inmunogenicidad de los tu­
mores. Por ejemplo, los tumores metastáticos,
que presumiblemente han evadido la acción del
sistema inmune, expresan dichos antígenos en
forma similar a los tumores no metastáticos.
En animales endocriados la resistencia a la
inducción de neoplasmas inducida por virus tu­
morales se correlaciona generalmente con cier­
tos haplotipos de genes del CMFI. Por ejemplo,
algunos virus ARN de tumores murinos indu­
cen tumores sólo en ciertas cepas endocriadas
de ratones. Este hecho sugiere que es necesaria
la expresión de ciertos alelos del CMH para
poder inducir una respuesta inmune, la que será
altamente específica para una proteína viral de­
terminada. Si el péptido inmunodominante de
esa proteína se une a un alelo particular de antí­
genos de clase I, este péptido será inmunogéni­
co en las cepas de ratones que expresan dicho
alelo. De esta forma, sólo ciertas cepas endo­
criadas de ratones serán capaces de generar una
respuesta inmune efectiva contra los tumores
que expresan ese antígeno viral.
M ecanismos efectores
en la inmunidad anti-tumoral
Los antígenos tum orales inducen una res­
puesta inm une hum oral y celu la r in vivo y
ex isten vario s m ecanism o s in m u n o ló g ico s
efectores capaces de lisar células tumorales in
vitro. Es importante determinar si alguno de es­
tos mecanismos efectores es capaz de inducir
una respuesta inmune efectiva contra los tumo­
res de origen espontáneo. Estos m ecanism os
pueden ser:
1) Mediados por anticuerpos. Los animales
portadores de tumor son capaces de generar an­
ticuerpos específicos contra los antígenos tu­
morales. Los antígenos que generan estas res­
puestas son proteínas que no se expresan sobre
tejidos normales, por consiguiente no han indu­
cido tolerancia inmunológica.
Los pacientes con linfomas asociados al vi­
rus de Epstein Barr poseen anticuerpos contra
antígenos codificados por el virus, cjue se ex­
presan sobre la superficie tumoral. Ciertos pa­
cientes con cáncer producen anticuerpos contra
sus propios tumores que pueden ser utilizados
para realizar una tipificación in vitro , para
identificar antígenos tumorales. Sin embargo,
no existe una evidencia clara sobre la función
que cumple esta respuesta inmune humoral pa­
ra controlar el crecimiento del tumor.
Una gran variedad de células tumorales pue­
den ser hsadas in vitro por mecanismos media­
dos por anticuerpos. Én condiciones experi­
mentales generalmente los anticuerpos contra
los antígenos tumorales son generados en otras
especies animales y su actividad tumoricida es
mediada por activación del complemento o por
e ito to x ic id a d d e p e n d ie n te de a n tic u e rp o s
(ADCC), vía receptores Fe presentes en macró­
fagos o en células NK.
2) Mediados por linfocitos T. Los linfocitos
T citotóxicos (LTc) proporcionan inm unidad
anti-tumoral in vivo. En estos casos las células
efectoras son predom inantemente LTc CD8“^,
restringidos por antígenos del CMH de clase I
y actúan en forma similar a los LTc aloreacti-
vos. Sin embargo, la participación de estos LTc
en los mecanismos de vigilancia inmunológica
en los tumores no inducidos por virus es cues­
tionable, ya que dichos tum ores no son fre­
cuentes en animales deficientes de células T ni
en pacientes con su respuesta celular deprimida
por efecto de drogas o por infección por el vi­
rus HIV.
Por otra parte, los linfocitos periféricos de
pacientes con estadios avanzados de desarrollo
tumoral, incluyendo carcinomas y melanomas,
poseen LTc que son capaces de lisar explantos
de esos tumores extraídos de los mismos pa­
cientes. Mas aún, células mononucleares deri­
vadas de los infiltrados inflamatorios en tumo­
res sólidos hum anos, denominados linfocitos
infiltrantes de tumores (TILs), también inclu­
yen LTc con capacidad de lisar el tum or del
cual provienen. Si bien esta respuesta no pare­

ce ser efectiva para controlar el crecimiento del
tum or, el aum ento de las respuestas de LTc
puede ser un blanco para la terapia tumoral en
un futuro.
Si bien los LT CD4+ por lo general no son
citotóxicos, cumplen una función im portante
en la respuesta anti-tumoral ya que proveen las
citoquinas necesarias para que los LTc cum ­
plan con su función. Además, los LT colabora­
dores activados por antígenos tumorales p u e­
den secretar TNF e INFy que aumentan la ex­
presión de antígenos de clase I sobre la célula
tumoral haciéndolos más sensibles a la hsis por
LTc. Los tumores que expresan antígenos de
clase II podrían activar directamente LT cola­
boradores CD4+.
3) M ediados p o r eélulas “n a tu ra l-killer”
(NK). Los linfocitos NK pueden ser células
efectoras en las respuestas inmunes naturales o
adquiridas frente a ciertos tumores. Para matar
a las células blanco utilizan el mismo mecanis­
mo lítico que los LTc. Sin embargo, se diferen­
cian de éstos en que no expresan receptores pa­
ra el reconocimiento antigénico y son capaces
de lisar a las células blanco en forma irrestricta
con respecto a antígenos del CMH. Las células
NK son capaces de lisar tanto células infectadas
por virus como ciertas líneas tumorales, espe­
cialmente tumores hematopoyéticos in vitro.
La capacidad tum oricida de las células NK
puede ser aumentada por tratamiento con cito-
quinas, las que incluyen los interferones, factor
de necrosis tumoral (TNF), interleuquina 2 (IL-
2) e interleuquina 12. De esta manera, su rol en
la defensa anti-tumoral puede depender de la
presencia y estimulación de linfocitos T y m a­
crófagos, ya que son las células que producen
estas citoquinas.
Las células NK activadas por IL-2 , denomi­
nadas LAK, son producidas in vitro por trata­
miento de células periféricas o LTc de los pa­
cientes portadores del tumor con una alta dosis
de IL-2. Las células LAK poseen una mayor
capacidad para lisar las células tumorales en
forma inespecífica.
4) Mediados por macrófagos. Los macrófa­
gos son mediadores celulares potencialm ente
importantes en la inmunidad anti-tumoral. Su
efecto se puede demostrar in vitro ya que los
macrófagos activados Usan preferentemente cé­
lulas tumorales pero no células normales. En
forma semejante a las células NK, los macrófa­
gos expresan receptores Fe, de esta forma unen
anticuerpos y actúan sobre células tumorales.
Existen varios mecanismos por los cuales los
macrófagos lisan las células tumorales; algunos
son los m ism os que utilizan para matar m i­
croorganismos, liberando enzimas lisosomales
y metabolitos oxígeno-reactivos. Los macrófa­
gos activados también secretan citoquinas co­
Inmunología tumoral 667
mo el TNF, con capacidad para matar células
tum orales pero no células normales. El T N F
podría actuar por 2 mecanismos diferentes:
a) La unión del TNF a sus receptores de alta
afinidad es tóxica para las células tumorales.
La toxicidad puede ser debida a la producción
de radicales libres. Las células normales re s­
ponden al TNF sintetizando superóxido dismu-
tasa, hecho que no harían las células tumorales.
b) El TNF podría producir necrosis tumoral
por activación de ciertas respuestas del h u é s­
ped.
Vigilancia inmunológica
El concepto de vigilancia inm unológica se
originó a principios de siglo cuando Paul Ehr-
lich postuló que las células tumorales se origi­
naban con mucha frecuencia aunque no rm al­
mente eran eliminadas por los mecanismos de
defensa del huésped. Esta teoría llevó a tratar
de demostrar la inmunidad específica frente a
los tum ores, los que eran trasplantados de un
animal a otro. Como los trasplantes eran recha­
zados, este hecho se tomó como una evidencia
de inmunidad anti-tumoral. Posteriormente se
demostró que el rechazo no era consecuencia
de una respuesta inmune contra el tumor sino
contra antígenos del complejo mayor de h isto ­
compatibilidad.
Medio siglo después, Burnet utilizó el térm i­
no vigilancia inmunológica para definir un es­
tado en el cual el sistema inmune celular del
huésped podía reconocer y destruir células au-
tólogas que expresaban marcadores no propios,
por ejem plo, células portadoras de antígenos
tumorales.
En la actualidad, y con el conocimiento de
que realmente los antígenos tumorales existen,
el concepto de vigilancia inmunológica está en
discusión. Los argumentos a su favor son los
siguientes: 1) muchos tumores expresan antíge­
nos que inducen reacciones de rechazo, 2) los
anim ales de experim entación o los pacientes
inm unosuprim idos son más susceptibles de
contraer cáncer, 3) la inmunodeficiencia p ro d u ­
cida por la edad o por factores genéticos está
asociada con una mayor incidencia de ciertos
tum ores malignos, 4) la inm unoestim ulación
aumenta la resistencia a la inducción de un tu­
mor, 5) los tumores primarios generalmente es­
tán infiltrados por macrófagos y linfocitos, 6)
en ocasiones se puede encontrar regresión es­
pontánea de un tumor, posiblemente m ediada
por reacciones inmunológicas, 7) los inverte­
brados no rechazan aloinjertos ni presentan tu­
mores, en cambio los vertebrados sí lo hacen.
La m ayor evidencia de la efectividad de este
mecanismo proviene del estudio de tumores in­
ducidos por virus ADN, por ejemplo poliom a y
668 Inmunopatología
SV40. Se argum enta que esto sólo refleja un
estado de inmunosupresión contra el virus, pe­
ro hay hechos que indican que no es así. En el
caso del virus polioma la respuesta inmune ha­
cia el virus no es necesaria ni eficaz para pro­
ducir un rechazo, por el contrario, la inmuniza­
ción con tumores polioma que no producen vi­
rus confiere efectiva protección contra tra s­
plantes de estos tumores. En el caso del virus
de la inm unodeficiencia hum ana (HIV), éste
infecta LT colaboradores y monocitos. Estos
dos tipos celulares son fundamentales en la ini­
ciación de la respuesta inmune y su destrucción
lleva al síndrome de inmunodeficiencia adqui­
rida (SIDA). Los pacientes con SIDA presen­
tan una alta incidencia de tumores, particular­
mente del sistema linfoide, y frecuentem ente
desarrollan el sarcoma de Kaposi.
Es importante destacar que la vigilancia in­
munológica es sólo una forma más dentro de la
vigilancia constante del huésped para evitar el
desarrollo de un tumor.
Mecanismos de escape tumoral
Los mecanismos de escape no invalidan la
vigilancia inmunológica ya que muchos tum o­
res son eliminados sin haber sido detectados.
En otras palabras, los tumores son selecciona­
dos por su capacidad para evadir al sistema in­
mune.
Los mecanismos de escape están relaciona­
dos con la paradoja central de la inmunología
tumoral que se pregunta por qué los tumores
que son inm unogénicos pueden evadir la vía
efectora del sistema inmune. El escape tumoral
tendría lugar cuando el balance entre los facto­
res que contribuyen favoreciendo el crecimien­
to o la destrucción del tumor se inclina en bene­
ficio del tumor. Algunos mecanismos de escape
son tan eficientes que pueden evadir no sólo la
respuesta autóloga sino también la terapia anti-
tumoral.
Si bien muchos tumores son débilmente in­
munogénicos, hay otros que son capaces de in­
ducir una respuesta inmune. Todavía no está
claro cómo hacen las células tum orales para
evadir al sistema inmune. Este proceso, que in­
volucra los m ecanism os de escape tum oral,
puede ser explicado de diferentes formas:
1) La expresión de los antígenos del CMH
sobre las células tumorales podría estar regula­
da deficientem ente y así serían incapaces de
formar complejos péptido tumoral-antígeno de
histocompatibilidad, capaces de ser reconocidos
y procesados por el sistema inmune.
2) Ciertos tumores podrían ser débilmente
inmunogénicos en un huésped porque éste no
expresa apropiadamente los antígenos del CMH
de clase II necesarios para activar células CD4+
específicas contra el tumor. La actividad de los
LTc es dependiente de las citoquinas produci­
das por estos linfocitos. Si las CPA no infiltran
el tumor adecuadamente, toman y presentan el
antígeno tumoral y activan a los LT colabora­
dores, no tendrá lugar la correcta diferenciación
de los LTc con actividad contra el tumor.
3) Aun en el caso de péptidos tumorales re­
conocidos por los LT, la falta de coestimulado-
res sobre las células tumorales puede impedir
la activación de los LT. Muchos tumores deri­
van de tejidos que no proveen de coestimulado-
res para la activación de los LT colaboradores.
Además, la activación de los LTc requiere la
coestimulación de moléculas como B7 que no
se expresan en las células tumorales. La p re­
sentación de los antígenos tumorales en ausen­
cia se coestimuladores puede inducir tolerancia
periférica o anergia clonal sobre los LT especí­
ficos para el tumor.
4) Un huésped puede ser to lerante h acia
ciertos antígenos tumorales porque los ha reco­
nocido como propios en la etapa neonatal o
porque las células tumorales pueden presentar
sus antígenos en forma tolerogénica, por ejem­
plo en altas dosis.
5) La cinética del crecimiento tumoral po­
dría permitir el establecimiento de tumores re­
sistentes al sistema inmune antes de que se de­
sarrolle una respuesta inm une efectiva. Este
m eca n ism o de tipo so lap ad o , d en o m in ad o
“sneaking through”, ha sido estudiado funda­
mentalmente en modelos de trasplante de célu­
las tumorales. Por ejemplo, la transferencia de
unas pocas células tumorales de un animal a
otro puede llevar al establecimiento de un nue­
vo tumor, mientras que el trasplante de muchas
células tumorales del mismo tumor puede ser
rechazado. Una explicación posible a esta con­
tradicción podría ser que bajas dosis de antíge­
no tumoral no serían estimulantes para el siste­
ma inmune. Sin embargo, mientras tiene lugar
el crecimiento de estas células en el huésped
podrían ocurrir mutaciones en los antígenos tu­
morales lo que disminuiría la posibihdad de ser
reconocidas por parte del sistema inmune.
6) La inm unidad anti-tumoral podría traer
como consecuencia una selección de células tu­
morales mutadas que han perdido la expresión
de proteínas inmunogénicas, especialmente si
estas proteínas no son críticas para el fenotipo
maligno del tumor.
7) La pérdida de la expresión de antígenos
tumorales de membrana por unión con el anti­
cuerpo, proceso denominado modulación anti­
génica, lleva a una resistencia contra los meca­
nismos efectores de la respuesta inmune. La
modulación antigénica es producida por endo-
citosis o por liberación de los complejos anti­

geno-anticuerpo form ados. D e esta m anera,
ciertos anticuerpos no fijadores del com ple­
mento unidos a la superficie del tumor podrían
proteger a las células tumorales del efecto de
otros anticuerpos fijadores de com plem ento
impidiendo la lisis celular.
8) Los antígenos liberados por las células
tumorales o complejos antígeno-anticuerpo for­
mados con estos antígenos liberados fueron
postulados como factores bloqueadores que in­
terferían con la respuesta inmune anti-tumoral.
Este mecanismo aún es incierto pero podría in­
volucrar el bloqueo de los receptores Fcy de las
células NK o la inducción de células supresoras
que disminuyen la función de los LT colabora­
dores específicos.
9) Los antígenos tumorales de superficie po­
drían estar ocultos para el sistema inmune debi­
do a la presencia de moléculas glucoproteicas
constituidas por mucopolisacáridos que inclu­
yen ácido siálico en su composición. Este m e­
canismo se denomina enmascaramiento antigé­
nico y puede ser consecuencia de una sobre-ex­
presión de estas moléculas por las células tu­
morales.
10) Podría existir un estado de inmunosupre-
sión inducido por el tumor o por agentes físi­
cos, quím icos o infecciosos que indujeron la
transformación maligna. Este es el caso del fac­
tor |3 transformante del crecimiento {transfor-
ming growth factor /J) (TGFp), que es secretado
por varios tumores y que inhibe una amplia ga­
ma de funciones de linfocitos y macrófagos.
Antígenos tumorales
Los animales de experimentación pueden ser
inmunizados con células tumorales y la inm u­
nidad obtenida es específica, es decir, dirigida
Cuadro 33-2. Antígenos tumorales que estimulan a los L T
Antígenos de trasplante específicos de tum or inducidos
quím icam ente
Productos de m utaciones puntuales al azar en genes no in ­
volucrados en la patogenia del tum or
Productos de genes silenciosos que norm alm ente no .se e x ­
presan en individuos adultos
Productos de oncogenes activados por m utaciones o reo r­
denam ientos de genes norm ales
Productos m utados de genes supresores de tum or
Productos de genes virales en cánceres asociados a virus
Inmunología tumoral 669
contra el tumor que ha sido utilizado para la in­
munización y no contra otros tumores relacio­
nados. E sta inm unidad puede ser transferida
pasivamente por células sensibilizadas y no por
anticuerpos, y está mediada por linfocitos T.
Los antígenos tumorales se pueden clasificar
en dos grandes grupos:
- A quellos que son reconocidos por L T y
pueden inducir el rechazo de tumores trasplan­
tados en anim ales previam ente inm unizados
con el tum or. Estos antígenos tum orales son
proteínas que han sido procesadas y presenta­
das a los LT CD4+ o CD8+ en forma de pépti­
dos asociados a antígenos del CMH. Algunos
de estos antígenos son propios y particulares de
determinados tumores, otros son compartidos
por varios, hrcluyen una gran variedad de pro­
teínas celulares y virales que se indican en el
cuadro 33-2.
- Otros antígenos tumorales pueden ser de­
tectados mediante anticuerpos, que se utilizan
para poner en evidencia la presencia de m olé­
culas expresadas sobre la superficie de la célu­
la. Estas moléculas no necesariamente estim u­
lan una respuesta inmune efectiva, pero los an­
ticuerpos generados son útiles para el diagnós­
tico y terapia anti-tumoral.
ANTIGENOS T U M O R A LES
RECONOCIDOS POR LT
Antígenos de trasplante específicos
de tumor (TSTA)
Se han descrito numerosos antígenos de re­
chazo característicos y particulares de cada tu­
mor. No se conoce si estos antígenos están co­
dificados al azar por múltiples genes no rela-
No existen ejem plos a nivel m olecular
La m utación p 9 IA en el m astocitom a m urino
iVlAGE-]
La proteína p21ras con una m utación puntual en el la p o s i­
ción 12 , en 10% de los carcinom as hum anos
El producto p210 a partir de reordenam ientos bcr/abl, en las
leucem ias m ielogénicas crónicas
p53, en m ás del 50% de tum ores hum anos
A ntígeno S V 40 T
Productos genéticos del viru s de papilom a humano E 6 y E7.
Producto genético EB N A -1, del virus de Epstein-B arr
670 Inmunopatología

clonados, por una única familia de genes o por
un número restringido de fam ilias genéticas.
Las características generales de estos antígenos
de rechazo son las siguientes;
1. Son específicos para cada tumor y dife­
rentes de los de otros tumores aun si comparten
el mismo tipo histológico, inducidos en el mis­
mo órgano o por el mismo carcinógeno, en la
misma cepa de ratones y aun en el mismo ra­
tón.
2. No se pueden poner en evidencia sobre
células normales singeneicas.
3. Se definen por experimentos de trasplante
(rechazo), en animales de experimentación.
4. Se encuentran predominantemente en tu­
mores inducidos por agentes físicos o químicos
pero también en algunos tumores espontáneos
experimentales.
5. No se conoce si son producidos a partir de
la amplificación clonal de antígenos preexis­
tentes, por activación de genes silenciosos o a
partir de proteínas mutantes específicas del tu­
mor.
La m ayoría de los carcinógenos físicos o
químicos son mutágenos por lo cual en general
se asume que los antígenos que se expresan en
tumores inducidos por carcinógenos son el pro­
ducto de genes mutados.
E xperim entalm ente es posible inducir un
sarcoma en un ratón pintando su piel con el
carcinógeno químico metilcolantreno. El tumor
puede ser extraído quirúrgicamente y ser intro­
ducido en otro ratón de la misma endocría, y el
sarcoma crecerá nuevamente, pero la reinocula­
ción del mismo sarcoma en el huésped original
llevará al rechazo. Por otra parte, si las células
del sarcoma se irradian previo a su inoculación
y se utilizan para inm unizar otro ratón de la
misma cepa, este animal rechazará un trasplan­
te posterior de las células tumorales originales
viables (fig. 33-1). Sin embargo, no es posible
obtener protección contra otros tumores singe-
neicos similares, hecho que indica que los antí­
genos específicos de trasplante son diferentes
en cada tumor. Esto se demostró también en los
tumores inducidos por radiación ultravioleta.
Como los antígenos se detectan por el recha­
zo de las células tumorales trasplantadas se los
denomina antígenos de rechazo o antígenos de
trasplante. Los experimentos de transferencia
adoptiva demuestran que el rechazo está media­
do por linfocitos T citotóxicos específicos.
Como se indicó anteriormente, una de las ca­
racterísticas de estos antígenos es su enorme
diversidad y la especificidad de la respuesta in­
mune que inducen, ya que un sarcoma inducido
por metilcolantreno no inducirá una respuesta
protectora contra otro sarcoma del mismo tipo.

Ratón con sarcom a MCA

inducido

Ausencia de crecimiento Crecimiento del Ausencia de crecim iento

tumoral (rechazo inmunlógico) tumor tumoral (rechazo inmuno-
lógico)

F ig. 33-1. P or tratam iento de un ratón con m etilcolantreno se puede inducir el crecim iento de un sarcom a. Si este tum or
se exti'ae quirúrgicam ente y se trasplanta en un huésped singeneico volverá a crecer. El ratón que fue portador dei tum or
rechazará un segundo trasplante hecho con el m ism o tum or. P or inoculación de células m uertas del m ism o tum or en un
huésped singeneico tam bién se puede inducir protección contra el desafío con células viables.

ni siquiera en el caso de que ambos se hubieran
originado en el mismo ratón. Pese a que estos
experimentos fueron realizados hace más de 30
años, la naturaleza molecular de estos antíge­
nos es aún desconocida.
En 1970 Burnet postuló que la individuali­
dad de los antígenos de trasplante inducidos
por carcinógenos podría ser debida a la ampli­
ficación clonal de células que expresan un antí­
geno normal particular. De acuerdo a esta hipó­
tesis, cada precursora de una célula normal en
el huésped poseería diferentes antígenos, que
no estarían en cantidad suficiente para ser reco­
nocidos por el sistema inmune, aunque podrían
ser reconocidos luego de una am plificación
clonal. Una situación análoga podría ocurrir
cuando se produce una enfermedad maligna de
origen celular T o B. El idiotipo, presente en
muy pocas células normales, no induciría una
respuesta inm une en el huésped pero podría
servir como antígeno blanco para células tumo-
rales que portan el mismo idiotipo.
Antígenos tumorales codificados
por genes celulares mulantes
La mayor parte de los cánceres humanos son
el resultado de mutaciones producidas por car­
cinógenos físicos o químicos en genes celula­
res que controlan el crecimiento normal de las
células. Algunas de estas mutaciones pueden
ser consecuencia de un daño en una célula nor­
mal que afecta a varios genes al azar. Sin em ­
bargo, la mayoría de las mutaciones represen­
tan una desventaja para las células tumorales, y
las que se producen cuando se origina un tumor
son altamente seleccionadas, probablemente a
través de un largo proceso de carcinogénesis y
progresión tumoral. Algunas de estas mutacio­
nes afectan secuencias de ADN lo que induce
la aparición de proteínas mutadas en el tumor.
Antígenos tumorales codificados
por genes celulares normales
Ciertos genes que están silenciosos en célu­
las normales pueden estar activados en las cé­
lulas malignas. En consecuencia, podrían ex­
presarse en el tejido equivocado, en una etapa
inadecuada e inducir una respuesta inm une.
Recientemente se ha descrito que existen LT
citotóxicos que reconocen antígenos en m ela­
nomas humanos y están codificados por genes
normales que se expresan sólo en las células
malignas. El gen MAGE-1 (antígeno de m ela­
noma) fue aislado de una línea celular obtenida
a partir de un melanoma maligno y codifica pa­
ra un antígeno que es reconocido por un clon
de LT citotóxicos obtenido del paciente porta­
dor del melanoma. La proteína MAGE-1 se ex­
Inmunología tumoral 671
presa en el 50% de los melanomas y el 25% de
los carcinomas de mama, y no se detecta en te­
jidos normales.
No se ha podido demostrar que la activación
selectiva de genes norm ales lleve a la ex p re­
sión de antígenos específicos de tumor en las
células tumorales, y aún no existen evidencias
contundentes de que genes silenciosos norm a­
les activados específicamente en células tum o-
rales codifiquen para antígenos específicos de
tumor.
Antígenos tumorales codificados por
oncogenes o por genes supresores de tumor
Prácticam ente todos los tum ores expresan
genes que son utilizados para el proceso de
transformación maligna. Algunos de estos g e ­
nes fueron identificados y generalmente consti­
tuyen formas alteradas de genes celulares n o r­
males que controlan la proliferación y diferen­
ciación celular. Los protooncogenes pueden e s­
tar alterados por mutaciones puntuales induci­
das por carcinógenos, por deleciones, o p o r
translocaciones cromosómicas dando origen a
los oncogenes, cuyos productos poseen activi­
dad transformante. Las formas alteradas de los
protooncogenes y de los genes supresores de
tumor expresadas por los tumores pueden in d u ­
cir una respuesta inmune. Estas proteínas son
generalm ente moléculas intracelulares que se
procesan y presentan como péptidos asociados
a moléculas del CMH de clase I, aunque la fa­
gocitosis y la liberación de antígenos tumorales
puede inducir una presentación asociada a m o ­
léculas del CMH de clase II.
El análisis de variantes tum- obtenidas tra ­
tando líneas tumorales in vitro con un mutáge-
no demostró que una única mutación puntual
en genes expresados por las células tumorales
puede generar antígenos de rechazo. A lgunas
de estas mutaciones provocan cambios en a l­
gún aminoácido, hecho que produce un im pedi­
mento del péptido para unirse a moléculas del
CMH de clase 1 mientras otras mutaciones p u e ­
den crear nuevos epitopes. De esta manera, las
m utaciones puntuales que afectan cu alq u ier
gen poseen una buena probabilidad de generar
nuevos antígenos que serán reconocidos por los
LT, hecho que puede ocurrir en ciertos tum ores
humanos.
Proteínas codificadas por una mutación
del oncogén RAS
El potencial tumorigénico del protooncogén
RAS puede ser adquirido por mutaciones acti­
vantes que tienen lugar en un sitio predecible y
afectan los residuos de aminoácidos 12 o 61, y
menos frecuentemente, el residuo 13 de la p ro ­
672 Inmunopatología
teína RAS p21. El RAS mutado puede inducir
anticuerpos específicos pero esta proteína está
localizada en la membrana de la célula tumoral
y es inaccesible a estos anticuerpos. Sin embar­
go, los péptidos originados por clivaje proteolí-
tico se pueden unir a moléculas del CMH de
clase II e inducir respuestas colaboradoras. Por
ejemplo, se demostró que células T CD4+ hu­
manas reconocían una sustitución de valina por
glicina en la posición 12 del gen RAS, que es
una de la mutaciones más frecuentes en cáncer
humano.
Proteínas codificadas por una mutación
del gen supresor p53
Las mutaciones en el gen supresor p53 son
las más comunes encontradas en cáncer hum a­
no y experimental. La proteína p53 se descu­
brió mediante un anticuerpo obtenido contra un
sarcoma murino y también con otro anticuerpo
contra antígenos del SV40. Esta proteína se en­
contró en una gran variedad de procesos tumo-
rales pero no fue detectada en células embrio­
narias adultas no malignas. Actualmente se co­
noce que la proteína p53, que actúa como su­
presora del crecimiento celular, está muy poco
expresada en células normales y por lo general
no es detectada, mientras que la p53 que se en­
cuentra en células malignas representa una va­
riante mutante de la p53 normal. Los pacientes
elaboran anticuerpos contra las mutantes pero
éstos no afectan el curso de la enfermedad. No
se conoce aún hasta qué punto las m utantes
pueden ser reconocidas por los LT.
Antígenos tumorales codificados
por virus oncogénicos
Tanto los virus ARN como los ADN están
implicados en el desarrollo de tumores experi­
mentales y humanos. Este tipo de tumores con­
tiene genomas provirales y generalm ente las
células expresan proteínas codificadas por el
virus, que son sintetizadas en forma endógena
y pueden ser procesadas junto con moléculas
del CMH de clase I previo a ser expresadas so­
bre la superficie de la célula tumoral.
Virus ADN con capacidad tumoral
El SV40 y los polioma son virus ADN in­
ductores de cáncer que codifican proteínas fun­
cionalmente similares pero antigénicamente di­
ferentes, ya que son requeridas para la induc­
ción y mantenimiento de la transformación m a­
ligna. Estos antígenos de origen viral son com­
partidos por todos los tumores inducidos por el
mismo virus independienteniente del tejido o
especie animal. Las proteínas se encuentran en
form a intracelular, predom inantemente como
antígenos nucleares, pero los genes que codifi­
can para estas proteínas son los requeridos para
la expresión de los antígenos de trasplante vi­
rus-específico sobre la superficie de las células
reconocidas por los LT citotóxicos.
Los antígenos de rechazo son específicos del
tumor en el sentido de que no son expresados
por las células normales del huésped, no son
codificados por los genes del huésped y no es­
tán presentes en el virión.
Hace algunos años se postuló que el gen que
codifica para los antígenos de superficie de
SV40 podría codificar también para el antígeno
nuclear T. Por transfección de porciones trun­
cadas no transformadas de este gen se determi­
nó que los LT citotóxicos restringidos por antí­
genos del CMH de clase I pueden reconocer
sobre la superficie celular fragmentos procesa­
dos provenientes de proteínas que inicialmente
estaban localizadas intracelularmente.
Los adenovirus presentan genes tempranos,
denominados EIA y EIB, los que son transcrip­
tos no sólo durante los estadios tempranos de
replicación viral sino también en las eélulas
transformadas. En este último caso estos antí­
genos son requeridos para el m antenim iento
del fenotipo transformado.
Existen por lo menos 3 tipos de virus ADN
asociados al cáncer humano;
- algunos miembros de la familia de los virus
papiloma están asociados con el cáncer cervi­
cal.
- los virus de la hepatitis B están asociados
con cáncer primario de hígado.
- los virus de Epstein Barr se asocian con el
linfoma de Burkitt y con linfomas inmunoblás-
ticos.
Virus ARN con capacidad tumoral
Los virus tumorales ARN de tipo exógeno o
endógeno se integran dentro del ADN del hués­
ped. Durante la mayor parte de su ciclo de vida,
los virus exógenos existen y se replican en for­
ma de partículas infecciosas capaces de infectar
otras células. Contrariamente, los virus endóge­
nos permanecen como provirus integrados den­
tro del genoma del huésped y sólo producen
partículas infecciosas por efecto de radiaciones
ionizantes, carcinógenos químicos, mutágenos
o inhibidores de la síntesis de proteínas.
El ADN genómico de ratones endocriados
contiene alrededor de 50 copias de secuencias
provirales relacionadas con el virus de la leuce­
mia murina (MuLV). Estos provirus se pueden
dividir en 3 grandes grupos: virus ectotrópicos,
que se replican en eélulas de ratón pero no en
eélulas de otras especies; virus xenotrópieos,
que se replican en células de otras especies pe­

ro no en las murinas y virus politrópicos, que
se replican en ambos tipos de células. La dife­
rencia entre estos virus está en los genes que
codifican para la glucoproteína de envoltura de
70 kD (gp70).
El virus linfotrópico T humano (HTLV-1) es
el tínico virus ARN conocido que está asociado
con un cáncer humano, la leucemia T del adul­
to. Sin em bargo, estos virus están asociados
con varios tipos de cáncer en animales.
ANTÍGENOS T U M O R A LES
D ETECTA D O S P O R A NTICUERPOS
Existen antígenos, denominados antígenos
asociados a tumor (TAA), que se expresan so­
bre la superficie de diferentes células tumorales
y normales por lo cual generalmente no indu­
cen una respuesta inmune en el huésped porta­
dor del tumor. Sin embargo, en algunos casos
se genera un respuesta mediada por anticuerpos
o por células T, que no cumple ninguna fun­
ción protectora pero es útil para el diagnóstico
y tratamiento de ciertos tipos de cáncer.
Antígenos de diferenciación
Algunos antígenos expresados sobre las cé­
lulas tumorales también están expresados sobre
las células normales en ciertos estadios de su
diferenciación, y muchos de ellos pueden ser
considerados como marcadores de diferencia­
ción. Como no son específicos del tumor se los
denomina antígenos asociados a tumor y cons­
tituyen un variado grupo de glucoproteínas y
glucolípidos.
Pueden estar expresados ampliamente o en
forma restringida sobre un pequeño clon de cé­
lulas normales y el tiempo en que se expresan
durante el período de diferenciación puede va­
riar considerablem ente. Las células m alignas
pueden expresar estos antígenos en forma muy
aumentada en relación a las células normales.
La importancia de estos marcadores de dife­
renciación radica en el hecho de que las células
malignas generalmente expresan alguno de los
genes característicos del tipo celular normal del
que se originaron, lo que puede ayudar a deter­
minar el tipo celular que dió origen a la patolo­
gía. Por ejem plo, los tumores de linfocitos B
expresan inmunoglobulinas de superficie y las
leucemias de linfocitos T pueden ser mediadas
por LT colaboradores o supresores. Esta dife­
renciación es importante ya que los diferentes
subtipos de tumor pueden tener diferente prog­
nosis y pueden ser susceptibles de diferentes
terapias. Los marcadores de diferenciación son
útiles particularmente para clasificar los tum o­
res hematopoyéticos.
Inmunología tumoral 673
Antígenos embrionarios y fetales
Hace 50 años se encontró que ciertas células
tum orales humanas expresaban antígenos que
daban reacciones cruzadas con antígenos de te­
jido embrionario normal. Esto se atribuyó a un
proceso de retrodiferenciación, ya que la pérdi­
da de un fenotipo de diferenciación general­
mente se asocia con la aparición de antígenos
que fueron expresados en altos niveles en célu­
las fetales embrionarias. Si la reexpresión de
antígenos embrionarios tiene lugar como con­
secuencia de la transformación maligna, podría
llevar a la activación o desrepresión de genes
que se m antienen silenciosos en las células
adultas, pero activos en las células em briona­
rias y fetales. Alternativamente, los antígenos
em brionarios o fetales se expresarían en las
stem cells o células indiferenciadas norm ales
del tejido adulto pero no en las progenies más
m aduras, o por lo menos no en niveles altos;
por consiguiente los tum ores representarían
una amplificación e inmortalización de las stem
cells originales.
Sin embargo, no hay evidencias convincen­
tes de que las células tumorales reexpresen an­
tígenos fetales o embrionarios u otros m arcado­
res de etapas tempranas de diferenciación, co­
mo consecuencia de su transformación en célu­
las malignas.
U no de los marcadores tumorales em briona­
rios mejor estudiados es el antígeno carcinoem-
brionario (CEA). Este fue descubierto com o un
antígeno específico de tumor en el carcinoma
de colon humano, y está presente como antíge­
no fetal en intestino, páncreas e hígado durante
los 6 primeros meses de la gestación. A ctual­
m ente se conoce que el CEA también se en­
cuentra en bajos niveles en tejidos no malignos
como la mucosa de colon, pulmones y tejido
mamario.
Inicialmente se pensó que el CEA podría ser
utilizado como marcador para la detección pre­
coz de enfermedades gastrointestinales, pero se
han encontrado elevados niveles de C E A en
otras enfermedades malignas como el cáncer
de pulm ón y de mama.
A pesar de que los niveles séricos de CEA
no son útiles para el diagnóstico preco z del
cáncer, pueden ser utilizados para monitorear
los efectos de la terapia anti tumoral.
La alfa fetoproteína es otro ejemplo de una
proteína embrionaria o fetal que es producida
por el hígado fetal y por células del saco viteli-
no y está presente en pequeñas concentraciones
en el suero de individuos adultos normales. Se
encuentra elevada en pacientes con cáncer de
hígado así como en pacientes con enferm eda­
des hepáticas no malignas. En forma sim ilar al
CEA, los niveles de alfa fetoproteína no pue­
674 Inmunopatología
den ser utilizados para un diagnóstico precoz
del cáncer. Sin embargo, se utilizan para la de­
tección del cáncer de hígado primario en un es­
tadio precoz y para el monitoreo de los pacien­
tes luego de la terapia.
Antígenos clónales
Se expresan únicamente en unas pocas célu­
las normales, posiblemente sólo en el clon ce­
lular a partir del cual se originó el tumor. Por
ejemplo, en el idiotipo de la inmunoglobulina
de superficie en una célula B maligna. En este
caso particular, la inmunización de ratones con
la proteína del mieloma induce una inmunidad
de trasplante anti-idiotipo débil contra el mie­
loma que expresa ese idiotipo.
Los antígenos clónales se expresan solamen­
te en idiotipos de LT y LB.
Antígenos tumorales humanos
Se han realizado num erosos intentos para
utilizar los anticuerpos para detectar neo-antí-
genos en tumores humanos. Una única muta­
ción en una célula puede llevar a la expresión
de un antígeno nuevo, un antígeno específico
de tumor, que es capaz de inducir una respuesta
inmune pero de utilidad restringida, ya que ese
antígeno es individual y no se encuentra en
otros tumores.
Cuando se desarrollaron los métodos de pro­
ducción de anticuerpos monoclonales se pensó
que éstos proporcionarían la forma de diferen­
ciar las células normales de las tumorales. Se
han podido producir anticuerpos monoclonales
contra un antígeno asociado al tumor en la leu­
cemia linfoblástica aguda (CALLA), denomi­
nado actualmente CDIO. Estos anticuerpos per­
mitieron observar que algunas células normales
de médula ósea también poseían este antígeno.
Posteriormente se determinó que el CDIO es un
antígeno de diferenciación que se expresa nor­
m alm ente en linfocitos pre-B. Pero desde el
C uadro 33-3. Distribución y características de antígenos de meianoma
Antígenos
A ntígenos del com plejo m ayor de histocom patibilidad
A ntígenos de pigm entación
R eceptores para factores de crecim iento
M oléculas de adhesión
Proteínas de transporte
Proteínas de la m atriz extracelular
punto de vista de diagnóstico y tratamiento el
CALLA es útil. Las células CALLA' no se en­
cuentran generalmente en médula ósea (<1%)
ni en sangre periférica, por consiguiente, pue­
den ser marcadores de enfermedad. Además,
como el antígeno CALLA no está presente en
las células pluripotentes de médula ósea es po­
sible eliminar las células CALLA”'’ de la médu­
la ósea, mediante el empleo de anticuerpos m o­
noclonales dirigidos contra este antígeno, sin
dañar su capacidad para regenerar el sistema
hematopoyético. Otros antígenos de diferencia­
ción pueden proporcionar posibilidades simila­
res.
Uno de los tumores más estudiados, desde el
punto de vista de los antígenos que expresa, es
el melanoma. Se conocen aproximadamente 40
antígenos definidos por anticuerpos monoclo­
nales en estos tum ores. Ninguno de ellos es
realmente un antígeno asociado a tumor y se
han descrito por lo menos 6 categorías diferen­
tes entre ellos, las que se detallan en el cuadro
33-3.
La expresión de, por lo menos, alguno de es­
tos antígenos podría influir en el com porta­
miento de las células tumorales. Por ejemplo,
el aumento de los receptores para factores de
crecimiento puede llevar al crecim iento des­
con tro lad o , y la p roducción o d istrib u ció n
anormal de moléculas de adhesión influenciará
la capacidad de las células para dar metástasis.
Por consiguiente, anticuerpos m onoclonales
contra estas moléculas podrían ser utilizados en
inmunoterapia ya que estos antígenos se expre­
san en forma aumentada en las células tumora­
les pero su expresión es mínima en células nor­
males.
TERAPIA ANTI-TUMORAL
La terapia anti-tumoral se utiliza para esti­
mular al sistema inmune contra los antígenos
tumorales. Se puede llevar a cabo de diferentes
formas:
D istribución y características
L os m elanom as expresan generalm ente antígenos de clase ] y II
S on intracelulares, a veces poseen valor diagnóstico
R eceptores para EG F, T G F a , T G F P, N G F y FG F
Protoglicanos, glangliósidos, m oléculas de adhesión asociadas a
m elanom as
M etalotransferrina, S-100 Ca hinding protein
L am inina y colágeno

1) Por estimulación activa, actuando direc­
tamente sobre el sistema inmune del huésped.
2) Por inmunoterapia adoptiva, transfiriendo
células inmunocompetentes de un individuo a
otro.
3) Utilizando inmunoterapia pasiva, por ad­
ministración de anticuerpos monoclonales con­
tra antígenos específicos del tumor con el obje­
to de focalizar los “blancos” para los agentes
citotóxicos.
4) En el caso de trasplantes de médula ósea,
en pacientes leucémicos que han sido som eti­
dos a radiaciones, para deplecionar la médula
ósea de células tumorales (autotrasplante), o de
LT maduros (trasplante alogeneico).
Estimulación de m ecanism os efectores
Se han utilizado varios tipos de tratamiento
en la inm unoterapia de tumores ya estableci­
dos. La estimulación inespecífica con los deno­
minados “modificadores de la respuesta bioló­
gica”, por ejemplo el bacilo de Calmette-Gué-
rin (BCG), los INFs o la IL-2 han sido amplia­
mente empleados. La estim ulación con BCG
fue utilizada por su efecto estimulatorio sobre
los macrófagos y se demostró que prolonga la
sobrevida de niños con leucem ia linfocítica
aguda y de adultos con leucem ia m ielocítica
aguda. No es efectivo en el tratamiento de pa­
cientes con tumores sólidos pero la inoculación
intra-lesional de BCG puede inducir una regre­
sión de ciertas lesiones producidas por el mela-
noma. En forma similar, la inoculación intrave-
sical con el bacilo de Calmette-Guerin se está
utilizando con éxito en el cáncer de vejiga. Los
mecanismos anti-tumorales involucrados en es­
ta terapia estarían mediados por LT citotóxicos
e sp e c ífic o s, e ito to x ic id a d n o -re stric ta p o r
CMH, liberación de citoquinas y efectos anti
proliferativos del bacilo per se.
Inmunización a c t iv a
Los intentos de vacunación en animales de
experimentación a efectos de inducir una resis­
tencia hacia el tumor han tenido poco éxito y
en ciertas circunstancias, por ejemplo con tu­
mores inducidos quím icam ente, la inm uniza­
ción con estas células tumorales irradiadas pre­
vio al trasplante con las células tumorales via­
bles puede llevar a una facilitación del creci­
miento tumoral por inducción de anticuerpos
de bloqueo. En algunos casos particulares, por
ejemplo en la vacunación con el virus de la he­
patitis B, se encontró que este tratamiento re­
duce la incidencia del hepatoma primario.
Actualmente se está investigando la posibili­
dad de introducir ciertos genes dentro de las
células tumorales, hecho que las convertiría en
Inmunología tumoral 675
más inmunogénicas y, además, tratar de identi­
ficar los antígenos reconocidos por los LT.
Se sabe que las células tumorales expresan
antígenos que pueden inducir respuestas m e­
diadas por linfocitos T. También se conoce que
las células tumorales son malas presentadoras
de antígenos ya que no proveen la segunda se­
ñal necesaria para la activación de los LT. En
la figura 33-2 se esquematizan los com ponen­
tes indispensables para activar una respuesta
citotóxica mediada por LT. No es suficiente
que los LT CD8+ reconozcan un péptido prove­
niente de un antígeno tumoral presentado den­
tro del contexto de antígenos del CMH de clase
I para que se active eficientemente la respuesta
inmune. Es necesario además una segunda se­
ñal dada por las linfoquinas producidas p o r LT
CD4+. Para producir linfoquinas estas células
necesitan reconocer grupos separados de pépti­
dos antigénicos presentados dentro del contex­
to de moléculas de clase II expresadas sobre
células presentadoras de antígenos tales como
los macrófagos y las células dendríticas. Estas
células endocitan los antígenos desde el exte­
rior y los colocan en el compartimiento endo-
som al/lisosom al donde son degradados; los
péptidos resultantes se asocian a moléculas de
clase II.
Actualmente se conoce que lo que caracteri­
za a una célula presentadora de antígeno profe­
sional es la expresión de moléculas coestimula-
torias, del tipo de B7, que se unen a receptores
cjue se expresan sobre las células T, tales como
el CD28, y esto ocurre en forma concomitante
con el reconocimiento antigénico mediado por
el receptor T. Dicho reconocimiento en ausen­
cia de ía señal coestimulatoria puede llevar a la
anergia celular, responsable de la tolerancia
contra antígenos propios expresada en la peri­
feria. Según el esquema de la figura 33-2 la fal­
ta de respuesta inmune contra un antígeno tu­
moral puede ser debida no sólo a la falta de an­
tígenos específicos de tumor o de LT CD8+ ca­
paces de reconocerlos sino también a un defec­
to en la rama colaboradora de la respuesta in­
mune, ya que sin producción de las citoquinas
apropiadas no se producirá la activación de los
LT citotóxicos.
Las citoquinas regulan la reactividad de las
células involucradas en la respuesta inm une y
controlan los procesos de maduración, activa­
ción y migración de células que participan de
la inflamación. Investigaciones llevadas a cabo
en modelos animales demostraron que la provi­
sión local de ciertas citoquinas, realizada por
inoculación directa o por terapia génica, puede
inducir una fuerte respuesta inmune que puede
llegar a la inhibición del crecimiento tumoral.
Recientemente se ha demostrado que, si se
transfectan genes que codifican para citoquinas
676 Inmunopatología

EFEC TO C ITO TÓ X IC O E FEC TO C O LA B O R A TIV O

A ntígeno tum oral

con restricción para
CIVIH-II (vía exocí-
Célula tumoral tica/endosóm ica

A ntígeno tum oral con

restricción
>11 í u u i u i I para CMF)-I
p a l a \-/ivii i" i
(vía endocítica)
M a c ró fa g o
. v ^ ^^ A n tig e n o / A ntíg e n o/
jfe"*'— CM FI-clase i CiVIH-clase
.RCT

Linfoquinas

Linfocito T Linfocito T
C itotóxico (Te) CD8+ C olaborador (Th) CD4+

Fig. 33-2. P ara que los LT citotóxicos específicos de tum or restrictos por antígenos del C M H de clase I se activen deben
recibir por lo m enos dos señales, la prim era está dada por el reconocim iento antigénico m ediado por el receptor T (R CT) y
la segunda por la liberación de linfoquinas p or los L T colaboradores, los que deben ser previam ente activados vía p resen ­
tación del péptido tum oral por una célula presentadora de antígeno profesional, dentro del contexto de antígenos del C M H
de clase II. Estas C PA profesionales expresan en su m em brana m oléculas com o B7, capaces de enviar señales coestim ula-
torias uniéndose a receptores (CD 28) expresados sobre los L T colaboradores.

o para sustancias coestimuladoras dentro de las
células tumorales, y estas células son reinyec-
tadas en el huésped de donde se extrajeron, se
induce una buena respuesta inmune. Por ejem ­
plo, cuando se transfectan los genes para IL-2,
IL-4, IL-6, IL-7, F N T a, INFy o GM -CSF en
tumores de ratón, éstos regresan. En algunos
casos se acumulan infiltrados inflamatorios al­
rededor de los tumores que secretan las cito-
quinas, y el tipo celular del infiltrado varía con
la citoquina. Esto es importante ya que en fun­
ción del infiltrado celular y las citoquinas libe­
radas se pueden cumplir diferentes funciones
efectoras y accesorias necesarias para una bue­
na activación de los LT aum entando las res­
puestas específicas de los LT contra los antíge­
nos tumorales.
Se han llevado a cabo investigaciones utili­
zando linfocitos infiltrantes de tum or (TILs)
provenientes de pacientes con melanoma, los
que han sido transfectados con el gen para el
F N T a y también para IL-2, con el objeto de
aumentar la inmunorreactividad hacia las célu­
las tumorales, evitando la toxicidad que produ­
ce la administración sistémica de estas drogas.
Por transfección de células tumorales con el
gen para la IL-7 se facilita el rechazo tumoral
por un mecanismo que involucra la expansión
de LT CD8+, generación de LT citotóxicos y
generación de células LAK por parte de las cé­
lulas CD8+ y NK. En algunos tumores los LT
CD4+ y los macrófagos podrían ser importan­
tes inhibiendo el crecimiento vía reacción de
hipersensibilidad retardada.
Por transfección del gen que codifica para la
molécula coestimulatoria B7 se puede obtener
una respuesta anti-tumoral mucho más efecti­
va. Las células tumorales que expresan B7 son
rechazadas en el huésped singeneico mientras
que las células tumorales originales no lo son.
Además, la expresión de B7 en las células tu­
morales induce inmunidad hacia las células tu­
morales originales inoculadas en otro sitio dis­
tante del inicial.
La identificación de genes que codifican p a­
ra antígenos específicos de tumor reconocidos
por LT citotóxicos proporcionó las bases para
la introducción de grandes cantidades de antí­
geno en las células tumorales, uniendo los ge­
nes que codifican para los antígenos con pro­
motores activos, transfectando estas construc­
ciones (constructs) en las células tum orales
del huésped u otros tipos celulares in vivo y
reintroduciendo las células transfectadas en el
paciente. Alternativamente, las vacunas de v i­
rus vaccinia recombinantes con insertos de ge­
nes de antígenos tumorales pueden ser utiliza­
das para aum entar la expresión de antígenos

tum orales en el paciente. P or otra parte, los
antígenos tum orales com partidos por varios
tumores, como el MAGE-1 en los melanomas
o la proteína ras m utada en la posición 12,
pueden ser potencialm ente buenos inm unóge­
nos. Utilizando la reacción en cadena de la po­
limerasa (PCR) es posible determinar si un p a­
ciente expresa un antígeno tumoral por detec­
ción del gen mutado, y se podría emplear la ti­
pificación de antígenos del CMH para eviden­
ciar si un paciente puede expresar moléculas
que se unen al péptido inm unodominante de
ese antígeno.
In m u n o terap ia pasiva
Se están utilizando variados y diferentes m é­
todos en la terapia con anticuerpos con el fin de
inducir una regresión tumoral o prevenir su re­
currencia. Los más utilizados son:
1) Anticuerpos anti-idiotipo. Han sido utili­
zados en el tratamiento de linfomas B que ex­
presan inmunoglobulinas de superficie con es­
pecificidad frente a idiotipos particulares. El
idiotipo sería un antígeno tum oral altam ente
específico, ya que se expresa sólo en el clon de
células B neoplásicas y no en otras células. La
unión del anticuerpo anti-idiotipo, capaz de ac­
tivar el com plemento o la citotoxicidad anti-
cuerpo-dependiente (ADCC) produciría la des­
trucción de las células tumorales. Sin embargo,
este tratamiento no siempre actúa en forma sa­
tisfactoria.
2) A nticuerpos dirigidos contra receptores
de factores de crecimiento (receptor de lL-2).
Han sido utilizados en terapia experimental en
linfomas T humanos incluidos las leucemias y
linfomas asociados al virus HIV. Esta terapia
se basa en el hecho de que la IL-2 estimularía
el crecimiento de las células tumorales que ex­
presan el receptor de IL-2. Los anticuerpos an-
ti-receptor podrían modular o bloquear dichos
receptores, de esta manera se impediría la acti­
vación celular. A lternativam ente, estos an ti­
cuerpos m onoclonales podrían producir lisis
mediada por complemento de las células tumo-
rales que expresan el receptor de lL-2. La tera­
pia con anticuerpos anti receptor de IL-2 no es
específica y podría llegar a producir inmunosu-
presión ya que también actuaría sobre los LT
norm ales activados transform ándolos en no-
funcionales.
3) Anticuerpos específicos para un producto
inducido por un oncogén. Estos serían poten­
cialmente capaces de inhibir el crecimiento tu­
moral si el producto del oncogen fuera esencial
para el fenotipo transform ado. A nticuerpos
monoclonales contra la proteína de superficie
inducida por el oncogén nen inducen la rever­
Inmunología tumoral 677
sión del fenotipo nen-transformado a no-trans­
formado in vitro y los mismos anticuerpos son
capaces de inhibir el crecimiento del tum or en
ratones.
4) Anticuerpos anti-tumor copulados a toxi­
nas o drogas. Ciertas toxinas, por ejemplo rici­
no o la toxina diftérica, son potentes inhibido­
res de la síntesis proteica. Unidos covalente­
mente a anticuerpos monoclonales pueden ser
utilizados en ínfimas dosis y pueden ser dirigi­
dos hacia el blanco deseado (la célula tumoral),
actuando como inm unotoxinas: Este m ism o
principio puede ser utilizado con ciertas drogas
antineoplásicas o con radioisótopos con acción
citocida que podrían actuar unidos covalente­
mente a anticuerpos específicos. Estas m etodo­
logías requieren de dos requisitos para que la
terapia resulte exitosa: a) la especificidad del
anticuerpo debe ser tal que sea capaz de unirse
sólo a células tumorales pero no normales. Co­
mo ya ha sido descrito previam ente, esto es
muy difícil de lograr; b) es difícil de prever y
asegurar que el anticuerpo llegará realmente en
una concentración suficiente a la célula blanco
antes de ser eliminado por las células fagocíti-
cas a través de sus receptores Fe. Si esto suce­
de se reduce la efectividad de la terapia aunque
la utilización de (F ab ’)^ conjugado a toxinas
puede minimizar este problema.
5) Anticuerpos heteroconjugados. En este ca­
so, un anticuerpo específico hacia un antígeno
tumoral se une covalentemente a otro anticuerpo
con especificidad contra una proteína de superfi­
cie presente en una célula efectora citotóxica,
por ejemplo NK o linfocitos T citolíticos ( LTc).
Estos heteroconjugados favorecen la unión de
dichas células hacia las células tumorales blanco
apropiadas, por ejemplo un anticuerpo anti-CD3
unido a un anticuerpo contra una proteína de su­
perficie del tumor favorecerá la lisis de las célu­
las tumorales mediadas por LTc.
6) Conjugados de anticuerpos y hormonas.
Pueden ser utilizados para dirigir LTc hacia las
células tumorales que expresan receptores para
dicha hormona. Por ejemplo anticuerpos anti-
CD3 unidos a la hormona estimulante de mela-
nocitos aumentan la destrucción in vivo , m e­
diada por LTc, de células de melanoma hum a­
no con receptores para la hormona.
7) Depleción in vitro de células tum orales
de médula ósea por lisis mediada por anticuer­
pos y complemento. Este tratamiento se utiliza
en pacientes con linfoma B que reciben un tras­
plante antologo de médula ósea. En estos casos
se toman células de médula ósea del paciente y
se somete a éste a una dosis de radiación y qui­
mioterapia para destruir sus células tumorales.
Por supuesto, también son destruidas las célu­
las norm ales del individuo. La m édula ósea
previamente removida es tratada con anticuer­
678 Inmunopatología

pos monoclonaJes contra los antígenos norma­ zar para para dirigir una célula o un ligando ha- ■
les de LB que también se expresan en las célu­ cia la célula tumoral, o para incrementar la es­
las del linfoma. Posteriormente se añade com ­ pecificidad y afinidad de interacción de una cé­
plem ento para producir la lisis de todas esas lula con su molécula blanco.
células. La médula ósea, que de esta manera
fue purgada de las células tumorales, se rein- Inmunoterapia celular adoptiva
yecta en el paciente para reconstituir su sistema
hematopoyético destruido por la radiación y la Implica la transferencia de células en cultivo
quimioterapia. que pueden reaccionar contra el tumor cuando
8) Actualmente se están comenzando a utili­ son inoculadas en el huésped. Esto puede lle­
zar nuevas moléculas obtenidas por tecnología varse a cabo de dos formas:
del ADN recombinante. Los anticuerpos huma­
nizados y quiméricos se utilizan en pruebas clí­ a) Utilizando la terapia con células killer ac­
nicas y las cadenas Fv de ciertos anticuerpos se tivadas por citoquinas. Este método tiene por
están evaluando en modelos anim ales. F rag­ objeto la generación in vitro de células LAK, lo
mentos de cadenas de IgG se pueden fusionar o que se logra por cultivo de leucocitos periféri­
conjugar a diferentes moléculas de manera tal cos tomados del paciente con tumor en presen­
de obtener nuevas funciones efectoras, tal co­ cia de altas dosis de IL-2. Las células LAK ge­
mo se esquematiza en la figura 33-3. Es posible neradas (originadas principalmente a partir de
crear m oléculas con doble especificidad por las células NK) se reinyectan en el paciente.
unión de dos sitios Fv, las que se pueden utili­ Este tratamiento administrado junto con IL-2

F ig . 33-3. E sq u em atizació n de la
e stru ctu ra co m p leta de una m o lé ­
c u la d e Ig G y s u s f r a g m e n to s
F (ab ’)2, Fab y Fv, lo que es p o si­
b le obtener por m étodos quím icos
o por recom binación. Por estos m é­
F(ab’)2 todos pueden obtenerse m oléculas
b iv a le n t e s b ie s p e c íf ic a s |l g G ,
F (ab ’)2], capaces de unirse al antí­
geno tum oral por uno de los sitios
d e c o m b in a c ió n y p o r el o tro a
reactivo,s adecuados com o drogas,
to x in as, en zim as, rad io n u cleid o s,
c ito q u in a s , p a r a q u e e je r z a n su
efecto directo sobre la célula tum o-
ral. Estos reactiv o s pueden u nirse
tam bién a fragm entos F ab y Fv por
m éto d o s q u ím ico s, co n stitu y en d o
reactivos biesp ecífico s en los que
los fragm entos derivados de la m o ­
lé c u la a n tic u e rp o son b iv a le n te s
pero sólo tienen un sitio de co m b i­
nación para cada ligando
 Inmunología tumoral 679

tuvo mucho éxito en la regresión de tumores los factores estimulantes de colonias granulo-
sólidos en ratones. En seres humanos se está cíticos (G-CSF). Se utihzan en inmunoterapia
utilizando actualmente en los casos de tumores contra el cáncer si bien no actúan aumentando
metastáticos avanzados. la respuesta inm une contra los tum ores. Ac­
b) Mediante terapia con linfocitos infiltra­ tualm ente, y en form a experim ental, se está
dos en el tumor. La finalidad es la generación tratando de transfectar las células tum orales in
de células LAK a partir de células mononuclea­ vitro con los genes de diferentes citoquinas pa­
res tomadas del infiltrado inflamatorio que está ra luego trasplantar estas células en anim ales
próximo a los tumores sólidos. De esta manera portadores del tumor. De esta manera se logra
se enriquece la población de linfocitos TILs la producción de las citoquinas específicamen­
que incluyen a las células NK y a los LTc que te en el sitio donde está creciendo el tumor.
son células asesinas inespecíficas. Este trata­ Esto se llevó a cabo con genes de IL-2, IL-4 e
miento se realiza administrado junto con altas INFy. En todos los casos se logró la inhibición
dosis de IL-2 y está siendo utilizado actual­ del crecimiento tumoral. Todavía no puede ser
mente en seres humanos. utilizado en humanos porque los resultados ob­
tenidos, si bien alentadores, son muy prelim i­
Terapia con citoquinas nares.
En resumen, los agentes m odificadores de
Esta terapia se fundam enta en el hecho de las respuestas biológicas pueden ser utilizados
que las citoquinas poseen la capacidad de acti­ para activar macrófagos y células NK. Los an­
var las células que participan de la respuesta ticuerpos monoclonales dirigidos contra antí­
inmune. Las más utilizadas son las siguientes; genos tumorales bivalentes o biespecíficos y
IL-2. Administrada en altas dosis se utiliza unidos a drogas citotóxicas o toxinas también
sola o junto con inm unoterapia celular adopti­ pueden ser buenas armas contra el tum or. Al­
va. Este tratamiento es efectivo en inducir re­ tern ativ am en te, con ju g ad o s de an ticu erp o s
gresión tum oral en 20-40% de pacientes con asociados a enzimas inoculadas en el sitio de
melanoma y carcinoma renal. Presumiblemen­ crecimiento tumoral podrían actuar sobre pre­
te la IL-2 actúa activando células NK y/o LTc cursores de ciertas drogas las que, adm inistra­
induciendo la aparición de células LAK in vi­ das en forma sistémica, producen la liberación
vo. E ste tr a ta m ie n to p u e d e tra e r e fe c to s del compuesto activo en el sitio correcto y ne­
secundarios, fiebre, edema pulmonar, etc. y es­ cesario.
to es producto de la activación de otros linfoci­ Es aún muy difícil conocer cuál o cuáles de
tos los que, a su vez, liberan TNE, INFy y lin- los m étodos em pleados tendrá más éxito. El
fotoxina. hecho real es que se dispone de una am plia se­
TNF. Se utilizó en pacientes con carcinomas rie de estrategias para contrarrestar el creci­
avanzados. Si bien posee un gran efecto anti- miento tumoral. El futuro aclarará cuál será el
turnoral in vitro, produce un efecto tóxico en mejor tratamiento, según el tipo de patología, a
las dosis necesarias requeridas in vivo. utilizar en la inmunoterapia del cáncer.
IN F a. Es producido por leucocitos. Posee
efectos anti-proliferativos in vitro, incrementa
el potencial lítico de las células NK y aumenta B IB L IO G R A F ÍA
la expresión de antígenos del CMH de clase I A bbas A .K .. Lichtm an A .H . and P ober LS. (1993). Cellu^
en diferentes tipos celulares. Se lo utilizó y se lar an d M o lecu lar Im m u n o lo g y . W .B . S au n d ers Com-
obtuvieron 10-15% de regresiones en carcino­ pany. 3rd. Edition.
mas renales, melanomas y sarcoma de Kaposi, B o o n , T ., C ero ttin i, J.C ., V an d en E y n d e, B ., V a n der
40-50% en linfomas y 80-90% en la leucemia B ruggen, P. and V an Peí, A. (1994) Tum or an tig en s re-
c o g n ized by T lym pbocytes. A nnu. Rev. Im m u n o l. 12,
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efecto confiable. veillance. Progress in Exp. T um or Res. 13, 1-27.
INFy. Se lo utilizó para el tratamiento de tu­ Franks, L.M , and Teich, N.M. (1991). Introduction to the.
C ellu lar and M olecular
mores sólidos y hem atopoyéticos sin m ucho B io lo g y o f C án c er, 2 n d . E d itio n , O x fo rd U niv er.sity
éxito. Se pensó que su efecto activante sobre Press.
los macrófagos y las células NK, así como su G eorge, A .J.T., Spooner, R.A. and Epenetos, A .A . (1994).
capacidad para aumentar la expresión de antí­ A pplications of
m o n o c lo n al an tib o d ies in clin ic al oncology. Im m u n o l.
genos del CMH favorecería su capacidad para T oday, 15,559-561.
hacer más efectiva la inmunidad anti-tumoral H erlyn,M . and K oprow ski, H. (1988). M elanom a antigens:
pero esto no fue así. im m unological and biological characterization an d clini­
cal significance. A nnual Rev. of Im m unol. 6, 283 -3 0 8 .
Factores de crecim iento hem atopoyéticos. Jack so n , A .M . and .lam es, K. (1994). U n d erstan d in g the
Estos incluyen los factores estimulantes de co­ m o st successful im m unotherapy fo r cáncer. T h e Immu-
lonias granulocito-macrofágicos (GM-CSF) y nologi.st, 2/6, 208-214.
680 Inmunopatología
K le in , G ., S jo g re n , H ., K lein E. an d H e lls tro m , K .E.
(1960). D emon,stration o f resistance against m ethylcho-
lanthrene-induced .sarcomas in the prim ary autochtonoiis
host. C áncer Res. 20, 1561-1572.
K nudson, A .G . (1986). G enetics o f H um an C ancers: re-
view. A nnual Re. o f G enetics 20, 231 -51.
L añe, D.P. (1994). T he regulation o f p53 function: Steiner
A w ard Lecture. Int. J. C áncer 57, 623-627.
L anzavecchia, A. (1993). Identifying strategies for im m une
intervention. Science 260, 937-944.
P ardoll, D .M . (1993). C áncer vaccines. Im m unol. Today,
14, 310-316.
Paul, W . (1993). Fundam ental Im m unology. R aven press.
3rd. Edition.
R o sen b erg , S.A . and Lotze, M .T. (1986). C áncer im m u-
notherapy using interleukin -2 and in terle u k in -2 activa-
te d ly m p h o c y te s. A n n u a l R ev . o f Im m u n o l. 4 , 6 8 1 -
710.
S c h r e i b e r ,H ., W a rd P .L ., R o w le y D .A . a n d S tr a u s s
H .J.(I988). U nique tum or-specific antigens. A nnual Rev.
o f Im m unol. 6 ,3 5 9 -3 8 0 .
Tonaka, K. Y oshioka T., B ierberich,C . and Jay,G . (1988).
The role o f the m ajor histocom patibility com plex class I
antigens in tum or grow th and m etastases. A nnual Rev. o f
Im m unol. 6 , 359-380.
U rban, J.L. and Schreiber, Fl. (1992). T um or A ntigens. A n ­
nual Rev, o f Im m unol. 10, 617-644.
V itetta, E.S., Thorpe, P.E. and U hr, J. (1993). Im m unoto-
xins: m agic bullets or m isguided m issiles. Im m unology
T oday 14, 253-259.
W aterfield, M .D . (1989). G row th factors. B ritish M edical
Bulletin 45, 541-553.
Inmunología
de la reproducción
RICARDO MARGNI
ILEANA MALAN BOREL
INTRODUCCION
Los mecanismos que conducen a que el feto,
considerado como un injerto alogeneico, no sea
rechazado por su madre, no están totalm ente
esclarecidos. Se han propuesto varias hipótesis,
apoyadas en investigaciones científicas. Los
avances en los últimos años de las técnicas de
biología molecular y de anticuerpos monoclo­
nales, contribuyeron a esclarecer ciertos meca­
nismos inm unológicos involucrados en la re­
producción.
M edewar, en un principio, propuso que el
éxito de la preñez se debía a que el útero era un
sitio privilegiado, en donde cualquiera sea el
tejido implantado no se produce rechazo. Más
adelante, y conociendo la importancia que los
antígenos del CMH tienen sobre el rechazo de
injertos, se atribuyó a que la placenta, al estar
desprovista de estos antígenos, actuaría como
una barrera antigénicamente neutra entre el feto
y la madre. Con el avance de las investigacio­
nes se postuló que durante la preñez se produce
una inm unosupresión no específica local, es
decir, en la unidad feto-placentaria y una inm u­
nosupresión no específica sistémica.
En los rechazos de injertos alogeneicos hu­
manos, los linfocitos T desempeñan una fun­
ción importante tanto en el reconocimiento de
los antígenos no propios, como en la citolisis y
destrucción de las células que exponen a estos
antígenos. El feto está protegido contra el efec­
to de estas células citotóxicas; los mecanismos
involucrados en este fenómeno serán analiza­
dos más adelante.
El sistema inmune de la madre desempeña un
rol fundamental en el mantenimiento de la ges­
tación, existiendo además una estrecha relación
entre este sistema y el endocrino. Una buena re­
34
lación entre ambos, junto con factores placenta-
rios y factores séricos producidos durante la
preñez habrán de llevar al éxito de la misma.
En el presente capítulo, todo cuanto se espe­
cule sobre sistema inmune, órganos co m p ro ­
m etidos y productos sintetizados durante la
preñez, está referido a humanos. Cuando se tra­
te de otros vertebrados se los identificará espe­
cíficamente.
PLACENTA
Durante el primer período de su desarrollo,
el embrión extrae directamente del endometrio
las sustancias nutritivas y el oxígeno que nece­
sita. A medida que se desarrolla, este tipo de
intercambio con el organismo materno se hace
insuficiente. A las nuevas exigencias nutricias
y respiratorias del embrión, responde la form a­
ción de un nuevo órgano: la placenta. En la
mujer, ésta se desarrolla gradualmente durante
los tres primeros meses de gestación y al final
del tercer mes está completamente formada.
F orm ación de la placenta
La formación de la placenta se puede dividir
en dos períodos: a) prevelloso y b) velloso.
a) En el período prevelloso el huevo fecunda­
do llega al útero donde se implanta en el estadio
de blastocito. El disco embrionario se orienta
hacia la parte profunda del endometrio; una es­
pesa capa de trofoblastos lo separa de las célu­
las deciduales. Una vez producida la im planta­
ción el trofoblasto se diferencia en sincitiotrofo­
blasto primitivo, formado por una espesa masa
citoplasm ática sin límites intercelulares. Este
sincitio emite brotes que, por acción de enzimas
680 Inmunopatología
K le in , G ., S jo g re n , H ., K lein E. an d H e lls tro m , K .E.
(1960). D em onstration o f resistance against m ethylcho-
lanthrene-induced sarcom as in the prim ary autochtonoiis
host. C áncer Res. 20, 1561-1572.
K nudson, A .G . (1986). G enetics o f H um an C ancers: re-
view. A nnual Re. o f G enetics 20, 231 -51.
L añe, D.P. (1994). T he regulation o f p53 function: Steiner
A w ard Lecture. Int. J. C áncer 57, 623-627.
L anzavecchia, A. (1993). Identifying strategies for im m une
intervention. Science 260, 937-944.
P ardoll, D .M . (1993). C áncer vaccines. Im m unol. Today,
14, 310-316.
Paul, W . (1993). Fundam ental Im m unology. R aven press.
3rd. Edition.
R o sen b erg , S.A . and Lotze, M .T. (1986). C áncer im m u-
notherapy using interleukin-2 and interleukin-2 activa-
te d ly m p h o c y te s. A n n u a l R ev . o f Im m u n o l. 4 , 6 8 1 -
710.
S c h r e i b e r ,H ., W a rd P .L ., R o w le y D .A . a n d S tr a u s s
H .J.(I988). U nique tum or-specific antigens. A nnual Rev.
o f Im m unol. 6 ,3 5 9 -3 8 0 .
Tonaka, K. Y oshioka T., B ierberich,C . and Jay,G . (1988).
The role o f the m ajor histocom patibility com plex class I
antigens in tum or grow th and m etastases. A nnual Rev. o f
Im m unol. 6, 359-380.
U rban, J.L. and Schreiber, H. (1992). T um or A ntigens. A n ­
nual Rev, o f Im m unol. 10, 617-644.
V itetta, E ,S „ Thorpe, P,E, and U hr, J, (1993), Im m unoto-
xins: m agic bullets or m isguided m issiles, Im m unology
T oday 14, 253-259,
W aterfield, M ,D , (1989), G row th factors, B ritish M edical
Bulletin 45, 541-553,
Inmunología
de la reproducción
RICARDO MARGNI
ILEANA MALAN BOREL
INTRODUCCION
Los mecanismos que conducen a que el feto,
considerado como un injerto alogeneico, no sea
rechazado por su madre, no están totalm ente
esclarecidos. Se han propuesto varias hipótesis,
apoyadas en investigaciones científicas. Los
avances en los últimos años de las técnicas de
biología molecular y de anticuerpos monoclo­
nales, contribuyeron a esclarecer ciertos meca­
nismos inm unológicos involucrados en la re­
producción.
M edewar, en un principio, propuso que el
éxito de la preñez se debía a que el útero era un
sitio privilegiado, en donde cualquiera sea el
tejido implantado no se produce rechazo. Más
adelante, y conociendo la importancia que los
antígenos del CMH tienen sobre el rechazo de
injertos, se atribuyó a que la placenta, al estar
desprovista de estos antígenos, actuaría como
una barrera antigénicamente neutra entre el feto
y la madre. Con el avance de las investigacio­
nes se postuló que durante la preñez se produce
una inm unosupresión no específica local, es
decir, en la unidad feto-placentaria y una inm u­
nosupresión no específica sistémica.
En los rechazos de injertos alogeneicos hu­
manos, los linfocitos T desempeñan una fun­
ción importante tanto en el reconocimiento de
los antígenos no propios, como en la citolisis y
destrucción de las células que exponen a estos
antígenos. El feto está protegido contra el efec­
to de estas células citotóxicas; los mecanismos
involucrados en este fenómeno serán analiza­
dos más adelante.
El sistema inmune de la madre desempeña un
rol fundamental en el mantenimiento de la ges­
tación, existiendo además una estrecha relación
entre este sistema y el endocrino. Una buena re­
34
lación entre ambos, junto con factores placenta-
ríos y factores séricos producidos durante la
preñez habrán de llevar al éxito de la misma.
En el presente capítulo, todo cuanto se espe­
cule sobre sistema inmune, órganos co m p ro ­
m etidos y productos sintetizados durante la
preñez, está referido a humanos. Cuando se tra­
te de otros vertebrados se los identificará espe­
cíficamente.
PLACENTA
Durante el primer período de su desarrollo,
el embrión extrae directamente del endometrio
las sustancias nutritivas y el oxígeno que nece­
sita. A medida que se desarrolla, este tipo de
intercambio con el organismo materno se hace
insuficiente. A las nuevas exigencias nutricias
y respiratorias del embrión, responde la form a­
ción de un nuevo órgano: la placenta. En la
mujer, ésta se desarrolla gradualmente durante
los tres primeros meses de gestación y al final
del tercer mes está completamente formada.
F orm ación de la placenta
La formación de la placenta se puede dividir
en dos períodos: a) prevelloso y b) velloso.
a) En el período prevelloso el huevo fecunda­
do llega al útero donde se implanta en el estadio
de blastocito. El disco embrionario se orienta
hacia la parte profunda del endometrio; una es­
pesa capa de trofoblastos lo separa de las célu­
las deciduales. Una vez producida la im planta­
ción el trofoblasto se diferencia en síncítiotrofo-
blasto primitivo, formado por una espesa masa
citoplasm ática sin límites intercelulares. Este
sincitio emite brotes que, por acción de enzimas
682 Inmunopatología

citolíticas, destruyen a las células deciduales que Los troncos principales (vellosidades de 1er
los rodean liberando sustancias nutricias para el orden) se subdividen en vellosidades de 2- y de
embrión (glucógeno, lípidos, prótidos, etc). El 3“' orden. El conjunto de las ramificaciones de­
otro producto de diferenciación es el citotrofo- rivadas de cada vellosidad de 1er orden consti­
hlasto primitivo, situado en la vecindad de la tuyen un cotiledón placentario, separados entre
cavidad coriónica y constituido por una capa de sí por tabiques que se originan en la decidua.
células poliédricas. El origen del sincitio y del Cada una de las vellosidades está formada por
citotrofoblasto no se conocen. un estroma de tejido conectivo, por el que cir­
Más adelante aparecen, en el sincitiotrofo- cula una arteriola y una vénula procedentes de
blasto, numerosas vacuolas o lagunas separa­ la arteria y de la vena umbilical del feto, y por
das por trabéculas formando las cavidades la­ un revestimiento de sincitiotrofoblastos.
berínticas. Esta capa va perforando los capila­ La parte materna de la placenta es la decidua
res del endometrio hasta alcanzar las arteriolas basal, la que en su parte superficial es compac­
y las vénulas que lo recorren, penetrando así la ta y en su parte profunda esponjosa debido a la
sangre materna en los espacios [acunares. La presencia de glándulas y vasos venosos. Duran­
verdadera circulación de la sangre por las lagu­ te el parto la decidua se desprende de la pared
nas trofoblásticas se inicia en la tercera sema­ uterina (fig. 34-2).
na, cuando las arterias espiraladas del endome­ Si se secciona la placenta se puede observar
trio son perforadas. En esta etapa el huevo ha hacia la superficie fetal la placa corial cubierta
penetrado en el endometrio más profundamente por el líquido amniótico y hacia la superficie
y se completa la anidación. materna la placa basal formada por la decidua
b) El período velloso se inicia a partir del día y por el epitelio de sincitiotrofoblastos. Entre
13 con una intensa actividad proliferativa del ambas placas se encuentra el espacio interve­
trofoblasto. Las trabéculas del sincitio toman lloso (fig. 34-2 y 34-3).
un aspecto velloso y hay penetración de células La placenta ejerce innumerables funciones,
citotrofoblásticas, formándose las vellosidades las que se adaptan a la tarea que aquella debe
primarias. Éstas, al evolucionar se transforman desarrollar para lograr el mantenimiento del fe­
en troncos vellosos que darán origen a los coti­ to en el útero materno. A través de la placenta
ledones fetales. Los cotiledones están formados la sangre venosa del feto cede el COj a la san­
por un centro conjuntivo vascular rodeado por gre m aterna y se provee nuevam ente de O^.
un epitelio de citotrofoblastos o capa profunda También hay pasaje de ciertas sustancias nutri­
y por un epitelio de sincitiotrofoblastos o capa cias tales como agua, azúcares, grasas, aminoá­
superficial. cidos, sales, vitaminas, etc, fundamentales para
El lugar de implantación ocupa sólo una par­ la nutrición fetal. La placenta constituye, ade­
te del endometrio; a esta zona durante la preñez más, una barrera de protección para determina­
se la denomina decidua. dos microrganismos patógenos que pueden en­
contrarse en la sangre materna. Por el contra­
Estructura y función rio, ciertos virus como los del sarampión, vari­
cela y viruela atraviesan la placenta, quedando
La .placenta humana es de tipo hemocorial, el feto expuesto a los mismos.
esto significa que las células trofoblásticas es­ La placenta humana y de algunos vertebrados
tán en contacto directo con la sangre materna. permite el pasaje de anticuerpos producidos por
En un embarazo de término, la placenta hu­ el sistema inmune de la madre. En el hombre
mana, cuando está completamente desarrollada los anticuerpos de tipo IgG son los que atravie­
es de tipo circular, esponjosa, con un diámetro san la placenta otorgando protección fetal, ya
de alrededor de 20 cm, un espesor de 2 cm y su que el feto todavía no es capaz de producirlos.
peso oscila entre 500 y 600 g. El cordón umbi­ La placenta secreta varias hormonas como
lical se inserta en la cara que enfrenta al feto y son la gonadotrofina coriónica, estrógenos,
por transparencia se pueden ver los vasos san­ progesterona, las que son volcadas al torrente
guíneos distribuidos en forma de estrella a par­ circulatorio materno. La placenta secreta tam­
tir de su punto de inserción (fig. 34-1). bién factores moduladores de la respuesta in­
E stá constituida por una parte fetal y una mune a los que se les atribuye una función pri­
parte materna. La parte feta! está formada por mordial en el mantenimiento del feto en el úte­
las vellosidades córlales que se han desarrolla­ ro materno.
do y ramificado. Hay dos tipos de vellosidades, A partir del 7“ mes de gestación la actividad
las fija s que profundizan en la decidua y cuya de la placenta va disminuyendo, la altura de las
función sería la de “anclar” la placenta a la pa­ vellosidades es menor, el corion degenera en
red uterina, y las libres, más numerosas, están algunos puntos y entre el corion y la decidua se
en contacto directo con la sangre materna en van formando depósitos fibrosos. A este proce­
las lagunas sanguíneas. so se lo denomina senescencia de la placenta,

que anuncia el cese de las funciones placentaria
que terminarán con el parto.
Células trofoblásticas: expresión antigénica
El feto no se encuentra en contacto directo
con la madre, son las células trofoblásticas las
que lo hacen, formando lo que se denomina in­
terfase materno-fetal. En ella existen dos áreas
de contacto: el sincitiotrofoblasto y el citotro­
foblasto. Los sincitiotrofoblastos son las célu­
las que recubren las vellosidades coriónicas y
por tal razón constituyen la mayor interfase en­
tre la madre y el feto, ya que las vellosidades
están bañadas por la sangre materna. Estas cé­
lulas en los roedores se denominan trofoblastos
laberínticos. Los citotrofoblastos invaden a la
decidua endometrial y es aquí donde se ponen
en contacto con las células maternas. En los
roedores a estas células se las denomina espon-
giotrofoblastos.
La expresión de los diferentes antígenos en la
placenta ha sido ampliamente estudiada. Dado
que la preñez se asemeja a un trasplante aloge­
neico, e! mayor énfasis ha sido puesto en una
serie de antígenos codificados por el CMH, res­
ponsables de los rechazos de injertos. Con el ob­
jeto de ayudar a comprender cómo pueden coe­
xistir madre y feto, siendo ambos genéticamente
diferentes, es que se han realizado estudios in­
munológicos y moleculares para analizar la ex­
presión de los genes que codifican para los antí­
genos del HLA de clase I y de clase II en las di­
ferentes poblaciones de células trofoblásticas.
La regulación en la expresión de los antígenos
HLA a nivel placentario sería uno de los hechos
más importantes para el éxito de la preñez.
Los antígenos HLA clase 1 y clase II clásicos,
indispensables para el desarrollo de la respuesta
inmune humoral y celular, están ausentes en los
sincitios y en los citotrofoblastos. En el ratón,
las células laberínticas no expresan moléculas
de clase I, mientras que los espongiotrofoblastos
pueden expresar antígenos de clase I (H-2K, H-
2D) y en algunas cepas se ha encontrado la ex­
presión de los antígenos H-2L. Se supone que
estos antígenos, al estar presentes en las células
trofoblásticas, actuarían como un inmunoadsor­
bente uniendo las moléculas de anticuerpos anti­
paternos formados en la madre los que se degra­
darían más rápidamente. En la rata la situación
es semejante a la del ratón, salvo que en los es­
pongiotrofoblastos se ha demostrado la expre­
sión de un sistema antigénico denominado Pal y
Pa2 (“pregnancy associated”).
En el hombre, los citotrofoblastos expresan
un antígeno denominado HLA-G. Este fue pri­
m eram ente identificado como una m olécula
HLA de clase I clásica (A,B,C) ya que reaccio­
naba con el anticuerpo monoclonal W6/32. E s­
Inmunología de la reproducción 683
te anticuerpo reacciona con una porción co n ­
servada de las moléculas de clase I clásicas. A
pesar de esta expresión aloantigénica los trofo­
blastos, in vitro, y por razones no establecidas,
no son destruidos por células citotóxicas ni por
lisis mediada por complemento. A causa de e s­
tos hechos se considera que cum plirían u n a
función importante en la protección del feto en
el útero materno. Existen diversas sustancias,
tales como INE-y, IL-4, 5-azycytidina (5 Azac)
que tienen la capacidad de inducir la expresión
de los antígenos HLA-II clásicos sobre las c é ­
lulas trofoblásticas. El lEN-y lo hace, por ejem ­
plo, sobre los espongiotrofoblastos del ratón y
la 5-Azac sobre las células laberínticas. Otras
sustancias como la a-fetoproteína, son capaces
de inhibir la inducción ejercida por el INE-y so ­
bre la expresión de esos antígenos.
En 1978 Eaulk y col. observaron la expre­
sión en células trofoblásticas de un antígeno,
posteriormente descrito en linfocitos por otros
investigadores. A este antígeno se lo denominó
TLX (Trophoblast lymphocytes cross-reactive
antigens). Es un antígeno heterogéneo en su
peso molecular (55-65 kD) según provenga de
diferentes líneas celulares y de distintas prepa­
raciones de trofoblastos. Los trofoblastos y lin ­
focitos de un mismo individuo expresan el m is­
mo epitope antigénico. Trabajos recientes han
demostracTo que este antígeno es sinónimo de
CD46. Esta proteína es un cofactor de mem bra­
na capaz de unirse a C3b y C4b y facilitar la
inactivación de éstos por la proteína I del siste­
ma complemento. De esta manera CD46 ejer­
cería un efecto protector del trofoblasto evitan­
do un ataque inmunológico.
Al antígeno TLX se le asigna además u n
efecto protector de las células trofoblásticas.
Estos antígenos estimularían a la madre a una
respuesta inmune beneficiosa para el desarrollo
de la placenta. Se postula además la formación
de un anticuerpo anti-idiotipo; un equilibrio e n ­
tre la relación anti-TLX y su anti-idiotipo sería
beneficioso para el éxito de la preñez. Su a u ­
sencia llevaría al aborto. En esta hipótesis se
basa el tratamiento que a ciertas pacientes que
presentan abortos recurrentes de etiología d es­
conocida se les hace inyectándoles una suspen­
sión de linfocitos provenientes de su pareja,
con el fin de lograr embarazos que lleguen a fe ­
liz término.
Expresión de proteínas relacionadas
con la regulación del sistema complemento
Las células trofoblásticas expresan ciertas
sustancias que modulan la activación del co m ­
plemento: “la proteína cofactor de membrana”
(MCP, identificada actualmente como sinóni­
mo de CD46, TLX, arriba descrita) y el “factor
684 Inmunopatología
_ Vasos
sanguíneos
F ig . 34-1. L a placenta vi.sta desde la cara fetal (Tom ada de
E n ciclopedia “C onsulta” Edit. C odex, 1965.)
acelerador del decaimiento” (DAF) modulan la
activación de C3 de la cascada del complemen­
to, acelerando la inactivación de la actividad
funcional de C3-convertasa de la vía clásica y
de C3bBb de la vía alterna. Estas proteínas han
sido bien identificadas. Las características del
MCP (CD46) ya han sido indicadas. El DAF es
una glucoproteína sim ple de PM 74 kD. La
función de estas proteínas sería la de proteger a
la placenta de un ataque inmunológico media­
do por complemento.
Antígenos relacionados
con los grupos sanguíneos
Los antígenos relacionados con el sistema
ABO no estarían expresados sobre las células
F ig. 34-2. Estructura y circulación placentaria (T om ada de E nciclopedia “C onsulta” Edit. C odex, 1965.)
trofoblásticas humanas. Se ha localizado un an­
tígeno sialyl-Le* en los citotrofoblastos. Fue
detectado con dos anticuerpos monoclonales,
uno dirigido contra los hidratos de carbono fu-
cosilados y el otro contra los hidratos de carbo­
no sialilados de la cadena precursora de los
grupos sanguíneos tipo 1 y tipo 2. Los sincitio-
trofoblastos, células que recubren las vellosida­
des coriónicas, no reaccionan con ninguno de
estos dos anticuerpos.
Durante el desarrollo embrionario hay expre­
sión de algunos antígenos carbohidratados. Es­
tos podrían estar involucrados en el reconoci­
miento célula-célula e incrementar la sialidación
de glucoconjugados de superficie, mecanismo
que en las células tumorales le confiere resisten­
cia a su lisis por las células NK. Sería muy inte­
resante determinar si estos antígenos tienen al­
guna función semejante en la interacción que se
produce entre células trofoblásticas y células de
la decidua. De ser así, su presencia en las célu­
las trofoblásticas sería importante para el mante­
nimiento de la integridad placentaria.
DECIDUA
La decidua es un tejido membranoso consti­
tuido por la mucosa uterina que se forma du­
rante la gestación y que es expulsada luego del
parto. En la decidua humana y de ratón se ha
evidenciado una gran variedad de células. En­
tre ellas los macrófagos CD14+, los que expre­
san antígenos CMFÍ clase II que les confiere
una función inmunológica importante, actuan-
nI Espacio
E
¡: intervelloso
inte
J
lasal
 Inmunología de la reproducción 685

F ig . 34-3. C o rte transversal de placenta:

ubicación de ias células trofoblásticas.

do como células presentadoras de antígenos a ción de la lL-2, interfiriendo con los receptores
los linfocitos T. En el tejido decidual están en para dicha interleuquina. El desarrollo de esta
contacto con los citotrofoblastos placentarios. población de pequeños linfocitos requiere de
Los macrófagos normalmente están presentes ciertas señales hormonales, así como también
en el estrom a endom etrial duran te el ciclo de factores solubles secretados por los trofo-
menstrual, aumentando su número al comenzar blastos. Al factor soluble secretado por los p e ­
la preñez. queños linfocitos presentes en la decidua m uri­
Los linfocitos T forman parte también de las na se lo ha relacionado con TGE-P^ (“Transfor-
células del estroma uterino, presentando la m a­ ming growth factor (32” ). Su presencia está re ­
yoría receptores T C R (a/p); una baja propor­ lacionada con una preñez normal, ya que, si su
ción presenta receptores TCR( y/5). Los linfoci­ actividad es débil se producen abortos. jEste
tos T CD3+, CD8* podrían participar en meca­ efecto ha sido corroborado con experiencias
nismos de supresión. realizadas in vivo inyectando a la madre un an­
En el estroma decidua! humano existe una ticuerpo monoclonal anti-TGF-p^. Hasta el m o ­
población de leucocitos con características de mento no se conoce cual es el linaje de estos
gran linfocito (LGL). En el primer trimestre de pequeños linfocitos.
la gestación éstos forman la mayor parte de las
células deciduales (75%), no presentan caracte­
rísticas de linfocitos T ni de hnfocitos B, pero IM PLA N T A C IÓ N
sí presentan actividad NK. Expresan el marca­
dor de superficie CD 56 y son CD2+, C D 3% La im plantación de los blastos en el útero
C D l6", no presentando receptores para Fe. Es­ materno es regulada por una serie de mecanis­
tas células serían las responsables de la produc­ mos endocrinos e inmunológicos estrechamen­
ción de factores de crecimiento. La actividad te relacionados, que llevarían al éxito de la im ­
NK que presentan les otorgaría un rol im por­ plantación del huevo fecundado.
tante en la gestación controlando la invasión En el momento de la implantación las célu­
del trofoblasto en el tejido uterino. las endometriales sufren diferenciación y proli­
Se ha demostrado que la decidua, tanto hu­ feración. Todo esto es controlado por una serie
mana como de ratón, expresa capacidad inmu- de sustancias tales como hormonas esteroideas
nosupresora. En el humano no se han identifi­ ováricas, histamina, prostaglandinas, leucotrie­
cado aún las células responsables de este efec­ nos y factor activador de plaquetas (PAF), las
to. En el ratón esto se atribuye a una población que contribuyen a la transformación celular, es
de pequeños linfocitos que presentan gránulos decir, a la formación de la decidua endom e­
citoplasmáticos. Clark y col. han demostrado trial. Estas sustancias son secretadas por los te ­
que estas células o no estaban presentes o, si lo jidos endometriales del útero. En el endometrio
estaban, lo hacían en muy baja proporción en humano se secretan factores supresores depen­
dos m odelos m urinos que presentan un alto dientes de la progesterona, que atenúan la lin-
grado de resorción fetal. Estos investigadores foproliferación producida por los mitógenos o
han identificado además un factor soluble, se­ los aloantígenos.
cretado por dichas células, que actuaría b lo ­ En los program as de fertilización in vitro
queando la respuesta de los linfocitos T a la ac­ que se realizan en humanos, sobrenadantes de
686 Inmunopatología
cultivos tie embriones presentan, como en el
caso anterior, la misma actividad inmunosupre-
sora, existiendo una estrecha correlación entre
la presencia de este efecto y el éxito de la im­
plantación.
Imakawa y col. han encontrado una sustan­
cia bioquímicamente activa denominada proteí­
na de trofoblasto (TP-1) en ovinos y en bovi­
nos, que guarda una estrecha relación con el
IFN -a. Dicha proteína presenta efecto anti viral
y tiene la propiedad de inhibir la respuesta de
linfocitos a mitógenos y a IL-2, por lo que se le
atribuye una activa participación en el control
de la respuesta inmune materna a los aloantíge-
nos embrionarios.
Otra de las proteínas encontradas es la |3-lac-
toglobuhna (PLG/PP14), secretada por las cé­
lulas del epitelio glandular del endometrio, con
efecto inmunosupresor sobre la actividad de las
células NK. Por este mecanismo el embrión es­
taría protegido del ataque por las células NK
maternas durante el período de pre-implanta-
ción.
Las células del estroma endometrial produ­
cen INF-P 2, IL-6 en respuesta a IL-1, TNF e
IFN-y, efecto que es suprimido por la acción
de los estrógenos. La IL-1 estimula la produc­
ción de prostaglandina E-2 (PG-E2) en el teji­
do endometrial, y como ésta tiene un potente
efecto inm unosupresor, el hecho de haberse
encontrado niveles elevados de IL-1 en el en­
dometrio luego de la implantación, hace que se
le atribuya una función regulatoria. La IL-1
tendría otro efecto, como es el de inhibir la de-
cidualización de las células del estroma endo­
metrial humano inducida por la progesterona.
Si células endometriales son cultivadas, duran­
te dos semanas, con 10 * M de progesterona, se
transforman en células deciduales productoras
de prostaglandina, fenóm eno que es inhibido
por el añadido de IL-1. No se comprende exac­
tamente cuál es el rol de la IL-1 en el endome­
trio, pero podría pensarse que la infertilidad
causada por una inflamación endometrial, po­
dría deberse a un incremento de la secreción
de, esta molécula por parte de los macrófagos
uterinos activados.
En el período de implantación, se le ha asig­
nado un posible rol en el desarrollo de la pla­
centa, al factor estimulador de colonias de ma­
crófagos (M-CSF). Si bien este factor se en­
cuentra presente en cultivos de células epitelia­
les y de células del estroma, la adición de pro­
gesterona sólo estimula la producción del mis­
mo por las células del estroma. En el endome­
trio, M-CSF podría actuar en la diferenciación
y maduración de los macrófagos tisulares y de
las células endometriales, como así también en
el d e sarro llo p la c e n ta rio en el p e río d o de
preimplante.
RESPU ESTA INMUNE ESPECÍFICA
Y NO ESPECÍFICA
Las investigaciones realizadas hasta el pre­
sente confirman que el sistema inmunológico
de la madre desempeña un rol fundamental en
el mantenimiento fetal. La regulación de la res­
puesta inmune materna se llevaría a cabo me­
diante dos mecanismos: uno específico y otro
inespecífico. Los mecanismos específicos esta­
rían m ediados por anticuerpos y por células
sensibilizadas, en tanto que mecanismos supre-
sores locales y sistémicos lo harían en forma
inespecífica.
Mecanismos inespecíficos
Los mecanism os supresores locales serían
debidos a factores locales no específicos inhibi­
dores de la respuesta celular. Esta actividad po­
dría estar mediada, entre otros, por TGF-p se­
cretado por células presentes en la decidua. Los
sobrenadantes de cultivos de células placenta-
rias suprimen la respuesta mitogénica y alogéni-
ca de linfocitos estimulados en cultivo mixto,
inhibiendo además la actividad de las células
NK. No se conoce exactamente la naturaleza de
estos factores, pero se sabe que rompen los me­
canismos de adhesión célula-célula esenciales
para el desarrollo de una respuesta inmune.
Los mecanismos supresores sistémicos esta­
rían mediados por factores derivados de la pla­
centa y de la decidua que alcanzan la circula­
ción materna, entre los que se encuentran hor­
monas y glucoproteínás asociadas a la preñez
(a^-PAG y P,-PSE), las que inhiben la funcio­
nalidad del Unfocito T y de las células NK. Su
origen es atribuido a la placenta por habérselas
encontrado en varios sueros retroplacentales al
comienzo de la preñez, para ir desapareciendo
a lo largo de la misma. Es probable que éstas
sean eliminadas antes de entrar a la circulación,
lo que hace que con frecuencia no se las detec­
te en el suero materno o sólo lo sean en bajas
concentraciones.
Mecanismos específicos
Los sincitiotrofoblastos vellosos están en
contacto directo con la sangre materna y los ci­
totrofoblastos presentes en la decidua lo hacen
con las células maternas. Estas serían las áreas
más importantes en donde los linfocitos mater­
nos pueden ser sensibilizados por las células
trofoblásticas. En la interfase entre la madre y
el feto se realiza el pasaje de células a la circu­
lación materna llevando, de esta manera, antí­
genos hacia otros lugares del sistema inmuno-
lógico de la madre donde podría ocurrir una
respuesta inmune.

En la vena uterina de algunas mujeres emba­
razadas se han encontrado sincitiotrofoblastos
y citotrofoblastos. No se conoce el motivo del
desprendimiento de estas células de la placenta
y su posterior pasaje a la circulación materna.
En ésta se han detectado durante el parto y en
algunos casos durante el embarazo, células ro­
jas fetales.
El tipo de respuesta inmune que la madre de­
sarrolla durante la preñez dependería de la na­
turaleza de los antígenos expresados por las cé­
lulas placentarias y por los tejidos fetales que
están en contacto con las células inmunocom­
petentes maternas.
Respuesta a antígenos HLA paternos
No obstante que los antígenos HLA clásicos
no están presentes sobre las células trofoblásti­
cas, la madre puede estar expuesta a antígenos
paternos expresados en células fetales, desarro­
llándose de esta manera anticuerpos dirigidos
hacia dichos antígenos. Esta sensibilización po­
dría deberse al pasaje de leucocitos fetales,
HLA+, a la circulación materna, debido a una
ruptura accidental de la continuidad de las ve­
llosidades coriónicas. Se han detectado an ti­
cuerpos citotóxicos anti-HLA paternos en un
15% de mujeres que transcurren con un primer
embarazo normal, elevándose este porcentaje
al 60% en el caso de mujeres multíparas. Estos
anticuerpos no son capaces de fijar com ple­
mento; su presencia no pondría en peligro la
integridad del feto.
Respuesta a antígenos no pertenecientes
al sistema HLA clásicos
Durante el embarazo hay una respuesta in­
mune hacia diferentes antígenos, los que pue­
den ser moléculas específicas de la placenta o
del feto, aloantígenos presentes en tejidos pla-
centales y tejidos fetales, los que pueden ser
expresados, o no, por los tejidos somáticos del
adulto. Existe, además, una serie de antígenos
expresados por las células trofoblásticas y por
los linfocitos, tales como TLX y HLA-G. En
estos casos los anticuerpos producidos pueden
ser detectados cuando se usa como antígenos
(célula “blanco”) los linfocitos paternos.
Existen otros antígenos denominados antíge­
nos de histocompatibilidad menores definidos
por técnicas celulares y por injertos, pero no
por serología. Durante el embarazo no se han
detectado anticuerpos con esa especificidad.
Producción de anticuerpos “facilitantes”
Trabajos sobre tumores realizados en la dé­
cada del ’60, demostraron la presencia de anti­
Inmunología de la reproducción 687
cuerpos que se unen específicamente a los antí­
genos presentes en células tumorales, ocultán­
dolos del sistema inmune del huésped y evitan­
do, de esta manera, su eventual rechazo. A e s­
tos anticuerpos se los denominó/ac77íía«íe.s d e­
bido a que, al impedir la destrucción del tum or
por un mecanismo inmune de tipo celular, faci­
litan su crecimiento. Se presume que un m eca­
nismo de tipo similar podría tener lugar durante
la gestación. En efecto, en el suero de mujeres
embarazadas se encontró una IgG que bloquea
específicamente la respuesta inmune celular de
la madre hacia los antígenos paternos y hacia
los antígenos presentes en la placenta. Este tipo
de anticuerpo no fue detectado en mujeres que
presentan abortos recurrentes.
Anticuerpos IgG asimétricos
A com ienzos de 1970 pudim os dem ostrar
que toda respuesta inmune que cursa con p ro ­
ducción de anticuerpos de la clase IgG, precipi­
tantes, fijadores del complemento, depuradores
de antígenos, está acompañada por otra pobla­
ción de anticuerpos, de la clase IgG, de lo s
mismos isotipos que los precipitantes y que tie ­
nen un comportamiento inmunoquímieo y b io ­
lógico totalm ente diferente. P ara estos a n ti­
cuerpos, descritos en detalle en el capítulo 19,
hemos propuesto el nombre de anticuerpos IgG
asimétricos y es como se los conoce en la lite­
ratura. La designación proviene del hecho de
que estas moléculas de IgG tienen insertado un
oligosacárido en sólo uno de sus Fab, originan­
do este hecho una asimetría molecular. El o li­
gosacárido más representativo es de alto conte­
nido en mañosa (“high mamiose type”), con c a ­
pacidad de unirse a la lectina concanavalina A,
a diferencia de lo que ocurre con los oligosacá -
ridos que se encuentran en el Fe, donde predo­
minan los que tienen restos de galactosa y ác i­
do siálico. Esto hace que de la población total
de moléculas de anticuerpos IgG, sólo los a si­
métricos se fijan a Con A. Este hecho ha p e r­
mitido, además, poder demostrar que en to d a
población de IgG "no específica” aislada de un
suero normal, el 10-15% de las moléculas son
de tipo asimétrico. Este es un hecho extensivo
a todos los vertebrados y que afecta a las dife­
rentes subclases de IgG que se elaboran.
Estas moléculas son consecuencia de un fe ­
nómeno de origen postraduccional, no son e la ­
boradas por células distintas, ya que, como lo
hemos demostrado empleando cultivos de h i­
bridomas, son sintetizados por el mismo clon
celular. Los mecanismos que pueden ser re s ­
ponsables de este hecho han sido discutidos en
el capítulo 19.
El resto oligosacarídico, responsable de la
asim etría, interfiere en la funcionalidad d el
588 Inmunopatología
fragmento Fab al que afecta. A consecuencia
de ello este Fab no puede unirse a grandes li-
gandos y la molécula de IgG funciona como
anticuerpo bloqueante, univalente, protector
del agente agresor y no deJ huésped. Al no for­
mar agregados, debido a su univalencia funcio­
nal, no pueden poner en marcha mecanismos
efectores de la respuesta inmune como precipi­
tación por formación de complejos adecuados,
fijación del complemento y depuración antigé­
nica, entre otros.
En condiciones normales la inoculación de
antígenos solubles en pocas dosis o en dosis re­
petidas por períodos prolongados, inducen en
todos los casos respuestas en las que los anti­
cuerpos IgG asimétricos sólo llegan al 10-15%
de la población total de anticuerpos produci­
dos. Los antígenos particulados, inoculados en
forma repetida, inducen respuestas en las que
los anticuerpos asim étricos pueden llegar a
constituir hasta el 70% del total. Dado que la
afinidad por el ligando de los anticuerpos IgG
normales y la de los asimétricos es la misma
(son sintetizados por el mismo clon celular), un
suero que los contenga se comportará de mane­
ra diferente segíin sus proporciones, ya que en
este caso la competición será por masa de anti­
cuerpo. E stud ios efectuad o s m u estran que
cuando en una m ezcla de anticuerpos de la
misma especificidad, la proporción de anticuer­
po asimétrico es del 20%, o menor, esa concen­
tración no modifica el comportamiento del an­
ticuerpo precipitante normal pero, si esa pro­
porción aumenta, dicha actividad disminuye y
para mezclas en las que la proporción de anti­
cuerpo asimétrico es del 70-80%, la actividad
del anticuerpo normal no se expresa. Esto hace
que los sueros inmunes, que contienen alta pro­
porción de anticuerpo IgG asimétrico, se com­
porten como univalentes, bloqueantes, protec­
tores del agente agresor y no del huésped. Esta
situación es la que hemos podido observar en
infecciones crónicas, que son fenómenos de la
naturaleza que cursan con estimulaciones a re­
petición por antígenos particulados. En estos
casos los anticuerpos asimétricos, al proteger al
microrganismo o parásito, contribuyen a poten­
ciar la cronicidad (véase cap. 19).
Dado el particular comportamiento de estos
anticuerpos, hemos investigado si podrían tener
alguna participación en la protección del feto
en el útero materno. Hemos podido demostrar
que la proporción de moléculas IgG asimétri­
cas, que en el suero de mujeres no gestantes es
del 10-15%, se duplica en las em barazadas.
Cuando analizamos las moléculas de IgG elui-
das de placentas previamente lavadas con solu­
ción salina y tratadas luego con buffer diso­
ciante (Glicina-HCI 0,1 M, pH 3 o KCl 4 M),
entre el 40-60% de esas moléculas eran asimé­
tricas. Cuando se investigó la actividad anti-an-
tígenos paternos, usando linfocitos como célu­
las “blanco” , pudim os dem ostrar que el 70-
80% tenían actividad, en tanto que de las IgG
normales o simétricas sólo el 7% reaccionaban
con los linfocitos paternos. Teniendo en cuenta
la competición que existe entre moléculas nor­
males y asimétricas, y la proporción con activi­
dad anti-antígenos paternos en ambas poblacio­
nes de IgG, es lógico presum ir que los anti­
cuerpos IgG asimétricos deben jugar un papel
importante en la protección del feto en el útero
de la madre.
Cuando se analizaron los sueros de mujeres
embarazadas, que contenían 30% de moléculas
asimétricas, sólo el 2% de éstas tenían activi­
dad anti-paterno, lo que está indicando que la
inducción de asimetría molecular es un fenó­
meno general, que debe afectar a la mayoría de
las células sintetizadoras de inmunoglobulina,
y no solamente a aquellas comprometidas con
la síntesis de anticuerpos antipaternos. Todos
los fenómenos descritos son bien evidentes en
las multíparas, siendo por el contrario muy di­
fíciles de evidenciar en prim íparas. Es muy
probable que ello esté relacionado con las rees-
timulaciones en las multíparas y con la sensibi­
lidad de los métodos de detección usados. En
efecto, teniendo en cuenta el volum en de la
placenta hum ana (20x10x2 cm) y el tam año
promedio de las células (10 |J- de diámetro) que
la constituyen, la misma estaría compuesta por
aproximadamente 2 x 10^ células. Si se admite
como valor promedio que el número de epito­
pes por célula es lO”*, su número total sería 2 x
10‘“. Si la concentración de anticuerpo fuera
aproximadamente 1,5 ng/ml (10“"M ) sería muy
difícil de detectarlos por los métodos serológi-
cos de diagnóstico. No obstante, si a esa con­
centración molar se la multiplica por el número
de Avogadro (6,2 x 10^^) se obtiene el número
de moléculas por litro de sangre, en este caso 6
X 10'^, número muy superior al total de epito­
pes que sería necesario bloquear para lograr un
efecto beneficioso.
Por otra parte, no debe olvidarse que de los
métodos serológicos usados con fines de diag­
nóstico, algunos son de interacción prim aria
(ELISA, radioinmunoanálisis, inm unofluores­
cencia) en tanto que otros, como la inmunopre-
cipitación, hemaglutinación, fijación del com­
plemento, son de interacción secundaria (véan­
se caps. 8 y 9). En una mezcla de anticuerpos
IgG precipitantes normales y asimétricos, todos
ellos serán puestos en evidencia si se usa una
reacción de interacción primaria pues sólo uno
de los sitios de combinación del anticuerpo o
Fab interacciona con el ligando. En cambio, si
se usan reacciones de interacción secundaria, en
las que la agregación es fundamental y para que

ella ocurra deben participar los dos Fab de la
molécula, sólo serán puestos en evidencia los
anticuerpos normales, no así los asimétricos.
És muy importante el conocimiento de este
hecho. Se considera como una muy probable
causa del aborto recurrente la aparición de anti­
cuerpos normales capaces de interaccionar con
los antígenos paternos y poner en marcha reac­
ciones de agresión, a diferencia de lo que ocu­
rre con los anticuerpos asim étricos que blo ­
quean al antígeno y lo protegen de los mecanis­
mos agresores de la inmunidad humoral y celu­
lar. El hacer una buena evaluación diferencial
de la respuesta inmune que se ha originado po­
dría ser de mucha utilidad para una mejor eva­
luación diagnóstica y pronóstica.
Flay quienes utilizan, en el tratamiento pre­
ventivo del aborto recurrente, inoculaciones re­
petidas de suspensiones de leucocitos de origen
paterno. M uy probablemente este tratamiento
lleve, por ser una inoculación repetida de antí­
genos particulados, a la inducción de la síntesis
de anticuerpos IgG asimétricos, supliendo de
esta m anera alguna falla del mecanismo res­
ponsable de la regulación de este fenómeno.
Si bien no caben dudas de la importancia de
los anticuerpos asimétricos, el interrogante sur­
ge sobre cuáles son los mecanismos que llevan
a su síntesis preferencial durante la preñez. So­
bre este particular, investigaciones desarrolla­
das por nosotros han permitido demostrar que
la placenta, mediante factores que sintetiza, es
la responsable de la regulación de la calidad de
los anticuerpos que se elaboran. Utilizando co­
mo reactivo diferentes hibridomas con distintas
especificidades, que sintetizan bajas proporcio­
nes de anticuerpos asim étricos de las clases
IgG l e IgG2b, hemos comprobado que el aña­
dido a los cultivos de hibridomas del sobrena­
dante de cultivos placentarios varía la calidad
del anticuerpo sintetizado, haciendo que se in­
cremente la proporción de anticuerpos asimé­
tricos. Ello ocurre cuando el sobrenadante es
añadido al hibridom a en la proporción 5-8%,
produciéndose un efecto inhibitorio de la sínte­
sis de anticuerpos totales cuando esas propor­
ciones superan al 20%.
Estas experiencias ponen en evidencia que la
placenta secreta factores capaces de modular la
calidad del anticuerpo que se elabora. Constitui­
ría un mecanismo fisiológico normal de la pre­
ñez, el que haría que la respuesta inmune de la
madre contra los antígenos paternos se desviara
hacia la producción de anticuerpos protectores
de esos antígenos, protegiéndolos del efecto
agresor que pudieran inducir los anticuerpos
precipitantes normales, a la vez que bloquearían
los mecanismos de la inmunidad celular.
Se ha podido determinar que la acción regu­
ladora de los factores placentarios es un fenó­
Inmunología de la reproducción
meno general, que afecta a todo el sistema in ­
mune. Hemos demostrado que cuando se in o ­
culan ratas vírgenes y ratas preñadas con an tí­
genos convencionales (ovoalbúmina), la p ro ­
porción de anticuerpos asimétricos sintetizados
por ambos grupos es diferente. En las ratas v ír­
genes la relación anticuerpo asim étrico/anti­
cuerpo norm al es 15/85, en tanto que en las
preñadas esa relación en los anticuerpos an ti­
ovoalbúmina sintetizados es 30-35/70-65. V a ­
lores sim ilares a estos ú ltim os se o b tien en
cu an d o ra tas v írg en e s son in o cu lad a s c o n
ovoalbúm ina e inyectadas sim ultáneam ente,
por v ía intraperitoneal, con sobrenadante de
cultivos de placenta.
Estos resultados indican que factores secre­
tados por la placenta, cuyo aislamiento, purifi­
cación e identificación estamos intentando en
estos momentos en nuestros laboratorios, p u e ­
den m odular la calidad de respuesta inm une.
Los anticuerpos inducidos ejercen un p o d e r
protector de los antígenos hacia los que están
dirigidos. Se han iniciado estudios en los que
se procurará determinar si, como consecuencia
de este efecto, su uso podría ser beneficioso en
el tratamiento de algunas enfermedades autoin­
munes y en la facilitación del implante de órga­
nos y tejidos alogeneicos.
Un efecto similar al de los sobrenadantes de
cultivos de placenta lo hemos encontrado en
los provenientes de cultivos de linfocitos de
embarazadas, que expresan receptores citosóli-
cos para progesterona, cuando son pulsados
con la hormona. Estos sobrenadantes constitu­
yen el material del que Szekeres-Bartho aisló el
factor que ha demostrado efecto supresor sobre
linfocitos T citotóxicos y células NK.
Una reflexión final cabe sobre la síntesis de
anticuerpos asimétricos por las mujeres gestan­
tes. Siendo estos anticuerpos protectores d el
antígeno, incapaces de mediar reacciones b io ­
lógicas que lleven a la destrucción del agente
agresor, ¿habrá de resultar beneficioso, en to ­
dos los casos, vacunar a la madre con la finali­
dad de transferirle al feto una inmunidad h u ­
moral pasiva congénita, que no habrá de ser
precisamente de la calidad deseada?
Respuesta inmune hacia el trofoblasto,
mediada p or células
La inmunidad celular requiere de la interac­
ción de linfocitos T y de macrófagos, ambos
presentes en la decidua en el prim er trimestre
de gestación. A pesar de que el trofoblasto no
expresa antígenos HLA clase II, es posible que
antígenos del trofoblasto sean presentados al
linfocito T por macrófagos deciduales y de esta
manera estimular la formación de linfocitos T
c ito tó x ico s esp ecífico s para el tro fo b lasto .
690 Inmunopatología
Membranas de sincitiotrofoblasto provenientes
de placentas autólogas no estimulan la respues­
ta proliferativa en linfocitos maternos. Los ci­
totrofoblastos tampoco estim ulan a linfocitos
en cultivo mixto de linfocitos, lo que sugiere
que a diferencia de los antígenos HLA-clase 1,
los antígenos HLA-G (presentes en los citotro­
foblastos) serían incapaces de generar células T
citotóxicas.
Importancia de la respuesta inmune
materna para el éxito de la preñez
Normalmente se presentan un niimero bajo
de abortos espontáneos que pueden ser detecta­
dos clínicamente (10-15%). Existen los llama­
dos abortos recurrentes, así denom inados a
aquellos producidos más de tres veces en una
paciente y que transcurren antes de la semana
20 de gestación. La frecuencia con que apare­
cen es de 1 en 300 mujeres gestantes, su etiolo­
gía es desconocida pero se lo asocia a proble­
mas endocrinos y a anormalidades anatómicas.
Los inmunólogos han propuesto varios meca­
nismos para encontrar una explicación al éxito
de la preñez. En todos ellos se involucra la for­
mación de anticuerpos, por el sistema inmune
de la madre, dirigidos contra antígenos paternos
a efectos de protegerlos y asegurar el manteni­
miento fetal. En estos mecanismos participa­
rían: a) la formación en la madre de anticuerpos
citotóxicos con actividad anti-iinfocitos pater­
nos, b) la síntesis de anticuerpos “facilitantes” o
bloqueantes y de moléculas IgG asimétricas con
actividad específica, capaces de bloquear antí­
genos paternos e inhibir el cultivo mixto de lin­
focitos, c) la producción de anticuerpos anti-
TLX. En las parejas que no comparten este an­
tígeno y que presentan embarazos de término,
se ha demostrado la presencia de anticuerpos
anti-TLX, los que tendrían por función blo ­
quear a dichos antígenos e impedir que sean el
“blanco”de agresión por los componentes nor­
males de una respuesta materna. Se ha observa­
do que las abortadoras comparten con su pareja
los antígenos TLX y no presentan anticuerpos
contra éste. Es por ello que hay autores que su­
ponen que los antígenos TLX podrían tener al­
guna participación en los mecanismos que regu­
lan la protección del feto en el iítero materno.
Corno ya se indicara, se ha ensayado con al-
gtin éxito, en los casos de abortos a repetición,
la inoculación de suspensiones de linfocitos
provenientes del padre, la que puede revertir la
situación, haciendo que el embarazo llegue a
término. La mayoría de los autores consideran
que ello sería debido a la inducción previa en la
madre de una respuesta inmune con formación
de anticuerpos protectores contra los antígenos
paternos; los anticuerpos IgG asimétricos po­
drían tener participación en este hecho. Otros
autores, en cambio, estiman que ello sería con­
secuencia de un fenómeno inespecífico media­
do por citoquinas que aparecen por cualquier
estímulo antigénico, y no necesariamente por
antígenos de origen paterno.
Muy interesantes son los resultados experi­
mentales de Clark y Chaouat, quienes han estu­
diado en profundidad un modelo murino que
p re s e n ta un alto g rad o de re s o rc ió n fe ta l
(CBA/j X DBA/2). Si hembras CBA/j (H2-k)
son apareadas con machos de la cepa DBA/2
(H2d), se produce la preñez pero con un alto
grado de resorción fetal (30%). Este porcentaje
disminuye considerablemente si a las hembras
C B A /j, antes de ser apareadas con m achos
DBA/2 se las inoculas con: a) células espléni-
cas provenientes de ratones BALB/c (H-2d), b)
suero de ratones CBA/j previamente inmuniza­
dos con células de BALB/c, c) si se las aparea
con ratones BALB/c.
Se podría pensar que el efecto que tienen las
inoculaciones linfocitarias sobre la resorción
pudiera ser debido a la producción de anticuer­
pos anti-H-2d, así como también a un efecto in­
flamatorio. Este efecto estimularía la produc­
ción de citoquinas y de factores de crecimiento
que estimularían el desarrollo placentario, evi­
tando así los abortos. Esto último estaría avala­
do por el hecho de que, si a las hembras sólo se
les inyecta adyuvante de Freund completo an­
tes de aparearlas con los machos, el porcentaje
de resorción también se ve reducido.
FACTORES INMUNOMODULADORES
SECRETADOS POR EL TROFOBLASTO
Tanto el feto como la placenta expresan una
variedad de antígenos, entre los que se encuen­
tran los antígenos del complejo mayor de histo­
compatibilidad no clásicos (HLA-G), antígeno
TLX, antígenos oncofetales, antígenos especí­
ficos de tejidos, contra los cuales la madre po­
dría reaccionar generando una respuesta inm u­
ne y producir por lo tanto el rechazo del feto.
Esto afortunadam ente no sucede. A pesar de
que en el suero de la madre se pueden encon­
trar anticuerpos específicos y linfocitos sensibi­
lizados para alguno de ellos, la sobrevida de la
unidad feto-placentaria no se ve comprometida.
Los diferentes mecanismos propuestos para
encontrar una respuesta a esta incógnita son los
siguientes:
1. La placenta formaría una barrera fisiológica
evitando el pasaje de células maternas y de
células fetales.
2. A dsorción de anticuerpos citotóxicos por
células expresadas en la placenta.

3. Falta de expresión de antígenos del C M tF
clase I y clase II clásicos, por las células tro­
foblásticas.
4. La expresión de los antígenos HLA-G.
5. La producción de anticuerpos “facilitantes”.
6. La producción de anticuerpos asimétricos
de la clase IgG.
7. La inducción de una supresión local y sisté-
mica de la respuesta inmune materna.
8. La suceptibilidad dañada de los trofoblastos
a las células NK y a las CTL (células “ki­
ller” activadas por linfoquinas).
9. Una inmunorregulación local debida a los
productos celulares secretados por la ínter-
fase materno-fetal, que incluyen trofoblas­
tos, células deciduales y linfocitos presentes
en el endometrio.
Un número elevado de factores asociados al
trofoblasto han sido propuestos como agentes
inmunomoduladores involucrados en la sobre­
vida de la unidad feto-materna, posiblemente
inhibiendo el efecto de eitotoxicidad T aioge-
neica hacia los aloantígenos expresados en el
trofoblasto. Estos factores pueden ser clasifica­
dos en dos categorías; I) factores inmunosupre-
sores, II) factores inmunoestimuladores.
I. Factores inmunosupresores:
Extractos obtenidos de sincitiotrofoblastos
tienen un efecto inmunosupresor sobre la res­
puesta proliferativa que ejercen distintos mitó­
genos, como la concanavalina A (Con A) y fito-
hemaglutinina (PHA), sobre linfocitos y células
alogeneicas en los cultivos mixtos de linfocitos.
Sobrenadantes de cultivos de trofoblastos pro­
venientes de placentas normales generaron in
vitro una población de linfocitos supresores, a
los que generalmente se considera responsables
de la tolerancia inmunológica. Estos sobrena­
dantes reducen también la actividad de las célu­
las NK contra células “blanco” K562. Efectos
similares fueron encontrados en roedores.
Extractos placentarios retardaron, en ratón, el
rechazo de un injerto tumoral alogeneico. Aná­
lisis serológicos mostraron que estos extractos
causaban una disminución en la producción de
anticuerpos fijadores de complemento como lo
es la IgG2 y un incremento en los anticuerpos
anafilácticos (IgGl). Estos extractos indujeron
una desviación en la respuesta contra aloantíge­
nos, así como también un aumento en la pro­
ducción de anticuerpos y células supresoras, fa­
voreciendo de este modo la sobrevida del feto.
A partir de cultivos de células de coriocarci-
noma humano se identificó un complejo protei­
co de PM 150-200 kD que inhibe la transfor­
mación linfocitaria producida por la PHA y por
el toxoide tetánico. Parecería que estos factores
Inmunología de la reproducción 691
sólo suprimen la función proliferativa de célu­
las inm unocompetentes sin afectar su activ a­
ción ni su diferenciación. Estos factores serían
semejantes a los derivados de los trofoblastos
humanos.
Factores inmunosupresores
no específicos
a) Hormonas. Las hormonas esteroideas se
incrementan durante la gestación e influyen en
la reactividad inmunológica. Estas hormonas,
producidas inicialmente por el cuerpo lúteo ba­
jo el estímulo de la gonadotrofina coriónica y a
partir del 7® mes por la placenta, desempeñan
una importante función en el mantenimiento de
la gestación. La progesterona actúa inhibiendo
las contracciones del miometrio, bloquea la ac­
tividad de la colagenasa uterina, m odifica la
actividad de las enzimas proteolíticas y afecta
además a la respuesta inmune. Hay evidencias
de que altas concentraciones de progesterona
son capaces de prolongar la sobrevida de un in­
jerto de piel xenogeneico y alogeneico, habién­
dose logrado además prolongar la sobrevida de
células tumorales xenogeneicas en el útero de
un hámster aplicando un tratamiento con pro­
gesterona. Si éste es suspendido aparece inm e­
diatamente el rechazo.
Tanto los estrógenos como la progesterona
suprimen in vivo e in vitro, las reacciones in­
munes. La progesterona inhibe la incorpora­
ción de 3H-timidina por los linfocitos estim ula­
dos con PHA; este efecto se produce al iniciar­
se el cultivo, lo que indicaría que esta horm ona
inhibe el proceso de activación inicial de la mi-
togénesis de las células T. La progesterona en
combinación con la prostaglandina E (PGE) (la
que aumenta en el endometrio y en la decidua)
tiene un efecto sinergístico sobre la respuesta
mitogénica de linfocitos periféricos humanos.
Los niveles de las hormonas esteroideas en
suero y en placenta no son suficientes com o
para ejercer un efecto directo sobre los' linfoci­
tos. El nivel de estas hormonas en el útero y en
la interfase materno-fetal es mayor que en san­
gre periférica, por lo que cada una de ellas po­
dría regular desde allí la respuesta inmune. N i­
veles elevados de estas hormonas en la vecin­
dad de la placenta participarían en la sobrevida
fetal, actuando como un factor inmunosupresor
local no específico. Se podría pensar tam bién
que estas hormonas puedan afectar indirecta­
mente a la respuesta inmune, induciendo la sín­
tesis de proteínas o glucoproteínas con propie­
dades inmunosupresoras, como así tam bién la
producción tímica de células o factores inm u-
norreguladores.
La gonadotrofina coriónica humana (hCG )
es una glucoproteína de PM 46 kD producida
692 Inmunopatología

durante la gestación por los sincitiotrofoblas­ timocitos murinos dependiente de IL-1. Estos
tos. Esta horm ona es capaz de inhibir la res­ factores bloquean la capacidad de la IL-I de es­
puesta linfocitaria a la PHA, como también la timular la proliferación linfocitaria, inhibiendo
respuesta de células alogeneicas. No presenta además, en humanos, la mitogénesis de los lin­
efectos citotóxicos sobre los linfocitos. En un focitos T de sangre periférica sin afectar la sín­
comienzo se pensó que la inoculación de esta tesis de IL-2.
hormona prolongaba la sobrevida de un injerto
de piel y disminuía la incidencia de enferme­ II- Factores inmunoestimuladores
dad injerto-huésped. Experiencias posteriores
dem ostraron que ese efecto era debido a un Las células placentarias tienen la capacidad
contaminante presente en las muestras ensaya­ de secretar diferentes factores solubles con ac­
das, proveniente de la orina, a partir de la cual tividad inmunestimuladora, favoreciendo el de­
se hacían las purificaciones. Esta sustancia fue sarrollo de tejido placentario. Entre ellos pode­
identificada y se la denominó “Urom odulin”, mos citar a algunas citoquinas que actúan sobre
con capacidad para bloquear eventos tem pra­ la diferenciación celular, como son la IL-1 y la
nos en la proliferación de células T y de regular IL-6, a los factores estimuladores de colonias
la actividad de la IL-1. GM-CSF y M-CSF, al TNF (factor de necrosis
b) Proteínas y glucoproteínás. Existe una tumoral), interferón (INF).
serie de proteínas y glucoproteínás de origen La IL-1 y la IL-6 son glucoproteínás de PM
placentario, cuyas propiedades biológicas toda­ 17 kD y 26 kD, respectivamente, que presentan
vía se encuentran en estudio, a las que se les múltiples actividades biológicas. La IL-1 actúa
atribuye actividad inmunosupresora. induciendo la secreción de IL-6 en diferentes
- a^-glucoproteína asociada a la preñez (a^- sistema celulares, entre ellos fibroblastos, célu­
PAG). Su PM es 360 a 380 kD. Su efecto in­ las endoteliales y células endometriales. Estas
munosupresor es preferentemente sobre la res­ interleuquinas son producidas por los trofoblas­
puesta mediada por linfocitos T. tos y regulan la secreción de hCG por dichas
- Pj-glucoproteína específica de la preñez células.
(Pi-PSG). Es sintetizada también por el sinci- El T N F -a ha sido detectado en sobrenadan­
tiotrofoblasto y alcanza su máxima concentra­ tes de tejidos placentarios y deciduales, así co­
ción al final de la preñez. Su PM es 90 kD. Se mo también en líquido amniótico. Si a las célu­
encuentra en muy baja concentración en el sue­ las trofoblásticas se las estimula con T N F -a e
ro materno, por lo que se sugiere que su efecto IL-1, hay aumento de IL-6 y por ende un au­
supresor sea efectuado localmente, en la inter­ mento en la secreción de hCG, lo que indica
fase materno-fetal. que dichos factores regularían los niveles de
- Proteína A plasmática asociada a la preñez secreción de IL-6 por esas células.
(PAPP-A). Es una macroglobulina de PM 750 Se ha determinado la presencia de IN F -a “li-
kD, sintetizada por el trofoblasto. k e” sobre las células trofoblásticas. Teniendo
- Proteína placental 14 (PP14). Fue aislada en cuenta que las células placentarias presentan
de placenta y tiene una estructura similar a las receptores específicos para IN F-a, se considera
otras proteínas asociadas a la preñez. que el IN F -a “like” funcionaría como regula­
Estas sustancias presentan un potente efecto dor fisiológico de los procesos celulares de la
inm unosupresor sobre la proliferación celular placenta, participando de esta manera en la re­
inducida por aloantígenos o por mitógenos y gulación de la proliferación de tejidos previa­
sobre el cultivo mixto de linfocitos. La PPM m ente estim ulados por los factores de creci­
presenta además un efecto inhibitorio sobre la miento.
secreción de IL-1 y sobre la producción de IL- El factor M-CSF, originalmente identificado
2 por linfocitos estimulados con PHA. como factor de crecim iento hem atopoyétieo,
- F actor transform ante del crecim ien to -p indispensable para la proliferación, diferencia­
(TGF-p, “transforming growth factor”). Es un ción y sobrevida de las células mononucleares,
polipéptido multifuncional de PM 25 kD, com­ fue identificado en el útero y su nivel aumenta
puesto de 2 subunidades de 12,5 kD cada una. l.OOO veces durante la gestación. Fue detectado
Es producido por células neoplásicas, por célu­ en placenta de rata y en el tracto reproductivo
las hematopoyéticas y por células asociadas a de ratones preñados. Recientemente se demos­
los órganos de la reproducción. En efecto, las tró la expresión de un gen para el factor M-
células placentarias, las células deciduales y las CSF en placenta y decidua, lo que indicaría la
células granulosas del ovario producen este posible regulación, por parte de este factor, del
factor. Su acción es muy similar a los factores crecimiento y diferenciación de las células en
inmunosupresores derivados de los cultivos de la interfase materno-fetal.
trofoblastos. Tanto el TGF-P, como su homólo­ Como dijéramos anteriormente, la placenta
go el TGF-p 2 suprimen la proliferación de los secreta factores que modulan in vivo e in vitro

la calidad y cantidad de la síntesis de anticuer­
pos. Estos factores, inducen una síntesis prefe-
rencial de anticuerpos IgG asimétricos los que,
dado su particular comportamiento biológico,
contribuirían al mantenimiento de la unidad fe­
to-placentaria.
FACTORES LINFOCITARIOS
M O D U LA D O R ES DE LA RESPUESTA
INM UNE
Además de los factores placentarios citados
anteriorm ente existen factores linfocitarios
moduladores de la respuesta inmune.
Szekeres-Bartho y col. demostraron que lin­
focitos CD8+ provenientes de mujeres embara­
zadas presentan receptores para progesterona
(PRs). El porcentaje de linfocitos PRs positi­
vos aumenta a lo largo de las gestas que trans­
curren normalmente mientras que abortos es­
pontáneos o abortos recurrentes van asociados
a una alteración en el número de dichos linfo­
citos.
El estudio y caracterización de estos recep­
tores demostraron que es una proteína de PM
80-100 kD formada por 3 dominios: la región
N-terminal, la región central rica en cisteína y
la región C-terminal. El dominio central es el
responsable de la unión del receptor al ADN,
el dominio C-terminal es la estructura de unión
de la horm ona con funciones de traslocación
nuclear y el N-terminal contiene los determi­
nantes antigénieos. La mayoría de los anticuer­
pos están dirigidos contra esta región proteica.
Los linfocitos CD8+ de mujeres em baraza­
das que presentan PRs, en presencia de la hor­
mona secretan un factor con propiedades mo-
duladoras de la respuesta inmune. Este factor
es una proteína de 34 kD con capacidad para
inhibir la lisis mediada por células NK, de in­
hibir la proliferación de cultivo mixto de linfo­
citos y de generar células con fenotipo y fun­
ciones supresoras. Esta proteína aparece en el
suero de mujeres que transcurren con embara­
zos normales; su nivel dism inuye considera­
blemente si hay abortos o amenazas de abor­
tos. Esto indicaría una estrecha relación entre
esta proteína y el éxito de la gestación.
Es posible inducir la expresión de PRs+ en
poblaciones linfoideas por estim ulación con
m itógenos o por acción de aloantígenos. Se
han detectado células PRs+ en pacientes poli-
transfundidos y en aquellos que fueron someti­
dos a trasplantes hepáticos.
Este factor no solo tiene efecto modulador
in vitro de la respuesta inmune, sino que pre­
senta in vivo efecto antiabortivo. Si sobrena­
dante de linfocitos de ratones preñados estim u­
lados con progesterona se inyecta en ratones
Inmunología de la reproducción 693
que presentan un alto grado de resorción fetal,
como es la cruza CBA/2 x DBA/j, se observa
una disminución en el grado de resorción. Este
efecto no se logra si los linfocitos provienen
de ratones vírgenes. Un efecto contrario puede
observarse si a ratones preñados norm ales se
les administra bloqueantes de los PRs com o es
el RU486, de manera que la hormona no pueda
actuar y por ende no se pueda secretar el factor
modulador.
Trabajos realizados en nuestros laboratorios
han demostrado que el sobrenadante de cultivo
de células linfoides provenientes de bazo de
ratas, obtenidos al día 10 de preñez alogeneica
(W istar X Fischer) modulan in vitro la produc­
ción de anticuerpos IgG l anti-DNP simétrico
y asim étrico por células de hibridom a. E ste
efecto no se m anifiesta si los leucocitos son
previam ente incubados con progesterona. El
añadido de 5% de sobrenadante leucocitario a
las células del hibridoma produjeron un in cre­
mento del 70%, respecto del control, en la se­
creción de moléculas Ig G l asimétricas, y un
aum ento del 10% en la producción to tal de
Ig G l. Si el sobrenadante provenía de leucoci­
tos previamente incubados eon la hormona, las
células de hibridom a redujeron la síntesis de
IgG l anti-DNP asimétricas en un 9% y en un
18% la producción total de moléculas de an ti­
cuerpo.
Los resultados expuestos, provenientes de
experiencias in vivo e in vitro, indican que la
placenta y los linfocitos de hembras preñadas
secretan factores que increm entan la p ro p o r­
ción de moléculas IgG asimétricas, las que, d a­
do su co m portam iento b io ló g ico p a rtic u la r
(bloqueante), si expresan actividad anti-antíge-
nos paternos participarían activamente en los
mecanismos de protección del feto durante la
preñez.
Por otra parte, se podría presum ir que la
progesterona, al actuar sobre los PRs citosóli-
cos presentes en las células linfoideas, pondría
en marcha un mecanismo modulador de la sín ­
tesis de moléculas simétricas y asimétricas in ­
ducida por los linfocitos de las hembras p reñ a­
das.
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METODOLOGÍAS

IV
Métodos utilizados para la identificación
y cuantificación de antígenos y anticuerpos

RICARDO MARGNI

PRECIPITACIÓN
de tubos 0,2 mi del suero precipitante, añadien­
CUALITATIVA do luego por las paredes 0,2 mi del material a
investigar en diluciones 1:1, 1:2, 1:5 y 1:10.
Dejar en baño de agua a 37“C durante una hora
Precipitación en medios líquidos y observar si en alguno de ellos aparece un p re ­
cipitado anular blanco.
Puede hacerse mezclando volúmenes igua­ 2. Cuando se desea identificar un antígeno:
les de las soluciones de antígeno y anticuerpo. colocar en una serie de tubos 0,2 mi de los d is­
La aparición de turbidez indica reacción posi­ tintos sueros precipitantes, añadiendo luego por
tiva. las paredes 0,2 mi del material sospechoso. In ­
No obstante, el método más utilizado es el cubar a 37°C durante una hora e investigar la
del anillo, basado en la reacción interfásica que aparición de anillo blanco en alguno de ellos.
se produce cuando en un pequeño tubo se colo­
can sucesivamente, y evitando que se mezclen, El tubo que dé reacción positiva indicará co ­
las soluciones de antígenos y anticuerpos que rrespondencia entre el antígeno y el respectivo
se corresponden. Es conveniente, para evitar anticuerpo.
redisoluciones, que los reactivos se encuentren En todos los casos es indispensable colocar
en concentraciones equivalentes. tubos testigos con solución salina y cada uno
de los reactivos (fig. 9-1).
M aterial necesario
Precipitación en medios gelosados
a) Sueros precipitantes, clarificados por cen­
trifugación. IN M U N O D IF U S IÓ N
b) Antígenos: si están en solución, se em ­
plean como tales. Si fueran productos insolu­ 1. Precipitación en tubos (método de Ou-
bles sospechosos de contener antígenos solu­ din)'
bles, se los trata con solución salina fosfatada
para solubilizar. Centrifugar para clarificar. Material necesario
c) Solución salina fosfatada: solución de clo­
ruro de sodio 0,15 M, fosfatos 0,01 M, pH 7,2. a) Agar purificado para uso inmunológico al
d) Tubos de 5 X 0,3 cm. 1% en solución de cloruro de sodio 0,15 M y
e) Pipetas Pasteur. 0,01% de Merthiolate.
f) Gradillas; baño termostatizado; centrífuga. b) Agar al 0,5% en el mismo 'diluyente.
c) Antígenos a estudiar.
Método d) Sueros precipitantes o anticuerpos p u rifi­
cados correspondientes.
1. Cuando se desea saber si un antígeno d e­ e) Pipetas de 1 mi.
terminado está presente: colocar en una serie f) Tubos de 5 X 0,5 cm.
698 Metodologías
Método
En pequeños tubos de hem ólisis m ezclar
partes iguales de agar al 1% fundido y enfriado
a 50°C y suero precipitante. Transferir 1 mi de
la mezcla al tubo de reacción, enfriando rápida­
m ente para que solidifique. Inm ediatam ente
después añadir 0,5 mi de agar al 0,5% fundido
y enfriado a 50"C, y luego de la solidificación
agregarle 1 mi de una mezcla en partes iguales
de agar al 1% y antígeno.
Después de la solidificación, los tubos, con­
venientemente tapados para evitar evaporacio­
nes, son dejados a temperatura ambiente 24-48
horas para la lectura de los resultados (figs. 9-8
y 9-9).
2. Precipitación en placas (Método de Oueh-
terlony)^
Material necesario
a) Agar purificado al 1,5%, en solución de
cloruro de sodio 0,15 M y 0,01% de M erthiola­
te o agarosa al 0,8%.
b) Sueros precipitantes.
c) Soluciones de antígenos a estudiar.
d) Placas de Petri o portaobjetos.
e) Pipetas de 1 mi y 10 mi.
f) Pipetas Pasteur.
g) Sacabocados o matrices especiales para
la confección de los orificios sobre el gel de
agar.
Método
En caja de Petri estéril se vierten 15 mi de
agar fundido y enfriado a 50°C. Se deja solidi­
ficar y se confeccionan los orificios de 5 mm
de diámetro, que deben distar 1 cm entre sí. Si
se usaran portaobjetos, se añade a cada uno 2,5
mi de agar, y la distancia entre los orificios, de
2,5 mm de diámetro, debe ser de 5 mm.
Según los sistemas que se desee anahzar así
será la distribución de los antígenos y antisue­
ros en los orificios de las placas de agar con­
feccionadas (figs. 9-10, 9-11 y 9-12).
Las lecturas de los resultados se efectúan a
las 24-72 horas; las placas o portaobjetos se
mantienen en cámaras húmedas.
Si interesa conservar los resultados, puede
colo reárselo s previa d esecació n , según las
instrucciones indicadas en inmunoelectrofore­
sis.
Para obtener buenas reacciones de precipita­
ción eo geles, tanto en tubos como en placas,
los reactivos deben ser utilizados en diluciones
óptimas para evitar la solubilización de los pre­
cipitados por exceso de reactivos, en especial
de antígeno.
In m u n o e l e c t r o f o r e s is ^''*
M aterial necesario
a) Agar purificado para inmunoelectrofore­
sis. Existen en el comercio agares elaborados
que reúnen las condiciones de pureza necesa­
rias para su uso (Agar Difeo, Ion Agar, Agar
Noble, etc.). En caso contrario, el agar debe ser
sometido a lavado y precipitaciones alcohólicas
para eliminarle todas aquellas sustancias que
pudieran interferir en la reacción.
Con el agar se prepara una solución acuosa
al 2,5%, que en el momento del uso, previa fu­
sión, se mezcla con partes iguales del buffer
usado para la eleetroforesis.
Puede usarse agarosa a la concentración fi­
nal del 0,8%. En este gel los fenómenos elec-
troendosmóticos están minimizados, hecho que
debe tenerse en cuenta en la interpretación de
los resultados.
b) Buffer para eleetroforesis: se prepara disol­
viendo 11 g de Veronal sódico en 900 mi de
agua destilada. Se añade luego HClN hasta pH
8,4 (aproximadamente 16 mi), y se completa
con agua hasta un litro. Su fuerza iónica es 0,05.
c) Portaobjetos desengrasados. Para evitar
cjue el agar o la agarosa se desprenda de los
portaobjetos, conviene pretratarlos cubriéndo­
los con una pequeña película de agar al I % en
NaCl 0,15 M o agarosa al 0,5% en el mismo
diluyente. Los portaobjetos desengrasados cu­
biertos con una delgada capa de gel, bien ex­
tendida sobre la superficie con un hisopo, son
secados en estufa a 50°C. Una vez secos se los
envuelve en papel de aluminio y se los conser­
va en heladera hasta el momento de ser usados.
Los geles preparados sobre estos portaobjetos
quedan adheridos y no se desprenden.
d) Matrices para confeccionar los orificios
de siembra y las canaletas de precipitación.
e) Pipetas Pasteur.
f) Pipetas graduadas en lam bdas para las
siembras de las muestras.
g) Cubas para las corridas electroforéticas.
h) Fuente de poder estabilizada capaz de su­
ministrar una tensión de 0-400 voltios y 0-50
miliamperios.
i) Solución salina para lavado: cloruro de so­
dio 0,15 M.
j) Soluciones colorantes: existen varias, sien­
do recomendables las siguientes proteínas:
I) Fucsina á c id a .............................. 0,5 g
Alcohol 96°.................................. 250 mi
Agua destilada............................ 200 mi
Ácido acético............................... 50 mi
II) Negro am ido................................ 100 mg
Acido acético................................ 20 mi
Agua destilada.............................. 980 mi
 Métodos utilizados para ia identificación y cuantificación de antígenos 699

Para coloraciones de glucoproteínás, Upo- d) Suero a valorar clarificado por centrifuga­

proteínas o sustancias con actividad específica, ción, adicionado a EDTA 7 mg • m i '.
pueden emplearse otros métodos de tinción. e) Solución del poüósido específico (500 |j,g
k) Decolorantes: se utiliza ácido acético al • m i '), clarificada por centrifugación.
25% en metano) al 50%. f) Solución de hidróxido de sodio 0,1 N.
g) Baño termostatizado, gradillas, centrífuga,
Método refrigeradora.
h) Espectrofotómetro,
Se preparan las placas y se añaden 2,5 mi de
la m ezcla agar-buffer por cada portaobjeto. M étodo
Mediante la aplicación de las matrices corres­
pondientes se confeccionan los esquemas ade­ La valoración se efectúa en tubos de hem óli­
cuados. Se colocan las placas en los soportes y sis de acuerdo con el siguiente esquema:
con pequeños trozos de papel de filtro embebi­
dos en buffer se efectúan los puentes que unen Suero Antígeno añadido S o lu ció n
las placas con las cubas. Se colocan las m ues­ precipi- ~ sa lina
tras a analizar en los orificios de siembra y, he­ T ubo tante (mi) (mi) (Mg) (m i)
chas las conexiones, se pone en funcionamien­ 1 0,5 0,05 25 0,45
to la fuente de poder, aplicando una corriente 2 0,5 0,10 50 0,40
de aproximadamente 6 v/cm. Con 75 minutos 3 0,5 0,15 75 0,35
de corrida se consigue una buena separación 4 0,5 0,20 100 0,30
5 0.5 0,25 125 0,25
electroforética. 6 0,5 0,30 150 0,20
Luego de esto, se separan las placas, se eli­ 7 0,5 0,35 175 0,15
mina el agar de las canaletas en las que se colo­ 8 0,5 0,40 200 0,10
ca el inmunosuero y se las deja en cámara hú­ 9 0,5 0,45 225 0,05
10 0,5 0,50 250 -
meda por 24-48 horas para que la precipitación
entre los antígenos y anticuerpos se produzca.
Para conservar los resultados las placas pue­
den ser directamente fotografiadas o secadas y In c u b a r ' e n b a ñ o d e a g u a a 37“C d u r a n te 1
coloreadas para su conservación. En este caso, hora, y 24 horas a 4 “C en refrigeradora.
estas placas deben ser previamente lavadas por Centrifugar, volcar los sobrenadantes y lavar
inmersión en solución salina, donde se las deja los precipitados tres veces con solución salina
24-48 horas, con recambios cada 12 horas. El tamponada. Finalmente, escurrir los tubos por
lavado es necesario para eliminar la proteína no inversión sobre papel de filtro, disolviendo los
precipitada. Luego de lavadas, se cubren las precipitados en 2 mi de NaOH 0,1 N. Leer al
placas con un trozo de papel de filtro húmedo y espectrofotóm etro a 280 nm. Las DO leídas,
se dejan a tem peratura ambiente hasta seque­ multiplicadas por 2 (dilución) y por el factor
dad. Se retira el papel y se las sumerge en la correspondiente a la inmunoglobulina de la es­
solución colorante (15 minutos para la I y una pecie animal que se analiza (10/E '*,^,^), dan
hora para la II). El exceso de colorante se eli­ los valores del contenido proteico (anticuerpo)
mina por inmersión en la solución decolorante de cada tubo. Con ellos se confecciona la curva
y se procede luego al secado, que puede acele­ de precipitación y se grafican mg de anticuerpo
rarse colocándolas en una estufa a 50“C (figs. en el precipitado (0,5 mi de suero) versus |J,g de
9-15, 9-16 y $-17). antígeno añadido, lo que permite determinar el
título de los anticuerpos. La figura 9-3 y el cua­
dro 9-1 corresponden a una valoración de anti­
CUANTITATIVA cuerpos antipoliósido neumocócico tipo III.
Los factores de conversión de inmunoglobu­
Valoración de anticuerjpospor curva linas de diferentes especies anim ales se en­
de precipitación cuentran en el Apéndice III.

Cua n d o e l a n tíg e n o n o c o n tie n e n itró g e n o C u a n d o e l a n t íg e n o e s u n a e r o t e ín a

(P O L I Ó S I D O S M I C R O B IA N O S )^ C O M P L E J A (O V O A L B Ú M IN A , S E R O A L B Ú M IN A
B O V IN A , E T C ./ ’
M aterial necesario
M aterial necesario
a) Tubos de hemólisis.
b) Pipetas de I mi, 2 mi y 5 mi. a) Tubos de hemólisis.
c) Solución salina tamponada (cloruro de so­ b) Tubos de 5 X 0,3 cm
dio 0,15 M, fosfato 0,01 M, pH 7,2). c) Pipetas de 1 mi, 2 mi y 5 mi.
700 ' Metodologías
d) Pipetas Pasteur.
e) Solución salina tamponada (cloruro de so­
dio 0,15 M, fosfato 0,01 M, pH 7,2).
f) Suero a valorar clarificado por centrifuga­
ción, adicionado a EDTA 7 mg • m h ’.
g) Solución del antígeno específico (500
|j,g-ml-l) clarificado por centrifugación.
h) Solución de hidróxido de sodio 0 ,1 N.
i) Baño termostatizado, gradillas, centrífuga,
refrigeradora.
j) Espectrofotómetro.
Método
Se efectúa en tubos de hemólisis utilizando
el esquem a indicado en el m étodo anterior.
Terminada la incubación de 24 horas a 4°C, los
tubos se centrifugan y se separan los sobrena­
dantes de los precipitados. Con los precipitados
se procede del mismo modo indicado anterior­
mente, y se determina el contenido proteico de
cada tubo (anticuerpo y antígeno). Con cada
sobrenadante se efectúan precipitaciones zona­
les por el método del anillo descrito, frente a
antígeno y anticuerpo, a efectos de establecer
la zona de equivalencia (tubo en el que la pre­
cipitación sea negativa para ambos). Estableci­
do ello, al contenido proteico total del tubo, de­
terminado por espectrofotometría, se le resta la
proteína antigénica añadida ya conocida, y di­
cha diferencia corresponderá a la proteína anti­
cuerpo contenida en 0,5 ml de suero.
Para la conversión de la DO en mg de proteí­
na se utilizan los factores correspondientes a
las respectivas inm unoglobulinas, dado que
siendo las relaciones Ac/Ag aproximadamente
10 a 1, la proteína antigénica influye muy poco
en los resultados (cuadro 9-3).
C u a n d o e l a n t íg e n o e s u n a p r o t e ín a
M ARCADA CON UN HAPTENO CUYA MÁXIMA
ABSORCIÓN BSPBCTROFOTOMÉTRICA
SE PRODUCE A UNA LONGITUD DE ONDA
DISTINTA DE 280 NM (PROTEÍNAS MARCADAS
CON DINITROFENOL, ÁCIDO SULFANÍLICO, ETC.)’
Para la descrición del método se tomará co­
mo ejemplo un suero de conejo obtenido por
inmunización con gammaglobulina humana di-
nitrofenolada (HGG-DNP) y como antígeno,
albúm ina bo v in a m arcada con d in itro fen o l
(BSA-DNP), ya que interesa valorar anticuer­
pos antidinitrofenol (a-DNP).
Material necesario
a) Tubos de hemólisis.
b) Pipetas de 1 ml, 2 m l y 5 ml.
c) Solución salina tamponada (cloruro de so­
dio 0,15 M, fosfato 0,01 M, pH 7,2).
d) Suero a valorar clarificado por centrifuga­
ción, al que se le añaden 7 mg • m h ‘ de EDTA
para evitar la coprecipitación del complemento.
e) Solución de BSA-DNP (500 |ig • m h ‘)-
D ebe contener no menos de 30 grupos DNP
por mol de BSA. Para su preparación, véase el
capítulo 44.
Considerando que el antígeno incorpora pro­
teína al precipitado, para calcular la proteína
anticuerpo es necesario determinar el factor de
corrección del antígeno a usar. Para ello se pre­
paran cuatro diluciones del mismo en solución
salina tamponada, que contengan 100, 200, 300
y 400 |Tg • m l l a s que se mezclan con un vo­
lumen igual de NaOH 0,1 N. Se deja 15 minu­
tos en reposo para estabilizar y se lee al espec­
trofotómetro a 280 nm y 360 nm. Los resulta­
dos obtenidos se grafican y con ellos se deter­
mina el factor de corrección. La figura 35-1 co­
rresponde a una determinación experimental.
f) Solución de hidróxido de sodio 0,1 N.
g) Baño termostatizado, gradillas, centrífuga,
refrigeradora.
h) Espectrofotómetro.
Método
La valoración se efectúa en tubos de hemóli­
sis siguiendo el mismo esquema indicado para
antígenos proteicos complejos (ovoalbúmina,
seroalbúmina bovina, etc.). Los precipitados,
una vez disueltos en 2 ml de NaOH 0,1 N, son
leídos en el espectrofotóm etro determ inando
las DO a 280 nm y 360 nm. A las DO medidas
a 280 nm se les sustrae el valor que resulta de
multiplicar la DO a 360 nm por el factor de co-
iTección (proteína del antígeno). La DO a 280
nm resultante, m ultiplicada por el factor de
conversión correspondiente (A péndice III),
perm itirá conocer los miligramos de proteína
anticuerpo en el precipitado de cada tubo. Con
ellos se confecciona la curva de precipitación y
se determina la concentración de anticuerpo sé­
rico (fig. 9-4 y cuadro 9-2). Con las lecturas de
DO a 360 nm se calcula el antígeno presente en
cada tubo, lo que a su vez permite establecer
las relaciones Ac/Ag. Éstas sirven de control
ya que en la zona de equivalencia (m áxim a,
precipitación del anticuerpo) dicha relación es
aproximadamente 10.
Valoración de anticuerpos por floculación®
Este método se utiliza cuando el antisuero a
valorar es de origen equino (suero antidiftérico,
suero antitetánico, etc.). Como ya se ha indica­
do, en estos casos el precipitado que se deposi­
ta en forma de flóculos es soluble en exceso de
anticuerpo y de antígeno, y la zona de precipi­
tación es más estrecha (fig. 9-7).
 Métodos utilizados para la identificación y cuantificación de antígenos
Se tomará como ejemplo la valoración de un
suero antidiftérico (método de Ramón).
M aterial necesario
a) Tubos de hemólisis.
b) Pipetas de 1 mi, 2 mi y 5 mi.
c) T oxoide diftérico. Se utiliza un toxoide
estabilizad o valorado en L f (véase cap. 4).
Conviene diluirlo a 100 L f • mL'.
d) Suero antidiftérico a valorar clarificado
por centrifugación. Si no se tiene idea aproxi­
mada del título, conviene hacer la valoración
por duplicado, usando en una serie suero sin di­
luir y en la otra suero 1:5.
e) Solución salina tamponada (cloruro de so­
dio 0,15 M, fosfato 0,01 M, pH 7,2).
f) Baño termostatizado, gradillas, centrífuga.
Método
En una serie de tubos colocar cantidades fi­
jas de toxoide y cantidades crecientes de anti­
suero. Completar al mismo volumen con solu­
ción salina tamponada, mezclar para homoge­
neizar e incubar en baño de agua a 45“C hasta
floculación del primer tubo. Calcular el título
de suero analizado (cuadro 35-1).
Éste contendrá 100 L f de antitoxina, ya que
la floculación ocurre en aquel tubo en que antí­
geno y anticuerpo se encuentran en la zona de
equivalencia. Si el tubo en que aparece la flo­
culación inicial hubiese sido el N° 4, el título
del suero sería 100/0,4 = 250 L f • mL’.
Valoración de antígenos
por inmunodifusión radial®
M aterial necesario
a) Agar purificado para uso en inmunodifu­
sión. Con él se prepara una solución al 2% en
buffer de Veronal sódico pH 8,4 (el indicado
en inmunoelectroforesis, adicionado con 0,01%
de Merthiolate).
b) Antisueros específicos.
c) Antígenos patrones.
d) Placas de vidrio de 3 x 10 cm o similares.
En casos especiales pueden usarse portaobjetos.
e) Pipetas de 2 ¡il, 1 mi y 5 mi.
f) Sacabocados de 2 mm de diámetro o ma-
Cuadro 35-1
Tubos 1 2
Suero antidiftérico 0,1 0,2
Toxoide diftérico (100 L f • m i-') 1 1
Solución salina 0,9 0,8
' Los v o lú m en es in d icad o s c o rresp o n d e n a m i.
701
|ig DNP - BSA/ml
Fig. 35-1. G ráfica que perm ite d eterm inar con cu án ta p ro ­
teína contribuye el antígeno en los precipitados A g-A c. C o ­
rresponde a albúm ina bovina dinitrofenolada (D N P-B SA ).
trices especiales para la confección de los o rifi­
cios sobre las placas de agar.
Método
A ñadir 5-10% del antisuero específico al
agar fundido y enfriado a 50°C, procurando que
la m ezcla sea lo más hom ogénea posible (la
cantidad de antisuero a usar depende del conte­
nido en anticuerpos del que conste). Inm ediata­
mente cubrir la placa con una cantidad d e la
m ezcla capaz de producir una capa de gel de
1 mm de espesor y dejar en reposo hasta solidi­
ficación. Mediante el empleo del sacabocados
efectuar sobre el gel una serie de orificios, los
que deben estar situados a distancias co n v e ­
nientes para evitar interferencias. Se necesita
un orificio para la muestra a valorar y cuatro a
cinco orificios para las distintas concentracio­
nes del antígeno patrón, las que habrán de u tili­
zarse para la elaboración de la curva.
En un orificio de la placa se colocan 2 ^ I de
la solución antigénica a valorar, o dilución co n ­
veniente. En los orificios restantes son coloca­
dos 2 |i! de las diluciones del antígeno patrón
(idéntico al que se valora). Las placas se m an ­
tienen a temperatura ambiente, en cámaras h ú ­
medas, hasta que el halo de precipitación no
aumente.
La evaluación de los resultados se hace m e­
diante la determinación del diámetro de los h a ­
3 4 5 6 7 S 9 JO
0,3 0,5 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1
1 1 1 1 1 1 1 1
0,7 0,5 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 _
Incubar a 45° h asta floculación de! p rim er tubo
702 Metodologías

los de precipitación. Puede efectuarse sobre el g) Baño termostatizado, gradillas, centrífu­

material fresco o previa desecación y lavado de ga, refrigeradora.
manera similar a la indicada para inmunoelec­ h) Espectrofotómetro.
troforesis.
L a m edida directa de los diám etros de los Método
halos de precipitación es un método poco sen­
sible. Resulta más conveniente utilizar una am­ Utilizando el método indicado en Valoración
pliadora fotográfica. Colocando las placas en la de anticuerpos por curva de precipitación, de­
ranura donde se ubican los negativos, es posi­ terminar cuál es la dosis de antígeno que pro­
ble ampliar los halos convenientemente y me­ duce la máxima precipitación (zona de equiva­
dirlos sobre papel milimetrado. Con los valores lencia), usando para ello volúmenes fijos de 0,5
obtenidos se calculan los r^. mi de suero de conejo antidinitrofenol y canti­
Graficando los valores de r^ versus las res­ dades crecientes de seroalbúmina bovina dini­
pectivas concentraciones del antígeno patrón, se trofenoiada.
obtiene la curva que permitirá calcular la con­ Conocido ello, en una serie de tubos colocar;
centración antigénica de la muestra analizada. 0,5 mi de suero antidinitrofenol y cantidades
Si se hubiese valorado una solución de albú­ crecientes de hapteno (0,05 a 0,35 mi), comple­
mina bovina, y con un dilución de la solución tando todos los tubos a 0,85 mi con solución
de 1:100 se hubiese obtenido un r^ de 10 mm^, salina tamponada. Incubar 1 hora a 37“C en ba­
tomando como valores los de la curva patrón ño de agua. Añadir luego a cada tubo la canti­
de la figura 9-13 la concentración de albúmina dad de antígeno correspondiente a la zona de
bovina sería 0,6 x 100 = 60 mg • m L‘. equivalencia e incubar 1 hora a 37"C y 24 horas
a 4°C (cuadro 35-2).
Inhibición de precipitación por haptenos " Centrifugar, volcar los sobrenadantes y lavar
los precipitados tres veces con solución salina
Teniendo en cuenta que la reversibilidad de tamponada. Añadir a cada tubo 2 mi de NaOH
la reacción entre el hapteno y el anticuerpo es 0,1 N y después de 15 minutos leer las DO a
más manifiesta, aproximadamente cinco veces 280 nm. Considerando como 100% de precipi­
superior, que la correspondiente entre anticuer­ tación (0% de inhibición la lectura del tubo
po y antígeno, constituye éste un dato importan­ N°8), calcular sobre la base de las lecturas ob­
te que no debe olvidarse cuando se hacen cálcu­ tenidas en los otros tubos los correspondientes
los teóricos previos para estos tipos de ensayos. porcentajes de inhibición.
Se tomará como ejemplo suero de conejo an- Al realizar el gráfico del “porcentaje de inhi­
tidinitrofenol, obtenido por inm unización con bición” versus “|i,g de hapteno añadido”, puede
gammaglobulina humana dinitrofenoiada. elaborarse la correspondiente curva (fig. 9-6),
Conviene incluir como testigos un tubo con
M aterial necesario un sistema Ag-Ac distinto del reactivo (en este
caso ovoalbúmina-antiovoalbúmina) y otro con
a) Anticuerpo: suero de conejo antidinitro- el mismo sistema y el hapteno en estudio para
fenol conteniendo aproximadamente 3 a 4 mg ■ descartar el poder inhibitorio inespecífico que
m i ' de anticuerpo. éste pudiera tener.
b) Antígeno: seroalbúmina bovina dinitrofe­
noiada al 0 ,1% en solución salina tamponada. E lectroforesis, inmunoelectroforesi
c) Hapteno específico: solución de dinitro­ se inm unodifusión rad ial cuan titativ a
fenol 0,001 M en solución salina tamponada. en acetato de celulosa**
d) Solución salina tam ponada; cloruro de
E l e c t r o f o t r e s is
sodio 0,15 M, fosfato 0,01 M, pH 7,2.
e) Tubos de hemólisis. El acetato de celulosa como soporte de corri­
f) Pipetas de 1 mi y 10 mi. da tiene mayor poder resolutivo que el papel.

Cuadro 35-2
Tubos I 2 5 4 5 6 7 8

A ntisuero 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

H apteno (0,001 M) 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 . -
S olución salina 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 _ 0,35
Incubar a 37“C durante una hor a
A ntígeno (dosis óptim a) 0,5 ' 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Incubar 1 hora a 37'C y 18 horas a 4"C
" L o s v o lú m en es in dicados co rresp o n d e n a m i.
 Métodos utilizados para la identificación y cuantificación de antígenos 703

Puede usárselo también con muy buenos resul­ locada en la cuba. En estas condiciones el tiem ­
tados para inmunoelectroforesis. El acetato de po de corrida óptimo es de 55 minutos.
celulosa gelatinizado (“C ellogel” de Cheme- e) Después del fraccionamiento proteico, su­
tron, Milán) es recomendable. mergir las tiras en la solución colorante durante
5 m inutos, y decolorar luego con la solución
M aterial necesario decolorante. Normalmente, con tres recambios
se consigue una buena decoloración de las p ar­
a) Tiras de acetato de celulosa (Cellogel 2,5 tes libres de proteínas.
X 17 cm). f) Si se desea hacer cuantificación, puede lo­
b) Buffer Veronal-Veronal sódico: grarse por densitometría o elución. En este íilti-
mo caso cortar las fracciones proteicas, co lo ­
Veronal sódico 10,30 g carlas en tubos de ensayo y disolverlas en un
Veronal 1,34 g volumen fijo de ácido acético a f 80%. Leer en
Agua destilada hasta 1.000 mi el esp ectro fo tó m etro a 620 nm . Usar co m o
Ajustar a pH 8,6 blanco un trozo de la tira de acetato de celulosa
procesada, que no contenga proteínas, disuelta
c) Solución colorante: en ácido acético al 80%.
Los cálculos de los porcentajes de las distin­
Amidoschwartz 10 B 0,5 mg tas fracciones proteicas de la muestra se hacen
Metanol 35 mi relacionando directamente las DO (620 nm). Si
Agua destilada 45 mi se conoce la concentración proteica de la m ues­
Acido acético glacial 10 mi tra analizada, los porcentajes hallados pueden
transformarse en valores absolutos.
d) Solución decolorante: ácido acético al 5% La cuantificación de las fracciones puede ha­
en agua. cerse también mediante el empleo de un densi-
e) Baño deshidratante: metanol puro. tómetro adecuado.
f) Baño de transparencia: g) Si las corridas electroforéticas efectuadas
son para estudios cualitativos, conviene transpa-
Metanol 87 mi rentizar el material. Para ello, las tiras decolora­
Acido acético 12 mi das segiín se indicó en e) son deshidratadas por
Glicerina I mi inmersión en metanol durante 30 segundos, de
inmediato se las coloca en la solución de trans­
g) Líquido de elución: ácido acético al 80% parencia durante 60 segundos, agitando m anual­
en agua destilada (v/v). mente. Retirarlas y colocarlas sobre una placa
h) Cubeta para eleetroforesis: con puente so­ de vidrio limpia; eliminar el exceso de líquido
porte de 11 cm y 8,5 cm. Resulta muy iitil el de transparencia. Llevar a estufa a 60“C o poner
modelo 2 PAC/5 (Chemetron). la placa de vidrio bajo una lámpara de rayos in­
i) Fuente de poder estabilizada capaz de su­ frarrojos hasta completar la transparentización.
ministrar 0-400 voltios y 0-50 mA. Dejar a temperatura ambiente hasta la pérdida
j) Dispositivo para las siembras. completa de la humedad (figs. 9-17 y 35-2).

Método 1 N M U N O E I.E C T R O F O R E S L S

a) Las tiras de acetato de celulosa, que se M aterial necesario

conservan sumergidas en metanol al 40%, de­
ben ser lavadas previamente con solución buf­
fer para eliminar todo vestigio de alcohol que
pudiera desnaturalizar las proteínas.
b) Sacar las tiras del buffer y secarlas entre
dos hojas de papel de filtro. Extenderlas sobre
el soporte (puente de 11 cm), con la superficie
absorbente hacia arriba.
c) Utilizando un sembrador adecuado, depo­
sitar a 2,5 cm del extremo catódico 3,5 |ll de la
muestra a analizar. La concentración proteica
debe ser ajustada a 50-70 mg • mL‘ si se trata
de una mezcla de sustancias. Para productos
puros, 10-30 mg ■mL*.
d) Fíacer pasar una corriente de 200 V fijos y
2,5 mA por cada tira de acetato de celulosa co-
a) Micropipetas de 2,5 y 25 [J,!.
b) Solución salina: cloruro de sodio 0,15 M.
c) Plantilla guía para depósito de las m u es­
tras a analizar y los antisueros.
d) Antisueros específicos.
e) El resto de material necesario es el indica­
do en eleetroforesis en acetato de celulosa.
Método
C olocar las tiras lavadas con buffer en el
puente soporte de 8,5 cm. De acuerdo con los
esquemas indicados en la figura 35-3, sem brar
2,5 |ll de muestra a analizar. Efectuar el íxac-
cionamiento proteico en las condiciones indica-
704 Metodologías

que la línea de depósito sea lo más fina posible

y guarde las relaciones de distancia indicadas.
Colocado el antisuero se cortan los extremos
de las tiras de acetato de celulosa (para evitar
que contacten con el líquido de la cámara de
difusión) y se las deja en su interior para que
actiíe como cámara hiimeda. El tiempo de difu­
sión no debe ser superior a 18-24 horas. Finah-
zado éste, retirar las tiras de la cámara htimeda
y lavarlas con solución salina durante dos ho­
ras, agitando, con el objeto de eliminar el exce­
so de antisuero y proteínas que no han precipi­
tado. Durante esta operación conviene recam­
biar 3-4 veces la solución de lavado.
Colorear y transparentizar como se indicó en
electroforesis (fig. 9-17).

C u a n t if ic a c ió n d e p r o t e ín a s
POR INMUNODIFUSIÓN RADIAL
EN ACETATO DE CELULOSA

El principio del método es el descrito para

inmunodifusión radial en agar.

F ig . 3S-2. Electroforesis en acetato de celulosa de tres sue­ M aterial y método

ro s de pacientes con m ielom a. Las inm unoglobulinas son
IgG m onoclonales con diferente carga neta, de ahí su dis­
tinta m ovilidad electroforética.
das anteriormente (200 V, 2,5 mA por tira, 55
minutos de corrida).
Finalizado ei fraccionamiento, dejar las tiras
sobre el puente soporte y, empleando la planti­
lla guía o una reglilla, depositar con una pipeta
de 25 |0,1 el antisuero específico. La cantidad
depende del título de anticuerpos del antisuero.
Generalmente son necesarios 50 ¡jl (2 pipetas);
para ello colocar 25 |xl y, cuando se hayan ab­
sorbido, colocar los otros 25 jal. Es importante
a) Tiras de acetato de celulosa; resultan muy
titiles para estas determinaciones las de Cello-
gel, 5,7 X 14 cm. Previo a su uso deben ser la­
vadas con buffer de veronal sódico (veronal só­
dico 8,24 g, agua destilada hasta 1.000 ml; pH
9,2).
Se las seca entre dos hojas de papel de filtro
y se las coloca en un bastidor con la superficie
absorbente hacia arriba. Existen en el comercio
cámaras de inm unodifusión con tensores que
permiten fijar los extremos de las tiras.
b) Plantilla de siembra, con perforaciones de
igual diámetro, para el depósito de las muestras
a valorar.

2 mm
\
50 ni antisuero
(-) c
O 2.5 ni Ag
-f
2mm

3 mm
C
5mm ] ^ 2 ,5 hI Ag 50 |xl antisuero
25 M
-l antisuero (+)
........................ 1

F ig . 35-3. El esquem a A se utiliza cuando se desea com parar dos antígenos. El esquem a B, para com parar antisueros.
 Métodos utilizados para la identificación y cuantificación de antígenos
c) El inmunosuero precipitante debe ser uti­
lizado a dilución conveniente para conseguir la
máxima precipitación. Con 200 |il se cubre la
superficie de la tira, distribuyéndolos unifor­
memente. Los esparcidores volumétricos DC/6
(Chemetron) facilitan esta tarea.
Tapar la cámara de difusión y dejar 24 horas
para conseguir una buena estabilización de la
tira. Para evitar que se seque conviene sellar la
cámara con cinta Durex.
d) Transcurrido el tiempo indicado, sacar la
tapa de la cámara de inmunodifusión y dejarla
descubierta durante 2-3 minutos para que la tira
pierda una parte del líquido de saturación y se
absorban con facilidad las muestras a valorar,
que se depositarán sobre su superficie. Para
ello sacar la cubierta, y a través de los agujeros
de la plantilla de siem bra depositar, con una
micropipeta o microjeringa, 1 )il de cada una
de las diluciones de la proteína patrón y de las
muestras a valorar.
e) Retirar las tiras de la cámara de inmunodi­
fusión y colocarlas individualmente entre dos
vidrios de 10 x 20 cm; cerrar los bordes con
cinta Durex. Colocar en cámara húmeda bien
nivelada y dejar 48 horas.
f) Retirar las tiras, lavarlas con solución sali­
na durante una hora, agitando constantemente.
Recambiar el líquido de lavado cuatro a cinco
veces durante ese período.
Colorear durante 3 minutos con solución de
Amidoschwartz al 0,5% en metanol-agua-ácido
acético y decolorar como se indicó en electro­
foresis.
g) La lectura de los resultados, la prepara­
ción de la curva de calibración y los cálculos se
efectúan de igual manera que la indicada en in­
munodifusión radial en agar.
E l e c t r o in m u n o d jf u s ió n
(“R O C K E T ” E L E C T R O F O R E S IS )‘^ “ fracciones con movilidad beta.
Es un método muy usado para el dosaje de
algunas proteínas séricas; sus fundamentos han
sido ya descritos en el capítulo 9.
Puede ser desarrollada sobre placas de gel de
agarosa conteniendo el correspondiente an ti­
suero o en tiras de acetato de celulosa, prefe­
rentemente Cellogel, impregnadas con el inm u­
nosuero. Se describirá la metodología que utili­
za este último soporte.
M ateriales necesarios
a) Tiras de Cellogel de 5,7 x 14 cm.
b) Equipo com pleto para electroforesis en
acetato de celulosa.
c) Micropipetas de 1 |il.
d) Distribuidor volumétrico DC/6.
e) Antisueros monoespecíficos.
705
f) Soluciones patrones de antígenos.
g) Solución buffer de veronal sódico 0,04 M,
pH 9,2 (8,24 g • htro->).
h) Solución de lavado: NaCl 0,15 M.
i) Solución colorante: azul brillante de Coo-
masie al 2,5% en metanol-ácido acético-agua
(5:1:5).
j) Solución decolorante; metanol-ácido acéti-
co-agua (5:1:5).
Método
Sumergir las tiras de acetato de celulosa en
la solución buffer por 10 minutos, retirarlas, es­
currirlas sobre dos hojas de papel de filtro y ex ­
tenderlas sobre el puente de 8,5 cm de la cám a­
ra electroforética. Dejar 2-3 minutos para que
las tiras se vuelvan más absorbentes.
A continuación, empleando micropipetas de
1 ¡il, se siembran las diferentes concentraciones
de antígeno patrón y las muestras de suero d es­
conocidas en las que ese antígeno se quiere v a ­
lorar. Las muestras se siembran a 1 cm de d is­
tancia del cátodo y separadas entre sí por 0,8
cm. Para visualizar mejor la zona de la siembra
es recomendable colorear las muestras con azul
de bromofenol.
Inm ediatam ente después, esparcir, con el
distribuidor volum étrico, el antisuero co n v e­
nientemente diluido en buffer (3 |il/cm^ de su­
perficie), hasta conseguir una buena d istribu­
ción y absorción del antísuero.
La cantidad total de antisuero a usar, así c o ­
mo su dilución, dependen del título de a n ti­
cuerpos. Generalmente se usan 150 |il de d ilu ­
ción 1:2.
A continuación se hace pasar la corriente
eléctrica, que será de 120 volts durante 75-90
minutos cuando se valora albúmina, y durante
tiempos mayores (120-180 minutos) para las
Finalizada la corrida, las tiras se lavan con
solución de NaCl 0,15 M durante 30 minutos,
agitando perm anentem ente, con el objeto de
eliminar las proteínas no precipitadas.
Se introducen las tiras en solución colorante
por 5-10 minutos y luego se decoloran hasta la
perfecta visualización de los picos de precipita­
ción (fig. 9-19).
La medida de la altura de los picos se e fe c ­
túa con un vernier o una regla de buena c a li­
dad, considerando como punto base el centro
de la siembra. Con los valores obtenidos con
las diferentes concentraciones del antígeno p a ­
trón (los picos máximos no deben ser inferio­
res a 4 cm de alto) se construye una gráfica, la
cual perm ite calcular por interpolación, tal c o ­
mo se describiera en inmunodifusión radial, la
concentración antigénica de la muestra an ali­
zada.
706 Metodologías
INMUNOFUACIÓN'* I"
Los fundam entos del m étodo ya han sido
descritos en el capítulo 9.
M aterial necesario
a) Tiras de acetato de celulosa, preferente­
mente desecado no gelatinizado, de 150 X 78
mm, porque requiere menor cantidad de inmu­
nosuero para el revelado y menos muestra para
el análisis.
b) Antisueros monoespecíficos (para el estu­
dio de inmunoglobulinas: anti-y, anti-ji, anti-a,
anti-5, anti-e, anti-K y anti-?^).
c) Cuba electroforética y fuente de poder.
d) Nigrosina, Ponceau S, azul brillante de
Coomassie R-250.
Método
a) La proteína a inmunofijar debe ser previa­
mente diluida en el buffer de corrida de modo
que su concentración final oscile entre 5 y 20
mg%. En casos particulares en que interese ob­
tener una banda de precipitación más intensa,
sobre todo cuando se analizan sueros patológi­
cos, éstos deben ser diluidos de modo que la
concentración proteica del producto a investi­
gar oscile entre 50 y 100 mg%.
b) E fectuar la eleetroforesis convencional
sobre acetato de celulosa, haciendo siembras
con un m ultiaplicador de m anera de obtener
varias corridas de la misma muestra.
El buffer a usar es el de Veronal 0,06 M, pH
8,6 y la corrida debe hacerse con una corriente
constante de 0,4 mA/cm de ancho de la tira.
c) El inm unosuero a usar debe ser diluido
convenientemente en el buffer de Veronal de
corrida adicionado con polietilenglicol 6.000 al
4%. La dilución debe ser tal que permita una
buena precipitación del antígeno, lo que se
consigue cuando Ag y Ac están en zona de
equivalencia. No debe olvidarse que el exceso
de Ag da lugar a la formación de complejos so­
lubles, hecho que es más manifiesto cuando los
inmunosueros fueron obtenidos por inmuniza­
ción de caballos y ovejas. Estos inconvenientes
están minimizados si los antisueros provienen
de conejos o cabras.
Los antisueros diluidos 1:10 a 1:2 de su con­
centración origina] deben ser previamente fil­
trados por m em branas porosas para retener
cualquier proteína agregada que pudieran con­
tener, ya que su presencia daría lugar a un
“fondo” en los preparados teñidos.
d) Inmediatamente después de la electrofore-
sis, la tira de acetato de celulosa se corta en
fragmentos, de modo que cada uno de ellos co­
rresponda a una corrida. Uno de los fragmentos
es procesado para su teñido en la forma habi­
tual indicada para eleetroforesis en acetato de
celulosa, con Ponceau S al 0,2% en ácido tri-
eloroacético al 3% o con Nigrosina al 0,1%, se­
gún el caso.
El resto de los fragmentos es introducido en
recipientes planos especiales que contienen los
diferentes inm unosueros m onoespecíficos, o
apoyados sobre soportes son recubiertos con
aquéllos. Después de 5 minutos, las tiras de
acetato de celulosa son lavadas con el buffer de
corrida, adicionado con 0,1% de Tritón X-100,
y con solución salina. Inmediatamente después
son coloreadas como en el caso anterior, usan­
do Ponceau S si el inmunosuero empleado fue
previamente diluido 1:2, o Nigrosina si la dilu­
ción fue 1:10. Muy buenos resultados se obtie­
nen también tiñiendo eon azul brillante de Coo­
massie R-250 al 0,25% en metanol-agua-ácido
acético (5:5:1 en volúmenes).
Por comparación de los fragmentos de aceta­
to de celulosa correspondientes a la corrida no
inm unoprecipitada y a las que reaccionaron
con los inm unosueros, puede establecerse la
identidad del componente sospechoso.
V a l o r a c ió n s im u l t á n e a e n s u e r o d e o v e ja
D E a n t i c u e r p o s U B IC A D O S EN LA S ER A C C IO N E S
in m u n o g l o b u l ín ic a s I g GI (yl) e IgG2 (y2)‘°
Puede lograrse por com binación de adsor­
ción en zona de equivalencia y eleetroforesis
en acetato de celulosa.
M aterial necesario
a) El descrito para valoración de anticuerpos
totales por precipitación cuantitativa.
b) El indicado en eleetroforesis en acetato de
celulosa.
Método
1. Valoración de proteínas totales. Se hace
p o r c u a lq u ie ra de los m éto d o s c o n o c id o s
(Biuret, Lowry, etc.). Puede efectuarse tam ­
bién por lec tu ra e sp ectro fo to m étrica. P ara
ello, diluir el suero convenientemente (1/75 a
1/100) y leer absorción a 280 nm. M ultipli­
cando el valor de la DO leída por 0,83 se ob­
tiene la concentración proteica del suero en
mg • m \-'. El valor 0,83 resulta de lO/E co ­
rrespondiente a un suero normal de oveja cu ­
yo contenido proteico fue determinado previa­
mente por Kjeldahl.
2. Valoración de anticuerpos totales. Se ob­
tiene por curva de precipitación de acuerdo con
el método ya descrito. Es necesario determinar
el título de anticuerpos y en especial la zona de
equivalencia (concentración de antígeno que
 Métodos utilizados para la identificación y cuantificación de antígenos 707

produce la máxima precipitación). Si se trata antígeno añadido. Ello se consigue aplicando la

de anticuerpos contra determinantes antigéni­ siguiente ecuación:
cos definidos (DNP), se hace por lectura espec­
IgG% X proteínas totales del suero (mg ■m k ') x F
trofotométrica a la longitud de onda correspon­ = mg ■m l'‘
d ie n te . C u an d o so n a n tíg e n o s c o m p le jo s Too
(ovoalbúmina), se efectúa reacción zonal con en la cjue IgG = IgG l o IgG2, y E = 1 + v o lu ­
los sobrenadantes de los tubos de precipitación, men de antígeno añadido por mi de suero.
frente a anticuerpo y antígeno, estableciendo en La proteína del antígeno añadido no interfie­
cuál de ellos no existe exceso de ninguno de re porque es incorporada a la concentración co ­
los reactivos. rrespondiente a la zona de equivalencia y en
3. Valoración de anticuerpos ubicados en esas condiciones es prácticamente eliminada en
las fracciones globulínicas y\ y yZ. Se hace el precipitado.
por electroforesis en acetato de celulosa. Es La concentración de los anticuerpos u b ica­
necesario efectuar dos determinaciones: la pri­ dos en las fracciones inmunoglobulinas Ig G l e
mera correspondiente al suero inmune total, y IgG2 se calculan sustrayendo a las valoracio­
la segunda, al mismo suero previamente adsor­ nes de IgG l e lgG2 en mg • ml'^' del suero no
bido con el antígeno específico en la zona de adsorbido, las obtenidas respectivamente en la
equivalencia. Para ello, a 1 mi de suero añadir­ valoración del suero después de la adsorción
le la cantidad de antígeno determinada en b. con el antígeno específico.
Dejar en contacto durante una hora a 37“C y
24 horas a 4°C. Puede hacerse también por in-
AGLUTINACIÓN
m unoadsorción, usando el inm unoadsorbente
específico (antígeno polim erizado o unido a
CUALITATIVA
saphorosa).
En el sobrenadante de centrifugación, ai Ensayos de identificación
igual que en el suero inmune sin adsorber, va­ de microorganismos
lorar proteínas totales en la forma indicada e
inmunoglobulinas IgG l e lgC2 por electrofore­ M aterial necesario
sis en acetato de celulosa. Para ello, una vez
efectuada la corrida y antes de la coloración, a) Un cultivo en medio sólido de la bacteria
cortar las tiras en los valles correspondientes a a tipificar.
las fracciones IgG l e IgG2 (fig. 35-4). Cada b) Antisueros anti bacterianos de distinta es­
fracción inmunoglobulínica se disuelve en 3 mi pecificidad.
de ácido acético al 80% (v/v) y el resto de la ti­ c) Placas de Petri.
ra en 9 mi. Leer las DO a 620 nm. Con estos d) Mango de Kole con hilo de platino o ni-
resultados, y después de haber hecho las co­ crón.
rrecciones teniendo en cuenta los volúmenes de e) Solución salina tamponada: cloruro de so­
disolución de los fragmentos de la tira de ace­ dio 0,15 M, fosfato 0,01 M, pH 7,2.
tato de celulosa, pueden calcularse las concen­ f) Tubos de hemólisis.
traciones por ciento de IgG l e IgG2. g) Pipetas de 0,1 mi.
En el caso del suero sin adsorción, esos valo­ h) Pipetas Pasteur.
res pueden transform arse en mg ■ mi ' c o ­ i) Varillas de vidrio para agitar.
nociendo la concentración proteica total del
suero. Método
Para calcular IgG l e IgG2 en el suero adsor­
bido, es necesario hacer las correcciones por Suspender el cultivo microbiano en solución
variación de volumen como consecuencia del salina tamponada, procurando que sea lo más

Fig. 35-4. E lectro fo re sis en acetato

de celulosa de suero de oveja. Las lí­
neas de puntos m arcan las zonas don­
de deben efectuarse los cortes para la
separación de IgG l e Ig 0 2 a efectos
de su cuantificación. igG2
708 Metodologías
densa posible (no menos de 20.000 millones de
bacterias por ml). En placa de Petri colocar
0,03 ml de cada uno de los antisueros y 0,03 de
solución salina tamponada (testigo), de modo
que estén a distancias prudenciales para evitar
mezclas. Añadirles una gota (± 0,03 ml) de la
suspensión bacteriana y mezclar para homoge-
neizar. Agitar la placa por rotación manual du­
rante 3 minutos y observar.
La aparición de aglutinación indicará corres­
pondencia entre antígeno y antisuero (fig. 9-23).
Ensayos de tipificación de antígenos
hemáticos
S is t e m a AB/0
M aterial necesario
a) Placa de reacción.
b) Palillos de madera para mezclar.
c) Sangre total obtenida directam ente del
pulpejo del dedo, sangre oxalatada, citratada o
heparinizada.
d) Sueros hemoclasificadores antí-A y antiB.
Método
Colocar en la placa de reacción una gota de
suero anti-A y otra de anti-B. A ñadir a cada
una de ellas un volumen de sangre total aproxi­
madam ente igual a 1/3 del correspondiente a
antisueros. Mezclar y, manteniendo la placa a
tem p eratu ra am biente, o b serv ar si aparece
aglutinación.
Los resultados se interpretan de la siguiente
manera:
Aglutinación con
G rupo sanguíneo Suero anti-A Suero anti-B
AB
S is t e m a R h
1. Prueba en placas con suero anti-D (para
determinar si el individuo es Rh positivo).*'
M aterial necesario
a) Placa de reacción: teniendo en cuenta que ximadamente 10" (100.000 millones) de bacte­
los anticuerpos anti-Rh interaccionan mejor en rias por mililitro, en solución de cloruro de so­
caliente, es muy útil em plear como placa de dio al 12%.
reacción una botella de cara plana llena de agua
calentada a 45-50‘’C.
b) Palillos de madera para mezclar.
c) Sangre total obtenida directam ente del
pulpejo del dedo; sangre oxalatada, citratada o
heparinizada.
d) Suero anti-D para pruebas en placa.
Método
Colocar sobre la placa de reacción una gota
de suero anti-D y añadirle igual volum en de
sangre. Mezclar y observar si aparece aglutina­
ción. No conviene prolongar los tiem pos de
lectura (máximo 3-5 minutos).
2. Prueba en tubos con sueros anti-C, anti-D,
anti-E, anti-c y anti-e (para determinar el fe­
notipo y el probable genotipo)
M aterial necesario
a) Suspensión de hematíes al 2%; se prepa­
ran a esa concentración en su propio suero o
plasma.
b) Sueros anti-D, anti-C, anti-E, anti-c y an-
ti-e para pruebas en tubo.
c) Tubos de hemóhsis pequeños.
d) Pipetas de 1 ml y 5 ml.
e) Pipetas Pasteur.
f) Baño termostatizado regulado a 37“C.
g) Centrífuga.
Método
En una serie de cinco tubos colocar, respec­
tivamente, una gota de cada antisuero. Añadir a
todos ellos una gota de la suspensión de hema­
tíes, mezclar por agitación e incubar a 37“C du­
rante 15 minutos. Centrifugar a 1.000 rpm du­
rante un minuto. Por agitación muy suave de
los tubos, determinar en cuáles se ha producido
aglutinación.
CUANTITATIVA
Valoración por el método rápido
de aglutinación en placas*^
M aterial necesario
a) Antígeno: suspensión microbiana de apro­
Generalmente se adicionan colorantes, como
el cristal violeta que, además de actuar como
 Métodos utilizados para la identificación y cuantificación de antígenos
bacteriostáticos, facilitan la lectura de los resul­
tados.
b) Suero a valorar.
c) Pipetas de 0,2 mi y 1 mi.
d) Aglutinoscopio.
Método
Sobre la placa de vidrio del aglutinoscopio,
colocar 0,08 mi, 0,04 mi, 0,02 mi, 0,01 mi y
0,005 mi del suero a valorar. Añadir, 0,03 mi
del an tíg en o a to d o s ello s, m ezclar y le e r
los resultados entre los 3 y 5 minutos. El títu­
lo estará dado por la máxima dilución agluti­
nante.
P ara las cantidades indicadas los títu lo s
aglutinantes son, respectivamente, 1:25, 1:50,
1:100 y 1:400. Cuando el título de los anticuer­
pos es muy elevado (aglutinación de todas las
diluciones), debe usarse suero 1:2 o 1:4, multi­
plicando el título obtenido por la dilución para
expresar el valor final.
Valoración por aglutinación
lenta en tubos
M aterial necesario
a) Antígeno: suspensión bacteriana en solu­
ción salina tamponada a la concentración de 5
X lO® (5.000 millones) por mililitro.
b) Solución salina tamponada: cloruro de so­
dio 0,15 M, fosfato 0,01 M, pH 7,2.
c) Pipetas de 1 y 5 mi.
d) Tubos de hemólisis.
e) Baño termostatizado regulado a 37°C, gra­
dillas.
Método
En una serie de tubos, colocar 0,5 mi de so­
lución salina tamponada. Al primero de la se­
rie, añadirle 0,5 mi del suero a valorar, m ez­
clar, extraer 0,5 mi de la mezcla y transferirla
al segundo; 0,5 mi de ésta transferirla al terce­
ro, y así sucesivamente. El último tubo lleva
sólo solución salina como control. A ñadir a
todos los tubos 0,5 mi de suspensión antigéni­
ca e incubar a 37°C durante 2 horas. Leer los
resultados. El título estará dado por la máxima
dilución capaz de dar aglutinación visible.
En los casos de urgencia pueden acelerarse
los resultados incubando durante 15 minutos
a 37°C y centrifugando luego a 3.000 rpm du­
rante 5 m inutos. Previa agitación suave, d e ­
term inar cuál es la m áxim a dilución ag lu ti­
nante.
709
AGLUTINACIÓN CON ANTÍGENOS
SOLUBLES UNIDOS A SOPORTES
INERTES
Cuando se emplean hematíes como
soporte
P o r f i j a c i ó n d i r e c t a (s i e l a n t í g e n o
ES U N h i d r a t o d e C A R B O N O )'^
El método es muy utilizado en la investiga­
ción de anticuerpos contra lipopolisacáridos
bacterianos y antígenos poliosídicos diversos.
M aterial necesario
a) Antígenos: se emplean productos purifica­
dos. En el caso de los lipopolisacáridos b acte­
rianos se los obtiene a partir de bacterias trata­
das con fenol-agua a 65-68“C y precipitación
posterior con alcohol, según las especificacio­
nes dadas en el capítulo 43. La concentración
antigénica óptim a debe determ inarse ex p e ri­
mentalmente en cada caso.
b) Suero a valorar: previo a su uso se lo ca­
lienta a 56“C durante 30 minutos y se lo adsor­
be durante una hora a tem peratura am biente
con un 10% de hematíes lavados para elim inar
anticuerpos heterófilos.
c) Glóbulos rojos de carnero: se utiliza una
suspensión al 2% en cloruro de sodio 0,15 M,
fosfato 0,01 M, pH 7,2. Para su preparación y
v alo ració n se sigue el m étodo indicado en
Complemento (cap. 22).
d) Sensibilización de los hematíes: se m ez­
clan volúmenes iguales de la solución antigéni­
ca y glóbulos rojos al 2%. Después de 30 m i­
nutos de contacto a 37°C se centrifuga, se lavan
los hematíes dos veces con solución salina tam ­
ponada y se suspenden al 1% en el mismo d ilu ­
yente.
e) Tubos de hemólisis.
f) Pipetas de 0,1 mi, 1 mi y 5 mi.
g) Baño termostatizado, gradillas, centrífu­
ga.
Método
En una serie de tubos pequeños, colocar 0,5
mi de diluciones crecientes del suero a valorar
y añadir a cada uno de ellos 0,5 mi de glóbulos
rojos sensibilizados con el antígeno poliosídi-
co. Incubar a 37°C durante una hora y dejar a
temperatura ambiente hasta el día siguiente. Se
examinan los tubos y se determina cuál es la
m áxim a dilución con capacidad aglutinante.
Para ello se sigue el criterio indicado en h e-
moaglutinación pasiva de Boyden.
Es necesario incluir siempre testigos consti­
tuidos por glóbulos rojos no sensibilizados y
710 Metodologías
suero a analizar, y glóbulos rojos sensibilizados
frente a sueros negativos y de positividad cono­
cida.
P o r s e n s ib il iz a c ió n p r e v ia
(A N T ÍG E N O S PR O T E IC O S)
1. Hemoaglutinación pasiva de Boyden'’^-'''
M aterial necesario
a) Antígeno: debe emplearse la concentra­
ción óptima en cada caso, que varía entre 1 y 5
mg de proteína por mi.
b) Suero a valorar: previo a su uso debe ser
calentado a 56°C durante 30 minutos y adsorbi­
do con hematíes lavados no sensibilizados para
eliminar anticuerpos heterófilos. Para ello, aña­
dirle un 10% del paquete globular e incubar a
temperatura ambiente durante una hora, clarifi­
cando por centrifugación.
c) Solución buffer de pH 7,2:
Cloruro de sodio 0,15 M ..................... 500 mi
Fosfato monopotásico 0,15 M ........... 120 mi
Fosfato disódico 0 ,15 M ..................... 380 mi
d) Solución buffer de pH 6,4:
Cloruro de sodio 0 ,15 M ..................... 500 mi
Fosfato monopotásico 0,15 M ........... 339 mi
Fosfato disódico 0,15 M ..................... 161 mi
e) Solución salina: cloruro de sodio 0,15 M.
f) Glóbulos rojos lavados al 2,5%: normal­
mente se emplean los de carnero.
La sangre obtenida por punción venosa se
m ezcla con solución de A lsever y en el m o­
mento del uso se lava tres veces con 10 volú­
menes de solución salina y se diluye al 2,5% en
buffer de pH 7,2. Para su valoración se emplea
el método indicado en Complemento (cap. 22).
g) Solución de tanino: se prepara al 1% en
agua destilada. Se conserva bien en heladera,
debiendo desechársela si contiene precipitados.
El tanino a usar debe ser de muy buena calidad.
Para la reacción se usa una dilución 1:20.000
en solución salina, la que se prepara a partir de
la solución madre.
h) Tañado de los hematíes: mezclar volúme­
nes iguales de glóbulos rojos al 2,5% y tanino
1:20.000. Incubar a 37°C durante 10 minutos y
centrifugar a 2.000 rpm durante 5 m inutos.
Volcar el sobrenadante y lavar con un volumen
igual de solución buffer de pH 7,2, efectuando
luego un lavado con solución salina. Resuspen­
der en ella hasta volumen original.
i) Sensibilización de los hematíes: a 2 mi de
glóbulos rojos tañados agregar 8 mi de solu­
ción buffer de pFI 6,4 y 2 mi de antígeno. Mez­
clar y dejar a temperatura ambiente 10 minu­
tos. Centrifugar y lavar dos veces con 4 mi de
suero normal de conejo al 1% en solución sali­
na, llevando finalm ente el sedimento a 2 mi
con el mismo diluyente.
Sim ultáneam ente se prepara la suspensión
testigo de glóbulos rojos tañados siguiendo el
procedimiento anterior, pero reemplazando el
antígeno por solución salina.
Nota: para algunos antígenos, como el toxoi-
de tetánico, por ejemplo, se consiguen mejores
suspensiones aglutinantes si para el tañado de
los eritrocitos se usa una dilución 1:40.000.
Método
Siendo la reacción altam ente sensible, el
suero a valorar debe ser diluido en forma con­
veniente.
En una serie de tubos colocar 0,5 mi del sue­
ro a valorar diluido en razón 2, utilizando suero
normal de conejo al 1% en solución salina co­
mo diluyente. Añadir a todos los tubos 0,05 mi
de glóbulos rojos tañados y sensibilizados al
2,5%. Incluir dos tubos testigos que contengan
0,5 mi de la primera y las últimas diluciones
del suero a valorar, respectivamente, a los que
se les añade 0,05 mi de glóbulos rojos tañados
no sensibilizados al 2,5%.
Agitar y dejar a temperatura ambiente efec­
tuando la lectura entre las 3 y 24 horas.
Puede facilitarse la lectura con la ayuda de
un espejo cóncavo. Conviene incluir tubos con­
trol con sueros positivos y negativos.
La figura 9-26 muestra los fondos de los tu­
bos de reacción, en los que pueden verse distin­
tos grados de hemoaglutinación.
2. Hemoaglutinación pasiva previa sensibiliza­
ción con tricloruro de cromo (CrCl¡)‘''^
El material y el instrumental necesarios son
los indicados en los otros métodos de hemoa­
glutinación.
a) Sensibilización de glóbulos rojos: se em ­
plean glóbulos rojos humanos del grupo O, Rh
negativo, o hematíes de pollo, los que, previo
lavado por tres veces, son suspendidos en solu­
ción de NaCl 0,15 M. Antes de su uso se sepa­
ran los glóbulos rojos por centrifugación.
A un volumen de NaCl 0,15 M añadirle y
mezclar un volumen de la solución del antíge­
no proteico (0,5-3 mg.ml *) y un volumen del
paquete de los glóbulos rojos lavados. Añadir
luego 2 volúm enes de una dilución 1/50 en
NaCl 0,15 M de una solución madre de CrClj
(CrClj 6H,0 al 1% en agua destilada). Agitar
 Métodos utilizados para la identificación y cuantificación de antígenos 711

intensamente 5-15 minutos. Añadir 20-40 vo­ lución salina fosfatada añadirles 0,1 mi de una
lúmenes de NaCl 0,15 M, centrifugar, lavar 3 suspensión de glóbulos rojos de carnero al 50% ,
veces con la m ism a solución y suspender al previamente lavados y suspendidos en el mismo
2%. diluyente. Agregar 1 ml de bencidina bis-diazo-
Si los iiematíes así sensibilizados dieran au- tizada diluida 1:30 en solución salina fosfatada
toaglutinación en solución salina, significa que y m antener la mezcla a temperatura ambiente
el tratamiento con CrClj ha sido excesivo. Para durante 15 minutos. Centrifugar 5 m inutos a
una buena sensibilización se necesita exceso de 1.500 rpm, volcar el sobrenadante y lavar los
antígeno; de ahí que dicha concentración y el glóbulos rojos dos veces con solución salina
tiempo de tratamiento con CrClj deben ser re­ tamponada. Suspender en 2,5 ml de la m ism a
gulados en cada caso, dentro de los rangos se­ solución adicionada de 1% de suero normal de
ñalados. conejo. Se obtiene de este modo una suspensión
b) Suero a analizar (calentado 30 minutos a de glóbulos rojos sensibilizados al 2%.
56°C): previa dilución 1:10, se lo mezcla con c) Suero a valorar: luego de un calentamien­
igual volumen de glóbulos rojos lavados e in­ to a 56°C durante 30 minutos se lo adsorbe con
cuba una hora a 37°C. Se separan los glóbulos glóbulos rojos para eUminar anticuerpos hete-
por centrifugación y el sobrenadante, libre de rófilos.
cualquier heteroaglutinina natural antihematíe, d) Solución salina tamponada: cloruro de so ­
es el que se utiliza en los ensayos. dio 0,15 M, fosfato 0,01 M, pH 7,2.
e) Tubos de hemólisis.
Método f) Pipetas de 0,1 ml, 1 ml y 10 ml.
g) Baño termostatizado, gradillas, centrífuga.
En una serie de tubos de hemólisis colocar
0.5 ml de diluciones seriadas en razón 2, del Método
suero a valorar. Añadirles 0,05 ml de glóbulos
rojos sensibilizados con el antígeno específico La reacción se hace mezclando 0,5 ml de d i­
y dejar a tem peratura am biente 10 m inutos. luciones seriadas del suero a valorar y 0,05 mi
Centrifugar un minuto a 1.000 rpm y leer los de la suspensión de glóbulos rojos sensibiliza­
resultados como en los métodos ya descritos. dos.
Los resultados se leen a las 18 horas de p e r­
P o r f ija c ió n d ir e c t a o in d ir e c t a manecer los tubos a temperatura ambiente.
D E A N T ÍG E N O A G L Ó B U L O S R O JO S M ED IA N T E
u n io n e s CO VA LEN TES 2. Método del difluordinitrobencem/'-’

1. Método de la hencidina his-diazotizada^'’ Se utiliza para la investigación de anticuer­

La hencidina tratada con ácido nitroso da un
bis-diazo capaz de copularse simultáneamente
con un antígeno y restos reactivos de la mem ­
brana de los eritrocitos.
pos antidinitrofenol. La marcación de los h e ­
matíes con difluordinitrobenceno se hace sobre
los residuos lisina de la membrana celular.
M aterial necesario

M aterial necesario a) Solución buffer-EDTA pH 7,5: se deben

a) Bencidina bis-diazotizada: disolver 0,23 g
de bencidina en 45 ml de HCl 0,2 N y enfriar en
baño de hielo. Separadamente, disolver 0,175 g
de NaNOj en 5 ml de agua destilada y enfriar
del mismo modo. En un período de aproxima­
damente un minuto, añadir, con agitación cons­
tante, la solución de nitrito de sodio sobre la
bencidina. M antener la mezcla en el baño de
hielo durante 30 minutos, agitando cada 5 m i­
nutos. Para dar por terminada la reacción con­
viene investigar la ausencia de nitrito libre con
reactivo de ioduro de potasio-almidón.
La bencidina bis-diazotizada se conserva a
- 2 0 ”C; es conveniente repartir el material en
ampollas y almacenarlo hasta su uso.
b) Sensibilización de los glóbulos rojos: a 3
ml de solución antigénica (1 a 3 m g-m l‘) en so­
disolver 17 g de EDTA disódico en 300 ml de
agua destilada, ajustar a pH 7,5 con NaOH N
(± 45 ml) y añadir luego NaCl 0,15 M h asta
completar un litro.
b) Solución buffer-EDTA pH 8,4: disolver
1,7 g de EDTA disódico y 5 g de glucosa en 80
ml de agua destilada. A justar a pH 8,4 con
NaOH N y completar a 100 ml con agua d esti­
lada.
c) Glóbulos rojos de carnero, conejo o h u ­
manos marcados con DNP: lavar los hematíes
3-5 veces con buffer-EDTA pH 7,5 y suspen­
derlos al 10% en el mismo buffer.
D isolver 1-3 di flúor 4-6 dinitrobenceno al
2% en acetona y por cada 0,15 ml añadirle 1 ml
de buffer-EDTA pH 8,4. Inmediatamente, a un
volumen de éste añadirle, gota a gota y agitan­
do, la mitad del volumen de glóbulos rojos al
712 Metodologías
10%. Dejar a 37°C durante 15 minutos e inte­
rrumpir la reacción por añadido de 6 volúme­
nes de buffer-EDTA pH 7,5. Centrifugar, lavar
tres veces con el mismo buffer y completar a
un volumen cinco veces superior al de glóbulos
rojos inicialmente usado. De este modo se tiene
una suspensión final de glóbulos rojos dinitro-
fenolados al 2%.
Si no se dispone de difluordinitrobenceno
para la marcación, puede usarse fluordinitro-
benceno. Como aquí la reacción es más lenta,
para conseguir buenos resultados el buffer ED­
TA pH 7,5 a utilizar durante la marcación debe
prepararse con NaCl 0,3 M. Para la interrup­
ción de la reacción y los lavados debe usarse
buffer-EDTA pH 7,5 preparado con NaCl 0,15
M. Pueden usarse también glóbulos rojos trini-
trofenolados, los que se preparan de la siguien­
te manera; con el paquete de glóbulos rojos
previamente lavado con buffer de fosfatos 0,1
M.pH 7,8, preparar una suspensión el 5% (v/v)
en el mismo buffer.
Preparar una solución de trinitrofenil sulfo­
nato de sodio (TNB) de 3 mg ■mi ' en buffer
de fosfatos 0,1 M. pH 7,8.
A un volumen de la suspensión de glóbulos
rojos añadir, gota a gota y agitando m anual­
m ente, un volum en igual de TNB. D ejar en
agitación rotatoria por 1 hora a tem peratura
ambiente. Lavar los glóbulos rojos trinitrofeno-
lados con NaCl 0,15 M, fosfatos 0,01 M, pH
7,2 y suspender en el mismo buffer.
d) Suero a valorar: previo a su uso se lo ca­
lienta a 56"C durante 30 minutos y se adsorbe
con glóbulos rojos no marcados para eliminar
anticuerpos antihematíes naturales que pudie­
ran existir.
e) Tubos de hemóhsis.
f) Pipetas de 0,1 mi, 1 mi y 10 mi.
g) Baño termostatizado, gradillas, centrífuga.
Método
A 0,5 mi de diluciones seriadas del suero a
valorar, añadir 0,05 mi de glóbulos rojos dini-
trofenolados, incubar 15 minutos a 37°C y de­
jar a temperatura ambiente hasta el día siguien­
te. La lectura de los resultados se efectúa en la
forma ya indicada.
3. Método del glutaraldehído'^‘^'^'^^
M aterial necesario
a) Glóbulos rojos de carnero lavados no m e­
nos de tres veces con buffer de fosfatos 0,15
M , pH 7,2. Separar el paquete globular por
centrifugación.
b) Dializar la proteína antigénica a fijar a los
eritrocitos contra buffer de fosfatos 0,15 M, pH
7,2 y ajustar a la concentración adecuada (1-2
mg • mL')-
c) A 10 mi de esta solución, añadir 0,4 mi
del paquete de glóbulos rojos de carnero, mez­
clar para homogeneizar y adicionar la cantidad
óptima de glutaraldehído al 2,5% en agua (0,52
mi). Continuar agitando durante 1 hora, lavar
las células tres veces con el buffer de fosfatos
indicado (10 mi cada vez) y suspender final­
mente en 5 mi del mismo buffer que contiene
1% de suero normal de conejo o seroalbúmina
bovina.
Reacción. Con el suero a analizar, efectuar
d iluciones seriadas usando com o diluyente
NaCl 0,15 M fosfatos 0,01 M, pH 7,2, añadido
de 1% de suero normal de conejo o seroalbú­
mina bovina. A 0,5 mi de cada dilución añadir
0,05 mi de glóbulos rojos sensibilizados, mez­
clar por agitación y dejar a 4°C por toda una
noche. Leer los resultados.
H e M O A G L U T IN A C IÓ N p a s i v a PA R A A N T ÍG E N O S
PR O T E IC O S Y PO L IO SÍD IC O S U S A N D O G L Ó B U L O S
R O JO S E S T A B IL IZ A D O S C O N A L D E H ID O S^'
Glóbulos rojos de carnero, pollo o conejo,
estabilizados con aldehido fórmico o pirúvico,
pueden fijar directamente antígenos proteicos o
hidrocarbonados y ser utilizados para reaccio­
nes de hem oaglutinación. Para los antígenos
proteicos los mejores son los glóbulos rojos de
carnero estabilizados con aldehido fórmico y,
para los hidrocarbonados, los de conejo estabi­
lizados sucesivamente con aldehido pirúvico y
fórmico.
Estos glóbulos rojos así sensibilizados, con­
servados en heladera, se mantienen útiles por
cinco semanas.
Estabilización de glóbulos rojos
de carnero con aldehido fórm ico
Se emplean glóbulos lavados, suspendidos al
8% en buffer de fosfatos 0,11 M, pH 7,2. A un
volumen de formol (aldehido fórmico al 40%)
al 7,5% en buffer de fosfatos 0,11 M, pH 7,2,
se le añade con agitación continua un volumen
de glóbulos rojos al 8%. Se mantiene la agita­
ción (agitador magnético) durante 17 horas a
temperatura ambiente (20“C) y luego se centri­
fuga y lava cinco veces con buffer de fosfatos.
Se filtra por gasa y se lo suspende al 10% en
buffer de fosfatos 0,11 M. Se conserva a 4“C.
Sensibilización, con antígenos proteicos,
de glóbulos rojos estabilizados con aldehido
fórm ico
Se suspende 0,1 mi del paquete globular en 9
mi de buffer de acetato 0,1 M, pH 5 y se le
 Métodos utilizados para la identificación y cuantificación de antígenos
añade 1 mi de solución de antígeno (0,5-3 mg-
mi). El buffer a utilizar debe ser de un pH pró­
ximo al punto isoeléctrico de la proteína. El in­
dicado es el recomendado para ovoalbtimina o
albúminas séricas. Se los mantiene en agitación
durante 2 horas, se los lava cinco veces y sus­
pende al 1% en buffer de fosfatos 0,11 M, pH
7,2.
Estabilización de glóbulos rojos de conejo
con aldehido pirúvico y fórm ico
Glóbulos rojos de conejo son estabilizados
con aldehido pirúvico al 3% (ajustado a pH
7,2 con NaOH) de manera similar a la indica­
da para aldehido fórm ico. Finalmente se los
suspende al 8% en buffer de fosfatos 0,11 M,
pH 7,2. A un volum en de los mism os se le
añade un volumen de aldehido fórmico al 3%
(formol al 7,5% ) en buffer de fosfatos y se
agita 17 horas a 20-24°C. Se filtra por gasa y
se los suspende al 10% en buffer de fosfatos
0,11 M, pH 7,2.
Sensibilización, con antígenos
hidrocarbonados, de glóbulos rojos
de conejo estabilizados con aldehido
pirúvico y fórm ico
Se suspende 0,1 mi del paquete globular en 9
mi de buffer de fosfatos 0,11 M, pH 7,2 y se
añade 1 mi de la solución de antígeno (10-300
)ig • mf*)- Se agita durante una hora, se lava
cinco veces y se suspende al 1% en buffer de
fosfatos 0,11 M, pH 7,2.
Reacción: Puede hacerse en placas con con­
cavidades o en tubos. Para la reacción se efec­
túan diluciones seriadas del suero en fosfato
0,11 M, pH 7,2, adicionado con 0,1% de gelati­
na y 0,5% de albúm ina (conejo o humana) o
1% de suero normal. Si se efectuara en placas,
en cada concavidad se colocan 25 |U,1 de las di­
luciones séricas e igual volum en de glóbulos
rojos sensibilizados. Si se hace en tubos, los
volúmenes son 0,5 mi. Se agita tres veces con
intervalos de 10 minutos y se deja a temperatu­
ra ambiente durante 16-20 horas. Las lecturas
se hacen de manera similar a las ya indicadas.
Nota: Los glóbulos rojos formolizados, obte­
nidos de acuerdo con las indicaciones dadas en
el método precedente, pueden ser utilizados pa­
ra la preparación de glóbulos rojos sensibiliza­
dos por la bencidina bisdiazotizada o el difluor-
dinitrobenceno, tal como si fueran glóbulos ro­
jos frescos. En, el caso de sensibilización por
tanino, éste debe usarse en una dilución de
1:2.000 en lugar de 1:20.000.
Tienen la ventaja de conservarse estables va­
rias semanas y no Usarse en soluciones hipotó-
nicas.
713
Cuando se emplean bacterias como
soporte^^
En algunas oportunidades pueden emplearse
bacterias como soportes, en sustitución de h e ­
matíes, para reacciones de aglutinación pasiva.
Una de las más utilizadas es el Micrococcus ly-
sodeikticus, y el método de fijación de los antí­
genos, es el de la carbodiim ida hidrosoluble.
Este método da buenos resultados para diferen­
tes tipos de antígenos como los toxoides, albú­
minas, gammaglobulina, etc.
M aterial necesario
a) M icrococcus lysodeikticus: la masa m i­
crobiana necesaria se obtiene por cultivo de
una cepa controlada, en agar peptonado e n ri­
quecido con 5% de extracto de levadura. D es­
pués de 48 horas de incubación a 37“C las bac­
terias se suspenden en solución salina fosfatada
y se las calienta a 60°C durante 1 hora; repítase
el calentam iento al día siguiente. Hechos los
controles de esterilidad, se procede a centrifu­
gar y lavar por tres veces el sedimento m icro­
biano, usando para ello solución salina fosfata­
da, suspendiendo finalmente al 80% en el m is­
mo diluyente.
b) Sensibilización de las bacterias; a 1 mi de
la suspensión bacteriana al 80% se añaden 6,6
m i de la so lu c ió n p ro te ic a an tig é n ic a (1 5
mg-mf^ en solución salina fosfatada) y 5 mi de
clorhidrato de l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-
carbodiim ida al 10%; se m antiene la m ezcla
con agitación constante 14 a 16 horas, a 4°C.
Se lavan las bacterias dos veces con Na^EDTA
al 2% en solución salina fosfatada y se las su s­
pende al 5% en solución salina.
c) Suspensión microbiana control; se prepara
en las m ism as c o n d ic io n e s e sp e c ific a d a s
en b), pero sustituyendo los 6,6 mi de solución
proteica antigénica por solución salina fo sfa­
tada.
d) Coloración de las bacterias; para facilitar
la visualización, las bacterias sensibilizadas
pueden teñirse por el añadido de azul de meti-
leno al 4% en solución salina fosfatada (0,05
mi por cada mi de suspensión bacteriana). C o­
mo conservador puede añadirse azida sódica al
0,1%. Debe conservársela a 4°C.
e) Suero por valorar; previo calentamiento a
56°C durante 30 m inutos, adsorberlo con la
suspensión m icrobiana no sensibilizada p a ra
elim inarle cualquier anticuerpo inespecífico
que pudiera contener.
f) Solución salina fosfatada; NaCl 0,15 M ,
fosfatos 0,01 M, pH 7,2.
g) A glutinoscopio o placas p ara aglutina-
714 Metodologías

Método M ateriales necesarios

E n la p la c a d el a g iu tin o s c o p io c o lo c a r
0,03 ml de las diluciones seriadas del suero por
valorar que contiene los anticuerpos específi­
cos para el antígeno fijado a las bacterias y
0,03 ml de la suspensión de bacterias sensibili­
zadas.
Colocar como control, 0,03 ml de la primera
dilución de suero y 0,03 ml de la suspensión
microbiana no sensibilizada.
Mezclar con una varilla de vidrio o monda­
dientes y determinar directamente, entre los 2 y
4 minutos, si hay aglutinación.
Cuando se emplean sustancias inertes
como soportes
O tras sustancias distintas de los hem atíes
han sido utilizadas para la fijación de antíge­
nos. Eiguran entre ellas las partículas de bento-
nita de diámetro conveniente seleccionadas por
centrifugación diferencial, las partículas de co­
lodión y las de látex (poiiestireno) de 0,21 a
0,81 jl de diámetro.
De todas ellas, la más usada es el látex de
poiiestireno, el que suspendido al 1% en solu­
ción sahna boratada de pH 8,2 (partes iguales
de NaCl 0,3 M y ácido bórico 0,1 M ajustado a
pH 8,2 con NaOH), glicina 0,1 M ajustada a
pH 8,2 con NaOH 0,1 N u otras soluciones es-
tabilizadoras, puede fijar antígenos en su super­
ficie por sim ple contacto, a tem peraturas y
tiempos variables. Las concentraciones antigé­
nicas y las condiciones de fijación deben esta­
blecerse experimentalm ente en cada caso. Se
consiguen buenas fijaciones entre los 35“C y
los 50°C; los tiempos varían con la temperatura
empleada.
Con las partículas sensibilizadas se hacen
reacciones en placas, m ezclando volúm enes
iguales (aproximadamente 0,05 ml) de ellas y
del suero a analizar. Las lecturas se efectúan a
los 3-5 minutos y la positividad se establece
por la aparición de grumos. El método puede
hacerse cuantitativo si se utilizan distintas dilu­
ciones del suero.
F IJA C IÓ N
a) E ritrocitos de carnero: se preparan de
acuerdo a las indicaciones dadas en el capítulo
22. Su concentración final depende del sistema
hemolítico a preparar.
b) H emolisina anticarnero: los métodos de
preparación y titulación ya han sido indicados
en el capítulo 22.
c) Complemento: se utiliza una mezcla de
sueros frescos de cobayo. Los métodos de va­
loración en unidades 50 y 100% hemolíticas y
las recomendaciones para su conservación fue­
ron especificadas en el capítulo 22.
d) Buffer Veronal-salino: se emplea el reco­
mendado por Mayer (capítulo 22).
e) Solución frenadora de la hemólisis: citrato
de sodio al 4% en solución de cloruro de sodio
0.15 M, mantenida en baño de hielo para ser
agregada helada.
f) Antígenos; deben ser titulados previamen­
te a su uso. Para ello se efectúan reacciones
con diferentes diluciones de él, respetando las
dosis de antígeno indicadas para el sistema. Se
considera como óptima para la reacción aquella
que dé el máximo de sensibilidad y especifici­
dad cuando se la ensaya frente al anticuerpo es­
pecífico y a otros no relacionados.
g) Sueros a examinar: deben ser frescos y
mantenidos en heladera no más de 48 horas. En
caso de que deban conservarse más tiempo, pa­
ra evitar que se vuelvan anticomplementarios
por agregación de gammaglobulina o contami­
naciones, se les añade 0,1% de cisteína o glici­
na y 0,01% de Merthiolate, que no interfieren
en la prueba. Antes de su uso deben ser calen­
tados a 56°C durante 30 minutos.
h) Tubos de hemólisis.
i) Pipetas de 1 ml y 5 ml.
j) Gradillas, baños termostatizados, centrífu­
ga, refrigeradora.
k) Espectrofotómetro.
1. Reacción cualitativa con lectura del 100%
de hemólisis
Tubos 1 2 3 4 5 6
0,1 _ 0,1
S uero a analizar 0,1
Suero a analizar - 0,1 - _ -
diluido 1:5
A ntígeno 0,1 0,1 0,1 _ 0,1 -

Com plem ento Id r Id r Idr Idr - Idr

DEL COMPLEMENTO» diluido 1:30*
B uffer c.s.p. 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Pueden emplearse sistemas con lecturas fina­ Incubar 1 hora a 37»C
les del 50 a 100% de hemólisis, los que a su S istem a hem olí- 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
lico ** Incubar 30 m inutos a 37°C
vez pueden ser cualitativos o cuantitativos.
L ectura de los resultados
Como varios de los reactivos a utilizar son
comunes a los diferentes sistemas, se describi­ dr= dosis de reacción obtenida en la titulación (100% hem ojítica)
E l siste m a a em p le a r está co n stitu id o p o r g ló b u lo s ro jo s al 2% y
rán en conjunto los materiales necesarios y lue­ 2DHioo/mÍ de h em o lisin a , m ez clad o s en p arte s iguales.
go los métodos para cada reacción. El v o lu m en d e ios re activ o s está ex p resad a en m l.
 Métodos utilizados para la identificación y cuantificación de antígenos 715

Interpretación
Tubo I Tubo 2 R esultado

O O
O 50
25 75 ++
% de lisis +
50 100
75 100
100 100

Los tubos 1 y 2 son de reacción. Los tubos 3, 4 y 6 (100% de hemólisis) y el tubo 5 (0% de h e ­
móhsis) son testigos.

2. Reacción cuantitativa con lectura del 100% de hemólisis

Tubos 10 II
Suero a analizar 1:1 0,1 0,1 0,1
Suero a analizar 1:5 0,1
Suero a analizar 1:10 0,1
Suero a analizar 1:20 0,1
Suero a analizar 1:40 0,1
Suero a analizar 1:80 0,1
Suero a analizar 1:160 0,1
A ntígeno 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
C om plem ento diluido 1:30 Id r Id r Idr Idr Id r Idr Id r Idr Id r Id r
B uffer c.s.p. 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0 ,5
Incubar 1 hora a 37°C
Sistem a hem olítico 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
L ectura de los resultados

El v o lu m en d e los re acü v o s e s tá e x p resad o en m i.

Los tubos 1 a 7 son de reacción, y los tubos nm, calculando los porcentajes de hemólisis en
8 a 11, controles. cada tubo y usando como testigos tubos que
Las dosis reactiva (dr) de complemento y el corresponden al O y 100% de hemólisis, prepa­
sistema hemolítíeo a emplear son los ya indica­ rados por el agregado de 1 mi de buffer y 1 mi
dos en la reacción cualitativa. de agua destilada, respectivamente, a 1 mi de
El título estará dado por la máxima dilución sistem a hem olítico. Producido el lacado, se
capaz de inhibir la hemólisis en forma parcial o añade a ambos tubos 2 mi de citrato de sodio
total. Si se expresa el resultado en unidades, és­ helado.
tas corresponderán a la inversa de la dilución El sistema hemolítico a emplear en la reac­
que produce el efecto deseado (unidades/0,1 ción se prepara mezclando partes iguales de
mi). glóbulos rojos de carnero al 5% y 5 DHj,/ml de
Leer las DO en el espeetofotóm etro a 565 hemolisina.

3. Reacción cualitativa con lectura del 50% de hemólisis

Tubos / 2 3 4 5 6 7

0,1 ... - 0,1

A ntígeno diluido según titulo 0,1 0,1 -

Suero a analizar 1:1 0,1 ... 0,1 0,1 0,1 0,1

Suero a analizar 1:5 - 0,1 - - - -
C om plem ento 3CH,(, en 0,2 m i 0,2 0,2 0,2 0,2 - - -
Com plem ento 2 C H 5,, en 0,2 mi - - - - 0,2 - -
Com plem ento 4CH,,| en 0,2 mi - -- - - - 0,2 -
B uffer V eronaLsalina 0,6 0,6 0,7 0,7 0,6 0,6 0,8
Incubar 18 horas a 4 “C y 15 m inutos a 37“C
Sistem a hem olítico 1 1 1 1 1 1 1
Incubar 30 m inutos a 37°C
Citrato de sodio al 4% helado 2 2 2 2 2 2 2
Centrifugar a 3.500 rpm durante 5 m inutos y esperar el sobrenadante

El volum en de los re activ o s es tá ex p resad o en m i.

716 Metodologías

Interpretación

Tubos 1 2 3 4 5 6 7 Positividad

í 0 0 50 a > 50 50 a > 50 50 a > 50 >50 0 ++++

0 12 50 a > 50 50 a > 50 50 a > 50 >50 0 +++
% de hem ólisis 0-12 12-25 50 a > 50 50 a > 50 50 a > 50 >50 0 -H-
12-25 25-50 50 a >50 50 a > 50 50 a >50 >50 0 +
25-50 50 a > 50 50 a > 50 50 a > 50 50 a > 50 >50 0 ±
50 a > 50 50 a > 50 50 a > 50 50 a >50 50 a > 50 >50 0 -

4. Reacción cuantitativa con lectura del 50% reactivas 50% hemolíticas. Para ello multipli­
de hemólisis (cuadro A) car la dilución del suero que más se aproxima a
50% de lisis por el factor correspondiente. Su
Separar los sobrenadantes y leer en el espec­ inversa constituye el número de unidades reac­
trofotómetro las DO a 565 nm; calcular el por­ tivas de anticuerpo por 0,1 mi.
centaje de hem ólisis en cada tubo y emplear Para las condiciones indicadas en la reac­
para ello los tubos 13 (0% de lisis) y 14 (100% ción, 3CH,g de complemento constituye la do­
de lisis). Los tubos 9, 10,11 y 12 son testigos. sis óptima.
U tilizando cualquiera de los métodos des­
critos al ocuparnos de la valoración de com ­ 5. R e a c c ió n de fija c ió n d e c o m p le m e n to
plem entos en unidades 50% hemolíticas, cal­ en placas
cular cuál es la dilución del suero que da 50%
de hem ólisis. Su inversa corresponde a las Materiales necesarios
unidades de anticuerpo por mililitro.
Aplicando la ecuación de von Krough a este a) Sueros a examinar inactivados por calen­
sistema reactivo, el valor de 1/n = 0,2. Con él tamiento a 56“C por 30 minutos.
se ha calculado el cuadro 35-3, que correspon­ b) Sueros controles positivos y negativos,
de a los valores de 1 (1-x) para los diferentes inactivados.
porcentajes de hemóhsis, ya que lo que se mide c) Glóbulos rojos de carnero al 2,8%, según
es consumo de complemento. Siempre que las se indicó en el capítulo 22.
condiciones de la reacción no se modifiquen ni d) H em olisina valorada en placas frente a
varíen, se la puede usar para calcular las dosis glóbulos rojos al 2,8%.

C u ad ro A. Reacción cuantitativa con lectura del 50% de hemólisis

T uhos 3 5 7 8 10 II 12 13 14

A ntígeno diluido
según título
0,1 0,1 0,1 0 ,¡ 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

Suero 1:1 0,1 0,1

Suero 1:2 0,1
Suero 1:4 0,1
Suero 1:8 0,1
Suero 1:16
Suero 1:32 0,1
Suero i :64 0,1
Suero 1:128 0,1
Com plem ento 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
3 C H 5„ en 0,2 mi
C om plem ento 0,2
2CH,,, en 0,2 mi
C om plem ento 0,2
4CHj(, en 0,2 mi
BuíTer V eronal-salina 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,7 0,7 0,7 0,7 0,9
A gua destilada 0,9
Incubar 18 horas a 4°C y 1.5 m inutos a 37°C
Sistem a hem olítico 1 1 1 7 1 1 1 1 1 1 1
Incubar a 37“C durante 30 m inutos
C itrato de sodio al 4% 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
helado C entrifugar a 3500 rpm durante 5 m inutos
 Métodos utilizados para la identificación y cuantificación de antígenos 717

Cuadro 35-3 Cuadro 35-4. Estándares de porcentaje de li-

—— —- —---------------------—- sis
% de lisis Factor % de lisis F actor
Solución
10 1,36 55 0,96 de hem oglobina Eritrocitos
12 1,33 60 0,92 H em ólisis (ml) a l 0,28% (m l)
14 1,30 65 0,87
16 1,28 70 0,82 0 0,0 LO
18 1,26 75 0,75 10 0,1 0.9
20 1,24 80 0,68 20 0,2 0.8
25 1,20 82 0,65 30 0,3 0.7
30 1,16 84 0,61 40 0,4 0.6
35 1,12 86 0,57 50 0,5 0,5
40 1,08 88 0,51 60 0,6 0,4
45 1,04 90 0,45 70 0,7 0.3
50 1 80 0,8 0,2
90 0,9 0,1
100 1,0 0,0
L os eritro cito s al 0,28% se p re p ara n m ez clan d o 1 volum en de g l ó ­
e) Sistema hemolítico. Mezclar partes igua­ bulos ro jo s al 2 ,8 % (su sp e n sió n estándar) y 9 v o lú m en es de b u ff e r
d iluyente.
les de glóbulos rojos al 2,8% y hemoUsina (2 L a so lu ció n d e h e m o g lo b in a se p re p ara m ez clan d o 1 m l d e g l ó b u ­
dmh • por ml '). los rojos d e ca rn ero al 2 ,8 % , b ien h o m o g en e iz ad o s con 7 v o lú m e ­
f) Diluyente. Es el mismo que se utiliza para nes d e a g u a d estilada, A g itar h asta que los eritro cito s estén lisa d o s .
A ñ a d ir lu eg o 2 m l d e b u ffer d e d ilu ció n y m ezclar.
el macrométodo.
g) Antígeno, usado a la dilución óptima, pre­
via valoración en placas.
h) C om plem ento. Suero fresco de cobayo llar la reacción de fijación de complemento en
valorado en placas frente al sistema hemolítico placas, se indican en la figura 35-5.
indicado. Las dosis 5 CH^g deben estar conteni­
das en 50 |0,1. Las dosis de complemento 2,5 M edición de la capacidad fijadora
CHjg y 1,25 CH jq se preparan diluyendo la do­ de complemento, usando glóbulos
sis 5 CHjg a 1:2 y 1:4 en buffer diluyente, res­ rojos marcados con ®^Cr
pectivamente.
M ateriales necesarios
Método
a) Glóbulos rojos de carnero marcados con
Las cantidades y la distribución de los reacti­ “•■Cr. Para ello los eritrocitos son lavados con
vos, así como los pasos a seguir para desarro- buffer de Mayer (véase cap. 22) y resuspendidos

Dilución 5 2,5 . U25

de suero 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 C H ,, CH,,, GH,,

~ Suero descon. 25 25 25 25 25 25 25 25 25 A ntígeno Control

Reacción Antígeno 25 25 25 25 . 25 25 25 25 25 Diluyente antígeno
5C H j, 50 50 50 50 50 50 50 5() 50 Com plem ento

Suero descon. 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Suero desc. 1:8 Control

Control Diluyente 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Diluyente suero d esc.
_ 5CH„, 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Com plem ento

Suero posil. 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Suero posit. 1;8 Controi

Reacción Antígeno 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Diluyente suero p osit.
5CH3„ 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Com plem ento
Testigo
positivo Suero positiv. 25 25 25 25 25 25
Control Diluyente 25 25 25 25 25 25 50 50 50 Diluyente Control
5CH,„ 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Com plem ento diluyente

— Suero negal. 25 25 25 25 25 25
Reacción Antígeno 25 25 25 25 25 25 100 Diluyente Control
Testigo 5 C H ,, 50 50 50 50 50 50 Sistem a
negativo hemol.
Suero negativo 25 25 25 25 25 25
Conlrol D iluyente 25 25 25 25 25 25
L 5 C H ,, 50 50 50 50 50 50

F ig. 35-5. Los volúm enes de los reactivos están expresados en |i.l. A gitar e incubar a 4“C por 15-18 horas. Añadir a to d o s
los pocilios 25 |0.1 del sistem a hem olítico (volúm enes iguales de eritrocitos de carnero al 2,8% y dosis óptim a de h e m o lisi­
na). C ubrir la placa con tira plástica transparente e incubar a 37°C durante 30 m inutos. R etirar. C olocar en cada uno de c in ­
co pocilios, 25 |il de los controles de O, 30, 50, 80 y 100% de lisis, preparados según el cuadro 35-4. C entrifugar si se di.s-
pone de centrífuga apropiada o dejar en heladera 2-3 horas hasta que las células sedim enten. Leer los resultados por c o m ­
paración con los testigos de porcentaje de lisis. Para que los resultados de la reacción sean válleos, los controles de 5 CLIj,,
y 2,5 CH 51, y 1,25 CHj,j deben dar los correspondientes grados de lisis.
718 Metodologías

al 50% en el mismo buffer. A 0,2 mi de la sus­ Siendo A, radiactividad del sobrenadante, y

pensión de hematíes se le añaden 50-100 |0,Ci de B, radioactividad del sedimento. Un 100% de
^'Cr (Na/'CrO^) en solución salina. La suspen­ lisis en los tres tubos significa reacción negati­
sión se incuba 1 hora a 37“C con agitación fre­ va.
cuente. Las células se lavan 4-5 veces con 20-30
volúmenes de buffer de Mayer. El sobrenadante
del último lavado no debe tener radiactividad IN V ESTIG A C IÓ N D E A N TIC U ER PO S
medible. Ajustar la suspensión celular a 2 X 10* ANTI RH INCOMPLETOS
eritrocitos por mi. La marca incorporada no de­
be ser inferior a 2.000 c.p.m. para la cantidad de Por dilución en medio albuminoideo^"’
eritrocitos a usar por tubo de reacción.
b) Hemolisina. Se la emplea a la dilución 2 M aterial necesario
ACH|,,„.ml"', determinada según se indicó en el
capítulo 22. a) Glóbulos rojos del grupo 0-Rh positivos
(D o de la especificidad deseada) al 4% en
Método NaCl 0,15 M adicionado con 15% de albúmina
bovina. Lavar los glóbulos tres veces eon 10
Tubox I 3 5 volúmenes de NaCl 0,15 M. Decantar el sobre­
nadante, medir 0,05 mi del paquete globular y
A ntígeno 0,25 0,25 0,25 0,25
A ntisuero 1:50 0,25 0,25
añadir 1,2 mi de NaCl 0,15 M con 15% de al­
A ntisuero 1:100 0,25 búmina bovina.
A ntisuero 1:200 0,25 b) Diluyente: albúm ina bovina al 20% en
C om plem ento 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 NaCl 0,15 M.
D iluyente 0,25 0,25 0,25 0,50 0,50 0,75 1,0
c) Suero a valorar.
hicubar a 37“C por I hora d) Tubos de hemólisis pequeños.
S istem a
hem olítico* 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 e) Pipetas de 0,01,1 mi y 5 mi.
Incubar a 37“C por 30 m inutos f) Gradillas, baño termostatizado, centrífuga.
* El s iste m a h e m o lític o usad o estíl co n stitu id o p o r u n a m ez cla de
p a rte s iguales d e eritro cito s d e ca rn ero y h em o lisin a en las c o n c e n ­ Método
tra c io n e s in d ic a d o s . E l v o lu m en d e lo s re a c tiv o s e s tá e x p re s a d o
en m i.
En una serie de tubos, colocar 0,1 mf de di­
luciones crecientes en razón 2, del suero a va­
lorar en albúmina bovina al 20%. Añadir a to­
c) Complemento. Se utiliza suero fresco de dos los tubos 0,1 mi de la suspensión de glóbu­
cobayo diluido convenientemente de modo que los rojos al 4% e incubar una hora a 37°C. Cen­
1 CH|pg esté contenida en 0,25 m. La determi­ trifugar un minuto a 1.000 rpm. Determinar el
nación de las unidades CH,pg se efectúa como título estableciendo cuál es la máxima dilución
se indicó en el capítulo 22. aglutinante, previa agitación suave del sedi­
d) Antígeno. Se lo diluye de manera tal que mento globular.
contenga 10-15 ¡ag.ml'. Deben incluirse en la reacción tubos testigos
e) El suero a valorar, previamente inactivado con sueros positivos y negativos.
a 56°C por 30 mirmtos, se lo diluye 1:50, 1:100
y 1:200. Por modificación previa de la superficie
f) Diluyente. Buffer de M ayer (véase cap. de los hematíes por acción enzimática^f’
22 ).
Finalizada la incubación, los tubos son cen­ M aterial necesario
trifugados y se procede a medir la radiactividad
en 0,75 mi de cada uno de los tubos y en los se­ a) Glóbulos rojos 0-Rh positivos (D o de la
dimentos de todos ellos, previa eliminación del especificidad deseada) tripsinados: se emplea
resto de sobrenadante. Para la lectura de los re­ una suspensión al 4% en NaCl 0,15 M. Para la
sultados se utiUza un contador de radiaciones tripsinización, a un volumen de glóbulos rojos
gamma. Los tubos 1, 2 y 3 son de reacción, y lavados tres veces con solución salina se le
los restantes son controles. añade un volum en y m edio de solución de
El porcentaje de ^'Cr liberado en los tubos de tripsina (solución salina 10 mi, tripsina crista-
reacción, representante de la capacidad fijadora tizada 10 mg, fosfato disódico 1/15 M 2 mi,
de complemento, se calcula como sigue: fosfato monopotásico 1/15 M 0,05 mi). Se in­
cuba en baño de agua a 37“C, con agitación
AX 2 periódica, durante 10-15 m inutos. Luego se
% 5 iC r= ------------ X 100 lavan con solución salina y se los suspende en
A +B ella al 4%.
 Métodos utilizados para la identificación y cuantificación de antígenos 719

b) Solución salina: NaCl 0,15 M.
c) Tubos de hemólisis.
d) Pipetas de 0,1 mi, 1 mi y 10 mi.
e) Baño termostatizado, gradillas, centrífuga.
Método
Cualitativo. En un tubo de hemólisis colocar
0,2 mi del suero a analizar y 0,1 mi de la sus­
pensión de glóbulos rojos tripsinados. Dejar en
reposo 5-10 minutos a temperatura ambiente y
centrifugar a 1.000 rpm durante 1 minuto. D es­
prender suavemente el botón celular y determi­
nar la presencia de aglutinación.
C uantitativo. R epetir el m étodo anterior,
usando diluciones seriadas del suero a analizar.
El título estará dado por la máxima dilución
aglutinante.
Por la prueba de Coombs indirecta”
El título estará dado por la m áxim a dilución
aglutinante.
Por bloqueo^*
M aterial necesario
a) Suero a analizar.
b) Glóbulos rojos 0-Rh positivos (D o de la
especificidad deseada). Se utiliza una suspen­
sión al 2% en solución sahna.
c) Solución salina: NaCl 0,15 M.
d) Suero aglutinante anti-Rh: usar un suero
de buen poder aglutinante, de tipo salino, espe­
cífico para los glóbulos rojos empleados en la
prueba.
e) Tubos de hemólisis.
f) Pipetas de 0,2 mi, 1 mi y 10 mi.
g) Baño termostatizado, gradillas, centrífuga.

M aterial necesario
Método
a) Glóbulos rojos 0-Rh positivos (D o de la
especificidad deseada). Con los mismos, previo 1. Cualitativo: a dos tubos de hemólisis (n- 1
lavado, se orepara una suspensión al 1% en y n- 2) añadir 0 ,1 mi de la suspensión globular.
NaCl 0,15 M. Al tubo n® 1 agregarle 0 ,1 mi del suero a inves­
b) Diluyente: Na C1 0,15 M. tigar y al tubo n° 2, 0,1 mi de solución salina.
c) Suero de Coombs (suero de conejo anti­ Mezclar e incubar en baño de agua a 37“C d u ­
globulina humana). rante una hora. Centrifugar a 1.000 rpm duran­
d) Tubos de hemólisis. te 1 minuto. Volcar el sobrenadante y agitar el
e) Pipetas de ] mi y 5 mi. sedimento. Si no hay aglutinación, añadir a c a ­
f) Baño termostatizado, gradillas, centrífuga. da tubo 0,1 mi del suej-o aglutinante, mezclar e
incubar a 37“C durante una hora.
Método La lectura de los resultados se efectúa de
manera similar a la indicada en ¡os otros m éto­
1. Cualitativo: el esquema de la reacción es dos descriptos. Ausencia de aglutinación en el
el siguiente: tubo n® 1 y aglutinación en el tubo n° 2 (testi­
go) indica presencia de anticuerpos bloquean­
tes. Aglutinación en ambos tubos expresa re ­
T uhos / 2 sultado negativo.
2. Cuantitativo: se repite el ensayo anterior,
G lóbulos rojos al 1% (mi) 0,1 0,1 usando diluciones seriadas del suero a valorar.
Suero a valorar (mi) 0,2 -
N aC I 0,15 M (mi) - 0,2 El título estará dado por la máxima dilución ca ­
paz de inhibir aglutinación.

Incubar una hora a 37°C, centrifugar y lavar DETECCIÓN DE ANTICUERPOS

no menos de tres veces con 20 volúmenes de CONTRA ANTÍGENO NUCLEAR
NaCl 0,15 M para eliminar las proteínas no an­ EXTRACTARLE (ENA)
ticuerpos inespecíficamente adheridas. Volcar
los sobrenadantes y añadir a cada tubo 0,1 mi Se sigue esencialmente la técnica de hem oa­
de suero de Coombs. Incubar a 31°C durante 15 glutinación pasiva de Boyden con la siguientes
minutos, centrifugar y determinar si hay agluti­ variantes.
nación.
El tubo 1 es el de reacción, y el 2, el de con­ M aterial necesario
trol. Aglutinación en el tubo 1 indica presencia
de anticuerpos incompletos. a) Antígeno: extracto salino de timo de co n e­
2. Cuantitativo: repetir el ensayo anterior, jo. La concentración óptima es 1 mg de proteí­
usando diluciones seriadas del suero a valorar. na por mi.
720 Metodologías

b) Suero a valorar: previo a su uso debe ser
calentado a 56“C durante 30 minutos.
c), d) y e) Igual a la técnica original.
f) Glóbulos rojos lavados al 4%. Se emplean
glóbulos rojos humanos, grupo O, Rh negativo.
g) Igual a la técnica original.
h) Tañado de los hematíes: mezclar voMme-
nes iguales de glóbulos rojos lavados al 4% y
ácido tánico al 1:20.000. Incubar 30 minutos a
temperatura ambiente y 30 minutos a 4°C. La­
var 3 veces con solución de buffer pH 7,2. Re-
suspender luego hasta volumen original.
i) Sensibilización de los hematíes: mezclar
volúmenes iguales de glóbulos rojos tañados y
solución antigénica. Mezclar y dejar a tem pe­
ratura ambiente durante una hora. Centrifugar
y lavar una vez con solución buffer de pH 7,2
y dos veces con suero normal de conejo al 2%
en solución salina, llevando parcialm ente el
sedim ento a volum en original con el mismo
diluyente. Dividir el volumen total de la sus­
pensión de glóbulos rojos en partes iguales. A
una de ellas se le agrega una solución de RNa-
sa a razón de 1 mg por cada mi de suspensión
de glóbulos rojos y se coloca 30 m inutos a
37“C.
rojos tañados y sensibilizados tratados o no con
RNasa.
Se continúa igual que en la técnica original.
Interpretación
Si las dos series de sueros a los que se les
agregaron glóbulos rojos tañados y sensibiliza­
dos con RNasa y sin ella tienen igual título, la
positividad es debida solamente a anticuerpos
contra antígeno Sm. Si la positividad se en ­
cuentra únicamente en la serie donde se coloca­
ron las células sin tratar, los anticuerpos están
dirigidos contra antígeno RNP solamente. Si
por el contrario, la reducción del título en la se­
gunda serie no es total, habrá presencia de anti­
cuerpos contra ambos antígenos.
VALORACIÓN DE ANTITOXINAS
POR NEUTRALIZACIÓN
Se describirá como modelo la valoración de
antitoxina tetánica.
M aterial necesario

a) Toxina valorada: las instituciones oficia­

M étodo
Se realizan dos series de diluciones por cada
suero en estudio. En cada orificio de la micro-
placa se colocan 50 )ll del suero a valorar dilui­
do en razón 2, utilizando suero normal de cone­
jo al 2% en solución salina como diluyente. Se
añaden a todos los orificios de una serie 25 |J,1
de glóbulos rojos tañados y sensibilizados y a
los de la otra serie los glóbulos rojos tañados,
sensibilizados y tratados con RNasa. Se inclu­
yen orificios testigo que contienen la primera y
la última dilución de cada suero en estudio a
los que se les añaden 25 ¡il de glóbulos rojos
tañados, no sensibilizados; además, orificios
donde se colocan 50 |ll de diluyente y glóbulos
les proveen antitoxinas patrones para la valora­
ción de toxinas, dada la poca estabilidad de és­
tas. Para ello se hace una dilución conveniente
de la toxina en solución salina, la que es mez­
clada en diferentes dosis con una cantidad co­
nocida de antitoxina (en este caso 0,1 UA),
com pletando a un volum en final de 2,5 mi.
Después de 45 minutos de reposo a temperatu­
ra ambiente se inoculan cobayos de 300 ± 20 g
de peso.
La dosis de toxina tetánica a utilizar en futu­
ras valoraciones de antitoxina es la que mezcla­
da con 0,1 UA m ata al cobayo en 96 horas
(véase cap. 3).
A continuación se transcribe como ejemplo
un protocolo de valoración de toxina tetánica:

Antitoxina O bservaciones Título

tetánica de la
Toxina tetánica patrón ¡Solución salina Cobayos H oras toxina
al 1 p o r m il (mi) 0,1 U Alm l (mi) (mi) (peso en g) 24 48 72 96 (mg)

0,21 ■ 1 1,28 285 0 0 0 0

0,22 1 1,28 300 0 0 It It
0,23 1 1,27 310 0 It t t
0,24 1 1,26 295 It t t mt
0,2-5 1 1,25 290 It t mt ■ + 0,25
0,26 ] 1,24 305 t t +
0,27 I 1,23 295 t mt +
0: au se n cia de tétanos; It; ligero tétanos; t: tétan o s; m t: m u ch o tétan o s; +; m u erte d el anim al.
 Métodos utilizados para la identificación y cuantificación de antígenos 721

. O bservaciones
Antitoxina tetánica T oxina patrón T ítu lo
a valorar (1:1.000) Solución salina Cobayos H oras U A /m l
( l m l dilución) (d. test 0,2.5 ml) (ml)' (pe.m en g) 24 48 72 ■ 96

1:6.000 0,25 1,25 305 0 0 0 0

1:7.000 0,25 1,25 310 0 0 0 0
1 :8.000 0,25 1,25 295 0 It It t
1:9.000 0,25 1,25 280 It It t t
1 :10.000 0,25 ■ 1,25 295 It t t mt
1: 11.000 0,25 1,25 300 t t mt + 1.100
1 : 12.000 0,25 1,25 285 t mt +

b) Cobayos de 300 ± 20 g de peso, sanos y suspende al 0,5% en la misma solución. E sta

bien alimentados.. concentración puede variar según las técnicas y
e) Solución salina: NaCl 0,15 M. los virus a identificar.
d) Tubos cónicos anchos y cortos (20 x 40 b) L íquido hem oaglutinante: proviene de
mm) para la mezcla de la toxina y antitoxina. medios de cultivo, líquido amniótico, líquido
e) Pipetas de 1 ml, 2 ml y 5 ml. alantoideo de embriones de pollo infectados,
f) Jeringas hipodérmicas 5 ml, agujas 25/6. etcétera.
c) Tubos de hemólisis.
Método de valoración d) Pipetas de 1 ml.
e) Solución salina fosfatada: NaCl 0,15 M,
Es similar al indicado para la valoración de fosfatos 0,01 M, pH 7,2.
toxina, con la diferencia que lo desconocido, en
este caso, es la antitoxina (véase cuadro, arri­ Método
ba).
Preparar con el líquido hemoaglutinante d i­
luciones que van de 1:20 a 1:5.120, usando so­
HEMOAGLUTINACIÓN POR VIRUS lución salina fosfatada como diluyente. R epar­
Y NEUTRALIZACIÓN tir las diluciones en una serie de tubos de h e ­
DE HEM OAGLUTINACIÓN» mólisis a razón de 0,5 ml por tubo. Añadir a to­
dos los tubos 0,5 ml de la suspensión de hem a­
N um erosos virus tienen la propiedad de tíes, agitar y dejar a temperatura ambiente por
aglutinar hematíes sobre los que se han fijado. 90 minutos.
Asimismo, los sueros que contienen anticuer­ El título hemoaglutinante estará dado po r la
pos antivirales inhiben específicamente la he- máxima dilución aglutinante.
moaglutinación.
Los dos fenómenos, son de uso corriente en Inhibición de hemoaglutinación
virología. El primero, para detectar la presencia
de un virus en un medio de cultivo, y el segun­ M aterial necesario
do, para establecer un diagnóstico serológico
en el caso de una infección viral generadora de a) Suero a analizar. Para eliminar inhibidores
anticuerpos específicos. inespecíficos conviene calentar a 58°C durante
20-30 minutos.
Hemoaglutinación b) Líquido hemoaglutinante.
c) Suspensión de hematíes al 0,5%
M aterial necesario d) Tubos de hemólisis.
e) Pipetas de 1 ml.
a) Glóbulos rojos: el poder aglutinante de un f) Solución salina tamponada.
virus no se manifiesta sobre todos los glóbulos
rojos, sino sobre los de determinadas especies. Método
El virus de la influenza aglutina los glóbulos
rojos de pollo y humanos grupo 0; el de las pa­ Efectuar diluciones seriadas del suero a an a­
peras, los de pollo, cobayo, camero y humanos; lizar en volúmenes de 0,25 ml, usando como di­
el de la poliom ielitis, los hum anos, etc. Su luyente solución salina fosfatada. Añadir a cada
elección dependerá del virus a investigar. uno de los tubos 0,25 ml de líquido hemoaglutí-
Se los obtiene por punción venosa o cardía­ nante (4 unidades/0,25 ml). Mezclar, dejar en
ca, y se los recoge en solución de Alsever. contacto 15 minutos y añadirles 0,5 ml de sus­
Para su uso se los lava v arias veces con pensión de hematíes al 0,5%. Dejar a tem pera­
NaCl 0,15 M, fosfatos 0,01 M, pH 7,2 y se los tura ambiente 1 hora y leer los resultados. ■
722 Metodologías
El título estará dado por la más alta dilución
del suero capaz de inhibir la hemoaglutinación.
ANAFILAXIA (ANTICUERPOS
CITOTRÓPICOS)
A nafilaxia generalizada
A c t iv a
M aterial necesario
a) A ntígeno sensibilizante: se u tilizará el
más apropiado. Es muy recomendable para fi­
nes demostrativos la ovoalbúmina purificada.
b) Solución salina: NaCl 0,15 M.
c) Jeringas hipodérm icas de 1 mi y agujas
25/ 6 para inoculaciones subcutáneas e intrape-
ritoneales y 15/3 para inoculaciones intraveno­
sas.
d) Tubos de ensayo, pipetas de 1 mi, 2 mi y
5 mi.
e) Cobayos. Son recomendables los albinos
de la raza Hatíey, de 300 g de peso, por su ma­
yor sensibilidad para este tipo de ensayos.
Método
Preparar una solución de antígeno en solu­
ción salina (50 mg.ml) e inocular a cada coba­
yo 0,5 mi por vía subcutánea y 0,5 mi por vía
intraperitoneal. Tres semanas después, desen­
cadenar, inoculando por vía intravenosa, 1 mi
de solución antigénica al 5%. Si el animal esta­
ba suficientemente sensibilizado, presentará a
los pocos m inutos los síntom as del “ shock”
anafiláetico (véase cap. 32).
Las venas más fácilmente abordables son las
de las patas delanteras y traseras y la del pene.
Con los debidos cuidados, la inoculación puede
hacerse también por vía intracardíaca.
P a s iv a
M aterial necesario
a) Suero sanguíneo proveniente de un animal
activamente inmunizado.
b) Cobayos no inmunizados.
c) Los restantes materiales indicados en ana­
filaxia activa generalizada.
Método
Inocular los cobayos, por vía intravenosa,
con 1-2 mi del suero inmune. Por la misma vía
inocular 12-18 horas después, 1 mi (10 mg.ml)
de la m ism a solución antigénica usada para
sensibilizar al animal dador. A los pocos minu­
tos aparecerán los síntomas del “shock” anafi-
láctico.
A nafilaxia local
A c t iv a
l . Anafilaxia cutánea
M aterial necesario
a) Animal activamente inmunizado (cobayo,
ratón).
b) Antígeno: solución al 0,01-0,02% en solu­
ción salina.
c) Solución salina; NaCl 0,15 M.
d) Solución colorante; azul de Evans al 0,5-
1% en solución salina.
e) Jeringas tipo tuberculina y agujas 15/5 pa­
ra las inoculaciones intradérmicas y 15/3 para
las endovenosas.
Método
Rasurar los animales en la parte dorsal, pro­
curando no producir lesiones, las que inciden
desfavorablemente en los resultados al producir
extravasaciones no específicas del colorante.
Inocular por vía intradérmica, en la zona ra­
surada, 0,1 mi de la solución antigénica. A una
distancia no inferior a los 2 cm, inocular 0,1 mi
de solución salina como control. Inm ediata­
mente después, inocular por vía intravenosa 0,5
mi de la solución colorante.
Si la reacción es positiva, entre los 15-30 m i­
nutos, en el punto de inoculación del antígeno
aparecerá una mancha azul cuya intensidad y
tamaño dependerán del grado de sensibiliza­
ción del animal.
La mejor manera de leer la reacción es sacri­
ficar al animal, quitarle la piel rasurada y ob­
servarla por transiluminación. En estos casos se
pueden m edir muy bien los diámetros de las
manchas del colorante, lo que permitirá expre­
sar los resultados en cruces según dicho diáme­
tro, a saber;
Diámetro del. halo (cm) Grado de positividad
0,5 -f
1 +
1,5 ++
2 + ++
m ás de 2 ++++
2. Des granulación de los mastocitos^^
M aterial necesario
a) Animal activamente inmunizado (cobayo,
ratón).
 Métodos utilizados para la identificación y cuantificación de antígenos
b) Antígeno: solución al 0,01-0,02% en solu-
eión salina.
c) Solueión salina: N aCl 0,15 M, fosfatos
0,01 M, pH 7,2.
d) Solución fijadora: alcohol metílico 50 mi,
agua 50 mi, ácido acético 3 mi.
e) Solución colorante: tionina acuosa al 1%.
f) Portaobjetos: placas de Petri.
g) Pipetas de 1 mi y 5 mi.
h) Pipetas Pasteur.
i) Microscopio.
Método
Sacrificar los animales; con la mayor pulcri­
tud separar la serosa peritoneal y adosarla a los
portaobjetos, los que son colocados en una pla­
ca de Petri. Cubrirlos con la solución antigéni­
ca y mantenerlos de preferencia a 4°C durante
20-30 minutos. V olcar el antígeno, lavar con
solución salina tamponada y cubrir con el fija­
dor, previamente enfriado a 4“C. Se lo deja ac­
tuar durante 30 minutos, se lava con solución
salina tamponada y finalmente se cubre eon el
colorante durante 3 minutos. Se lava, se seca y
se observa al microscopio.
Deben incluirse siempre testigos sin antíge­
no.
El resultado se expresa en p o rcentaje de
mastocitos desgranulados, el que debe estable­
cerse co m o p ro m e d io de no m en o s de
2.0003.000 células contadas (fig. 32-10 cap.
32).
P a s iv a
1. Anafilaxia cutánea^^
M aterial necesario
a) Suero sanguíneo proveniente de un animal
activamente inmunizado.
b) Cobayos no inmunizados.
c) Solución de antígeno al 0,2% en solución
salina.
d) El mismo material indicado en anafilaxia
cutánea activa.
Método
Rasurar los cobayos en la parte dorsal e ino­
cularles 0,1 mi de diluciones del suero en ensa­
yo. Tres horas después, inocular por vía intra­
venosa 1 mi de una mezcla en partes iguales de
solución antigénica y colorante. A los 15-30
m inutos leer los resultados, procediendo de
igual modo al indicado en anafilaxia cutánea
activa (fig. 32-11, cap.32).
723
2. Desgranulación de los mastocitos
M aterial necesario
a) Suero sanguíneo proveniente de un anim al
activamente inmunizado.
b) Cobayos no inmunizados.
c) El mismo material indicado en desgranu­
lación activa de mastocitos.
M étodo
Los portaobjetos conteniendo la serosa p eri­
toneal, preparados según las indicaciones espe­
cíficas en el método activo, se cubren con dilu­
ciones del suero a ensayar. Se los deja en con­
tacto 30 minutos, se lava con solución salina
tamponada y se los cubre con el antígeno, con­
tinuando luego con la metodología indicada al
hablar de desgranulaeión activa.
Es necesario incluir testigos de suero, antíge­
no y solución salina.
IN M U N O FLU O RESC EN C IA ^’-
M aterial necesario
a) Antisueros marcados con el fluorocromo
(isotioeianato de fuoresceína). Separar la frac­
ción globulínica del suero inmune por precipi­
tación con un volumen igual de solución satu­
rada de sulfato de amonio. Conviene añadir la
solución salina sobre el suero, en un tiempo de
2 a 3 minutos, con mantenimiento constante de
la agitación durante una hora, mediante el em ­
pleo de un agitador magnético. Centrifugar a
5.000 rpm durante 30 minutos, desechar el so­
brenadante y redisolver el precipitado en agua
destilada, en un volumen igual a la mitad ini­
cial. Reprecipitar con sulfato de amonio y d i­
solver el precipitado en iguales condiciones a
las indicadas en la primera precipitación. C olo­
car el precipitado en un tubo de celofán y d iali­
zar frente a solución salina tam ponada h asta
reacción negativa de sulfatos en el líquido de
diálisis, usando solución de cloruro de bario al
5% como reactivo indicador. La diáhsis debe
hacerse a 4“C, con agitación constante (agita­
dor magnético), recambiando la solución salina
cada 4 horas.
Finalizada la diálisis, se valoran las proteínas
totales por cualquiera de los métodos con o ci­
dos. Flallado este valor, se determina la canti­
dad de isotioeianato de fluoresceína a utilizar,
la que debe estar en relación de 0,02 mg a 0,03
mg por ing de proteína.
Para la marcación se diluye la solución p ro ­
teica en solución salina tam ponada hasta una
concentración de 20 a 30 m g.m f' y se lleva a
724 Metodologías

pH 9-9,5 con buffer de carbonato de sodio 0,5 fría. Agregar a la suspensión de tejido filtrado
M (partes iguales de carbonato de sodio 0,5 M 4 voMmenes de acetona fría, agitar en agitador
y bicarbonato de sodio 0,5 M). Las globulinas m agnético y centrifugar luego 10 m inutos a
colocadas en un vaso de precipitación son lle­ 2.000 rpm. Filtrar por Buchner cubierto con pa­
vadas a heladera (4°C) y se las agita con agita­ pel de filtro embebido en acetona y lavar el te­
dor magnético. Se añade la fluoresceína en pe­ jido retenido con varios volúmenes de acetona
queñas cantidades, no efectuando nuevos agre­ fría. Decantar el sobrenadante y repetir el lava­
gados hasta disolución del anterior, operación do con acetona otras cuatro veces. El material,
que lleva de 3 a 4 horas. La agitación debe con­ al que se le ha eliminado el máximo de acetona
tinuar toda la noche. por aspiración, es colocado en cajas de Petri o
Otra manera de efectuar el marcado es colo­ recipientes similares y secado en estufa a 37°C.
car la solución de IgG en una bolsita de celofán Si fuera necesario se lo puede triturar en morte­
para diálisis e introducirla en un recipiente con ro hasta transformarlo en polvo fino. Se lo con­
la cantidad adecuada de isotiocianato de fluo­ serva en heladera en frascos oscuros.
resceína disuelta en el buffer de marcación. Se O tra m anera de resolver el problem a, que
agita con agitador magnético a 4“C durante 18 perm ite obtener IgG conjugada con diferente
horas. El produv-co de marcación, contenido en número de moléculas de isotiocianato de fluo­
la bolsa de diálisis, resulta más hom ogénea­ resceína, libres a su vez de IgG no conjugada,
mente marcado que en el caso anterior. es el siguiente. Dializar el producto de conjuga­
La eliminación de la fluoresceína no conju­ ción frente a buffer de fosfatos 0,01 M, pH 7,6.
gada puede hacerse dializando la solución de El producto así obtenido se pasa por columna
globulinas frente a solución salina tamponada o de D EA E-celulosa equilibrada con el mismo
filtrando por Sephadex G-25, En este caso una buffer. A esa molaridad eluye la IgG no conju­
colum na de 1 X 30 cm que contenga 5 g de gada, la que de estar presente podría competir
Sephadex resulta útil para la purificación de por masa y actuar como bloqueante. Por elucio­
5-8 mi de solución conjugada. Como eluyente nes escalonadas con buffer de fosfatos 0,05 M,
se usa solución salina tamponada. 0,1 M y 0,2 M se obtienen poblaciones de IgG
Todo conjugado debe ser evaluado antes de que han fijado diferentes números de moléculas
su uso para determinar la intensidad de la tin­ de isotiocianato de fluoresceína, ya que esta
ción específica y la presencia y la cantidad de molécula aumenta la carga positiva del produc­
fondo o tinción inespecífica. Ello se determina to de conjugación. Cada pico eluido es concen-
m ediante reacciones de inm unofluorescencia , trado y analizado en cuanto a su capacidad de
frente a patrones conocidos. unión al antígeno y a su tinción inespecífica.
Un exceso de tinción inespecífica puede re­ Los eluidos con buffer de la más alta molari­
solverse a veces por simple dilución de conju­ dad corresponden a m oléculas de IgG m uy
gado. En otras, es necesario adsorber con polvo marcadas con la sustancia fluorescente y pre­
de tejidos, generalmente de hígado. La canti­ sentan una tinción basal más elevada. Los reac­
dad a utilizar es aproximadamente 100 mg por tivos más eficientes generalmente son los que
mi de conjugado a adsorber. La adsorción se eluyen con fosfatos 0,05 M, pH 7,6.
hace a 4-5“C durante una hora, y después se se­ c) Solución tamponada: NaCl 0,15 M, fosfa­
para el sobrenadante por centrifugación. Gene­ tos 0,01 M ,p H 7 ,2 .
ralm ente con dos adsorciones se consigue el d) Glicerina tamponada; a 9 partes de glice­
efecto deseado. rina neutra añadirle 1 parte de solución salina
b) Polvo de tejido para adsorciones. Colocar tamponada llevada a pH 9 con carbonato de so­
una determinada cantidad de órgano (hígado de dio 0,5 M.
ratones) en una licuadora y añadirle un volu­ e) M icroscopio para las lecturas: existen
men igual de agua destilada enfriada a 4“C. Tri­ equipos especiales. No obstante, puede ser usa­
turar durante 5 minutos, centrifugar y volcar el do un microscopio común que posea condensa­
sobrenadante. Repetir la operación dos o tres dor de fondo oscuro y lárnpara de luz ultravio­
veces para eliminar hemoglobina. Trasvasar a leta para la iluminación. Esta debe contar con
un vaso de precipitación, colocarlo sobre un filtros excitadores que dejen pasar solamente la
agitador magnético previa introducción de la luz ultravioleta deseada, y el microscopio debe
barra de agitación y añadirle cuatro volúmenes tener un filtro de bloqueo que impida la llegada
de acetona fría. Agitar 5 minutos. Trasvasar a del exceso de luz al ojo del observador.
tubos de centrífuga y centrifugar 10 minutos a
2.000 rpm. D ecantar el sobrenadante, añadir Método
solución salina tamponada, mezclar y centrifu­
gar. Repetir la operación 3-4 veces hasta que el 1. Directo.
líquido sobrenadante sea claro. Filtrar por do­ En este caso se emplea el anticuerpo especí­
ble gasa y lavar el residuo con solución salina fico marcado con el fluorocromo.
 Métodos utilizados para la identificación y cuantificación de antígenos
Sobre portaobjetos limpios y desengrasados
liacer las im presiones del material a analizar,
dejando secar a temperatura ambiente (aproxi­
m adam ente 30 m inutos). Introducirlos en un
vaso de Coplin con acetona fría y dejarlos en
heladera por un tiempo que puede variar entre
1 y 4 horas según el material a fijar.
Para la tinción, escurrir los portaobjetos y
dejar que tomen la temperatura ambiente. Cu­
brirlos con el anticuerpo marcado con el fluo­
rocromo, previamente diluido según su título y
dejarlos en cámara húmeda 30-60 min a 37°C.
Lavar con abundante solución salina tampona­
da para eliminar el ñuorocromo no fijado, en­
juagar rápidam ente con agua destilada, dejar
escurrir y secar.
Para la observación m icroscópica, m ontar
previamente con glicerina tamponada.
2. Indirecto
Para el método directo es necesario marcar
cada anticuerpo específico. En el indirecto se
hace actuar anticuerpo sin marca sobre el antí­
geno y sobre el complejo formado antigamma-
globulina (contra la gammaglobulina de la es­
pecie animal de la que proviene el anticuerpo
sin marca) conjugada con isotiocianato de fluo­
resceína. Tiene la ventaja de no necesitar un
anticuerpo marcado para cada antígeno.
Las impresiones del material antigénico so­
bre los portaobjetos se preparan de manera si­
milar al método directo. Se cubren con el anti­
cuerpo no marcado y se dejan en cámara húm e­
da a 37”C durante 30-60 minutos. Se lavan con
solución salina tam ponada; se cubren con la
antigammaglobulina marcada con isotiocianato
y se dejan en cámara húmeda 30-60 minutos a
37"C. Se lavan con abudante solución salina
tamponada y se enjuagan con agua destilada.
Se dejan escurrir y secar y, previamente a la
observación microscópica, se los monta en gli­
cerina tamponada (fig. 8-8, cap. 8).
INMUNOENZIMOLOGÍA»»..^)
Esta metodología puede usarse para analizar
cortes de tejidos o improntas celulares, de un
modo similar al que se hace por inmunofluo­
rescencia. Tiene la ventaja de que utiliza m i­
croscopía óptica común.
Puede usarse también para investigar y dosar
antígenos y anticuerpos previamente fijados a
placas de poiiestireno.
En este apartado sólo se describirá el método
usado para estudios de cortes histológicos, ya
que las otras aplicaciones del enzim oinm u-
noensayo, o ELISA, se describen en detalle en
el capítulo 38.
725
M aterial necesario
a) Inm unosuero m arcado con peroxidasa.
Los del comercio resultan útiles.
b) Buffer Tris-HCl 0,05 M, pH 7,6.
c) 0.1'^0 en el buffer indicado en b).
d) Irñprontas con el antígeno (cortes de teji­
dos, células, etc.) específico para los anticuer­
pos a investigar.
e) Suero a analizar.
f) Microscopio óptico común.
Método
a) Cubrir las improntas con el suero a anaU-
zar e incubar a 37°C por 15 minutos, en cám ara
húmeda.
b) Lavar y cubrir con antiinm unoglobulina
m arcada con peroxidasa, convenientemente di­
luida (1:10 a 1:50), e incubar a 37“C durante 15
minutos.
c) Lavar y cubrir con 1 ml del siguiente reac­
tivo:
3,3’ diaminobencidina. HCl 5 mg
Buffer Tris-HCl 0,05 M, pH 7,6 9 ml
im l
(preparar la mezcla en el momento de usar)
Mantener a temperatura ambiente durante 20
minutos, lavar, secar y observar al microscopio.
Los antígenos que han reaccionado con el
correspondiente anticuerpo y la antiinmunoglo­
bulina marcada con peroxidasa toman colora­
ción pardusca.
Los sueros marcados con peroxidasa pueden
ser antiinmunoglobulinas totales o m onoespe­
cíficos.
DETECCIÓN DE COMPLEJOS
INMUNES
1. Dosaje de complejos inmunes usando fa cto r
reumatoideo 19S monoclonal
El método se funda en la interacción que tie­
ne lugar entre el factor reumatoideo IgM 19 S
monoclonal y la IgG agregada. Si se utiliza fac­
tor reumatoideo marcado con se lo puede
hacer com petir con factor 19 S frío y de esa
manera llegar a determinar la IgG agregada (in-
munocomplejo).
M aterial necesario
a) Buffer de unión: Tris HCl 0,075 M, E D ­
TA.N a, 0,01 M, seroalbúm ina bovina al 1%,
pH 7,4."
b) IgG agregada: disolver 600 mg de IgG
comercial en 30 ml de solución salina tam po-
726 Metodologías

nada (SST), pH 7,4. Calentar a 63°C por 20 m i­ bos y determinar las cpm en contador de radia­
nutos y centrifugar a 145.000 x g a 4“C durante ciones gamma.
1 hora. Suspender los sedimentos en 10 mi de Las muestras se analizan por duplicado.
SST y homogeneizar con un homogeneizador Deben incluirse los siguientes controles: 1)
de tejidos. Centrifugar a 600 x g durante 15 mi­ buffer de unión solo, sin muestra ni IgG agre­
nutos a 4“C, separar el sobrenadante y guardar­ gada y ‘^‘’I.FRm. Mide la unión no específica,
lo en alícuotas a -70°C. Cuando se lo va a usar, que debe ser descontada de todos los tubos de
descongelar y centrifugar a 600 x g por 15 mi­ reacción; 2) IgG-Sepharosa y '^T.FRm. Deter­
nutos. Cuantificar los agregados del sobrena­ mina 100% de unión.
dante midiendo la concentración proteica por el El porcentaje de inhibición se calcula como
método de Lowry. sigue
c) IgG-Sepharosa: véase Fijación de proteí­
Cpm 100% de unión - cpm de la m uestra
nas a Sepharosa activada con CNBr (cap. 41). % inhibición --------------------------------------------------------- x 100
d) Factor reumatoideo purificado (FRm): se cpm 100% de unión
lo aísla de pacientes con enfermedades linfo-
proliferativas (artritis reumatoidea) o crioglo- Los resultados, comparados con la curva de
bulinemias. calibración obtenida con diferentes concentra­
Si el factor reumatoideo es una crioglobuli- ciones de IgG agregada, perm ite expresar la
na, se separa ésta del suero por enfriamiento a concentración de los com plejos inm unes en
4°C durante 24 horas. Se centrifuga, se lava concentraciones equivalentes de IgG agregada.
eon SST y se la disocia con buffer de acetato
0,1 M, pH 4. Si la unión fuera muy fuerte usar 2. Determinación de complejos inmunes fija ­
glicina-FlCl 0,1 M, pFl3. Filtrar por columna dores de complemento p o r su interacción
de Sephadex G-200 estabilizado con el mismo con células Raji
buffer. E lu ir con el b u ffer de diso ciació n .
El factor reum atoideo eluye con el volum en Las células Raji son una línea celular linfo-
de exclusión (véase cap. 41). Los tubos que blastoide hum ana cultivada, derivadas de un
contienen el FRm se juntan y dializan contra linfoma de Burkitt. Los complejos inmunes que
SST, fijan el complemento se unen a los receptores
Si el factor reumatoideo no es una crioglobu- de C lq , C3b y C3d que tienen esas células. Co­
lina, se lo aísla por cromatografía de afinidad mo carecen de receptores Fe, los complejos fi­
usando una columna de IgG-Sepharosa. Previo jados pueden detectarse eon un suero antigam-
lavado de la colum na con SST, se disocia el maglobulina.
FRm por tratamiento con glicina-HCl 0,1 M,
pH3, procediendo de inmediato a su neutraliza­ Material necesario
ción con Tris y diálisis posterior frente a SST.
Se lo conserva a -70°C. a) Medio esencial de Eagle: los cultivos de
e) IgG radiomarcada con véase el capí­ células R aji se m antienen en el laboratorio
tulo 41. por pasaje en medio esencial de Eagle suple-
mentado.
Método La composición de este medio es la siguien­
te: L-arginina 17,4 mg; L-cistina 6,0 mg; L-his-
En dos tubos de plástico de 10 x 75 mm co­ tidina 3,2 mg; L-isoleucina 26,2 mg; Lleucina
locar, respectivam ente, 0,1 mi de buffer de 13,1 mg; L -lisina 18,2 mg; L -m etionina 7,5
unión y 0,1 mi de m uestra a ensayar diluida mg; L-fenilalanina 8,3 mg; L-treonina 11,9 mg;
1:10. En otra serie de tubos, colocar 0,1 de IgG L-triptófano 2 mg; L-tirosina 18 mg; L-valina
agregada a la concentración de 200, 100, 50, 11,7 mg; L-glutam ina 146 mg; colina 1 mg;
25, 12 y 6 )i,g.mf' para confeccionar la curva ácido nicotínico 1 mg; ácido pantoténico 1 mg;
de calibración. piridoxal 1 mg; riboflavina 0,1 mg; tiamina 1
Añadir 0,1 mi de ’^q.pRm (2 ¡ag.mf’; activi­ mg; inositol 1 mg; biotina 1 mg; ácido fóhco l
dad específica 0 ,1 jiCi.mg^*)- mg; glucosa 2.000 mg; NaCl 8.000 mg; KCl
Mezclar en mezclador Vortex y añadir 0,25 400 mg; CaCl^ 140 mg; M g S o ,.7 H p 100 mg;
mi de una suspensión de Ig G -S ep h aro sa al M g C L .ó H p 100 mg; N a,H P 0 ,.2 H 2 0 60 mg;
1,25%. Añadir 0,55 mi de buffer de unión, ta­ KHjPO^ 60 mg; NaHCOj 350 mg; rojo fenol
par los tubos e incubar a temperatura ambiente, 20 mg; penicilina 0,5 mg; agua destilada hasta
por 18 horas, con rotación. 1 litro.
Centrifugar los tubos tapados a 200 x g du­ b) Suero de conejo anti-IgG humana: se ob­
rante 2 minutos, quitar los tapones y aspirar los tiene como se indica en el capítulo 37. La frac­
sobrenadantes. Lavar tres veces con NaCl 0,4 ción IgG del suero se marea en por el m é­
M, EDTA 0,1 M, pH 7,4. Volver a tapar los tu­ todo de la cloramina T (cap. 33). Se la diluye a
 Métodos utilizados para la identificación y cuantificación de antígenos
1 mg.mf*; actividad específica alrededor de 3 x
10^ cpm.|i,g^'.
Método
Células Raji de 72 horas de cultivo (2x10'’
células en 200 |J,1 de medio) se transfieren a tu­
bos plásticos cónicos de 1,5 ml (Eppendorf).
Añadir 1 ml de m edio mínim o de Eagle sin
Ca^t ni Mg^+ y centrifugar a 800 x g durante 8
miriutos. Aspirar los sobrenadantes y resuspen­
der las células en 50 |0,1 del mismo medio. Aña­
dirles 25 |al del suero a ensayar diluido 1:4 en
NaCl 0,15 M e incubar a 37"C por 45 minutos,
agitando manualmente cada 5-10. Lavar las cé­
lulas tres veces con el medio de Eagle. Después
del último lavado añadir la anti-IgG hum ana
marcada con y dejar reaccionar a 4°C por
30 minutos, agitando cada 5 minutos. La anti-
IgG debe usarse a la dilución óptima, previa­
m ente determ inada, usando como diluyente
medio mínimo de Eagle adicionado de albúmi­
na humana al 1%.
Después de la incubación se lavan las células
tres veces, se elimina el sobrenadante y se de­
termina la radioactividad del sedimento en un
contador de radiaciones gamma.
Deben incluirse testigos de medio de cultivo
y células Raji, sin la muestra a anahzar, para
determ inar la captación inesp ecífica de ra ­
dioactividad por las células Raji.
Se calcula el porcentaje de radioactividad re­
tenida siguiendo el procedimiento indicado en
valoración de inmunocomplejos con ‘^“’I.FRm.
Con el dato obtenido, utilizando una curva de
calibración preparada de igual manera que la
indicada para la muestra en análisis, pero utili­
zando en este caso cantidades variables de IgG
agregada mezcladas con suero humano normal
diluido 1:2 (fuente de complemento), se deter­
mina la concentración de inmunocomplejos ex­
presados como IgG agregada.
3. D eterm inación de com plejos inmunes p o r
precipitación con polietilenglicol (PEG)
El PEG es un polímero no cargado, soluble
en agua que añadido a un suero produce la
precipitación de proteínas sin que éstas expe­
rimenten desnaturalización. Esta precipitación
es en cierto modo dependiente de la concen­
tración y el peso m olecular de las proteínas
presentes, las cuales en condiciones normales
no p recipitan con concen tracio n es de PEG
6.000 inferiores al 4%. Los complejos inm u­
nes, dado el mayor peso molecular, son preci-
pitables con PEG al 3% concentración final.
El método, si bien práctico, presenta errores
ya que todo agregado existente en el suero por
valorar en el que no participan las inm unoglo­
727
bulinas - o componentes proteicos de muy alto
peso m olecular com o las m acro g lo b u lin as-,
algunos componentes del sistema com plem en­
to o productos que participan en los fenóm e­
nos de la inflamación, pueden ser precipitados
por PEG al 3%. No obstante ello, es un m éto ­
do que aún se sigue utilizando en los exám e­
nes rutinarios.
M aterial necesario
a) Polietilenglicol (PEG) 6.000 (Mr 6.000)
al 6% en SST. Antes de usar filtrar por papel
de filtro W hatman N° 1.
b) NaCl 0,15 M, fosfatos 0,01 M . pH 7,4.
M étodo
Mezclar volúmenes iguales de suero a anali­
zar y PEG 6.000 al 6%. Incubar 1 hora a A°C.
Centrifugar a 1.000 x g a 4“C en centrífuga
refrigerada, por 20 minutos.
Rem over el sobrenadante y lavar el precipi­
tado con PEG 6.000 al 3% en SST.
La valoración del precipitado obtenido p u e­
de hacerse por métodos nefelométricos o redi-
solviéndolo en NaOH 0,1 N y midiendo la ab­
sorbancia a 280 nm. Si se multiplica la D 0 2 8 0
x E l'tm de la IgG humana (12,3) x factor de
dilución se obtiene el valor que permite ex p re­
sar la concentración de inm unocomplejos co­
mo IgG.
4. Valoración de complejos inmunes p or f i ja ­
ción a eritrocitos de pollo
El método se basa en la capacidad que tienen
los eritrocitos de los diferentes vertebrados de
fijar, por intermedio de un receptor específico,
el fragmento Fe de IgG agregado bajo la form a
de complejo Ag-Ac. Los glóbulos rojos hum a­
nos no tienen receptores para Fe en su superfi­
cie y sólo los exponen después de tripsiniza-
ción.
Para el desarrollo del método los eritrocitos
a usar serán los de pollo.
M aterial necesario
a) G lóbulos rojos de p o llo obtenidos de
sangre heparinizada. Antes de su uso se los la­
va 5 veces con NaCl 0,15 M.
b) Suero a analizar. Debe ser previam ente
calentado a 56°C durante 30 minutos y cen tri­
fugado a 10.000 rpm durante 15 minutos.
c) Suero anti-IgG hum ana. Se lo ob tien e
por inoculación de IgG en conejos, de acuerdo
con los planes de inmunización indicados en el
capítulo 45. Antes de su uso se lo adsorbe con
glóbulos de pollo.
728 Metodologías
M étodo
En una serie de tubos de hemólisis, se colo­
can 0,2 mi de diluciones crecientes, en razón 2,
del suero a analizar y 0,05 mi de glóbulos rojos
de pollo al 1%. Después de incubar a 4°C du­
rante 18 horas, observar los tubos para estable­
cer si hubo aglutinación directa. Los tubos no
algutinados lavarlos con NaCl 0,15 M e inves­
tigar si tienen fijados com plejos A g-Ac m e­
diante reacción de Coombs con suero anti-lgG.
El título, en valores relativos, se expresa por
la inversa de la máxima dilución del suero ca­
paz de dar una reacción de Coombs positiva
cuando previamente ha sido incubado a 4“C du­
rante 18 horas.
Por este método se puede detectar hasta 1 (ig
de complejo inmune (expresado como Ac en el
complejo), cuando los complejos existentes en
el suero están en la relación M/M Ac/Ag = 3,8
o ligeramente superior. Los complejos forma­
dos en marcado exceso de Ag (relación M/M
Ac/Ag = L8 o menor) no se fijan en los eritro­
citos.
Cuando hay alta concentración de com ple­
jos, especialmente los formados por anticuer­
pos precipitantes, suele observarse aglutinación
directa de los eritrocitos.
BIBLIOGRAFIA
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35. D resser, DW ; W ortis. HH: N attire, 208:859, 1965.
 Metodologías para la evaluación
de las células inmunocompetentes
CLAUDIA MONGINl
CLAUDIA WALDNER
IN T R O D U C C IÓ N
El estudio del sistema inmune es de funda­
mental importancia ya que posibilita el enten­
dimiento y el control de varias enfermedades
autoinmunes y de aquellas que directa o indi­
rectam ente afectan la respuesta inmune. Las
metodologías descritas en este capítulo están
dirigidas, a investigar las funciones inmunes en
individuos normales y en pacientes con enfer­
medades congénitas o adquiridas. Además, los
protocolos pueden ser aplicados al estudio de
procesos infecciosos o de envejecimiento del
sistema inmune, no sólo en seres humanos, si­
no también en modelos experimentales.
La importancia de la evaluación funcional se
fundamenta en el uso creciente de estas técni­
cas en el diagnóstico y en el monitoreo de pa­
cientes eon cáncer, SIDA, enfermedades au ­
toinmunes y de aquellos que recibirán un tras­
plante de órganos. Además, la utilización de
agentes inmunomoduladores en la práctica clí­
nica y de modificadores de la respuesta bioló­
gica en experimentos clínicos, hacen necesario
el empleo de técnicas confiables para el segui­
miento de las funciones del sistema inmune. En
la actualidad, es posible medir un amplio es­
pectro de parámetros funcionales que van des­
de la activación, la proliferación, la síntesis de
sustancias inmunomoduladoras hasta la funcio­
nalidad de las células efectoras. La mayoría de
las disfunciones del sistema inmune se tradu­
cen en la falta o depresión en uno o más de ps-
. tos parámetros.
En la rama humoral de la respuesta inmune,
mediada por linfocitos B, la producción de anti­
cuerpos inducida por inmunización o sensibili­
36
zación con un determinado antígeno, y la poste­
rior medición de los anticuerpos por ensayos
cualitativos y cuantitativos, proveen inform a­
ción acerca de la respuesta de los linfocitos B
como el resultado final de un ntiniero de eventos
celulares independientes pero inteiTelacionados.
En la ram a celular de la respuesta inm une
m ediada por linfocitos T se realizan, com o
pruebas funcionales, ensayos in vitro que son
relativamente simples y de fácil reproducibili­
dad. Sin embargo, éstos no son indicativos de
la suma de los fenómenos complejos observa­
dos en un individuo ya que utilizan poblaciones
aisladas de linfocitos o subpoblaciones de célu­
las purificadas. Por el contrario, la prueba cutá­
nea de hipersensibilidad retardada es el único
ensayo in vivo de la función de las células in­
m unocom petentes y puede proveer in fo rm a­
ción valorable acerca del estado inmune en su
totalidad.
La caracterización fenotípica de las células
inmunes, así como la determinación del núm e­
ro de éstas, a menudo no ofrece información
acerca de su actividad, porque el fenotipo celu­
lar frecuentem ente no se correlaciona con la
funcionalidad de las células.
El personal involucrado en la ejecución de
las técnicas aplicadas en la evaluación de la in­
munidad celular, no sólo deberá estar capacita­
do para trabajar en las condiciones de esterili­
dad requeridas e indispensables para el cultivo
de células, sino también estar familiarizado con
las normas de bioseguridad. Es por ello que en
primer lugar se detallan una serie de conceptos
básicos que deberá conocer todo operador an­
tes de realizar las técnicas que se describen a
continuación.
728 Metodologías
M étodo
En una serie de tubos de iiemólisis, se colo­
can 0,2 ml de diluciones crecientes, en razón 2,
del suero a analizar y 0,05 ml de glóbulos rojos
de pollo al 1%. Después de incubar a 4°C du­
rante 18 horas, observar los tubos para estable­
cer si hubo aglutinación directa. Los tubos no
algutinados lavarlos con NaCl 0,15 M e inves­
tigar si tienen fijados com plejos A g-Ac m e­
diante reacción de Coombs con suero anti-IgG.
El título, en valores relativos, se expresa por
la inversa de la máxima dilución del suero ca­
paz de dar una reacción de Coombs positiva
cuando previamente ha sido incubado a 4“C du­
rante 18 horas.
Por este método se puede detectar hasta 1 (ig
de complejo inmune (expresado como Ac en el
complejo), cuando los complejos existentes en
el suero están en la relación M/M Ac/Ag = 3,8
o ligeramente superior. Los complejos forma­
dos en marcado exceso de Ag (relación M/M
Ac/Ag = 1,8 o menor) no se fijan en los eritro­
citos.
Cuando hay alta concentración de com ple­
jos, especialmente los formados por anticuer­
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 Metodologías para la evaluación
de las células inmunocompetentes
CLAUDIA MONGINl
CLAUDIA WALDNER
IN T R O D U C C IÓ N
El estudio del sistema inmune es de funda­
mental importancia ya que posibilita el enten­
dimiento y el control de varias enfermedades
autoinmunes y de aquellas que directa o indi­
rectam ente afectan la respuesta inmune. Las
metodologías descritas en este capítulo están
dirigidas, a investigar las funciones inmunes en
individuos normales y en pacientes con enfer­
medades congénitas o adquiridas. Además, los
protocolos pueden ser aplicados al estudio de
procesos infecciosos o de envejecimiento del
sistema inmune, no sólo en seres humanos, si­
no también en modelos experimentales.
La importancia de la evaluación funcional se
fundamenta en el uso creciente de estas técni­
cas en el diagnóstico y en el monitoreo de pa­
cientes con cáncer, SIDA, enfermedades au ­
toinmunes y de aquellos que recibirán un tras­
plante de órganos. Además, la utilización de
agentes inmunomoduladores en la práctica clí­
nica y de modificadores de la respuesta bioló­
gica en experimentos clínicos, hacen necesario
el empleo de técnicas confiables para el segui­
miento de las funciones del sistema inmune. En
la actualidad, es posible medir un amplio es­
pectro de parámetros funcionales que van des­
de la activación, la proliferación, la síntesis de
sustancias inmunomoduladoras hasta la funcio­
nalidad de las células efectoras. La mayoría de
las disfunciones del sistema inmune se tradu­
cen en la falta o depresión en uno o más de ps-
. tos parámetros.
En la rama humoral de la respuesta inmune,
mediada por linfocitos B, la producción de anti­
cuerpos inducida por inmunización o sensibili­
36
zación con un determinado antígeno, y la poste­
rior medición de los anticuerpos por ensayos
cualitativos y cuantitativos, proveen inform a­
ción acerca de la respuesta de los linfocitos B
como el resultado final de un ntímero de eventos
celulares independientes pero inteiTelacionados.
En la ram a celular de la respuesta inm une
m ediada por linfocitos T se realizan, com o
pruebas funcionales, ensayos in vitro que son
relativamente simples y de fácil reproducibili­
dad. Sin embargo, éstos no son indicativos de
la suma de los fenómenos complejos observa­
dos en un individuo ya que utilizan poblaciones
aisladas de linfocitos o subpoblaciones de célu­
las purificadas. Por el contrario, la prueba cutá­
nea de hipersensibilidad retardada es el único
ensayo in vivo de la función de las células in­
m unocom petentes y puede proveer in fo rm a­
ción valorable acerca del estado inmune en su
totalidad.
La caracterización fenotípica de las células
inmunes, así como la determinación del núm e­
ro de éstas, a menudo no ofrece información
acerca de su actividad, porque el fenotipo celu­
lar frecuentem ente no se correlaciona con la
funcionalidad de las células.
El personal involucrado en la ejecución de
las técnicas aplicadas en la evaluación de la in­
munidad celular, no sólo deberá estar capacita­
do para trabajar en las condiciones de esterili­
dad requeridas e indispensables para el cultivo
de células, sino también estar familiarizado con
las normas de bioseguridad. Es por ello que en
primer lugar se detallan una serie de conceptos
básicos que deberá conocer todo operador an­
tes de realizar las técnicas que se describen a
continuación.
730 Metodologías
1. C O N SID ER A CIO N ES DE
B IO SEG U R ID A D PARA
TRABAJAR CON MATERIAL
DE ORIGEN HUMANO SUSCEPTIBLE
DE ESTAR INFECTADO
El primer paso para trabajar eon material de
origen humano es considerar cada muestra eon
la que se trabaja como posiblemente infectada
y por lo tanto potencialmente peligrosa. Es por
ello que el personal que llevará a cabo los ex­
perimentos con muestras humanas debe estar
entrenado en el manipuleo de muestras conta­
minadas eon agentes patógenos. En este senti­
do el profesional a cargo deberá instruir al per­
sonal acerca de los procedim ientos y de los
m ateriales apropiados para trab ajar con las
muestras así como los pasos a seguir para pro­
cesar los desechos provenientes del material
posiblemente contaminado. A tal efecto, exis­
ten publicaciones editadas por organismos sa­
nitarios nacionales e internacionales (Biosafety
in M icrobiological and Biom edical laborato-
ries. NIH Publication #, 88-8395, U.S.; Normas
de bioseguridad. VIH, el virus de la inmunode-
ficiencia adquirida humana. Ministerio de Sa­
lud y Acción Social Secretaría de Salud, Bue­
nos Aires) en donde figuran la determinación
precisa de áreas de trabajo, normas de trabajo
p ara evitar la infección del o p erad o r y los
agentes químicos y físicos a emplearse en la
decontaminación.
A continuación se enum eran una serie de
normas básicas a seguir en el laboratorio donde
se procesan muestras de origen humano. Estas
reglas están destinadas primordialmente a pro­
teger al operador y a todas aquellas personas
que, de una u otra forma, estarán en contacto
con dichas muestras.
Normas de protección del operador
y manipulación del material
1. El operador debe utilizar guantes descarta-
bles. Si existe riesgo de salpicaduras deberá
utilizar anteojos y barbijo.
2. Se debe evitar pipetear cualquier material de
riesgo eon la boca, para ello se debe recurrir
a los pipeteadores manuales o automáticos.
3. No se debe fumar, comer ni beber en los si­
tios en donde se maneja material de riesgo.
Asimismo no se debe apoyar comidas ni be­
bidas sobre las mesadas de trabajo.
4. Se debe evitar el uso de elementos punzan­
tes y cortantes en la manipulación del mate­
rial.
5. Las agujas no deben ser dobladas ni coloca­
das en el capuchón. Estas serán colocadas
en recipientes de plástico resistente, sella­
dos.
6. Debe evitarse el material de vidrio para la
manipulación de la sangre, por este motivo
debe ser transportada y/o centrifugada en tu­
bos de material plástico con tapa a rosca.
Decontaminación del material
1. El material de vidrio o plástico deberá ser
colocado inm ediatamente después del uso
en una solución de lavandina extemporánea
al 10% y permanecer en remojo durante 18-
24 h.
2. El material descartable contaminado, así co­
mo los coágulos, cultivos y otros materiales
que puedan ser de riesgo deberán ser incine­
rados. Para ello deberán ser colocados en re­
cipientes de plástico eon tapas y depositarse
en contenedores especiales, destinados para
tal fin y correctamente rotulados.
3. Las agujas ya utilizadas serán incineradas
previo a su descarte.
4. Las mesadas de trabajo deberán ser deconta­
minadas antes y después de realizar el traba­
jo. Con esta finalidad se pueden utilizar al­
cohol al 70®, lavandina al 10% u otro desin­
fectante apropiado.
2. AISLAMIENTO DE POBLACIONES
CELULARES IN M U N O C O M PE T EN T ES
Antes de realizar una purificación o el enri­
quecimiento de poblaciones celulares inmuno-
competentes se deben considerar varios aspec­
tos: el órgano donde existe el mayor porcentaje
de las células de interés, la accesibiUdad de di­
cho órgano (en general cuando se trabaja con
seres humanos se utiliza sangre periférica), la
menor contaminación con otras células, etc. Es
por ello que resulta de gran importancia recor­
dar la distribución de las células pertenecientes
al sistema inmune en la sangre y en los tejidos
linfáticos secundarios (cuadro 36-1).
2.1. AISLAM IENTO DE CÉLULAS
M ONONUCLEARES HUMANAS
A PARTIR D E SANGRE PERIFÉRICA
POR MEDIO D E GRADIENTES
En la mayoría de las técnicas empleadas para
el estudio de las células inmunocompetentes es
ventajoso trabajar con las células mononuclea­
res sin la contam inación que representan los
eritrocitos y los granulocitos. A diferencia de
lo que ocurre con los eritrocitos, cuya presen­
cia no representa mayor problema, los granulo­
citos liberan sustancias tóxicas y por lo tanto es
conveniente proceder a su separación. Si bien
los nódulos linfáticos, las amígdalas y el bazo
poseen una baja proporción de granulocitos y
 M etodologías para la evaluación d e la s célu las in m u n ocom peten tes
Cuadro 36-1. Distribución de las poblaciones linfocitarias en los diferentes compartimientos
M arcadores
Tipo celular F unciones fenotípicos
Linfocitos B CM H clase 11;
Inm unoglobulina
Linfocitos T colaboradores CD 3^
CD4+; C D 8 ^
citotóxicos CD 3^
CD4 ; C D 8+
N atural killer Receptor Fcy
(CD16)
pueden ser utilizados directamente, la muestra
de elección para obtener células mononucleares
de seres humanos es, sin lugar a dudas, la san­
gre periférica por su accesibilidad.
2.1.1. Separación de células mononucleares
mediante gradientes con Ficoll-Hypaque
El método de elección para el aislamiento de
las células m ononucleares a partir de sangre
entera fue descrito originai'i ámente por Boyum
(Boyum, 1968) y consiste en la separación de
las células a través de un gradiente de Ficoll-
Hypaque. El Ficoll es un polisacárido que pro­
duce la aglutinación de los eritrocitos logrando
que éstos sedimenten más rápidamente y el Hy-
paque es una sustancia densa que, diluida apro­
piadamente, confiere a la mezcla la densidad
requerida para la separación.
El aislamiento de las células mononucleares
se realiza teniendo en cuenta la diferencia de
densidades que existe entre los elementos de la
sangre. Los eritrocitos y los granulocitos p o ­
seen una densidad mayor que 1.077 g/ml y por
lo tanto se ubicarán por debajo de la capa del
gradiente de esa densidad, mientras que los mo­
nocitos, los linfocitos y las plaquetas, al ser m e­
nos densos, flotarán por encima (fig. 36-1). Las
plaquetas serán separadas de las células mono-
nucleares por medio de lavados sucesivos o por
centrifugación a través de un gradiente de suero
fetal bovino, que permite que las células mono-
nucleares lo penetren pero no las plaquetas.
Materiales
- Sangre heparinizada (5U de heparina sódi-
ca/ml de sangre).
- Solución salina tamponada (SST). Ver apén­
dice al final del capítulo.
“ Solución de Hanks libre de Ca+* y Mg+“^, a
temperatura ambiente. Ver apéndice al final
del capítulo.
731
P orcentaje del total de lirifocitos
N odulos Sangre
B azo linfáticos periférica
40-45 20-25 10-15
50-60 50-60 50-60
10-15 15-20 20-25
~ 10 ~ 10
Solución de Ficoll-H ypaque. Preparar una
solución de densidad 1,077 g/ml, agregando
64.0 g de Ficoll (PM: 400.000; Sigma cat.
n° E4375); 99.0 g de diatrizoato sódico (Sig­
ma cat.n° S4506) y 0.7 g de NaCl para 1 li­
tro de solución. Filtrar a través de una m em ­
brana esterilizante de 0,22 [Xm y conservar a
4°C. Alternativamente se puede adquirir la
so lu ció n de F ico ll-H ypa qu e de d en sid ad
1,077 g/1 (Sigma, Histopaque 1077-1 o P har­
macia 17-0840-02).
- Suero fetal bovino (SFB), descomplementa­
do a 56°C durante 30 minutos.
M edio RPMI completo adicionado con un
10% de SFB. Véase apéndice al final del ca­
pítulo.
- Tubos cónicos de plástico para centrífuga de
15 o 50 mi.
Método
1. Diluir la sangre agregando un volum en de
SST que deberá estar a temperatura am bien­
te. Alternativamente, en los casos en que in­
terese separar previamente el plasma, centri­
fugar la sangre a 900 x g, a temperatura am ­
biente, durante 10 minutos. Posteriormente
recoger las células ubicadas en la interfase
entre los eritrocitos y el plasma y resuspen-
derlas en 2 partes de SST.
2. Agregar cuidadosamente la solución de F i­
coll-Hypaque por debajo de la suspensión
celular, o bien a un tubo que contiene la so­
lución de Ficoll-Hypaque agregar la sangre
diluida por la parte superior con extrem o
cuidado. La proporción de Ficoll-Hypaque
usada dependerá de los volúmenes de traba­
jo: para un tubo de 15 mi se dispensarán
3 mi de Ficoll-Hypaque cada 7 mi de sangre
diluida. Cuando se trabaja en tubos de 50 mi
se agregarán 10 mi de F icoll-H ypaque y
40 mi de sangre diluida.
732 Metodologías
Centrifugación
Ficoll-Hypaque
F ig. 36-1. Esquem a de la distribución de los elem entos de la sangre en un gradiente de Ficoll-H ypaque.
3. Centrifugar entre 20 y 30 minutos, a 900 x
“g ” y sin usar el freno de la centrífuga. Los
gradientes son dependientes de la temperatu­
ra, es por ello que se deberá mantener la mis­
ma entre 18 y 20°C durante la centrifugación.
4. Recoger la capa de células mononucleares
que se encuentra en la interfase entre el Fí-
coll-H ypaque y el plasm a (fig. 36-1) cui­
dando de no arrastrar los eritrocitos que se
encuentran en la parte inferior. Transferir
las células a un nuevo tubo en el que se han
dispensado 2 a 3 voMmenes de solución de
Hanks por cada volumen de capa de células.
5. Lavar las células tres veces con exceso de
solución de Hanks. ■
6. Resuspender las células en medio RPMI com­
pleto. Contar y determinar la viabilidad celu­
lar por el método de exclusión del azul tripán.
2.1.2. Separación de granulocitos, células
mononucleares y linfoblasíos a partir de
sangre periférica o de cultivos celulares.
Gradientes de Percoll
Para determ inadas experiencias es conve­
niente separar las poblaciones celulares de la
sangre o aislar células estimuladas (linfoblas-
tos), de células no estiinuladas provenientes de
cultivos celulares. En estos casos, la separación
a través de un gradiente discontinuo de polyvi-
nilpirrolidona, conocido com ercialm ente con
el nombre de Percoll, ofrece un método senci­
llo y rápido. Usando esta técnica es posible ob­
tener los granulocitos en la interfase de la capa
correspondiente a una densidad de 1.083, las
células mononucleares en la de 1.077 y los eri­
trocitos, que se ubican en el fondo del tubo. Por
otra parte, los linfoblastos se separan de las cé­
lulas sin activar por su diferencia de densidad.
Plasma diluido
Células
mononucleares
Células
polimorfonucleares
Glóbulos rojos
los primeros flotarán por encima de la capa co­
rrespondiente a una densidad 1.065 y las célu­
las sin activar lo harán sobre la capa de 1.077.
Materiales
- Sangre heparinizada (5U de heparina sódi-
ca/m l de sangre) o una suspensión celular
con linfocitos estimulados por medio de m i­
tógenos. Véase punto 2.4.
- Percoll (Pharmacia, Uppsala, Suecia)
- Solución salina tamponada (SST lOx), para
ajustar la isotonicidad de la solución de Per­
coll.
- M edio RPMI completo. Véase apéndice al
final del capítulo.
- Solución salina tamponada (SST). Ver apén­
dice al final del capítulo.
- Tubos de centrífuga de 15 o 50 ml.
- Pipetas Pasteur.
Método
1. Preparar una solución isotónica de Percoll a
partir de la solución stock de Percoll, agre­
gando 1 volumen de SST lOx por cada 10
volúmenes de solución final (para preparar
100 ml de solución isotónica de P ercoll
agregar 10 ml de SST lOX y 90 ml de la so­
lución stock de Percoll). Esta solución de
Percoll posee una densidad aproximada de
1,12 g/ml.
2. Mezclar la solución de Percoll con SST de
forma tal de obtener la soluciones de dife­
rentes porcentajes. P ara la separación de
granulocitos y de células mononucleares se
req u ieren so lu cion es de P erco ll al 70%
(densidad de 1.083) y al 60% (densidad de
1.077) mientras que para separar linfocitos
 Metodologías para la evaluación de las células Inmunocompetentes
activados (linfoblastos) de células sin acti­
var se utiliza una solución de Percoll al 50%
(1,065) y otra al 60%.
3. Dispensar 3 mi de Percoll al 70% en un tu­
bo de centrífuga de 15 mi y sembrar, por en­
cima, 3 mi de Percoll al 60%, evitando re-
suspender las capas. Por últim o agregar,
cuidadosamente, 8 mi de sangre diluida al
medio con SST.
En el caso de la separación de los linfo­
blastos se preparará un gradiente discontinuo
con una capa inferior de Percoll al 60% y
una superior de Percoll al 50%. Por sobre
ésta colocar la suspensión celulai- de blastos
(las células en el medio de cultivo donde se
las estimuló durante 48-72 h con el mitógeno
ad e c u a d o . R e fe rirs e al p u n to 2 .4 p a ra
la descripción de cómo obtener linfoblastos).
4. Centrifugar el gradiente a temperatura am ­
biente durante 20 minutos, a 900 x g. Sepa­
rar las células m ononucleares que se e n ­
cuentran por encima de la capa de Percoll al
60% y posteriormente los granulocitos de la
interfase del Percoll 70%.
Los linfoblastos se ubicarán en la interfase
superior (sobre la capa de Percoll 50%) y
las células sin activar flotarán sobre la capa
de P ercoll 60% (fig. 36-2). Para el aisla­
miento de células activadas solamente, se
puede preparar un gradiente con P erco ll
60% y recuperar la fracción celular obtenida
en la parte superior del mismo.
5. Lavar tres veces las células con exceso de
SST.
6. R esuspender las células en medio R PM I
completo. Contar y determinar la viabilidad
celular por el método de exclusión del azul
tripán.
2.2. ENRIQUECIMIENTO EN
POBLACIONES LINFOCITARIAS
POR PASAJE A TRAVÉS DE COLUMNAS
DE LANA DE NYLON
El aislam iento de poblaciones linfocitarias
es generalmente un requisito previo para su es­
tudio fenotípico o funcional. Los monocitos,
junto con los linfocitos B, constituyen un 25%
de la población mononuclear. Es por ello que
para algunas determinaciones es necesario se­
parar la población Iinfocitaria T de la B, como
es el caso en la tipificación de HLA de clase II
o al realizar un cross m atch específico para
linfocitos T y linfocitos B, previo a un tras­
plante.
Uno de los métodos clásicos de enriqueci­
miento de poblaciones linfocitarias utilizando
colum nas de nylon, fue descrito o rig in aria­
mente por Julius y colaboradores (Julius y col.,
1973). Los linfocitos B y las células accesorias
733
Plasma diluido
Blastos, monocitos, NK
1.065
Linfocitos
1.077
Granulocitos
1.090
Eritrocitos
F ig. 36-2. E.squema de la di.stribución de los elem en to s de
la sangre y de linfoblastos en un g radiente de Percoll.
como los macrófagos se adhieren preferente­
mente a la lana de nylon mientras que los lin­
focitos T no se adhieren o lo hacen pobrem en­
te y se recogen directamente. Los linfocitos B
y los macrófagos pueden ser eluidos a co n ti­
nuación por medio de agitación. La técnica de
la lana de nylon es la más usada para el enri­
quecimiento en linfocitos T a partir de las cé­
lulas mononucleares obtenidas de un gradiente
de Ficoll-H ypaque. La ventaja que p o see es
que no requiere de anticuerpos o complemento
y es el método de elección en aquellas ocasio­
nes en las que se quiere separar linfocitos B y
linfocitos T en gran cantidad a partir de bazo o
nódulos linfáticos. Por otra parte, debe co n si­
derarse que las poblaciones celulares aisladas
no son tan puras como las que se purifican por
procedimientos específicos, como la elim in a­
ción de poblaciones por medio de la citotoxici­
dad mediada por anticuerpos y complemento o
m étodos de inmunoplaqueo o panning.
M ateriales
- Lana de nylon esterilizada (véase apéndice al
final del capítulo).
- Jeringas de 10 o 20 mi.
- M edio RPMI adicionado con 5% de SFB,
RPMI-5 (véase apéndice al final del capítulo).
- Agujas 19-G.
- Tubos cónicos de plástico de 50 mi.
- Suspensión de células mononucleares o b te­
nidas de sangre periférica por medio de un
gradiente de Ficoll-Hypaque o esplenocitos,
M étodo
1. A rm ar una colum na de lan a de nylon de
acuerdo a la metodología especificada en el
734 Metodologías
apéndice. (El tamaño de la columna depen­
derá de la cantidad de células a sembrar:
p ara sep arar h asta 1,5 x 10* célu las se
aconseja usar una columna de 12 mi empa­
cada con 0,8-1,0 g de lana de nylon. Para
cantidades entre 1,5 y 3,0 x 10* células se
prefiere usar una columna de 20 mi con 1,6
a 2 g de lana de nylon, usando en ambos ca­
sos 15 a 20 mi de medio de cultivo para
eluir las células).
2. Calentar el medio de cultivo a 37°C y man­
tenerlo en estas condiciones a lo largo del
procedimiento.
3. Impregnar la lana de nylon con medio RP-
Ml-5 tratando de elim inar las burbujas de
aire atrapadas y compactar la columna con
una pipeta estéril. Cerrar la parte superior de
la colum na con parafilm y la inferior con
una llave de tres vías y ana aguja de 19-G.
Colocar la columna a 37°C durante 30 mi­
nutos, en una estufa gaseada con 5% de
CO,.
4. Ajustar la suspensión celular libre de glóbu­
los rojos a una densidad de 7,5 x 10’ cél/ml
en RPMI-5.
5. Eluir la columna completamente y sembrar
en la parte superior la suspensión celular.
Dejar drenar todo el medio y adicionar entre
0,5 y 1 mi de medio a 37°C. Cerrar la llave
de tres vías y agregar 2 o 3 mi de medio.
Cerrar la parte superior de la columna con
parafilm.
6. incubar la colum na durante 45 minutos a
37°C en estufa gaseada con 5% de CO 2.
7. L lenar la colum na con m edio RPM I-5 a
37"C. Abrir la llave de tres vías e inmediata­
mente recuperar las células no adherentes
(linfocitos T) eluidas en un tubo cónico de
50 mi. Agregar medio RPMl-5 adicional y
recoger las células de los primeros 15 mi de
medio eluidos a través de la columna.
8. Para obtener las células adherentes (linfoci­
tos B y macrófagos) agitar enérgicamente la
columna con una varilla de vidrio estéril du­
rante 1 minuto y eluirlas rápidam ente con
20 mi de medio, en otro tubo cónico.
9. Centrifugar las células 10 minutos a 200 x
g. Resuspender en la concentración adecua­
da y determinar la viabilidad celular por el
método de exclusión dei azul tripán.
Generalmente se recupera un 80 a un 90%
de linfocitos T contaminados con un 10 a 20%
de linfocitos B y macrófagos.
2.3. P U R IF IC A C IÓ N D E L IN F O C IT O S B,
LIN F O C ITO S T Y SU BP O BLA C IO N E S T
El método de inmunoplaqueo o panning, la
purificación por selección negativa mediante la
citotoxicidad específica dependiente de anti-
Cuadro 36-2. Marcadores de superficie de las
células inmunocompetentes y de sus principa­
les contaminantes
Tipo celular M arcador de superficie
Linfocitos T colaboradores CD4
Linfocitos T citotóxicos CD8
Linfocitos B CD20
Inm unoglobulinas
N atural killer CD 16
M onocitos CD14
C D Il
G lóbulos rojos glicoforinas
cuerpo-complemento y la técijica de aislamien­
to con partículas magnéticas, más recientemen­
te desarrollada, se fundamentan en la separa­
ción de las células de interés de aquellas no de­
seadas en base al reconocimiento de antígenos
p re se n te s en la m em b ran a c e lu la r (cu ad ro
36-2), por parte de anticuerpos específicos.
La separación celular puede ser por selec­
ción negativa cuando la población que se desea
purificar carece del antígeno específico en su
membrana. Por el contrario, en la selección po­
sitiva se aislará la población que expresa el
marcador de interés.
A continuación se detallan los marcadores
de superficie de las principales clases de célu­
las inmunocompetentes y de las células conta­
minantes.
2.3.1. Aislamiento de linfocitos por medio
de lisis específica mediada por anticuerpo-
complemento
La citotoxicidad dependiente de anticuerpo-
complemento es una técnica utilizada, general­
mente, para depletar una población heterogé­
nea de células en donde una subpoblación es
reconocida específicamente por un anticuerpo
dirigido hacia un antígeno de la superficie celu­
lar. Este complejo antígeno-anticuerpo form a­
do en presencia de complemento lleva a la lisis.
Puede ser utilizada como un paso preliminar de
selección negativa o para eliminar células con­
taminantes de una población celular enriqueci­
da en una determ inada clase de células. Este
protocolo presenta la ventaja de originar una
población celular que no ha sido m anipulada
por uniones antígeno anticuerpo y sus desven­
tajas son la pérdida de la población celular que
se une al anticuerpo y el requerimiento de que
el anticuerpo utilizado sea fijador de com ple­
mento.
A continuación se detalla la técnica de puri­
ficación de la subpoblación de linfocitos T co­
laboradores (CD4+) por lisis específica de la
subpoblación citotóxica (CD8+).
 Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes
Materiales
- M edio RPM I com pleto suplem entado con
SFB al 1%, RPMI-1 (véase apéndice al final
del capítulo).
- Complemento de conejo con baja linfotoxi-
cidad.
- Suspensión de linfocitos T.
- Anticuerpos monoclonales anti-CD8.
- Tubos de centrífuga cónicos de plástico de
15 mi.
Método
1. Determinar de antemano la dilución del an­
ticuerpo a utilizar por inmunofluorescencia
o por citometría de flujo, asimismo, la con­
centración óptima de complemento que pro­
duce la máxima citotoxicidad específica y la
mínima citotoxicidad no-específica.
2. En un tubo de centrífuga agregar una sus­
pensión de 1 X 10*’ - 1 X 10’ células y cen­
trifugar 10 minutos a 18-20°C y 400 x g.
Descartar el sobrenadante y resuspender las
células en la dilución apropiada de anticuer­
po.
3. Colocar las células en un baño de hielo du­
rante 30 minutos. Centrifugar 10 minutos a
4°C y a 400 x g. Descartar el sobrenadante.
4. Resuspender las células en una concentra­
ción de 1 X 10'' cél/m l de la dilución del
com plem ento en R PM I-1. Incubar 1 h a
37°C. Examinar una alícuota de la suspen­
sión celular para determinar la lisis celular.
Si el tratamiento no hubiese resultado total­
mente efectivo repetir la incubación con el
anticuerpo y el complemento.
5. Frenar la lisis agregando a la suspensión ce­
lular 10 mi de medio RPMI frío. Centrifugar
10 minutos a 4°C y 400 x g. Lavar 2 veces y
resuspender las células en medio R PM l-1.
6. Determinar la viabilidad y el porcentaje de
citotoxicidad según la siguiente fórmula:
(N° cél. no v ia b le s )'
% de citotoxicidad (C D 8"^) = -
(N° cél. viables +
N “ cél. no viables)
7. Eliminar la células no viables por medio de
un gradiente de Ficoll-Hypaque recuperan­
do las células viables que se encuentran en
la interfase superior (las células no viables
se ubicarán en el fondo del tubo).
2.3.2. Aislamiento de linfocitos
por el método de inmunoplaqueo
o panning
La técnica de plaqueo en un comienzo fue
desarrollada para la separación de los linfocitos
735
B de los linfocitos T (Mage y col., 1977; Wy-
socki & Sato, 1978; Mage et al. 1981). Puede
ser utilizada ya sea como método positivo o ne­
gativo de selección celular. La pureza de las
poblaciones celulares obtenidas es comparable
con aquellas derivadas del citómetro de flujo.
Además, esta metodología es superior a la téc­
nica de lisis por complemento ya que la pobla­
ción no seleccionada puede ser recuperada.
En la técnica de plaqueo directa (fig. 36-3a),
las células son separadas usando placas de po­
liestireno sensibilizadas con anticucipos espe­
cíficos unidos al plástico por medio de uniones
no-covalentes. A continuación, las células que
poseen en su superficie el antígeno determina­
do se unen a los anticuerpos específicos, m ien­
tras que las células que no los poseen son recu­
peradas por medio de lavados. Las células uni­
das pueden a su vez ser obtenidas cambiando
las condiciones de la reacción: por el agregado
de m ed io con a lta c o n c en trac ió n p ro te ic a
(SFB) o por tratamientos mecánicos. L a des­
ventaja de necesitar grandes cantidades de .anti­
cuerpo purificado indujo al desarrollo de la téc­
nica de plaqueo indirecta.
El método de plaqueo indirecto consiste en
el tratam iento de las células con aiticuerpos,
generalmente monoclonales, que reconocen es­
pecíficamente a los marcadores de las células.
A la suspensión celular así tratada, se la incuba
en placas previamente sensibilizadas con una
anti-gamma globuhna específica para la espe­
cie utilizada para reconocer a las células. Las
células que poseen en su superficie el anticuer­
po monoclonal serán fijadas a la placa quedan­
do libre la subpoblación que no fue reconocida.
A continuación se describe, a modo de ejem ­
plo, la purificación de linfocitos T CD4+ y de
linfocitos CD8+ por medio de la técnica de pla­
queo indirecta (fig. 36-3b).
M ateriales
- Anti-gamma globuhna de ratón purificada y
adsorbida contra iminunoglobulina hum ana.
X 100
- Anticuerpos monoclonales murinos específi­
cos para la población celular a purificar (anti
CD8).
- Solución salina tamponada (SST). Ver apén­
dice al final del capítulo.
- Tris-Cl 0.05 M, pH: 9,5.
- Suspensión enriquecida en linfocitos T por
lana de nylón.
- SST adicionada con 5% y 1% de SFB (SST-
5 o SST -1).
- M edio RPMI completo. Ver apéndice al fi­
nal del capítulo.
~ Placas de Petri de plástico estériles de 15 x
100 mm.
- Tubos cónicos de 15 mi.
736 Metodologías

Ag- F ig . 36-3a. E squem a del fu n d am en ­

A g- to de la técnica de inm unoplaqueo d i­
recta (Panning directo).

Placas sensibilizadas con

anticuerpo específico
para su marcador Y
de superficie diferencial

Selección positiva Selección negativa

Ag+ Ag+

’fyy'P
M étodo
1. A una placa de Petri adicionar 10 ml del an-
tisuero anti-gamma globulina de ratón dilui­
do adecuadam ente (aproxim adam ente 10
|Xg/ml) en Tris-Cl 0,05 M, pH; 9,5. Incubar
durante 40 minutos a temperatura ambiente
o 24 h a 4°C. (Las placas así sensibilizadas
pueden ser conservadas durante 2 semanas
a4°C).
2. En un tubo de centrífuga agregar 2-3 x 10’
células y centrifugar a 400 x g durante 10

Células- anticuerpo monoclonal

específico para un m arcador de
superficie determinado

Placas sensibilizadas
con anti-gama globulina

Selección positiva Selección negativa

F ig . 36 -3 b . E squem a del fundam ento

d e la técn ica de inm unoplaqueo in d i­
recta {Panning indirecto).
 Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes
minutos a 4°C. Descartar el sobrenadante
y resuspender las células con la dilución
del anticuerpo específico (anti CD8) deter­
minada de antemano por medio de una in-
munofluorescencia o por citometría de fl u ­
jo. Colocar las células en hielo por 30 mi­
nutos.
3. Agregar 5 mi de SST-5 y centrifugar 10 mi­
nutos a 400 X g en frío y lavar con SST-5.
4. Resuspender las células en 3 mi de SST-5.
5. Rem over la solución del antisuero de la
placa de Petri usando una pipeta estéril y
lavar tres veces con 10 mi de SST-5 agi­
tando suavemente cada vez. (El antisuero
recuperado puede ser reutilizado.)
6. Retirar completamente el líquido de lavado
de la placa de Petri e inmediatamente agre­
gar la suspensión celular. A gitar suave­
mente e incubar durante 1 h a 4°C (a los 30
minutos, agitar suavemente durante 30 se­
gundos).
7. R ecoger por aspiración la suspensión de
células que no se han unido. Lavar 2 veces
con 7 mi de SST-1, o hasta haber retirado
todas las células no adheridas.
Todos los pasos detallados en este punto
deben ser realizados suavemente, colocan­
do la pipeta sobre un lado de la placa, de
m anera tal de no desprender las células
unidas específicamente (CDS*^).
8. Despegar las células adheridas con una es­
pátula ad hoc o bien pipeteando enérgica­
mente 15 mi de SST-1. Examinar la placa
en un microscopio invertido y colocar las
células obtenidas en otro tubo de 15 mi.
9. Centrifugar los tubos con las células adhe­
rentes y el de las células no adherentes a
4°C, durante 10 minutos a 400 x g.
10. Resuspender en medio RPMI y determinar
el grado de pureza por medio de inmuno-
fluorescencia o citometría de flujo. Si se
requiere un mayor grado de pureza repetir
el procedimiento a partir del paso 3.
2.3.3. Purifícación de células por medio
de técnicas inmunomagnéticas
La purificación de poblaciones y subpobla­
ciones celulares por métodos inmunomagnéti-
cos, a partir de una muestra heterogénea, ha si­
do desarrollada am pliam ente en los últim os
años debido al grado de pureza de las muestras
obtenidas (comparable al método de citometría
de flujo), la reproducibilidad y la facilidad del
manejo de muestras pequeñas o grandes.
Esta metodología se fundamenta en una se­
paración física en un campo magnético, de las
células unidas a un anticuerpo específico que
se encuentra adherido a microesferas magnéti­
cas de poliestireno.
737
Al igual que en la técnica de plaqueo, se
puede realizar una selección positiva o negati­
va de las células. En el caso de la inmunosepa-
ración positiva, la separación de las partículas
m agnéticas de las células es muy trabajosa,
m ientras que la selección negativa ofrece un
p ro ced im ien to muy sen cillo p ara p u rific a r
grandes cantidades de células, por lo que se la
prefiere. Además, uno o más anticuerpos nio-
noclonales pueden ser adheridos a las m icroes­
feras para la separación simultánea de varias
poblaciones celulares contaminantes.
Aislamiento inmunomagnético de linfocitos T
p o r selección negativa
M ateriales
- Células mononucleares separadas a partir de
sangre periférica por medio de un gradiente
de Ficoll-Hypaque; o suspensión celular de
bazo, de nodulos linfáticos, de tumores o de
fluido peritoneal.
- Anticuerpos monoclonales específicos para
linfocitos B (CD20), monocitos (CD14), cé­
lulas NK (CD16) y glóbulos rojos (anti-gli-
coforinas). (Véase cuadro 36-2.)
- Solución de Hanks libre de Ca++, adi­
cionada con 10% de SFB y buffer H EPES
10 mM (Hanks-10),
~ Microesferas magnéticas recubiertas con anti
IgG de ratón obtenido en cabra (aproximada­
mente 7 microesferas por célula blanco; Dy-
nabeds M-450, Dynal 11005 y 1 1006),
- Aparato para la separación magnética (Dynal
MPCI 12001 o Advanced Magnetic 41025).
- Tubos de polipropileno de 15 mi.
Método
Importante: todos los pasos a seguir debe­
rán ser realizados a 4°C para minimizar fen ó ­
menos de capping y el desprendimiento de los
anticuerpos de la membrana celular.
1. D eterm inar la concentración saturante de
anticuerpos monoclonales por medio de in-
m unofluorescencia o citom etría de flu jo .
Generalmente se logra con una concentra­
ción de 1 |ig/ml.
2. Resuspender las células en una concentra­
ción de 2 X 10’ cél/ml de H anks-10.
3. Agregar 1 mi de la solución de la mezcla de
anticuerpos cada 10 mi de suspensión celu­
lar. Incubar 30 minutos a 4°C con agitación
continua (6 a 10 rpm) para evitar que las cé ­
lulas sedimenten.
4. Lavar 2 veces las células con Hanks-10 cen­
trifugando en frío a 150 x g, durante 10 m i­
nutos. Resuspender las células en 10 mi de
738 Metodologías
Hanks- IO frío y transferirlas a un tubo nue­
vo.
5. A gregar 4 x 10® m icroesferas (Im l de la
suspensión comercial) para 2 x 10® células
mononucleares totales y lavar con Hanks-
10. Colocar el tubo de forma de orientar las
partículas en una cara del tubo y aspirar el
medio con una pipeta colocada en el fondo
del tubo. Repetir la operación y resuspender
las microesferas en 1 ml de H anks-10.
6. Agregar la suspensión de microesferas a la
suspensión celular y agitar suavemente (6 a
10 rpm) 1 h a 4°C.
7. Separar las células marcadas con los anti­
cuerpos monoclonales unidos a las microes­
feras m agnéticas colocando el tubo en un
campo magnético. Después de 5 minutos,
transferir las células no marcadas a un tubo
nuevo y repetir el procedimiento. Contai' las
células y resuspenderlas en H an k s-10 en
una concentración de 2 x 10’ cél/ml.
8. Repetir los pasos 4 a 7 en los casos en que
se requiera un mayor grado de pureza.
2.4. O BTE N C IÓ N D E L IN F O B L A ST O S
M ateriales
- Suspensión de esplenocitos o de células mo-
nonucleares.
M edio RPM I com pleto suplem entado con
SFB al 10% (véase apéndice al final del ca­
pítulo).
- Frascos de cultivo de 75 cm^ (T75).
- Solución de PHA o Con A para linfocitos T
y solución de Staphyíococcus A Cowan 1 pa­
ra linfocitos B (véase cuadro 36-5).
NOTA: todos los reactivos y materiales que
estén en contacto con las células deberán estar
en condiciones de esterilidad y el operador de­
berá seguir los procedimientos empleados para
el cultivo de células.
M étodo
1. Ajustar la suspensión celular en 5,0 x 10'’
cél/m l en m edio R P M I-10. A d icio n ar la
concentración del mitógeno que estimula a
la población linfocitaria en form a óptima,
previamente determinada por medio de un
ensayo linfoproliferativo.
2. Incubar las células a 37°C en estufa gaseada
con 5% de CO^, durante 48-72 h.
3. Centrifugar las células a 900 x g durante 5
minutos.
4. R esuspender las células en m edio RPM I
completo. Contar y determinar la viabilidad
celular por el método de exclusión del azul
tripán.
OBTENCIÓN D E ESPLENOCITOS
2 .5 .
M U R IN O S
M ateriales
- Ratones de una cepa determinada, entre 6 se­
manas y 6 meses de edad.
- Alcohol 70°.
- Solución de Hanks o medio de cultivo RPMI
co m pleto suplem entado con 5% de SFB
(véase apéndice al final del capítulo).
~ Malla de acero inoxidable o de nylon de 200
|jm .
- Material de cirugía estéril.
M étodo
1. Sacrificar los ratones por dislocación cer­
vical o inhalación de CO^.
2. C olocarlos en posición dorsal sobre una
plantilla de disección.
3. Rociarlos con alcohol 70“.
4. Practicar la incisión adecuada para poner
en descubierto el bazo, abriendo la cavidad
peritoneal desde abajo h acia la cabeza.
(Véase fig. 36-4.)
5. Cortar el bazo con pinza y tijera estéril en
varios pedazos. Colocarlo en una placa de
Petri y lavarlo con medio de cultivo.
6. Colocarlo sobre una malla de acero inoxi­
dable y triturarlo en fragmentos pequeños
con una tijera de punta curva. Preparar un
homogeneizado celular en medio de culti­
vo, por disgregación sobre la malla. Lavar
la malla varias veces con medio de cultivo
para desprender las células que hayan que­
dado adheridas.
7. Recoger la suspensión celular filtrada por
la malla con una pipeta Pasteur y colocarla
en un tubo cónico.
8. Dejar reposar 5-6 minutos para que sedi­
menten los grumos.
9. Centrifugar el sobrenadante a 200 x g du­
rante 10 minutos.
10. Descartar el sobrenadante y lavar el sedi­
mento celular con medio de cultivo.
11. Resuspender las células en el medio ade­
cuado.
Se recuperan aproximadamente 5-15 x 10’
células por bazo.
N O TA : En general es aconsejable lisar los
glóbulos rojos presentes en una suspensión de
esplenocitos por medio de las metodologías de­
talladas en el apéndice antes de ajustar la con­
centración celular. No obstante, existen contro­
versias acerca de la conveniencia de eliminar
los glóbulos rojos contaminantes presentes en
la suspensión de esplenocitos cuando se reali­
zan pruebas funcionales.
 Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes
F ig. 36-4. Esquem a de la distribu­
ción de los órganos del ratón.
Intestino—f
Nodulo linfático
mesentérico
2.6. OBTENCIÓN D E CÉLULAS
GANGLIONARES MURINAS
Materiales
- Ratones de una cepa determinada, entre 6 se­
manas y 6 meses de edad.
- Alcohol 70“.
- Solución de Hanks o medio de cultivo RPMI
com pleto suplem entad o con 5% de SFB
(véase apéndice al final del capítulo).
- Malla de acero inoxidable o de nylon de 200
|im.
- Material de cirugía estéril.
M étodo
1. Sacrificar los ratones por dislocación cervi­
cal o inhalación de CO^.
2. C olocarlos en posición dorsal sobre una
plantilla de disección.
3. Rociarlos con alcohol 70°.
4. Poner en descubierto los ganglios de la zona
poplítea, inguinal o axilar y seccionarlos
con pinza y tijera (fig. 36-4).
5. Transferirlos a una placa de Petri, lavar con
medio de cultivo y extirpar cualquier resto
de tejido extraño que pudiera estar adosado
a los ganglios.
6. Lavar nuevamente con medio de cultivo y
proceder a la fragmentación, el homogenei-
zado y la separación de las células como se
indicó para el bazo.
Se recuperan aproximadam ente 5-10 x 10^
células por ganglio.
2.7. OBTENCIÓN D E TIMOCITOS
MURINOS
M ateriales
- Ratones de una cepa determinada, entre 3 y
6 semanas de edad.
739
— Nodulo linfático axilar
Nodulo linfático axilar lateral
Hígado
Bazo
- Estómago
Riñón
_ Nódulo linfático
inguinal superficial
Nódulo linfático poplíteo
~ Alcohol 70°.
- Solución de Hanks o medio de cultivo RPM I
co m p leto suplem entado con 5% de SFB
(véase apéndice al final del capítulo).
- M alla de acero inoxidable o de nylon de 200
¡am.
- Material de cirugía estéril.
M étodo
1. En las preparaciones de timocitos debe ex­
cluirse a las células provenientes de la san­
gre. Para evitar esta contaminación, sangrar
los animales a blanco a través def plexo re-
troorbital. Normalmente el ratón muere co ­
mo consecuencia de esta maniobra. Si así no
ocurre, sacrificarlo por inhalación con CO^
y no por dislocación cervical pues ello p ro ­
duce muerte de células en el área tíniica.
2. C olocar al ratón en posición dorsal sobre
una plantilla de disección.
3. Realizar una incisión, con ] mza y tijera, en
la piel del cuello previamente i ociada con
alcohol 70°.
4. Con cuidado poner en descubierto el tim o,
extirparlo y colocarlo en una cápsula de P e­
tri .
5. Ehminar nodulos linfáticos y vasos, lavar el
timo con medio de cultivo y luego disgre­
garlo en una malla de acero inoxidable.
6. Recoger la suspensión de células con pipeta
Pasteur y colocarlas en un tubo cónico.
7. D ejar reposar 5-6 minutos para que se d i­
menten los grumos.
8. Centrifugar el sobrenadante a 200 x g d u ­
rante 10 minutos.
9. D escartar el sobrenadante y lavar el se d i­
mento celular con medio de cultivo.
10. Resuspender las células en el medio ade­
cuado.
Para la obtención de timocitos es convenien­
te usar ratones de 3 a 6 semanas ya que los an i­
740 Metodologías
males de mayor edad dan menores rendimien­
tos. Se obtienen aproximadamente 10-30 x 10’'
timocitos por animal.
2.8. OBTENCIÓN D E MACRÓFAGOS
Y MONOCITOS
1.
2.8.1. Obtención de macrófagos peritonea­
les de rató n : cuando se quieren obtener macró­
fagos peritoneales murinos es conveniente esti­
mular en el animal la producción de los mis- 2.
Materiales
- Ratones de una cepa determinada.
- Medio tioglicolato (Difeo), envejecido en la
heladera por 2 a 3 meses.
- Solución de Hanks (véase apéndice al final
del capítulo).
- Alcohol de 70”.
- Materia] de cirugía estéril.
Método
1. Inocular ratones intraperitonealm ente con
medio de tioglicolato envejecido. Por cada
ratón inocular 2-3 mi.
2. Recoger las células peritoneales, previa ino­
culación de 5 mi de solución de Hanks, cua­
tro días después de la estimulación con tio­
glicolato.
Puede procederse también, sacrificando al
animal por dislocación cervical, fijando lue­
go al ratón en una plantilla de disección.
Frotar el abdomen con alcohol de 70°, in­
yectar intraperitonealm ente 5 mi de solu­
ción de Hanks y m asajear suavem ente el
área abdominal. Efectuar Un corte en la piel
correspondiente a la zona peritoneal baja y
recoger la suspensión celular con pipeta
Pasteur.
3. Centrifugar las células a 200 X g durante 10
minutos y lavarlas una o dos veces con solu­
ción de Hanks.
El rendimiento es de 3-4,5 x 10’ células por
ratón.
2.8.2, Separación de monocitos-macrófagos
por adherencia al plástico
Materiales
- Células mononucleares aisladas por Ficoll-
Hypaque o macrófagos murinos obtenidos
por estimulación con tioglicolato,
- Solución salina tam ponada (SST) (véase
apéndice al final del capítulo).
“ RPMI completo (véase apéndice al final del
capítulo).
- Placas de Petri de plástico de 100 mm de
diámetro,
~ SST-EDTA 0,02%.
Método
Ajustar las células, aisladas de sangre por el
método de Ficoll-HypaCjue o las provenien­
tes del exudado peritoneal, a 2 x 10® cél/ml
en RPMI.
Añadir 10 mi de la suspensión celular en las
placas de Petri.
3. M antener las placas en incubación a 37°C
en estufa gaseada con 5% de CO^, durante
60 minutos.
4. Agitar las placas vigorosamente en forma
manual, evitando derram ar el fluido, para
separar los linfocitos no adherentes. Descar­
tar el medio que contiene las células no ad­
heridas. Lavar 2 veces con medio y agregar
10 mi de RPMI completo.
Por este procedimiento, los linfocitos quedan
en suspensión mientras que los macrófagos
permanecen adheridos al fondo de la placa.
5. Para remover las células adheridas a la pla­
ca, adicionar SST-EDTA 0,02% frío. Dejar
10 minutos y despegar las células golpeando
enérgicamente la base de la placa. Transferir
las células a un tubo cónico de 15 mi y cen­
trifugar las células a 300 x g durante 10 mi­
nutos.
6. Resuspender las células obtenidas en RPMI.
La pureza conseguida generalmente excede
al 90%.
3. CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA
DE LAS CÉLULAS QUE PARTICIPAN
EN LA RESPU ESTA INMUNE. SU
UTILIDAD EN EL DIAGNÓSTICO
DE ENFERMEDADES
La determinación del número de linfocitos
es uno de los métodos utilizados de rutina para
el m onitoreo inm unológico de pacientes con
deficiencias en su inmunidad celular. Por ejem­
plo: en personas afectadas por el virus de la in-
m unodeficiencia adquirida (HIV) decrece el
porcentaje de linfocitos T CD4+. El análisis fe-
notípico de las células mononucleares de san­
gre periférica incluye marcadores para monoci­
tos, células NK, linfocitos T, linfocitos B y
marcadores de activación T como por ejemplo:
CD25 (receptor para IL-2) o HLA-Dr.
Hace ya más de IO años, se realizó la primer
mesa de trabajo internacional sobre antígenos
de diferenciación de leucocitos humanos y sur­
gió una nomenclatura nueva para designar ti­
pos y subtipos de células. Se establecieron una
serie de grupos denom inados CD, del inglés
 Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes 741

clusters de diferenciación para definir antíge­ Esta metodología ha sido reemplazada por la
nos celulares (véase cap. 2). Los antígenos su­ detección del receptor CD2 utilizando anticuer­
perficiales forman parte del fenotipo de una cé­ pos monoclonales. Sin embargo, aún se utiliza
lula. Aunque esta nomenclatura se empleó ori­ para el aislamiento de linfocitos T a partir de
ginariamente para designcir antígenos de leuco­ células mononucleares. Las rosetas de linfoci-
citos humanos luego se extendió su uso a otros tos T y glóbulos rojos de carnero se separan de
dpos celulares y especies. En el cuadro 36-3 se otras células mononucleares por centrifugación
enumeran marcadores de los linfocitos T y de en un gradiente de Ficoll-Hypaque. Luego se
los linfocitos B. aíslan las células T de los glóbulos rojos unidos
Actualmente, con el advenimiento de los an­ en las rosetas por lisis hipotónica.
ticuerpos monoclonales marcados con fluoro- A continuación se detallará la técnica de fo r­
cromos y del clasificador electrónico de células mación de rosetas E para la detección de lin fo ­
activado por fluorescencia (FACS), han ido de­ citos T.
jándose de lado otras metodologías como las
rosetas, para la determinación del número y del M ateriales
fenotipo de los hnfocitos.
- Suspensión de mononucleares de sangre p e ­
3.1. LIN F O C IT O S F O R M A D O R E S riférica en RPMI-10 (1 x 10’ cél/ml),
D E R O SE T A S E SP O N T Á N E A S - Glóbulos rojos de carnero suspendidos en el
CON E R IT R O C IT O S D E C ARN ERO medio Alsever.
(R O SE TA S E) - M edio de cultivo RPMI suplementado con
SFB al 10%, RPMLIO. (Véase apéndice al
Los linfocitos T humanos tienen receptores final del capítulo.)
para eritrocitos de cai'nero, denominados CD2. ~ Solución de Hanks. (Véase apéndice al final
Cuando se m ezclan células mononucleares y del capítulo.)
glóbulos rojos de camero, éstos se unen a los - SFB inactívado I h a 56“C.
linfocitos T portadores de los receptores CD2
formando rosetas, llamadas rosetas E. Es por M étodo
ello que una de las maneras de identificar a los
linfocitos T ha sido por su capacidad de unir 1. Lavar los glóbulos rojos de carnero con so­
glóbulos rojos de carnero y formar rosetas. lución de Hanks, mezclando 1 volumen de

C u ad ro 36-3. Principales marcadores de superficie de los linfocitos T y B

Linfocitos T Linfocitos B

M olécula M olécula
de superficie/m arcador Fim ción de superficie/m arcador Fuñí ion

TC R (ap )* R eceptor antigénico Inm unoglobulina* R eceptor antigénico

TC R (y8)* R eceptor antigénico M oléculas del CM H Interacción de LT h y LB
clase II

CD2* ( T ll,L F A - 2 ), M olécula de adhesión, activación C D 10 (C A LLA ) E ndopeptidasas asociada a m em ­

receptor p ara glóbu­ de células T brana (enkefalinasa)
los rojo,s de carnero
[en hum anos]

CD 3* (T3, Leu-4) M olécula que form a parte del C D 1 9 (B 4 )* A ctivación o regulación de lin fo ­
com plejo del TCR citos B

CD4* (T4, Leu-3, M olécula de adhesión (CMH cla­ C D 2 0 (B 1 )* A ctivación o regulación de lin fo ­
L 3T4 [en ratónj) se 11) y transducción de señales citos B

C D 8 * (T 8, Leu-2, M olécula de adhesión (CM H cla­ CD22* A dhesión celular y activación de

Lyt-2 [en ratón]) se 1) y transducción de señales LB

C D 28* (Tp44) M olécula eoestim ul adora en la ac­ CD40* A ctivación de LB inducida por
tivación del LT contacto con LT h

CD35 R eceptor de C3b CD35 R eceptor de C3b

^ M arcad o r e s p e cífico
** C D 2, p re sen te tam b ién en N K ; C D 4, p re sen te tam bién en m o n o c ito s y m ac ró fa g o s hu m an o s.
742 Metodologías
glóbulos rojos y 9 volúmenes del diluyente.
Centrifugar a 1000 x g durante 10 minutos.
Repetir el procedimiento cinco veces. Re-
suspender el sedim ento g lobular en una
concentración al 2% v/v en RPM I-10.
2. Mezclar 0,25 mi de la suspensión de eritro­
citos con 0,25 mi de la suspensión de mono-
nucleares e incubar en baño de agua a 37”C
por 15 minutos.
3. Centrifugar a 200 x g durante 5 minutos pa­
ra favorecer el contacto entre los glóbulos
rojos y los linfocitos.
4. Incubar a 4°C entre 2 a 16 h.
5. R esuspender suavem ente y determ inar el
número absoluto de rosetas E colocando go­
tas de la suspensión en una cámara de Neu-
bauer. Observar al microscopio a 400 X.
Se consideran linfocitos T, form adores de
rosetas E, a todas aquellas células que tienen
adheridas a su superficie 3 o más eritrocitos. Se
calcula el porcentaje determinando el número
total de células presentes y el de aquellas que
formaron rosetas.
Una modificación de esta técnica fue utiliza­
da para identificar o separar subpoblaciones de
linfocitos. Algunos linfocitos T y linfocitos B
tienen receptores para Fe de inmunoglobulinas
y/o receptores para C3b del complemento. Es­
tos linfocitos son capaces de unirse, a través de
estos receptores, a eritrocitos recubiertos con
anticuerpos específicos para un antígeno del
glóbulo rojo o a glóbulos rojos sensibilizados
con hemolisina en presencia de una fuente de
complemento deficiente en C,, formando rose­
tas. El receptor para Fe se expresa en la mem­
brana de muchas células incluyendo, linfocitos
B, linfocitos T (pequeña subpoblación), mono­
citos, macrófagos, granulocitos, plaquetas y cé­
lulas NK mientras que el receptor para C3b es­
tá presente en eritrocitos, neutrófilos, macrófa­
gos, eosinófilos, linfocitos T, linfocitos B y cé­
lulas dendríticas foliculares. Si bien la metodo­
logía es similar a la formación de rosetas E, es­
tas técnicas son inespecíficas para identificar
linfocitos T o linfocitos B y han sido totalmen­
te dejadas de lado para tal fin.
3.2. IN M U N O F LU O R ESC E N C IA
Los anticuerpos específicos para los antíge­
nos presentes en los linfocitos humanos, son
reactivos indispensables para la identificación
de estas células. En la década del ’60, se desa­
rrollaron metodologías sencillas para la marca­
ción de proteínas con reactivos fluorescentes,
uno de los fluorocromos más comúnmente uti­
liz a d o es el is o tio c ia n a to de flu o re sc e ín a
(FITC). Mediante las técnicas de inmunofluo-
rescencia, que se detallan en el capítulo 35, se
pueden identificar células en suspensión o en
cortes fijos de tejidos, disponiendo de un m i­
croscopio de luz ultravioleta. Los resultados se
expresan en forma cualitativa o semicuantitati-
va como porcentaje de células positivas expre­
sando un determinado antígeno.
3.3. C ITO M E TRÍA D E FLUJO.
SU U TILID AD E N LA D ETE C C IÓ N
D E L F EN O TIP O C ELU LAR, LA
C L A SIF IC A C IÓ N D E C ÉLU LAS
Y E L A N Á L IS IS D E L A D N
La tecnología de los clasificadores de células
activados por fluorescencia se desarrolló en la
década del ’70 con el propósito de disponer de
métodos cuantitativos y para facilitar los estu­
dios de poblaciones de linfocitos que podrían
ser identificados y clasificados sobre la base de
la expresión de un antígeno determinado pre­
sente en la membrana de la célula, y luego ca­
racterizados funcionalmente.
La determinación del número y la capacidad
funcional de los leucocitos de sangre periférica
de un individuo reflejan el estado íntegro de la
inm unidad. Los linfocitos expresan diversos
marcadores de superficie que pueden ser iden­
tificados por anticuerpos monoclonales, anti­
sueros policlonales o monoespecíficos. El uso
de anticuerpos monoclonales junto con la cito­
metría de flujo permite definir el fenotipo celu­
lar de linfocitos discrim inando no sólo entre
linfocitos T, linfocitos B y células NK sino
también entre subgrupos de estas poblaciones.
La citometría de flujo para determinar sub­
poblaciones de linfocitos humanos ha comen­
zado a ser muy útil en el diagnóstico y pronós­
tico de diversas situaciones clínicas, como el
trasp lan te de órganos y de m édula ósea, el
diagnóstico de leucemias y linfomas y la eva­
luación de inmunodeficiencias. Esta metodolo­
gía ha desplazado a las técnicas de inmunojluo-
rescencia en la práctica clínica por ser más
confiable, reproducible y sensible que la deter­
minación por microscopía.
Los citómetros de flujo son instrumentos que
analizan rápidamente células individuales m ar­
cadas con fluorocromos que fluyen a gran velo­
cidad en un medio líquido por delante de una
fuente de excitación. Cada célula se evalúa se­
gún diversas características: forma, tam año,
composición antigénica y bioquímica. Esta m e­
todología perm ite la identificación de subpo­
blaciones pequeñas en mezclas complejas de
células por sus características de alta precisión
y sensibilidad. Una propiedad im portante de
estos aparatos consiste en poder discriminar la
fluorescencia de los fluorocromos que emiten a
diversas longitudes de onda. De esta forma, va­
rios marcadores presentes en la membrana de
 Metodologías para ¡a evaluación de las células inmunocompetentes
una célula (por ejemplo en linfocitos T: CD3,
CD8) pueden ser detectados simultáneamente
mediante el empleo de anticuerpos específicos
conjugados a distintos fluorocromos, anti CD3
conjugado a FITC, anti CD8 conjugado a PE
(véanse figs. 36-5b y 36-6).
La citofluorom etría tam bién puede separar
subpoblaciones de células de acuerdo a las ca­
racterísticas medidas. Las células que emiten
señales fluorescentes predeterminadas pueden
ser desviadas d iferencialm en te por cam pos
electromagnéticos cuya intensidad y dirección
varía de acuerdo a la intensidad de la señal de
la fluorescencia medida. De esta forma, se pue­
den aislar poblaciones celulares en base al anti­
cuerpo, conjugado a un fluorocromo, unido a la
superficie celular, obteniéndose las células se­
paradas en tubos colectores. Los instrumentos
capaces de ¡•ealizar este tipo de clasificación
electrónica de células se denominan clasifica­
dores de células activados por fluorescencia,
conocidos por su denominación en inglés fluo-
rescence-activated cell sorter (FACS).
Un citóm etro de flujo analiza electrónica­
mente las señales generadas por células u otras
partículas simples homogéneamente suspendi­
das cuando fluyen por delante de una fuente de
luz. El flujo con la muestra que contiene las cé­
lulas es introducido bajo presión a través de
otro flujo de líquido, denominado vaina, que
puede ser agua o solución salina isotónica. De
esta forma, las partículas se alinean y pasan a
través de la fuente de luz en hilera. La fuente de
luz, que es generalmente un haz de láser, pro­
vee la longitud de onda específica. La presencia
de una célula en el camino del láser dispersa luz
en todas las direcciones y excita a los fluorocro­
mos unidos a cada célula. Esta interacción per­
mite diversas mediciones de importancia bioló­
gica en las células. (Véase fig. 36-5.)
Cuando una célula interacciona con el rayo
láser, la luz dispersada es medida por detecto­
res orientados en forma ortogonal (SS) o frontal
(FS) a la luz incidente (fig, 36-5a). Estos detec­
tores no son sensibles a la fluorescencia y se
utilizan para discrim inar células (marcadas o
no con fluorescencia) del detrito celular. Los
parámetros medidos por estos detectores se co­
nocen por su denominación en inglés, forw ard
scatter (FS) y side scatter (SS). Cuando se es­
tudian leucocitos, el FS indica el tamaño celu­
lar mientras que el SS se correlaciona con el
contenido celular de gránulos.
Otros detectores miden emisión de fluores­
cencia de una longitud de onda determ inada
por medio de filtros ópticos instalados en el
frente de los tubos fotomultiplicadores (véase
fig. 36-5a),
En un citómetro de flujo, la luz dispersada
en un ángulo de 90° y la emitida por los fluoro­
743
cromos conjugados a los anticuerpos unidos a
las células son detectadas por un sistema am-
phficador denominado tubos fotomultiplicado­
res. Estos convierten la luz emitida en señales
electrónicas que luego son transform adas y
analizadas por una computadora que producirá
los gráficos característicos. ^
3.3.1. Detección de antígenos de linfocitos
humanos por citometría de flujo
Una de las principales aphcaciones de la ci­
tometría de flujo es la determinación del fenoti­
po de leucocitos circulantes y la tipificación de
leucemias o linfomas (véase Aplicaciones d e la
Inmunogenética al diagnóstico de leucemias y
linfomas, desarrollado en el Anexo de este ca­
pítulo). El protocolo que se describirá fue d ise­
ñado para estudiar células humanas de sangre
periférica por citometría de flujo.
M ateriales
- Sangre periférica entera, obtenida con an ti­
coagulante (EDTA o Heparina) y recogida
en condiciones de esterilidad.
- Anticuerpos monoclonales marcados con un
fluorocromo.
- Solución para Usar glóbulos rojos de T ris-
Cloruro de amonio (véase apéndice al final
del capítulo) o H^O destilada estéril.
- SST (solución salina tamponada) contenien­
do 0,1 % de azida (véase apéndice al final del
capítulo).
- Solución fijadora, paraformaldehído 1% en
SST.
- Tubos de centrífuga con fondo cóncavo, 12
X 75 mm (Falcon # 2052).
N O T A : todos los reactivos y las m uestras
deberán estar en condición de esterilidad.
Método
1. Para cada muestra, mezclar en tubos de cen ­
trífuga de 12 X 75 mm, 100 ¡0,1 de sangre en ­
tera anticoagulada y 5-20 |xl de los anticuer­
pos monoclonales marcados.
2. Homogeneizar e incubar a temperatura am ­
biente 15 a 20 minutos en la oscuridad.
3. Lisar los glóbulos rojos con 2 mi de so lu ­
ción de lisis. Agitar en un vortex e incubar 5
minutos en la oscuridad.
4. Centrifugar a 200 x g, 5 minutos a 4°C y as­
pirar el sobrenadante.
5. Agregar 2 mi de SST conteniendo 0,1% de
azida en cada tubo de reacción y agitar con
un vortex. Centrifugar a 300 x g, 10 m in u ­
tos a 4°C. Aspirar el sobrenadante y repetir
el lavado.
744 Metodologías

Detector
de luz naranja

Detector
de luz roja Detector
de luz
Detector de luz verde>
dispersada
ortogonalmente

Fuente
de rayo
láser

Cubeta
de
cuarzo
Detector de luz
incidente frontal
(FS)

Fig. 36-5a. Esquem a de los com ponentes de un citóm etro de flujo.

6. Para fijar las células, resuspender cada sedi­
mento celular en un volumen final de 0 ,1 ml
con paraformaldehído al 1% en SST azida,
pH 7,4. Antes del análisis por citometría,
agregar SST estéril llevando a un volumen
final entre 0,6 y 1,0 ml.
7. Guardar las muestras en la oscuridad a 4°C
(hasta 7 días) o analizarlas directamente en
el citómetro de flujo.
Controles
- Células que no fueron marcadas para deter­
minar la autofluorescencia.
~ En el caso de una técnica de marcación di­
recta, se realiza un control con un anticuerpo
conjugado irrelevante del mismo isotipo para
determinar unión inespecífica,
~ En las técnicas de marcación indirecta, se
tratan las células con un anticuerpo irrele­
vante del mismo isotipo y como segundo an­
ticuerpo, el conjugado utilizado en la reac­
ción.
Estos controles son indispensables y opcio­
nalmente se puede realizar un control positivo
(por ejemplo; células normales, células de lí­
neas caracterizadas).
Representación gráfica de los resultados
Los datos obtenidos en el análisis de pobla­
ciones celulares a través de un citofluorómetro
se pueden representar en diversas formas, grá­
ficos de puntos o de contornos e histogramas,
entre otros (fig. 36-6).
En las figuras 36-6 a y 36-6b, se representan
gráficam en te los parám etros obtenidos por
FACS, correspondientes al tamaño y al conte­
nido de gránulos de las distintas poblaciones
celulares presentes en una m aestra de sangre
p eriférica hum ana norm al. Estos parám etros
fueron representados por gráficos de puntos
(fig. 36-6a) o de contornos (fig, 36-6b).
En las figuras 36-6c-f, se grafican los datos
obtenidos al analizar la expresión de uno o más
marcadores fenotípicos de superficie en la mis­
ma población celular (figs. 36-6c y 6d y 36-6e
y 6f, respectivamente).
 Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes 745

F ig . 3 6 -5 b . D istrib u c ió n de
las célu las p ara ser an a liz a ­
das en un citóm etro de flujo.

Rayo
láser

C onsideraciones generales rescencia son células hematopoyéticas que

- Fluorocromos utilizados: en el cuadro 36-4
se indican la absorción y emisión máxima de
los fluorocromos más comúnmente utiliza­
dos.
- Autofluorescencia: es el resultado de la luz
emitida por materiales intracelulares excita­
dos naturalmente a la longitud de onda utili­
zada para excitar a los fluorocromos unidos
a las células. La mayor fuente de aiitofluo-
se excitan a 488 nm y tienen un pico m áx i­
mo de emisión cercano a 560 nm, que in ter­
fiere en las mediciones de FITC y R-PE.
Muestra a analizar: la muestra de elección
para el estudio de células mononucleares h u ­
manas es sangre entera anticoagulada y p o s­
terior lisis de los eritrocitos, siguiendo la
metodología descrita anteriormente. Cuando
se trabaja con células de m édula ósea, es
aconsejable realizar una separaciÓJi en g ra ­
dientes de Ficoll-Hypaque.

Cuadro 36-4. Emisión y absorción máxima de los principales fluorocromos utilizados en citom e­
tría de flujo

Fluorocromo.': A bsorción m áxim a (nm) E m isión máxima (nm )

A) Fluorocrom os para conjugar anticuerpos

Isotiocianato de fluoresceína (FITC) 495 525 (verde)
F icoeritrina B (B-PE) 545/565 575 (naranja)
F icoeritrina R (R-PE) 488/545/565 578 (naranja)
R ojo T exas (TXR) 595 62 0 (rojo)
A loficocianina (APC) 650 660 (rojo)
F icocianina C (CPC) 620 648 (rojo)
Rojo 613 488/565/595 613 (rojo)
Peridinin C lorophyll (PerCP) 470 680 (rojo)

B) Fluorocrom os para ácidos nucleicos

Y oduro de propidio (Pl) 340/530 620 (rojo)
B rom uro de etidio (EB) 345/530 605
N aranja de acridina 492 520
746 Metodologías
~~ Técnicas de m arcació n : pueden utilizarse
metodologías del tipo directa o indirecta, ex­
plicadas en las técnicas de inm unofluores­
cencia (cap. 35).
- F ijación: este tratamiento es optativo y se
realiza cuando las células no se analizan el
mismo día de la marcación. Permite que la
muestra se pueda guardar por 5 a 7 días sin
una pérdida considerable de la fluorescencia.
- V aloración de anticuerpos: la concentra­
ción óptima de anticuerpo se determina rea­
lizando una titulación del mismo frente a cé­
lulas conocidas positivas y se elige la con­
centración que produce la máxima respuesta.
La titulación es importante ya que una canti­
dad subsaturante puede disminuir el porcen­
taje de positividad mientras que un exceso
de anticuerpos puede resultar en aglutinación
de las células y aum entar la fluorescencia
in e sp e c ífic a . C o n sid eran d o que en cad a
muestra a analizar hay aproximadamente 1 x
JO® célu las, se agreg arán en tre 2,5 a 10
)j,g/ml de un anticuerpo monoclonal o 40 a
100 |ig/ml de anticuerpos polielonales para
alcanzar la concentración saturante.
Como las m oléculas de IgG se pueden
unir a los receptores para Fe, expresados en
la superficie de diversos tipos celulares, in­
dependientemente de su especificidad anti­
génica, es aconsejable utilizar anticuerpos
preparados con fragm entos Fab o F (ab )j’.
Otra forma para reducir las uniones inespe­
cíficas a los receptores de Fe, es bloquear
los sitios de unión con un exceso de suero.
3.3.2. Clasificación de células
La separación de células en citóm etros de
flujo involucra el análisis y la clasificación de
células individuales.
El uso de esta metodología está limitado por
el número total de células a separar. Conside­
rando que la velocidad de análisis y de clasifi­
cación de células es de aproximadamente 5.000
cél/segundo, no es conveniente utilizarla para
obtener altas concentraciones de subpoblacio­
nes celulares (por ej., 2 x 10’). Los métodos al­
ternativos de separación de células, inmunopla­
queo, inmunomagnéticos y depleción mediada
por complemento y anticuerpo, detallados ante­
riormente, tienen las ventajas de ser simples en
su procedim iento, producir un m ayor rendi­
miento y lograr una pureza equivalente al clasi­
ficador electrónico de células.
3.3.3. Análisis del ADN y del ciclo celular
por citometría de flujo
El contenido de ADN de los núcleos celula­
res refleja el com plem ento de crom osom as
(CR) o ploidía y la fase del ciclo celular en la
que se encuentran las células en estudio. Las
células que proliferan atraviesan distintas fases
del ciclo celular, las que fueron designadas
G|, S (síntesis), G^ y M (mitosis). En las etapas
de G^^ y G |, las células contienen una copia
simple del ADN (2 CR). Dentro de una pobla­
ción de células en un determinado tiempo, la
mayoría permanece sin dividirse, quiescentes o
en Go (véase fig. 36-7) y preparándose para la
síntesis del ADN (G,). Cuando las células co­
mienzan a proliferar entran en la fase S, duran­
te la cual se sintetizará un duplicado del ADN.
En la etapa G^ las células contienen dos grupos
de cromosomas (4 CR). La fase M termina con
la división celular y cada célula contiene una
cantidad normal de cromosomas (2 CR), deno­
minado euploidía o diploidía. Las células que
contienen cantidades anormales de ADN, au­
m entado o dism inuido, se identifican como
aneuploides. En general, las poblaciones celu­
lares aneuploides así como también las pobla­
ciones diploides pero con un alto grado prolife-
rativo (SG 2/M) se correlacionan con un pronós­
tico peor en diversas enfermedades malignas.
Lfna de las aplicaciones clínicas importantes
del análisis por citometría de flujo es la evalua­
ción del contenido celular del ADN para deter­
minar ploidía y frecuencia de células en las dis­
tintas fases del ciclo celular. El contenido del
ADN de una célula se estima por la unión este-
quiom étrica de un fluorocrom o al ADN nu­
clear. De esta manera, las células que estén en
G , tendrán una cantidad doble del ADN y fluo­
rocromo que las células en G^. Esta metodolo­
gía se aplica en el diagnóstico de leucemias en
seres humanos.
Para la determinación del ADN y del ciclo
celular por citofluorom etría, en el protocolo
que se describirá, las células en suspensión
son fijadas con etanol y se marcan con yoduro
de propidio. Éste se intercala dentro de la do­
ble cadena de los ácidos nucleicos y puede ser
excitado por un rayo láser de 488 nm, utiliza­
do comúnmente en los citómetros de flujo. Se
u tiliz a la en zim a A R N asa que d e g rad a al
ARN para que el yoduro de propidio sólo pue­
da unirse a la doble cadena del ADN intrace­
lu la r. L a unión del yo d u ro de p ro p id io al
ADN incrementa la fluorescencia alrededor de
50 veces.
El yoduro de propidio emite a 620 nm y por
lo tanto, puede ser discriminada de la emisión
de la fluorescencia del FITC (520 nm) en los
citómetros de flujo. Esta propiedad permite co­
rrelacionar el contenido de ADN con la expre­
sión de un antígeno celular de superficie utili­
zando yoduro de propidio y un anticuerpo con­
jugado con FITC para marcar las células que
serán analizadas.
 Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes
M ateriales
- Células creciendo en suspensión o monoca-
pa, de sangre periférica o de médula ósea.
- Buffer muestra (glucosa al 0.1% en SST, fil­
trar por 0,22 |am y guardar a 4°C).
Medio RPMI completo adicionado con SFB
al 10%, R PM I-10 (véase apéndice al final
del cap.).
^ Etanol al 70° a 0“C.
- Solución madre de yoduro de propidio de 1
mg/ml (100 mg de Pl guardado en desecador
en 100 mi de H^O, filtrar por 0,22 |am, con­
servar a 4°C protegida de la luz). El yoduro
de propidio es un carcinógeno potencial, y se
deben tomar precauciones en su manipuleo.
- Solución de trabajo de yoduro de propidio:
0.5 mi de la solución madre de yoduro de
propidio, 1000 unidades Kunitz de ARNasa
(100 U /m l concentración final), 10 mi de
buffer muestra. Realizar la mezcla en el mo­
mento de usarla,
- Tubos de centrífuga de 15 x 75 mm.
M étodo
1. Centrifugar las células en suspensión a 400
X g, a 4°C durante 10 minutos. Descartar el
sobrenadante y resuspender las células en
10 a 12 mi de buffer muestra, lavar dos ve­
ces repitiendo el procedimiento y contar el
número de células.
A lternativam ente, las células podrían ser
tratadas previamente con anticuerpos mono­
clonales para la detección de un antígeno
superficial. Se aconseja utilizar como fluo-
rocromo el FITC.
2. Ajustar la concentración a 1-3 x 10*’ cél/ml
diluidas en buffer muestra dependiendo del
citómetro de flujo. Pipetear 1 mi de la sus­
pensión celular en tubos de centrífuga.
3. Centrifugar las células a 400 x g durante 10
minutos, a 4“C. D escartar el sobrenadante
con cuidado sin tocar el sedimento celular.
4. Agitar en vortex vigorosamente durante 10
segundos. Continuar la agitación en vortex
y adicionar 1 mi de etanol al 70° frío, gota a
gota, sobre el sedimento. Tapar los tubos y
dejar las muestras fijándose en etanol, toda
la noche a 4°C, para lograr una resolución
máxima del ADN celular.
Las células que han sido fijadas en etanol
son estables por años a 4°C. Las muestras fi­
jadas pueden ser marcadas después de 18 a
24 h.
5. Preparar la solución de trabajo de yoduro de
propidio.
6. Agitar la muestra en un vortex. Centrifugar 5
minutos, a alta velocidad (por ej. 2.000 x g).
747
D escartar el etanol sin tocar el sedimento.
Verificar que haya un sedimento visible. En
el caso contrario, volver a centrifugar a m a­
yor velocidad hasta que sea visible.
7. Agitar en un vortex para resuspender las cé­
lulas en el etanol residual. Adicionar 1 mi
de solución de yoduro de propidio en cada
tubo y agitar cuidadosamente. Incubar las
muestras a temperatura ambiente durante un
tiempo superior a 30 minutos.
Una agitación suave puede acelerar el proce­
so de marcación y asegurar la degradación
de la doble cadena del ARN. La ARNasa es
activa en etanol.
8. A nalizar las muestras en un citóm etro de
flujo dentro de las 24 h.
En la fig. 36-7, se muestra el histograma co ­
rrespondiente al análisis del ciclo celular de c é ­
lulas mononucleares obtenidas de sangre p e ri­
férica humana. Del gráfico surge que la m ayo­
ría de las células se encuentran en la fase G .
4. ESTU D IO DE LAS
C A R A C T E R ÍSTIC A S IN M U N O LÓ G IC A S
BÁSICAS DE LAS CÉLULAS QUE
PARTICIPAN DE LA RESPUESTA
INMUNE. PRUEBAS FUNCIONALES
IN VITRO
4.1. E V A L U A C IÓ N D E LA A C T IV A C IÓ N
L IN E O C IT A R IA
La activación de los linfocitos, mediada p o r
un antígeno o un estimulante policlonal, es un
proceso caracterizado por una cascada com ple­
ja de eventos bioquímicos y moleculares que
com ienza con la generación de los segundos
mensajeros y culmina con la proliferación y el
desarrollo de funciones efectoras. Los eventos
tempranos de esta cascada incluyen la activa­
ción de tirosina quinasas, la hidrólisis de fosfo­
lípidos de membrana, el aumento de la activi­
dad de la Proteína quinasa C (PKC) e in cre­
mento del Ca^+ intracitoplasmático. Fastos s e ­
gundos mensajeros estimulan la transcripción
de los genes requeridos para la proliferación y
las funciones efectoras de las células.
Diversos ensayos permiten la evaluación de
eventos tempranos de la activación celular, ta ­
les como, aumento en la concentración de Ca^+
intracelular (Kammer, 1992), activación de la
PKC (Kraft y col., 1982; LePeuch y col,; 1983)
que ocurren en minutos o la síntesis de IL-2 y
la expresión del IL-2R producidas a las 24 h o ­
ras. La detección de lL-2, se describirá en el
punto 4.4.2.1 de este capítulo.
748 Metodologías

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FSC-H/FSC-Height Tamaño Celular FSC-H/FSC-Height Tamaño Celular ■

11 :/1/A007/FL1 -H/CD4 FITC

® S>.

FI1-H/CD4 FITC 10=* lO-*

S
§
LL

FI1-H/CD3 FITC-> FI1-H/CD3 FITC

i
F ig . 36-6. Representación gráfica de los parám etros obtenidos al analizar una suspensión celuhu- en un citóm etro de flujo,
a y b . G ráficos de puntos y contornos que representan el contenido de gránulos y el tam año celular, SSC y FSC resp ecti­
vam ente, de células provenientes de una m uestra de sangre periférica hum ana, c y d. G ráfico de puntos e histogram a co ­
rrespondientes a la expresión del m arcador CD 4 en las células provenientes de una m uestra d e sangre periférica hum ana, e
y f. G ráficos de puntos y de contornos correspondientes a la expresión de los inarcadores CD3 y C D 8 , determ inados si­
m ultáneam ente en las células provenientes de una m uestra de Sctngre periférica hum ana. (Estos gráficos fueron gentilm ente
cedidos por la bioquím ica A na E scalada y el doctor A rgim iro R. Suárez.)
 Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes
F ig. 36-7. H istogram a correspondiente al contenido del A D N de u n a població n de células m ononucleares humanas. (G rá ­
fico gentilm ente cedido p or la bioquím ica A na Escalada y el doctor A rgim iro R. Suárez).
4.2. E V A L U A C IÓ N D E LA
P R O L IF E R A C IÓ N LIN F O C IT A R IA
I N VITRO
La interacción entre el receptor de membra­
na de un linfocito y su ligando específico de­
sencadena señales de activación intracelulares,
que en la mayoría de los casos llevan a la divi­
sión celular. La capacidad de los linfocitos para
responder in vitro a un estímulo es la respuesta
más simple y conveniente de ser evaluada en
investigación y en estudios clínicos.
La respuesta proliferativa puede incluir a las
poblaciones linfocitarias T, B o ambas. Una lis­
ta parcial de los ligandos que pueden iniciar la
división celular de los linfocitos incluye a: los
mitógenos extraídos de plantas (fitohemagluti-
nina, PHA; concanavalina A, Con A y el mitó-
geno de la fitolaca, PWM), productos bacteria­
nos {Staphylococcus aureus Cowan 1), antíge­
nos ubicuos que activan a linfocitos de mem o­
ria {Candida albicans, toxoide tetánico, etc),
linfocitos alogeneicos, citoquinas y anticuerpos
m onoclonales específicos para receptores de
superficie (CD3 o CD2). En el cuadro 36-5 se
enumeran los activadores más comunes de los
linfocitos humanos y los rangos de dosis en
que se utilizan.
Los mitógenos PHA y Con A son capaces de
estimular a los linfocitos T maduros incluidos
los CD4 y CD8 (a/p) y también los CD3+(y/6).
749
Contenido de ADN celular
400 600
Estas lectinas se unen a la porción de azúcares
de las glucoproteínas expresadas en la superfi­
cie de las células T y de las células presentado­
ras de antígeno conduciendo a la activación p o ­
liclonal de los linfocitos. Los linfocitos T aisla­
dos no responden al estímulo antigénico o mi-
togénico ya que necesitan la presencia de célu ­
las presentadoras de antígeno.
La estimulación de las células mononuclea­
res de sangre periférica mediada por el PW M
es una m-'dida de la funcionalidad de los lin fo ­
citos T y de la sensibilidad de los linfocitos B.
Los linfocitos B puros.no responden al PW M
porque necesitan que los linfocitos T activados
secreten linfoquinas para poder diferenciarse
en células plasmáticas.
Las enterotoxinas de los Staphylococcus son
mitógenos potentes para los linfocitos T y el
Staphylococcus aureus Cowan 1, es un estim u­
lante de los linfocitos B.
El lipopolisacárido (LPS) es un mitógeno de
linfocitos B pero no posee un efecto mitogéni-
co importante sobre los linfocitos B humanos.
En un ensayo de proliferación podría m edir­
se el número de células generadas y sobrevi­
vientes en el cultivo luego de un determinado
estímulo, usando un colorante vital y por o b ­
servación posterior de las células en el m icros­
copio óptico. Considerando que esta m etodo­
logía es muy laboriosa, en la práctica se estim a
la proliferación por la determinación de la in-
750 Metodologías

Cuadro 36-5. Activadores de linfocitos humanos

Activador Tipo celular Blanco ele activación Rango de dosis

A ntígenos

T oxoide tetánico LT TCR I a 20 |j,g/ml

PPD LT TC R I a 10 |j,g/nil

M itógenos

PHA LT CD 2. C D 3-TC R 1a 10 |j,g/ml

C on A LT C D 2, C D 3-T C R l a iO
Staph A C ow an I LB Inm unoglobulina de superficie l:I 0^al : 105
PW M LT yLB dilución final 1:100 dilución final

CéJ ulas

A logcneicas no LT LT TCR 1:1 a L IO E /R *

A ntologas no LT LT TCR 1:1 a 1:10 E/R*

lo n ó foros

lonom icina LB y LT Canales iónicos 0,5 pM

É steres de forbol

PM A LB yLT PK C 0,5 a IO ng/m l

A nticuerpos

A nti-C D 3 LT C D 3-TC R D eterm inar la dosis

A nti-IgM LB Inm unoglobulina de superficie 10 a 50 |j,g/ffll

Linfoquinas

lL -2 LT y LB Cadenas p /y d e l 1L-2R 1 a 100 U/ml

IL-4 LT yLB IL-4R 1 a 100 U/ml
B C G F (factor de creci­ LB BCG R-R 10% concentración final
m iento de LB)

* N ú m ero de células c s tim u la d o ra s/n ú m erü de cé la la s re sp o n d ed o ra s.

corporación de timidina tritiada al ADN de las lo general, suspensiones celulares del bazo de
células cultivadas, proceso que está general­ un animal, por ejemplo, esplenocitos murinos.
mente relacionado con cambios en el número
de células. 4.2.1. Proliferación in vitro de células
En este capítulo se describirán microensayos mononucleares inducida por un mitógeno
para evaluar la respuesta de células m ononu­
cleares, inducida por estimulación con mitóge­ Esta metodología permite medir la respuesta
nos de plantas, células alogeneicas o antígenos de las células mononucleares, aisladas de san­
ubicuos, usando la incorporación de timidina gre periférica obtenida de diferentes donantes,
tritiada como una medida de la proliferación frente a distintas concentraciones del mitógeno
celular. Los mitógenos son estimulantes del ti­ PHA, que estimula principalmente la prolifera­
po policlonal y transforman a la mayoría de los ción de linfocitos T. El protocolo puede ser
linfocitos de individuos normales, independien­ modificado para ser usado con una variedad de
tem ente de una inm unización previa. Por el estimulantes polielonales (cuadro 36-5).
contrario, los antígenos son estimulantes espe­
cíficos de linfocitos provenientes de donantes M ateriales
sensibilizados y, consecuentemente, activan a
un menor número de linfocitos. - Suspensión de células mononucleares aisla^
En las meíodologías que se detallarán, se uti­ das de sangre periférica por un gradiente de
lizan células mononucleares de sangre periférica Ficoll-Hypaque.
humana, como fuente de células efectoras de la - Medio de cultivo RPMI completo suplemen­
inmunidad celular. Cuando se realizan estos en­ tado con 5% de SFB, RPMl-5 (véase apéndi­
sayos con fines experimentales, se utilizan, por ce al final del capítulo).
 Metodologías para ¡a evaluación de las células inmunocompetentes
- Solución madre de PHA (1 mg/ml) en RPMI-
5. Se guarda en alícuotas a -20'>C.
- Suero fetal bovino (SFB), inactivado a 56°C,
30 minutos, previamente ensayado para des­
cartar la presencia de LPS contaminante que
podría inducir una estimulación basal.
- M icroplacas de cultivo de 96 orificios con
fondo en “U”.
- Metil timidina tritiada ([^H] TdR, ImCi/ml,
6,7 Ci/mmol; Du Pont NEN, # NET-027).
- Papel de fibra de vidrio.
- Cosechador de células.
~ Contador de centelleo líquido del tipo |3.
N OTA: todos los reactivos y materiales que
estén en contacto con las células deberán estar
en condiciones de esterilidad y el operador de­
berá seguir los procedimientos empleados para
el cultivo de células.
Método
1. Contar las células mononucleares de sangre
periférica y ajustar la concentración de la
suspensión celular a 1 x 10*’ células/ml en
RPML5.
2. Sembrar 1 x 10'’ células (100 }il de la sus­
pensión celular previamente homogeneiza-
da) en cada uno de los pocilios de la placa
de 96 orificios. Para cada condición experi­
mental realizar cuadruplicados.
3. Diluir la solución madre de PHA en concen­
traciones de 2, 5, 10 y 20 |ag/ml. Las dilu­
ciones se hacen con RPM L5 y se agregan
100 1J,1 de cada una por pocilio, obteniéndo­
se concentraciones finales de PHA en los
cultivos de 1, 2,5, 5 y 10 |ag/ml respectiva­
mente. Realizar controles de proliferación
basal, cultivando el mismo niimero de célu­
las respondedoras en presencia de RPMI-5.
4. Incubar a 37"C, en una estufa de cultivo ga­
seada con atmósfera de 5% de CO^, durante
48 o 72 h.
5. En las últim as 4 a 24 h agregar 1 |0,Ci de
[3H]-TdR en cada orificio. Luego de ia in­
cubación, cosechar las células y posterior­
mente proceder a la medición de la radiacti­
vidad incorporada, siguiendo las metodolo­
gías detalladas en el apéndice.
En una serie de experiencias es importante
respetar el tiempo del pulso de [^H]-TdR pa­
ra obtener resultados comparables.
Existen diversas ventajas en el uso de sangre
entera en ensayos de proliferación respecto del
uso de células aisladas. Una de las más impor­
tantes es que se requiere un mínimo volumen
de sangre (0,1 mi); esto puede ser crítico en
personas muy enfermas, en niños o cuando se
realiza un estudio longitudinal. El uso de san­
751
gre entera se correlaciona con una mejor repre­
sentación de las condiciones in vivo, ya que no
se m odifica la distribución de los elem entos
humorales y celulares.
El procedim iento es igual al descrito an te­
riormente, excepto que la m uestra se prepara
diluyendo la sangre heparinizada 1:5 en medio
de cultivo (RPMI 1640), sin agregarle suero
exógeno. Se siembran 100 ¡xl de dicha suspen­
sión celular en cada pocilio de una placa de 96.
4.2.2. Reacción de cultivo mixto linfocitario
unidireccional
La reacción de cultivo mixto linfocitario es
una medida de la capacidad de los linfocitos T
de un individuo de reconocer diferencias en
antígenos alogeneicos, principalmente de clase
11, expresados en los linfocitos B y en los m o ­
nocitos de otro individuo. En esta reacción se
evalúa la proliferación de los linfocitos en re s­
puesta a la estim ulación de células m ononu­
cleares alogeneicas tratadas con mitomicina C
o irradiadas, para evitar la proliferación de e s­
tas últimas.
A pesar de que esta reacción ha sido a m e­
nudo utilizada en la evaluación de la inm uni­
dad celular, l;i utilidad más im portante es en
los estudios de compatibilidad de donantes p a ­
ra trasplantes, particularmente en los de m édu­
la ósea.
M ateriales
- Medio de cultivo RPMI completo suplemen­
tado con SFB al 5%, RPMI-5. Véase apéndi­
ce al final del capítulo.
- Suspensión de células respondedoras (célu­
las mononucleares de sangre periférica).
- Suspensión de células estimuladoras aloge­
neicas (células mononucleares de sangre p e ­
riférica).
- Suspensión de células estimuladoras antolo­
gas (células mononucleares de sangre perifé­
rica).
~ Solución de M itom icina C, 0.5 mg/ml en
RPMI-5. Esta solución debe mantenerse p ro ­
tegida de la luz. Alternativamente, las célu ­
las pueden ser irradiadas con una dosis de
2000-3000 rads de radiación y.
- M icroplacas de cultivo de 96 orificios con
fondo en “U”.
- Metil timidina tritiada ([^H] TdR, Im Ci/ml,
6.7 Ci/mmol; Du Pont NEN, # NET-027).
- Papel de fibra de vidrio.
- Cosechador de células.
- Contador de centelleo líquido del tipo p.
N O TA : todos los reactivos y materiales que
estén en contacto con las células deberán estar
752 Metodologías
en condiciones de esterilidad y el operador de­
berá seguir los procedimientos empleados para
el cultivo de células.
Método
1. Contar las células mononucleares y ajustar
en una concentración de 1 x 10'> células/ml
en RPMI-5.
2. Con el propósito de inhibir la proliferación
celular, tratar a las células mononucleares
e stim u lad o ras, a lo g e n e ic a s y au tó lo g a s
(control), con mitoinocina C o con irradia­
ción.
Tratamiento con mitomocina C: a la sus­
pensión de células a tratar, se le agrega mi-
tomicina C en una concentración final de 25
|ig/ml y se incuba 30 minutos en estufa de
^ cultivo a 37“C, 5% de CO^ en la oscuridad.
Luego, se lavan las células tratadas 3 veces
con R PM I-10 para remover los restos de la
droga, centrifugando a 400 x g, durante
5-10 minutos, preferentemente en centrífuga
refrigerada. Entre cada lavado, las células se
incuban 5 minutos a 37“C.
Irradiación: 2000-3000 rads (el tiempo
de exposición a la radiación dependerá del
equipo utilizado como fuente de radiación).
Es importante, determinar la viabilidad ce­
lular posteriorm ente a estos tratam ientos,
ya que las células deben perm anecer via­
bles.
3. Dispensar 100 |0,1 de células respondedoras
por orificio (1 x 10^ células/pocilio). Reali­
zar cuadruplicados para cada condición ex­
perimental.
4. A gregar 100 jal de células estim uladoras
alogeneicas o 100 |i.l de células autólogas
previamente tratadas (1 x 10'* células/poci­
lio), en los pocilios correspondientes que
contienen las células respondedoras. El con­
trol de proliferación basal se realiza agre­
gando 100 ¡il de RPMI-5 a las células res­
pondedoras. Además, se debe controlar que
las células hayan recibido una irradiación
adecuada y no proliferen. Para ello, sembrar
100 |u,l de estas células en presencia de 100
[il de RPMI-5.
5. Incubar a 37“C, 5 a 7 días en estufa de culti­
vo gaseada con 5% de CO^.
6. En las últimas 4 a 24 h agregar 1 ¡aCi de
I^H j-TdR en cada orificio. Luego de la incu­
bación, cosechar las células y posteriormen­
te proceder a !a medición de la radiactividad
incorporada, siguiendo las metodologías de­
talladas en el apéndice.
En una serie de experiencias es im portante
respetar el tiempo del. pulso de pHJ-TdR para
obtener resultados comparables.
4.2.3. Proliferación de linfocitos inducida
por estimulación antigénica
Este protocolo se desarrolló para m edir la
proliferación de los linfocitos T en respuesta a
un antígeno específico. En este, caso, se utiliza
el toxoide tetánico porque es un antígeno para
el cual la mayoría de la población está sensibi­
lizada y evalúa la respuesta inmune de memo­
ria. Esta técnica sirve de modelo pudiendo ser
modificada para analizar la respuesta prolifera­
tiva de linfocitos T frente a otras proteínas o
polisacáridos antigénieos.
Materiales
- Células m ononucleares aisladas de sangre
del paciente. Alternativamente, podría utili­
zarse una suspensión de linfocitos T purifi­
cados adicionados con células autólogas pre­
sentadoras de antígeno (monocitos-macrófa­
gos).
“ Solución de toxoide tetánico, 1 mg/ml.
Los m ateriales necesarios son los mismos
que se mencionaron para la proliferación por
mitógenos o en el Cultivo mixto linfocitario.
NOTA: todos los reactivos y materiales que
estén en contacto con las células deberán estar
en condiciones de esterilidad y el operador de­
berá seguir los procedimientos empleados para
el cultivo de células.
Método
1. Ajustar la concentración de las células res­
pondedoras (células mononucleares o linfo­
citos T purificados) a 1 x 10® células/ml en
RPMI-5. En el caso de trabajar con linfoci­
tos T purificados, tratar a las células presen­
tadoras de antígeno con m itom icina C o
irradiación y llevar a una concentración a 2
X 105 células/ml.
2. Colocar 150 ¡al de la suspensión de células
mononucleares en cada pocilio. Si se utili­
zan linfocitos T puros, sem brar 100 jal de
estas células y 50 ¡xl de la suspensión de cé­
lulas presentadoras en cada pocilio.
3. Siguiendo el protocolo de la reacción, colo­
car 50 jo.1 de cada dilución de la solución de
toxoide tetánico en cada orificio y por cua­
druplicado. Las concentraciones finales del
toxoide tetánico serán de O, 1, 5, 10 y 20
ug/ml, entonces se deberán dispensar 50 jiJ
de RPMI-5 y 50 jal de cada una de las con­
centraciones del toxoide tetánico, 4, 20, 40
y 80 jig/ml respectivamente.
4. Incubar entre 5 a 8 días en estufa de cultivo
gaseada con 5% de CO, a 37“C, Para cada
 Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes 753

C on canavalina A (^g /m l)

F ig . 3 6 -8 . R e s p u e s ta lin f o p ro life r a tiv a d e c é lu la s m o n o n u c le a re s h u m a n a s en r e s p u e s ta a d iv e rs a s c o n c e n tr a c io n e s de

c o n c a n a v a lin a A.

antígeno se debe establecer el tiempo (días) En este tipo de ensayos es indisp en sab le
en donde el pico proliferativo sea mayor. comparar la respuesta de los linfocitos d e los
5. En las últim as 4 a 24 h agregar ] |j,Ci de pacientes con la de donantes normales.
[^HJ-TdR en cada orificio. Luego de la incu­ £in la figura 36-8 se grafica la respuesta pro-
bación, cosechar las células y posteriormen­ liferativa de células mononucleares de sangre
te proceder a la medición de la radiactividad periférica humana, estimuladas in vitro con dis­
incorporada, siguiendo las metodologías de­ tintas concentraciones de Con A. Esta curva
talladas en el apéndice. dosis-respuesta es un ejemplo típico de u n a es­
En una serie de experiencias es importante timulación mitogénica.
respetar el tiempo del pulso de pH]-TdR pa­ A manera de ejemplo, en el cuadro 36-6 se
ra obtener resultados comparables. muestran los resultados correspondientes a un
cultivo mixto linfocitario realizado para elegir
4.2.4. Expresión e interpretación al donante para un trasplante de médula ósea.
de los resultados
4.3. E V A L U A C IÓ N D E LA
Existen diversos criterios sobre la mejor m a­ FUNCIONALIDAD CELULAR POR
nera de expresar los datos de un ensayo de pro­ MEDIO D E REAC C l O M S D E
liferación. Cuando se utiliza la incorporación CITOXICIDAD M l D \D i POR CÉLULAS
de [^HJ-TdR como medida de la proliferación,
la forma más común es calcular el promedio de 4.3.1. Ensayos para evaluar la función
las cuentas por minuto (cpm) para cada condi­ citotóxica mediada por linfocitos T
ción experimental, por ejemplo, cpm promedio
de los cultivos estimulados menos cpm prom e­ La eitotoxicidad o lisis mediada por linfoci-
dio de los cultivos control, sin tratar. Otra m a­ tos T requiere de la interacción del R eceptor T
nera frecuentemente utilizada es calcular el ín­ con péptidos antigénicos unidos a m oléculas
dice de estimulación como el cociente entre las del Complejo M ayor de H istocom patibilidad
cpm de las células estimuladas y las cpm de las (CMH) presentes en las células blanco. E sta in­
células control, no estim uladas. Este últim o teracción desencadena la lisis celular a través
método tiene un ineoveniente, las células no de la liberación de gránulos que contienen en­
estimuladas pueden variar considerablemente zimas proteolíticas. Este mecanismo efector es
las cpm incorporadas (proliferación basal) y de fundamental importancia en la respuesta in­
afectar al índice de estimulación. Calcular las mune dirigida hacia tumores, trasplantes y vi­
cpm promedio y el desvío estándar para cada rus. La mayoría de las células efectoras citotó-
condición experim ental o para el control. El xicas son linfocitos T CD8+ específicos que re­
desvío estándar de las réplicas debe ser menor conocen a los antígenos presentados en el con­
al 15%. texto de las moléculas del CMH de clase L Sin
754 Metodologías

Cuadro 36-6. Cultivo mixto linfocitario

Respondedoras Estimuladoras"

D onante no
P aciente M adre Padre Hei'mano 1 H erm ano 2 relacicMado

P a c ie n te 303 + 104 27890 + 3345 35674 ± 3267 2 1 4 5 6 + 2343: 319 ± 1 6 2 37658 ± 2343

M a d re 1 2 3 4 5 ± 1 047 222±85 40111 ± 3 1 2 0 13375+1999 12567±2015 33432 ± 3789

P a d re 169 8 9 ± 2 0 0 5 2 5 6 7 5 ± 1078 678 + 309 26574 + 2378 10301 + 6 9 2 41500 ± 3954

H e rm a n o 1 28887 ± 3 2 7 8 2 0 5 4 6 ± 1879 26998 ± 2367 3 0 3 + 156 24908 >1768 39003 ± 4 0 0 9

H e rm a n o 2 423+105 2 0 7 8 6 + 1 457 34789 ± 3699 42549 ± 3987 ,2 8 9 ± 7 8 53406 + 5123

D o n a n te rio r e la c io n a d o 27567 ± 3109 37568 ± 3654 52309 ± 4 9 9 7 42346 + 3560 44376 ± 2 6 5 4 302 ± 1 4 4

Las cé lu la s m ononucleares; estim u la d o ra s sep a rad a s p o r F ico ll-H y p a q u e fu e ro n iirad íad as.
E t pac ien te y el h erm a n o 2 son m u tu a m e n te jio re s p o n d e d o re s ,.n o e stim u la d o re s, in d ican d o q u e e x iste c o m p a tib ilid a d a nivel de an tíg en o s
del H L A . E stos datos unidos con los dalos d e la tip ific ac ió n sero ló g ic a, in d icarán q u e el herm a n o 2 es un exc elen te d o n an te para el p ac ien te,
m ien tras q u e el h erm a n o I no lo es. C ad a uno d e los in d iv id u o s n o re sp o n d ió a las células estim u la d o ra s antologas.

embargo, se demostró que existen, en menor cientemente por quimioluminiscencia, tendien­

proporción, poblaciones de linfocitos T CD4+ tes a reem plazar el material radiactivo y au ­
citotóxicos, que efectúan el reconocimiento an­ mentar la sensibilidad.
tigénico a través de las moléculas del CMH de
clase II. M ateriales
El primer paso de una determinación de cito-
toxicidad comprende la generación de los lin­ - Células efectoras: generalmente se utilizan
focitos T citotóxicos específicos. Estos pueden células mononucleares obtenidas por centri­
encontrarse pre-estim ulados en el huésped o fugación de sangre periférica a través de un
deberán ser sensibilizados in vivo o in vitro. gradiente de Ficoll-Hypaque o células de un
En sangre periférica los linfocitos T citotóxi­ homogenato de bazo con fines experimenta­
cos no pueden ser detectados sin una sensibih- les. Las células mononucleares pueden estar
zación previa, a menos que el individuo se en­ previamente activadas para ejercer citotoxi­
cuentre en el período de actividad de una infec­ cidad, es decir linfocitos T citotóxicos pre­
ción viral. Cuando se quiere medir la reactivi­ formados con una cierta especificidad (anti­
dad de los linfocitos T citotóxicos generalmen­ viral, alogeneica, etc). Alternativamente, las
te es necesario estimular a las células efectoras células mononucleares que se utilizarán co­
in vitro pre-incubando células mononucleares mo efectoras citotóxicas, pueden ser genera­
en presencia de antígenos específicos. Para ello das in vitro.
se co-cultivan las células m ononucleares de
sangre periférica, durante 5 a 7 días, con antí­ Generación de linfocitos T
genos solubles o con células que expresan los citotóxicos in vitro
antígenos de interés, previam ente irradiadas.
Los linfocitos T citotóxicos específicos genera­ 1. Mezclar 1 x 10’ células blanco, estimulado­
dos se cosechan al final de los cultivos. ras, tratadas con mitomicina C o irradiadas,
La técnica más frecuentemente empleada pa­ con 1 X 10’ células respondedoras en un
ra determinar citotoxicidad utiliza la liberación frasco de cultivo T75 con un volumen de 20
de '“''C r por la célula blanco. Las células efecto- mi de RPMLIO.
ras son puestas en contacto con las células La relación óptima de células respondedo­
blanco marcadas radiactivamente con ^‘Cr, du­ ras/células estimuladoras (R/E) utilizada pa­
rante un período de incubación de 4h. La ra­ ra la generación de células efectoras citotó­
diactividad liberada es directamente proporcio­ xicas puede variar en cada caso. Es aconse­
nal a la lisis celular. jable preestablecerla probando con distintas
Si bien la liberación de ^'Cr es un procedi­ proporciones entre 10:1 hasta 1:1 de R/E.
miento ampliamente utilizado para detectar ci­ 2. Incubar las células a 37“C durante 6 días, en
totoxicidad, en los últimos años se han desarro­ una estufa gaseada con 5% de CO^ para ge­
llado métodos colorimétricos (véase apéndice nerar los linfocitos T citotóxicos específicos.
al final del capítulo), fluorimétricos y más re­ 3. Lavar las células con RPMl-lO.
 Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes
4. Determinar la viabilidad celular y resuspen­
derlas en la concentración reciuerida. Esta
suspensión se utiliza como fuente de células
efectoras citotóxicas.
~ C élulas blanco: la elección de las mismas
dependerá de la función efectora a medir y
de su disponibilidad. En la elección de una
célula blanco, se deben tener en cuenta las
siguientes características, la capacidad para
ser lisadas por las células efectoras, la capa­
cidad para procesar antígeno in vitro, la m a­
yor facilidad para incorporar y retener la
marca y la expresión de antígenos del CMH
de clase I y II.
a. células blanco para lirifocitos T citotóxi-
cos con reactividad antiviral: podrían
utilizarse fibroblastos, la línea celular B-
LCL, que son linfocitos B humanos in­
m ortalizados por el virus Epstein-B arr
(EBV), linfocitos activados por m itóge­
nos o m acrófagos alveolares. En todos
los casos las células deberán provenir de
donantes autólogos. Las células blanco
se pueden infectar con el virus, transfec-
tar con un gen viral específico o sensibi­
lizar con un péptido inm unodom inante
viral.
b. células blanco alogeneicas: son de utili­
dad para definir la especificidad en antí­
genos de HLA en una respuesta de linfo­
citos T citotóxicos (medición de los nive­
les de aloreactividad después de una sen­
sibilización contra antígenos del CMH en
un trasplante de órganos). Como células
blanco pueden usarse blastos (células m o­
nonucleares estim uladas por un m itóge­
no, PHA). A lternativam ente, se pueden
inmortalizar linfocitos B de un paciente o
donante, tratando a las células m ononu­
cleares de sangre periférica con ciclospo-
rina y un cultivo de EBV.
- M icroplacas de cultivo de 96 pocilios con
fondo en “U”.
~ M edio RPMI com pleto suplem entádo con
5% y 10% de SFB , R P M l-5 y R PM I-IO
(véase apéndice al final del capítulo).
- Solución salina tam ponada adicionada con
5% de SFB (SST-5) (véase apéndice al final
del capítulo).
- ImCi/ml de Na 2'“^'CrO^ (Amersham, NEN).
- Cosechador de sobrenadantes semi-automá-
tico (optativo).
- Contador para radiación p o y.
NOTA: todos los reactivos y materiales que
estén en contacto con las células deberán estar
en condiciones de esterilidad y el operador de­
berá seguir los procedimientos empleados para
el cultivo de células.
755
Método
a. Marcación de las células blanco
1. Las células blanco deberán encontrarse en
fase log de crecimiento, debido a que las cé­
lulas en proliferación activa toman m ejor el
crom ato y co n sig u ien tem en te se m arcan
mejor.
2. Centrifugar la suspensión celular a 400 x g,
10 minutos de forma de obtener 1-2 x 10'’
células blanco en el sedimento. Descartar el
sobrenadante y elim inar cualquier exceso
del mismo drenando sobre una toallita de
papel.
3. Resuspender en 0,25 ml de cromato de so­
dio marcado. Incubar las células durante 45
minutos (no más de 60 minutos, para evitar
la liberación espontánea de marca) a 37°C
con agitación suave (4-6 rpm) y protegidas
con una pantalla de plomo. En el caso de te­
ner fragilidad celular adicionar SFB en una
concentración final entre 10-20%.
4. Lavar 3 veces las células con SST-5 calen­
tado a 37°C.
5. Resuspender las células marcadas radioacti­
vamente en medio RPMI-5 en una concentra­
ción adecuada para llevar a cabo el ensayo.
Por ejemplo, si se usan 2.500 células blanco
en un volumen de 50 |i,l, ajustar las células
en 50.000/ml, Mantener la suspensión en la
estufa para evitar la lisis espontánea. Si la
preparación de la reacción llevara más de 1
h, efectuar un lavado previo de las células
marcadas antes de su uso y ajustar la concen­
tración nuevamente. Determinar la incorpo­
ración de 5>Cr, contando una alícuota de la
suspensión celular en un contador [3 o y.
b. M edición de la actividad citotóxica.
Ensayo de liberación de ®'Cr
1. Lavar las células efectoras y ajustar la d en ­
sidad celular según la concentración final
que se agregará en las placas. Para una rela­
ción de células efectoras a células blanco de
50:1, se necesitarán 125.000 células efecto-
ras por cada 2.500 células blanco. Conside­
rando un volumen final de reacción de 100
|i.l por pocilio, se preparará una suspensión
de células efectoras de 2.5 x lO^ml. G ene­
ralm ente en un ensayo de eitotoxicidad se
establecen varias relaciones de células efec­
toras a células blanco, entre 50:1 y 1:1, para
determinar cuál es la más conveniente.
2. Sem brar en una placa de 96 pocilios con
fondo en “U”, 50 pl de las diferentes co n ­
centraciones de células efectoras y luego 50
pl de la suspensión de células blanco en ca­
da uno de los pocilios. Los controles de li­
756 Metodologías

beración espontánea de la marca se efectua­ Nota: la lisis espontánea no deberá superar.

rán colocando 50 |J,1 de las células blanco y el 20% de la liberación máxima.
50 |ji de medio, por pocilio. Efectuar cada En algunas ocasiones es conveniente expre­
determ inación por triplicado. E stab lecer sar los resultados como unidades líticas (UL),
controles de liberación máxima de radioac­ correspondientes a un determinado porcentaje
tivo sembrando 50 |il de las células blanco y de lisis, frecuentemente se utiliza el 30% o el
50 p,I de HCl IN o de una solución de Tri­ 50%. Para ello se grafica el porcentaje de lisis
tón X-100 al 5%. en función de la relación de células efectoras a
3. Centrifugar las placas a 500 x g por 1 minu­ células blanco, e interpolando en la curva por
to e incubarlas a 37“C durante 4 h en estufa el 50% de lisis se lee la relación correspondien­
gaseada con un 5% de CO^. (En algunas te de células efectoras a blanco y se establecen
ocasiones el período de incubación puede las unidades líticas en forma arbitraria, calcu­
extenderse hasta 24 h aunque el mecanismo lando 100/células efectoras interpoladas. Como
efector es, en la mayoría de los casos, más se muestra en el gráfico 36-9, para la población
eficiente durante las primeras 2-4 h.) B las UL50 son 4 (100/25).
4. Agregar 10'' iil de RPMI-5 frío en cada uno
de los pocilios. Centrifugar nuevamente las 4.3.2 P ru eb as para determinar citotoxicidad
placas a 500 x g durante 5 minutos a 4°C. de células natural killer (NK)
Recoger 100 ¡0,1 del sobrenadante, con mu­
cho cuidado, de manera de evitar resuspen­ Las células NK forman parte de la inmuni­
der el sedimento. Colocar los sobrenadantes dad natural y median reacciones de citotoxici­
en viales apropiados para poder ser leídos dad sin requerir de una .sensibilización previa,
en un contador y o [3, en este último caso de­ ni poseen especificidad antigénica ni restric­
berá agregarse líquido de centelleo (véase ción por moléculas del CMH, los cuales son
apéndice al final del capítulo). prerrequisitos de los linfocitos T citotóxicos.
5. Calcular el porcentaje de lisis específica de La actividad NK en los seres humanos se mide,
acuerdo a la siguiente fórmula: generalmente, en ensayos de liberación de -‘’'Cr
de 4 h utilizando como células blanco a las cé­
lisis es- e x p e rim e n ta le s - c p m e s p o n tá n e a s) lulas tumorales K562 humanas.
100 Cuando se quiere evaluar la actividad NK en
p e c ífic a (cpm m á x im a s - c p m e s p o n tá n e a s)
sistemas murinos, generalmente se utiliza una

F ig . 3 6 -9 . G rá fic o c o rre s p o n d ie n te a la c u rv a d e c ito to x ic id a d e s p e c ífic a d e d o s p o b la c io n e s c e lu la re s (A ) y (B ) e n f u n ­

c ió n d e la re la c ió n d e c é lu la s e fe c to ra s a c é lu la s b la n c o . E n el m is m o se m u e s tra la d e te rm in a c ió n d e las U L 5 0 p a ra c ad a
u n a d e la s p o b la c io n e s.
 Metodologías para la evaluación de las células Inmunocompetentes
suspensión celular de bazo. Como células blan­
co suelen emplearse las células de la línea Yac-
1, que provienen de un linfoma murino induci­
do por el virus Moloney (ATCC).
M ateriales
~ Células efectoras: células mononucleares de
sangre periférica humana separadas en gra­
dientes de Ficoll-Hypaque, preferentemente
frescas. Para evaluar la actividad de NK, es
conveniente usar las células el mismo día de
la obtención. Las células mononucleares se
pueden guardar en medio completo con SFB
(5-10%), por un período de tiempo no mayor
de 18 h a 4°C para evitar pérdidas de la acti­
vidad citotóxica de las células NK:
- Células blanco: obtenidas de una línea esta­
blecida a partir de células de un paciente con
una eritroleucemia crónica en crisis blástica
(K562), Esta línea celular es deficiente en la
expresión de antígenos del CMH de clase I y
clase U.
N OTA: todos los reactivos y materiales que
estén en contacto con las células deberán estar
en condiciones de esterilidad y el operador de­
berá seguir los procedimientos empleados pai'a
el cultivo de células.
Método
La marcación de las células blanco con ^'Cr,
se realiza como se describe para las células
blanco de hnfocitos T citotóxicos (véase ítem
1-5 de marcación de células blanco del punto
4.3.1). El ensayo de liberación de -‘''C r de 4 h,
es sim ilar al detallado anteriormente, para la
evaluación de linfocitos T citotóxicos.
R g . 3 6 -1 0 . E s q u e m a del m e c a n ism o d e la r e a c c ió n d e C C D A m e d ia d a p o r c é lu la s e fe c to ra s c ito tó x ic a s N K y a n tic u e r­
p o s e s p e c ífic o s p a ra d e te rm in a n te s a n tig é n ic o s p r e s e n te s s o b re la s c é lu la s b lan c o .
757
4.3.3. Reacción de citotoxicidad celular
dependiente de anticuerpo (CCDA)
La citotoxicidad celular dependiente de anti­
cuerpo (CCDA) es un mecanismo inmunológi­
co efector citotóxico que es dependiente de la
interacción cooperativa de elementos efectores
humorales y celulares. Depende de la presencia
de células efectoras que tienen receptores, ge­
neralmente para Fcy, y de anticuerpos capaces
de unirse específicamente a los epitopes antigé­
nicos expresados en la superficie de una célula
blanco. La interacción entre las células efecto-
ras y las células reconocidas por los anticuer­
pos resulta en citolisis (véase fig. 36-10). Este
ensayo evalúa la capacidad de las células efec­
toras inmunocompetentes o la actividad de un
anticuerpo específico para mediar CCDA.
Este tipo de reacción es mediada principal­
m ente por células NK que expresan receptor
para Fe. Otras células como los monocitos, gra­
nulocitos y cierta .subpoblación de linfocitos T,
son también efectoras en las reacciones de cito-
toxicidad celular dependiente de anticuerpo.
Clínicamente, el ensayo de CCDA es útil en
la evaluación funcional de células efectoras in­
munocom petentes, por ejemplo, en pacientes
con cáncer en tratamiento inmunológico.
O tra aplicación im portante de la C CD A es
en la evaluación de anticuerpos contra aloantí-
genos, células tumorales o virus. La CCD A se
utiliza para estudiar ios sueros de los pacientes
que recibirán un trasplante o que cursan un re­
chazo de injerto y en individuos que cursan una
infección viral.
A continuación se describe un método para
m edir actividad efectora de CCDA en células
mononucleares de sangre periférica empleando
células blanco marcadas con -“''Cr.
758 Metodologías
Si bien la liberación de ‘’'Cr es un procedi­
miento ampliamente utilizado para detectar ci­
totoxicidad, en los últimos años se han desarro­
llado métodos colorimétricos (véase apéndice
al final del capítulo), fluorimétricos y más re­
cientemente por quimioluminiscencia, tendien­
tes a reem plazar el m aterial radiactivo y au ­
mentar la sensibilidad.
Materiales
- Medio de cultivo RPMI suplementado con
SFB al 10%, RPMLIO con HEPES 25mM.
- Células efectoras, mononucleares de sangre
periférica suspendidas en RPMI-10. Podrían
utilizarse también otros tipos de células, sus­
pensión de nódulos linfáticos o de células de
bazo.
- Células blanco marcadas con ^'Cr, recubier­
tas o no con anticuerpo.
Las células blanco utilizadas en este tipo de
ensayos de CCD A deberían ten er las s i­
guientes características: facilidad para ser
cultivadas, alta actividad específica y bajos
niveles de liberación espontánea de la marca
incorporada. Entre las células más com ún­
mente usadas en los ensayos de CCDA, se
encuentran las células Chang, Rají (células
de linfoma de Burkitt) y P815 (células de un
mastocitoma murino).
- Tritón X-100 al 5% v/v.
- Placas de 96 orificios con fondo en “U” .
- Tubos de centrífuga de 15 mi.
- Antisuero de conejo específico contra las cé­
lulas blanco. La fuente de anticuerpos es un
factor para ser considerado, los anticuerpos
de conejo tienen buena actividad en los ensa­
yos de CCDA.
- Im C i/m l de N a/>CrO , (250-500 m C i/m g,
Amersham).
~ Cosechador de sobrenadantes semi-automá-
tico (optativo).
- Contador para radiación p o y.
NOTA: todos los reactivos y materiales que
estén en contacto con las células deberán estar
en condiciones de esterilidad y el operador de­
berá seguir los procedimientos empleados para
el cultivo de células.
Método
a. Sensibilización y marcación de las células
% lisis
blanco
1. Se utilizan entre 1-5 x 10® células por mar­ cpm experimentales: cpm del sobrenadante de
cación,
2. Lavar las células tres veces con RPMLIO. cpm máximas: cpm del sobrenadante de las cé­
Antes del último lavado separar las células lulas blanco m ás Tritón.
en dos alícuotas iguales. Centrifugar a 550 x , cpm espontáneas: cpm del sobrenadante de las
g, 10 minutos y descartar el sobrenadante.
3. A una de las alícuotas de células blanco
agregarle la dilución del antisuero de cone­
jo, calentado a 56°C durante 1 h. Agregar
200 |i.Ci de Na^'^'CrO^ a cada una de las alí­
cuotas. Incubar a 37°C durante 30 minutos.
4, Lavar las células tres veces y resuspender
en una concentración de I X 10-“’ cél/ml en
medio de cultivo RPMLIO.
b. Medición de la actividad de CCDA.
Ensayo de liberación de ®‘Cr
1. Preparar una suspensión de 1 x 10’ cél/ml
efectoras mononucleares. Hacer diluciones
seriadas (1:2, 1:4 y 1:8) a partir de la sus­
pensión original.
2. Sembrar por sextuplicado, 100 |il de cada
una de las diferentes concentraciones de cé­
lulas efectoras.
3. P ara cada d ilución de células efectoras,
agregar 100 |al de células blanco no recu­
biertas con el anticuerpo, en tres de los po­
cilios y colocar 100 |j,l de las células blanco
recubiertas con el anticuerpo, en los tres po­
cilios restantes.
4. Realizar controles de máxima liberación de
la marca, agregando a 100 )il de las células
blanco tratadas con el anticuerpo, 100 jil de
Tritón X-100 al 5%. Repetir el mismo pro­
cedimiento con las células blanco no trata­
das con el anticuerpo.
5. Realizar controles de liberación espontánea
de la marca, agregando a 100 pl de las célu­
las blanco tratadas con el anticuerpo, 100 pl
de R PM LIO . R epetir el m ism o p ro ce d i­
miento con las células blanco no tratadas
con el anticuerpo.
6. Cubrir las placas y centrifugar a 55 x g du­
rante 2 minutos a temperatura ainbiente. In­
cubar entre 4 h a 18 h en una estufa de culti­
vo en atmósfera de 5% de COj.
7. Centrifugar las microplacas a 550 x g a tem ­
peratura ambiente durante 5 minutos y cose­
char los sobrenadantes en viales, utíhzando
una pipeta multicanal o un cosechador se-
miautomático.
8. Determinar la radiactividad de los sobrena­
dantes usando un contador de radiación y o
p. Calcular el% de lisis según la siguiente
fórmula:
[cp m e x p e rim e n ta le s - c p m e s p o n tá n e a s]
= ------------------------------------------------------------- ^— X 100
[cp m m á x im a s - c p m e s p o n tá n e a s]
las células efectoras y las células blanco,
células blanco más medio de cultivo.
 Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes
El porcentaje de Jisis específica debe calcu­
larse para las células blanco recubiertas y para­
lelamente para las células no recubiertas por
anticuerpos. El porcentaje de CCDA se calcula
restando al porcentaje de lisis específica de las
células recubiertas con anticuerpos, el porcen­
taje de lisis encontrado para las células blanco
sin recubrir.
4.4. ESTUDIO D E LA FUNCIONALIDAD
DE LOS LINFOCITOS B Y T A TRAVÉS
DE LA PRODUCCIÓN DE SUSTANCIAS
BIOACTIVAS SECRETADAS POR ELLOS
4.4.1. Funcionalidad de linfocitos B
Una de las maneras de determinar la funcio­
nalidad de los linfocitos B es a través de la me­
dición de inmunoglobulinas secretadas en "res­
puesta a un antígeno determinado. Si bien éstas
metodologías son muy sencillas el resultado re­
fleja una serie de mecanismos celulares com ­
plejos que involucran no sólo a los linfocitos B
sino también su interrelación con varios tipos
celulares como las células accesorias y los lin­
focitos T colaboradores.
La síntesis de anticuerpos puede ser medida
como la sumatoria de las inmunoglobulinas se­
cretadas en respuesta a un antígeno y por lo
tanto, en este caso se mide la cantidad de inm u­
noglobulinas que se acumulan en un sobrena­
dante de cultivo de linfocitos o en el suero de
un individuo inmunizado. Alternativamente, si
se analiza la célula que está secretando el anti­
cuerpo, además de los anticuerpos producidos
se determina el número de linfocitos B en una
población que secreta la inmunoglobulina con
una determinada especir^idad y de un isotipo
particular. Para el primer objetivo, las metodo­
logías más empleadas son el enzimoinmunoen-
sayo (ELISA) y el radioinm unoensayo (RIA)
que fueron detallados en los capítulos 38 y 39.
Por otra parte, la identificación de los linfocitos
B estimulados in vitro específicamente u obte­
nidos a partir de animales inmunizados con un
antígeno determinado puede llevarse a cabo a
través de la técnica clásica áe form ación de
placas de hemólisis o por medio del ELISPOT.
Estas técnicas son útiles para determinar la ci­
nética de producción de inm unoglobulinas,
particularmente en aquellas situaciones asocia­
das con un cambio rápido del número de célu­
las secretoras de los anticuerpos.
4.4.1.1. Medida de la síntesis
de inmunoglobulinas polielonales
por medio de la técnica de formación
de placas de hemólisis
La técnica de formación de placas de hem o­
759
lisis se fundamenta en la lisis de los eritrocitos
al ser reconocidos por los anticuerpos específi­
cos, secretados por las células presentes en la
placa, en presencia de complemento. El antíge­
no puede ser una proteína del eritrocito o una
molécula covalentemente unida a la superficie
del glóbulo rojo que sirve de indicador de la
reacción. Los anticuerpos son sintetizados por
las células secretoras de inmunoglobulinas que
se están evaluando, las cuales son mezcladas
con la suspensión de eritrocitos en un medio
semi-sólido que las inmoviliza logrando favo­
recer el contacto entre los anticuerpos y los an­
tíg en o s presentes en los glóbulos ro jo s. El
complejo inmune específico al unir el com ple­
mento agregado, inducirá la hsis de los eritro­
citos que se manifestará como placas de hem ó­
lisis (área de lisis que bordea a las células se­
cretoras de anticuerpos). Cada placa de hem óli­
sis formada corresponderá a una célula secreto­
ra de anticuerpos. Esta técnica es sumamente
sensible y puede ser realizada en forma directa,
indirecta o reversa de acuerdo al objetivo de la
medición.
Técnica de formación de placas de hemólisis
directa (fig. 36-1 la): Esta técnica es útil para
detectar IgM específica, las demás inm unoglo­
bulinas fijadoras de complemento no pueden
ser determinadas debido a las condiciones en
las que se lleva a cabo el ensayo. Las células
secretan IgM específica que migra por difusión
en el medio semi-sólido y al reconocer al antí­
geno específico en la superficie del eritrocito,
se une a él. Este puede ser un antígeno eritroci-
tario o una proteína covalentemente u n id a al
glóbulo rojo, como fue indicado en el capítulo
35 para la hemaglutinación pasiva. Los com ­
plejos inmunes formados en la superficie de los
eritrocitos fijan complemento, el cual produce
la hsis de aquellos eritrocitos circundantes a los
linfocitos B, originando las placas de lisis.
Técnica de formación de placas de hemólisis
indirecta (fig. 36-1 Ib): Las células secretoras
sintetizan inmunoglobulinas específicas que al
difundir se unen a su antígeno presente sobre el
eritrocito. Como para la fijación de co m p le­
mento se requieren dos moléculas de IgG cer­
canas y en esta situación difícilmente se logra,
para poder detectar las IgG se agrega un anti­
cuerpo anti-IgG m onoespecífico y lu e g o el
complemento. La hemólisis de los eritrocitos
indicará la liberación de IgG y de IgM p o r par­
te de los diferentes linfocitos B.
Asimismo esta metodología resulta de utili­
dad para poder detectar linfocitos B secretores
de inmunoglobulinas con especificidad para un
determinado antígeno, no fijadoras de com ple­
mento.
Técnica de formación de placas de hemólisis
reversa (fig. 36-1 le): Esta variante metodoló-
760 Metodologías

*"% C om plem ento

. .

\
H E M O LIS IS

IgM específica

F ig . 3 6 - l l a . E s q u e m a d e l fu n d a m e n to d e la té c n ic a d e fo rm a c ió n d e p la c a s d e h e m o lisis d ire c ta .

gica es utilizada para detectar la producción de los complejos así formados unen complemento
inmunoglobulinas totales y no anticuerpos es­ y ocasionan la lisis de los eritrocitos.
pecíficos, como ocurre en las técnicas explica­ A continuación se detalla la técnica de fo r ­
das precedentemente. En este caso los eritroci­ mación de placas de hemólisis directa.
tos pueden ser sensibilizados con Proteína A,
que tiene la propiedad de fijar la región Fe de Materiales
las inmunoglobulinas, o con anticuerpos anti-
inmunoglobulinas. Aunque la mejor sensibili­ ~ Placas de Petri de 10 cm de diámetro descar­
zación de los glóbulos rojos se logra tratando tables.
en un primer paso a los eritrocitos con Proteína - Agar purificado (agar noble) o agarosa.
A y luego con IgG con actividad anti inmuno- “ Solución salina fosfatada de Dulbecco (véa­
globulina de la especie que se quiere determi­ se el apéndice al final del capítulo).
nar. Las anticuerpos liberados por los linfocitos - Solución de Gey (véase el apéndice al final
B se unen a los glóbulos rojos sensibilizados y del capítulo).

anti-lgG

i H EM O LISIS

IgG específica

C om plem ento

F ig . 3 6 - l l b . E squem a del fundam ento de la técnica de form ación de placas de hem ólisis indirecta.
 Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes
anti-Ig
Inm unoglobulinas
F ig . 3 6 - l l c . E s q u e m a d e l fu n d a m e n to d e la té c n ic a d e fo rm a c ió n d e p la c a s d e h e m o lisis rev e rsa .
- Eritrocitos de carnero (sensibilizados con an­
tígenos específicos o sin sensibilizar) al 20%
en solución de Gey.
- Células mononucleares, esplenocitos o linfo­
citos purificados.
Suero de cobayo, fresco o liofilizado. Es
conveniente adsorberlo con 1 mi de sed i­
mento de eritrocitos de carnero durante 20
minutos en bario de hielo, para eliminar anti­
cuerpos contaminantes.
- Tubos de plástico de 15 y 50 mi.
-- Tubos de ensayo.
NOTA: todos los reactivos y materiales que
estén en contacto con las células deberán estar
en condiciones de esterilidad y el operador de­
berá seguir los procedimientos empleados para
el cultivo de células.
Método
1. Verter sobre la placa de Petri 5 mi de una
solución de agar o agarosa estéril, al 1,2%
en solución salina fosfatada de D ulbecco,
fundida y enfriada a 50°C. A gitar suave­
mente en forma rotativa, sobre una superfi­
cie nivelada y dejar sohdificar. (Estas placas
así preparadas pueden guardarse a 4°C, du­
rante varios días).
2. Preparar con anterioridad, agar o agarosa al
0,6% en solución de Gey. Repartir en alí­
cuotas de 2 mi en tubos de ensayo y esterili­
zar en autoclave. Fundir en baño de agua
hirviente 1 tubo por cada placa y mantener a
40-42“C (agar) o a 46-48‘>C (agarosa). R eti­
rar y añadir 0,1 mi de la suspensión de eri­
trocitos e inmediatamente 0,1 mi de la dilu­
ción (2 X 10® células/m l) de las células a
analizar. Agitar y verter rápidamente en la
761
C om plem ento
H E M O LIS IS
placa de Petri que ya tiene la capa inferior.
Homogeneizar por rotación y dejar solidifi­
car.
3. Incubar a 37“C durante 90-120 m inutos y
agregar, uniformemente sobre toda la super­
ficie, 1 mi de complemento de cobayo dilui­
do 1:10 en solución de Gey. Incubar durante
60 minutos.
4. C ontar las placas de hem olisis form adas,
con lupa estereoscópica o microscopio y re­
ferirlas al número de células sembradas. (Si
las placas no pueden ser leídas de inmediato
fijar los eritrocitos con una solución de glu­
taraldehído al 0,25%.)
Las células que sintetizan anticuerpos del
isotipo IgG frecuentem ente no dan placas de
hemólisis. Ello es debido a que el niímero de
moléculas elaboradas no es suficiente para sen­
sibilizar adecuadamente a los eritrocitos, cosa
c]ue sí ocurre con la IgM, como consecuencia
de su estructura m olecular. Para determ inar
otras inmunoglobulinas, excepto la IgM, se de­
sarrolló el método indirecto de formación de
placas de hemóhsis. Esta técnica, se realiza de
manera similar al ensayo directo, con la varian­
te de que antes de añadir los glóbulos rojos al
agar o a la agarosa fundida, se agrega una dilu­
ción del suero anti-gammaglobulina monoespe-
cífico. Este ensayo mide las células formadoras
de placa totales (CFPtotales): las células for­
madoras de placas para la inmunoglobulina en
estudio (CFPespecíficas) y las directas (Ig M,
CFPdirectas). Simultáneamente debe realizarse
un ensayo directo para determinar las C FPdi­
rectas. La diferencia entre ambos valores deter­
mina el número de CFPespecíficas del ensayo.
CFPespecíficas = CFPtotales - CFPdirectas
762 Metodologías
4.4.I.2. Medida de la síntesis
de inmunoglobulinas por medio de la técnica
de plaqueo inm unoenzim ático o E L IS P O T
La técnica del plaqueo inmunoenzimático o
ELISPOT, utilizada para la detección de las cé­
lulas productoras de anticuerpos de una deter­
minada especificidad, es un ensayo desarrolla­
do en los años ’80 que ofrece una alternativa
más sencilla y versátil a la detección de linfoci­
tos B secretores de anticuerpos, por medio de
la formación de placas de hemólisis. A su vez
permite el análisis de poblaciones celulares que
sintetizan anticuerpos dirigidos hacia dos antí­
genos diferentes. Asim ism o, resulta de gran
utilidad para la determinación de células secre­
toras de anticuerpos en tejidos como el intesti­
nal o el pulmonar en donde el aislamiento de
linfocitos es de gran dificultad.
El ELISPOT se lleva a cabo en tres pasos, la
sensibilización de la fase sólida (generalmente
nitrocelulosa o placas de poliestireno) con el
antígeno, la incubación de las placas con las
células secretoras de anticuerpo y la detección
del complejo antígeno-anticuerpo formado en
la zona de secreción de anticuerpos, por medio
de una técnica inmunoenzimática (fig. 36-12).
Materiales
“ Solución de antígeno en SST.
- Células secretoras de anticuerpos presentes
en la capa de células mononucleares aisladas
de sangre periférica o en esplenocitos.
- Anti-gammaglobulina de la especie en estu­
dio conjugada con peroxidasa (0,5 - 5 fig/ml
en SST/Tween).
- SST adicionada con 5% de SFB (SST-5) o
BSA al 1% en SST.
- M edio IMDM adicionado con 5% de SFB
(IMDM -5) o RPM I-10. (Véase apéndice al
final del capítulo.)
- SST adicionada con 0,005% de Tween 20
(SST/Tween).
^ Sustrato para la enzima utilizada preparado
en una solución de agarosa. Disolver 50 mg
de 1,4-p-fenilendiamina (PPD, Sigma) en 2
mi de metanol. Momentos antes de ser utili­
zado agregar 50 ¡il de H,02 al 30% y 100 mi
de agarosa al 1% en SST calentada a 46“C.
Este sustrato produce manchas de color ma­
rrón.
Placas de poliestireno de 96 pocilios (alter­
nativamente se pueden utilizar placas de 6, 24,
48 o 96 pocilios y Placas de Petri).
NOTA: todos los reactivos y materiales que
estén en contacto con las células deberán estar
en condiciones de esterilidad y el operador de­
berá seguir los procedimientos empleados para
el cultivo de células.
Método
1. Sensibilizar las placas de poliestireno con
una dilución del antígeno en SST. (La dilu­
ción óptima del antígeno deberá ser deter­
m inada de antemano utilizando diferentes
concentraciones de antígeno y esplenocitos
sensibiUzados. Generalmente se utiliza una
concentración antigénica entre 10 y 200
|i,g/ml.) Incubar 18 h a 4°C o 2 h a 37°C. Las
placas se pueden guardar a 4°C por varias
semanas.
2. Descartar el sobrenadante. Lavar tres veces
con SST y drenar el exceso de líquido sobre
una toallita de papel. Bloquear la placa con
SST-5 incubando 30 minutos a 37°C.
3. Descartar el sobrenadante drenando la placa
sobre una toallita de papel y agregar 200 )J,1/
pocilio de las diferentes concentraciones de
la suspensión celular en IMDM-5 (entre 10'*
y lO'’ células/ml). Incubar durante 3, 4 o 18
h a 37“C en estufa gaseada con 5% de CO^.
4. Recuperar las células para posteriores ensa­
yos o descartarlas y lavar las placas con
SST/Tween.
5. Adicionar 100 |il del anticuerpo conjugado.
Incubar 2 h a temperatura ambiente o 18 h a
4°C (en cámara húmeda).
6. Lavar las placas tres veces con SST/Tween
y el último lavado con SST.
7. Descartar el sobrenadante y drenar cuidado­
samente cualquier exceso de solución de la­
vado.
8. Agregar 50 (xl de la solución de sustrato por
pocilio. Mantener las placas en una superfi­
cie horizontal nivelada y controlar el desa­
rrollo de las manchas de color que aparece­
rán dentro de los 5 a 10 minutos,
9. Las células productoras de anticuerpos se
identifican por la aparición de m anchas de
color marrón. Contar las manchas formadas
en un microscopio con un aumento de 10 o
30X.
La inm unización parenteral con antígenos
proteicos induce por lo general, entre 50 y 500
manchas/ lO*’ células totales después del 6° día
de la primera inoculación del antígeno. Cada
m ancha representa una única célula secretora
de anticuerpo,
4.4.2. Funcionalidad de linfocitos T.
Detección de la producción de citoquinas
por E L IS A o por ensayos biológicos
La identificación de las citoquinas y de los
productos solubles de la activación inmune, es
una de las maneras de evaluar la frmeipnalidad
de las células inmunocompetentes. Estos m ar­
cadores presentes en el suero reflejan la activi­
 Metodologías para la evaluación de las células Inmunocompetentes
dad de todas las células inmunes del cuerpo. Es
por este motivo que la medición de estas sus­
tancias provee información acerca del estado
inmune de un individuo.
El factor inhibitorio de la migración de los
m onocitos-fagocitos (MIE) es producido por
linfocitos T activados y fue una de las primeras
citoquinas identificadas in vitro por su capaci­
dad de inhibir la movilidad de los macrófagos.
Si bien esta metodología ha sido muy utilizada
anteriormente, la identificación bioquímica y el
significado biológico del MIE no han sido aún
aclarados, y en la actualidad ha sido reem pla­
zada por ensayos para la detección de linfoqui­
nas, tales como IL-2 o interferón y.
Entre los productos de activación que actual­
mente se pueden determinar mencionaremos: P
2-microglobulina, receptor soluble de IL-2 (an­
tígeno Tac), moléculas solubles de CD4 y CD8
así como anticuerpos. Estas proteínas son los
productos finales de una serie de procesos celu­
lares y, por lo tanto, los niveles incrementados
en el suero indican un aumento en su produc­
ción y la activación de estos sistemas celulares.
Diversos marcadores están elevados en cier­
tas enfermedades, infecciones por microbios,
rechazo de injertos, desórdenes autoinmunes o
en enfermedades malignas de células linfoides
y su determinación es una medida de la activi­
dad de la enfermedad pero no es un marcador
específico de diagnóstico.
Las metodologías que pueden ser utilizadas
para la medición de las citoquinas, principales
mediadores celulares involucrados en la re s­
puesta inmune, incluyen el enzimoinmunoensa-
yo (ELISA), el ELISPOT y bioensayos. El enzi-
moinmunoensayo tiene miíltiples ventajas, alto
grado de especificidad, fácil ejecución y no re­
quiere del cultivo de tejidos o de radiactividad.
Dentro de las desventajas del método se desta­
can, la menor sensibilidad en comparación con
los ensayos biológicos y el hecho de que se
pueden detectar proteínas con reactividad in­
munológica pero que no tengan actividad bio­
lógica. Por el contrario los bioensayos se ca­
racterizan por ser más sensibles que el ELISA y
por detectar proteínas biológicamente activas.
El principal problema en este tipo de ensayos
es que se puede valorar la actividad de más de
una citoquina. Cuando dos o más citoquinas es­
tán presentes pueden producir interacciones si-
nérgicas o antagónicas que llevan a posibles re­
sultados falsos. Este inconveniente puede ser
subsanado empleando anticuerpos monoclona­
les específicos para neutralizar la actividad de
las citoquinas contam inantes. C onsiderando
que los bioensayos detectan las citoquinas fun­
cionalm ente m ientras que los enzim oinm u-
noensayos en form a estructural, en la actuali­
dad se aconseja el uso de ambos tipos de m eto­
763
dologías para la detección de una determinada
citoquina.
A continuación se describirán metodologías
para la determinación de IL-2 e interferón.
4.4.2.I. Medición de IL-2
El método tradicional para la detección de
IL-2 en muestras de suero o de sobrenadantes
de cultivo de linfocitos humanos, es un bioen-
sayo que utihza las células CTLL-2. Esta línea
celular murina derivada de células de bazo esti­
muladas por células alogeneicas se propaga in
vitro dependiendo de la IL-2 (Gillis & Smith,
1977). Este ensayo consiste básicamente en de­
terminar la proliferación in vitro de las células
CTLL-2 en presencia de las muestras a exam i­
nar o de diferentes concentraciones de IL-2 hu­
m ana usada como estándar. Posteriormente, se
calculan las unidades de interleuquina corres­
pondientes a la muestra por comparación con
los estándares. Este método es laborioso y está
sujeto a los posibles efectos de otros inmuno-
moduladores presentes en la muestra (por ej.,
otras citoquinas, prostaglandinas E, etc).
Detección de IL-2 usando
las células CTLL-2
La metodología utilizada en este caso se ba­
sa en las técnicas de proliferación descritas an­
teriormente.
NOTA; todos los reactivos y materiales que
estén en contacto con las células deberán estar
en condiciones de esterilidad y el operador de­
berá seguir los procedimientos empleados para
el cultivo de células.
M étodo
1. Colocar 100 |J.I de cada dilución de IL-2 (es­
tándares) o de las muestras, por cuadrupli­
cado, en una placa de cultivo de 96 orificios
de fondo en “U”. Incluir un control negativo
con RPM I-10.
En el caso de las muestras provenientes de
los sobrenadantes de cultivo, realizar dilu­
ciones desde 1:1, 1:2 y 1:4 hasta que dism i­
nuya la máxima actividad proliferativa. Si
se utilizan sueros humanos, éstos deben ser
diluidos ya que los sueros normales contie­
nen inhibidores que pueden afectar a este ti­
po de ensayo.
2. U tilizar las células CTLL-2 después de 2
días del último agregado de medio de culti­
vo. Lavar 3 veces las células con SST. Cen­
trifugarlas 10 minutos a 335 x g a 4°C y re-
suspender el sedimento en 1 ml de SST lle­
vando luego a 50 ml de SST; repetir este
procedimiento 3 veces.
764 Metodologías
Placas se nsibilizadas
con Ag específico
A
Incubación
•
F ig . 3 6 -1 2 . E s q u e m a d e lo s p a s o s d e la té c n ic a d e ELÍSPO T.
3. Contar las células y ajustar la concentración
a 5 X 10“*cél/ml en R PM I-10 completo.
4. Sembrar 100 ¡il de las células en cada poci­
lio de la microplaca. Incubar las placas du­
rante 28 h a 37°C en estufa de cultivo gasea­
da con 5% de CO^.
5. En las últimas 8 h, agregar 1 (iCi de [^H]-
TdR en cada orificio. Luego de la incuba­
ción, cosechar las células y posteriormente,
proceder a la medición de la radiactividad
incorporada, siguiendo las metodologías de­
talladas en el apéndice.
6. Para el cálculo de la concentración de la
lL-2 presente en las muestras se pueden rea­
lizar diferentes procesamientos de los datos.
En los diferentes tipos de gráficos se corre­
laciona la síntesis del ADN con la concen­
tración de los estándares.
C élulas secretoras
y no secretoras
de Ac específico
Anti-Ig conjugada
con peroxidasa
Lavado
Sustrato específico
Determinación de IL-2 por E L ISA
La determ inación específica de citoquinas
por ELISA, en este caso de la IL-2, se funda­
menta en un ensayo de doble anticuerpo, tipo
sandwich. Es un enzimoinmunoensayo en fase
sólida donde se utiliza un anticuerpo monoclo­
nal específico and IL-2 para capturar esta inter­
leuquina presente en la muestra o en el están­
dar. Después de lavar el material no unido, se
agrega un anticuerpo policlonal que se une a la
IL-2 capturada. Luego de los lavados, se agre­
ga un anticuerpo, conjugado a una enzima, con
especificidad para reconocer al segundo anti­
cuerpo. En el caso de la detección de IL-2 en
muestras de origen humano, los niveles encon­
trados son muy bajos. Por este motívo, es con­
veniente desarrollar metodologías para aumen­
 Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes
tar considerablemente la sensibilidad de la de­
terminación, por ejemplo, utilizai' el sistema de
biotina-estreptoavidina.
4A.2.2. M edición de Interferón y
La producción in vitro de IFN y por células
mononucleares de sangre periférica en respues­
ta a una estimulación por antígenos o mitóge­
nos, es un método muy efectivo para evaluar la
funcionalidad de los linfocitos T. Un defecto
en la síntesis in vitro del interferón o de otras
citoquinas está asociado con diversas enferme­
dades del sistema inmune, autoinmunidad, in­
munodeficiencias, malignidades linfoides e in­
fecciones con ciertos virus.
Los linfocitos T son las células responsables
de la síntesis del interferón y (IFN y) en res­
puesta a estímulos específicos, como los antí­
genos, o inespecíficos, como los m itógenos,
anticuerpos anti-linfocitos o IL-2. A pesar que
los interferones a, |3 y y poseen todos la capaci­
dad de inhibir la replicación viral, son antigéni­
camente diferentes. Debido a esta característi­
ca, se pueden utilizar anticuerpos para la iden­
tificación de estas proteínas por inhibición de
la actividad antiviral o por ensayos inmunoló­
gicos como el ELISA o el RIA. Los interferones
se pueden medir en el suero de pacientes infec­
tados con el virus de la inmunodeficiencia ad­
quirida o con desórdenes autoinmunes.
Los ensayos biológicos para evaluar la pro­
ducción de los interferones miden el grado con
que éstos inhiben el crecimiento viral: inhibi­
ción de la producción del virus, inhibición del
efecto citopático inducido por el virus, inhibi­
ción de la formación de placas virales, inhibi­
ción de la formación de antígenos virales o in­
hibición de la producción de ácidos nucleicos
virales. Básicam ente estos ensayos requieren
de la incubación de las células con el interfe­
rón, remoción del interferón, infección de las
células con el virus y medición de la reducción
del crecimiento viral dentro de las células in­
fectadas, m ediada por el IFN (Hooks & De-
trick, 1992).
Los inmunoensayos tienen la ventaja de ser
específicos, realizarse más rápidamente y son
de utilidad para el monitoreo simultáneo de nu­
merosas muestras. De todas maneras no pueden
reem plazar com pletam ente a los bioensayos
que detectan moléculas biológicamente activas.
El enzimoinmunoensayo específico, para la
cuantificación de IFN y es similar al descrito
para la IL-2. El IFN es capturado del fluido
biológico por un anticuerpo monoclonal espe­
cífico pegado a una fase sólida y luego es de­
tectado usando un suero policlonal anti-IFN y.
El agregado de un anticuerpo policlonal anti-
inmunoglobulina conjugado a una enzima, am­
765
plifica la señal de detección. La cuantificación
se realiza por medición espectrofotométrica de
la conversión del sustrato en un producto cro-
mogénico.
5. PRUEBAS FU N C IO N A LES PARA
EVALUAR LA INM UNIDAD MEDIADA
POR CÉLULAS IN VIVO
La hipersensibilidad retardada (HR) es una
respuesta inmune mediada por células, que se
manifiesta como una reacción inflamatoria, en
la cual el último efector es el macrófago. Este
tipo de inmunidad mediada por células, princi­
palmente por linfocitos T y macrófagos, es par­
te de los mecanismos de defensa contra bacte­
rias intracitoplasmáticas que no pueden ser eli­
minadas por los macrófagos no activados. Para
poder eliminarlas se necesita aumentar la fun­
ción microbicida de los macrófagos y esto se
logra por las citoquinas producidas por los lin­
focitos T activados.
Las proteínas antigénicas o haptenos quími­
cam ente reactivos, pueden d esen cad en ar el
mismo tipo de reacción de hipersensibilidad re­
tardada que los microbios, pudiendo causar in­
juria tisular. En este caso, cuando el antígeno
no es un patógeno, la reacción de hipersensibi­
lidad retardada producirá injuria sin causar una
función protectora.
S .L P R U E B A S C U TÁ N E A S D E
H IP E R SE N SIB IL ID A D R ETA R D A D A
A pesar de que se han desarrollado num ero­
sos ensayos in vitro para medir la actividad de
los linfocitos T, éstos no evalúan n ecesaria­
mente las mismas células que median hipersen­
sibilidad retardada ni consideran las influencias
de los eventos regulatorios ciue influencian la
función in vivo de los linfocitos T. Por lo tanto,
las respuestas cutáneas de hipersensibilidad re­
tardada representan una importante fuente de
información relacionada con la actividad de los
linfocitos T in vivo. En la clínica, las pruebas
cutáneas son de valor en la evaluación total de
la inmunocompetencia.
Estas reacciones se dividen en dos fases, la
de sensibilización con un antígeno específico y
la del desafío de la respuesta de hipersensibili­
dad retardada, que se desarrolla generalmente
entre 6 a 14 días después de la sensibilización.
Esta prueba se realiza fácilmente en seres hu­
manos y cobayos, mientras que en ratones es
más difícil de inducir este tipo de respuesta. La
reacción de hipersensibilidad retardada ocurre
en el sitio de inoculación del antígeno que ge­
neralmente es la piel, de allí que a este tipo de
ensayo se lo conoce como prueba de hipersen-
766 Metodologías
sibilidad retardada cutánea (HRC). Histológi­
camente se caracteriza por una induración pro­
ducida por células mononucleares y un número
limitado de polimorfonucleares.
La inyección intradérm ica de un antígeno
puede inducir una o más de los tres tipos de
reacciones cutáneas en humanos, que se descri­
ben a continuación.
a) una roncha y reacción eruptiva con un pi­
co de aparición entre 15-20 minutos después
de la inyección del antígeno, relacionado con
la presencia en la piel de IgE específica para
ese antígeno. Esta reacción se conoce como
alergia.
b) una reacción vascular local llam ada de
Arthus con un pico entre 12-24 horas y es el re­
sultado de la interacción del antígeno y del an­
ticuerpo fijador de complemento en el sitio de
la inyección.
c) una reacción de hipersensibihdad retarda­
da, dependiente de hnfocitos T y macrófagos,
caracterizada por eritema e induración en el si­
tio de la inyección, con un pico de intensidad
entre las 24 y 48 h.
Ciertos antígenos son llamados ubicuos ya
que la mayoría de los individuos están sensibi­
lizados con ellos. Entre los más comúnmente
utilizados en las pruebas cutáneas, mencionare­
mos: Candida albicans, Trichophyton, proteína
purificada derivada de tuberculina (PPD), to­
xoide tetánico, Coccidioidin. Cuando se utili­
zan en una prueba cutánea, uno o más de estos
antígenos comunes, la reacción de hipersensi­
bilidad se debe a un fenómeno de memoria in­
munológica. Si una persona no responde a nin­
gún antígeno común intradérm ico dando una
reacción de hipersensibilidad retardada, mani­
fiesta un estado de anergia.
La hipersensibilidad por contacto es otra ma­
nifestación de hipersensibilidad retardada cutá­
nea y se puede evocar por una exposición epi­
dérmica prolongada a un antígeno, que podría
ser una macromolécula exógena o un hapteno
conjugado a proteínas de la piel (por ejemplo:
Dinitro cloro benceno). La sensibilización por
co n tacto y p o sterio r d esafío con el m ism o
neoantígeno permite evaluar la respuesta inmu­
ne primaria y de memoria.
Respuestas dérmicas positivas generalmente
se correlacionan con los resultados de pruebas
in vitro incluyendo respuestas proliferativas de
linfocitos y medición de la producción de cito-
quinas.
Las pruebas de hipersensibilidad retardada
cutánea son útiles en la evaluación de pacientes
con síndromes de inm unodeficiencias prim a­
rias o adquiridas. Este tipo de pruebas han sido
usadas para evaluar los resultados de inmuno-
terapias en enfermedades malignas, para moni-
torear el curso de ciertas enfermedades o en el
diagnóstico de enfermedades infecciosas.
Rutinariamente existen dos métodos disponi­
bles como pruebas de hipersensibilidad retarda­
da cutánea. El método clásico se relaciona con
la inyección intradérmica de un antígeno (reac­
ción típica de tuberculina) y la sensibilización
por contacto, que se diferencian entre sí por la
manera en que se origina la respuesta. En la
sensibilidad por contacto, las etapas de sensibi­
lización y del desafío involucran aplicaciones
de un hapteno químicamente reactivo que m o­
difica moléculas autólogas en la piel resultando
en un reclutamiento y activación de los linfoci­
tos T específicos en el sitio involucrado.
5.1.1. Prueba cutánea de hipersensibilidad
retardada para un único antígeno (Prueba
de tuberculina)
Materiales
- Aguja de tamaño 27-6 (hipodérmica).
- Jeringa de tuberculina.
- Proteína purificada derivada de tuberculina
(PPD), 0,1 mi (5 U de tuberculina) o de otro
antígeno microbiano que se quiera estudiar.
Método
1. Inyectar intradérmicamente en el antebrazo
una aguja biselada (27-6) unida a una jerin­
ga de tuberculina que contenga 0,1 mi de
PPD. Usar la punta de la aguja para elevar
la piel y manternerla plana mientras la aguja
va entrando. Evitar una inyección subcutá­
nea.
2. Sim ultáneam ente a la aplicación de la in­
yección, se desarrollará una ampolla de 6 a
10 mm.
3. Luego de 24 o 48 h, u opcionalmente 72 h,
medir el diámetro mayor de la induración y
el eritema.
Los grados de la reacción se establecen de la
siguiente forma:
G RAD O D E
O BSER VAC IÓ N P O SITIVID AD
E r ite m a > d e 10 m m e in d u ra c ió n d e ] -5 m m +
In d u ra c ió n > 10 m m ++
In d u ra c ió n 11 -2 0 m m
In d u ra c ió n > 2 0 m m ++++
L a p re se n c ia d e sólo un erite m a n o indica re acc ió n po.siliva.
El mismo procedim iento se realiza con un
mayor número de antígenos (6 por lo menos)
para determinar posibles defectos en la inmuni­
dad celular.
 Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes
5.1.2. Prueba cutánea múltiple
de hipersensibilidad retardada
Los ensayos de hipersensibilidad retardada
cutánea que utilizan un panel de antígenos co­
munes se realizan cuando se quiere evaluar a
pacientes en quienes se sospechan defectos en
la inmunidad, por ejemplo: en individuos con
infecciones severas y recurrentes o infecciones
con microorganismos no comunes y en pacien­
tes que padecen enfermedades malignas como
parámetro de valor pronóstico.
El test múltiple es una técnica estandarizada
en la que se usa un aplicador plástico con pin­
zas que liberan simaltáneamente 7 antígenos y
un control, cuando se presiona sobre la piel.
Esta prueba denom inada m ultitest evalúa la
reactividad frente a los siguientes antígenos:
Candida albicans, Trichophyton rnentagrophy-
tes, Proteus mirabilis, Tuberculina Vieja (mez­
cla de proteínas, polisacáridos, lípidos y ácidos
nucleicos, parcial o totalm ente desnaturaliza­
dos provenientes de un cultivo de Mycobacte-
rium tuberculosis envejecido), Estreptococus
del grupo C, Toxoide diftérico, Toxoide tetáni­
co y glicerina como control.
Este tipo de ensayo fue estandarizado para
realizarse en la piel del antebrazo en adultos o
en la espalda para niños.
5.1.3. Prueba de hipersensibilidad
por contacto
La hipersensibilidad por contacto es un ensa­
yo in vivo que evalúa la inmunidad m ediada
por células. En esta prueba, se exponen las cé­
lulas de la epidermis a un hapteno exógeno y se
desencadena una reacción de hipersensibilidad
retardada que puede ser medida y cuantificada.
Las células de Langerhans que son las células
presentadoras del antígeno inician la sensibili­
zación presentándole el hapteno a los linfocitos
T CD4, los cuales secretan linfoquinas y reclu­
tan otras células en el sitio de la reacción.
5.I.3.I. Prueba del Dinitro Cloro
Benceno (DNCB)
El D NC B es uno de Jos agentes quím icos
utilizados en las reacciones de hipersensibili­
dad por contacto, es altamente sensibilizante y
puede causar reacciones necróticas severas. Es
por este motivo que se lo utiliza en pacientes
donde se sospecha anergia, y sólo cuando las
pruebas cutáneas con los antígenos com unes
dieron negativas.
Materiales
~ DNCB (agente sensib ilizan te) diluido en
767
acetona en concentraciones de 2.000 y 50
fXg/0,1 ml para las dosis sensibilizante y con­
trol, respectivam ente. E stas soluciones se
guardan en botellas oscuras y se deben usar
dentro de las dos primeras semanas.
M étodo
1. Luego de limpiar la piel con acetona, aplicar
0,1 ml de cada dosis en sitios separados en
la parte superior del brazo, utilizando un
anillo de 2 cm de diámetro. Dejar evaporar
con ayuda de un secador de cabello. C ubrir
los sitios con vendas y dejar por 24 h.
2. Transcurrida una semana, observar la p re­
sencia de un eritema en el sitio de la reac­
ción. Un resultado positivo indica el desa­
rrollo de una reacción de hipersensibilidad
retardada.
3. De no observarse un eritema aplicar la dosis
de desafío antigénico o desencadenarite. En
el día 14 posterior a la aplicación de la dosis
inicial aplicar 50 jig/ml de la solución de
DNCB y leer la reacción a las 24 y 48 h.
Los grados de la reacción se establecen de la
siguiente forma:
G RAD O D E
O B SE R V A C IÓ N P O SIT IV ID A D
E r ite m a y /o in d u ra e ió n e n un á re a m e n o r
a la m ita d del sitio d e p ru e b a +
M a y o r in d u ra c ió n ++
J-++
V e s ic u la c ió n
U lc e ra c ió n ++++
En el caso supuesto de encontrarse en la p ri­
mera etapa de la reacción, sólo un eritema en el
sitio sensibilizante, la reacción es de g rado
mientras que un eritema en ambos sitios,
control y sensibilizante, es grado +-1-+-1-.
5.I.3.2. Reacciones de dermatitis
por contacto
Los médicos alergistas y dermatólogos em ­
plean comúnmente la Prueba del parche para
detectar reacciones de hipersensibilidad retar­
dada causadas por sustancias que se piensa que
son las responsables de las reacciones de der­
matitis por contacto.
Método
1. Aplicar el alergeno en la piel, en una con­
centración no irritante y cubrir el área con
un apósito.
2. Pasadas las 48 h, quitar el apósito y obser­
var .la presencia de reacción inflamatoria en
el sitio de aplicación del antígeno.
768 Metodologías
5.1.4. Interpretación de las pruebas
de hipersensibilidad retardada cutánea
La estandarización de los antígenos que se
utilizan en los reactivos comerciales disponi­
bles, para pruebas de hipersensibilidad retarda­
da cutánea, es insuficiente o no existe y, en-
toQces, la comparación entre estudios es difi­
cultosa.
Los materiales utilizados se preparan por di­
lución a partir del m aterial stock com ercial.
Con el propósito de realizar una buena inter­
pretación de los resultados, las diluciones de
cada nuevo lote deberían ser probadas por su
reactividad y potencia en voluntarios normales.
Es im portante establecer la concentración
adecuada de antígeno a ser utilizada en estos
ensayos. Cuando se utilizan concentraciones
demasiado altas de la sustancia a probar, pue­
den ocurrir reacciones falsas positivas. Las
reacciones falsas negativas pueden deberse a
concentraciones demasiado bajas.
Las diluciones de los antígenos se deben pre­
parar en el momento ya que podrían perder ac­
tividad por adsorción de proteínas a la superfi­
cie del frasco de vidrio o por aceleración de la
descomposición de las proteínas en las solucio­
nes diluidas.
En los individuos que están muy sensibiliza­
dos pueden ocurrir reacciones locales severas.
En ciertas personas las pruebas de hipersensibi­
lidad retardada cutánea pueden causar necrosis
dérmica y el tratamiento indicado en estos ca­
sos sería dar corticoides orales o parenterales
según la severidad del caso.
Los recién nacidos menores de 6 semanas de
vida, rara vez dan respuestas de hipersensibili­
dad retardada, y luego la respuesta depende de
la exposición antigénica. P or ejem plo, una
reacción de hipersensibilidad retardada cutánea
positiva para los toxoides diftérico y tetánico,
generalmente se desarrolla dentro del primer
mes posterior a la prim era inm unización con
esos antígenos.
APENDICE
1. Determinación del número
y de la viabilidad celular
1. Hacer una dilución adecuada de las células
en SST (dependerá de la densidad original
de cada tipo celular).
2. Colocar una gota de la suspensión celular en
una cámara de Neubauer y contar el número
de células por observación en un microsco­
pio óptico. Contar cada uno de los cuatro
cuadrantes de la cámara, sumarlos y sacar el
número promedio de células.
3. Calcular número de células de la siguiente
manera:
N ú m e ro p ro m e d io C é lu la s to ta le s
d e c é lu la s e n los c u a tro c u a d ra n te
0,1 m ra^ (v o l. d e
c a d a c u a d ra n te )
[N ú m e ro p ro m e d io
N ú m e ro to ta l d e d e cé lu la s]
c é lu la s p o r m i = X d ilu c ió n X 10^
(cél/cm ^) 0,1 m m '
4. Para ajustar una suspensión celular a una
densidad determinada, aplicar la siguiente
ecuación;
Vf X Cf
Vi X Ci = Vf X Cf Vi = -
Ci
2. Determinación de la viabilidad celular
por el método de exclusión del azul tripán
Para determinar el número de células viables
presentes en una suspensión se utiliza la técni­
ca de exclusión de un colorante. Este método
se fundamenta en la capacidad de excluir cier­
tos colorantes como el azul tripán, la eosina o
el propidio, por parte de las células vivas que
poseen m em branas celulares intactas. Por el
contrario, las células muertas son penetradas
por el colorante y se tiñen. Para ello, se mezcla
una suspensión celular con el colorante y luego
se examina en el microscopio para determinar
si las células tomaron o excluyeron al coloran­
te. En el caso de usar azul tripán, una célula
viable tendrá el citoplasma refringente mientras
que una célula no viable tendrá el citoplasma
azul.
1. Resuspender el sedimento celular en SST o
medio completo sin SFB.
Las proteínas del suero se colorean con azul
tripán y pueden causar resultados erróneos
2. Mezclar una parte de la solución de azul tri­
pán al 0,4% con una parte de la suspensión
celular. Incubar la m ezcla alrededor de 3
minutos a temperatura ambiente.
Las células se deben contar dentro de los 3 a
5 minutos de realizada la mezcla con el azul
tripán, ya que períodos más largos de incu­
bación podrían conducir a la muerte celular
y reducir el número de células viables,
3. Cargar una gota de la mezcla de las células
y del colorante en una cámara de Neubauer
y colocarla en un microscopio.
 Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes
4. Contar separadamente las células no colo­
readas (viables) y las coloreadas (no via­
bles). Para obtener el número total de células
viables por mi, multiplicar por 2 el número
total de células viables (factor de dilución
por el azul tripán), ver punto 1 del apéndice.
5. Calcular el porcentaje de células viables se­
gún la siguiente fórmula:
Número de cél.
viables por mi
>de células viables = X 100
Número total
de células por mi
3. M étodos para Usar glóbulos rojos
1. Por lisis hipotónica: a un volumen del sedi­
mento celular añadir un volumen de agua
destilada, hom ogeneizar con una pipeta.
Después de exponer las células al shock hi-
potónico durante 15 segundos añadir rápida­
mente medio de cultivo o SST 2X. Hom o­
geneizar y centrifugar a 200 X g durante 10
m inutos y lavar las células sedim entadas
con medio o SST.
2. Por lisis con solución tam ponada de Tris-
Cloruro de amonio. Para preparar la solu­
ción de trabajo de Tris-Cloruro de amonio
ver su preparación al final de capítulo. Para
producir la hsis de los glóbulos rojos conta­
minantes, centrifugar las células y agregarle
1 ral de buffer Tris-NH^Cl pH 7.2. Agitar a
temperatura ambiente por 2 minutos. Prote­
ger las células agregando SFB y centrifugar
a 300 X g durante 10 minutos. Si la lisis de
los eritrocitos no fue completa repetir el tra­
tamiento. Lavar las células dos veces con
SST antes de usar.
4. Marcación de células con timidina
tritiada para la determinación de la
proliferación celular en microplacas
Materiales
1 |aCi/m] de [^H] metil timidina ([^H] TdR,
6.7 Ci/mmol; Du Pont NEN, # NET-027).
- Medio RPMI completo sin suero.
- Papel de fibra de vidrio.
- Aparato cosechador de células manual o se-
miautomático (NUNC, SKATRON).
Método
1. Agregar 1 ¡iCi de [^Hl-TdR por pocilio, di­
luyendo 1:20 la solución de Im C i/m l de
[^H] metil timidina con RPMI completo sin
SFB. Colocar 20 |J,1 de esta dilución de [’’H]-
TdR en cada pocilio de la microplaca.
769
2. Retornar la inicroplaca a la estufa de culti­
vo, e incubar por 4 a 24 h adicionales.
La duración del período de marcación debe
ser determ inada em píricam ente para cada
cultivo. Un período de marcación de toda la
noche (18 a 24 h) es conveniente y m inim i­
za los efectos de la síntesis asincrónica del
ADN por los hnfocitos.
3. Recoger los cultivos sobre papel de fibra de
vidrio utilizando un cosechador de células.
Aspirar las células y lavar varias veces con
agua para lisar las células y tran sferir el
ADN al papel permitiendo que se elim ine la
[^H]-TdR no incorporada,
4. Secar los papeles en estufa a 37“C o en mi­
croondas, y posteriorm ente, colocar cada
uno en un vial de centelleo líquido.
5. Eluir la pHJ-TdR incorporada con el líquido
de centelleo (véase al final de este capítulo).
Contar la radiactividad incorporada (cpm) en
un contador de centelleo líquido del tipo p,
5. Cuantificación de la síntesis de ADN
u sando el ensayo colorimétrico de MTT
Para la determ inación colorim étrica d e la
síntesis del ADN se utiliza la sal de tetrazolio
[3-(4,5-dimetil tiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazo-
lium bromuro] (MTT), que al ser clivada por
las mitocondrias activas, vira del color amarillo
a un producto (formazan) soluble en HCl-iso-
propanol que es de color azul y puede ser de­
tectado en un lector de policubetas a 570 nm
(Mosmann, 1983), Este ensayo provee un m é­
todo simple para detectar células vivas crecien­
do, sin el uso de radiactividad.
M ateriales
- MTT (Sigma#M-2128).
- HCl 0,04 N en isopropanol.
- Filtros de 0,22 |U,m.
~ Lector de microplacas con filtro de 570 nm.
M étodo
1. Disolver el MTT en SST (solución stock de
5 mg/ml). Filtrar para esterilizar y elim inar
los residuos insolubles.
2. Adicionar 10 )il de la solución de MTT/SST
en cada pocilio (conteniendo 100 ¡xl de célu ­
las). Incubar las células a 37°C, en la estufa
g asead a con 5% de CO, durante 4 h. El
M TT reemplaza a la pH]-TdR,
3. Adicionar 100 \x\ de HCl 0,04 N en isopro­
panol en cada pocilio. Pipetear tres o cuatro
veces para disolver los cristales azules oscu­
ros. Dejar las placas unos minutos a tem pe­
ratura ambiente hasta que los cristales se so-
lubilicen.
770 Metodologías
4. Leer las placas en el lector de microplacas
utilizando un filtro de 570 nm. El color es
estable unas pocas horas a temperatura am­
biente.
Soluciones tam ponadas y reactivos quím icos
Líquido de centelleo
- 5 g de 2,5- difeniloxazol (PPO)
- 0,3 g de 1,4-bis [-2-(5-feniloxazolil)]-bence-
no (POPOP)
- 2 ml de ácido acético glacial
Llevar a 1 litro con tolueno y agitar durante 1
h. Este reactivo debe ser usado dentro de los 6
meses y guardarse en un frasco oscuro.
Medio de cultivo IM D M completo: es el medio
de Dulbecco modificado por Lscoves
“ L-glutamina 2mM
~ 2-Mercaptoetanol 50 |iM
- Estreptomicina 160p,g/ml
- Penicilina 100 U/ml
Al medio ÍMDM completo suplementado con
5% de suero, descomplementado por calenta­
miento a 56”C durante 30 min, se lo cita como
IMDM-5.
Medio de cultivo RPM I completo
- RPMI 1640
~ L-glutamina 2 mM
- 2-Mercaptoetanol 50 jiM
- NaCOjH 2 g/l
- Estreptomicina 160 [tg/ml
- Penicilina 100 U/ml
Al medio así preparado se lo denomina com­
pleto. Cuando al medio RPMI 1640 completo
se lo suplementa con 10% de SEB u otro suero,
descom plem entado por calentam iento a 56“C
durante 30 min, se lo cita como RPMl-lO.
Solución salina tamponada (SST)
~ N a C I9 g (1 5 4 m M )
^ Na^HPO, 1,15 g (anhidro) (8,1 mM)
- N a H 2 P 0 ,0,23 g (anhidro) (1,9 mM)
Agregar agua destilada hasta 900 ml y ajustar a
pH 7.2-7.4 utilizando N aOH IN o HCl IN.
Adicionar agua hasta 1 litro.
Solución de Hanks
NaCl 137 mM
- KCl 5.4 mM
- Na^HPO^ 0,3 mM
- KHjPO, 0,4 mM
- NaHCOj 4,2 mM
- CaCL 1,3 mM
- MgCI^ 0,5 mM
- MgSO, 0,6 mM
- D-glucosa 5,6 mM
Agregar agua destilada hasta completar un litro
y ajustar el pH a 7,4.
Solución para lisar glóbulos rojos (Solución
tamponada de Tris-Cloruro de amonio)
Solución tamponada stock
- N H p 0,16 M (8,3 g/l)
- Tris 0,17 M, disolver 20,6 g de Tris en 900
ml de agua destilada, ajustar a pH 7,65 con
HCl IN. Completar a 1000 ml.
Solución tamponada de trabajo
- 9 0 m ld e N H 4 C I0 ,1 6 M
- 10 m id e Tris 0,17 M ,p H 7,65.
- Ajustar a pH 7,2 con HCl IN.
Solución de Gey
- S o lu c ió n I. N aC l 35 g; K Cl 1,85 g;
N a2H PO ,.l2 H ,0 .5 g; K H ,P 0 , 0,119 g;
glucosa 5 g; rojo fenol 0,05 g; agua destilada
hasta 1 litro.
^ Solución II. MgCIj. 6 H p 0,42 g; M gSO,
7 H 2O 0,14 g; CaClj 0,34 g; agua destilada
hasta 1 0 0 ml.
- Solución III. NaHCOj 2,25 g; agua destilada
hasta 1 0 0 ml.
Esterilizar en autoclave cada una de estas solu­
ciones. En el momento de usar, mezclar 20 ml
de la solución I, 5 ml de la solución II, 5 ml de
la solución III y 70 ml de agua destilada estéril.
Solución salina fosfatada de Dulbecco
- S o lu c ió n I. N aC l 4 0 ,4 5 g; K C l 1,45 g;
KH^PO, 1,45 g; Na^HPO, 5,49 g; agua desti­
lada hasta 400 ml.
- Solución II. CaClj 0,95 g; agua destilada
hasta 50 ml.
~ Solución III. M gCl 2 0,95 g; agua destilada
hasta 50 ml.
Esterilizar en autoclave cada una de estas solu­
ciones. En el momento de usar, mezclar 80 ml
de la solución I, 10 ml de la solución II, 10 ml
de la solución III y 900 ml de agua destilada
estéril.
Preparación de la columna de lana de nylon
Este protocolo describe la preparación de la la­
na de nylon para el enriquecimiento en linfoci­
tos T.
 Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes 771

B o y u m , A . Iso la tio n o f m o n o n u c le a r c e lls an d g r a n u lo c y te s

Material fro m h u m a n b lo o d . S c a n d . J. CU n. l^ab. In v e s t S iip p l
2 1 ,7 7 -8 9 ,1 9 6 8 .
~ HCl al 1%. G illis, S. & S m ith , K . L o n g -te rm c u ltu re o f tu m o r -s p e c if ic
- Lana de nylon (nueva o reciclada). c y to to x ic T c ells. N a tu re , 26 8 , 1 5 4 -1 5 6 , 1977.
- Guantes de amianto. H o o k s , J. & D e tric k , B . E v a lu a tio n o f th e in te rfe ró n sy s-
tem . p 2 4 0 -2 4 3 . In R o se , N, C o n w a y d e M a ca rio , E ., F a -
- Jeringa descartable de 12 a 20 ml. je y , .1,, F rie d m a n , H , & P e n n , G ( e d ito rs ), M a n u a l o f cU-
n ic a l la b o ra to ry im m u n o lo g y , 4 th ed . A m e ric a m S o c ie ty
fo r M ic ro b io lo g y , W a sh in g to n , D .C . 1992.
Método J u liu s , M ., S im p s o n , E ., & H e rz e n b e rg , L . A ra p id m e th o d
f o r th e is o la tio n o f f u n c tio n a l th y m u s - d e r iv e d m ii r i n e
1. Colocar la lana de nylon en un vaso de pre­ ly m p h o c y te s . E u r. .1. I m m u n o l. 3, 6 4 5 -6 4 9 , 1973.
cipitado de 4 litros. Saturar con un volumen K a m m e r , G . M . T - ly m p h o c y te a c tiv a tio n . p 2 0 7 - 2 1 2 . In
en exceso de HCl al 1%. R o s e , N , C o n w a y d e M a c a rio , E ., F a je y , J., F rie d m a n , H,
2. Hervir 5 a 10 minutos para remover conta­ & P e n n , G (e d ito rs ). M a n u a l o f c lin ic a l lab o ra to ry i m m u ­
n o l o g y , 4 t h e d . A m e r ic a m S o c ie ty f o r M ic r o b io l o g y ,
minantes. W a s h in g to n , D .C . 1992.
Las burbujas de aire formadas como conse­ K ra ft, A ., A n d e rs o n , W ., C o o p c r, H . & S a n d o , J. D e c r e a s e
cuencia de la ebullición son atrapadas deba­ in c y to s o lic c a lc iu m /p h o s p h o lip id - d e p e n d e n t p r o te in l á ­
ñ a s e a c tiv ity f o llo w in g p h o rb o l e s te r tre a tm e n t o f E I .4
jo de la lana de nylon lo que resulta en m o­
th y m o m a c e lls. J. B io l. C h e m . 251, 1 3 1 9 3 -1 3 1 9 6 , 1 9 8 2 .
vimientos violentos del recipiente. Usar los L e P e u c h , C ., B a lle s te r, R . & R o s e n , O . P u rified ra t b ra in
guantes para mantenerlo firme. c a l c i u m a n d p h o s p h o l i p i d - d e p e n d e n t p r o te in k i n a s e
3. Dejar enfriar y luego descartar el líquido. p h o s p h o rila te s r ib o s o m a l S6. P ro c. N a ti. A cad . S ci. U S A ,
8 0, 6 8 5 8 -6 8 6 2 , 1983.
Exprimir la lana de nylon para liberar el lí­
M a g e , M , M c H u g h , L .L ., & R o th s te in , T . L. M o u s e ly m ­
quido atrapado y lavar con agua. Repetir al p h o c y te s w ith and w ith o u t su rfa c e im m u n o g lo b u lin : P re -
menos 10 veces para extraer todo el HCl p a r a t iv e s c a le s e p a r a tio n in p o ly s ty r e n e tis s u e c u l t u r e
(controlar de llegar a pH neutro). p la te s c o a te d w ith s p e c ific a lly p u r ifie d a n ti- im m u n o g lo ­
4. Secar la lana de nylon a tem peratura am ­ b u lin . J , I m m u n o l. M e th o d s , 15, 4 7 - 5 6 , 1977.
M a g e , M , M a th i e s o n , B ., S h a r r o w , S ., M c H u g h , L . L .,
biente y pesar la cantidad apropiada. H a m m e r lin g , U ., K a n n e lo p o u lis -L a n g e v in , C ., B r id e a u
5. Peinar la lana de nylon con un cepillo hasta J r., D ., a n d T h o m a s III, C . P rc p a ra tiv e n o n -ly tic s e p a r a ­
que no tenga nudos y triplique su volumen. tio n o f Lyt2-i- an d L y t2 - T ly m p h o c y te s , fu n ctio n al a n a ly ­
sis o f th e se p a ra te d c e lls , and d e m o s tra tio n o f s y n e rg y in
6. Remover el émbolo de la jeringa y usarlo
g ra ft v e rs u s h o s t re a c tio n o f L.yt2+ a n d L y t2 - c e lls , E u r.
para colocar la lana de nylon dentro de la J, Im m u n o l., 11: 2 2 8 -2 3 5 , 1981.
jeringa. Insertar el émbolo para para com ­ M o s m a n n , T . R a p id c o lo rim e tric a ssa y fo r c e ilu la r g r o w th
pactar la lana de nylon. Presionar firm e­ a n d s u rv iv a l: A p p lic a tio n to p r o lifc r a tio n and c y to t o x i -
mente. c ity a s sa y s . J, Im m u n o l. M e th o d s , 6 5 , 5 5 -6 3 , 1983.
N o rm a s d e b io se g u rid a d . V IH , el v iru s d e la in m u n o d e f i-
7. A u to c la v a r las c o lu m n a s 15 m in u to s a c ie n c ia a d q u irid a h u m a n a . M in is te rio d e Salu d y A c c ió n
110«C. S o c ia l S e c re ta ría d e S a lu d , B u e n o s A ire s , 1988,
Las columnas de lana de nylon esterilizadas W y s o c k i, W , L, an d S a to , V . L, P a n n in g fo r ly m p h o c y te s :
A m e th o d f o r c ell se le c tio n , P ro c , N a ti, A cad , Sci, U S A ,
se pueden guardar durante meses a tempera­
7 5 ,2 8 4 4 - 2 8 4 8 , 1978,
tura ambiente.
B ib liografía de consulta

B IB L IO G R A FIA M a n u a l o f c lin ic a l la b o ra to ry im m u n o lo g y , 4 th ed, A m e r i ­

B io s a fe ty in M ic ro b io lo g ic a l a n d B io m e d ic a l la b o ra to rie s .
H e a lth a n d t tu m a n S e r v ic e s P u b lic a c ió n # ( N I H ) , 8 8 -
8 3 9 5 , U .S . G o v e r n m e n t P r in t in g O f f ic e , W a s h in g to n
D .C .
c a m S o c ie ty fo r M ic ro b io lo g y , C o n w a y d e M a c a rio , E ,,
F a je y , J,, F rie d m a n , H . & P e n n , G (e d ito rs ), W a s h in g to n ,
D ,C , 1 9 92,
C u r r e n t P r o to c o ls in I m m u n o lo g y , C o lig a n , J,E ,, K r u i s -
b e e k , A ,M ,, M a rg u lie s , D .H ,, S h e v a c h , E, M , & S tro b e r ,
W , (ed ito rsX N u e v a Y o rk , 1995,
ANEXO
Aplicaciones de ia inmunogenética
al diagnóstico de leucemias y linfomas
M. LEONARDO SATZ
M. ROSA PADRÓS
NORA HALPERIN
LEONARDO FAINBOIM
IN T R O D U C C IÓ N
El desarrollo de la tecnología para la produc­
ción de anticuerpos monoclonales (AcM) (cap.
37) ha permitido en los últimos años una mejor
comprensión de los procesos de maduración de
los leucocitos. Habíamos visto en los capítulos
anteriores (5 y 6) que, durante la diferenciación
linfocitaria B en la médula ósea y T en el timo,
los distintos estadios de maduración se caracte­
rizan por la expresión diferencial de un conjun­
to de moléculas en la superficie celular y por
reordenamientos en los genes de inmunoglobu­
linas y receptor T. Asimismo, existen numero­
sas moléculas de superficie celular (CD), que
son específicas de la serie mieloide, eritrocítica
y plaquetaria (véanse más detalles en el Anexo
listado CD, Apéndice Cap. 2).
Las leucemias y los linfomas constituyen un
grupo de enfermedades caracterizadas por una
proliferación maligna de las células presentes
en la sangre, médula ósea, ganglios linfáticos o
bazo. La patología puede afectar cualquiera de
los tipos celulares presentes en dichos tejidos:
células de la serie eritrocítica, mielomonocítica
o linfocitaria B y T. La correcta identificación
del tipo celular involucrado resulta crucial tan­
to para el avance en la comprensión de la bio­
logía y la patogénesis de estos tumores como
para predecir el pronóstico y decidir el correcto
tratamiento de cada uno de ellos.
El diagnóstico habitual surge de una serie de
pautas entre las cuales la clínica, la morfología
de las células al microscopio óptico y la expre­
sión de enzimas específicas de linajes, son las
más útiles. Las células malignas constituyen un
clon que se ha expandido a partir de una célula
que se ha detenido en su maduración normal y
se replica desreguladamente, a partir del proce­
so de “leuceraización”. La disponibilidad de
una colección de AcM dirigidos contra los di­
versos CD leucocitarios, perm ite contar con
una herramienta complementaria para identifi­
car el linaje celular involucrado en la patología.
Básicam ente, m ediante técnicas de inm uno-
marcación (véase más adelante), se cuantifican
los porcentajes de células reactivas contra cada
AcM . T eniendo en cuenta el porcen taje de
blastos (o células con morfología anómala) en
la muestra, el porcentaje de células positivas
para un marcador dado y los valores habitual­
mente normales para ese marcador en ese teji­
do, se establece el linaje afectado. En muchos
casos, la tipificación de la leucemia se realiza
con los elementos diagnósticos mencionados
antes; otras veces, la definición del subtipo in­
munológico es decisiva en la distinción de las
leucemias mieloides de las hnfoides, para las
cuales hay diferencias en el pronóstico y el tra­
tamiento.
Tipificación de leucemias
y linfomas
De acuerdo al grado de maduración de la cé­
lula afectada y a una serie de características clí­
nicas, las patologías se agrupan en agudas y
crónicas, y podrán afectar en ambos casos a las
series B, T o mielomonocítica.
Leucemias agudas
En el cuadro 36-7 se muestran los fenotipos
que caracterizan a las leucemias agudas, con
dos o tres AcM específicos para cada linaje he-
matopoyético, B, T y mieloide.
 Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes 773

C u ad ro 36-7. Clasificación inmunológica de inmaduras sólo expresan HLA-DR, CD34 y la

las leucemias agudas
A ntígenos de
diferenciación LLA-B'^'^ L L A -T
C D IO
C D I9
CD 22*
CD3
CD5
CD7
C D 13
C D 33
aM PO *
Exprejiión citoplásm ica.
** L L A -B te m p ra n a (C D 1 0 -), co m ún (C D IO ) y pre-B (m u-cito)
LEUCEMIAS LINFOBLASTICAS
AGUDAS (LLA)
Los primeros marcadores utilizados para di­
ferenciar los subtipos de LLA, fueron el recep­
tor para los GRC (rosetas E), que identificaban
a las LLA-T, y las Igs de superficie (slg) que
identificaban a las llamadas LLA-B. Posterior­
mente se describieron antisueros contra el Ag
de diferenciación CDIO (anti-CALLA), que
reaccionan con las células de un 70% de las
LLA, con pronóstico más favorable que las an­
teriores. Originalmente, a las de este subgrtipo
de LLA se las denominó “comunes” (por su fre­
cuencia) y se les asignó un linaje “no T, no B”.
Posteriormente, con la definición de otros mar­
cadores de linaje celular (HLA-DR, p. ej.), la
observación de un pequeño porcentaje de célu­
las normales en médula ósea con igual fenotipo,
y la detección de reordenamientos en los genes
de Igs en estas células, se concluyó que las
LLA no T-no B, constituyen células del linaje
B, en estadios tempranos de diferenciación.
Más recientemente, la identificación de nue­
vos marcadores de diferenciación de la serie B
permitió definir nuevos subtipos de LLA: des­
de los estadios más indifereneiados hasta los
más maduros (cuadro 36-8). Las células más
enzima TdT. Luego adquieren CD19 (LLA-nu-
las) y luego el CDIO (LLA-comunes).
La frecuencia de los distintos subtipos de
LM A LLA en la población de la Capital Federal y
Gran Buenos Aires en el período 1983-1986
fue la siguiente: LLA común, 73,9%, LLA nu­
la, 11,7%; LLA-T, 13,4%; LLA indiferencia-
das, 3%, y LLA-B, 0,84% (experiencia de los
-/+ autores, sobre la base de más de 250 casos es­
tudiados). Estos resultados son similares a los
observados en otros centros europeos con p o ­
blación caueasoide.
L EU C EM IA S LIN FO B LÁ STIC A S
A G U D A ST
Como dijimos antes, las LLA-T representan
alrededor de un 15% de las LLA. El m arcador
más útil para detectar una LLA-T es el CD7 ya
que está presente en la mayoría de los tim oci­
tos y células T y ausente en las LLA de estirpe
B. El cuadro 36-9 muestra la clasificación de
las LLA-T de acuerdo al nivel de diferencia­
ción tím ica. El grupo I incluye a las células
más inmaduras, que expresan CD2 (rosetas E)
CD5 y CD7. En este estadio las células ya han
reordenado los genes T-beta y pueden tener o
no T-alfa reordenado (véase cap. 7 y más ade­
lante en este cap.).
El grupo II expresa, además, CDI, C D 4 y
CD8 sobre la misma célula y un 25% de los ca­
sos expresa también CD3. Las células han reo r­
denado y expresan T-beta.
El grupo III representa los timocitos m adu­
ros y linfocitos T periféricos, los cuales c a re ­
cen de C D l, expresan CD3 junto a CD4 en al­
gunos casos o a CD8 en otros; poseen reorde-
nados y expresan T-alfa.
Leucemias mieloides agudas (LMA)
Se han descrito AcM que reconocen m arca­
dores presentes en células de estirpe mieloide
maduras e inmaduras, pero ninguno de ellos es

C uadro 36-8. Fenotipos principales que caracterizan a los subtipos de LLA de linaje B
Antígenos
de diferenciación In d if Nula Com ún p re-B ' B

CD 34 + -v - /+ _
H L A -D R + + + +
CD 19 - + + + -f
C D IO - - + r ...

CD 20 - + -r
m u c ito p . - - /+ f
s lg - - .... - --
TdT + + - /+ ....
-
774 Metodologías

C uadro 36-9. Clasificación de las LLA-T

A ntígenos de diferenciación

CD7 CD5 CD2 CD3 CD4 CD8 CDI

G ru p o I + + + (7 5 ) - - - -

G ru p o 11 + + + + (2 5 ) + + +

G ru p o III + + + + + /-* + /-* -

* N o p re sen ta ex p resió n s im u ltán e a de C D 4 y C D 8 co m o en el g ru p o 11.

Se indica en tre p arén tesis el p o rc en taje d e casos positivos.

específico de células leucémicas; sin embargo, cional. Para distinguir ambas situaciones el Dr.
la presencia de CD34 junto con los anterior­ Catovsky propuso un sistema de scores (cuadro
mente mencionados indica que estamos en pre­ 36-11), en cual la presencia de ciertos marca­
sencia de un proceso leucém ico. El cuadro dores tiene mayor peso para definir una LBA.
36-10 muestra los fenotipos inmunológicos de Así, por ejemplo, si una LA con marcadores
las LMA segtin la clasificación de la FAB. Hay mieloides expresa además CD22 citoplásmico
gran variación en la expresión de estos marca­ y CDIO o CD19, el score será de 3 y la leuce­
dores en distintas leucemias. Por otra parte, no mia se define con bifenotípica; si sólo expresa
hay una correlación entre la expresión de deter­ CDIO o CD I9 como marcador fuera de linaje,
minados marcadores y las patologías clasifica­ el score será de 1 y, por lo tanto, no será bife­
das según la FAB. Usualmente se incluye un notípica sino simplemente una LMA.
marcador pan-mieloide que reconoce tanto pre­
cursores de granulocitos como precursores de Desórdenes linfoproliferativos
monocitos, como el CD13 o CD33, para el pri­ de la serie B madura
mer análisis de una leucemia aguda de estirpe
desconocida. Se caracterizan por la proliferación clonal de
La LMA-MO es un ejemplo típico de la ne­ células con fenotipo maduro y comprenden la
cesidad de evaluar el inmunofenotipo para lle­ leucemia linfática crónica (LLC-B), leucemia
gar a un correcto diagnóstico, ya que en ella la prolinfocítica (LPL), leucemia a células vello­
m orfología de los blastos se asem eja a una sas o tricoleucemia (LCV), mieloma múltiple
LLA y este estadio es negativo para la citoquí- (M M ), m acroglobulinem ia de W aldenstróm
mica mieloide. (MW) y linfomas (LE). El cuadro 36-12 resu­
me los marcadores inmunológicos que caracte­
Leucem ias bifenotípicas agudas rizan a estas patologías.
Las células de las LLC-B expresan recepto­
Se han descrito casos en los que la misma res para eritrocitos de ratón e Igs de superficie;
célula blástica coexpresa marcadores indicati­ la clonalidad se demuestra por la expresión de
vos de linajes celulares diferentes. Esto puede un solo tipo de cadena liviana, ya sea kappa a
deberse a la presencia de una leucemia bifeno- lambda, sobre la superficie celular. La densi­
típiica aguda (LBA) que afectan a células em­ dad de expresión de las Igs de superficie es m e­
brionarias multipotentes, con una diferencia­ nor, sin embargo, que la presente en otras pato­
ción genotípica y fenotípica multilineal; alter­ logías, como los linfomas linfocíticos y leuce­
nativam ente, puede tratarse se una leucem ia mias prolinfocíticas. Las LLC-B expresan tam ­
aguda mieloide, B o T, en las cuales las células bién el antígeno CD5, típico de la serie T. Se
expresan aberrantemente algún marcador adi- lo encuentra normalmente en una pequeña sub­
población celular en los ganglios linfáticos. E s­
tudios de ontogenia han demostrado que repre­
C u a d ro 36-10. Fenotipos inm unológicos de senta la prim era población que coloniza los
las LMA ganglios linfáticos y daría origen al resto de la
población B en ellos, que luego pierden este
Estadio de la EAB Fenotipo inm unológico marcador. Identificaría entonces a las células
M 0 ,M 1 , M 2 G D I 3, C D 3 3 , C D 3 4 , M P O , H L A -D R
en transición entre la médula ósea y el ganglio.
M3 C D 1 3 , C D 3 3 ,M P O Las células de las LLC-B poseen sus genes
M 4, M 5 C D 1 3 , C D 3 3 , G D 1 4 , C D 6 8 , H L A -D R de cadena pesada y liviana reordenados y un
M6 C D 3 3 , a n ti-g lic o fo rin a A 10% de los casos presentan* también reordena­
M7 C D 3 3 ,C D 4 1 ,C D 4 2 , C D 61
mientos de T-beta (véase más adelante).
 Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes 775

Cuadro 36-11. Sistema de scores para distinguir la leucemia bifenotípica aguda

Puntos Linaje

B r M

2 cC d 2 2 cC D 3 M PO*
1 C D IO CD2 C D 13
CD 19 CD 5 C D 33
0,5 TdT TdT C D l) b ,c
CD7 C D l 4 /5

c, C ito p lásm ica .

* D e m o stra ció n d e M P O p o r cu a lq u ie r m étodo.
El scorc del m a rc a d o r fu e ra d e lin aje ce lu la r deb e ría ser > 2 p ara d ia g n o s tic a r q u e la leu c em ia ag u d a en cuestión es bifenotípica.

C uadro 36-12. Fenotipo inmunológico de las enfermedades linfoproliferativas de la serie B m.a-

dura

M arcador LLC -B LPL LF I.C V M M /M W

R o se ta s M ++ -/+ -/+
sig -/+ ++ ++
C D 19, C D 20
CD5 -/+
C D 21
C D IO
C D 25 -/+ -/+ -/+
P C A -I
PC -1
C D 38

Las células de los desórdenes malignos de la
serie B expresan también marcadores típicos de
células B: HLA-DR, CD19, CD20, excepto en
el miel orna múltiple y en la macroglobulinemia
de W aldenstrSm , que afectan a plasm ocitos.
Estos últimos expresan, además, CD38, PC A l
y PCI.
Desórdenes linfoproliferativos crónicos
de la serie T
El fenotipo de estas patologías corresponde a
células postímicas, es decir, siempre son nega­
tivas para TdT y C D l, este último expresado
frecuentemente en linfomas linfoblásticos T y
en un subtipo de LLA-T. El cuadro 36-13 resu­
me el fenotipo inm unológico de estas patolo­
gías, útil en su clasificación y diagnóstico: leu­
cem ia linfática crónica T (LLA-T), leucem ia
prolinfocítica crónica T (LPL-T), leucemia-lin-
foma T del adulto (LLTA) y linfoma cutáneo
de células T (LCCT). La naturaleza elonal de
estas patologías se puede evidenciar por reo r­
denam ientos de los genes T -beta y T -g am a
(véase más adelante).
Con excepción de la LLC-T, todas las pato­
logías se caracterizan por la proliferación de
células T CD4+. Existe, sin embargo, una h ete­
rogeneidad funcional: las células de las L CC T
y LPL-T se comportan in vitro como coopera­
doras, mientras que las células de las LLTA ac­
túan como potentes supresores de la diferencia­
ción B. No se sabe si esto refleja la afección de
' dos o más subpoblaciones T CD4 diferentes, o
alteraciones funcionales como consecuencia de
la patología.

C uadro 36-13. Fenotipo inmunológico de las patologías malignas de células T maduras

M arcador L L C -T L P L ^T LLTA LC C T

CD5 _ + + +
CD3 + + + +
CD4 - + + +
CD8 + _

CD2 + + + +
CD7 +
C D 25 - - + -
776 Metodologías

Las células malignas de las LCCT se carac­ Procedimiento experimental

terizan por su núcleo cerebriforme. En las mi­
cosis fungoides estas células aparecen en la La detección de los antígenos de membrana
piel y son CD7+, mientras que en el síndrome se realiza por inmunofluorescencia (lE) directa
de Sézary están en sangre p e riférica y son o indirecta. Generalmente se realiza IF directa
CDT. para la detección de Igs de superficie, mientras
La LLTA es una patología asociada frecuen­ que los marcadores de diferenciación reconoci­
tem ente, aunque no siempre, a un retrovirus dos por AcM murinos se detectan por IF indi­
humano llamado HTLV-L Se presenta en Ja­ recta.
pón, Caribe y EE. UU. Las células son de feno­ La estrategia diagnóstica para una muestra
tipo cooperador y expresan además la cadena con diagnóstico presuntivo de leucemia aguda,
beta (p55) del receptor para la lL-2 (CD25). involucra una prim era evaluación de los si­
Luego de 24-48 horas en cultivo, estas células guientes marcadores; HLA-DR, CD7, Igs de
expresan en el citoplasma las proteínas virales s u p e rfic ie , C D IO , C D 2 0 , C D 1 9 , C D 33 y
pl9 y p24. C D I4. Si el porcentaje de células CD7“^ suma­
Las células CD8+ de algunas LLC-T exhiben do al número de blastos leucémicos es mayor
función de ADCC y rara vez actúan como efec­ de 100, indicará la presencia de una leucemia
tores supresores o NK. Algunos casos de LLC- aguda T y se evalúan los siguientes marcado­
T coexpresan CD4 y C D ll o CD8 y C D Il, y res: CD2, CD5, CD8, CD4, CD3, CDL
son de peor pronóstico que las de fenotipo más Para las leucemias crónicas, una primera in­
común, CD8, CD3. vestigación incluye: H LA -D R, CD7, CDIO

F ig . 3 6 -1 3 . G rá fic o s d e d o b le flu o re s c e n c ia o b te n id o s p o r a n á lis is d e c ito m e tría d e flu jo , (a ) G rá fic o d e d o t p lo t, d o n d e

la s o rd e n a d a s p o s e e n u n a e s c a la lo g a r ítm ic a d e in te n s id a d r e la tiv a d e f lu o re sc e n c ia (F L 2 ) p a ra el m a rc a d o r C D 1 9 y las
a b s c is a s u n a e s c a la s im ila r p a ra F L l (C D IO ). El o p e ra d o r d e fin e lo s c u a d ra n te s te n ie n d o e n c u e n ta lo s v a lo re s b a s a le s d e
flu o re sc e n c ia , (b ) G rá fic o d e c o n to rn o s d e la s m is m a s c é lu la s, (c) A n á lis is d e l % d e c é lu la s p re s e n te s e n c a d a c u a d ra n te :
U L (su p e rio r iz q u ie rd o ), U R ( su p e rio r d e re c h o ), L I. (in f e rio r iz q u ie rd o ) y L R (in fe rio r d e re c h o ). S e in d ic a ta m b ié n el n ú ­
m e ro d e c é lu la s r e g is tra d a s en c a d a c u a d ra n te (ev e n ts ), y el p o r c e n ta je d e las m is m a s s o b re el to ta l d e c é lu la s p a s a d a s p o r
e l a p a ra to o s o b re un g ru p o d e célula.s (g a te d ) p r e -s e le c c io n a d a s p o r el o p e ra d o r, en b a s e a u n p a rá m e tro (p .e j. ta m a ñ o :
b ia s to s le u c é m ic o s ). T a m b ié n se re g is tra la in te n s id a d m e d ia d e flu o re s c e n c ia p a ra c a d a m a rc a d o r (X m e a n y Y m ea n ).
 Metodologías para ¡a evaluación de las células inmunocompetentes 777

CD3, CD33, Igs de superficie, CD20, CD5. De las células dos veces con PBS conteniendo
ser positivos CD3 o CD7, se identifican las 0 ,1% seroalbúmina bovina y 0,1% azida sódi­
subpoblaciones T CD4, CD8, C D l. Si las Ig de ca. Al sedimento celular resuspendido se agre­
superficie son positivas, se detecta la monoclo­ ga el segundo anticuerpo: F (ab)’2 anti-inmu-
nalidad kappa/lambda. noglobulina de ratón (cabra) conjugado con
isotio cian ato de fluoresceína. Se incuba 30
min a 4"C, y se lava 2-3 veces con PBS suple-
A SPEC T O S T EC N IC O S m entado como antes. Si se dispone de A cM
conjugados con fluorocromos, se puede re ali­
Se obtiene la m uestra (sangre periférica o zar IFD.
m édula ósea) con heparina. Es conveniente Análisis: si el resultado será determinado por
procesarla a la brevedad, aunque puede perm a­ microscopía de fluorescencia, después del últi­
necer hasta 24 horas a tem peratura ambiente mo lavado se resuspende el sedimento celular
con una leve disminución de la viabilidad ce­ en un mínimo volumen de PBS (0,1 ml) y se
lular. Se diluye la muestra a la mitad o a la ter­ observa entre portaobjeto y cubreobjeto con
cera parte (si el recuento leucocitario superior m icroscopio de epifluorescencia. Se cuentan
es 25.000/mm^), con solución salina tampona­ 200 células y se registra el porcentaje de célu­
da (PBS). Las células mononucleares se obtie­ las fluorescentes. La intensidad de la fluores­
nen por centrifugación de 10 ml de la muestra cencia es propiedad del número de moléculas
diluida sobre 3 ml de Eicoll-Hypaque, 20-30 presentes por célula y de la afinidad del Ac por
min a 400 x g. Se obtienen ]as células mono- su epitope. Por ello, es variable y se requiere, de
nucleares de la interfase y se lavan tres veces gran entrenamiento del operador para las d eter­
con PBS. Se cuenta el número de células/ml y minaciones. Por lo general el uso de un segun­
se ajusta la concentración a lO^/ml. Para IF in­ do anticuerpo, como fracción F(ab)’2, evita fal­
directa, se centrifugan 10® células a 300 g por sos positivos. Hay numerosas leucemias (sobre
5 min y se descarta el sobrenadante. Se resus­ todo de estirpe mieloide) que poseen receptores
pende el sedimento celular y se agrega el AcM con alta afinidad para el fragmento Fe de las
(volumen y dilución indicadas por el fabrican­ Igs y el uso de un segundo Ac como Ig total
te y previa titulación en el laboratorio). Se in­ origina falsos positivos; para ello es necesario
cuban las células 30 min a 4"C. Luego se lavan siempre incubar un blanco control de células

V 3 :2 2 8 3 0 0 3 /F L 1 -/F lu o re sc e n c e O ne Height
C a d e n a L. Lam bda- % To tal= 13,19
M ean = 108.96

102 1Q3

F ig . 3 6 -1 4 . G rá fic o s d e h is to g ra m a s d e flu o re sc e n c ia o b te n id o s p o r c ito m e tr ía d e flu jo . L a s a b scisa s s e ñ a la n en e s c a la lo -

gíu'ítm ica ia in te n s id a d r e la tiv a d e f lu o re sc e n c ia p a ra la p re s e n c ia d e c a d e n a s liv ia n a s k a p p a (a) y la m b d a (b ). L as o r d e n a ­
das re fle ja n el n ú m e ro re la tiv o d e c é lu la s a n a liz ad a s. E l o p e ra d o r d e fin e , se g ú n la f lu o re sc e n c ia b a s a l, a p a rtir d e q u é in ­
te n s id a d se c o n s id e ra rá p o s itiv a la m u e s tra (in d ic ad o c o n u n a lín e a h o riz o n ta l n e g ra ), (c) a m b o s h isto g ra m a s de ( a ) y ( b )
re s u m id o s e n u n g rá fic o trid im e n s io n a l.
778 Metodologías
con el segundo Ac solamente. Estos blancos
deben ser inferiores al 5%.
Actualmente, muchos centros especiahzados
determinan el porcentaje de células positivas
por citometría de flujo (CF). Esta técnica per­
mite medir simultáneamente numerosos pará­
metros celulares; (a) tam año celular relativo
{forward scatter)\ (b) com plejidad celular y
granularidad del citoplasma (side scatter)\ in­
tensidad de fluorescencia relativa (F L l, FL2,
pueden representar, por ejemplo, dos fluorocro­
mos diferentes). La CF permite identificar cé­
lulas patológicas aun cuando están presentes en
muy pequeño porcentaje. Luego de incubadas
con los AcM, las células se resuspenden en 1
mi de PBS para ser anahzadas por CF inmedia­
tam ente. T am bién pueden resuspenderse en
PBS conteniendo fijadores, lo que permite con­
servarlas en la oscuridad a 4“C y leerlas días
después.
Las figuras 36-13 y 36-14 muestran ejemplos
de cómo se grafican los resultados obtenidos.
La figura 13 a (gráfico de “dot plot”) y 13b
(“contour plot”) muestra dos formas de graficar
la presencia de células que co-expresan CDIO
(en E LI) y CD19 (FL2), que corresponden a
una LLA común. La figura 13c registra el por­
centaje de células positivas en cada uno de los
cuatro cuadrantes en que se ha dividido la figu­
ra 13a; UL (upper left) cuadrante superior iz­
quierdo, que contiene las células positivas para
EL2 (CD19) pero negativas para FL l (CDIO)
posee 8,5% de las células analizadas. UR; (up­
per right) cuadrante superior derecho, que po­
see las células positivas para ambos marcadores
y registra un 64% de dobles positivas. LL se re­
fie re al cu ad ran te de las d o b les n eg ativ as
(25.48%) y LR al que registra las células positi­
vas para FLl y negativas para FL2 (1.92%). La
figura 36-14 muestra otra forma de graficar re­
sultados obtenidos por CF. Se trata de histogra-
mas que poseen en el eje de las abscisas la in­
tensidad de fluorescencia y en las ordenadas, el
número de células. Son útiles para analizar cé­
lulas teñidas sólo con un fluorocromo. La figura
2 gráfica resultados obtenidos con una LLC-B,
donde las células fueron marcadas con un Ac
anti-cadenas livianas kappa y anti-cadenas li­
vianas lambda. La figura 14a muestra que más
del 86% de las células analizadas son positivas
para kappa (con intensidad media relativa de
119) y sólo el 13,19% es positivo para lambda
(fig. 14b). Esta distribución indica un exceso
clonal de kappa en esta LLC-B.
Reordenamientos genéticos
como complemento diagnóstico
La demostración de la presencia de una po­
blación celular monoclonal resulta crucial para
distinguir una proliferación benigna de una m a­
ligna. En más del 95% de los casos, la conjun­
ción del diagnóstico clínico, hematológico e in­
m unológico perm ite la correcta clasificación
del tipo celular comprometido. En el 3-5% res­
tante el análisis no es concluyente. Por un lado
es frecuente la existencia de un gran número de
células normales junto con las células neoplási-
cas en el tejido analizado, y en patologías que
afectan a células maduras será imposible dis­
tinguir las células afectadas. Lo mismo sucede
en una médula ósea: no es posible distinguir
células normales y un pequeño porcentaje de
células malignas. Por otro lado, algunas neo-
plasias se caracterizan por células con propie­
dades de membranas alteradas que unen ines­
pecíficamente AcM dirigidos contra marcado­
res específicos de diversos linajes o realmente
exhiben marcadores de dos linajes (leucemias
bifenotípicas). En la actualidad, la biología m o­
lecular presenta una herramienta de diagnóstico
complementaria para la correcta tipificación de
estos casos dudosos.
En los capítulos 6 y 7 se han descrito los
procesos genéticos involucrados para el ensam­
blado de genes activos para la biosíntesis de la
inmunoglobulinas (Igs) y del receptor T (recT).
Obsérvese en la figura 36-15 que durante los
procesos de reordenamiento genético se produ­
cen cambios en los sitios reconocidos por de­
terminadas nucleasas de restricción, alrededor
de los genes involucrados. Mediante la utiliza­
ción de genes clonados del recT y de las Igs
com o sondas m o lecu lares en la técn ica de
Southern, es posible analizar el ADN extraído
de las células tumorales y determinar la confi­
guración germinal o reordenada de los mismos
(fig. 34-16). Una expansión monoclonal de cé­
lulas B o T constituye la progenie de una sola
célula original. Esta población puede ser identi­
ficad a m ediante el an álisis m o lecu lar, aun
cuando esté presente en proporciones tan bajas
como un 5% en un tejido dado. Los linfocitos
presentes en un tejido normal presentarán, cada
uno de ellos, un reordenamiento característico
propio, pero el pequeño número de células de
cada clon que contribuye con su DNA al total
no permite detectar la banda específica de cada
clon por la sensibilidad de esta técnica.
Para estudiar el ADN por estos procedimien­
tos, se requieren un mínimo de 2 x 107 células.
El ADN purificado de estas células se digiere
con enzimas de restricción, se fracciona en ge­
les horizontales de agarosa y luego de la elec­
troforesis se transfiere a membranas de nitroce­
lulosa o nylon. Dichas membranas se incuban
(hibridan) con una sonda de ADN correspon­
diente a estos genes de Igs o rec T, marcada
con radioisótopos (^^P) u otros métodos enzi­
máticos. Los fragmentos que posen secuencias
 Metodologías para la evaluación de las células inmunocompetentes 779

16 kb

Bam H I* BamHI

Fam ilia de genes

de cadena pesada
S ondas

(Línea germ inal) 13 kb

B am H I* BamHI

Fam ilia de genes

i J. i
de ca de n a liviana Kappa
Sonda

Fig. 36-15. D u ra n te la m a d u ra c ió n Iin fo c ita ria se p ro d u c e n reo rd e n a m ie n to .s g e n é tic o s q u e a p ro x im a n u n gen v a ria b le (V)
p ró x im o a u n g e n (en lo s g e n e s d e c a d e n a liv ia n a ) y u n g e n V d e c a d e n a p e s a d a p ró x im a a u n g e n D h y a u n g e n Jj^. E n
to d o s e s to s s u c e s o s se p ie r d e n fra g m e n to s d e A D N , y c o n e llo s se p ie rd e n sitio s d e r e c o n o c im ie n to d e c ie rta s n u c le a s a s de
re,stricción. E n la fig u ra , lo s sitio s in d ic a d o s con el a s te r is c o (* ), p ró x im o s a lo s g e n e s J, s o n lo s q u e in v a ria b le m e n te d e s a ­
p a re c e n p o r lo s re o rd e n a m ie n to s . E n c o n s e c u e n c ia , lo s fra g m e n to s g e n ó m ic o s d e te c ta d o s p o r las s o n d a s d e g en es c o n s ta n ­
tes, c a m b ia n d e ta m a ñ o re s p e c to d e la lín e a g e rm in al.

homologas a la sorvda utilizada se detectan por nas de las Igs. Para la estirpe T se utilizan son­
au to rrad io g rafía. D esde la obtención de la das correspondientes a los genes T-beta y T-
m uestra hasta la visualización de los resulta­ gamma. Por la organización genómica peculiar
dos, el procedimiento lleva un mínimo de 3-5 que poseen los genes T-alfa (una extensa fam i­
días. Para la estirpe B se utilizan genes clona­ lia J-alfa dispuesta a lo largo de más de 60 kb
dos correspondientes a C-mu y JH de las cade­ de A D N ), es sum am ente d ifícil d eterm in ar
nas pesadas de Igs, y para las cadenas livia­ reordenamientos en esta familia usando com o

Fig. 36-16. E je m p lo s re p re s e n ta tiv o s d e re o rd e n a m ie n to s d e lo s g e n e s d e in m u n o g lo b u lin a s en p a to lo g ía s lin fo p ro ü f e ra ti-

v a s . S e d ir ig ió a p r o x im a d a m e n te 10 p g d e A D N p u r if ic a d o d e la s c é lu la s le u c é m ic a s , co n la e n z im a d e r e s t r i c c ió n
B a m H I, y se la a n a liz ó p o r la té c n ic a d e S o u th e rn . C o m o s o n d a se u tiliz ó un fra g m e n to g e n ó m ic o d e 1,3 kb c o r r e s p o n ­
d ie n te al g e n Cfi. L a f le c h a in d ic a la p o s ic ió n d e u n a b a n d a d e 17 k b , c o rre s p o n d ie n te al fra g m e n to d e lín e a g e rm in a l. L a s
mue.stra.s in d ic a d a s ¿i, c y / , s ó lo m u e s tra n ei fra g m e n to g e rm in a !. L a s m u e s tra s d y e m u e s tra n la p r e s e n c ia de u n a le l o en
c o n fig u ra c ió n g e rm in a l y u n o re o rd e n a d o . L a m u e s tra b s e ñ a la la p r e s e n c ia d e a m b o s a le lo s re o rd e n a d o s .
780 Metodologías
sonda el gen C-alfa: un resultado negativo no
excluye reordenamientos.
IN T E PR E T A C IO N
D E LOS RESULTADOS
En las leucemias agudas de linaje B inmadu­
ro, las LEA nulas (C D l9+ HLA-DR+, TdT+)
pueden exhibir sus genes de cadenas pesadas
de Igs en configuración germinal o reordena-
dos. En las LEA comunes (CD10+), todos los
casos poseen los genes de cadena pesada reor-
denados, mientras que alrededor de un 40% ex­
hibe reordenados los genes de cadena liviana.
Hasta un 20% de las LEA comunes pueden po­
seer reordenados los genes T,B- Las células B
de patologías de estirpes más maduras (LLA-B,
linfomas, tricoleucemias, mielomas), exhiben
siempre reordenados o delecionados los genes
de cadena pesada y liviana de Igs y raenos del
10% de los casos muestran T-beta reordenados.
Por otra parte, las ¡eucemias T agudas po­
seen células que han reordenado genes T-beta y
T-gama, y sólo las de extirpe más madura reor-
denan y expresan T-alfa. Hasta un 10% de los
casos pueden exhibir, además, reordenados los
genes C-mu, aunque en ningún caso se ha ob­
servado reordenamiento de genes de cadena h-
viana de inmunoglobulinas. En muy raras oca­
siones se han observado reordenam ientos en
células de estirpe mieloide. Se desconoce el
significado de los reordenamientos genéticos
fuera de linaje; si pueden ocurrir en células
normales o si constituyen aberraciones caracte­
rísticas de células leucémicas. A pesar de esto,
la determinación de reordenamientos genéticos
constituye una metodología de estudio comple­
m entaria para el diagnóstico en estas patolo­
gías.
B IB L IO G R A FÍA
W K n a p p , H S tro b e , O M a jd ic . F lo w c y to m e tric a n a ly s is
o f ceJI s u r f a c e a n d i n tr a c e l lu l a r a n tig e n s in le u k e m ia
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Hibridomas y anticuerpos
monoclonales
FERNANDO ALBERTO GOLDBAUM
CARLOS ALBERTO FOSSATI
HIBRIDOMAS Y ANTICUERPOS
M O N O C LO N A LES
Consideraciones generales
Ante el estímulo con un inmunógeno, un ani­
mal responde produciendo una gran variedad de
anticuerpos dirigidos contra diferentes compo­
nentes del antígeno inoculado (polipéptidos, po­
lisacáridos, etc.) y contra los distintos determi­
nantes antigénieos (epitopes) de cada uno de
esos componentes. Cada determinante antigéni­
co, a su vez, podrá ser reconocido por más de
un anticuerpo, con diferentes afinidades.
El conjunto de los anticuerpos producidos,
secretados hacia el suero del animal inmuniza­
do, constituye el antisuero. Un antisuero es,
pues, una mezcla heterogénea de anticuerpos
capaces de reaccionar con el antígeno.
Dada la naturaleza dinámica del sistema in­
mune, la composición del antisuero está some­
tida a un cambio continuo en el animal inmuni­
zado, lo cual sumado a las diferencias indivi­
duales entre animales, hace que dicha mezcla
sea, además de heterogénea, irreproducible.
La tboría de la selección clonal, presentada
por Burnet en 1959, propone que cada célula
produce sólo un anticuerpo en respuesta a su
estimulación, teoría en la que subyace, por lo
tanto, la idea de monoelonalidad. Esta idea per­
mitió com prender la naturaleza del m ielom a
múltiple, enfermedad debida a la proliferación
de un clon celular en el que todas las células
producen la misma inmunoglobulina. La para-
proteína del suero de pacientes de esta enfer­
medad fue la primera fuente de inmunoglobuli­
nas monoclonales.
En 1972, Potter pudo inducir la formación
de mielomas en ratones, lo que permitió dispo­
37
ner de líneas celulares productoras de anticuer­
pos químicamente homogéneos, algunos de los
cuales reaccionan con antígenos ambientales.
Los mielomas inducidos pueden ser transplan­
tados in vivo y adaptados a crecer in vitro. Sin
embargo, y lamentablemente, en general no es
posible la inducción de mielomas antígeno-es-
pecíficos.
A lgunos investigadores intentaron obtener
anticuerpos homogéneos mediante la transfor­
mación de linfocitos B con virus tales com o
Epstein-Barr, SV40 y Moloney, lo que perm i­
tió el establecimiento de algunas líneas produc­
toras de anticuerpos específicos que, sin em ­
bargo, secretan muy pequeñas cantidades de
anticuerpo.
Se intentó también la inmortalización y el
clonado de células productoras de anticuerpos
mediante la proliferación in vivo. La técnica
desarrollada por Askonas y W illiamson co n ­
siste en obtener trozos de bazo de animales in ­
munizados que contengan en promedio una so­
la célula productora de anticuerpos contra el
antígeno inmunizante; cada uno de esos trozos
es luego transferido a un huésped irradiado
conjuntamente eon el antígeno; tras sucesivos
pasajes se va enriqueciendo el nuevo huésped
con el clon elegido y se logran preparaciones
monoclonales. Sin embargo, no ha sido p o si­
ble una verdadera inmortalización con ese m é­
todo.
Está claro, entonces, que para disponer de
una solución que contenga un solo anticuerpo,
y siempre el mismo, es necesario lograr la p ro ­
liferación de una sola célula productora de a n ti­
cuerpos.
La m ejor manera de hacerlo es fusionar la
célula productora de anticuerpos específicos
para ef antígeno deseado con una célula que
780 Metodologías
sonda el gen C-alfa: un resultado negativo no
excluye reordenamientos.
IN T E PR E T A C IO N
D E LOS RESULTADOS
En las leucemias agudas de linaje B inmadu­
ro, las LLA nulas (CD19+ HLA-DR+, TdT+)
pueden exhibir sus genes de cadenas pesadas
de Igs en configuración germinal o reordena­
dos. En las LLA comunes (CD10+), todos los
casos poseen los genes de cadena pesada reor­
denados, mientras que alrededor de un 40% ex­
hibe reordenados los genes de cadena liviana.
Hasta un 20% de las LLA comunes pueden po­
seer reordenados los genes T,B. Las células B
de patologías de estirpes más maduras (LLA-B,
linfomas, tricoleucemias, mielomas), exhiben
siempre reordenados o delecionados los genes
de cadena pesada y liviana de Igs y raenos del
10% de los casos muestran T-beta reordenados.
Por otra parte, las ¡eucemias T agudas po­
seen células que han reordenado genes T-beta y
T-gama, y sólo las de extirpe más madura reor-
denan y expresan T-alfa. Hasta un 10% de los
casos pueden exhibir, además, reordenados los
genes C-mu, aunque en ningún caso se ha ob­
servado reordenamiento de genes de cadena h-
viana de inmunoglobulinas. En muy raras oca­
siones se han observado reordenam ientos en
células de estirpe mieloide. Se desconoce el
significado de los reordenamientos genéticos
fuera de linaje; si pueden ocurrir en células
normales o si constituyen aberraciones caracte­
rísticas de células leucémicas. A pesar de esto,
la determinación de reordenamientos genéticos
constituye una metodología de estudio comple­
m entaria para el diagnóstico en estas patolo­
gías.
B IB L IO G R A FÍA
W K n a p p , H S tro b e , O M a jd ic . F lo w c y to m e tric a n a ly s is
o f ceJI s u rt'a c e a n d i n tr a c e l lu l a r a n tig e n s in le u líe m ia
d ia g n o s is . C y to n ie try 18: 1 8 7 -1 9 8 , 1994.
R V e n d itti y c o l. M in im a lly d iff e re n tia te d a c u te m y e lo id
le u k e m ia (AM L-M O)-. c y to c h e m ic a l, im m u n o p h e n o ty p ic
a n d c y to g e n e tic a n a ly s is o f 19 c a se s. B ritish J H e m a to -
lo g y 8 8 : 7 8 4 -7 9 3 , 1994
A M a c e d o y co l. C a ra c te riz a c ió n fe n o típ ic a d e la d ife r e n ­
c ia c ió n m ie lo id e n o rm a l. S a n g re 39: 2 7 7 -2 8 2 , 1994.
D C a to v s k y , E M a tu te s . L a c la s ific a c ió n d e la l e u c e m ia
a g u d a . R e v is ta L a tin o a m e r ic a n a d e la E u ro p e a n S c h o o l
o f O n c o lo g y . S u p p l. 2; K > 2 1 , 1993.
G D ig u ie ro , a n d th e F re n c h c o o p e ra tiv e g ro u p o n C L L . B -
cell c h ro n ic ly m p h o c y tic le u k e m ia : p re s e n t s ta tu s a n d fu -
tu re d ire c tio n s . B lo o d 78: 1 9 0 1 -1 9 1 4 , 1991.
G B F o g h e t. C h ro n ic ly m p h o c y tic le u k e m ia : a n u p d a te d re-
v iew . J. C lin . O n c o l. 12: 1 9 7 4 -1 9 9 0 , 1994.
L W D ia m o n d y co l. A k n o w le d g e b a s e d sy ste m fo r th e in -
te r p r e t a ti o n o f f lo w c y to m e tr y d a ta in l e u k e m ia s a n d
ly m p h o m a s. C y to m e try 17: 2 6 6 -2 7 3 , 1994.
Hibridomas y anticuerpos
monoclonales
FERNANDO ALBERTO GOLDBAUM
CARLOS ALBERTO FOSSATI
HIBRIDOMAS Y ANTICUERPOS
M O N O C LO N A LES
Consideraciones generales
Ante el estímulo con un inraunógeno, un ani­
mal responde produciendo una gran variedad de
anticuerpos dirigidos contra diferentes compo­
nentes del antígeno inoculado (polipéptidos, po­
lisacáridos, etc.) y contra los distintos determi­
nantes antigénicos (epitopes) de cada uno de
esos componentes. Cada determinante antigéni­
co, a su vez, podrá ser reconocido por más de
un anticuerpo, con diferentes afinidades.
El conjunto de los anticuerpos producidos,
secretados hacia el suero del animal inmuniza­
do, constituye el antisuero. Un antisuero es,
pues, una mezcla heterogénea de anticuerpos
capaces de reaccionar con el antígeno.
Dada la naturaleza dinámica del sistema in­
mune, la composición del antisuero está some­
tida a un cambio continuo en el animal inmuni­
zado, lo cual sumado a las diferencias indivi­
duales entre animales, hace que dicha mezcla
sea, además de heterogénea, irreproducible.
La téoría de la selección elonal, presentada
por Burnet en 1959, propone que cada célula
produce sólo un anticuerpo en respuesta a su
estimulación, teoría en la que subyace, por lo
tanto, la idea de monoclonalidad. Esta idea per­
mitió com prender la naturaleza del m ielom a
múltiple, enfermedad debida a la proliferación
de un clon celular en el que todas las células
producen la misma inmunoglobulina. La para-
proteína del suero de pacientes de esta enfer­
medad fue la primera fuente de inmunoglobuli­
nas monoclonales.
En 1972, Potter pudo inducir la formación
de mielomas en ratones, lo que permitió dispo­
37
ner de líneas celulares productoras de anticuer­
pos químicamente homogéneos, algunos de los
cuales reaccionan con antígenos ambientales.
Los mielomas inducidos pueden ser transplan­
tados in vivo y adaptados a crecer in vitro. Sin
embargo, y lamentablemente, en general no es
posible la inducción de mielomas antígeno-es-
pecíficos.
A lgunos investigadores intentaron obtener
anticuerpos homogéneos mediante la transfor­
mación de linfocitos B con virus tales com o
Epstein-Barr, SV40 y Moloney, lo que perm i­
tió el establecimiento de algunas líneas produc­
toras de anticuerpos específicos que, sin em ­
bargo, secretan muy pequeñas cantidades de
anticuerpo.
Se intentó también la inmortalización y el
clonado de células productoras de anticuerpos
mediante la proliferación in vivo. La técnica
desarrollada por Askonas y W illiamson co n ­
siste en obtener trozos de bazo de animales in ­
munizados que contengan en promedio una so­
la célula productora de anticuerpos contra el
antígeno inmunizante; cada uno de esos trozos
es luego transferido a un huésped irradiado
conjuntamente con el antígeno; tras sucesivos
pasajes se va enriqueciendo el nuevo huésped
con el clon elegido y se logran preparaciones
monoclonales. Sin embargo, no ha sido p o si­
ble una verdadera inmortalización con ese m é­
todo.
Está claro, entonces, que para disponer de
una solución que contenga un solo anticuerpo,
y siempre el mismo, es necesario lograr la p ro ­
liferación de una sola célula productora de anti­
cuerpos.
La m ejor manera de hacerlo es fusionar la
célula productora de anticuerpos específicos
para e í antígeno deseado con una célula que
782 Metodologías
posea ilimitada capacidad de división; de este
modo la célula fusionada será capaz de vivir en
cultivo, dividirse y producir anticuerpos. El
aislamiento y la expansión de uno de tales clo­
nes celulares, en el que todas las células produ­
cen el mismo anticuerpo, constituye una fuente
inm ortal de inm unoglobulinas quím icam ente
homogéneas denominadas “anticuerpos mono­
clonales” (AcMo) (fig. 37-1).
En 1975, Kóhíer y Milstein desarrollaron la
técnica de hibridización de células somáticas
(hibridomas), que permite el establecimiento y
la inm ortalización de células productoras de
anticuerpos monoclonales. Por el desarrollo de
esta metodología, en 1984 les fue otorgado el
premio Nobel de Medicina.
Teoría y aspectos generales
de la producción de hibridomas
La fusión entre células somáticas fue obser­
vada por primera vez hacia fines del siglo pasa­
do, y el primer aislamiento de una célula somá­
tica híbrida se produjo a principios de la déca­
da de 1960. El desarrollo de medios selectivos
por Littiefieid y el uso de nuevos agentes de fu­
sión aumentaron la frecuencia de formación de
híbrido y facilitaron su producción.
El origen de los hibridomas productores de
anticuerpos se remonta a los intentos realizados
para estudiar la expresión genética y la regula­
ción de la producción de inmunoglobulinas en
células de mieloma, lo que permitió la realiza­
ción de im portantes observ acio n es para el
afianzamiento de esta metodología, entre ellas:
a) el híbrido celular no presenta exclusión alé-
lica, o sea que la fusión de células productoras
de anticuerpos lleva a la expresión de ambas
inmunoglobuhnas parentales, lo que conduce a
la formación de moléculas híbridas por asocia­
ción al azar de las cadenas pesadas entre sí y de
éstas con las livianas; b) no se producen nue­
vas cadenas de inmunoglobulinas, lo que sugi­
rió estabilidad en la expresión de inm unoglo­
bulinas y control independiente de la expresión
de los genes de ambas células parentales y c)
una variante de mieloma que no expresa cade­
nas livianas ni pesadas no suprime en el híbri­
do la producción de la inmunoglobulina codifi­
cada por la otra célula parental.
Esta clase de trabajos culminaron con los ex­
perimentos de Kohler y Milstein, quienes fue­
ron capaces de fusionar células normales de ba­
zo de ratones inm unizados con eritrocitos de
carnero, con una línea de mieloma y pudieron
aislar un híbrido celular secretor de anticuerpos
específicos para el antígeno inmunizante. Ese
hibridoma crecía continuamente in vitro y se­
cretaba grandes cantidades de anticuerpo quí­
micamente homogéneo al medio de cultivo o al
suero, y/o ascitis cuando crecía in vivo como
tumor trasplantado.
Célula de mieloma y método de selección
La célula parental responsable de la prolife­
ración del hibridoma es de una línea de mielo­
ma. Son células aneuploides, capaces de vivir y
chvidirse in vitro y fueron seleccionadas por ser
defectivas en la enzima hipoxantil-guanil-fos-
forribosil-transferasa (HGPRT); defecto enzi­
mático necesario para la selección post-fusio-
nal. La HGPRTasa es una enzima que utiliza
guanina o hipoxantina para producir purinas, lo
que permite la reutilización de las bases cuando
la síntesis de novo se ve interrum pida, por
ejemplo, por antagonistas del ácido fólico -c o ­
mo la aminopterina-, que bloquean la síntesis
de purinas y de timidina. La adición de timidi­
na (T) al medio le permite a la célula sintetizar
TMP (timidina monofosfato) vía timidina qui-
nasa (TK), pero al no poder sintetizar bases pú-
ricas la célula muere aun en presencia de del
precursor hipoxantina (H). (fig. 37-2).
El medio selectivo (HAT) consiste en enri­
quecer el medio de cultivo celular con hipoxan­
tina y timidina, con el agregado de aminopteri-
na (A) como inhibidor de la síntesis de novo.
En presencia de aminopterina sólo podrán so­
brevivir aquellas células que expresan HGPRT,
como los hibridomas. Las de mieloma morirán
y las de bazo no desarrollan en cultivo.
La selecció n de m u lan tes d e fe ctiv o s en
HGPRT involucra mutagénesis de la línea ce­
lular por exposición a un agente tóxico análogo
a la base normal (8-azoguanina para HGPRT o
bromodeoxiuridina para TK), y posterior clo­
nado de las poblaciones seleccionadas.
Células seleccionadas de esta forma podrían
eventualmente revertir y reexpresar la enzima,
por lo que es aconsejable desarrollar el mielo­
ma en presencia del análogo tóxico o controlar
periódicamente que las células mueran en pre­
sencia de HAT.
Algunas de las líneas de mieloma habitual-
mente utilizadas en la producción de hibrido-
mas producen y secretan cadenas de inmuno-
globulinas.
En la célula híbrida se coexpresan las cade­
nas codificadas por cada célula parental. Dos
cadenas pesadas se combinan con dos cadenas
livianas para formar las diferentes inmunoglo­
bulinas; esta asociación no es enteramente al
azar puesto que la asociación homologa es más
frecuente que la heteróloga y no se detectan
asociaciones entre cadenas de distinto isotipo
(fig. 37-3).
La fusión de células somáticas conduce a la
formación de un híbrido celular (heterocarion).
Inicialmente, el heterocarion es una célula muí-
 Hibrídomas y anticuerpos monoclonales
tinucleada (2 a 5 núcleos separados). Posterior­
mente, durante la división celular, se desintegra
la membrana nuclear y se forma un solo núcleo
que contiene los cromosomas de ambas células
parentales. En este estadio las células son ines­
tables y a medida que se dividen pierden algu­
nos cromosomas de una o ambas células origi­
nales, hasta que se logra la estabilidad celular.
O casionalm ente la p érd id a de crom osom as
puede incluir algún cromosoma esencial para la
vida de la célula y conducirla a la muerte. Por
otro lado, esta pérdida puede conducir a que un
h ib rid o m a que o rig in alm e n te expresa, p o r
ejemplo, cuatro cadenas diferentes, deje de ex­
presar alguna de ellas y, eventualmente, pierda
la expresión de todas las cadenas. La pérdida
afecta principalm ente a los cromosomas que
codifican para cadenas pesadas (fig. 37-4).
En virtud de lo precedentemente detallado,
queda claro que lo más conveniente es utilizar
para la fusión, células de una línea de mieloma
no productor de cadenas de inmunoglobulinas.
En estas condiciones, los hibrídomas sólo po­
drán producir la inm unoglobulina codificada
por el linfocito B fusionado. Actualmente las
líneas no secretoras, por ejemplo la NSO, son
las más utilizadas para la producción de hibri-
domas murinos.
Inmunización
Se han probado muchos esquemas de inm u­
nización y diferentes protocolos mostraron ser
mejores para algunos antígenos que para otros.
En general, para los inmunógenos buenos prác­
ticamente cualquier protocolo induce una ade­
cuada generación de anticuerpos y, en definiti­
va, de anticuerpos monoclonales útiles. Dado
que la frecuencia de hibrídomas de la especifi­
cidad deseada está aproximadamente relaciona­
da al número de células productoras de anti­
cuerpos en el momento de la fusión, los inm u­
nógenos débiles no serán buenos generadores
de anticuerpos monoclonales. Una manera bas­
tante efectiva de aumentar la inmunogenicidad
de esos antígenos, es conjugarlos a proteínas
portadoras muy inmunogénicas (p.ej., KLH).
Un protocolo simple y generalmente efectivo
es inocular intraperitonealmente 50-100 (ig de
antígeno soluble en adjuvante de Freund com ­
pleto, determinar el título de anticuerpos 4 se­
manas después, dejar bajar el nivel de anticuer­
pos y reestim ular periódicam ente, finalmente
inocular unos 50 ^g de antígeno en solución fi­
siológica por vía intravenosa 3 días antes de la
fusión. Cuando se dispone de muy bajas canti­
dades de antígenos particulados se puede recu­
rrir a la inoculación intraesplénica, la que tam ­
bién da buenos resultados con antígenos solu­
bles. Existen, además, métodos de inm uniza­
783
ción in vitro que han resultado efectivos para la
producción de anticuerpos monoclonales.
Fusión
Se puede aseverar que desde la descripción
de K ohler y M ilstein, quienes usaron v iru s
Sendai com o fusógeno, no se han producido
modificaciones sustanciales al protocolo origi­
nal de fusión. En la actualidad, la mayoría de
los laboratorios utilizan polientilenglicol (PEG)
como agente fusionante.
La fusión es realizada 3 o 4 días después de
la última inoculación del antígeno, momento de
máxima presencia de blastos en el bazo. El ren ­
dimiento habitual es de 2.000 a 5.000 híbridos
por cada 10* células de bazo.
Si bien no se conoce con exactitud el m eca­
nismo de acción del PEG, se ha verificado la
necesidad del contacto celular directo entre las
células a fusionar donde el PEG parece prom o­
ver su unión. Algunos autores sugieren que las
impurezas del PEG son los verdaderos estim u­
ladores de la fusión. La máxima frecuencia se
logra con PEG al 40-50% (peso/vol); a e sta
concentración no se puede detectar agua física­
mente libre en el medio. El agua físicamente li­
bre disminuye a medida que aumenta la c o n ­
centración de PEG, lo que también aumenta la
osmolaridad, inconveniente que puede ser re ­
vertido por el agregado de dim etilsulfóxido
(DMSO). Sin embargo el DM SO aumenta la
frecuencia de fusión de tres células o más, d is­
minuyendo la eficiencia de producción de hi-
bridomas viables.
Las células blastoides -e n activa división-,
son las que fusionan más eficientemente. L a
mayor eficiencia parece ser debida a la expre­
sión de ciertas características p osfusionales
más que a una mayor frecuencia de fusión. Si
la célula que fusiona no se encuentra en estado
blastoide su núcleo no estará en división m itó-
tica al mismo tiempo que el núcleo de la célula
mielomatosa, y resultará en una población que
contendrá un núcleo extra, silencioso. La fu ­
sión correcta será aquella producida entre una
célula linfoide y una de mieloma. Aun así los
núcleos podrán dividirse asincrónicam ente y
dar lugar a poblaciones celulares abortivas.
La fusión del mieloma con otros tipos celu ­
lares no B no dan lugar, en las condiciones h a ­
bituales de producción de AcMo, a la form a­
ción de hibrídomas.
Cultivo de hibrídom as
En el cultivo de hibrídomas la calidad de los
componentes del medio de cultivo debe ser óp­
tima, para favorecer la división celular y la p ro ­
ducción- y secreción de anticuerpos.
784 Metodologías

Anti-1

Syero

1 2 3

I Antígeno I

PEG

Células de
é mieloma
(HGPRT)

F ig . 3 7 -1 . A n tic u e rp o s m o n o c lo n a le s y a n tis u e ro s c o n v e n c io n a le s

El crecimiento celular está muy influido por
la concentración de células presentes en el cul­
tivo; fuera de ciertos valores el crecim iento
puede verse interrumpido. El límite inferior de
concentración de células com patible con un
buen crecimiento celular puede establecerse en
aproximadamente 10'* cel • m f ’, y el superior
en 10®, límites que son aplicables a la mayoría
de las líneas celulares. Uno de los elementos
involucrados en el establecimiento de un límite

F ig. 37-2. M etabolism o de bases púricas. H G PRT: hipoxantil guanil fosforibosil transferasa.
 Hibridomas y anticuerpos monoclonales 785

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Fig. 37-3. D ia g ra m a d e s e g re g a c ió n d e c a d e n a s de in m u n o g lo b u lin a s. H y M, ca d e n a s p e s a d a s y K y L, c a d en a s liv ia n a s
d e las in m u n o g lo b u lin a s d e l e s p le n o c ito y d e la c é lu la s d e m ie lo m a , re s p e c tiv a m e n te .

• •

F ig. 37-4. D ivisiones m itóticas posfusionales. El esquem a incluye sólo algunas de las posibles divisiones incorrectas.
786 Metodologías
superior es la competencia por los nutrientes.
En el inferior se destaca la necesidad de deter­
m inada cantidad de factores de crecim iento
producidos por células en división, tales como
monoquinas, linfoquinas, interleuquinas e in ­
termediarios mctabólicos.
Algunos autores utilizan células alimentado-
ras para m ejorar las condiciones de cultivo,
esas células, tales como macrófagos, timocitos
o célula de bazo irradiadas, son de escaso cre­
cimiento pero proveen nutrientes y factores que
enriquecen el medio, permitiendo así el mante­
nimiento y crecimiento de células en baja con­
centración.
Otra manera de sostener el crecimiento celu­
lar en esas condiciones es agregar al cultivo un
medio “ gastado” proveniente del cultivo en
crecimiento exponencial de células no secreto­
ras de anticuerpos.
Otro componente fundamental en el cultivo
de hibridomas es la calidad del suero bovino
fetal utilizado. En la actualidad se dispone de
medios que no requieren el agregado de suero,
especialmente formulados para facilitar la puri­
ficación de los AcMo.
La mayoría de los hibridomas se dividen ca­
da 8-12 horas; de este modo, los lím ites de
crecimiento celular antes mencionados adm i­
ten un incremento de 100 veces en la concen­
tración celular, lo que permite el cultivo por 2
a 4 días sin necesidad de efectuar cambios de
medio.
Monitoreo de la producción de anticuerpos
monoclonales
La detección de anticuerpos específicos en el
medio de cultivo donde crecen los hibridomas
es uno de los puntos críticos, si no el más im ­
portante, en la estrategia de producción de anti­
cuerpos monoclonales.
Las técnicas a utilizar deben ser de alta sen­
sibilidad como para detectar ¡.tg mi"', ser rápi­
das para evitar la atención de cultivos inútiles y
deberían, además, brindar información acerca
de la utilidad del anticuerpo con respecto a los
fines para los cuales se los produce.
En ese sentido los métodos más usuales y
útiles son, en términos generales, los radioin-
munométricos y enzimoinmunométricos, aglu­
tinación pasiva e inmunofluorescencia, los que
son descritos en detalle en otros capítulos de
este libro.
C lonado
En los cultivos en que se detectan anticuer­
pos contra el antígeno de trabajo, pueden coe­
xistir varios hibridomas. Uno o más de ellos se­
rán productores de anticuerpos de interés mien­
tras que otros podrán secretar anticuerpos irre­
levantes para el sistema, o ser no secretores de'
anticuerpos. Puede, entonces, tratarse de un
cultivo policlonal, por lo que resulta indispen­
sable proceder a su clonado.
El clonado debe realizarse tan pronto como
sea posible para evitar que los otros hibrido­
mas, o variantes del que se pretende establecer,
crezcan más rápido y eliminen a los producto­
res de anticuerpos deseadas.
Para ello se puede recurrir básicamente a dos
métodos: clonado en agar blando o dilución en
medio líquido.
El primero consiste en cultivar,sobre agar se-
misólido células aisladas, las que al crecer da­
rán origen a una colonia donde todas las célu­
las derivan de una misma célula aticestral. Las
colonias pueden ser individualmente repicadas
a medio líquido y allí expandidas.
El segundo se fundamenta en la realización
de diluciones de la población original, de ma­
nera de obtener, con una cierta probabilidad es­
tadística, cultivos que contengan una sola célu­
la, que al crecer dará origen al clon correspon­
diente.
Algunas células del clon podrían perder un
cromosoma o más, pero permanecer viables y
continuar dividiéndose, con lo cual el cultivo
se transformaría en biclonal o aun multiclonal.
La pérdida de producción de anticuerpos de
una línea originalmente buena productora sue­
le deberse a biclonalidad con una no produc­
tora.
En la figura 37-5 puede observarse un esque­
ma de la metodología para la obtención de hi­
bridomas.
Producción de AcMo
L a p roducción de grandes can tid ad es de
AcMo se puede realizar tanto in vivo como in
vitro.
tn vivo, como ya se mencionó, se aprovecha
la propiedad tumoral del hibiridoma para culti­
varlo en un huésped adecuado (habitualmente
isogénico con la línea celular); esto posibilita la
obtención de cantidades im portantes de anti­
cuerpo (1-15 mg ml-1), a partir del líquido as-
cítico o del suero del animal portador del tu­
mor.
In vitro, los anticuerpos son obtenidos del
sobrenadante de los cultivos, lo que permite la
producción del anticuerpo monoclonal relativa­
mente diluido (0,01-0,5 mg m f')- Si bien los
métodos de producción escapan a los alcances
de este libro, se mencionan a continuación los
más comúnm ente usados: en la producción a
escala de laboratorio se utilizan sistemas esta­
cionarios o rotativos (roller)-, a escala de labo­
ratorio e industrial existen numerosos métodos
 Hibrídomas y anticuerpos monocionaies
y sistemas tales como crecimiento de células en
suspensión, matrices fluidizadas, reactores de
fermentación, cultivo sobre microcarriers; asi­
mismo, pueden cultivarse células m antenidas
en sistemas de membranas, holíow fibers, o en
matrices cerámicas.
Purificación de AcMo
Sea cual fuere el sistema de producción utili­
zado, el AcM o se obtiene contam inado con
otras proteínas y componentes del m edio de
cultivo o de los fluidos biológicos. En algunas
aplicaciones, la purificación de los anticuerpos
se hace indispensable.
Los dos factores fundamentales en la elec­
ción del método de purificación son: el uso al
cual el anticuerpo está destinado y la fuente de
obtención del mismo.
El objetivo del esquema metodológico elegi­
do es purificar o concentrar la especie molecu­
lar en consideración, a un grado tal que se
mantengan en la preparación final, las propie­
dades o actividades deseadas mientras se elimi­
nan los contaminantes indeseables.
En términos generales, el esquema de purifi­
cación de anticuerpos monoclonales involucra
tres pasos:
1. Preparación de la muestra. El método que se
aplique en este paso debe ser com patible
con los aplicables al paso siguiente. Las téc­
nicas más utilizadas incluyen precipitación
salina, clarificación e intercambio de buffer
de trabajo (diálisis).
2. P urificación principal. Los m étodos más
aplicados son los de cromatografía de afini­
dad y cromatografía de intercambio iónico.
3. Purificación posterior. Suele aplicarse para
elim inar im purezas menores y preparar la
muestra para su almacenamiento. Las más
frecuentemente usadas son filtración en gel,
crom atoenfocado y cromatografía de inte­
racción hidrofóbica.
Cabe destacarse que, si bien el esquema an­
terior es de aplicación general, se puede lograr
la purificación de un anticuerpo m onoclonal
en un solo paso. En nuestra experiencia, la
precipitación salina con SO^(NH4)2, seguida
por cromatografía de intercambio iónico (espe­
cialmente por EPLC), ha resultado de gran uti­
lidad para obtener preparaciones de alta pure­
za. Por otra parte, hem os logrado p u rifica r
ÍgG 1 a partir de líquido ascítico en un solo pa­
so de purificación mediante cromatoenfocado
y de lgG3 por precipitación en buffer de baja
fuerza iónica.
La metodología antes mencionada está deta­
llada en otros capítulos de este libro.
787
Diferencias entre anticuerpos m onoclonales
y policlonales
Las principales diferencias entre los anti­
cuerpos monoclonales y los antisueros (anti­
cuerpos policlonales) derivan, básicamente, de
que los primeros, por ser químicamente homo­
géneos, poseen las propiedades individuales de
la proteína anticuerpo que lo compone, mien­
tras que el antisuero tiene propiedades que son
promedio entre las de sus componentes.
La estabilidad podría constituir una desven­
taja para los AcMo, ya que algunos de ellos se
inactivan rápidamente a temperatura ambiente
o no resisten la descongelación o liofilización.
También los hay sensibles a ciertos pH extre­
mos y otros que pueden perder integridad o
reactividad al ser marcados enzimática o isotó­
picamente.
Sin embargo, estos inconvenientes no son tan
frecuentes y pueden, además, ser salvados fácil­
mente mediante un análisis que permita detectar
aquellos AcMo que cumplen con las condicio­
nes predeterminadas para su utilización.
El anti suero, en cambio, no se ve afectado en
el campo de la estabilidad, ya que como conse­
cuencia de su heterogeneidad sólo una pequeña
proporción de sus componentes podrá ser sen­
sible a un tratamiento dado, lo que mayormente
no incidirá en sus propiedades promedio.
La avidez de un antisuero es otra propiedad
promedio entre la de todos los anticuerpos que
la componen. Es suficiente que un porcentaje
muy pequeño de los anticuerpos presentes sea
de alta afinidad o avidez para que el conjunto
se comporte de esa forma. Los anticuerpos mo­
noclonales, en cambio, responderán a las carac­
terísticas fisicoquím icas de su único com po­
nente, el que poseerá, o no, las propiedades que
de él se necesitan. Aquí, nuevamente un buen
m étodo de selección perm itirá es aislamiento
de los AcMo deseados.
Reactividad secundaría. En general, los Ac­
Mo no pueden ser utilizados para técnicas de
precipitación puesto que no pueden formarse
complejos precipitantes cuando se utilizan anti­
cuerpos homogéneos con antígenos m onova­
lentes o bivalentes.
En cambio, los anticuerpos monoclonales sí
producen complejos precipitantes cuando reac­
cionan con antígenos con epitopes repetitivos.
Los anticuerpos antihapteno dan reacciones de
p recip itació n aJ reaccio n ar con conjugados
hapteno-proteína debido al carácter multiepitó-
pico de las proteínas conjugadas. Puede tam­
bién lograrse la precipitación mediante mezclas
de dos AcMo dirigidos contra determinantes
antigénicos ubicados en diferentes cadenas de
un a.ntígeno o aun contra epitopes diferentes de
una misma cadena.
788 Metodologías

CéiiilBíi de bazo Culi¥0 cátalas

ratón Ifimunlzado fiilei«Ra(HQPRT|-

Fusión
I
Selección en HAT

Ensayot de
i l anticuerpos
I
Cultivos positivos

Clonado

Congelación
I
■#♦■ C lo n » positivos

Reclonado
I
eterización de clones
y selección de variantes
I
Producción
Fig. 3 7 -5 . E s q u e m a e x p e rim e n ta l d e la o b te n c ió n d e h ib rid o m a s .

Especificidad. Todas las moléculas de una
población de anticuerpos monoclonales tienen
la misma especificidad debido a que poseen la
misma región variable. Esta uniformidad ofre­
ce la ventaja de que no existirán diferencias de
especificidad entre las distintas partidas de Ac-
Mo, como sucede con los antisueros conven­
cionales.
La gran homogeneidad de estos anticuerpos
permite análisis que no son posibles con anti­
sueros debido a las reacciones cruzadas que es­
tos presentan.
Los AcMo pueden exhibir reactividad cruza­
da, la que en ese caso, es característica de todas
las moléculas y por ende no puede ser elimina­
da por adsorción sin eliminar toda la actividad
anticuerpo. La reactividad cruzada de los A c­
Mo puede deberse a reacciones con un mismo
determinante antigénico sobre diferentes molé­
culas; a reactividad con estructuras quím ica­
mente relacionadas; a reacción con moléculas
evolutivamente relacionadas o a estructuras no
relacionadas que incidentalm ente posean es­
tructuras parecidas. En el caso de mezclas de
AcMo pueden darse efectos sinérgicos que mo­
difiquen su reactividad.
A plicaciones
La homogeneidad y monoespecificidad de los
anticuerpos monoclonales los convierte en reac­
tivos y herramientas de elección para una gran
variedad de propósitos, tanto para su uso in vitro
como in vivo, especialmente en el campo de los
productos terapéuticos y de diagnóstico.
Veamos algunas pocas de las áreas donde la
aplicación de anticuerpos monoclonales ha sido
y es de fundamental importancia.
Purificación de proteínas
Se pueden producir anticuerpos monoclona­
les contra componentes minoritarios de m ez­
clas complejas de proteínas con sólo disponer
de un método de “screening” que permita de­
tectar anticuerpos contra el antígeno deseado,
seleccionarlo y producirlo para su utilización
en procedimientos de purificación, por ejem ­
plo, cromatografía de afinidad. De esta forma
se puede reducir a un paso la purificación de
componentes que, de otra forma, requerían va­
rios pasos de cromatografía, frecuentemente de
bajo rendimiento.
Ideiitificación y aislamiento de células,
subpoblaciones y clones celulares
Es posible obtener anticuerpos monoclona­
les contra antígenos de membrana que repre­
senten a determinadas poblaciones o estadios
de diferenciación celular que permitan su iden­
tific ac ió n , por ejem p lo , lin fo c ito s CD4+ o
CD8+. También es posible detectar proteínas
de membrana exclusivas de ciertos clones de
 Hibridomas y anticuerpos monoclonales
linfocitos. Esos anticuerpos, denominados an­
ticuerpos clonotípicos han resuhado de gran
importancia en la identificación y caracteriza­
ción de células T.
Detección de tumores
La producción de anticuerpos monoclonales
contra proteínas presentes en membrana de cé­
lulas tumorales pero ausentes (o expresadas en
muy baja densidad) en células normales, p er­
mite su utilización para detectar la presencia de
esas células en un tejido u órgano o para elimi­
narlas.
El uso de AcMo para la detección de tum o­
res presenta un inmenso potencial. En efecto, la
presencia desde ciertos antígenos serviría para
el diagnóstico temprano. Por otra parte, anti­
cuerpos marcados con radioligandos han sido
empleados para localizar tuinores primarios o
focos metastásicos en los pacientes mediante
técnica de imágenes (“scanning”) de radioisó­
topos o por resonancia magnética nuclear.
Pueden también, provocar específicamente
la muerte de células tumorales, de forma direc­
ta por lisis mediada por complemento o hacerlo
por medio de conjugación a una toxina letal o
un radioisótopo adecuado para transformar el
anticuerpo en una Inmunotoxina. Se pueden
usar toxinas de diversos orígenes, tales como
Shigella, diftérica, colérica, ricina, etc. Estas
toxinas están formadas por 2 componentes po-
lipeptídicos, uno portador de la acción tóxica y
el otro responsable de unirse a receptores celu­
lares. El segundo resulta inofensivo en ausen­
cia del primero. La inmunotoxina se puede pre­
parar ligando la subunidad tóxica al anticuerpo
de manera de dirigir la toxicidad solamente ha­
cia la célula blanco.
Aplicaciones básicas
Sólo mediante la cristalización de AcMo y
de sus complejos inmunes, ha sido posible es­
tablecer con alta resolución la estructura tridi­
mensional del anticuerpo y los complejos y es­
tudiar las modificaciones estructurales causa­
das por mutaciones puntuales.
Resultaron fundamentales, también, en el es­
tudio de la diversidad de los anticuerpos. Así,
el análisis de la secuencia de las regiones varia­
bles de AcMo, expresadas contra un determina­
do antígeno en respuesta primaria y secundaria,
fue fundamental para comprender el fenómeno
de mutación somática y la “maduración” de la
respuesta inmune.
El estudio de anticuerpos monoclonales anti-
idiotípicos, permitió la “disección” de las re­
giones variables de esos anticuerpos y el estu­
dio de sus propiedades biológicas.
789
Anticuerpos catalíticos
La unión de un anticuerpo a su antígeno tie­
ne algunas características similares a la unión
de una enzima a su sustrato. Las interacciones
son no covalentes, de alta especificidad y fre­
cuentemente de alta afinidad.
El anticuerpo no altera al antígeno mientras
que la enzim a cataliza una m odificación del
sustrato, para ello la enzima utiliza la energía
de unión para estabilizar el estado de transición
del sustrato, reduciendo así la energía de acti­
vación para la m odificación del sustrato. La
unión del anticuerpo puede “congelar” los gra­
dos de libertad rotacional y translacional de un
sustrato, favoreciendo energéticamente la reac­
ción. De tal m anera, un anticuerpo dirig id o
contra un análogo estable de un componente de
transición de una determinada reacción quím i­
ca, podría actuar como enzima, catalizando la
reacción.
El descubrimiento de tales anticuerpos cata­
líticos abre un inmenso panorama de aplicacio­
nes. Los anticuerpos pueden ser “fabricados”
específicamente para determinada aplicación,
producidos a bajo costo y purificados fácilm en­
te. Además, se pueden obtener anticuerpos para
catalizar reacciones químicas para las cuales no
existen enzimas.
OTROS HIBRIDOMAS
Hibridomas híbridos (iiibridomas
biespecíficos) o heteroconjugados
Como ya vimos, si la célula de mieloma ex­
presa cadena liviana y pesada, el hibridom a
puede expresar esas cadenas junto con las del
esplenocito. Si el mieloma fusionante es a su
vez un hibridoma productor de un anticuerpo
de determinada especificidad, la célula híbrida
producida por fusión con un linfocito B podrá
fabricar moléculas que expresen en un F ab el
sitio de combinación del hibridoma parental y
en el otro brazo el sitio de combinación del an­
ticuerpo codificado por el linfocito B.
M ediante esta estrategia, Milstein y Cuello
fueron capaces de producir anticuerpos m ono­
clonales biespecíficos, dirigidos sim ultánea­
m ente contra peroxidasa y som astotatina, lo
que les permitió la realización de estudios in-
munohistoquímicos de detección tisular de la
hormona en un solo paso.
Uno de esos sistemas consiste en fusionar
células parentales deficientes en HGPRT, pero
que expresan TK, con otras defectivas en TK
pero que expresan HGPRT,, o a la fusión de cé­
lulas sensibles a HAT pero resistentes a uabaí-
na, coñ otras resistentes a HAT y sensibles a
790 Metodologías
uabaína. En ambos casos las células híbridas
serán capaces de crecer en medio HAT mien­
tras que las parentales no podrán hacerlo.
Hibridomas “humanos”
El uso de los Ac Mo en la terapéutica huma­
na es uno de los campos de aplicación clínica
más importantes en medicina.
La inyección de anticuerpos monoclonales
murinos con fines terapéuticos en hum anos,
provoca la formación de anticuerpos humanos
anti-anticuerpos de ratón (HAMA). Esta res­
puesta conduce a una disminución de la efecti­
vidad del tratamiento con las sucesivas inocu­
laciones, debido a un aumento en la velocidad
de clearence del agente terapéutico y al blo­
queo de la unión del anticuerpo a su antígeno.
También puede generar reacciones de hipersen-
sibiUdad.
Como consecuencia, la generación de anti­
cuerpos monoclonales humanos constituye un
campo'de gran interés. Por ello se han desarro­
llado diversas estrategias para la producción de
hibridomas humanos tales como: fusión de cé­
lulas humanas con mielomas de ratón; hibridi­
zación de células linfoides humanas con mielo-
mas humanos; transformación de linfocitos por
infección con virus de Epstein-B arr para in­
mortalizar células productoras de anticuerpos y
la producción de anticuerpos con característi­
cas humanas generados por manipulación ge­
nética por aplicación de técnicas de ingeniería
genética.
H eter ohibridomás
La primera de esas estrategias, hibridización
interespecies (heterohibridomas), resulta ser de
escasa utilidad debido a que habitualmente los
hibridomas son inestables y se produce una rá­
pida segregación de cromosomas con pérdida
preferencia! de cromosomas humanos. No obs­
tante se han descrito heterohibridomas estables.
Hibridomas humano-humano
La producción de este tipo de hibridom as
presenta importantes dificultades entre las que
se pueden destacar: a) las células B periféricas
humanas (únicas de fácil obtención) no son una
buena fuente de células productoras de anti­
cuerpos, por lo que se está trabajando intensa­
mente en el desarrollo de métodos de inmuni­
zación in vitro; b) la producción de células hu­
manas sensibilizadas para la fusión no pueden
ser, en muchos casos, obtenidas por inmuniza­
ción; c) las células de mieloma humano, en ge­
neral, no se adaptan fácilmente al cultivo in vi­
tro por largos períodos y continúan secretando
sus propios anticuerpos; d) la inducción de mu­
taciones para permitir la selección por HAT in­
crementa la inestabilidad de estas células y e)
los hibridomas suelen producir anticuerpos só­
lo en bajas cantidades.
Transformación por virus de Epstein-Barr
Los linfocitos B humanos pueden ser trans­
form ados con virus de E pstein-B arr (EVB).
Cuando los linfocitos son cultivados con el an­
tígeno en presencia de EVB, algunas de las cé­
lulas B adquieren la capacidad de crecimiento
inmortal mientras continúan produciendo el an­
ticuerpo deseado. Por clonado de estas células
transformadas es posible obtener anticuerpos
monoclonales humanos.
Frecuentemente las líneas celulares obteni­
das resultan ser pobres productoras de anticuer-
pos.
Anticuerpos quiméricos y “humanización”
de anticuerpos
Una estrategia alternativa consiste en elimi­
nar las regiones xenogeneicas del anticuerpo
monoclonal murino y reemplazarlas por estruc­
turas humanas. Combinando la tecnología de
AcMo con la ingeniería genética se ha logrado
introducir en inmunoglobulinas humanas Va re ­
gión variable de anticuerpos monoclonales es­
pecíficos derivados de ratón, para producir de
este modo anticuerpos “humanos” contra el an­
tígeno para el cual se inmunizó originalmente
el animal. Estos anticuerpos, denominados an­
ticuerpos quiméricos, están formados por los
dominios Vj^ y V^^ murinos insertados en genes
CH y CL humanos. Son mucho menos inmuno-
génicos en humanos que los anticuerpos muri­
nos a pesar de mantener su capacidad de gene­
rar respuesta anti idiotípica, respuesta que pue­
de evitarse o disminuirse utilizando, en las su­
cesivas inyecciones, anticuerpos quiméricos de
igual especificidad pero conteniendo diferentes
isotipos.
U na form a de lograr una “hum anización”
más completa de los anticuerpos murinos sería
in je rta r sólo las reg io n es determ inantes de
complementariedad (CDR) en anticuerpos hu­
manos. Por esta vía se ha logrado construir an­
ticuerpos contra una gran variedad de antíge­
nos potencialmente importantes en la salud hu­
mana.
Expresión recombinante de fragmentos
de inmunoglobulinas
La expresión recombinante surgió como una
estrategia alternativa para “inmortalizar” clones
específicos y producir in vitro grandes cantida­
 Hibrídomas y anticuerpos monoclonales
des de fragmentos de anticuerpos monoclona­
les. El huésped elegido para los primeros inten­
tos fue Escheríchia coli, dadas sus ventajas ta­
les como su rápido crecimiento y la disponibili­
dad de muchos y diferentes vectores para el
clonado y la posterior expresión. El crecimien­
to de E.coli es barato y puede ser realizado en
escala industrial con equipamiento mucho más
simple que el requerido para la fermentación de
células eucariontes. Además presenta la ventaja
de proveer una fácil ruta para la modificación
de los fragmentos por ingeniería genética.
La mayor dificultad encontrada en el desa­
rrollo de esta tecnología fue la utilización de
sistemas de secreción adecuados. Los primeros
intentos para producir fragmentos de inmuno-
globulinas como cuerpos de inclusión intrace­
lulares no fueron fructíferos, dado que los pro­
cedimientos de solubilización de los cuerpos de
inclusión, además de tediosos, producen una
importante pérdida de la actividad anticuerpo.
E sa d ific u lta d fu e so rte a d a a p a rtir del
informe, en 1988, del uso de vectores para la
secreción de estas proteínas dentro del espacio
periplásmico de la bacteria. Dicho ambiente es
favorable para el correcto plegamiento de do­
minios de inmunoglobulinas, dado su carácter
oxidante, que permite la formación del puente
disulfuro interno que es imprescindible para el
correcto plegam iento de los dominios v aria­
bles. Ello facilita la secreción del fragmento en
forma soluble, ya sea en el espacio periplásmi­
co de la bacteria o en el sobrenadante de culti­
vo. Este fenómeno se produce si las células son
inducidas por prolongados períodos, en dicho
caso la acumulación de proteína en el espacio
periplásmico junto con la lisis bacteriana pro­
ducen la salida parcial del fragmento al sobre­
nadante de cultivo.
De esta m anera fue posible expresar frag ­
mentos Fab, lo que se logró coexpresando bajo
la regulación del mismo promotor los fragmen­
tos CH,-Vjj de la cadena pesada y la cadena li­
viana en el espacio periplásmico de la bacteria.
El rendimiento de estos sistemas de expresión
va de 0.5 a 5 mg/litro de cultivo.
Paralelamente surgió la necesidad de produ­
cir fragmentos con actividad anticuerpo de m e­
nor tamaño, fundamentalmente, para mejorar la
penetrabilidad en los tejidos de fragmentos de
inm unoglobulinas potencialm ente utilizables
en tratamiento de tumores o en diagnóstico por
imágenes en diversas patologías, así como para
simplificar los estudios estructurales de la inte­
racción antígeno-anticuerpo. Ello motivó la ex­
presión de fragmentos E^, consistentes en hete-
rodímeros formados por los dominios V„ y V ,.
Dicho heterodímero tiene esencialmente igual
constante de afinidad por el antígeno corres­
pondiente que el anticuerpo del que proviene;
791
su PM es de aproxim adam ente 25 kD, y sus
componentes están asociados en forma no co­
valente.
La estabilidad del heterodím ero es p arcial­
mente dependiente de la secuencia aminoacídi­
ca de las regiones determ inantes de com ple-
mentariedad (CDRs), ya que estos aminoácidos
participan en contactos V h“^ l- Esto hace que
determinados fragmentos Fy sean muy poco es­
tables como dímeros, lo que se vuelve crítico a
bajas concentraciones. P ara solucionar este
problema se diseñó, basado en la estructura tri­
dimensional de varios Fabs y E^s, un péptido
de 15 aminoácidos de composición (Gly^Serjj
que actúa de puente entre el residuo carboxi-
terminal de VH y el residuo N-terminal de VL.
Dicho péptido cumple la función de unir cova-
lentemente los dos dominios sin alterar la es­
tructura del sitio de combinación. La estructura
resultante se denomina scF^ (Single chain o
Fy unicatenario), tiene alta estabilidad y con­
serva en general la afinidad por el antígeno,
aunque la flexibilidad que le confiere el p épti­
do de unión provoca que se produzcan fenóm e­
nos de dimerización o polimerización parcial.
Los fragmentos Fy y scFy son expresados de
igual manera que los fragmentos recombinan-
tes Fab, alcanzándose rendimientos que van de
0.5 a 10 mg/litro de cultivo, siendo menores en
el caso de scFVs. En todos los casos la purifi­
cación es realizada mediante cromatografía de
afinidad (fig. 37-6).
Amplificación de ADN de dominios
variables de inmunoglobulinas
L a reacc ió n en cad en a de la p o lim e ra sa
(PCR) (véase cap. 40) ha sido ampliamente u ti­
lizada para el clonado de los genes que codifi­
can para los fragmentos variables de inmuno-
globulinas. Esta técnica permite rápida y sim ­
plem ente amplificar varios millones de veces
esos genes mediante el uso de “primers dege­
nerados”.
Un primer (Pr.) degenerado implica que di­
ferentes nucleótidos pueden ser encontrados en
una posición particular en la secuencia del Pr.,
esto significa que el Pr. obtenido del sintetiza-
dor de ADN es en realidad una mezcla de va­
rios Prs., con diferencias en la secuencia oligo-
nucleotídica en una o más posiciones. E stos
Prs. son diseñados en base a secuencias conser­
vadas de los extremos amino y carboxi-termi-
na! de los fragmentos variables de las cadenas
pesada y liviana. En las posiciones donde no se
observa am inoácidos conservados estos Prs.
contienen secuencias degeneradas, las que son
obtenidas agregando en esas posiciones m ez­
clas de,las 4 bases nucleotídicas. Además estos
Prs. introducen en los extrem os de los frag-
792 Metodologías

H ibridom a o linfocito B

Purificación de AR N m

AAA A A

AR N m C adenas Pesada y Liviana

iAAAAA
T ra nscriptasa reversa

TT T T T

ADN catenario

Prim ers de
Inm unoglobulinas

V„ .élLm m CH, CH, CH, V, .M — C.

Jj^PCR

Tstf •AWiiTZi^'Ví-'y. •»

Vh V,

F ig . 3 7 -6 . E s q u e m a e x p e rim e n ta l d e la o b te n c ió n d e g e n e s q u e c o d ific a n p a ra lo s fra g m e n to s v a ria b le s d e in m u n o g lo b u ­

lin as.

mentos amplificados sitios de restricción espe- La amplificación puede realizarse a partir de

cíficos. Esos sitios son utilizados para el poste- ARN mensajero proveniente de un hibridoma
rior clonado de los fragm entos en diferentes secretor de un anticuerpo monoclonal. En di­
vectores mediante el uso de enzimas de restric- cho caso se conoce de antemano la especifici-
ción (fig. 37-7). dad del anticuerpo, y se lo clona para obtener
 Hibridomas y anticuerpos monoclonales 793

PstI BstEII SacI

PstI BstEII SacI Xhol

i
CH,

BstEII SacI Xhol

I
w
Linker V, Tag

F ig . 3 7 -7 . D ia g ra m a d e v e c to re s u tiliz a d o s p a ra la e x p re s ió n y s e c r e c ió n d e fra g m e n to s d e in m u n o g lo b u lin a s. a ) F r a g ­

m e n to s F V ; b ) F ra g m e n to s F a b y c ) sc F v . C írcu lo lle n o : p ro m o to r la c z . R e c tá n g u lo lle n o : líd e r P e lB p a ra la s e c r e c ió n pe-
rip lá sm ic a ; L in k e r: g e n p a ra el p é p tid o d e u n ió n e n tr e V H y V L . T a g : s e c u e n c ia n u c le o tfd ic a q u e c o d ific a p a ra u n p é p tid o
u tiliz a d o p a ra la in m u n o d e te c c ió n d e scF v .

SU secuencia nucleotídica y a través de ella la que codifican para un inm enso repertorio de
secuencia aminoacídica. Además dichos clones anticuerpos, expresados como proteínas de fu­
pueden ser utilizados para la expresión del sión en la superficie del fago. La gran cantidad
fragmento Fv del anticuerpo en sistemas proca- de fagos producidos por infección en E .coli,
riontes o eucariontes. En este caso se parte de pueden ser seleccionados en base a su afinidad
un material enriquecido en copias del ARNm por el antígeno unido a una fase sóUda. L os fa­
específico (ya que el hibridoma secreta en cul­ gos deseados pueden ser fácilmente clonados y
tivo grandes cantidades del anticuerpo m ono­ el anticuerpo producido masivamente.
clonal). Los Prs. utilizados deben ser lo sufi­ También se han establecido bibliotecas com­
cientemente diversos como para amplificar los binatorias a partir de ARNm, expandiendo ge­
fragmentos Vj, y V, del anticuerpo. nes V,:,, V k y VX por PCR y posterior recom bi­
Esta metodología ha servido también de base nación para formar constructos scF^, fusiona­
al desarrollo de bibliotecas de expresión de dos al fago.
fragmentos variables de anticuerpos. En este Se han obtenido así fragmentos específicos
caso el grado de degeneración de los Prs. utili­ para una variedad de antígenos. Con esta estra­
zados debe ser muy alta, a fin de am plificar tegia ha sido posible, también, producir frag­
idealmente a todos los componentes de una po­ mentos Fab.
blación policlonal. E ste tipo de estrategia tiene la ventaja que
permite el manejo de un niimero de especifici­
Fragmentos de anticuerpos y biblioteca dades muy superior al que se puede manipular
genómica combinatoria por procedimientos de “screening” y produce
in vitro, un fenómeno de selección parecido a
Otro enfoque para solucionar las dificultades la maduración de la respuesta in vivo.
en la producción de anticuerpos monoclonales El uso de fragmentos recombinantes de anti­
“hum anos” , hace uso de otras estrategias de cuerpos humanos ofrece varias ventajas sobre
manipulación genética, tal como la expresión y los anticuerpos “hum anizados” . Entre otras:
selección de moléculas de anticuerpos en bac­ son escencialmente humanos por lo que no ge­
teriófagos. nerarán anticuerpos HAMA; el bajo costo de
Brevemente, el ARNm de células B hum a­ producción permite su utilización fuera de los
nas se convierte en ADNc y los genes de anti­ propósitos académicos; no requiere inm uniza­
cuerpos (o de sus fragmentos) se expanden por ción y reúne mejores condiciones farmacociné-
PCR. Luego se fabrican constructos en los que ticas para su uso terapéutico.
se permite la combinación al azar de los genes Además, los fragmentos se pueden clonar en
para cadenas H y L, en tándem con el gen de vectores de expresión que los fusionen a proteí­
un bacteriófago. Esta biblioteca combinatoria nas, diferentes de las inmunoglobulinas, de im­
contiene una enorm e cantidad de pares H-L portancia funcional, tales como toxinas, enzi­
794 Metodologías
mas u hormonas. Esto permitirá su utiüzación
para el direccionamiento específico de drogas o
toxinas hacia sus blancos.
Recientemente se ha logrado la producción
de anticuerpos humanos específicos en respues­
ta a la estimulación antigénica de ratones mani­
pulados genéticamente. Esto se logró insertando
elementos de los loci de cadenas pesadas y ca­
denas livianas hum anas en ratones (ratones
transgénicos) en los que se eliminó la produc­
ción de cadenas H y L endógenas (ratones
“knockout”). Los ratones así modificados pue­
den ser utilizados para producir anticuerpos hu­
m anos contra antígenos hum anos y tam bién
empleados para la producción de hibridom as
secretores de anticuerpos humanos. Estos ani­
males pueden expresar una extensa diversifica­
ción de anticuerpos y permitir la obtención de
anticuerpos de buena afinidad. De acuerdo al
manipuleo genético al que son sometidos pue­
d en , ta m b ié n p ro d u c ir cam b io de is o tip o
(“switch” de clase). Este hecho es importante
porque es conocido que anticuerpos de la mis­
ma especificidad pueden tener diferentes efec­
tos (por ejemplo: terapéutico) dependiendo del
isotipo al que pertenecen.
Hibridomas a células T
Hasta aquí hemos presentado hibridotnas, ge­
nerados por fusión de células de mieloma con
linfocitos B, capaces de producir anticuerpos.
Las células T pueden producir hibridomas
por fusión con células T neoplásicas denomina­
das, tímoma, de manera equivalente a la descri­
ta para células B.
En lugar de secretar anticuerpos, los hibrido­
mas T poseen otras propiedades tales como se­
creción de linfoquinas o expresión de receptor T
específico para un dado complejo Ag-CMH. Se
han obtenido también, hibridomas T con caracte­
rísticas de T helper, supresores o citotóxicos. Sin
embargo su uso no se ha extendido por diversas
razones inherentes al sistema y fundamentalmen­
te porque se han desarrollado métodos prácticos
de cultivo y clonado de linfocitos T.
Anticuerpos producidos en plantas
En los últimos años, el desarrollo de plantas
transgénicas ha alcanzado un grado tal de desa­
rrollo que se puede dirigir la expresión de pro­
teínas extrañas tanto a un órgano de elección
com o a un com partim iento subcelular. Entre
ellas, se destaca la producción de anticuerpos.
Para ello, cADN codificantes para cadenas
pesada y liviana, preparado a partir de un hibri­
doma, fueron insertados en Agrobacterium tu-
mefaciens, bacteria de probada utilidad para la
transformación de células vegetales. El Agro-
bacterium transfiere ADN a la célula de la plan­
ta donde se integra a su genoma. Luego se rege­
neraron plantas que expresaban, individualmen­
te, cadena pesada o cadena liviana. Las plantas
fueron luego cruzadas sexualmente para expre­
sar la inmunoglobulina entera.
Los anticuerpos, obtenidos por purificación a
partir de un homogeneizado de hojas, mantuvie­
ron la reactividad y afinidad por su antígeno es­
pecífico.
La producción de anticuerpos en plantas abre
nuevas posibilidades tanto para la investigación
básica cuanto para la producción en gran escala
a bajo costo. No obstante para su aplicación
masiva, es necesario realizar una gran cantidad
de estudios previos, tales como el de la compo­
sición de carbohidratos, proleólisis, inmunoge-
nicidad, propiedades funcionales, etcétera.
PARTE EXPERIMENTAL
1. Medios de cultivo y soluciones
a. Medios básicos: los medios más comúnmen­
te usados, de entre los muchos disponibles,
son: RPMI 1640. DMEM (Dulbecco’s modi-
fied Egle’s médium) e IMDM (Iscove’s Mo-
dified Dulbecco’s Médium). Estos son me­
dios básicos que requieren ser suplementa-
dos para las distintas etapas del cultivo (pue­
den contener o no C 0 jNa 2, 2 g/l).
b. Medio libre de suero: medio básico con el
agregado de l-glutamina 3,5 x 10"^ M, piru-
vato sódico 1,75 x lOf M, penicilina 100 UI
m f', estreptomicina 100 g mf*. Algunos au­
tores adicionan 2-mercaptoetanol 5 x 10 M,
anfotericina B 2,2 mg/1, entre otros.
c. Medio 10%: 900 ml de medio libre de suero
más 100 ml de suero bovino fetal.
d. Medio 20%: 900 ml de medio libre de suero
más 200 ml de suero bovino fetal.
e. M edio HT: m edio 20% más h ipoxantina
4 X 10“M y timidina 1,6 x 10-“^M.
f. M edio HAT: medio HT más aminopterina
4 x lO m
M edio de congelación
Suero bovino fetal con 10% de dimetilsulfóxido
(DMSO).
Solución de agente fusógeno
P o lietilen g lico l (PEG ) 1500 50% peso/vol,
1 vol; GKN 1 vol.
GKN puede ser reemplazado por medio básico;
algunos autores recom iendan el agregado de
DMSO al 5% final. Se puede utilizar PEG de
otros pesos moleculares.
 Hibrídomas y anticuerpos monoclonales
Buffer GKN
Cloruro de sodio 8 g; CIK 0,4 g; fosfato disódi-
co 2 H p 1,77 g; PO.H^Na 2 H p 0,69 g; G lu­
cosa 2 g; rojo fenol 0,01 g; agua csp 1 litro.
Este buffer es recomendable para el lavado
de las células, especialm ente cuando se usa
PEG.
2. Células que se deben usar en la fusión
Células de bazo
Sacrificar el animal y extraer asépticamente
el bazo, colocarlo en un recipiente con medio
de cultivo solo o con 3% de suero (o en GKN),
R esuspender las células linfoides. Para esto
existen varios métodos, aunque nosotros opta­
mos por el homogeneizador de Potter pues per­
mite obtener buenas suspensiones en forma rá­
pida y con buen rendimiento. Dejar sedimentar
los agregados celulares por 5 minutos o filtrar
por tamiz de 60-80 mallas por cm^.
Lavar las células 3 veces por centrifugación
a 300-400 xg, 5 min a temperatura ambiente y
contar las células viables mediante la prueba de
exclusión del colorante con Azul tripán. A lgu­
nos autores aconsejan lisar los eritrocitos antes
del recuento.
Células de mieloma
Cosechar células que se encuentren en fase
exponencial de crecim iento. Las células de
mieloma son fácilmente despegadas de la su­
perficie mediante aspiración-expulsión con pi­
peta Pasteur. Para realizar la fusión, la viabih-
dad no debe ser menor del 80%.
Células alimentadoras
Una de las células alim entadoras más fre­
cuentemente utihzadas son los macrófagos de
exudado peritoneal. Para su obtención, inyectar
8-10 mi de buffer GKN intraperitonealmente y
retirar el líquido después de 1-2 minutos. Lue­
go lavar las células blancas, de las que aproxi­
madamente el 75% son macrófagos, resuspen­
der en HAT y distribuir en los pocilios de culti­
vo a razón de aproximadamente 10“^ células en
cada uno, 24 horas antes de la fusión. Se pue­
den utilizar también timocitos e inclusive es­
plenocitos.
Método
Fusión de células en suspensión
Mezclar en un tubo cónico de 50 mi, las cé­
lulas de bazo con las de mieloma en proporcio­
795
nes adecuadas, las que varían según el mieloma
utilizado entre 10:1 y 1:1. Centrifugar a 400 xg
5 min. Eliminar completamente el sobrenadan­
te, succionando con pipeta Pasteur para evitar
la dilución del PEG.
Colocar el tubo en un baño de agua a 37°C
(resulta muy cómodo usar como recipiente para
el agua un vaso de precipitados de 250 mi) y
agregar 1 mi de PEG precalentado a 37“C, agi­
tando suavemente por rotación del tubo y suave
vaivén de la pipeta, durante 1 minuto. En este
tiempo puede observarse la aglutinación de cé ­
lulas.
C o n tin u ar agitando durante otro m in u to .
Agregar 2 mi de medio sin suero (o GKN) du­
rante 2 min, siempre con agitación suave. A gre­
gar otros 10 mi lentamente durante 6 minutos.
Centrifugar (5min, 400 xg), eliminar el so­
brenadante, lavar y resuspender las células en
50 mi de medio selectivo (HAT). Distribuir en
no menos de 6 placas de 24 fosas y completar a
1 mi por fosa con el mismo medio (se pueden
usar placas de 96 fosas a razón de 100 (il/fosa).
Incubar en estufa de atm ósfera controlada
con 5-10% de CO^ según el medio utilizado y
95% de humedad.
A los 5 días aproximadamente puede com en­
zar a observarse el crecimiento de las células
híbridas; al día 7 agregar 1 mi más de m edio
selectivo.
Si se utilizan células ahmentadoras, éstas d e ­
berán ser incorporadas a la placa de cultivo 24-
48 horas antes de la fusión.
Se debe alim entar periódicam ente, d escar­
tando 1 mi de sobrenadante y renovándolo por
1 mi de medio fresco. Después de 2 o 3 sem a­
nas, reemplazar el HAT por HT.
Otros métodos de fusión
Existen otros métodos de fusión, com o el
que tiene lugar sobre membranas filtrantes, v a­
riantes que incluyen electrofusión y varias m o ­
dificaciones del protocolo descrito, que h an
mostrado ser efectivas.
2. Detección de anticuerpos
en el sobrenadante de cultivo
Los ensayos con sobrenadantes se realizan
cuando los cultivos alcanzan aproximadamente
70% de confluencia y después de 2 o 3 días sin
recambio de medio.
Los m étodos más com únm ente em pleados
son: enzimoinmunométodos, radioinm unom é-
todos, inmunofluorescencia indirecta, aglutina­
ción directa o indirecta, lisis complemento-de­
pendiente, detección de células productoras de
anticuerpos (Jeme), métodos descritos en d eta­
lle en otros capítulos de este libro.
796 Metodologías
3. Clonado
Por dilución límite
Este método está especialmente indicado pa­
ra cuando se obtienen pocos cultivos positivos.
Una forma de hacerlo es sembrando, en las
tres primeras filas de una placa de 96 pocilios,
un promedio de 5 'células por fosa, en las tres
filas siguientes 1 célula por fosa y 0,5 células
por fosa en las dos filas restantes.
Para ello conviene preparar 4,6 ml de una sus­
pensión conteniendo 230 células híbridas viables
por ml en medio de cultivó con 20% SBF y dis­
pensar 100 ^tl en cada una de las 36 primeras fo­
sas. Al mililitro restante agregarle 4 ml de medio
y sembrar otras 36 fosas. A la suspensión rema­
nente adicionarle 1 ml de medio y sembrar las
últimas 24 fosas. También pueden ser utilizadas
otras variantes de esta distribución.
Incubar, tratando de no moverlas, por lo me­
nos durante 7 días, observar al microscopio in­
vertido y marcar las fosas en las que crezca un
solo clon. Los cultivos deben ser realimentados
alrededor de los días 7 y 14 con unos 100 |il de
medio. Cuando se alcance un crecimiento con­
fluente, se debe tomar sobrenadante para el en­
sayo de anticuerpos.
Los cultivos que conteniendo originalmente
un solo clon en crecimiento resulten positivos,
p u ed en ser e x p a n d id o s, m ie n tra s que los
biclonales o pohclonales pueden ser reclonados.
Clonado en agar semisólido
Preparar una capa de agar base al 0,5% en
m edio 20% (un volum en de m edio 2X con
20% de suero fetal más 1 volumen de agar al
1 % en agua), colocando 15 ml por placa de Pe-
tri de 10 cm de diámetro (disminuir apropiada­
mente para placas de m enor tam año) y dejar
solidificar.
Hacer distintas diluciones celulares (de 100
a 50.000 por mililitro) en tubos con medio 20%
de suero mantenidos a 40-42“C y agregarles 1
volumen (1 ml) de agar 0,5% preparado en la
forma indicada arriba, mezclar y distribuir cui­
dadosamente sobre la capa base.
Dejar soUdificar e incubar a 37°C en incuba­
dor de COj. A los 4-5 días pueden observarse
colonias microscópicas que pueden ser transfe­
ridas a medio líquido en policubetas. El uso de
células alimentadoras es conveniente en este
paso. Norm alm ente es suficiente con repicar
una veintena de clones de cada híbrido. El repi­
que se realiza con pipeta fina, Pasteur o capilar,
observando al m icroscopio invertido con el
menor aumento.
Tras 13-15 días de cultivo en agar los clones
son observables a simple vista.
Las células repicadas se dejan crecer lo sufi­
ciente para el ensayo de los sobrenadantes.
El reclonado es aconsejable a fin de asegurar
la monoclonalidad, cualquiera que sea el méto­
do utilizado.
4. Expansión de clones positivos
Los clones en crecim iento sem iconfluente
que dan reacción positiva son expandidos gra­
dualm ente, observando los lím ites de creci­
miento ya mencionados, hasta alcanzar el gra­
do de expansión deseado.
5. Congelación de células
Centrifugar 10®-10’ células a 400 xg a 4°C,
durante 5 minutos. Eliminar el sobrenadante y
resuspender en 1 ml de medio de congelación;
transferir a vial de congelación y colocarlos en
una caja de telgopor con paredes de por lo m e­
nos 1 cm de espesor. Colocar en congelador de
-70°C durante 24-48 horas y luego transferir
directamente a tanque de nitrógeno líquido.
Es conveniente congelar por lo menos 3 via­
les de cada hibridoma.
6. Descongelación de células
Descongelar tan rápidamente como se pueda
agitando el vial en baño de agua a 37"C; trans­
ferir las células a un tubo con medio contenien­
do 10% de suero, a 4°C. Centrifugar, resuspen­
der en medio para cultivo (20% es aconsejable
en este estadio) y transferir a 6-12 fosas de una
placa de 24 pocilios, o a frasco de cultivo de
25 cm^ de superficie.
7. Producción de líquido ascítico
Cosechar células de un cultivo con buen cre­
cimiento, lavarlas varias veces y resuspender
en GKN e inyectar intraperitonealmente 0,5 ml
conteniendo 2 X 10*> células, en ratones isogéni-
cos previamente inoculados (1-9 semanas an­
tes) por esa misma vía con 0,5 ml de pristane
(tetrametilpentadecano).
El líquido acumulado es drenado por pun­
ción peritoneal (usualm ente alrededor de 10
días luego de la inoculación) y repetir el proce­
dimiento cada 2 o 3 días hasta el sacrificio o
muerte del animal.
En lugar de ratones isogénicos se pueden uti­
lizar animales alogénicos inmunosuprimidos.
BIBLIOGRAFÍA
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ELISA
NORBERTO W. ZWIRNER
C O N C EPT O S BÁSICOS
Los enzim oinm unoanálisis (EIA) o ELISA
(“Enzym e-Linked Iram uno Sorbent A ssay”),
descritos hace 25 años, se basan en dos fenó­
menos biológicos importantes:
1. la elevada especificidad de los anticuerpos
(Ac);
2. la alta actividad de algunas enzimas usadas
en este tipo de ensayos, lo que perm ite la
am plificación de la señal generada por la
muestra.
Independientemente de los esquemas experi­
mentales empleados, los EIA comprenden dos
etapas generales;
1 . la reacción de un inmunorreactante con un
antígeno (Ag) o anticuerpo (Ac);
2 . la detección de ese inm unorreactante m e­
diante la utiUzación de un conjugado enzi­
mático.
La sencillez de los ELI§A, sumada a la po­
tencialidad de los anticuerpos m onoclonales
(AcMo), hace que día a día se vayan imponien­
do sobre métodos tales como aquellos basados
en la utilización de un trazador radiactivo (ra-
dioinmunoanálisis -RIA-), un trazador emisor
de luz (quim iolum iniscencia) o un trazador
fluorescente (fluorografía). La gran ventaja del
ELISA sobre los-otros métodos reside en que
no requiere un equipamiento demasiado sofisti­
cado para su implementación en el laboratorio.
Además, los reactivos empleados son de una
vida media muy alta (en el caso del RIA, un
trazador radiactivo marcado con iodo tiene una
vida media de 60 días, mientras que un conju­
38
gado enzimático usado en ELISA suele conser­
varse en buen estado durante años) y no se co­
rre el riesgo de contaminación producida por el
manipuleo de isótopos radiactivos.
Antes de comenzar con la descripción de los
EIA más comunes es importante definir dos pa­
rámetros ampliamente usados:
SENSIBILIDAD es el cambio en la respues­
ta (dR) por cada cambio de la cantidad de reac-
tante (dC). En un gráfico de dosis-respuesta en
EIA (fig. 38-1), la sensibilidad es la pendiente
de la curva en un punto determinado. Debido a
que las curvas dosis-respuesta de los EIA en
g e n e ra l son sig m o id e a s, la s e n s ib ilid a d
(dl^dC ) no es constante. LIMITE DE DETEC­
CION es la mínima cantidad de inmunorreac­
tante que puede detectar el sistema.
De acuerdo a los parámetros definidos en el.
párrafo anterior, la curva roja de la figura 38-1
corresponde a un sistema con una sensibilidad
mayor que la curva azul. A pesar de ello, ésta
tiene un límite de detección menor que la curva
roja.
C lasificación de los enzim oinm unoanálisis:
Los enzim oinm unoanálisis pueden clasifi­
carse en:
a. EIA homogéneos;
b. EIA heterogéneos.
Los primeros se realizan exclusivamente en
fase líquida, mientras que en los segundos se
em plea un soporte sólido para inm ovilizar a
uno de los inmunorreactantes. Por cuestiones
de sencillez y aplicabilidad general, sólo nos
dedicaremos al estudio de los EIA heterogé-

Los ElA heterogéneos pueden clasificarse en
dos tipos:
L enzim oinm unoanálisis de amplificación
de actividad; y
2. enzimoinmunoanálisis de modulación de
actividad.
En los enzim oinmunoanálisis de amplifica­
ción de actividad o no competitivos (fig. 38-
2a), se em plea un gran exceso del inm uno-
rreactante con el objeto de obtener una señal
máxima debida a la presencia del compuesto a
ser dosado. De acuerdo a la ley de acción de
masas, un exceso de inmunorreactante permite
detectar niveles muy bajos del analito que se
quiere determinar. Estos ELISA se subdividen
de acuerdo a la molécula inmovilizada en la fa­
se sólida. La inmovilización del Ag para detec­
tar Ac es un sistema que tiene una alta detecta-
bilidad debido a que varias moléculas del con­
jugado enzimático, que en este caso son Ac an-
ti-Ig marcados con la enzima, pueden unirse a
cada molécula de Ac que reaccionó con el Ag
inm ovilizado. Este efecto se traduce en una
gran amplificación de la señal. Mediante la uti­
lización de métodos de “puenteo” inmunológi-
co (con Ac anti-Ig) o no inmunológico (con el
sistema avidina-biotína o proteína A) es posi­
ble aumentar aún más la detectabilidad. En ge­
neral, estos sistemas se denominan ELISA de
amplificación.
Otro sistema de amplificación de actividad
es el ELISA de captura, en el que se inmovili­
za un Ac (“Ac de captura”), se captura Ag y se
revela su presencia con un conjugado enzim á­
tico anti-Ag. Este sistem a se emplea para la
cuantificación de Ag o para la detección de Ac
contra el Ag capturado. En general, es desea­
ble que el conjugado enzimático y el Ac inm o­
vilizado provengan de la misma especie para
evitar interferencias en el sistem a originadas
por reacción cruzada del conjugado con el Ac
de captura.
En enzimoinmunoanálisis de modulación de
actividad o competitivos (fig. 38-2b) se modula
la actividad del conjugado enzimático por com­
petición con el analito. Menores cantidades del
conjugado enzimático permiten obtener una de-
tectabilidad mayor, ya que pequeñas cantidades
del competidor tienen un gran impacto sobre la
actividad enzimática detectada en la fase sólida.
Existen dos diseños generales de ensayos de
modulación de actividad: en uno de ellos, el li­
gando m arcado con enzim a y el ligando sin
marcar que se quiere dosar se- incuban simultá­
neamente en el sistema; en el otro diseño, el li­
gando no marcado a ser dosado se incuba en una
primera etapa y en una segunda etapa se incuba
con e! ligando marcado enzimáticamente, el que
ELISA 799
reaccionará con los sitios no ocupados por el li^
gando que reaccionó en la primera etapa.
Independientemente de estos dos diseños g e­
nerales, en ELISA de modulación de actividad
se puede inmovilizar el Ae en la fase sólida y
agregar el Ag marcado con la enzima (fig. 38-
3a). Se observará una disminución de la activi­
dad enzim ática a medida que se compite con
cantidades crecientes de Ag libre presente en
una solución patrón de Ag o en una m uestra
problema, siendo la concentración de producto
coloreado formado inversamente proporcional
a la concentración de Ag libre.
Alternativamente (fig. 38-3b) es posible in ­
m ovilizar el Ag y usar Ac anti-Ag m arcados
con enzima. En este caso se realiza una com pe­
tición de la unión de estos Ac al Ag inm ovili­
zado, por medio de Ag libre presente en una
solución patrón o en una m uestra problem a.
Como consecuencia de esta competición, la ac­
tividad enzimática deteetable disminuye a m e­
dida que se emplean concentraciones crecientes
de Ag libre.
Una tercera variante (fig. 38-3c) es usar el
sistema descrito en el párrafo anterior con la
diferencia de que se emplea un Ac anti-Ag sin
m arca en zim ática y en una etap a sig u ien te
agregar un conjugado anti-Ig marcado con la
enzima. Este ensayo es de modulación y am pli­
ficación de actividad y tiene la ventaja de que
permite aumentar la detectabilidad del sistema.
En todos los ensayos inmunoenzimátieos en
fase sólida, independiente de las numerosas es­
trategias existentes, se pueden distinguir 3 eta­
pas:
1. inmovilización del inmunorreactante (A c o
Ag) en la fase sólida:
2. incubación con la muestra de modo que ésta
reaccione con el inmunorreactante inm ovili­
zado:
3. amplificación o modulación por medio de la
utilización de un conjugado enzimático (es­
ta etapa puede en realidad ser de mas de un
paso).
Sistemas alternativos de reconocimiento:
1. Sistema A vidina-biotina
La avidina es una proteína de la clara de
huevo y la estreptavidina es una proteína p ro ­
ducida por ciertas levaduras. Ambas se caracte­
riz a n p o r su e le v a d a a fin id a d por b io tin a
(K^ = 10*5 ]y¡-i) Debido a que la biotina es fá-
cilinente acoplable a distintas proteínas (entre
ellas, Ac y enzimas) por unión covalente sin
afectar su actividad biológica, se han desarro­
llado métodos inmunoenzimátieos basados en
la interacción avidina-biotína (fig. 38-4).
800 Metodologías

C u ad ro 38-1. Proteína A de Staphilococ-

cus aureus (cepa Cowan I) y reactividad
con inmunoglobulinas de distintas especies
Especie ¡sotipo A finidad

IgG , ++++
IgG a +-I--I-+
H um ano
Ig G ,
IgG ^ ++++
IgG , +
IgG 2. ++++
R a tó n +++
lg G ,„
F ig . 38-1. C urvas dosis (C ) - respuestas (R) típicas obte­
IgGj
nidas en ensayos inniunoenzim áticos. S e p u e d e observíu-
q u e la curvii ro ja tie n e u n a m a y o r sen .sib ilid ad en la z o n a de
Ig G , +
m a y o r p e n d ie n te (d R /d C ) q u e la c u rv a az u l. P o r su p a rte ,
R a ta IgG ,.,
é s ta tie n e u n lím ite d e d e te c c ió n m e n o r q u e la c u rv a ro ja.
Ig G a
Ig G ,, +++

La biotinil ación se produce por reacción del O v e ja + /-

grupo carboxilo de la biotina con grupos -NH^
C a b ra -
de residuos de lisina de las proteínas. En gene­
ral se preparan ésteres de líiotina con grupos C a b a llo ++
químicos separadores (“spacers”) que permiten
C e rd o ++-f
que el residuo de biotina quede en una zona ex­
terna de la molécula, accesible para la reacción C o n e jo ++++
posterior con la avidina.

2. Proteína A
nos isotipos de las inmunoglobulinas, los que
Es una proteína de la pared de Staphüococ- se detallan en el cuadro 38-1. Tiene 4 sitios de
cus aureus (cepa Cowan I) que tiene alta afini­ unión pero usualmente sólo reaccionan dos. Es­
dad (K = 10* M ’) por fragmentos Fe de algu- tas propiedades permitieron el desarrollo de di-

íi>
c"am ísm
mm m m
i )€
m
[% *
^ Inm unorreactante unido a fase sólida

' Inm unorreactante 1 ^ Inm unorreactante 2 ^ Inm unorreactante com petidor

unido a fase sólida co n ju g a d o
enzim ático C onjugado enzim ático

b
Fig. 38-2. C lasificación general de los ensayos inn iu n oen zim áticos heterogéneos, a) E L ISA de am plificación de a c­
tividad. E n e s te tip o d e e n s a y o s , u n e x c e s o d e l in m u n o r re a c ta n te 2 (az u l) r e a c c io n a c o n el in m u n o rre a c ta n te 1 in m o v iliz a ­
d o en la fa s e s ó lid a (ro jo ). L u e g o d e la e ta p a d e la v a d o , el in m u n o rre a c ta n te 2 q u e re a c c io n ó se p o n e e n e v id e n c ia al e n ­
fre n ta rlo c o n u n e x c e s o del c o n ju g a d o e n z im á tic o (v e rd e y ro sa ), b. E L ISA de m odulación de actividad. E n e s te tip o d e
e n s a y o s , el in m u n o rre a c ta n te c o m p e tid o r (a z u l) y el c o n ju g a d o e n z im á tic o (az u l y ro sa ) c o m p ite n p o r la u n ió n al i n m u n o ­
rre a c ta n te in m o v iliz a d o e n la fa s e s ó lid a (ro jo ).
 ELISA 801

f
%

'%f Anticuerpo de captura

^ A ntígeno unido a fase sólida
♦ A ntígeno a ser capturado
A ntíg e n o com pe tid o r soluble
C onjugado antígeno-enzirm a %
%¡ C onjugado anticuerpo-enzinia

Fig. 38 -3. V arian tes d el E L IS A d e m od ulación de

actividad, a) E L ISA de com petición usando A g m a r­ ► ^
cado con enzim a. E n e s te e n s a y o se íia c e u n a c o m p e ti­
c ió n e n tre el A g p re s e n te en u n a so lu c ió n p atró n o e n
u n a m u e s tra p ro b le m a (ro jo ) y el A g m in e a d o c o n u n a
e n z im a (ro jo y v e rd e ) p o r el A c in m o v iliz a d o en la fa s e
só lid a (a z u l), b) E LISA de com petición usando A c es­ ' .i ■!
p ecíficos m arcad os con en zim a. E n e s ta v a ria n te se V, - - J
re a liz a u n a c o m p e tic ió n e n tre el A g in m o v iliz a d o en la
fa s e s ó lid a (ro jo ) y A g en fa s e liq u id a (y a se a en u n a s o ­
lu c ió n p a tr ó n o e n u n a m u e s tra p ro b le m a ; ro jo ) c o n A c <
e s p e c ífic o s d e A g m a rc a d o s c o n e n z im a (azul y ro sa ),
c) FX ISA de com petición usando A c específicos sin
m arca enzim ática. E s ta v a ria n te es s e m e ja n te a la a n ­
te rio r c o n la d ife re n c ia d e q u e los A c e sp e c ífic o s (a z u l)
q u e re a c c io n a ro n c o n el A g in m o v iliz a d o en la fa s e s ó ­
lid a (ro jo ) se re v e la n e n u n a e ta p a p o s te rio r m e d ia n te la
' i, —
^ -V '
u tiliz a c ió n d e u n c o n ju g a d o e n z im á tic o a n ti-in m u n o g lo -
b u lin a s e s p e c ie -e s p e c ífic o (v io le ta y ro sa ). ' 4'’ S-
V_ __ /

1 ■m*

*- A ., ■*

V A ^

/
€m m
-

I iJ
Fig. 38-4. E n sayo inm u n oen zim ático m ediante la u ti­ , Inm unorreactante 1 ' Biotina
lización d el sistem a a vid in a -b iotin a. E l i n m u n o r re a c ­ unido a fa se sólida
ta n te 2 (a z u l) m a rc a d o c o n b io tin a (v io le ta ) re a c c io n a en ‘ Inm unorreactante 2
u n a p rim e ra e ta p a c o n el in m u n o r re a c ta n te 1 in m o v iliz a ­ '<
■Inm unorreactante 2 Im a rc a d o con b io tin a
do en la fa s e s ó lid a (ro jo ). P o s te rio rm e n te , el s is te m a se
re v e la m e d ia n te la u tiliz a c ió n d e u n c o itju g a d o de a v id in a
c o n e n z im a (v e rd e y ro sa ). 'i> C onjugado
O avidina-enzim a
802 Metodologías
C uadro 38-2. Requisitos que deben reunir
las enzimas para ser utilizadas en ensayos
inmunoenzimátieos
1. D e b e n se r e s ta b le s d u ra n te su a im a c e n a m ie n to , y a
se a lib re s o c o n ju g a d a s .
2. D e b e n se r d e fá c il p re p a ra c ió n , o b te n e rs e c o n e le ­
v a d a p u r e z a y b a jo c o sto .
3. L a a c d v id a d e n z im á tic a d e b e se r a lta , y a se a c o m o
e n z im a lib re o c o m o e n z im a c o n ju g a d a .
4. L a a c tiv id a d e n z im á tic a d e b e s e r fá c ilm e n te d e te c -
tab le .
5. D e b e n se r c o m p a tib le s c o n la s c o n d ic io n e s d e l e n ­
sa y o (pH , fu e rz a ió n ic a , c o m p o s ic ió n d e lo s “ b u f­
fe rs ” , etc.).
6. D e b e n p o s e e r g ru p o s q u ím ic o s r e a c d v o s p a ra la
c o n ju g a c ió n .
7. D e b e n s e r fá c ilm e n te c o n ju g a b le s a a n tic u e rp o s u
o tro s s is te m a s d e d e te c c ió n .
8. L a e n z im a del c o n ju g a d o n o d e b e e s ta r p re s e n te en
el c o m p o n e n te q u e se fija rá a la fa s e só lid a .
versos tipos de ensayos inm unoenzim átieos
eon proteína A (fig. 38-5).
E nzim as utilizadas en ensayos
inm unoenzim átieos
Toda enzima a ser utilizada en ensayos in-
munoenzimáticos debe reunir ciertos requisi­
tos, los que se mencionan en el cuadro 38-2.
Los factores mencionados en el cuadro 38-2
hacen que la peroxidasa y la fosfatasa alcalina
sean las dos enzimas más ampliamente utiliza­
das en estos ensayos, a pesar de que la fosfata­
sa alcalina es una enzima que tiene tendencia a
la polimerización, lo que dificulta el proceso de
conjugación. Desde hace unos años se ha di­
fundido el uso de la ureasa debido a una serie
de características que se comentan más adelan­
te. Otras enzimas usadas en EIA son p-galacto-
sidasa y glucosa-oxidasa.
Por otra parte, para la etapa del revelado del
ELISA se emplean sustratos crom ogénicos o
C u ad ro 38-3. Condiciones que deben reu­
nir los sustratos o compuestos cromogéni­
cos para ser utilizadas en ensayos inmu-
noenzimáticos
1. D e b e n se r s o lu b le s en a g u a , in c o lo ro s, in o d o ro s y
n o tó x ic o s.
2. E l p ro d u c to f o rm a d o d e b e p o s e e r u n a lto c o e fic ie n ­
te d e e x tin c ió n m o la r, c o n u n m á x im o d e a b s o rb a n ­
c ia e n tre 4 0 0 y 6 0 0 nm .
3. D e b e n se r e s ta b le s al a lm a c e n a m ie n to y lu e g o d e la
d e te n c ió n d e la re a c c ió n e n z im á tic a .
4 . N o d e b e n se r fo to s e n s ib le s.
5. D e b e h a b e r u n a m p lio ra n g o d e lin e a lid a d e n tre el
c o lo r fo rm a d o y la c o n c e n tra c ió n d e e n z im a .
mezclas de sustratos y compuestos cromogéni­
cos, los que deben reunir ciertos requisitos
(cuadro 38-3).
En general, los tiempos de incubación con
los sustratos varían entre 10 y 30 minutos, por
lo que en EIA no se miden velocidades inicia­
les de la actividad enzimática. Las reacciones
enzim a-sustrato se detienen por agregado de
ácidos o bases, los que producen un efecto ba-
tocrómico o hipsocrómico del máximo de ab­
sorbancia, con el consiguiente aum ento del
coeficiente de extinción molar.
1. Peroxidasa
Las p ero x id a sa s son h em o p ro teín as que
transfieren hidrógeno desde un donante (DH)
al HjOj. La reacción catalizada puede escribir­
se como
2 DH + H ,0 , ^ 2 H ,0 + 2 D (1)
La peroxidasa más utilizada en enzimoinmu-
noensayos se obtiene del rabanito (“horseradish
peroxidase” o HRP), con un alto contenido en
hidratos de carbono, lo que facilita la reacción
de conjugación a anticuerpos. Es una enzima
sensible a la azida sódica (se inhibe con con­
centraciones superiores a lO'^M), compuesto
habitualmente utihzado en diversas soluciones
diluyentes de los EIA.
En la etapa de revelado de los EIA se suelen
utilizar donantes de H de tal manera que el cro-
mógeno o producto formado (D en la ecuación
1) sea soluble y cuantificable por espectrofoto-
m etría. Entre estos donantes de H podem os
mencionar el 2,2’-azino-di-(3-etil-benzotiazoh-
na)-6-sulfonato de diamonio (ABTS), que es
incoloro, con un máximo de absorbancia a 340
nm, mientras que el producto oxidado formado
tíene un máximo de absorbancia a 414 nm.
Un crom ógeno am pliam ente utilizad o en
ELISA es la 3-metif-2-benzotiazolinona hidra-
zona (MBTH), que una vez oxidado reacciona
con el á cid o 3 -(d im e tila m in o ) b e n z o ic o
(DMAB) produciendo un acoplamiento oxida-
tivo. A sí se forma una indamina catiónica de
color azul-púrpura y con un máximo de absor­
ción a 590 nm. Este sistema de detección tiene
una elevada detectabilidad y la ventaja de que
es uno de los pocos que utifizan cromógenos
no carcinogénicos. Sin embargo, en determina­
dos casos, el MBTH-DMAB tiende a dar colo­
res basales altos.
Otro cromógeno muy usado es la orío-feni-
lendiamina (OPD) o 1,2-bencenodiamina. Su
producto oxidado coloreado tienen máximo de
absorbancia a 492 nm. Tiene la ventaja de ser
un cromógeno que permite tener una detectabi­
lidad elevada. Sin embargo, es un compuesto

carcinogénico, en determinados sistemas tiende
a dar coloración basal significativa y es foto­
sensible, por lo que hay que almacenarlo en la
oscuridad y prepararlo en el momento de usar.
Sustratos menos empleados son el ácido 5-ami-
no-salicílico, el 3-amino-9-etilearbazol, la orto-
danisidina y la orío-toluidina.
2. Fosfatasa alcalina
Las fosfatasas alcalinas utilizadas en E lA se
aíslan a partir de intestino bovino o de Escheri-
chia coli. Estas enzimas hidrolizan una amplia
gama de ésteres de fosfatos, tales como las de
alcoholes prim arios, secundarios, fenoles y
aminas, tienen un pH óptimo alcalino (por lo
que se emplean “buffers” a base de dietanola-
mina con pH cercano a 9) y requieren de M g y
Zn como cofactores. El sustrato más am plia­
mente usado para la fosfatasa alcalina en los
EIA es el para-nitrofenilfosfato (p-NPP). Tiene
la ventaja de sufrir un bajo nivel de hidrólisis
espontánea, es soluble en soluciones acuosas y
su producto de hidrólisis (p-nitrofenol) absorbe
intensamente a 405 nm.
3. Ureas a
Es una enzim a que se está em pleando en
ElA para establecer el punto final de una titula­
ción por determinación visual. La reacción ca­
talizada por la enzim a es la hidrólisis de la
urea, con formación de CO^ y NHj. La activi­
dad enzimática de la ureasa produce un cambio
de pH en el medio que, en presencia de púrpura
de bromocresol, se visualiza como un viraje del
color de) indicador de amarillo a púrpura, por
lo que no se requiere de un espectrofotómetro
para cuantificar la actividad enzim ática. Sin
embargo, debido a la inestabilidad de la ureasa,
su uso es restringido.
Preparación de conjugados enzimáticos
En la práctica es posible preparar conjuga­
dos enzimáticos de anticuerpos o de antígenos.
Independientem en te de la m olécula que se
marque con la enzima, un buen conjugado debe
reunir una serie de características, las que se
detallan en el cuadro 38-4
En realidad, ninguno de los procedimientos
de conjugación actualmente existentes permite
obtener un conjugado con todas esas caracterís­
ticas. Por ello, hay que seleccionar muy bien el
procedim iento de conjugación, teniendo en
cuenta, entre otros factores, las características
de la enzima que se desea conjugar.
Dado que los EIA tienen como objetivo gene­
ral la amplificación de la señal generada por el
componente que se desea dosar, es importante
ELISA 803
Cuadro 38-4. Características de un buen
conjugado enzimático
1. D e b e te n e r u n a c o m p o s ic ió n d e fin id a y h o m o g é n e a .
2. D e b e o b te n e rs e sin p é rd id a d e la a c tiv id a d e n z im á ­
t ic a d e b id o al p r o c e s o d e c o n ju g a c ió n ,
3. D e b e s e r a lta m e n te e s ta b le al a lm a c e n a m ie n to p o r
p e río d o s p ro lo n g a d o s ,
4. D e d e s e r e c o n ó m ic o , r á p id o y fácil d e p rep a ra r,
5. E l p ro c e d im ie n to d e c o n ju g a c ió n d e b e c o n d u c ir a
u n a lto re n d im ie n to e n c o n ju g a d o y un b a jo r e n d i ­
m ie n to en h o m o p o lím e ro s d e A c y /o en zim a.
6. E l p ro c e d im ie n to d e s e p a ra c ió n d e l c o n ju g a d o d e
las e s p e c ie s n o m a rc a d o s (A c y e n z im a ) d eb e s e r
s e n c illo .
obtener conjugados con una relación enzima:an-
ticuerpo lo más alta posible, sin que se vea afec­
tada la actividad enzimática ni la capacidad de
unión del anticuerpo o antígeno marcados.
Existen dos métodos generales de conjuga­
ción. El primero comprende una conjugación
química con formación de uniones covalentes
entre la enzima y el anticuerpo, ya sea entre las
cadenas polipeptídicas de ambos reactantes o
entre las cadenas laterales de oligosacáridos (si
los reactantes son glucoproteínas).
El segundo método de conjugación se d eno­
mina conjugación inmunológica (fig. 38-6) y se
basa en la reacción de un anticuerpo anti-enzi-
ma y la enzima sin afectar la actividad catalíti­
ca de la misma. E ste com plejo enzim a-anti-
cuerpo es luego ligado al anticuerpo que reac­
cionó con su Ag (unido a fase sólida) por m e­
dio de anticuerpos anti-inmunoglobulinas esp e­
cie-específicas. Este método de conjugación
sólo se emplea en ensayos de amplificación de
actividad y tiene una detectabilidad unas 100
veces superior a la obtenida mediante la utiliza­
ción de conjugados químicos.
I. Conjugación química
La intención de los métodos de conjugación
química es lograr un conjugado con una re la ­
ción enzima-anticuerpo elevada, para lo cual se
parte de altas concentraciones de los reactantes,
lo que en muchos casos conduce a la formación
de polím eros y agregados inactivos desde el
punto de vista inmunológico y enzimático. El
problema de la presencia de estos polímeros es
que compiten por el Ag reconocido por el an ti­
cuerpo que se usó para la preparación del co n ­
jugado cuando se realiza el ensayo inmunoen-
zimático. Por otro lado, concentraciones de en ­
zima y anticuerpo bajas tienden a favorecer la
reacción de conjugación intramolecular por so ­
bre la conjugación intermolecular. Como co n ­
secuencia, se obtiene un producto de menor ca ­
lidad.
804 Metodologías
, t i ...
>*
• i
1 Proteína A
^ C onjugado proteína A -enzim a
b
Con el objeto de favorecer las interacciones
enzima-anticuerpo y minimizar las interaccio­
nes enzima-enzima y anticuerpo-anticuerpo, el
pH del “buffer” usado durante la conjugación
es de importancia crucial. Debe estar entre el pl
de la enzima y del anticuerpo, ya que de esa
manera ambos reactantes tienen cargas opues­
tas y las moléculas de enzima y anticuerpo se
atraerán entre sí, favoreciendo la reacción de
conjugación.
m « ¡
n m 'H
J_¿
í . • m
• ; i
‘1 ^
Fig. 38-5. Proteína A de Sta p h ilo co ccu s a u reu s (ce­
pa C owan I) en ensayos inm unoenzim áticos. a) P or
inm ovilización de proteína A en la fase sólida. E s te
tip o d e e n s a y o s p e rm ite c a p tu ra r e s p e c ífic a m e n te d is ­
tin ta s in m u n o g lo b u lin a s s é ric a s p o r su p o rc ió n F e ( ro ­
jo ) p a ra lu e g o ca p tu ríir A g (az u l) y r e v e la r su p re s e n c ia
m e d ia n te la u tiliz a c ió n d e A c e s p e c ífic o s m a rc a d o s c o n
e n z im a (v e rd e y ro sa ), b) P or em pleo de proteína A
m arcad a con en zim a com o tra za d o r. E s te t ip o d e
E L IS A p e rm ite r e v e la r la p re s e n c ia d e A c e s p e c ífic o s
(a z u l) d e A g in m o v iliz a d o en la fase s ó lid a (ro jo ).
Los agentes químicos que permiten la unión
del anticuerpo a la enzima son agentes homobi-
funcionales (en los que los grupos quím icos
reactivos son iguales) o heterobifuncionales (en
los que los grupos químicos reactivos son dis­
tintos).
Los procedimientos de conjugación química
se pueden realizar en una o dos etapas. En el
primer caso se hace reaccionar directamente el
Ac con la enzima, utilizando diversos agentes

A nticuerpo Enzim a
anti-enzim a
T
Ac unido A c de
al A g en puenteo
fase sólida
Fig. 38-6. C onjugación in m u n ológica y utilización d el conjugado en ensayos inm u n oen zim áticos. E n u n a p r im e r a
e ta p a se fo rm a n los c o m p le jo s e n z im a -a n ti-e n z ira a p o r re a c c ió n e n tre la e n z im a (a m a rillo ) y A c e s p e c ífic o s (az u l)' P o s t e ­
rio rm e n te , e s to s c o m p le jo s so n u tiliz a d o s p a ra r e v e la r la p r e s e n c ia d e A c e s p e c ífic o s (a z u l) d e u n A g in m o v iliz a d o e n la
f a s e só lid a (v e rd e ) p o r fo rm a c ió n d e p u e n te co n A c a n ti- in m u n o g lo b u lin a s e s p e c ie -e s p e c ífic a s (ro jo ).
químicos bifuncionales. Estos métodos tienden
a generar un elevado porcentaje de homopolí-
meros, por lo que los métodos que se realizan
en dos etapas resultan mas apropiados. En és­
tos se activa una de las macromoléculas (en ge­
neral, la enzima) haciéndola reaccionar con el
agente bifuncional. En una segunda fase la en­
zima activada se conjuga al anticuerpo. Si bien
existen numerosos reactivos químicos usados
en este tipo de conjugaciones, se utiliza habi­
tualmente el glutaraldehído y el periodato de
sodio.
El glutaraldehído es el agente químico ho-
mobifuncional más ampliamente usado para es­
te tipo de conjugaciones. Reacciona en forma
irreversible con los grupos e-NH2 de las lisinas
de las proteínas, lo que se ve favorecido a pH
superiores a 7. Existen numerosos protocolos
que varían en la concentración de glutaraldehí­
do empleada, el tiempo y la temperatura de in­
cubación.
La conjugación se puede realizar en un paso
(inás apropiado para unir fosfatasa alcalina a
anticuerpos) o en dos pasos (más apropiado p a­
ra unir peroxidasa a IgG o a fragmentos Fab).
La conjugación en dos etapas presenta la venta­
ja de que se trabaja en condiciones más contro­
ladas y se genera menor cantidad de productos
no deseados (tales como conjugados Ac-Ac),
ya que se realiza una primera reacción de la en­
ELISA 805
C om p lejo enzim a-
antl-enzim a
C om plejo enzim a-
anti-enzim a
zima con el glutaraldehído, se elimina el exce­
so de glutaraldehído y se enfrenta la enzima ac­
tivada con el Ac para permitir la unión de am ­
bos reactivos.
El uso de agentes heterobifuncionales tiene
la ventaja de que permite realizar la reacción de
conjugación en forma secuencial y en co n d i­
ciones más controladas, ya que cada grupo qu í­
mico reactivo reacciona con la macromolécula
en condiciones diferentes. En general, se em ­
plean derivados de la maleiimida, pero los co n ­
jugados obtenidos no son tan estables como los
obtenidos por otros métodos.
La conjugación química con periodato de so­
dio es lítil para la conjugación de glucoproteí-
nas en general y ampliamente empleado para la
unión de peroxidasa a IgG. Este método produ­
ce un conjugado con un rendimiento 3 a 4 ve­
ces superior y una detectabilidad 5 veces su p e­
rior a la obtenida por conjugación con glutaral­
dehído. Sin embargo, cierto porcentaje de la
enzim a se inactiva. En este método, los re s i­
duos hidrocardonados de la enzima se oxidan
inicialmente con m-NalO^, produciendo grupos
aldehido y carboxilo. Los primeros forman lu e­
go una base de Schiff con grupos e-NH^ libres
no protonados de la IgG (o de proteína A, es
que se conjuga esta proteína) y por reducción
con NaBH^ se estabilizan los aductos am ino-
carbonilo formados. Este método optim izado
806 Metodologías
perínite conjugar hasta un 90% de la peroxida­
sa y se conserva un 90% de la actividad enzi-
inática. La mayoría de las moléculas de IgG se
conjugan con una molécula de peroxidasa, pero
un bajo número de moléculas de conjugado po­
seen una relación enzim a:anticuerpo de 2 o
más. La etapa final del proceso de conjugación
química comprende la separación de la enzima
y del anticuerpo no conjugados. Esto se logra
por precipitación con (NH^^^SO^ al 33% de sa­
turación (con lo que se separa la peroxidasa li­
bre), cro m ato g rafía de in terca m b io iónico
(DEAE-celulosa) y crom atografía de afinidad
por columnas con concanavalina A inmoviliza­
da en hi matriz sólida (con lo que se separa la
IgG libre de las moléculas del conjugado, el
que es específicamente retenido en la columna
y posteriormente eluido).
2. Conjugación inmunológica
Debido a que en la mayoría de los casos, la
actividad de las enzim as no se altera por su
unión a un Ac, es posible formar complejos in­
munes enzima-anti-enzima y utilizarlos como
trazador en reacciones inmunoenzimáticas (fig.
38.6). Ello se logra mediante un puenteo entre
el complejo inmune enzim a-anti-enzim a y la
inm unoglobulina a revelar, por medio de Ac
anti-inmunoglobulinas especie-específicos. E s­
te método presenta la ventaja de evitar la habi­
tual inactivación de las m oléculas de enzima
y/o de anticuerpo durante los procesos de con­
jugación química, reduce la coloración basal y
aumenta la detectabilidad.
En líneas generales, existen dos metodolo­
gías para la utilización de conjugados inmuno-
lógicos. En una de ellas, se adiciona en forma
secuencial el Ac anti-inmunoglobulinas, el Ac
anti-enzima y la enzima. Este esquema de tra­
bajo presenta la desventaja de que se debe tra­
bajar con los Ac anti-enzima purificados por
inmunoafinidad ya que, si se utUiza suero ente­
ro, la fracción y-globulina entera o la IgG total
anti-enzima habrá una elevada reactividad de
los Ac anti-inmunoglobulinas con y-globulina
espuria (no específica para la enzima).
En la otra metodología, los Ac anti-enzima
reaccionan con la enzima, formando los com­
plejos antes de ser utilizados en el ensayo y
presenta la ventaja de no requerir la purifica­
ción de los Ac específicos de enzima para su
realización. Esta segunda m etodología se ha
optimizado para la detección de inmunoglobu­
linas de distintas especies con peroxidasa (mé­
todo “peroxidasa-anti-peroxidasa” o PAP) o
con fosfatasa alcalina (método “fosfatasa alca-
lina-anti-fosfatasa alcalina” o APAAP). Para el
caso del PAP, los complejos peroxidasa-anti-
peroxidasa se preparan incubando una relación
óptima de suero específico y enzima. El preci­
pitado (complejos inmunes) se separa por cen­
trifugación, se lava y se redisuelve por leve aci­
dificación y adición de un exceso de enzima,
de modo de formar complejos inmunes solu­
bles en exceso de Ag, los que se pueden alma­
cenar durante años a -20°C en glicerol al 50%.
T am bién se han desarrollado m étodos de
puenteo inmunológico mediante la utilización
de AcMo anti-enzima, pero debido a que éstos
en su mayoría reconocen epitopes no repetidos
sobre la molécula de la enzima, el tamaño de
los complejos formados es pequeño y no se al­
canza una detectabilidad tan elevada como en
el caso del uso de sueros policlonales anti-enzi­
ma.
Inmovilización de inmunorreactantes
en fase sólida
La facilidad con que es posible separar el Ac
(o Ag) unido del libre (por simple aspiración o
decantación) cuando el complejo Ag-Ac está
inm ovilizado en fase sólida ha contribuido a
aumentar la popularidad de los ElA. Sin em ­
bargo, las superficies a ser utilizadas en este ti­
po de ensayos deben reunir ciertas característi­
cas, tales como la alta capacidad de unión de
inmunorreactantes (fases sólidas con una rela­
ción superficie/volum en elevada), deben ser
capaces de inmovilizar diversos inm unorreac­
tantes, debe producirse una desorción mínima y
desnaturalización despreciable de la molécula
inmoviUzada durante los ensayos.
Si bien existen numerosos soportes sólidos
utilizados en EIA, tales como agarosa, celulo­
sa, dextrán, vidrio, nitrocelulosa, etc., se ha im ­
puesto el uso de distintos plásticos debido a la
facilidad de operación con este material. La
forma de las superficies plásticas para ELISA
es variable: esferas, discos, tubos o placas (po-
licubetas) de fondo plano, en U o en V. Los
plásticos que han resultado mas aptos para la
fabricación de placas de ELISA son el poliesti-
reno y el cloruro de polivinilo (PVC). El poli­
propileno ha resultado igualmente útil para la
fabricación de tubos para ELISA. Sin embargo,
la utilización de tubos en EIA presenta la des­
ventaja de que requiere volúm enes relativ a­
mente grandes de muestras para las incubacio­
nes (aproximadamente 1 mi). Además, la utili­
zación de policubetas de poliestireno o PVC ha
facilitado la automatización de las técnicas, ya
que se dispone hoy en día de equipos que reah-
zan lavados, dispensado de reactivos y lecturas
de absorbancias directamente en las placas, lo ,
que representa una enorme simplificación de la
técnica.
La inm ovilización del inmunorreactante en
fase sólida puede ser covalente o no covalente.

La primera se emplea generalmente en los ca­
sos en los que la inmovilización por simple ad­
sorción no es eficiente (ya sea porque el inm u­
norreactante no se adsorbe bien o porque se de­
so rb e d u ra n te las e ta p a s p o s te rio re s del
ELISA). Para el caso de la unión no covalente,
la naturaleza de la interacción inmunorreactan-
te-plástico es principalmente hidrofóbica y de­
pende de la carga del inmunorreactante. Existe
cierto grado de desorción a lo largo del ensayo,
la que debe ser minimizada. Por ello es necesa­
rio usar el inmunorreactante a una concentra­
ción apropiada y lavar en forma intensiva luego
de cada etapa del EIA. La adsorción a la fase
sólida se puede describir de acuerdo con la
ecuación de Langmuir, propuesta para describir
la adsorción de una monocapa de gas sobre un
sóhdo:
1/m = 1/b -I- l/(bKc) (2)
donde m es la cantidad de inm unorreactante
adsorbida a la fase sólida, b es la máxima can­
tidad de inmunorreactante que puede adsorber­
se al plástico, K es la constante de afinidad del
inmunorreactante por la superficie sólida y c es
la concentración de inm unorreactante en fase
líquida. Mediante esta ecuación es posible cal­
cular la constante de afinidad K a partir de da­
tos experimentales.
Debido a la naturaleza de la interacción entre
el inmunorreactante y la fase sólida es posible
que ciertos antígenos se inmovilicen preferen-
cialmente por determinadas regiones de la mo­
lécula (porciones hidrofóbicas). De este modo
existe la posibilidad de que algunos epitopes
queden ocultos o enm ascarados, con lo que
pueden surgir dos inconvenientes. Por un lado
puede ocurrir que esos epitopes no puedan ser
detectados por Ac específicos. Por otro lado, es
posible que no puedan evidenciarse Ac especí­
ficos contra esos epitopes en sueros a analizar.
Para el caso de la inmovilización de Ac de
captura, se ha demostrado que sólo de un 3 a
10% de los sitios de unión permanecen funcio­
nales luego de la adsorción pasiva al pohestire-
no, según se inm ovilicen Ac monoclonales o
polielonales. Si la inm ovilización del Ac de
captura se realiza mediante la utilización de Ac
anti-inmunoglobulinas unidos a la fase sólida
o, si se inmovilizan Ac mareados con biotina
por unión a avidina adsorbida a la fase sólida,
se preserva más de un 70% de los paratopes del
Ac de captura. Así, hay evidencias de que la
adsorción al poiiestireno produce gran desnatu­
ralización de algunas macromoléculas inm ovi­
lizadas, con la consiguiente pérdida de su fun-
cionahdad. Para el caso de la adsorción pasiva
de Ac polielonales se ha detectado también una
pérdida de la avidez.
ELISA 807
La m áxim a cantidad de inm unorreactante
que se puede adsorber a la fase sólida se d eno­
mina “capacidad de saturación” de la placa.
Por debajo de este valor hay una relación lineal
entre la concentración de inmunorreactante en
fase líquida y la cantidad de éste que se adsor­
be a la fase sólida (ver ecuación 2). Ese valor
está en el orden de 1 a 10 |ig/ml para una am ­
plia variedad de Ag y Ac, siendo independiente
del peso molecular del inmunorreactante. Sin
embargo, el porcentaje de inmunorreactante fi­
jado a la fase sólida es variable y propio para
cada uno. Por encima de ese valor de satura­
ción comienza a observarse adsorción en multi-
capas, lo que puede interferir en etapas poste­
riores del EIA. En el caso de la inmovilización
de mezclas antigénicas a concentraciones que
estén por encima de la capacidad de saturación
de la placa pueden manifestarse fenómenos de
com petencia entre las moléculas de Ag de la
mezcla por los sitios de la placa, que son los li­
mitantes en la interacción.
En la práctica se dispone de dos métodos para
calcular la capacidad de saturación de la placa.
Uno de estos métodos consiste en adsorber dis­
tintas concentraciones de un Ag marcado con un
isótopo radiactivo y medir la radiactividad en
las fosas de la placa luego de la etapa de adsor­
ción. El otro método consiste en adsorber distin­
tas concentraciones de un Ag no marcado y, en
una etapa posterior, adsorber una cantidad cons­
tante y saturante de peroxidasa a los sitios no
ocupados (método de la saturación con peroxi­
dasa). La actividad enzimática detectada será in­
versamente proporcional a la cantidad de Ag in­
movilizado. Este método tiene la ventaja de que
no requiere el empleo de isótopos radiactivos.
De acuerdo a las características de a d so r­
ción, es posible distinguir dos clases de placas:
las que poseen una baja capacidad de unión de
Ag y las que poseen una alta capacidad de
unión de Ag.
Los factores más importantes en el proceso
de adsorción de inmunorreactantes a fases sóli­
das son la temperatura, el tiempo, el pH y la
concentración. En general, el proceso de unión
a fase sólida se realiza incubando toda la noche
a 4°C o una hora a 37°C. La concentración ó p ti­
ma para la sensibilización de placas de ELISA
está entre 1 y 10 |ig/ml para Ag o Ac puros o
10 a 100 ng/ml para mezclas antigénicas co m ­
plejas. Los inmunorreactantes se diluyen h a b i­
tualmente en una solución isotónica tamponada
de N aCl 0,15M y fosfatos 0 ,0 IM , pH = 7,4
(PBS) o en un “buffer” carbonato de sodio - b i­
carbonato de sodio 0,1M, pH = 9,6. Debido a la
naturaleza de la interacción, la presencia de d e ­
tergentes no-iónicos o iónicos en la solución
del inmunoiTeactante a unir a la fase sólida in­
terfiere en la etapa de unión a la misma.
808 Metodologías
En determinados casos se hace necesaria la
unión covalente de ciertos inmunorreactantes a
las fases sólidas plásticas. Tal es el caso de la
unión de ADN nativo, haptenos, oligopéptidos
pequeños o Ag que se unen con muy baja afini­
dad al plástico. El pretratamiento del plástico
con glutaraldehído permite la unión covalente
de Ag con grupos amino libres. La inmovihza-
ción de componentes con alta afinidad por el
plástico, marcados con moléculas que hagan
puenteo, es un artificio que permite la inmovili­
zación de Ag que se unen con muy baja afini­
dad a la superficie sólida. Estas moléculas que
hacen el puenteo son las mismas que se utilizan
para el acoplamiento covalente de las enzimas a
los Ac. El ADN nativo se inmoviliza por pretra­
tamiento del plástico con sustancias policatióni-
cas, tales como la protamina o la polilisina.
También es posible inmovilizar células ente­
ras, para lo que se realiza un pretratamiento de
las placas de ELISA con polilisina, Ac, leetinas
o glutaraldehído.
Ensayos inmunoenzimáticos cuantitativos
En este tipo de ensayos, uno de los inmuno­
rreactantes está inmovilizado en la fase sólida.
En una etapa siguiente se agrega la muestra con
lo que el componente a analizar es retenido.
Posteriormente éste reacciona con el inmuno­
rreactante específico marcado con una enzima.
La medida de la actividad enzimática será una
m edida de la actividad o co n centración del
componente de la muestra retenido por el inmu­
norreactante e inmovilizado en la fase sólida.
En cualquiera de sus variantes, la etapa de
lavado es crítica para separar el componente
específicamente unido al inmunorreactante in­
movilizado en la fase sólida, de componentes
que pueden reaccionar en forma no específica.
En general, las soluciones de lavado son sali­
nas isotónicas tamponadas suplementadas con
un detergente no iónico (como Tween 20 al
0,05%), lo que favorece la eliminación de esos
componentes inespecíficamente retenidos. Los
volúmenes de incubación en general son de 50
a 200 lal.
Debido a que después de la etapa de sensibi­
lización de la fase sólida (ya sea con Ag o con
Ac) persisten sitios de unión al plástico no ocu­
pados, es necesario bloquear estos sitios con
proteínas ajenas al sistema. De otro modo, los
inmunorreactantes que se emplearán en etapas
posteriores podrán unirse a estos sitios, produ­
ciendo resultados falsamente positivos. Con es­
te fin se emplean seroalbúmina bovina, sueros
de animales de diversas especies (caballo, ca­
bra, oveja, etc.) o leche en polvo descremada,
preparadas en solución salina isotónica tampo­
nada. Si bien la leche descremada al 3% es la
solución de bloqueo más económica y su uso
se ha difundido ampliamente, hay dos situacio­
nes en las que no es posible su em pleo: a)
cuando se está utilizando un sistem a Ag-Ac
donde el Ag es algún componente de la leche
(por ejemplo, al evaluar la respuesta inmune en
pacientes alérgicos a diversos componentes de
la leche), y b) cuando se está evaluando el cur­
so de una respuesta inmune en sueros bovinos,
ya que un sistema de este tipo se revelará al
e m p le a r un c o n ju g a d o e n z im á tic o de Ac
anti-inmunoglobulinas bovinas, el que podría
reaccionar con las inmunoglobulinas bovinas
de la leche utilizada como bloqueante y que se
han inmovilizado en la fase sólida.
En las etapas posteriores del ELISA existe el
riesgo de que algunas moléculas del inm uno­
rreactante (un Ag, un Ac o el conjugado enzi­
mático) se unan en forma no específica a algún
componente inmovilizado en la fase sólida. Es­
to produciría resultados falsamente positivos en
el ensayo. Para evitar este efecto se diluye cada
inmunorreactante en presencia de un gran exce­
so (0,1-1%) de una proteína ajena al sistema
con el objeto de que compita con el inm uno­
rreactante por esos sitios de unión no específi­
ca. En general, se emplean las mismas proteí­
nas que se emplearon durante la etapa de blo­
queo. Además, y con el mismo fin, a estas so­
luciones diluyentes suele agregárseles un deter­
g en te no ió n ic o , sien d o m ás e m p lead o el
Tween 20 al 0,05%.
El tiempo y temperatura óptimos de incuba­
ción con cualquiera de los inmunorreactantes
debe establecerse en forma empírica. En gene­
ral se incuba entre una y tres horas a tempera­
tura am biente o a 37°C en cám ara húm eda,
aunque en estas condiciones suele detectarse
una mayor actividad enzimática en las fosas la­
terales de las placas de ELISA (“efecto b o r­
de”), producto del gradiente de temperatura ge­
nerado en la placa cuando se la lleva de tempe­
ratura ambiente a 37°C, sumado al efecto acele­
rador de la velocidad de reacción que produce
el aumento de temperatura. Algunos autores re­
comiendan el precalentamiento a 37°C de las
soluciones a ser usadas con el objeto de mini­
mizar este “efecto borde”.
La dilución óptima de conjugado enzimático
a ser empleada debe determinarse por titula­
ción previa. Para el caso de un conjugado anti-
inmunoglobulinas marcado con enzima, es po­
sible inm ovilizar el Ag (inmunoglobulinas) e
incubar con diluciones seriadas de ese conjuga­
do. Una vez revelado el sistema, se elegirá la
m ayor dilución que genere una absorbancia
máxima (saturante) con la intención de usar, en
el ensayo posterior, una cantidad de conjugado
en exceso y que éste no sea el limitante en la
reacción.

Un problema habitual en ELISA diseñados
para la determinación de Ac es la reactividad
cruzada que presentan las inmunoglobulinas de
distintas especies. Esto puede solucionarse me­
diante el uso de anticuerpos monoclonales, m e­
diante el uso de antisueros específicos de espe­
cie (previamente adsorbidos con inmunoglobu­
linas de las especies que pueden producir inter­
ferencia en el ensayo) o por otros métodos. En­
tre éstos hay que destacar la posibilidad de em ­
plear Ac policlonales anti-inm unoglobulinas
(conjugados enzim áticam ente) preincubados
con suero (o inmunoglobulinas) de la especie
con las que se desea que el conjugado no reac­
cione, de modo de reahzar una competición/in­
hibición de los Ac de reactividad cruzada que
forman parte de la población de moléculas de
Ac que integran el conjugado.
Ya se mencionó que los EIA cuantitativos
pueden clasificarse en EIA no competitivos y
EIA competitivos y que en ambos casos pue­
den inmovilizarse tanto el Ag como el Ac. En
los EIA no competitivos el conjugado enzimá­
tico debe emplearse en exceso con el objeto de
lograr una detectabilidad máxima. C ontraria­
mente, en los EIA competitivos el conjugado
enzim ático (o el Ac que luego será revelado
con un conjugado anti-inmunoglobulinas usado
en exceso) debe ser limitante en la reacción,
pero debe usarse una dilución tal que en ausen­
cia de competidor el sistema produzca una ab­
sorbancia cercana al máximo (generalmente se
elige la dilución que genera un 90% de la ab­
sorbancia máxima). Esto asegura en la práctica
un rango máximo de detección del competidor.
1. Enzimoinmunoensayos no competitivos
con Ag inmovilizado en fa se sólida
En esta clase de ensayos se pueden distinguir
tres tipos de métodos, ordenados por aplicabili-
dad general y detectabilidad creciente: a) méto­
dos directos; b) métodos indirectos; c) métodos
por puenteo.
Los métodos directos presentan la desventaja
de que debe disponerse de un conjugado enzi­
mático para cada Ag que se desea detectar. Es
una metodología poco empleada, salvo para los
casos de titulación de conjugados anti-inmuno­
globulinas, donde se inmovilizan las inmuno-
globulinas específicas contra las cuales reac­
ciona el conjugado y se incuba con diluciones
seriadas de éste. Este método puede describirse
de la siguiente manera:
—A r -i- Ac-E ■ Ae-Ac-E
donde | la fase sólida y Ae-E son Ac anti-
Ag marcados con enzima.
ELISA 809
Los métodos indirectos consisten en la in­
movilización de Ag, reacción con Ac específi­
cos y posterior revelado con un conjugado anti-
inmunoglobulinas especie-específico. La reac­
ción se produce en dos etapas, que se pueden
describir como:
J - Ag -h Ac, ^ -A g-A c,
-A g -A c , -f- Ac 2-E - A g-Ac|-Ac,-E
donde Ac, son los Ac específicos de Ag de la
muestra que se está analizando y Ac^-E son Ac
anti-inmunoglobulinas de la especie 1, m arca­
dos con enzima. Estos métodos son g en eral­
mente empleados para la titulación de Ac espe­
cíficos en sueros de distintas especies. Tienen
una detectabilidad unas 10 veces superior a la
de los métodos directos y una ventaja im por­
tante es que el mismo conjugado puede em ­
plearse para la detección de Ac en sueros de la
misma especie contra un niimero muy grande
de Ag.
Los métodos por puenteo emplean conjuga­
dos inmunológicos (como es el caso de la p ero ­
xidasa-anti-peroxidasa o PAP), la reacción en­
tre biotina y avidina o lectinas. El PAP requiere
del empleo de un Ac que haga el puenteo entre
el Ae anti-enzima y el Ac que reaccionó con el
Ag y que se encuentra sobre la fase sólida. La
reacción de la PAP se produce en dos etapas,
que se pueden describir como:
— A g -I- A c , — A g -A c,
-A g -A c , + A c2 + P A P - - A g ^ A c i-A c ,~ P A P
donde Ac, es el Ac específico de Ag presente
en la m uestra (sueros) que se desea analizar,
ACj es el Ac que reconoce al Ac, y al complejo
peroxidasa-anti-peroxidasa (PAP). Como p u e ­
de observarse, el Ac, y el Ac anti-peroxidasa
del complejo PAP deben provenir de la m ism a
especie. Además, el Ac^ debe emplearse en ex ­
ceso, de modo de permitir que uno de sus sitios
de combinación reaccione con el Ac, y el otro
sitio de combinación lo haga con el complejo
PAP. Este método tiene una detectabilidad su­
perior al método indirecto. También se han d e­
sarrollado sistemas de ELISA similares al PAP,
pero donde se ha reem plazado el empleo del
Ac anti-inm unoglobulinas (Ac^) por proteína
A, aprovechando la presencia de varios sitios
de unión de inmunoglobulinas en esta proteína,
lo que le permite efectuar el puenteo.
Otra variante de este tipo de métodos consis­
te en emplear el sistema avidina-biotína, en un
ELISA que lleva tres etapas:
810 Metodologías
A g + A ci H H — A g -A ci
— Ag-A C] + A c 2 - b io tin a ^
~ A g - A c i~ A c 2 -b io tin a + a v id in a + E -b io tin a
I — A g -A c I"A c 2 -b io ti n a -a v id in a -b io tin a -E
donde Ac, es el Ac específico de Ag de la
muestra (suero) y Ac^ son Ac anti-inmunoglo-
bulinas de la especie !, marcados con biotina.
Alternativamente, es posible revelar el sistema
empleando un conjugado avidina - enzima en
lugar de usar avidina libre y enzima marcada
con biotina.
Este método tiene una detectabilidad similar
y aplicabilidad más general que el método de la
PAP debido a que no hay restricción de espe­
cie. La preparación previa de los com plejos
avidina-biotina-enzim a perm ite increm entar
aun más (entre 20 y 100 veces) la detectabili­
dad del sistema respecto del método indirecto.
2. Enzimoinmunoensayos no competitivos
con Ac inmovilizado en fa se sólida
Estos ensayos Inmunoenzimáticos reciben el
nom bre genérico de E LISA de captura. En
principio, es posible inmovilizar tanto inmuno-
globulinas enteras como fragm entos E(ab) o
F (a b ’) (“Ac de cap tu ra”) con el objeto de
cuantificar Ag en diversas muestras. También
es posible emplear este sistema para la titula­
ción de Ac específicos en sueros. Existen nu­
merosas variantes de este método, aunque se­
gún la clase de ELISA de captura habrán cues­
tiones específicas y limitaciones que deben ser
consideradas. La primera y principal es el re­
quisito de que cualquier Ac anti-inmunoglobu­
linas (ya sea marcado enzimáticamente o no)
que se emplee en estos sistemas no debe reac­
cionar con el Ac inmovilizado en la fase sólida,
ya que eso traería aparejada una reactividad ba­
sal muy elevada. En algunos casos esto se con­
sigue empleando Ac de captura provenientes'
de la misma especie que los Ac que componen
el conjugado enzimático, aunque una alternati­
va que se va imponiendo día a día es el uso de
Ac monoclonales que reconocen inmunoglobu­
linas de una sola especie.
Las distintas variantes de los ELISA de cap­
tura comparten la primera etapa que es la cap­
tura del Ag a partir de una mezcla antigénica
compleja (“exti'acción inmune”). Esta etapa se
puede esquematizar de la siguiente manera:
— A ci + A g ^
— A g - A c ,-A c 2 -b io tiiia
■A c i-A g
Luego de esta etapa, se pueden realizar dis­
tintas variantes de ELISA de captura. Algunas
de ellas se pueden esquematizar de la siguiente
manera:
Variante 1:
— A c p A g + A c 2 -E —AcrAg-Ac2-E
Variante 2:
■ -A C ]-A g + A c 2 -
I • A c i- A g - A c j
—Aci-Ag-Ac2 + AC3-E - - Ac,-Ag-Ac2-Ac3-E
Variante 3:
-F(ab’)2^Ag + Ac2-4Í F(ab’)2-Ag-Ac2
- F ( a b ’) ,- A g - A c 2 + p ro te ín a A + A c ,-E -
- F ( a b ’)2 -A g -A c2 -p ro teín a A -A c j-E
Variante 4:
■ -A crA g +Acj — Ac,-Ag-Ac2
—AC]"Ag-Ac2 + Ac3 + AC4-E -
—F(ab’)2-Ag-Ac2-Ac3-Ac4-E
Variante 5:
— A c j-A g + A c 2 -b io tin a - —A c i-A g - A c 2 -b io tin a
A c p A g -A c 2 -b io tin a + a v id in a + E ~ b io tin a -
■■ — A c I-A g - A c 2 “b io tin a -a v id in a -b io tin a -E
Variante 6:
— A c ,-A g + A c 2 —Aci-Ag-Ac2
— A c |- A g - A c 2 + A c 3 -b io tin a
— A c ,-A g -A c 2 " A c 3 -b io tin a
— A c r A g -A c 2 - A c i- b io tin a + a v id in a + E -b io tin a -
— A c i-A g - A c 2 - A c 3 -b io ü n a -a v id in a -b io tin a -E
En la variante 2, ACj-E es el conjugado enzi­
mático de Ac anti-inmunoglobulinas de la es­
pecie 2 que no debe reaccionar con el ACj. En
la variante 3, ACj-E es un complejo enzima-an-
ti-enzima y la proteína A hace de puente entre
estos Ac y el Ac^. Debido al empleo de proteí­
na A (que reacciona con las porciones Fe de las
inmunoglobulinas) en este tipo de sistemas de­
ben emplearse fragmentos F(ab) o F(ab’)^ co­
mo Ac de captura. Para la variante 4 existen
 ELISA 811

dos alternativas. En una de ellas, Ac^-E es un una solución patrón) por el Ac inmovilizado en
complejo enzima-anti-enzima, el que es puen- la fase sólida. La reacción puede esquematizar­
teado con el Ac^ por medio del ACj (anti-inmu- se de la siguiente manera:
noglobulinas de la especie de la que vienen los
Acj y Ac^). En la otra alternativa, Ac^ son Ac - A c + Ag + Ag-E — A c-A g o [ m - A c-A g -E
anti-inmunoglobulinas de la especie de la que
viene el Ac^ y Ac^-E es el conjugado enzimáti­ La reacción puede realizarse en una etapa
co de Ac anti-inmunoglobulinas de la especie (incubación simultánea de Ag y Ag-E) o en dos
de la que viene el Ac,. La variante 6 se asemeja etapas secuenciales. En este caso, en la primera
bastante a la variante 4, con la diferencia de etapa se incuba con el Ag libre y, en la segun­
que el ACj se encuentra marcado con biotina y da, se incuba con el Ag-E. Este método tiene
que el conjugado enzimático en lugar de ser un una detectabilidad superior al método que se
Ac anti-inmunoglobulinas de la especie de la realiza en una sola etapa.
que viene el Ac^ es un conjugado inmunológi­ Estos ELISA revelan la presencia de Ag li­
co avidina-biotina-enzima. Tanto en esta va­ bre como una caída en la absorbancia respecto
riante, como en la variante 5, es posible revelar del control que se incuba sin Ag libre (“dosis
el sistema empleando un conjugado avidina - cero”).
enzima en lugar de usar avidina libre y enzima
marcada con biotina. 4. Enzimoinmunoanálisis competitivos
Los sistemas de ELISA de captura tienen con A g inmovilizado en fase sólida
gran utilidad para la detección de Ac de distin­
tas clases y subclases específicos de Ag. En la Esta metodología se basa en la inhibición de
práctica este método se aplica para la determi­ la reactividad de un conjugado enzimático Ac-
nación de IgM específica (fig. 38-7), lo que es E Ag-específico con Ag inmovilizado en la fa­
particularmente litil para diferenciar infeccio­ se sólida, por Ag libre presente en la muestra
nes agudas de crónicas. No es conveniente ha­ (o en una solución patrón). La reacción puede
cer la determinación de IgM por ELISA indi­ esquematizarse de la siguiente manera:
recto con Ag inmovilizado debido a la mayor
concentración y afinidad de la IgG sérica espe­ - A g + A g ir — A g-A c-E +
cífica de Ag, lo que bloquea la reactividad de
la IgM y en una titulación por ELISA de ampli­ + A g m u c s tra O |jjj|j|j| — A g + A g n iu e stra " A C- E

ficación produciría resultados subvaluados. El

sistema desarrollado para la determinación de La actividad enzimática detectada en fase só­
IgM específica (o de Ac de distintas clases o lida es inversamente proporcional a la cantidad
subclases) consiste en inmovihzar Ac anti-cla- de Ag presente en la muestra o solución patrón.
se o subclase de la inmunoglobulina que se de­ Esta metodología, al igual que para el caso del
sea determinar. Esto permite capturar todas las ELISA competitivo con Ac inmovilizado en fa­
inmunoglobulinas séricas de esa clase o subcla­ se sólida, puede realizarse en una etapa (incuba­
se del suero problema. Posteriormente el siste­ ción simultánea de Ag libre y Ac-E) o en dos
ma se enfrenta contra el Ag específico. Si en el etapas secuenciales. En este caso, en la primera
suero habían Ac Ag-específicos de la clase o etapa se incuba el Ag libre con el Ac-E y en la
subclase, el Ag será capturado. Finalmente, só­ segunda etapa se incuba esa mezcla de reacción
lo resta poner en evidencia la presencia del Ag con el Ag inmovilizado en la fase sólida. ,
capturado en la fase sólida, para lo que se em­ Debido a que para este tipo de ELISA debería
plea alguno de los métodos discutidos en párra­ disponerse de un conjugado Ac-E específico pa­
fos anteriores (utilización de Ag marcado, reac­ ra cada Ag que se quiera cuantificar, se ha desa-
ción posterior del Ag capturado con Ac Ag-es- ■rrollado una variante que permite utilizar conju­
pecíficos marcados con enzima, etc.). gados Ac-E anti-inmunoglobulinas especie-es-
pecíficas para cuantificar diversos Ag. El esque­
3. Enzimoinmunoanálisis competitivos ma general de esta variante es el siguiente:
con Ac inmovilizado en fase sólida
Los enzimoinmunoanálisis competitivos (ya
sea por inmovilización de Ac o por inmoviliza­
I - - - A g + A g m u c stra + A C i - Ag-AC|

— A g + A g n iu e s tr a - A C |
+ A g in u e s tr a O

ción de Ag) tienen por objeto la cuantificación

de Ag. ■ — A g-Aci + A c 2-E —> H H — A g-A ci-A c 2-E

Los enzimoinmunoanálisis competitivos con

Ac inmovilizado en fase sólida se fundamentan donde Ac, es el Ac específico de Ag y Ac^-E es
en la competición entre el Ag marcado con en­ el conjugado anti-inmunoglobulinas de la espe­
zima y el Ag libre presente en la muestra (o en cie 1 ínarcado con enzima.
812 Metodologías
Anti-lgM IgM sérica
inmobilizado
en fase sólida IgM sérica
Incubación con Ag
Nuevamente, la existencia de Ag libre se
manifestará como una caída en la absorbancia
respecto del control incubado sin Ag libre
(“dosis cero”).
Procesamiento de datos y expresión de
resultados en ensayos inmunoenzimátieos
1. Cálculo del título de un suero
Los resultados de los ELISA pueden expre­
sarse de dos formas. Por un lado es posible in­
formar la concentracicSn (molar, mg • mb’, etc.)
de un Ag por comparación e interpolación en la
zona de mayor pendiente (sensibilidad) de una
curva de calibración hecha con una solución de
Fig. 38-8. C álculo del título de un suero por titulación
a p un to final. Se puede observar que el título del suero
depende del criterio elegido para calcularlo. Si se elige co­
m o título la dilución del suero que produce una absorban­
cia igual al 50% de la absorbancia rnáxim a del sistem a se
ob tien e un valor (título A) que será diferente del obtenido
si se elige com o título la dilución del suero que produce
una absorbancia de 0,2 (título B).
Fig. 38-7. D etección de IgM esp e­
cífica de A g p or E L ISA de cap tu ­
ra. En este en say o , se c a p tu ra la
IgM sérica total (m arrón) m ediante
la utilización de Ac anti-IgM inm o­
v iliza d o s en la fase só lid a (azul).
P o ste rio rm e n te la Ig M e s p e c ífic a
captura el Ag (verde) y finalm ente
se revela su presencia por alguno de
los m étodos discutidos en páginas
anteriores.
Revelado del
sistema con un
Ac anti-Ag
marcado con
enzima
concentración conocida de Ag; por otro lado se
puede informar la actividad de un suero en uni­
dades arbitrarias. Esto se debe a que no es posi­
ble informar el título de un suero en mg • m i'
de Ac específicos debido a la heterogeneidad
de clases, subclases y afinidades de los Ac que
componen los sueros. Este problema se presen­
ta también si se ciuiere comparar la reactividad
del suero con la reactividad de un suero patrón
en un determinado ensayo, ya que ambos pre­
sentarán una curva dosis-respuesta propia.
El problema del procesamiento de resultados
en ELISA se presenta entonces con el cálculo
del título de Ac sét;icos específicos. En los pá­
rrafos siguientes se comentan algunos aspectos
relacionados a este problema.
Existen varios métodos para calcular el título
de sueros; cada uno presenta una serie de ven­
tajas y desventajas. Los más ampliamente utili­
zados:
a) el método de titulación a punto final;
b) la medida de la absorbancia de un suero a
dilución sitnple, y
c) el cálculo del título de un suero en unida­
des arbitrarias por comparación con un suero
patrón.
a) Titulación a punto fin a l
El método de titulación a punto final consis­
te en analizar el suero problema en diluciones
seriadas en razón 2. Si se grafica la absorbancia
en función del logaritmo de la inversa de la di­
lución del suero se obtendrá una curva sigmoi­
dea. Si se elige una determinada absorbancia se
podrá calcular la dilución de suero que produce

DO
1 lución simple. Para ello se construyen curvas
0,8 +
0,6 -
0 ,4 - lo de cada uno por el método de la titulación a
0,2
C . • • 2*
log [titu lo ]
Fig. 38-9. C álculo del títu lo de un suero por m edida de
la absorbancia a dilución sim ple. Si se grafica la absor­
bancia de una dilución pre-establecida de sueros negativos
y positivos en función del logaritm o del título (por titula­
ción a punto final) de esos sueros (puntos azules) se obten­
drá una curva sigm oidea (rojo) com o la de la figura. A sí se
podrá calcular el título de un suero problem a como si se lo
hubiese titulado a punto final, por interpolación en la curva
de la absorbancia de ese suero ensayado a dilución simple.
dicha absorbancia y este valor podrá ser toma­
do como el título de ese suero (fig. 38-8). El
problema está en elegir ese valor de absorban­
cia. Algunos autores eligen como título la dilu­
ción de suero que produce una absorbancia
igual al doble de la absorbancia producida por
el control incubado sin suero. Otros autores eli­
gen una absorbancia de 0,5 como valor para es­
tablecer el título de un suero, mientras que
otros prefieren elegir como título la dilución de
suero que produce un 50% de la absorbancia
máxima. Como es fácil de imaginar, estos cri­
terios brindarán títulos que no serán compara­
bles entre sí. Lo importante es fijar un criterio
de trabajo y respetarlo, de modo de poder com­
parar títulos de sueros a lo largo del tiempo. El
método de la titulación a punto final presenta la
ventaja de que se analiza la curva de titulación
de cada suero. Esto permite obtener el título de
sueros ya sean de bajo o de alto título. Sin em­
bargo, es un método laborioso y costoso, por lo
que en muchos casos se prefiere el inétodo de
la medida de la absorbancia a dilución simple.
b) Medida de la absorbancia a dilución simple
El método de la absorbancia a dilución sim­
ple consiste en tomar como título la absorban­
cia del suero a una dilución fija, elegida previa­
mente. Si bien es un método sencillo y más eco­
nómico que el anterior, presenta la desventaja
de no ser útil para discriminar entre sueros de
bajo título (porque la absorbancia está demasia­
do cercana a la obtenida en ausencia de Ac) ni
para discriminar entre sueros de alto título (por­
que la absorbancia está cercana al máximo de
saturación del sistema, en muchos casos limita­
dos por la capacidad del lector de policubetas).
ELISA 813
Existe un método alternativo que permite
calcular el título de un suero analizándolo a di­
dosis-respuesta de un gran número de sueros
(desde negativos hasta positivos altos) o de un
suero patrón altamente positivo y diluciones
del mismo en süero negativo. Se calcula el títu­
punto final. Luego se determina la absorbancia
de cada suero a una dilución simple (por ejem­
plo, 1/1000). Se obtendrá para cada suero, pa­
res de valores (título; absorbancia a dilución
simple). Si se grafica esa absorbancia (en las
ordenadas) en función del logaritmo del título
(en las abscisas) se obtendrá una curva sigmoi­
dea (fig. 38-9). Posteriormente se podrá anali­
zar cualquier nuevo suero a la dilución simple
elegida y, por interpolación en esta curva sig­
moidea, calcular su título. Este método presen­
ta la ventaja de que se podrá calcular el título
de un suero analizándolo a dilución simple. Sin
embargo, presenta la desventaja de que se asu­
me un paralelismo entre las curvas de titulación
de los diferentes sueros, lo que en la práctica
pocas veees ocurre. Además, el método es útil
sólo en las zonas donde la curva sigmoidea tie­
ne mayor pendiente, si bien existen artificios
matemáticos para expandir el rango útil de la
curva (por ejemplo, aplicando la función logit).
c) Título de un suero en unidades arbitrarias
p or comparación con un suero patrón
El método de titulación y comparación con
un suero patrón consiste en titular el suero pro­
blema y un suero patrón, al que arbitrariamente
se le asigna una determinada cantidad de uni­
dades • ml * como actividad de Ac. Partiendo
de la base de que una misma absorbancia es
producida por cantidades equivalentes de Ac,
será posible calcular la cantidad de unidades ■
m l' del suero problema por comparación con
el suero standard (fig. 38-10). Ese valor de ab­
sorbancia para realizar la comparación debe
caer en la zona de mayor pendiente de las cur­
vas de titulación de los sueros. En caso de no
disponerse de un suero patrón será posible to­
mar como estándar una mezcla (“pool”) de sue­
ros positivos, a la que se le asigna una determi­
nada cantidad de unidades ■m l'. Este método
presenta la desventaja de que, para que sea po ­
sible comparar el comportamiento de los sue­
ros, éstos deben originar curvas de titulación
paralelas. Sin embargo, esta situación se da po­
cas veees en la práctica.
2. Cálculo del valor de corte
Un elemento esencial en todo ELISA cuanti­
tativo es establecer el valor de discriminación
814 Metodologías
entre una muestra positiva y una muestra nega­
tiva. Este valor se denomina valor de corte o
“cut'Off ’ y es independiente del método usado
para el cálculo del título del suero.
En todo ELISA, los sueros negativos mues­
tran una comportamiento que se asemeja a una
distribución normal, pero presentan un sesgo
positivo o tendencia a producir valores de ab­
sorbancia o títulos mas altos que los esperados
si siguieran una distribución normal (véase fig.
38-11).
Debido a este comportamiento, y desde un
punto de vista matemático, el uso de paráme­
tros que surgen de muestras que siguen tal dis­
tribución no es formalmente correcto en este ti­
po de ELISA. Sin embargo, el desvío estándar
es un parámetro ampliamente utilizado en di­
versos ELISA para establecer el valor de corte
y puede calcularse como:
D S= J i : ( x . - m ) ^
n- 1
donde n es el número de sueros negativos ana­
lizados, m es el media aritmética y x¡ es la
reactividad de cada suero.
El análisis de las muestras por duplicado o
triplicado mejora la confiabilidad del DS obte­
nido pero la distribución de la reactividad de
los sueros negativos no cambia, al igual que
ese sesgo positivo antes mencionado.
Para el caso de un número bajo de muestras
negativas, la distribución que se aplica habi­
tualmente es la distribución t, la que presenta
un área mayor en las colas de la curva de distri­
bución.
Otro aspecto a tener en cuenta cuando se rea­
lizan ensayos serológicos en general y ELISA
en particular es la confiabilidad de un resulta­
do, ya sea positivo o negativo. Esta confiabili­
dad depende de la prevalencia del Ag o Ac en
la población. Para aclarar esto es necesario de­
finir dos parámetros: el índice de detectabilidad
para muestras positivas [ID(-i-)] y el índice de
detectabilidad para muestras negativas [ID(-)].
El ID(-i-) es la medida de la habilidad del ensa­
yo de mostrar como positiva a una muestra que
realmente es positiva (también conocido como
“sensibilidad”, término que no debe confundir­
se con la “sensibilidad del ensayo” -definida
anteriormente-); por otra parte, el ID(-) es la
medida de la habilidad del ensayo de mostrar
como negativa a una muestra que realmente es
negativa (también conocido como “especifici­
dad”). En términos matemáticos se pueden es­
cribir como
positivos en el ensayo
S ensibilidad o ID(-’r ) =
positivos en el ensayo
+ falsos negativos
negativos en el ensayo
Especificidad o ID (-) = -------------------------------------- x 100
negativos en el ensayo
+ falsos positivos
donde los positivos en el ensayo son las mues­
tras positivas que el ensayo detecta como posi­
tivas, los falsos negativos son las muestras que
en realidad son positivas pero que el ensayo
muestra como negativas, los negativos en el
ensayo son las muestras negativas que el ensa­
yo detecta como negativas y los falsos positi­
vos son las muestras que en realidad son nega­
tivas pero que el ensayo detecta como positi­
vas. Por supuesto, para poder calcular estos pa­
rámetros es necesario disponer de un lote de
muestras positivas y negativas conocidas.
La confiabilidad en la positividad [C(-i-)J o
valor predictivo es la probabilidad de que una
muestra que el ensayo detecta como positiva
sea realmente positiva. Del mismo modo, la
confiabilidad en la negatividad [C(-)] es la pro-
babiUdad de que una muestra que el ensayo de­
tecta como negativa sea realmente negativa. En
términos matemáticos, se pueden escribir como
positivos en el ensayo
C(+) = X 100
positivos en el ensayo + falsos positivos
negativos en el ensayo
C(-) = X 100
negativos en el ensayo + falsos negativos
Para ver el impacto de la prevalencia (núme­
ro de individuos positivos por cada 100 indivi­
duos) sobre estos parámetros, veamos dos si­
tuaciones teóricas donde los ID(-t-) e ID(--) son
del 90% y la prevalencia es del 2% en un caso
y del 30% en el otro. En el primer caso, una
prevalencia del 2% significa que de cada 1000
m.uestras, 20 son positivas. Sin embargo, con
unos ID del 90%, el ensayo sólo detecta a 18
como positivas (2 son falsos negativos) y a 882
como negativas (98 son falsos positivos). De
todos los positivos detectados con el ensayo,
sólo 18 son realmente positivos. Esto hace que
la C(+) sea del 15,5%. Para las muestras nega­
tivas tenemos que de las 884 (882 + 2) detecta­
das como tales, sólo 882 lo son realmente, lo
que hace que la C(-) sea del 99,8%. Para el ca­
so de una prevalencia del 30% la C(-i-) aumenta
enormemente a 79,4%, mientras que la C(-)
cae levemente a 95,5%.
El valor de corte del sistema debe ser tal que
minimicé los resultados falsos, ya sean positi­
vos o negativos. En muchos casos existe una
zona de solapamiento en la distribución de la
reactividad de sueros positivos (los de bajo tí­
tulo) y negativos, en donde no puede estable­
X 100
cerse con certeza si una muestra que cae en esa
zona de la distribución es positiva o negativa
(fig. 38-12). En estos casos se elegirá un valor

de corte de manera tal de tener más falsos posi­
tivos o falsos negativos, según qué tipo de error
produzca consecuencias menos graves.
Si se analiza un gran número de muestras, se
puede establecer el valor de corte como la reac­
tividad media de los sueros negativos -i- 2 o 3
DS. Si paralelamente se analiza la reactividad
de una muestra positiva standard y/o una mues­
tra negativa standard, será posible expresar el
valor de corte como un porcentaje de la reacti­
vidad de estas muestras standard. De este mo­
do, en ensayos subsiguientes se podrá calcular
el valor de corte analizando únicamente la
reactividad de estas muestras patrones y multi­
plicando por un factor obtenido aplicando la si­
guiente fórmula:
A,
ve = VCn X■
Ao
donde VC es el valor de corte para el día que
se realiza el ensayo, VCq es el valor de corte
calculado el día que se analizó un gran número
de muestras negativas, A^ es la absorbancia del
standard el día que se realiza el ensayo y Ag es
la absorbancia del estándar el día que se calcu­
ló el valor de corte por análisis de la reactivi­
dad de un gran número de muestras negativas.
La relación VCo/A,, es el factor que habitual­
mente proveen los fabricantes de reactivos co­
merciales de ELISA para el cálculo del valor
de corte.
Este método de cálculo del valor de corte
permitirá ahorrar tiempo y dinero, además de
evitar las variaciones interensayo en los ELI­
SA.
Distintas modalidades del ELISA
Se han desarrollado distintas modalidades
del ELISA. Entre ellas, las más importantes
son las siguientes:
1. TERELISA.
2. GEDELISA.
3. DIG-ELISA.
1. TERELISA
El TERELISA consiste en un ELISA con­
vencional realizado en placas de Terasaki, pla­
cas habitualmente usadas para la tipificación de
alelos del complejo mayor de histocompatibili­
dad por microcitotoxicidad en placa y que son
más pequeñas que las placas de plástico diseña­
das para ELISA. La ventaja que presenta este
sistema por sobre los ELISA descritos en pá­
rrafos anteriores es que requiere volúmenes
ELISA 815
muy pequeños de los distintos inmunorreactan­
tes. En general, en el TERELISA se emplean
volúmenes del orden de los 10 |al por pocilio, a
diferencia de los ELISA convencionales, donde
se emplea entre 50 y 200 |J,I por pocilio. Sin
embargo, este sistema presenta la desventaja de
que no se han diseñado espectrofotómetros
(lectores de policubetas) aptos para leer la ab­
sorbancia en estas placas, por lo que la lectura
debe realizai'se a simple vista. Esto ha dificul­
tado la difusión y empleo masivo de este tipo
se sistemas.
2. GEDELISA
El GEDELISA es otra modalidad del ELISA
donde en una primera etapa se realiza una sepa­
ración de una mezcla antigénica por electrofo­
resis en geles de pohacrilamida en presencia de
dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE). A conti­
nuación se eluye el antígeno o los antígenos de
interés, para lo cual el gel se corta en tiras de
unos pocos milímetros de espesor, las que se
incuban con solución fisiológica durante tmo o
dos días a 4°C. Este procedimiento tiene por
objeto permitir la solubilización de los antíge­
nos en la solución fisiológica. Seguidamente,
estos antígenos se emplean para la sensibiliza­
ción de placas de poliestireno y se prosigue con
el ELISA tal cual se describió en páiTafos ante­
riores. Este sistema permite detectar Ac contra
determinados componentes de una mezcla anti­
génica compleja separada por SDS-PAGE. Sin
embargo, la presencia del SDS provoca la des­
naturalización de los antígenos separados, de
modo que no se podrán evidenciar Ac contra
algunos epitopes que se vieron afectados por el
tratamiento con SDS. Además, el remanente
del detergente que queda en la solución del an­
tígeno extraído del gel es capaz de interferir en
la etapa de sensibilización de la fase sólida
(véase “Inmovilización de inmunorreactantes
en fase sólida”).
3. DIG-ELISA
En el DIG-ELISA (“diffusion-in-gel enzy-
me-linked immunosorbent assay”) se realiza
una cuantificación de anticuerpos específicos
mediante la medición de su habilidad de formar
un gradiente de difusión sobre una superficie
de poliestireno sensibilizada con el antígeno
respectivo. La reacción Ag-Ac se visualiza en
una etapa posterior por empleo de un conjuga­
do enzimático anti-inmunoglobulinas especie-
específico.
En el DIG-ELISA se sensibiliza una placa de
Petri cón el antígeno en estudio. Luego de lavar
816 Metodologías
DO
log dii
Fig. 38-10. C álculo del título de un .suero por com p ara­
ción con un suero p atrón . Si se dispone de un suero pa­
trón (curva azul) será posible calcular el título de un suero
problem a (curva roja) en unidades arbitran'as/m l por com ­
paración de las curvas de titulación de am bos sueros.
e] exceso de antígeno no unido, se cubre la pla­
ca con una capa de agar, en la que se practican
orificios a modo de pocilios. En estos pocilios
se siembra la solución con el anticuerpo, se de­
ja difundir, se elimina el agar y se cubre toda la
placa con el conjugado enzimático. Luego de
esta incubación, se lava el exceso de conjugado
y se cubre la placa con agarosa que contiene la
solución de sustrato. AI cabo de cierto tiempo
se desarrollará el color producido por la activi­
dad enzimática unida a la placa. El diámetro de
los halos de color formados será proporcional
al logaritmo de la concentración de anticuerpo
que había en la muestra.
El DIG-ELISA presenta la ventaja de que no
se requiere de un lector de policubetas para una
cuantificación de la reacción antígeno-anticuer-
po, ya que se mide la velocidad de difusión de
estos anticuerpos en el agar. Sin embargo, la
complejidad operacional de estos sistemas
conspira contra su implementación en la deter­
minación de anticuei*pos específicos en el labo­
ratorio de serología diagnóstica.
Fwaieiwa
^ ^ o p o s ttv o
A is o fte w a
Fig. 38-11. G ráfico de frecuencia en función del inter-
valo de absorbancias de sueros negativos. Se m uestra la
curva de distribución y el sesgo positivo (rosa) caracterís­
tico de la distribución de absorbancias de sueros negativos
y la curva de di.stribución norm al (verde) que se obtendría
si los sueros negativos .siguieran dicha distribución.
a n a d « M l^iw níeiito
- ' 4
Fig. 38-12. G ráfico de frecuencia en función d el interva­
lo de ab so rb a n cia s de sueros n eg a tiv o s y positivo.s. Se
puede observar que hay un solapam ieiito de las distribucio­
nes de sueros positivos (rojo) y negativos (azul), lo que p ro ­
voca una incertidum bre en la clasificación d e un suero co­
m o positivo o negativo si su absorbancia cae en la zona de
solapanriento.
Dot-blot
El Dot-blot es un método inmunoenzimático
en el que se inmoviliza un inmunorreactante en
una fase sólida compuesta por vm papel. Exis­
ten varios tipos de papeles empleados en este
tipo de reacciones. Todos ellos presentan la
atractividad de que sirven para inmovilizar
cantidades muy pequeiias de inmunorreactante.
Muchas de las consideraciones que se comen­
taron para ELISA son válidas para el Dot-blot.
El Dot-blot es una técnica ampliamente em­
pleada para realizar el análisis de sobrenadan-
tes de cultivo de hibridomas (“screening”) o
para analizar la reactividad de un suero o anti­
cuerpo purificado contra un panel de antígenos
diferentes.
Mediante el empleo de distintos tipos de pa­
peles es posible inmovilizar proteínas, ácidos
nucleicos, membranas celulares, fracciones y
organoides subcelulares y hasta células enteras.
En los próximos párrafos se harán algunos co­
mentarios acerca de la inmovilización de pro­
teínas en papel.
El papel de filtro activado con bromuro de
cianógeno ha sido ampliamente empleado para
la- unión covalente de proteínas a la fase sólida.
Este tipo de sistemas es muy usado para la in­
movilización de alérgenos con el objeto de de­
tectar la presencia de anticuerpos específicos
en sueros de pacientes alérgicos atópicos.
Sin embargo, el papel más ampliamente em­
pleado para la inmovilización de proteínas es la
nitrocelulosa. La unión es no covalente y la in­
teracción hidrofóbica parece ser la que gobier­
na el proceso de interacción proteína-nitrocelu-
losa. Esto hace que la presencia de detergentes
en la solución de proteína interfiera el proceso
de unión. A pesar de esto, es posible inmovili­

zar antígenos proteicos en solución de deter­
gentes, particularmente no-iónicos (tales como
Tritón X-100, Tween 80) y a una concentra­
ción inferior al 0,01%.
Una ventaja que presenta la inmovilización
de proteínas en nitrocelulosa es que la unión es
cuantitativa hasta cubrir la capacidad de satura­
ción del papel. Las proteínas inmovilizadas
pueden revelarse por tinción directa con colo­
rantes tales como el negro amido, el azul de
Coomassie o el Ponceau-S.
Sin embargo, en la reacción de Dot-blot se
realizan incubaciones con anticuerpos específi­
cos y el sistema se revela mediante el empleo
de un conjugado enzimático. Antes de efectuar
la incubación con cualquier anticuerpo es nece­
sario bloquear los sitios de unión a la nitrocelu­
losa libres. Para ello se emplean soluciones ta­
les como las empleadas en ensayos de ELISA.
El bloqueo puede realizarse con leche descre­
m ada al 0,5% d ilu id a en PBS o en N aCl
0,15M, TrisHCl 0,05M, pH 7,4 (TBS), durante
30 minutos a 37“C. Los anticuerpos (sueros,
sobrenadantes de cultivo de hibridomas, líqui­
dos ascíticos de anticuerpos monoclonales o
anticuerpos purificados) y el conjugado enzi­
mático se diluyen en soluciones proteicas, sien­
do la más empleada la solución de leche des­
cremada al 0,5% en PBS o TBS. Los lavados
se realizan con PBS o TBS y en general se evi­
ta el empleo de detergentes en estas soluciones
con el objeto de evitar el despegado del Ag in­
movilizado en la nitrocelulosa. En caso de em­
plearse un conjugado enzimático de peroxidasa
es necesario utilizar diluyentes y soluciones de
lavado a base de TBS, ya que el fosfato del
PBS interfiere en la etapa del revelado.
Los sustratos que se emplean en Dot-blot, a
diferencia de los empleados en ELISA, generan
un producto insoluble que se deposita sobre la
nitrocelulosa en los sitios donde se localiza la
actividad enzimática. Para el caso de la peroxi­
dasa, los sustratos pueden ser el 4-cloro-l-naf-
tol o la diaminobencidina. El primero genera
un producto azul oscuro que tiene un muy buen
contraste para casos en los que sea necesario
fotografiar el Dot-blot. La diaminobencidina,
por su parte, genera un producto marrón que no
tiene un contraste tan elevado para fotografía
pero que tiene una detectabilidad superior al
4-cloro-l-naftol. Para el caso del empleo de
conjugados enzimáticos a base de fosfatasa se
emplea como sustrato una mezcla de 4-nitro-
bluetetrazolium (NBT) y 5-bromo-4-cloro-3-
indolilfosfato (BCIP), que generan un producto
insoluble azul oscuro.
La actividad enzimática se detiene por lava­
do de la nitrocelulosa con agua destilada. Una
vez lavada, es posible secar la nitrocelulosa al
aire y guardarla entre papeles de filtro durante
ELISA 817
mucho tiempo sin que se altere la visualización
de los resultados.
A diferencia del ELISA, la lectura del Dot-
blot es visual y por lo tanto no sirve para reah­
zar cuantificaciones. Sin embargo, se pueden
realizar lecturas densitométricas (se requiere de
densitómetros de reflexión) de la membrana de
nitrocelulosa revelada y, si cada punto (dot) tie­
ne la misma área, tomar la altura de los puntos
como medida de la reactividad del anticuerpo.
Parte experimental
1. Cálculo de la capacidad de saturación
de placas de ELISA p o r el método
de la peroxidasa
Sensibilizar placas de ELISA con 100 )J,1 de di­
luciones seriadas de una solución de OVA u
otro antígeno, desde 0,1 )0 .g/ml h asta 10
|ig/ml, diluida en un “buffer” carbonato-bi-
carbonato lOOmM pH ==9,2-9,4.
Incubar durante 18 horas a 4°C.
Lavar 3 veces con PBS.
Incubar 3 horas a 37“C con 100 p,l/pocillo de
una solución de peroxidasa de 100 jig • m l'\
Lavar 3 veces con PBS suplementado con
0,05% de Tween 20 (PBS-T).
Incubar con 100 }.il/pocillo de una solución de
o-fenilendiamina de 1 mg/ml en un “buffer”
de ácido cítrico y fosfatos 0,1M pH = 5 y
H^O^ al 30% (1 ¡il • m i'), durante 30 minutos
en la oscuridad.
Detener la reacción por agregado de 25 jj.1 de
H,SO^ 4N a cada pocilio.
Leer la densidad óptica a 490 nm en un lector
de policubetas.
Graficar la densidad óptica en función del loga­
ritmo de la inversa de la concentración de
OVA y calcular la concentración necesaria
para saturar la placa.
2. Marcación de anticuerpos
con peroxidasa
Dialisar una solución del anticuerpo a marcar
(aproximadamente 5 mg/ml) contra “buffer”
de carbonato-bicarbonato sódico lOOmM pH
= 9,2 durante 18 horas a 4“C.
Disolver 2,5 mg de peroxidasa (de buena cali­
dad) en 0,25 mi de NaHCOj lOOmM en un
tubo de vidrio.
Agregar 0,25 mi de NalO^ (p.a.) 12mM.
Incubar 2 horas a temperatura ambiente en os­
curidad.
Mezclar la solución del anticuerpo dialisado
con la peroxidasa y agregar una sexta parte
(peso/volymen) de Sephadex G-25 seco con
el objeto de reducir el volumen de reacción a
la mitad.
818 Metodologías
Incubar 3 horas a temperatura ambiente en la
oscuridad.
Agregar 1/20 en volumen de una solución re­
cién preparada de NaBH^ (5 mg • mh' en
NaOH 0,lmM).
Incubar 30 minutos a 4°C.
Agregar 1/10 en volumen de la solución de
NaBH,.
Incubar 1 hora a 4°C.
Separación de la peroxidasa libre y del Ac no
conjugado:
Precipitar con (NH^) SO^ al 50% de saturación
(precipitan la IgG ubre y la IgG conjugada a
peroxidasa).
Incubar 1 hora y centrifugar durante 15 minu­
tos a ó.OOOxg. Desechar el sobrenadante.
Lavar el precipitado con (NH^j^SO^ al 50% de
saturación. Desechar el sobrenadante.
Equilibrar el sedimento con una solución de
fosfatos 0,1M, NaCl 0,1M, pH = 7,2 o con un
“buffer” de acetato sódico O,IM, NaCl IM,
CaCl^ ImM, MgCl^ ImM, MnCl^ ImM, pH =
6 por diálisis o por pasaje por una columna de
Sephadex G-25.
Realizar una cromatografía de afinidad con
Sepharosa-Concanavalina A, con lo que la
IgG libre eluye con el frente y se retiene el
conjugado. Monitorear el proceso por lectura
de la absorbancia a 280nm.
Eluir la columna con una solución de a-metil •
manósido 10 a lOOmM en fosfatos 0,1M,
NaCl 0,1M, pH = 7,2 o en acetato sódico
0,1M, NaCl IM, CaCL ImM, MgCL ImM,
MnCl^ ImM, pH = 6.
Agregar un volumen de glicerina neutralizada
y guardar en congeladora de -18‘’C.
Titular por ELISA frente al antígeno específico
para comprobar la actividad del conjugado.
3. ELISA de amplificación (indirecto)
para la titulación de sueros
Se describe un ELISA para la titulación de an­
ticuerpos anti-ovoalbúmina (OVA) en sueros
de conejos inmunizados con OVA.
Sensibilizar placas de ELISA con 100 |al de
una solución de OVA de 1 |xg/ml (100 ng de
OVA/fosa), diluida en un “buffer” carbonato-
bicarbonato lOOmM pH = 9,2-9,4.
Incubar durante 18 horas a 4°C.
Lavar 3 veces con PBS suplem entado con
Tween 20 al 0,05% (PBS-T).
Bloquear la placa por incubación con 250
¡al/fosa de una solución de leche descremada
al 3% preparada en solución fisiológica tam­
ponada (PBS) durante Ihora a 37°C.
Lavar 3 veces con PBS-T.
Realizar diluciones seriadas en razón 2 del sue­
ro de conejo anti-OVA a analizar, en un volu­
men de 100 |J,l/fosa. Utihzar como diluyente
una solución de leche descremada al 1% en
PBS-T.
Incubar 1 hora a 37°C.
Lavar 3 veces con PBS-T.
Incubar con 100 |j,l/fosa de la dilución apropia­
da del conjugado anti— globuhnas de conejo
marcado con peroxidasa, diluido en una solu­
ción de leche descremada al 1% en PBS-T,
durante 1 hora a 37°C.
Lavar 3 veces con PBS-T.
Incubar con 100 |il/fosa de una solución de o-
fenilendiamina de Img/ml en un “buffer” de
ácido cítrico y fosfatos 0,1M pH = 5 y H^Oj
al 30% (l|il/ml), durante 30 minutos en la os­
curidad.
Detener la reacción por agregado de 25 )ll de
HjSO^ 4N a cada pocilio.
Leer la densidad óptica a 490 nm en un lector
de policubetas.
Graficar la densidad óptica en función del loga­
ritmo de la inversa de la dilución de suero de
conejo analizado y calcular el título.
4. ELISA de captura
Sensibilizar placas de poliestireno de alta capa­
cidad de unión con el anticuerpo de captura
purificado, durante 18 horas a 4°C a razón de
2|ag por pocilio (50|i,l/pocillo), diluido en
PBS.
Lavar 3 veces con PBS-T.
Bloquear la placa por incubación con 200|al/fo-
sa de una solución de leche descremada al 3%
en PBS durante 1 hora a 37°C.
Lavar 3 veces con PBS-T.
Capturar el antígeno específico a partir de la
fracción antigénica diluida en leche descre­
mada al 1% en PBS, por incubación durante
1 hora a 37°C a razón de 50 |i/fosa. Dejar un
grupo de pocilios sin antígeno capturado co­
mo control del ensayo.
Lavar 3 veces con PBS-T.
Incubar durante 30 minutos a temperatura am­
biente y a razón de 50 ¡il/ fosa con una dilu­
ción apropiada (por ejemplo, 1/500) de los
sueros a analizar. Diluir los sueros en leche
descremada al 1% en PBS.
Lavar 3 veces con PBS-T.
Incubar durante 30 minutos a temperatura am­
biente y a razón de 50 \iV fosa con una dilu­
ción apropiada de anticuerpos anti-inmuno-
globulinas e.specie-específicos marcados con
peroxidasa, diluidos en leche descremada al
1% en PBS.
Lavar 3 veces con PBS-T.
Incubar con 50 |il/fosa de una solución de o-fe-
nilendiamina de 1mg/ml en un “buffer” de
ácido cítrico y fosfatos 0,1M pH = 5 y H^O^
al 30% (1 )il/ml), durante 30 minutos en la
oscuridad.

Detener la reacción por agregado de 25 |xl de
HjSO^ 4N a cada pocilio.
Leer la densidad óptica a 490 nm en un lector
de policubetas.
Graficar la diferencia entre la absorbancia pro­
ducida por cada suero en la fosa con Ag y la
absorbancia producida por el mismo suero en
la fosa sin Ag.
5. ELISA de modulación de actividad
para la cuantificación de antígeno
Se describe un ELISA para la cuantificación de
ovoalbúmina (OVA) en diversas muestras.
Sensibilizar placas de ELISA con 100 jil de
una solución de OVA de 1 |ig • ml ■(100 ng
de OVA/fosa), diluida en un “buffer” carbo­
nato-bicarbonato lOOmM pH = 9,2-9,4.
Incubar durante 18 horas a 4°C.
Lavar 3 veces con PBS-T.
Bloquear la placa por incubación con 250
|il/fosa de una solución de leche descremada
al 3% en PBS durante Ihora a 37"C.
Lavar 3 veces con PBS-T.
En un volumen de 50 |xl/fosa, realizar dilucio­
nes seriadas en razón 2 de una solución pa­
trón de concentración conocida de OVA, par­
tiendo de una concentración de 10 |ig ■m f .
Utilizar como diluyente una solución de leche
descremada al 1% en PBS-T. Paralelamente,
realizar otra serie de diluciones de la/s mues-
tra/s problema. Dejar una fosa sin OVA solu­
ble ni muestra, que corresponderá al 0% de
inhibición.
Agregar a cada fosa 50 )il del doble de la dilu­
ción del suero de conejo anti-OVA que pro­
dujo una absorbancia igual al 90% de la ab­
sorbancia máxima producida por ese suero,
diluido en leche descremada al 1% en PBS.
Incubar 1 hora a 37°C,
Lavar 3 veces con PBS-T.
Incubar con 100 |J,l/fosa de la dilución apropia­
da del conjugado anti-y-globulinas de conejo
mai'cado con peroxidasa, diluido en una solu­
ción de leche descremada al 1% en PBS-T,
durante 1 hora a 37°C.
Lavar 3 veces con PBS-T.
Incubar con 100 |J,l/fosa de una solución de o-
fenilendi amina de Img • ml * en un “buffer”
de ácido cítrico y fosfatos 0,1M pH = 5 y
H^Oj al 30% (1 }il • m l'), durante 30 minutos
en la oscuridad.
Detener la reacción por agregado de 25|J,1 de
HjSO,^ 4N a cada pocilio.
Leer la densidad óptica a 490nm en un lector
de policubetas.
Calcular el porcentaje de inhibición producido
por cada dosis de OVA soluble, tomando como
0% de inhibición la absorbancia obtenida en la
fosa incubada sin inhibidor (OVA soluble).
ELISA 819
Graficar dicho porcentaje en función del loga­
ritmo de la concentración de OVA de la solu­
ción patrón. Por interpolación del porcentaje
de inhibición producido por una muestra pro­
blema se podrá calcular la concentración de
OVA en la misma.
6. Análisis de la distribución de reactividad
de sueros normales y cálculo del valor
de corte
Se describe un ELISA de amplificación para el
análisis de la distribución de reactividades de
sueros humanos normales a dilución simple y
cálculo del valor de corte del sistema frente a
un sobrenadante de 45.000xg de epimastigotes
de Trypanosoma cruzi lisados (fracción F45).
Sensibilizar placas de ELISA con 100 |al de la
fracción F45, a razón de 10 ¡ag • m f, diluida
en un “buffer” carbonato-bicarbonato lOOmM
pH = 9,2-9,4.
Incubar durante 18 horas a 4°C.
Lavar 3 veces con PBS-T.
Bloquear la placa por incubación con 250|al/fo-
sa de una solución de leche descremada al 3%
preparada en solución fisiológica tamponada
(PBS) durante 1 hora a 37<>C.
Lavar 3 veces con PBS suplem entado con
Tween 20 al 0,05% (PBS-T).
Realizar diluciones (1/500 o 1/1000) de al me­
nos 30 sueros humanos normales y al menos
un suero de paciente chagásico (control posi­
tivo). Utilizar como diluyente una solución de
leche descremada al 1% en PBS-T. En cada
fosa debe quedar un volumen de 100 | i l .
Incubar 1 hora a 37°C.
Lavar 3 veces con PBS-T.
Incubar con 100 |al/fosa de la dilución apropia­
da del conjugado anti-y-globulinas humanas
marcado con peroxidasa, diluido en una solu­
ción de leche descremada al 1% en PBS-T,
durante 1 hora a 37“C.
Lavar 3 veces con PBS-T.
Incubar con 100 |il/fosa de una solución de o-
fenilendiamina de 1 mg • m f en un “buffer”
de ácido cítrico y fosfatos 0,1M pH = 5 y
HjOj al 30% (1 |al • m f ), durante 30 minutos
en la oscuridad.
Detener la reacción por agregado de 25 |J,1 de
HjSO^ 4N a cada pocilio.
Leer la densidad óptica a 490nm en un lector
de policubetas.
Agrupar las absorbancias de los sueros en in­
tervalos de densidad óptica y graficar la fre­
cuencia de cada intervalo en función del in­
tervalo.
Paralelamente calcular la absorbancia media
(m) de los sueros negativos y el desvío están­
dar (a^ |). Con estos parámetros calcular el va­
lor de corte del sistema como m + 2 o 3 ,.
820 Metodologías
BIBLIOGRAFÍA
B u tler J.E. 1981. T he am phfied ELISA : principies o f and
aplications for the com parative quantitation o f class and
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bination o f polycrylam ide gel electrophoresis w ith enzy-
ine-linked im m unosorbent assay: a sim ple m ethod for de-
term ination o f antibody specificity and detection o f anti­
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N ieto A ., G ayá A., M oreno C. y Vives J. 1984. N uevo m é­
todo para determ inar la adsorción de proteínas a las p la­
cas de p o lie s tire n o u s a d a s en E L IS A . I n m u n o lo g ía ,
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P ateraki E., G uesdon J.I.., Serie C. and A vram eas S. 198 L
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Tijssen P. 1988. Practice and theory o f enzym e im m unoas­
says. tm : Laboratory techniques in biochem istry and m o­
lecular biology. Vol. 15. Eds. B urdon R.H. and K nippen-
berg P.H. Elsevier, A m sterdam , T he N etherlands.
Inmunoanálisis radiométrícos
EDGARDO POSKUS
INTRODUCCIÓN
Los inmunoanálisis radiométricos compren­
den un conjunto de técnicas en las cuales las
moléculas implicadas como reactivos inmuno-
químicos se hallan marcadas radiactivamente.
Como guía general puede considerarse que la
determinación de los antígenos se efectúa con
anticuerpos específicos como reactivos y que,
inversamente, la detección de anticuerpos espe­
cíficos se realiza con los correspondientes antí­
genos. También como modelo general puede
decirse que los reactivos de esos sistemas ana­
líticos son los que están marcados con un ra-
dionucleido, aunque como se verá principal­
mente en el radioinmunoanálisis, las técnicas
basadas en reacciones de competencia pueden
diseñarse de modo que se marca el mismo tipo
de molécula (se emplea, por ejemplo, antígeno
puro marcado para medir el antígeno frío que
se haha en muestras desconocidas y luego ara­
bos interactúan con los anticuerpos específi­
cos).
En la inmunología moderna, tras unas cuatro
décadas de aplicación de estos recursos analíti­
cos, se ha verificado una fuerte competencia
metodológica. Los principios inmunoenzimáti-
cos y los análisis basados en quimioluminis-
cencia han disputado últimamente el campo de
aplicación con el radioinmunoensayo y sus su­
cedáneos. Hoy en día la elección de un método
de análisis aplicado a la inmunología, o valién­
dose de recursos que ella brinda, es un tema
complejo. Existen muchos factores que deciden
esa elección: los económicos, los de seguridad
operativa, los de accesibiUdad, etc. Pero, si se
sopesan también las cuestiones referidas a re­
producibilidad, exactitud y sensibilidad, debe
admitirse que no existen métodos ideales y sus-
39
titutivos de los otros. En ese contexto las radio­
metrías han cedido posiciones, aunque conser­
van un número de especificaciones de uso que,
en ciertos casos, las torna como la mejor op­
ción disponible.
Dado que el radioinmunoensayo, o radioin­
munoanálisis, es la técnica radiométrica proto­
tipo y la que efectuó el mayor impacto históri­
co relativo, comenzaremos a partir de ella la
descripción de los métodos radiométricos de
base inmunológica.
RADIOINMUNOENSAYO
El desarrollo del radioinmunoensayo {ra-
dioimmunoassay, RIA) comienza en 1956 de
forma un tanto desapercibida, con los trabajos
de Yalow y Berson sobre el metabolismo de la
insulina. Esos autores hallaron que la cantidad
de insulina marcada con átomos de iodo radiac­
tivo que se unía a una fracción de globulinas de
individuos diabéticos (luego reconocida como
anticuerpos), se relacionaba con la concentra­
ción de insulina fría existente. Tal observación
constituyó la base de la detección de esa hor­
mona plasmática y del posterior desarrollo de
todos los métodos radioinmunológicos de satu­
ración y desplazamiento. A partir de las prime­
ras publicaciones en 1959 y 1960 que descri­
bieron explícitamente la determinación de insu­
lina plasmática sin previa extracción, resultó
ampliamente reconocido que el RIA era un m é ­
todo ventajoso. Entre sus cualidades se hallan
la alta sensibilidad, su comparativa sencillez
respecto de los métodos biológicos usados en
endocrinología, y su versatilidad para aplicarlo
a muestras de pequeños volúmenes y en gran­
des series. Esas propiedades lo convierten en
820 Metodologías
BIBLIOGRAFÍA
B u tler J.E. 198 L T he am plified ELISA : principies o f and
aplications for the com parative quantitation o f class and
subclass antibodies and the distribution o f antibodies and
a n tig e n s in b io c h e m ic a i s e p a ra te s . IMeth. E n z y m o l.
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bination o f polycrylam ide gel electrophoresis w ith enzy-
ine-linked im m unosorbent assay: a sim ple m ethod for de-
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gens in com plex m ixtures, Vet, Im m unol, Im m unopathol,
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Lutz H,, H iggins J,, P edersen N,C, and Theilen G,H, 1979,
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nique, T h e gel electro p h o re sis-d e riv ed en z y m e-lin k ed
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M alvano R,, B oniolo A,, D ovis B, and Zannino M, 1982,
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expression. ,1, Im m unol, M eth, 48:51-60,
N ieto A,, G ayá A,, la n sa M ,, M oreno C, and V ives J, 1984,
D irect m easurem ent o f antibody affinity distribution by
hapten-inhibition enzym e im m unoassay. M ol, Im m unol,
21(6):537-543,
N ieto A ,, G ayá A,, M oreno C,, la n sá M, and Vives I, 1986,
A dsorption-desorption o f antigen to polyestyrene plates
used in EL ISA , Ann, Inst, P asteu r Im m unol,, 137:161-
172,
N ieto A ,, G ayá A,, M oreno C, y Vives I, 1984, N uevo m é­
todo para determ inar la adsorción de proteínas a las p la­
cas de p o iie s tire n o u s a d a s en E L IS A , I n m u n o lo g ía ,
3(l):25-28,
P ateraki E,, G uesdon I,L ,, Serie C, and A vram eas S, 1981,
TERELISA : T he ELISA test perform ed in Terasaki p la ­
tes, I, Im m unol, M eth, 46:361-368,
Pesce A, and M ichael J,G, 1992, Artifacts and limitations of
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150:5-21,
Tijssen P, 1988, Practica and theory o f enzym e im m unoas­
says, Em: Laboratory techniques in biochem istry and m o­
lecular biology, Vol, 15, Eds, B urdon R,H, and K nippen-
berg P,H, Elsevier, A m sterdam , T he N etherlands,
Inmunoanálisis radiométrícos
EDGARDO POSKUS
INTRODUCCIÓN
Los inmunoanálisis radiométrícos compren­
den un conjunto de técnicas en las cuales las
moléculas implicadas como reactivos inmuno-
químicos se hallan marcadas radiactivamente.
Como guía general puede considerarse que la
determinación de los antígenos se efectúa con
anticuerpos específicos como reactivos y que,
inversamente, la detección de anticuerpos espe­
cíficos se realiza con los correspondientes antí­
genos. También como modelo general puede
decirse que los reactivos de esos sistemas ana­
líticos son los que están marcados con un ra-
dionucleido, aunque como se verá principal­
mente en el radioinmunoanálisis, las técnicas
basadas en reacciones de competencia pueden
diseñarse de modo que se marca el mismo tipo
de molécula (se emplea, por ejemplo, antígeno
puro marcado para medir el antígeno frío que
se haUa en muestras desconocidas y luego ara­
bos interactúan con los anticuerpos específi­
cos).
En la inmunología moderna, tras unas cuatro
décadas de aplicación de estos recursos analíti­
cos, se ha verificado una fuerte competencia
metodológica. Los principios inmunoenzimáti­
cos y los análisis basados en quimioluminis­
cencia han disputado últimamente el campo de
aplicación con el radioinmunoensayo y sus su­
cedáneos, Hoy en día la elección de un método
de análisis aplicado a la inmunología, o valién­
dose de recursos que ella brinda, es un tema
complejo. Existen muchos factores que deciden
esa elección: los económicos, los de seguridad
operativa, los de accesibilidad, etc, Pero, si se
sopesan también las cuestiones referidas a re-
producibilidad, exactitud y sensibilidad, debe
admitirse que no existen métodos ideales y sus-
39
titutivos de los otros. En ese contexto las radio­
metrías han cedido posiciones, aunque conser­
van un número de especificaciones de uso que,
en ciertos casos, las torna como la mejor op­
ción disponible.
Dado que el radioinmunoensayo, o radioin­
munoanálisis, es la técnica radiométrica proto­
tipo y la que efectuó el mayor impacto históri­
co relativo, comenzaremos a partir de ella la
descripción de los métodos radiométrícos de
base inmunológica.
RADIOINMUNOENSAYO
El desarrollo del radioinmunoensayo {ra-
dioimmunoassay, RIA) comienza en 1956 de
forma un tanto desapercibida, con los trabajos
de Yalow y Berson sobre el metabolismo de la
insulina. Esos autores hallaron que la cantidad
de insulina marcada con átomos de iodo radiac­
tivo que se unía a una fracción de globulinas de
individuos diabéticos (luego reconocida como
anticuerpos), se relacionaba con la concentra­
ción de insulina fría existente. Tal observación
constituyó la base de la detección de esa hor­
mona plasmática y del posterior desarrollo de
todos los métodos radioinmunológicos de satu­
ración y desplazamiento. A partir de las prime­
ras publicaciones en 1959 y 1960 que descri­
bieron explícitamente la determinación de insu­
lina plasmática sin previa extracción, resultó
ampliamente reconocido que el RIA era un m é ­
todo ventajoso. Entre sus cualidades se hallan
la alta sensibilidad, su comparativa sencillez
respecto de los métodos biológicos usados en
endocrinología, y su versatiUdad para aplicarlo
a muestras de pequeños volúmenes y en gran­
des series. Esas propiedades lo convierten en
822 Metodologías
uno de los métodos analíticos de base inmuno-
lógica de mayor importancia, con proyecciones
en medicina, veterinaria y en áreas no médicas
interesadas en la detección de muy bajas con­
centraciones de compuestos orgánicos. Las va­
riantes metodológicas acumuladas últimamente
hacen que no exista un RIA en particular, sino
un conjunto de procedimientos basados en un
principio general que describiremos a continua­
ción.
PRINCIPIO GENERAL
La base del RIA consiste en la inhibición
competitiva de la unión de un antígeno radiac­
tivo (trazador) a su anticuerpo específico por
parte del antígeno no marcado. El sistema ra-
dioinmunológico descrito puede esquemati­
zarse como una interacción reversible combi­
nada;
A g* Ac-A g*
Ac ( 1)
Ag A c-A g
donde Ac representa el anticuerpo específico;
Ag* es el antígeno marcado (trazador) libre;
Ag es el antígeno libre no marcado de las solu­
ciones patrones o de las muestras desconoci­
das; Ac-Ag* es el complejo soluble entre el
anticuerpo y el antígeno marcado, y Ac-Ag
es e! complejo soluble con el antígeno no mar­
cado.
El proceso obedece a la ley de acción de ma­
sas y, además la distribución del trazador den­
tro del antígeno total es indiscriminable por
medio del anticuerpo de modo que, cuanto ma­
yor sea la cantidad de antígeno no marcado
presente, menor será la cantidad de trazador
que se une al anticuerpo. Bajo este principio se
puede determinar la concentración del antígeno
en muestras complejas de fluidos biológicos
con suficiente sensibilidad y especificidad si se
cumplen los siguientes requisitos: 1) el traza­
dor es altamente radiactivo y por lo tanto puede
colocarse en concentraciones infinitesimales,
pero cuantificables, y 2) el anticuerpo es alta­
mente específico, posee muy alta afinidad y se
halla en muy baja concentración. La justifica­
ción teórica y el ajuste de las condiciones expe­
rimentales en relación a esos postulados se
enuncian formalmente más adelante.
Para efectuar las determinaciones que si­
guen, además de optimizar la calidad y la con­
centración de los componentes del sistema, es
necesario aplicar algún método que permita se­
parar y medir el trazador libre y el trazador uni­
do. Todas esas operaciones se realizan según
un diseño general cuya secuencia se da a conti­
nuación.
SECUENCIA EXPERIMENTAL DEL RIA
Una vez cubierta la etapa de los requeri­
mientos (obtención de antisueros, preparación
de los trazadores, selección de los métodos se­
parativos, etc.) para la ejecución de un RÍA se
efectúan dos ensayos fundamentales: 1) la titu­
lación del antísuero, y 2) el ensayo de despla­
zamiento o RIA propiamente dicho.
Ensayo de titulación o curva de calibración
En esta etapa se efectúa un ajuste empírico
de la concentración de los anticuerpos específi­
cos actuantes en el test. En la figura 39-1 se
muestra un esquema del ensayo y la selección
final de la dilución del antísuero para condicio­
nes especificadas. En este caso se utilizó polie-
tílenglicol (PEG) como agente separativo del
antígeno en sus formas libre, f* (del vocablo
inglés universalmente adoptado, free) y unida,
b* (de bound). El PEG al 12,5% de concentra­
ción final y en frío, precipita casi exclusiva­
mente las inmunoglobulinas, estén libres o uni­
das a antígenos. Otros sistemas y recursos se­
parativos también son aplicables según vere­
mos en la parte final de Requerimientos. Me­
diante la representación gráfica de alguna de
las variables con que suele expresarse la res­
puesta (la más sencilla es la actívidad de los
precipitados), en función de la dilución del an­
tisuero, puede seleccionarse un valor apropia­
do. Según se verá en la explicación teórica,
puede optarse por aquella dilución que cause
aproximadamente un 50% de unión del antíge­
no radiactivo (fig. 39-1).
Ensayo de desplazamiento
Este etapa consiste en la elaboración de una
curva patrón, empleando una dilución fija del
antisuero según se mencionó en la etapa de titu­
lación, frente a una serie de concentraciones co­
nocidas del antígeno frío. Obviamente el traza­
dor y los otros componentes y condiciones del
sistema no se modifican respecto de la etapa de
titulación. En la figura 39-2 se muestra el es­
quema general de un ensayo modelo. Luego del
procesamiento de la información (cuadro 39-1)
es factible calcular la concentración de mues­
tras desconocidas mediante la interpolación de
las respuestas dentro de los mismos rangos.
Una mejor visualización de lo mencionado
antes se obtiene redefiniendo los componentes
de los equilibrios presentados en (1) como si-
gue:
A g* A c-Ag*
(f*) (b*)
Ac (2 )
(Q) Ag ^ A c-A g
(i) (b)
 Inmunoanálisis radiométricos 823

R EACC IO N TuboN® 1 2 X y z

T R A Z A D O R 0,1 ml (10“ cpm)

D ILU Y E N TE 0,1 ml
A N TIS U E R O 0,1 ml

Dilución 1/103 1/2x10^ -1/1 OV 1/103 CT

SU E R O
IN C U BAC IÓ N 4°C, 1-5 días C O N TR O L
37“C, 2-18 horas NO IN M U NE

SEPAR AC IÓ N ------T u bos N® 1 - Y -

P olletilengllcol
(PEG 6000) 1 5 % .................... 1,5 ml (4»C)

A gitación
SN
C entrifugación
sepa ra ción y conteo

=Í>P

10
G R A FIC A C IÓ N
b*
(cpm X 1Cr^)

1/1Q3 1 / 10 “ 1/ 10 = 1/106

Dilución del antisuero

)
Fig. 39-1. C urva de titulación del antisuero o de calibración para la selección de la dilución apropiada en los ensayos p o s ­
teriores del R IA (en el m odelo: 1/2,5 x 10^; expresada com o dilución final será tres veces m ayor).
CT: control de cuentas totales adicionadas en todos los tubos. Las condiciones de incubación señaladas representan a l­
gunas de las variantes más usadás. El PEG actúa com o agente de separación pues precipita las inm unoglobulinas lib res y
las unidas al antígeno. T am bién existen otros métodos separativos.
La form a de la curva en el ám bito de las diluciones bajas y la unión incom pleta del trazador se deben a diversos facto res
que no se analizarán aquí. L os ensayos esquem atizados suelen realizarse po r duplicado o triplicado.

donde Q representa el anticuerpo libre o, ixtás
precisamente, el “sitio” ligante para un anti­
cuerpo considerado como univalente; f* repre­
senta el trazador libre; b* es el trazador unido
al anticuerpo; f es el antígeno frío libre, y b es
el antígeno frío unido. Luego la curva patrón o
estándar que refleja la relación básica dosis-
respuesta del RIA puede trazarse, por ejemplo,
representando b* u otras formas derivadas, en
función de la concentración de antígeno frío
adicionado (cuadro 39-1 y fig. 39-3 A-D). En
particular la relación b*/f* es muy utilizada y
ventajosa. Ese cociente puede obtenerse direc­
tamente de las actividades (cuentas por minuto)
determinadas para cada fase luego de separado
el antígeno libre del unido. Pero, como además
se parte del supuesto de que el anticuerpo no
distingue entre el antígeno genuino y el marca­
do, la distribución de antígeno frío libre y uni­
do también es la misma (b*/f* = b/f). Vemos,
entonces, que en general el cociente definido
por la concentración del antígeno total unido
(B) y la correspondiente al antígeno total libre
(FX resulta ponderado idealmente por este m e­
dio. Por ende, se puede prescindir, al confec­
cionar las escalas, de toda referencia a la po­
blación de m oléculas m arcadas. Esto es,
b*/f* = B/F.
En la práctica se han aplicado numerosas va­
riantes para la representación gráfica de las res­
puestas medidas y de ellas hap surgido diferen­
tes tipos de curvas patrones, incluso otras río
presentes en 1a figura 39-3. La representación
gráfica de cualquiera de esas variantes suele
824 Metodologías

REACCION T ubo N= 7 8 9 10

TRAZADOR 0,1 mi (10“ cpm)

ANTISUERO 0,1 mi (1/2,5 x lO^^)
ANTÍGENO 0,1 mi

conc. final O 0,026 0,052 0,833 MD CT

(ng/0,3 mi)

INCUBACION 4“C, 1-5 días

37“C, 2-18 horas

SEPARACIÓN -Tubos Ns 1 - 9-

Polietilenglicol
(PEG 6000) 1 5 % ...................1,5 mi (4“C)

Agitación
Centrifugación,
separación y conteo

PROCESAMIENTO V éase cuadro 39-1

F ig . 39-2. E squem a del desarrollo experim ental de un RIA para insulina. La dilución del antisuero em pleado es la hallada
p reviam ente en un ensayo de titulación (fig. 39-1).
antígeno en gran exceso para control de la unión inespecífica. A veces suele incluirse en su lugar un control com o el
del tubo “y” en la figura 39-1.
M D: m uestra desconocida. CT: control de cuentas totales adicionadas en todos los tubos. Las condiciones de incubación
son las m ism as escogidas para la titulación. Los ensayos esquem atizados suelen realizarse por duplicado o triplicado.

Cuadro 39-1. Valores correspondientes al RIA ni >delo para insulina desarrollado en la figura
39-2
E xpresiones de los datos

D osis de
Tubo antígeno Respuesta
N" (ng/0.3 mi) b* (cpm) Bo

1 0 5.000 (b *) 0,50 1,00 1,00

2 0,026 4.500 0,45 0,90 0,82
3 0,052 4.000 0,40 0,80 0,67
4 0,104 3.000 0,30 0,60 0,43
5 0,208 2.000 0,20 0,40 0,25
6 0,417 1.500 0,15 0,30 0,18
7 0,833 1.000 0,10 0,20 0,11
8 oo 300 U N E 0,03 0,06 0,03
9 MD 3.500 0,35 0,70 0,54
10 CT 10.000 (T)

b^ : cuentas p ro m ed io d e d u p licad o s o trip lic ad o s un id o s a an ticu e rp o s. P o r re s u lta r p ro p o rcio n ales a las co n c en íra cio n es d ei an tíg en o un id o
(B ) en las ex p resio n es re la tiv a s a p a rec e d ire c ta m e n te este sím bolo,
an tíg en o en g ra n exceso.
U N E : unión n o esp e cífica . E se v alo r tam b ién p u e d e su strae rse a todos los dato s d e b* antes d e e fectu a r los cálculos.
 Inmunoanálisis radiométricos 825

B B__ b*
B (cpm X 103)
T
0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

Dosis (insulina, ng/0,3 ml)

Dosis (insulina, ng/0,3 ml) Dosis (insulina, ng/0,3 ml)

F ig. 39-3. Curvas estándar obtenidas del R IA m odelo para insulina (datos en cuadro 39-1). La concentración de an tíg en o
en la m uestra desconocida puede estim arse por interpolación según se indica en los gráficos. Las líneas cortadas p aralela s
al eje de abscisas indican la unión no específica. A, B, C, D son distintas form as de expresión gráfica. N ótese que en C y D
las dosis se representan en escala geom étrica, equivalente a una escala aritm ética de log [Ag]

dar resultados aceptables; sin embargo las cur­ ción de la curva estándar. Entre los más em ­
vas hiperbólicas de los datos sin transforma­ pleados se halla la transformación logit-log,
ción previa (fig. 39-3 A y B) pueden generar di­ donde el logit de la variable y se define según:
ficultades para interpolar con exactitud valores
extremos de concentración del antígeno en logit y = In
1- y
muestras desconocidas. Si la variable indepen­
diente se grafica sobre el eje de abscisas como para y = B/Bo,
el log de la concentración, y la variable depen­ B /B o
diente (en forma directa o en alguna de sus logit B /Bo = In
1 - B /B o
transformaciones) se representa linealmente en
ordenadas, se obtienen curvas sigmoidales donde B/Bo se obtiene como se indica en el
(fig. 39-3 C, D). cuadro 39-1, aunque previamente suele dedu­
Otros procedimientos de transformación de cirse la unión inespecífica y se calculan los co­
ambas variables se emplean para la rectifica­ cientes corregidos (B/Bo)^.
826 Metodologías

D o sis \ F ig. 39-4. Transform ación lo-

(n g /0 ,3 m l) \ b J , ^ \B , g it-lo g de la c u rv a está n d ar.
La recta ajustada a los puntos
0 ,0 2 6 0 ,8 9 2 ,0 9 experim entales puede ob ten er­
0 ,0 5 2 0 ,7 9 1 ,3 2 se con ca lcu la d o ras sen cillas
0 ,1 0 4 0 ,5 7 0 ,2 8 program adas p ara efectuar re­
0 ,9 9 0 ,2 0 8 0 ,3 6 0 ,5 8 g re s io n e s lin e a le s o c o n un
0 ,4 1 7 0 ,2 6 1 ,0 5 procesador y graficador en lí­
0 ,8 3 3 0 ,1 5 1 ,7 3 n ea con el c o n ta d o r g am m a.
MD 0 ,6 8 0 ,7 5 Los valores representados c o ­
rresponden a los datos del cu a­
dro 39-1 luego de co rrecció n
por la unión no específica (re­
cu ad ro inserto). La escala de
ordenadas de la izquierda y la
escala de abscisas son las h a ­
lladas en cartas lo g it-lo g im ­
presas. Los datos en ese caso
in g re s a n sin p r o c e s a m ie n to
previo.

0 ,0 5
0 ,0 4
0 ,0 3
0,02

10 ^ 10-0
D o sis (n g /0 ,3 mi)

En pocos casos se obtiene una rectificación
semejante a la ideal. En los contadores y auto­
máticos provistos de un procesador programa­
do para esos cálculos, o mediante ordenadores
en línea o independientes, puede obtenerse un
gráfico con la recta de ajuste optimizado y sus
parámetros estadísticos.
En la fig. 39-4 se muestra un ejemplo de rec- •
tificación de la curva estándar luego de la
transformación logit-log. Las desviaciones de
la linealidad observadas se deben a errores ex­
perimentales. Las más notorias suelen darse en
los rangos extremos de concentración de antí­
geno.
Cálculos de los parámetros
de la interacción primaria
Los procesamientos hasta aquí indicados
conducen ordinariamente al cálculo de la con­
centración del antígeno en muestras desconoci­
das. Este es el objetivo esencial y rutinario de
los RIAs como procedimientos de difundida
aplicación, por ejemplo en analítica clínica. Sin
embargo, con otros propósitos de investigación
básica puede requerirse la estimación de las
afinidades y la capacidad de unión de los anti­
cuerpos involucrados, así como una expresión
formal de la reactividad cruzada de antígenos
alternativos en el ensayo, etc. Para todo ello se
requiere tratar previamente con cierta profundi­
dad la teoría básica del RIA, de la cual es posi­
ble calcular luego con cierta aproximación los
valores de esos parámetros. Como se verá, esa
información también surge a partir de las cur­
vas de desplazamiento.
TEORÍA MATEMÁTICA DEL RIA
La teoría básica del RIA ha sido desarrollada
fundamentalmente para el diseño racionalizado
de los procedimientos, para evaluar la cah dad y
la capacidad analítica y para la interpretación
de los resultados, todo lo cual implica poder
medir la afinidad y la concentración de los an­
ticuerpos en el ensayo. Por ello, para el trata­
miento de este tema necesariamente deben re­
visarse los principios básicos de la interacción
primaria antígeno-anticuerpo.
Algunas de las ecuaciones fundamentales
dadas en el capítulo 8 vuelven a presentarse,
 Inmunoanálisis radiométrícos 827

aunque ahora como variantes especialmente En el equilibrio y de acuerdo a la ley de ac­

adaptadas a esta metodología. Asimismo, las ción de masas de primer orden tenemos c¡ue:
representaciones gráficas han sido efectuadas [b*
en los sistemas de coordenadas más propicios, K* = - (5)
de modo de destacar ciertos efectos e implica­ 1^2 [f*:i íQ]
ciones de las curvas dosis-respuesta y derivar
ib]
las predicciones teóricas más relevantes. K= ( 6)
Inicialmente consideraremos en algún deta­ ^ 2 [fj [Q]
lle el modelo más sencillo de RIA y analizare­
mos sus propiedades. Luego trataremos en cier­ donde K* y K representan las constantes de
ta extensión algunos modelos más complejos y afinidad. En virtud de la suposición 3 del mo­
cercanos a las situaciones reales. delo básico K* = K. La concentración total de
antígeno unido ya había sido simbolizada antes
como B, la cual está dada entonces por:
A. El modelo básico B = [b*| + [b] (7)

El modelo más sencillo posible de RIA con­ En forma similar, la concentración total de
tiene un número de restricciones o postulados antígeno libre, F, está dada por:
que se enumeran a continuación: F = [f-M + [ f l (8 )

1, Tanto el antígeno como el anticuerpo son Luego, la relación de antígeno unido a libre
especies químicas homogéneas y univalentes, ya mencionada, B/F, puede expresarse según:
2, La interacción antígeno-anticuerpo obe­
dece a la ley de acción de masas de primer or­ [b*] [b]
(9)
den (con una cinética química de segundo or­ F |f*] [f]
den) sin que existan otros fenómenos alostéri-
cos o cooperativos, De (6) y (9) obtenemos.
3, El antígeno marcado radiactivamente B
(trazador) es indistinguible del antígeno inmo- K = --------- ( 10)
F • [Q]
dificado, desde el punto de vista de su inmuno-
rreactividad. Además, podemos definir la concentración
4, La condición final considerada luego de total de antígeno marcado. A*, como:
la reacción antígeno-anticuerpo es la del equili­ A* = [f*| + [b * ] ( ¡ 1)
brio,
5, Las formas libres y unida del trazador son y la de antígeno frío. A, como:
idealmente separables, sin perturbaciones del A = m + [bj ( 12 )
equilibrio y finalmente son medibles con exac­
titud. Finalmente, la concentración de antígeno to­
tal, A j se define como:
Aunque muchas de esas imposiciones no se A,,, = A* + A ( i3)
alcanzan en las situaciones experimentales rea­
les, el tratamiento que sigue provee una razo­ Por otro lado, definimos la concentración to­
nable aproximación a los sistemas de RIA apli­ tal de anticuerpo, q, como:
cados habitualmente. Luego, en forma progre­ q = [Q]-H [b*] + |b l (14)
siva iremos considerando las situaciones de in­
cumplimiento simple o combinado de esos pos­ Luego, de acuerdo a (7) tenemos que:
tulados. q = [Q] + B (15)
Para cada una de las interacciones represen­
tadas en (2) podemos escribir: Combinando (10) y (15) y reordenando, ob­
tenemos;

f* + Q íz > b* (16)
k,

f + Q (4) El gráfico de Scatchard

La ecuación (16) indica que existe una rela­
donde k, y k, ’ simbolizan las constantes cinéti­ ción lineal entre la relación B/F y la concentra­
cas de asociación, y k, y k^’, las constantes ci­ ción del antígeno unido, B. Esta rectificación
néticas de disociación. de la ley de acción de masas de primer orden
828 Metodologías
1.5
1,0
0,5
-J- J-
1 2 3 4
Dosis (hGH, ng/0,5 ml)
F ig . 39 -5 . A n álisis de d esp la zam ien to p ara el antígeno
hG H (horm ona de crecim iento hum ana) y un anticuerpo
m onoclonal específico (Q A 68). El trazador em pleado fue
' “ I-hG H. (•): m edia de ios puntos experim entales. El grá­
fico m enor insertado corresponde a un análisis de S cat­
ch ard cuya pendiente es igual a 2,5 x 10‘“ M ' y correspon­
de a -K . La proyección que intercepta las abscisas perm ite
calcular la concentración de sitios ligantes, totales (q) en el
sistem a. D e ese dato y de la dilución del fluido ascítico en
q u e se h allaba el anticuerpo Q A 68 se pudo hallar la capa­
cidad de unión. A dem ás, a nartir de K y q y de los otros
p arám etros fijados para el ensayo pudieron calcularse los
valores de las resp u estis p m c u ü q u ie r valor de la dosis.
Esos valores teóricos ti ish d ad o s nuevam ente al gráfico de
desplazam iento (o) m uestran la coherencia del tratam iento
fue originalmente desí ida por Scatchard,
en 1949, para describir las interacciones entre
proteínas y pequeñas moléculas. Posteriormen­
te fue aplicada al RIA por Berson y Yalow.
La ecuación (16) constituye la forma más
simple y compacta para expresar la evolución
de la relación B/F como una respuesta variable
en el RIA.
En la figura 39-5 se muestra un ensayo de
desplazamiento efectuado con un sistema antí-
geno-anticuerpo para el cual se cumplen con
suficiente aproximación los postulados del
modelo básico. En particular, el empleo de un
anticuerpo monoclonal decide que el gráfico
de Scatchard obtenido sea lineal (representa­
ción incluida en la misma fig. 39-5). La recta
obtenida tiene una pendiente de -K e intercep­
ta las abscisas en un valor de B igual a la con­
centración de sitios totales de anticuerpo, q.
En general, se requiere una medida indepen­
diente de la concentración de anticuerpos,
[Ac], para obtener mediante el cociente q/[Ac]
la valencia del anticuerpo en cuestión. Recor­
demos al respecto que puede obtenerse otra
forma de la ecuación de Scatchard según la
relación:
■= K ( n - r ) (17)
donde r se define como el número de sitios de
anticuerpo ocupados por el antígeno (B/[Ac]),
n se define como el número total de sitios li­
gantes por molécula de anticuerpo y c equivale
a la concentración del ligando libre que noso­
tros aquí simbolizamos como F.
Según la ecuación (17), de la pendiente de
un gráfico de r/c = f (r) también se obtiene -K,
pero de la intersección con las abscisas se ha­
lla n. O sea que, tanto a partir de la ecuación
(16) como de la (17), se requiere conocer la
concentración de anticuerpo total por un pro­
cedimiento separado. La diferencia radica en
que a partir de la ecuación (16) puede prescin-
dirse de esta determinación si sólo se desea
medir K y la concentración de anticuerpos, ya
sea en el ensayo (q) o en el fluido original sin
diluir (concentración total original o capacidad
de unión, en términos del antígeno total que
potencialmente se puede ligar). El valor de n
en muchos casos no es objeto de cálculo si se
trata de una clase de inmunoglobulina “nor­
mal” (n = 2 para IgG e IgA y 5 o 10 para
IgM). En estos casos, q y [Ac] total se inter-
convierten fácilmente. Pero, si en cambio se
trata de definir la valencia de anticuerpos asi­
métricos (p. ej., los definidos como coprecipi­
tantes), donde obviamente n no puede presu­
ponerse, entonces, es imposible soslayar la de­
terminación de [Ac] totales para luego calcular
n con la ecuación (16) o (17) indistintamente.
Esa equivalencia puede formalizarse reempla­
zando F por c en la ecuación (16) y dividién­
dola por [Ac] total. De ese modo, llegamos a
la ecuación (17). Una ventaja para normalizar
los datos en términos de r/c ha sido sugerida
cuando los ensayos de interacción primaria
se hacen variando la concentración de anti­
cuerpo.

E l cálculo de B
Las concentraciones suelen estar expresadas
en moles por litro, consecuentemente los valo­
res de K quedarán expresados en litros por mol
(M"'). Si se emplea otra escala de concentracio­
nes, por ejemplo para q y B en la ecuación
(16), se ve que se produce un cambio recíproco
en las unidades de K. Para obtener los valores
de B en un gráfico como el de la figura 39-5
debemos considerar los datos de las dosis de
antígeno adicionado (variable independiente) y
además los valores de las respectivas respues­
tas. Se puede hallar una expresión de B en fun­
ción de la concentración del antígeno total,
y de B/F a partir de las ecuaciones (7), (8) y
(11)-(13), de donde primero se deduce que;
B + F = A,, (18)
Luego, despejando F y dividiendo por B se
obtiene:
A^ - 1
09)
y finalmente se llega a:
( 20)
En forma análoga se deduce para F:
A„
F = (20’)
+ 1
F se 13 en moles/litro. Ese fue el procedimiento
La ecuación (20) permite calcular B en con­
centración molar cuando A.j, ingresa en las mis­
mas unidades, ya que F/B es el cociente adi-
mensional que se obtiene de la determinación
de actividades según la ecuación (9). Sin em­
bargo, en la práctica resulta más útil obtener
una expresión equivalente a la (20), donde las
concentraciones se convierten a las unidades
moles por litro a partir de otras unidades de uso
habitual en el RIA. Por ejemplo, en la curva de
desplazamiento de la figura 39-5, la concentra­
ción del antígeno se expresa en ng/volumen de
reacción; luego resulta útil ingresar en la ecua­
ción (20) el dato de dosis, D, directamente en
nanogramos. El factor que permite esa conver­
sión es lO'VPM X V, donde PM representa el
peso molecular del antígeno y V el volumen de
reacción expresado en mililitros. Como en vir­
tud de la relación (13) A^ puede desdoblarse en
los componentes marcado y frío (A* y A), ese
factor permitirá calcular inclusive A* si tam ­
bién la cantidad de trazador, T, se da en nano­
gramos.
Entonces, utilizando el factor común de con­
versión, tenemos que:
Inmunoanálisis radiométricos 829
A* + A = (T + D) ( 21 )
PM x V
Pero, a su vez, T en la práctica puede expre­
sarse en términos de otras unidades. Estas son
la actividad colocada (a) en cpm, la eficiencia
del contador (E) expresada en porcentaje (la
cual convierte las cpm en desintegraciones por
minuto, dpm) y la actividad específica (AE), la
cual suele expresarse en |aCi/|J.g. Considerando
que un Ci es igual a 2,2 x 10'^ dpm y requirién-
dose la conversión de las unidades de trazador
en nanogramos finales, se puede deducir otro
factor de conversión igual a 4,54 x 1 0 De es­
te modo, la expresión explícita de T en nano­
gramos será:
T = 4,54 X 10^-2 (22)
ExA E
Si se combinan las ecuaciones (21) y (22), se
tiene la relación buscada para calcular la con­
centración del antígeno total en moles por litro:
A^ = A* + A =
10-6 / , a \
= --------------------- ( 4 ,5 4 x 1 0 - ^ ----------- + D 1 (23)
PM x V y E X AE )
Obviamente, si V, a, E, AE y D en forma in­
dividual o combinada se dan en otras unidades,
deberán ajustarse los factores de conversión
respectivos.
Al reemplazar el numerador de la ecuación
(20) por su equivalente en la (23), puede hallar­
seguido para calcular los valores de B en el
gráfico de Scatchard de la figura 39-5 a partir
de los datos de la curva de desplazamiento.
Revisión de conceptos para definir el nivel
de “antígeno trazador”
Las transformaciones hasta aquí señaladas no
significan solamente una ventaja para operar en
los cálculos de B en concentraciones molares.
Además, para la deducción de la ecuación (23)
se ha introducido el concepto de actividad espe­
cífica del trazador, como un relación entre la
actividad y la m a p de la molécula marcada.
Ese valor constituye una especificación relativa
al número y la calidad de átomos del nucleido
con que se ha modificado el antígeno.
Los conceptos básicos de radioquímica per­
miten deducir una expresión compacta para el
cálculo de la actividad específica teórica de un
trazador preparado mediante la incorporación
de n átomos de nucleidos radiactivos. En parti­
cular, para n = 1 se tiene que:
1,88 X IQii
AE = (24)
PM
830 Metodologías
donde ss el período de semidesintegración
del isótopo radiactivo expresado en minutos.
La AE resulta expresada entonces en [iCi/jig.
Las unidades de tiempo pueden seleccionarse
para los distintos tipos de nucleidos según su
estabilidad. Así, por ejemplo, para el cuyo
t ¡/2 es de unos 60 días, el factor de la ecuación
(24) se convierte en 1,30 x 10*. Por lo tanto,
expresando t,^j en días, la AE surge también en
|iCi/|Xg. Otros factores pueden convertir esos
datos en Ci/|imol, lo que representa otras uni­
dades de AE de uso común.
Las técnicas de marcación que permiten ob­
tener distintos valores de AE serán menciona­
das más adelante cuando se trate el tema de los
requerimientos del RIA. Pero en este punto es
más importante definir cuál es el reflejo de la
AE en las propiedades de un trazador. Para ello
reconsideraremos un experimento de titulación
como el de la figura 39-1, donde sólo se coloca
el trazador y el antígeno frío no interviene. En
este caso, la ecuación (23) únicamente incluirá
el primer sumando. Se ve, entonces, que para
una actividad apropiada en el ensayo (p. ej.,
a ~ 10“*cpm) la concentración del trazador, A*,
guarda una relación inversa con la AE. Cuando
la AE presenta un nivel relativamente alto (que
luego indicaremos en forma más precisa), por
virtud del nucleido seleccionado y el grado de
incorporación (ecuación 24), A* presentará un
valor relativamente bajo. Ello repercutirá en un
valor correspondientemente bajo de B según la
ecuación (20) y, por último, en la (16), reorde­
nada según la relación:
(1 6 ’)
Ahora resulta evidente que cuando B sea su­
ficientemente bajo respecto de q, podrá igno­
rárselo, resultando:
-^ ^ K q (25)
Ese valor inicial de B/F también es designa­
do como (B/F)g.
Esa consideración que pudo introducirse in­
mediatamente después de definir la ecuación
(16), gana ahora un significado formal más
contundente, ya que es la cantidad relativa del
trazador empleado la que puede causar que la
respuesta (B/F) sea función sólo de la afinidad
y de la concentración de los sitios ligantes
(K.q). La afinidad viene determinada por facto­
res moleculares del paratope y del epitope, que
condicionan el nivel energético de la interac­
ción. Ello a su vez es consecuencia, por parte
del anticuerpo, de factores inscriptos en la in­
munogenética del organismo que produjo tal
variante de anticuerpo. Con ello se intenta de­
cir que el diseñador de un RIA podrá manio­
brar con ese parámetro sólo en términos de la
selección apropiada del anticuerpo dentro de
un repertorio disponible. Pero q, sí es un pará­
metro modulable, el cual puede ajustarse tenta­
tivamente en un experimento de titulación co­
mo el de la figura 39-1 o, en casos menos fre­
cuentes, conocida la concentración por méto­
dos independientes, puede colocarse en los en­
sayos directamente en el rango de concentra­
ciones que darán una unión del trazador de un
50%. Obsérvese que según la ecuación (25)
cuando B/F=l, q=l/K. Eso implica que, utili­
zando un trazador de AE suficientemente alta,
un RIA puede ajustarse a una relación (B/F)^ =
1 (respuesta “inicial” o valor de los “ceros”)
cuando la concentración de sitios iguala la in­
versa de la constante de equilibrio de asocia­
ción. Ello no implica que esa situación sea la
óptima para todos los fines analíticos; sin em­
bargo, es conceptualmente importante y otorga
una adecuada referencia en el momento de ge­
nerar en forma racional un RIA optimizado.
También es importante el papel del trazador
para decidir el límite de detección del análisis.
Esa situación y otras, en las que la concentra­
ción del trazador (o del antígeno en general) no
es insignificante respecto de q, se analizan en
la parte siguiente.
Análisis de curvas dosis-respuesta
Las deducciones efectuadas hasta aquí nos
llevaron a la ecuación más simple posible (la
de Scatchard) para describir la evolución de la
respuesta en el RIA en términos de la variable
B/F. Sin embargo, aún no presentamos formal­
mente la evolución de la variable B/F respecto
de la dosis de antígeno total. Esto es, no deduji­
mos aún la función que describe la curva de
desplazamiento. En este punto también debe­
mos hacer un retorno a temas anteriores de la
secuencia para reconsiderarlos más profunda­
mente.
Como punto de partida consideremos que la
ecuación (16) relaciona B/F con los parámetros
K,q y con la variable dependiente B. Pero ya
conocemos que B puede expresarse a su vez en
términos de A,, (ecuación 20). Sin embargo, es­
ta última ecuación también incluye la variable
B/F. Si reemplazamos entonces B en (16) por
su equivalente en (20) obtenemos luego de su­
cesivos reordenamientos una ecuación de B/F
en términos de todas las variables implicadas:
/ B \2 B
j + [K (A,. - q) + i] — - K q = O (26)
Esta ecuación cuadrática ha sido deducida
por distintos autores siguiendo diversas vías.
Constituye la llave de todas las relaciones do­

sis-respuesta en los ensayos de “un anticuerpo
y un antígeno”. Como la relación B/F puede
expresarse en función de A*, A, q y K, es facti­
ble generar toda la diversidad de curvas dosis-
respuesta que se desee cambiando una o más
de esas variables a la vez. Para ello basta con
asignar los valores de las variables, conservan­
do la coherencia en la unidades. Por ejemplo,
A*, A y q en moles/litro y K en litros/mol.
Luego, por practicidad pueden tabularse los
coeficientes a, b y c de la ecuación (26) para
cada condición propuesta.
Los coeficientes de la variable en cada su­
mando son:
a= 1
b = K (A ,,~q) + l
c = -K q
La solución de la ecuación puede hallarse se­
gún la expresión típica:
JL = -b ± ^ r h T T '^ i c
F 2a
Ese algoritmo puede aplicarse a todos los da­
tos tabulados (preferentemente con el auxilio
de una calculadora manual programable o de
un ordenador), y finalmente obtener los gráfi­
cos de desplazamiento simulados. En la figura
39-6 se muestra un modelo numérico para ilus­
trar en qué proporción se hallan todos los com­
ponentes del sistema antígeno-anticuerpo para
una condición inicial fija (K y q establecidos) y
dosis variables de trazador y de antígeno frío.
Observando atentamente la figura 39-6 con­
cluimos que para q = l/K el antígeno marcado
cumple aceptablemente su función trazadora
hasta valores de concentración vecinos a O, I K
(punto 3). Eso demuestra que no existe ventaja
en reducir la traza debajo de esa cota por medio
de un incremento de la AE o de una disminu­
ción de la actividad aplicada. Fijada esa con­
centración del trazador, una dosis igual del an­
tígeno frío disminuye poco la respuesta (punto
4), y probablemente en los casos reales no sea
discriminable de la anterior debido a la disper­
sión de los valores experimentales. Cuando el
antígeno total iguala a l/K, y por ende en este
caso a q, la respuesta ha sufrido una variación
franca (punto 5), cercana al punto medio del
rango. Finalmente, cuando la concentración del
antígeno supera 10 veces el caso anterior, la
respuesta ha sufrido casi su máxima evolución.
Aquí se ha cubierto prácticamente todo el ran­
go útil de ese RIA y nos hallamos cerca del
ámbito de la unión inespecífica.
Si bien esta propuesta es suficientemente
ilustrativa a los fines didácticos, en la práctica
resulta más útil aplicar una forma explícita de
la ecuación (26). Esto es, podemos retomar la
Inmunoanálisis radiométricos 831
ecuación (23) para calcular A,,, en términos de
los datos directos de los protocolos analíticos
(PM, V, a, E, AE y D), tal como se hizo para
B, y luego introducirlos ya normalizados en la
(26). En la figura 39-7 se ofrece una serie de
gráficos en los que se han alterado los paráme­
tros en forma aislada o combinada. El simple
análisis visual permite predecir qué consecuen­
cias tendrían tales cambios en los ensayos res­
pecto de una situación de referencia. De un
modo análogo se ha deducido la curva teórica
de la figura 39-5. En este caso q se ha calcula­
do previamente de modo de ajustar el valor de
(B/F)q al experimental. Eso se logró mediante
un reordenamiento de la ecuación (26) que per­
mite despejar esa variable. Luego, proponiendo
las dosis, D, se calcularon las respectivas rela­
ciones B/F por el procedimiento habitual.
Criterios de evaluación del RIA
En general se considera que un RIA presenta
una buena curva cuando el ensayo arroja alta
exactitud, precisión y sensibilidad. Según los
objetivos que se persigan en cada caso analítico
se hará una diferente elección del sistema de
coordenadas y también diferirá el criterio de
evaluación. Varios son los parámetros que se
han usado para tales evaluaciones. Entre ellos
se incluyen: 1) la pendiente: en general cuanto
más empinada sea la curva, mejor resultará el
ensayo, aunque la dispersión de los puntos ex­
perimentales, concordantemente, también será
mayor. 2) La intersección en el eje de ordena­
das, (B/F)^: ya se explicó que este punto puede
condicionarse sólo por la influencia de K y q
cuando el trazador es infinitesimal. También
puede manipularse tal condición para otras si­
tuaciones mediante la orientación de una ecua­
ción como la (26). Siempre es deseable que se
parta de un valor apropiadamente alto. 3) Dosis
media del rango: se refiere a la dosis de antíge­
no que modifica la respuesta a un valor igual a
la mitad de su magnitud inicial. Este valor tam­
bién se puede obtener de la intersección en x de
la curva construida en un gráfico logit-log. En
ese punto el logit B/Bo es cero y corresponde a
B/Bo = 0,5. 4) Coeficiente lambda: se lo define
en cada punto de la curva dosis-respuesta como
la pendiente en ese punto dividida por la des­
viación estándar calculada por la dispersión de
la respuesta en tal punto. Fls un parámetro esta­
dístico que pondera la desviación estándar o el
coeficiente de variación de la respuesta estima­
da para una muestra desconocida en ese punto.
5) ¡Dosis mínima detectable: este parámetro es
de capital importancia ya que muchas veces re­
sulta crítico en biología detectar metabolitos,
hormonas o factores presentes en ínfimas canti-
832 Metodologías
1,0 -------- 4
0,8
0,6
0 ,4
0,2
O dor (A*) igual a 0,002/K , 0,01/K y 0,1/K , res­
10 - 10 - ' 2 10-1
dades en los fluidos bajo investigación. La do­
sis mínima deteetable ha sido deñnida como la
menor concentración de antígeno frío, la cual,
cuando se adiciona a una solución carente de
él, produce un cambio significativo en la varia­
ble que expresa la respuesta. Normalmente se
realizan réplicas de todos los puntos de la cur­
va patrón, incluidos los controles sin antígeno
frío (ceros). Luego se calcula la media (X) y la
desviación estándar (DE) de las respuestas ex­
perimentales en cada punto. Para los ceros se
sustrae del valor medio el valor equivalente a 3
veces la desviación estándar y se lo proyecta
hacia la curva dosis-respuesta, El valor corres­
pondiente a ese punto en las abscisas determina
la dosis mínima deteetable. Como se advierte,
ese parámetro está muy influenciado por la pre­
cisión, reflejando la variación causada por las
micropipetas y dispensadores y los propios
operadores. El control de la precisión puede
hacerse construyendo una curva o un perfil de
precisión a lo largo de la curva estándar. En or­
denadas suele representarse el coeficiente de
variación (CV % = DE x 100/X). La curva ob­
tenida habitualmente tiene la forma de U.
Según las recomendaciones de R. P. Ekins,
F ig . 39 -6 . C u rv a de d esp lazam ien to teó rica
para un R IA ideal realizado con un anticuerpo
k = IQi» M-' hom ogéneo. L a tabla inferior ilustra encolum -
nadam ente la proporción d e m oléculas totales,
com binadas y libres de cada tipo (los valores
ta b u la d o s r e p r e s e n t a n c o n c e n tr a c io n e s
M X 10’'^ en núm eros integrales por sim plici­
dad) y finalm ente la relación B /F calculada.
A ju stad o el v alo r d e q a 1/K las relacio n e s
B /F se dedujeron em pleando la ecuación (26)
para cada dosis propuesta. P untos 1-3: traza­
10-10 10-9
pectivam ente. P unto 4: trazador igual a 0,1/K
m ás igual dosis d e antígeno frío (A). P untos
5-6: trazador igual a 0,1/K m ás antígeno frl^o
hasta antígeno total igual a 1/K y 10/K, re s ­
pectivam ente.
cuando se fija la concentración de anticuerpos
al valor 3/K y la concentración del trazador a
4/K, se obtiene la menor dosis deteetable posi­
ble. En ese caso, además se predice que las cur­
vas se iniciarán con un mismo valor de B/F = 1
para cualquier K propuesta. También se deduce
que, si sólo existe el error de conteo, esa rela­
ción de K, q y trazador provee el mejor coefi­
ciente lambda para los ceros.
El térm ino sensibilidad, frecuentem ente
mencionado en el área del RIA, ha generado al­
guna controversia respecto de la definición más
apropiada. Nosotros aquí podemos definirla
tanto en términos de la dosis mínima deteetable
como de la pendiente de la curva estándar do­
sis-respuesta. Esta asimilación es válida si se
supone que el error experimental no cambia
cuando logra aumentarse la pendiente de un en­
sayo y entonces esto se traduce en una reduc­
ción de la dosis mínima deteetable. El siguiente
ejemplo concreto puede servir para clarificar el
concepto: supongamos que la pendiente de una
curva dosis-respuesta conduce a un cambio del
10% en la respuesta para una dosis de xpg, y
que el error estadístico en la determinación es
del 10%. Entonces la cantidad mínima detecta-
 Inmunoanálisis radiométrícos 833

T
A E = 3 0 0 n C i/jig
a = 5 .000 cpm
E = 70 %

K=10'“M -\ K=109M-'
K=10"M-' \q = 10-’“IVI \q = 10-9M
\ q = 10 -"M \ \

0,01 0,1 10

D o sis (insulina, ng/ml)

F ig . 39-7. C urvas de desplazam iento sim uladas em pleando las ecuaciones (23) y (26). E n A , B y C se varió un p arám etro
a la vez. E n D se variaron K y q recíprocam ente de m odo que K, = 1/q.. E n las curvas cuyo (B/F)^, es m en o r que 1 el tra z a ­
dor ya ejerce un efecto de “autodesplazam iento”. Para el m odelo seleccionado (insulina) las flecnas indican a m odo d e re ­
ferencia los valores más frecuentem ente em pleados. Las dosis aquí se refieren sólo a insulina fría. El trazador es '“ I-in su -
lina, por lo cual scgiín la ecuación (24) 1 átom o de '“ I p o r m olécula corresponde a ~ 380 H.Ci/|j.g.

ble estará en el orden de xpg. Si la pendiente nales de referencia y el sometimiento a progra­

puede mejorarse y alcanza un valor 10 veces
más alto (100% de cambio en la respuesta para
la misma cantidad), entonces, para el mismo
error supuesto en las determinaciones anterio­
res, la cantidad mínima detectable será x/10 pg.
mas regionales de control constituyen medidas
adicionales para mejorar las prestaciones de los
RIAs.
B. Ensayos en preequilibrio

Control de calidad en el RIA
Para los laboratorios que ejecutan rutinaria­
mente los RIAs con distintos fines, es necesa­
rio documentar la exactitud y precisión de los
análisis, de modo de controlar las propiedades
y la estabilidad de los métodos aplicados. En el
área de los análisis clínicos, por ejemplo, esto
contribuye a la reducción de los ámbitos difu­
sos que separan los valores normales de los pa­
tológicos. La aplicación de métodos estadísti­
cos y la confección de cartas de control permi­
ten reconocer si una determinación se halla o
no dentro de los límites de las especificaciones
establecidas. El empleo de patrones internacio­
Hasta aquí sólo tratamos los aspectos teóri­
cos del RIA bajo los postulados del modelo bá­
sico, uno de los cuales (número 4) suponía que
el estado final alcanzado era el de equilibrio.
Ahora bien, si los reactivos de un ensayo no se
agregan simultáneamente y las incubaciones se
interrumpen antes de alcanzado el equilibrio,
entonces las consecuencias serán diferentes se­
gún las especificaciones seguidas. Si bien se ha
desarrollado una teoría matemática que predice
la cinética del RIA, nos limitaremos en este
punto a mencionar que uno de los recursos más
empleados dentro de estas variantes es el de la
adición demorada del trazador. Consiste en adi­
cionar anticuerpos y antígeno frío en los tubos
834 Metodologías
de reacción y luego incubar hasta que se alcan­
ce el equilibrio, o un estado cercano a él. Final­
mente, se agrega el trazador y se comienza a
tomar el tiempo de esta segunda incubación.
Luego de un lapso preestablecido por un test
empíricamente controlado, la reacción se detie­
ne con la ejecución de la etapa separativa. Los
resultados esperados de un ensayo óptimo arro­
jarán un valor de (B/F)^ o (B/T)„ casi igual al
de un test normal, pero a bajas dosis, la curva
del ensayo de “preequilibrio” exhibirá una ma­
yor pendiente que la convencional. Además,
tanto el rango de trabajo como la dosis media
de ese rango mostrarán un desplazamiento ha­
cia la región de dosis bajas. Todo ello significa
un aumento en la sensibilidad del ensayo cuan­
do no existen otros factores que aumentan la
dispersión de los datos respecto de un RIA nor­
mal.
C. RIAs con multicomponentes
El siguiente nivel de complejidad que trata­
remos es el más habitual, o sea el de los siste­
mas en que intervienen mezclas de anticuerpos
de variada afinidad por el antígeno. Tal es el
caso de los sueros inmunes y también el de los
anticuerpos fraccionados y rotulados como
“monoespecíficos” por reaccionar específica­
mente contra un solo epitope del antígeno.
Además, la heterogeneidad del antígeno en
otros casos también causa problemas de conta­
minación, de reactividad cruzada o de inespeci-
ficidad.
A los fines didácticos sólo consideraremos
en esta parte los modelos referidos a un antíge­
no frente a dos o más anticuerpos en el test y al
de dos antígenos frente a un anticuerpo, con re­
ferencias a una generalización para los sistemas
polielonales. Todos estos casos se inscriben
dentro de los modelos más cercanos a los rea­
les, y representan, por ende, a los RIAs habi­
tuales que no cumplen con el postulado número
1 del modelo básico.
Heterogeneidad en la afinidad
En general los anticuerpos séricos causan
curvas de Scatchard francamente contrastantes
respecto de las mostradas por los anticuerpos
homogéneos. Mientras que en estos últimos se
obtiene una recta (véase el caso de un anticuer­
po monoclonal en la figura 39-5), los anticuer­
pos heterogéneos causan gráficos curvados
(fig. 39-8). Los antisueros, por representar un
sistema heterogéneo de anticuerpos, suelen ex­
hibir típicos gráficos de Scatchard con concavi­
dad hacia arriba. Ese fenómeno, también po­
tencialmente adjudicable a una cooperatividad
negativa, como la descrita para ciertos recepto­
res, parece no producirse con los anticuerpos.
Dicho en otros términos, en la mayoría de los
casos no hay evidencias de que la ocupación de
un paratope disminuya la afinidad del otro en
la misma molécula por un efecto alostérico
(postulado número 2 del modelo básico).
La base formal para analizar el modelo de
dos o más anticuerpos surge de considerar una
de las ecuaciones, como la (10), para cada uno
de ellos, reexpresándola en términos de q - B
en lugar de [QJ, resolviendo para cada B:
K iq ¡ F
(28)
1 + K ¡F
Entonces para la suma de concentraciones.
B Z y en particular para m = 2 :
i= l
K ,q ,F K ^ q .F
B = (29)
1 -l-K, F 1 -l-K, F
Si dividimos por F tenemos otra forma equi­
valente en términos de la relación B/F:
(30)
F 1 + K |F l+ K jF
Tanto en la ecuación (29) coino en la (30) F
puede ser reemplazado en función de A Para
la ecuación (29), utilizando la relación (13), F =
A-j, - B, y luego, reordenando la variable B sur­
ge una ecuación cúbica. Para ingresar a la ecua­
ción (30), F se calcula utilizando la relación
(20’). Luego tenemos una expresión de B/F
también en términos de A^, y de los parámetros
de afinidad y concentración, como se había he­
cho para m = 1 (ecuación 26). Sólo que su ex­
presión reordenada para B/F genera una ecua­
ción aun más compleja. Por ende, una solución
más conveniente para resolver las ecuaciones
(29) o (30) es el empleo de programas de com­
putación, donde K,, qj, y q^ ingresan como
aproximaciones obtenidas de las tangentes grá­
ficas (fig. 39-8) y se ajustan luego mediante
métodos iterativos. Otros sistemas de procesa­
miento de datos prescinden de tales valores
aproximados y calculan directamente los cuatro
parámetros con los datos experimentales.
Si la mezcla de anticuerpos es más compleja
que la seiialada, entonces el tratamiento analíti­
co hasta aquí efectuado no será estrictamente
aplicable. Tal es el caso de muchos sistemas
constituidos por un antisuero y, como agravan­
te, por un antígeno suficientemente voluminoso
como para permitir interacciones independien­
tes y no interactuantes con dos o más epitopes
a la vez. Ai respecto es ilustrativo mencionar
que macromoléculas globulares a partir de PM
5-6 KDa (p. ej., la de insulina) ya presentan ra­
dios de Stokes suficientemente importantes co-

F ig . 39-8. G ráfico de S catchard curvib'neo produci-
do por u na m ezcla de dos anticuerpos con diferen-
tes afinidades. Ei análisis es estrictam ente aplicable
a un sistem a de un antígeno y dos anticuerpos rao-
n o c io n a le s e s p e c ífic o s c o n tra el m ism o epitope
(com parar con el sistem a análogo más sencillo de la
fig. 39-5). L a curva es una hipérbola cuyas tangen­
tes g ráficam ente trazadas con los puntos extremos
(líneas continuas) perm iten la estim ación algo ine­
xacta de las afinidades de cada anticuerpo. Por la
in tersecció n de las ab scisa s se p uede apreciar la
concentración total de sitios de anticuerpos (no se
discrim in a la contribución de cada sum ando). Un
an á lisis m ás e la b o ra d o , u tiliz a n d o el m étodo de
G auss-N ew ton de regresión no lineal pesada para el
ajuste de los datos experim entales, perm ite calcular
los cuatro parám etros KjQiKjqj. Con ellos es posi­
ble trazar las asíntotas (líneas cortadas). Estas rectas
corresponden a los gráficos de Scatchard de los dos
com ponentes en que se descom pone la hipérbola.
mo para admitir la interacción simultánea con
dos inmunoglobulinas específicas. La forma­
ción de complejos cíclicos (Ac,, Ac^): 2Ag
conduce a un incremento de la afinidad aparen­
te con deformación de los gráficos de Scat­
chard. Ésa es la base de un RIA cooperativo
que utiliza dos anticuerpos monoclonales apro­
piados a la vez.
A pesar de todo lo comentado, es frecuente
hallar en la bibliografía conectada al tema, re­
ferencias a tratamientos “para dos componen­
tes” aplicados a sistemas de anticuerpos poli­
clonales contra antígenos proteicos. Es discuti­
ble si tal aproximación es lícita o no (incumpli­
miento de los postulados números 1 y 2 del
modelo básico) en cada caso en particular.
Afinidades promedio
Del gráfico de Scatchard curvilíneo pueden
obtenerse gráficamente dos tipos de afinidades
promedio. La más ampliamente usada es la
constante intrínseca promedio, Ko. En realidad,
refleja con mayor exactitud el valor de la me­
diana que el valor denominado “promedio pe­
sado de la afinidad”, K. Mientras este último
valor se calcula contemplando la concentración
m no habrá otras consecuencias en cuanto a la
y la afinidad conjuntamente (X K¡q/q^^^j,j),
i= 1
el de Ko se obtiene calculando la pendiente de
la tangente en el punto de la curva donde B =
qi^^i,j/2. De este modo, la Ko resulta más difícil
de obtener gráficamente que la constante pro­
medio pesado, ya que ésta surge simplemente
del cociente entre los puntos de intersección de
la curva en ambos ejes (fig. 39-8).
Según se analiza en la teoría general de la in­
teracción primaria antígeno-anticuerpo (cap. 8),
para los antisueros heterogéneos puede calcu­
larse un índice de heterogeneidad y un valor de
Inmunoanálisis radiométricos 835
F K, = 6 , 9 x 1 0 '“M^'
K^q^+K^q,
q, = 2 , 6 x 10^” IVI
2,0 K, = 9 , 5 x 10»M-i
K iq, q2 = 3 , 0 x 1 0 ’' “M
R = 6 ,4 x 1 0 ® M
1.0
^ 1+^2
K jq j
0,1 0,2 0 ,3
i (h G H , nM )
afinidad promedio mediante el gráfico de Sips.
En este caso, la constante apreciada es Ko.
Heterogeneidad en el antígeno
El RIA ha sido una herramienta importante
para estudiar no sólo los antígenos “genuinos”,
relacionables a los inmunógenos, sino otros es­
tructuralmente vinculados y que exhiben una
reactividad cruzada frente a los mismos anti­
cuerpos. Este fenómeno, muy tempranamente
descrito en inmunología, puede ser explotado
con fines analíticos. Con anterioridad deben re­
conocerse sus dos variantes condicionadas por:
1) la estructura naoleculav de ios antígenos, y 2)
el grado de heterogeneidad de los anticuerpos.
El caso más sencillo es el de un anticuerpo
homogéneo reaccionando alternativamente con
dos antígenos. Podría incluirse dentro de este
modelo hasta el propio sistema común de un
solo antígeno y su trazador, donde este último,
debido a la modificación química sufrida puede
unirse al anticuerpo con menor afinidad que el
antígeno inmodificado (incumplimiento del
postulado número 3 del modelo básico). Siem­
pre y cuando el grado de deterioro de esa inte­
racción no determine la inutilidad del trazador,
exactitud de los análisis, aunque sí en el cálcu­
lo de la afinidad. En efecto, fue tempranamente
reconocido en la historia del desarrollo del RIA
que su validez para ponderar antígenos depen­
de de la idéntica inmunorreactividad del están­
dar y de los desconocidos (o sea sus propieda­
des para competir con la unión del trazador) y
no depende en cambio de la similitud en la in­
munorreactividad del trazador respecto del es­
tándar o de los desconocidos. Pero en esta sec­
ción analizaremos otro tipo de experimento que
suele darse en la práctica del RIA: la determi­
nación de un antígeno no homólogo competi­
dor, A2, en un ensayo realizado en principio
836 Metodologías
con un anticuerpo homogéneo anti-A, (induci­
do por un inmunógeno A,) y un trazador A,*
presente en concentración infinitesimal. Luego
nos referiremos al caso de un antisuero hetero­
géneo frente a los mismos antígenos.
Antes de entrar en los aspectos formales que
describen estos modelos, debemos justificar en
qué situaciones de la práctica radioinmunoana-
lítica no se cumple el postulado número 1 del
modelo básico, ahora por causa del antígeno.
El antígeno A^ puede presentar reactividad
cruzada frente a ese anticuerpo anti-A, por cau­
sa de dos mecanismos diferentes: a) el epitope
de no es idéntico al de A l porque comparte
sólo una fracción de los grupos funcionales;
b) los grupos funcionales son enteramente
idénticos en A, y A^, pero en este último la es­
tructura espacial presenta una conformación un
tanto alterada. El caso a se da típicamente en
los antígenos proteicos que constituyen las lla­
madas familias de proteínas filogenéticamente
relacionadas y que presentan mutaciones a ni­
vel de uno o más residuos aminoacídicos. Tal
es el caso de varias hormonas polipeptídicas
que, según ias distintas especies animales, re­
sultan altamente homologas. Por ejemplo, la
insulina porcina difiere solamente en un resi­
duo respecto de la humana. Si al obtener anti­
cuerpos monoclonales inducidos por la insulina
porcina, el epitope involucrado incluye ese re­
siduo, puede ocurrir que la reactividad cruzada
con la insulina humana sea algo menor (con
otros monoclonales, la reacción puede ser idén­
tica o nula). En ese caso, un RIA aplicando in­
sulina porcina trazadora puede permitir no sólo
la determinación de la hormona humana sino
que es factible determinar su constante de afi­
nidad. Además, es innecesario efectuar los es­
fuerzos para generar un trazador de insulina
humana o incluso para obtener anticuerpos mo^
nocionales vía ese inmunógeno.
Otra situación dentro del caso a, donde pue­
den verse involucrados dos antígenos relacio­
nados, es la de su coexistencia natural en un
mismo fluido biológico. Tal es el caso de la
hormona de crecimiento hipofisaria (hGH) y
del lactógeno placentario (hGS) en el suero de
embarazadas. Ambas hormonas dan reactividad
frente a antisueros específicos o ante algunos
anticuerpos monoclonales inducidos por cual­
quiera de ellas. La determinación específica de
hGH en presencia de niveles considerables de
hCS (hasta 10^ veces mayores) presenta un pro­
blema analítico que se considera a la luz de los
modelos teóricos de competición que se verán
seguidamente.
El caso b se da típicamente en los antígenos
macromoleculares desnaturalizados o que per­
dieron su conformación nativa por hallarse es­
cindidos a un nivel que no involucra los epito­
pes, pero que causan su alteración topográfica
indirecta. Éso puede ocurrir durante las etapas
preparativas, de purificación, o de almacena­
miento de macromoléculas algo inestables y
que luego se estudian mediante RIA como con­
trol de calidad. También surgen cambios du­
rante la ruptura o la síntesis de antígenos pro­
teicos sometidos a estudio de restricción de
epitopes.
Base teórica del modelo anticuerpo
homogéneo-tmzador homólogo-
antígeno competidor
En la figura 39-9A se muestran esquemática­
mente, a los fines comparativos, las curvas de
desplazamiento obtenidas en forma separada
para el antígeno homólogo A l (ensayo “nor­
mal”) y para el antígeno competidor A^, em­
pleando el mismo trazador ideal, A,*, en am­
bos experimentos.
El simbolismo que utilizaremos aquí conser­
va en lo posible las formas ya utilizadas e in­
corpora las del competidor, según el siguiente
listado:
q : concentración total de sitios de anticuer­
pos
[Q] : concentración de sitios de anticuerpos
libres
A l : concentración de antígeno frío
A l* : concentración del trazador
[fl*] y [bi*] : concentración del trazador libre y unido,
respectivam ente
A 2 : concentración del antígeno com petidor
[fa] y [b2] : concentración del antígeno com petidor
libre y unido, respectivam ente
B [bi*] : relación de las concentraciones de radiac-
= tividad unida/libre m edidas
F [fl*] :
: constante de asociación para A]
K ^2 • constante de asociación para A 2
En este modelo se cumplen dos reacciones
de equilibrio simultáneamente:
Q + (31)
f,* b *
Puesto que [Q] = q - [b,*] - [b^], según la
ley de acción de masas puede expresarse una
relación para cada equilibrio:
[ b i* ]
K a, = (3 2 )
[ f i* ] ( q - ~ [ b ,* ] - [ b j)
[bzl
K .,= (3 3 )
[ f J (q - [b ,* l - [bj])
 Inmunoanálisis radiométricos 837

En el punto medio del rango de ordenadas

(fig. 39-9) se cumple a partir de (34) y (25’)
que:

( 7). K A iq
K ., ( q ^ [ b , * ] ^ [ b j ) = (3 6 )

Resolviendo la ecuación (36) para [bj*], y

sustituyendo en la ecuación (34), tenemos que:
t T 4 ( 1 - K a i [f,* ]) = [ b j (3 7 )
X - 1 + q V ■' + Dosis (log)
X de A ,O A ,
Luego, resolviendo la ecuación (36) para q,
y sustituyendo en la ecuación (33), tenemos
B que:
[b,]
Trazador = A * K a2 [ b J = (3 8 )
q/2

Combinando las ecuaciones (37) y (38) obte­

nemos:
Ka2 = ^ ( 1 - K a , [fj* ]) (3 9 )
[Í2]
Por líltimo, de las ecuaciones (38) y (39) lle­
gamos a que:

An - ( l- K ., [f,*]) (4 0 )
de A, o
Esta ecuación nos demuestra que para B/F =
F ig . 39-9. A, R IA esquem ático para el inraunógeno, A l, (B/F)(/2, la concentración del antígeno compe­
y para un antígeno con reactividad cruzada, Aj, en un sis­
tem a de anticuerpos hom ogéneos. D e los valores de absci­ tidor puede ser función sólo de q y con la
sas en los puntos m edios de) rango de respuestas se p u e ­ condición de que [f,*] sea insignificante res­
den obtener relaciones en térm inos de y B, R IA pecto de l/K .,, luego K^ [f,*] es « 1 y puede
esquem ático para los m ism os antígenos ixente a dos h ipo­ ignorarse el ultimo factor de la ecuación (40),
téticos sueros heterogéneos. En un caso los anticuerpos d i­
fieren en sus afinidades determ inando una curva no p ara­ con lo que se obtiene:
lela (reactividad cruzada de tipo 1), E n el otro caso, la h e ­
terogeneidad se refiere a la especificidad por ios epitopes.
Al -- - (4 1 )
En la curva de A^ para el suero con reactividad cruzada de
tipo 2 sólo intervienen ios anticuerpos dirigidos hacia ep i­
topes com partidos por A, y A ,. El resto sólo reacciona es­
pecíficam ente con A, y su trazador. Además, por una vía mucho más sencilla,
para el modelo simple donde Aj = O y sustitu­
yendo en la ecuación (26) B/F por el valor del
La ecuación (32) puede reordenarse de modo
que resulte una expresión de B/F = [b,*J/[fj*] punto medio, (B/F)p/2 = tenemos que:
en función de [b,*] o de [f *]:
[b,*:i
Al —• + —
q (4 2 )
= K a , ( q - [ b ,* : | - [ b J ) (3 4 )

[b,*] Ka , ( q ^ f b j ) Como se advierte, las ecuaciones (41) y (42)

(3 5 ) son muy semejantes y permiten relacionar, en
[fi 1 + K a , [f,*]
los puntos de (B/F)y2 de cada curva de despla­
Luego se cumple que, para la condición en zamiento, los valores de dosis con las respecti­
que tanto A, como A^ tienden a cero, B/F al­ vas constantes de afinidad para un mismo y de­
canza un valor límite igual que el definido para finido valor de q.
la ecuación (25) del modelo básico: En la figura 39-9A se destacan las proyeccio­
nes de esos valores en el eje de las abscisas (x e
= (25’) y para A¡ y A^, respectivamente). Como esta­
mos comparando dos experimentos paralelos
838 Metodologías

con un mismo valor de q, despejando q/2 en las sarios (pero no suficiente) para demostrar iden­
ecuaciones (41) y (42) e igualándolas, tenemos tidad radioinmunoanalítica entre un estándar de
que: referencia y la muestra problema: el paralelis­
I I mo de sus curvas de desplazamiento frente a un
Ao - A , = ------------ --------- (4 3 ) suero policlonal específico.
La reactividad cruzada de tipo 2 puede ocu­
O sea que, determinando el valor de por rrir solamente si se da la llamada heterogenei­
los procedimientos ya descritos, el valor de dad de especificidad para diferentes determi­
puede obtenerse de la ecuación (43), donde - nantes. En este caso hay sólo una fracción de
A, representa la diferencia entre las dosis y y x . anticuerpos dentro del antisuero heterogéneo
Si bien la pendiente de la curva para A2 en que puede reaccionar con el competidor A^.
ese punto es menor que la de Al (analíticamen­ Luego el antígeno A^ no podrá causar un des­
te puede demostrarse que la diferencia se debe plazamiento completo como el A,, a ningún va­
a las distintas afinidades), en una escala loga­ lor de dosis (fig. 39-9/?). Nuevamente aquí po­
rítmica de abscisas resultan paralelas. Además, demos aplicar el concepto de especificidad co­
el competidor A^ puede lograr el total desplaza­ mo lo hicimos antes, sólo que para este caso
miento del trazador a concentraciones propor­ definiremos un suero como específico para el
cionalmente mayores que las de A,. Esas carac­ antígeno A, cuando sólo una mínima fracción
terísticas son propias de los llamados antígenos de sus anticuerpos pueda reaccionar contra A^.
con reactividad cruzada verdadera o de tipo 1. Por ejemplo, si sólo el 1% de los anticuerpos
En los sistemas con anticuerpos monoclonales anti-A| (sin mencionarse las afinidades) reac­
es la única clase de inmunorreactividad cruza­ ciona con un epitope compartido por A^, puede
da factible, a diferencia de lo que puede ocurrir decirse entonces que el antisuero es 100 veces
con los sueros heterogéneos, según veremos. más específico para A, que para A,^. Un RIA
Además, si definimos la especificidad como elaborado en estas condiciones arrojaría una
una propiedad en cierto sentido inversa a la de recta paralela al eje de las abscisas, sin indicar
reactividad cruzada, podemos considerar que desplazamiento perceptible para el antígeno A
un anticuerpo homogéneo será específico hacia
su antígeno homólogo A,, en presencia de un
contaminante A^, cuando la relación RIA HETERÓLOGO
sea suficientemente elevada. Se ha considerado
que un valor > 10^ es aceptable en los casos co­ En los casos anteriores los anticuerpos y el
munes para discriminar A, de A^. Para otras si­ trazador pertenecían a un sistema homólogo,
tuaciones extremas (como la ya señalada para esto es, el anticuerpo monoclonal o el antisuero
las hormonas séricas hGH y hCS que coexisten se habían inducido en una especie animal me­
en el embarazo en relación ~ 1:10^), ese índice diante un inmunógeno A, y el trazador también
debe ser aun mayor si se desea determinar con se preparaba con el mismo antígeno (A,*). En
un anticuerpo monoclonal “específico” el pri­ cambio, ahora definiremos como RIA “heteró-
mer antígeno sin la interferencia del segundo. logo” aquel en el cual el trazador se sustituye
por el del antígeno no idéntico, A^*, y el des­
Reactividad cruzada con anticuerpos plazamiento se efectúa con A^. Este modelo ha
heterogéneos sido propuesto en ciertos casos en que tal com­
binación permite obviar dificultades de especi­
Hay dos tipos de heterogeneidad en pobla­ ficidad mostradas por el RIA normal u “homó­
ciones de anticuerpos heterogéneos: 1) respecto logo”. El caso más típico es el del sistema FSH
de afinidades, y 2) respecto de la especificidad (hormona foliculoestimulante): anti-ESH, don­
por los determinantes. Si los anticuerpos son de estos últimos sueros suelen exhibir reactivi­
específicos por un único determinante pero he­ dad cruzada con otras glicoproteínas presentes
terogéneos en afinidad, estamos en presencia en la misma especie, tal como la hCG (gonado­
de un caso de reactividad cruzada de tipo 1. Sin trofina coriónica). Los procedimientos de ab­
embargo, las curvas de desplazamiento no re­ sorción de los sueros con hCG para lograr una
sultarán paralelas (fig. 39-9B). En ese modelo adecuada especificidad no suelen dejar sufi­
el tratamiento formal es bastante complejo y cientes anticuerpos de alta afinidad y realmente
puede concluirse que no será válido comparar específicos para FSH. Eso probablemente se
afinidades relativas en los puntos de (B/E)(/2. debe a que las regiones moleculares críticas pa­
De un RIA en estas condiciones a lo sumo pue­ ra la función hormonal de FSH son relativa­
de obtenerse una idea cualitativa con respecto a mente menos inmunogénicas que las regiones
que la constante de afinidad promedio del com­ homólogas con otras hormonas glicoproteicas
petidor A, es menor que la del antígeno A l. En de la familia. Cuando se aplica un RIA heteró-
este principio se basa uno de los criterios nece­ logo con un trazador de igual hormona pero de

otra especie, se está seleccionando la población
de anticuerpos de especificidad requerida. Se
espera en ese caso que los anticuerpos exhiban
también una afinidad suficientemente alta por
el trazador, aunque por otro lado deba emplear­
se una concentración de suero mayor que para
el RIA homólogo. Por ejemplo, un RIA para
FSH humana empleando suero anti-FSH ovina
y FSH humana marcada puede resultar tan es­
pecífico y sensible como un RIA homólogo
ideal. La unión de la FSH humana a los anti­
cuerpos involucrados puede ser tan buena o
mejor que la del trazador y por ende la curva
de desplazamiento no sufrirá disminución en la
pendiente asociada a cambios a la sensibilidad.
D E T E R M IN A C IÓ N D E A N TIC U ER PO S
Los métodos radiométrícos para la determi­
nación de anticuerpos son varios. En esta sec­
ción nos ocuparemos del RIA en fase fluida
clásico y de otras variantes relacionadas.
Utilización del RIA
En los RIAs el componente que se determina
habitualmente es el antígeno. No obstante, en
ciertas ocasiones el objetivo analítico principal
es la determinación de los anticuerpos específi­
cos para un antígeno en especial. Determinar
los anticuerpos estrictamente significa ponde­
rar tanto los valores de concentración como los
de afinidad. Pero en situaciones prácticas de la­
boratorio de inmunología muchas veces basta
con tener una idea globalizada de “la potencia”
de un suero, lo cual significa sencillamente te­
ner un título que incluye el producto de ambos
tipos de parámetros. Ese dato emerge directa­
mente de la primera etapa del desarrollo de un
RIA, como es la curva de calibración, según vi­
mos al comienzo. En cambio a veces puede re­
querirse la determinación de la concentración
total de anticuerpos específicos en un volumen
determinado de suero, lo cual debe derivarse
del valor de q o Xqi molares calculados de un
ensayo de desplazamiento y del análisis de
Scatchard o sus equivalentes. Esta vía conduce
en realidad a la concentración de los sitios de
unión, según vimos, y de acuerdo al valor de la
valencia (conocida o supuesta) se llega a la
concentración de los anticuerpos. En ciertas
circunstancias las convenciones utilizadas exi­
gen la transformación de los datos de q o q to­
tal en términos del antígeno unido. Tal es el ca­
so de la determinación de los anticuerpos an-
tiinsulina por radiometría, utilizando como uni­
dad de expresión la capacidad de unión, o BC
(de Binding Capacity). En estos casos además
se requiere conocer el factor de conversión pa­
Inmunoanálisis radiométrícos 839
ra la masa de insulina en unidades de actividad
biológica (lU = 41,67 |j.g). Luego es factible
determinar la magnitud de la respuesta inmune
humoral específica hacia la insulina de la tera­
pia sustitutiva en los diabéticos, en términos de
BC y expresada en U de insulina fijables por li­
tro de plasma. Esta magnitud es más fácilmente
interpretable por los médicos diabetólogos para
estimar la relación entre la dosis de insuhna ad­
ministrada y la cantidad de anticuerpos poten­
cialmente secuestrantes de la hormona que el
valor de q total, ya que éste representa un dato
empírico de concentración molar de sitios en el
tubo del RIA.
Utilización del ensayo de unión
de radioligando (RBA)
Cuando los sueros poseen muy bajas con­
centraciones de anticuerpos específicos hacia
un antígeno macromolecular soluble y bien ca­
racterizado, puede utilizarse para la determina­
ción rápida de esos anticuerpos el llamado test
de unión de radioligando o RBA (del inglés,
Radiobinding Assay).
El RBA consiste en un ensayo de fase fluida
en el cual se enfrentan los sueros, en una dilu­
ción convencional orientada por las necesida­
des, con una dosis fija de antígeno marcado ra­
diactivamente. Luego de la incubación, hasta
alcanzar un estado cercano al de equilibrio, se
procede a la separación de la marca unida y la
marca libre por los medios habituales. El méto­
do más empleado es la precipitación de los an­
ticuerpos y de los complejos inmunes con PEG
al 12,5%.
Este tipo de ensayo radiométrico así conce­
bido posee un diseño idéntico al de la primera
etapa del RIA (curva de calibración), aunque se
ejecuta con una única dilución fija del suero.
Es por ello que ocasionalmente se lo ha deno­
minado como “RIA”, en lugar de RBA. Es
conveniente, no obstante, mantener la distin­
ción de nomenclatura entre ambos métodos, ya
que el primero sirve en general para la determi­
nación de antígenos y en cambio el segundo se
aplica para medir anticuerpos.
En el RBA la expresión final de los resulta­
dos se efectúa en términos de porcentaje de
marca unida, lo cual representa una unidad re­
lativa, dependiente de las condiciones experi­
mentales. En cambio, cuando se recurre al RIA
para la determinación de anticuerpos específi­
cos, por tratarse de un ensayo e saturación con
antígeno, las unidades de expresión son absolu­
tas e independientes de las condiciones experi­
mentales.
FJ análisis teórico del RBA y su verificación
experimental permiten conocer la relación exis­
tente entre la unión porcentual específica del
840 Metodologías
trazador (B%) y la concentración de este últi­
mo. Ese análisis teórico puede simplificarse si
lo asimilamos al del RIA, en particular comen­
zando de las curvas dosis-respuesta en térmi­
nos de B/F en función de concentración de an­
tígeno. Recordemos que la ecuación que des­
cribe esa relación para anticuerpos homogé­
neos es la (26). L,uego resta hallar una forma de
conversión entre B/F y el B%, la cual se obtie­
ne de las siguientes relaciones: B% -f- F% = 100
y B%/F% = B/F. Combinándolas y despejando
B% se obtiene la siguiente expresión:
100
B% = - ¡ ------ (44)
— + 1
la cual es semejante a la (20), donde el antíge­
no se expresa en %.
A partir de la ecuación (44) podemos obte­
ner curvas de desplazamiento donde B/F es
reemplazado por el B% y su expresión gráfica
es como de la figura 39-3 C. Otra forma de ob­
tener estas curvas, más directa y aplicable aun
a sistemas heterogéneos de anticuerpos, parte
de la ecuación (29) resuelta para B como se ex­
plicó en ese punto y luego convirtiendo su va­
lor en B%.
Si volvemos a la búsqueda de la relación en­
tre el B% y la concentración del trazador, vemos
que ésta se halla comprendida en la relación ge­
neral entre el B% y la concentración de antígeno
(esté o no marcado). Por lo tanto podemos
reemplazar antígeno frío de las abscisas por an­
tígeno marcado e incluso invertir el sentido de
la escala para expresar con mayor conveniencia
la evolución de la AE para una actividad cons­
tante del trazador cargado en los tests.
En la figura 39-10 se muestran las curvas del
B% en función de la AE del trazador para dos
sueros con diferente nivel de anticuerpos espe­
cíficos. Se observa que, cuando la AE aumenta
(y por lo tanto desciende la concentración de
antígeno marcado para una carga de actividad
AE (iiCi/,ug)
constante), el B% evoluciona sigmoidalmente.
Por lo dicho anteriormente, se espera que este
tipo de representación sea la imagen invertida
de la curva de desplazamiento y que se alcance
un valor plateau cuando el antígeno marcado
tienda a concentración cero (o su equivalente:
cuando la AE alcance cierto valor óptimo).
El valor límite de la unión porcentual del tra­
zador (B%máx.) puede obtenerse de la ecuación
(44) donde B/F se sustituye por su equivalente
para antígeno infinitesimal, Kq (ecuación 25):
100
B% máx i (45)
-L + 1
B
Se observa que, en efecto, para una AE sufi­
cientemente alta (en general la que resulta de la
incorporación de un átomo de por molécula
de antígeno), el B%máx. no resulta función de
la concentración del antígeno y sólo depende
de la concentración y afinidad del anticuerpo.
Para sistemas polielonales Kq se reemplaza en
la misma ecuación (45) por 2 Kiqi.
A diferencia de otras situaciones, donde el
analito se detecta con máxima eficiencia utili­
zando un exceso del reactivo (como en el RIA,
donde se satura a los anticuerpos con antígeno
para determinar su concentración absoluta), en
el RBA se requiere un infinitésimo del reactivo
(el trazador) para lograr la máxima señal por­
centual relativa. Este concepto tiene otra deri­
vación: los cálculos de capacidad de unión
(BC) no son factibles a partir del RBA (todo
intento de cálculo de unión a partir del B%
arrojará datos seudoabsolutos y de magnitud
muy inferior a la real).
Otra aplicación de la ecuación (45) es que a
parür de ella se puede deducir cuál es el efecto
de cambiar la concentración del suero en el test
(o sea la concentración de anticuerpos específi­
cos). Para el sistema más sencillo de un anti­
cuerpo monoclonal, se deduce que la relación
no es hneal. Esto es, si por ejemplo duphcamos
la concentración de anticuerpo en el RBA
F ig . 39-10. Efecto en el R B A de
la A E d el tra z a d o r (a d ic io n a d o
c o n u n a a c tiv id a d c o n s ta n te de
10.000 cpm ) sobre la señal B % ,
re p re s e n ta d a p a ra dos su ero s de
alto nivel (suero I) y de bajo nivel
(suero 2) de anticuerpos antiinsu-
lina.

(q pasaría a ser 2q), la unión porcentual del tra­
zador puede no resultar duplicada (B% resulta­
ría distinto de 2B%). En realidad se puede veri­
ficar que si el B% inicial es cercano a cero, el
incremento de q, n veces, repercute en la unión
de tal modo que se alcanza el valor nB%. En
cambio, si el B% inicial es cercano a 100% el
incremento de q es nulo, lo cual resulta lógico
por la saturación alcanzada por la señal del B%
desde el inicio. Entre esos dos extremos se dan
todas las situaciones intermedias.
Una consecuencia práctica de este estudio
teórico es qüe en el monitoreo de anticuerpos
en muy bajo nivel, como en ciertos períodos de
las enfermedades autoinmunes en que se ras­
trean autoanticuerpos hacia antígenos bien ca­
racterizados, deben utilizarse protocolos de
RBA con la mínima dilución posible del suero.
Además, deben efectuarse incubaciones a baja
temperatura, para favorecer la mejor expresión
de la afinidad (el mayor valor posible de K) y
durante el tiempo necesario para permitir que
se alcance un estado cercano al equilibrio (va­
rios días, según los casos, para que el B% sea
el máximo posible). Sin embargo, el incremen­
to, de la concentración relativa del suero en el
ensayo debe balancearse en la práctica con el
aumento progresivo de la unión inespecífica.
Este inconveniente puede sortearse de todos
modos con la inclusión de ensayos de control,
confeccionados con sueros normales.
A pesar de tratarse de un ensayo de equili­
brio en fase líquida, donde por ende no inter­
vienen efectos de amplificación de la avidez
como veremos más adelante, el RBA ha sido
indicado como el método de elección para mo­
nitorear ciertos autoanticuerpos. El enzimoin-
munoanálisis, que exhibe ventajas en otros sis­
temas de detección, ha demostrado menor pre­
cisión y sensibilidad en estos casos. Al menos
cuando los anticuerpos son de afinidad mode­
radamente alta (en respuestas maduras contra
antígenos macromoleculares), el RBA resulta
más apropiado que los métodos enzimáticos al­
ternativos.
Utilización del ensayo de titulación
Otra forma de medir por radiometría los anti­
cuerpos específicos es la denominada “titula­
ción”. En realidad, no la consideraremos como
una verdadera variante metodológica puesto que
su principio es idéntico al de la etapa de calibra­
ción del RIA (una serie de diluciones del suero
incubadas con la traza constante) o al del “RBA
con varias diluciones”. El título se define luego
como aquella dilución del suero que alcanza una
unión convencional (generalmente B% = 50;
véase la fig. 39-1) o, menos frecuentemente, una
unión específica mínima arbitraria.
Inmunoanálisis radiométricos 841
A partir de todo lo discutido precedentemen­
te debemos enfatizar que el título de un suero
es una función combinada de las concentracio­
nes y afinidades de todos sus anticuerpos espe­
cíficos. Si no se dispone de esos parámetros,
determinables independientemente, no se pue­
de inferir solamente a partir del título si un sue­
ro dado es apropiado o no para determinados
usos (por ej., para aplicarlo en un RIA de alta
sensibilidad). Tampoco es un parámetro total­
mente válido para la comparación de dos sue­
ros con una misma especificidad.
RIAs en sistemas bifásicos
(RIAs en fase sólida)
Una de las razones por las que han sido con­
cebidos los “RIAs en fase sólida” (RIA-ES) fue
la de facilitar la separación de las fracciones li­
bre y unida. El modelo más sencillo consta de
una matriz sólida (dextranos, celulosa, vidrio,
papel, plásticos) a la cual se han adsorbido o
unido químicamente los anticuerpos específi­
cos. Esta superficie activada se dispone en ge­
neral en forma de pequeñas esferas, discos o
simplemente es la cara interna del propio tubo
de reacción. En la figura 39-1 lA se muestra un
esquema de la disposición de los componentes
del sistema y de las operaciones sucesivas en un
RIA-ES realizado en tubos plásticos. La separa­
ción de la marca unida a los anticuerpos de
aquella que se halla libre en la solución se reali­
za, sin adiciones ni centrifugaciones, por medio
de simple decantación o aspiración de la mezcla
de reacción. Luego se cuenta la actividad unida
a los tubos secos. Las ventajas de esta metodo­
logía son: la simplicidad, la rapidez, la omisión
de etapas separativas sometidas al riesgo de
error, el ahorro de reactivos y la susceptibilidad
de automatización. Las desventajas de estos
métodos son el comparativamente alto consumo
de antisuero y la variación en las propiedades
adsortivas de una misma sustancia entre las dis­
tintas partidas (aunque provengan de un mismo
proveedor). Muchas veces, este último inconve­
niente se ha sorteado modificando la etapa de
unión del anticuerpo al soporte mediante la
aplicación de films de otros polímeros o a tra­
vés de la unión covalente de las inmunoglobuli­
nas a los plásticos con reactivos como el gluta­
raldehído o las carbodiimidas hidrosolubles.
Los RIAs-ES se han optimizado ajustando
empíricamente no sólo las condiciones de fija­
ción de los anticuerpos sino las de aquellas
otras etapas críticas que constituyen el diseño
básico: los lavados de exceso de antisuero, la
cobertura de las superficies activadas con otras
proteínas inertes, la reacción inmunoquímica
propiamente dicha y los lavados finales antes
de contar.
842 Metodologías
Los aspectos teóricos relacionados con estos
sistemas bifásicos de interacción han contem­
plado ciertos efectos de incremento en la afini­
dad aparente. Sobre todo en aquellos modelos
donde se ha fijado el antígeno a la matriz sóli­
da, aparecen fenómenos de unión por puntos
múltiples con anticuerpos que normalmente
también son,bivalentes o multivalentes. Esas
interacciones definidas como “monogámicas”
conducen a uniones de carácter casi irreversi­
ble. Otro fenómeno que se suma al anterior está
relacionado con la alta concentración efectiva
local de sitios dispuestos en la superficie, com­
parado con el mismo número de sitios dispues­
tos en solución. Esta situación es observable
aun con antígenos monovalentes frente a frag­
mentos Fab, también univalentes. Las conse­
cuencias de no respetar el principio básico por
el que los reactivos del sistema deberían estar
libremente distribuidos en solución, son las
previsibles según otros modelos teóricos que
no analizaremos aquí. Sólo debemos considerar
que en estos casos los fenómenos de retención
ejercidos por la alta concentración local de si­
tios de unión pueden conducir a erróneas inter­
pretaciones sobre los parámetros de interacción
que intentan medirse.
Variante del RIA-FS
Una serie de variantes radioinmunoanalíticas
en fase sólida han sido desarrolladas con dife­
rentes propósitos en el curso de las últimas dos
décadas. Ello ha causado cierta confusión en la
nomenclatura e incluso ha complicado el pano­
rama, pues esas variantes siguen pautas teóri­
cas, prácticas y de optimización que difieren
respecto de las correspondientes al RIA clási­
co.
Dentro de esas variantes hay un grupo de
métodos que han sido designados genéricamen­
te como “inmunorradiométricos” y cuyo proto­
tipo es el “ensayo inmunorradiométrico de dos
sitios,” o simplemente IRMA (de Immunora-
diometric assay). El objetivo de este procedi­
miento es el uso de anticuerpos específicos so­
bre una fase sólida para extraer el antígeno de
fluidos de donde se los purifica y concentra.
Mientras el antígeno permanece unido, un se­
gundo anticuerpo marcado se une a otro sitio
sobre el antígeno. Así pueden efectuarse deter­
minaciones del antígeno en función de la canti­
dad de anticuerpo marcado que se ha unido. Si
los dos anticuerpos son diferentes, se aumenta
considerablemente la especificidad del sistema.
Otros procedimientos se basan en acoples suce­
sivos de este tipo y han sido designados con­
juntamente “técnicas en sandwich”. Según la
variante empleada, si se fija primero el antíge­
no o el anticuerpo, o si se intenta detectar uno u
otro, cambian los nombres. Por ejemplo, si tan­
to los antígenos como los anticuerpos se detec­
tan a través de un anticuerpo antiinmunoglobu-
lina marcado, se los denomina “métodos indi­
rectos”.
Estos son los principios que se usan para la
detección de inmunoglobulina E y de alérgenos
en el diagnóstico de alergias atópicas. Los tests
denominados “PRIST” y “RAST”, respectiva­
mente, se esquematizan en la figura 39-115 y
39-1IC. En estos casos los ensayos se optimi­
zan empíricamente y las dosis se expresan co­
mo unidades relativas de IgE respecto de están­
dares internacionales de referencia.
Además de los RIAs-FS basados en el prin­
cipio de los “dos sitios” del antígeno, existen
otros modelos de concepción semejante (anti­
cuerpo adsorbido a una matriz: antígeno: anti­
cuerpo) pero que funcionan de manera distinta.
Eso ocurre cuando se dan las siguientes restric­
ciones: 1) con antígenos macromoleculares y
antisueros heterogéneos, cuando tanto los anti­
cuerpos en la fase sólida como los de la fase lí­
quida reaccionan contra una misma área anti­
génica, o sea contra un mismo epitope o contra
dos epitopes muy vecinos y excluyentes para
interaccionar simultáneamente con dos anti­
cuerpos. Esta situación no es frecuente. 2)
Cuando el antígeno es de pequeñas dimensio­
nes respecto de las áreas paratopes, de modo
que la situación anterior es la única opción. 3)
Cuando en forma independiente del antígeno,
intervienen dos anticuerpos homogéneos selec­
cionados (un mismo anticuerpo monoclonal o
dos de tipo excluyen te).
En todos esos casos, si la molécula marcada
es el antígeno, la unión de aquélla a la fase só­
lida por medio del anticuerpo adsorbido puede
disminuirse competitivamente por la presencia
del anticuerpo en la fase líquida. Este recurso
puede explotarse para la determinación de los
anticuerpos en la solución, ya que su potencia
inhibitoria (determinada conjuntamente por
concentraciones y afinidades) puede estimarse
en relación inversa a la marca que subsiste en
los tubos luego de la aspiración de sus conteni­
dos.
REQUERIMIENTOS
Los requerimientos básicos del RIA en su
versión clásica son el anticuerpo específico, el
antígeno marcado, el antígeno frío patrón y los
componentes de la etapa separativa. Muchas de
las especificaciones que deben cumplir estos
elementos para lograr un RIA optimizado sur­
gieron durante la discusión teórica precedente.
Nos limitaremos entonces a describir somera­
mente las fuentes, las formas alternativas de los
 Inmunoanálisis radiométrícos 843

F ig . 39-1 1. A , esq u em a del

procedim iento RIA -FS en tu ­
bos plásticos desechables. B,
p rin cip io del m étodo P R IS T
(d el in g lé s : p a p e r d is k ra-
d lo Iw m u ñ o so rh e n t test) p ara
la determ inación de IgE total.
C , p r in c ip io d e l m é to d o
PR A S T o R A ST {paper disk
radioallergosorhent test) para
la determ inación de IgE espe­
cíficas. Aspiración,
trazador (®) lavado
Calibración de la adsorción Antígeno (o)
(Patrón
desconoc.)

IgE

Disco de Suero Incubación Adición de Incubación

papeleen 1 /2 -1 /1 0 lavado '^'^l-Anti-lgE lavado,
Anti-lgE conteo
unida

IgE

E s p e ^ ^ a j-^
O
E I3
Disco Inespecífica Adición de
de papel '25|-Anti-lgE
con alergeno Suero
unido

componentes y a recapitular sus propiedades Los regímenes de inmunización varían bas­

descollantes.
Los anticuerpos específicos
En el sentido más amplio, la sustancia ligan­
te específica puede pertenecer a un sistema no
inmune. Por ejemplo, puede tratarse de un re­
ceptor celular, de un transportador plasmático
de hormonas, de una enzima, etc. En ese caso,
en lugar de antígeno el ligando puede cambiar
de nombre (p, ej,, sustrato) y el ensayo también
(radioensayo competitivo). Limitándonos al
ejemplo típico del RIA, las macromoléculas li­
gantes son las inmunoglobulinas específicas in­
ducidas por uno o más antígenos en animales
de experimentación. Los programas de inmuni­
zación se aplican a diferentes especies anima­
les, a veces seleccionadas por las diferencias
estructurales conocidas del antígeno respecto
de los componentes propios, si ése es el caso.
El inmunógeno puede administrarse emulsio­
nado con adyuvante de Freund directamente, o
previa conjugación a un soporte que incremen­
ta sus propiedades estimulantes.
tante según las distintas recomendaciones, pe­
ro en general emplean la inyección subcutánea
de las emulsiones en multisitios de patas y lo­
mo de los animales. En lo posible se usan lotes
con un buen número de animales. Los interva­
los de inyección suelen ser de 2 a 3 semanas.
El adyuvante de Freund completo suele em ­
plearse sólo en la primera inyección, luego se
usa el incompleto.
Las dosis de inmunógenos suelen ser sufi­
cientemente bajas. Por ejemplo, para hormo­
nas proteicas alrededor de 10-100 |.ig por vez y
por animal. Eso está motivado por la necesi­
dad de inducir selectivamente los clones de
linfocitos productores de anticuerpos específi­
cos de alta afinidad. Cantidades superiores a
1 mg pueden inducir, además de posibles fenó­
menos de tolerancia o parálisis inmune según
los casos, una inducción de anticuerpos de ba­
ja afinidad.
Luego de períodos de no inoculación (3-6
meses) suelen hacerse reinmunizaciones con
efectos notables en los títulos de anticuerpos.
Mediante sangrías exploratorias y ensayos con
844 Metodologías
trazadores radiactivos pueden controlarse los
títulos periódicamente. El criterio final de se­
lección de los sueros será, según se discutió
ampliamente, el de un ensayo para la afinidad.
Éste puede ser poco elaborado, observándose
empíricamente la dosis mínima detectada, rela­
cionada con la pendiente inicial de la curva de
desplazamiento. Con estos ensayos puede indi­
carse el descarte de los animales (sueros con
baja afinidad) o la prosecución de las inmuni­
zaciones (sueros con apropiada afinidad pero
bajos títulos). Muchos sueros suelen usarse en
diluciones finales de 10'^-10'’, por lo cual pue­
den conservarse sin diluir congelados, o en di­
luciones de reserva (-1/1.000) efectuadas con
sueros no reactivos al 1-2% y con conservado­
res (timerosal 1/5.000). De este modo se pre­
servan los anticuerpos diluidos de la adsorción
a los tubos de plástico o vidrio.
También pueden usarse anticuerpos purifi­
cados parcialmente por precipitación de las in­
munoglobulinas o específicamente por croma­
tografía de afinidad. Sin embargo, algunas
ventajas respecto de la homogeneidad de los
anticuerpos, contabilizando sólo la especifici­
dad, se dan en los anticuerpos monoclonales
surgidos de la tecnología de los hibrídomas.
Por otro lado, si se considera la afinidad apa­
rente, relacionada a la sensibilidad de los
RÍAs, los sistemas que combinan dos anticuer­
pos monoclonales apropiados o sueros policlo­
nales, pueden presentar sensibles ventajas, se­
gún se mencionó.
Los antígenos marcados
Como se ha analizado exhaustivamente, el
trazador como componente crítico del RIA
consiste en una cantidad minúscula del antíge­
no radiactivamente marcado. Se recomienda la
adición de aproximadamente 10.000 cuentas
por minuto (error estadístico de conteo del
1%). El porcentaje de error de conteo se obtie­
ne de la relación: error% = 100/Vcuentas. Así,
para los puntos de la curva donde las cuentas
han descendido a 1.000 cpm, el error es del
3,2%. Si se comparan esas magnitudes con los
errores de pipeteo, separación, etc., se observa
que los errores estadísticos debidos al conteo
son de mínima influencia. De este modo se per­
mite la detección del antígeno marcado en el
nivel de los picogramos en la etapa final del
ensayo. En los trazadores marcados para los fi­
nes del RIA se ha incorporado un nucleido que
espontáneamente emite partículas o radiación
electromagnética, cambiando la composición
de su núcleo (radionucleido). Son muy pocos
los elementos radiactivos naturales (’^'C, ‘‘“K,
^^'’Ra), de modo que los radionucleidos de inte­
rés son preparados artificialmente por irradia­
ción. De todos ellos, los más útiles para el RIA
son los isótopos del iodo, *^^I y ‘^*1, aunque en
particular el primero presenta especiales venta­
jas, según comentaremos.
Otros isótopos ocasionalmente usados son
los siguientes: ^'“’Se, “’^Co (vitamina B^^) y '^‘T e.
Para RIAs de algunos esteroides se ha emplea­
do Tritio (^H), el cual no provoca los cambios
estructurales que ocasiona la marcación con
'251. El Tritio (t|/2 , 12,25 años) y el '^C (1,^^
5.736 años) son emisores ¡3 (electrones); con
ellos se alcanzan menores actividades específi­
cas y deben ser contados en un contador de
centelleo líquido, lo cual representa alguna des­
ventaja respecto de los isótopos que se cuentan
en contadores gamma. Precisamente, el es
el isótopo de elección en muchos casos por
presentar alta actividad específica en conjun­
ción con su carácter de emisor de rayos gamma
de baja energía. Además, otra ventaja radica en
la relativa simplicidad con la que se incorpora
a residuos de tirosina e histidina en péptidos y
proteínas. El '^'I que goza de las mismas pro­
piedades químicas fue el isótopo de elección en
los primeros años del RIA. Teóricamente, el
‘^'I otorgaría una mayor actividad específica a
las moléculas a las que se incorpora respecto
del según se deduce de los valores de t,^
(8,07 días y 60,14 días, respectivamente) apli­
cados en la ecuación (24). Pero ocurre que el
'^’I suele proveerse con una pureza del 15-30%
(el resto es '^’I) en comparación con la del
que es cercana al 100%. Además, en los conta­
dores gamma comunes la eficiencia para el '^*1
es menos de la mitad respecto de la del (70-
75%). Todo ello hace que para la misma con­
centración molar de ambos isótopos las cuentas
leídas sean aproximadamente del mismo orden.
Además, el '^'I junto a la emisión gamma pro­
duce una fuerte emisión beta que causa más rá­
pidamente un daño por radiación a los materia­
les biológicos.
Por todas esas razones, el resulta el isóto­
po más conveniente. A pesar de ello, deben
considerarse ciertos fenómenos inherentes a la
marcación con ese isótopo y, en cierta medida,
los vinculados al grado de incorporación a las
moléculas de antígeno. Éstos son: 1) la dismi­
nución de la inmunorreactividad debida a la
“catástrofe por decaimiento”. La energía libera­
da es suficiente como para efectuar escisiones
moleculares; 2) el daño ocasionado al antígeno
durante la marcación y purificación (daño de
preparación) y 3) el daño producido durante la
reacción inmunoquímica en medios con proteí­
nas plasmáticas (daño de incubación). Este últi­
mo es causado por enzimas proteolíticas sobre
los trazadores susceptibles.
El principio de marcación con (“ioda-
ción”) se basa en la oxidación de por me­

dio de oxidantes apropiados.* Probablemente
se genera iodo atómico con la siguiente trans­
formación a iones iodonio ('^^1''). El agente oxi­
dante más conocido es la Cloramina-T, intro­
ducida por Hunter y Greenwood en 1962, la
cual genera ácido hipocloroso. Por su inestabi­
lidad sus soluciones deben prepararse a último
momento. Junto con la sustitución electrofílica
del iodo en los anillos de tirosina, o a veces de
histidina, se puede producir la oxidación de re­
siduos de cisteína y de metionina por parte de
ese enérgico oxidante. El empleo de protocolos
de “Cloramina-T limitante” permite disminuir
las oxidaciones indeseadas. Los cambios con-
formacionales que pueden generarse en el antí­
geno son entonces debidos al iodo y a las posi­
bles reacciones paralelas, si éstas no son mini­
mizadas. Suele emplearse un agente reductor
para detener la reacción. El más comúnmente
usado es el metabisulfito de sodio.
El iodo se incorpora a pH óptimo (7-7,8) en
las tirosinas (posición 2 o 2 y 6) y a pH 8,4-9
en las histidinas. Cuando el residuo modificado
es en particular el de un hapteno, el incremento
del tamaño molecular puede ser considerable,
ya que el iodo posee un volumen semejante al
del anillo bencénico. Un diiododerivado triph-
cará entonces el volumen del grupo original.
Además, el oxhidrilo fenólico es más disocia-
ble por el efecto de disminución de su pKa. Es­
tos efectos pueden resultar críticos para las mo­
léculas pequeñas como la de los esteroides. El
resultado final observable podría ser un cambio
apreciable en la afinidad de los anticuerpos ha­
cia el trazador respecto del antígeno inmodifi-
cado.
A pesar de los inconvenientes mencionados,
la cloramina-T es el oxidante más usado por su
simplicidad. Otros métodos oxidativos emplean
lactoperoxidasa con adición directa de HjOj o
con producción enzimática (glucosa oxidada/
P-D glucosa), u oxidantes como el iodogen,
etc. Para péptidos o antígenos no peptídicos
que no poseen residuos tirosilo o histidilo se ha
empleado el reactivo de Bolton y Hunter. Este
* H ay que tener en cuenta que para la utilización de isó to ­
pos radiactivos deben seguirse las norm as oficiales que re­
gulan su em pleo. En especial para la preparación de com ­
puestos radioiodados se requieren adecuadas instalaciones,
equipam iento y la participación de personal habilitado. Ei
principal problem a del constituye la volatilidad de su
form a elem ental, sobre todo en las soluciones ácidas. La
glándula tiroides resulta la principal captadora luego de su
inspiración accidental. Se deben tom ar especiales precau­
ciones en la etapa de extracción del Na'^^l (en m edio alca­
lino) y d urante la oxidación. Luego no existen m ayores
riesgos en la m anipulación de las cantidades habituales en
el RIA . El em pleo de los “kits” com erciales im plica el uso
de actividades bajas en todo m om ento, las cuales pueden
m aniobrarse con razonable seguridad.
Inmunoanálisis radiométricos 845
reactivo se marca previamente con ‘“ I y luego
luego se conjuga a los antígenos a través de
grupos amino de este último.
Luego de la marcación es casi siempre nece­
sario purificar los antígenos marcados de los
productos de reacción y de las moléculas daña­
das, Los métodos más empleados son los de fil­
tración en Sephadex, los basados en adsorción
(columnas de celulosa) y los electroforéticos.
Ultimamente se han desarrollado métodos muy
refinados basados en electroforesis en geles
discontinuos o multifásicos de poliacrilamida,
en intercambio iónico y en cromatografía líqui­
da de alta resolución (HPLC de fase reversa).
Con ellos se logra para ciertos antígenos protei­
cos la preparación de monoiododerivados ho­
mogéneos (un solo residuo tirosilo modificado
e identificable). Los ejemplos más sobresalien­
tes son los de trazadores homogéneos de la in­
sulina: mono ’^^l-insulina modificada en su re­
siduo tirosilo número 14 o número 19 de la ca­
dena polipeptídica A (designados “A14” y
“A19”, respectivamente) o número 26 de la ca­
dena B (“B26”).
Estos trazadores poseen varias ventajas, entre
las cuales se destacan: 1) propiedades inmuno-
químicas inalteradas o al menos uniformes; 2)
gran estabilidad (más de 6 meses de vida útil);
y 3) declinación conocida de la actividad espe­
cífica a través del tiempo. Este tipo de trazador
se prepara incorporando iiiicialmente relaciones
bajas de por molécula de antígeno (-0,1
átomo/molécula), que se logra mediante el ex­
ceso relativo del antígeno respecto del
Luego, la etapa de purificación elimina no sólo
los componentes inútiles de la reacción, sino
que separa las moléculas no marcadas y las for­
mas iodadas entre sí. Entre estas últimas están
las monoiodadas en distintas posiciones (que
presentan diferencias sutiles en su conducta ió­
nica) y cantidades bajas de diiodo y poliiodo
derivados. Los monoiodo derivados poseen teó­
ricamente la alta actividad específica inicial que
prevé la ecuación (24). Obsérvese que la activi­
dad específica inicial de la mezcla de reacción
era 10 veces menor (método subestequiométri-
co). Si esos productos se purifican sólo por fil­
tración en geles, resultan heterogéneos y su ac­
tividad específica calculada es la del promedio
(además representa un valor relativo bajo). Co­
mo ya se analizó, eso puede tener consecuen­
cias negativas en la sensibilidad de los ensayos.
En cambio, serán trazadores estables, pues la
baja incidencia de diiodo derivados generará
pocas moléculas dañadas y radiactivas. Éstas
son causadas por la desintegración de uno de
los átomos y la persistencia muy probable de la
marca debida al otro átomo.
Si se intenta elevar desde el inicio la activi­
dad específica por la incorporación de un áto­
846 Metodologías
mo de '“ I por molécula (método estequio métri­
co) se obtendrá ese valor en promedio con una
distribución estadísdca de moléculas hiperioda-
das y otras menos iodadas y frías. Estos traza­
dores son útiles desde el punto de vista de la
sensibilidad en los RIAs, pero resultan inesta­
bles y muestran elevado daño a los pocos días
de guardados, aun a ~~20'’C y diluidos. Los mo-
noiodo derivados exhiben ambas propiedades a
la vez: alta .actividad específica y alta estabih-
dad, dos características que se contraponen en
los trazadores convencionales o clásicos.
De todo lo mencionado surge que es necesa­
rio efectuar controles de cahdad sobre los tra­
zadores. Los más comunes son: 1) el test de
unión a anticuerpos en diluciones conocidas de
estos últimos (establecidas mediante calibra­
ciones con trazadores anteriores); 2) el test de
daño por radiólisis por métodos electroforéti-
cos o cromatográficos, y 3) la determinación de
la actividad específica por técnicas de autodes-
plazamiento. Estas a veces incluyen el control
de corrección por la máxima inrnunorreactivi-
dad real, puesto que parte de la marca puede
estar incorporada a moléculas no antigénicas.
Puede obtenerse una medida de la eficiencia
de la marcación y una estimación aproximada
de la actividad específica por métodos directos
y sencillos cuando se purifica la mezcla de
marcación mediante columnas de Sephadex.
En esos casos se integran los valores de activi­
dad en el pico correspondiente a la proteína (x)
y se hace lo propio con el pico correspondiente
a la fracción de ioduro no incorporada (y). El
cálculo de eficiencia se hace a partir de la rela­
ción x/(x + y) y el de la actividad específica
promedio se obtiene de la relación x/masa de
proteína marcada. En ese caso, x se expresa
usualmente en jO,Ci y ia masa en |ag.
Los patrones de antígeno frío
Se recuerda que para validar los procedi­
mientos radioinmunoanalíticos los antígenos de
los estándares deben ser inmunoquímicamente
idénticos a los de las muestras desconocidas.
En cambio, no se requiere su identidad química
o en términos de potencia biológica. Para los
fines comparativos es necesario que los distin­
tos laboratorios posean preparaciones de refe­
rencia comunes y accesibles al uso general.
Cuando esos casos no se dan, debe contarse al
menos con muestras de concentración conocida
para evaluar las soluciones desconocidas.
La estabilidad y las especificaciones para la
conservación de cada tipo de sustancia patrón
deben seguirse según las recomendaciones que
se difunden. En cambio, es un requisito genera­
lizado el empleo de proteínas inertes o deter­
gentes no iónicos para prevenir la adsorción de
los antígenos patrones. En efecto, debido a las
altas diluciones de las soluciones patrones en
stock (20 ng/ml-1 |J,g/ml), y diluidas aun más
durante los ensayos, se produciría su firme ad­
sorción a los recipientes y tubos de vidrio o
plástico.
Técnicas separativas
En muy raras ocasiones la separación de los
antígenos libre y unido se logra directamente
por precipitación espontánea de los inmuno-
complejos durante una simple centrifugación.
Esto ha sido mencionado por ejemplo para el
antígeno australiano debido a sus dimensiones
y concentración en los ensayos. En el caso de
antígenos más pequeños o diluidos, como
acontece para las hormonas plasmáticas, los
complejos inmunes permanecen en solución.
Por ende, se han desarrollado una serie de téc­
nicas separativas basadas en distintos princi­
pios y ejecutados según diferentes variantes.
En el cuadro 39-2 se compendian las técnicas
aplicadas comúnmente. Las más frecuentes son
las técnicas de carbón (Norit A), las de polieti­
lenglicol, las de fijación de anticuerpos a fase
sólida y las de doííle anticuerpo (precipitación
de los complejos inmunes por un antianticuer­
po). Las ventajas y hmitaciones de cada una de
ellas no son tan definidas como para favorecer
a una en particular.
Respecto de esta etapa final de los RIAs
puede comentarse que es factible contar una o
ambas fases. En general, se recomienda contar
sólo una de ellas por razones de practicidad y
sin hacer concesiones apreciables a la precisión
de las medidas. Puede aconsejarse contar, por
ejemplo, la fracción unida cuando ésta repre­
senta menos del 50% de la actividad total. Para
los trazadores con emisión beta se prefiere con­
tar los sobrenadantes (marca unida o libre, in­
distintamente), pues los precipitados son difir
cultosos de suspender o disolver en los fluidos
de centelleo.
OTRAS TECNICAS RADIOMETRICAS
Marcación nietabólica de proteínas
e inmunoprecipitación
La marcación metabólica de proteínas segui­
da de la inmunoprecipitación específica es un
método de considerable utilidad en varios cam­
pos de la biología experimental, por lo cual ha­
remos una somera descripción de esa estrategia.
La marcación metabólica comprende la sus­
titución de átomos naturales, frecuentemente
de las proteínas, por isótopos radiactivos que se
incorporan durante la biosíntesis natural. El
 Inmunoanálisis radiométricos 847

Cuadro 39-2. Técnicas empleadas en radioinmunoensayo para la separación del antígeno en sus
formas líbre y unida a anticuerpos

A ntígeno

P rincipio Variante Libre Unido

P recipitación de com ­ D oble anticuerpo

plejos antígeno-anti­ Polietilenglicol
cuerpo
-alco h o l
S olventes orogénicos | Sobrenadantes Precipitados
-d io x a n o

Precipitación salina

A dsorción de antígeno Carbón - S in tratam iento

libre a m ateriales só­ -R ec u b ierto con dextrano, albú­
lidos m in a ficoll, etc.

C elulosa -P o lv o -C rom atoelectro -

< foresis Precipitados S obrenadantes
-P a p e l -T iras de adsor­
ción

- -C o lu m n a

í -T a lc o
S ilicatos
l -Á c id o silícico y silicatos

-A n ió n ic as
R esinas intercam biadoras
-C atió n ic as

A dsorción o unión co­ T ubos í -P o lie stiren o

valente de anticuer­ -P o lip ro p ilen o
pos a polím eros [ -P o iie tilen o

P lacas (policubetas) -P lá stic o s varios

Partículas í -T e fló n Fase líquida Fase sólida

j -S ep h ad ex
t -B en to n ita

D iscos J -T e fló n
1 -P o lip ro p ilen o

A ntisuero polim erizado

Separaciones varias T am ices m oleculares

Eleetroforesis en papel

precursor más común para estas marcaciones
es el aminoácido metionina, al cual se le coloca
radiactivo, en lugar del isótopo normal. El
^-“’S es un emisor (3 con un período de semide-
sintegración de 87,5 días.
El cultivo de células eucariontes o proca-
riontes (modificadas genéticamente, para la ex­
presión de una proteína seleccionada) en un
medio libre de metionina al cual se le agrega el
aminoácido radiactivo conduce a la marcación
de las proteínas. Ajustando las variables de es­
tas incubaciones (AE del aminoácido, concen­
tración, tiempo de incubación), se regula la ac­
tividad de los productos finales marcados.
Luego de una etapa preparativa, que incluye
la lisis celular y la separación de las proteínas
solubles, los productos marcados se ensayan
frente a los anticuerpos específicos directamen­
te o luego de una purificación. Este último paso
es el que se conoce en general como inmuno-
precipitación. Las formas de separación de los
inmunocomplejos formados comprenden una
vai'iedad de procedimientos. Los principios ge­
nerales incluyen variantes en fase fluida (seme­
jantes al RBA), y detecciones efectuadas en fa­
se sólida tras procedimientos electroforéticos y
autoradiográficos. En este último caso además
se pueden obtener datos estructurales del antí­
geno, como su peso molecular.
Mediante estos procedimientos de marcación
radiactiva e inmunoprecipitación se han estu­
diado, de manera relativamente sencilla, tanto
antígenos como anticuerpos provenientes de
mezclas complejas.
848 Metodologías
APÉNDICE
Técnicas modelo para un RIA de proteínas
(insulina):
1. Marcación con ’^^I.
2. RÍA en fase líquida.
3. RIA en fase sólida.
Marcación con
Método “estequiométrico” (incorporación
de 0,2-] átomos de ‘^^1por molécula de proteí­
na) con cloramina-T limitante.
Este método conduce a la obtención de tra­
zadores de actividad específica relativamente
alta (para la insulina aproximadamente 80-380
¡xCi/jig), pero que muestran apreciable radióli-
sis luego de conservarse una o dos semanas,
aun en forma diluida y a -20°C. Por esa razón,
luego de esos períodos puede requerirse la re­
purificación mediante cromatografía en colum­
nas de Sephadex.
Procedimiento: utilizar un tubo de vidrio (ti­
po hemólisis) siliconado y agregar sucesivamen­
te las siguientes soluciones: 10 jil de buffer fos­
fato de sodio 0,5 M, pH 7,4 (BF); 2,5 ^1 de una
solución de reserva de insulina de 1 mg/ml, co­
rrespondiente a 2,5 [ig de la hormona. La solu­
ción de reserva se prepara con insulina porcina
altamente purificada, 1 mg, disuelta en 100 jxl
de HCl 0,01 N, diluida a 1 mg/ml por la adición
de 200 |al de NaOH 0,01 N y 700 |xl de BF;
1 mCi (37 MBq) de Na'^^I (normalmente disuel­
to en NaOH 0,1 N); 5 |il de cloramina-T de 30
|Lig/ml en BF preparada recientemente (menos
de 15 minutos). Se agita con suavidad la mez­
cla, evitando proyecciones, durante 1 minuto. A
modo de orientación puede efectuarse un con­
trol de incorporación de según lo indica J.
Roth (véase la bibliografía recomendada). Este
procedimiento, o el resultado de una marcación
preliminar, pueden sugerir la necesidad de ajus­
tar empíricamente las cantidades de cloramina-T
a adicionar. Finalmente, agregar a la mezcla de
reacción 0,5 mi de una solución de seroalbúmi­
na bovina (SAB) de 1 mg/ml en BF 1:17.
Aplicar la solución a una columna (aproxi­
madamente de 0,9 X 60 cm) de Sephadex G-50
equilibrada y eluida con BF 1:17/SAB. El flujo
se ajusta a 10-15 ml/h y se recogen fracciones
de 0,5 mi. Para los ensayos de RIA se utiliza el
pico que eluye generalmente en una zona inter­
media entre el pico de los agregados (volumen
de exclusión, Vo) y el pico de no incorpo­
rado (volumen de inclusión total, Vo -t- Vi).
* El procedim iento debe ser realizado por personal autori­
zado y bajo las norm as e infraestructura recom endadas p a ­
ra el m anipuleo de en el orden de los m ilicuries.
Método subestequiométrico (<0,2 átomos
de ^^-7p o r molécula de proteína)
Este método intenta obtener mayor propor­
ción relativa de mono-’^’I-derivados a expensas
de una reducción de la actividad específica pro­
medio alcanzable (para la insulina, aproxima­
damente 10-50 ¡xCi/)ig), lo que conduce a una
preparación de trazador de buena estabilidad a
la radiólisis y por ende puede usarse por perío­
dos prolongados (1-2 meses). En caso de ser
preciso puede incrementarse la actividad espe­
cífica (hasta aproximadamente 380 |aCi/|Xg, co­
rrespondiente a 1 átomo de '^^I por molécula de
insulina) mediante un procedimiento especial
de purificación al final de la marcación que eli­
mina la insulina fría. Véase por ejemplo la re­
ferencia de S. Linde y col. en la bibliografía re­
comendada. Este tipo de trazadores monoioda-
dos y homogéneos puede utilizarse 6 meses o
más sin detectarse una radiólisis importante.
Procedimiento: en un tubo como el descrito
para el método anterior, adicionar sucesiva­
mente; 10 )xl de la solución de reserva de insu­
lina de 1 mg/ml, correspondiente a 10 |j.g de in­
sulina; 1 mCi de Na'^4 disuelto en la solución
alcalina de origen; 10 )il de cloramina-T de
0,88 mg/ml en BF. La mezcla de reacción se
agita suavemente durante 45 segundos y se adi­
cionan 5 |li1 de m etabisulfito de sodio de
4,8 mg/ml en BF.
Los pasos sucesivos del ensayo de incorpo­
ración, de adición de la SAB y de purificación
en columna de Sephadex, son los mismos seña­
lados para el procedimiento anterior. Si en
cambio se opta por la purificación de la mezcla
de marcación mediante geles multifásicos de
poliacrilamida, por intercambio iónico, o por
técnicas de HPLC, la muestra ingresa directa­
mente en esos sistemas sin la adición de SAB.
Este agente protector de la adsorción del traza­
dor a los recipientes se agrega al final.
RIA en fase líquida
Incubaciones
El siguiente procedimiento para el RIA de
insulina se basa en la técnica propuesta por
Yalow y Berson. En el cuadro 39-3 se ofrece
un protocolo del ensayo. Conviene utilizar mi-
cropipetas y dispensadores de precisión con­
trolada.
La dilución apropiada del anti suero utilizado
(B/F~l) se puede obtener de un ensayo preli­
minar en idénticas condiciones, donde se inclu­
yen tubos con d iluciones seriadas desde
1:1.000 hasta 1:512.000 (razón 1:2).
Obviamente, este ensayo sólo incluye el tra­
zador y no el patrón de insulina fría.
 Inmunoanálisis radiométricos 849

Cuadro 39-3. Protocolo modelo para un RIA de insulina en fase líquida. Los ensayos se efectúan
por duplicado o triplicado
"h-lns^
patrón Antisuero'^ '^-'Lp-lns"
Tubos D iluyente' (12,4 ng/m l) (l/x ) ( W - l f f > cp m )
N” ¡Jil m ¡il ' ¡ll

300 0 100 100

299 1 100 100
3 298 2 100 100
4 297 3 100 100
5 296 4 100 100
6 296 5 100 100
7 290 10 100 100
8 180 20 100 100
9 260 40 100 100
10 220 80 100 100
C ontrol de unión inespecífica 11 300-^ 100 100
Insulina en
análisis (suero
desconocido)
Suero desconocido 12 200 1000 100 100
C ontrol de suero desconocido 13 300 100" 100
C ontrol de cuentas totales 14 100

' D iluyente; b u ffe r barbital 0 ,0 2 M , p H 8,6, su p lem en tad o con su e ro norm al d e co b a y o 1% y s e ro alb ú m in a h u m an a 0 ,25% .
^ Patrón;- in su lin a h u m an a a ltam e n te purificada (e stá n d ar de re fe re n c ia ) dilu id a a p a rtir d e una so lu ció n sto ck de 0,1 fig /n il con d ilu y en te. L a
s erie apH cada d e b e ad o p ta rse a ca d a suero segtín su afinidad.
^ A ntisuero; d ilu ció n stock 1;] .000 en d ilu y en te y m erthiolate (l;5 ,0 0 t)), d ilu id a p a ra u s o según e n sa y o p revio h asta u n ió n de ~ 50% d e l tra ­
zador.
Trazador; in su lin a p o rc in a m arc ad a . Según el antisuero utilizado s e re co m ien d a u n a c o n c en tra ció n d e 2- iOO pg/m l,
^ C ontrol d e u n ió n in esp ec ífica: d eb e v erificarse que se ad ic io n a u n g ran ex ceso d e an tíg en o o b te n ién d o se el m áx im o d esp laz am ien to p o s i­
ble. P uede u s a rs e un p atrón m ás c o n c en tra d o en ese punto.
'' S ueros desc o n o cid o s; se e n sa y an en dilu cio n es finales de l; 10 h a s ta l;50.

Los tubos con las mezclas de reacción se in­ Empleo de carbón recubierto
cuban a 4°C durante 3-5 días. También es usual (carbón-dextrano)
la incubación a 37“C durante una noche.
El comportamiento del carbón solo o recu­
Separación de las marcas libre bierto para lograr la adsorción selectiva de pép­
y unida (carbón) tidos no es bien conocido y ha originado cier­
tos conflictos de opinión. Algunos autores in­
Los .siguientes tratamientos se aplican a to­ terpretan que la adsorción parcial, indeseada,
dos los tubos indicados en el cuadro 39-3, ex­ de complejos antígeno-anticuerpo puede ser in­
cepto para el control número 14. hibida por un tratamiento del carbón con molé­
Si se sigue un procedimiento de separación culas de tamaño adecuado. De este modo, recu­
con adsorbentes, antes de su adición se coloca briendo los poros del carbón de gran tamaño y
suficiente cantidad de suero normal a todos los no los de pequeño diámetro, se lograría una ad­
tubos de los patrones como para igualar la con­ sorción selectiva del antígeno en cuestión sin
centración presente en las muestras desconoci­ captar los inmunocomplejos. Otros autores no
das. han avalado esta argumentación por no hallar
La separación con carbón no recubierto (No- diferencias entre carbón intacto o recubierto.
rit grado A) se efectúa con 0,2 ml de una sus­ Dé todos modos es bastante frecuente efectuar
pensión de 100 mg/ml en buffer barbital 0,02 un tratamiento con dextrano del modo que si­
M, pH 8,6. La cantidad de carbón agregada a gue: se prepara una suspensión de carbón al
cada tubo corresponde a 20 mg. Conviene eje­ 5% en buffer fosfato de sodio 0,03 M, pH 7,4 y
cutar estas operaciones en baño de hielo y utili­ se mezcla con partes iguales de dextrano (PM
zando un agitador Vortex para suspender la promedio 80 KD) al 0,75% en el mismo buffer.
mezcla de cada tubo durante unos segundos. Luego se .aplica a los tubos del ensayo en las
Luego se centrifugan los tubos a 3.000 rpm, a proporciones antes indicadas para el carbón sin
4°C, durante 15-20 minutos. tratamiento.
Los sobrenadantes pueden descartarse o pa­
sarse a otra serie de tubos numerados. De este RIA en fase sólida(en tubos plásticos)
modo, puede optarse por contar sólo los preci­
pitados con la marca libre adsorbida, los sobre­ Las etapas experimentales incluyen la si­
nadantes con la marca unida, o ambos tubos. guiente sucesión: 1) calibración de la adsorción
850 Metodologías

de antisuero a los tubos de reacción; 2) prepa­ tubos (15 minutos) con 200 |al del mismo
ración de un lote grande de tubos calibrados, y PBST, suplementado con 20% de suero huma­
3) ensayos de desplazamiento con patrones y no norm al tratad o con exceso de carbón
desconocidos. (PBST, SHN-C). Luego de la aspiración del
contenido de los tubos se realiza la siguiente
Calibración de la adsorción de antisuero etapa de incubación con el trazador.
a los tubos de reacción A todos los tubos se les agrega 100 )xl de la
solución PBST, SHN-C y 100 |i,l de una solución
Se pueden utilizar tubos plásticos desecha- del trazador '^^I-p-Insulina en el diluyente PBST
bles de poliestireno, polipropileno, etc. Es con­ (aproximadamente 5.000 cpm, actividad especí­
veniente que sean pequeños (aproximadamente fica 100-380 jxCi/ixg). Se incluyen dos tubos ex­
6 X 20 mm) de fondo U o cónico. tra, no tratados, a los que se aplica sólo 100 |al
Se coloca 200 |il de antisuero anti-p-insulina del trazador como control de cuentas totales.
diluido en buffer ácido bórico-borato de sodio La serie completa de tubos se incuba durante
0,013 M, pH 8 (BB) en una serie de tubos nu­ 17 horas a 37°C en cámara húmeda hermética.
merados cubriendo las diluciones 1:1.000 a Luego, todos los tubos, excepto los controles
1:64.000 (razón 1:2). Se incluye un control de de cuentas totales, se aspiran y se lavan dos ve­
suero normal de cobayo 1:1.000 en BB. Nor­ ces con 400 |xl de agua destilada, a 4“C, Final­
malmente este protocolo se sigue por duplicado mente se cuentan durante 1 minuto.
o triplicado. Realizando un gráfico de la unión del traza­
Se incuba a 37“C durante una noche (17 ho­ dor en función de la dilución del antisuero se
ras) en una cámara húmeda hermética. Tam­ facilita el cálculo de aquella dilución que efec­
bién puede optarse por incubaciones de 2 ho­ túa aproximadamente el 50% de captación del
ras. Luego se aspira el contenido de los tubos y antígeno.
se los lava y recubre con 400 )il de una solu­
ción de buffer fosfato de sodio 0,05 M, pH 7,4, Preparación de un lote grande
NaCl 0,15 M, N3Na 0,01%, Tween 20 0,05% de tubos calibrados
(PBST). Este tratamiento para recubrir los si­
tios de adsorción remanentes del soporte puede Una vez seleccionada la dilución apropiada
mejorarse si se repite la operación anterior con del antisuero se puede activar un lote importan­
PBST y luego mediante una exposición de los te de tubos en las mismas condiciones origina­

Cuadro 39-4. Protocolo modelo para un RIA de insulina en fase sólida. Los ensayos se efectúan
por duplicado o triplicado. Las incubaciones y las operaciones siguientes se realizan igual a lo
indicado para la etapa final del ensayo de calibración

Tubos '^^¡-p-Ins
(A ctivados con D iluyente h -ln s patrón (5.000 cpm, A E =
antisuero) PBST, SH N -C en PBST, SH N -C 100-380 n Ci/fig)
N° ni (iiH '/¡0 0 fil) ni

1 100 0 100
2 0,31 100
3 0,62 100
4 1,25 100
5 - 2,50 100
6 5,0 100
7 10,0 100
8 - 20,0 100
9 40,0 100
10 80,0 100
D iluyente Insulina en análisis
PB ST (suero desconoci­
do) |Xl
S uero desconocido 11 80 20 100
C ontrol de suero desconocido 12" 80 20 100
D iluyente
P B ST, SHN -C
C ontrol de unión inespecífica 13" 100 - 100
C ontrol de cuentas totales 143 “ “ 100

‘ L a ca n tid a d de in su lin a se d a d irec tam en te en u n id ad e s in te rn a c io n a le s (1 u U = 41,67 pg).

2 T u b o s tratados con suero n o rm al d e cobayo.
^ T u b o n o tratado.

les. El número de tubos a procesar contemplará
los requerimientos analíticos del laboratorio
durante períodos suficientemente prolongados.
Esto puede hacerse así dado que la estabilidad
de los anticuerpos adsorbidos es muy buena
cuando se los conserva a -20“C en recipientes
bien tapados.
Ensayos de desplazamiento
con patrones y desconocidos
En el cuadro 39-4 se muestra un protocolo
modelo para el RIA en fase sólida de insulina.
Tal como se indicó para el RIA en fase líquida,
la serie de tubos con antígeno patrón debe ajus­
tarse según las características del antisuero em­
pleado.
La graficación de los resultados y el procesa­
miento de los datos puede efectuarse como se
mencionó durante el desarrollo de este capítulo.
B IB L IO G R A FÍA
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Metodologías básicas en biología molecular.
Técnicas de hibridizaeión y reacción
en cadena de la polimerasa (PCR)
GLORIA E. CERROME
LAURA MORELLI
TÉCNICAS BÁSICAS DE BIOLOGÍA
MOLECULAR
Se puede considerar que el nacimiento de la
Biología Molecular ocurrió en 1953 cuando
Watson y Crick publicaron el modelo de la es­
tructura en doble hélice del ADN. Desde en­
tonces se ha producido una verdadera revolu­
ción molecular debido al desarrollo de la tecno­
logía de ADN recombinante, un conjunto de
técnicas rápidas y sensibles para la manipula­
ción del ADN, ARN y proteínas que llevaron a
una explosión de actividades en todos los as­
pectos de la genética humana tanto en la inves­
tigación como en la clínica.
En el curso de estos cuarenta años se ha de­
sarrollado un arsenal metodológico, que nos
permite en la actualidad comprender los meca­
nismos implicados en la expresión normal de
los genes, la detección directa de las mutacio­
nes moleculares responsables de las enferme­
dades hereditarias y la producción de proteínas
de interés médico y bioquímico.
En principio todas las enfermedades genéti­
cas pueden ser analizadas en términos molecu­
lares y algunas de ellas ser eventualmente trata­
das y/o curadas debido a la identificación mo­
lecular precisa de los defectos en el ADN y sus
consecuencias metabólicas. Existen además
muchas enfermedades no heredadas asociadas
a cambios en el ADN de células somáticas co­
mo ocurre generalmente en los cánceres ; y se
han encontrado evidencias crecientes de que
variaciones en los rearreglos del ADN que
acompañan la diferenciación del sistema inmu­
ne tienen efecto en la susceptibilidad de los in­
dividuos a diversos tipos de tumores o infec­
ciones virales.
40
El ADN (ácido desoxirribonucleico) que se
encuentra en el núcleo de todas las células de
un organismo lleva la información para la sín­
tesis de todos los ARN (ácidos ribonucleicos),
algunos de los cuales codifican para la síntesis
de las proteínas de una célula. Recién en 1953
Watson y Crick proponen un modelo para la
estructura del ADN el cual indica que está for­
mado por dos cadenas de polinucleótidos heli­
coidales con giro a la derecha dispuestas en do­
ble hélice alrededor de un eje central en forma
de antiparalelas es decir que siguen direcciones
opuestas. Los nucleótidos tienen una composi­
ción similar; todos ellos poseen un anillo de un
azúcar biológico (desoxirribosa) un grupo fos­
fato y una base nitrogenada que en número de
cuatro (adenina, citosina, timina y guanina) es
la que otorga la variación a los correspondien­
tes nucleótidos. Estos se polimerizan por unio­
nes fosfodiéster disponiéndose las bases nitro­
genadas en el interior de la hélice en forma per­
pendicular al eje helicoidal y las dos cadenas se
mantienen unidas por puentes de hidrógeno en­
tre las bases A y T (2 uniones) y entre C y G (3
uniones) (fig. 40-1).
Los cromosomas están conformados por nu­
merosos y ordenados plegamientos de ADN
combinado con ciertas proteínas. Cada cromo­
soma tiene un determinado número de secuen­
cias denominadas genes que codifican para la
síntesis de proteínas. Cada célula humana con­
tiene aproximadamente 3 x 10® pares de bases
que en conjunto constituyen su genoma; la in­
formación así almacenada se transmite de ge­
neración en generación dando origen a nuevos
individuos con cai-acterísticas similares a las de
sus progenitores. Se considera que el 10 % del
genoma está ocupado por genes que codifican
 Metodologías básicas en biología molecular
í/'
OH
dATP dGTP
Unión de dATP a dGTP
l/. ADN polimerasa
L
OH
Fig. 40-1. U nión entre nucleótidos. C ada uno de los nucleótidos (dA T P y dG TP) tienen un grupo OH unido al C3 y un
grupo trifosfato unido al C5. Cuando los 2 nucleótidos se unen por acción de la A D N polim erasa se fo rm a una unión fo s-
fodiester y se libera pirofosfato.
proteínas el resto está constituido por ADN no
codificante, como el ADN repetitivo sin fun­
ción conocida, el ADN centromérico o el ADN
telomérico.
Existen métodos que permiten aislar el ADN
celular para poder estudiarlo. Este puede ser
purificado a partir de cualquier tejido u órgano
debido a que la información génica es la misma
en todas las células de un organismo. General­
mente se utiliza sangre periférica debido a la
facilidad en la obtención de. la muestra ya que
es un procedimiento no cruento.
En el caso del estudio de ARN mensajeros
que constituyen los componentes centrales de
la expresión de genes en organismos eucariotas
y procariotas es necesario elegir el tejido para
proceder a la purificación.
La Biología Molecular nos ofrece varias he­
rramientas y técnicas para el estudio de los áci­
dos nucleicos. Considerando el gran tamaño
del genoma eucariótico (3x10® pares de bases),
es necesario contar con métodos que nos per­
mitan aislar un gen para su estudio.
El clonado molecular permite aislar un úni­
co fragmento discreto de ADN de una pobla­
ción de genes, purificar el segmento a homoge­
neidad y la obtención de millones de copias del
mismo en forma pura para análisis químicos,
biológicos y genéticos.
Consiste en cortar fragmentos de ADN por
medio de endonucleasas de restricción (enzi­
853
♦ Grupo fosfato
■
■
OH
Adenina
Guanina
Azúcar biológico
mas que reconocen secuencias específicas del
ADN y lo chvan) y unirlo a vectores e introdu­
cirlos en bacterias para que éstas lo repliquen
junto a su genoma. Así se puede obtener una
biblioteca genómica que comprenda la colec­
ción de todas las secuencias contenidas en el
genoma en forma estable a partir de la cual se
puede aislar una determinada secuencia de
ADN en forma pura. También es posible cons­
truir bibliotecas de ADN complementario que
son colecciones en las que están representados
todos los ARN mensajeros bajo la forma de
ADN complementario o copia (ADNc) de un
tipo celular dado (tejido) en forma estable.
Es una metodología laboriosa donde se de­
ben cumphr tres grandes pasos: 1) la elección y
preparación del material genético a clonar, que
puede ser ADN genómico o ADN complemen­
tario, 2) el clonado (construcción de las biblio­
tecas) y 3) la identificación y aislamiento de re-
combinantes para su estudio.
Ensayos de hibridización
Existen técnicas basadas en la hibridización
molecular que permiten analizar fragmentos de
ADN. Para su correcta interpretación es nece­
sario aclarar ciertos conceptos básicos:
En condiciones fisiológicas, las dos hebras
de la doble hélice no pueden separarse espontá­
neamente. Pero cuando éstas son expuestas a
854 Metodologías
temperaturas cercanas a 100“C o a condiciones
de pH extremas se separan, se desnaturalizan
en los dos componentes simple cadena. Las dos
cadenas complementarias pueden recombinarse
entre sí para formar la doble hélice nativa cuan­
do son llevadas a temperaturas menores. La re-
naturalización o hibridizaeión es muy especí­
fica y produce doble hélice sólo cuando las dos
cadenas son exactamente complementarias u
homologas, si bien a temperaturas menos exi­
gentes o astringentes (más bajas) pueden hi-
bridizar moléculas no totalmente complemen­
tarias. Este término “astringencia” señala si las
condiciones de hibridizaeión son favorables o
no para que se establezca la unión puente de hi­
drógeno.
¿Cuánta homología se necesita para que dos
hebras permanezcan hibridizadas? Si bien es
importante el porcentaje de homología, una
variable importante es la localización dentro
de la secuencia; pares de bases adyacentes se
mantienen unidas más fuertemente que el mis­
mo ntímero disperso a lo largo de la secuencia
de ADN. Las hebras hibridizadas con bajo ni­
vel de homología (alrededor del 10 %) tienden
a disociarse o desnaturalizarse rápidamente en
la mayoría de las condiciones. Con un 50 % de
homología la unión dependerá de las condicio­
nes de reacción dado que los puentes de hidró­
geno son el pegamento que mantiene unidas a
las cadenas; diversos reactivos químicos (por
ejemplo la formamida) y las condiciones de
reacción (temperatura, presencia de sales etc.)
influyen en la misma. Trabajando en condicio­
nes de reacción exigentes o de alta astringen­
cia sólo hibridizan las moléculas muy homólo-
gas.
Se llama temperatura de “melting” o de
fusión (Tm) a la correspondiente al punto me­
dio de la curva de desnaturalización del ADN,
es decir, aquella a la cual la relación entre las
hebras de ADN hibridizadas/desnaturalizadas
en la reacción es 0,5. Tm puede ser modificada
según las condiciones de reacción: aumenta
con el contenido de GC, con la astringencia sa­
lina (concentración de sales monovalentes
“M”), con la longitud de la cadena más corta
del dúplex (“n”) y disminuye con la concentra­
ción de agentes desnaturalizantes de la doble
hélice, como la formamida.
Es posible calcular la Tm de un híbrido de
acuerdo a:
Tm=81,5 “C + 16,6 log M -h 0,41 (%G+C) -
- 500/n - 0,61 (% formamida)
Cuando se hacen experimentos de hibridiza-
ción, se puede controlar el porcentaje de homo­
logía necesaria para que se formen híbridos
ajustando las condiciones de la reacción, sien­
do astringentes (exigentes) cuando las condi­
ciones se acerquen más al Tm del ADN en es­
tudio.
A través de las técnicas de Biología Molecu­
lar es posible identificar una secuencia deter­
minada de ácidos nucleicos en una muestra por
hibridizaeión a una secuencia de ADN o ARN
conocida. Generalmente la hebra conocida se
encuentra “ marcada” y se conoce como sonda
o “probe”. Los procedimientos de marcación
habituales incluyen radionucleidos ^^S, o
marcas no isotópicas que se detectan por fluo­
rescencia o colorimetría. La hebra no marcada
en la muestra a analizar es homóloga de la son­
da y se conoce como blanco o “target”. La
presencia e intensidad de la señal hibridizada
será función del grado de homología entre
blanco y sonda, la concentración de blanco, las
condiciones de astringencia y la actividad espe­
cífica de la sonda marcada.
Existen diversas técnicas de hibridizaeión
molecular. Una variante es extraer el ADN ge­
nómico o el ARN de una muestra, desnaturali­
zarlo e inmovilizarlo en un soporte sólido para
hibridizarlo con una sonda marcada. General­
mente la inmovilización se realiza en filtros de
nitrocelulosa o nylon depositando la muestra
en orificios que delimitan un punto y con la
ayuda de un sistema de vacío, de allí la expre­
sión “dot hibridization” (fig. 40-2).
Con el descubrimiento de las enzimas de res­
tricción, en la década de 1970, se abrió un nue­
vo panorama en el estudio de secuencias espe­
cíficas. Estas endonucleasas de restricción fue­
ron aisladas de bacterias, reconocen secuencias
de 4 a 6 pares de bases de ADN y lo clivan en
sitios específicos dentro de ellas.
Las enzimas de restricción fueron utilizadas
por E. M. Southern cuando desarrolló una téc­
nica revolucionaria que lleva su nom bre,
“Southern blot”. Es una de las herramientas
más importantes y de mayor difusión para el
estudio de la estructura de genes ya que permi­
te la localización de una secuencia de ADN en
particular.
El ADN a anahzar es digerido con enzimas
de restricción generando una serie de fragmen­
tos que son separados electroforéticamente en
geles de agarosa o poliacrilamida de acuerdo a
su tamaño. Luego son desnaturalizados para
obtenerlos en forma de simple cadena y trans­
feridos a un filtro o soporte sólido mediante un
flujo de buffer que eluye el ADN del gel hacia
el filtro sobre el que es inmortalizado conser­
vando el mismo orden de pesos moleculares; es
decir, que se obtiene una réplica del ADN del
gel en el filtro manteniéndose las mismas posi­
ciones relativas.
La hibridizaeión con sondas de ADN o ARN
marcados, específicas para el gen en estudio
 Metodologías básicas en biología molecular
permite la identificación de bandas que indican
el número y el tamaño de fragmentos que son
complementarios. Es posible así construir un
mapa del gen, conformado por las posiciones de
los sitios de restricción, el cual se puede utilizar
para comparar con el mapa obtenido a partir de
otras muestras permitiendo, por ejemplo, la de­
tección de rearreglos dentro del gen en estudio.
La técnica de “Southern blot” ha sido muy im­
portante para la detección de grandes delecio­
nes o rearreglos encontrados en varias enferme­
dades humanas, para comprender las recombi­
naciones genómicas que dan origen a los anti­
cuerpos y los receptores de las células T y para
la detección de oncogenes modificados.
Al igual que en el caso del “dot blot” las
sondas utilizadas pueden ser de ARN purifica­
do, un cADN clonado o un oligonucleótido sin­
tético y los resultados son analizados luego de
una radioautografía del filtro hibridizado (fig.
40-2).
“Northern blot” es una técnica utihzada para
analizar ARN. En este caso se purifica ARN
total o poli (A) ARN, se fracciona de acuerdo a
su tamaño en geles de agarosa, se transfiere a
soportes sólidos como se indicó anteriormente
y se detectan las moléculas de ARN mediante
sondas apropiadas. Este procedimiento tan sim­
ple puede indicar en qué tejidos o tipos celula­
res se expresa un gen en particular o ios facto­
res que regulan su expresión.
En las técnicas de análisis de ADN, los teji­
dos se destruyen imposibilitando cualquier co­
rrelación histológica, es por ello que se idearon
otras técnicas de hibridización “in situ”, don­
de el ADN no se extrae, sino que se mantiene
la célula intacta y allí se une la sonda. Es posi­
ble determinar la ubicación cromosómica de un
gen, por hibridización “in situ” de un extendido
cromosómico, con una sonda en estudio. Tam­
bién ésta técnica sirve para detectar virus inte­
grados en un genoma.
Existe otra técnica de hibridización “in situ”,
“touch blot”, que consiste en hacer repetidos
toques con tejidos que se sospecha están infec­
tados con un determinado parásito sobre un so­
porte sólido, en el que se realiza directamente
la hibridización con una sonda correspondiente
al parásito en estudio (previa desnaturalización
de la muestra).
La diferencia más importante es el nivel de
detección entre estas metodologías, por ejem­
plo, sólo una copia de virus sobre un total de
100 células es suficiente para ser detectada por
“Southern blot” mientras que son necesarias 20
copias por célula para la detección “in situ”.
Esta disparidad se debe a varias razones, por un
lado es más difícil para la sonda encontrar el
blanco puesto que debe atravesar el laberinto
de las proteínas nucleares y ácidos nucleicos
855
comparado con el ADN desnudo pegado al fil­
tro en “dot” o “Southern blot”. Por otra parte
los métodos de extracción y purificación de
ADN confieren un efecto de concentración de
secuencias no comunes de ADN.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
En los últimos 10 años la metodología de
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
se convirtió en una herramienta básica y esen­
cial tanto en los laboratorios de investigación
como en la clínica. La técnica de PCR fue de­
sarrollada por Kary M ullis a mediados de
1980, revolucionando la genética molecular en
virtud de su velocidad, sensibilidad, especifici­
dad y simplicidad, constituyendo una nueva
aproximación para el estudio de genes,
En el hombre el mayor problema en el análi­
sis de genes está en la complejidad del genoma
humano que comprende alrededor de 100.000
genes. La genética molecular provee muchas
técnicas para soslayar este problema, pero mu­
chas de ellas demandan demasiado tiempo e in­
cluyen clonado y otros métodos para detectar
una secuencia de ADN específica. La PCR
cambió esto ya que permite producir gran can­
tidad de copias de ADN de una secuencia de­
terminada sin necesidad de clonar.
La ventaja principal es la capacidad de la
reacción para amplificar muy pequeñas canti­
dades de material hasta un millón de veces,
produciendo suficiente producto para analizar.
El ADN o ARN que se quiere amplificar no ne­
cesita estar extremadamente purificado, debido
a la especificidad de la reacción, que restringe
la actividad de la polimerasa a una determinada
secuencia blanco. Su desarrollo rápido y de re­
lativamente bajo costo permite su aplicación a
gran número de muestras.
La PCR explota situaciones de la replicación
del ADN. La ADN polimerasa usa ADN sim­
ple cadena como “templado” o molde para la
síntesis de una nueva cadena complementaria,
requiriendo además una pequeña sección de
ADN doble cadena para iniciar la síntesis
[“Primer” (Pr) o cebador].
El principio en que se basa la PCR es la am­
plificación enzimática de fragmentos de ADN
flanqueados por dos Prs oligonucleotídicos que
hibridizan con hebras opuestas de la secuencia
“target”. Ciclos repetidos de desnaturalización
térmica del templado, acoplamiento de los Prs
a su secuencia complementaria y extensión de
los mismos con una ADN pohmerasa, resultan
en la amplificación de un segmento de ADN
con un tamaño definido por la distancia entre
los extremos 5’ de los Prs de PCR (fig. 40-3).
Para realizar una PCR se necesitan por lo
menos íos siguientes reactivos: A) muestras de
856 Metodologías

“Slot b lo f Fig. 40-2. A nálisis por h i­

El ADN extraído se aplica sobre
un filtro mediante un sistema de vacío
Placa cribada conectada al vacío
Hibridización y posterior
detección del ADN
b r id iz a c ió n en filtr o s . El
jo O O A D N ex traído de célu las o
¡0 0 0 tejidos se ap lica a un filtro
(slot o dot blot) o se tran s­
0 0 0 f ie r e d e s d e u n g e l a u n a
m em brana luego de separar­
se e l e c tr o f o r é tic a m e n t e
(S o u th e rn b lo t). L a in f o r ­
m a ció n ac e rc a d el ta m añ o
del A D N target es evidente
en Southern blot pero no así
en slot blot.
Muestras positivas
• i

“Southern hibridization”

El ADN extraído se separa

mediante electroforesis

Las muestras de ADN se

transfieren a un filtro

■20kb
Hibridización y posterior
detección de AON - 8kb
■ 3kb

ADN doble cadena, B) buffer con iones Mg, C) biopsias de carcinomas cervicales embebidas
la ADN polimerasa, D) los cuatro nucleótidos en parafina por más de 40 años e inclusive se
o dNTP (dATP, dTTP, dCTP y dGTP) y E) Prs ha logrado analizar por PCR material obtenido
específicos para el “target” que se quiere am­ de momias egipcias.
plificar. A partir de una gota de sangre sembrada en
A) La muestra para PCR puede ser ADN tarjetas de papel se puedo realizar la detección
simple o doble cadena, ARN. En el caso de neonatal de fenilcetonuria en muestras conser­
partir de ARN ya sea total o poliadelinado, se vadas durante muchos años. Es posible extraer
prepara ADNc previa a la PCR. Normalmente hasta 1 mg de ADN, cantidad más que sufi­
se utilizan concentraciones menores a nanogra- ciente para poder hacer análisis por PCR de ge­
mos en el caso de templados clonados o meno­ nes responsables de enfermedades hereditarias.
res a un microgramo para ADN genómico. La B) La composición más común del buffer
PCR está diseñada para amplificar simplemen­ que se utiliza en la reacción es la siguiente, en
te una molécula de “templado”. En estos casos una concentración lOx, siendo necesario diluir­
se deben tener extremos cuidados para evitar lo 1/10 en el momento del uso:
las contaminaciones biológicas a través de he­
rramientas de trabajo o del operador, debido a 100 mM de Tris - HCl pH 8,3
que muy pequeñas cantidades de material con­ 500 mM de KCl
taminante pueden traer serias consecuencias. 15 mM de MgCl^
Por ello es esencial que se realicen controles 0,1 % ( P/V ) de gelatina
negativos de cada reacción de PCR ya que pue­
den revelar la presencia de ADN contaminante La concentración final de MgCl2 puede ser
en los reactivos. variada en la mezcla de reacción, generalmente
Debido a que el ADN es un material muy en el orden de 0.5 a 5 mM. Los iones Mg^+ for­
noble es posible amplificar muestras conserva­ man un complejo soluble con los dNTP, que es
das durante largos períodos. Por ejemplo, se ha esencial para la incorporación de los nucleóti­
detectado ADN del virus papiloma humano en dos; además estimulan la actividad de la poh-
 Metodologías básicas en biología molecular 857

Fig. 40-3. R eacción en cad en a

d e la p olim erasa. La figura ilus­
tra los diferentes m ecanism os de A-T-G-C-C-T-A-G-G-T-A-A-T-C-G-C-A-G-T-T
la re a c c ió n . D e s n a tu ra liz a c ió n ADN bicatenario
T-A-C-G-G-A-T-C-C-A-T-T-A-G-C-G-T-C-A-A
de ADN target de doble cadena,
h ib rid iz a c ió n de los p rim e rs y 5’
síntesis de ADN.

5’ 3’
A-T-G-C-G- G-G-T-G-A-A

Primer A Primer B

Desnaturaiizaión, hibridización y síntesis de ADN

5’ 3’
A-T-G-C-C-T-A-G-G-T-A-A-T-C-G-C-A-G-T-T
^ ________ T-C-C-A-T-T-A-G-C-G-T-C-A-A-
3’

Dirección de la síntesis

Dirección de ia síntesis
5’ 3’
A-T-G-C-C-T-A-G-G-T-A-A-T-C-G ------------»•
T-A-C-G-G-A-T-C-C-A-T-T-A-G-C-G-T-C-A-T
3’

merasa e incrementan el Tm de la interacción moléculas de ADN, y tolera los calentamientos

templado/Pr. La concentración de MgC12, pue­ repetidos a 95“C realizados durante el proceso
de tener una consecuencia dramática en la efec­ de amplificación. Actualmente existen varias
tividad y el rendimiento de la PCR. enzimas termoestables obtenidas por ingeniería
C) La enzima ADN polimerasa cataliza la genética de mayor pureza y reproducibilidad.
polimerización de nucleótidos en dirección 5’a D) Es necesario utilizar deoxirribonucleóti-
3’ a partir de los Prs que utiliza como cebado­ dos dNTP de alta pureza, los cuales son provis­
res. Para que ocurra la polimerización es nece­ tos comercialmente en soluciones stock indivi­
sario que exista un área de transición entre la duales o en mezclas de los cuatro nucleótidos.
doble cadena y la simple hebra, de manera que La concentración que se utiliza usualmente es
la enzima ocupe ese lugar y use la simple hebra de 100 m)a, debiendo ser ajustada em pírica­
parental como molde (fig. 40-4). Por lo tanto, mente para cada reacción de PCR.
como se trabaja con ADN bicatenario, el próxi­ Existen nucleótidos modificados que pueden
mo paso es desnaturalizar la muestra. Esto se ser incorporados con distintos fines, por ejem­
logra aumentando la temperatura a 94-95°C. plo, la incorporación de nucleótidos marcados
¿Cómo soporta la enzima una temperatura radiactivamente permite la localización de los
tan extrema? De hecho, el avance más signifi­ productos de PCR por radioautografía. Así es
cativo en la optimización de la técnica de PCR posible realizar, por ejemplo, secuenciación di­
ha sido el aislamiento de enzimas termorresis- recta, análisis de polimorfismos de conforma­
tentes capaces de ser biológicamente activas a ción en simple cadena, ensayos de protección o
temperaturas de desnaturalización del ADN. La “footprinting”. También se pueden adicionar
fuente de donde se obtiene comiínmente es una grupos fluorescentes o biotina, que permiten la
bacteria, Thermus aquaticus (de allí el nombre detección no isotópica del producto de amplifi­
de Taq, ADN, polimerasa) que habita en aguas cación.
calientes y fue aislada por primera vez en el E) Los Prs son secuencias cortas, de entre 20
Parque Nacional de Yellowstone (EE.UU). Esto y 30 nucleótidos simple cadena, que son com­
no significa que la enzima sea indestructible, si­ plementarios a los extremos de una determina­
no que soporta hasta cinco minutos a 95‘C , que da secuencia templado (quedando sus extremos
es el tiempo necesario para desnaturalizar las 3’ señalándose entre sí).
858 Metodologías
ADN target de doble cadena
A) 5’- _ — _3’
Separación de las hebras
y unión de los primers
B) 5L .3 ’
Primer 2 m ' Primer 1
3”
. 5
,
C)
Separación de las hebras
y unión de los primers
D) _ 5 ’
Nuevos primers
_ _ 3 ,
Extensión de los primers
Fig. 40-4. D iferentes p asos de la P C R . Paso A ) S eparación de las hebras de A D N bicatenario. Paso B) U nión d e los p ri­
m ers. Paso C) Síntesis de las nuevas cadenas. Paso D ) S eparación de las hebras y unión de los prim ers. Paso E) Extensión
d e los prim ers y síntesis de hebras de tam año variable. Paso F) Separación de las hebras y uitión d e los nuevos prim ers,
Paso G ) Extensión de los prim ers y síntesis de hebras del tam año deseado.
Los juegos de Prs se diseñan a partir del aná­
lisis de la secuencia que se quiere amplificar,
para ello existe abundante literatura que detalla
la secuencia parcial, y a veces total, de oncoge-
nes, virus, etc. El par de oligonucleótidos nece­
sario para amplificar un determinado fragmento
de ADN debe contener, en lo posible, el mismo
ntímero de bases, evitando aquellas secuencias
que poseen estructura secundaria. Además no
deben ser complementarios entre sí en sus extre­
mos 3’, ni intramolecularmente. Esta precaución
puede reducir la incidencia de formación de dí-
meros de Prs, que es un artefacto de la técnica.
La distancia entre los Prs cuando hibridizan
con el ADN generalmente es menor que 10 kilo-
bases o k b . (lkb=1.000 pares de bases), si bien
se observa una disminución en la eficiencia de
síntesis para regiones que exceden las 3 kb.
Para algunas aplicaciones los Prs pueden no
ser exactamente complementarios al templado.
Por ejemplo en el caso de mutagénesis dirigida
por PCR una(s) base(s) mutada está usualmen­
te localizada en el centro del oligonucleótido.
Un parámetro importante a tener en cuenta
en la selección de los Prs es la Tm. Ésta puede
ser calculada para un Pr en particular usando
una serie de ecuaciones como la presentada an­
E)
Hebras de tamaño
va ria b le ^
Separación de las hebras
y unión de los primers
— 3.
F)
" “ 5’
Extensión de los primers ^
G)
Fragmentos deseados
Multiplicación del
proceso
teriormente y para cada reacción es preferible
diseñar juegos de Prs en los que ambos tengan
una Tm similar.
Existen programas computados, para ayudar
en el diseño de Prs (OLIGO TM, Pr detective),
que calculan la estabilidad del diiplex de ADN
y analizan las zonas de complementariedad
dentro de la secuencia y posibles estructuras
secundarias que se deben evitar.
Las temperaturas de apareamiento de Prs
con el “templado” están relacionadas con la
Tm pero ésta sólo es una referencia para co­
menzar la experimentación. Es necesario deter­
minar empíricamente cuál es la temperatura
óptima de la reacción de apareamiento, eligien­
do aquella en la que se obtiene una amplifica­
ción más específica.
Durante el desarrollo de la técnica de PCR
un punto importante fue la posibilidad de auto­
matizar los ciclos de temperatura a través de ci-
cladores termales, que constan de bloques tér­
micos programables, de manera de permitir un
control adecuado y reproducible de la tempera­
tura en todas las reacciones. Los parámetros
del ciclado en cuanto a temperatura y tiempo
son críticos para alcanzar el éxito en la amplifi­
cación de productos de PCR.
 Metodologías básicas en biología molecular 859

¿Cómo se llega a obtener un producto de C uadro 40-1. Amplificación por PCR de frag-
amplificación o amplícóii? Para ello se prepa­ m c n io s d e A D N
ra la mezcla de reacción con el ADN en estu­
dio, los Prs oligonucleotídicos específicos, el tic ciclos V«/7i(ríV).5
buffer de reacción con su correspondiente con­ doble c(i<lcna de ini<léail(is uii vei
centración de MgC12 la enzima ADN polime­ 1 0
rasa y los cuatro dNTP precursores. 2 0
El primer paso es la desnaturalización del
ADN por medio del calentamiento de la mezcla 4
.s X
de reacción a 94°C por 5 minutos. De esta ma­ '■ 16
nera se obtienen cadenas simples que serán el 32
“templado” para los Prs. Luego se disminuye la S 64
temperatura para permitir el apareamiento de 9 12H
10
los Prs a sus secuencias complementarias, ge­ 1i
nerando los templados adecuados para la ADN 12
polimerasa. La temperatura se lleva ahora a ¡.í
72°C, óptima para que la Taq polimerasa co­ 14 4096
1?
mience la síntesis incorporando nucleótidos y 16
extendiendo los Prs en dirección 5’a 3’. En el 17
siguiente ciclo la temperatura se lleva a 94®C IS 65536
sólo por 30 segundos para que se separen la 19 131072
nueva cadena sintetizada y el molde original 20 262144
21 524288
(fig. 40-4b). Estas hebras simple cadena consti­ 22 1048576
tuyen templados para una nueva ronda de sínte­ 2? 2097152
sis de ADN a través de ciclos que comprenden 24 4I94.504
el calentamiento para separar cadenas aparea­ 25 8388608
26 16777216
miento de Prs y síntesis de nuevas hebras. 27 i 33544432
El Pr producto de extensión resulta de la sín­ 2S 67108864
tesis sobre el templado original, por lo tanto no 29 .^4217728
tiene una longitud diferencial debido a que la ?() 268435456
.31 536870912
ADN poUmerasa continuará sintetizando ADN 32 1073741824
hasta que sea interrumpida por el comienzo de
un nuevo ciclo. El producto del segundo ciclo
de extensión también tiene un tamaño indeter­
minado; en el tercer ciclo se sintetizan fragmen­ moléculas doble cadena que son copias de la
tos de la secuencia target que tienen ya una lon­ secuencia de ADN entre los dos Prs. General­
gitud definida correspondiente a la distancia que mente la reacción se realiza por 30 a 40 ciclos.
separa ambos Prs en el templado original. Lue­ Es así que luego de 32 ciclos, por ejemplo, teó­
go, a partir del cuarto ciclo la secuencia es am­ ricamente se podrían producir 1.073.741.824
plificada exponencialmente (fig. 40-4). copias de una sola molécula original. El niíme-
Por lo tanto, al final de “n” ciclos, la reac­ ro de moléculas “target” amplificadas en rela­
ción contiene teóricamente un máximo de 2" ción a los ciclos aplicados se presenta en el

Desnaturalización de la muestra-
para separar cadenas
94-95 °C, 5’

Apareamiento de Prs
a la simple cadena
37 a 65 °C, 30"

Desnaturalización para Síntesis de nuevas cadenas

separar cadenas por Tap Polimerasa
a 95 °C, 30" 72 °C, 1 a 5’

F ig .4 0 -4 b
860 Metodologías
cuadro 40-1. La reacción no es 100% eficiente
por lo cpe la práctica de rutina es amplificar
entre 100 y 500 nanogramos para que pueda
ser visualizado en geles de agarosa o acrilami-
da teñidos con bromuro de etídio, si bien teóri­
camente se podría amplificar hasta 0,01 pg.
Se ha desarrollado el diagnóstico prenatal de
enfermedades hereditarias a través del estudio
por PCR, de pequeñas muestras de ADN obte­
nidas por amniocentesis o punción de vellosi­
dades coriónicas.
¿Qué ocurre si los Pr no sólo encuentran a la
secuencia “target” o a veces “equivocan” la se­
cuencia a unir? Lamentablemente, los Pr pue­
den unirse a secuencias “no-target”, surgiendo
como consecuencia el problema de la especifi­
cidad de la reacción. Para contestar esto debe­
ríamos conocer con qué frecuencia se encuen­
tra, en un ADN “no-target”, una secuencia de
aproximadamente 20 bp exactamente comple­
mentaria a la del Pr. En realidad éste es un
evento muy poco frecuente. Pero si ello llegara
a ocurrir, existe otro mecanismo que protege a
la ampUficación no específica; la helara resul­
tante debe poseer una región complementaria y
altamente homologa a la secuencia del otro Pr
porque de lo contrario no se lograría una am­
plificación geométrica de la secuencia “target”.
Debemos tener en cuenta también que el extre­
mo 3’del Pr podría aparearse en esa base y, por
lo tanto, originar un sitio de iniciación para la
síntesis de ADN. Esto se conoce como “mis-
priming”. Otra cosa que puede ocurrir con los
Pr es que se unan entre ellos (“Pr oligomer”),
evento que resulta altamente improbable consi­
derando la concentración de Pr en la mezcla de
reacción.
De acuerdo a lo planteado a nivel teórico se
pueden obtener tres tipos de información a par­
tir del análisis de productos específicos de
PCR;
a) detección en el blanco de la secuencia espe­
rada y sus posibles alteraciones.
b) cuantificación del rendimiento de la reac­
ción de PCR para determinar las cantidades
absolutas o relativas del blanco de ADN o
ARN original.
c) análisis de la secuencia amplificada por hi-
bridización con sondas o por secuenciación
directa del producto.
Metodología
I. Preparación de la muestra
Se han descrito diversos protocolos para la
obtención de ácidos nucleicos. Los más prácti­
cos no apuntan a una purificación extensiva de
las preparaciones sino que son extracciones lo
suficientemente limpias como para ser usadas
en PCR. Debido a la extrema sensibilidad de la
técnica es imprescindible limitar el problema
de las contaminaciones.
La experiencia en el laboratorio ha enseñado
que el utilizar un conjunto de pipetas exclusi­
vas para la reacción, manipular las enzimas en
áreas separadas y nunca preparar soluciones
“stock” disminuye efectivamente el grado de
contaminación. No es indispensable usar “tips”
con algodones o realizar las reacción bajo cam­
pana estéril. Como regla general es convenien­
te utilizar material autoclavado o estéril (tubos,
“tips”, soluciones, etc.). El uso de guantes ayu­
da a evitar las contaminaciones con nucleasas y
ácidos nucleicos y productos de PCR del ope­
rador. Todos los procedimientos deben reali­
zarse evitando la contam inación entre las
muestras o del equipamiento del laboratorio,
A. Preparación de ADN genómico a partir
de hisopados clínicos;
Este protocolo se diseñó para aislar ADN de
muestras genitales pero puede emplearse con
cualquier tipo o cultivo celular que se obtenga
fácilmente por abrasión. El hisopo se sumerge
en un tubo de 15 mi con 2 mi de SST/antibióti-
cos (NaCl 0,15 M; buffer fosfatos 0,01 M; pe­
n icilina 0,06 mg/m l y estreptom icina 0 , 1
mg/ml). Las muestras pueden quedar a tempe­
ratura ambiente o refrigerarse si no se procesan
en el día. Se centrifuga a 2000-3000 rpm du­
rante 2 minutos y el precipitado se lava con
1 mi de TE (Tris ImM, EDTA 10 mM) si es
que presenta rastros de sangre. Se repiten los
lavados tantas veces como sea necesario hasta
obtener un precipitado limpio, el cual se resus-
pende en 4 mi de buffer de lisis (TE/Tween
0,5%/proteinasa K 100()j,g ■mi) incubándose a
55°C durante 1 hora. Se inactiva la proteinasa
K por calentamiento a 95°C, 10 minutos.
B. Preparación de ADN genómico a partir
de tejido;
El procedimiento incluye un paso de chsocia-
ción utilizando homogenizador manual o mecá­
nico (dependiendo de las características del te­
jido) a fin de reducir el tejido a una suspensión
lo más homogénea posible. Si los tejidos se en­
cuentran incluidos en parafina se deben despa-
rafinar (la parafina inhibe la amplificación).
Para ello se realizan 2 extracciones seriadas de
un minuto cada una en xileno (desparafinante)
y en etanol 95 % (elimina al xileno). La mues­
tra se seca, se resuspende en agua, se hierve 5
minutos y luego se realiza el tratamiento con
200 p.g de proteinasa K.
■ C. Preparación de ADN genómico a partir
de linfocitos de sangre periférica;
 Metodologías básicas en biología molecular
El fraccionamiento celular puede realizarse
mediante el empleo de gradientes de Ficoll-Hy-
paque o bien aislando el “buffy-coat” (capa de
linfocitos ubicada entre el paquete globular ro­
jo y el plasma, iuego de una centrifugación a
baja velocidad). Estas células se lavan en dos
volúmenes de SST y se les añade el buffer de
lisis (100 (il por cada 5.000 células), se incuba
a 56°C durante 45 minutos y se calienta a 95“C
10 minutos para inactivar a la proteinasa K.
D. Utilización de sangre entera:
Mezclar 50 |il de sangre entera antíeoagula-
da con EDTA con 0,5 ml de TE en un tubo de
1,5 ml, se centrifuga 10 segundos a 13.000 xg,
se resuspende el sedimento celular en 100 )0 .1 de
buffer de lisis de glóbulos blancos y se incuba
como ya se describió. Usar 10 ¡al por cada reac­
ción de PCR. Un recuento de glóbulos blancos
en sangre normal oscila en 5.000 células • ¡il,
por lo que 50 |il de sangre contienen 250.000 o
más células nucleadas.
Es importante aclarar que en los procesos de
extracción de ADN se pueden utilizar deter­
gentes compatibles con la Taq polimerasa co­
mo el Laureth 12 o el Tween 20 al 0,5%. El
NP40 debe usarse con cuidado puesto que inhi­
be a la Taq polimerasa cuando se usa al 0,1%.
El SDS no puede usarse con ninguna polimera­
sa a pesar que completa excelentemente la ac­
ción de la proteinasa K.
La proteinasa K es de elección para la diges­
tión de núcleos o células enteras a fin de liberar
ADN y ARN para que sean accesibles a la ac­
ción de la polimerasa. Tiene la ventaja de ser
termoestable entre los 50°C y 60"C y fácilmen­
te inactivable a 95°C.
2. Preparación de la mezcla
de reacción
Puesto que las muestras de ADN pueden
contener inhibidores de la reacción (sangre,
quelantes del Mg, exceso de Mg) y dado que es
una técnica extremadamente sensible es siem­
pre recomendable diluir la muestra 1/10 o 1/20
en el volumen final de la reacción. La concen­
tración adecuada de Mg es aproximadamente 1
861
Fig. 40-5. A m pU ficación de A D N ge-
n ó m ic o p o r P C R . E le c tro fo re sis en
gel de agarosa de los productos d e am ­
p lific a c ió n con P rs esp ecífico s para:
dos exones del gen CFTR (afectado en
enferm edad fibroquística) y m a rc a d o ­
res de pesos m oleculares.
mM y de Pr 0,5 )0 ,M si bien, como se comentó
previamente, es necesario determinar- empírica­
mente la mejor concentración de cada uno para
la reacción.
3. Diseño de los ciclos
Todos comienzan con un paso de desnaturali­
zación seguido, en la mayoría de los casos, por
el apareamiento de los Pr, extensión (síntesis de
la nueva cadena) y, de nuevo, desnaturaliza­
ción. Los protocolos convencionales indican
temperaturas entre 93 y 95“C para la desnatura­
lización, entre 37°C y 65°C por 1-2 minutos pa­
ra el apareamiento y aproximadamente 72°C
por 1-2 minutos para la extensión. Existen pro­
tocolos más sencillos que otros y sólo la propia
experiencia del operador servirá para introducir
modificaciones al protocolo original ajustándo­
lo a las necesidades particulares del laboratorio.
Para asegurar que la mezcla de reacción al­
cance la temperatura deseada en el menor tiem­
po posible es indispensable utilizar tubos de
paredes ultra finas de 0,5 ml y cubrir la mezcla
final con aceite mineral, a fin de evitar su eva­
poración.
Se encuentran disponibles en el comercio
“kits” que incluyen enzimas, nucleótidos y buf­
fer listos para utilizar en las diluciones reco­
mendadas. Una vez lista la mezcla de reacción
se calienta el bloque del termociclador a 94°C y
se colocan las muestras. Se da curso a los ci­
clos (25-40) y una vez finahzados se conserva­
ban las muestras a 4“C.
4. Detección de los productos
amplificados
El método más simple para visualizar un
producto de amplificación consiste en realizar
electroforesis de una alícuota de la PCR en ge­
les de agarosa o poliacrilamida. Mediante la
tinción con bromuro de etidio, un colorante
fluorescente que se intercala entre las bases del
ADN, es posible observar el producto de am­
plificación por medio de transiluminación ul­
travioleta. El gel puede ser fotografiado para
obtener un documento permanente del experi­
862 Metodologías

mentó. Para determinar el tamaño exacto del
amplicón se utilizan marcadores de pesos mo­
leculares en el gel (fig. 40-5).
Una alternativa para visualizar las bandas de
ADN es la tinción de los geles con plata lo cual
permite la visualización directa del mismo sin
transiluminación UV.
Para productos de peso molecular pequeño o
para la detección de pequeñas diferencias de ta­
maños, se pueden usai" geles de poliacrilamida
no desnaturalizantes o geles desnaturalizantes
de secuencia. Sin embargo el tamaño no puede
considerarse como único criterio de amplifica­
ción específica. Puede ocurrir también que la
eficiencia de la reacción no fuera óptima y que
el producto final estuviera en concentraciones
al límite de la detección con el bromuro de eti-
dio (aproximadamente 50 ng de ADN). Es por
esto que a veces se emplean las técnicas de hi-
bridización descritas anteriormente, cuya sensi­
bilidad es del orden de 0,1 pg de DNA, para la
confirmación de la identidad de un producto de
PCR utilizando sondas específicas radiactivas o
no. Estos métodos aumentan la sensibilidad de
la detección comparados con la tinción con
bromuro de etidio y además confirman la am­
plificación del producto esperado. Es posible
utilizar sondas oligonucleotídicas para la detec­
ción de los productos de PCR las que general­
mente se marcan con ^^P por incubación con
g32p _ y ^ 4 polinucleótido quinasa. Tam­
bién pueden realizarse marcaciones no isotópi­
cas utilizando colorantes fluorescentes, digoxi-
genina, peroxidasa de rábano picante [horsera-
dish peroxidase) o fosfatasa alcalina.
Alternativamente, los productos de PCR
pueden marcarse durante la reacción de ampli­
ficación por la adición de nucleótidos o Prs ra­
diactivos (^T), o bien marcados con biotina o
fosfatasa alcalina siguiéndose los correspon­
dientes protocolos de detección.
Es posible también detectar los productos de
amplificación, a través de hibridizaciones alelo
específicas, utilizando Prs diseñados especial­
mente para analizar m utaciones puntuales
(ASO),
La sensibilidad y especificidad de la amplifi­
cación, tanto de ADN como de ARN (ADNc),

Secuencia target Secuencia no-target

Productos de PCR
con el primer juegb de primers

Agregado del segundo juego de

primers complementarios a
secuencias internas específicas

Los primers internos no se unen

a la secuencia no-target por lo
tanto no la amplifican

La secuencia target es amplificada

usando primers internos

F ig. 40-6. Prs n ested aum entan la especificidad de la PC R . A partir de la secuencia blanco a estudiai-, se diseñan dos
ju eg o s de Prs, uno de los cuales son internos a la región am plificada por el prim er par . Los productos d e la prim er PCR
(Pr rosados) incluyen secuencias blanco y otras no deseadas. U na alícuota de la p rim er reacción es am plificada con un se­
gundo ju e g o de Prs internos (Pr grises). Solo se am plifican los fragm entos que son com plem entarios al segundo juego de
Prs.
 Metodologías básicas en biología molecular 863

puede ser sumamente aumentada mediante el
método de nested PCR (PCR interna o anidada).
El fragmento de ADN producido por PCR puede
ser reamplifieado con nuevos Prs, internos a la
secuencia amplificada, llamados Prs “nested” o
internos. Esta técnica elimina los productos de
amplificación inespecífica, debido a que éstos no
serán complementarios de los nuevos Prs y, por
lo tanto, no servirán como templado para una se­
gunda amplificación (fig. 40-6).
5. Optimización de la PCR
Desde que el método fue inventado se han
desarrollado en la optimización de la técnica
sustanciales mejoras, como el empleo de enzi­
mas termoestables y la automatización. Induda­
blemente ningún protocolo único puede ser
aplicado a todas las situaciones.
Los problemas con los que el operador se
encuentra habitualmente son: productos no de-
tectables, bajo rendimiento del producto desea­
do, la presencia de “background” no específico
debido a “mis-priming” o “mis-extension” de
los Pr, la dimerización de los Pr y las mutacio­
nes o heterogeneidad debida a errores en la in­
corporación de las bases.
Para una eficiente optimización de la técnica
el parámetro a considerar sobre los protocolos
estándar es la concentración de los reactivos a
utilizar. Lo sugerido es:
]. ADN “target”: debe oscilar entre 100.000 y
1.000.000 de moléculas. Un (|_Lg de ADN
genómico de simple cadena, 10 ng de leva­
duras o 1 (.ig de E. coli equivalen a 300.000
moléculas “target”.
2. Pr: 20 pmoles de cada uno es lo recomenda­
ble.
3. Buffer de reacción: generalmente se utiliza
uno 20 mM de Tris/CIH pH 8,3; 1,5 mM
MgCl; 25 mM Kcl dependiendo defa marca
comercial de la enzima.
4. dNTP: 50 |aM de cada uno; habitualmente
se preparan a una concentración final 10
mM y se conservan a -20°C. La estabilidad
de los dNTP es aproximadamente del 50%
luego de 50 ciclos. Los 4 dNTP deben usar­
se a concentraciones equivalentes para mi­
nimizar errores de incorporación.
5. Taq polimerasa: oscila entre 1-2 unidades
por cada 100|.il. Si la concentración es muy
alta aparece “background” de los productos
no específicos y si es muy baja se produce
una cantidad insuficiente del producto de­
seado.
Habitualmente se desnaturaliza la muestra 5
minutos a 94°C y se realizan entre 25 y 40 ci­
clos con el siguiente perfil de temperatura: de­
naturalización 94“/30 segundos, apareamiento
de los Pr 55°C! 30 segundos, extensión 72“C/un
minuto. Los ciclos se terminan con una exten-

Síntesis “target” específica

- Región “target”
Taq
polimerasa T A T I C G
-Pr1
3’ 5’

Síntesis de “target” específica (“mispriming”)

-Región “target”
Taq
polimerasa J A T T ^ G
-P rt

Ollgomerizaclón de Pr

Taq 3’ Taq
P r2 P r2
polimerasa polimerasa
F ig . 4 0 -7 . P o s ib il id a d e s de ------- ►
a p a rea m ien to de los p rim ers. T A ■c T T
U nión “ta rg e t” específica, “ta r­
A T T G ____
g e t” no específica y o ligom eri- -P r 1
zación. "s
864 Metodologías
HSN
¡ i * *
i:,
G
T val
5728
5589 !cy s
Ggly
C ata
G
A start” PCR es incorporar los Pr y/o la Taq y/o
Agio
A Aunque este procedimiento no es difícil, resul­
C thr
A
A de muestras. Existen modificaciones químicas
Cpro
Fig. 40-8. Secu en ciación p or P C R de un fragm ento del
gen de tiroglobulina, que presenta 138 pares de bases dele-
cionadas (indicadas entre las flechas).
sión final a 72°C por 5 minutos. La reacción se
detiene enfriando a 4°C y/o por agregado de
EDTA 10 mM.
Existe un procedimiento diseñado para inhi­
bir considerablemente la síntesis de ADN no
específico, el que se conoce como “hot-start
PCR”. Ya se ha mencionado que la síntesis de
ADN está predeterminada por los Pr y se co­
mentó también que éstos no siempre se unen al
ADN “target” sino que pueden hacerlo entre
ellos o bien hibridizar con secuencias no 100%
homologas. Es importante reforzar la idea que
la Taq polimerasa es extremadamente eficiente
y sólo necesita que los Pr se unan a hebras no
apareadas para que comience la síntesis de
ADN. La fase limitante de la reacción no es la
actividad enzimática sino la tem^peratura y
tiempo de apareamiento de los Pr. Éstos tienen
tres posibilidades de unión; 1) hibridizar el
ADN “target” con el 100% de homología; 2)
hibridizar con zonas “no-target” sin homología
completa; 3) hibridizar entre ellos (véase fig.
40-7).
Al comenzar la PCR la temperatura se incre­
menta hasta 94°C a una velocidad de un grado
por segundo, todo el ADN se encuentra como
simple hebra y es imposible que hibridice. Ma­
nejando el concepto de Tm se podrían diseñar
diversas cinéticas de hibridización de acuerdo a
las tres posibilidades descritas anteriormente.
En un modelo ideal, entre la temperatura am­
biente y los 55°C, el Tm debería ser máximo
para la unión de los Pr al ADN “target” y míni­
mo para la unión de los Pr a secuencias no “tar-
get” o entre sí.
El concepto de “hot start” PCR es simple; no
permitir a los Pr la oportunidad de unirse a una
hebra de ADN hasta que se haya alcanzado la
temperatura crítica que sea desfavorable para
las rutas no específicas. Una modificación al
protocolo habitual es añadir la Taq polimerasa
una vez que la mezcla de reacción haya llegado
a los 80“C. De este modo se aumenta la especi­
ficidad y la sensibilidad de la PCR.
El protocolo manual para realizar una “hot-
el Mg una vez que la mezcla llega a 80”C.
ta engorroso si se trabaja con un gran número
en la “hot- start” PCR que aumentan la especi­
ficidad como, por ejemplo, separar la muestra
de reacción que contiene los Pr de la Taq por
medio de una capa de cera. La cera funde a los
80“C permitiendo que la enzima se mezcle con
los otros reactivos y la cera funcione luego co­
mo barrera para evitar la evaporación. Otra
forma es incorporar a la mezcla proteínas que
se unan al ADN y, como resultado de la unión,
se desestabiliza la doble hebra proporcionando
un sustrato para la amplificación. Se han des­
crito y caracterizado 2 proteínas, la derivada
del gen 32 del bacteriófago T4 y la SSB deri­
vada de E. coíi. Estas proteínas se unen al
ADN a temperatura ambiente disminuyendo
obviamente el Tm del fragmento de ADN es­
pecífico. Por lo tanto la unión Pr-ADN no es­
pecífico que posea la menor cantidad de puen­
tes H será más suceptible de ser destruida que
la unión Pr-ADN específica que posee gran
cantidad de puentes H.
Aplicaciones de la técnica
La gran versatilidad de la reacción de PCR
constituye una herramienta muy poderosa para
el análisis de genes. Existen múltiples aplica­
ciones, entre ellas;
• Secuenciación directa de fragmentos de
ADN. Es posible determinar por PCR la se­
cuencia nucleotídica de un blanco sin necesi­
dad de recurrir al clonado (fig. 40-8).
 Metodologías básicas en biología molecular

18q21 t(14;18) 14q32

(a) (b) (c)

Fig. 40-9. D etección de célu las cancerígenas por PC R . En linfom as foliculares existe un rearreglo entre los c ro m o so ­
mas 14 y 18. P arte del locus para cadenas pesadas de inm unoglobulinas JH en el crom osom a 14q32 es traslocado al lo cu s
para el oncogen BCL2 del crom osom a 18q21. Se diseñaron Prs que se aparean a los sitios 5 ’ y 3 ’ de ruptura de los c ro m o ­
som as 18 y 14 respectivam ente, b) la traslocación t (1 4 ;I8 ) (q32;21) perm ite que los Prs se apareen ju ntos en la m ism a
m olécula de A D N doble cadena. Cuando se am plifica A D N de pacientes que llevan la traslocación, se genera un frag m en ­
to de PCR de aproxim adam ente 300 pb que com prende la zona de unión de am bos crom osom as, este fragm ento de P C R es
perfectam ente difereneiable de los fragm entos de tam año variable obtenidos por am plificación de cada uno de los c ro m o ­
som as analizados (a y c).

Análisis de genes. A través de éste método un indicador muy sensible para el médico on-
es posible estudiar la estructura génica; la cólogo (fig. 40-9).
identificación molecular precisa de un deter­
minado gen, de sus defectos, rearreglos o de-
leciones. En inmunología e inmunoparasito-
logía resulta muy títil para el estudio de los
genes de las inmunoglobulinas, sustancias
del complemento, antígenos de histocompati­
bilidad, etcétera.
Análisis de mutaciones. Permite analizar la
presencia de mutaciones moleculares conoci­
das responsables de enfermedades heredita­
rias o de tumores. Conocer la naturaleza de
las inutaciones en un paciente es importante
É
para el diagnóstico y la terapia de la enfer­
medad. Algunos cánceres se originan como
resultado de traslocaciones que envuelven
genes conocidos. En linfomas foliculares
existe una traslocación entre los cromosomas
14 y 18. Utilizando éstas mutaciones como
marcadores se pueden detectar células cance­
rígenas por Southern blot convencional si es­
tán presentes en una de cada 100 células nor­ Fig. 40-10. a. P edigrí de una fam ilia en la que se an alizó el
males. Por lo tanto, un paciente puede ser gen de la p globina por m edio de la am plificación de A D N
juzgado como libre del cáncer por este méto­ genóm ico con Prs específicos para el intrón 1 del gen d e P
do pero puede seguir conservando un ntímero globina (zona de m utaciones m ás frecuentes), b. R adioauto-
grafía correspo n d ien te a la h ib ridizaeión de los p ro d u cto s
significativo de células enfermas. En contras­ de P C R con A SO mutado. c. R adio au to g rafía co rre s p o n ­
te, la PCR es capaz de detectar hasta 1 célula diente a la hibridizaeión de los productos de PCR con A S O
cancerígena entre 10'> normales proveyendo normal.
866 Metodologías
XJ1.1 p87 J.Bir
I I I te un “kit” comercial para determinar alelos del
l i l i
500 1000 1500 2000
N ■
F ig . 40-11. P C R m u ltip lex. En u n a m ism a reacción .se
am plifica con 9 juegos de Prs sim ultáneam ente y lo.s pro­
ductos de PCR son separados en geles de agarosa y teñi­
dos con brom uro de etidio. El p aciente 1 no tiene delecio-
nes para ninguna de las regiones analizadas, m ientras que
el paciente 4 presenta una gran deleción de 1000 pb. Los
otros pacientes presentan deleciones de tam año variable.
M: m arcador de peso m olecular. N : control negativo.
Es posible, por ejemplo, estudiar la presen­
cia de mutaciones puntuales en un gen respon­
sable de una determinada enfermedad genética.
Para ello se amplifica por PCR un fragmento
del gen que se quiere analizar, se realiza un dot
blot y luego se hibridiza con dos sondas marca­
das: por un lado con un oligonucleótido com­
plementario a la secuencia normal y por el otro
con un oligonucleótido que detecta la mutación
conocida. De esta manera se realiza una hibri-
dización con sondas alelo específicas o ASO
que permiten la detección de mutaciones pun­
tuales (fig. 40-10).
Recientemente se ha desarrollado la técnica
reversa que permite analizar varias secuencias
en un solo ensayo. En este caso los distintos
ohgonucleótidos son unidos a una membrana y
el material del paciente amplificado por PCR
con dNTP marcado es usado como sonda que
se une a sus secuencias complementarias. Exis­
A ntígeno M ayor de H isto co m p atib ilid ad
(HLA).
Debido a que se puede realizar una co-am-
plificación de varias secuencias en una misma
reacción de PCR se desarrolló el método de
multiplex. Este método permite el análisis ge­
nético de varios fragmentos de ADN de un gen
al mismo tiempo, a través de la combinación de
distintos juegos de Prs. Así es posible estudiar
un determinado gen mediante la amplificación
de varios exones en una sola reacción; de ma­
nera de poder determinar, por ejemplo, grandes
deleciones.
Es el caso del estudio de la Distrofia Muscu­
lar de Duchénne mediante una PCR multiplex.
Se diseñaron Prs para amplificar 9 regiones del
gen de la Distrofina que son las más frecuente­
mente delecionadas en ésta enfermedad (fig.
40-11).
• Detección de una amplia gama de organis­
mos. La PCR es utilizada para monitorear in­
fecciones bacterianas o virales. Convencio­
nalmente los métodos de diagnóstico están
basados en el crecimiento en cultivo de los
organismos o en la detección de su presencia
con anticuerpos. Las dificultades que presen­
tan se deben a que se requieren varias sema­
nas para el diagnóstico en el primer caso y
que existe la posibihdad de reacciones cruza­
das en el segundo. La PCR permite detectar
con alta especificidad y sensibilidad pocas
células infectadas dentro de una gran pobla­
ción de células no infectadas.
BIB L IO G R A FÍA
W atson, H opkins, R oberts, Steitz, W einer. M olecular B io-
logy o f the Gene. F ourth Ed. T he B enjam ín Cum m ings
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METODOS
INMUNOQUÍMICOS

V
Métodos cromatográficos de fase
líquido-sólido (LSC) aplicados
a la purificación de proteínas
JULIANA LEONI
IRINA MATHOV
LEOPOLDO F. ABDON
1. CROMATOGRAFIA.
PRINCIPIOS GENERALES
La característica que distingue a los métodos
cromatográficos de otros métodos ñ^sicos y quí­
micos de separación, es la presencia de dos fa­
ses mutuamente no miscibles (una móvil y otra
estacionaria) que se hallan en contacto. Una
muestra introducida en la fase móvil es trans­
portada a lo largo de la columna, que contiene
una fase estacionaria homogéneamente distri­
buida. Los diferentes componentes de la mues­
tra experimentan repetidas interacciones entre
la fase móvil y la estacionaria. Al final del pro­
ceso, los componentes separados eluirán en or­
den creciente de interacción con la fase estacio­
naria. El componente que menos interactúa (el
menos retenido) eluirá primero, el retenido más
fuertemente eluirá último. El reparto entre las
fases aprovecha las diferencias entre las propie­
dades fisicoquímicas de cada uno de los com­
ponentes de una muestra dada. Una separación
óptima entre dos componentes de una muestra
se obtiene cuando el pico que eluye en segundo
término es lo suficientemente retenido como
para impedir su superposición con el pico que
eluyó en primer término.
La columna de separación es el centro del
cromatógrafo ya que proporciona una gran ver­
satilidad para los distintos tipos de análisis. Es­
ta característica, debida a las posibilidades de
selección de materiales para las fases móvil y
estacionaria, permite separar moléculas que di­
fieren muy poco en sus propiedades fisicoquí­
micas. En un sentido amplio, la distribución de
un soluto entre las fases móvil y estacionaria es
el resultado del balance de fuerzas entre las
moléculas del soluto y las moléculas de cada
fase.
41
La resolución cromatográfica de macromolé-
culas biológicas, en todos los casos excepto en
la cromatografía por exclusión molecular, es un
proceso mediado por la adsorción diferencial
de solutos a la superficie del material de empa­
quetamiento de la columna. La optimización de
una separación cromatográfica depende funda­
mentalmente de dicha adsorción.
Las macromoléculas biológicas difieren en
sus características fisicoquímicas: tamaño, for­
ma, carga, hidrofobicidad y arreglo de sus gru­
pos funcionales dentro de su estructura tridi­
mensional. Es lógico, por lo tanto, que los mé­
todos cromatográficos más comunes para el
fraccionamiento de estas moléculas sean: cro­
matografía por exclusión molecular (discrimi­
nación por tamaño y forma), cromatografía por
intercambio iónico (discriminación por carga),
cromatografía por interacción hidrolobica (su­
perficie hidrofóbica), cromatografía en fase re­
versa (hidrofobicidad total), cromatografía de
afinidad por inmovilización de metales (histidi-
nas accesibles en la superficie), y cromatogra­
fía de afinidad (distribución de aminoácidos es­
pecíficos en la superficie de las proteínas).
1.1. Clasificación
de los Métodos Cromatográficos
Los métodos cromatográficos se clasifican
de acuerdo a las características físicas de las fa­
ses móvil y estacionaria.
La fase móvil puede ser un gas o un líquido,
mientras cjue la fase estacionaria puede ser un
líquido o un sólido. Cuando la separación invo­
lucra un reparto simple entre dos fases líquidas
no miscibles, una móvil y la otra estacionaria,
el procedo se llama cromatografía líquido-líqui­
do (LLC). Cuando la fase estacionaria es un só-
870 Métodos inmunoquímicos
Cuadro 41-1. Clasificación de los métodos cromatográficos
Crom atografía de gases
G as-Líquido G as-Sólido
(GLC) (G SC)
liclo y participan fuerzas físicas de retención la
crom atografía se denom ina líquido-sólido
(LSC). Debido a la orientación de este libro,
nos abocaremos solamente al análisis de la cro­
matografía líquido-sólido, ya que es la croma­
tografía más utilizada para la separación de
biomoléeulas de importancia inmunológica.
En base a las caraeterístieas de la fase sólida
que se desea utilizar, en función de las propie­
dades fisicoquímicas de la muestra, la LSC se
divide en no adsortiva y adsortiva. La primera
incluye la de exclusión molecular y dentro de
la segunda podemos encontrar las siguientes
variantes: de intercambio iónico, de afinidad,
de cromatoenfoque, de fase reversa, y de hidro­
fobicidad (cuadro 41-1).
2. CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN
(FILTRACIÓN POR GELES)
2.1. Funcjamentos
Dentro de las técnicas eromatográficas em­
pleadas para la purificación de proteínas, la fil­
tración por geles es la única en la que el frac­
cionamiento se fundamenta en el tamaño y for­
ma de las proteínas.
La filtración por geles utiliza como soporte
cromatográfico esferas con poros de diferente
tamaño. Una columna construida con esta ma­
triz tendrá dos volúmenes medibles, el volu­
men externo (Vo), constituido por el líquido in­
tersticial, y el interno (Vi) que es el volumen
de las esferas a los que los solutos y solventes
pueden acceder cuando se introducen dentro de
aquéllas a través de sus poros. Las moléculas
que no pueden acceder al Vi, debido a que su
tamaño es mayor al del los poros, sólo se equi­
librarán en el Vo, mientras que las de menor ta­
maño se equilibrarán en ambos volúmenes.
Cuando una mezcla proteica, disuelta en un pe­
queño volumen, es aplicada a una columna con
estas características, filtrará a través de la mis­
ma. Las proteínas de mayor peso molecular
eluirán con el Vo y por lo tanto eluirán prime­
C rom atografía de líquidos
¡Jquido-líquido Líquido-sólido
(LLC) (LSC)
No adsortiva Adsortiva
Exclusión Intercam bio iónico
Crom atoenfoque
A finidad
Fase reversa
H idrofobicidad
ro, mientras que las de menor tamaño, que pue­
den acceder al Vi, eluirán más tardíamente de­
pendiendo de su tamaño y por lo tanto eluirán
en un volumen de elución (Ve) determinado
(figs. 41-1 y 41-2).
En una cromatografía de filtración por geles
se debe tener en cuenta el diámetro de los po­
ros de las esferas, el volumen interno de las
mismas y el diámetro hidrodinámico de las mo­
léculas proteicas que se desean separar. Este
último se define como el volumen esférico que
presenta una proteína en solución. Moléculas
cuyo diámetro hidrodinámico es menor que el
promedio del diámetro de los poros de las esfe­
ras del gel, tendrán acceso a todo el volumen
interno de la matriz, o sea, al volumen total de
la columna (Vt). Proteínas cuyo diámetro hi­
drodinámico sea comparable al promedio del
diámetro del poro tendrán acceso a parte del
volumen interno, que se describe como el volu­
men de elución (Ve). Proteínas cuyo diámetro
hidrodinámico sea mayor que el promedio del
diámetro del poro no serán capaces de acceder
al Vi, por lo tanto eluirán con el Vo de la co-
ooo ooo
oo o®o oo
ooo o®o®o 0.00
oo ®o o oo
© © ©
Q Partícula de gel filtrante
0 Soluto de alto peso molecular
» Soluto de bajo peso molecular
Fig. 41-1. Esquem atización de la filtración por geles. So­
lutos de m ayor tam año que el poro del gel no pueden acce­
der al interior de la esfera. Solutos de m enor tam año que
los poros penetran dentro del gel.
 Métodos cromatográfíeos de fase líquido-sólido
Vt-Vo
Fig. 41-2. R epresentación esquem ática del Vo, Vi = V t-V o
y Vt de una colum na de exclusión m olecular.
lumna. El orden de elución de una mezcla de
proteínas, cuando es aplicada a una columna de
exclusión molecular, es inversamente propor­
cional al diámetro hidrodinámico de aquéllas.
Esta discusión sólo puede ser aplicada a mez­
clas proteicas, ya que se asume que la mayoría
de ellas adoptan una estructura globular. M olé­
culas no globulares eluirán en un volumen in­
correcto, si se las compara con proteínas de pe­
so molecular similar. Éste es el caso de molé­
culas del tipo de los polisacáridos. Un perfil de
elución obtenido por crom atografía de exclu­
sión molecular se ilustra en la figura 41-3.
El volum en de elución para moléculas ex­
cluidas se designa como Vo (void) y representa
el volumen externo de la matriz. El volumen de
elución para moléculas totalmente incluidas se
denomina Vt y es igual a Vo + Vi, es decir, la
sumatoria del voluinen externo y el volumen in-
Fig. 41-3. R epresentación del volum en de separación (Vs)
de dos solutos que eluyen a través de una colum na de ex ­
clusión m olecular. El gráfico indica que el volum en de la
m uestra, luego de sufrir la dilución dentro de la colum na,
en ningtin caso puede ser superior al Vs.
871
temo de las esferas. Volilmenes de elución in­
termedios entre estos valores son designados Ve
y estarán situados en los voliimenes comprendi­
dos entre el Vo y Vo+Vi y ello dependerá del
Kd o coeficiente de distribución del soluto.
El Kd se define como la relación entre las
concentraciones de un soluto que puede distri­
buirse entre el Vo y el Vo -i- Vt. Para las sustan­
cias de mayor peso molecular, que no pueden
penetrar dentro de las partículas del gel, el valor
de su Kd será igual a O (cero), mientras que p a­
ra moléculas muy pequeñas dicho valor será de
1 (uno); entre ambos valores se sitiian sustan­
cias de pesos moleculares intermedios. Tenien­
do en cuenta el Kd, el Ve de un soluto será:
Ve = Vo + Kd ■Vi
Si dos solutos de diferente peso m olecular
forman parte de una misma solución, sus volú­
menes de elución dependerán de sus correspon­
dientes Kd. Aquí debemos introducir el c o n ­
cepto de volumen de separación (Vs), que es el
volumen que separa el frente de la curva de
ambas sustancias (fig. 41-3). Si los dos solutos
presentes en la solución tienen valores de K ’d
y K”d respectivamente, sus volúmenes de elu ­
ción serán:
V e’ = Vo Vi • K ’d (1)
Ve” = Vo -I- Vi • K”d
Vs = V e’ ^ Ve” = (Vo -t- Vi K ’d) - (Vo -t- Vi ■K ”d)
Vs = V i ( K ’d - K ”d)
De acuerdo a lo expresado, para la correcta
separación de dos solutos, el volumen de m ues­
tra a sembrar en una columna, multiplicado por
el volumen de dilución que sufre la misma d u ­
rante la elución, no podrá ser superior al V s
(véase en la sección 2.3).
Cuando se trata de la separación de dos sus­
tancias cuyos valores de K’d = 1 y K”d = O, el
Vs = Vi, se puede calcular fácilmente el tam a­
ño de la columna a utilizar. Esto es lo que ocu­
rre generalmente cuando se desea desalar una
muestra empleando geles de poro pequeño, co ­
mo es el caso del Sephadex G-25. Como el v a ­
lor de Vi es aproximadamente igual al 50% del
Vt, el volumen de la muestra a filtrar no podrá
ser superior a la mitad del volumen de gel co n ­
tenido en la colum na. No o curre lo m ism o
cuando los valores de Kd son próximos. Si de
la ecuación (1) se despeja el valor de Kd:
Kd = V e - V o / V i o
Kd = Ve - Vo / Vs
Debido a que, en la filtración por geles, el
volumen que ocupa la fase estacionaria es igual
a Vi, luego el Vs no podrá ser superior a dicho
872 Métodos inmunoquímicos

volumen. Como el Kd está relacionado con la
fracción de volumen de la fase estacionaria dis­
ponible para la difusión de un determinado so­
luto, en la práctica, dicho volumen así definido
no es fácil de determinar. Por lo tanto es más
conveniente sustituir al Vi por Vt-Vo, lo que
permite obtener:
Kav = Ve-Vo/Vt-Vo
El valor Kav representa la fracción del volu­
men que ocupa la fase estacionaria disponible
para la difusión de un determinado soluto. Te­
niendo en cuenta que, a diferencia del Vi, el
valor de Vt -Vo no incluye el volumen de la
matriz formadora del gel que es inaccesible a
todas las moléculas del soluto, el Kav no es un
verdadero coeficiente de partición, aunque el
volumen que ocupa la matriz es despreciable.
No obstante, es un valor experim entalm ente
útil y, además, para cada gel existe una rela­
ción constante Kav/Kd que es independiente de
la naturaleza del soluto o sus concentraciones.
Cuando se emplean columnas empaquetadas
con geles filtrantes se puede calcular fácilmen­
te su Vt y su Vo, lo que permite determinar los
Ve de los diferentes solutos. Con esos valores
se pueden calcular los correspondientes Kav.
La representación gráfica del coeficiente de
partición en función al logaritmo del peso mo­
lecular se muestra en las figuras 41-4A y 41-
4B. Como puede observarse, la separación de
proteínas a partir de una mezcla, aplicando cro­
matografía por geles filtrantes, será óptima en­
tre valores de Kav 0,2 y 0,8 ya que sólo dentro
de ese rango se observa una pendiente; por lo
tanto, todas aquellas moléculas que eluyen en el
Vo o en el Vt no podrán ser separadas entre sí.
Por todo lo dicho se desprende que no todas
las proteínas contenidas en una mezcla pueden
ser separadas por este método, ya que ello de­
pende exclusivamente de su peso molecular. La
separación óptima de dos o más proteínas de
una mezcla se obtiene cuanto más alejados se
hallen los valores de sus pesos moleculares.
Cuando se requiere la separación de moléculas
de tamaño similar es necesario recurrir a otros
métodos cromatográficos más efectivos (véase
más adelante).
2.2. M atrices
Las propiedades de las matrices más utiliza­
das, tanto en cromatografía convencional como
en la de alta resolución (cromatografía líquida
de alta presión/resolución y cromatografía lí­
quida de alta resolución para péptidos/proteí-
nas: HPLC y FPLC), se detallan en los cuadros
41-2 al 41-5.
Las diferentes matrices comerciales que se
utilizan en la crom atografía convencional se
distinguen por su relativo bajo costo, aunque el
flujo y resolución alcanzados son también ba­
jos. Estas matrices se comercializan en suspen­
sión o en polvo, lo que depende de las caracte­
rísticas de cada matriz, siendo necesaria para su
empaquetamiento una columna de tamaño con­
veniente en relación al volumen de la muestra.
Los valores del flujo (ml/h) que deben apli­
carse a cada gel normalmente se obtienen mul­
tiplicando el flujo lineal listado en el cuadro
41-3, por el área de la columna expresada en

C u ad ro 41-2. Matrices más utilizadas en LSC no adsortiva

E stalnlidad D iám etro ele

las partículas
N om bre M arca C om posición * Presentación pH Temp. C'C) (lím)

E n c ro m a to g ra fía convencional
Bio~Gel A Bio-Rad AG Suspensión 4-13 1-30 40-300
Bio-G el P Bio-Rad PA Polvo 2-10 10-80 40-300
Sephacyl HR Pharm acia DX /PA Suspensión 2-13 1-100 25-75
Sephadex G Pharm acia DX Polvo 2-10 1-100 20-300
Sepharosa Pharm acia AG Suspensión 4-10 1-40 45-200
U ltrogel A IBF AG Suspensión 3-10 2-36 60-140
E n c ro m a to g ra fía d e a lta reso lu c ió n (H P L C y F P L C )
Protein Pak W aters S Colum na emp. 2-8 1-90 10
Shodex Showa Denko s Colum na emp. 3-7,5 10-45 9
Superóse Pharm acia AG Colum na emp. 1-14 4-40 10-13
SynC hropak SynChron S C olum na emp. 2-7 1-60 5-10
Zorbax D upont s C olum na emp. 3-8,5 1-100 4-6
TSK -SW T oyo-Soda s C olum na emp. 3-7,5 1-45 10-13

* L o s sig u ien tes sím b o lo s son u sados para in d icar la c o m p o sició n q u ím ic a d e la m atriz; A G , e n tre cru zam ien lo de ag a ro sa; P A , entrecruza-
m ie n to de poliacrila m id a ; D X , e n tre cru zam ien lo de dex tra n o ; D X /D A , co p o lím ero de alil-d ex tran o y bisacrila m id a ; A G /P A , m ezcla de ag a­
ro sa y p o liacrilam ida; S, Sílica.
 Métodos cromatográficos de fase líquido-sólido 873

Fig. 41-4. R epresentación de la resolución de una Volumen (ml)

m atriz de exclusión m olecular. En (A) se ilustra
un perfil de elución. El com ponente 1 no penetra O 20 40 60 80
dentro de la m atriz y eluye con el Vo de la colum ­
na; el com ponente 2 penetra parcialm ente dentro
d e la m atriz, eluyendo en un determ inado Ve; el
com ponente 3 es incluido totalm ente dentro de la
m atriz, eluyendo en el V t de la colum na. (B ) ilus­
tra la relación sigm oidal entre el Kav y el logarit­
mo del peso m olecular de los com ponentes. Como
se puede o bservar, las m oléculas que eluyen en
V o y el V t no pueden ser separados.

Peso molecular (10^'’)

cm^. Una columna puede ser empaquetada con muestras no pueden tener una concentración
un flujo aproximadamente cinco veees mayor proteica superior a 50 mg/ml y deben ser clari­
al usado durante la corrida cromatográfica. ficadas por centrifugación o filtración antes de
Las matrices para cromatografía de alta reso­ ser aplicadas a la columna para prevenir que el
lución se distinguen por su mayor resolución y material insoluble pueda retardar el flujo de la
rapidez, aunque su costo es mayor (ver más misma.
adelante). Las matrices para cromatografía de
alta resolución usualmente se comercializan en 2.2.1. Propiedades fisicoquím icas
columnas ya empaquetadas, debido a que de­ y estabilidad de las matrices
ben ser armadas a altas presiones. Las colum­
nas analíticas más pequeñas son de alrededor I. S e p h a d e x . E sta m atriz, fab ricad a p o r
de 8 X 300 mm y permiten el sembrado de po­ Pharmacia, es preparada por entrecruzamiento
cos mg de proteínas, operando a un flujo de de dextrano por epicloridrina. El alto contenido
aproximadamente Iml/min. Las columnas más de grupos oxhidrilos hace que el gel sea alta­
largas se utilizan para fines preparativos y son mente hidrofílico. Los diferentes tipos -G de
de aproximadamente de 20 x 300 mm y perm i­ Sephadex difieren en el grado de entrecruza­
ten la siembra de hasta 100 mg de proteína. Las m iento y se denom inan G -10, G-15, G -2 5 ,

C uadro 41-3. Parámetros de las matrices en polvo

Rango de V olum en del Tiem po de

fraccionam iem o g el hidratado hidratación (h) Flujo lineal
N om bre Código (kD) (m l/g) 20"C 90“C (em/h)"-'’

Bio-G el P-60 3-60 14 4 1 5

P -100 5-100 15 4 1 5
P -200 30-200 29 4 1 4
P -300 60-400 36 4 1 3
G -50 2-30 10 3 1 5
G-lOO 4-150 18 72 5 5
G -150 5-300 25 72 5 3
Sephadex G -200 5-600 35 72 5 2

“ L os valores lista d o s co rresp o n d e n a esferas de m alla m ediana.

El flujo lineal in d icad o , es el a p ro p ia d o p a ra u n a óptim a re so lu c ió n cro m a to g ráfic a. E l volum en del flu jo en m l/h se o b tien e m u ltip lic a n d o
el flujo lineal p o r el área de la co lu m n a en cm^.
874 Métodos inmunoquímicos

Cuadro 41-4. Parámetros de las matrices en suspensión

R ango de fraccionam iento Flujo Lineal"
Nom bre Código (líDa) (cm/h)

Bio-G el A -0,5 m <10-500 18

A - l,5 r a 10-1500 18
A~5 m 10-5000 18
Sephacryl S -200 HR 5-600 15
S-300 HR 10-1500 15
S -400 HR 20-8000 15
Sepharosa C L - 6B 10-4000 18
U krogel A6 25-2400 5
A4 55-9000 4
A cA 54 5-79 45
A cA 44 10-130 45
A cA 34 20-350 4
A cA 22 100-1200 25

" El flu jo lineal in dicado, es el ap ro p ia d o p a ra una ó p tim a resolución cro m a to g ráfie a. El vo lu m en del flujo en m l/h se o b tien e m u ltip iiean d o
el flujo lineal p o r el d iám etro d e u n a co lu m n a en cm^.

G-50, G-75, G-lOO, G-150 y G-200 a medida
que dicho entrecruzamiento disminuye, lo que
im plica que los poros de las esferas serán cada
vez mayores. En ello se basa el diferente rango
de fraccionamiento de cada uno de los tipos G.
Las esferas de los Sephadex con alto grado de
entrecruzam iento (G-10, G-15, G-25, G-50 y
G-75) son más rígidas y pueden aplicarse flujos
rápidos, sin correr riesgo de un eiupaqueta-
miento excesivo que im phcaría finalmente un
flujo sumamente lento. Las esferas con un gra­
do de entrecruzamiento menor (G-lOO, G-150
y G-200), son menos rígidas y por ende el flujo
del solvente debe ser más lento (cuadro 41-3).
Los Sephadex, dependiendo del tamaño de las
esferas, se denominan grueso, mediano y fino y
en algunos casos, superfino. El tam año de la
partícula no influye demasiado en su rango de
fraccionamiento pero sí en la resolución, por lo
tanto se aconseja la utilización del tipo G grado
fino. El tipo G superfino sólo se usa para cro­
matografía en capa delgada (TLC) ya que, en
cromatografía en columna, el flujo sería dema­
siado lento. En el cuadro 41-6 se detallan las
características más importantes de los diferen­
tes tipos de Sephadex.
El Sephadex contiene, aunque pocos, grupos
carboxilos, lo que hace que un solvente de baja
fuerza iónica pueda causar interacciones no de­
seadas entre la muestra y la matriz. Por lo tanto
sustancias con carga neta positiva podrán ser
retardadas, mientras que aquellas con carga ne­
ta negativa eluirán en un Ye menor. Estos efec­
tos pueden ser eliminados con el uso de solven­
tes con una fuerza iónica superior a 0,02 M.
Los rangos de fraccionamiento de cada uno
de los tipos de Sephadex no son modificados
por los diferentes solventes crom atográficos,
pero un fraccionam iento puede no coincidir
con lo esperado si se usan sales o detergentes

C u ad ro 41-5. Parámetros de las columnas pre-empaquetadas

P oro diám etro D iám etro largoX R ango

N om bre Código (nm ) (mm) de fra ccio n a m ien to

Protein Pak 60 50 7 ,8 x 3 0 0 1-20

125 125 2-80
300 300 10-500
Shodex W S 802,5 150 8 X 300 4-1,50
W S 803 300 10-700
W S 804 500 10-2000
Superosa 12 - 10x300 1-300
6 - 5-5000
SynChropak 60 60 7,8 X 300 5-30
100 100 5-130
300 300 15-800
5000 500 ■30-2000
TSK G 2000SW 125 7 ,5 x 3 0 0 5-60
G 3000SW 250 1-300
G 4000SW 500 5-1000
Zorbax G F-250 150 9,4 X 250 4-500
G F-450 300 5-900
 Métodos cromatográficos de fase iíquido-sólido 875

Cuadro 41-6. Características de los diferentes tipos de Sephadex

D iám etro A gua em bebida Volumen, de lecho Volum en externo Rango d e
Tipo de la partícula (/Jmj (m l/g) (tnl'/g) (Vo) fra ccionam iento (IcDa)

Sephadex G -IO 40-120 2-3 0,9 0,7

Sephadex G -15 40-120 1.5 2,5-3,5 0,9 1,5
Sephadex G-25
grueso 100-300 2.5 4-6 1-5
medio 50-150 2.5 4-6 L5
fino 20-80 2.5 4-6 1-5
Sephadex G-50
grueso 100-300 5 9-11 1.5-30
m edio 50-150 5 9 -H 1.5-30
fino 20-80 5 9-11 1.5-30
superfino 10-40 5 9-11 1.5-30
Sephadex G-75
fino 40-120 7.5 12-15 3-80
superfino 10-40 7.5 12-15 3-70
Sephadex G-lOO
fino 40-120 10 15-20 4-150
superfino ' 10-40 10 15-20 4-100
Sephadex G -150
fino 40-120 15 20-30 5-300
superfino 10-40 15 18-32 5-150
Sephadex G -200
fino 40-120 20 30-40 5-600
superfino 10-40 20 ' 20-25 5-250

que alteren la eonformaeión de las sustancias a N ,N ’-metilen bisacrilamida unidas covalente­

separar. Los tipos de Sephadex G-IO y G-15
pueden ser utilizados en solventes orgánicos
como dim etilsulfóxido o dim etilform am ida.
Mezclas de agua con baja concentración de al­
cohol pueden ser usadas en los Sephadex tipo
G-10, G-15. G-25 y G-50. Los solventes orgá­
nicos, aunque no dañen la matriz del gel, pue­
den modificar su grado de humectación, por lo
tanto en estos casos se recomienda el uso de
Sepharosa CL (véase más adelante).
El Sephadex es insoluble en todos los sol­
ventes; es estable en agua, soluciones salinas,
solventes orgánicos y soluciones de ácidos y
álcalis débiles. Soluciones altam ente ácidas
pueden hidrolizar las uniones glucosídicas de
la matriz; no obstante, el tratamiento con HCl
0,1 N durante 1-2 horas no produce efectos de-
tectables. Los agentes oxidantes pueden alterar
su matriz.
Todos los tipos de Sephadex se comerciali­
zan en polvo, por lo tanto antes de su uso de­
ben ser adecuadamente hidratados. El tiempo
para una perfecta hidratación, como se indica
en el cuadro 41-3, varía con la temperatura.
El Sephadex hidratado a pH neutro puede ser
esterilizado a 120°C durante 30 minutos. Si se
lo conserva empaquetado en columnas puede
incorporarse al solvente un bacteriostático co­
mo aldheído fórmico al 5% , butanol al 20%, o
azida sódica al 0,05%.
II . S ep h a cryl. E ste gel es fabricado por
Pharmacia y se prepara mediante el entrecru­
zam iento de m oléculas de alil-dextrano con
mente.
El diám etro de las esferas oscila entre 40-
105 |0,m con un promedio de 70 |im, C om o en
el caso del Sephadex, el diferente grado de en­
trecruzam iento producirá diferentes tip o s de
Sephacryl, por ejemplo, S-200, S-300, S-400,
S-500 y S-1000, por ende el rango de fraccio­
nam iento será diferente en cada caso (véase
cuadro 41-4). El Sephacryl usualmente es utili­
zado en solventes acuosos, ya que los orgáni­
cos pueden alterar el tamaño de los poros. Es
insoluble en todos los solventes y puede ser
usado en un rango de pH que oscile entre 3 y
11, ya que a un pH inferior a 3 las cadenas de
dextrano pueden ser hidrolizadas; el Sephacryl
tratado con NaOH 0,2 M durante 100 horas a
temperatura ambiente no presenta alteraciones
en sus características. Puede ser usado en sol­
ventes que contengan SDS y en solventes de
alta densidad como clorhidrato de guanidina 6
M. Puede ser autoclavado en buffer de pH 7 a
120“C.
Dada su estructura quím ica las esferas del
Sephacryl son muy rígidas, por lo tanto colum ­
nas muy altas siguen manteniendo un buen flu­
jo, a diferencia de lo que ocurre con los Sepha­
dex de similar rango de fraccionamiento.
Debido a la alta densidad de la matriz y por
p resen tar algunos grupos carboxilos, el S e ­
phacryl puede presentar problemas de adsor­
ción similares al Sephadex, por lo tanto no de­
be ser usado con solventes de fuerza iónica me­
nor de 0,05 M.
876 Métodos inmunoquímicos

IH . Sepharosa. Es una m atriz también fa­ Sepharosa es desulfatada por hidrólisis alcali­
bricada por Pharmacia y se prepara a partir de na, rindiendo un gel con muy bajos grupos io­
agarosa, la que debe ser previamente purifica­ nizados. Como en el caso de la Sepharosa,
da con el objeto de eliminar los polisacáridos existen tres tipos de Sepharosa CL: CL-2B,
con carga. El gel se forma cuando se enfría la CL-4B y CL-6B.
solución de agarosa previam ente calentada. La Sepharosa CL puede ser usada en un ran­
Existen tres tipos de Sepharosa: 2B, 4B y 6B go de pH que va de 3 a 14. Su estructura es
(2, 4 y 6 indican los porcentajes de agarosa uti- muy similar a la del Sephadex, pero las fibras
lizcidos en cada caso). El rango de fracciona­ que forman el gel son mucho más rígidas. Por
m iento dism inuye a m edida que aum enta el tal motivo se lo puede someter a mayor presión
porcentaje de agarosa usada en la preparación y así obtener un flujo más rápido sin modificar
del gel (véase cuadro 41-4). Es estable en agua las características del gel y la resolución de la
y soluciones salinas, dentro un rango de pH de cromatografía. Así mismo, el volumen de hu­
4-9 y en ausencia de agentes oxidantes. Debi­ mectación con solventes orgánicos no es dife­
do a la presencia de un azúcar poco común, el rente al volumen de humectación con solventes
3,6-anhidro-L-galactosa, la Sepharosa es alta­ acuosos. Puede ser esterilizada por autoclavado
m ente resistente a la degradación enzimática. a 120°C sin cambios aparentes en su estructura.
Si se somete a tem peraturas superiores a los La Sepharosa CI^ es el gel que menos efectos
49°C, puede ser irreversiblemente dañada, por de adsorción presenta.
lo tanto sólo puede ser esterilizada mediante La Sepharosa CL es el gel de elección para
tratamiento químico, por ejemplo con dietilpi- ser utilizado en cromatografía de afinidad (véa­
rocarbonato. se más adelante).
La extraordinaria apertura de la trama de la V. Ultrogel AcA. Estas matrices son fabrica­
Sepharosa permite que ésta sea utilizada para das por IBF por entrecruzamiento de poliacrila­
el fraccionam iento de proteínas de alto peso mida y agarosa. Debido a la rigidez de las partí­
molecular, de hasta 40.000 kD para la sepharo­ culas, las cromatografías realizadas con este gel
sa 2B. Pero la ausencia de estándares de tan al­ pueden ser de un flujo relativamente alto sin
to peso impide la confección de una curva es­ perder resolución (véase cuadro 41-7). La con­
tándar para la correcta caracterización de los centración de poliacrilam ida y agarosa en las
pesos moleculares de las diferentes proteínas a esferas de Lfltrogel varían de acuerdo a cada ti­
separar. po, la AcA34 por ejemplo, contiene 3% de po­
L a Sepharosa contiene, aunque pocos, gru­ liacrilamida (Ac) y 4% de agarosa (A). Debido
pos sulfato y carboxilos que pueden causar, a a su composición química estos geles pueden
b aja fuerza iónica, la adsorción de proteínas ser usados tínicamente entre 2°C y 36“C, por la
básicas. Este efecto puede ser eliminado utili­ tanto no pueden ser esterilizados por autoclava­
zando solventes de fuerza iónica superior a do. El Ultrogel es estable entre pH 3 y 10, de­
0,02 M. biéndose utilizar solventes de un pH dentro de
IV. Sepharosa CL. La Sepharosa CE se pre­ este rango. Altas concentraciones de agentes
para haciendo reaccionar Sepharosa con 2,3- desnaturalizantes, como clorhidrato de guanidi-
dibromopropanol en condiciones fuertem ente na y urea pueden alterar la matriz del gel, sin
alcalinas, produciendo un entrecruzamiento del embargo el clorhidrato de guanidina puede ser
gel que aumenta extraordinariamente su estabi­ usado hasta una concentración 2 M. Los deter­
lidad química, pero manteniendo la porosidad gentes como SDS y Tritón X-100 no producen
del gel original. Luego del entrecruzamiento, la cambios aparentes en la matriz, aunque dentro

C u ad ro 41-7. C'aracterísticas de los diferentes tipos de Ultrogel y Trisacryl

R ango de Lím ite de Tamaño de la

fraccionam iento exclusión partícula Resolución Flujo lineal
Nom bre (kOa) (kDa) (¡im) (plaíos/m ) (cm /h)

T rysacryl GF 05 0 , 2 -2 ,5 3 40-80 2500 4-4,5

Trisacryl G F 2000 10-15.000 20.000 40-80 2500 10
U ltrogel A cA 202 1-15 22 60-140 5000 4-4,5
U ltrogel A cA 54 5-70 90 60-140 2000 4-4,5
U ltrogel A cA 44 10-130 200 60-140 2000 ■4-4,5
U ltrogel A cA 34 20-350 750 60-140 2000 4-4,5
U ltrogel A cA 22 100- 1.200 3.000 60-140 2000 2,5
U ltrogel A 6 24-2.400 4.000 60-140 2000 5
U ltrogel A 4 55-9.000 20.000 60-140 2000 4
U ltrogel A 2 120-23.000 50.000 60-140 2000 3
 Métodos cromatográficos de fase iíquido-sólido 877

de los diferentes tipos de Ultrogeles, los más
estables son AcA 54, AcA 202 y A6.
VI. Trisacryl. Estos geles, manufacturados
por !BF, se diferencian del resto de las matrices
utilizadas en este tipo de cromatografía en que
son totalmente sintéticas, por lo tanto son más
resistentes a la contaminación microbiana. Los
geles de Trisacryl son altamente hidrofílicos
por la presencia de amidas secundarias y gru­
pos alcohólicos prim arios. Son insolubles en
todos los solventes comúnmente usados en cro­
matografía líquida. Son químicamente inertes y
resistentes a los agentes desnaturalizantes co­
mo urea 8 M y clorhidrato de guanidina 6 M, y
a detergentes tipo Tritón X-100 y SDS. El Tri­
sacryl es particularmente resistente a la hidróli­
sis ácida y a las altas temperaturas, por lo tanto
puede ser esterilizado por autoclavado.
Las características crom atográficas de los
dos tipos de Trisacryl que se comercializan se
hallan en el cuadro 41-7.
VIL B io-G el P. Esta matriz, preparada por
BioRad a base de poliacrilamida, es extremada­
mente hidrofílica y casi libre de cargas. Sus
partículas son sumamente homogéneas y son
com patibles con ácidos orgánicos diluidos,
urea 8 M, clorhidrato de guanidina 6 M, agen­
tes caotrópicos y detergentes. Para evitar posi­
bles efectos de adsorción, se recomienda utili­
zar solventes con una fuerza iónica superior a
0,05 M. Solventes orgánicos m iscihles con
agua pueden ser usados hasta un 20% V/V, sin
que las condiciones del gel se alteren. El pH de
los solventes para uso crom atográfico puede
variar entre 2 y 10, pudiéndose trabajar en un
rango de temperatura entre 4 y 80°C. Los Bio-
Gel P pueden ser autoclavados en soluciones
buffer de pH 5,5-6,5. Como los Sephadex, los
diferentes tipos de Bio-Gel P se comercializan
en polvo, por lo tanto, también deben ser co ­
rrectamente humectados antes del armado de la
columna. El tiempo de humectación y tem pera­
tura para los tipo de Bio-Gel P más usados se
hallan en el cuadro 41-3.
VIH . Bio-G el A. Esta matriz, también prepa­
rada por BioRad, está constituida por agarosa
altamente purificada. Provee geles estables y el
volumen del lecho no cambia en gran m edida
con el em pleo de soluciones salinas de alta
concentración y algunos solventes orgánicos
como dioxano o metanol. Puede ser usada en
un rango de pH 4-13. La temperatura a la que
puede operarse es de 2 a 30°C. A temperaturas
mayores pierde consistencia y la congelación
colapsa su estructura.
Las características de los Bio-Gel P y Bio-
Gel A más importantes y su rango de fraccio­
namiento se detallan en el cuadro 41-8.
2.3. Preparación de la muestra
Las muestras no pueden tener una concentra­
ción proteica superior a 50 mg/ml. Deben ser
clarificadas por centrifugación para elim inar
todo material insoluble que pueda disminuir el
flujo de la columna y fundamentalmente conta­
minar la matriz de la misma.
Con el objeto de optimizar la resolución cro-
m atográfica es necesario conocer el volumen
de muestra a sembrar en relación al volumen
de gel. Esta relación se establece sobre la base
de cálculos experimentales previos, entre ellos
el grado de dilución que experimenta en la co ­
lumna un soluto de alto peso molecular. U na
sustancia muy usada con tal fin es el azul de
dextrano 2.000, colorante de peso m olecular
aproximadamente de 2 x 10'^ kDa. Para ello se
siembra un pequeño volumen de colorante en

C uadro 41-8. Características más significativas de los distintos tipos de Bio-Gel P y Bio-Gel A

D iám etro de la partícula R ango de fraccionam ieiito Volumen de lecho hidratado

Producto hidratada (¡.Un) (kD a) (m l/g)

Bio-G el P GDG 90-180 1-6 1

Bio-G el P-2 40-80 0 , 1-1 3,5
Bio-G el P-4 80-1-50 0, 8- 1,8 5
Bio-G el P -6 150-300 1-6 7
B io-G el P-10 150-300 1,5-20 9
Bio-G el P-30 150-300 2,5-40 11
Bio-G el P-60 150-300 3-60 14
Bio-G el P-100 150-300 5-100 15
B io-G el P-150 150-300 15-150 18
B io-G el P-200 150-300 30-200 25
Bio-G el P-300 150-300 60-400 30
B io-G el A 0,5 m 150-300 10-500
B io-G el A 1,5 m 150-300 10-1.500
B io-G el A5m 150-300 10-5.000
B io-G el A 15 m 150-300 40-15.000
Bio-G el A 50 m 150-300 100-50.000
B io-G el A 150 m 150-300 100-150.000
878 Métodos inmunoquímicos
la columna, que luego es eluido. Si se utilizan
geles cuyo límite de exclusión está por debajo
del peso molecular del colorante, el volumen
de solvente que eluye hasta la aparición de co­
lor corresponderá al volumen muerto de la co­
lumna, o sea aquel en el que no habrá elución
de proteínas, y el colorante eluirá en con el Vo
de la columna. La relación entre el líquido co­
loreado eluido y el volumen sembrado corres­
ponde a la dilución que sufre la muestra. Este
valor es muy im portante ya que, si se utiliza
una columna cuyo volumen es inferior a la di­
lución que sufre la muestra durante el proceso
crom atográfico, la resolución de los com po­
nentes no será óptima. No todos los geles dilu­
yen una muestra en la mism a relación por lo
tanto este valor debe calcularse previamente al
uso del gel de interés. En el caso de Sephadex
G -150/200 es aproximadamente 20.
2.4. Solventes cromatográficos
Los solventes usados en la cromatografía de
exclusión molecular deben reunir las siguientes
condiciones: a) el pH debe ser compatible con
las propiedades fisicoquímicas de la matriz del
gel; b) la fuerza iónica debe ser lo suficiente­
mente elevada como para impedir la adsorción
inespecífica del soluto a la matriz por interac­
ciones electrostáticas o uniones Van der Waals,
y dependerá de las características de cada gel.
Como la mayoría de las proteínas son estables
en soluciones salinas, el solvente generalmente
utilizado es solución salina tamponada (NaCl
0,15 M, llevada a pH 7.5 con bujfer de fostato
de sodio).
La mayoría de las proteínas son estables a
tem peratura ambiente y sólo requieren bajas
temperaturas con el objeto de reducir la hidróli­
sis catalizada por algunas enzimas proteolíticas
presentes en la muestra. Por lo general se utili­
za azida sódica 0,02%, lo que evita también la
contaminación de la matriz.
2.5. Problemas comunes a la cromatografía
de exclusión molecular
Para obtener una correcta resolución se deben
tener en cuenta los posibles problemas que pue­
den surgir durante la corrida cromatográfica:
1. M ala resolución. Éste es un problem a
común a la cromatografía por exclusión mole­ 2.6. Aplicaciones de la cromatografía
cular, ya que es inherente al método. Sin em­ de exclusión molecular
bargo, cambios en algunos parámetros opera-
cionales pueden mejorar la resolución. El flujo Las aplicaciones más comunes de la croma­
y la resolución son inversamente proporciona-. tografía de exclusión molecular son:
les, por lo tanto una disminución del flujo pue­
de m ejorar la resolución; pero un flujo muy 1.
lento puede producir difusión de la muestra y lizan geles cuyo tamaño de poro es pequeño.
rendir picos en forma de meseta, por lo que la
muestra corre el riesgo de ser eluida en un vo­
lumen mayor, y la resolución será menor. El
uso de partículas de menor tamaño o de un gel
de rango más limitado pueden mejorar la reso­
lución.
2. Flujo lento. Esto puede deberse a la con­
tam inación del filtro o de m uestras no bien
centrifugadas que contengan partículas en sus­
pensión. La utilización de partículas muy finas,
com o el caso de los S ephadex G -25, G-50,
G-75, G-lOO, G-150 y G-200 superfinos no son
recomendados para ser utilizados en columna
ya que el flujo que se obtiene es muy lento, el
grado más recomendado es el fino. Los geles
una vez utilizados, si se desea mantenerlos em­
paquetados, deben lavarse en flujo reverso con
agentes solubilizantes, como detergentes no ió­
nicos.
3. P icos de fo rm a no deseada. La causa
principal es la incorrecta aplicación de la mues­
tra. Para verificar la calidad de la aphcación, la
muestra puede ser sembrada con un colorante
inerte como azul de dextrano o dicromato de
potasio. Si la corrida presenta un frente irregu­
lar, las moléculas de la muestra eluirán en pi­
cos asimétricos. Las “colas” de los picos gene­
ralmente son el resultado de adsorciones entre
las proteínas de la m uestra y la matriz. Este
problem a puede solucionarse aum entando la
molaridad de la sal del solvente o utihzando sa­
les liotrópicas como perclorato de potasio. En
el caso de la cromatografía de alta resolución
(HPLC o FPLC), las colas pueden deberse a
una pérdida de la sílica de la matriz, situación
que requiere el cambio de la columna. Picos en
forma de meseta pueden ser el resultado de un
equilibrio dinámico entre diferentes estados de
polimerización de la proteína. Cambios en el
pH, tem peratura o solvente crom atográfico
puede llevar el equilibrio a un único estado de
polimerización.
4. Elución de la proteína en un Ve inco­
rrecto. Puede ocurrir por adsorción de la pro­
teína a la matriz del gel y eluir en un Ve no es­
perado o directamente eluir en el Vt de la co­
lumna. Puede añadirse al solvente un detergen­
te no iónico que no absorba a 280 nm o, si la
estabilidad de la matriz y de la misma proteína
lo perm ite, usar clorhidrato de guanidina o
urea.
Desalado de solutos. En este caso se uti­
 Métodos cromatográficos de fase líquido-sólido
Por tal motivo, las proteínas no tendrán acceso
al Vi de la matriz, eluyendo con el Vo de la co­
lumna y sí lo harán las sales que se desean eli­
minar, eluyendo con el Vt de la columna. Las
matrices más utilizadas son los tipos de Sepha­
dex G-10, G-15 y G-25, Trisacryl GF05 y los
Bio-gel P-2 y P-4.
2. Caracterización de pesos moleculares.
Dentro de los métodos cromatográficos, la cro­
matografía de exclusión molecular es el único
que permite calcular el peso molecular de una
proteína dada. Para ello son necesarias proteí­
nas de peso molecular conocido, que se disuel­
ven en un pequeño volumen de solvente y lue­
go se siembran en la columna seleccionada. De
acuerdo al volumen de elución de cada proteína
estandar se calcula el Kav y se confecciona una
gráfica representado el Kav versus el logaritmo
de cada uno de los pesos moleculares, como se
indica en la figura 41-4B.
3. Separación de solutos de pesos molecula­
res diferentes. Es necesario recordar que en este
tipo de cromatografía ningún soluto es retenido
por ]a matriz, por lo tanto la resolución de este
método cromatográfico es poco eficiente.
Para optimizar la resolución de una muestra
se debe tener en cuenta:
a) El peso molecular de la sustancia que se
desea purificar debe ser, por lo menos, la mitad o
el doble del resto de las moléculas de la mezcla.
b) El rango de fraccionamiento del tipo de
matriz a utilizar dependerá del peso molecular
del soluto de interés, cuyo valor debe hallarse
en el punto medio del rango de fraccionamiento
de la matriz seleccionada.
c) Si se utiliza una matriz en polvo, tipo Se­
phadex o Bio-gel P, se debe humectar previa­
mente durante el tiem po adecuado para cada
matriz y luego empaquetar la columna.
En estos casos se debe conocer el volumen
de humectación/peso en g de polvo, dato que
trae el envase de cada matriz. Para el armado de
la columna, la matriz debe estar suspendida en
un exceso de volumen y a medida que el gel de­
canta se debe eliminar el sobrenadante, tenien­
do la precaución de que el gel no forme interfa-
ses. Durante todo el tiempo se debe trabajar a la
misma temperatura, de lo contrario se coire el
riesgo de que se produzcan burbujas dentro de
la columna, en este caso se procederá a su nue­
vo armado. Para m inim izar este problema es
importante degasear previamente los solventes.
d) Como se verá más adelante, a mayor nú­
mero de platos teóricos, mejor será la resolu­
ción del cromatograma, por lo tanto la columna
deberá ser alta y de poco diámetro, por ejemplo
Icm de diámetro por Im de altura.
e) Como se explicó más arriba, toda muestra
sufre una dilución que dependerá del tipo cada
879
F ig . 4 1 -5 . R e p re s e n ta c ió n d e la s e p a ra c ió n d e Ig G y a lb ú ­
m in a h u m a n a s a tr a v é s d e u n a c o lu i r in a d e S e p h a d e x
G -2 0 0 .
matriz. El Vi de la columna nunca deberá ser
inferior a dicho volumen; en general, para una
in áx im a re so lu ció n se u tiliz a una re la c ió n
100:1 (V /V ) de colum na con respecto a la
muestra.
En la figura 41-5 se muestra la separación de
IgG de albúmina, mediante el uso de una co ­
lumna de Sephadex G-200.
3. C R O M A T O G R A FIA
DE IN T ER C A M B IO IÓ N IC O
Y C R O M A T O E N FO C A D O
Las separaciones obtenidas por estas m eto ­
dologías se basan en las características de carga
de las diferentes biomoléculas en solución. D e­
bido a que la mayoría de las biomoléculas co n ­
sisten en subunidades con carga, por ejem plo
aminoácidos, sacáridos y nucleótidos, estas téc­
nicas son aplicables a una am plia gam a de
muestras.
La clave de la resolución obtenida está dada
por la selectividad, determ inada por un gran
número de variables. En cromatografía de in­
tercambio iónico y cromatoenfocado, la selecti­
vidad se basa en las características fisicoquími­
cas del solvente y de las mismas biomoléculas
que van a ser separadas. La utilización de di­
chas variables ofrece innumerables posibilida­
des para resolver los problemas de la separa­
ción y purificación.
3.1. C rom atografía de intercam bio
iónico
3.1.1. Fundamentos
La cromatografía de intercambio iónico tra ­
baja m ediante la unión de biom oléculas con
880 Métodos inmunoquímicos

F ig . 4 1 -6 . In te r a c c ió n e n tre ,
la re s in a in te rc a m b ia d o ra (en
el e je m p lo , u n a re s in a d e in ­
te rc a m b io a n ió n ic o ) y la b io -
m o lé c u la . L a in te r a c c ió n se
r o m p e m e d ia n te el a g re g a d o
d e io n e s sa lin o s.
\ ■

Intercambio aniónico
(ej, DEAE)

O '

%
O

una carga determinada a una matriz estaciona­ 3.1.2. Matrices 31 solventes

ria de carga opuesta (fig. 4]-6). La fuerza de
dicha unión puede ser modificada variando la
concentración salina y el pH de la solución
lampón (buffer) utilizada como eluyente.
La separación de sustancias por resinas de
intercambio iónico se consigue por un m eca­
nismo de adsorción reversible. Consiste en la
fijación inicial a una resina estabilizada de las
sustancias a fijar o unir, seguida de su rem o­
ción. Si las sustancias fijadas tienen diferentes
propiedades eléctricas, mediante la variación
del pH o la fuerza iónica del eluyente se conse­
guirá que cada una de ellas eluya por separado.
Las sustancias se unen a resinas de intercambio
iónico cuando tienen carga opuesta a la de los
iones fijos de la resina siendo esta unión de ti­
po electrostático y reversible.
La matriz puede estar constituida por silicato
de aluminio, resinas sintéticas, polisacáridos
como la celulosa y el dextrano, etc., y la natu­
raleza de los grupos cargados es la que deter-
rnina el tipo y la fuerza del ion intercambiador.
Dentro del grupo de resinas de intercambio ca-
tiónico, las que contienen grupos carboxilos se
denominan de intercambio catiónico débiles, y
las que contienen grupos sulfónicos, fuertes.
Lo mismo ocurre con las resinas de intercam­
bio aniónico: aquellas que contienen grupos
cargados constituidos por derivados diamina-
dos alifáticos o aromáticos se comportan como
intercam biadores débiles, y como fuertes las
que contienen aminogrupos cuaternarios (cua­
dro 41-9).

C uadro 41-9. Tipos de resinas celulósicas de intercambio iónico

D esignación Form a iónica Tipo

A E (a m in o e til-) -0 C H 2 -C H j N H ,+ ' A m ó n ic a
D E A E (d ie tila m in o e til-) -0 2 2
C H - C H N H (C2H ,)2* A n ió n ie a
T E A E (trie tila m in o e til-) -0 2 2 2
C H -C H N íC jH ,) ," H N+ A n ió n ie a
G E (g u a n id o e ti)-) -0 2 2
C H -C H N H -C = N H 2 A n ió n ie a
C M (c a rb o x im e til-) 2
-0 CH C O - 2 C a tió n ic a
S M (su lfa m e li)-) 2
-0 C H S O , C a tió n ic a
S E (su lfo e til-) 2 2
- 0 C H -C H S O , C a tió n ic a
 Métodos cromatográficos de fase líquido-sólido 881

La medida de la cantidad de iones contrarios do, será fácil elegir una resina anióniea o catió­
que puede intercam biar una resina constituye nica según las características de dicho grupo.
su capacidad, la que dependerá del número de En las sustancias anfotéricas, que poseen gru­
grupos cargados que la resina posea. La capaci­ pos cargados positivos y negativos, su carga
dad iónica total estará dada por la cantidad de neta dependerá del pH, pudiendo unirse, según
grupos cargados y potencialm ente cargados, el pH del medio, a resinas aniónicas o catióni-
mientras que la capacidad medible es la deter­ cas. En su punto isoeléctrico (pl), su carga neta
minada experimentalmente y depende de la ac­ será cero y no se fijará a ningún tipo de resina
cesibilidad de los grupos funcionales, de la intercambiadora. Como las proteínas son su s­
fuerza iónica, pH y tem peratura del eluyente, tancias que responden a estas características,
de la naturaleza de los iones contrarios, etc. Pa­ tienen capacidad para fijarse a resinas de am ­
ra las diferentes resinas su capacidad viene in­ bos tipos y podrán ser eluidas con soluciones
dicada en el envase y está expresada en mEq/g de determinado pH según el caso. Lo único que
o en los mg de una proteína determinada capa­ limita la elección es la desnaturalización que
ces de ser fijados por Ig de resina. estas proteínas podrían sufrir en las condicio­
Un intercambiador iónico fuerte es aquel que nes de trabajo (fig. 41-7).
no muestra variaciones en su capacidad inter­ Las resinas pueden ser activadas en form a de
cambiadora de iones (por ej. mmoles C f unidos H+ u OH;. El uso de una resina anióniea o ca­
por mi de gel) con un cambio de pH, ni posee tiónica depende de la carga neta de la proteína
la habilidad de tomar o ceder protones con las al pH del buffer a utilizar. Este debe ser tal que
variaciones de pH. En cambio, un intercambia­ perm ita la m ayor disociación de los grupos
dor iónico débil varía su capacidad de inter­ reactivos de la resina, de modo tal que su capa­
cambiar iones con los cambios del pH. cidad de adsorción sea máxima. Las resinas de
La elección correcta de la resina, en especial intercam bio aniónico interactúan con m olécu­
en lo que se refiere al grupo funcional, depen­ las cargadas negativamente, mientras que las
derá de la carga neta de la sustancia a separar. de intercambio catiónico interactúan con m olé­
Cuando ésta tiene un solo tipo de grupo carga­ culas cargadas positivamente.

a) intercambiador catiónico, b) intercambiador catiónico, c) intercambiador aniónico,

pH 3,0 pH 5,0 pH 11,0

A280 A280 A280

Intercambiador

pH

F ig . 4 1 -7 . C u rv a s d e titu ia c ió n d e tre s p ro te ín a s d is tin ta s y su s e p a ra c ió n p o r c ro m a to g ra fía d e in te r c a m b io ió n ic o . L a s z o ­

n a s re c u a d r a d a s in d ic a n d ó n d e u tiliz a r la s d istin ta s re s in a s .
882 Métodos inmunoquímicos
Las resinas más empleadas en el laboratorio
de inmunoquímica son la Dietilaminoetil Celu­
lo sa (D E A E ) y la C arbo x i M etil C elu lo sa
(CMC), intercam biadoras débiles, que deben
ser activadas previam ente a su uso. Existen
también resinas de intercambio iónico que no
requieren activación previa (D E AE-Sepharo­
sa, D E A E -Sephadex G25, D E A E -Sephadex
G 50, D E A E -S e p h a c e ll). A lg u n as de éstas
combinan la separación por intercambio iónico
con el efecto de tamiz molecular. Para el labo­
ratorio de inmunoquímica que disponga de un
equipo de FPLC, las resinas mas empleadas
son las QSepharosa y la S-Sepharosa (inter­
cam biadores fuertes), de P harm acia (véase
más adelante).
La carga neta de una proteína varía con el
pH, por lo que éste puede modificarse para su
elución según que la proteína se encuentre fija­
da a una resina intercambiadora aniónica o ca-
tiónica. Si se encuentra fijada a una resina ca-
tiónica (donde los grupos intercambiables po­
seen carga positiva) para conseguir su elución
la variación del pH debe ir de su pK ’ 1 al punto
isoeléctrico, y en el caso de que estuviera fijada
a una resina aniónica (grupos intercambiables
con carga negativa), desde su p K ’2 al punto
isoeléctrico. El grado de diferencia entre las
curvas de titulación de dos proteínas indica qué
posibilidad existe de que dichas proteínas pue­
dan ser separadas por crom atografía de inter­
cambio iónico (fig. 41-7).
La elución de una proteína fijada a una resi­
na intercambiadora puede conseguirse también
por variación de la fuerza iónica del eluyente.
A fuerzas iónicas bajas la competición por los
grupos cargados de la resina es mínima, au­
mentando a medida que la fuerza iónica crece,
con lo que se consigue reducir la interacción
entre la resina y la muestra fijada, producién­
dose su elución. En la separación de mezclas
de proteínas que no difieren mucho en su carga
neta, el empleo combinado de variaciones de
pH y fuerza iónica permite obtener una mejor
resolución.
Los gradientes de elución, ya sea de pH o de
fuerza iónica, pueden realizarse en forma conti­
nua o en “saltos” (véase Metodología).
3.2. Cromatoenfocado
3.2.1. Fundam entos
El cromatoenfocado es una técnica analítica
o preparativa empleada para separar biomolé­
eulas de acuerdo a su punto isoeléctrico'(pl).
En un gradiente de pH descendente, una es­
pecie molecular existirá en tres estados de car­
ga: negativo, neutro y positivo. La esencia del
cromatoenfocado es que las moléculas indivi­
duales cambian constantem ente su estado de
carga a medida que se desarrolla el gradiente
de pH (fig. 41-8). Esto produce un efecto de
F i g . 4 1 - 8 . C i c lo q u e r e s u l t a r á e n u n
e fe c to d e e n fo q u e d u ra n te el c ro m a to e n ­
f o c a d o . L a s m o lé c u la s q u e se e n c u e n ­
tra n re tra s a d a s m ig ra n m ás rá p id a m e n te
q u e las d e l fre n te d e e lu c ió n , p ro d u c ie n ­
d o u n e s tr e c h a m ie n to d e la s b a n d a s d e
Eluyente e lu c ió n s e g ú n lo s d ife re n te s p u n to s i s o e ­
es rápido léc tric o s.
 Métodos cromatográficos de fase líquido-sólido
enfocado, favorecido por el flujo del eluyente,
cuya velocidad es mayor que el desarrollo del
gradiente de pH. Las m oléculas que se van
cargando positivam ente son repelidas de la
matriz (que tiene carga positiva) y son llevadas
rápidamente al frente de la zona de la muestra.
En este desplazamiento al frente de la muestra,
las moléculas encuentran un incremento en el
pH. Esto lleva a las moléculas sucesivamente
de su form a positiva a la neutralidad y a su
forma negativa. Cuando las moléculas se car­
gan negativamente, son retenidas por interac­
ción con la matriz, quedando nuevamente re­
trasadas en el flujo. Este intercambio de m olé­
culas entre el frente y la cola de la muestra re­
sulta en un continuo estrecham iento de esta
zona hasta que la muestra eluye de la columna.
En este momento, el pH del efluente de la co­
lumna es aproximadam ente el pl del com po­
nente de interés.
3.2.2. Matrices y solventes
Los geles comúnmente usados son Polybuf-
f e r in te rc a m b ia d o r P B E 94 y M ono P, de
Pharmacia. Este último gel está sustituido con
varias aminas terciarias y cuaternarias, y se uti-
hza con mejores resultados cuando los com po­
nentes de la muestra tienen carga negativa. Los
buffers de elución más comunes son el Poly-
bujfer 96 y el Polybujf'er 74 (Pharmacia) que
contienen numerosas sustancias anfotéricas de
diferentes valores de pKa. Para obtener g ra­
dientes lineales de pKa durante la elución de la
columna se debe ajustar el pH del Polybujfer a
uno ligeramente inferior al de la colunrna pre-
equilibrada.
Componentes cuyos pl difieren hasta 0,02
unidades de pH pueden ser separados. Se pue­
den utilizar intervalos amphos de pH (9-6, 7-4,
etc.) para “screening” de las muestras, e inter­
valos más estrechos, de 0,5 a 2 unidades de pH
para obtener altas resoluciones.
3.3. M etodología
3.3.1. Activación de resinas
de intercambio iónico
Para el caso de las resinas tipo D EAE o
CMC, se debe proceder a su activación previa­
mente a su uso mediante el siguiente procedi­
miento: colocar en un vaso de precipitación 10-
15 g de resina y añadirle 500 mf de NaOH 0,5
N + NaCl 0,5 M. Agitar con agitador magnéti­
co durante 20-30 minutos, decantar el sobrena­
dante y resuspender en 500 mi de NaCl. Agitar
nuevamente y eliminar el sobrenadante; repetir
el procedimiento hasta obtener un pH neutro.
Filtrar- por Buchner sobre papel de filtro grueso
883
de modo de eliminar la mayor cantidad posible
de líquido y resuspender la resina húmeda en
500 mi de HCl 0,5 N. Previa agitación, filtrar
nuevamente por Buchner y lavar con agua des­
tilada hasta neutralidad. Suspender en el buffer
a usar en la elución, pero con una molaridad
5-10 veces superior, agitar, mantener en co n ­
tacto 10-15 minutos y filtrar por Buchner. L a­
var con agua destilada y suspender luego en el
buffer de elución, efectuando cinco recambios
con intervalos de 30 minutos, manteniendo la
agitación. Introducir la resina activada en la co­
lumna cromatográfiea y pasar a través de ella
su buffer de elución hasta que su pH y su con­
ductividad igualen a las del eluido. Esta últim a
operación puede hacerse por agitación d e la
mezcla en recipientes adecuados.
3.3.2. Obtención de gradientes continuos
de elución
Para lograr un gradiente de elución, de m ola­
ridad o pH, puede usarse un dispositivo de va­
sos comunicantes. En el recipiente A se coloca
el buffer de menor molaridad o pH, según el
caso, y en el B, el de mayor molaridad o pH, en
volúmenes iguales. A medida que fluya buffer
del recipiente A por la tubuladura de salida h a­
cia la columna, pasará buffer del recipiente B a
través de la tubuladura comunicante hasta n ive­
lar volúmenes. Si mediante un agitador se ase­
gura la mezcla del contenido del recipiente A,
en él se producirá una variación constante y
progresiva de la molaridad o el pH.
En el caso de trabajar con un equipo tipo
FPLC, el gradiente se regula automáticamente.
El tipo de gradiente es programable, de manera
que se puede establecer el tiempo en el que de­
be aumentarse el porcentaje del buffer de m a­
yor molaridad.
4. C R O M A T O G R A F ÍA D E A F IN ID A D
4.1. Fundamentos
La purificación por cromatografía de afin i­
dad es una de las técnicas más poderosas para
el aislam iento de proteínas. Consiste en una
cromatografía de adsorción en la que se apro­
vecha la especificidad de interacciones biológi­
cas entre proteínas aisladas, como lo es la inte­
racción antígeno-anticuerpo, enzima-inhibidor,
hormona-receptor, lectina-hidrato de carbono,
etc. M ediante la insolubilización de uno de los
reactivos se consigue una sustancia fijadora in­
soluble con afinidad biológica para la sustancia
a ser purificada. Es requisito indispensable que
el componente insolubilizado retenga su cap a­
cidad de unión específica.
884 Métodos inmunoquímicos

La purificación por cromatografía de afini­
dad puede ser dividida en tres pasos principa­
les: 1) preparación de la m atriz fijadora; 2)
unión de la sustancia a purificar a la matriz fi­
jadora; 3) elución de la sustancia a purificar.
En el primer paso, se fija el ligante (anticuer­
pos monoclonales o policlonales, o antígenos
según el caso) en forma covalente a una matriz
insoluble. Luego de la preparación de la matriz,
se realiza la unión no covalente de la sustancia
a purificar (ligando), y las m acrom oléculas
contaminantes se eliminan por lavado. En un
tercer paso, la interacción ligando-ligante (por
ejemplo, antígeno-anticuerpo) se rompe tratán­
dolos con condiciones a veces drásticas, produ­
ciéndose la elución de la sustancia a purificar.
Los factores que contribuyen al éxito de una
purificación por afinidad son varios. Los tres
más importantes son la concentración relativa
inicial de la sustancia a purificar, la afinidad
del ligando por el ligante (ej.: anticuerpo por el
antígeno), y la facilidad con que la interacción
puede ser desplazada,
La concentración relativa de la sustancia a
ser purificada es el punto más im portante a
considerar para determinar la pureza del pro­
ducto final. El grado de purificación obtenible
es limitado, y el uso de columnas de afinidad
tiene algunos problemas de inespecificidad. Si
el producto a crom atografiar se encuentra en
muy bajas proporciones en la muestra, esta me­
todología debe ser acompañada de pasos pre­
vios de enriquecimiento.
Debido al carácter de este libro, esta metodo­
logía se enfocará hacia la separación de antíge­
nos o anticuerpos. La afinidad del anticuerpo
por el antígeno debe ser también considerada,
ya que determinará la cantidad de antígeno que
puede ser obtenida de una muestra. Para anti­
cuerpos de alta afinidad (Ka >10** M^‘), un buen
resultado puede ser obtenido en menos de una
hora. Aun en altas concentraciones de anticuer­
po, si estos son de baja afinidad (Ka < 10‘^M'),
nunca se podrá remover todo el antígeno de la
muestra, la unión del antígeno será dificultosa, y
se perderá parte de lo unido durante los lavados.
El tercer factor que influenciará el resultado
de una purificación por afinidad es la facilidad
relativa con que un antígeno pueda ser eluido.
El anticuerpo ideal a ser utilizado en cromato­
grafía de afinidad es aquel que posea una alta
afinidad por el antígeno y cuya unión pueda ser
revertida por métodos suaves y simples como
por ejemplo, una variación en el pH, en la fuer­
za iónica, o por competencia. Las condiciones
de elución no deberán afectar las propiedades
biológicas de la sustancia que se desea purificar.
4.2. M atrices y solventes
La naturaleza de la matriz a la que se fijan
los ligandos es muy importante, ya que en las
condiciones experim entales debe ser física y
químicamente estable, no debe actuar como ta­
miz molecular y además debe asegurar un buen
flujo durante la elución.
Existen numerosas matrices comerciales dis­
ponibles en su forma activada o sin activar para
ser utilizadas como soporte para el anticuerpo o
antígeno específico (cuadro 41-10). Asimismo,
el inmunoadsorbente puede ser preparado en el
laboratorio mediante la insolubilización de pro-

C uadro 41-10. Algunas matrices aptas para su activación

Rango R ango de Grupos de Ejem plos
Matriz. E stabilidad quím ica depH tem peratura copulación A ctivadores comercicdes

A g a ro s a M a la . E v ita r a g e n te s c a o tró - 4 -1 0 4 - 3 0 “C -O H B ro m u ro d e c ia n ó - B io -G e l A (B io -
p ic o s , e x p o s ic ió n p r o lo n ­ geno Rad)
g a d a a u re a o g u a n id in a C a rb o n ild iim id a z o l S e p h a ro s a (P h a r­
m a c ia )
U ltra g e l A (IB E )
C ross-linked B u e n a . E v ita r e x p o s ic ió n 3 -1 4 4-1 2 0 » C -O H B ro m u ro d e c ia n ó - S e p h a ro s a C L
a g a ro sa p ro lo n g a d a a a g e n te s c a o - geno (P h a rm a c ia )
tró p ic o s C a rb o n ild iim id a z o l
C lo ru ro d e to silo

P o lia c rila m id a E x c e le n te . Á lc a lis fu e rte s 2 -1 0 4 - 1 2 0 “C -N H j G lu ta ra ld e h íd o B io -G e l P (B io -

c o n v ie rte n las a m id a s en Rad)
c a rb o x ilo s
C o p o lím e ro s M a la . E v ita r a g e n te s c a o tró - 4 -1 0 4-30»C -O H B ro m u ro d e c ia n ó - U ltra g e l A c A
d e p o lia c ri­ p ic o s , e x p o s ic ió n p r o lo n ­ -N H j geno (IB F )
la m id a y g a d a a u re a o g u a n id in a C a rb o n ild iim id a z o l
a g a ro s a G lu ta ra ld e h íd o
P o lia c rílic o E x c e le n te . Á lc a lis fu e rte s <1-11 - 2 0 - l 2 G “C -O H B ro m u ro d e c ia n ó - T ris a c ry l (IB F )
c o n v ie rte n la s a m id a s en geno
c a rb o x ilo s C a rb o n ild iim id a z o l
C lo ru ro d e to silo
 Métodos cromatográficos de fase iíquido-sóiido
Cuadro 41-11. M étodos de copulación de anticuerpos a matrices
¿A nticuerpo copulante en el
M étodo Variantes orientado?
Proteína A U nión directa Sí
U nión m ediante anti- Sí
cuerpos anti-lg
M atrices activadas C arbonildiim idazol No
B rom uro de cianógeno No
Glutaraldeliído No
H idrox i succinim ida No
Cloruro de tosilo No
A nticuerpos activados Carbodiim idas No
A gentes condensantes No
G lutaraldehído No
P eriodato Sí
A nticuerpo biotiniiado No
M atriz estreptoavidina
teínas, por ejemplo mediante el empleo de glu­
taraldehído (véase Metodología).
Existen numerosos métodos que pueden ser
utilizados para unir covalentemente anticuer­
pos a una matriz de fase sólida que pueden ser
divididos en tres clases: 1) geles de proteína
A/G; 2) geles activados; 3) anticuerpos activa­
dos. Los métodos más titiles son aquellos que
utilizan matrices que ya han sido modificadas
para que contengan reactivos secundarios que
unan específicamente a los anticuerpos. Una de
las matrices más utilizadas es la de proteína A
del estafilococo. Ésta une específicamente el
Fe de los anticuerpos, y luego de la unión del
anticuerpo se estabiliza por cross-linking o en­
trecruzamiento con un reactivo de unión bil\m-
cional. El segundo tipo de método directamente
une el Ac a una resina activada, por ejemplo
Sepharosa CL 4B activada con CNBr. El tercer
método de unión consiste en activar en primer
lugar al anticuerpo, colocando el grupo reacti­
vo en el anticuerpo soluble, para unirlo a la
matriz insoluble. Los diferentes métodos de co­
pulación se resumen en el cuadro 41-11.
En cuanto a los solventes empleados, depen­
derán del método a utilizar. En general, se pue­
de decir que el solvente empleado para la fija­
ción del ligando difiere en su pH o concentra­
ción salina del que se utiliza para su elución.
4.2.1. Unión de anticuerpos a geles
de proteína A/G para la separación
de antígenos
Dentro de las utilizadas para la purificación
por cromatografía de afinidad, las matrices de
proteína A/anticuerpo son una de las más ver­
sátiles. Las columnas son fáciles de preparar, y
885
G rupo
anticuerpo Ventajas D esventajas
B uena orientación C aro
Fácil
-NH^ Económ ico El anticuerpo p u ed e
-NHj D isponibles en resultar d añado
fo rm a com ercial en la unión. M tíl-
-NHj tiples pasos p a ra
~ N H ,, ~SH activar y u n ir
- N H j,- C O O H E conóm ico El anticurpo p u e d e
resultar d añado
-N H , en la unión. M ú l­
A zíicar tiples pasos p a ra
activar y unir
-N H , U nión en solución C aro
debido a que las moléculas de anticuerpo se
unen por el Fe, el sitio de combinación con el
antígeno se encuentra orientado correctamente.
Los anticuerpos pueden ser unidos directa­
mente a la proteína A, o ser unidos mediante
un interm ediario (un anticuerpo anti-inmuno-
globulina). Aquellos anticuerpos cuyo Fe posea
alta afinidad por la proteína A pueden ser uni­
dos directam ente; aquellos con baja afinidad
requieren del interm ediario. U na vez que los
anticuerpos se han unido a la proteína A, deben
ser entrecruzados covalentemente a la m atriz
con cualquier reactivo bifuncional. El más u ti­
lizado es el dim etilpimelim idato (DMP), que
tiene la ventaja de su bajo costo y fácil manejo.
Los dos grupos del DMP se unen a aminos li­
bres, por lo que anticuerpos con grupos aminos
libres en el sitio de coml3Ínación con el antíge­
no no pueden ser unidos mediante este tipo de
reactivos. Otros grupos bifuncionales de d ife­
rentes largos pueden ser utilizados para el en­
trecruzamiento.
Debido a que la proteína A posee diferente
afinidad para las inmunoglobulinas de distintas
especies, clases y subclases, podría no ser p o si­
ble unir una alta concentración de cualquier an­
ticuerpo a matrices de proteína A. Esto podría
ser subsanado utilizando matrices de proteína
G del estreptococo, utilizando un anticuerpo in­
term ediario, o ajustando las condiciones de
unión a la matriz (como sería el caso de unión
de IgG, de ratón). Las columnas de proteína G
se preparan de manera idéntica a las de proteí­
na A, pero tienen distinta afinidad por las dis­
tintas subclases de inm unoglobulinas, segíin
puede verse en el cuadro 41-12.
Una precaución que debe ser observada es
que, si la muestra de antígeno a purificar con-
886 Métodos inmunoquímicos
C u a d ro 41-12. A finidad de la proteína A/G
por anticuerpos de distintas especies
A finidad A finidad
Especie p o r proteína A p o r proteína G
H um ano ++++ ++++
C aballo ++ ++++
V aca ++++
Cerdo +++ +++
O veja +/- ++
C abra ++
C onejo
Pollo
H ám ster + ++
Cobayo ++++ ++
R ata + /~
Ratón ++
tiene anticuerpos de mamíferos, estos serán se­
parados junto con el antígeno.
4.2.2. Inmunoadsorbentes preparados
con Sepharosa
Es posible ligar covalentemente a las distin­
tas Sepharosas comerciales toda clase de pro­
teínas y sustancias que contengan grupos ami-
nos primarios. El método empleado para acti­
var una de las Sepharosas comerciales, la Se-
p h a ro sa CL 4B, es m edian te el em pleo de
CNBr. Si bien el mecanismo de reacción con el
CNBr y la Sepharosa no es bien conocido, se
presume que es debido a la formación de imi-
nocarbonatos acíclicos y cíclicos. É stos, al
reaccionar con los aminogrupos primarios de
las proteínas ligantes, originan uniones cova-
lenles, las que aseguran una unión estable.
Existen en el comercio derivados de la Se­
pharosa 4B, conocidos con los nom bres de
A U -Sepharosa 4B y CH -Sepharosa 4B, que
contienen grupos aminos y carboxilos libres,
respectivamente. Ello permite que ligantes con
grupos carboxilos o am inos, según el caso,
puedan ser unidos a la matriz insoluble, utili­
zando para ello la formación de una unión pep-
tídica mediante el empleo de carbodiimidas.
Los productos comerciales tienen además la
ventaja de que los grupos amino y carboxilos
están separados de la matriz por cadenas de 6
átomos de carbono (brazos espaciadores), lo
que aumenta la capacidad fijadora del imnu-
noadsorbente. Esta mayor separación entre li­
gante y matriz elimina algunos impedimentos
estéricos que pueden ocurrir cuando aquél se
une directam ente a la matriz insoluble, espe­
cialmente si son sustancias polianiónicas.
Para la purificación de proteínas de mayor o
menor PM se usan Sepharosas con distinto gra­
do de cross-línking o entrecruzamiento.
4.2.3. Columnas de afinidad preparadas
con anticuerpos activados
Los anticuerpos purificados pueden ser acti­
vados por tratamiento con reactivos bifuncio-
nales, con uno de los grupos unido al anticuer­
po y el otro libre para unirse a la matriz insolu-
ble. Los reactivos comúnmente usados para la
unión indirecta son: carbodiimidas solubles en
agua, agentes condensantes usados para la sín­
tesis de péptidos (como la N-etoxicarbonil-2-
etoxi-1,2- dihidroquinolina), glutaraldehído o
periodato. Luego de la activación pueden ser
unidos a las distintas matrices insolubles. Las
proteínas activadas con carbodiimidas o agen­
tes condensantes se unirán a ácido carboxílico,
mientras que las activadas con glutaraldehído o
periodato se unirán a aminas.
La principal ventaja que ofrece esta metodo­
logía es que permite la elección de una amplia
variedad de geles con diferentes espaciadores,
coinbinaciones que pueden ser importantes o
esenciales para purificaciones específicas. La
única excepción son los anticuerpos activados
con periodato.
4.2.4. Cromatografía de afinidad
con lectinas
La utilización de lectinas como reactivos p a­
ra la purificación de fracciones de glucoproteí-
nas o para la caracterización de los azúcares
terminales de distintas sustancias hidrocarbo-
nadas comenzó a popularizarse a principios de
la década del ’80. Las lectinas son proteínas
provenientes de plantas, aunque existen ejem ­
plos de lectinas provenientes de otras fuentes,
que tienen la característica de unirse con distin­
ta afinidad a determinadas secuencias de hidra­
tos de carbono, más específicamente a los azú­
cares terminales. El grado de afinidad varía se­
gún el tipo de unión entre los monosacáridos,
pero se puede decir que en general la afinidad
es alta para su secuencia específica de hidrato
de carbono. La desorción de las lectinas se rea­
liza siempre por competencia con el azúcar es­
pecífico y, como el volumen requerido para la
desorción es pequeño, ocurre una concentra­
ción de la glucoproteína que se quiere purifi­
car. Se debe tener en cuenta, sin embargo, que
la cromatografía de afinidad con lectinas rara­
mente es suficiente para la purificación de una
g lu co p ro teín a determ in ad a, y que debe ser
acompañada de procesos previos de enriqueci­
miento.
Lectinas con diferente afinidad pueden ad­
quirirse insolubilizadas por unión a Sepharosa
y conjugadas a enziinas, para ser utilizadas pa­
ra cromatografía de afinidad o para detección
de azúcares terminales.
 Métodos cromatográficos de fase líquido-sólido 887

Cuadro 41-13. Algunos reactivos de elución utilizados en cromatografía de afinidad

Solución
Reactivo Soluciones sugeridas Solución de Lavado de recolección R eu tiliza ció n

A lto pH 100 m M trietilam ina, pH 11,5 10 m M fosfato, pH 8,-0 1/20 vol IM fosfato pH 6,8 F recuente
100 m M fosfato ácido, pH 12,5 10 m M fosfato, pH 8,0 1/20 vol IM fosfato pH 6,8 O casional
Bajo pH 100 m M glicina, pH 2,5 10 m M fosfato, pH 6,8 1/20 vol IM fosfato pH 8,0 Frecuente
100 m M glicina pH 1,8 10 m M fosfato, pH 6,8 1/20 vol IM fosfato pFI 8,0 O casional
A lta cc de sal 5 M LiC 1, 10 mM fosfato pH 7,2 10 m M fosfato, pH 7,2 N inguno F recuente
3,5 M gCl^ 10 m M fosfato pH 7,2 10 m M fosfato, pH 7,2 N inguno F recuente
D etergen 1:es ió­ 1% SDS solución neutra N inguno No
nicos 1% D O C solución neutra N inguno A lguna
A gentes diso­ 2 M urea solución neutra N inguno O casional
ciantes 8 M urea solución neutra Ninguno No
2 m guanidina solución neutra N inguno A lguna
A gentes caotró- 3 M tiocianato solución neutra N inguno A lguna
picos
Solventes o rgá­ 10 % dioxano solución neutra N inguno F recuente
nicos 50% etilenglicol, pH 11,5 solución neutra N inguno F recuente
50% etilenglicol, pH 8,0 solución neutra N inguno F recuente
A gua solución neutra N inguno F recuente

4.3. Solventes precipitados, al igual que una cromatografía de

El solvente a ser utilizado para la elución de
la proteína fijada a una colum na de afinidad
dependerá del sistema empleado. En el cuadro
41-13 se muestran algunos de los solventes re­
comendados.
4.4. M etodología
4.4.1. Obtención de inmunoadsorbentes
po r insolubilización de proteínas
Un método muy utilizado es la polimeriza­
ción de proteínas con glutaraldehído, la cual se
facilita trabajando a pH próximo al punto isoe­
léctrico de la proteína. Para albtjminas es reco­
mendable el buffer aceto/acético 0,2 M, pH 5,0
y para gamaglobulinas, buffer de fosfato 0,2 M,
pH 7,0.
Para la polimerización, colocar en un vaso
de precipitación los mililitros de proteína a pro­
cesar (solución de 40 mg/ml en el buffer co­
rrespondiente). Añadir glutaraldehído al 2,5%
en el mismo buffer con agitación constante, en
un volumen igual al 20% de la solución protei­
ca. Dejar a 4“C durante 24 horas hasta comple­
tar la gelificación. Formado el gel, se rom pe
con un homogeneizador de tejidos, se lo lava
varias veces con solución salina, con buffer de
disociación, y finalmente con la solución en la
que se solubilizará el producto a adsorber.
Para preparar las columnas de adsorción y
con el objeto de evitar el empaste, es conve­
niente m ezclar el inm unoadsorbente con una
pequeña cantidad de Sephadex G-25, polvo de
vidrio u otro material inerte. La adsorción pue­
de hacerse también por agitación en un vaso de
intercambio iónico.
Teniendo en cuenta que durante la polim eri­
zación sólo quedan expuestos aproxiinadamen-
te un 10% de los determinantes antigénicos de
la proteína, cuando se hagan cálculos de n ece­
sidades de antígeno para una determinada can­
tidad de anticuerpos a adsorber, éstas deben
ser 10 veces superiores a las correspondientes
a la zona de eciuivalencia determinada por cu r­
va de precipitación. Como en medios líquidos
para la mayoría de las proteínas antigénicas de
pesos moleculares 50-200 kD, la relación ó p ti­
ma mg Ac/mg Ag es aproximadamente 10, si
están polimerizadas, dicha relación no debe ser
superior a 1.
Las proteínas p o lim erizadas pueden fija r
grupos químicos, como dinitrobenceno (DNP),
sulfanil-azo, p-aminobenzoico, etc., y adquirir
especificidad para ellos.
Los inmunoadsorbentes preparados con p ro ­
teínas polimerizadas, previa desecación por lio-
filización y pulverización por trituración en
mortero de vidrio, pueden conservarse en reci­
piente cerrado, a 4“C. Antes de su uso, deben
humectarse convenientemente.
4.4.2. Unión del anticuerpo específico
a matrices de proteína A en form a directa
Esta técnica puede ser em pleada para unir
anticuerpos monoclonales murinos de las sub­
clases IgG2a, IgG2b e IgG3 y anticuerpos p o li­
clonales de ratón, conejo, humano, caballo, bu­
rro, cerdo, cobayo, perro o vaca.
1. Unión del anticuerpo a la proteína A. Los
anticuerpos con alta afinidad por la proteína A
888 Métodos inmunoquímicos

pueden ser unidos desde suero, sobrenadante 1. Unir el anticuerpo con especificidad anti-
de cultivo, ascitis o soluciones purificadas. Si inm unoglobulina al gel. Si los anticuerpos a
es fundamental conocer la concentraci(5n exac­ unir no fueron purificados previamente, saturar
ta de anticuerpo unido, éste debe ser purificado el gel de p ro teín a A (aproxim adam ente 20
previo a su uso. Unir 2 mg de anticuerpo por mg/ml). Si el anticuerpo a unir fue previamente
ml de gel humectado. Si se utilizan anticuerpos purificado por afinidad, emplear 2 mg/ml.
con baja afinidad, utilizar concentraciones ma­ 2. Agregar el anticuerpo específico en exce­
yores. Mezclar la solución de anticuerpo con el so, ya que la recuperación final del mismo esta­
gel en un vaso de precipitado con agitación rá dada por la cantidad de anticuerpo anti-in-
suave durante una hora a temperatura ambien­ munoglobulina que se haya unido en el primer
te. No utilizar una columna en este paso. paso. Mezclar en un vaso de precipitados e in­
2. Lavar el gel dos veces con 10 volúmenes cubar durante una hora a temperatura ambiente
de borato de sodio 0,2 M pH 9,0 por centrifu­ con agitación suave. Este paso puede realizarse
gación a 3000g durante 5 minutos. en columna, ya que se trabaja en exceso de an­
3. Resuspender el gel en 10 volúmenes del ticuerpo.
mismo bujfer de lavado. Guardar el equivalente
a 10 (xl de gel. Agregar DMP (dimetilpimelimi­ Los siguientes pasos son iguales a los ya in­
dato) en droga sólida para llevar a una concen­ dicados anteriormente (2 a 7) para la unión di­
tración final de 20 mM (el pH de la solución de recta del anticuerpo.
reacción debe ser mayor de 8,3).
4. Incubar durante 30 minutos a temperatura 4.4.4. Activación de Sepharosa CL- 4B
ambiente en un agitador. Guardar el equivalen­ con CNBr
te a 10 |J,1 de gel.
5. La reacción se detiene por lavado del gel Precaución: ésta técnica debe ser realizada
en etanolamina 0,2 M pH 8,0. Incubar durante bajo campana con extractor de aire y en un am ­
dos horas a temperatura ambiente con agitación biente bien ventilado, ya que el CNBr es extre­
suave en el mismo buffer. madamente tóxico.
6. Luego del lavado final resuspender el gel Lavar 30 ml de Sepharosa 4B con agua des­
en buffer fosfato/salino adicionado de 0,01% tilada y resuspenderla hasta un volumen final
de mertiolate o azida sódica. de 50 ml. Enfriar en baño de hielo y bajo cam­
7. C ontrolar la eficiencia de la unión por pana con extractor añadir un volumen igual,
SDS-PAGE al 10% en condiciones reductoras, e n fria d o , de C N B r en agu a d e s tila d a (50
hirviendo las muestras reservadas en su m o­ mg/ml). Mantener el pH a 11-11,5 por añadido
mento en buffer muestra. Correr el equivalente de NaOH 2N; controlando perm anentem ente
de Ifil de la muestra tomada en el punto 3 y 9 con pH-metro. La reacción se ha completado
jj,l de la muestra tomada en el punto 4. cuando el pH se mantiene constante sin añadi­
do de nuevas cantidades de álcali. Las partícu­
Si el anticuerpo que se desea unir es de la las de Sepharosa activada se lavan con agua
subclase IgG, de ratón, se deben observar las destilada fría, usando un filtro de vidrio poroso,
siguientes modificaciones: y luego con buffer frío de carbonato/bicarbona­
to o borato 0,1 M pH 8,3, conteniendo NaCl
1. Ajustar el pH de la solución de anticuer­ 0,5 M.
po a pH 9,0. Medir el volumen y agregar ClNa
para ajustar la concentración a 3 M. Controlar 4.4.5. Fijación de ligante a Sepharosa
el pH y volver a ajustar de ser necesario. Unir 4B activada con CNBr
el anticuerpo al gel. En estas condiciones, la
proteína A unirá aproximadamente 2-5 mg de Este gel puede ser adquirido ya activado, o
anticuerpo por ml dé gel. activarse según se indicó más arriba.
Los pasos siguientes son iguales a los ya in­
dicados para otros isotipos, con la salvedad de 1. Separar el gel de Sepharosa activada por
que el buffer de lavado del punto 2 consiste en centrifugación y añadirle un volumen igual de
borato de sodio 50 mM, NaCl 3 M pH 9,0. b u ffe r c a rb o n a to /b ic a rb o n a to 0 , 1M pH
8,3/NaCl 0,5 M conteniendo 5-10 mg de pro­
4.4.3. Unión del anticuerpo específico teína a fijar por cada 1 ml de gel. Mezclar por
mediante el empleo de un anticuerpo agitación en un rotor durante 2 horas a tempe­
intermediario ratura am biente o durante toda una noche a
4°C. No debe usarse agitador magnético.
Anticuerpos de cualquier fuente (suero, asci­ 2. Centrifugar, lavar con el mismo buffer y
tis, sobrenadante de cultivo, etc) pueden ser luego con glicina 0,2 M, pH 8,5 durante 2 ho­
unidos mediante esta metodología. ras, con el objeto de bloquear los grupos acti­
 Métodos cromatográficos de fase líquido-sólido 889

vos residuales. Otra alternativa es suspender el aconsejable toda una noche en la refrigeradora
gel durante dos horas en buffer de Tris pH 8,0. o a temperatura ambiente.
3. Centrifugar, lavar con el buffer de fija­ 3. El producto final deberá ser lavado alter­
ción, luego con buffer acetato 0,1 M pH 4, con­ nativamente con buffer de pH alto y bajo, como
teniendo NaCl 0,5 M, seguido de buffer de fija­ se d escrib ió en Sepharosa 4B activada con
ción. El conjugado de Sepharosa/pmteína- está CNBr. Si para la fijación se usó m ezcla de
en condiciones de ser usado para la adsorción. agua y solvente orgánico, ésta debe emplearse
Puede conservárselo a 4“C. para el lavado final del producto. Lavar luego
Mediante ensayos piloto, utilizando alícuotas con agua destilada y finalmente con el buffer a
de Sepharosa 4B activada con CNBr y cantida­ usar en la cromatografía de afinidad.
des variables de proteína, puede establecerse
cuál es la concentración óptim a de ésta para Para la conservación del inm unoadsorbente
conseguir el máximo de fijación en las condicio­ es recomendable un buffer neutro o de pH lige­
nes ya indicadas. Determinando la concentra­ ramente ácido, adicionado de NaCl IM, y una
ción proteica de los sobrenadantes por lectura de tem peratura de 4®C. C onviene incorporar un
la DO a 280 nm, en comparación con los valo­ agente bacteriostático.
res de la solución proteica inicial, pueden calcu­
larse los correspondientes porcentajes de unión. 4.4.7. Fijación y elución de anticuerpos
en la cromatografía de afinidad
4.4.6. Fijación de ligantes a AH-Sepharosa
4B y CH-Sepharosa 4B La fijación de los anticuerpos puede hacerse:
a) por mezcla en recipiente adecuado del inm u­
La cantidad requerida de polvo de AH-Sep- noadsorbente con el antisuero, agitando con
harosa 4B o CH-Sepharosa 4B se mezcla con agitador magnético durante dos horas a 4°C, o
NaCl 0,5M y agita durante 15 minutos, filtran­ b) haciendo pasar el suero por una colum na
do luego por medio de filtro de vidrio poroso. crom atográfiea arm ada con el inm unoadsor­
Se continúan los lavados con la misma solu­ bente. Antes de la fijación del ligando, el inm u­
ción (aproximadamente 200 mi por gramo de noadsorbente debe ser estabilizado con buffer
material seco) y luego con agua destilada ajus­ de fosfatos 0,1M pH7, NaCl 0,25-0,5 M, ad i­
tada a pH 4,5 (aproximadamente 50 mi por gra­ cionado de Tween 20 al 1% para reducir las ad­
mo de Sepharosa). sorciones proteína-proteína no específicas.
La carbodiim ina a usar en la fijación debe Conviene diluir el producto a cromatografiar
ser soluble en agua, siendo una de las más em ­ en partes iguales con un buffer similar al ante­
pleadas el clorihidrato de N -etil-N ’-(3-dimeti- rior pero de doble concentración.
laminopropil) carbodiimina. Para la reacción, U na vez term inada la adsorción el in m u ­
es aconsejable carbodiimina a la concentración noadsorbente debe ser lavado con solución sa­
final de 10 mg por mi de gel. lina fosfatada hasta que los sobrenadantes o
La fijación del ligante a la matriz se efectúa eluidos no den lecturas de DO a 280 nm, con el
en agua destilada ajustada a pH 4,5-6. Si el li­ objeto de asegurar la eliminación de cualquier
gante no es soluble en agua, puede ser añadido proteína no fijada específicamente.
dioxano purificado o etilenglicol hasta concen­ La elución de los anticuerpos puede hacerse
tración final del 50% a la solución de fijación. con buffer glicina-HCl 0,1M pH 2,9, solucio­
En estos casos es conveniente controlar el pH nes de NaCl 2M o NaSCN 4M, o soluciones de
con papel indicador pues los solventes orgáni­ los correspondientes haptenos a concentración
cos pueden dañar los electrodos. 0,1M pH 7,4. Ein todos los casos las soluciones
de anticuerpos eluidas deben ser dialisadas en
1. Disolver el ligante en la solución de fija­ solución salina fosfatada, efectuando num ero­
ción controlando el pH. La concentración de sos recambios. El producto de diálisis debe ser
aquél debe ser en exceso respecto de la concen­ centrifugado a lO.OOOg para eliminar la p roteí­
tración de grupos reactivos de la matriz. Añadir na desnaturalizada y luego ha de ser co n v e ­
la solución de ligante al gel (una relación líqui- nientemente concentrado.
do/gel de 2:1 permite una adecuada agitación)
ajustando el pH entre 4,5 y 6. 5. CROMATOGRAFÍA
2. Añadir la carbodiimida en polvo, por p e­ POR INTERACCIÓN HIDROFÓBICA
queñas cantidades, o disuelta en agua a pH 4,5, Y EN FASE REVERSA
mezclando por agitación. El pH de la mezcla
reactiva decrece durante la primera hora, sien­ 5.1. Fundamentos
do necesario ajustarlo por el añadido de peque­
ñas cantidades de solución diluida de NaOH. Las interacciones hidrofóbicas son un fen ó ­
El tiempo de reacción depende del sistema. Es meno de gran significancia biológica siendo
890 Métodos inmunoquímicos
una de las principales fuerzas que estabilizan la
estructura tridimensional de las proteínas. Las
interacciones de este tipo participan en el man­
tenimiento de la estructura de la bicapa lipídica
en las membranas biológicas y en las uniones
antígeno-anticuerpo y enzima-sustrato.
La hidrofobicidad puede definirse como la
repulsión entre un com puesto no polar y un
medio polar como podría ser el agua. Las inte­
racciones hidrofóbicas no constituyen uniones
de grupos hidrofóbicos entre sí, sino que estas
interacciones son “forzadas” sobre compuestos
no polares por el medio polar que los rodea.
Podemos decir, entonces, que son las molécu­
las del agua las que “fuerzan” las interacciones
hidrofóbicas entre moléculas no polares disuel­
tas en una solución acuosa. Si variásem os la
composición de la solución acuosa disolviendo
en ésta sales o solventes orgánicos, las interac­
ciones hidrofóbicas se verían afectadas de al-
glín modo. Las sales, al disolverse en agua,
producen una disminución de la capa de solva-
tación que rodea a las moléculas en solución;
de esta forma, se produce una disminución de
las interacciones hidrofílicas lo que favorece la
interacción hidrofóbica. Los solventes orgáni­
cos producen una modificación de la constante
dieléctrica del medio acuoso, lo que también
llevará a una disminución de la capa de solva-
tació n acuosa de las m oléculas siendo ésta
reemplazada por moléculas del solvente orgá­
nico.
Debemos tener en cuenta que todas las bio-
moléculas tienen un cierto grado de carácter hi-
drofóbico. Este grado de hidrofobicidad depen­
de de la secuencia aminoacídica primaria de la
proteína o péptido; ciertos aminoácidos son hi­
l:-:n:-3cc:on n.crofóoica ■í-orrjstie'.T
Matriz
—OH ^ : .-....... ^ Sitio
hidrofóbieo
—OH
— OH
drofóbicos como el triptófano y la fenilalanina
entre otros. Por otra parte, las interacciones hi­
drofóbicas estabilizan las estructuras terciaria y
cuaternaria de las proteínas existiendo muchos
aminoácidos hidrofóbicos expuestos en la su­
perficie lo que le dará el grado de hidrofobici­
dad a una proteína en su estado nativo. La ca­
pacidad de una proteína de producir una inte­
racción hidrofóbica en el estado nativo depen­
de de los sitios hidrofóbicos en su superficie; y
estos sitios hidrofóbicos dependen de una es­
tructura terciaria y cuaternaria intacta. Esto de­
be ser distinguido de la hidrofobicidad intrínse­
ca de la proteína la cual depende solamente de
su estructura primaria. En conclusión, cuando
se use la hidrofobicidad como base para la se­
paración de proteínas, se deben tener en cuenta
los caracteres de hidrofobicidad de la proteína
que surgen de la estructura terciaria y cuaterna­
ria y aquellos que surgen de su estructura pri­
maria.
5.2. C ro m ato g rafía p o r interacción
hidrofóbica (H IC)
Este método cromatográfico permite la sepa­
ración de biomoléculas aprovechando su dife­
rente grado de hidrofobicidad. Es útil para el
fraccionamiento de proteínas solubles en agua,
así como de proteínas lipofílicas, y ofrece una
opción para la separación de AcMo, suponien­
do que los mismos sean estables a altas con­
centraciones salinas. Todas las inmunoglobuli­
nas presentan un cierto grado de hidrofobicidad
que varía dentro de las distintas subclases.
Esta técnica hace uso de la presencia de si­
tios hidrofóbicos expuestos en la superficie de
F ig. 41-9. Interacción hidrofóbica verdadera. L a
proteína Pj , con un sitio Irdrofóbico expuesto, se
u n irá al lig an d o liid ro fó b ic o , m ien tra s q ue la
proteína P„ , sin sitio hidrofóbico expuesto, no
podrá hacerlo.
 Métodos cromatográficos de fase líquido-sólido
las proteínas, que resultan en diferentes grados
de interacción hidrofóbica con una matriz no
cargada que contiene grupos hidrofóbicos co­
mo alquilos, fenilos o aminoalquilos.
La cromatografía por interacción hidrofóbica
puede dividirse en dos grupos: la “cromatogra­
fía hidrofóbica verdadera” y la “cromatografía
hidrofóbica anfifílica” . La prim era categoría
contiene aquellas separaciones que dependen
sólo de la presencia de un residuo hidrofóbico
inm ovilizado y la segunda, aquellos métodos
separativos que dependen tanto un residuo hi­
drofóbico como de uno hidrofílico (general­
mente iónico) inmovilizados en una matriz.
En el caso de la crom atografía hidrofóbica
verdadera, si se aplica una proteína (P„) que no
expone grupos hidrofóbicos en su superficie a
una matriz con grupos alquilos, no se producirá
ningún tipo de unión, mientras que una proteí­
na (Pj), con regiones hidrofóbicas expuestas, sí
se unirá a ella (fig. 41-9). No obstante, como
las interacciones hidrofóbicas son débiles, tal
proteína se uniría muy débilmente o aun sería
sólo retardada en Ja crom atografía. Como la
unión hidrofóbica se incrementa con el aumen­
to de la fuerza iónica, la unión de esta proteína
al sustituyente hidrofóbico podrá aumentarse
optimizando la concentración salina del solven­
te cromatográfico. A partir de ello, la elución
Matriz
N aC l + EtiengB osI ■
Matriz
F ig. 41-10. Interacción h id ro fó ­
bica anfifílica. U na p ro teín a con
su sitio hidrofóbico ro d ead o por
cargas negativas se u n irá fu erte­
m ente a una m atriz sustituida con
un g rupo a m in o alq u iio . L a e lu ­
ción se h a rá con una m e zcla de
una solución acuosa de alta fuer­
za iónica con un solvente orgáni­
co que d ism inuya la polaridad del
solvente crom atográfico.
891
de las proteínas se hará disminuyendo la fuerza
iónica del bujfer de elución.
Por otra parte, proteínas con su sitio hidrofó­
bico rodeado por cargas negativas se unirán dé­
bilmente a grupos alquilos pero podrán unirse
fuertem ente a grupos am inoalquilos pues se
verán envueltas fuerzas iónicas e hidrofóbicas
en el proceso de adsorción produciéndose una
“interacción compuesta” . En presencia de altas
concentraciones salinas, la proteína se unirá
fuertem ente como resultado de la interacción
hidrofóbica; pero a baja fuerza iónica, donde la
interacción hidrofóbica es débil, la adsorción
será debido a la atracción iónica entre la p roteí­
na y la matriz cargada. Este es un ejemplo de
cromatografía hidrofóbica anfifílica (véase fig.
41-10). En este caso, la elución de la proteína
será difícil a menos que se haga a valores de
pH muy altos (donde la proteína no será esta­
ble) o bien por elución con una solución acuosa
de alta fuerza iónica y con una polaridad dism i­
nuida con un solvente orgánico.
Un tercer tipo de interacción hidrofóbica es
la llamíída cromatografía charge transfer o “n -
7t“ en )a cual el ligando alquil-hidrofóbico es
reemplazado por un ligando aromático, prefe­
rentemente conteniendo un sustituyente atrac-
tor de electrones como la fenil-agarosa o la di-
nitrofenil-agarosa.
- O - C - N - C 3H ,
H
C1
Na
NH,
- O - C - N - C 3H ,
H
892 Métodos inmunoquímicos
5.2.1. Matrices
Afortunadamente, a pesar de que los meca­
nismos de las interacciones hidrofóbicas son
complicados, las técnicas cromatográficas ba­
sadas en las interacciones hidrofóbicas son sen­
cillas.
Las matrices utilizadas en la cromatografía
convencional (sin presión externa) son geles
hidrofílicos como la agarosa o la Sepharosa
sustituidos con grupos no polares de cadena
corta como alquilos, aminoalquilos o fenilos.
En los sistemas de alta resolución como HPLC
se utilizan matrices de sílice sustituidas con
grupos fenilos o alquilos; en cambio, en los
sistem as tam bién de alta re so lu c ió n com o
FPLC se utilizan matrices de Phenyl o Alkyl-
Superosa.
Ante la elección de un gel para la separación
de una proteína no caracterizada, la mejor op­
ción para comenzar es generalmente una resina
fenil-sustituida, pues las proteínas fuertemente
hidrofóbicas no serán fácilmente eluidas de re­
sinas altam ente hidrofóbicas como las octil-
sustituidas. La hidrofobicidad del ligando feni-
lo es intermedia entre grupos n-butilo y n-pen-
tilo y se unirá a aminoácidos aromáticos a tra­
vés de interacciones “ti - tí”. Resinas octil-sus-
tituidas como la octyl-Sepharosa CL-4B puede
ser usada para proteínas débilm ente hidrofó­
bicas.
La unión de las proteínas al gel está influen­
ciada por:
1. La hidrofobicidad del ligando: como vi­
mos anteriormente la phenyl-Sepharosa CL-4B
es menos hidrofóbica que la octyl-Sepharosa
CL-4B.
2. La fuerza iónica del buffer: aquellas sales
que producen precipitación salina {salting out)
como el S 0 ^(NH^)2 favorecen la unión de las
proteínas a los ligandos hidrofóbicos. La unión
a octyl- y phenyl-Sepharosa CL-4B es práctica­
m ente im posible a m enos que se usen altas
concentraciones de sales. La concentración sa­
lina debe ser ligeramente inferior a la usada pa­
ra el salting out.
3. Temperatura; se ha notado que la fuerza
de unión hidrofóbica se reduce en un 20-30%
cuando la tem peratura dism inuye de 20°C a
4°C.
5.2.2. Solventes cromatográficos
A partir de lo descrito anteriormente, la elu­
ción de la proteína de la matriz podrá hacerse
disminuyendo la concentración de iones en el
buffer (gradiente negativo), dism inuyendo la
temperatura, o bien en el caso de una interac­
ción anfifílica, utilizando un solvente de alta
fuerza iónica, para disminuir la interacción ió­
nica, y con su polaridad disminuida mediante
un solvente orgánico para desfavorecer la inte­
racción hidrofóbica.
La mayoría de las estrategias de elución son
no desnaturalizantes. El uso de por ejem plo
solventes que dism inuyen la polaridad es, a
menudo, el último recurso usado para la elu­
ción de proteínas unidas muy fuertemente pues
este método frecuentemente es desnaturalizante
de proteínas.
5.3. Cromatografía en fase reversa (RFC)
La RPC es otra de las técnicas cromatográfi­
cas basadas en las interacciones hidrofóbicas
entre una matriz sustituida y la molécula a se­
parar. Su aplicación en sistemas de alta resolu­
ción como HPLC es muy importante pues per­
mite el estudio analítico de mezclas proteicas.
No ocurre lo mismo en sistemas de FPLC don­
de se busca una alta recuperación de la activi­
dad biológica que no puede lograrse con la uti­
lización de la RPC (véase Sistemas de alta re­
solución).
La cromatografía en fase reversa o inversa
surge como método inverso a la cromatografía
en fase normal. En un principio, la diferencia­
ción entre los métodos fue hecho en base a la
polaridad de la fase móvil. Los sistemas de fase
normal son aquellos en los cuales la matriz es
sílice y la fase móvil un solvente no polar co­
mo el hexano (véase Sistemas de HPLC en fase
normal). La RPC utiliza una matriz hidrofóbica
de sílice sustituida usualmente con un grupo
funcional hidrofóbico y una fase móvil más po­
lar que la fase estacionaria, frecuentem ente
parcial o totalmente acuosa. Las sustancias po­
lares corren en la fase móvil y eluyen primero.
Conforme aumente el carácter hidrofóbico de
los compuestos, la retención será mayor.
5.3.1. Matrices
Las matrices utilizadas como relleno en co­
lumnas para HPLC son derivados sustituidos
de sílice (grupos alquilsilanos). El largo de ca­
dena más efectivo para proteínas es de C^ (4
carbonos) a Cg, mientras que las cadenas más
largas (C^ a C,g) son generalmente usadas para
péptidos pequeños.
5.3.2. Solventes cromatográficos
La elución de las moléculas de la fase esta­
cionaria se realiza con una mezcla agua/solven­
te orgánico. Una buena selectividad en la RPC
se alcanza mediante la manipulación de la fase
móvil. En la RPC de proteínas el solvente en
que se siembra la m uestra consiste en una solu­
 Métodos cromatográficos de fase líquido-sólido
ción acuosa ácida, mientras que el solvente de
elución lo constituye un solvente orgánico.
El componente acuoso ácido de la fase móvil
contribuye a la retención mediante; (1) su in ­
fluencia sobre el estado iónico de la proteína,
(2) el control de la ionización de los grupos si-
lanol de la superficie del soporte, (3) la forma­
ción de pares iónicos entre los residuos de su­
perficie de la proteína y el ácido y (4) su in ­
fluencia sobre la desnaturalización de la proteí­
na. Por lo tanto, el pH de la fase móvil regula
los estados de ionización de la proteína y de los
grupos silanol de superficie. Ciertos ácidos hi­
d ro fó b ico s com o el ácido triflu o ro a c é tic o
(TEA) aumentan la hidrofobicidad de las pro­
teínas mediante la formación de pares iónicos y
de esta forma se ve favorecida la retención de
la misma.
Los ácidos son usados en la fase móvil para
incrementar tanto la recuperación como la reso­
lución de muchas proteínas. El TEA es el ácido
más popularm ente usado debido a que es un
buen agente solubilizante; no obstante, la sepa­
ración de proteínas de membrana u otras pro­
teínas hidrofóbicas requieren la utilización de
otros ácidos como el ácido fórmico en concen­
traciones entre 5 a 80%.
Los solventes más usados como componente
orgánico de la fase móvil son acetonitrilo, m e­
tanol, etanol y propanol. La elección del com­
ponente orgánico se basa en la solubilidad .de
los solutos y en la viscosidad del solvente. D u­
rante el proceso de elución la solubilidad de la
proteína puede convertirse en un problema si se
produce la precipitación de la misma; en estos
casos, es en general el 2-propanol el solvente de
elección. La importancia de la viscosidad de la
fase móvil aumenta cuando se trabaja a altas
presiones, pues el límite de presión permitido
podría ser excedido con una aumento de la vis­
cosidad del solvente cromatográfico. El m eta­
nol y el acetonitrilo son solventes populares
porque tienen baja viscosidad y son fáciles de
conseguir con excelente pureza. Los solventes
de fuerza intermedia entre estos solventes y el
agua se obtienen normalmente preparando m ez­
clas. En este tipo de cromatografía los gradien­
tes se generan con la disminución continua en
la polaridad del eluyente durante la separación,
por ejemplo aumentando gradualmente el con­
tenido de solvente orgánico en las m ezclas
(H 2 0 -TFA)/Metanol o (H 2 0 -TFA)/Acetonitrilo.
5.4. Diferencias entre Cromatografía
por interacción hidrofóbica
y Cromatografía en fase reversa
La cromatografía por interacción hidrofóbica
(HIC) y la cromatografía en fase reversa (RPC)
son métodos separativos basados ambos en las
893
interacciones entre moléculas hidrofóbicas de
una muestra y un grupo hidrofóbico insoluble e
inm ovilizado (matriz). Como vimos anterior­
mente, estas técnicas crom atográficas surgen
con la aplicación de sistemas de alta resolución
como HPLC y FPLC (véase más adelante). En
forma general la RPC es aplicada en HPLC y la
HIC es u sad a co m ú n m en te en sistem as de
FPLC.
Es de utilidad conocer las diferencias básicas
entre HIC y RPC. En la interacción hidrofóbica
la m atriz es hidrofílica y está sustituida con
grupos no polares de cadena corta como fenilos
u octilos. La fase móvil es usualmente una so­
lución acuosa salina. En cromatografía en fase
reversa la matriz es sílice sustituida con largas
cadena de n-alquilos, comtínmente Cg (octilsi-
lil) o C,g (octadecilsilil). La m atriz es m enos
polar que la fase móvil la cual generalm ente
está constituida por una mezcla de agua y un
modificador orgánico menos polar. Las separa­
ciones en HIC son usualmente hechas en solu­
ciones acuosas salinas, las cuales brindan un
medio no desnaturalizante. Las separaciones en
cromatografía en fase reversa son generalmente
realizadas en mezclas de agua y solventes orgá­
nicos, los cuales generan a menudo condicio­
nes desnaturalizantes.
Estos dos métodos explotan las diferentes
fuentes de hidrofobicidad de las proteínas. La
HIC depende de los grupos hidrofóbicos de su­
perficie pues se lleva acabo en condiciones que
permiten mantener la integridad de la molécula
proteica. La RPC depende de la hidrofobicidad
intrínseca de la proteína y se realiza bajo co n ­
diciones que hacen que esta exponga casi todos
los grupos hidrofóbicos hacia la matriz.
6 . CROMATOGRAFÍAS LÍQUIDAS
DE ALTA RESOLUCIÓN
Con el avance tecnológico, las técnicas cro ­
m atográficas han sido perfeccionadas, tan to
desde el punto de vista de la eficiencia del m é­
todo como en la rapidez. Dependiendo del tipo
de soluto que se quiera separar y/o caracterizar,
se pueden diferenciar dos tipos de cromatogra­
fías líquidas de alta resolución: HPLC y FPLC.
6.1. Cromatografía líquida
de alta presión: HPLC
La crom atografía líquida de alta p resió n ,
identificada comúnmente con la sigla en inglés
HPLC (H igh Presure or Perform ance L iq u id
Chromatography) es uno de los recursos analí­
ticos más apreciados y difundidos para la p u ri­
ficación y caracterización de todo tipo de su s­
tancias. Las ventajas principales son la v eloci­
894 Métodos inmunoquímicos
Detector Registrador
F ig. 41-11. Esquem a básico de un equipo de HPLC.
dad de análisis, alta sensibilidad y resolución,
resultados cuantitativos y factibilidad de auto­
matización. En general la EIPLC es utilizada
para la caracterización y/o separación de solu­
tos, donde el solvente usado y la alta presión
del equipo no altera la conformación tridimen­
sional y por ende la actividad biológica de la
molécula en estudio. Para la separación de ma-
cromoléculas, donde las condiciones operativas
pueden modificar la conformación de la molé­
cula y por lo tanto la actividad biológica de la
misma (anticuerpos, enzimas, citoquinas, etc),
es conveniente la utilización de la FPLC. Sin
embargo algunos métodos de HPLC pueden ser
aplicados para este tipo de proteínas sin el ries­
go de desnaturalización de la molécula.
El principio general de la HPLC no difiere
del enunciado para la cromatografía convencio­
nal en sus diferentes variantes. La muestra en
estudio se di.stribuye en dos fases, una estacio­
naria y otra móvil, de modo tal que cada uno de
los componentes de una mezcla son selectiva­
mente retenidos por la fase estacionaria. La di­
ferencia principal de los sistemas de HPLC ra­
dica en el empleo de columnas de diámetro re­
ducido y rellenas de materiales pulverulentos
especiales y de un instrumental más sofisticado
para su operación. En la década del ’60 fue in­
troducido el prim er materia] de em paqueta­
miento: era un gel de carbohidratos de partícu­
las inferiores a 50 |j,m.
Los avances en la instrumentación, la sínte­
sis de nuevos materiales y tecnología de empa­
quetamiento, que se pvodujerón durante la dé­
cada del ’70 permitieron la preparación de co­
lumnas con un gel de menor diámetro de partí­
cula (5-10 |j,m), lo que permitió avanzar en la
Bombas de
aita presión
Controlador de gradiente
resolución y en la rapidez. R esum iendo: la
HPLC no es más que el resultado del avance
tecnológico, tanto en la teoría operacional co­
mo en la fabricación de los sistemas cromato-
gráficos. Los sistemas de HPLC para la separa­
ción de macromoléculas biológicas se diferen­
cian fundamentalmente de la antigua cromato­
grafía por tres motivos; a) Las partículas pue­
den soportar presiones mucho más elevadas, b)
Su tamaño ha podido disminuirse más de 10
veces, aumentando de esta manera la cinética
de adsorción-desorción, c) El tiempo de la co­
rrida cromatográfica ha disminuido entre 10 a
60 veces, debido a la alta presión que puede
aplicarse a estas columnas. De hecho, el líqui­
do puede ser forzado a través de la columna a
una velocidad y presión controladas por medio
de bombas de alta presión, la muestra es intro­
ducida en una estrecha tubuladura y mientras
que el sistema opera bajo presión, el efluente
de la columna puede ser monitoreado mediante
la aplicación de espectrofotómetros de alta sen­
sibilidad y finalmente recolectado; simultánea­
mente un graficador representa el cromatogra-
ma (fig. 41-11).
6.1.1. Métodos cromatográficos utilizados
en H PLC
Los principios básicos de los métodos cro­
matográficos utilizados en HPLC son los mis­
mos que para la cromatografía convencional, a
diferencia de algunas metodologías que se han
desarrollado para ser aplicadas en las cromato­
grafías de alta resolución, como ser la cromato­
grafía de fase normal y cromatografía de fase
reversa.
 Métodos cromatográficos de fase líquido-sólido 895

La cromatografía de fase normal utiliza una 6.1.2. Instrum entación del sistema HPLC
fase estacionaria polar (generalmente hidrofíli-
ca) y una fese móvil menos polar. La cromato­ Para la obtención de una efectiva resolución
grafía de fase reversa utiliza una fase estacio­ en la utilización de un método cromatográfico
naria con un enlace hidrofóbico, generalmente por HPLC, es importante tener en cuenta los si­
un grupo funcional octadecilo (C,g) u octilo guientes parámetros;
(Cjj) y una fase m óvil polar, frecuentem ente
parcial o totalmente acuosa (véase en FPLC). 1. En primer lugar se debe conocer el fu n ­
La cromatografía de pares de iones es otro cionamiento cada uno de los componentes m ás
método desarrollado en función de las técnicas importantes de un equipo de HPLC. En la figu­
erom atográficas de alta resolución. Su m eca­ ra 41-11 se ha esquem atizado un equipo de
nismo exacto no ha sido establecido claramen­ HPLC.
te. En primer lugar se postula que la molécula 2. En base a las características del soluto
del soluto forma un par iónico con el contrac­ que se desea caracterizar y/o separar, es nece­
ción de la fase móvil. Este par iónico se reparte saria una correcta selección de la colum na y
dentro de la fase estacionaria lipofílica. El se­ por ende del método cromatográfico y del sol­
gundo mecanismo postulado es que el contrac­ vente a utilizar.
ción se reparte en la fase estacionaria, o es 3. Los problemas que pueden surgir durante
“cargado” durante el empaquetado de la fase el desarrollo del método seleccionado.
reversa enlazada, con su grupo iónico orientado
hacia la superficie. En base a estos postulados Un equipo de HPLC está compuesto por:
puede ocurrir que: a) el material a cromatogra­
fiar sea atraído por el hidrocarburo unido a la a. Sistem a de bombas. Como el fundam ento
matriz de manera similar a lo que ocurre en fa­ de este método es la aplicación de altas p re­
se reversa o b) puede interaccionar a modo de siones, el sistema de bombas es un com po­
intercambio iónico. n ente v ital de to d o eq u ip o m oderno d e
En el cuadro 41-14 se detallan los métodos HPLC. Los requisitos esenciales son los si­
utilizados en HPLC, sus características y las guientes: I) El material de las bombas debe
columnas usadas en cada caso. ser químicamente resistente a toda fase mó-

C uadro 41-14. Características cíe los métodos p o r HPLC

M étodo/D escripciónJC olum na“ E jem p lo de la utilización del m étodo

F ase N orm al
Fase m óvil: m ezclas de solventes orgánicos B uen m étodo cuando fase reversa o pares d e iones son in efecti­
Colum nas: ciano, diol, am ino, sílice vos. M étodo de elección para m uestras hidrofílicas que no se
disuelven bien en aguíi/ m ezclas orgánicas y p ara m ezclas d e
isóm eros y para escala preparativa (con colum nas de sílice)
Pares de iones
Fase m óvil: agua/solventes orgánicos, un buffer co­ B uen método para com puestos iónicos o ionizables, especial­
mo control de pFI y un reactivo con un par de iones m ente bases o cationes
Colum nas: C l 8 , C 8, ciano

F a se reversa
Fase m óvil: agua/solventes orgánicos M étodo de elección p ara com puestos no ionizados que se d isu el­
Colum nas: C I 8, C 8, fenil, trim etilsilil, ciano ven en agUíi/solventes orgánicos

C rom atografía de exclusión m olecular

Fase móvil: utiliza siem pre solventes acuosos M étodo de elección para separar m oléculas de alto peso m o lecu ­
Colum nas: fase-diol sintéticos lar, com o proteínas y polím eros. Se utiliza p ara calcular pesos
m oleculares
C rom atografía de in tercam b io ión ico’’
Fase móvil: solventes acuosos con un buffer de iones M étodo de elección para separar m ezclas de proteínas, ácidos
para control de pH. • nucleicos y com puestos relacionados
Colum nas: intercam bio iónico o catiónico

C rom atografía de in teracción hidrofóbica'’

Fase m óvil: soluciones salinas S e utiliza para separar mezclas de proteínas
C olum nas: sim ilares a las de fase reversa pero mucho
m enos hidrofóbicas

T odas las c o lu m n as a q u í m e n c io n a d a s, excepto las de exclusión m o le c u la r son em p a q u e ta d a s con p artíc u la s de sílice a las que se le a c o p ló
eí esp a ciad o r c o rresp o n d ien te ,
^ P ara la .separación d e p ro te ín a s y de otras m o lécu la s b iológicas, d o n d e la actividad b io ló g ic a es fu n d a m e n tal, se re co m ien d an los m ism o s
m étodos p ero a p lica d o s en F P L C .
896 Métodos inmunoquímicos
vil utilizada. A lgunos equ ip o s antiguos de
H PLC tenían bom bas construidas con acero
inoxidable que podían ser atacadas por solven­
tes altamente ácidos. En la actualidad los mate­
riales de elección son el titanio y plástico de al­
ta resistencia. Los sistemas con bombas cons­
truidas con estos materiales son generalmente
más caros que los construidos con acero inoxi­
dable, pero su vida media es mayor y los resul­
tados más confiables; por otra parte su mayor
duración hace que el mayor costo sea justifica­
do. II) El HPLC requiere generalmente el uso
de dos bombas, por tal motivo se debe tener en
cuenta las variaciones de presión en cada una
de ellas. Una variación de presión de más del
1% puede causar una diferencia de 12 segun­
dos en el tiempo de retención en una corrida de
20 minutos. III) Debido al pequeño diámetro
de las partículas de las columnas y la viscosi­
dad de los solventes, las bombas deben produ­
cir una presión de por lo menos de 400 atm.
Como puede observarse en la ecuación.
ISOvLri (l-e)2/dp2e2
la presión {P^) requerida para forzar un líquido
a través de la columna es función del flujo de
la fase móvil (v), del diámetro de las partículas
(dp), de la longitud de la colum na (L), de la
viscosidad de la fase móvil (ti), de la presión
inicial (Pg) y de la porosidad interparticular (e).
IV) Los solventes deben estar libres de conta­
minantes que puedan absorber la longitud de
onda de trabajo, por lo tanto se debe a utilizar
so lv e n te s de alto g rad o de p u re z a (g rad o
HPLC). Por otra parte, pulsaciones de presión
en el envío del solvente pueden causar flujos
discontinuos a través de la columna y detecto­
res. Estas pulsaciones de presión también pue­
den dañar el material de empaque de la colum­
na. V) Debido a que generalmente se trabaja
con gradiente de solventes y que la velocidad
de la fase móvil puede variar desde 10 |il/min
C uadro 41-15. Características generales de los sistemas de bombas
Tipo de bomlya Ventajas
Jeringa N o produce pulsaciones en el flujo
Pistón recíproco P erm ite un rápido cam bio de solvente.
B ueno para elución con gradientes
Perm ite gran rango de flujo (0,1-10 m l/m in)
D iafragm a B ajos pulsos. B ueno p ara gradientes
continuos. Presión constante. M uy bajos
pulsos en el flujo. Pre.sión constairte,
Econótnico. Correcto rango de flujo
D urable
hasta 10 ml/min, se debe tener la precaución de
realizar una buena mezcla de los solventes. Los
diferentes tipos de sistemas de bombas más co­
munes y sus características principales se deta­
llan en el cuadro 41-15.
b - Amortiguador de los pulsos de presión.
El sistema de bombas que produce pulsos de
flujo discontinuo requiere algún tipo de amorti­
guador de estos pulsos. Se conocen dos tipos
de amortiguadores de pulso. Uno de ellos in­
corpora un tubo flexible sellado, dentro de un
contenedor con líquido comprimible. Cuando
se produce un pulso de flujo, éste es amortigua­
do por el tubo que se expande y la energía es
absorbida por el medio. Otro sistema de amor­
tiguación de pulsos usa un tubo chato de acero
inoxidable de 1-3 m de largo que se expande
cuando recibe el pulso de presión. La desventa­
ja de este último es que proporciona un volu­
men m uerto dem asiado grande y los pulsos
continuos pueden resq u eb rajar el m aterial.
Amortiguadores de pulso electrónicos son mu­
cho más efectivos, rindiendo un correcto flujo
continuo.
c - Sistema para la mezcla de los solventes.
La mayoría de los métodos para la separación
de solutos, utiliza gradientes de diferentes sol­
ventes. La función del mezclador es la mezcla
de estos solventes sin que se produzcan modifi­
caciones en el gradiente. Se fabrican dos tipos
de mezcladores, uno dinámico y otro estático.
El dinámico usa una barra magnética dentro de
un recipiente, donde se produce la mezcla por
agitación m ecánica de ambos solventes. Este
mezclador es el más versátil, pero tiene la des­
ventaja de un volumen muerto de 1-3 mi dentro
del sistema de bombas. El mezclador estático
consiste en un recipiente lleno de un material
inerte que simula una columna cromatográfiea
de muy baja eficiencia, produciendo bandas an­
chas de difusión, las que permiten la mezcla de
los solventes. En efecto, este método de mez­
clado se basa en la difusión del solvente. La
D esventajas
La com presión del líquido altera el flujo
U tiliza grandes volúm enes
F alla del sellado de los pistones. Produce pulsaciones
en el flujo
G ran volum en m uerto. N o eficiente para gradientes rá­
pidos. Costo elevado. Presión basal de la colum na,
viscosidad d e la fase m óvil y tem peratura deben
m antenerse constantes. Lim itado sum inistro de sol­
ventes. Trabaja a presiones no m ayores de 2000 psi.
Inconvenientes en eluciones con gradientes
 Métodos cromatográficos de fase iíquido-sólido
ventaja del m ezclador estático es que puede
m ezclar pequeños volúmenes, pero solventes
altamente viscosos son pobremente mezclados.
d -D etectores. El avance tecnológico del
HPLC se vio obstaculizado por la falta de de­
tectores adecuados. El detector ideal es aquel
que cumple los siguientes requisitos: alta sensi­
bilidad, estabilidad, lectura continua y respues­
ta universal. Es al día de hoy que aún no existe
uii detector que cumpla con todos estos requisi­
tos. Sin embargo, al evaluar la elección de un
determinado detector en función a las caracte­
rísticas fisicoquímicas de las sustancias que se
desea analizar, se deberán tener en cuenta las
siguientes propiedades generales:
1. Respuesta. Puede ser general, de acuerdo
a la capacidad que tenga el detector de generar
una señal con todo tipo de muestra o con una
en particular.
2. Sensibilidad. Se puede definir la sensibi­
lidad de un detector como la relación entre la
señal generada y la cantidad de muestra que
produce dicha señal. E sta señal no indica la
cantidad m ínim a detectable, puesto que ésta
puede estar lim itada por el ruido de base del
instrumento.
3. Ruido. Es la variación de señal que puede
detectar el instrumento que no es debida a la
muestra; puede ser producida por fallas electró­
nicas, variaciones de flujo o temperatura, fluc­
tuaciones en el voltaje, burbujas de aire disuel­
tas en el solvente, etc. Por lo tanto un detector
muy sensible, pero muy ruidoso puede ser m e­
nos útil que uno poco sensible, pero con un ni­
vel de ruido más bajo.
4. Linealidad. Es la relación entre la señal
generada por el detector y la concentración de
la muestra. Esta relación debe ser lineal.
5. Estabilidad. Un buen detector debe ser
poco sensible a los cambio de temperatura y a
la variación de flujo. En la actualidad, los de­
tectores más comunes son los que miden; índi­
ce de refracción, fluorescencia, espectrometría
de masa y luz ultravioleta. Los detectores para
luz visible-UV son los más utilizados. Los de­
tectores de diodo son particularmente atracti­
vos, ya que pueden examinar el espectro desde
200 hasta 600 nm en menos de un segundo.
e - Columnas. La cromatografía de fase re­
versa es la más utilizada en HPLC. La fase m ó­
vil inicial (comúnmente denominado buffer A)
es débil y generalmente consiste en soluciones
de ácidos altamente diluidos como por ejemplo
el ácido trifluoracético al 0,1 % (TEA), m ien­
tras que la fase móvil eluyente es un solvente
orgánico como ser metanol, 2-propanol o ace­
tonitrilo (comúnmente denominado buffer B).
Puesto que la muestra, disuelta en la fase móvil
897
débil, es inyectada dentro de la columna, rete­
nida por la matriz de la mism a y desplazada
por el solvente orgánico, lo que depende de la
correcta elección de los bujf'ers y del gradiente
aplicado, el pico obtenido deberá ser estrecho.
Debido a los solventes utilizados no se re co ­
mienda este método para la separación de pro­
teínas, cuando se desea mantener la actividad
biológica de las mismas. El HPLC es un p ode­
roso método analítico para péptidos y m olécu­
las pequeñas. La fase estacionaria más utilizada
son derivados alquilsilanos de sílice. El largo
de las cadenas sustituyentes para proteínas son
de un rango corto (C^ a Cg), mientras que para
péptidos y pequeñas moléculas son más largas
(Cj a C,g). Para la separación de proteínas tam ­
bién se utilizan macroporos derivados de po-
hestireno-divinilbenceno.
El material de empaque para las columnas de
cromatografía de exclusión molecular debe ser
neutro e hidrofílieo para minimizar todo efecto
de adsorción. Un método es fabricar m atrices
con alto grado de entrecruzamiento, mecánica­
mente estables. Con este fin se han usado aga­
rosa y dextranos, pero el proceso de entrecruza­
miento generalmente introduce grupos hidrofó­
bicos; incluso con estas m atrices no pueden
emplearse presiones muy elevadas (no más de
30 atm). Los macroporos de sílice a los que se
les une polímeros orgánicos son las m atrices
más efectivas.
Las columnas más utilizadas en los diferen­
tes métodos de HPLC y sus características más
im portantes se hallan resumidas en el cuadro
41-16.
De acuerdo al método seleccionado y por en ­
de la columna a utilizar, es fundamental el tipo
de solvente a emplear. Las fases móviles id ea­
les para HPLC son aquellas que no dañan los
sistemas de bombas. No deben emplearse su s­
tancias que puedan absorber al UV. Todos los
solventes, (inclusive H^O deionizada o bidesti-
lada), buffers, ácidos o bases para ajustar el pH,
deben ser altamente purificados. Todas las so­
luciones deben ser pasadas a través de filtros
de 0,45 |am para rem over toda partícula que
pueda dañar la columna; los solventes deben
ser previam ente degaseados, ya que m ínim as
burbujas pueden alterar severamente la línea de
base del cromatograma. La fase móvil depende
de la co lu m n a seleccio n ad a. En el c u a d ro
41-16 se detallan, de acuerdo al tipo de colum ­
na, las características de las fases móviles reco ­
mendadas para cada caso.
6.1.3. Características del soluto
que se desea analizar y/o separar
Antes de seleccionar un método cromatográ­
fico por HPLC es necesario conocer las carac-
898 Métodos inmunoquímicos

C u ad ro 41-16. Características de las columnas más usadas en los diferentes métodos por
HPLC

Colum na D escripción

F a se norm al
C N - (ciano) G rado de polaridad óptim o cuando éste es el m étodo de elección
M ás polar que la CN-
O H - (diol) A itam ente polar, m enos estable
N H ,- (am ino) Económ ica, m enos conveniente
S ílice

F ase reversa y p ares de iones

C 1 8 (ü c ta d e s iliiO D S ) A lto poder de retención. L a más utilizada
C 8 (octil-) S im ilar a la C 18, m enor poder de retención
C 3 ,C 4 M enor poder de retención. C olum na de elección para péptidos y proteínas
C -I (trim etil-silil, TiVIS) M enor poder de retención, m enos estable
Fenil M oderado poder de retención
CN - M oderado poder de retención. U tilizada en fase reserva y norinal
NH2- P oder de retención débil. U tilizada para carbohidratos. M enos estable

Poliestireno E stable con fase móvil en pH 1-3

E xclusión m olecular
S ílice A dsortiva
S ílice silanizada M enos adsortiva, gran com patibilidad con los solventes utilizados
U tilizada con solventes orgánicos
O H - (diol) M enos estable, utilizada con solventes acuosos
Poiiestireno U tilizada con solventes orgánicos, incom patible con solventes polares

Intercam b io iónico
C on uniones quím icas a la m atriz M enos estable y reproducible
Poiiestireno M enos eficiente, m ás estable, más repoducible

terísticas de la muestra a analizar y/o separar.
El éxito de la separación depende de esto, y los
puntos principales que hay que tener en cuenta
son los siguientes:
1. La información sobre la muestra define el
éxito de la separación
2. ¿La muestra necesita un tratamiento pre­
vio a la separación cromatográfica?
3. Elección del detector
4. Selección del método cromatográfico, pa­
ra luego estimar las mejores condiciones de co­
rrida.
5. Optimización de las condiciones de sepa­
ración
Por otro lado, el éxito de una separación cro­
matográfica incluye la-respuesta de las siguien­
tes preguntas:
1. ¿Se desea analizar la muestra o colectarla?
2. ¿Se conocen las características de todos
los componentes de la muestra?
3. ¿Se desea resolver todos los componentes
de la muestra o uno en particular?
4. ¿Si se desea realizar un análisis cuantita­
tivo de la muestra, qué precisión se necesita?
5. ¿Es necesario más de un procedimiento
cromatográfico?
6.1.4. Problemas que pueden surgir durante
el desarrollo del método seleccionado
1. Problemas con la línea de base. En las
separaciones isocráticas generalmente es posi­
ble obtener una línea de base plana sin falsos
picos ni otros disturbios. En las separaciones
con gradientes, una línea de base plana, por
diversas razones, es más difícil de obtener.
Por lo tanto es imperioso realizar, previa in­
yección de la m uestra, una “corrida blanco”
para tener la seguridad de una correcta línea
de base. Los falsos picos pueden deberse a
impurezas que son absorbidas a la mism a lon­
g itud de onda de trabajo, contenidas en los
solventes. El uso de solventes de alto grado de
p u re z a p u ed e m im in iz ar esto s p ro b lem as.
T am bién es común observar artefactos si se
utiliza el detector a una muy alta sensibilidad
y una longitud de onda demasiado baja. Por lo
tanto la corrida blanco debe realizarse bajo las
mismas condiciones que se utilizarán durante
la separación de la m uestra. Un increm ento
demasiado pronunciado de la línea de base a
medida que se incrementa el solvente B, pue­
de deberse a una diferente absorbancia del
mismo con respecto al solvente A. Por lo tan­
to hay que controlar que ambos solventes ten­
gan la misma absorbancia.
 Métodos croma tográficos de fase líquido-sólido 899

C uadro 41-17. Materiales más utilizados para la producción de la fase estacionaria quím ica­
mente unida

Tamaño
N om bre Grupo unido Soporte de partícu la (¡Im) Marca

M icropacck CH O ctadecilo Lichrosorb 10 V arian A erograph

Lichrosorb R P-18 O ctadecilo Lichrosorb 5-10 E. M erck
B ondapack C - 18 O ctadecilo [i Porasil 10 W aters
ODS-Silx-1 O ctadecilo S iix-I 15 Perkin Elm er
Zorbax ODS O ctadecilo Zorbax-Sil 6 D upont
Portasil O D S '2 O ctadecilo Portasil 10 H ew lett Packard
Lichrosorb R P -8 Octilo Lichrosorb 5-10 E. M erck
Zorbax C -8 O ctilo Zorbax-Sii 6 D upont
|i B ondapack Phenyl Fenilo (.t Porasil 10 W aters
Lichrosorb R P-2 13imetilo Lichrosorb 5-10 E. M erck
C yano Silx-I Nitrilo Silx-I 15 Perkin Ehner
H, B ondapack CN Nitrilo ¡l Porasil 10 W aters
A m ino Silx-I A m ino Silx-I 15 Perkin Elm er
B ondapack NH^ A m ino |j, Porasil 10 W aters
Bondapack carbohidrato Am ino H Porasil 10 W aters
Z orbax N H, A m ino Zorbax-Sil 6 D upont
|j, B ondapack ácido graso H idrocarburo |l Porasil 10 W aters
B ondapack C18/Corasi! O ctadecilo Corasil 37-50 W aters

2. R esolución de los picos de interés. La
elección de una correcta fase móvil y de un
gradiente apropiado es lo que más influye en
resolución de una muestra, teniendo en cuenta
que la colum na a utilizar es la apropiada. El
cuadro 41-17 muestra los materiales más utili­
zados para la producción de la fase estacionaria
y el cuadro 41-18 m uestra la influencia del
cainbio de algunos solventes sobre resolución
de una muestra.
6.1.5. Aplicaciones de la cromatografía
líquida de alta presión
La gran versatilidad de la cromatografía lí­
quida de alta presión permite purificar y carac­
terizar un sinníímero de sustancias de caracte­
rísticas fisicoquím icas totalm ente diferentes,
como ser;
a) C om puestos iónicos, com o a m in o áci­
d os, sa le s in o rg á n ic a s , á c id o s o rg á n ic o s,
etcétera.
b) Compuestos de alto peso molecular, co ­
mo polím eros, hidrocarburos p o linucleares,
productos naturales, etc.
c) Compuestos termolábiles y no volátiles,
como vitaminas, pesticidas, esteroides, plastifi-
cantes, drogas y una gran variedad de produc­
tos farmacéuticos.
d) Separación de péptidos provenientes del
clivaje enzimático o químico de proteínas para
ser analizada su secuencia por microsecuencia-
ción.

C u ad ro 41-18. Influencia de las características de la fa se móvil en la resolución de una

muestra

Variable Cc>mentarios

Solvente orgánico En fase reversa, un cam bio de m etanol por acetonitrilo o tetrahidrofurano
(THE), puede aum entar la resolución. Cam bios sim ilares pueden realizarse
en fase norm al, usando cloruro d e m etileno, m etil-t-butil-eter (M TB E) o ace­
tonitrilo.

pH de la fase móvil Para m uestras que contienen ácidos o bases, un cam bio en el pH puede mejorar
la resolución.

Fuerza iónica del .solvente U n cam bio en la fuerza iónica puede significar un im portante cam bio en la re­
solución de la m uestra, tanto en fase reversa com o en fase norm al o pares de
iones. Es un buen sistem a para optim izar la resolución de una corrida crom a-
tográfica.

Tem peratura L a tem peratura pu ed e variarse entre 0 y 70”C. Sin em bargo tem peraturas entre
25 y 60”C son las má.s com unes. G eneralm ente no se usan variaciones de
tem peratura para optim izar las condiciones de una corrida crom atográfiea.
900 Métodos inmunoquímicos
Debido a que los contenidos de este texto
son fundamentalmente inmunológicos tom are­
mos como ejemplo la purificación de péptidos
provenientes del clivaje enzim ático del frag­
mento Fd de una inmunoglobulina.
Cuando se desea conocer la secuencia de
aminoácidos de una inmunoglobulina es nece­
sario realizar previamente la separación y frag­
mentación de ambas cadenas. El equipo auto­
mático de secuenciación de aminoácidos puede
procesar y por lo tanto dar información de no
más de 40 aminoácidos, en consecuencia, es
imprescindible trabajar con péptidos no mayo­
res a ese tamaño.
Los pasos a seguir para la obtención de una
secuencia de aminoácidos de una inm unoglo­
bulina son los siguientes;
1. Obtención del fragm en to Fab. Para la
obtención del fragmento Fab se puede utilizar
la digestión con tripsina y luego separación de
los fragm entos obtenidos m ediante crom ato­
grafía de exclusión molecular.
2. A islam iento de la cadena L y el fr a g ­
mento Fd. El fragmento Fab es parcialmente
reducido con ditiotreitol 10 mM en un buffer
de 10 mM de Tris-HCl pH 8,2. Luego de 1 ho­
ra a temperatura ambiente se procede a la al-
quilación con ácido iodoacético a una concen­
tración de 22 mM con el añadido de •'^C ácido
iodoacético como trazador. La muestra es de­
salada mediante el pasaje por una columna de
Sephadex G-25, estabilizada previam ente en
ácido acético IM . El material obtenido final­
m ente se liofiliza. Luego se disuelve en tri­
fluoracético (TFA) 0,1% y se inyecta a una co­
lum na de HPLC de fase reversa C18, usando
un gradiente discontinuo de acetonitrilo en
TFA 0.1%. El perfil de elución de la cadena li­
v ia n a y del frag m en to Fd y el c o n tro l de
T ie m p o (m in.)
pureza por SDS-PAGE se muestran en la figu­
ra 41-12.
3. Clivaje enzimático y purificación de los
péptidos obtenidos. Una vez separado el frag­
mento Fd de la cadena liviana se procede a su
clivaje enzimático. La elección de la enzima a
utilizar depende del conocimiento que se tiene
respecto a la com posición de am inoácidos.
C ualquiera que sea la enzim a a utilizar hay
que tener en cuenta que debe ser de un alto
grado de pureza, y se las identifica como grado
HPLC.
En este caso se seleccionó Lisina-C (Lys-C)
Endoproteinasa, enzima que d iv a uniones Lys-
X dejando la Lys como aminoácido C-terminal.
Luego de la digestión, los péptidos fueron se­
parados por pasaje a través de una columna de
fase reversa C,g, usando un gradiente linear de
0-66% de acetonitrilo en TFA 0.1%. En la fi­
gura 41-12A se muestra el perfil de separación.
La composición de aminoácidos de cada uno
de los picos reveló que el pico K6 contenía un
péptido de gran tamaño y con alto contenido de
asparagina (Asn), por lo tanto se digirió nueva­
mente. La figura 41-12B muestra el pico K6 di­
gerido con Asn-N, endoproteinasa que d iv a
uniones X-Asn y corrido en las mismas condi­
ciones que en el caso anterior.
6.2. FPLC® (Fast Protein, Peptide
and Polynucleotid Liquid Chromatography)
El FPLC (desarrollado p osteriorm ente al
HPLC) es un sistema de purificación de alta re­
solución compatible con sustancias biológicas.
Este sistema desarrollado por Pharmacia traba­
ja a presiones inferiores (10-20 atmósferas) a
las utilizadas en los sistemas de HPLC lo que
perm ite optim izar las condiciones de trabajo
F ig . 4 1 - 1 2 A . S e p a r a c ió n p o r
H PLC de la cadena liviana y dei
fragm ento Fd de u na inm unoglo­
b u lin a . L a c a d e n a liv ia n a y el
fragm ento Fd fueron separados a
partir del fragm ento F ab p arcial­
m ente reducido, p o r pasaje a tra­
vés de u n a co lu m n a de fase re ­
versa Cjg, usando un gradiente de
elu ció n disco n tin u o , (— ) % d e
bu ffer B. L a figura interior repre­
senta el SD S-PA G E de los picos
o b te n id o s , c o m p a ra d o s c o n el
Fab y los estándares de peso m o ­
lecular (M ). (Tom ado d e Leoni y
col. T h e prim ary structure o f the
F ab fragm ent o f a protein K A U ,
a m onoclonal im m unoglobulin M
co id a g g lu tin in . J. B io l. C h e m
266: 2836-2842, 1991).
 Métodos cromatográficos de fase líquido-sólido 901

Tiempo (min)

F ig . 41-12B . S eparación por H PL C d e los péptidos d el fragm ento F d Kiego d e la d igestión con Endoproteinasa L y s-C .
Los péptidos fueron separados usando una colum na C |j de fase reversa, con gradiente linear de 0-66% de acetonltrilo en
0.1% de T F A .( — ) gradiente de buffer B; * péptidos radiactivos; la figura interior m uestra la separación de los p ép tid o s
resultantes del clivaje del péptido K5, po r acción de la Endoproteinasa A sn-N , utilizando las m ism as condiciones. (T o m a ­
do de Leoni y col. The priraary structureof the Fab fragm ent o f a protein K A U , a m onoclonal im m unoglobulin M coid ag-
glutinin, J. B iol. C hem 266; 2836-2842, 1991).

para mantener la actividad biológica e integri­
dad estructural de las biomoléeulas.
Este sistem a puede ser aplicado a técnicas
erom atográficas convencionales como la cro­
matografía de intercambio iónico, la filtración
por geles, la cromatografía de afinidad y el cro­
matoenfocado y a técnicas que fueron desarro­
lladas a partir de estos sistemas como la croma­
tografía por interacción hidrofóbica y en fase
reversa.
Los sistem as de FPLC fueron diseñados y
desarrollados específicamente para la separa­
ción de moléculas biológicas y presentan algu­
nas ventajas con las técnicas eromatográficas
tradicionales y de alta perform ance (HPLC).
Algunas de esas ventajas son;
• Alta recuperación de la actividad biológica
• Compatibilidad con buffers salinos y solven­
tes orgánicos
“ Alta velocidad, alta resolución, alta capacidad
• Escala analítica y preparativa.
En la figura 41-13 puede verse un equipo de
FPLC fabricado por Pharmacia. La presión de
trabajo en estos sistemas permite utilizar m ate­
riales más resistentes a la corrosión como c o ­
lumnas de vidrio o tubuladuras plásticas, a di­
ferencia de los accesorios generalmente de ace­
ro, necesarios para las presiones a la que se d e ­
be trabajar en sistemas de HPLC. Estos siste­
mas son compatibles con buffers salinos y to ­
dos los materiales en contacto con el eluyente
son totalmente resistentes a la corrosión por sa­
les, alto o bajo pH y a un amplio espectro de
solventes orgánicos. Esto es debido a que los
extractos biológicos son invariablem ente d i­
sueltos en este tipo de soluciones para preser­
var su actividad biológica y estructura.
6.2.1. Matrices utilizadas en FPLC
Los sistemas de alta resolución emplean re ­
sinas con partículas de diámetro muy pequeño
(3-15 |im ) lo que sumado a la baja difusión y la
presión empleada le permite obtener cromato-
gramas con alto poder resolutivo.
La m ay o ría de las m atrices u tilizadas en
FPLC son a base de agarosa como la Sepharosa
o la Superosa. La utilización de estas resinas es
902 Métodos inmunoquímicos
F ig . 41-13. Equipo de F P L C ” (Pliíirmacia): (1) graficador, (2) colector de fracciones, (3) colum nas, (4) m ezclador, (5) d e­
tector U .V., ( 6) bom bas, (7) program ador.
posible debido a que la presión de trabajo del
sistem a no es excesivam ente alta como para
que se produzca un apelmazamiento de la ma­
triz. No ocurre lo mismo con los sistemas de
HPLC donde las presiones usadas son mucho
mayores por lo que se requerirán matrices más
resistentes a base de sílice.
Las Monobeads son partículas de polímeros
hidrofílicos monodispersos para cromatografía
de alta velocidad y alta resolución. La estructu­
ra de estas resinas permite cromatografías alta­
mente resolutivas a bajas presiones debido a
que la gran uniformidad en su tamaño facilita
el empaquetamiento del gel. La empresa Phar­
macia ofrece en el comercio columnas preem-
paquetadas para uso analítico como la Mono Q
(intercam biador aniónico fuerte, con aminas
cuaternarias como grupo funcional), M ono S
(intercam biador catiónico fuerte, con grupos
sulfónicos). M ono P (usada en crom atoenfo-
que, con aminas terciarias y cuaternarias como
grupos funcionales) y la aliiyl- o phenyl-Supe-
rosa (usada en la cromatografía por interacción
hiodrofóbica).
También pueden obtenerse en el comercio
resinas derivadas de la agarosa utilizadas para
el empaquetamiento de columnas, generalmen­
d l‘* E — *fc.»
(7 ),
te en escala preparativa, como la Q-Sepharosa
y la S-Sepharosa usadas en crom atografía de
intercambio iónico y la P-Sepharosa usada en
cromatoenfocado. Esto representa una ventaja
con los sistemas de HPLC donde las columnas
se adquieren únicam ente preempaquetadas lo
que eleva los costos con respecto a las colum­
nas armadas en el laboratorio.
En la cromatografía de exclusión molecular
se utilizan columnas con matrices de Supero­
sa. Se debe tener en cuenta que los sistemas de
FPLC no han resultado de gran utilidad en este
tipo de cromatografía dado que no se ha obser­
vado un aum ento considerable en la reso lu ­
ción, principalm ente para m oléculas de alto
peso molecular como las proteínas. Esto hace
que la cromatografía convencional, en el caso
de filtración por geles sea, en general, de elec­
ción.
La cromatografía en fase reversa no es tan
utihzada en estos sistemas como en HPLC. D e­
bido a la naturaleza de los solventes, esta técni­
ca cromatográfiea es aplicada a proteínas cuan­
do la pérdida de su actividad biológica no es
importante. Los geles usados en FPLC son el
ProRPC en el caso de proteínas y el Pep RPC
para péptidos de menor tamaño.
 Métodos cromatográficos de fase líquido-sólido
6.2.2. Aplicaciones del FPLC
Este sistema se utiliza principalmente para la
purificación de biomoléculas en donde el man­
tenimiento de la actividad biológica de la m is­
ma es muy importante (enzimas, inmunoglobu­
linas, etc).
La p u rific a c ió n de A cM o co n stitu y e un
ejemplo claro de la aplicación de esta metodo­
logía. Una de las técnicas cromatográficas más
utilizadas en los sistemas de FPLC para la puri­
ficación de AcMo es la cromatografía de inter­
cambio iónico la que, en general, ofrece una
separación rápida y de alta calidad. Es difícil
recomendar un procedimiento general de puri­
ficación, pues los AcMo poseen distintos pun­
tos isoeléctricos, aun aquellos de una m ism a
subclase de inmunoglobulina.
La cromatografía de intercambio aniónico se
utiliza frecuentemente, particularmente en los
casos en que la muestra consiste en líquido as-
cítíco (LAT). La estrategia general consiste en
aprovechar la diferencia entre el punto isoeléc­
trico (pl) de los AcMo (generalmente entre 6.0
y 8.5) y el pl de los principales contaminantes
del LAT como la albúmina y la transferrina (pl
= 4.7-5.0). De esta manera, el AcMo es reteni­
do débilmente mientras que los contaminantes
son fuertem ente retenidos. El gradiente em ­
pleado para la elución se elegirá de manera tal
que el AcMo eluya libre de contaminantes en
primer lugar.
La utilización de colum nas de alta resolu­
ción para cromatografías de intercambio anió­
nico {Mono Q) requiere una preparación de la
muestra muy rigurosa, eliminando toda partícu­
la por filtración y rem oviendo contaminantes
que pudieran coagular como lípidos, lipoproteí-
0.2 -
F ig . 4 1 - 1 4 . P e r f il d e
e lu c ió n d e un A cM o
m urino del isotipo IgG I ,
por crom atografía de in ­
te rc a m b io a n ió n ico , de
u n a c o lu m n a M o n o Q
H R /5 5 ( P iia r m a c ia ) ,
B u ffer A: T ris /C IH 20
niM , pH 8,5; B u ffer B:
buffer A + N aC l !M , p ll
8 ,5 . M u e s tr a ; 100 |il
L A T + 100 Lil de buffer
A. Flujo: 1 ml/m in.
nas, etc.; así mismo, es im portante el lavado
periódico de las columnas para lograr una m a­
yor vida útil de la misma.
La figura 41-14 m uestra el perfil crom ato-
gráfico de purificación de un AcMo de isotipo
IgGj a partir de una muestra de líquido ascítico
(LAT) previamente precipitada con S0 4 (NFI^)2
al 50% de saturación, utilizando una colum na
Mono Q.
En muchos de los LAT analizados se obser­
va que no toda la transferrina eluye de acuerdo
a su pl, probablemente debido a que la transfe­
rrina eluye formando un complejo con la inm u­
noglobulina. Para disminuir la formación de es­
tos complejos, la precipitación salina se realiza
durante 2 horas en frío y no durante una noche,
como es realizada comúnmente; de esta form a
es posible ehminar gran cantidad de albúmina
y una cantidad apreciable de transferrina del
LAT en estudio.
7. E V A LU A C IÓ N D E LO S P E R F IL E S
CROMATOGRÁFICOS: RESOLUCIÓN
El resultado de una separación cromatográfi­
ca es a menudo expresado como la resolución,
es decir, la separación entre los picos de in te­
rés. La resolución (Rs) es determinada a partir
del cromatograma como se muestra en la figura
41-15.
La resolución entre dos picos se define m ate­
máticamente como la relación entre la distancia
entre los picos máximos (V^-Vj) y el promedio
d el a n c h o de la b a se de lo s dos p ic o s
{'W^+'W^/2). Los volúm enes de elución y los
anchos de los picos deben ser medidos con las
mismas unidades para así obtener un valor de
resolución adimensional.
- 100
IgG,
h
i A / Albúminá %B
T ran sferrina
,/ A /
20 ; 46
Tiempo{min)
904 Métodos inmunoquímicos
w.
Rs es lina verdadera medida de la eficiencia
de una separación crom atográfica y es usada
para determinar si es necesaria una mejor opti­
m ización del proceso. Si Rs = 1,0, se asume
que el pico presenta aproximadamente un 98%
de pureza lo que surge a partir de la integración
de las correspondientes áreas. De la misma for­
ma, si Rs = 1,5 la pureza será del 100% (fig.
41-16).
Matemáticamente Rs es proporcional al pro­
ducto de selectividad (a), eficiencia (N) y ca­
pacidad (k’) de la columna cromatográfica (1).
(a - 1) k’
R s = 1/4 --------- (VÑ) ( 1)
(1 + k ’)
La selectividad define la capacidad del mé­
todo crom atográfico de distinguir dos picos
(distancia entre picos) mientras que la eficien­
cia está relacionada con el ancho y el área de
los picos, lo que se debe al fenómeno de difu­
sión dentro de la columna (fig. 41-17).
Del análisis de la ecuación (1) podemos de­
ducir que una buena selectividad es más impor­
tante que una alta eficiencia.
Teóricamente, la eficiencia se expresa como:
N = L/HEPT
definiendo HEPT como la altura equivalente de
un plato teórico, y L como el largo de la co­
lumna.
La altura de un plato teórico depende del ta­
maño de las partículas de gel. Cuanto menor
sea el tamaño de ésta, menor será la altura de
un plato teórico y de esta forma será mayor la
F ig . 41-15. D ete rm in a­
c ió n d e la R e s o lu c ió n
(Rs) entre dos picos.
V,-V,
■(W^ + W j / 2
Volumen
eficiencia, lo que llevará a una mayor resolu­
ción.
Por otra parte la eficiencia depende también
del flujo de la columna. En la cromatografía de
exclusión molecular, un flujo muy lento hará
que las moléculas tengan más tiempo para di­
fundir dentro de la columna lo que producirá
una disminución de la eficiencia. Por otra par­
te, un flujo muy alto no permitirá que las molé­
culas entren en las partículas del gel, lo que
disminuirá la eficiencia. Luego existe un flujo
óptimo donde la eficiencia será máxima.
Experimentalmente, la eficiencia se calcula a
partir del cromatograma según la ecuación (2):
( 2)
donde es el ancho del pico a la mitad de su
altura.
La capacidad es una constante que está rela­
cionada con el poder de retención de la matriz
cromatográfica. Una matriz con un alto factor
de capacidad hará que los componentes sean
altamente retrasados. En la crom atografía de
exclusión molecular todos los picos aparecen
entre el V„ el V„-i-Vj, luego la capacidad de este
método cromatográfico es baja. En cambio en
las técnicas adsortivas los picos pueden apare­
cer más allá del V^+Vj siendo la capacidad de
estos métodos mayor.
Este factor no debe ser confundido con la
“capacidad de siembra” de la columna la cual
es expresada como mg de muestra/ml de resina
en el caso de las técnicas adsortivas o en volu­
men de muestra/ml de resina en el caso de téc­
nicas no adsortivas.
 Métodos cromatográficos de fase líquido-sólido 905

Buena selectividaci

- Aita eficiencia

■e
o
-— Baja eíiciencia

Volumen
2%B 2%A

Mala sslectlvldad

.... - Alta ef'ciencis

R„= 1.5

-Baja eficiencia

-1 0 0 % A -1 0 0 % r Volumen
Volumen

F ig . 41-16. R esultados de separaciones crom atográficas F ig. 41-17. Efecto de la selectividad y eficiencia en la r e ­
con diferentes resoluciones. solución.

B IB L IO G R A F ÍA 4. A ntibodies. A Laboratory M anual. E d H arlow y D av id

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Eleetroforesis en gel de poliacrilamida;
isoelectroenfocado; inmunotransferencia
(“immunoblotting”)
RICARDO MARGNI
EMILIO L. MALCHIODI
MÓNICA G. CHIARAMONTE
ELECTROFORESIS EN GEL
DE POLIACRILAMIDA
Es un método analítico de alto poder resolu­
tivo que com bina la m igración en un campo
eléctrico y el tamizado molecular a través de
un gel de corrida.
El poro del gel desempeña un papel funda­
mental. En algunos geles, como los de agarosa,
los poros son suficientem ente grandes como
para no retener a la mayoría de las moléculas
proteicas que migran, por lo que aquí la separa­
ción dependerá fundamentalmente de la carga
neta de éstas. Además, dado que se trata de un
producto natural, sus poros no son hom ogé­
neos. En el caso de los geles de poliacrilamida
pueden conseguirse poros de diferentes diáme­
tros según las condiciones de la polim eriza­
ción; como consecuencia, para un gel de deter­
minado poro, el tamaño molecular y la carga
neta serán los factores determinantes de la se­
paración de las moléculas de una mezcla.
Los geles de poliacrilam ida resultan de la
polimerización en largas cadenas de la acrila-
mida monomérica (CH^ = CH— CO— NH^) y
de su entrecruzam iento por interm edio de la
N,N-metilenbisacrilaÍTiida (CH, = CH — CO—
NH — CH^ ^ NH — CO ™ CH = CH^), co­
rrientemente designada bisacrilamida. El poro
del gel formado dependerá de las concentracio­
nes relativas de ambos reactivos durante la po­
limerización.
La polimerización de la acrilamida necesita
de un iniciador del proceso. Los más común­
mente usados son el persulfato de amonio y la
riboflavina. Se añade, además, como acelera­
dor, N ,N ,N ’,N ’-tetram etiletilendiam ina (TE­
MED). En el sistema persulfato de amonio-TE-
MED, este último cataliza la formación de ra­
42
dicales libres a partir del persulfato, lo que en
definitiva inicia la polimerización. En este me­
canismo interviene la base libre TEMED, por
lo que la acidificación retarda la polim eriza­
ción. Cuando se usa riboflavina, para que la
polimerización se inicie se requiere luz; ésta,
origina radicales libres al fotodescomponer la
riboflavina.
El oxígeno inhibe la polimerización; ello ha­
ce que los reactivos a emplear deban ser pre­
viamente desgasificados.
El tamaño del poro del gel decrece a medida
que la concentración de acrilam ida total au­
menta. Para una determinada concentración de
acrilamida monomérica, el tamaño del poro de­
penderá del entrecruzamiento producido.
Experimental mente, la eleetroforesis en gel
de poliacrilamida puede efectuarse en tubos o
en placas. En el primer caso se utiliza un ciUn-
dro de gel para cada muestra a analizar mien­
tras que cuando se emplean placas, pueden co­
rrerse en form a sim ultánea, en una sola de
ellas, varias muestras. Este procedimiento re­
sulta útil para separar proteínas de una mezcla,
las que pueden ser aisladas por simple cortado
del gel y posterior elución. Si bien las cantida­
des recuperadas son pequeñas, muchas veces
son suficientes para el análisis de algunas de
sus propiedades o para usarlas como inmunó-
genos.
La eleetroforesis en geles de poliacrilamida
puede desarrollarse también usando soluciones
buffer que contienen sustancias disociantes, en
especial detergentes iónicos. Una de las más
usadas es el dodecilsulfato de sodio (SDS). Las
proteínas a analizar son hervidas a 100°C en
presencia de un exceso de SDS y 2-mercaptoe-
tanol. En esas condiciones el tiol rom pe los
puentes disu lfu ro que pudieran e x istir y el
 Electroforesis en gel de poliacrilamida
agente desnaturalizante hace que la proteína se
desdoble en sus polipéptidos constitutivos, los
que fijan SDS en una relación constante (1,4 g
de SDS por g de polipéptido). A causa de ello
la carga intrínseca del péptido se hace insignifi­
cante ante el exceso de carga negativa del SDS;
como consecuencia, la carga de todas las molé­
culas será prácticamente idéntica. Su desplaza­
miento en un campo eléctrico, en el que el so­
porte de corrida es un gel de determinada poro­
sidad, dependerá exclusivamente de su tamaño
molecular. Este método, conocido como elec­
troforesis en gel de pohacrilamida en presencia
de SDS o SDS-PAGE, permite, por compara­
ción con sustancias de peso molecular conoci­
do que han sido corridas simultáneamente, de­
terminar el peso molecular relativo de los pro­
ductos en análisis. Se lo utiliza en forma rutina­
ria con tal finalidad, y para ello sólo son nece­
sarias ínfimas cantidades de muestra.
La electroforesis en gel de poliacrilam ida
puede desarrollarse usando sistem as b u ffer
continuos o discontinuos. En el primer caso,
los iones que constituyen el buffer durante todo
el recorrido de la muestra (gel, reservorios) son
los mismos y el pH es constante. En algunas si­
tuaciones sólo puede variar la concentración
iónica en los vasos de contención o reservorios.
Cuando se usan estos sistemas, las muestras a
analizar se siembran directamente en el gel de
resolución. En los sistem as discontinuos, el
buffer de los geles y el de los reservorios de los
electrodos son diferentes. Normalmente los pH
de ambas soluciones buffer son también distin­
tos. I^as muestras a analizar se siembran en un
gel de poro grueso (gel de paso rápido, apila-
miento o stacking) en buffer Tris-HCl, pH 6,8,
al que se ha hecho polimerizar por sobre el gel
de corrida (pH 8,8). El buffer del recipiente
que contiene el cátodo es Tris-ghcina pH 8,3.
E llo perm ite que volúm enes apreciables de
muestras diluidas de proteínas puedan ser ana­
lizadas, ya que al ser sembrados en un gel de
este tipo en el que los iones y el pH de los buf­
fer son diferentes, las moléculas se desplazarán
a través del gel y se concentrarán en una zona
estrecha, en el límite correspondiente al gel de
corrida, previo a su separación en éste.
Al pH del gel de apilamiento, o stacking, y
de la m uestra (pH 6,8), la glicina que forma
parte del buffer del reservorio catódico está
muy poco disociada ya que éste es próximo a
su pKa, por lo que su movilidad en el campo
eléctrico será reducida. Los iones cloruro, en
cambio, a ese pH tendrán una movilidad mayor
dado su grado de disociación y la movilidad de
las proteínas ocupará una posición intermedia.
Cuando se aplique un voltaje los iones cloruro
migrarán alejándose de la ghcina, dejando tras
de ellos una zona de menor conductividad. C o­
907
mo ella es inversamente proporcional al campo
de fuerza, esta zona genera un gradiente de vol­
taje mayor que acelera la migración hacia ella
de la glicina, la que se aproxim a a los iones
cloruro, creándose un estado de uniformidad en
el que los productos de movilidad y gradiente
de pH de ambos iones es igual. Éstos se m u e­
ven ahora a la misma velocidad, con un estre­
cho límite de separación entre ellos. M ientras
se desplazan a través de la muestra y del gel de
stacking, un gradiente de bajo voltaje se mueve
antes que ellos y otro de alto voltaje, después.
Cualquier proteína que se mueva por delante de
la banda iónica es rápidamente atrapada ya que
su movilidad es menor a la de los iones cloru­
ro, pero mayor que la de la glicina. Como co n ­
secuencia es concentrada en una delgada ban­
da. Las diferentes proteínas se irán apilando
unas sobre otras en una banda delgada por d e­
trás de los iones cloruro y por delante de la g li­
cina, acumulándose finalmente en el límite del
gel de resolución. En ese momento, al aum en­
tar el pH (gel de resolución: pH 8,8) la glicina
incrementa su disociación y su movilidad efec­
tiva sobrepasa a la proteína y migra junto a los
iones cloruro. Al mismo tiempo, al disminuir el
tamaño del poro del gel, las moléculas protei­
cas se m ovilizarán en una zona uniforme de
gradiente de voltaje y pH pero con un despla­
zamiento regulado por sus respectivas cargas y
tamaños moleculares, lo que hace posible la se­
paración de diferentes especies m oleculares
dentro de una m ezcla. En el caso del SD S-
PAGE, la carga neta de las diferentes m olécu­
las es prácticamente la misma por lo que la se­
paración será sólo por tamaño molecular.
Existen otros sistemas de electroforesis en
ausencia de SDS. En este caso, el sistema está
diseñado de tal forma que se mantienen la co n ­
formación nativa de las proteínas, las interac­
ciones entre sus subunidades y su actividad
biológica. La separación de las proteínas en e s­
tado nativo ocurre de acuerdo al tamaño y la
carga intrínseca. Uno de los inconvenientes ra ­
dica en que la determinación del peso m olecu­
lar sólo es válida si los patrones de peso m ole­
cular usados tienen la misma conformación, el
mismo grado de hidratación y el mismo volu­
men parcial específico, con lo que este sistema
no será el de elección si se quiere determinar el
peso molecular de una proteína en particular.
La resolución de una m ezcla de proteínas
que puede lograrse utilizando geles de pohacri­
lamida puede ser mejorada por varios factores:
el uso de pequeñas cantidades de muestra, el
uso de sistemas de buffers discontinuos y la re ­
moción de altas concentraciones de iones de las
muestras.
La separación está influida por el pH del gel
(solo en el caso de electroforesis de proteínas
908 Métodos inmunoquímicos
nativas) y por la concentración del gel. Esta
concentración debe ser tal que no se produzca
una total exclusión del gel o que las proteínas
migren con el frente de corrida.
En el caso de una m ezcla heterogénea de
proteínas la concentración elegida del gel de
resolución será aquella que produzca un ade­
cuado perfil de todos los componentes de inte­
rés.
Es importante destacar que la relación entre
el log,Q del peso molecular y la movilidad rela­
tiva de las proteínas es lineal en un rango limi­
tado de peso molecular. Como regla general
para SDS-PAGE la relación se mantiene en los
siguientes rangos: 15% acrilamida para 12-45
kD; 10% acrilamida para 15-70; 5% acrilami­
da, 60-200 kD.
Una alternativa para el análisis inicial de una
mezcla de proteínas por SDS-PAGE es utilizar
geles de resolución en gradiente, en los cuales
la concentración de acrilamida aumenta, con la
disminución consecuente del tamaño de poro,
en la dirección de la migración eléctrica. Esto
permite, por un lado, el fraccionamiento en un
rango de peso molecular más amplio del que se
logra con una concentración uniforme y, ade­
más, el empleo de un gradiente en el tamaño
del poro provoca una mayor agudeza y defini­
ción de las bandas durante la migración. Los
gradientes lineales más comúnmente utilizados
para un anáhsis inicial por SDS-PAGE son de
5-20% o 6-18%.
PARTE EXPERIMENTAL (para el método
discontinuo desarrollado a pH alto)
R eactivos
1. Purificación de drogas
Las drogas comerciales acrilamida, bisacrila­
mida y dodecilsulfato de sodio (SDS) pueden
ser repurificadas antes de su uso, si fuera nece­
sario.
a) Acrilamida. Disolver 70 g de acrilamida
en 1 litro de cloroformo calentado a 50°C. Fil­
trar en caliente y recristalizar a -2 0 “C. Separar
los cristales por filtración al vacío en Buchner,
lavar con cloroformo frío y secar al vacío.
Nota: cuando se trabaje con las manos acri­
lam ida o bisacrilamida, deben usarse guantes
descartables pues son neurotóxicas. La acrila­
mida polimerizada no es tóxica.
b) Bisacrilamida. Disolver 10 g en 1 litro de
acetona calentada a 50“C, filtrar en caliente y
recristalizar a — 20°C. filtrar y lavar con aceto­
na fría; secar al vacío.
c) SDS. Disolver 200 g de SDS en 3 litros
de etanol hirviendo; filtrar en caliente y recris­
talizar a 4“C. Separar los cristales por filtra­
ción, lavar con etanol y secar.
2. Soluciones de reserva
a) Acrilamida-bi.mcrilam.ida (30:0,8).
Acrilamida ............................................ 30 g
B isacrilam ida........................................ 0,8 g
Agua destilada c s p ...............................100 mi
Disolver, filtrar y conservar en frasco oscuro a
4°C.
b) TEMED. Conservar a 4°C.
c) Persulfato de amonio al 1,5%. Conviene
preparar pequeños volúm enes (10 mi) en el
momento de usar.
d) SDS al 10%. Se prepara una solución al
10% en agua (P/V). Conservada a 4°C es esta­
ble varias semanas. No conviene preparar gran­
des volúm enes. C om o a bajas tem peraturas
cristaliza, es necesario calentar a 37°C antes de
su uso.
e) B u ffe r p a ra g el de apilam iento, p o ro
grueso o stacidng. Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8.
Disolver 6 g de Tris en 40 mi de agua desti­
lada y llevar a pFI 6,8 con HCl 1 N (+48 mi).
Completar a 100 mi con agua, filtrar y conser­
var a 4“C.
f) Buffer para gel de resolución. Tris-HCl 3
M, pH 8,8
Disolver 36,6 g de Tris en 48 mi de HCl 1 N.
Ajustar pH y llevar a 100 mi con agua destila­
da. Filtrar y conservar a 4°C.
g) Buffer para los reservorios. Tris 0,25 M-
ghcina 1,92 M, pH 8,3.
Disolver 3,03 g de Tris y 14,4 g de glicina
en 60 mi de agua destilada. Ajustar a pH si fue­
ra necesario. Completar a 100 mi, m ezclar y
conservar a 4“C. Si el buffer va a ser usado en
SDS-PAGE, añadirle 1% de SDS.
h) Geles de poro grueso para apilam.iento
(stacking) y de resolución. El gel de poro grue­
so es el mismo en todos los casos. El gel de re­
solución puede tener diferentes concentracio­
nes de acrilamida-bisacrilamida, lo que signifi­
ca geles de poros diferentes, en el cuadro 42-1
están indicadas las cantidades de los diferentes
reactivos a mezclar para lograr los geles desea­
dos.
i) Solución fijadora. A gua-m etanol-ácido
acético (5:5:2).
j) S o lu c ió n c o lo ra n te. C o o m assie B lue
R250 al 0,1%, disuelto en solución fijadora.
k) Solución decolorante. Resulta útil la si­
guiente mezcla:
Isopropanol............................................. 12,5 mi
Ácido acético .......................................... 10 mi
Agua destilada c s p ................................. 100 mi
 Eleetroforesis en gel de poliacrilamida 909

C u ad ro 42-1. Mililitros de reactivos de reserva necesarios para preparar el gel de apilamiento

(stacldng) diferentes geles de resolución

G eles de resolución
Gel de (concentración fin a l en % de acrilam ida)
apilam iento
Solución de reserva (stacking) 20 17,5 15 12,5 10 7,5

A crilam ida-bisacril am ida (30:0,8) 2,5 20,0 17,5 15,0 12,5 10,0 7,5 5,0
B uffer para gel de apilam iento
(stacking) 5.0
B uffer para gel de resolución 3.75 3,75 3.75 3,75 3,75 3,75
P ersulfato de am onio al 1,5% 1.0 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5
A gua destilada 11,5 4.75 7,25 9.75 _ 12,25 . 14,75 17,25 19,75
TE M E D 0,015 0,015 0,015 0,015 0,015 0,015 0,015 0 ,0 1 5

V olum en final (mi) 20 30 30 30 30 30 30 30

C u an d o se d ese e h a c e r S D S -P A G E , añ a d ir a los com ponentes in d ic a d o s 0 ,2 m i d e S D S al i 0% ai gel d e a p ilam ien to (sta kin g ) y 0,3 m ] a lo s
g eles de re so lu c ió n , los que serán desc o n ta d o s d el volum en d e ag u a a añ a d ir in d icad o e n el cuadro.
C om o co n se cu en c ia de las d ilu cio n es, las co n c entraciones fin ale s do las diferen tes so lu cio n es b u ffer s erán las siguientes: a) en el gel d e a p i-
laraiento: T iis-H C l 0 ,125 ]VI, p H 6,8; b ) en el gel d e resolución: T ris -H C l 0,375 JVI, pH 8,8. La solución d e re serv a del b u ffe r d e los re s e rv o -
rios se dilu y e 1:10 e n agua d estilad a para su uso, p o r lo que la co n c e n tra c ió n d u ra n te la co rrid a será T ris 0,025 M , g licin a 0 ,1 9 2 M, pH 8,3

3. Preparación de la muestra para La cantidad de muestra a sembrar es im por­

SDS-PAGE tante, dado que un exceso puede llevar a una
distorsión de las bandas de esa calle y de las
La muestra debe ser procesada previamente calles adyacentes en el caso de geles en placa,
a su análisis, para lo cual será mezclada con un mientras que una cantidad en defecto puede lle­
volumen igual de Tris-HCl 0,125 M, pH 6,8, var a que componentes en pequeñas cantidades
conteniendo 4% de SDS, .10% de 2-mercaptoe- no puedan ser detectados. Por lo tanto es co n ­
tanol, 20% de sacarosa y 0,002% de azul de veniente probar varias concentraciones de la
bromofenol. Inmediatamente después se la c a ­ muestra a anaUzar para determinar cuál es la
lienta en baño de agua hirviente por 3 minutos correcta. En general en el caso de una m ezcla
para desnaturalizar los componentes proteicos compleja 50-100 |Tg es suficiente para un buen
de la muestra y se la deja enfriar a temperatura análisis. Respecto al volum en sembrado, d e ­
ambiente antes de usar. penderá del sistema empleado; en un sistem a
Como no siempre se hace tratamiento de la continuo es deseable un volumen tan pequeño
muestra con 2-mercaptoetanol, es recomenda­ como sea posible para una mejor resolución.
ble proceder de la siguiente manera. Disolver En cambio en el caso de sistemas discontinuos,
0,1512 g de Tris en 4 mi de agua destilada y el em pleo de un gel de apilam iento (gel de
llevar a pH 6,8 con HCl 1 N. Añadir 0,4 g de stacking) hace que nos independicemos del v o ­
SDS, disolver, añadir 2 g de sacarosa, disolver lumen, excepto por la capacidad de la calle.
y completar a 9 mi. Añadirle 0,1 mi de una so­ Previo a la aplicación en el gel es importante
lución de 2 mg de azul de bromofenol disueltos eliminar por centrifugación, cualquier material
en 1 mi de agua destilada. Conservar a 4°C. Si insoluble, de lo contrario podría producirse una
se desea incorporar el agente reducción 2-mer­ especie de “chorreado” durante la corrida elec-
captoetanol, se añaden 50 jal de éste a 0,5 mi de troforética.
muestra a analizar, mezclados con igual volu­
men de la solución buffer indicada. En caso 4. Eleetroforesis
contrario se elimina el 2-mercaptoetanol y la
solución b u ffer se m ezcla con un volum en La eleetroforesis en gel de poliacrilamida y
igual de la muestra a analizar. En ambos casos, la SDS-PAGE pueden desarrollarse en peque­
previo a la siembra, la mezcla es hervida por 3 ños cilindros o en placas. En las figuras 42-1;
m inutos y enfriada luego a tem peratura am ­ 42-2; 42-3; 42-4; 42-5 y 42-6 pueden observar­
biente. se las características correspondientes a lo s
Si la corrida en SDS-PAGE va a ser desarro­ equipos usados en ambos casos y resultados
llada junto con patrones de comparación de pe­ obtenidos en las corridas.
sos moleculares conocidos con el objeto de de­
terminar los PM relativos de las muestras en /. Eleetroforesis en tubos cilindricos. G ene­
análisis, aquéllos deben ser previamente proce­ ralmente los equipos tienen capacidad para 8
sados de la misma manera que lo fueron éstas. tubos cilindricos de 80 mm de alto y 5 mm de
910 Métodos inmunoquímicos
diámetro interno. Para conseguir después de las
.corridas electroforéticas un buen desprendi­
miento del gel, los cilindros de vidrio deben ser
previam ente siliconados. Para ello, preparar
una solución de silicona en isopropanol-tolue-
no (10:90) con la que se llenan los tubos previa
obturación de uno de sus extremos usando pa-
rafilm o cualquier dispositivo adecuado. Dejar
en contacto unos minutos, volcar la solución,
desobturar los tubos y ponerlos en estufa a
50°C para eliminar los restos de solventes.
El volumen de gel de poro grueso y de reso­
lución a preparar depende del número de tubos.
Establecida la cantidad mezclar todos los reac­
tivos indicados en el cuadro 42-1, excepto el
TEMED. Desairear por aspiración con vacío, y
F ig . 42-2. Fotografía del equipo usado p ara electroforesis
en gel de p oliacrilam ida en tubo.
F ig . 4 2 - 1 . E sq u e m a .s d e
e le c tr o f o r e s is en g e le s d e
p o li a c r i la m i d a , A . a y b ,
cubas de corrida, con buffer;
c, e le c tr o d o s d e p la tin o o
carbón; d, tubos de corrida.
B, repre.sentación esquem á­
tica d e electroforesis en gel
de p o liacrilam id a en placa.
1. Gel de poliacrilam ida pa­
ra el ap ilad o o s ta ck in g de
las p roteínas de la m uestra.
2, G el de resolución. 3 y 4.
R e se rv o rio s q u e co n tien en
las soluciones buffer. 5 y 6 .
Electrodos.
sólo al fin a liz a r la o p e ra c ió n se añ ad e el
TEMED el cual se incorpora por agitación sua­
ve. El gel así preparado está en condiciones de
ser usado.
Para el llenado de los tubos de vidrio con los
geles, obturar su extremo inferior y mantener­
los en posición vertical. Para tubos de 80 mm
de alto introducir gel de resolución hasta 65
mm de altura, utilizando pipeta Pasteur y evi­
tando inclusión de burbujas de aire. Para evitar
la formación de menisco cubrir el gel con agua,
con cuidado, sin mezclar. Dejar gelificar a tem-
F ig. 42-3. Fotografía de una corrida electroforética en gel
de poliacrilam ida en tubo.

F ig . 42 -4. A , esq u em a del equipo
p ara electroforesis en gel de p o lia­
crilam ida en placa; B y B ’, vidrios
usados para el arm ado de las placas
de gel de poliacrilam ida; C y C ’, se­
paradores de acrílico para los bordes
la terales e in fe rio r; D , p e in e p ara
elaborar las cam aritas de siem bra, y
E , sujetadores metálicos.
1 cm
11,5 cm
0,5 cm 0,7 cm
peratura am biente evitando vibraciones, que
pueden alterar la calidad de los poros. Si la co­
rrida electroforética no se realiza el mismo día,
conservar los tubos en cámara húmeda.
Producida la gelificación, volcar el agua por
inversión y añadir una capa de 5-10 mm de es­
pesor de gel de poro grueso; cubrir con agua y
dejar gelificar como en el paso anterior. Inm e­
diatamente después se arma el equipo y se co­
nectan los tubos con el gel.
La cantidad de muestra a sembrar puede os­
cilar entre ÍO-100 |J,1, dependiendo ello de la
concentración de los diferentes componentes
presentes. Entre 1 y 10 |ig pueden ser bien de­
tectados, considerándose 100 |ig en total, una
cantidad aceptable cuando se trata de una m ez­
cla compleja. Efectuada la siembra, se comple­
ta el llenado de los tubos con buffer del reser-
vorio (solución de reserva diluida 1:10 en agua
destilada). Ambos reservorios, el superior y el
inferior, en los que se hacen penetrar los extre­
mos inferiores de los tubos, son llenados con el
buffer correspondiente (diluido 1:10). Inmedia­
tamente después se conectan los electrodos a la
fuente de poder (cátodo: reservorio superior, y
Electroforesis en gel de poliacrilamida 911
- 12,8 cm-
-19cm -
-18cm -
á fc - " 1 8 5 c m ^ ^ ^ ^ 5
ánodo: reservorio inferior). La intensidad de
corriente debe ser de 4 mA por tubo durante el
empaquetamiento de las proteínas en el gel de
apilamiento o stacking y de 6 mA cuando se
desplazan en el gel de resolución. La corrida se
da por fin alizad a cuando el colorante lib re
(azul de bromofenol), que en las condiciones
de la corrida se desplaza por delante de las p ro ­
teínas, llega al extremo inferior del tubo. Para
las condiciones especificadas, el tiempo de co ­
rrida es ele 2-2,5 horas.
Se desarm a el aparato y se procede a d es­
prender el gel contenido en los cilindros de v i­
drio. Ello se consigue con un mandril adecua­
do, operando debajo del agua en un recipiente
apropiado, para evitar que el gel se rompa. El
desprendimiento se ve facilitado si los tubos de
vidrio fueron previamente siliconados. Los ci­
lindros de gel se transfieren a tubos de 120x10
mm con solución fijadora, la que luego de 30
minutos es sustituida por solución colorante.
Después de 8-10 horas de tinción se procede a
decolorar para eliminar el colorante no retenido
por los componentes de la muestra analizada.
Se efectúan varios recambios del decolorante.
912 Métodos inmunoquímicos

En el comercio existen equipos especiales

que permiten cuantificar por densitometría los
diferentes componentes sometidos a análisis.
Dada su mayor laboriosidad, actualmente el
uso de la eleetroforesis en tubos cilindricos está
restringido a los fines preparativos, cuando se
desea aislar y recuperar del gel algunas de las
proteínas sometidas a la separación electroforé-
tica, ya sea por elución con agua destilada o
por eíectroelución. Los geles cilindricos tienen
capacidad para sembrar mayores voMmenes de
muestras, por lo cual son mejores para estos fi­
nes.
La eleetroforesis empleando geles cilindri­
cos es actualmente más utilizada en las técnicas
de eleetroforesis en 2 dimensiones, donde la
mezcla de proteínas se separa en una primera
dimensión segiín sus pL en un gel cilindrico
(en general un tubo capilar), el cual se adosa
luego a un gel en placa para realizar otra sepa­
ración electroforética en una segunda dimen-
F ig . 42-5. Fotografía del equipo usado para eleetroforesis
en gel de acrilam ida en placa.

II. Eectroforesis en placas. Los elementos

dándose por finalizada la operación cuando se necesarios para esta clase de eleetroforesis
observen las bandas proteicas bien teñidas, li­ son:
bres de colorante de fondo.
a) Geles y soluciones buffer: los indicados
para eleetroforesis en tubos.
b) Placas de vidrio: su formato depende del
aparato. Las utilizadas normalmente son de 20
cm X 1 5 cm. Una de ellas posee una escotadu­
ra, que le permite al gel ponerse en contacto
con el buffer del reservorio superior. Para deta­
lles véanse figuras 42-15, 42-4 y 42-5.
e) Separadores: pequeñas láminas de acríli-
co de 1 cm de ancho y de largo tal que permi­
tan cubrir el perím etro correspondiente a las
"Í-. partes laterales e inferior de las placas. El espe­
m m sor de los separadores (1-1,8 mm) será el que
determinará el espesor del gel.
d) Sembrador: para construir en el gel de
poro grueso o apilamiento las pequeñas fosas
que habrán de contener las muestras a sembrar,
se utiliza el dispositivo en forma de peine indi­
cado en la figura 42-4.
e) Sujetadores metálicos: son indispensables
para mantener unidas las placas de vidrio que
conforman la cámara plana que contiene el gel
y para el mantenim iento de éste en contacto
con los reservorios catódicos y anódico.
f) Reservorios: existen diferentes modelos.
El de las figuras 42-4 y 42-5, es usado en nues­
tros laboratorios y está construido en placas de
acrílico de 4 mm de espesor.

Armado del equipo y corrida electroforética.

F ig . 42-6. Fotografía de corridas electroforéticas en placas
correspondientes a Usados de diferentes especies de E nte­
robacterias.
C olocar sobre una superficie lisa y nivelada
una de las placas de vidrio, haciendo deslizar
por los bordes laterales e inferior una banda fi-
 Electroforesis en gel de poliacrilamida 913

kD kD

116-----
97,4----- 116-
97,4^
6 6 ----

4 5 -----

2 9 ----- «a 45-

m 29-

IJ C l! r b c d e f

Fig. 42-7. Sepai-ación por SD S-PA G E de distintos estadios de Trypanosom a cruzi. A . G el de resolución al 10% de acrila-
m ida-bisacrilam ida. a. Patrones de peso m olecular; b. tripom astigotes m etacíclicos; c. am astigotes; d . tripom astigotes sa n ­
guíneos; e. epim astigotes. B. G el de resolución al 7,5% de acrilam ida-bisacrilam ida. a. Patrones de peso m olecular; b -f.
tripom astigotes obtenidos luego de diferentes días de cultivo. La tinción se realizó con C oom assie B lue R2,‘)0. A la iz­
quierda se indica la m asa m olecular relativa en kD de los patrones de peso m olecular.

liforme de agar (2,5% en agua) fundido en ba­
ño de agua liirviente. Apoyar sobre ella los se­
paradores de modo de formar un marco con el
borde inferior y los laterales. Distribuir agar
sobre los separadores, de manera igual a la des­
crita, apoyando inm ediatam ente la otra placa
de vidrio, presionando y fijando con los sujeta­
dores metálicos.
Gelificado el agar, probar, mediante llenado
con agua, que la cámara formada no tiene pér­
didas. Escurrir el agua y llenar con gel de reso­
lución hasta una altura de 15 cm. Cubrir con
agua y dejar gelificar. Producida la gelifica-
ción, volcar el agua y cubrir con gel de poro
grueso o apilam iento, introduciendo en él el
sembrador, de modo que al gelificar se formen
las pequeñas camaritas de siembra. Dejar geli­
ficar, retirar el sembrador y el separador corres­
pondiente a la parte inferior de las placas, de
modo que cuando sean introducidas en el reser­
vorio correspondiente, el gel pueda ponerse en
contacto con el buffer de corrida. A rm ar el
equipo haciendo que la placa que presenta la
escotadura se conecte con el reservorio supe­
rior. Conviene colocar entre ambos una junta
de goma o plástico para asegurar un buen con­
tacto y al presionar evitar pérdidas de buffer.
Introducir la parte inferior de la placa en el re­
servorio anódico y fijar adecuadamente.
Introducir las diferentes muestras en cada
una de las camaritas de siembra, completando
su llenado con buffer para los reservorios (so­
lución de reserva diluida 1:10 en agua destila­
da). Llenar los reservorios con el mismo buffer
y conectar los electrodos con la fuente de po­
der. Para una placa de 15 cm x 15 cm x 1,8
mm se aplica una corriente de 32 mA cuando la
muestra se desplaza en el gel de poro grueso o
apilamiento, y de 45 mA cuando lo hace en el
gel de resolución.
Como en el caso de la electroforesis en tu ­
bos, la posición del colorante en la placa será la
que indicará cuándo la corrida se dará por con­
cluida. Finalizada ésta desarmar el equipo, reti­
rar la placa de gel y, colocándola en una cuba
de vidrio adecuada, proceder a la fijación, la
coloración y la decoloración, de igual m anera
que la indicada en electroforesis en tubos.
Una de las ventajas más importantes de los
geles en placa es que varias muestras, incluidos
los marcadores de PM, pueden ser corridos en
las mismas condiciones en un solo gel y por lo
tanto los patrones de bandas son directamente
comparables, hecho que no se cumple en el ca­
so del sistema que utiliza geles cilindricos, ya
que mínimas diferencias en la eficiencia de po­
limerización, largo del gel y diámetro hace que
los geles cilindricos, aun de las mismas m ues­
tras, raram ente sean idénticos (figs. 4 2 -6 y
42-7). Existen otras ventajas adicionales com o
por ejemplo: el uso de geles en placas perm ite
una mejor disipación del calor, disminuyendo
la distorsión de las bandas, la forma de los g e­
les hace más fácil la densitometría y fotografía
y pueden secarse para guardarse o para hacer
autorradiografía.
A ctualmente varias firmas comerciales han
diseñado aparatos que permiten desarrollar la
electroforesis en geles de p oliacrilam ida en
placas de dim ensiones más pequeñas. E sto s
914 Métodos inmunoquímicos
nuevos sistemas de “mini-geles” perm iten un
análisis más rápido de muestras de proteínas o
ácidos nucleicos y que pueden ser desarrolla­
dos en la mitad o el tercio del tiempo empleado
en los sistemas convencionales, manteniéndose
una resolución comparable. Estos nuevos siste­
mas están diseñados de manera tal que pueden
realizarse al mismo tiempo dos geles en placas,
analizándose hasta 30 muestras diferentes.
En cuanto a las dimensiones de las placas de
vidrio, depende de la marca comercial pero en
general tienen apro x im ad am en te 8,3 cm x
10,2 cm con un tamaño de gel de 7 cm x 8 cm.
Por lo tanto, el volumen de reactivos para un
gel de este tamaño es considerablemente me­
nor, con la consiguiente reducción en los costos
de cada corrida. De acuerdo al espesor del gel,
que se ajusta según los separadores utilizados
(de 0,5 mm a 1,5 mm), los volúmenes pueden ir
desde 2,8 a 8,4 mi. La cantidad de muestra a
sembrar también será menor (desde 5 a 50 ^il),
dependiendo de la concentración disponible.
Coloración por Coomassie Blue
Este colorante permite detectar de 0,2 a 0,5
|j.g de cualquier proteína en una banda fina. Da­
do que el colorante está preparado en una solu­
ción conteniendo ácido acético, la fijación de
las proteínas y su coloración ocurren en el mis­
mo momento.
Coloraciones alternativas
a) Tincióñ'areéntica.
La coloración\on Coomassie Blue no es su­
ficientemente sen^ble para detectar proteínas
en trazas o bajas doncentraciones. Como alter­
nativa la coloración con plata permite la detec­
ció n de p ro te ín a s en el ra n g o de lo s ng
(2-10 ng).
La técnica descrita por Merril y col., emplea­
da en nuestro laboratorio es la siguiente:
1. Colocar el gel en un recipiente contenien­
do una solución al 50% de metano! y 12% de
ácido acético por un tiempo mínimo de 20 mi­
nutos para la fijación de las proteínas (puede
dejarse toda la noche).
2. El exceso de SDS del gel es removido por
3 lavados de 10 min cada uno, con agitación,
con una solución al 10% de etanol y 5% de áci­
do acético.
3. A g re g a r u n a so lu c ió n d e 0 ,0 0 3 4 M
KjCrO^ y 0,0032 N ácido nítrico e incubar du­
rante 5 min.
4.Realizar 4 lavados con H^O destilada, de
30 seg cada uno, con agitación.
. 5. Agregar una solución de 0,012 M de ni­
trato de plata e incubar durante 30 min (para
aumentar la sensibilidad se recomienda que los
primeros 5 min el gel se exponga a una luz in­
tensa y uniforme).
6. Enjuagar rápidam ente 2 veces con una
solución desarrolladora conteniendo 0,28 M de
carbonato de sodio y 0,5 ml/1 de formol y luego
dejar incubando en esta solución hasta que las
bandas adquieran una tonalidad marrón amari­
llenta. La tinción de fondo aum enta con el
tiempo, por lo que la operación debe interrum­
pirse en el m om ento adecuado, m ediante el
agregado de 1% AcH.
Los volúmenes a utilizar de todas estas solu­
ciones dependerá del tamaño del gel, para el
caso de geles de 7 cm x 9 cm, serán suficientes
100-150 mi de cada una de las soluciones para
cubrirlo perfectamente.
Nota: Se debe trabajar con guantes descarta-
bles para evitar impregnaciones exógenas del
gel. Los recipientes a usar deben estar bien lim ­
pios y enjuagados con agua destilada.
B) Tinción con reactivo de Sciiiff-ácido p e ­
riódico (PAS). Algunas glucoproteínás con alto
contenido en hidratos de carbono no fijan ade­
cuadamente el Coomassie Blue. En estos casos,
0 cuando interese establecer la presencia de
glucoproteínás, puede realizarse una reacción
de PAS. El método usado en nuestros laborato­
rios es el que sigue.
1. Las proteínas separadas en el gel de polia-
crilamina son fijadas por inmersión en solución
de etanol al 40% y ácido acético al 5% en agua
destilada, durante 18 horas, efectuando cam ­
bios periódicos de la solución.
2. Transferir a una solución de ácido periódi­
co al 0,7% durante 2-3 horas.
3. Tratar con solución de m etabisulfito de
sodio al 0,2% en ácido acético al 5%, durante
2-3 horas, con un recambio luego de los prime­
ros 30 minutos.
' 4. Incubar con reactivo de Schiff 12 a 18 ho­
ras y guardar los geles a 4”C, en el mismo reac­
tivo y en la oscuridad.
Se recom ienda registrar los resultados por
fotografiado, inm ediatamente después de ter­
minada la coloración.
5. Se puede intensificar el color por transfe­
rencia a una solución de metabisulfito de pota­
sio al 0,2% en ácido acético al 5%. Después de
2 horas de permanencia de los geles en la solu­
ción, la coloración de las bandas se hace más
intensa.
Preparación del reactivo de Schiff. Disolver
2,5 g de fucsina básica en 200 mi de agua des­
tilada caliente; enfriar y agregar 50 mi de HCl
1 N y 4,25 g de metabisulfito de sodio, comple­
tando 500 mi con agua. Agitar hasta la decolo­
ración.
 Eleetroforesis en gel de poliacrilamida 915

D e t e r m in a c ió n d e p e s o s m o l e c u l a r e s
R E L A T IV O S M E D IA N T E E L E C T R O F O R E S IS
EN G E L D E P O L IA C R IL A M ID A E N P L A C A

Si se corren en diferentes calles de una m is­

ma placa péptidos de pesos moleculares cono­
cidos que previamente fueron hervidos 3 m inu­
tos en presencia de SDS y 2-mercaptoetanol y
sustancias cuyo PM se desconoce, previamente
sometidas al mismo tratamiento, es posible co­
nocer los pesos moleculares relativos (M r) de
esas sustancias o las de sus péptidos constituti­
vos. Ello puede hacerse determinando la m ovi­
lidad relativa de la proteína que interesa m i­
diéndola con referencia a una proteína estándar
o a un colorante trazador. Generalmente se ha­
ce respecto del colorante marcador que norm al­
mente se incorpora al gel.
D istancia m igrada por la p ro teín a
M ovilidad
relativa (Rf)
D istancia m igrada por el co lo ran te

Si se determina el R f de diferentes péptidos

F ig. 42-8. D eterm inación de pesos m oleculares relativos
(M r) por eleetroforesis en gel de acrilam ida en placas. C a­
lles: a, patrones de pesos m oleculares conocidos; b. IgG ; c,
albúm ina; d , IgG reducida y alquilada (cadenas H y L); e,
suero hum ano norm al.
de PM conocido, con los datos obtenidos es po­
sible graficar log PM versus Rf. Conociendo el
Rf de una sustancia en análisis, puede calcular­
se su PM relativo o M r por interpolación en la
curva (fig. 42-8).
Las sustancias de referencia más usadas fi­
guran en el cuadro 42-2.
C u ad ro 4-2. Pesos moleculares de p olipépti­
dos estándar

P e so
m o lec u la r
Poner en contacto con carbón activado pre­ Polipépüdo (líD)
viamente lavado con ácido clorhídrico y agua.
Cadena pesada de m ioslna (m úsculo de conejo) 212
Eliminar el carbón por centrifugación, ya que Subunidad P de ARN polim erasa (E. colí) 155
el uso de papel de filtro (por ser celulosa) colo­ p-galactosidada (E. colí) 130
rea la solución. Filtrar por lana de vidrio, de­ F oslórilasa a (m úsculo de conejo) 92
biendo quedar el filtrado incoloro. Seroalbúm ina bovina 68
C atalasa (hígado de bovino) 57,5
Conservar a 4°C en frascos oscuros. Piruvatoquinasa (m úsculo de conejo) 5 7 ,2
G lutam atodehidrogenasa (hígado bovino) 53
Secado de los geles F um arasa (hígado de cerdo) 4 8 ,5
O voalbúm ina 43
Enolasa (m úsculo de conejo) 42
Luego de la corrida electroforética los geles 41
A lcoholdeshidrogenasa (hígado de caballo)
pueden conservarse por tiem po indefinido a A ldolasa (m úsculo de conejo) 40
través del secado de los mismos. Este procedi­ Subunidad de ARN polim erasa (£. coli) 39
miento es posible con geles de un espesor no L actatodeshidrogenasa (corazón de cerdo) 36
mayor a 1,5 mm. Pepsina 35,5
A nhidrasa carbónica 29
Existen aparatos diseñados para tal fin, de Q uim otripsinógeno A 2 5 ,7
forma tal que se aplica calor al gel y al mismo T ripsina 24
tiempo vacío, para evitar la rotura irreversible Inhibidor d e tripsina (soybeun) 2 0 ,!
IVIioglobina (corazón de caballo) 16,95
del mismo. Para evitar que el gel reduzca su ta­ a-lactoalbúm in a (leche bovina) 14,4
maño, éste se coloca sobre un papel de filtro y Lisozim a (clara de huevo) 14,3
sobre el gel un papel de celofán. Dependiendo C itocrom o c 11,7
el espesor del gel este procedimiento puede lle­
var aproximadamente de 2 a 4 horas. N ota; to d o s los p roductos ind.icados p u ed e n adquirirse c o in c rc ia l-
m enlc.
916 Métodos inmunoquímicos
Para calcular PM conviene hacer dos corri­
das en geles de diferente porosidad. En ambos
casos los resultados deben ser eoincidentes.
En el mercado existen mezclas de proteínas,
ya listas para usar, de masa molecular relativa
conocida, en un rango de alto o bajo peso mo­
lecular, eligiéndose la más conveniente, lo que
depende de la concentración de gel de resolu­
ción que vaya a utilizarse y de las proteínas de
interés analizadas. Se encuentran disponibles
también marcadores preteñidos, lo cual permite
ir evaluando la corrida electroforética a medida
que va ocurriendo. Hay tam bién otro tipo de
mezclas denominadas “rainbow ” (arco iris) o
caleidoscopio, donde los marcadores constituti­
vos están preteñidos con diferentes colores ca­
da uno, lo que permite una identificación rápi­
da de los mismos, evitándose malas interpreta­
ciones de las bandas obtenidas.
ISO E L E C T R O E N FO C A D O
El isoelectroenfocado es una técnica de se­
paración por electroforesis muy usada en el
análisis de proteínas, la que es desarrollada en
un gradiente de pH establecido entre dos elec­
trodos y estabilizado por anfolitos transporta­
dores. Mediante esta técnica las proteínas mi-
gran hasta alinearse en la zona del gradiente de
pH correspondiente a su punto isoeléctrico (pl).
Aquí la proteína no posee carga neta y la mi­
gración cesa. Es una técnica de alto poder reso­
lutivo; pueden separarse componentes que di­
fieren en 0,001 unidades de pH.
Los anfolitos usados para isoelectroenfocado
deben ser sustancias con una gran capacidad
buffer. Ello significa que estas sustancias son
las que deben establecer las características del
pH de un gradiente, aun en presencia de altas
concentraciones de sustancias que se compor­
tan como anfolitos, como lo son las proteínas.
Cuando un anfolito se halla a un pH superior
al de su pl, está cargado negativamente, y su
carga será positiva en caso contrario. En un
campo eléctrico con pH variable migrará hasta
la zona correspondiente a su punto isoeléctrico,
donde se concentrará. Para que una sustancia
funcione como un buen anfolito debe poseer
cierta capacidad buffer en su pl. Para ello, sus
pKj y pKj deben estar lo más próximos posible
y pl-pK no deben diferir en más de 0,5 unida­
des. Debe formar, además, un pequeño plateau
de pH alrededor de su máxima concentración.
Si se dispone de una mezcla de anfolitos con pl
próximos que responden a esas características,
se originará un gradiente de pH.
Las proteínas, por ser anfotéricas, migrarán
y se focalizarán de la misma manera, alineán­
dose en sus correspondientes pl.
Diferentes sustancias han sido experimenta­
das como anfolitos. Aminoácidos, polipéptidos
sintéticos y proteínas hidrolizadas no han dado
resultados aceptables. Pharmacia ha consegui­
do elaborar mezclas d e productos que funcio­
nan muy bien con esa finalidad y que abarcan
diferentes rangos de pH. Se los conoce comer­
cialmente con el nombre de Pharmalyte y se
obtienen por copohmerización de aminas selec­
cionadas con epiclorhidrina. El producto se ca­
racteriza por no contener zonas de reducido po­
der buffer o pobre conductividad, hecho obser­
vado en otros anfolitos.
Si bien las proteínas y los anfolitos son sus­
tancias anfotéricas, las primeras, por su mayor
tamaño, tienen un coeficiente de difusión me­
nor. Además, la capacidad buffer de las proteí­
nas, por unidad de peso, es menor. Esto signifi­
ca que, si ambos productos están presentes en
cantidades similares, el gradiente de pH será
determinado por el anfolito, prácticamente sin
modificaciones debidas a la acción buffer de la
proteína. Como consecuencia de sus mayores
coeficientes de difusión y zonas de sobreposi-
ción, resulta prácticam ente imposible separar
dos anfolitos con pl próximos, cosa que se lo­
gra con proteínas.
Inicialmente el isoelectroenfocado se desa­
rrolló en medio líquido en gradiente de sacaro­
sa. Actualmente se prefieren los medios gelifi-
cados como la agarosa o el gel de poliaerilami-
da, siendo éste el de preferencia.
Para ensayos analíticos los geles de agarosa
y de poliacrilam ida en bajas concentraciones
(3%), son buenas matrices para realizar el isoe-
lectroenfoque, dado que no constituyen un me­
dio tamizador, por lo tanto el tamaño molecular
de las proteínas no será un factor determinante
de la movilidad al someterse a un campo eléc­
trico. La agarosa tiene la ventaja de tener poros
grandes pero también la desventaja de que pue­
de tener grados variados de cargas negativas
residuales de grupos sulfatos. Por esa razón, los
geles de poliacrilamida son los geles de elec­
ción.
Las muestras de proteínas para isoelectroen-
foque deben estar libres de material insoluble y
de sales, por lo tanto, previo a su aplicación las
muestras deben desalificarse, dializarse contra
agua destilada, o contra una solución al 2% de
anfolitos o al I % de glicina.
PARTE EXPERIMENTAL
El isoelectroenfoque con poliacrilamida co­
mo gel puede hacerse en cilindros o placas. A
continuación se describe la metodología y los
m ateriales necesarios para realizar iso elec­
troenfoque en “mini-geles”.
 Electroforesis en gel de poliacrilamida 917

Con este sistema el gel se pone en contacto C u ad ro 42-4. Soluciones de electrólitos reco­
(en form a invertida) directam ente sobre los mendadas para usar con Pharmalyte cuando el
electrodos de grafito conectados directamente electroenfocado se hace en geles en placas
al ánodo y al cátodo. El gel tiene un tamaño de
125 X 65 X 0,4 mm Pharm alyte
Intervalo Solución Solución
a) Reactivos de p H ánodo (+ ) cátodo {—)
1. Solución de reserva de poliacrilamida. 2 ,5 - 5 H jS O .O .l M L,-histidina 0,2 M
24,25% P/V acrilamida 0 N aO H 0,1 M
0,75% P/V bisacrilamida 4 - 6,5 Á cido glutám ico (DL) L -histidina 0 ,2 M
Esta solución puede almacenarse a 4°C y a 0,04 M
5 -8 A cido glutám ico (DI^) N aO H 1 M
resguardo de la luz durante 1 mes. 0,04 M
2. Riboflavina 0,1% P/V. 6 ,5 - 9 H EPES* NaOH 1 M
3. Persulfato de amonio 10% P/V (preparar 0,25 M
en el momento) 8 - 10,5 H EPES* NaOH 1 M
0,25 M
4. Glicerol 25% P/V. 3 - 10 A cido aspártico (I5L) NaOH 1 M
5. TEMED 0,04 M

Á cido N -2 h id ro x iclil p ip era /,in a -N ’-2-ctanesulf()nico,

Se prepara la solución de po liacrilam ida
conteniendo los anfolitos de la siguiente forma.

HjO destilada ........................................... 5,5 mi catalizador de la reacción. Como el gel es de

Sol. reserva de poliacrilamida ..............
Glicerol .....................................................
Anfolitos (40% en H^O destilada).........
Esta mezcla se desairea durante 5 minutos y
luego se agrega la solución iniciadora conte­
niendo:
Persulfato de amonio (10% P /V ) ........... 70 |iJ
Riboflavina (0,1% P /V ) .......................... 50 |al
TEMED ..................................................... 5 |J,1
Luego esta mezcla se coloca rápidamente en
el aparato diseñado para el ensamblado del gel
y se irradia con una fuente de luz fluorescente
durante 45 minutos para permitir la polimeriza­
ción dado que en este caso la luz actúa como
C uadro 42-3. Soluciones de electrólitos reco­
mendadas para usar con Pharmalyte cuando el
electroenfocado se realiza en geles cilindricos
Pharm alyte
Intervalo Solución Solución
de p H ánodo (+) cátodo f - j
2,0 mi 0,4 mm de espesor se arma sobre una m em bra­
2,0 mi na especial denominada “Gel Bond”.
0,5 mi La aplicación de las muestras es más conve­
niente utilizando sem bradores especiales que
permiten sembrar cantidades de 0,5 a 2 |a,l; se
deja difundir durante 5 minutos y el gel se co ­
loca directamente sobre los electrodos en fo r­
ma invertida.
b) Soluciones buffer para los reservorios. En
el cuadro 42-3 están indicadas las soluciones
anódicas y catódicas a usar cuando el isoelec-
troenfocado se hace en tubos cilindricos. En el
cuadro 42-4 están indicadas las soluciones a
usar cuando la electroforesis se hace en placas
de 1 mm de espesor.
c) C ondiciones de corrida. El enfoque se
realiza a voltaje constante que se va aumentan­
do en forma gradual. Se comienza con 15 m i­
nutos a 100 voltios, luego se aumenta a 200
voltios por 15 minutos y finalmente se aumenta
a 450 voltios durante 60 minutos adicionales.
Finalizada la corrida se desarma el equipo,
se seca el gel (adherido al “Gel Bond”) a 37°C
y luego se colorea en la forma indicada p ara
SDS-PAGE.

2,5 - 5 A cido am inoacético HEPES*

0,01 M
IN M U N O TR A N SFER EN C IA
0,01 M
4 ^ 6,5 A cido glutám ico (DL) H istidina (Im m unoblotting)
0,01 M 0,01 iVI
5 -8 A cido glutám ico (DL) Etanolam ina La transferencia de componentes separados
0,01 M 0,01 M por electroforesis en un medio soporte gelifica-
6,5 - 9 H EPES* Etanolam ina
0,01 M 0,01 M do, como la agarosa, a otro en el que los p ro ­
8 - 10,5 HEPES* Etilendiam ina ductos transferidos pudieran dar una unión fir­
0,01 M 0,01 M me con el soporte, como lo son las membranas
3 - 10 A cido im idoacético Etilendiam ina
0,01 M
de nitrato de celulosa, fue descrita inicialmente
0,01 M
por Southern para híbridos de ARN-ADN. En
Á cido N -2 h id ro x iclil p ip e ra z in a -N ’-2-etanesulfónico. este caso la transferencia se hace por sim ple
918 Métodos inmunoquímicos
contacto del gel de agarosa, en el que se ha rea­
lizado la separación electro fo rética, con la
membrana de nitrato de celulosa. Los produc­
tos fijados a ella se identifican por tinción di­
recta.
Poco tiempo después fue descrita, para sus­
tancias antigénicas, una técnica similar a la an­
terior en la que los componentes de una mezcla
son separados por SDS-PAGE, y la transferen­
cia a las membranas de nitrato de celulosa tiene
lugar mediante el paso de corriente eléctrica, a
pH alto. Como consecuencia, las m oléculas
proteicas se movilizan y contactan con la mem­
brana de nitrato de celulosa, donde se fijan. Las
moléculas antigénicas transferidas son identifi­
cadas por interacción con anticuerpos específi­
cos. Los complejos Ac-Ag formados pueden
ser identificados desarrollando sobre el com ­
p le jo fo rm ad o u na re a c c ió n c o lo re a d a de
ELISA (fig. 42-9). La identificación de antíge­
nos en la forma descrita ha sido denominada
inm unotransferencia o immunoblotting segtin
la literatura inglesa.
Un método para la transferencia por difusión
consiste en crear un flujo de solvente desde el
gel a través de la membrana por capilaridad.
Esto se logra poniendo la membrana sobre el
gel y sobre ésta papel de filtro y una pila de
kD
131
-1 2 5
— 116
\ 1 1
51
1— 45
43
b f
F ig . 42-9. Reactividad por “im m unoblotting” de sueros de
pacientes chagásicos y leishm aniásicos frente a epim asti-
g o tes de T ry panosom a cruzi sep arad o s p or S D S -P A G E
con geles de resolución al 7,5% de acrilam ida-bisacrilam i-
da. [a-cj. Sueros de pacientes leishm aniásicos; d-g. Sueros
de pacientes chagásicos. En este caso se em pleó un conju­
gado antí-y globulina hum ana-peroxidasa y H , 02 -4 -Cl, 1-
naftol com o sustrato/crom ógeno. A la derecha se indica la
m asa relativa (en kD ) de los antígenos característicos reco ­
nocidos por los pacientes chagásicos.
toallas de papel absorbente, así, el buffer atra­
viesa la membrana hacia las toallas de papel.
Estos métodos de difusión son más eficientes
con geles de agarosa, que tienen poros grandes
y no está limitado el movimiento de moléculas
grandes. Con este procedimiento una transfe­
rencia eficiente se realiza en tiempos de 90 min
a 2 horas, aunque puede dejarse toda la noche
sin inconvenientes.
Los geles de poliacrilamida, tanto en condi­
ciones nativas como disociantes, tienen poros
más pequeños, lo c]ue limita el movimiento de
moléculas más grandes, por lo tanto la transfe­
rencia por capilaridad no es eficiente. La trans­
ferencia del gel a la membrana en este último
caso se lleva a cabo mediante el paso de co­
rriente eléctrica.
En cuanto a las membranas empleadas hay
de varios tipos aunque la de nitrocelulosa es la
más utihzada. El mecanismo de unión a la ni­
trocelulosa es debido fundamentalmente a inte­
racciones del tipo hidrofóbico. Las membranas
de nitrocelulosa de un tamaño de poro de 0,45
|0.m es la más empleada para la mayoría de los
propósitos, aunque polipéptidos de bajo PM
pueden pasar sin unirse, lo que puede ser solu­
cionado con m em branas de 0,1 |im de poro.
Una desventaja de la nitrocelulosa es su baja
capacidad de unión, cerca de 80 |ag/cm^.
Hay otro tipo de m em branas disponibles,
como las catiónicas de nylon (por ej,, Z eta
Probe'^, Bio-Rad), que son más resistentes y
no se rompen al secarse, lo que ocurre con la
n itro celu lo sa. E stas m em branas tien en una
mayor capacidad de unión de proteínas (hasta
500 ¡Jg/cm^), aunque esto es dependiente de la
concentración. Sin embargo, esta alta capaci­
dad de unión se vuelve una desventaja ya que
estas m em b ran as tien d en a un ir p ro te ín a s
inespecíficamente, lo que resulta en altas se­
ñales de fondo, aun luego del bloqueo con
proteínas inertes.
En cuanto a los buffers para la transferencia,
el más utihzado contiene 25 mM tris, 192 mM
ghcina, pH = 8,3. El agregado de metanol pre­
viene el hinchamiento del gel durante la trans­
ferencia y aumenta la unión de las proteínas a
la membrana, aunque reduce la eficiencia de
elución de las proteínas del gel.
Si las moléculas transferidas van a ser identi­
ficadas con un antisuero, un anticuerpo mono­
clonal o alguna otra sonda es importante blo­
quear los sitios libres de la membrana para evi­
tar uniones inespecíficas de estas sondas. Los
bloqueantes utilizados dependen del tipo de
membrana y de la sensibilidad del sistema em­
pleado. Es importante recordar que estos blo­
queantes no deben tener reactividad cruzada
con ninguno de los reactivos utilizados en las
etapas posteriores.
 Electroforesis en gel de poliacrilamida
En general puede emplearse cualquier tipo
de proteína o mezcla de proteínas que resulten
inertes en el sistema. Por ser barata y accesible,
la leche descremada es muy utilizada, además
se obtienen bajas señales de fondo. Una con­
centración adecuada sería de 0,5%. Se ha com ­
probado que concentraciones mayores (1-3%)
pueden producir un mayor despegado de las
proteínas unidas a la membrana. Los detergen­
tes no-iónicos pueden también utilizarse como
bloqueantes, pero su mayor desventaja consiste
en que producen una considerable pérdida de
proteínas y las señales de fondo tienden a ser
más altas. En el caso de utilizar membranas ca-
tiónicas (p. ej., Zeta Probe'^) dada su mayor ca­
pacidad de unión, se necesitan condiciones más
estrictas para el bloqueo, con concentraciones
más altas del bloqueante y tiempos y tempera­
tura de incubación mayores.
919
método, además, es aproximadamente 3 veces
más sensible que el uso de sustancias eromogé-
nicas, y combina la rapidez y seguridad de los
sistemas enzimáticos con la sensibilidad de los
radioisótopos.
Para evaluar la transferencia a la membrana
es aconsejable hacer una tinción no específica
de las proteínas luego de la transferencia. Los
colorantes que pueden em plearse son: negro
amido, fast green, Coomassie Blue. Todos es­
tos colorantes son irreversibles y la membrana
no puede utilizarse para identificar a las m olé­
culas adsorbidas a ella con reactivos específi­
cos. En cambio el colorante Ponceau S tiene la
propiedad de teñir en forma reversible, por lo
tanto, puede utilizarse para ver la eficiencia de
la transferencia y realizarse luego la reacción
inmunoenzimática, dado que durante la incuba­
ción con la solución de b