TEMA 61: ABSORCIÓN MOLECULAR UV-V Y FLUORESCENCIA MOLECULAR 1

TEMA 61:

1.- INTRODUCCIÓN JUSTIFICATIVA:

2.- MÉTODOS ÓPTICOS (TEMA 60)

Los métodos ópticos de análisis son aquellos que miden la radiación electromagnética que emana
de la materia o interacciona con ella.
Los métodos ópticos se dividen en:
 Métodos ópticos no espectroscópicos: se basan en una interacción entre radiación
electromagnética y la materia que produce como resultado un cambio en la dirección de las
propiedades físicas de la radiación electromagnética.
En estos métodos los mecanismos de interacción son la reflexión, refracción, difracción,
dispersión, interferencias, polarización o la dispersión refractiva. (se explica en el tema 60)
 Métodos ópticos espectroscópicos: se basan en la medida de la intensidad y longitud de onda
de la energía radiante. La característica común a todos ellos es que se basan en la medida de espectros.
Estos son debidos a transiciones entre estados de energía característicos.
Clásicamente el comportamiento de la luz se ha atribuido a su naturaleza ondulatoria, pero hay
fenómenos (absorción o emisión) que no pueden explicarse con la teoría ondulatoria y que requieren
que la radiación se comporte como pequeños haces de energía, es decir, como partículas llamadas
fotones.
Max Planck en 1.900 unificó ambas teorías (ONDA-CORPUSCULO), para ello, consideró que la
energía de las partículas en movimiento térmicamente excitadas, está cuantizada, es decir, que
únicamente están permitidas ciertas energías. Posteriormente supuso que cuando un sistema pasa de un
nivel de energía a otro de menor energía, se emite un cuanto de energía, y que esta energía está
relacionada con la frecuencia de la radiación emitida, mediante:

hc
E    h 


Donde: E: Energía del cuanto de radiación.

: Longitud de onda de la radiación
: Frecuencia de la radiación.
h: Cte. de Planck = 6’624·10-27Hz/s

La ecuación de Planck unifica las dos teorías ya que relaciona la energía de un cuanto de radiación
(concepto corpuscular), con la frecuencia de la radiación (concepto ondulatorio).
Lo anterior supone que para distintas  existen distintas energías, conformando lo que se conoce
como “espectro” de la radiación electromagnética.
El espectro electromagnético abarca un intervalo enorme de longitudes de onda y frecuencias,
dividiéndose en regiones que abarcan intervalos de longitudes de onda más estrechos.
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La Zona del espectro en que se suele trabajar es desde 200 nm hasta 1000 nm:

- Ultravioleta: 200 nm a 380 nm.

- Visible: 380 nm a 750 nm.
- Infrarrojo próximo: 750 nm a 1000 nm.

3.- ABSORCIÓN MOLECULAR UV-V:

3.1 FUNDAMENTO Y DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA:

Cuando una partícula, que se encuentra en «estado de reposo» o «estado fundamental»,

interacciona con un haz de luz, absorbe energía, y pasa a lo que se denomina «estado excitado».
En la partícula se producen cambios que dependen de las características de la propia partícula (tipo
de enlaces, etc.) y de la energía (longitud de onda) de la luz que interacciona.
La partícula en estado excitado tiende a regresar espontáneamente a su estado fundamental,
desprendiendo la energía absorbida en forma de calor:

A0 + h   →A * → A0 + calor
Siendo: A0 = absorbente en estado fundamental.
A* = absorbente en estado excitado.
h   = energía del fotón absorbido.
h = constante de Plank.
 = frecuencia de la radiación.

La medida de la cantidad de luz absorbida por una solución de una especie absorbente, es el
fundamento en que se basan las técnicas de Espectrofotometría de absorción.

Cuando un haz de luz de intensidad Io incide sobre una cubeta cuadrada que contiene una solución
coloreada que absorbe luz a una determinada longitud de onda, se produce en la solución un proceso
de absorción, y el haz de luz que sale después de atravesar la cubeta tiene una intensidad menor, Is:
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Se define como transmitancia la relación entre la luz incidente y la luz transmitida:

Is
T 
I0

En la práctica, se define el porcentaje de transmitancia:

Is
%T   100
I0

Para evitar interacciones por parte del solvente o de la cubeta, y considerar así sólo la absorción
del compuesto de interés, hay que hacer una primera medida con una «solución de referencia» o
«blanco», que contiene todos los posibles compuestos que participan en la lectura, menos el
compuesto a medir.
Todas las medidas que se hagan con posterioridad serán referidas a esta medida inicial, y se deben
hacer en la misma cubeta que se utilizó para la medida del blanco (Práctica nº 1 de
espectrofotometría).
El valor experimental de la transmitancia, o %T, es de escaso empleo hoy en día, pero conviene no
olvidar que lo único que se puede medir es la luz transmitida.
En la práctica se emplea, en lugar del valor de transmitancia, el de Absorbancia (A), ya que la
relación entre la concentración de una solución y su transmitancia es inversa y logarítmica, mientras
que la relación entre la absorbancia y concentración es directamente proporcional:

Is
A   log T   log
I0

3.2 DESCRIPCIÓN DEL INSTRUMENTAL:

En base al sistema selector de longitud de onda, los aparatos se clasifican en dos tipos:
 Fotómetros: Emplean filtros, obteniendo luz monocromática a longitudes de onda discretas.
 Espectrofotómetros: Emplean monocromadores, del tipo de prismas o redes de difracción,
obteniendo luz monocromática en un intervalo continuo de longitudes de onda.
Según la disposición de los componentes fotométricos, se pueden clasificar en espectrofotómetros
de haz simple o de doble haz.
Todos los fotómetros y espectrofotómetros constan esencialmente de:
a) Fuente estable de energía radiante.
b) Rendijas de entrada y salida.
c) Selector de longitud de onda.
d) Cubeta destinada a contener la muestra.
e) Detector de energía radiante.
f) Presentación de datos.
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Constan esquemáticamente de los componentes antes mencionados: la luz emitida pasa a través de
un monocromador que seleccionará la longitud de onda deseada; unas rendijas de entrada y salida
consiguen que el haz de luz sea estrecho, y evitan la luz difusa; la luz pasa a través de la cubeta, donde
se produce la absorción; la luz no absorbida es transmitida al detector, que convierte la energía
radiante en energía eléctrica, que es registrada en un lector.

Los componentes descritos anteriormente se pueden combinar de distintas maneras para fabricar
docenas de instrumentos para realizar medidas de absorción. El diseño de estos equipos varía desde los
más sencillos a los más sofisticados, existiendo notables diferencias en su precio. La selección de un
instrumento se debe hacer según el tipo de trabajo para el que va a ser destinado.

Podemos distinguir entre:

- Fotómetros.
- Espectrofotómetros.

Fotómetros:
Un fotómetro es un instrumento sencillo y relativamente barato para el análisis de absorción.
Poseen generalmente una alta resistencia y es fácil de mantener. Se utiliza principalmente cuando el
análisis no requiere una alta pureza espectral.

Actualmente también existen fotómetros tipo sonda.

Espectrofotómetros
Se clasifican como tales en el espacio y en el tiempo.

a) Espectrofotómetros de doble haz en el espacio: Todos los componentes están duplicados

menos la lámpara. Dos haces de luz pasan al mismo tiempo a través de los diferentes componentes
separados en el espacio (muestra/patrón y blanco)
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b) Espectrofotómetros de doble haz en el tiempo: Normalmente utilizan los mismos

componentes que un instrumento de haz simple. Dos haces de luz pasan a través de los mismos
componentes, pero no en el tiempo. Emplean un «chopper (es una rueda giratoria con secciones
plateadas y rendijas alternas) colocado a continuación de la rendija de salida. Un sistema de espejos
dirige la porción de luz reflejada por el chopper a través de una cubeta de referencia y de ahí al
detector común. El detector ve alternativamente el haz de luz procedente de la muestra y el de
referencia.

Componentes de fotómetros y espectrofotómetros

a) Fuente de energía radiante

La misión de la fuente de energía es proporcionar energía radiante en forma de luz visible o no

visible. Existen distintas lámparas que emiten en distintas zonas del espectro visible UV.
 Lámparas de filamento de tungsteno: Se utilizan habitualmente con fuentes de radiación para
longitudes de onda del espectro visible y UV próximo son fuente de un espectro continuo de energía
radiante entre 360 y 950 nm.
 Lámparas de filamentos de haluros de tungsteno: Son de mayor duración, producen más luz a
longitudes de onda cortas, y emiten energía radiante de mayor intensidad que las de filamento de
tungsteno. Se emplean frecuentemente las de yoduro de tungsteno.
 Lámparas de hidrógeno y deuterio: Producen un espectro continuo en la región UV (220 a 360
nm). Se emplean para medidas en esta región del espectro, siendo más usada la de deuterio, de mayor
intensidad que la de hidrógeno.
 TEMA 61: ABSORCIÓN MOLECULAR UV-V Y FLUORESCENCIA MOLECULAR 6

 Lámparas de vapores de mercurio: Emiten un espectro discontinuo «espectro de líneas» (313,

365, 405, 436 y 546 nm). Son muy útiles par propósitos de calibración de longitudes de onda, pero no
son utilizadas en muchos espectrofotómetros. Se emplean en espectrofotómetros para cromatografía
HPLC.

b) Rendijas

La función de las rendijas de entrada es reducir al máximo la luz difusa y evitar que la luz dispersa
entre en el sistema de selección de longitud de onda.
Las rendijas de salida tienen como función impedir que la luz difusa atraviese la cubeta, lo que
generaría desviaciones a la Ley de Beer.

c) Sistemas de selección de longitud de onda

Su finalidad es seleccionar la longitud de onda o intervalos de longitud de onda deseados para el
análisis. Se clasifican en filtros y monocromadores.

c.1.- Filtros
Es un mecanismo sencillo compuesto por un material que transmite selectivamente una longitud de
onda y absorbe todas las demás. Existen dos tipos:
 Filtros de vidrio y filtros Wratten. Basados en la transmisión selectiva de la luz. Los filtros
Wratten consisten en una capa de gelatina coloreada entre dos láminas de vidrio transparente. Los
filtros de vidrio están compuestos por una o más capas de vidrios coloreados. Ambos tipos transmiten
más energía radiante en una parte del espectro que en otras. Son preferibles los filtros de vidrio por ser
más duraderos, y menos susceptibles de daño por el calor y la luz solar.
 Filtros de interferencia. Basados en el principio de interferencia. Cuando la luz choca con una
fina película, una parte es reflejada en la superficie frontal de la película mientras que la que penetra
en ella es reflejada por la cara interior. Este último rayo de luz ha viajado más que el primero, y la
diferencia de recorrido viene dada por el espesor de la película. Si ambos rayos reflejados (en la cara
frontal y en la cara interior de la película) están en fase, su intensidad queda duplicada, mientras que si
están fuera de fase se anulan entre sí. De esta forma, cuando la luz blanca incide sobre una película de
este tipo, algunas de sus longitudes de onda quedan aumentadas, mientras que otras se anulan. Los
filtros de interferencia separan intervalos más estrechos de longitud de onda que los de vidrio.

c.2.- Monocromadores
Los monocromadores son capaces de dar bandas espectrales mucho más estrechas que los filtros, y
tienen la ventaja adicional de poderse ajustar fácilmente dentro de una amplia zona del espectro.
El elemento dispersante de la luz puede ser un prisma o una red de difracción.
 Prismas. Son fragmentos con forma de cuña, de vidrio, cuarzo, cloruro sódico o cualquier otro
material que permita la transmisión de la luz. Debido a la variación del índice de refracción en función
de la longitud de onda, la luz que penetra en el prisma se dispersa en mayor o menor medida según la
longitud de onda de la luz. La dispersión de la luz no es lineal, es decir, se hace cada vez menor a
medida que se acortan las longitudes de onda. Cuando se pretende trabajar en la zona visible del
espectro y en la UV próxima, se pueden utilizar prismas de vidrio, pero para trabajar en el UV lejano,
han de ser de cuarzo.
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 Redes de difracción. Consisten en un gran número de líneas (hendiduras) paralelas, situadas a

distancias iguales entre sí, trazadas sobre un vidrio o una superficie metálica. Cuando incide la luz
blanca sobre ella, cada hendidura se comporta como un pequeño prisma; la luz se refleja o atraviesa la
red de manera que la luz blanca se descompone en varios colores.

Parámetros de los sistemas de selección de longitud de onda

Con excepción de los mecanismos ópticos láser, la luz obtenida con cualquier sistema selector de
longitud de onda no es verdaderamente monocromática, sino que comprende un intervalo de
longitudes de onda.
En un sistema selector de longitudes de onda con una anchura igual para las rendijas de entrada y
salida, la luz que emerja de la rendija de salida se representa por un triangulo isósceles. De este modo
podemos definir varios parámetros:
d) Cubetas

Es el recipiente donde se coloca la muestra para la medición espectrofotométrica.

 Formas
Pueden ser redondas, cuadradas, o rectangulares, y de tamaño menor o mayor. Habitualmente
tienen 1 cm de paso de luz. Se obtienen mejores resultados trabajando con las cubetas de lados
paralelos, a ser posible fundidas en lugar de cementadas. Las de forma redonda se deben marcar e
introducir en el aparato siempre en la misma posición.

 Materiales
La mayoría están fabricadas en vidrio, lo cual permite trabajar satisfactoriamente entre longitudes
de onda que van de 320 a 950 nm. También existen cubetas de plástico. Para medidas por debajo de
320 nm (UV) es necesario emplear cubetas de cuarzo, que también se podrían emplear para
mediciones a longitudes de onda superiores, pero su costo lo desaconseja.

e) Sistemas de detección

Existen dos tipos de detectores empleados tanto en las regiones del visible como del UV: células
fotovoltaicas y fototubos. La elección de uno u otro sistema depende fundamentalmente de la energía
radiante de que se disponga. Si se han empleado como selectores filtros o monocromadores de baja
dispersión, éstos proporcionarán un haz de luz de suficiente energía como para emplear células
fotovoltaicas. Si se emplean monocromadores de elevado poder resolutivo, hay que recurrir a
fotomultiplicadores para la detección.

f) Sistemas de presentación de datos

La energía eléctrica del detector se refleja en sistemas de lectura y presentación de datos. Estos
pueden ser sistemas de lectura directa, que suelen ir aplicados a aparatos con detectores del tipo
fotocélulas, o bien pueden introducir amplificadores de señal, como ocurre en los aparatos con
fototubos.
Hoy en día todos los aparatos incorporan ya la lectura digital, la cual, unida también a la
introducción de microprocesadores, permite cálculos directos de concentración con arreglo a factores
de calibración prefijados, y lectura contra estándares, o curvas de calibración en memoria.
 TEMA 61: ABSORCIÓN MOLECULAR UV-V Y FLUORESCENCIA MOLECULAR 8

A esta presentación digital de resultados se une también la posibilidad de conexión de

registradores, de gran utilidad en el estudio de reacciones cinéticas, y en la realización de barridos a
través de intervalos de longitudes de onda del espectro.

3.3 MANTENIMIENTO DEL INSTRUMENTAL:

La primera etapa que debe realizarse siempre antes de cualquier medida de absorbancia es el ajuste
del medidor de señal. En primer lugar se ajusta el cero de transmitancia bloqueando la radiación antes
del detector con un obturador o introduciendo una cubeta opaca (ajuste del 0 % de T). A continuación
se ajusta el indicador al 100% de T (o cero de absorbancia), este ajuste se realiza con el disolvente o
blanco en la trayectoria del haz incidente.

1. Limpiar externamente el espectrofotómetro, incluyendo los controles,

pantallas o metros de medición. Esto se puede realizar con una pieza de
tela fina –similar a la textura de los pañuelos– humedecida con
agua destilada.
2. Inspeccionar y limpiar el cable de alimentación eléctrica.
3. Verificar que la lámpara esté limpia y en buen estado. Si no funciona,
instalar una nueva, con las mismas especificaciones de la original. En los
espectrofotómetros modernos, el estado de la lámpara es detectado
automáticamente mediante el software que controla el estado y el
funcionamiento del equipo, por lo que es fácil determinar en qué momento
es necesario cambiar la lámpara. Efectuar el cambio de la lámpara y
realizar el ajuste posterior siguiendo el procedimiento recomendado por el
fabricante.
4. Revisar el fusible de protección. Antes de abrir el alojamiento del
fusible, comprobar que el espectrofotómetro esté apagado y que sus
contactos se encuentren limpios y en buen estado. Si es necesario
reemplazarlo, colocar uno nuevo con las mismas características del
recomendado por el fabricante.
5. Colocar el instrumento en la configuración operacional.
6. Accionar el interruptor de encendido para permitir un funcionamiento
por cinco (5)
minutos. Verificar lo siguiente:
a) Si las lámparas o indicadores piloto funcionan.
b) Si el indicador de lectura permanece en cero (0).
c) Si la luz de la fuente funciona.
7. Realizar una prueba de corriente de fuga en las posiciones de encendido
y apagado.
a) Verificar el polo a tierra y la polaridad correcta.
b) Verificar la polaridad correcta sin polo a tierra.
c) Verificar la polaridad inversa sin polo a tierra.
8. Calibrar el panel frontal del espectrofotómetro siguiendo las
instrucciones del
fabricante.
9. Medir la sensibilidad del equipo.
10. Realizar una prueba siguiendo la ley de Beer.
11. Regresar el espectrofotómetro a la configuración inicial, si la
 TEMA 61: ABSORCIÓN MOLECULAR UV-V Y FLUORESCENCIA MOLECULAR 9

calibración se ha
efectuado con éxito.

3.4 INTERPRETACIÓN DE LOS REGISTROS GRÁFICOS:

El empleo de la espectrometría va a permitir, basándonos en el comportamiento dual de la luz (onda,

corpúsculo), estudiar en una muestra, el contenido de una determinada sustancia basándonos en la
capacidad de la misma para absorber (absorbancia) o emitir luz (transmitancia).
Cada especie absorbente (cromógeno) tiene lo que se llama un
«espectro de absorción característico» (por eso puedes aplicarse
esta técnica para análisis cualitativo). Este espectro representa la
relación entre la longitud de onda incidente y la absorbancia que
presenta una solución de la especie, en condiciones definidas de
trabajo. Al gráfico que resulta de representar en un eje de
coordenadas absorbancia (ordenadas) frente a longitud de onda
(abscisas), es a lo que llamamos espectro de absorción.
Los espectros de absorción son de utilidad tanto para
seleccionar la longitud de onda más adecuada para una medida
cuantitativa (longitud de onda a la que la absorción es máxima),
como para fines de identificación cualitativa.
a) Determinar la longitud de onda (λ) a la cual la absorbancia es máxima. Esta será la λ empleada
para desarrollar la recta patrón.

Este procedimiento, proporcionara un valor de λ donde la absorbancia es máxima, por lo general habrá
oscilaciones de manera que se observaran varios λ máxima, normalmente se selecciona aquel valor que sea
mayor de todos, pero en principio daría igual un valor de λ que otro (siempre que sean máximos en la curva
de barrido), pues después la disolución se comportará igual independientemente de la longitud de onda
empleada.

El barrido se puede iniciar indistintamente, en cualquier longitud de onda, pero siempre dentro del
ultravioleta cercano y el visible (200 a 800 nm).

a) Curva de Calibrado: Es la representación gráfica en un eje de coordenadas de absorbancia

(ordenadas) frente a concentración (abscisas).
El método de trabajo con curva de calibración consiste en ensayar varías soluciones de
concentraciones conocidas, y determinar sus absorbancias; a continuación, se construye la curva de
calibración (que debe ser una recta), representando las concentraciones frente a sus absorbancias
gráficamente. Una vez ensayadas las soluciones problema, su concentración se averigua por
interpolación de las absorbancias de las soluciones problema en la recta de calibración.

Is 1 100
A   log   log T   log  log  log100  log T
I0 T %T

A  2  log %T
 TEMA 61: ABSORCIÓN MOLECULAR UV-V Y FLUORESCENCIA MOLECULAR 10

De esta relación matemática se deduce que la relación logarítmica entre A y %T se traduce en dos
escalas:

%T → va de 0 a 100 → Si %T = 100 → A = 2 -log 100 = 0

A→ va de ∞ a 0 → Si %T = 0 → A = 2 -log 0 = ∞

La escala va desde 0 a  pero la máxima exactitud se obtiene en el intervalo de 0’1 a 1’0 por lo
tanto las condiciones experimentales se deben elegir de manera que la absorbancia producida ocurra
dentro de dicho intervalo: las disoluciones que originen A demasiado elevadas se diluyen y las de A
baja se concentran. Normalmente esto se prevé mediante una determinación preliminar.

En los aparatos que se usan hoy en día, las lecturas de %T son transformadas en absorbancias y
presentadas así al operador, pero conviene no olvidar que la absorbancia no es en sí misma una
cantidad medible, sino que se obtiene por cálculo matemático a partir de los datos de transmitancia que
mide el sistema fotométrico.
La Ley de Beer establece la relación entre el grado de absorbancia de una solución y otras dos
variables: la concentración del absorbente y la longitud del trayecto que el haz de luz recorre a través
de la solución. Según esta ley, la absorbancia de una solución es directamente proporcional a la
concentración y a la longitud del paso de luz:
A=a·b·c

Siendo: A = absorbancia. a = coeficiente de absorción, o absortividad. b = longitud del paso de luz

en centímetros. c = concentración de absorbente.
El coeficiente de absorción a se denomina coeficiente de extinción molar, representado con el
símbolo ε cuando las unidades de b son centímetros y las de c son moles/litro. El coeficiente de
extinción molar es constante para un compuesto dado cuando se fijan condiciones de longitud de onda,
pH, solvente, temperatura, y otros factores. Sus unidades son 1/mol·cm.
En la práctica, el significado del coeficiente de extinción molar es el siguiente: cuanto mayor sea ε
en una sustancia (cromóforo) para unas condiciones de trabajo determinadas, mayor será la
absorbancia de ese compuesto en esas condiciones de trabajo y, por tanto, mayor será la sensibilidad
del método que lo emplea. (Para una misma concentración de cromógeno, si ε aumenta, A aumenta.)
 TEMA 61: ABSORCIÓN MOLECULAR UV-V Y FLUORESCENCIA MOLECULAR 11

7.0

6.5 Ajuste linear, y=b*x + a

Y = 0.01163 * X + 0.0150002
6.0
Coeficiente de la determinación r^2 = 0.9977
5.5

5.0

4.5

4.0
Absorbancia3.5

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

0 100 200 300 400 500 600

CONCENTRACION (ppb)

4.- FLUORESCENCIA MOLECULAR:

4.1.- FUNDAMENTO Y DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA:
El fenómeno de fluorescencia se encuentra dentro de los fenómenos llamados de “luminiscencia”
que incluye además de éste, la fosforescencia y la quimioluminiscencia. Todos ellos son resultantes
de la interacción de la luz con la materia que acaba con “emisión” de energía radiante.

Ao + h.v1 A* Ao + h.v2

Siendo: Ao: absorbente en estado fundamental

h.v1: energía de excitación
A*: absorbente en estado excitado
h.v2: energía de emisión

Según el tipo de energía absorbida por la molécula se pueden clasificar los distintos fenómenos
luminiscentes en:
Quimioluminiscencia: cuando es una reacción química la que produce la energía capaz de excitar
 TEMA 61: ABSORCIÓN MOLECULAR UV-V Y FLUORESCENCIA MOLECULAR 12

la molécula.
Fotoluminiscencia: cuando la fuente de excitación electrónica es una radiación luminosa; son
fenómenos de este tipo la fluorescencia y la fosforescencia.

Existen otros tipos de luminiscencia como son: bioluminiscencia, termoluminiscencia,

radioluminiscencia etc. La fluorescencia se produce cuando una molécula absorbe luz (longitud de
onda de excitación), pasa a un estado excitado y al retornar a su estado fundamental, emite luz
(longitud de onda de emisión); la fluorescencia será por tanto la emisión de esa radiación. La
energía de la radiación emitida es menor y por tanto, la longitud de onda es mayor que la de la
radiación absorbida. La diferencia o aumento entre estas 2 longitudes de onda se denomina
desviación de Stokes y, de forma general, los mejores resultados de las medidas de fluorescencia se
obtienen con compuestos que tienen grandes diferencias entre las 2 longitudes de onda de excitación y
de emisión.
Sólo ciertas sustancias poseen la propiedad de ser fluorescentes: son los fluorocromos (fluoróforos).
Compuestos que no son en sí mismo fluorescentes o sólo débilmente, pueden convertirse en derivados
muy fluorescentes mediante reacciones químicas como condensaciones, sustituciones,
deshidrataciones u oxidaciones, o simplemente modificando su pH particular.
4.2- DESCRIPCIÓN DEL INSTRUMENTAL
Para la medida de la fluorescencia se emplean fluorímetros o espectrofluorímetros; la diferencia entre
ellos es el sistema de selección de la λ de excitación y de emisión:
La luz procedente de la lámpara de excitación se hace pasar por el filtro o monocromador de
excitación, que selecciona la λ adecuada que incide sobre la cubeta con el espécimen; parte de la luz se
 TEMA 61: ABSORCIÓN MOLECULAR UV-V Y FLUORESCENCIA MOLECULAR 13

absorbe y como consecuencia del proceso de fluorescencia, se emite luz de mayor λ ; ésta se hace
pasar por el filtro o monocromador de emisión colocado perpendicularmente al primero, para evitar
interferencias de la luz de excitación (si no se colocase así, se detectaría no sólo la luz emitida por
fluorescencia sino también aquella transmitida). Finalmente la luz llega al detector, donde se
transforma en energía eléctrica

Fluorímetro: emplea filtros interferenciales o de vidrio

Espectrofluorímetro: emplea prismas o redes de difracción
Los componentes básicos de estos aparatos son:
1. fuente de luz de excitación
2. rendijas de excitación y de emisión
3. selector de la λ de excitación
4. compartimento para la muestra: cubeta
5. selector de la λ de emisión
6. detector
7. registro

Fuente de energía:
Las lámparas que se emplean deben emitir energía radiante de intensidad elevada porque para
detectar la emisión fluorescente será necesario previamente excitar el mayor número de flluoróforos
posible (la intensidad de la radiación fluorescente es directamente proporcional a la intensidad de la
radiación de excitación).
El espectro de absorción de la mayoría de los compuestos fluorescentes de interés se sitúa entre los
300-500 nm; por ello es conveniente una lámpara intensa capaz de emitir energía radiante en una
región espectral amplia. Las fuentes de luz que mejor se ajustan a este criterio son:
La lámpara de arco de xenón: produce un espectro continuo entre 250 y 600 nm con un máximo en
470 nm.
TEMA 61: ABSORCIÓN MOLECULAR UV-V Y FLUORESCENCIA MOLECULAR 14

La lámpara de mercurio de alta presión: produce un espectro discontinuo con líneas de emisión entre
los 365 y 734 nm.
Otras fuentes: lámparas halógenas y combinación de las lámparas de mercurio-xenón, a veces
también el láser.
Rendijas:
Las rendijas de entrada y salida son similares a las de un espectrofotómetro.

Selectores de la de excitación y emisión:

Mediante:
Filtros: interferenciales o de vidrio coloreado
Monocromadores. prismas o redes de difracción
De todos ellos, los filtros interferenciales son los más utilizados, pues los filtros transmiten más luz
y son menos costosos que los monocromadores.
Los selectores se colocan antes y después del compartimento de la muestra.
Fin: los de excitación, seleccionar la λ de la radiación de excitación y los de emisión, seleccionar la
λ de la radiación de emisión (eliminar las no deseadas) antes de que la luz incida en el detector.

Compartimento para la muestra:

Forma: las cubetas utilizadas son generalmente rectangulares, por lo menos con 2 caras adyacentes
transparentes; las 2 caras restantes pueden ser también transparentes o pueden tener una superficie
reflectante para dirigir la emisión fluorescente hacia el detector. También pueden ser cilíndricas.

Material: generalmente de cuarzo para UV-visible. Las de vidrio sólo para la zona del visible, a
veces de plástico para la zona del visible, pero pueden causar fluorescencia adicional, lo que
produciría pérdida de sensibilidad

5. Detector:
Los más utilizados son los tubos fotomultiplicadores (ya que son capaces de cuantificar la pequeña
señal fluorescente, logrando así el deseado nivel de sensibilidad en la medida).
Generalmente están dispuestos en ángulo recto respecto del haz de luz incidente.
TEMA 61: ABSORCIÓN MOLECULAR UV-V Y FLUORESCENCIA MOLECULAR 15

Como ya se dijo, las medidas de fluorescencia, se deben hacer sobre soluciones diluidas.
Las medidas de fluorescencia se realizan con referencia a un estándar de fluorescencia máxima: el
aparato se lleva a cero con un blanco adecuado no fluorescente (solvente puro) y a continuación se
coloca en la cubeta el estándar de mayor valor y se ajusta el aparato a 100%. Se miden el resto de los
estándares y las muestras y sus valores se expresan como porcentaje del estándar mayor (con los
estándares se obtiene una recta de calibración).
La necesidad de una recta patrón surge de que en las medidas de fluorescencia no hay una magnitud
equivalente al coeficiente de extinción molar (ε) y, por tanto, no se puede desarrollar una ecuación
similar a la de Lamber-Beer.
4.3 MANTENIMIENTO DEL INSTRUMENTAL:

4.4 INTERPRETACIÓN DE LOS REGISTROS GRÁFICOS:

Como ya se dijo, las medidas de fluorescencia, se deben hacer sobre soluciones diluidas.
Las medidas de fluorescencia se realizan con referencia a un estándar de fluorescencia máxima: el
aparato se lleva a cero con un blanco adecuado no fluorescente (solvente puro) y a continuación se
coloca en la cubeta el estándar de mayor valor y se ajusta el aparato a 100%. Se miden el resto de los
estándares y las muestras y sus valores se expresan como porcentaje del estándar mayor (con los
estándares se obtiene una recta de calibración).
La necesidad de una recta patrón surge de que en las medidas de fluorescencia no hay una magnitud
equivalente al coeficiente de extinción molar (ε) y, por tanto, no se puede desarrollar una ecuación
similar a la de Lamber-Beer.
TEMA 61: ABSORCIÓN MOLECULAR UV-V Y FLUORESCENCIA MOLECULAR 16

7.0

6.5 Ajuste linear, y=b*x + a

Y = 0.01163 * X + 0.0150002
6.0
Coeficiente de la determinación r^2 = 0.9977
5.5

5.0

4.5

4.0

3.5
Fluorescencia
3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

0 100 200 300 400 500 600

CONCENTRACION (ppb)
 TEMA 61: ABSORCIÓN MOLECULAR UV-V Y FLUORESCENCIA MOLECULAR 17

CRITERIOS DE SELECCIÓN DE LA TÉCNICA:

ABSORCION MOLEC
La ley de Beer es solamente aplicable a disoluciones en las cuales las interacciones, entre
moléculas o iones absorbentes sean mínimas. Estas interacciones, que generalmente comienzan a
aparecer a concentraciones superiores a 0’01M.

Se producen desviaciones aparentes de la Ley de Beer cuando las especies absorbentes

experimentan disociación, asociación o reacción con el disolvente, originando productos con
características absorbentes distintas de las del analito.
La fluorescencia emitida puede cuantificarse; la luz fluorescente se puede utilizar para
cuantificar la cantidad de compuesto fluorescente que la emite. La ventaja más importante de la
fluorimetría es su enorme sensibilidad: puede llegar a ser de 100 a 1000 veces más sensible que las
técnicas colorimétricas
Se puede aplicar al fenómeno de fluorescencia la Ley de Beer, siempre que se trabaje con
soluciones diluidas: según ella, la intensidad de la radiación fluorescente es proporcional a la
concentración de la sustancia en solución (esta relación es sólo válida para soluciones diluidas donde
la absorbancia es <2% de la radiación excitante ya que si es mayor aparece el efecto de “filtro
interno”). lo aconsejable es disminuir la concentración de la muestra: normalmente para
transmitancias mayores del 95%, lo cual significa valores de absorbancia inferiores a 0,022, el efecto
de filtro interno es prácticamente despreciable.
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