UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA

Ismael de Deus Medeiros - 21351849

RELATÓRIO CARACTERIZAÇÃO DE MOLÉCULAS MÉTODO DE

BRADFORD PARA ANÁLISE DE PROTEÍNA

Prof. Edson do Carmo

Manaus - Am

2018
INTRODUÇÃO

Proteínas são compostos poliméricos complexos com alto peso

molecular(PM). Podem ser formadas apenas por cadeias de aminoácidos ou
constituídas por aminoácidos (parte proteica) conjugados com outras classes
de compostos como lipídios, ácidos nucleicos, carboidratos, grupo inorgânico,
entre outros (SANTANA, 2012).
Por serem formadas por aminoácidos e considerando-se que os
aminoácidos aromáticos absorvem luz na região ultravioleta, as proteínas, em
geral, podem ser detectadas através da absorção de luz a 280 nm. No entanto,
a detecção de proteínas em materiais biológicos envolve reações específicas
com determinados reativos, os quais originam substâncias coloridas que
absorvem luz na região visível, permitindo a sua quantificação. Dentre os
métodos utilizados, situa-se o método do biureto, que é baseado na reação do
sulfato de cobre em meio alcalino (reativo do biureto) com proteínas e
peptídeos (no mínimo tripeptídeos) (IB/UFF, 2013). As ligações peptídicas das
proteínas (-CONH-) reagem com os íons cúpricos, em meio alcalino, formando
um complexo de coloração violeta que é proporcional ao teor das Proteínas no
meio (BIOCLIN, 2013).
O ensaio de Bradford engloba várias preparações do corante
Coomassie azul brilhante usado com o objectivo de quantificar proteínas, e foi
descrito pela primeira vez por Bradford (1976). No método de Bradford, o
analito é colocado em contacto com uma solução do corante Coomassie G-250
azul brilhante e é permitida a sua incubação por um curto período de tempo. O
corante ir-se-á ligar aos aminoácidos básicos ou aromáticos. Em consequência
da ligação à proteína uma alteração metacromática, para uma cor
avermelhada, de 465 para 595 nm é observada devido à estabilização da forma
aniónica do corante.
A absorvância é lida espectrofotometricamente e, através da aplicação
de uma curva de calibração e da Lei de Lambert-Beer, a concentração de
proteína pode ser calculada a partir da absorbância (Lehninger).
OBJETIVO

O presente relatório, tem como objetivo o preparo do reagente Bradford,

para realização de ensaio, para contificação de proteínas.

MATERIAIS

Espectrofotometro, proveta, tubos de ensaios, estante para tubos de

ensaios, papel filtro, funil, bequer, pipeta volumétrica, erlenmeyer, água
destilada, reagentebradfor e albumina.

MÉTODO
PREPARO DO REAGENTE BRADFORD PARA CONTIFICAR PROTEÍNA

Para a preparação do reagente de Bradford, dissolveu-se 100 mg de

Coomassie Brillante Blue G-250 em 50mL de etanol absoluto e, em seguida
adicionou-se 100mL de ácido fosfórico a 85%. A solução assim obtida foi
avolumada para 1L com água deionizada. Após filtração em papel de de fitro
quantitativo, a solução foi usada para a quantificação de proteinas.
Para fazer o ensaio foi adicionado 100ul de amostra ae 1 ml de bradford
tudo feito em triplicata nas seguintes proporções: 0, 5, 20, 50, 100 e 200 e após
ler em espectrofotometro em 595 nm, para determinação das proteínas.

RESULTADO E DISCUSSÃO

Com os resultados obtidos pelo método de Bradford, utilizando a

albumina, nas diferentes concetrações em triplicatas, pudemos obter as médias
das absorbâncias, e apartir das médias foi realizar a curva de calibração. A
curva de calibração é apresentada no gráfico a baixo, conforme pode ser
observado, a correlação entre a absorbância a 595nm e a concentração de
albumina se mostrou fora dos padrões esperados, devido talvez algum erro que
ocorreu no decorrer do experimento, ou algum defeito no espectroffotometro na
hora da leitura.
 Apartir desses resultados, fica evidenciado que erros na hora do
experimento, compromete todo o resultado final do experimento, seja qual for o
método utilizado.

Tabela 1mostra os resultados das absorbâncias das amostras

ALBUMIA MG/ML ABS 1 ABS 2 ABS 3 MED. ABS ALBUMINA

0 0,289 0,169 0 0,152

5 0,543 0 0 0,181

20 0,348 0 0,283 0,210

50 0,312 0 0,116 0,142

100 0,350 0,512 0 0,287

200 0,350 0,316 0 0,222

O gráico mostra a correlação da absorbância com a

concentração de proteína

0.35
y = 0.0492x
R² = -1.21
0.3

0.25

0.2
Series1
0.15 Linear (Series1)

0.1

0.05

0
0 2 4 6 8
CONCLUSÃO

A partir dos resultados observados, conclui-se que é possível

determinar a presença de proteínas em solução com o auxílio de algumas
reações químicas conhecidas, bem como a natureza de alguns aminoácidos
presentes nestas proteínas. O método Bradford, se mostra bastante eficaz para
a analise de concentação de proteínas e, por ser de fácil execução, e elevada
sensibilidade e com baixo custo dos reagentes é bastante utilizado em
experimento para medir a concentração de proteína de uma substância.
 REFERÊNCIAS
BIOCLIN. Proteínas totais. 2012. sitebiomedico.br.tripod.com/proteinas.htm >
março de 2013.

Identificação de proteínas em alimentos pelo método do Biureto, EBAH.

Disponível em:< http://www.ebah.com.br/content/ABAAAftBgAA/relatorio-
identificacao-proteinas-emalimentos-pelo-meetodo-Biureto>. Acesso em 21 de
março de 2018.

Jessica Gamba, Débora Grinet, Adriane M. F. Milagres, Walter Carvalho, USP.

Elaboração de curva de calibração para a quantificação de proteínas pelo
método de Bradford. Disponível
em:<https:uspdigtal.usp.br/siicusp/cdOnlineTrabalhoVisualizarResumo?numero
lnscricaoTrabalho=2961&numeroEdição=16>.Acesso em 21 de março de 2018.

NELSON, D.L.; COX, M.M. Lehninger Princípios de Bioquímica. 3ª edição. São

Paulo, 2002. c).

Roteiro de aulas praticas. Universidade Federal Fluminense. Instituto de

biologia. Disponível em:<http: uff.br/gcm/GCM/graduacao_arquivos/Apostila.pdf
>. Acesso em 21 de março de 2018.
ANEXOS

Imagem 1, mostra alguns

materiais utilizados no
experimento.

Imagem 2, mostra o momento em

que o reagente Bradford e
adicionado nas diferentes
concentrações de proteínas

Imagem 3, mostra o momento em que o

reagente é filtrado para posterior uso
em contificação de proteinas.
 Imagem 4, mostra os pelites
com as diferentes
concentrações de proteinas,
que foram feitas em
tripicatas.

Imagem 5, mostra o
momento em que são
lidas as absorbâncias em
espectrofotometro a 595
nm.