ESPECTROFOTOMETRÍA

Miguel Ángel Calderón-Moreno

calderon.miguel@correounivalle.edu.co
Universidad del Valle, Departamento de Biología
Laboratorio de Biología Celular y Bioquímica I
4 de abril de 2018.

Resumen
La espectrofotometría es un método sencillo para la identificación de soluciones y sus concentraciones. Se
fundamenta en la interacción de la luz con la materia, y la cantidad de luz que es capaz de atravesar soluciones,
describiendo aspectos como la transmitancia o la absorbancia. Usando la ley de Beer-Lambert es posible calcular
la concentración de una solución a partir de la absorbancia obtenida mediante el espectrofotómetro. Con el fin de
aplicar los conceptos referentes a la espectrofotometría y evidenciar la relación entre absorbancia y concentración
descrita por la ley de Beer-Lambert, se determinaron los espectros de absorción de 4 soluciones distintas (rojo
congo, BTB pH 7.5, BTB pH ácido y mezcla), variando las longitudes de onda cada 30 nm en un rango de 400 a
700 nm. Además, se aplicó la ley de Beer-Lambert para la determinación de la concentración de 3 soluciones a
partir de la línea de mejor ajuste para cada solución, comprobando la relación entre absorbancia y concentración.
La mezcla presentó los valores más altos de absorbancia, registrando el máximo pico de absorción a 520 nm. El
rojo congo y el BTB pH ácido registraron sus picos de máxima absorción en la misma longitud de onda, 430 nm.
Para la solución de rojo congo se registró un pico de máxima absorción a una longitud de onda de 610 nm. Se
concluyó que los espectros de absorción permiten identificar disoluciones, así como su concentración y pH.
Además, estos factores influyen notablemente en la absorbancia de una solución.
Palabras clave: Colorimetría, rojo congo, azul de bromotimol, luz, colorante.
Abstract: Spectrophotometry is a simple method for identifying solutions and their concentrations. It is based on the interaction
of light with matter, and the amount of light that is capable of crossing solutions, describing aspects such as transmittance or
absorbance. Using Beer-Lambert's law it is possible to calculate the concentration of a solution from the absorbance obtained
by the spectrophotometer. In order to apply the concepts related to the spectrophotometry and to demonstrate the relationship
between absorbance and concentration described by the Beer-Lambert law, the absorption spectra of 4 different solutions were
determined (Congo red, BTB pH 7.5, BTB acid pH and mix), varying the wavelengths every 30 nm in a range of 400 to 700
nm. In addition, the Beer-Lambert law was applied to determine the concentration of 3 solutions from the line of best fit for
each solution, verifying the relationship between absorbance and concentration. The mixture presented the highest values of
absorbance, registering the maximum absorption peak at 520 nm. The red congo and the BTB acid pH recorded their peaks of
maximum absorption at the same wavelength, 430 nm. For the Congo red solution, a maximum absorption peak was recorded
at a wavelength of 610 nm. Se concluyó que los espectros de absorción permiten identificar disoluciones, así como su
concentración y pH. Además, estos factores influyen notablemente en la absorbancia de una solución.

Key words: Colorimetry, Congo red, bromothymol blue, light, coloring.

INTRODUCCIÓN a que la sustancia absorbe algunas radiaciones

Al observar disoluciones acuosas a trasluz se perciben
colores específicos según el tipo de solución que se
tenga. Si tomamos como ejemplo una solución de Cu2+
la interacción de sus iones con la radiación lumínica
que lo atraviesa mostrará un color azulado. Esto se debe
lumínicas, pero las radiaciones no absorbidas
atraviesan la disolución sin problema llegando a los
ojos del espectador, haciéndole ver en este caso el color
azul (Arenas & López, 2004). De igual forma, la
intensidad del color observado está relacionada
directamente con la concentración de la sustancia
problema, por lo que a una mayor intensidad del color
es posible deducir que existe una mayor concentración
de la solución. Uno de las técnicas más usadas para la
determinación de la concentración de disoluciones es la
colorimetría.
La colorimetría consiste en la medición de los
compuestos de una mezcla haciendo pasar luz a través
de una solución coloreada, haciendo que algunas
longitudes de onda se absorban con preferencia sobre
otras. La alta especificidad y sensibilidad de estas
reacciones permite incluso la medición de
concentraciones de la sustancia a reconocer. La
intensidad del color es proporcional a la concentración
del compuesto que se mide, mientras que la cantidad de
luz absorbida es proporcional a la intensidad del color,
y por lo tanto a su concentración. Uno de los problemas
del colorímetro era la gran amplitud de longitudes de
onda que podían pasar por el filtro, haciendo difícil la
diferenciación de dos sustancias con absorción
parecida (Plummer, 1981). Como solución a este
problema y haciendo uso de los principios de la
colorimetría, el espectrofotómetro hace pasar un haz de
luz a través de un monocromador, que permite la
separación de dos picos de absorción similares (Arenas
& López, 2004).
Cuando el haz de luz atraviesa la sustancia se producen
dos aspectos del mismo fenómeno: la transmitancia y
la absorbancia. La transmitancia es la fracción de la
radiación incidente que transmite la solución, es decir,
la luz que pasa sin problema. La transmitancia (T) se
calcula como el cociente de la cantidad de luz que
atraviesa (I), sobre la cantidad de luz incidente inicial
(I0), y el resultado suele expresarse como porcentaje:
𝐼 un espectrofotómetro, se midió el espectro de absorción
𝑇=
𝐼0
Por su parte la absorbancia (A) es la frecuencia de onda
que es absorbida por la sustancia y se calcula como
menos el logaritmo de la transmitancia, así:
𝐴 = −𝑙𝑜𝑔𝑇
La medición de estos dos aspectos se realiza con la
solución del analito contenida en una celda, que se
introduce a su vez en el espectrofotómetro (Skoog et
al., 2015).
La absorbancia de un analito puede ser relacionada
cuantitativamente con la concentración de las
soluciones. La ley de Lambert-Beer relaciona la
intensidad inicial (I0) del rayo de luz monocromática
que atraviesa la solución, con la intensidad de la luz
transmitida (I). Esta relación es dependiente de la
longitud del medio absorbente (l) y la concentración
inicial de la solución absorbente. La ley de Beer-
Lambert se expresa como:
𝐼 = 𝐼0 𝑒 −𝑘3 𝑐𝑙
Al seguir la ley de Lambert-Beer y manteniendo l
constante, al obtener valores y graficar se obtiene una
línea recta (Plummer, 1981).
El amplio uso de esta técnica en química analítica y
bioquímica para la medición de velocidades de
reacción catalizadas por enzimas, la determinación de
soluciones y su concentración, o la determinación de
interacciones estructurales hace de esta una
herramienta útil y necesaria para los estudiantes y su
instrucción como científicos. Los objetivos de esta
práctica fueron determinar el espectro de absorción de
luz visible de algunas sustancias, así como su longitud
de máxima absorción y mediante los datos tomados
comprobar la relación entre absorbancia y
concentración.
METODOLOGÍA
Determinación de los espectros de absorción
Se repartió 1 de 4 soluciones previamente preparadas
(Tabla 1) a cada grupo de laboratorio, y con ayuda de
de la sustancia asignada. La solución correspondiente a
este grupo fue azul de bromotimol (BTB) en medio
ácido. Las mediciones se realizaron cada 30 nm dentro
de las longitudes del espectro visible (desde 400 hasta
700 nm). Entre cada aumento de longitud de onda se
calibró el espectrofotómetro usando 10 ml de agua
destilada como blanco. Los datos obtenidos fueron
tabulados. Para la construcción de la gráfica en un
sistema de coordenadas (concentración vs.
absorbancia) con los datos de cada solución, se calculó
el promedio para los dos conjuntos de valores
obtenidos por los grupos para las soluciones de rojo
congo y BTB pH 7.5. No se calculó promedio para la
solución de azul de bromotimol en medio ácido por no
disponer a tiempo del conjunto de valores obtenidos
por el otro grupo de laboratorio. Además, para BTB pH
ácido no se registraron absorbancias por encima de 580
nm por presentarse valores atípicos. Una vez ubicados
los puntos en el sistema de coordenadas, se trazó una
línea de tendencia. Para determinar la correlación entre
las variables concentración y absorbancia se calculó el
coeficiente de correlación R2 de Pearson usando el
programa estadístico IBM SPSS Statistics v21.
Comprobación de la ley de Beer-Lambert
Se prepararon 7 tubos con disoluciones a distintas
concentraciones (Tabla 2) y un tubo con 10 mL de agua
destilada como blanco. Los tubos con las disoluciones
se midieron a la longitud de onda de máxima absorción
obtenida en el punto anterior. La calibración con el
blanco se realizó sólo una vez al inicio de las
mediciones, ya que no se varió la longitud de onda.
Para este punto se utilizó azul de bromotimol en medio
ácido preparado con las mismas características que el
punto anterior (100 mg/mL, con una gota de ácido
acético al 5%) a concentraciones diferentes. La
concentración final fue calculada según la expresión
V1.M1=V2.M2, donde V1 y V2 corresponden a volumen
inicial y volumen final respectivamente, y M1 y M2
corresponden a concentración inicial y concentración
final de la disolución. Despejando de esta fórmula la
concentración 2 (M2) obtenemos V1.M1/V2=M2, para
determinar la concentración final de la disolución
(Tabla 2). Para efectos de estandarización de unidades
de medida, las concentraciones se calcularon en litros
(L).
Solución problema
A cada grupo de laboratorio se le asignó un tubo de
ensayo con colorante de concentración desconocida.
Con el espectrofotómetro se evaluó su absorbancia con
la longitud de onda de máxima absorción reportada
para el colorante. Para conocer la concentración, utilizó
la ecuación de la recta y=mx+b, donde y es la
absorbancia, m la pendiente de la recta, b el intercepto
y x la concentración.
RESULTADOS

La medición de los espectros de absorción de 4 para BTB pH 7.5 a las absorbancias

disoluciones (Rojo congo, BTB medio ácido, BTB correspondientes (Tabla 6).
pH 7.5 y mezcla) para la determinación de los picos
de absorción de estas sustancias. Se encontraron
valores de máxima absorbancia: 0,693 a 520 nm para [C]
la mezcla, 0,324 a 430 nm para rojo congo, 0,157 a mg/L Absorbancia (U.A)
430 nm para BTB pH ácido y 0,592 a 610 nm para Rojo BTB pH BTB pH
BTB pH 7.5 (Tabla 3). congo ácido 7,5
2.5 0,124 0,114 0,125
Absorbancia (U.A) 5 0,225 0,197 0,302
λ Rojo BTB pH BTB pH 10 0,439 0,157 0,471
Mezcla congo ácido 7.5 15 0,626 0,506 0,886
400 0,485 0,285 0,119 0,206 20 0,821 0,631 1,150
430 0,486 0,324 0,157 0,157 30 1,203 1,128 1,666
460 0,535 0,292 0,139 0,116 40 1,630 1,461 2,131
490 0,633 0,264 0,073 0,119 Tabla 4. Absorbancia según la concentración de la
520 0,693 0,207 0,027 0,151 disolución. Se observa una tendencia directamente
proporcional.
550 0,678 0,113 0,007 0,270
580 0,583 0,041 0,009 0,426
610 0,646 0,013 - 0,592
Colorante
640 0,471 0,007 - 0,454
Rojo congo BTB pH ácido BTB pH 7.5
670 0,191 0,014 - 0,120
R2 0,999 0,997 0,986
700 0,017 0,004 - 0,008
Tabla 5. Valores de correlación de R2 de Pearson para las
Tabla 3. Absorbancia registrada para los 3 colorantes a
variables concentración y absorbancia.
distintas longitudes de onda. U. A= Unidades arbitrarias.

Las cuatro sustancias evaluadas presentaron picos de

absorción diferentes, y en particular la mezcla Colorante
presentó el pico de máxima absorción y en general Rojo BTB pH BTB pH
los valores de absorbancia más altos. congo ácido 7.5
La medición de la absorbancia de las disoluciones de A (U.A) 0,8325 0,513 0,992
distintas concentraciones en su pico de máxima [C] (mg/L) 20.2 14 18.1
absorción (Tabla 4) permitió ubicar los puntos en un Tabla 6. Determinación de las concentraciones de las
sistema de coordenadas y trazar la línea de tendencia disoluciones a partir de la absorbancia obtenida.
(Anexo 1). Las gráficas concentración ([C]) vs.
absorbancia mostró una pendiente mayor para el
BTB pH 7.5 (m=0,0542) en comparación con el rojo DISCUSIÓN
congo (m=0,0398) o BTB pH ácido (m=0,0377).
La prueba de correlación R de Pearson arrojó valores La variación del comportamiento de los picos de
muy cercanos a 1 (Tabla 5), indicando una fuerte máxima absorción de una solución a otra obedece a
relación lineal entre las variables. que los espectros de absorción son característicos
Una vez comprobado que existe una relación lineal para soluciones particulares, lo que permite su
entre las variables y extrapolando los datos al eje x identificación. Factores como concentración, pH y
se obtuvieron concentraciones de 20.2 mg/L para el color de la disolución están relacionados con el
rojo congo, 14 mg/L para BTB pH ácido y 18.1 mg/L espectro de absorción de la misma (Skoog, AÑO).
Para el caso del BTB, al ser un indicador ácido-base,
su color varía según el pH al que se encuentra,
presentando color azul en medio alcalino, y amarillo
en medio ácido. Los colores observados
corresponden al color complementario de las
longitudes de onda absorbidas por la solución. En
medio ácido, la solución de BTB absorbe longitudes
de onda azul, dejando pasar el color complementario,
el amarillo. A pH alcalino, ocurre el proceso
análogo, absorbiendo la longitud de onda amarilla y
dejando pasar el azul (LD Didactic Group, 2015).
Además de influir en el color, a medida que el pH de
la solución de BTB aumenta, el pico de máxima
absorción es más pronunciado (Klotz et al, 2011).
Esto concuerda con los resultados obtenidos en el
laboratorio, al observar que para el BTB pH ácido se
registró una máxima absorbancia de 0,157 a 430 nm,
mientras que para el BTB a pH 7,5 la absorbancia
máxima registrada fue de 0,592 a 610 nm. A medida
que el pH del BTB aumenta, la absorbancia puede
alcanzar valores superiores a 2,5 (Truppo & Turner,
2010).
Para la disolución de rojo congo se obtuvo un pico
de máxima absorbancia de 0,324 a 430 nm. Esto
contrasta con los resultados obtenidos por Ahsan et
al (2015), en los que para el rojo congo se registró un
espectro de máxima absorción entre los 490 y 540
nm. A pesar de no ser una diferencia abrupta, esta
puede deberse a diferencias en las concentraciones
utilizadas en el laboratorio.
La mezcla de rojo congo con BTB pH 7,5 presentó
absorbancias mayores en términos generales es
consecuencia de que no haya habido cambio en las
propiedades físico-químicas de las sustancias, por lo
que la absorbancia de las sustancias individuales no
fue alterada. Siendo así, la absorbancia de la mezcla
resultó ser la suma de las absorbancias de cada
componente (Harris, 2010).
En la segunda parte de la práctica, el aumento de la
absorbancia en respuesta al aumento de la
concentración obedece a la Ley de Beer-Lambert. La
atenuación o absorbancia depende de la
concentración de las moléculas absorbentes y de la
longitud de la trayectoria donde ocurre la absorción.
A medida que la luz atraviesa un medio que contiene
un analito absorbente, la intensidad de esta
disminuye al excitarse las moléculas del analito
(Skoog, 1997). Como consecuencia de esto, a mayor
concentración de la solución mayor atenuación de la
luz que atraviesa el analito, lo que se traduce en una
mayor absorbancia registrada.
Al seguir la Ley de Beer-Lambert, el gráfico de la
absorbancia en función de la concentración es una
línea recta, descrita por la escala logarítmica de la
absorbancia. A partir de esa recta es posible la
determinación de la concentración de una muestra
problema conociendo la absorbancia (Plummer,
1981).
CONCLUSIONES
Mediante el análisis de los espectros de absorción de
una muestra es posible determinar la identidad de la
misma, así como su concentración o pH al que se
encuentra. A su vez, factores como concentración y
pH producen variaciones significativas en los
espectros de absorción de una misma muestra.
La relación lineal descrita entre la concentración de
una solución y su absorbancia hace posible la
determinación de concentraciones desconocidas a
partir de una absorbancia determinada.
A longitudes de onda cada vez más cercanas (o
superiores) a 700 nm es común no registrar
absorbancia debido a que se sale del espectro de onda
visible.
BIBLIOGRAFÍA
- Arenas, I., López, J., (2004)
Espectrofotometría de absorción. Métodos
de Laboratorio. Universidad Nacional
Autónoma de México.
- Mu, P., & Plummer, D. T. (1988).
Introduction to practical biochemistry. Tata
McGraw-Hill Education.
- Harris DC (2007). Análisis químico
cuantitativo. Reverté, España.
- Skoog, D. A., West, D. M., & Holler, F. J.
(1997). Fundamentos de química analítica
(Vol. 2). Reverté.