Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre

Identificação do pH ótimo da
invertase

Lídia Luz, Matheus Braga e Roberto Bugs

Porto Alegre, setembro de 2017

Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre

Identificação do pH ótimo da
invertase

Este relatório de aula prática é referente a

disciplina de Bioquímica I do curso de
Biomedicina Noturno.

Professora Regente: Prof.ª Dr.ª Alethéa Gatto Barschak

Biomedicina Noturno 2021

Lídia Luz – Turma A

Matheus Braga – Turma A

Roberto Bugs – Turma A

Porto Alegre, setembro de 2017.

 Introdução

As enzimas são proteínas especiais com função catalítica de

acelerar reações bioquímicas que ocorrem na célula, possuindo
especificidades, funcionam em soluções aquosas e temperatura e pH
fisiológicos (variando conforme a enzima), não sendo consumindas durante
a reação bioquímica e podendo ser reguladas por moduladores
(disponibilidade de substrato, enzimas alostéricas, modificação covalente,
clivagem proteolítica e controle gênico). As enzimas podem ser
classificadas em 6 tipos: oxirredutase, transferases, hidrolases, liases,
isomerases e ligases.

A catálise enzimática das reações é essencial para os sistemas

vivos, pois reações não catalisadas tendem à serem lentas. As reações
como digestão de alimentos, a neurotransmissão e contração muscular
ocorreriam muito lentamente sem a ação catalítica das enzimas. O
mecanismo utilizado pelas enzimas baseia-se na diminuição da energia de
ativação necessária para que ocorra uma reação.

Bioquímica ilustrada. Champ.P.C et. al. 3ªed.Artmed.2007.

3
 Existem fatores capazes de aumentar a capacidade catalítica,
como a concentração do substrato, concentração da enzima, temperatura
e pH. As enzimas são comumente utilizadas na clínica biomédica para
prognóstico e diagnóstico. Em situações como a ausência ou insuficiência
de uma determinada das mesmas, como por exemplo, no caso da
intolerância à lactose, em que há a administração da própria enzima
Lactase.

A variação de pH em um meio contendo enzimas pode levar à

modificação estrutural e iônicas destas moléculas, usualmente conhecidas
por sua atividade catalítica. Durante este experimento, iremos abordar o
fenômeno do pH ótimo da enzima Invertase, utilizada durante a aula
prática. O pH ótimo corresponde a melhor faixa de pH de atividade da
enzima atua. Para a maior parte das enzimas essa faixa se situa entre o
pH 4 e 8, porém para a invertase o pH ótimo fica em torne 4,5 e 5,5.

Materiais e Métodos
Materiais

Suspensão de invertase 0,5 g/dL;

Tampão ácido cítrico-citrato de sódio 0,1M pH 3,0;

Tampão ácido cítrico-citrato de sódio 0,1M pH 3,8;

Tampão ácido cítrico-citrato de sódio 0,1M pH 4,7;

Tampão ácido cítrico-citrato de sódio 0,1M pH 5,4;

Tampão ácido cítrico-citrato de sódio 0,1M pH 6,2;

Tampão ácido cítrico-citrato de sódio 0,1M pH 8,0;

Solução de sacarose 0,05 M;

Reativo do ácido 3,5-dinitrosalicílico (RA-3,5-DNS).

4
 Métodos

1. Identificar 7 tubos de ensaio da seguinte maneira: B, 1, 2, 3, 4,

5 e 6;

2. Distribuir os reagentes conforme indicado no quadro abaixo:

Branco Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6

Tampão pH 3,00 - 0,8 mL - - - - -
Tampão pH 3,80 - - 0,8 mL - - - -
Tampão pH 4,70 - - - 0,8 mL - - -
Tampão pH 5,40 - - - - 0,8 mL - -
Tampão pH 6,20 - - - - - 0,8 mL -
Tampão pH 8,00 - - - - - - 0,8 mL
Invertase - 0,2 mL 0,2 mL 0,2 mL 0,2 mL 0,2 mL 0,2 mL
Água Destilada 1,0 mL - - - - - -
RA-3,5-DNS 1,0 mL - 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL
Sacarose 1,0 mL 1,0 mL

3. Agitar todos os tubos e incubar durante 5 minutos à

temperatura ambiente;

4. Interromper a reação por adição de 1 mL do RA-3,5-DNS em

cada um dos tubos, exceto no B;

5. Colocar todos os tubos em banho-maria fervente por

exatamente 5 minutos;

6. Esfriar os tubos em água corrente e acrescentar 7,5 mL de

água destilada em cada tubo;

7. Misturar por inversão e ler em 540 nm (filtro verde) contra o

tubo B;

8. Caso alguma leitura ultrapasse a DO de 1,0, diluir todos os

tubos por adição de 1 mL de água destilada e ler novamente (foi utilizado
um total de 3 mL adicional de água destilada para a diluição).

5
 Resultados e Discussão

Resultados
Os valores de DO podem ser observados na tabela abaixo:

Tubo Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6

DO 0,173 0,437 0,822 0,999 0,932 0,443
pH 3,00 3,80 4,70 5,40 6,20 8,00

Com os resultados foi possível montra um gráfico mostrando a

atividade enzimática da invertase no pH em que ela se encontrava.

Discussão
De acordo com a literatura, o pH da enzima invertase fica em torno
de 4,5 e 5,5. Após a realização do experimento, concluímos que o pH ótimo
da enzima na literatura corresponde ao que foi observado no experimento
prático.

6
 Questionário

1. Explique a forma de sino apresentada pela curva de atividade

enzimática versus pH.

O pH é um dos principais fatores que influenciam na atividade da

enzima devido às variações no estado de ionização dos componentes da
enzima. Todas as enzimas Michaelianas apresentam curva em formato de
sino pois as cadeias laterais dos aminoácidos podem exercer um papel
essencial nas interações que mantém a estrutura proteica, quando o pH
está muito extremo, essas cadeias laterais tornam-se ionizadas e isso
prejudica a estrutura da enzima, comprometendo a sua função. Já quando
o pH está em uma faixa mais neutra (varia de enzima para enzima), o
chamado pH ótimo, a sua atividade catalítica é maximizada pela ótima
conformação das cadeias laterais.

2. O que significa pH ótimo para uma enzima? Todas as enzimas agem

no mesmo pH?

É o pH em que a enzima consegue atingir o pico de sua atividade.

Nem todas as enzimas atuam no mesmo pH. Porém a maioria das enzimas
possuem o seu ponto de pH ótimo entre 4 e 8.

3. Considerando que o centro ativo de uma determinada enzima é

constituído por dois radicais de lisina e um de ácido aspártico e que
o substrato desta enzima, no pH ótimo, apresenta uma carga positiva
e duas cargas negativas identifique a faixa de pH onde deve estar o
pH ótimo, sabendo que o pK do radical do ácido aspártico é de 3,86 e
o da lisina é de 10,53. Justifique a sua resposta.

Abaixo do pH de 3,86 a enzima possuí um grupamento COOH e

NH3+ e no pH acima de 10,53 a enzima apresenta um grupamento COO-
e NH2. O pI da enzima com dois radicais lisina e um radical de ácido
aspártico fica em torno de 7,2.

7
 Conclusão

Os experimentos realizados nessa aula esclareceram a influência

do o pH sobre a atividade das enzimas, foi possível verificar a baixa taxa
de atividade em pH muito ácido e muito básico e compreender o conceito
de pH ótimo da enzima Invertase e de outras enzimas Michaelianas.

Referências Bibliográficas

LEHNINGER, N. Princípios de Bioquímica. 6. Ed. Porto Alegre: Editora

Artmed, 2014.

HARVEY, R.A.; FERRIER, D. R. Bioquímica ilustrada. 5a ed. Porto Alegre:

ARTMED, 2012.

MARZZOCO, A.; TORRES, B.B. Bioquímica Básica – 3a Ed. Rio de

Janeiro: Guanabara Koogan, 2007.