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Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de
condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuadas, así como un
grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de
crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.
La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a los
líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de
extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes.
El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licúa
completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas
excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen
en él.
La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias
provocan su licuación.
También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formación de
ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como
indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como
inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram-positivas).
El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de
factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio.
Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que,
además, representa una fuente fácilmente asequible de nitrógeno y carbón ya que la mayoría de los
microorganismos, que no suelen utilizar directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de atacar
los aminoácidos y otros compuestos más simples de nitrógeno presentes en la peptona.
Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se añade a muchos medios
sustancias como suero, sangre, líquido ascítico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos
carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias
promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamínica.
Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas
actividades metabólicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos
microorganismos.
Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo productos como albúmina,
gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado semisólido o sólido.
Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no
se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusión de este solidificante y de que
otros tienen la capacidad de licuarla.
Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay también
gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está ampliamente extendido en el laboratorio.
Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno normal. Algunas
pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios
estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto
intermedio, los microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmente
anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un
metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.
Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen
desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de
estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de
agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque
el medio.
5- Luz ambiental
La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar.
Hay excepciones evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos.
6- pH
7- Temperatura
Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y 43ºC. Otros como los
psicrófilos crecen a 0ºC y los temófilos a 80ºC o incluso a temperaturas superiores (hipertemófilos). En
líneas generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor
de 37ºC, y los saprofítos tienen rangos más amplios.
Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de
vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los
especimenes inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el
autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante)
Podemos decir que la microbiología empieza su verdadero desarrollo como ciencia en el momento en
que se descubre el microscopio y comienza la observación de los primeros microorganismos, pero es
indudable que la puesta a punto de los medios de cultivo y la utilización del agar como solidificante,
marcan dos importantes puntos de inflexión en su evolución.
La primera noticia de la utilización de medios de cultivo nos llega del micólogo Brefeld, que consiguió
aislar y cultivar esporas de hongos en medios sólidos realizados a base de gelatina.
Sin embargo este sistema no era adecuado para las bacterias (por su menor tamaño) y no fue hasta el
año 1878 cuando Lister popularizó un método enfocado al cultivo puro basado en diluciones seriadas en
un medio líquido.
Koch realizó sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas de patata como soporte
nutritivo sólido, pero no tardó en recurrir al caldo de carne líquido, diseñado por Loeffler, al que, en
1881, añadió gelatina, logrando un medio sólido transparente ideal para la observación de la morfología
macroscópica de las colonias microbianas.
En el año 1882 tiene lugar uno de los grandes avances de la microbiología en relación con los medios de
cultivo: el médico alemán Walter Hesse introduce el agar-agar (polisacárido extraído de algas rojas)
como solidificante.
En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de cristal planas, que se llaman
desde entonces placas de Petri, para sustituir a las clásicas bandejas de vidrio cubiertas con campanas
que se usaban hasta entonces.
Beijerinck y Winogradsky, que desde de 1888 realizaron sus investigaciones sobre las bacterias
quimioautótrofas (utilización de nitrógeno y azufre sobre todo) tuvieron gran importancia en el desarrollo
de los medios selectivos y de enriquecimiento. Diseñaron este tipo de medios de tal forma que su especial
composición química favorecía el crecimiento de ciertos tipos de microorganismos que, en función de sus
procesos metabólicos, eran los únicos capaces de utilizar para su desarrollo ciertos nutrientes del medio.
líquidos
semisólidos
sólidos
Para usos generales: no selectivos, para cultivo de una amplia variedad de organismos
difíciles de hacer crecer. A menudo están enriquecidos con materiales como: sangre,
suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento de
las bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc)
Agua
Bases nutritivas
Carbohidratos
Sales Minerales
•Macroelementos (fósforo, azufre, sodio, cloro, hierro y otros) •Microelementos (zinc, cobre y otros)
Colorantes e indicadores
Factores de crecimiento
•Vitaminas •Proteínas •Otros
Otros
Antibióticos y lípidos
CLASIFICACIÓN
Medios naturales o complejos: constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal, las que son
usualmente complementadas por la adición de minerales y otras sustancias. En ellos no se conocen todos los
componentes, ni las cantidades exactas presentes de cada uno de ellos.
Medios definidos o sintéticos: son los medios que tienen una composición química definida cuali y
cuantitativamente. Generalmente se usan en trabajos de investigación.
Medios de enriquecimiento: son medios líquidos que favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en
particular. Permiten aumentar el número de microorganismos de ese tipo. Usualmente contienen una o más
sustancias inhibidoras del crecimiento de los microorganismos con excepción de los que se quieren cultivar.
Medios selectivos: son parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian por ser medios sólidos y están diseñados
para el aislamiento de microorganismos específicos.
Medios diferenciales: son medios que contienen indicadores de productos derivados de la actividad microbiana de
los microorganismos. No contienen ningún tipo de sustancia con actividad antimicrobiana. Permiten revelar
características fisiológicas de los microorganismos.
Líquidos
Semisólidos
Sólidos
PREPARACIÓN
Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus constituyentes básicos, o por
simple rehidratación de productos asequibles comercialmente (medios de cultivo deshidratados). Generalmente se
prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque, además de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor
probabilidad de obtener resultados reproducibles.
Luz ambiental
La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay
excepciones evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos.
pH
La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayoría de
ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No
se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden
sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos normales.
Temperatura
Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y 43 oC. Otros como los psicrófilos
crecen a 0 oC y los temófilos a 80 oC o incluso a temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas generales, los
patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37 oC, y los saprofítos tienen
rangos más amplios.
Prepararlos sólo a partir de productos que provengan de fabricantes o proveedores que suministren productos de
calidad.
Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiológica y fisicoquímica adecuada.
Utilizar materiales de vidrio bien lavados y enjuagados con agua destilada o desmineralizada.
Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilización. Nunca se deben exceder las
condiciones señaladas por el fabricante.
Detección de microorganismos patógenos a partir de muestras de fluidos, tejidos y excretas y sus toxinas
causantes de enfermedades.
Industria alimenticia
Investigaciones
Estudios morfológicos, funcionales, sistemáticos y de otro tipo, dirigidos al conocimiento de la flora microbiana.
Investigaciones relacionadas con el desarrollo de sustancias o productos en las industrias y sectores anteriormente
señalados.
Fisiología de las bacterias
- Funciones de relación. Muchas bacterias tienen movilidad, ya sea por flagelos, contracción o
reptación, acercándose o alejándose de los estímulos ambientales. Pueden responder también
modificando su metabolismo adaptándolo a las condiciones concretas. Si el ambiente es desfavorable
originan formas de resistencia conocidas como endosporas, formas de vida latente protegidas por una
gruesa membrana, capaces de resistir condiciones extremas. Cuando el ambiente es favorable,
germinan y originan bacterias funcionales.
• Fotorganótrofas, utilizan energía lumínica pero también materia orgánica, por lo que son
heterótrofas, como las bacterias verdes carentes de azufre.
• Quimioheterótrofas, son el grupo más abundante. Según el tipo de materia orgánica que utilicen
hay bacterias saprobias,(materia orgánica muerta) parásitas (de otro ser vivo causándole un daño),
simbióticas (asociadas a otro organismo con beneficio mutuo, como el género Rhizobium fijador de
nitrógeno, asociado con leguminosas) e incluso hay bacterias depredadoras de otras bacterias
(mixobacterias).
• Transformación bacteriana. Se produce cuando una bacteria capta fragmentos de ADN de otra
bacteria rota que estaban libres en el medio. Es el proceso menos frecuente.
•Conjugación bacteriana. En este proceso, una bacteria donadora F +transmite a través de un puente
o pili, un fragmento de ADN, a otra bacteria receptora F-. La bacteria F+ posee uno o más plásmidos o
factor F, además del cromosoma bacteriano. Si el plásmido está integrado en el cromosoma bacteriano
(episoma) las bacterias son Hfr (alta frecuencia de recombinación). Las bacterias F + solo transmiten el
factor F, en las Hfr el episoma arrastra parte del cromosoma bacteriano.
• Transducción bacteriana. En este caso la transferencia de ADN de una bacteria a otra se realiza a
través de un virus bacteriófago, que se comporta como un intermediario entre las dos bacterias.
Estos intercambios son rutinarios en las bacterias, de tal forma que el patrimonio genético de todas las
bacterias del mundo forma una reserva global al alcance de todas ellas. Se produce un "intercambio
horizontal" entre seres de la misma generación, proceso que no está al alcance de los seres superiores,
que tienen los genes encerrados en su cuerpo, y solo los mezclan en la reproducción. La gran variabilidad
y poder de adaptación de las bacterias se consigue por estos mecanismos. Un ejemplo es la resistencia
a los antibióticos que posen algunas bacteria patógenas por coexistir en el intestino con bacterias
simbiontes resistentes a estos fármacos, y que pasan la resistencia a los patógenos.
Fisiología
La estructura bacteriana les permite llevar a cabo las funciones propias de cualquier ser vivo: nutrición, reproducción
y relación.
Nutrición
Son el grupo de seres vivos más amplio de la naturaleza, por lo que presentan una gran gama de metabolismos.
Se clasifican según la fuente de carbono necesaria para sintetizar moléculas orgánicas y según el origen de la energía
empleada:
Bacterias fotoautótrofas. Captan la energía de la luz, ya que realizan la fotosíntesis y utilizan CO2 como fuente
de carbono. Característico de las cianobacterias.
Bacterias fotoorganótrofas. Realizan la fotosíntesis y la fuente de carbono son moléculas orgánicas.
Bacterias quimioautótrofas. Obtienen la energía que liberan reacciones de oxidación de moléculas
inorgánicas. La fuente de carbono es el CO2 . Estas bacterias son imprescindibles para los ciclos
biogeoquímicos.
Bacterias quimioorganótrofas. La energía procede de de la oxidación de moléculas orgánicas, que también
constituye la fuente de carbono. Es propia de la mayoría de las bacterias, que son los pricipales seres
descomponedores.
Reproducción
Las bacterias son seres haploides que se reproducen asexualmente por bipartición.
Además existen otros mecanismos, denominados parasexuales, que implican recombinación genética, por lo que
generan variabilidad:
Conjugación. Una bacteria donadora transmite ADN de sus plásmidos a través de pilis sexuales a una bacteria
receptora.
Transformación. Las bacterias captan del medio fragmentos de ADN que integran en su cromosoma.
Transducción. Las bacterias intercambian material genético mediante un virus transmisor o bacteriófago.
La importancia de las Buenas Prácticas de Manufactura (GMP por sus siglas en inglés) radica en que las medicinas de
mala calidad no solamente ponen en peligro la salud (ya sea conteniendo sustancias tóxicas que pudieran haber sido
agregadas no intencionalmente, o bien careciendo del efecto terapéutico previsto si la cantidad de los ingredientes
demandados es diferente que la debida), sino que además son una pérdida de dinero para los gobiernos y los
consumidores individuales.
Por ello, la instrumentación de las buenas prácticas de manufactura es de suma importancia para permanecer en el
negocio, y además, constituyen un fuerte impulso cuando se busca crecer, dado que las oportunidades de exportación
de fármacos dependen mucho de estas GMP, puesto que la mayoría de los países aceptan solamente la importación
y venta de medicinas que han sido fabricadas con base en prácticas de manufactura internacionalmente aceptadas.
Es precisamente por lo anterior que no sea una casualidad que los gobiernos que buscan promover la exportación de
productos farmacéuticos, lo hagan en buena medida promoviendo la obligatoriedad de producir bajo GMP para toda
la industria farmacéutica y entrenando a sus inspectores en requisitos de GMP.
DESCRIPCIÓN DE LAS GMP
Las buenas prácticas de manufactura son un sistema que ayuda a asegurar que los fármacos sean producidos y
controlados constantemente por estándares de calidad.
En cada caso de producción farmacéutica las GMP se diseñan buscando minimizar los riesgos para la calidad que no
puedan ser eliminados simplemente controlando la calidad del producto final. Los riesgos principales son:
Las buenas prácticas de manufactura cubren todos los aspectos de la producción: materias primas, premisas, equipo,
entrenamiento e higiene del personal, detallando por escrito el procedimiento para cada proceso que podría afectar
la calidad del producto final. Debe haber sistemas que proporcionen las pruebas documentales de que los
procedimientos son seguidos consistentemente a lo largo del proceso de fabricación y durante todas las corridas de
producción.
GMP Y EL LABORATORIO DEL CONTROL DE CALIDAD
El buen control de calidad se debe construir desde adentro, durante el proceso de fabricación, ya que una vez que el
producto sale de la línea de producción sólo existe la opción de aprobarlo o rechazarlo. Las GMP en cambio previenen
los errores que podrían presentarse durante el proceso productivo.
Sin GMP es difícil asegurar la homogeneidad de un lote de producción no sólo respecto de otros lotes, sino dentro del
mismo, y por ello los resultados del control de calidad en el laboratorio podrían adquirir un cierto grado de
incertidumbre que podría resultar incluso peligroso.
BUENAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO BPL
Definición. "Es un conjunto de reglas, de procedimientos operacionales y prácticas establecidas y promulgadas por determinados
organismos como la (Organization for Economic Cooperation and Development (OCDE), o la Food and Drug Administration
(FDA), etc.), que se consideran de obligado cumplimiento para asegurar la calidad e integridad de los datos producidos en
determinados tipos de investigaciones o estudios".
Principales principios que abarcan las BPL. Basado en las descripciones de Goldman (2) son:
1. Facilidades Adecuadas. Desde el punto de vista del trabajo, para que éste pueda ser realizado por los trabajadores en
forma segura y apropiada. Se debe contar con suficientes salas, para que el personal trabaje sin limitaciones de espacio. El
propósito y el tipo de producto a analizar deben ser considerados en el diseño de un laboratorio (3-5).
2. Personal Cualificado. Es importante contar con personal cualificado. Esto es una decisión de manejo basada en trabajo
de calidad.
3. Equipamientos Mantenidos y Calibrados. Emplear equipos mantenidos y calibrados de manera apropiada. Además
disponer de los registros de los mantenimientos.
4. Procedimientos Estándares de Operación (SOPs). Procedimientos operacionales estándares escritos. Ellos aseguran
que cada uno obedezca al único procedimiento al mismo tiempo, porque no es lo mismo dar las indicaciones en forma oral,
o decir que se sigan las indicaciones que aparecen en alguna literatura, donde muchas veces la traducción no es la más
adecuada, que si están establecidas por escrito. Es importante esta práctica, tanto para las operaciones de muestreo como
en las del procedimiento analítico, porque es una manera de asegurar que la muestra, está en condiciones para el análisis.
Se debe considerar que: sólo lo que está escrito existe.