Instituto Politécnico de Viana do Castelo

Escola Superior Agrária

Microbiologia
1º Ano, 2º Semestre

Protocolos das Aulas Práticas

2017/2018
Luísa Moura

DOCENTES:
Luísa Moura (Responsável)
Isabel Afonso

NOME ALUNO:
Nº:
CURSO:
ÍNDICE Pág.

P1. OBSERVAÇÃO MICROSCÓPICA DE MICRORGANISMOS: BACTÉRIAS, 2

PROTOZOÁRIOS e LEVEDURAS

P2. OBSERVAÇÃO MICROSCÓPICA DE FUNGOS FILAMENTOSOS 4

P3. MEIOS DE CULTURA – Preparação, esterilização e distribuição de meios de cultura 6

P4. MICRORGANISMOS NO MEIO AMBIENTE 7

P5. ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS A PARTIR DE CULTURAS MISTAS: Obtenção 10

de culturas Puras

P6. ESTUDO MORFOLÓGICO DE MICRORGANISMOS: Coloração Diferencial – Método de 12

Gram

P7. CINÉTICA DO CRESCIMENTO BACTERIANO IN VITRO – Quantificação de 14

microrganismos

P8. ACTIVIDADES BIOQUÍMICAS DOS MICRORGANISMOS: Provas do metabolismo 19

respiratório

P9. ACTIVIDADES BIOQUÍMICAS DOS MICRORGANISMOS: Utilização de kits comerciais 20

de multitestes de provas bioquímicas

P10. CONTROLO DOS MICRORGANISMOS POR AGENTES QUÍMICOS: Estudo da 21

susceptibilidade bacteriana aos antibióticos

P11. BACTERIÓFAGOS COMO INDICADORES DE POLUIÇÃO FECAL: Pesquisa de 26

colifagos em efluentes de uma estação de tratamento secundário

1
P1. OBSERVAÇÃO MICROSCÓPICA (MOC) DE DIFERENTES TIPOS DE
MICRORGANISMOS: BACTÉRIAS, PROTOZOÁRIOS e LEVEDURAS
Introdução
Os microrganismos não são todos iguais embora partilhem a característica comum de na sua maioria serem
individualmente invisíveis a olho nu, necessitando por isso de ampliação, de forma a serem visualizados. Os
microrganismos diferem entre si na sua organização celular, na sua aparência e na sua atividade. A dimensão
celular, só por si, pode auxiliar-nos na constituição de diferentes grupos.
Podemos dividir os microrganismos em dois grandes grupos baseados no tipo de organização celular. Os
microrganismos eucariotas e os microrganismos procariotas. Os microrganismos eucariotas incluem três
grandes grupos: os protozoários, as algas e os fungos. Estes últimos, os fungos, são divididos em dois subgrupos
em função da sua organização multicelular (bolores ou fungos filamentosos) ou unicelular (leveduras).. Os
microrganismos procariotas incluem as bactérias.

Objetivos
 Observar e saber diferenciar diferentes tipos de microrganismos
 Relembrar conceitos básicos de utilização do microscópio óptico composto (MOC)

Material e Reagentes
- Microscópios
- Lâminas e lamelas
- Pipetas pasteur
- Papel absorvente
- Suspensão de leveduras
- Preparação definitivas de bactéria (ou preparação fixada com coloração)
- Lamas de ETAR (lamas ativadas)
- Contentor para material utilizado com desinfectante

Procedimento experimental
1. Sobre uma lâmina de vidro coloque uma pequena gota do material que pretende observar, e cubra com uma
lamela pressionando levemente.
2. Observe ao microscópio, aumentando progressivamente de ampliação.
3. Fazer esboços das células observadas, tendo em atenção a complexidade celular observada e a dimensão
relativa das espécies.

Registo de resultados

Data: ____/____/____

Material Esboço da morfologia Ampliação

Comentário
Observado predominante utilizada

Suspensão de
Leveduras

2
 Material Esboço da morfologia Ampliação
Comentário
Observado predominante utilizada

Bactérias
(preparação
fixada com
coloração)

Lamas
ativadas

3
P2. OBSERVAÇÃO MICROSCÓPICA DE FUNGOS FILAMENTOSOS

Introdução
Os fungos são microrganismos eucariotas e podem ser unicelulares (leveduras) ou filamentosos (bolores). A
observação das culturas primárias podem fornecer-nos informações chave para posterior identificação do agente
em causa, permitindo distinguir, logo à partida, as leveduras dos fungos filamentosos.
A observação microscópica de leveduras fornece informações importantes para a sua identificação, que incluem
as características de gemulação (simples, múltipla), tamanho e morfologia da célula.
As colónias de fungos filamentosos são formadas por hifas que formam o micélio que fica em contato com o
agar (micélio vegetativo) e pelo micélio aéreo, onde se encontram as estruturas diferenciadas para a reprodução.
A identificação dos fungos filamentosos, além do aspeto macroscópico do micélio, depende ainda do aspeto
macroscópico das hifas e das estruturas reprodutoras.
Para a coloração de fungos usa-se vulgarmente o azul de lactofenol, um corante com afinidade para a quitina e
celulose da parede fúngica.

Objectivos
 Observar e caracterizar fungos filamentosos ao microscópio
 Conhecer e aplicar as colorações necessárias para a observação de fungos

Material e Reagentes:
- Corante Azul de lactofenol
- Lâminas e lamelas para microscópio
- Microscópio
- Ansas; palitos esterilizados
- Fita adesiva e tesoura
- Lamparina e álcool
- Contentor para material utilizado com desinfectante

Material biológico
- Culturas de fungos filamentosos
- Frutos contaminados

Procedimento experimental

A - Coloração com azul de lactofenol (fungos filamentosos)

1. Colocar uma gota de lactofenol numa lâmina;
2. Recolher uma porção do micélio com um palito estéril ou com uma ansa (fio recto) previamente
esterilizada à chama;
3. Colocar o fragmento de cultura sobre a gota ;
4. Colocar uma lamela sobre a lâmina e pressionar levemente;
5. Aquecer ligeiramente (para destruição do agar)
6. Observar ao microscópio (10x e 40 x e 100 x);
7. Fazer um desenho da observação.

B - Técnica da fita adesiva (fungos filamentosos)

1. Colocar uma gota de lactofenol numa lâmina;
2. Cortar um pequeno quadrado de fita adesiva;
3. Fazer a fita aderir à ansa ou palito esterilizado e tocar com a parte da fita adesiva contendo cola no
micélio do fungo;
4. Colocar a fita adesiva contendo o micélio na lâmina;
5. Observar ao microscópio (10x e 40 x e 100 x);
6. Fazer um desenho da observação.

4
Registo de resultados

Data: ____/____/____

___________________________ _________________________

Notas:

___________________________ _________________________

5
P3. MEIOS DE CULTURA – Preparação, esterilização e distribuição de meios de cultura

Introdução
O conhecimento das exigências nutricionais dos microrganismos permite elaborar meios que promovam o seu
crescimento em meios de cultura, in vitro. Os meios de cultura contêm essencialmente fontes de carbono, azoto,
fósforo e água. Os nutrientes essenciais para o crescimento variam entre os diferentes microrganismos, havendo
microrganismos nutricionalmente exigentes.
Os meios de cultura em bacteriologia têm geralmente pH ligeiramente alcalino, enquanto os meios de cultura
para fungos são ácidos. É essencial não só que os meios de cultura possuam um pH dentro dos limites, mas
também, que o valor deste não sofra grandes variações durante o crescimento dos microrganismos.
Os meios de cultura podem ser líquidos, sólidos ou semi-sólidos. O agente solidificante utilizado na sua
preparação é o agar, extraído de algas, fluidificando com a água por fervura e formando um gel sólido à
temperatura de 42ºC. Não é degradado pelas bactérias, sendo por isso o agente solidificante ideal em
microbiologia.
Após a dissolução dos meios de cultura e a sua distribuição em fracos, balões ou tubos, procede-se à sua
esterilização por autoclavagem a 121ºC durante 15 minutos. Após arrefecimento até cerca de 60ºC, os meios de
cultura sólidos para isolamento microbiano, são distribuídos em placas de Petri estéreis, e mantidos no local de
trabalho até solidificarem. A preparação de geloses inclinadas requer a inclinação dos tubos de ensaio após a
autoclavagem até à solidificação.

Objetivos
 Familiarizar o aluno com a preparação, esterilização e distribuição de meios de cultura, bem como
conhecer e discutir a utilização dos diversos tipos de meios de cultura.

Material, Reagentes e Equipamentos

- Marcadores
- Provetas e copos
- Frascos e varetas de vidro
- Água destilada
- Placas de Petri esterilizadas
- Balança de precisão
- Microondas
- Cestos de rede para esterilização
- Autoclave + fita de autoclavagem
- Câmara de fluxo laminar
- Meios de cultura desidratados: Nutriente Agar (NA); Potato Dextrose Agar (PDA)

Procedimento experimental
1. Pesar a quantidade de meio desidratado indicado na embalagem, necessário para o volume de meio de cultura
a preparar. Transferir para um balão ou copo de vidro;
2. Utilizando uma proveta, medir o volume de água destilada necessário;
3. Misturar no copo ou balão de vidro o meio de cultura desidratado pesado em 1. e a água;
4. Agitar, com auxílio de vareta de vidro ou agitador magnético, até completa dissolução.
5. Colocar a mistura no microondas, aquecendo lentamente até o agar estar completamente liquefeito;
6. Identificar os frascos de vidro autoclaváveis, com o nome do meio de cultura e a data. Colocar o meio de
cultura preparado nos frascos; marcar o frasco com papel indicador de esterilização (fita de autoclavagem);
7. Esterilizar em autoclave a 121ºC durante 15 minutos;
8. Após arrefecimento, e na camara de fluxo laminar, distribuir cerca de 20 ml de meio por placa de Petri. Deixar
arrefecer até completa solidificação do meio.

Registe a composição dos meios de cultura preparados:

6
P4. MICRORGANISMOS NO MEIO AMBIENTE

Introdução

O meio ambiente está repleto de microrganismos. Podemos encontrá-los no ar, na água, no solo, nos vários
objetos e superfícies que nos circundam. Por estas razões, a realização de trabalhos em microbiologia deverá ser
executado em condições de assepsia que impeça a contaminação dos meios e das amostras a estudar, com
microrganismos adventícios. De todos os seres vivos, os microrganismos são sem dúvida, os mais abundantes e
ubiquistas, distinguindo-se também pelas suas dimensões e pela sua diversidade, muito marcada.

Objectivos
 Detetar a presença de microrganismos em diferentes ambientes, tomando consciência de que eles
existem à nossa volta.
 Conhecer os nichos ecológicos prediletos dos microrganismos e verificar a sua ubiquidade na natureza.
 Iniciar o aluno no contato com a diversidade de formas das colónias de alguns microrganismos e
distingui-las pelos seus diferentes aspetos morfológicos.
 Iniciar o aluno com a manipulação em condições asséticas.

Material, Reagentes e Meios de Cultura

- Zaragatoas esterilizadas
- Solução fisiológica estéril
- Lamparina e álcool
- Marcadores
- Esguicho com álcool
- Temporizador de laboratório
- Estufas de incubação (25 ºC e 37 ºC)
- Placas de Petri com agar nutritivo (NA)
- Placas de Petri com PDA
- Placas de Petri com agar sangue (AS)
- Contentor com desinfetante para material utilizado

Procedimento experimental
Para testar vários ambientes e objetos existentes no laboratório ( ar, superfície da pele, mucosas nasais, etc) vai
usar placas de Petri com diferentes meios de cultura (agar nutritivo, PDA e meio de agar sangue) para a
revelação dos microrganismos a detetar. Cada grupo deverá seguir as indicações dadas pelo docente na aula,
relativamente aos elementos a testar:

1. Utilizando um marcador, identificar as placas de petri, com: Data, Operador, Inóculo (ar, pele, solo, etc)
2. Ambientes a testar:

2a) Ar: abrir uma placa de PDA e outra com agar nutritivo sobre a bancada da sala de aula, no exterior da sala,
na bancada da estufa de hortícolas, nas instalações dos animais; deixar as placas expostas durante 5 minutos, 20
minutos e 30 minutos em cada local a estudar. Fechar as placas ao fim do tempo respectivo, e incubar a 25 ºC
durante 48 horas.
 Comparar e descrever o crescimento dos microrganismos dos diferentes ambientes.
2b) Superfície da pele: com uma zaragatoa esterilizada e previamente humedecida em solução fisiológica,
recolher o conteúdo do espaço interdigital, passando-a entre os dedos de ambas as mãos; Inocular uma placa de
agar sangue, utilizando a técnica das estrias ou riscado. Colocar a zaragatoa usada no contentor com
desinfectante; Fechar a placa e incubar em estufa a 37 ºC, durante 48 horas.
 Comparar e descrever o crescimento dos microrganismos que cresceram no meio de cultura.
2c) Mucosas nasais: com uma zaragatoa esterilizada e previamente humedecida em solução fisiológica, recolher
material das fossas nasais; Inocular uma placa de agar sangue utilizando a técnica das estrias ou riscado; Fechar
a placa, e incubar em estufa a 37 ºC, durante 48 horas.
 Comparar o crescimento dos microrganismos que cresceram no meio de cultura.
2d) Outros elementos/ambientes a testar: efectue outras colheitas à sua escolha* e inocule placas com agar
nutritivo e agar sangue

* • Tossir ou espirrar à superfície do agar (agar sangue)

• Distribuir um pouco de solo agrícola à superfície do agar (agar nutritivo)
• Use a imaginação para inocular outras placas
• Incubar as placas de Petri em estufa a 25 °C ou 37 ºC durante, pelo menos 48 horas.

Obs. Depois de inoculadas as placas são incubadas em posição invertida para evitar que as gotas de condensação
formadas na tampa durante o arrefecimento do agar, caiam sobre a superfície do meio de cultura inoculado.

7
Continuação P3 e P4 – REGISTO DE RESULTADOS

Registo de Resultados

Data: ____/____/____

1-Descreva o aspeto geral do crescimento microbiano nas placas inoculadas, acompanhando de esboços dos aspetos
observados, relativamente à forma, margem, elevação (Figura A).

Colónias isoladas da pele das mãos Colónias isolados da mucosa nasal

Obs. Registar o tipo de hemólise observada no meio de cultura agar sangue

_____________________________ __________________________

8
 Registo de Resultados

Data: ____/____/____

2-Registe o número total de colónias e o nº de colónias diferentes observadas nos meios de cultura NA e Agar sangue.
Selecione diferentes colónias que apareçam isoladas no meio de cultura e caracterize-as relativamente à forma, margem e
elevação da colónia (Figura 1) quanto às características óticas (cor, transparência, brilho).

Figura 1 – Caraterização de diferentes tipos de colónias de microrganismos

em agar, quanto à Forma, Margem e Elevação

Amostra: Agar Nutritivo______________________________________

Caracterização do crescimento nos meios de cultura. Caraterização das colónias de bactérias observadas

Número de Caraterísticas*
Meio de Número total
colónias Colónia
Cultura de colónias Forma Margem Elevação Cor Brilho
diferentes

* ver Figura 1
Amostra:Agar sangue______________________________________

Caracterização do crescimento nos meios de cultura. Caraterização das colónias de bactérias observadas

Número de Caraterísticas*
Meio de Número total
colónias Colónia
Cultura de colónias Forma Margem Elevação Cor Brilho
diferentes

* ver Figura 1

9
P5. ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS A PARTIR DE CULTURAS MISTA: Obtenção
de culturas puras

Introdução
A cultura e o isolamento de microrganismos são duas operações básicas em microbiologia. O crescimento de
comunidades microbianas em meios de cultura no laboratório, permite a obtenção de culturas mistas (culturas
que têm mais do que um tipo de microrganismos) ou de culturas de puras (culturas que contêm apenas um tipo
de microrganismo). O isolamento em cultura pura promove a separação de um microrganismo a partir de
comunidades mistas. Um microrganismo inoculado num meio de cultura sólido adequado ao seu crescimento,
multiplicar-se-á no local em que foi colocado, dado que o meio sólido não lhe permite movimentar-se
livremente. Se num meio sólido os microrganismos crescerem suficientemente afastados uns dos outros, cada um
constituirá um núcleo de crescimento, a partir do qual surgirá uma massa macroscopicamente visível - uma
colónia.
A inoculação por estrias ou riscado é realizada com a finalidade de obter colónias isoladas, e realiza-se à
superfície de um meio sólido. A inoculação ou sementeira realiza-se com uma ansa, a partir de uma colónia
isolada ou de uma mistura de colónias, obtidas em meio de cultura sólido ou a partir de uma suspensão
bacteriana (Figura 2).
Existem várias técnicas de riscado (Figura 3), todas elas dando excelentes resultados se executadas corretamente.
O objectivo do riscado é o de obter colónias bem separadas umas das outras. As células ficam muito juntas no
início do riscado, originando colónias confluentes, mas à medida que o riscado continua, cada vez menos células
permanecem na ansa. As células ficam cada vez mais afastadas umas das outras no meio de cultura inoculado,
formando colónias cada vez mais separadas. Uma boa placa de riscado resulta de vários movimentos contínuos
ou descontínuos (com esterilização à chama e arrefecimento) da ansa ao longo da placa.

ou

Figura 2 - Colheita assética: flameje a ansa até o metal atingir o rubro. Trabalhe junto à chama e não faça
movimentos bruscos. Deixe arrefecer a ansa e recolha uma amostra da placa de petri ou do tubo

Figura 3 - Esquema da inoculação de meios de cultura sólidos pela técnica das estrias ou riscado

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Objetivos
 Isolar culturas puras de bactérias, partindo de culturas mistas de microrganismos
 Utilizar o método das estrias ou riscado

Material e Reagentes
- Estufas de incubação
- Vortex
- Ansas
- Solução fisiológica estéril
- Marcadores
- Lamparina e álcool
- Contentor com desinfectante para material utilizado

Meios de Cultura
- Placas de Petri com meio agar nutritivo
- Placas de Petri com meio agar sangue

Procedimento experimental
A partir dos crescimentos microbianos obtidos na aula anterior (Protocolo P3), isole em cultura pura uma
colónias que cresceu no meio agar sangue e no agar nutritivo. Para isso, faça uma sementeira por estriamento em
três setores, seguindo as indicações do docente na aula:

A - Isolamento a partir de uma mistura de colónias, obtidas em meio de cultura sólido

1. Identificar as placas de Petri a inocular, contendo meio de cultura apropriado, registando a data, o operador, o
inóculo;
2. Esterilizar a ansa na chama e arrefecer no agar não inoculado ou na solução fisiológica estéril;
3. Tomar uma porção da cultura da bactéria a isolar, tocando com a ansa na colónia (não remova demasiado
material, basta mesmo só tocar) e passe com a ansa sobre a superfície do meio, levemente e com a ansa inclinada
num ângulo agudo para não rasgar o agar (1º sector). Flameje a ansa novamente e, depois de a arrefecer, cruze
parte da zona já semeada (1º sector) e faça novamente o riscado, inoculando o 2º sector. Sem flamejar a ansa
repita o procedimento, inoculando o 3º sector;
4. Incubar as placas em posição invertida na estufa a 37°C (agar sangue) ou 25 ºC (NA) durante 24-48 horas.
5. Observar as placas e registe a existência de colónias isoladas, e as suas caraterísticas.

B - Isolamento a partir de uma suspensão bacteriana

1. Identificar as placas de Petri a inocular com meio de cultura apropriado, registando a Data, operador, inóculo;
2. Esterilizar a ansa na chama e arrefecer no agar não inoculado ou na solução fisiológica estéril;
3. Tomar uma porção de cultura da bactéria a isolar, tocando com a ansa na colónia. Depositar no tubo com
solução fisiológica estéril;
4. Agitar no Vortex para obter uma suspensão bacteriana uniforme;
5. Com ansa esterilizada à chama, e após arrefecimento, retire uma ansada da suspensão bacteriana preparada, e
faça uma sementeira por estriamento em três setores, conforme descrito anteriormente. Prossiga como indicado
anteriormente em A4. e A5.

Registo de resultados após incubação (25 ºC ou 37 ºC) durante 24-48 horas

______________________________ __________________________________

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P6. ESTUDO MORFOLÓGICO DE MICRORGANISMOS: Coloração Diferencial – Método de
Gram

Introdução
As células microbianas vivas, num exame a fresco, são difíceis de visualizar por falta de contraste com o meio
aquoso circundante. A coloração das células microbianas com corantes básicos permite obter esse contraste e
facilita o estudo morfológico das células microbianas, por microscopia óptica.
A coloração de Gram foi originalmente desenvolvida por Christian Gram em 1984. Esta técnica cora
diferencialmente as bactérias. A coloração diferencial de Gram é a que se utiliza com maior frequência em
Bacteriologia e separa as bactérias em dois grupos taxonómicos: os que coram de roxo – bactérias Gram
positivo, e os que coram de vermelho – bactérias Gram negativo.
A capacidade da bactéria reter ou perder a coloração, reflete as diferenças na estrutura e composição química da
parede celular bacteriana sendo, por isso, um importante carácter taxonómico (Quadro 5). A positividade ao
corante de Gram, ou seja, a capacidade de resistir à descoloração pelo etanol ou acetona, é uma caraterística
própria das células bacterianas jovens de algumas espécies. As células envelhecidas perdem esta particularidade
e convertem-se, aparentemente, em bactérias Gram negativas.
É, por isso, importante efectuar o esfregaço a partir de culturas jovens, antes do fim da fase de crescimento
exponencial.

Diferenças químicas da parede celular de bactérias Gram positivo e Gram negativo:

Composição da parede celular Gram positivo Gram negativo

Mucopeptídeo ou Peptidoglicano +++ +
Ácidos teicóicos ++ -
Lípidos:
Fosfolípidos - +
LPS - +
Lipoproteínas - +
Ácidos Lipoteicóicos + -
Proteínas – porinas - +

Objectivos
 Demonstrar a importância da coloração de Gram na classificação das bactérias
 Executar esfregaços e coloração de Gram
 Classificar as bactérias em dois grupos (Gram + e Gram -)
 Permitir ao aluno reconhecer bactérias Gram positivo e Gram negativo

Material e Reagentes
- Corantes: violeta de cristal e vermelho neutro - Lâminas para microscópio
- Mordente: lugol - Microscópio
- Solução descorante: álcool ou acetona - Óleo de imersão
- Soro fisiológico estéril - Contentor com desinfetante
- Ansas para material utilizado

Culturas bacterianas: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus spp.. Bacillus spp., Pseudomonas
fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas corrugata

Procedimento experimental

A - Preparação, secagem e fixação do esfregaço a partir de uma cultura em meio sólido

1. Colocar sobre a lâmina uma gota de soro fisiológico esterilizado;
2. Recolher, com o fio recto previamente esterilizado à chama, uma pequena quantidade de uma colónia e
espalhá-la em camada muito fina;
3. Deixar secar ao ar ou, para ser mais rápido, colocar sobre a chama de um bico de Bunsen ou da lamparina a
uma altura onde, com a mão, se suporta o calor, para se evitar a carbonização do esfregaço;
4. Passar lentamente a lâmina três vezes pela chama para fixação do esfregaço.
5. Deixar arrefecer;
6. Fixar a lâmina numa pinça, ou colocá-la sobre um suporte e aplicar os corantes.

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B - Coloração de Gram
É fundamental que o esfregaço seja completamente coberto com cada reagente e que o produto anterior se remova
totalmente, antes de se adicionar o seguinte.

1.Cobrir o esfregaço com violeta de cristal, e deixar atuar durante 1 minuto;

2. Despejar o excesso do corante e lavar com um pouco de água;
3. Adicionar soluto de lugol (mordente) e deixar actuar durante 30 segundos;
4. Remover o lugol (mordente) e descorar com álcool a 95% ou acetona até que o produto da lavagem seja
transparente;
6. Lavar em seguida com água;
7. Cobrir com o corante de contraste - vermelho neutro - durante l a 2 minutos;
8. Lavar de novo com água;
9.Secar a preparação entre duas folhas de papel de filtro, cuidadosamente;
10. Focar com objectiva seca 4x ou 10x. Focar com a objectiva de 40x. Cobrir o esfregaço corado com óleo de
imersão e observar com objetiva de imersão (l00x).

Registo de Resultados

Desenhar um campo representativo dos esfregaços corados, indicando a forma, agrupamento e cor

__________________________________________ ____________________________________________

___________________________________________ _____________________________________________

Cultura Forma das Agrupamento Cor Coloração Gram

bacteriana/microrganismo células das células observada (Gram + ou Gram -)

Interpretação – As células bacterianas que aparecem coradas de roxo, são Gram positivo; aquelas que tomam a
cor do corante de contraste e apresentam com uma cor avermelhada, são consideradas Gram negativo.

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P7. CINÉTICA DO CRESCIMENTO BACTERIANO EM CULTURAS IN VITRO
QUANTIFICAÇÃO DE MICRORGANISMOS

Curva de crescimento bacteriano em meio de cultura não renovado:

A-Contagem de UFC mL-1 (Contagem do número de células viáveis)
B-Quantificação por Turbidimetria

Introdução
Os estudos em microbiologia obrigam com frequência à determinação do número de microrganismos presentes
num determinado inóculo, para caracterização da população presente numa certa amostra, ou para avaliação do
crescimento do microbiano. O crescimento é estudado pela análise da respectiva curva de crescimento. Quando
os microrganismos são cultivados num meio líquido em sistema fechado as concentrações de nutrientes sofrem
um declínio enquanto aumentam as concentrações dos produtos de degradação.
As células bacterianas dividem-se por fissão binária, após a replicação semi-conservativa do DNA. Em
condições fisiológicas adequada, certas espécies bacterianas crescem muito rapidamente em caldos nutritivos e o
crescimento pode ser representado graficamente como o logaritmo decimal do número de células versus o tempo
de incubação. A curva resultante caracteriza-se por quatro fases distintas: 1-fase de arranque (fase lag); 2-fase
exponencial de crescimento (fase log); 3-fase estacionária; 4-fase de morte celular. (Figura 4).

Figura 4 - Curva de crescimento bacteriano num sistema fechado

Durante a fase de crescimento exponencial cada microrganismo divide-se em intervalos constantes. Assim a
população duplicará num intervalo específico de tempo chamado tempo de geração (g). A taxa de crescimento
num sistema fechado pode ser expressa por meio de uma constante média da taxa de crescimento (K), ou seja o
nº de gerações por unidade de tempo, muitas vezes expresso em gerações por hora.

Objetivos
 Avaliação do crescimento bacteriano pelo método da contagem do número de células viáveis em meio
de cultura sólido, ao longo do tempo de crescimento, após realização de diluições sucessivas.
 Avaliação do crescimento bacteriano pelo método turbidimétrico.
 Elaboração e interpretação de curvas de crescimento bacteriano.

Procedimento experimental

A - Contagem do número de células viáveis por incorporação do meio de cultura

Material, Reagentes e Meio de cultura

- Contentor para material utilizado
- Lamparina
- Marcadores
- Tubos com 4,5 mL de água destilada esterilizada
- Tubos com 15 mL de meio agar triptose fundido
- Placas de Petri vazias esterilizadas
- Pipetas graduadas de 1mL + Micropipetas de 1000 µl e pontas esterilizadas
- Culturas bacterianas a fornecer pelo docente, previamente incubadas durante períodos de tempo
entre 0 e 30 horas.
- Estufas de incubação

14
A1 - Preparação de diluições decimais

Consiste na realização de diluições decimais sucessivas da amostra, em condições de esterilidade, e posterior

sementeira de quantidades conhecidas das mesmas, em caixas de Petri. A diluição tem como objetivo a obtenção
de menor densidade celular por unidade de volume, de forma que, após sementeira, pelo menos algumas células
fiquem isoladas, originando colónias formadas por células iguais entre si. A sementeira pode ser efetuada por
vários métodos, sendo os mais comuns o espalhamento à superfície e a inoculação por incorporação.

1. Identificar 8 tubos com 4,5 ml de água destilada esterilizada, com a diluição décimal a preparar
(10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8) e colocar no suporte para tubos.
2. A partir do tubo inicial (fornecido pela docente), correspondente a um determinado tempo de crescimento
bacteriano (0 h, 1 h, …..ou 30 horas) agitar em vortex e retirar asseticamente com uma pipeta estéril, 0,5 ml da
cultura bacteriana. Transferir para o tubo marcado com a diluição 1/10 (10 -1).
3. Agitar suavemente no vortex e, utilizando uma nova pipeta, retirar 0,5 ml da diluição 1/10 e depositar num
tubo novo com 4,5 ml de água destilada esterilizada (tubo identificado com 10 -2), preparando assim a diluição
1/100 ou 10-2.
4. Fazer diluições sucessivas até à diluição 10-8. Homogeneizar bem cada diluição antes de pipetar a amostra (0,5
ml de suspensão bacteriana) para preparar a diluição seguinte (Figura 5). Ter o cuidado de trocar sempre de
pipeta, para preparação da diluição décimal seguinte.

A2 - Inoculação do meio de cultura

5. Marcar 9 placas de Petri vazias e esterilizadas, identificando a diluição decimal a inocular (100, 10-1, 10-2,10-3,
10-4, 10-5 , 10-6, 10-7, 10-8). Identificar igualmente em cada placa, o Grupo de trabalho, Curso/Turma, espécie
bacteriana, e tempo de incubação (horas) da cultura;
6. Pipetar 1 ml de cada uma das diluições décimais preparadas anteriormente, e depositar na respetiva placa de
Petri vazia, previamente marcada com a diluição;
7. Em cada placa de Petri verter seguidamente, 15 ml de meio de cultura agar triptose estéril fundido e arrefecido
a 45-50ºC (encontra estes tubos já preparados, no Banho-Maria colocado na bancada central do laboratório).
8. Homogeneizar, com movimentos circulares lentos da placa de petri, para distribuir a amostra diluída (100,
10-1, 10-2, 10-3, ….. , 10-6, 10-7 ou 10-8 ) e incorporar o meio de cultura, até ao inicio do endurecimento do agar;
9. Deixar repousar sobre a bancada para solidificação completa;
10. Incubar as placas de Petri na estufa a 37 ou 28 ºC durante 24-48 horas;
11. Observar as placas das diferentes diluições inoculadas. Contar e registar o número de colónias de cada placa;
12. Calcular a concentração da amostra inicial (10 0) em ufc por ml (ufc ml-1). Deve considerar apenas as
contagens da placa em que existam entre 30-300 colónias.
13. Reunir os dados obtidos pelos diferentes grupos na aula e construir a curva de crescimento bacteriano,
utilizando os valores do log (ufc ml-1) e o tempo de incubação em horas.

Figura 5 - Preparação de diluições décimais e inoculação por incorporação do meio de cultura

15
B - Determinação do crescimento pelo método turbidimétrico

Material, Reagentes
-Contentor para material utilizado
- Lamparina
- Marcadores
- Pipetas graduadas de 1 ml estéreis
- Cuvetes para espectrofotómetro
- Espectrofotómetro
- Culturas bacterianas previamente incubadas durante períodos de tempo entre 0-30 horas

Procedimento experimental
1. Calibrar o espectrofotómetro
2. Identificar as cuvetes do espetrofotómetro com os tempos de crescimento bacterianos a analisar.
3.A partir de culturas bacterianas fornecidas anteriormente, agitar no vortex e retirar asseticamente 1 ml da
suspensão bacteriana. Transferir para a cuvete do espectrofotómetro respetiva.
3. Medir a absorvância a 580 nm.
4. Usar o conjunto dos dados obtidos na turma para construir a curva de crescimento bacteriano, utilizando os
valores da densidade otica (580 nm) e o tempo de incubação em horas..

Registo de Resultados 1

A-Contagem do nº de células viáveis por incorporação do meio de cultura

Data:______/_____/____

Grupo/Tempo incubação (horas): ____________

Microrganismo em estudo:___________________

Número de colónias (30-300)

Diluição
100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8

Cálculo da concentração da amostra inicial:

nº colónias na placa x fator de diluição da amostra

Nº colónias por ml (ufc ml-1) =
volume inoculado (ml )

Obs: Para o cálculo da concentração da amostra inicial (ufc ml-1)

deve considerar as placas em que existam entre 30-300 colónias.

ufc- Unidade Formadora de Colónias

16
Reúna os dados dos todos os grupos da aula e registe os resultados no Quadro abaixo.
Calcule a concentração inicial da amostra (log ufc ml-1) para os tempos de incubação estudados

Concentração da amostra inicial

Tempo de incubação Nº Volume Fator de ufc ml-1 Log
(horas) colónias inoculado (ml) diluição (ufc ml-1)
0

Data:______/_____/____

Microrganismo em estudo: ____________________________

Figura 6- Curva de crescimento de ___________________________

Identificar as fases do crescimento bacteriano e discutir os resultados obtidos

17
Registo de Resultados 2
B - Turbidimetria

Tempo de incubação Densidade otica

(horas) (580 nm)
0

Figura 7- Curva de crescimento de _________________________

Identificar as fases do crescimento bacteriano e discutir os resultados obtidos.

18
P8. ACTIVIDADES BIOQUÍMICAS DOS MICRORGANISMOS: Provas do metabolismo respiratório

Introdução
Muitas bactérias durante o seu metabolismo produzem peróxido de hidrogénio (H 2O2) e radicais livres de
oxigénio nocivos para a integridade celular. As bactérias aeróbicas estritas e as anaeróbias facultativas produzem
superóxido dismutase e catalase que levam à destruição daqueles compostos. As bactérias anaeróbicas estritas
como não possuem estas enzimas não sobrevivem em ambientes com oxigénio e têm de crescer exclusivamente
em anaerobiose, isto é, na ausência total de oxigénio.
A detecção da catalase é um teste muito importante pois permite diferenciar rapidamente algumas bactérias por
géneros (ex: Staphylococcus spp. é catalase positiva, e Streptococcus spp. é catalase negativa).
A citocromo oxidase é uma enzima que intervém no transporte de electrões na cadeia respiratória, como
acontece nas bactérias aeróbicas estritas (ex: Neisseria spp., Pseudomonas spp.), até ao aceitador final de O2. É
um teste de grande importância para a identificação bacteriana. A detecção da oxidase (citocromo c oxidase) faz-
se colocando as células bacterianas em contato com uma solução de um indicador de óxido-redução (N,N,N',N'-
Tetramethyl-1,4-phenylenediammonium dichloride). Este indicador é incolor na forma reduzida e ao ser oxidado
pela citocromo oxidase adquire cor azul.
Material, reagentes
- Contentor para material utilizado - Água oxigenada 3%
- Lamparina - Solução de N,N,N',N'-Tetramethyl-1,4-phenylenediammonium
- Luvas dichloride
- Suporte com ansas de inoculação e fio recto - Placa de Petri vazia
- Lamelas - Papel de filtro
- Ansas de plástico estéreis - Culturas bacterianas com 24 horas de crescimento

Procedimento experimental
Teste da catalase
1. Coloque uma gota de água oxigenada a 3% numa lâmina de vidro;
2. Em condições de assepsia, toque com a ansa esterilizada e arrefecida numa colónia e coloque a massa celular
na gota de água oxigenada, homogeneizando;
3. Verifique se há libertação imediata de oxigénio (borbulhar), o que indica a atividade da catalase, e o teste é
positivo (a catalase actua sobre a água oxigenada, libertando água e oxigénio de acordo com a seguinte reação:
H2O2 → 2 H2O + O2. Na ausência de libertação de gás, o teste é negativo (ausência de catalase).

Teste da oxidase
1. Utilizando luvas, coloque uma gota de reagente tetrametil p-fenilenodiamina, sobre um disco de papel de
filtro, previamente colocado numa caixa de Petri vazia;
2. Com uma pipeta de Pasteur com a extremidade fechada ou com uma ansa de plástico esterilizada toque numa
colónia da bactéria a estudar e friccione levemente contra o papel de filtro onde foi depositado o reagente;
3. Observe o resultado da actividade após 2 minutos.
Após a adição do reagente o desenvolvimento da coloração rosa (depois castanha e finalmente negra) na
superfície das colónias é indicativo da produção de citocromo oxidase e representa uma prova positiva (+). Se
não houver mudança de cor ou se as colónias apresentarem uma coloração rosa ligeira é indicativo da ausência
de actividade da oxidase e é uma prova negativa (-).

Registo de resultados

Microrganismo Catalase Oxidase Obs.

19
P9. ACTIVIDADES BIOQUÍMICAS DOS MICRORGANISMOS: Utilização de kits comerciais de
multitestes de provas bioquímicas.

Introdução
Os microrganismos efetuam as suas diferentes actividades bioquímicas utilizando nutrientes obtidos a partir do
ambiente que os rodeia. Essas reações bioquímicas são catalisadas por enzimas. No laboratório, é possível
demonstrar algumas das actividades bioquímicas através da observação da capacidade dos microrganismos
usarem enzimas para degradar hidratos de carbono, lípidos, proteínas e aminoácidos. Geralmente, a
metabolização destas moléculas orgânicas origina produtos finais cuja deteção pode ajudar na caracterização e
na identificação dos microrganismos.
Para se proceder à realização de provas laboratoriais baseadas em diferenças nas actividades bioquímicas dos
microrganismos podem ser usados sistemas miniaturizados de multitestes (“kits comerciais de provas
bioquímicas) que permitem identificar a espécie em causa. São usadas microtécnicas que incorporam um
conjunto de meios numa única unidade. Um destes sistemas disponíveis comercialmente é o Sistema API
(Analytical Profile Index).
O sistema API 20 (20 reações) é uma versão em miniatura dos testes bioquímicos convencionais. Existem vários
tipos de galerias, dependendo das cataterísticas do microrganismo a identificar: bactérias Gram positivo (ex.
Staphylococcus, Streptococcus), Gram negativo (ex. Enterobacteriaceae, Neisseria, Pseudomonas), anaeróbios e
também para leveduras.
Os diferentes meios de cultura estão introduzidos em diversas cúpulas da galeria plástica, no estado desidratado.
É preparada uma suspensão bacteriana que vai ser distribuída em cada poço da galeria. As galerias ficam a
incubar em estufa a 37 ºC ou 28 ºC durante 24 horas. Vai ocorrer a metabolização dos substratos que se tornam
evidentes por reacções colorimétricas ou por turvação. As leituras são feitas manualmente ou automaticamente,
obtendo-se um perfil numérico que permite identificar o microrganismo.

Objectivos
 Conhecer princípios e procedimentos de diversas provas bioquímicas usadas na identificação de
microrganismos
 Utilizar o Sistema API (Analytical Profile Index) para identificação de bactérias, analisando e
interpretando as provas bioquímicas realizadas

Material, reagentes e culturas bacterianas

- Contentor para material utilizado
- Lamparina
- Ansas
- Pipetas (API System)
- Culturas bacterianas a identificar (crescimento de 24 horas)
- Galerias API (20E, API 20NE, API Staph, API Strep)
- Reagentes de identificação
- Catálogo de identificação

Procedimento experimental e leitura de resultados

Seguir os procedimentos indicados nos folhetos fornecidos com Galeria API a utilizar.

Registo de resultados:

20
P10. CONTROLO DOS MICRORGANISMOS POR AGENTES QUÍMICOS. Estudo da susceptibilidade
bacteriana aos antibióticos

Introdução
Os antibióticos são utilizados na terapêutica de numerosas doenças infecciosas, daí serem também designados
por agentes quimioterapêuticos antimicrobianos. O espectro de acção antimicrobiano dos antibióticos é o seu
grau de eficácia antimicrobiana. Os antibióticos de largo espectro são ativos contra um grande número de
bactérias Gram (+) e Gram (-). Os de baixo espetro são ativos unicamente contra certas bactérias Gram (+) ou
Gram (-).
Define-se como antibacteriano o grupo de substâncias de origem bacteriana, fúngica, semi-sintética ou
sintética, que têm em comum a propriedade de provocar a morte bacteriana (bactericidas) ou inibir a sua
multiplicação (bacteriostático).
Os antibióticos bactericidas podem inibir a síntese proteica dos microrganismos ou podem destruir a membrana
citoplasmática provocando lesões profundas e irreversíveis nas células bacterianas (Figura 8).

Figura 8 - Modo de ação de diferentes antibióticos

Os antibióticos bacteriostáticos induzem bloqueios reversíveis da síntese proteica dos microrganismos. Este
fenómeno impede a multiplicação normal das bactérias no organismo e este depois encarrega-se de eliminar as
bactérias por intermédio de mecanismos imunológicos. As bactérias que sofrem uma destas acções dizem-se
sensíveis, aquelas que não são afetadas pela acção do antimicrobiano dizem-se resistentes. Por vezes a acção
antimicrobiana é parcial e depois de uma diminuição precoce do número de bactérias observa-se crescimento
bacteriano. Este fenómeno pode ser devido à instabilidade do antibiótico in vitro, à heterogeneidade da
população bacteriana, que pode comportar um número de bactérias genotipicamente mais resistentes que a
maioria da população, ou à indução da produção de enzimas que conferem resistência ao antibiótico.
A acção de um antimicrobiano sobre uma estirpe bacteriana pode ser caracterizada por dois parâmetros:
• CMI (Concentração Mínima Inibitória) – A mais baixa concentração de antibiótico que inibe a
multiplicação das bactérias (bacteriostase), em 18-24 horas. A CMI exprime-se em μg ml-1.

• CMB (Concentração Mínima Bactericida) – A mais baixa concentração de antibiótico capaz de matar,
após 18 horas de contacto a 37ºC, uma população bacteriana. A CMB exprime-se em μg ml-1.
Métodos de determinação da susceptibilidade bacteriana aos antibióticos – o antibiograma
O estudo do comportamento de uma bactéria face aos antibióticos, avaliado pelo crescimento de uma população
bacteriana na presença de gradientes de concentração diferentes, permite determinar a sua sensibilidade ou
resistência a esses antibióticos. Este teste designa-se por antibiograma. Para realizar um antibiograma podem
usar-se os seguintes métodos:

1) Métodos de diluição (em meio de cultura líquido ou sólido) – São métodos quantitativos, considerados de
referência, para determinar a sensibilidade das bactérias aos antibióticos. Baseiam-se na utilização de diluições
progressivas do antimicrobiano que é adicionado ao meio de cultura onde se irá inocular a bactéria a estudar.
Podem realizar-se em meio líquido ou sólido. Estes métodos permitem determinar a CMI e a CMB.

2) Métodos de difusão (em meio sólido) - O método de difusão em agar é uma prova qualitativa adequada para
estudar a sensibilidade das bactérias de crescimento rápido. Não é adequada para as bactérias de crescimento
lento e bactérias anaeróbias nem para os antibióticos que difundem com dificuldade no agar. É uma técnica
sensível e flexível no que diz respeito às substâncias que podem ser estudadas e permite classificar o
microrganismo em sensível, intermédio ou resistente a determinado conjunto de antibióticos.
Nesta técnica, discos de papel impregnados com uma quantidade definida de antibiótico são dispostos à
superfície de um meio gelosado de Mueller-Hinton previamente semeado com uma suspensão bacteriana em fase

21
exponencial de crescimento (Figura ). A partir do disco, o antibiótico difunde na gelose. Após 18 h de incubação
a 37ºC, verifica-se se existe inibição do crescimento bacteriano à volta dos discos. A sensibilidade ou a
resistência de cada estirpe bacteriana é função do diâmetro do halo de inibição do crescimento (zonas onde não
há crescimento bacteriano), à volta dos discos de antibióticos.

Figura G - Representação esquemática da determinação da susceptibilidade bacteriana aos antibióticos

pelo método dos discos.

Hoje em dia, o método dos discos é o mais utilizado e o mais rigoroso se forem respeitados três parâmetros:

i) Meio de cultura

Deve ter de espessura 4 mm e 9 cm de diâmetro. O pH deve estar entre 7,2 e 7,4. O meio de cultura a utilizar é o
meio sólido de Mueller-Hinton que apresenta as seguintes vantagens:
• Não apresenta incompatibilidades com os principais agentes antibacterianos.
• Não está sujeito a grandes variações de pH.
• É aproximadamente isotónico com o sangue, podendo ser adicionado de 5% de sangue para bactérias
mais exigentes.

ii) Densidade do inóculo

O inoculo tem de ser estandardizado pois uma má estandardização deste leva a uma grande variabilidade dos
diâmetros das zonas de inibição.
O inoculo é estandardizado com base na escala de McFarland. A escala de McFarland mede o grau de turvação
da suspensão bacteriana por comparação com uma solução de cloreto de bário. Para o antibiograma de
Enterobactérias deve usar-se um inóculo com 0,5 unidades McFarland. Para o antibiograma de Estafilococos
deve usar-se um inóculo com 1,0 unidades McFarland.
Se a concentração do inóculo for elevada a sementeira é muito densa e pode ocorrer má difusão do antibiótico na
gelose. Se a concentração do inóculo for baixa o antibiótico difunde-se sem restrições aparecendo uma zona de
actuação que é demasiado grande. Se a concentração do inóculo for ideal a difusão do antibiótico é correcta e o
disco fica envolvido por uma zona de inibição bem definida.

iii) Concentração de antibiótico

A concentração de antibiótico deve ser sempre a mesma para que possam ser usadas as tabelas de resultados. A
conservação dos discos de antibiótico deve ser feita no frigorífico e o seu controlo de qualidade deve ser
realizado com estirpes padrão de E. coli, S. aureus e P. aeruginosa.

Objectivos
 Conhecer os princípios dos vários métodos de executar testes de sensibilidade aos antimicrobianos
(TSA);
 Executar um antibiograma utilizando a técnica de Kirby-Bauer e estudar o efeito de vários antibióticos
sobre espécies bacterianas seleccionadas;
 Analisar e interpretar os resultados TSA (método de difusão em agar);
 Saber como se determina a concentração mínima inibitória (CMI) de um antibiótico;
 Compreender a importância dos testes de sensibilidade aos antimicrobianos em microbiologia.

22
Material, Meios de Cultura e Antibióticos

- Zaragatoas esterilizadas
- Solução fisiológica estéril
- Lamparina e álcool
- Suporte com ansas
- Marcadores
- Placas de agar Mueller-Hinton
- Escala de Mac Farland
- Contentor para material utilizado

Culturas bacterianas

- Escherichia coli
- Pseudomonas aeruginosa
- Staphylococcus aureus
- Bacillus sp.

Antibióticos
- -
- -
- -
- -
- -
- -
- -

Procedimento experimental

Execução de antibiograma segundo a técnica de Kirby-Bauer

1. Preparação do inóculo
A partir de culturas em fase exponencial de crescimento, preparar suspensões em solução fisiológica estéril e
ajustar a concentração de acordo com a Escala de McFarland:
Escherichia coli (5 colónias- 0,5 U McFarland)
Pseudomonas aeruginosa (10 colónias- 1 U McFarland)
Staphylococcus aureus (10 colónias-1 U McFarland)

2. Inoculação das placas

Com uma zaragatoa previamente mergulhada na suspensão bacteriana preparada, inocular/semear por estrias as
as placas de agar Mueller-Hinton em duas direcções ou mais, passando no final a zaragatoa a toda a volta da
placa. Deixa-se secar durante 5 a 10 minutos; Obs. Quando se inocula o meio de cultura, este não deve apresentar gotas
de água à superfície do meio nem na tampa, para o que estas são postas a secar na estufa a 35-37 ºC, geralmente 15 a 30
minutos.

3. Aplicação dos discos de antibióticos

Os discos devem ser conservados no frigorífico em embalagens bem fechadas. Estas devem ser retiradas do
frigorífico e aguardar à temperatura ambiente 1 a 2 horas, de tal modo que quando for necessário abrir as
embalagens, os discos já tenham atingido a temperatura ambiente.
Colocar em cada placa um máximo de sete discos de diferentes antibióticos, utilizando uma pinça flamejada na
chama, ou utilizando um aplicador mecânico. Pressionar ligeiramente os discos colocados à superfície do meio
para assegurar bom contacto. Incubar as placas a 37ºC durante 16-18 horas, de acordo com a bactéria em estudo.

4. Leitura dos resultados

Após 16 - 18 horas de incubação à temperatura indicada, medem-se os diâmetros das zonas de inibição de
crescimento (diâmetro do halo de inibição), utilizando uma régua. Deve observar-se a placa fechada invertida
debaixo de luz reflectida sob um fundo negro. Nos bacilos Gram-negativo pertencentes ao género Proteus, com
crescimento invasor (em “swarming”), mede-se também até ao bordo do crescimento mais denso, ignorando-se o
de menor intensidade.

23
De acordo com o diâmetro do halo de inibição de crescimento observado, a bactérias é classificada como
Sensível, Intermédia ou Resistente, de acordo com valores de tabelas publicadas por laboratórios
internacionalmente reconhecidos.

Registo de resultados

Anote o diâmetro dos halos de inibição obtidos para a(s) bactéria(s) estudada(s) e o resultado final

(Sensível – S; Intermédio – I; Resistente – R)*

Data: ____/____/____

Amostra:____________

Diâmetro do
Antibiótico halo de inibição Sensível* Intermédio* Resistente* Obs.
(mm)

*Por comparação com valores de tabelas de Laboratórios Internacionais

Amostra:____________

Diâmetro do
Antibiótico halo de inibição Sensível* Intermédio* Resistente* Obs.
(mm)

24
Elabore gráficos de barras para os microrganismos estudados/antibióticos avaliados.
Elabore a legenda das figuras efetuadas.

Figura 9-

Figura 10-

25
P11. BACTERIÓFAGOS COMO INDICADORES DE POLUIÇÃO FECAL: Pesquisa de colifagos em
efluentes de uma estação de tratamento secundário

Introdução:
Os bacteriófagos podem ser isolados a partir de muitos ambientes diferentes. Será de esperar encontrá-los em
grandes quantidades sempre que se estiver na presença de uma densa população bacteriana, como por exemplo
na água de esgoto.
Quando a amostra é incubada com a população bacteriana respectiva, os fagos específicos para aquela bactéria
vão multiplicar-se em larga escala, sendo mais fáceis de isolar.
Para o isolamento dos fagos, as amostras com bactérias são filtradas em membranas que serve para remover os
resíduos de células e as bactérias sobreviventes. Os fagos do filtrado podem ser isolados misturando uma
pequena quantidade de filtrado com uma cultura em fase exponencial de crescimento da bactéria hospedeira. A
mistura é então inoculada na superfície de uma placa de Petri contendo meio nutritivo. A esta técnica chama-se
cultura em dupla camada.
Na prática, os vírus e as bactérias são misturados numa gelose liquefeita que será colocada sobre a superfície do
agar base (meio TSA). Quando o agar da camada de cima solidifica, os vírus e as bactérias ficam imobilizados.
O fago, pelo facto de estar embebido na gelose e ter a sua mobilidade severamente restrita, infecta somente as
bactérias que lhe estão adjacentes. O fago vai reproduzir-se e, eventualmente, lisar a célula hospedeira. A
partícula viral irá dar origem a milhões de novos viriões, aparecendo então uma zona clara de bactérias lisadas
que se irá desenvolver na camada bacteriana. Esta zona clara, observada a olho nu, é denominada de
placa fágica (Figura 11).
Uma vez que cada placa provém de uma única partícula fágica, a contagem do número de placas irá permitir
calcular a concentração do fago na amostra original (título fágico). Uma vez que a eficiência do plaqueamento
raramente é próxima dos 100%, quando se utiliza o método das placas para quantificar os virus é mais correcto
exprimir o título fágico não como números absolutos de viriões mas como números de unidades formadoras de
placas (UFP).

Objectivo
 Ensaiar a técnica de pesquisa de bacteriófagos de bactérias aeróbias ou anaeróbias facultativas, neste
caso fagos de Escherichia coli.

Material, reagentes e meios de cultura

- Frasco de colheita de 500 ml
- Frasco de transporte de 500 ml (tampa de rosca)
- Contentor para material utilizado
- Lamparina e álcool
- Suporte com ansas
- Marcadores
- Tubos com 4,5 ml de TSB esterilizado
- Tubos com 2,5 ml de TSA esterilizado (mantidos a 45ºC)
-Tubo de 18-20 cm estéril (recolha do filtrado)
-Tubos de 8-10 cm vazios estéreis
- Pipetas de 1 ml e 10 ml
- Membrana de porosidade 0,2 μm
- Funil de filtração
- Kitasato
- Espectrofotómetro
- Vortex
- Banho de água a 45ºC
- Placas com TSA mole (Agar de Soja Tripticaseina mole)
- TSB (Caldo de Soja Tripticaseina)

Cultura bacteriana:
Escherichia coli em Meio TSB

Procedimento experimental

A – Colheita de amostras
Retirar com um frasco de colheita uma amostra de água a 0,3 m da superfície. Passar a amostra, para um frasco
de transporte esterilizado, de 500 ml. Transportar a amostra a 4ºC em mala isotérmica acondicionada com
permutadores térmicos.

26
B – Tratamento das amostras
1. Agitar vigorosamente (30 vezes) a amostra de água.
2. Filtrar 15 ml da amostra através de uma membrana filtrante (membrana com porosidade de 0,2 μm e recolher
o filtrado em tubo estéril. Distribuir 2 ml em tubos esterilizados (2 ml por cada grupo de trabalho).
3. A partir do filtrado preparar uma série de três diluições decimais até 10 -3, em TBS (utilizar sempre pipetas
novas para cada diluição).

C – Pesquisa de Bacteriófagos (Técnica da Dupla Camada de Agar)

1. Ajustar a absorvência da cultura nocturna de E. coli a 108 ufc ml-1 (A540 ~ 0,3).
2. Marcar 4 placas de petri com TSA, indicando a diluição a semear, data, turma, e grupo de trabalho.
Uma placa de petri com TSA adicional não é inoculada, funcionando como controle da esterilidade.
3. Marcar 4 tubos de TSA-mole com a diluição a inocular.
4. Inocular os tubos com TSA-mole com 0,3 ml da suspensão de E. coli 108 ufc ml-1 e 1 ml da amostra filtrada
(amostra não diluída, amostras diluída 1/10; amostra diluída 1/100 e amostra diluída 1/1000
5. Misturar rapidamente o conteúdo de cada tubo e derramar, um por um, na respectiva placa de Petri com meio
TSA já identificadas.
6. Agitar suavemente as caixas de Petri e deixar repousar até o meio solidificar.
7. Incubar as 4 placas (3 inoculadas e 1 controle) a 37 ºC durante 18-24 horas.

Registo de resultados

Data: ____/____/____

Observar e contar as placas fágicas desenvolvidas. Calcular o número de placas fágicas por unidade de volume
(ml) da amostra inicial, tomando em conta as diluições efetuadas e os volumes utilizados.
Os resultados são interpretados em função dos resultados dos vários grupos de trabalho e da análise crítica do
rigor da técnica tal como foi praticada por cada grupo.

As placas fágicas correspondem às superfícies clareadas no tapete das células bacterianas (Fig. H)

Figura 11 - Amostra contendo placas fágicas.

27