Вы находитесь на странице: 1из 146

Государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования "Северо-Западный


государственный медицинский университет имени И. И. Мечникова"
Министерства здравоохранения Российской Федерации

На правах рукописи

РАУШ
Екатерина Рудольфовна

ОСОБЕННОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ВНУТРИБОЛЬНИЧНОГО


ИНВАЗИВНОГО КАНДИДОЗА

03.02.12 – микология

ДИССЕРТАЦИЯ
на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук

Научный руководитель
доктор биологических наук, профессор
Васильева Наталья Всеволодовна

Санкт-Петербург – 2015
2

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………..5
ГЛАВА 1 Внутрибольничный инвазивный кандидоз - проблемы современной
лабораторной диагностики (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)………………………...10
1.1 Краткая историческая справка……………………………………………...10
1.2 Грибы рода Candida –возбудители инвазивного кандидоза………….…..14
1.3 Современные подходы к видовой идентификации возбудителей
инвазивного кандидоза……………………………………………………...21
1.4 Чувствительность возбудителей инвазивного кандидоза к
противогрибковым препаратам……………………………………………..31
1.5 Современные методы определения чувствительности Candida spp. к
противогрибковым препаратам………………………………………….….35
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ…………………..43
2.1 Объекты исследования………………………………………………………43
2.2 Подготовка культур Candida spp. ……………………………………….…43
2.3 Идентификация Candida spp. методом ДНК – секвенирования………….44
2.4 Идентификация Candida spp. методом MALDI-TOF масс-
спектрометрии………………………………………………………………..46
2.4.1 Изучение комплекса видов C. parapsilosis………………………….48
2.5 Видовая идентификация возбудителей внутрибольничного инвазивного
кандидоза с помощью тест-системы AUXACOLOR2……………………..49
2.6 Изучение морфологических особенностей возбудителей инвазивного
кандидоз ……………………………………………………………………...49
2.7 Методы определения чувствительности Candida spp. к противогрибковым
препаратам in vitro …………………………...………………………………50
2.7.1 Метод микроразведений в жидкой питательной среде - CLSI M27-
A3……………………………………………………………………….51
2.7.2 Диско-диффузионный метод определения чувствительности - CLSI
M44-А……...…………………………………………………………...54
3

2.7.3 Определение чувствительности с помощью микробиологического


анализатора Vitek 2 Compact…………..……………………………...55
2.8 Статистическая обработка результатов……………………………………55
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 3 Определение видового спектра клинических изолятов Candida
spp…………………………………………………………………………………56
3.1 Источники выделения возбудителей инвазивного
кандидоза……..……………………………………………………………….56
3.2 Сравнение результатов видовой идентификации Candida spp. методами
ДНК-секвенирования и MALDI-TOF масс-спектрометрии ………………57
3.3 Сравнение результатов видовой идентификации штаммов Candida spp.
методами MALDI-TOF масс-спектрометрии и тест-системой
AUXACOLOR 2………………………………………………………………59
3.4 Видовой спектр возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза
в течение 2012-2014 гг……………………………………………………….66
3.5 Географические особенности этиологии инвазивного кандидоза ……….69
3.6 Морфологические особенности возбудителей инвазивного кандидоза....71
3.7 Протеомное профилирование возбудителей инвазивного кандидоза……81
3.8 Молекулярно-генетические особенности возбудителей инвазивного
кандидоза ……………………………………………………………………..83
ГЛАВА 4 Определение чувствительности клинических изолятов Candida spp.
к противогрибковым препаратам…………………………………...…………..89
4.1 Результаты определения чувствительности возбудителей инвазивного
кандидоза методом CLSI M27-A3…………………………………..……..89
4.1.1 МПК противогрибковых препаратов для различных видов Candida
spp…………………………………………………….………………...92
4.2 Результаты определения чувствительности возбудителей инвазивного
кандидоза методом CLSI M44-А……..........................................................99
4.3Результаты определения чувствительности возбудителей инвазивного
кандидоза с помощью анализатора Vitek2 Compact.................................102
4

ГЛАВА 5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………..108
ВЫВОДЫ………………………………………………………………….……119
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ……………………………………….121
ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ…………………………………..…122
СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ………………………………….....123
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………………...124
5

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы
Микромицеты рода Candida из состава нормальной микробиоты тела
человека могут быть возбудителями внутрибольничного инвазивного
кандидоза. Ежегодно в мире выявляют до 200000 пациентов с внутри-
больничным инвазивным кандидозом (ИК), из которых 100000 больных
умирают [115]. Несмотря на то, что основными возбудителями ИК остаются
C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. tropicalis и C. krusei, в последнее
десятилетие отмечают нарастание доли C. не-albicans видов, в том числе
редких [37, 41].
Известно, что лишь у 50 - 75% больных ИК удается выявить Candida
spp. при посевах крови. Даже в случаях, когда удается выделить культуру
Candida, большинство используемых в микробиологической лаборатории
методов видовой идентификации дрожжей обеспечивают получение резуль-
тата только через 2 суток и более. Кроме того, особую проблему составляет
быстрая и надежная идентификация C. не-albicans видов [37]. В последние
годы все чаще сообщают о появлении резистентных штаммов возбудителей
ИК [39]. Однако, существует не только проблема устойчивости Candida spp.
к противогрибковым препаратам, но и проблема выбора метода определения
чувствительности клинически значимых дрожжей к антимикотикам.
Несмотря на перспективность современных методов молекулярной
биологии для точной видовой идентификации и быстрого выявления рези-
стентности грибов к противогрибковым препаратам, использование этих
методов в повседневной диагностической практике ограничено.
Таким образом, быстрое установление этиологии ИК и определение
чувствительности возбудителей к противогрибковым препаратам современ-
ными методами является актуальной проблемой.
Степень разработанности темы
В последние годы, благодаря внедрению современных методов, в том
числе ДНК-секвенирования и технологии MALDI-TOF масс-спектрометрии,
6

этиология ИК в ряде зарубежных стран постоянно уточняется [35]. В иссле-


довании ИК в отделениях реанимации и интенсивной терапии,
проводившемся в России ранее, использовали только морфологические и
биохимические методы видовой идентификации возбудителей [9]. При этом
до 10% штаммов Candida spp. не удавалось определить до вида.
В период с 2003 по 2008 гг. в России в рамках многоцентрового
глобального исследования ARTEMIS DISK была определена
чувствительность возбудителей ИК к флуконазолу (78%) стандартизованным
диско-диффузионным методом CLSI M44-A [15].
Однако отсутствуют сведения о чувствительности возбудителей ИК в
РФ к антимикотическим препаратам, в том числе сравнительно нового
поколения: вориконазолу, каспофунгину и позаконазолу, полученные рефе-
рентными методами. Введение новых критериев интерпретации результатов
определения чувствительности для основных возбудителей ИК, предложен-
ных Европейским комитетом по определению чувствительности микро-
организмов к антибиотикам (EUCAST, 2012 г.) и Институтом по клини-
ческим и лабораторным стандартам (CLSI, США, 2012 г.) обусловило
необходимость проведения оценки различных методов определения чувстви-
тельности Candida spp. к противогрибковым препаратам [40].
Цель исследования - изучить особенности возбудителей внутри-
больничного инвазивного кандидоза для оптимизации лабораторной диа-
гностики.
Задачи исследования:
1. Определить видовой спектр возбудителей внутрибольничного инвазивного
кандидоза в стационарах РФ с помощью современных методов иден-
тификации.
2. Сравнить используемые методы видовой идентификации Candida spp. и
выявить наиболее эффективные для применения в рутинной практике.
3. Определить чувствительность возбудителей инвазивного кандидоза к
современным антимикотикам с помощью стандартизованных методов (CLSI
7

M27-A3, CLSI M44-A) и микробиологического анализатора (VITEK 2


Compact).
4. Сравнить используемые методы определения чувствительности Candida
spp. к современным антимикотикам и выявить наиболее эффективный для
применения в рутинной практике.
5. Разработать алгоритм лабораторной диагностики внутрибольничного
инвазивного кандидоза.
Научная новизна исследования
Впервые:
1. Установлена этиология внутрибольничного инвазивного кандидоза в
РФ современными молекулярно-биологическими методами.
Соотношение видов C. albicans и C. не-albicans видов составляет 1:1,3.
Выявлены географические особенности этиологии инвазивного
кандидоза в различных регионах России.
2. Определены профили чувствительности возбудителей
внутрибольничного инвазивного кандидоза в России референтным
методом CLSI M27-A3 к следующим противогрибковым препаратам:
флуконазолу, вориконазолу, каспофунгину, позаконазолу.
3. Установлены диапазоны МПК, МПК50, МПК90 флуконазола,
вориконазола, каспофунгина, позаконазола для возбудителей
внутрибольничного инвазивного кандидоза в России.
4. Определены масс-спектро-профили возбудителей внутрибольничного
инвазивного кандидоза, в том числе редких видов Candida; внутри вида
C. parapsilosis выявлено 5 субкластеров.
Теоретическая и практическая значимость работы
Результаты диссертационного исследования вносят вклад в изучение
глобальных тенденций в этиологии внутрибольничного инвазивного
кандидоза и определение чувствительности возбудителей ИК к анти-
микотическим препаратам; они также важны для быстрой и точной иден-
тификации патогенов - возбудителей внутрибольничного инвазивного канди-
8

доза. Собранная в результате исследования коллекция чувствительных и


резистентных к противогрибковым препаратам изолятов Candida spp. от
пациентов с внутрибольничным инвазивным кандидозом депонирована в
Российскую коллекцию патогенных грибов и служит основой для изучения
молекулярных механизмов резистентности к азоловым препаратам.
Разработан алгоритм лабораторной диагностики возбудителей внутри-
больничного инвазивного кандидоза с помощью современных методов.
Методология и методы исследования
Данная диссертационная работа - многоцентровое исследование. Объекты
исследования – культуры Candida spp., выделенные от пациентов с внутри-
больничным инвазивным кандидозом. Для выполнения работы использовали
микробиологические, физико-химические, молекулярно-генетические и
статистические методы.
Положения, выносимые на защиту:
1. Возбудители внутрибольничного инвазивного кандидоза в
России представлены основными видами Candida spp. (96%): C. albicans,
C. parapsilosis, C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei, C. guilliermondii и
редкими (4%): C. lusitanie, C. dubliniensis, C. pararugosa, C. bracarensis, C.
kefyr, C. lipolytica, C. utilis, C. inconspicua.
2. Распространенность C. albicans как основного возбудителя
инвазивного кандидоза в России снизилась с 54% в 2012 г. до 32,8% в
2014 г. (р=0,015), C. parapsilosis - возросла с 9,8% (2012 г.) до 27,8%
(2014 г., р=0,01), тогда как уровень C. glabrata, C. tropicalis и C. krusei
остается неизменным.
3. Чувствительность изолятов C. не-albicans видов к флуконазолу in vitro
составила 58%, к вориконазолу - 95,7%. К каспофунгину все штаммы
возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза были
чувствительны.
Степень достоверности и апробация результатов диссертационного
исследования
9

Степень достоверности результатов, полученных при проведении иссле-


дования, подтверждается достаточным и репрезентативным объёмом выбор-
ки выполненных исследований, подтверждена адекватными методами
статистической обработки данных. Методы математической обработки
полученных результатов соответствуют поставленным задачам.
Материалы диссертационного исследования представлены на конферен-
циях и конгрессах:
международных – 12-я конференция Американского общества микро-
биологов «Candida и кандидоз», США, 2014 г.,
европейских: 23-й Европейский конгресс по клинической микробиологии и
инфекционным заболеваниям, Германия, 2013г.; 6-й конгресс «Тенденции в
медицинской микологии», Дания, 2013г.; 24-й Европейский конгресс по кли-
нической микробиологии и инфекционным заболеваниям, Испания, 2014 г.,
российских: Всероссийская научно-практическая конференция по
медицинской микробиологии и клинической микологии «Кашкинские
чтения» (Санкт-Петербург, 2013 г., 2014 г.); отчетные сессии научных под-
разделений СЗГМУ им. И.И.Мечникова, (Санкт-Петербург, 2013 г., 2014 г.).
По теме диссертации опубликовано 22 научные работы, в т. ч. 4 статьи в
изданиях, рекомендованных ВАК.
Личный вклад диссертанта. Автор лично выполнил основные микро-
биологические исследования по теме диссертации, статистическую обра-
ботку, анализ полученных данных, обобщение и оформление результатов.
Структура и объем диссертации Диссертационная работа изложена на
146 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литера-
туры, описания методов и материалов исследования, результатов работы,
заключения, выводов, практических рекомендаций. Диссертация содержит 25
таблиц и 42 рисунка. В работе использованы 30 отечественных и 154 ино-
странных источников литературы.
10

ГЛАВА 1 Проблемы современной лабораторной диагностики


возбудителей инвазивного кандидоза (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1 Краткая историческая справка

История грибов рода Candida и вызываемых ими заболеваний началась


более двух тысячелетий назад. Еще греческий ученый Гиппократ (460 – 377
гг. до н.э.) изучал заболевание «молочница» или aphta alba, названное так из-
за белых округлых язв на слизистых оболочках полости рта. Однако
идентификация возбудителя «молочницы» слизистых оболочек была
проведена лишь в XIX веке [14].
В период с 1839 по 1844 годы трое европейских ученых: Fredrik Berg (г.
Стокгольм), David Gruby (г. Париж), John Bennett (г. Эдинбург), независимо
друг от друга, провели исследование кандидоза слизистой оболочки щек у
детей. В 1841 году F. Berg в результате микроскопического выявления нитей
гриба между эпителиальными клетками удалось обнаружить, что причиной
афтозного поражения слизистых оболочек щек являются грибы, схожие с
плесенями. В 1853 году французский биолог Charles Robin зарисовал и
назвал гриб Oidium albicans (рисунок 1).
11

Рисунок 1 – Первые печатные иллюстрации Candida (Oidium) albicans: гриба


молочницы (champignon du muguet) - эпителиальные фрагменты с круглыми
клетками Oidium albicans и нитями псевдомицелия с бластоспорами (C. Robin,
1853 г.) [32].

В 1864 году немецкий ученый Burchardt опубликовал результаты


экспериментального микроскопического изучения возбудителя молочницы
12

(рисунок 2). Он изучал развитие возбудителя в препаратах эпителия на


предметных стеклах в течение 2 – 3 дней и обнаружил септирование,
разветвление нитей с боковыми почками, некоторые нити росли с
образованием почек на концах нитей. Эти нити были названы псевдогифами
[153].

Рисунок 2 – Филаментирующий рост возбудителя молочницы (Burchardt,


1864 г.) [32].
В 1869 году французский педиатр Joseph Parrot при изучении молочницы
пищевода, желудка, кишечника, гортани, трахеи и легких, возникших в
результате грибкового поражения ротоглотки, впервые произвел
гистологическое описание проникновения гриба в ткани. В 1877 году
немецкий ученый Paul Grawitz, культивируя возбудителя молочницы,
обнаружил, что в кислых условиях образовались не нити гриба, а
дрожжеподобные клетки, и назвал их Mycoderma vini. Одновременно
немецкий ученый Max Reess, исследуя биопсийный материал от больных,
описал возбудителя молочницы как дрожжеподобный микромицет, но назвал
его Saccharomyces albicans. Таким образом, P. Grawitz и M. Reess первыми
выявили диморфизм, характерный для Candida albicans, т.е. способность
образовывать и дрожжеподобные, и нитчатые формы [14, 32]. В 1890 году
немецкий ботаник Wilhelm Zopf переименовал возбудителя в Monilia albicans,
13

а заболевание соответственно стало именоваться «монилиаз» вплоть до 1923


года, когда датский микробиолог Christine Berkhout предложила назвать род
Candida и вид Candida albicans. Название Candida albicans было образовано
от двух латинских слов: toga candida (тога, которую носили кандидаты
древнеримского сената) и albicans - от латинского слова albicare –
«отбеливать», что связано с внешним видом колоний на питательной среде.
Хорошо известное сейчас название рода Candida было закреплено
лишь в 1954 году на VIII Ботаническом конгрессе в Париже и используется
до сих пор [11].
Количество видов грибов рода Candida постоянно увеличивается и в
настоящее время составляет около 150 видов, а включая синонимы - почти
800. Большинство Candida spp. являются сапротрофами. Основными
патогенами для человека являются около 20 видов [8].
В соответствии с классификацией патогенных грибов,
сформулированной в 1996 году американским микологом K.J.Kwon-Chung
[96], в основу которой положены способы размножения грибов, Candida spp.
относят к классу Ascomycetes и дрожжевым грибам. Ранее Candida spp.
относили к классу Fungi imperfecti (или Несовершенным грибам, для которых
половая стадия не была выявлена). С развитием методов диагностики
возбудителей кандидоза, включая молекулярно-генетические, у многих видов
Candida выявлена способность размножаться половым путем (половая стадия
– телеоморфа). Для тех видов Candida, у которых половая стадия до сих пор
не обнаружена, но молекулярно-генетическими исследованиями, характером
метаболизма подтверждено, что эти грибы являются аскомицетами, введено
понятие аффинитета, то есть сродства, в данном случае, к классу Ascomycetes.
Названия половой стадии и бесполой (анаморфы) Candida spp. различны.
В последние годы благодаря использованию современных молекулярно
– генетических методов значительно уточнены межвидовые отношения
внутри рода Candida. Так, описаны три клады в роде Candida spp.: клада 1 –
Candida albicans, включает C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis; клада 2 –
14

Clavispora – Metschnikowia, включает C. guilliermondii, C. lusitaniae,


Debaryomyces hansenii; клада 3 – Saccharomycetaceae, включает
Saccharomyces cerevisiae, C. glabrata, C. krusei [95].
Современная классификация грибов рода Candida выглядит следующим
образом.
Надцарство – Eukaryota
Царство – Fungi
Отдел – Ascomycota
Подотдел - Saccharomycotina
Класс – Hemiascomycetes
Порядок – Saccharomycetales
Семейство - Saccharomycetaceae
Род – Candida
Вид – Candida albicans и т.д.
[29]

1.2 Грибы рода Candida - возбудители инвазивного кандидоза

Инвазивный кандидоз – инфекция, вызванная грибами Candida spp., как


правило, внутрибольничная, возникающая при наличии следующих факторов
риска: долгое пребывание в отделении реанимации и интенсивной терапии,
сахарный диабет, хирургические манипуляции, парентеральное питание,
трансплантация органов и тканей, применение центрального венозного
катетера, антибиотиков широкого спектра действия, а также
иммуносупрессивной терапии и системы гемодиализа [4].
Грибы рода Candida являются важными представителями нормальной
микробиоты человека. Чаще всего Candida spp. можно обнаружить в
желудочно-кишечном тракте, на слизистых оболочках ротовой полости и
половых органов, коже. Также они широко распространены во внешней
среде (растения, почва, продукты питания) [29,69].
15

Дрожжи Candida spp. имеют общие характеристики: это одноклеточные


микроорганизмы; образуют псевдомицелий (кроме C. glabrata и C.
inconspicua); размножаются почкованием; размеры клеток в пределах 1,5 – 15
мкм; являются факультативными анаэробами, большинство видов растут при
температуре 370С [95].
В соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами,
принятыми в России, «СП 1.3.2322-08. Безопасность работы с
микроорганизмами III и IV групп патогенности (опасности) и возбудителями
паразитарных болезней» [13], Candida spp. относят к III и IV группам
патогенности, т.е. к условно-патогенным организмам, вызывающим
оппортунистические системные микозы при понижении иммунного статуса
человека (III группа) или являющимися возбудителями поверхностных
микозов (IV группа). В соответствии с зарубежной классификацией по
уровням биологического риска (BioSafety Level, BSL), принятой Всемирной
Организацией Здравоохранения [98], Candida spp. относят к BSL-1 и BSL-2 -
возбудителям низкого уровня риска, так как они вызывают глубокие микозы
на фоне иммунодефицита, критического состояния (BSL-1) или среднего
уровня риска (BSL-2) [11].
К основным возбудителям инвазивного кандидоза (ИК) человека
относят виды: C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis.
Реже встречаются: C. lusitaniae, C. guilliermondii, C. rugosa, C. inconspicua.
Редкими возбудителями ИК являются C. kefyr, C. utilis, C. lipolytica, C.
dubliniensis.
Самым частым возбудителем кандидоза, в том числе инвазивного,
является вид C. albicans, который входит в состав нормальной микробиоты
тела человека, колонизируя слизистые оболочки желудочно-кишечного
тракта. Поэтому ИК обычно возникает в результате эндогенной
диссеминации, реже – экзогенным путем. C. albicans растет при температуре
370С и 450С. При посеве на «голодные» среды (рисовый агар, голодный
щелочной агар) образует терминальные хламидоспоры. При инкубировании
16

культуры C. albicans с сывороткой крови образуются «ростковые трубки» –


короткие нити истинного мицелия. Аскоспор не образует [95].
C. parapsilosis обычно является экзогенным патогеном, обитает на коже
человека. Этот вид распространен в окружающей среде больниц, на
поверхностях катетеров и другом медицинском оборудовании. Образует
псевдомицелий. В 2005 г. были описаны два новых вида, которые
сформировали так называемый C. parapsilosis комплекс: собственно C.
parapsilosis, C. orthopsilosis и C. metapsilosis. Два последних вида часто
проявляют способность к формированию биопленок на биомедицинских
устройствах, их идентификация возможна с помощью молекулярно-
генетических методов, а также MALDI-TOF масс-спектрометрии [29, 39, 68].
C. glabrata может входить в состав нормальной микробиоты тела
человека. Псевдомицелий не образует. Ассимилирует глюкозу и трегалозу.
Важной особенностью C. glabrata является ее способность замещать вид C.
albicans на фоне лечения инфекции, вызванной этим видом. В 2005 году с
помощью ДНК-секвенирования выявлен «криптический» вид, т.е. вид не
отличающийся по морфологическим и биохимическим свойствам – C.
nivariensis, который является более устойчивым к азоловым
противогрибковым препаратам, чем C. glabrata [121], а в 2008 описан вид C.
bracarensis [29, 34].
C. krusei (телеоморфа Pichia kudriavtsevii, прежнее название -
Issatchenkia orientalis) входит в состав микробиоты желудочно-кишечного
тракта человека, однако может встречатся в почве и воде. Вид имеет
способность к ассимиляции и ферментации глюкозы [29].
C. tropicalis входит в состав нормальной микробиоты человека.
Образует псевдомицелий. Вызывает более тяжелые инфекции у
онкогематологических больных, чем C. albicans [29, 94].
C. lusitaniae (телеоморфа Clavispora lusitaniae) может входить в состав
нормальной микробиоты человека в качестве сапроба, однако может
17

вызывать ИК у пациентов с онкологическими заболеваниями крови и после


трансплантации стволовых клеток [29].
C. guilliermondii (телеоморфа Pichia guilliermondii) входит в состав
нормальной микробиоты человека, в частности, кожи и слизистых. Часто
встречается как возбудитель ИК у онкологических пациентов. По
биохимическим свойствам вид похож на C. famata, однако в отличие от C.
famata образует псевдомицелий [29, 36].
C. rugosa может быть возбудителем ИК у пациентов ожоговых
отделений. С 2006 года, после проведения молекулярно-генетической
идентификации вида C. rugosa, стало известно, что данный вид образует
комплекс, куда входят, кроме собственно C. rugosa, также C. mesorugosa, C.
neorugosa, C. pseudorugosa. Близкородственным видом является и C.
pararugosa, который отличается от C. rugosa по ряду биохимических свойств
(усвоение L-сорбозы и L-арабинозы, отсутствие ассимиляции глицерина).
Идентификация видов возможна также с помощью молекулярно-
генетических методов, а также MALDI-TOF масс-спектрометрии [112].
C. inconspicua (телеоморфа Pichia cactophila) растет на агаре Сабуро
при 370С и 420С. Не образует псевдомицелия. Вариабельно ферментирует
глюкозу, по биохимическим свойствам похожа на C. glabrata [89].
C. kefyr (телеоморфа Kluyveromyces marxianus) является возбудителем
ИК в основном у онкогематологических больных [29, 95].
C. utilis (телеоморфа Pichia jadinii) первоначально применяли в
пищевой индустрии, однако в 1988 г. был описан первый случай
возникновения ИК у пациента со СПИД после установления катетера [29].
C. lipolytica (телеоморфа Yarrowia lipolytica) является обитателем
окружающей среды. Первое сообщение об этом виде как возбудителе ИК
появилось в 1985 г., заболевание было связано с внутрисосудистой
катетеризацией. Гриб не ферментирует сахара, ассимилирует только глюкозу.
Вызывает заболевание у иммунодефицитных пациентов [29].
18

Вид C. dubliniensis по фенотипическим свойствам близок с C. albicans,


образует ростковые трубки в сыворотке крови при температуре 370С,
хламидоспоры на «голодных средах». Впервые описан в 1995 году как
возбудитель орофарингеального кандидоза у больных СПИД. Является менее
патогенным видом, чем C. albicans. Хотя в последнее время отмечают
тенденцию к увеличению количества штаммов C. dubliniensis, устойчивых к
азолам in vitro, клиническая устойчивость встречается редко. Отличается от
C. albicans по максимальной температуре роста: C. albicans растет при
температуре 450С, C. dubliniensis – не растет. Отличить два этих вида
надежно можно молекулярно-генетическими методами [29,118].
Из вышеперечисленных представителей рода Candida вид C. albicans
является основным возбудителем ИК [128]. Однако, в последние годы
отмечают снижение встречаемости этого вида как возбудителя ИК и
увеличение доли C. не-albicans видов. Второе место по распрострененности,
в зависимости от географического положения региона, профиля стацонара и
других факторов, занимают C. parapsilosis и C. glabrata [37]. Замечено, что C.
glabrata часто выделяют у пациентов старшего возраста [162]. В
исследовании (Аргентина, 2007-2008 гг.) доля C. albicans составила 38,4%,
среди C. не-albicans видов - C. parapsilosis (26,4%) и C. tropicalis (15,4%) [99].
В рамках исследования, проведенного в Ломбардии (Италия), выявлено, что с
1999 г. по 2009 г. доля C. glabrata возросла с 12,8% до 20,3% [16]. При
исследовании возбудителей ИК, выделенных из двух университетов Айовы
(США), обнаружено, что в период с 2004 по 2007 гг. доля C. albicans
составила 47%, C. glabrata – 29%, C. parapsilosis – 12%, C. tropicalis – 6%
[155].
Также в последние годы регистрируют возрастание доли редких видов
с природно сниженной чувствительностью к одному или нескольким
противогрибковым препаратам азолового ряда: С. cifferrii, C. guilliermondii,
C. inconspicua, C. humicola, C. lambica, C. lipolytica, C. norvegensis, C.
palmioleophila, C. rugosa и С. valida, а также двух видов со сниженной
19

чувствительностью к эхинокандинам: С. fermentati и С. guilliermondii [77]. В


исследовании, проведенном ранее (ARTEMIS DISK, 2005–2007 г.), доля
редких видов составляла около 4%; в исследовании, проведенном в те же
годы в Германии – 4,7%, а в рамках программы исследования CANDIPOP (39
госпиталей Испании) доля редких видов составляла уже более 6% [76, 131,
143].
Глобальные исследования эпидемиологии инвазивного кандидоза
начали проводить в 90-х годах ХХ века. Так, в исследовании ARTEMIS DISK,
которое проводили при участии 39 стран мира, в период 1997-2003 гг. была
отмечена тенденция к снижению уровня C. albicans с 73,3% (1997 г.) до
62,3% (2003 г.), доля C. не-albicans также постепенно возрастала. При этом
уровень C. glabrata вырос с 9,7% до 12%, доля C. tropicalis - c 4.6% до 7,5%,
C. parapsilosis - с 4,2% до 7,3%, C. krusei – с 1,7% до 2,7%. Таким образом,
доля C. не-albicans за 6 лет увеличилась с 26,7% до 37,7% [135].
По данным глобального исследования SENTRY, проведенного в 79
странах, в 2003 г. обнаружили, что видовой спектр возбудителей ИК в мире
представлен C. albicans (48,7%), на втором месте C. glabrata и C. parapsilosis
(по 17,3%), далее - C. tropicalis (10,9%). В аналогичном исследовании
SENTRY в период с 2008 по 2009 гг. выявили незначительные изменения
видового спектра среди штаммов C. не-albicans; так доля C. glabrata возросла
до 18,2% и снизилась доля C. tropicalis – 10,6%. Наибольший процент C.
albicans был определен в странах Азиатско-Тихоокеанского региона – 56,9,
на втором месте были C. glabrata и C. parapsilosis - 13,7%, далее C. tropicalis
– 11,7%. В европейских странах также преобладал вид C. albicans – 55,2%,
далее - C. glabrata – 15,7% и C. parapsilosis – 13,7%. Однако, в странах
Латинской Америки доля C. albicans была менее 50% (43,6%), штаммы C.
parapsilosis составляли 25,6%, на третьем месте по встречаемости был вид C.
tropicalis – 17,0% [163].
В национальных исследования видового спектра возбудителей ИК в
США отмечено, что уже в период с 1995 по 1998 гг. наблюдали снижение
20

доли C. albicans как возбудителя ИК до 46%, а с 2008 года – до 38% с


сохранением этого уровня до 2012 г. [51]. По данным других национальных
исследований, в частности проведенных на территории Северной и
Латинской Америки с 2001 по 2004 гг., доля C. albicans составляла 50 – 51 %,
а с 2004 – 2008 гг. обнаружили снижение до 46% [66]. В Испании снижение
уровня C. albicans (45,4%) было отмечено только с 2013 г. [65], тогда как в
Греции такой же уровень наблюдали уже в период с 2005 по 2009 гг. В
странах Азиатско-Тихоокеанского региона и Африке доля штаммов C.
albicans составила от 35,6% в Тайланде до 45,9% в Южной Африке. Стоит
заметить, что в странах Скандинавского региона, таких как Дания, Исландия,
Финляндия, Швеция, с 2000 г. и до настоящего времени не выявлено
уменьшение доли C. albicans среди возбудителей ИК - ниже 50%; в среднем
доля C. albicans в этих странах находится в пределах 52,1-70 %, в Германии –
58,5% [41, 99,163].
Среди C. не-albicans видов в Северной Америке, в частности США, в
Дании, Исландии, Финляндии, Швеции, Швейцарии, Германии,
Великобритании в основном преобладали штаммы C. glabrata (16 – 29%), вид
характеризующийся умеренной чувствительностью к противогрибковому
препарату – флуконазолу. C. parapsilosis занимала второе место как
возбудитель ИК в странах Средиземноморья: Греции (2005-2009 гг.) – 22,7 %,
Испании – 24,9% (по настоящее время), Италии – 36,9%, Тайланде – 27,1%,
Южной Африке – 25%, Китае – 23,8%. В Израиле, Латинской Америке, в
Турции на втором месте по встречаемости находилась C. tropicalis 17-24,1%
[64, 116]. В исследовании FUNGEMYCA (Испания, 2009-2011гг.) было
выявлено, что среди возбудителей ИК доля C. albicans составила 44,6%, C.
parapsilosis – 26,5%, C. glabrata - 11,4%, C. tropicalis – 8,2%, C. krusei – 1,96%,
C.dubliniensis – 0,29% [160].
В многоцентровом исследовании этиологии ИК, проведенном во
Франции (2007 – 2013гг.), установлено, что доля C. albicans составила 67,4%,
21

среди C. не-albicans второе место занимала C. glabrata - 15,3%, далее C.


parapsilosis – 8,5%, C. tropicalis – 8,0%, C. krusei – 3,4% [26].
Таким образом, можно заключить, что этиология ИК в различных
географических регионах не однородна. В последние десятилетия в
большинстве стран мира наблюдается изменение видового спектра
возбудителей ИК с увеличением распространенности C. не-albicans видов.

1.3 Современные подходы к видовой идентификации возбудителей


инвазивного кандидоза
Подтверждение диагноза ИК в России базируется на следующих
критериях диагностики: получение роста Candida spp. при посеве крови и
других в норме стерильных биосубстратов, биопсийного материала от
пациента с клиническими признаками инфекции, а также при обнаружении
Candida spp. при гистологическом исследовании глубоких тканей. Для
получения культуры возбудителя ИК забор крови производят у пациентов с
температурой более 380С или другими признаками генерализованной
вопалительной реакции 2 раза в день в течение не менее 3 дней,
серологические тесты не рекомендованы. Посев производят на жидкие
питательные среды (бульон Сабуро, сусло) [4]. В соответствии с
Европейскими рекомендациями по диагностике кандидоза (2012г.), забор
крови производится ежедневно трехкратно из каждой локтевой вены с
интервалом 30 минут, посев осуществляют во флаконы систем BacT/ALERT
и других (для аэробных и анаэробных культур) с инкубацией не менее 5
суток [63], что позволяет определить наличие или отсутствие Candida spp. в
крови [37].
Другие стерильные в норме биоматериалы засевают также на плотные
питательные среды. Для этого в большинстве лабораторий используют агар
Сабуро, сусло – агар. Применение хромогенных сред – питательных сред с
субстратом, который, взаимодействуя с ферментами различных видов
Candida, окрашивают их колонии в определенные цвета (CHROMAgar
22

Candida, BD Diagnostic) [136], помогает выявить разные виды Candida в


смешанной культуре, однако точно идентифицировать вид Candida не
позволяет [5, 21].
При выделении культуры микромицета для видовой идентификации в
настоящее время в практике используют различные коммерческие методы,
например тест-системы Remel BactiCard Candida Kit (Thermo Scientific™,
США). При чувствительности и специфичности данной тест-системы –
98,7 % и 99,6% соответственно, за 5 минут данный тест позволяет
дифференцировать вид C. albicans от других видов Candida [54]. Тест на
образование «ростковых» трубок также позволяет отличить C. albicans, C.
dubliniensis, образующих ростковые трубки в сыворотке крови, от других
видов.
Таким образом, заметим, что данных методов идентификации вида
недостаточно, поскольку они расчитаны в основном на дифференцировку C.
albicans от C. не-albicans видов. Более предпочтительны методы видовой
идентификации, ориентированные на определение биохимических свойств,
молекулярно-генетических особенностей и белкового масс-спектра профиля
микромицета (рисунок 3).
23

Второе Третье
поколение поколение

Биохимическое Молекулярно-
направление генетическое направление
(автоматические (ДНК-секвенирование)
анализаторы )

Идентификация
грибов

Первое Четвертое
поколение поколение

Физико-химическое
Биохимическое
направление
направление
(MALDI-TOF масс-
(ручные тест-системы)
спектрометрия)

Рисунок 3 – Развитие методов видовой идентификации грибов рода Candida spp.


Методы видовой идентификации, основанные на изучении
молекулярно-генетических особенностей, стали применяться сравнительно
недавно, а протеомные технологии – начиная с 2000-х годов [60].
Одним из давно разработанных методов идентификации является
определение видов Candida по биохимическим свойствам микромицета. Для
определения ферментации углеводов раньше использовали жидкие
питательные среды с углеводами, реактивом Андреде и стеклянными
поплавками. Ассимиляцию углеводов проводили методом дисков, т.е.
24

использовали бумажные диски с нанесенными на них растворами углеводов


[14]. За последние десятилетия появились промышленно приготовленные
тест – системы как для ручной постановки теста, так и для автоматической. К
числу «ручных» тест-систем относятся RapID Yeast Plus (Remel), API ID32C,
AUXACOLOR2 (BioRad) и другие. Подобные тест-системы просты в
использовании и обладают высоким процентом сопоставимости результатов
с референтными молекулярно-биологическими методами. Так, в
сравнительном исследовании трех биохимических тест-систем (Candifast,
API 20C AUX, Fungichrom) с использованием 116 клинических изолятов,
процент правильной идентификации составил 82,7 – 95,6, время определения
видов составило от 24 до 48 часов [81].
Среди автоматических анализаторов наиболее часто используют Vitek2
Compact (bioMerieux) с картами VITEK2 YST, с их помощью в исследовании
проведенном в Италии верно идентифицировали 98,2% из 750 клинических
изолятов дрожжей, предварительно прошедших ДНК-секвенирование [76].
Также автоматическими анализаторами являются MicroScan plus WalkAway
(Siemens), Phoenix (Becton Dickinson). Выявлено, что совпадение между
результатами идентификации MicroScan plus WalkAway и VITEK2 YST
составляет 94% [140]. При простой пробоподготовке и высокой
сопоставимости результатов с результатами референтного метода (ДНК-
секвенирование), длительность инкубации составляет до 18 часов, для
анализатора MicroScan plus WalkAway – 4 часа.
Во многих странах проводили сравнительные исследования
эффективности биохимических методов идентификации. Так, сравнение тест-
систем API ID32C, AUXACOLOR2 и Vitek2 Compact в рамках исследования
в отделениях реанимации и интенсивной терапии в Греции в период с 2005
по 2010 гг. выявило, что из 253 изолятов с помощью Vitek2 Compact верно
идентифицировано 84%, API ID32C – 83%, AUXACOLOR2 – 80%. Так, среди
наиболее часто встречающихся видов, таких как C. albicans, C. glabrata, C.
parapsilosis процент верно идентифицированных штаммов был выше
(AUXACOLOR2 – 94,5%, API ID32C – 94%, Vitek2 Compact – 91%), чем в
25

отношении редких видов (AUXACOLOR2 -74%, API ID32C – 75%, Vitek2


Compact – 82%) [87]. С помощью трех систем точно идентифицировали более
91% часто встречающихся изолятов, и эти системы могут быть применены в
рутинной практике; для редких видов рекомендовано применение
молекулярно-генетических методов. В исследовании, проведенном в
Бразилии, при сравнении результатов Vitek2 Compact и API ID20C AUX
было обнаружено, что совпадение составляет 93,6 % [158].
Таким образом, основным недостатком методов видовой
идентификации возбудителей ВБИК по биохимическим свойствам является
длительность идентификации (18 – 48 часов), а также невысокий процент
правильной идентификации редких видов.
Молекулярно-генетические методы направлены на определение
количественных и качественных характеристик первичной структуры ДНК.
В настоящее время разработаны и широко применяются различные методы
молекулярной генетики общим числом около ста. Основу подавляющего
большинства таких методов составляет полимеразная цепная реакиця (ПЦР).
Перечень наиболее часто используемых методов приведен в таблице 1[1].

Таблица 1 – Наиболее распространенные молекулярно-генетические методы


№ п/п Молекулярно-генетические методы
1 Полиморфизм длин амплифицированных фрагментов (AFLP)
2 Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (RFPL)
3 Расщепление резолвазой (EMD)
4 Методы, основанные на лигазной реакции (LDL, LCR, Radlock)
5 Инвазивное расщепление олигонуклеотидов (расщепление Clevase I)
6 Случайная амплификация полиморфной ДНК (RAPD, AP-PCR)
7 ПЦР с прямой терминацией синтеза (DT-PCR)
8 Анализ конформации одноцепочечных фрагментов ДНК (SSCP)
9 Гетеродуплексный анализ
10 Секвенирование ДНК
11 Минисеквенирование
12 Аллель-специфическая ПЦР
13 Масс-спектрометрия
14 ПЦР в реальном времени
15 Микрочипы
26

В зависимости от целей исследования все молекулярно-генетические методы


можно подразделить на две группы: методы, направленные на определение
структуры ДНК (видовая идентификация, поиск новых мутаций), и на анализ
известных генетических последовательностей (полиморфных вариантов
генов или идентификация микроорганизмов по референтной
последовательности ДНК).
Исторически первым методом идентификации генетических
последовательностей стал метод блот-гибридизации (Саузерн-блот),
предложенный еще в 1975 году английским ученым Эдвардом Саузерном. С
открытием термостабильной полимеразы, в практику молекулярных
генетиков вошел метод ПЦР, произведший переворот в генетических
исследованиях. Метод основан на многократном избирательном копировании
определенного участка нуклеиновой кислоты ДНК с помощью ферментов in
vitro. Копирование происходит только того участка, что удовлетворяет
заданным условиям и если он присутствует в исследуемом образце. В
отличие от амплификации ДНК в живых организмах (репликация), с
помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК.
Метод ПЦР лежит в основе всех методов, применяемых для диагностики и
идентификации микромицетов в клинической практике [1].
В настоящее время референтным методом определения видовой
принадлежности микромицетов является протокол M18-А Института
клинических и лабораторных стандартов (CLSI), по которому
идентификацию грибов необходимо проводить с применением ПЦР, с
последующим секвенированием генов мишеней, которые имеют достаточно
разнородный нуклеотидный состав, с высокой межвидовой дивергенцией.
Идентификация устанавливается путем выравнивания анализируемой
нуклеотидной последовательности с последовательностями, представлен-
ными в GenBank или в других базах данных генетической информации.
Общие положения данного подхода для молекулярной биологии предложены
Д. Сэмбруком и Д. Расселом в 2001 году (Sambrook & Russell) [141].
27

GenBank является базой данных всех аннотированных нуклеотидных


(ДНК и РНК) и аминокислотных последовательностей, которые они
кодируют, представленных в свободном доступе для исследователей всего
мира. Эту базу данных поддерживает Американская Национальная
библиотека медицины Национального центра биотехнологической
информации (NCBI). GenBank коллаборирует с другими информационными
банками, такими как Европейская молекулярно-биологическая лаборатория
(EMBL) и Банк данных ДНК Японии (DDBJ), осуществляют регулярный
обмен данными между этими тремя архивами аннотированных
нуклеотидных последовательностей [141].
Для видовой идентификации микромицетов выбран комплекс
рибосомальных генов (рисунок 4), содержащих высоко консервативные
домены, перемежающиеся с более вариабельными областями, которые
содержат видоспецифические «подписи». Для упрощения субъединицы этого
комплекса называют рДНК, подразумевая, что это гены, кодирующие рРНК
молекулы.

5’ Малая субъединица 5.8S РНК Большая субъединица 5S РНК 3’


18S РНК ITS1 ITS2 25-28S РНК IGS1 IGS2

Рисунок 4 – Организация рРНК генов микромицетов


Внутри рДНК комплекса существует совокупность множества
тандемных повторов нуклеотидов, находящихся по направлению от 5` к 3`
концу между субъединицами 18S и 5.8S, а также 5.8S и 28S, называющихся
вариабельными внутренними транскрибируемыми спейсерами (ITS),
соответственно 1 и 2. Фланкируют ген большой рибосомальной субъединицы
28S два вариабельных нетранскрибируемых спейсер региона: IGS1-5S-IGS2.
У Saccharomyces cerevisiae существует приблизительно 140 единиц повторов.
У предшественника транскрипта РНК происходит ферментативное удаление
ITS регионов, и, после дальнейших модификаций, формируются 18S, 5.8S и
28S зрелые рРНК, которые в комбинации с белками формируют
28

функциональные рибосомы. Биологическая роль ITS регионов - участие в


ранней транскрипции РНК процессинга. Таким образом, они являются
некодирующими регионами генома [141].
ITS1 и ITS2 регионы, фланкирующие 5.8S рДНК ген, показывают
значимую нуклеотидную дивергенцию. Каждый ITS регион около 300 пар
нуклеотидов в длину. Они очень хорошо подходят для видовой
идентификации как дрожжей, так и нитчатых грибов (таблица 2) [90].
Тринадцать известных патогенов, включая потенциально инвазивные виды
Aspergillus, можно идентифицировать путем сравнительного анализа их ITS1
и ITS2 последовательностей. При использовании двух спейсерных регионов
достигается лучшая межвидовая дифференциация, чем при использовании
одного региона.
Таблица 2 – Видовая идентификация путем прямого анализа региона
внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS) рДНК [90].
Wangiella (Exophiala) dermatitidis
Epidermophyton floccosum
ITS1 Microsoporum (4 вида)
Trichophyton (6 видов)
Malassezia (6 видов)
C. albicans, C. parapsilosis, 13 других видов Candida
ITS2 Cryptococcus (5 видов)
Rhodotorula
Aspergillus (13 видов) (Hinrikson et al., 2005)
Cryptococcus neoformans
ITS1 и ITS2 Fonsecaea compacta, F.pedrosol
Histoplasma capsulatum
Paracoccidioides brasiliensis
Pseudallescheria boydii

Также для видовой идентификации дрожжей используют вариабельный


регион (первые, приблизительно 600 пар нуклеотидов) большой
29

субъединицы РНК 28S (иногда в литературе описывается, как 26S),


названный D1/D2 субрегионом, тогда как остальная последовательность 28S
высоко консервативна [95]. Последовательности D1/D2 всех видов дрожжей
аскомицетов и базидиомицетов известны и представлены в GenBank.
Большинство видов дрожжей может быть идентифицировано по их
различиям в нуклеотидной последовательности D1/D2 домена. Для восьми
видов Candida spp. разработан метод быстрой диагностики с использованием
микросфер, с нанесенными нуклеотидными последовательностями D1/D2,
для проточной цитометрии [145].

Метод ДНК-секвенирования не зря признан «золотым стандартом» для


видовой идентификации микромицетов. По современным данным, видовая
идентификация по ITS региону клинических изолятов дрожжей (включая
виды Candida) в 99,7% случаев корректна, даже для редких видов [35]. По
нашим данным, согласие между результатами молекулярно-генетической и
классической фенотипической идентификаций варьирует между
исследованиями довольно значительно, в пользу ДНК секвенирования [4].
В настоящее время ДНК-секвенирование используют не только для
определения вида внутри рода, но и для типирования внутри вида. Подобное
внутривидовое типирование позволяет осуществить подход мультилокусного
сиквенс-типирования (MLST), который позволяет изучать, как историческое
развитие геномной последовательности, так и приобретенные
наследственные характеристики (различные перестройки генома,
приводящие к различным фенотипическим вариантам как приобретение
резистентных свойств к антимикотической терапии). В исследовании
Якобсена и соавторов [80] был проведен анализ изолятов C. albicans MLST,
охватывающий семь регионов различных генов. Показано, что между
различными сиквенс-типами существует значимая корреляция с
географическим нахождением. Данные исследования позволяют определять
схемы миграции клинически важных штаммов, и предсказывать
эпидемиологические вспышки.
30

Одним из новых быстрых методов видовой идентификации грибов


является технология MALDI-TOF масс-спектрометрии (матрично-
ассоциированная лазерная десорбция/ ионизация время-пролетная масс-
спектрометрия, от англ. MALDI-TOF MS – Matrix Assisted Laser
Desorption/Ionization – Time-of-Flight Mass-spectrometry) – метод видовой
идентификации микроорганизмов, основанный на анализе их белкового масс-
спектро-профиля [132]. Технология MALDI-TOF масс-спектрометрии была
разработана еще в середине 80-х годов учеными К. Танака, Ф. Гилленкампом,
М. Карасом и использовалась для изучения строения различных
высокомолекулярных соединений, в том числе биологического
происхождения [102]. Лишь в начале XXI века метод впервые был применен
для видовой идентификации патогенных грибов [101], несколько позже для
Candida spp. [102].
В 2008 – 2009 гг. в Германии было проведено сравнительное
исследование результатов видовой идентификации Candida spp., полученных
методами AUXACOLOR2 и MALDI-TOF масс-спектрометрии, в сравнении с
референтным молекулярно-генетическим методом. Обнаружено, что
методом MALDI-TOF масс – спектрометрии правильно было
идентифицировано 97,6%, а методом AUXACOLOR2 – 96,9% [138]. При
этом AUXACOLOR2 не смог выявить виды, входящие в комплекс C.
parapsilosis, а изолят C. bracarensis был определен как C. glabrata.
В 2012 году в Италии было проведено исследование по оценке
возможности с помощью метода MALDI-TOF масс-спектрометрии
определять Candida spp. непосредственно в положительных посевах образцов
крови (BC Bactec Mycosis, Becton Dickinson, BD). Полученные данные
сопоставляли с результатами видовой идентификации культур Candida из
крови, выделенных на плотных питательных средах. Обнаружено, что C.
albicans в посевах крови непосредственно в жидкой среде определена в
95,9% образцов, C. не-albicans виды – в 86,5%. Среднее время проведения
31

анализа составило 30 минут при низких затратах на расходные материалы


[56].
Следовательно, MALDI-TOF масс-спектрометрия является методом
быстрой и точной идентификации с низкой себестоимостью. Однако,
возможны затруднения в идентификации видов, если их масс-спектры
отсутствуют или единичные в базе данных масс-спектрометра.
Чувствительность микромицета к противогрибковым препаратам тесно
связана с его видовой принадлежностью, в связи с чем необходим
постоянный мониторинг и видового спектра и чувствительности к
противогрибковым препаратам, в том числе нового поколения.

1.4 Чувствительность возбудителей инвазивного кандидоза к


противогрибковым препаратам
Первые данные о появление устойчивости возбудителей ИК к группе
азоловых противогрибковых препаратов появились еще в 90-х годах у
больных СПИД с сопутствующим инвазивным кандидозом [105]. Оксман и
соавторы в исследовании ИК в двух многопрофильных центрах в США
обнаружили, что 19% Candida spp. были устойчивы к флуконазолу, причем
каждый третий штамм имел приобретенную устойчивость [44].
Отмечают, что C. albicans является преимущественно чувствительным
видом к антимикотикам, однако описаны механизмы устойчивости к
флуконазолу с потенциальной перекрестной устойчивостью к
противогрибковым препаратам азоловой группы. В исследовании ARTEMIS
DISK (1997–2007 гг.) выявлено, что устойчивость штаммов C. albicans к
флуконазолу с 2001 по 2007 гг. составляла в среднем от 1,0% – 1,6%. В
исследовании бразильских ученых среди 212 изолятов Candida spp. уровень
устойчивых к флуконазолу C. albicans составлял 7,1%, тогда как у C. glabrata
- 14.9%, C. tropicalis - 18,4% [143]. В исследовании, проведенном в Сан-
Антонио (США), среди устойчивых к флуконазолу C. albicans была
обнаружена также устойчивость к каспофунгину – 8,1%. Также обнаружена
32

тенденция, что значительно больше изолятов имею устойчивость к


каспофинугину и вориконазолу, если у них наблюдается устойчивость к
флуконазолу [51]. Известно, что в последнее время наблюдается смещение
видового спектра возбудителей ИК от хорошо чувствительной С. albicans к
малочувствительным к азолам изолятам C. не-albicans [133].
Так, у вида C. parapsilosis, который наряду с C. glabrata часто
встречаются как возбудители ИК, стали обнаруживать сниженную
чувствительность к препаратам азоловой группы и к эхинокандинам.
Сообщают о высоком уровне устойчивости к флуконазолу, который стал
встречаться намного чаще у C. parapsilosis (6,8%) и C. tropicalis (9,0%), чем у
C. albicans (2,0%) и C. dubliniensis (3,9%) [58]. Ранее в исследовании
SENTRY сообщали, что 99% штаммов Candida spp. были чувствительны к
каспофунгину, однако в последние годы обнаружено, что в связи с частым
использованием эхинокандинов возрос уровень ИК, вызванного C.
parapsilosis [110]. В исследовании, проведенном в странах Африки и
Ближнего Востока, было обнаружено, что доля штаммов со сниженной
чувствительностью к флуконазолу составляет 20%, а к вориконазолу – 14%
[156].
В исследовании ARTEMIS DISK (2001 – 2007 гг.) выявлено, что
устойчивость к флуконазолу у штаммов C. parapsilosis составляла 3,6%, а к
вориконазолу – 1,8%. C. glabrata обладала устойчивостью к флуконазолу в
15,7% случаев, к вориконазолу – 10% [36]. Также было отмечено, что среди
редких видов, таких как C. lusitaniae, устойчивость к флуконазолу составила
5,4%, а к вориконазолу – 2,0%, у C. rugosa – 41,8% и 21,2%, соответственно.
C. inconspicua была устойчива к флуконазолу в 53,2% случаев, к
вориконазолу – 3,9%. Среди штаммов C. utilis к обоим противогрибковым
препаратам устойчивости не наблюдали [66].
У штаммов комплекса C. glabrata (C. nivariensis, C. bracarensis)
чувствительность к антимикотикам различна. У C. glabrata вероятно
развитие множественной устойчивости к противогрибковым препаратам
33

[131]. По данным ARTEMIS DISK, доля штаммов C. glabrata, устойчивых к


флуконазолу была от 6% до 30%. В глобальном исследовании SENTRY (2008
– 2009 гг.) обнаружили, что устойчивость C. glabrata к вориконазолу
составила 11,1%, а к эхинокандинам – 16,7%, тогда как среди изолятов C.
tropicalis обнаружено лишь 1,9% устойчивых к флуконазолу штаммов и 1,3%
– к вориконазолу. В исследовании Oxman et al. также было выявлено 13%
устойчивых к флуконазолу штаммов C. glabrata с перекрестной
устойчивостью к эхинокандинам [44]. В настоящее время данный вид
является умеренно-чувствительным к флуконазолу. В исследовании 137
штаммов C. glabrata, было выделено 3 изолята C. bracarensis, один из
которых был устойчив к противогрибковым препаратам [29, 34]. C. krusei
является природно устойчивым видом к флуконазолу, чувствительны из них
к вориконазолу – 83% штаммов; к эхинокандинам, в частности к
каспофунгину, изоляты как правило чувствительны. У штаммов C. lusitaniae
отмечено быстрое развитие вторичной устойчивости к амфотерицину В [29,
94].
По данным исследования ARTEMIS DISK отмечено, что у C.
guilliermondii снижается чувствительность к флуконазолу, эхинокандинам и
амфотерицину В [29, 36].
У редкого вида C. rugosa зарубежными учеными обнаружена
тенденция к снижению чувствительности к флуконазолу, эхинокандинам и
амфотерицину В [113]. Вид C. inconspicua является чувствительным к
каспофунгину, тогда как к азоловым антимикотикам чувствительность
снижена. В исследовании ARTEMIS DISK доля устойчивых к флуконазолу
составила изолятов C. inconspicua 53,2%, к вориконазолу – 3,9% [89].
Большинство штаммов C. kefyr являются чувствительными к
противогрибковым препаратам, однако выявляют случаи устойчивости к
каспофунгину [26, 29, 137].
В последнее время наравне с увеличением встречаемости C. dubliniensis
возрастает и устойчивость этого вида к флуконазолу. Так, при исследовании
34

41 изолята C. dubliniensis и 44 штаммов C. albicans было обнаружено, что у C.


dubliniensis начинает развиваться стабильная устойчивость к флуконазолу
при длительном лечении этим препаратом [29, 117].
Национальные эпидемиологические исследования, проведенные в
разных странах, обнаружили ряд особенностей в отношении использования
противогрибковых препаратов для терапии ИК (амфотерицин В, флуконазол,
и группе эхинокандинов), что может быть одной из причин появления
резистентных штаммов.
Имеются наблюдения о географических различиях в
распространенности устойчивых к вориконазолу штаммов Candida spp., так в
Северной Америке - 14,6%, в других странах - 8,2 –11,3% [69].
Исследование, проводившееся в Китае в период с 2009 – 2011 выявило,
что среди C. albicans чувствительными к флуконазолу были 74,2%, к
вориконазолу – 100%, среди изолятов C. parapsilosis – 57.7% и 100%
соответственно, у C. glabrata чувствительность составила 9,1% и 100% к
вышеуказанным антимикотикам. У C. tropicalis – 31.6% , к каспофунгину все
100% штаммов были чувствительны, кроме 91.3% C. tropicalis [24].
В испанском национальном исследовании FUNGEMYCA (2009 –2011
гг.) было выявлено, что устойчивых и умеренно чувствительных среди C.
albicans к флуконазолу было 1,5%, к вориконазолу – 1,6%, к позаконазолу -
1,9%. У C. parapsilosis сниженной чувствительностью к позаконазолу и
каспофунгину обладали 0,3% штаммов, к флуконазолу и вориконазолу –не
выявлено. Для изолятов C. glabrata наибольшая доля со сниженной
чувствительностью наблюдалась для позаконазола – 14,5%, у флуконазола и
вориконазола – 6,3% и 1,2% соотвественно, у каспофунгина устойчивых
штаммов не обнаружено. Устойчивых к флуконазолу и вориконазолу у
изолятов C. tropicalis было обнаружено – 5,3%, а к позаконазолу – 7,1%, к
каспофунгину также устойчивых не было [79]. По данным исследования
ROCANET в Италии (10 госпиталей, 2013 г.) среди 101 Candida spp. была
установлена устойчивость к эхинокандинам у 2 штаммов (C. albicans и C.
35

tropicalis), к флуконазолу у 4 штаммов (2 C. glabrata), 1 штамм C. glabrata


имели устойчивость к вориконазолу и позаконазолу (перекрестная
устойчивость) [157].
В Российской Федерации исследований распространенности
устойчивости к противогрибковым препаратам не проводили.

1.5 Современные методы определения чувствительности Candida spp. к


противогрибковым препаратам

История развития референтных методов определения чувствительности


насчитывает порядка 20 лет. Однако до этого дня основными были методы
нестандартизованных серийных разведений и диско-диффузионные методы.
Проблема внутрилабораторной и межлабораторной воспроизводимости
данных методов привели к необходимости применения стандартизованных
методов. На сегодняшний день в мире существуют два крупных мировых
центра по разработке стандартных методов определения чувствительности
микромицетов к противогрибковым препаратам – CLSI (Clinical Laboratory
Standards Institute – Институт клинических и лабораторных стандартов,
США) и EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing
–Европейский коммитет по исследованию противомикробной
чувствительности).
CLSI в 1992 году разработал первый вариант протокола метода
разведений в жидкой питательной среде M27-P. Время проведения
исследований этим методом составляло 48 – 72 часа [74]. Благодаря
совершенствованию протокола в 2008 году был предложен готовый протокол
M27-A3 с дополнением S3, где время получения результата составляло 48
часов [47]. Данный метод является референтным методом определения
чувствительности. Однако, несмотря на точность получаемых результатов,
является трудозатратным и дорогим. В связи с этим, в 2004 году был
разработан протокол диско-диффузионного метода CLSI M44-A [46],
36

характеризующийся простой пробоподготовкой, автоматическим учетом


результата и высокой сопоставимостью результатов с референтным методом
CLSI M27-A3.
В системе EUCAST также предложили вариант определения
чувствительности дрожжей методом микроразведений в жидкой питательной
среде (протокол Edef 7.2 Revision), однако время получения результата
составило 24 часа, а не 48 - как у CLSI [75]. На протяжении нескольких лет
между двумя центрами CLSI и EUCAST шли дебаты относительно критериев
интерпретации минимальных ингибирующих концентраций, и лишь в 2012
году они были гармонизированы [48]. В проведенном в период 2012 – 2013 гг.
исследовании по сравнению результатов, полученных в соотвествии с
вышеуказанными протоколами было определено, что общая согласованность
составляла от 78,9% (позаконазол) до 99,6% (флуцитозин). Совпадение по
категориям чувствительности составило 95% для всех антимикотиков, кроме
каспофунгина (84,6%). Наряду с этим была обнаружена низкая
согласованность при определении чувствительности C. glabrata к
амфотерицину В, анидулафунгину, у C. parapsilosis, C. tropicalis, C. krusei – к
каспофунгину и у большинства видов – к итраконазолу и позаконазолу.
Высокая степень согласованности была обнаружена относительно
флуконазола, вориконазола и микафунгина против C. albicans, C. glabrata, C.
parapsilosis, C. tropicalis, C. krusei [126].
С развитием референтных методов стали появляться коммерческие
аналоги: ручные тест-системы – MICRONAUT –AM, SensititreYeastOne (Trek
Diagnostics), E – test (AB Biodisk), ATB Fungus 2 (bioMerieux) и
автоматические – Vitek (bioMerieux), MicroScan WalkAway (Siemens) для
удобства применения в практике.
В исследовании 133 изолятов Candida spp. отмечали, что совпадение
между этими системами для флуконазола составляет 82,7%, для триазолов
(72,9 – 77,9%) [28]. При сравнении результатов чувствительности к
антимикотикам 170 изолятов C. albicans, полученных тест-системой
37

MICRONAUT – AM с протоколам CLSI A27-A3, EUCAST, было обнаружено,


что все изоляты C. albicans были чувствительны к флуконазолу и
вориконазолу в сравнении с CLSI A27–A3, и 2% обладали промежуточной
чувствительностью к флуконазолу по сравнению с EUCAST [107].
Многоцентровое исследование по сравнению МПК противогрибковых
препаратов изолятов Candida spp., с использованием автоматической
системы Vitek2 Compact и референтного метода микроразведений по
протоколу CLSI M27–A3, показало, что совпадение между результатами
вышеуказанных методов составило 99,5% (n=867) в отношении
каспофунгина, 98,6% (n=867) – микафунгина и позаконазола - 95,6% (n=452)
[127]. В исследовании, проведенном в Бразилии при сравнении результатов
Vitek2 Compact и CLSI M27-A3, было обнаружено, что совпадение у C.
parapsilosis составило 97,5%, C. glabrata - 85,5 % [158].
Таким образом, в начале XXI века остается проблема быстрой, точной
идентификации и определения чувствительности к противогрибковым
препаратам Candida spp. в клинической микробиологической лаборатории. В
таблице 3 приведена эволюция методов диагностики в микробиологии.

Таблица 3 – Эволюция методов диагностики, применяемых в


микробиологии по Khardori N. [92].

Метод диагностики Интерпретация/время


Микроскопия Общая морфология / минуты
Окраска по Грамму Общая принадлежность / минуты
Определение фенотипических свойств Рост и идентификация / дни-недели
Антимикотическая/антимикробная Выбор антимикотиков (антибиотиков) /
чувствительность дни-недели
Обработка моноклональными антителами Идентификация / часы
Определение антигена Идентификация / часы
Идентификация микроорганизма методом Идентификация (сложность в определении
ПЦР в реальном времени редких видов) / часы
38

Продолжение таблицы 3
Метод диагностики Интерпретация/время
Идентификация микроорганизма методом Идентификация (даже для редких видов) /
ДНК-секвенирования дни
Определение генов резистентности методом Выбор антибиотика / часы
Масс-спектрометрия Идентификация (даже для редких видов) /
минуты после получения культуры

В настоящее время перспективным направлением в определении


чувствительности к противогрибковым препаратам является устойчивость к
ним с помощью молекулярно-биологических методов [31]
Один из них основан на масс-спектрометрии [104]. Этот метод хорошо
себя зарекомендовал себя в видовой идентификации грибов, однако
применение его для определения устойчивости к антимикотикам, только
начинается и пока проведено небольшое количество исследований. Так в
работе в серии разведений противогрибкового препарата определяли
пороговую концентрацию, при которой меняется белковый профиль
микромицета — C. albicans. Оказалось, что минимальная концентрация
флуконазола, изменяющая белковый профиль, находится в хорошем
соответствии с МПК, определенной по стандартам CLSI. Также при помощи
масс-спектрометра возможно непосредственное выявление продуктов
распада лекарственного вещества, ферментированного устойчивым штаммом
патогенного микроорганизма. Работы в этом направлении были проведены
пока только в отношении антибиотиков [104].
Известно, что при помощи масс-спектрометрии находят особенности
белковых профилей, свойственные устойчивым штаммам микромицетов
[138]. Такой подход можно назвать типированием. Следует отметить, что по
литературным данным, подавляющая часть клинических изолятов вида C.
parapsilosis sensu lato является чувствительной к противогрибковым
препаратам: флуконазолу, миконазолу, итраконазолу и нистатину [38],
флуконазолу и вориконазолу [25].
39

Методы, основанные на масс-спектрометрии, позволяют получить


результат за непродолжительное время — три часа по оценкам Постераро с
соавторами [23].
Также их несомненным достоинством является возможность
одновременного определения видовой принадлежности возбудителя и его
лекарственной устойчивости. Несмотря на это, разработка методов
определения лекарственной устойчивости микроорганизмов, основанных на
масс-спектрометрии, в частности, в отношении грибов рода Candida, ещё не
завершена [139].
Ещё одним новшеством, которое появилось сравнительно недавно,
стали методы определения чувствительности к противогрибковым
препаратам, основанные на изучении геномных последовательностей. Здесь
функциональный подход связан с изучением путей воздействия
противогрибковых препаратов на клетку и механизмов устойчивости к ним.
В настоящее время значительная часть фундаментальных разработок в этой
области относится к изучению полиморфизма генов, кодирующих белки-
мишени лекарств и трансмембранные переносчики [55].
Существует несколько механизмов, по которым грибы вырабатывают
устойчивость к действию лекарственных препаратов группы азолов. Во-
первых, это пути, связанные с индукцией мембранных переносчиков
семейств ABC (ATP-binding cassette) и MFS (Major Facilitator Superfamily). На
первой стадии развития устойчивости соответствующие транскрипционные
факторы связываются с промоторами генов этих белков, что приводит к
повышению их экспрессии, увеличении числа переносчиков в клеточной
мембране, и ускоренному выводу лекарственных веществ из цитоплазмы
клеток гриба. С увеличением времени воздействия антимикотика гены
транскрипционных факторов приобретают ряд мутаций. Аминокислотная
последовательность транскрипционных факторов меняется таким образом,
что они становятся постоянно связанными с промоторами генов мембранных
переносчиков [145]. Во-вторых, за приобретение микромицетами
40

устойчивости к воздействию азолов отвечают механизмы, ассоциированные с


ферментом CYP51. Ген CYP51 приобретает мутации. Аминокислотные
замены в цитохроме ухудшают связывание с молекулами лекарственного
препарата, активность же фермента меняется незначительно, что позволяет
грибу в присутствии молекул лекарства в цитоплазме поддерживать
приемлемую концентрацию эргостерола на мембране. Различные мутации в
гене CYP51 могут быть коррелировать с развитием устойчивости к
различным соединениям азольного ряда [146]. Также существуют изменения
в транскрипционной регуляции экспрессии гена цитохрома, по подобию тех,
которые были упомянуты для мембранных насосов. Они приводят к
увеличению количества цитохрома на мембране клеток гриба и к
повышению эффективной дозы лекарства. Интересно, что приобретение
гиперактивного аллеля транскрипционного фактора белка CYP51 связано со
снижением общей жизнеспособности и вирулентности патогена [57].
Эффекты мутаций, приводящих к изменению восприимчивости гриба к
препарату азольного ряда и выраженные в МИК, арифметически
суммируются [80]. Ещё один, менее распространённый у грибов рода
Candida механизм устойчивости связан с мутационной инактивацией
фермента Erg3: нарушение работы CYP51 не вызывает накопления
токсичного стерола [19].
Мишенью препаратов эхинокандинового ряда так же, как и азолов,
является поверхность клетки. Однако в случае с эхинокандинами это не
липидный, а полисахаридный компонент. Эхинокандины ингибируют 1,3-β-
D-глюкан-синтазу. Это приводит к нарушению структуры клеточной стенки
и лизису дрожжей и аберрантному гифальному росту у плесеней.
Устойчивость грибов рода Candida к эхинокандинам обусловливается
мутациями в гене, кодирующем элементы 1,3-β-D-глюкан-синтазного
комплекса. Эти мутации приводят к значительному повышению МПК по
сравнению с изолятами дикого типа. Мутации в гене 1,3-β-D-глюкан-синтазы
41

приводят к появлению устойчивости против всего класса эхинокандинов


одновременно [125].
В литературе нет единодушного мнения по вопросу перспективности
для клинической практики комплекса методов определения
чувствительности к антимикотикам, основанных на изучение геномных
последовательностей, хотя ряд ученых видят за ними будущее
персонифицированных подходов к антифунгальной терапии [31]. Также
следует отметить, что прямое или косвенное определение МПК не позволяет
предсказать результат лечения. А вот обнаружение некоторых мутаций в
генах, кодирующие белки-мишени воздействия антимикотических
преапаратов, позволяет это сделать. Но для успешного применения этого
подхода необходима разработка быстрых и эффективных методов
определения мутаций [142]. Их примерами могут послужить ПЦР-РВ, ПДРФ,
SPR-технология, методы ДНК-чипов и масс-спектрометрии [1, 10, 63, 84,
112].
Анализ полиморфизма рибосомальных межгенных транскрибируемых
спейсеров (ITS), последовательности локуса D1/D2 гена большой
рибосомальной субъединицы, последовательности гена бета-тубулина,
являющиеся в настоящее время «золотым стандартом» видовой диагностики
микромицетов, позволяющие изучать филогенетические отношения между
близкородственными видами, а также изучать филогению между
популяциями внутри вида и между отдельными видами, рассматривается и
как предикторы проявления резистентных качеств изолятов грибов к
антимикотической терапии.. В частности, Маккаллу с соавторами удалось
соотнести генетические варианты C. albicans, определённые методом ПДРФ,
с проявлением устойчивости к флуцитозину [104]. Аналогичные данные (по
флуцитозину, но не по флуконазолу и итраконазолу) методом
мультилокусного секвенирования-типирования для гриба того же вида
получены в работе Таванти с соавторами [131]. Для рода Aspergillus с
помощью молекулярно-филогенетических подходов описаны виды, не
42

различающиеся по морфологии, но проявляющие различную


восприимчивость к противогрибковым препаратам [19]. Эти примеры
показывают возможную перспективность изучения разнообразия геномных
последовательностей, используемых ранее для типирования, грибов рода
Candida, в частности локуса D1/D2 гена 28S рРНК, для выявления
резистентных изолятов.
Таким образом, в связи с актуальностью проблемы, выбор
оптимальных методов определения чувствительности для применения в
рутинной практике имеет решающее значение, особенно для пациентов с
внутрибольничным ИК.
43

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Объекты исследования

При проведении данного диссертационного исследования изучены 322


клинических изолята грибов рода Candida, выделенные от 284 пациентов с
внутрибольничным инвазивным кандидозом (37 стационаров,
преимущественно – отделения реанимации и интенсивной терапии 12
городов России) в течение 2011-2014гг. Большая часть культур Candida spp.
была получена в результате многоцентрового исследования
внутрибольничного кандидоза. Исследуемые изоляты Candida spp. были
выделены из образцов периферической крови, перитонеальной и
плевральной жидкостей, содержимого абсцессов внутренних тканей,
цереброспинальной жидкости (ЦСЖ), биоптатов (мочеточник, кишечник,
легкие, тромб сердца при аутопсии), желчи и пунктата суставной жидкости
при посеве на питательные среды. Возбудители ВБИК были
идентифицированы до вида с помощью тест-системы AUXACOLOR2
(BioRad,США), методом MALDI-TOF масс-спектрометрии (Bruker,
Германия), ДНК-секвенирования. Определение чувствительности к
противогрибковым препаратам исследуемых штаммов Candida spp.
проводили в соотвествии со стандартными протоколами CLSI M27-A3, CLSI
M44-A, а также с помощью автоматического анализатора Vitek2Compact
(BioMerieux).

2.2 Подготовка культур Candida spp.

Для выделения культур Candida spp. полученные образцы крови


засевали на жидкие питательные среды – бульон Сабуро, флаконы системы
посева крови Signal, (Oxoid), и анализатора гемокультур BactAlert
(BioMerieux), инкубировали при 35 – 370С до 10 суток. При выявлении
44

признаков роста ( при их отсутствии – через 10 суток) пересевали на плотную


питательную среду Сабуро в чашках Петри. Другие биосубстраты сеяли
непосредственно на агар Сабуро и в среду обогащения (бульон Сабуро).
Параллельно с посевом биосубстраты микроскопировали, отмечали наличие
дрожжевых клеток и псевдомицелия [3].
Часть изолятов Candida spp. были доставлены в лабораторию из других
медицинских центров уже в виде культур. Их пересевали на агар Сабуро с
антибиотиками для исключения бактериальной контаминации и после
получения культуры микроскопировали при увеличении х 400 для проверки
чистоты культуры. Выделенные чистые культуры Candida spp. хранили на
скошенном агаре Сабуро в пробирках при температуре 4 – 60С.
Для определения видовой принадлежности штаммов Candida spp. и их
чувствительности к противогрибковым препаратам использовали суточные
культуры гриба, выращенные на агаре Сабуро при 37 0С (в случае C. lipolityca
– при 280С) [5].

2.3 Идентификация Candida spp. методом ДНК-секвенирования

Выделение ДНК микромицетов

Для выделения ДНК использовали двухдневные культуры Candida spp.


Выделение ДНК производили по модифицированому методу Doyle и Doyle
[59]. Разрушение клеточной стенки гриба проводили с помощью
гомогенизатора Precellys со стеклянными шариками 5 мм (Sigma, США).
Фрагменты разрушенной клеточной стенки инкубировали с экстракционным
буфером SDS 1% (100 mM NaCl, 500 mM Tris, pH 8.0, 10% SDS) в течение
ночи при 650С. Далее проводили экстракцию хлороформ-изоамиловой (24:1)
смесью в течение 10 мин при 13 000 об/мин на микроцентрифуге MiniSpin
(Eppendorf). ДНК осаждали этанолом при -200С, после чего концентрировали
центрифугированием в течение 10 мин при 20 000 об/мин. Полученный
осадок дважды промывали 70% спиртом, высушивали и растворяли в буфере
45

ТЕ. Концентрацию выделенной ДНК измеряли на флуориметре Qubit


(Invitrogen, США).

Молекулярно-генетический анализ

Молекулярно-генетическая идентификация с помощью секвенирования ДНК


проводилась согласно рекомендациям СLSI ММ18-А [49]. Идентификация
основывалась на определении нуклеотидной последовательности регионов
нетранскрибируемого межгенного спейсера ITS1 и ITS2, и фрагмента D1/D2
гена, кодирующего большую рибосомальную субъединицу 28S рРНК, с
использованием праймеров ITS4 и ITS5, и NL1 и NL4, для намножения
соответствующих фрагментов генов ITS и D1/D2 [27], структура праймеров
приведена в таблице 4. Полученные фрагменты разделяли с помощью
электрофореза в 1,5% агарозном геле в трис-борат-ЭДТА буфере в
присутствии бромистого этидия и визуализировали в УФ-свете. ПЦР-
продукты очищали с помощью набора для очистки ДНК «Омникс» (Омникс,
Санкт-Петербург).

Таблица 4 – Структура праймеров, используемых для идентификации


микромицетов

Название праймера Последовательность (5` - 3`)


ITS 4 tcc-tcc-gct-tat-tga-tat-gc
ITS 5 gga-agt-aaa-agt-cgt-aac–aag-g
NL1 gca-tat-caa-taa-gcg-gag-gaa-aag
NL4 ggt-ccg-tgt-ttc-aag-acg-g

Секвенирование ДНК выполнялось по методу Сэнджера на генетическом


анализаторе ABI Prizm 3500 (Applied Biosystems, США). Реакцию проводили
с использованием набора BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit
(Applied Biosystems, США) в объеме 10 мкл согласно рекомендациям
производителя. Очистку от терминирующих аналогов нуклеотидов
осуществляли набором BigDye XTerminator Purification Kit (Applied
Biosystems, США). Секвенирование выполнялось в обоих направлениях. Все
46

несоответствия между фенотипической и молекулярно-генетической


идентификациями были проверены повторным секвенированием. Подготовку
последовательности и секвенирование образцов осуществляли по
стандартным протоколам, как описано ранее [6, 49]. Последовательности
прочитывали с обеих нитей ДНК, после удаления структур праймеров. Затем
проводили сравнение полученных последовательностей с
последовательностями, депонированными в базе данных GenBank и базе
данных Центра биоразнообразия грибов при Центральном бюро грибных
культур (Нидерланды). Поиск в базе данных GenBank осуществляли по
алгоритму megablast. Размер слова был 28 нуклеотидов для GenBank и 20 на
CBS, параметры по умолчанию. В анализ были взяты 414 нуклеотидов,
кодирующих фрагмент транскрибируемого спейсера ITS1, ген 5,8S
рибосомной РНК и фрагмент спейсера ITS2 и 416 нуклеотидов, кодирующие
регион D1/D2 гена 28S pPНК [6, 27, 49, 59, 60, 121].
Данный метод видовой идентификации возбудителей
внутрибольничного инвазивного кандидоза проводили в НИЛ молекулярно-
генетической микробиологии НИИ медицинской микологии им. П. Н.
Кашкина (зав. лабораторией Тараскина А. Е.).

2.4 Идентификация Candida spp. методом MALDI-TOF масс-


спектрометрии

В данном исследовании использовали прибор «Autoflex speed»


TOF/TOF (Bruker, Германия) с программным обеспечением MALDI Biotyper
3.1.
Из суточной культуры дрожжей выделяли белковый экстракт, содержащий, в
основном, рибосомальные белки. Анализ проводили на масс-спектрометре с
получением масс-спектро-профиля (МСП) и сравнивали МСП с базой
данных для видовой идентификации. (программный пакет MALDI Biotyper
3.1).
47

На сегодняшний момент база данных MALDI Biotyper содержит


сведения о 5627 видах микроорганизмов, в том числе о более чем 120 видах
Candida spp.
При исследовании нами клинических изолятов грибов рода Candida
spp. использовали протокол полной экстракции белка с помощью этанола
и муравьиной кислоты.
Суточную культуру исследуемого изолята Candida spp., полученную
рассевом на чашке Петри с агаром Сабуро суспендировали в 300 мкл
деионизированной воды в пробирке-эппендорфе, затем гомогенизировали
смесь с помощью вортекса (Bio-San, Латвия) в течение минимум 1
минуты. Далее, к смеси в пробирку-эппендорф добавляли 900 мкл
этанола и снова смешивали с помощью вортекса в течение минимум 1
минуты, а затем центрифугировали в течение 2 минут при 13000 об/мин
(Bio-San, Латвия). Образовавшуюся надосадочную жидкость полностью
удаляли пипеткой. На следующем этапе к оставшемуся осадку добавляли
50 мкл 70% муравьиной кислоты и смешивали с помощью вортекса
минимум в течение 1 минуты (70% муравьиную кислоту получали путем
смешения 30 мкл дистиллированной воды и 70 мкл 100% муравьиной
кислоты в чистой пробирке-эппендорф, перемешивая с помощью
вортекса). Затем, к полученной смеси добавляли 50 мкл 100%
ацетонитрила, смешивали с помощью вортекса в течение минимум 1
минуты и снова центрифугировали в течение 2 минут при 13000 об/мин. 1
мкл надосадочной жидкости наносили на 2 парные лунки 384-луночной
стальной полированной мишени, сушили при комнатной температуре (23
°С, 5 минут) и затем наносили 1 мкл раствора матрицы (α-циано-4-
гидроксикоричной кислоты) и сушили при комнатной температуре.
Подготовленную мишень помещали в масс-спектрометр.
В качестве калибранта использовали тест-стандарт белкового
экстракта E.coli. Процедуру калибровки и проверки выполняли на ячейке
планшета, содержащей образец бактериального тест-стандарта.
48

Полученный масс-спектр анализировали на основе базы данных


идентификации микроорганизмов MALDI Biotyper 3.1. Результат
учитывали по данным значения коэффициента видовой идентификации.
Использовали следующие критерии оценки результата MALDI-TOF масс-
спектрометрии: коэффициент < 2 – вид и род определены с точностью
100%; 1,8–1,99 – 100% определение рода, неуверенное определение вида;
> 1,79 – сомнительное определение рода [103, 164, 165, 167, 177, 182, 184].

2.4.1 Изучение комплекса видов Candida parapsilosis

Для определения внутривидового сходства исследуемых изолятов были


отобраны штаммы C. parapsilosis, включая устойчивые к противогрибковым
препаратам. Данные штаммы предварительно исследовали по
вышеуказанной методике MALDI-TOF масс-спектрометрии, однако, с целью
получения наиболее четких спектров, результаты фиксировали не с двух
парных лунок, а с четырех. Полученные масс-спектры штаммов C.
parapsilosis обрабатывали с помощью программного обеспечения MALDI-
TOF Biotyper 3.1 Offline Classification, используя статистический анализ
главных компонент (в приложении MATLAB). Далее с помощью метода PCA
(Principal Component Analysis – анализ главных компонент) проводили
построение дендрограммы, которая представляла собой графическое
изображение близкородственных индивидуальных спектров по отношению к
другим. Масс-спектры автоматически делились на кластеры, масс-спектры
которых обозначались одним цветом [103].
49

2.5 Видовая идентификация возбудителей внутрибольничного


инвазивного кандидоза с помощью тест-системы AUXACOLOR2

Видовую идентификацию изучаемых изолятов Candida spp. с помощью


AUXACOLOR2 проводили в соответствии в прилагаемым к тесту
руководством [30].
Помимо биохимических свойств гриба, учитывали и морфологические
характеристики: способность к пигментации, образованию артроспор,
хламидоспор, росту при 370С, наличие мицелия/псевдомицелия, капсулы.
Затем по результатам характеристик гриба формировали цифровой код и
сравнивали с таблицей кодов, прилагающихся к тест-системе AUXACOLOR2
[30, 165].

2.6 Изучение морфологических особенностей возбудителей инвазивного


кандидоза

Макроморфологические особенности исследуемых культур Candida spp.


изучали на «гигантских» колониях. Для этого готовили суспензии из
суточной культуры гриба в 5 мл. стерильного 0.85% раствора NaCl, наносили
каплю суспензии на поверхность агара Сабуро в центр чашки Петри и
инкубировали 14 суток при 370С. Фотографировали колонии с помощью
стереоскопического люминисцентного микроскопа SteREO Lumar.V12 (Carl
Zeiss, Германия).
Особенности микроморфологии клеток культур грибов рода Candida
изучали с помощью флуоресцентного микроскопа AxioImager.Z1 (Carl Zeiss,
Германия), использующего оптику Номарского. Для этого готовили
микропрепараты: на предметное стекло наносили каплю дистиллированной
воды, в которую вносили культуру исследуемого микромицета, взятую
бактериологической петлей с центральной и периферической поверхности
50

колонии, полученную суспензию накрывали покровным стеклом и изучали


особенности микроморфологии, проводили микрофотосъемку [7].

2.7 Методы определения чувствительности Candida spp. к


противогрибковым препаратам in vitro

Для 322 изолятов Candida spp. – возбудителей ВБИК была определена


чувствительность к противогрибковым препаратам по протоколам CLSI
(M27-A3, M44-A), а также на микробиологическом анализаторе Vitek2
Compact (BioMerieux).
Использованные основные термины и понятия приведены в таблице 5

Таблица 5 – Определение категорий чувствительности к противогрибковым


препаратам
Категория чувствительности штамма к
Определение
противогрибковому препарату

Чувствительная (Ч) изоляты подавляются обычно достижимыми


концентрациями антимикробных препаратов,
рекомендованной дозировкой

Умеренно-чувствительная (УЧ) изоляты могут подавляться с применение дозы


препарата, большей, чем обычно назначаемая
дозировка препарата.

Промежуточная (П) изоляты с МПК антимикробных препаратов,


данные которых не позволяют ясно
категорировать как точно «чувствительные» или
«устойчивые». Буферная зона, которая может
предотвратить небольшие, неконтролируемые,
технические факторы, вызывающие основные
расхождения в объяснениях.

Устойчивая (У) изолят обычно не подавляется концентрацией


препарата с нормальной дозировкой.
51

Минимальная подавляющая концентрация (МПК) - самая низкая


концентрация антимикробного препарата, который вызывает специфическую
остановку видимого роста в агаре или при определении чувствительности
методом разведении в жидкой питательной среде [45, 46].

2.7.1 Метод микроразведений в жидкой питательной среде – CLSI M27-


A3

В данном исследовании применяется версия протокола (2008 г.) и


критерии интерпретации результатов (2008 г. и 2012 г.).
Инокулюм готовили из 5 колоний 24-часовой культуры Candida spp. на
чашке Петри, суспендируя их в 5 мл 0,85% стерильного раствора NaCl до
соответствия стандарту мутности 0,5 McFarland (1х106 – 5х106 клеток/мл).
Рабочие суспензии далее разводили 1: 50 0,85% стерильным раствором NaCl,
затем жидкой средой RPMI 1640 - 1: 20 (1х103 -5х103 ) клеток/мл.
Для приготовления разведений субстанции противогрибковых
препаратов промышленного приготовления (Sigma, Германия) флуконазол
растворяли в стерильной воде, другие препараты (каспофунгин, позаконазол,
вориконазол) – в диметилсульфоксид (ДМСО). Далее готовили основные
растворы противогрибковых препаратов в концентрации 1280 мкг/мл. Затем,
в соответствии со схемами, указанными в стандарте, разводили рабочие
растворы противогрибковых препаратов: для вориконазола, позаконазола
диапазон концентраций устанавливали от 0,0313 до 16 мкг /мл, для
флуконазола - от 0,125 до 64 мкг /мл, для каспофунгина – от 0,015 до 8 мкг
/мл.
Выполнение микроразведений в жидких питательных средах
проводили в стерильных одноразовых, 96-луночных планшетах с U-
образными лунками. Двукратные концентрации препаратов вносили в ряды с
1 по 10 лунки планшета в объеме 100 мкл микроканальными пипетками.
Первые лунки рядов содержали самые высокие (64 или 16 мкг/мл)
52

концентрации препарата, а десятые лунки - самые низкие концентрации


препарата (0,12 или 0,03 мкг/мл). Далее в каждую лунку планшета вносили
по 100 мкл соответствующего двойного разведения суспензии инокулюма,
таким образом, получая разведения препарата и плотность инокулюма в
конечной концентрации. Лунки контроля роста содержали 100 мкл
стерильной среды, без препарата с соответствующим разведением суспензии
инокулюма. Последнюю лунку планшета использовали для контроля
стерильности (среда без препарата). В качестве контроля качества
исследования использовали тест-культуру C. parapsilosis ATCC 22019
(РКПГY-1245). Планшеты инкубировали в термостате при температуре 350С
в течении 24 часов. Учет результатов производили визуально с
использованием следующей цифровой шкалы: 0 - оптически прозрачно,1-
легкая мутность, 2- заметное снижение (~ 50%) видимого роста, 3 – слабое
подавление видимого роста, 4 – нет подавления видимого роста. Далее
сравнивали с критериями интерпретации МПК флуконазола, вориконазола и
каспофунгина (2008 г., 2012г) указаны в таблицах 6 и 7.

Таблица 6 – Критерии интерпретации CLSI M27-S3 (2008 г.)

Диапозон МПК (мкг/мл)


Умеренно-
Препарат
Чувствительные (Ч) чувствительные Усточивые (У)
(УЧ)
Флуконазол <8 16-32 > 64
Вориконазол <1 2 >4
Каспофунгин <2 - >2
53

Таблица 7 – Критерии интерпретации результатов определения


чувствительности (CLSI M27-S4, 2012 г.)

Диапозон МПК (мкг/мл)

Препарат Виды Умеренно-


Чувствительны
чувствительные Усточивые (У)
е (Ч)
(УЧ)
C.albicans <2 4 >8
C. glabrata - < 32 > 64
Флуконазол
C.krusei природно устойчив к флуконазолу
C.parapsilosis <2 4 >8
C.tropicalis <2 4 >8
C.albicans < 0,12 0,25-0,5 >1
C. glabrata - - -
Вориконазол C.krusei < 0,5 1 >2
C.parapsilosis < 0,12 0,25-0,5 >1
C.tropicalis < 0,12 0,25-0,5 >1
C.albicans < 0,25 0,5 >1
C. glabrata < 0,12 <0,25 > 0,5
C.krusei < 0,25 0,5 >1
Каспофунгин
C.parapsilosis <2 4 >8
C.guilliermondii <2 4 >8
C.tropicalis < 0,25 0,5 >1

Критерии интерпретации для позаконазола не установлены,


предположительно МПК чувствительной категории для большинства
штаммов < 1 мкг/мл [46, 47, 168, 169, 183].
54

2.7.2 Диско-диффузионный метод определения чувствительности -


CLSI M44-A

Использовали бумажные диски (производство Oxoid, Великобритания)


диаметром 6 мм, пропитанные противогрибковыми препаратами (диски с
вориконазолом содержали 1 мкг препарата, диски с флуконазолом – 25 мкг
препарата) и плотную питательную среду Мюллер-Хинтона, содержащую 2%
глюкозу и 0,5 мкг/мл красителя метиленового синего [45].
Для приготовления инокулюма использовали суточные культуры
исследуемых Candida spp. Мутность инокулюма соотвествовала 0,5
McFarland (1х106 - 5х106 клеток/мл ).
Посев инокулюма проводили не позднее, чем через 15 минут с момента
его приготовления. Стерильный хлопковый тампон несколько раз погружали
в инокулюм, затем переносили в чашку Петри со средой Мюллер-Хинтон и
растирали по всей поверхности среды, постепенно вращая тампон, для
получения роста «газоном» и полного впитывания инокулюма в среду.
Диски с флуконазолом и вориконазолом наносили стерильным пинцетом на
поверхность засеяной чашки, слегка придавливая для получения наибольшей
площади соприкосновения со средой. Инкубировали при температуре 350С
18-24 часа. Учет результатов проводили автоматически с помощью
микробиологического анализатора BIOMIC Vision (Giles Scientific, США) по
диаметру зоны задержки роста (Таблица 8). [2, 45]. В качестве контроля
качества исследования использовали тест-культуру C. parapsilosis ATCC
22019 (РКПГY-1245).

Таблица 8 – Критерии интерпретации метода М44-А

Флуконазол Вориконазол
Диаметр, МПК, Диаметр, МПК,
Категория чувствительности
мм мкг/мл мм мкг/мл

Чувствительный (Ч) > 19 <8 > 17 <1


Умеренно-чувствительный (УЧ) 15-18 16-32 14-16 2-4
Устойчивый (У) < 14 > 64 < 13 >6
55

Определение чувствительности по стандарту CLSI M44-A было


проведено в НИЛ микологического мониторинга и биологии грибов НИИ
медицинской микологии им.П.Н.Кашкина (Зав. лабораторией Богомолова
Т.С., исполнитель - н.с. Выборнова И.В.)

2.7.3 Определение чувствительности с помощью микробиологического


анализатора Vitek 2 Compact

Использовали автоматический анализатор Vitek 2 Compact (bioMerieux).


В качестве расходного материала использовали пластиковые карты AST-
YS01 (bioMerieux), содержащие в запаянных лунках серийные разведения
противогрибковых препаратов ( флуконазол, вориконазол, амфотерицин В, 5-
флуцитозин) [49,76].
Осуществление методики проводили в соотвествии с рекомендациями
производителя. Из суточной культуры Candida spp. готовили суспензию в 3
мл 0,85% раствора NaCl в специальной пластиковой пробирке, затем
пробирку вместе с картой AST-YS01 помещели в ячейки кассеты Vitek 2
Compact и устанавливали в прибор. Время определения чувствительности
дрожжей к противогрибковым препаратам составляло 18-35 часов.
Полученный результат автоматически выдавался после завершения
определения чувствительности. Анализ данных проводили в соотвествии со
стандартами интерпретации МПК CLSI M27-А3 S4 (2012).

2.8 Статистическая обработка результатов

Результаты исследования обрабатывали с помощью программы


STATISTICA for Windows версия 6.0. Использовали непараметрические и
параметрические методы. Критерием статистической достоверности
получаемых данных считали общепринятую в медицине величину р<0.05
[12].
56

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 3 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИДОВОГО СПЕКТРА КЛИНИЧЕСКИХ


ИЗОЛЯТОВ CANDIDA SPP.

3.1 Источники выделения возбудителей инвазивного кандидоза

В период с 2011 по 2014 гг. исследовали биосубстраты от 284


пациентов с внутрибольничным инвазивным кандидозом (из 37 стационаров,
в 12 городах России). Образцы периферической крови, перитонеальной и
плевральной жидкостей, содержимого абсцессов внутренних тканей,
цереброспинальной жидкости (ЦСЖ), биоптатов (мочеточник, кишечник,
легкие, тромб сердца при аутопсии), желчи и пунктата суставной жидкости
на питательные среды высевали наагар Сабуро. Было выделено 322 изолята
грибов рода Candida (рисунок 5). Биосубстраты были получены,
преимущественно, в результате многоцентрового исследования из отделений
реанимации и интенсивной терапии.

6 6 5 4 1
8
24
268

периферическая кровь перитонеальная жидкость содержимое абсцесса


ЦСЖ плевральная жидкость биоптат
желчь пунктат коленного сустава

Рисунок 5 – Виды биоматериалов, из которых выделены возбудители ИК


(n=322).
57

В большинстве случаев (83,2%) возбудители внутрибольничного


инвазивного кандидоза выделены из крови (рисунок 7).
Видовую идентификацию клинических изолятов Candida spp. осуществляли
с помощью различных методов (ДНК-секвенирования, MALDI-TOF масс-
спектрометрии, тест-системы AUXACOLOR2).

3.2 Сравнение результатов видовой идентификации Candida spp.


методами ДНК-секвенирования и MALDI-TOF масс-спектрометрии

Определили видовую принадлежность 97 штаммов грибов из рода


Candida референтным методом - ДНК-секвенированием, в соответствии с
международным протоколом CLSI MM18-A (рисунок 6) и методом MALDI-
TOF масс-спектрометрии (рисунок 7).

7.2 11 1 1

11.4 50.5

12.5

14.3
C. albicans C. parapsilosis C. tropicalis
C. glabrata C. krusei C. bracarensis
C. lipolytica C. lusitaniae C. kefyr

Рисунок 6 – Спектр грибов рода Candida, идентифицированных методом


ДНК-секвенирования (n=97).
По результатам исследования 97 штаммов методом ДНК-
секвенирования было определено 9 видов Candida, среди которых C. albicans
- 50,5%, другие виды Candida - 49,5% (C. parapsilosis - 14,4%, C. tropicalis –
58

12,4%, C. glabrata - 11,4%, C. krusei - 7,3%, C. lipolytica,C. lusitanie, C.


bracarensis, C. kefyr - по 1,0 %).
По результатам видовой идентификации методом MALDI-TOF масс-
спектрометрии 97 изолятов Candida spp. также определены 9 видов Candida
(рисунок 9), среди которых 50,5% штаммов составляли C. albicans и 49,5 %
составляли C. не - albicans виды (C. parapsilosis - 14,4%, C. tropicalis – 12,4%,
C. glabrata – 11,4%, C. krusei - 7,3%; C. lipolytica, C. lusitanie, C. bracarensis и
C. kefyr - по 1,0%).

7.2 11 1 1

11.4 50.5

12.5

14.3
C. albicans C. parapsilosis C. tropicalis
C. glabrata C. krusei C. bracarensis
C. lipolytica C. lusitaniae C. kefyr

Рисунок 7 – Видовой спектр Candida spp., определенный методом MALDI-


TOF масс-спектрометрии (n=97).
При сравнении результатов, полученных методом MALDI-TOF масс-
спектрометрии и ДНК-секвенирования обнаружено совпадение в 100%
случаев (таблица 9).
59

Таблица 9 – Результаты идентификации видов Candida spp. с помощью


методов ДНК-секвенирования и MALDI-TOF масс-спектрометрии (n=97)
MALDI-TOF масс-спектрометрия
ДНК-секвенирование n
Верная ИД Неверная ИД
C. albicans 49 49 0
C. parapsilosis 14 14 0
C. tropicalis 12 12 0
C. glabrata 11 11 0
C. krusei 7 7 0
C. lipolytica 1 1 0
C. lusitanie 1 1 0
C. bracarensis 1 1 0
C. kefyr 1 1 0
Всего 97 97 0
Примечание. ИД - идентификация
Так как ДНК-секвенирование является дорогим, трудоемким,
продолжительным по времени методом, требующим специально обученного
персонала, в настоящее время его неприменяют в большинстве
микробиологических лабораторий.
Учитывая сопоставимость результатов двух методов, в качестве
альтернативного мы применили метод быстрой и точной диагностики –
MALDI-TOF масс-спектрометрии. В дальнейшем исследовании мы сравнили
результаты видовой идентификации возбудителей ИК, полученных методами
MALDI-TOF масс-спектрометрии и биохимической тест-системой
AUXACOLOR2.

3.3 Сравнение результатов видовой идентификации штаммов


Candida spp. методами MALDI-TOF масс-спектрометрии и тест-системой
AUXACOLOR 2

Всего изучено 322 штамма Candida spp., выделенные от больных с ИК.


По результатам видовой идентификации методом MALDI-TOF масс-
спектрометрии выявлено, что исследуемые штаммы принадлежали к 14
60

видам грибов рода Candida: C. albicans – 139 (43,2%), C. parapsilosis – 65


(20,2%), C. glabrata – 37 (11,5%), C. tropicalis – 31 (9,6%), C. krusei – 20
(6,2%), C. guilliermondii – 17 (5,3%), C. lusitaniae – 4 (1,3%), C. pararugosa – 2
(0,6%), C. dubliniensis – 2 (0,6%), C. inconspicua – 1 (0,3%), C. bracarensis
– 1 (0,3%), C. utilis- 1 (0,3%), C. kefyr – 1 (0,3%), C. lipolytica – 1 (0,3%).
Таким образом, методом MALDI-TOF масс-спектрометрии, определено, что
43,2% клинических изолятов принадлежат к C. albicans, и 56,8% являются
представителями C. не-albicans видов, а среди часто встречающихся
штаммов C. не-albicans видов, выявлены также и более редкие виды - C. utilis,
C. pararugosa и C. inconspicua (рисунок 8).
0.3 0.3
0.6
0.6 0.3
1.3 0.3
5.3 0.3 43.2
6.2

9.6

11.5

20.2

C. albicans C. parapsilosis C. glabrata


C. tropicalis C. krusei C. guilliermondii
C. lusitaniae C. pararugosa C. dubliniensis
C. inconspicua C. bracarensis C. utilis
C. kefyr C. lipolytica

Рисунок 8 – Видовой спектр Candida spp., определенный методом MALDI-


TOF масс-спектрометрией (n=322).
С помощью тест-системы AUXACOLOR2 среди 322 исследуемых
штаммов - возбудителей ИК идентифицировали 11 видов грибов рода
Candida: C. albicans – 134 (41,6%), C. parapsilosis - 65 (20,2%), C. glabrata –
61

35 (10,9%), C.tropicalis –29 (9,0%), C.krusei –20 (6,2%), C.guilliermondii –16


(5,0%), C. dubliniensis –13 штаммов (4,0%), C.lusitaniae –3 штамма (0,9%),
C.rugosa –2 (0,6%), C.kefyr –1 (0,3%), C.lipolytica – 1 (0,3%). Для двух
штаммов видовая принадлежность неопределена (0,6%).

0.9 0.6 0.3


6.2 5 4 0.3
9
0.6
10.9
41.6

20.2

C. albicans C. parapsilosis C. glabrata C. tropicalis


C. krusei C. guilliermondii C. dubliniensis C. lusitaniae
C. rugosa C. kefyr C. lipolytica Candida spp.

Рисунок 9 – Видовая идентификация Candida spp. с помощью тест-системы


AUXACOLOR 2 (n=322).
При сравнении полученных результатов видовой идентификации 322
штаммов совпадение составило 93,2%, (таблица 10 и 11), у C. albicans (139)
доля неверной идентификации была - 7,9%, среди C.не- albicans видов - 6,0%.

Таблица 10 – Сравнение результатов идентификации возбудителей ИК тест-


системой AUXACOLOR2

MALDI-TOF MС AUXACOLOR 2
Верная ИД Неверная ИД
C. albicans (139) 128 11
C. parapsilosis (65) 64 1
C. glabrata (37) 35 2
C. tropicalis (31) 29 2
C. krusei (21) 20 1
C. guilliermondii (17) 16 1
62

Продолжение таблицы 10

MALDI-TOF MС AUXACOLOR 2
Верная ИД Неверная ИД
C. lusitanie (4) 3 1
C. pararugosa 2 0 2
C. bracarensis (1) 0 1
C. dubliniensis 2 2 0
C. lipolytica (1) 1 0
C. kefyr (1) 1 0
C. inconspicua (1) 0 1
C. utilis (1) 0 1
Всего (322) (%) 300 (93,2%) 22 (6,8%)

Таблица 11 – Причины расхожения результатов видовой идентификации

MALDI-TOF MС AUXACOLOR 2 Причины


C. parapsilosis (1) C. guilliermondii (1) AUX: ассимиляция в лунке в
целлобиозой
C. bracarensis (1) C. glabrata (1) Идентифицируется только молекуляр-
но – генетическими методами
C. tropicalis (2) C. albicans (2) AUX: ошибка тест-системы
C. pararugosa (2) C. rugosa (2) Идентифицируется только молекуляр-
но – генетическими методами
C. krusei (1) C. albicans (1) AUX: ошибка тест
C. glabrata (1) C. guilliermondii (1) AUX: ошибка тест
C. inconspicua (1) Candida spp. (1) Идентифицируется только молекуляр-
но – генетическими методами
C. utilis (1) Candida spp. (1) Идентифицируется только
молекулярно- генетическими методами
C. albicans (11) (11) C. dubliniensis AUX: ошибка тест-системы

При сравнении полученных данных с использованием тест-системы


AUXACOLOR 2 и метода MALDI-TOF масс-спектрометрии достоверных
различий между ними выявлено не было (рисунок 10). Вследствии выхода
тест-системы AUXACOLOR 2 за пределы допустимой ошибки, для видовой
идентификации, особенно, C.не- albicans видов лучше использовать метод
MALDI-TOF масс-спектрометрии, в связи с тем, что именно среди этих видов
постоянно появляются штаммы со сниженной чувствительностью к
противогрибковым препаратам.
63

Рисунок 10 – Сравнение данных полученных методами MALDI-TOF масс-


спектрометрии и AUXACOLOR 2

Таким образом, можно заключить, что использование современных


методов видовой идентификации (ДНК-секвенирование и MALDI-TOF масс-
спектрометрия) помогает точнее установить этиологию внутрибольничного
инвазивного кандидоза в России (рисунок 11): 43,2% C. albicans и другие
виды Candida spp. - 56.8%.
0.3 0.3
0.6
0.6 0.3
1.3 0.3
5.3 0.3 43.2
6.2

9.6

11.5

20.2

C. albicans C. parapsilosis C. glabrata


C. tropicalis C. krusei C. guilliermondii
C. lusitaniae C. pararugosa C. dubliniensis
C. inconspicua C. bracarensis C. utilis
C. kefyr C. lipolytica

Рисунок 11 – Cпектр возбудителей внутрибольничного ИК в РФ (n=322)


64

Также был рассмотрен спектр Candida spp. в различных биосубстратах


(рисунки 12 и 13)

45

40
38.8

35

30

25 22.3
%
20

15 11.6 11.2
10
6 5.2
5 1.5 0.7 0.7 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
0
i

sis
sis

ae

a
ns

ica
lis

s is
s
ta

a
ei

r
di

ili

cu
fy
os
gu krus
ra
ca

ni
ca

ien
on
ilo

en
ut

lyt
ke

pi
ug
ab

a
bi

pi

rm

ar
ps

in

o
sit

C.

ns
C.
r
al

lip
gl

tro

C.

ra

ac
ra

bl
ie

co
lu
C.

pa

du
C.

ill
pa

br
C.
in
C.

C.

C.

C.

C.
C.

C.
C.

Рисунок 12 – Спектр Candida spp., выделенных их крови.


Следует отметить, что в крови в качестве возбудителя ИК, преимущественно
изолировали C. не-albicans виды – 61,2%, в том числе C. krusei (природно
устойчивый к флуконазолу вид) – 6%, а также редкие виды (4,9%). В других
биосубстратах (перитонеальная и плевральная жидкости, желчь, ЦСЖ)
доминировали C. albicans, в биоптатах с одинаковой частотой выделяли C.
albicans и C. glabrata.
Таким образом, анализируя данные видового спектра Candida spp.,
было обнаружено, что среди 268 штаммов, выделенных из крови
преобладали C. не-albicans виды (р=0,008), а среди 54 штаммов, выделенных
из других биосубстратов - C. albicans (р=0,013).
65

Перитонеальная жидкость (n=24)


80 75
70
60
50
%
40
30
20
8.3 8.3
10 4.2 4.2
0
C. albicans C. glabrata C. krusei C. C. tropicalis
parapsilosis

Биоптаты (n=5) Плевральная жидкость (n=6)


45 60
40 40
40 50
50
35
30 40
% 33.3
25
20 % 30
20
15 20 16.7
10
5
10
0 0
C. albicans C. glabrata C. krusei C. albicans C. C. parapsilosis
guilliermondii

ЦСЖ (n=6)
Желчь (n=4)
90 83.3
80 75
80
70
70
60
60
% 50
50
40 %
40
30 25
30
20
20 16.7
10
10
0
0
C. albicans C. glabrata
C. albicans C. guilliermondii
66

Содержимое абсцессов (n=8)

40 37.5
35
30 25 25
25
% 20
15 12.5
10
5
0
C. parapsilosis C. albicans C. glabrata C. krusei

Рисунок 13 – Видовой спектр Candida spp., выделенный из других в норме


стерильных биосубстратах.

3.4 Видовой спектр возбудителей ВБИК в течение 2012-2014 гг.

Мониторинг видового спектра возбудителей ИК необходим для


своевременного обнаружения его изменения. Мы проанализировали видовой
спектр возбудителей ВБИК, выделенных нами в период исследования в 2012,
2013 и 2014 годах.
В 2012 году нами изучен 61 изолят Candida spp.и было отмечено, что в
данной группе преобладали C. albicans - 54 %, C. не-albicans составляет 46 %
(рисунок 14).

100

80

60 54
%
46%
40

20 16.4
9.8 8.2 8.2
1.7 1.7
0
C. albicans C. glabrata C. C. krusei C. tropicalis C. C. lipolytica
parapsilosis bracarensis
Рисунок 14 – Этиология ВБИК в 2012 гг (n=61)
67

Среди изученных в 2013 году 198 штаммов Candida spp., доля C. albicans
составила 43,4 %, а C. не-albicans виды -56,6% (рисунок 15)
100
90
80
70
60
% 50 43.4
56.6%
40
30
20.2
20
10.6 10.1 6.1 5.6
10 1.5 1 1 0.5
0

sis
sis

e
s

is

s
a

sa
ei

di

ili
n

ia
t
al

us
ra
ca

go

ien
on
o

ut
an
ic
sil

kr
ab
bi

rm

ru

in
p

sit

C.
p
al

gl
tro

C.

ra
ra

bl
ie

lu
C.

pa

du
C.

ill
pa

C.

C.
gu

C.

C.
C.

C.

Рисунок 15 – Этиология ВБИК в 2013 г (n=198).


В 2014 году, среди возбудителей ВБИК (61 штамм), мы обнаружили, что
доля штаммов C. albicans составила 32,8%, а C. не-albicans - 67,2% (рисунок
16).

100
90
80
70
60
% 50 67.2%
40 32.8
27.9
30
20 13.2
9.8 8.2
10 3.3 1.6 1.6 1.6
0
i
sis

ae

a
s

lis
a

ei

r
di
n

icu
t

fy
us
ra
ca

ni
ca
on
ilo

ke
kr

sp
ab

a
bi

pi
rm
ps

sit

C.
al

n
gl

tro

C.
ra

ie

co
lu
C.

C.

ill
pa

in
C.

C.
gu
C.

C.
C.

Рисунок 16 – Этиология ВБИК в 2014 г (n=61).


Таким образом, видовой спектр возбудителей внутрибольничного ИК в
течение 2012, 2013, 2014 гг. изменился: во-первых, уровень C. albicans
68

снизился с 54% (2012г.) до 32,8% (2014 г.) (р=0,01) (рисунок 17); во-вторых,
заметно возрос уровень C.не-albicans видов с 46% (2012г.) до 67,2% (2014
г.,р=0,001) (рисунок 17). При этом вырос также уровень C. parapsilosis: с
9,8 % (2012г.) до 27,8% (2014г., р=0,01) (рисунок 17). Доли часто
встречающихся видов C. glabrata (16,4% и 13,2%), C. tropicalis (10,6% и
8,2%) и C. krusei (8,2% и 6,1%) существенно не изменились (рисунок 17).
Также были выявлены редкие виды возбудителей ВБИК (рисунок 17).

60 18
54 16.4
16
50 43.4 13.2
14
40 10.6
32.8 12
10.1
% 30 10
8.2
8.2 8.2
% 8
20 6.1
6
10 3.2
4
0 2

2012 2013 2014 0


2012 2013 2014
C. albicans
C. glabrata C. tropicalis C. krusei

80 30
27.8
70
67.2
25
60 56.6
20.2
50 46 20

% 40 %
15
30 9.8
20 10

10 5
0
2012 2013 2014 0
2012 2013 2014
C. не - albicans
C. parapsilosis

Рисунок 17 – Видовой спектр возбудителей ВБИК в течение (2012-2014 гг.).


69

3.5 Географические особенности этиологии инвазвиного кандидоза

Исследуемые штаммы грибов рода Candida были выделены от пациентов из


стационарах 12 городов 6 федеральных округов (ФО) РФ: Южного (Ростов-
на-Дону, Краснодар), Центрального (Москва), Северо-Западного (Санкт-
Петербург, Петрозаводск),Приволжского (Пермь, Нижний Новгород, Казань),
Уральского (Тюмень, Сургут), Сибирского (Иркутск, Омск) (рисунок 18).

127

53
38

32
60

12

Рисунок 18 – Географическое распределение исследуемых штаммов Candida


spp (n=322).
При изучении видового спектра возбудителей ИК в федеральных
округах установлены географические особенности. Так в Сибирском и
Уральском (рисунок 19) федеральных округах доля C. albicans в структуре
возбудителей ИК была достоверно выше, чем в Северо-Западном и Южным
федеральных округах, р < 0.05.
70

100% 2.7 0.8 1.6


2.7 7.5 3.1 0.8 0.8
8.4 5
2.7 6.3 11.8
90% 2.7
8.3 3.1
15.1 9.3
80% 8.3 15.7 8.7 26.7
3.1
6.3 8.7
70%
15.7 7.8
30.2 12.5
60%
16.7

50% 9.4
23.6
15
40%
75
30% 57.8
47.2 46.9
20%
37 35
10%

0%
Сибирский ФО* Уральский ФО* Центральный ФО Приволжский ФО Северо-Западный Южный ФО (60)
(12) (38) (53) (32) ФО (127)
C. albicans C. parapsilosis C. glabrata C. tropicalis C. krusei
C. guilliermondii C. lusitaniae C. dubliniensis C. pararugosa C. utilis
C. inconspicua C. lipolytica С. bracarensis C. kefyr

Рисунок 19 – Распределение видов Candida spp. – возбудителей ИК в


федеральных округах РФ. *– р <0.05 в сравнении с Северо-Западным и
Южным ФО.
При анализе видового распределения штаммов в различных городах РФ
было выявлено, что между крупными городами (Санкт-Петербург и Москва)
достоверных различий в видовом спектре нет (р=0,2), тогда как существуют
видовые различия между долями C. albicans в структуре возбудителей ИК в
Иркутске и Ростове на Дону, достоверно (р=0,0009) выявлено преобладание
C. albicans в Иркутске. Помимо городов, указанных на рисунке 20 также
были выделены единичные штаммы из следующих городов: Омск – C.
tropicalis (1), Петрозаводск
* - *C.guilliermondii (1), Нижний Новгород – C.
parapsilosis (1), Казань – 3 штамма: C. tropicalis, C. parapsilosis, C.lusitaniae ,
Сургут – 4 штамма: C. albicans (2), C. krusei (1), C. inconspicua (1)
71

100% 3 3.5 0.8 0.8 2.3


6.2 7.5 0.8
9.1 3 4.5
7.1 11.2
6.2
9.1 3.6
17.6 3.6 15.1
12.5 8.7
80% 3.6
3.6 34.1
8.7
12.5 17.6 17.8 7.9
30.2
60%
3.6
23.8 18.2

40% 81.8

62.6 15.9
58.8
53.6
47.2
20% 37.3
25

0%
Иркутск** Краснодар Тюмень (34) Пермь (28) Москва (53) Санкт- Ростов-на -
(11) (16) Петербург Дону** (44)
(126)
C. albicans C. parapsilosis C. glabrata C. tropicalis C. krusei
C. guilliermondii C. lusitaniae C. dubliniensis C. pararugosa C. utilis
C. lipolytica С. bracarensis C. kefyr

Рисунок 20 – Спектр видов Candida spp. в различных городах РФ ** – р <0.05


в сравнении с Санкт-Петербургом и Москвой.
После установления видовой принадлежности каждого штамма Candida spp.
было проведено описание обнаруженных видов, включая редкие.

3.6 Морфологические особенности возбудителей инвазивного кандидоза

Были изучены морфологические особенности представителей 14


исследуемых видов Candida spp. – возбудителей инвазивного кандидоза.

C. albicans (Berkhout, 1923).


Макроморфология культур. Через 14 суток после посева на агар Сабуро
получен рост гриба в виде гигантской колонии диаметром 5 см. Окраска
колони кремовая, консистенция мягкая, поверхность гладкая, блестящая по
72

краям, центр колонии имеет складчатую текстуру, край колонии ровный


(рисунок 21а).
Микроморфология. При микроскопии обнаружены почкующиеся
дрожжевые клетки, округлые или слегка эллипсовидной формы размером
3,0-6,5 х 3,5-12,5 мкм (рисунок 21б).
C. dubliniensis (D.J. Sullivan, Western., K.A. Haynes, Dés.E. Benn. & D.C.
Coleman, 1995).
Макроморфология культур. На агаре Сабуро через 14 суток получен рост
гриба в виде гигантской колонии диаметром 4,5см. Окраска колонии белая,
блестящая, консистенция мягкая, поверхность бугристая, край колонии
неровный (рисунок 21в).
Микроморфология. При микроскопии обнаружены одиночные
почкующиеся дрожжевые клетки округлые и овальной формы размером 2,0-
7,0 х 3,0 - 8,5 мкм (рисунок 21г).

Рисунок 21 – Морфология культур C. albicans (изолят Дж-4) и C. dubliniensis


(Пер-18): а – гигантская колония C. albicans, б – микроскопия культуры C.
albicans; в – гигантская колония C. dubliniensis, г – микроскопия культуры C.
dubliniensis; ДК – дрожжевые клетки
73

C. glabrata S.A. Mey. & Yarrow, 1978.


Макроморфология культур. Гигантская колония на агаре Сабуро через 14
суток после посева имеет диаметр 5 см. Окраска колонии песочно-кремовая,
консистенция мягкая, поверхность гладкая, блестящая, в центре слегка
вдавленная, край колонии слегка волнистый (рисунок 22а).
Микроморфология. При микроскопии обнаружены одиночные дрожжевые
клетки эллипсовидной формы размером 2,0 х 3,5 мкм (рисунок 22б).
C. bracarensis A. Correia, P. Samp., S.A. James & C. Pais, 2006.
Макроморфология культур. Через 14 суток после посева на агаре Сабуро
получен рост гриба в виде гигантской колонии диаметром 3,5 х 3,0см.
Окраска колонии молочно-желтого цвета, консистенция мягкая, центральная
часть слегка тонко-бугристая, блестящая, край колонии слегка зубчатый
(рисунок 22в).
Микроморфология. При микроскопии обнаружены одиночные дрожжевые
клетки слегка округлой и эллипсовидной формы размером 3,0 - 3,5 х 4,0-
4,5мкм (рисунок 22г).

Рисунок 22 – Морфология культур C. glabrata (изолят М-3) и C. bracarensis


(изолят Дж-1): а – гигантская колония C. glabrata, б – микроскопия культуры
C. glabrata; в – гигантская колония C. bracarensis, г – микроскопия культуры
C. bracarensis; ДК – дрожжевые клетки
74

C. guilliermondii Langeron & Guerra, 1938.


Макроморфология культур. На агаре Сабуро через 14 суток после посева
получен рост гриба в виде гигантской колонии диаметром 5 см. Окраска
колонии песочно-кремовая, консистенция мягкая, поверхность гладкая,
блестящая, в центре слегка бугристая, край колонии слегка волнистый
(рисунок 23а).
Микроморфология. При микроскопии обнаружены одиночные дрожжевые
клетки округлые и слегка эллипсовидной формы размером 2,5-5,0 х 3,0-5,5
мкм (рисунок 23б).

Рисунок 23 – Морфология культуры C. guilliermondii (изолят Рос-18): а –


гигантская колония C. guilliermondii, б – микроскопия культуры C.
guilliermondii; ДК – дрожжевые клетки

C. inconspicua Lodder & Kreger-van Rij, S.A. Mey. & Yarrow, 1978.
Макроморфология культур. Гигантская колония через 14 суток после
посева на агар Сабуро имеет диаметр 4,5x3,5см. Окраска колонии молочная,
консистенция мягкая, поверхность гладкая, тусклая, в центре слегка плоская
приподнята. Край колонии выемчатый (рисунок 24 а).
Микроморфология. При микроскопии обнаружены одиночные дрожжевые
клетки эллипсовидной формы, размером 1,5 – 3,0 х 3,0-5,0 мкм (рисунок 24б).
75

Рисунок 24 – Морфология культуры C. inconspicua (изолят Пер-27): а –


гигантская колония C. inconspicua, б – микроскопия культуры C. inconspicua;
ДК – дрожжевые клетки

C. kefyr Uden & H.R. Buckley, S.A. Mey & Ahearn, 1983.
Макроморфология культур. C. kefyr через 14 суток после посева на агар
Сабуро формирует гигантские колонии диаметром 4,5 см. Окраска колонии
кремовая, консистенция мягкая, поверхность гладкая, слегка приподнятая.
Центр колонии мелко-зернистый; край – слегка волнистый, фестончатый
(рисунок 25 а).
Микроморфология. При микроскопии обнаружены одиночные дрожжевые
клетки округлой и овальной формы размером 3,1 – 4,8 х 4,6 – 9,0 мкм
(рисунок 25 б)

Рисунок 25 – Морфология культуры C. kefyr (изолят К.): а – гигантская


колония C. kefyr, б – микроскопия культуры C. kefyr; ДК – дрожжевые клетки
76

C. krusei Berkhout, 1923.


Макроморфология культур. На агаре Сабуро через 14 суток получен рост
гриба в виде гигантской колонии диаметром 4,5 x 3,5см. Окраска колонии
кремовая, консистенция мягкая, поверхность тусклая, шероховатая, край
колонии – слегка выемчатый (рисунок 26а).
Микроморфология. При микроскопии обнаружены одиночные дрожжевые
клетки эллипсовидной формы размером 2,0 – 5,0 х 4,2 – 11,0 мкм (рисунок
26б).

Рисунок 26 – Морфология культуры C.krusei (изолят М-10): а – гигантская


колония C.krusei, б – микроскопия культуры C.krusei; ДК – дрожжевые
клетки

C. lipolytica F.C. Harrison, Diddens & Lodder, 1942.


Макроморфология культур. C. lipolytica через 14 суток после посева на
агаре Сабуро образует гигантскую колонию диаметром 4,5 см. Окраска
колонии кремовая, консистенция мягкая, поверхность мелкоскладчатая,
слегка приподнятая. Центральная часть колонии складчатой текстуры
(рисунок 27а); край – слегка волнистый, фестончатый.
Микроморфология. При микроскопии обнаружены удлиненные и овальной
формы дрожжевые клетки размером 3,1-4,8 х 3,6-8,0 мкм (рисунок 27б)
77

Рисунок 27 – Морфология культуры C. lipolytica (изолят 39): а – гигантская


колония C. lipolytica, б – микроскопия культуры C. lipolytica; ДК –
дрожжевые клетки, ПК – почкующиеся клетки

C. lusitaniae Uden & Carmo Souza, 1959.


Макроморфология культур. На агаре Сабуро C. lusitaniae через 14 суток
после посева получен рост гриба в виде гигантской колонии диаметром 5,0
см. Окраска колонии кремовая, блестящая консистенция мягкая, поверхность
по краю крупно-дольчатая, слегка приподнятая, в центре колонии – мелко-
складчатостая (рисунок 28а).
Микроморфология. При микроскопии обнаружены одиночные дрожжевые
клетки округлой и овальной формы размером 2,0 – 5,0 х 3,0 – 7,0 мкм
(рисунок 28б).

Рисунок 28 – Морфология культуры C. lusitaniae (изолят Пер-25): а –


гигантская колония C. lusitaniae, б – микроскопия культуры C. lusitaniae; ДК
– дрожжевые клетки
78

C. parapsilosis Langeron & Talice 1932.


Макроморфология культур. Через 14 суток после посева на агар Сабуро
получен рост гриба в виде гигантской колонии диаметром 4,8 х 5,0 см.
Окраска колонии кремовая, блестящая, консистенция мягкая, поверхность –
мелкозернистая, край в виде валика, мелко-фестончатый (рисунок 29а).
Микроморфология. При микроскопии обнаружены одиночные дрожжевые
клетки округлой, эллипсовидные, овальной формы размером 3,1–4,8 х 4,0-9,0
мкм (рисунок 29б)

Рисунок 29 – Морфология культуры C. parapsilosis (изолят Дж-2): а –


гигантская колония C. parapsilosis, б – микроскопия культуры C. parapsilosis;
ДК – дрожжевые клетки

C. pararugosa Nakase, Komag. & Fukaz, 1978.


Макроморфология культур. На агаре Сабуро через 14 суток после посева
гигантская колония имеет диаметр 4,0х3,0 см. Окраска колонии молочная,
консистенция мягкая, поверхность – мелко-зернистая, слегка блестящая,
приподнятая. Край колонии мелко-складчатый (рисунок 30а).
Микроморфология. При микроскопии обнаружены скопления клеток
округлой и овальной формы клетки, размером 6,0 – 12,0 х 2,0 – 3,5 мкм
(рисунок 30 б).
79

Рисунок 30 – Морфология культуры C. pararugosa (изолят Пер-7): а –


гигантская колония C. pararugosa, б – микроскопия культуры C. pararugosa;
ДК – дрожжевые клетки

C. tropicalis Berkhout, 1923.


Макроморфология культур. Колония диаметром 4,5 см получена через 14
суток после посева на агар Сабуро. Окраска колонии кремовая, слегка
блестящая, консистенция мягкая, центр колонии имеет мелкозернистую
текстуру, край колонии равномерно (рисунок 31а).
Микроморфология. При микроскопии обнаружены скопления дрожжевых
клеток округлой и овальной формы размером 4,0-6,0 х 5,2-8,8мкм (рисунок
31б).

Рисунок 31 – Морфология культуры C. tropicalis (изолят Ом-1): а –гигантская


колония C. tropicalis, б – микроскопия культуры C. tropicalis; ДК–дрожжевые
клетки
80

C. utilis Lodder & Kreger-van Rij, 1952.


Макроморфология культур. Через 14 суток после посева на агар Сабуро
получен рост гриба в виде гигантской колонии диаметром 4,5 см. Окраска
колонии молочная, консистенция мягкая, поверхность – гладкая, слегка
блестящая, приподнятая. Край колонии мелко-складчатый (рисунок 32а).
Микроморфология. При микроскопии обнаружены скопления дрожжевых
клеток округлой и овальной формы размером 7,0 – 10,0 х 2,0 – 3,0 мкм
(рисунок 32б).

Рисунок 32 – Морфология культуры C. utilis (изолят Пер-27): а –гигантская


колония C. utilis, б – микроскопия культуры C. utilis ; ДК–дрожжевые клетки

В результате изучения морфологических особенностей представителей


14 видов грибов рода Candida обнаружено, что клетки C. albicans и
близкородственного ей вида C. dubliniensis при микроскопическом
исследовании практически не отличались друг от друга, равно как и клетки C.
glabrata и криптического вида – C. bracarensis. Было замечено значительное
сходство культур C. pararugosa и C. utilis, а также C. krusei и C. inconspicua
по макро- и микроморфологическим признакам. Стоит отметить, что
дрожжевые клетки редких видов, таких как C. bracarensis, C. pararugosa, C.
utilis, C. inconspicua достаточно мелкие при микроскопии, в сравнении с
другими видами Candida.
81

Таким образом, выявлено, что у некоторых видов Candida существует


сходство между собой как по внешнему виду колоний, так и дрожжевых
клеток, что затрудняет их дифференцировку. Особенно важно, что подобные
совпадения обнаружены между часто встречающимися и редкими видами.

3.7 Протеомное профилирование возбудителей инвазивного кандидоза

В связи с установленной тенденцией к увеличению встречаемости комплекса


видов C. parapsilosis среди C. не-albicans видов, нами был изучен состав
этого комплекса с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии (рисунок 33).
Показатель отличия

Рисунок 33 – Дендрограмма белковых масс-спектров штаммов C. parapsilosis


(n=65). №№ 1–5 –номера субкластеров
Проведенным иерархическим кластерным анализом основных масс-
спектропрофилей комплекса C. parapsilosis выявлено, что все исследуемые
штаммы комплекса принадлежали только к виду C. parapsilosis. Изолятов C.
82

orthopsilosis, C. metapsilosis в России не обнаружено. Все полученные масс-


спектры были распределены по 5 субкластерам сообразно их родству между
собой. Дальнейшее, более подробное, деление также происходило по
принципу родства. Были обнаружены близкородственные масс-спектры у
некоторых изолятов, которые были выделены в одних и тех же городах, в
одних и тех же стационарах, в один промежуток времени, но от разных
пациентов (изоляты №№ 29, 30, 31 – г. Москва , №№ 14, 15 – г. Тюмень, №№
24, 42 – г. Санкт-Петербург). Также выявлено, что изоляты №№ 21 и 39,
устойчивые к флуконазолу, располагались в субкластере № 2, а изоляты №№
24 и 41 находились в субкластере №3 и обладали устойчивостью и к
вориконазолу (изолят №41).
В качестве дополнения базы данных масс-спектропрофилей Bruker 3.1
для улучшения идентификации редких видов Candida нами были добавлены
их масс-спектры (рисунок 34).

а б

в г

Рисунок 34 – Масс-спектро профили редких возбудителей ИК: а – С. utilis, б -


C. lusitaniae, в – C. kefyr, г – C. bracarensis.
83

При сравнении масс-спектров C. parapsilosis, выделенных в России с


масс-спектрами тест-штаммов из зарубежных коллекций микроорганизмов,
приведенныхв базе данных Bruker Biotyper обнаружили различие белковых
масс-спектропрофилей C. parapsilosis исследуемых штаммов от зарубежных
коллекций типовых культур (рисунок 35). Также установлено, что масс-
спектр штамма C. bracarensis, выделенный в России отличается от масс-
спектров штаммов находящимся в Центральном бюро грибных культур в
Нидерландах (рисунок 36). При сравнении масс-спектро-профилей штамма C.
utilis, выделенного в РФ, со штаммами из зарубежных коллекций наоборот
выявлено близкое сходство между ними (рисунок 37).
Таким образом, протеомные профили редких видов Candida spp.
различны, что диктует необходимость дальнейшего наблюдения за видовым
спектром, циркулирующим на территории России.

3.8 Молекулярно-генетические особенности возбудителей инвазивного


кандидоза

Для исследования полиморфизма региона D1/D2 гена 28S рРНК нами


был выбран вид C. parapsilosis, которому принадлежит ведущая роль в
развитии инвазивного кандидоза, вызванного C. не-albicans. В ходе
исследования было получено 11 последовательностей данного региона для
исследуемых штаммов C. parapsilosis, четырёх – для контрольных (типовые
штаммы РКПГ), а также одного клинического штамма с не определённой
чувствительностью к противогрибковым препаратам.
Полученные последовательности были выравнены и обрезаны по
самым коротким, длина окончательного выравнивания составила 416 пар
нуклеотидов (рисунок 38). Исключение составил штамм A., для которого
удалось получить последовательность длиной только в 318 п.н.
84

Показатель отличия
Рисунок 35 – Масс-спектры исследуемых штаммов C. parapsilosis и штаммов из зарубежных коллекций.
85

Показатель отличия

Рисунок 36 – Масс-спектры исследуемых штаммов и штаммов из зарубежных коллекций C. bracarensis.


86

Показатель отличия

Рисунок 37 – Масс-спектры исследуемых штаммов и зарубежных коллекций C. utilis


87

Рисунок 38 – Выравненные последовательности региона D1/D2 гена 28S


рРНК C. parapsilosis.
В пределах полученного выравнивания нами было выявлено шесть
полиморфных вариантов (однонуклеотидных замен) (таблица 12).
88

Таблица 12 – Обнаруженные Однонуклеотидные полиморфные варианты


региона D1/D2 гена 28S рРНК C. parapsilosis.

№ п/п Однонуклеотидные Исследованный штамм


замены
1 C23G St.
2 T73C Tyum_1
3 80delT M_5
4 A101G Tyum_1
5 C372T RCPF 1206, RCPF 1321
6 T409C Tyum_1

Однонуклеотидные замены нуклеотидов были зарегистрированы в


анализируемой последовательности в позициях 23, 73, 80, 102, 372, 409,
считая от начала выравнивания. Устойчивые к азолам штаммы C. parapsilosis
(М4_2 и A.) оказались в группе 11 штаммов с основным типом
последовательности региона D1/D2. Таким образом, ген 28S рРНК штаммов
C. parapsilosis, выделенных от пациентов с микологической патологией г.
Санкт-Петербурга, имеет однонуклеотидные полиморфные варианты.
Однако имеющегося материала пока недостаточно для того, чтобы сделать
определённые выводы о практической ценности изучения
последовательности локуса D1/D2 гена 28S рРНК Candida spp. для
выявления резистентных изолятов. Вместе с тем, в настоящей работе сделан
задел для такого исследования — создана коллекция устойчивых изолятов,
для которых может быть проведено молекулярно-генетическое типирование.
89

ГЛАВА 4 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ КЛИНИЧЕСКИХ


ИЗОЛЯТОВ CANDIDA SPP. К ПРОТИВОГРИБКОВЫМ ПРЕПАРАТАМ

4.1 Результаты определения чувствительности возбудителей


инвазивного кандидоза методом CLSI M27-A3.

В период с 2011 по 2014 гг. был проведен мониторинг


чувствительности возбудителей ВБИК к противогрибковым препаратам по
протоколу CLSI M27-A3 (с оценкой по критериям CLSI M27-S3 (2008 г.) и
M27-S4 (2012 г.) (таблица 13).

Таблица 13 – Результаты определения чувствительности штаммов Candida


spp. к азоловым антимикотикам (CLSI M27-A3).
Виды Противогрибковый Распределение штаммов Candida spp. по
Candida spp.( n= 322) препарат чувствительности к антимикотикам, n(%)
Ч УЧ У
Флуконазол 136 0 3
C. albicans*(n = 139)
Вориконазол 139 0 0
Флуконазол 57 0 8
C. parapsilosis*(n=65)
Вориконазол 63 0 2
Флуконазол 0 37 0
C. glabrata*( n= 37)
Вориконазол 37 0 0
Флуконазол 30 0 2
C. tropicalis* ( n= 32)
Вориконазол 31 1 1
Флуконазол 0 0 21
C. krusei* ( n= 21)
Вориконазол 20 1 0
Флуконазол 8 3 5
C. guilliermondii** ( n= 17)
Вориконазол 11 1 3
Флуконазол 2 0 0
C. dubliniensis**(n= 2)
Вориконазол 2 0 0
Флуконазол 4 0 0
C. lusitaniae ** ( n= 4)
Вориконазол 4 0 0
90

Продолжение таблицы 13
Виды Противогрибковый Распределение штаммов Candida spp. по
Candida spp.( n= 322) препарат чувствительности к антимикотикам,n(%)
Ч УЧ У
Флуконазол 2 0 0
C. pararugosa ** ( n= 2)
Вориконазол 2 0 0
Флуконазол 1 0 0
C. lipolytica ** ( n= 1)
Вориконазол 1 0 0
Флуконазол 1 0 0
C. kefyr**( n= 1)
Вориконазол 1 0 0
Флуконазол 0 0 1
C. utilis ** ( n= 1)
Вориконазол 1 0 0
Флуконазол 1- 0 0
C. inconspicua ** ( n= 1)
Вориконазол 1- 0 0

Примечание * критерии CLSI M27-S4, ** критерии CLSI M27-S4; Ч-


чувствительный, УЧ-умеренно - чувствительный, У устойчивый

Из 322 изолятов Candida spp. были чувствительны к флуконазолу 75%,


умеренно – чувствительными - 13% штаммов, устойчивыми – 12%. C.albicans
были чувствительны в 97% случаев, умеренно чувствительными - 0,7% и
устойчивыми 2,3%. Среди C. не-albicans штаммов 58% были
чувствительными, умеренно – чувствительными – 23%; устойчивыми -19%
(рисунок 39а). Таким образом, наибольший процент штаммов со сниженной
чувствительностью к флуконазолу наблюдали среди видов C. не-albicans: C.
glabrata (37), C. krusei (21), C. parapsilosis (8), C. tropicalis (2).
91
100 2.2 100 1.6 0 0.3 2.7
0.7 0.9 1.6
12.1
90 19 90

80 13.4 80

70 23 70

60 60 У
% 50 97.1 % 50 97.5 99.7 95.7 УЧ
40 40
74.5
30 58 Ч
30

20 20
У
10 10

0 0
Candida spp. C. albicans C. не-albicans Candida spp. C. albicans C. не-albicans

а У б
Ч
Рисунок 39 - Чувствительность возбудителей инвазивного кандидоза к флуконазолу (а) и
вориконазолу (б) (метод CLSI М27-А3, n=322); У – устойчивый, УЧ – умеренно-
Ca
чувствительный, Ч – чувствительный
nd
Установлено распределение
id Candida spp. по категориям
a
чувствительности к вориконазолуsp(рисунок 39б): чувствительные - 97,5%,
умеренно чувствительные – 0,9% штаммов, устойчивые – 1,6%. Следует
отметить, что C. albicans были чувствительны в 99,7% случаев, устойчивыми
– 0,3%. Среди C. не-albicans видов были чувствительными к вориконазолу
95,7% штаммов, умеренно – чувствительными – 1,6% и устойчивыми 2,7%.
Сниженной чувствительностью к вориконазолу – C. parapsilosis 0,6% (2), C.
tropicalis 0,6% (2) и C. krusei 0,3% (1).
Наряду с этим, 6 штаммов – C. guilliermondii (2), C. parapsilosis (2), C.
tropicalis (1), C. albicans (1) были устойчивы к флуконазолу и к вориконазолу.
Таким образом, полирезистентных к азолам штаммов среди Candida spp.
было 1,9% (C.albicans – 0,3%, C. не-albicans видов – 1,5 %).
Среди Candida spp. – возбудителей ИК, 2,5% были устойчивы к вориконазолу.
В период проведения исследований (2011 – 2014 гг.), не было выявлено
(р=0,6) достоверного возрастания штаммов со сниженной чувствительностью.
92

4.1.1 МПК противогрибковых препаратов для различных видов Candida


spp.

C. albicans (n=139) C. parapsilosis (n=65)

C.glabrata (n=37) C. tropicalis (n=31)

C.guilliermondii (n=17) C. krusei (n=20)


Рисунок 40 – МПК противогрибковых препаратов для 6 основных видов
Candida spp.
При определении МПК противогрибковых препаратов для 6
основных возбудителей ВБИК обнаружена наибольшая гетерогенность
по этому показателю штаммов C. guilliermondii и C. parapsilosis
(рисунок 40).
93

Далее мы определили МПК50, МПК90 и диапазоны МПК анти-


микотиков у различных видов Candida. (таблица 14).

Таблица 14 – Особенности распределения МПК у различных видов Candida


Виды Противогриб- Диапазоны МПК50 МПК90 Критерии Среднее
Candida ковые МПК (мкг/мл) (мкг/м чувствительности геометри-
препараты (мкг/мл) л) CLSI M27-S3 и ческое
CLSI M27-S4 (мкг МПК
/мл) (мкг/мл)
флуконазол 0.06-32 0.5 2 <2 0,6
C.
вориконазол 0,015-8 0,03 0,125 <0,12 0,03
albicans
каспофунгин 0,015-0,5 0,125 0,25 <0,25 0,1
(n=139)
позаконазол 0,008-0,25 0,03 0,06 Не установлен 0,02
флуконазол 0.5-32 16 16 <32 (УЧ*) 11,9
C. вориконазол 0.008-0.5 0.03 0.125 <1 0,04
glabrata каспофунгин 0,015-0,25 0,06 0,125 <0,12 0,15
(n=37) позаконазол 0,008- 0,03 0,06 Не установлен 0,03
0,125
флуконазол 32-128 64 64 Природно устой- 61,8
чивый вид
C. krusei
вориконазол 0.06-1 0.125 0.5 0.5 0,15
(n=20)
каспофунгин 0.03-0.25 0.25 0.25 <0,25 0,13
позаконазол 0.015-0.25 0,06 0,25 Не установлен 0,03
флуконазол 0.25-64 4 64 <8 4,17
C. guillie-
вориконазол 0.03-8 0.06 1 <1 0,1
rmondii
каспофунгин 0.06-1 0.5 1 <2 0,19
(n=17)
позаконазол 0.015-0.25 0,03 0,25 Не установлен 0,03
флуконазол 0.125-16 1 2 <2 1,09
C. вориконазол 0.015-0.25 0.06 0.125 <0,12 0,05
tropicalis каспофунгин 0.03-0.25 0.125 0.25 <0,25 0,14
(n=31) позаконазол 0.015- 0,03 0,06 Не установлен 0,03
0.125
флуконазол 0.125-64 0.5 16 <2 1,33
C.
вориконазол 0.015-1 0.03 0.125 <0,12 0,03
parapsilos
каспофунгин 0.03-2 1 2 <2 0,15
is (n=65)
позаконазол 0,015-0,06 0,03 0,06 Не установлен 0,03

Обнаружено, что для C. parapsilosis и C. guilliermondii значения МПК90,


выходят за пределы категории чувствительности, а это есть тенденция на к
формированию устойчивости к флуконазолу у этих видов Candida .
94

Таблица 15 – Чувствительность изолятов C. parapsilosis к


противогрибковым препаратам в различных биосубстратах

% % категорий
Биосубстрат (все Противогрибковые n исследуемых
исследуемых
изоляты) препараты изолятов
изолятов Ч УЧ У
Периферическая Флуконазол 85 0 15
кровь (268) Вориконазол 60 22,3 98,3 0 1,7
Каспофунгин 100 0 0
Перитонеальная Флуконазол 100 0 0
жидкость (24) Вориконазол 1 4,2 100 0 0
Каспофунгин 100 0 0
Флуконазол 67 0 33
Содержимое
абсцесса (8) Вориконазол 3 37,5 67 0 33
Каспофунгин 100 0 0
Флуконазол 100 0
Плевральная
Вориконазол 1 16,7 100 0 0
жидкость (6)
Каспофунгин 100 0 0

Таблица 16 – Географическое разнообразие C. parapsilosis по


чувствительности к противогрибковым препаратам
Федеральный n Флуконазол Вориконазол Каспофунгин
округ
Ч УЧ У Ч УЧ У Ч УЧ У
Северо-
Западный 31 90 0 10 97 0 3 100 0 0
Центральный 16 75 0 25 100 0 0 100 0 0
Южный 9 89 0 11 100 0 0 100 0 0
Уральский 6 100 0 0 100 0 0 100 0 0
Приволжский 3 67 0 33 67 0 33 100 0 0
Сибирский 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Всего (%) 65 88 0 12 97 0 3 100 0 0

Наряду с этим, выявлено, что штаммы C. parapsilosis, выделенные из крови,


чувствительны к флуконазолу – 85% случаев, к вориконазолу (98,3%), к
каспофунгину (100%). Среди них наибольшее количество штаммов C.
parapsilosis (31 штамм), были выделены в Северо-Западном ФО, были
чувствительными к флуконазолу – 90%, к вориконазолу – 97%, к
каспофунгину – все штаммы (таблица 15 и 16).
95

При определении чувствительности возбудителей ИК к


противогрибковому препарату триазоловой группы нового поколения –
позаконазолу, установлено, что все исследуемые штаммы Candida spp. были
чувствительны.
К настоящему времени для позаконазола критерии интепретации не
определили, однако, по литературным данным признано, что МПК для
чувствительных штаммов составляет 1мкг/мл (таблица 17).

Таблица 17 – МПК позаконазола для Candida spp.


Вид Candida spp. (n=322) Количество штаммов с соответствующими МПК
(мкг/мл)
0,008 0,015 0,03 0,06 0,125 0,25
C. albicans (n = 139) 1 52 43 30 12 1
C. parapsilosis (n=65) 27 27 9
C. glabrata ( n= 37) 1 10 15 8 3
C. tropicalis ( n= 32) 5 17 6 4
C. krusei( n= 21) 1 2 7 7 1
C. guilliermondii ( n= 17) 2 9 2 1 3
C. dubliniensis (n= 2) 2
C. lusitaniae ( n= 3) 1 2
C. pararugosa ( n= 2) 2
C. lipolytica ( n= 1) 1
C. kefyr ( n= 1) 1
C. utilis ( n= 1) 1
C. inconspicua ( n= 1) 1

Отмечено, что большинство исследуемых штаммов Candida spp. имели МПК


0,015-0,03 мкг/мл. и соответствуют категории «чувствительные» (рисунок 41).
96

Рисунок 41 – МПК позаконазола для различных видов Candida spp.


Следует отметить, что 258 исследуемых клинических изолятов Candida
spp. были выделены от пациентов при однократном заборе биосубстрата и 64
изолята - при повторных заборах. Выявление нескольких видов Candida у
одних и тех же пациентов отмечали в 6 случаях.
97

Сведения о повторно выделеных клинических изолятах Candida приведены в


таблице 18.

Таблица 18 – Случаи повторного выделения Candida spp. от пациентов с


инвазивным кандидозом

Пациент Биосубстрат Количест Вид Candida МПК флуконазола,


во spp. вориконазола, каспофунгина,
повторов позаконазола (CLSI M27-A3),
мкг/мл
1 кровь 3 C. glabrata 16;0.125;0.06;0.06
16;0.06;0.06;0.06
16;0.06;0.06;0.06
2 кровь 2 C. albicans 2;0.06;0.25;0.03
2;0.06;0.25;0.015
3 кровь 2 C. albicans 1;0.06;0.06;0.03
1;0.06;0.015;0.015
4 кровь 3 C. albicans 0.25;0.015;0.25;0.015
0.5;0.06;0.125;0.015
0.5;0.125;0.125;0.015
5 кровь 2 C. albicans 0.5;0.03;0.125;0.03
0.5;0.03;0.125;0.015
6 кровь 3 C. parapsilosis 2.0;0.06;1.0;0.03 (13.03.2013)
0.5;0.015;0.5;0.015 (14.03.2013)
16;0.06;1.0;0.015 (30.03.2013)
7 ЦСЖ, перитоне- 1 C. albicans 1.0;0.06;0.015;0.06
альная жидкость 1.0;0.06;0.03;0.03
8 кровь, биопсия 1 C. albicans 0.5;0.06;0.25;0.06
0.25;0.06;0.125;0.03
9 кровь 2 C. albicans 0.25;0.06;0.25;0.03
0.125;0.015;0.25;0.015
10 кровь 2 C. lusitaniae 1.0;0.015;1.0;0.06
1.0;0.015;1.0;0.06
11 кровь 3 C. krusei 64.0;0.125;0.25;0.06
64.0;0.125;0.25;0.125
64.0;0.125;0.25;0.125
12 кровь 2 C. albicans 0.125;0.03;0.06;0.03
0.125;0.015;0.25;0.03
13 кровь 3 C. albicans 0.5;0.03;0.06;0.06
0.5;0.03;0.125;0.06
0.25;0.03;0.06;0.03
14 кровь, содержи- 1 C. parapsilosis 0.5;0.06;0.125;0.03
мое абсцесса 2.0;0.125;0.06;0.015
2.0;0.125;0.125;0.03
15 кровь, 1 C. parapsilosis 0.5;0.015;0.5;0.015
содержимое 0.25;0.015;2.0;0.015
абсцесса
98

Продолжение таблицы 18
Пациент Биосубстрат Количество Вид Candida МПК флуконазола,
повторов spp. вориконазола, каспофунгина,
позаконазола (CLSI M27-A3),
мкг/мл
16 кровь, перитоне- 1 C. albicans 0.5;0.03;0.5;0.015
альная жидкость 0.5;0.125;0.5;0.015
17 кровь 3 C. albicans 0.25;0.06;0.125;0.125
0.5;0.03;0.125;0.06
1.0;0.03;0.125;0.06
18 кровь 2 C. glabrata 32.0;0.03;0.015;0.03
16.0;0.03;0.015;0.03
19 кровь 2 C. guillier- 64.0;1.0;0.5;0.25
mondii 64.0;1.0;0.5;0.25
20 кровь 2 C. tropicalis 1.0;0.06;0.06;0.03
0.5;0.06;0.06;0.03
Из 20 приведенных случаев повторного выделения биосубстрата от одного
больного отмечено, что в 1 случае произошло выделение устойчивого к
флуконазолу штамма C. parapsilosis, ранее чувствительного к данному
антимикотику.
Среди исследованных культур также было отмечено, что от одного
пациента были случаи выделения нескольких видов Candida,
характеризующимся различными МИК к противогрибковым препаратам
(таблица 19).

Таблица 19 – Случаи выделения нескольких видов Candida spp. от одного


пациента

Пациент Биосубстрат Вид Candida Даты МИК флуконазола,вориконазола,


выделения каспофунгина, позаконазола (CLSI
M27-A3), мкг/мл
1 C. lipolytica 8;0.125;0.25;0.25
кровь 17.02.2012
C. parapsilosis 0.5;0.015;2.0;0.06
2 кровь 1 C. albicans 11.03.2013 0.25;0.03;0.125;0.015
кровь 2 C. parapsilosis 14.03.2013 2.0;0.03;0.125;0.015
3 C. albicans 0.5;0.03;0.125;0.06
кровь 1 05.06.2012
C. krusei 64.0;0.06;0.25;0.25
C. albicans 0.5;0.03;0.125;0.03
кровь 2 11.06.2012
C. krusei 64.0;0.06;0.25;0.06
4 кровь 1 C. albicans 29.07.2013 1.0;0.06;0.125;0.03
кровь 2 C. parapsilosis 0.5;0.03;0.125;0.015
содержимое C. albicans 12.08.2013 1.0;0.06;0.25;0.03
абсцесса
кровь 3 C. parapsilosis 13.08.2013 0.5;0.015;1.0;0.015
99

Продолжение таблицы 19
5 кровь 1 C. albicans 02.08.2013 0.5;0.03;0.25;0.03
содержимое C. glabrata 08.08.2013 16.0;0.03;0.06;0.03
абсцесса
кровь 2 C. 19.08.2013 0.5;0.03;0.06;0.015
guilliermondii
6 плевральная C. albicans 30.08.2013 0.25;0.03;0.25;0.03
жидкость
кровь C. glabrata 17.09.2013 16.0; 0.015; 0.015; 0.015

Следовательно, выявление нескольких видов Candida spp. у одного пациента


является серьезной причиной для тщательного мониторирования
чувствительности к противогрибковым препаратам.

4.2 Результаты определения чувствительности возбудителей


инвазивного кандидоза методом CLSI M44 - A

Учитывая что, метод серийных разведений (CLSI M27–A3) отличается


трудозатратностью, высокой себестоимостью и его использование в
рутинной практике затруднено, для определения чувствительности Candida
spp. к противогрибковым препаратам мы использовали метод CLSI M44 – A,
несложеный в исполнении и обладающий невысокой себестоимостью.
Определение чувствительности проводили в отношении флуконазола и
вориконазола (таблицы 20, 21).

Таблица 20 – Результаты определения чувствительности штаммов


Candida spp. к флуконазолу методом М44-А (n=141)
Виды Candida Кол-во штаммов, распределенных в соответствии с диаметром
зон задержки роста (мм)/МПК (мкг/мл) к флуконазолу
>19 / <8 15-18/16-32 <14/ >64
C. albicans (n=54) 53 - 1
C. parapsilosis (n=34) 26 1 7
C. glabrata (n=16) 2 13 1
C. tropicalis (n=11) 7 3 1
C. guilliermondii (n=11) 2 4 5
C. krusei (n=10) - - 10
100

Продолжение таблицы 20
Виды Candida Кол-во штаммов, распределенных в соответствии с диаметром зон
задержки роста (мм)/МПК (мкг/мл) к флуконазолу
>19 / <8 15-18/16-32 <14/ >64
C. pararugosa (n=2) 2 - -
C. utilis (n=1) 1 - -
C. lipolytica (n=1) 1 - -
C. kefyr (n=1) 1 - -

На основании полученных результатов выявлено, что 32,6% штаммов


Candida spp. обладали сниженной чувствительностью к флуконазолу: 14,9%
(21) штаммов – умеренной чувствительностью и 17,7% (25) штаммов –
устойчивые.
Изоляты C. albicans были чувствительны к флуконазолу – 98,2% (53) и
1,8% (1) устойчивы. Среди 34 штаммов C. parapsilosis 20,5% (7) были
устойчивы к флуконазолу и 2,9% (1) – обладал умеренной
чувствительностью; 45,5% (5) штаммов C. guilliermondii были устойчивы и
36,3% (4) – умеренно чувствительными к флуконазолу.

Таблица 21 – Результаты определения чувствительности штаммов


Candida spp. к вориконазолу методом М44-А (n=141)
Вид Candida Кол-во штаммов, распределенных в соответствии с диаметром
зон задержки роста (мм)/МПК (мкг/мл) к вориконазолу
>17 / <1 14-16/2-4 <13/ >6
C. albicans (n=54) 54 - -
C. parapsilosis (n=34) 28 3 3
C. glabrata (n=16) 15 1 -
C. tropicalis (n=11) 10 - 1
C. guilliermondii (n=11) 8 1 2
C. krusei (n=10) 7 3 -
C. pararugosa (n=2) 2 - -
C. utilis (n=1) 1 - -
C. lipolytica (n=1) 1 - -
C. kefyr (n=1) 1 - -
101

Среди 141 штамма Candida spp. чувствительными к вориконазолу были


90,0%, сниженной чувствительностью обладали 10%. Штаммы C. albicans
были чувствительны к вориконазолу. Среди 34 штаммов C. parapsilosis
сниженная чувствительность была отмечена у 17,6% (6) культур.
При сравнении результатов определения чувствительности к
флуконазолу и вориконазолу по протоколам CLSI M27-A3 и CLSI M44-A
были получены следующие данные (рисунок 42 а, 42 б).
100 98.1 98.1
92
90 83
80

70

60

% 50
M27-A3
40
M44-A
30

20

10 9 5.7 7.9
1.8 1.8 2.3
0

C. albicans Ч C. albicans У C. не-albicans C. не-albicans C. не-albicans


Ч УЧ У

Рисунок 42 а – Результаты сравнения чувствительности к флуконазолу,


определенной методом M44-A и M27-A3 (n=141)

100 96.3 96.3


90

80

70

60
M27-A3
48.8
% 50 46.6 M44-A
40
29.5
30 27.3
21.6 21.6
20

10 3.7 3.7
0
C. albicans Ч C. albicans У C. не-albicans C. не-albicans C. не-albicans
Ч УЧ У

Рисунок 42 б – Результаты сравнения чувствительности к вориконазолу,


определенной методом M44-A и M27-A3 (n=141)
102

Таким образом, достоверных различий между результатами обоих методов


не выявлено (p >0,05).
Однако, несмотря на простоту использования метода CLSI M44-A, во
многих лабораториях используют автоматические анализаторы, поэтому для
сравнения результатов определения чувствительности к азолам у изолятов
Candida spp., полученных стандартными методами, мы использовали
автоматический анализатор Vitek 2 Compact.

4.3 Результаты определения чувствительности возбудителей


инвазивного кандидоза с помощью анализатора Vitek2 Compact

Оценку результатов исследования проводили в соответствие с


критериями интерпретации референтного протокола CLSI M27-S4 (2012 г.).
В период 2011 – 2014 гг. было исследовано 82 штамма Candida spp.
При определении чувствительности к флуконазолу среди исследованных 82
штаммов Candida spp. установлено, что к категории «чувствительные»
относятся 66 (80,4%) штаммов, к категории «устойчивые» – 16 (19,5%) и 7
(8,5%) – к категории с «промежуточной чувствительностью».
При определении чувствительности к вориконазолу к категории
«чувствительные» отнесли 74 (90,2%) штаммов Candida spp., к категории
«устойчивые» – 4 (4,8%) и 4 (4,8%) к категории с промежуточной
чувствительностью (таблица 22).
103

Таблица 22 – Сравнение результатов МИК флуконазола и вориконазола,


полученных с помощью Vitek2 Compact и методом микроразведений по протоколу
CLSI M27 – А3 (n=82)

Виды и Противогрибковые Метод МПК (мкг/мл) Среднее %


число препараты Диапазо 50% 90% геометри совпа
изолятов н -ческое дения
CLSI M27- 0,25-128 1 64 2,8
Флуконазол A3 90,3
Candida
Vitek2 1-64 1 32 2,3
spp.
CLSI M27- 0,015-8 0,06 0,5 0,07
(n=82)
Вориконазол A3 94
Vitek2 0,125-8 0,125 0,25 0,14
CLSI M27- 0,25-32 0,5 2 3,4
Флуконазол A3 90,5
C. Vitek2 1-8 1 1 1,1
albicans
(n=21) CLSI M27- 0,015-8 0,03 0,125 8
Вориконазол A3 95,2
Vitek2 0,125 0,125 0,125 0,125
CLSI M27- 8-16 16 16 14,5
Флуконазол A3 100
C. Vitek2 1-8 2 8 2,43
glabrata CLSI M27- 0,015-0,5 0,03 0,125 0,06
(n=7) A3
Вориконазол 100
Vitek2 0,125- 0,125 0,125 0,14
0,25
CLSI M27- 2-64 4 64 10,3
C. Флуконазол A3 100
guillier- Vitek2 2-64 2 64 8,7
mondii CLSI M27- 0,03-8 0,125 1 2
(n=8) Вориконазол A3 100
Vitek2 0,125-8 0,125 4 5
CLSI M27- 64-128 64 64 71,8
Флуконазол A3 100
C. krusei Vitek2 4-32 8 16 11,3
(n=6) CLSI M27- 0,125-1 0,25 0,5 1
Вориконазол A3 83
Vitek2 0,125 0,125 0,125 0,125
CLSI M27- 8 8 8 8
Флуконазол A3 100
C.
Vitek2 2 2 2 2
lipolytica
CLSI M27- 0,125 0,125 0,125 0,125
*(n=1)
Вориконазол A3 100
Vitek2 0,125 0,125 0,125 0,125
CLSI M27- 0,25-1 0,5 1 1
Флуконазол A3 100
C.
Vitek2 1-2 1 2 1,4
lusitaniae
CLSI M27- 0,015 0,015 0,015 0,015
*(n=4)
Вориконазол A3 100
Vitek2 0,125 0,125 0,125 0,125
104

Продолжение таблицы 22
Виды и Противогрибковые Метод МПК (мкг/мл) Среднее %
число препараты геометри совпа
изолятов Диапазон 50% 90% -ческое дения
CLSI 0,25-64 1 64 2,2
Флуконазол M27-A3 91,3
C.
Vitek2 1-64 1 64 2,6
parapsilosis
CLSI 0,015-1 0,03 0,125 0,05
(n=23)
Вориконазол M27-A3 83
Vitek2 0,125-1 0,125 0,5 0,168
CLSI 0,5 0,5 0,5 0,5
M27-A3
Флуконазол 100
C. Vitek2 1 1 1 1
pararugosa
* (n=1) CLSI 0,125 0,125 0,125 0,125
Вориконазол M27-A3 100
Vitek2 0,125 0,125 0,125 0,125
CLSI 0,25-8 0,5 2 1
Флуконазол M27-A3 89
C. tropicalis Vitek2 1-2 1 1 1
(n=9) CLSI 0,03-0,25 0,06 0,25 0,07
Вориконазол M27-A3 78
Vitek2 0,125 0,125 0,125 0,125
CLSI 0,25 0,25 0,25 0,25
Флуконазол M27-A3 0
C.
Vitek2 16 16 16 16
inconspicua
CLSI 0,015 0,015 0,015 0,015
* (n=1)
Вориконазол M27-A3 100
Vitek2 0,125 0,125 0,125 0,125
CLSI 64 64 64 64
Флуконазол M27-A3 0.
C. utilis Vitek2 2 2 2 2
*(n=1) CLSI 0,015 0,015 0,015 0,015
Вориконазол M27-A3 100
Vitek2 0,125 0,125 0,125 0,125
* – CLSI M27-S3
Сравнением результатов, полученных с помощью методов
микроразведений по протоколу CLSI M27-A3 и Vitek 2Compact (таблица 22),
показано, что большинство исследованых изолятов в отношении
флуконазола обладали сниженной чувствительностью и демонстрировали
МПК90 – 32 мкг/мл и 64 мкг/мл для Vitek 2 и CLSI M27-A3, соотвественно.
Значения МПК вориконазола для данных методов составили соотвественно,
0,25 мкг/мл и 0,5 мкг/мл. Также было отмечено несовпадение результатов
105

определения чувствительности к флуконазолу в отношении штаммов редких


видов – C. utilis и C. inconspicua.
Поскольку оценку результатов Vitek 2 проводят по критериям интепретации
протоколов CLSI M27–S3 и CLSI M27–S4, мы выяснили насколько важно
своевременное обновление критериев, заложенных в приборе (таблица 23,
24).

Таблица 23 – Сравнение критериев интерпретации CLSI M27 S3 (2008г.) и


CLSI M27 S4 (2012г.) для МПК флуконазола (Vitek 2)

Категории чувствительности
МПК
CLSI M27-S3 CLSI M27-S4
флуконазола Виды Candida spp.
2008 г. 2012г.
(мкг/мл)
Ч УЧ У Ч УЧ У
C. albicans (n=19) 19 0 0 19 0 0
C. parapsilosis (n=15) 15 0 0 15 0 0
C. tropicalis (n=8) 8 0 0 8 0 0
1
C. lusitaniae (n=2) 2 0 0 н.д.
C. glabrata (n=2) 2 0 0 0 2 0
C. pararugosa (n=1) 1 0 0 н.д.
C. guilliermondii (n=4) 4 0 0 н.д.
C. glabrata (n=3) 3 0 0 0 3 0
C. parapsilosis (n=2) 2 0 0 2 0 0
C. utilis (n=1) 1 0 0 н.д.
2
C. tropicalis (n=1) 1 0 0 1 0 0
C. albicans (n=1) 1 0 0 1 0 0
C. lipolytica (n=1) 1 0 0 н.д.
C. lusitaniae (n=2) 2 0 0 н.д.
C. krusei (n=1) 1 0 0 0 0 1
4
C. parapsilosis (n=1) 1 0 0 0 1 0
C. glabrata (n=2) 2 0 0 0 2 0
8 C. krusei (n=3) 0 0 3 0 0 3
C. guilliermondii (n=1) 1 0 0 н.д.
C. krusei (n=2) 0 0 2 0 0 2
16
C. inconspicua (n=1) 0 1 0 н.д.
C. parapsilosis (n=2) 0 2 0 0 0 2
32
C. krusei (n=1) 0 0 1 0 0 1
C. parapsilosis (n=3) 0 0 3 0 0 3
64
C. guilliermondii (n=3) 0 0 3 н.д.
1-64 n=82 67 3 12 46 8 12

Таким образом, в соответствиии с критериями 2008 года, при


определении чувствительности к флуконазолу среди исследованных 82
106

штаммов Candida spp., установлено, что к категории «чувствительные»


относятся 67 (81,8%) штаммов, к категории «устойчивые» – 12 (14,6%) и 3
(3,6%) – к категории с «промежуточной чувствительностью». Отмечено, что
процент несовпадения между критериями 2008 и 2012гг. составил 16%
(11/66).

Таблица 24 – Сравнение критериев интерпритации CLSI M27 S3 (2008г.) и


CLSI M27 S4 (2012г.) для МПК вориконазола
Категории чувствительности
МПК CLSI M27-S3 CLSI M27-S4
вориконазола Виды Candida spp. 2008 г. 2012г.
(мкг/мл) Ч УЧ У Ч УЧ У
C. albicans (n=21) 21 0 0 21 0 0
C. parapsilosis (n=17) 17 0 0 17 0 0
C. tropicalis (n=9) 9 0 0 9 0 0
C. krusei (n=7) 7 0 0 7 0 0
C. glabrata (n=6) 6 0 0 н.д.
0,125 C. guilliermondii (n=4) 4 0 0 н.д.
C. lusitaniae (n=4) 4 0 0 н.д.
C. pararugosa (n=1) 1 0 0 н.д.
C. lipolytica (n=1) 1 0 0 н.д.
C. utilis (n=1) 1 0 0 н.д.
C. inconspicua (n=1) 1 0 0 н.д.
C. guilliermondii (n=1) 1 0 0 н.д.
0.25 C. glabrata (n=1) 1 0 0 н.д.
C. parapsilosis (n=1) 1 0 0 1 0 0
0.5 C. parapsilosis (n=3) 3 0 0 0 3 0
1 C. parapsilosis (n=1) 1 0 0 1 0 1
4 C. guilliermondii (n=2) 0 0 2 н.д.
8 C. guilliermondii (n=1) 0 0 1 н.д.
0,125-8 n=82 79 0 3 56 3 1

При определении чувствительности к вориконазолу, к категории


«чувствительные» отнесли 79 (96,3%) штаммов Candida spp. и 3 (3,7%) - к
категории «устойчивые» (по критериям 2008 года). С связи с тем, что у
некоторых видов критерии чувствительности не установлены к вориконазолу,
различия между критериями 2008 и 2012 гг. составил 6,6% (4/60).
107

Таким образом, определение чувствительности и выбор


соответствующего метода имеют важное клиническое значение, так как,
результаты определения чувствительности возбудителей ИК диско-
диффузионным методом (CLSI M44 – A) и с помощью автоматического
анализатора Vitek2Compact (в соответствии с новыми критериями
интерпретации) были достоверно сопоставимы с референтным методом
разведений в жидких питательных средах (CLSI M27 – A3), что позволяет
рекомендовать оба метода для применения в рутинной клинической практике,
CLSI M44 – A – в качестве основного, в связи с тем, что он также является
стандартным методом как и CLSI M27 – A3, а автоматический анализатор
Vitek2Compact - в качестве альтернативного метода.
108

ГЛАВА 5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основными возбудителями инвазивного кандидоза (ИК) являются C.


albicans, C. parasilosis, C. glabrata, C. tropicalis и C. krusei, реже другие виды.
В последнее десятилетие установлено, что по уровню заболеваемости
(200000 пациентов ежегодно) в мире инвазивный кандидоз занимает второе
место среди микозов и, несмотря на применение современных
противогрибковых препаратов, характеризуется стабильно высокой
летальностью 46 –75% [156]. В связи с тем, что до 50 - 75 % посевов крови от
больных ИК являются отрицательными, а методы идентификации Candida
spp. позволяют получить результат только через 48 часов и более, проблема
видовой идентификации и выбора ее методов представляется актуальной [88].
С учетом нарастания резистентности микромицетов к противогрибковым
препаратам не менее серьезной проблемой явлется определение
чувствительности к противогрибковым препаратам, а также выбор
соответствующих методов [23]. В связи с этим, представляется актуальным
изучение этиологии внутрибольничного инвазивного кандидоза и
чувствительности возбудителей к антимикотикам на территории России с
использованием современных методов диагностики.
В проведенном нами многоцентровом исследовании, посвященном
изучению особенностей возбудителей внутрибольничного инвазивного
кандидоза в период 2011–2014 гг. в России, впервые изучена этиология
ВБИК с применением современных методов видовой идентификации грибов
(MALDI-TOF масс-спектрометрии и ДНК-секвенирования). Изучены 322
клинических изолята Candida spp., выделенных от 258 пациентов из 37
стационаров в 12 городах России (6 Федеральных округов).
Исследование типов биоматериала (кровь и другие в норме стерильных
биосубстраты), было обнаружено, что в 83,2% случаев изоляты Candida spp.
были выделены из крови, в 7,5% – из перитонеальной жидкости. Зарубежные
исследователи также отмечали, что изоляты Candida spp. из стерильных в
109

норме биосубстратов при ВБИК, чаще всего выделяются из крови [58]. Так, в
многоцентровом исследовании SENTRY (2008-2009 гг.) 65% штаммов (2085
исследуемых культур Candida spp.) были выделены из крови [159].
Некоторые исследователи также отмечали, что Candida spp. высевали из
крови в два раза чаще, чем из перитонеальной жидкости, в отделениях
реанимации и интенсивной терапии [26].
Видовую идентификацию исследуемых штаммов Candida spp. ранее в
мире проводили в основном с использованием морфологических и
биохимических методов.
Так, в исследовании, проведенном более 10 лет назад в РФ [9] при
видовой идентификации этиологии инвазивного кандидоза в ОРИТ г. Санкт-
Петербурга (1998-2003 гг.) с использованием морфологических и
биохимических методов (тест на ростковые трубки, тест-системы
Fongiscreen, AUXACOLOR, API 20C AUX) было выделено 117 штаммов
Candida spp., при этом неидентифицировано до вида было 8,5% изолятов.
Однако, в последние годы молекулярно-биологические методы (ДНК-
секвенирование, MALDI-TOF масс-спектрометрия) тоже начали внедрять в
практику микробиологических лабораторий.
Определение видового спектра возбудителей ВБИК в нашем
исследовании проведено методами ДНК-секвенирования, MALDI-TOF масс-
спектрометрии и тест-системой AUXACOLOR2. ДНК-секвенирование
является рефентным методом видовой идентификации микроорганизмов; и
MALDI-TOF масс-спектрометрия, по данным ряда исследователей, также
является методом, приближенным по точности к референтному, но
превосходит по быстроте идентификации. Однако, сравнительных
исследований такого рода проведено относительно мало и на ограниченном
количестве штаммов.
Результаты идентификации изолятов Candida spp. (97 штаммов) в
нашем исследовании, полученные двумя методами (ДНК-секвенирование и
MALDI-TOF масс-спектрометрия) совпали в 100% случаев. По данным
110

тайваньских ученых, при сравнительном исследовании результатов видовой


идентификации 142 штаммов Candida spp. вышеуказанными методами,
обнаружили совпадение в 98,6% случаев [134]. В сравнительном
исследовании, проведенном в Кувейте, с использованием анализаторов Vitek
МS, Bruker Biotyper МS и ДНК–секвенирования установлено, что методом
MALDI-TOF масс-спектрометрии точно идентифицировано 86,7% изолятов.
Не удалось определить 1 штамм C. famata, 2 штамма C. kefyr, 1 штамм C.
guilliermondii. Были затруденения с идентификацией криптических видов
комплекса C. parapsilosis [92]. Совпадение результатов по идентификации
Candida spp. MALDI-TOF масс-спектрометрией с другими биохимическими
системами (Vitek 2) составило 93,2% [68]. Голландские исследователи при
изучении 19 изолятов клинически значимых дрожжей (8 видов из двух
родов), идентифицированных методом ДНК-секвенирования, показали что,
MALDI-TOF масс-спектрометрией и биохимической тест-системой API
определено 94, 7% [161 ].
При исследовании 322 штаммов Candida spp. с помощью MALDI-TOF
масс-спектрометрии и тест-системы AUXACOLOR2 нами обнаружено, что
совпадение результатов идентификации составляет 93,2%. В аналогичном
исследовании в Германии в 2010 г. совпадение между результатами MALDI-
TOF масс-спектрометрии и AUXACOLOR2 составило 96,9% [86].
Наибольший процент несовпадений в нашем исследовании возникал из-за
ошибочной идентифицикации некоторых изолятов Candida spp. тест-
системой AUXACOLOR2. Так, 11 штаммов C. albicans были
идентифицированы как C. dubliniensis. Кроме того метод AUXACOLOR2 не
обеспечивал выявление редких видов (C. utilis, C. inconspicua, C. bracarensis,
C. pararugosa). Таким образом, тест-системой AUXACOLOR2 определили,
что 39,7% клинических изолятов принадлежли к C. albicans, и 59,7% –
являются представителями других видов Candida, у 0,6% штаммов вид не
определен. Методом MALDI-TOF масс-спектрометрии установлено, что
43.2% клинических изолятов принадлежали к C. albicans, и 56.8% были
111

представителями других видов Candida. Данным методом также была


уточнена видовая принадлежность у штаммов неидентифицированных тест-
системой AUXACOLOR 2 – C. utilis и C. lusitaniae. Состав C. не-albicans
видов в нашем исследовании был представлен следующими патогенами:
20,2% – C. parapsilosis, 11,5% – C. glabrata, 9,6% – C. tropicalis, 6,2% – C.
krusei, 5,3% – C. guilliermondii, 4% – остальные редкие виды (С. bracarensis,
C. kefyr, C. utilis, C. lipolityca. C. inconspicua, C. dubliniensis, C. lusitaniae).
Всего было определено 14 видов возбудителей ВБИК. Выявленное нами
соотношение видов C. albicans / C. не-albicans (43,2%/56,8%) в структуре
возбудителей ИК, выделенных их всех в норме стерильных биосубстратов,
совпадает с рядом зарубежных исследований, которые были проведены ранее
или одновременно с нашей работой. В глобальном исследовании SENTRY
(79 центров из 4 регионов мира), проведенном в период 2008-2009 гг. при
изучении этиологии внутрибольничного инвазивного кандидоза, отмечено,
что в спектре видов Candida spp. доля C. albicans составила 48,4%, а C. не-
albicans – 51,6% [33]. Сообщается, что в Испании, выявлено аналогичное
соотношение: процент штаммов C. albicans был равен 45,4, C. не-albicans -
54,6. Помимо этого, было отмечено сходство и среди C. не-albicans видов;
как и в России, лидирующую позицию в Испании занимала C. parapsilosis –
24,9%, далее следовали 13,4% - C. glabrata и 7,7% - C. tropicalis [65].
Из крови в нашем исследовании было выделено 14 видов Candida spp.,
где содержание C. albicans составляло 38,8%, C. не-albicans виды – 61,2%, в
том числе и редкие виды. В других стерильных биосубстратах, в среднем,
было обнаружено от 2 до 5 видов Candida spp., причем преобладал C.
albicans (р<0.05). По результатам международного исследования PATH доля
C. albicans в крови составила 42,1%, видовой спектр был представлен 10
видами [66]. В Бельгии (2010 – 2012 гг.) в рамках отдельного госпиталя
выявлено стабильное соотношение возбудителей ИК C. albicans / C. не-
albicans видам как 37% / 63% [152].
112

Таким образом, мы, наравне с рядом зарубежных исследователей


выявили тенденцию к снижению встречаемости C. albicans вида и
увеличения распространенности C. не-albicans видов как возбудителей
инвазивного кандидоза.
Нами проанализированы изменения видового состава возбудителей
ВБИК на протяжении трех лет исследования. Выявлено, что имеется
снижение доли C. albicans среди возбудителей ВБИК. Наряду с этим, имело
место возрастание C. не-albicans видов, причем за счет C. parapsilosis (20,2%),
тогда как уровень C. glabrata, C. tropicalis и C. krusei (8,2%, 8,2% и 6,1%)
оставался стабильным. По данным испанских ученых, в 2009 году в Испании,
уровень вида C. albicans составлял 43%, C. parapsilosis – 29 %, а C. tropicalis
– 10% [131]. В аналогичный период в Бразилии процентное соотношение
видов было иное: C. albicans – 41%, C. tropicalis – 20 %, C. parapsilosis – 15%,
а в Тайланде: C. albicans – 39%, C. tropicalis – 28%, C. glabrata – 22% [151]. В
Греции доля C. parapsilosis составила 43,9 % (с 2007 – 2012 г.) [87]. В США в
2012 г. напротив на втором месте находилась C. glabrata – 29%, также как и в
Дании и Норвегии, где доля C. glabrata составляет 21,1% и 20,3%
соответственно [88].
Нами была выявлена географическая вариабельность видового состава
возбудителей ВБИК в разных федеральных округах России. Доля C. albicans
в Уральском (57,8%) и Сибирском (75%) федеральных округах в структуре
возбудителей ИК была достоверно выше, чем в Южном (36%) и Северо-
Западном (37%) федеральных округах (р < 0.05). По результатам нашего
исследования было выявлено, что доли C. albicans в структуре возбудителей
ИК в Иркутске и Ростове на Дону, достоверно выше были в Иркутске, тогда
как между крупными городами (Санкт-Петербург и Москва) достоверных
различий в видовом спектре возбудителей ИК не выявлено.
В период 2003 – 2008 гг. в рамках международного проспективного
исследования ARTEMIS DISK (127 центров, 39 стран) C. albicans была
причиной кандидемии в 62% случаев, по сравнению с периодом в 1997 по
113

1998 гг. доля C. albicans была выше, 73,3% [143]. В Дании в период с 2005 по
2011 гг. отмечали снижение доли C. albicans в структуре кандидемии с
69,8 % до 63% [115, 147]. В США с 1999 по 2012 гг. обнаружили
значительное снижение уровня C. albicans с 52% до 38% [86, 149, 155], в
Испании с 2005 по 2013 гг. доля C. albicans снизилась с 51% до 45,4 % [82].
Различия в этиологии ВБИК могут быть обусловлены рядом факторов:
географией региона, типом стационара, фоновыми заболеваниями, спектром
противогрибковых препаратов и выбранным методом идентификации
возбудителей [37].
Следует заметить, что обсуждаемые выше результаты получены
различными методами идентификации возбудителей ВБИК. При этом
методы молекулярной биологии (MALDI-TOF масс-спектрометрия, ДНК-
секвенирование) использовали редко. Учитывая, что референтный метод
идентификации грибов (ДНК-секвенирование) является трудоемким,
длительным по времени, дорогостоящим, в отличие от MALDI-TOF масс-
спектрометрии, сегодня, представляется нецелесообразным рекомендовать
его для применения в повседневную микробиологическую практику (таблица
25).
Таблица 25 – Краткая характеристика используемых методов диагностики.
Вид исследования ДНК- MALDI-TOF мс AUXACOLOR2
секвенирование
Время исследования (расчет на 1 10 минут
48 часов 48 часов
культуру)

Себестоимость исследования
(в зависимости от стоимости ~2000 р. ~10 руб ~750 р.
оборудования и расходных материалов)

Представителей всех обнаруженных видов Candida spp. (C. albicans, C.


parapsilosis, C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei, C. guilliermondii, С.
bracarensis, C. kefyr, C. utilis, C. lipolityca, C. inconspicua, C. dubliniensis, C.
pararugosa, C. lusitaniae) помимо биохимических характеристик изучили
114

микро - и макроскопически. Обнаружено, что микро- и


макроморфологические характеристики совпали с приведенными в
определителях [29, 95]. Однако следует заметить, что некоторые виды имели
сходные характеристики и по морфологии и по биохимическим свойствам, в
связи, с чем их можно было идентифицировать с ошибкой. Поэтому мы
уточняли видовую идентификацию методом MALDI-TOF масс-
спектрометрии. И следовательно в любой лаборатории только
фенотипический метод видовой идентификации возбудителей ВБИК нельзя
считать достаточным.
Кроме определения видов возбудителей ВБИК, важным является
выяснение чувствительности штаммов возбудителей к антимикотическим
препаратам, так как в последние годы все чаще сообщают о снижении
чувствительности Candida spp. к флуконазолу. Французскими учеными было
обнаружено, что чувствительность к этому антимикотику снизилось на 17%
[72]. По данным глобального исследования ARTEMIS DISK в России (2003-
2008 гг.) чувствительность возбудителей ИК составила 78% [15].
Первые результаты в рамках определения чувствительности
возбудителей ИК к противогрибковым препаратам в России были получены в
г. Санкт-Петербурге в период 1998 – 2004 гг. Методом CLSI M44-A
определена чувствительность к флуконазолу у 50 штаммов Candida spp. Было
обнаружено, что чувствительными были 58% изолятов, а 42% обладали
сниженной чувствительностью (34% были устойчивыми к флуконазолу и 8%
– умеренно-чувствительными) [124].

При проведении нашего исследования мы использовали два


референтных метода определения чувствительности грибов к
антимикотикам: стандартные – CLSI M27-A3, CLSI M44-A и
микробиологический анализатор Vitek2 Compact. В соответствии с нашими
данными, полученными по протоколу CLSI M27-A3, чувствительными к
флуконазолу были 74,5% изолятов Candida spp. (n=322), умеренно-
чувствительными - 13,4 % и 12,1% – устойчивыми. При этом, обнаружено
115

что C. albicans в 97,1% случаев были чувствительны к флуконазолу,


умеренно-чувствительны в – 0,7 % и 2,2% – устойчивыми. Таким образом,
вид C. albicans сохраняет высокую чувствительность к флуконазолу. Для C.
не-albicans видов чувствительность к флуконазолу составляет 58%
исследуемых штаммов; умеренно-чувствительными были 23% и 19%
штаммов – устойчивыми.
К вориконазолу чувствительность штаммов Candida spp. составила
97,5%, а доля умеренно-чувствительных и устойчивых составила – 0,9 % и
1,6%, соответственно. При этом 99,7% штаммов C. albicans были
чувствительными к вориконазолу, а среди C. не-albicans – 95,7% штаммов,
тогда как доля умеренно-чувствительных к вориконазолу составила 1,6%,
устойчивых – 2,7%. Также было установлено, что 2 штамма C. guilliermondii,
2 штамма C. parapsilosis, 1 штамм C. tropicalis и 1 штамм C. albicans были
устойчивы и к флуконазолу, и к вориконазолу. Таким образом, среди
штаммов Candida spp. 1,9% были полирезистентны к азоловым
антимикотикам. Наряду с этим, при изучении МПК противогрибковых
препаратов, МПК50, МПК 90 было выявлено, что к флуконазолу у C.
parapsilosis и C. guilliermondii начинает формироваться внутривидовая
устойчивость. Такая же тенденция, как и в России была отмечена в
исследовании в одном из госпиталей Бразилии в период исследования с 1998
по 2005 г [151]. В других исследованиях среди 1029 изолятов C.
guilliermondii (127 медицинских центров) было отмечено снижение
чувствительности к флуконазолу – до 25% штаммов [36].
В Турции при проведении исследования (2008 – 2009 гг.) по
определению чувствительности возбудителей ВБИК к флуконазолу методом
CLSI M27-A3 установили, что Candida spp. были чувствительными в 81,1%,
умеренно-чувствительными – 8,1 % и 10,8% - устойчивыми. В отношении
вориконазола доли умеренно-чувствительных и устойчивых были по 0,9 %
[61]. Таким образом, процентное соотношение категорий чувствительности
116

видов Candida spp., полученных нами, совпадает с данными, полученными


другими исследователями.
К каспофунгину штаммов со сниженной чувствительностью нами
обнаружено не было. При определении чувствительности к позаконазолу мы
ориентировались на значение МПК90 > 1 мкг/мл, также как и большинство
зарубежных исследователей, В нашем исследовании МПК90 позаконазола
составило 0,125 мкг/мл. В исследовании, проведенном в Бразилии, МПК90
позаконазола составляла 0,25 мкг/мл. [43].
При определении чувствительности Candida spp к противогрибковым
препаратам диско-диффузионным методом - протокол CLSI M44-A (141
клинический изолят) мы выявили, что 67,4% штаммов были чувствительны к
флуконазолу, 32,6% – обладали сниженной чувствительностью. Результаты,
полученные в соответствии с двумя стандартными протоколами (CLSI M27-
A3, критерии 2012 г. и CLSI M44-A) были сравнимы. Количество
чувствительных штаммов C. albicans составило 96,3% и 3,7% - устойчивых к
флуконазолу. Среди C. не-albicans видов чувствительными были 48,8 %
(CLSI M27-A3) и 46,6% (CLSI M44-A), умеренно-чувствительными 21,6%
(оба метода), устойчивыми – 29,5% и 27,3%. Чувствительных штаммов C.
albicans к вориконазолу было обнаружено 98,1%, а устойчивых – 1,8% по
обоим протоколам. Среди C. не-albicans видов чувствительными к
вориконазолу было 92% (CLSI M27-A3) и 83% (CLSI M44-A), умеренно-
чувствительных – 2,3% и 9%, устойчивых – 5,7% и 7,9%. Достоверных
различий в результатах, полученных двумя методами, не выявлено.
Для определения чувствительности к противогрибковым препаратам
использовали также коммерческий метод Vitek2 Compact (82 изолята).
Сопоставимость результатов, полученных с использованием протокола CLSI
M27-A3 и метода Vitek2 Compact (по критериям интепретации CLSI M27-A3,
2012 г.) составляла от 78 до 100% в зависимости от вида изолята. Однако при
сравнении результатов по критериям CLSI M27-A3, 2008 г. были отмечены
несовпадения (12% в отношении флуконазола и 4,8% в отношении
117

вориконазола). В исследовании американских ученых в 2011 г., при


сравнении результатов определения чувствительности к каспофунгину и
позаконазолу методами CLSI M27-A3 и Vitek2 Compact, обнаружено, что
совпадение для каспофунгина составило 99,5%, для позаконазола – 95,6%.
Однако, в зависимости от вида Candida spp. вариации в совпадении по
категориям чувствительности составляли от 30% (C. krusei) до 100% (C.
guilliermondii, C. parapsilosis) для каспофунгина [108, 109]. Совпадение
результатов чувствительности к флуконазолу и вориконазолу методами CLSI
M27-A3, Vitek2 Compact, E-test в исследовании французских ученых (2010 г.)
варьировало от 25% до 100% (25% – C. glabrata) [22].
В крупном проспективном исследовании FUNGINOS (Швейцария,
2004-2009 гг.), анализируя 1090 изолятов крови, сравнивали результаты их
чувствительности по критериям интерпретации EUCAST и CLSI M27-A3
(2008 и 2012 гг.). Для C. albicans не было выявлено значимых отличий МИК
флуконазола, вориконазола и каспофунгина, 98% штаммов были
чувствительны. Среди C. не-albicans наблюдали возрастание устойчивых
изолятов среди C. tropicalis и C. parapsilosis для азолов, а также C. glabrata и
C. krusei для каспофунгина в соответствии с новыми критериями EUCAST и
CLSI 2012 г. по сравнению с критериями CLSI 2008 г. [40].
Следовательно, на основании наших исследований можно заключить,
что в качестве метода выбора определения чувствительности к
противогрибковым препаратам возбудителей ВБИК в микробиологической
практике можно рекомендовать диско-диффузионный метод (протокол M44-
A) и микробиологический анализатор Vitek2 Compact с критериями CLSI
M27-A3 (2012 г). Метод разведения в жидких питательных средах (протокол
CLSI M27-A3), в связи с его трудоемкостью, можно рекомендовать к
использованию в основном в референтных лабораториях.
Учитывая возрастающее значение комплекса видов C. parapsilosis при
инвазивном кандидозе мы проанализировали 65 масс-спектро-профилей
этого комплекса. Были выявлены только штаммы, принадлежащие к виду C.
118

parapsilosis sensu stricto, криптические виды C. metapsilosis, C. orthopsilosis


не были обнаружены. Однако, в зарубежных исследованиях отмечают
обнаружение и криптических видов комплекса C. parapsilosis – C.
orthopsilosis, C. metapsilosis как методом MALDI-TOF масс-спектрометрии,
так и рефентным методом (ДНК-секвенирование). В Италии при
сравнительном исследовании комплекса C. parapsilosis, в который входят
такие виды как C. metapsilosis, C. orthopsilosis и собственно C. parapsilosis,
методом MALDI-TOF масс-спектрометрии и AFLP (молекулярно-
генетический метод) были выявлены все виды с высокой степенью точности,
входящие в комплекс.
Путем проведения кластерного анализа нами выявлены сходные
штаммы от разных пациентов – изоляты №№ 29, 30, 31 – г. Москва , №№ 14,
15 – г. Тюмень, №№ 24, 42 – г. Санкт-Петербург (в одном отделении и в один
промежуток времени). Также выявлено, что в субкластере № 2
располагаются устойчивые к флуконазолу изоляты №№ 21 и 39, а в
субкластере №3 находятся изоляты №№ 24 и 41, обладавшие устойчивостью
также и к вориконазолу (изолят № 41).
Следует заметить, что поскольку среди исследуемых штаммов C.
parapsilosis были выявлены сходные масс-спектры штаммов, к тому же
имевшие устойчивость к азоловым препаратам в одном и том же субкластере,
мы использовали ДНК – секвенирование в качестве метода поиска
полиморфизма у данных устойчивых штаммов. Полиморфизм в регионе
D1/D2 гена 28S рРНК, в том числе и множественный, был выявлен у
чувствительных к флуконазолу и вориконазолу штаммах C. parapsilosis, у
устойчивых штаммов полиморфизма не наблюдали. Следовательно, изучение
в дальнейшем полиморфных вариантов генов Candida spp. будет
перспективным при разработке быстрых методов определения устойчивости
возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза к
противогрибковым препаратам.
119

ВЫВОДЫ
1. Этиология внутрибольничного инвазивного кандидоза в РФ (2011–
2014 гг.) представлена следующими основными видами Candida (C.
albicans – 43,2%, C. parapsilosis – 20,2%, C. glabrata – 11,5%, C.
tropicalis – 9,6%, C. krusei – 6,2%, C. guilliermondii – 5,3%) и редкими
(C. lusitaniae – 1,3%, C. dubliniensis – 0,6%, C. pararugosa – 0,6%, C.
bracarensis – 0,3%, C. kefyr – 0,3%, C. lipolytica – 0,3%, C. utilis – 0,3%,
C. inconspicua – 0,3%).
2. Установлено, что в этиологической структуре основных возбудителей
инвазивного кандидоза возросла доля C. не-albicans (с 46% в 2012 г. до
67,2% в 2014 г.), при этом увеличилась доля C. parapsilosis (9,8% в
2012 г. против 27,8% в 2014 г., р <0,05). Уровень C. albicans достоверно
выше в Сибирском (75%) и Уральском (57,8%) федеральных округах,
р<0,05, по сравнению с другими федеральными округами (Северо-
Западный – 37%, Южный – 35%).
3. MALDI-TOF масс-спектрометрия является методом выбора для
определения вида возбудителей внутрибольничного инвазивного
кандидоза.
4. Чувствительными к флуконазолу были 97% штаммов C. albicans, к
вориконазолу - 99,7%. Среди штаммов C. не-albicans видов
чувствительными к флуконазолу были 58%, к вориконазолу – 95,7 %. К
каспофунгину устойчивых штаммов не обнаружено.
5. Диско-диффузионный метод CLSI M44-A является методом выбора
для определения чувствительности возбудителей инвазивного
кандидоза к противогрибковым препаратам в практике
микробиологических лабораторий.
120

Алгоритм диагностики возбудителей инвазивного кандидоза

ПОСЕВ КРОВИ И ДРУГИХ СТЕРИЛЬНЫХ В НОРМЕ альтернатива


БИОСУБСТРАТОВ среда Сабуро, системы
культивирования крови
(аназаторы гемокультур)

ПОЛУЧЕНИЕ КУЛЬТУРЫ CANDIDA SPP.

ВИДОВАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ альтернатива


MALDI-TOF масс-спектрометрия – метод выбора биохимические тест-
системы,
автоматические
анализаторы
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К
ПРОТИВОГРИБКОВЫМ ПРЕПАРАТАМ альтернатива
CLSI M44-A -метод выбора Vitek 2 Compact
CLSI M27-A3-в референс
лабораториях
121

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. У пациентов с признаками инвазивного кандидоза проводить


исследование всех стерильных в норме биосубстратов (кровь, ЦСЖ,
перитонеальная жидкость) на наличие грибов рода Candida.
2. Обязательно определять до вида все культуры Candida spp.,
выделенные из различных локализаций от пациентов с инвазивным
кандидозом современными методами. Для точной идентификации C.
не-albicans видов рекомендуется использовать метод MALDI-TOF
масс-спектрометрии.
3. Обязательно определять чувствительность всех культур Candida spp.,
выделенных из стерильных в норме биосубстратов к
противогрибковым препаратам.
122

ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

1. Анализ главных компонент белков масс-спектра (PCA-анализ) с


построением PCA-дендрограмм является перспективным для
внутривидового типирования штаммов Candida spp. и анализа
эпидемиологического процесса в отделениях реанимации и
интенсивной терапии, а также изучения способности штаммов к
образованию биопленок.
2. Разработка новых быстрых некультуральных методов обнаружения
Candida spp. в крови и определения их чувствительности на основе
геномики и протеомики.
123

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ


ВБИК – внутрибольничный кандидоз
ДК – дрожжевая клетка
ДМСО – диметилсульфоксид
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
ИД – идентификация
ИК – инвазивный кандидоз
MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization – Time-of-Flight
Mass-spectrometry) – MALDI-TOF масс-спектрометрия (Матрично-
ассоциированная лазерная десорбция/ионизация – время-пролетная масс-
спектрометрия)
МПК – минимальная подавляющая концентрация
МСП – масс-спектро-профиль
ПЦР – полимеразная цепная реакция
рРНК – рибосомальная рибонуклеиновая кислота
ЦСЖ – церебро-спинальная жидкость
У – устойчивый
УЧ – умеренно-чувствительный
Ч – чувствительный
ATCC (American Type Culture Collection) - американская коллекция типовых
культур
BSL (BoiSafety Level) – уровень биологического риска
CLSI ( Clinical and Laboratory Standards Institute) – Институт клинических и
лабораторных стандартов
EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) –
Европейский комитет по исследованию противомикробной
чувствительности
РСА (Principal cluster analysis) – анализ главных компонент
RPMI – среда для культур клеток
spp. – виды (грибов)
124

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Баранов В.С. Геномика на пути к предиктивной медицине // Acta
Nature. – 2009. – №3. – 77-86 c.
2. Выборнова И. В. Определение чувствительности Candida spp. к
флуконазолу двумя вариантами диско-диффузионного метода / И. В.
Выборнова, Н. В. Васильева, Т. С. Богомолова // Проблемы
медицинской микологии. – 2007. – Т.9, №2. – С. 5-7.
3. Диагностика микозов/ Р. А. Аравийский, Н. В. Васильева, Н. Н.
Климко // СПб.: Издательский дом СПбМАПО, 2004. – 186 с., ил
4. Диагностика и лечение микозов в отделениях реанимации и
интенсивной терапии. Российские национальные рекомендации. / А.Б.
Бакиров, А. В. Веселов, А. В. Власенко и др. (под ред. Климко Н. Н.) //
Москва: Изд.дом «Компания Боргес», 2010 г. – 92 с.
4. Идентификация возбудителей микозов с помощью секвенирования
ДНК / Ю. В. Михайлова, М. В. Руднева, Г. А. Чилина и др. //
Проблемы медицинской микологии. – 2013. – Т. 15, №2. – С. 105-106.
5. Микологические культуральные исследования. Методические
рекомендации / Н. В. Васильева, Н. П. Елинов, Т. С. Богомолова и др.
// ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И.И.Мечникова. – СПб. – 2013 г. – 40с.
6. Михайлова Ю.В. Молекулярная идентификация представителей
Aspergillus spp. из Российской Коллекции Патогенных Грибов / Ю. В.
Михайлова, Г. А. Чилина, А. Г. Полищук // Проблемы медицинской
микологии. – 2012. – Т. 14, №4. – С. 46-49.
7. Мухитов А.Р., Архипова С.С. Никольский Е.Е. Современная световая
микроскопия в биологических и медицинских исследованиях. М.:
Наука, 2011.-140с.
8. Патогенные и условно-патогенные макро- и микромицеты как
объекты царства грибов (Fungi), их характеристика с учётом
требований международного кодекса ботанической номенклатуры:
125

учебное пособие, выпуск I. / Н.П. Елинов, Н. В. Васильева, А. А.


Маметьева и др. (под ред. Елинова Н. П. // СПб.:КОСТА, 2011. – 64 с.
9. Пестова, Л.А. Кандидемия и острый диссеминированный кандидоз у
больных в отделениях интенсивной терапии: дис. канд. мед. наук
03.00.24, 14.00.37 / Пестова Любовь Альбертовна. – СПб, 2004. – 160 с.
10. ПЦР в реальном времени /Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов
Д.Ю. и др. (под ред. Д.В. Ребрикова). // М.: БИНОМ. Лаборатория
знаний. – 2014. - 223 с.
11. Рациональная научно-практическая терминология патогенных и
условно-патогенных грибов и вызываемых ими заболеваний: учебное
пособие, выпуск III. / Н. П. Елинов, Н. В. Васильева, Е. Р. Рауш и др.
(под ред. Елинова Н. П. // СПб.:ООО «МГК», 2014. – 72 c.
12. Реброва, О.В. Статистический анализ медицинских данных.
Применение пакета прикладных программ «Статистика» / О.В.
Реброва – 3-е изд. – Москва: Медиа Сфера, 2006. – 312 с.
13. СП 1.3.2322-08. Безопасность работы с микроорганизмами III и IV
групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных
болезней. – М., Российская газета, 2011. – 13 июля .
14. Candida. Кандидозы. Лабораторная диагностика / под ред. Н. П.
Елинов, Н. В. Васильева, А. А. Степанова и др. ( под ред. Елинова
Н.П.) // СПб.: КОСТА, 2010. – 224 с.
15. In vitro активность флуконазола и вориконазола в отношении более
10000 штаммов дрожжей: результаты 5-летнего проспективного
исследования ARTEMIS Disk в России / А. В. Веселов, Н. Н. Климко,
О. И. Кречикова и др. // Клиническая микробиология и антимикробная
химиотерапия. – 2008. – Т. 10.,№ 4. – С. 345-354.
16. A 1-year prospective survey of candidemia in Italy and changing
epidemiology over one decade / A. M. Tortorano, A. Prigitano, C. Lazzarini
et al. // Infection. – 2013. – Vol.41. – P.655–662.
126

17. A.V. Espinel-Ingroff /Medical Mycology in the United States. A historical


analysis (1894-1996)/ Kluwer Academic Publishers, the Netherlands, 2003
18. Alastruey-Izquierdo A. Antifungal susceptibility profile of cryptic species
of Aspergillus. / A. Alastruey-Izquierdo, L.Alcazar-Fuoli, M.Cuenca-
Estrella // Mycopathologia. – 2014. – Vol.178. – P.427–433.
19. Amino acid substitutions in the Candida albicans sterol Δ5,6-desaturase
(Erg3p) confer azole resistance: characterization of two novel mutants with
impaired virulence / F. Morio, F. Pagniez, C. Lacroix et al. // J. Antimicrob.
Chemother. – 2012. – Vol.67. – P.2131–2138.
20. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for
phylogenetics / White T. J., Bruns T., Lee S. et al. // PCR Protocols: A
Guide to Methods and Applications. – 1990. – P. 315-322.
21. An Implementation Strategy for the Use of Chromogenic Media in the
Rapid, Presumptive Identification of Candida Species / H. J. Adam, S.E.
Richardson, M. Roscoe et al. // The Open Mycology Journal. – 2010. –
Vol.4. – P. 33-38.
22. Antifungal susceptibility of 205 Candida spp. isolated primarily during
invasive Candidiasis and comparison of the Vitek 2 system with the CLSI
broth microdilution and Etest methods / N. Bourgeois, L.
Dehandschoewercker, S. Bertout et al. // J. Clin. Microbiol. – 2010. –
Vol.48. – P.154-161.
23. Antifungal susceptibility testing: current role from the clinical laboratory
perspective / B. Posteraro, R. Torelli, E. De Carolis // Mediterr. J. Hematol.
Infect. Dis. – 2014. – Vol.6. – e2014030.
24. Antifungal susceptibilities of Candida glabrata species complex, Candida
krusei, Candida parapsilosis species complex and Candida tropicalis
causing invasive candidiasis in China: 3 year national surveillance / M.
Xiao, X. Fan, S. C. Chen et al. // J. Antimicrob. Chemother. – 2014. – Vol.3.
– P. 152-161
127

25. Application of MALDI-TOF MS for requalification of a Candida clinical


isolates culture collection / R. Lima-Neto, C. Santos, N. Lima et al. // Braz.
J. Microbiol. – 2014. – Vol.45. – P. 515–522.
26. Arendrup M. Epidemiology of invasive candidiasis / M. Arendrup // Current
Opinion in Critical Care. – 2010. – Vol.16. – P. 445–452.
27. Assesment of ribosomal Large-Subunit D1-D2, Internal Transcribed Spacer
1, and Internal Transcribed Spacer 2 regions as targets for molecular
identification of medically important Aspergillus species / H. P. Hinrikson,
S. F. Hurst, T. J. Lott et al. // J. Clin. Microbiol . – 2007. – Vol. 43, № 5. – P.
2092-2103.
28. ATB fungus Comparative evaluation of ATB Fungus 2 and Sensititre
YeastOne panels for testing in vitro Candida antifungal susceptibility / E.
Eraso, M. Ruesga, M. Villar-Vidal et al. // Rev. Iberoam. Micol. – 2008. –
Vol.25. – P. 3-6.
29. Atlas of clinical fungi: electronic version 3.1. [Electronic resource] / Hoog
G.S. de, Guarro J., Gene J. et al. - Utrecht, Reus, 2011. – (СD-ROM).
30. AUXACOLOR2. User manual book. BioRad – USA. – 2003. – 79 p.
31. Balashov S. V. Assessing resistance to the echinocandin antifungal drug
caspofungin in Candida albicans by profiling mutations in FKS1 / S. V.
Balashov, S. Park, D. S. Perlin // Antimicrob. Agents Chemother. – 2006. –
Vol.50. – P. 2058-2063.
32. Barnett J. A. A history of research on yeasts 12: medical yeasts part 1,
Candida albicans / J. A. Barnett // Yeast. – 2008. – Vol.25. – P.385–417.
33. Candida bloodstream infections: comparison of species distributions and
antifungal resistance patterns in community-onset and nosocomial isolates
in the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program, 2008-2009 / M. A
Pfaller, G. J. Moet, S. A. Messer et al. // Antimicrobial Agents and
Chemotherapy. – 2011. –Vol. 55. – P. 561-566.
34. Candida bracarensis detected among isolates of Candida glabrata by
peptide nucleic acid fluorescence in situ hybridization: susceptibility data
128

and documentation of presumed infection / J. A. Bishop, N. Chase, S. S.


Magill et al. // J. Clin. Microbiol. – 2008. – Vol.46. – P. 443–446.
35. Candida identification: a journey from conventional to molecular methods
in medical mycology / M. Z. Alam, Q. Alam, A. Jiman-Fatani et al. //
World J. Microbiol. Biotechnol. – 2014. – Vol. 30. – P. 1437-1451.
36. Candida guilliermondii, an Opportunistic Fungal Pathogen with Decreased
Susceptibility to Fluconazole: Geographic and Temporal Trends from the
ARTEMIS DISK Antifungal Surveillance Program / M. A. Pfaller, D. J.
Diekema, M. Mendez et al. // J. Clin. Microbiol. – 2006. – Vol.44. –
P.3551–3556.
37. Candidiasis: New Insights for the Healthcare Professional / Q. Ashton
Acton (eds.) – Scholarly Editions, Atlanta, 2013. – P.57
38. Candida parapsilosis sensu stricto and the closely related species Candida
orthopsilosis and Candida metapsilosis in vulvovaginal candidiasis / Y.
Zhu, Y. Shan, S. Fan et al. // Mycopathologia. – 2014. – Vol. 17. – P.17-23
39. Candida parapsilosis,Candida orthopsilosis, and Candida metapsilosis
virulence in the non-conventional host Galleria mellonella / S. Gago, R.
Garcнa-Rodas, I.Cuesta et al. // Virulence. – 2014. – Vol. 5 - P.278–285.
40. Candida species distribution and antifungal susceptibility testing according
to European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing and new vs.
old Clinical and Laboratory Standards Institute clinical breakpoints: a 6-
year prospective candidaemia survey from the fungal infection network of
Switzerland / C. Orasch, O. Marchetti, J. Garbino et al. // Clin. Microbiol.
and Infect. – 2014. – Vol.20. – P. 698–705.
41. Candidemia in Europe: epidemiology and resistance. / A. M. Tortorano, C.
Kibbler, J. Peman et al. // Int J Antimicrob Agents. – 2006. – Vol.27. –
P.359–366.
42. Candidemia at intensive care units (ICU) in Saint-Petersburg, Russia / L.
Pestova, N. Klimko, T. Bogomolova et al. // Clinical microbiology and
infection. – 2004. – Vol. 10. – P. 639-640.
129

43. Candidemia epidemiology and susceptibility profile in the largest Brazilian


teaching hospital complex / A. Lopes Motta, G. Madeira, D. de Almeida et
al. // Braz. J. Infect. Dis. – 2010. – Vol.14. – P.15-24.
44. Candidaemia associated with decreased in vitro fluconazole susceptibility:
is Candida speciation predictive of the susceptibility pattern? / D. A.
Oxman, J.K. Chow, G.Frendl et al. // J. Antimicrob. Chemother. – 2010. –
Vol.65. – P.1460-1465.
45. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Reference method for
antifungal disk diffusion susceptibility testing of yeasts; approved guideline
// CLSI document M44-A. – 2004. – CLSI, Wayne, PA, USA.
46. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Reference Method for
Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts: third edition //
CLSI document M27-A3. – 2008. - CLSI, Wayne, PA, USA.
47. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Reference Method for
Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts: third edition //
CLSI document 3rd Informational Supplement M27-S3. – 2008. - CLSI,
Wayne, PA, USA.
48. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Reference Method for
Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts: third edition //
CLSI document 3rd Informational Supplement M27-S4. – 2012. - CLSI,
Wayne, PA, USA.
49. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Interpretive criteria for
identification of bacteria and fungi by DNA target sequencing; approved
guideline. // CLSI document MM18-A. – 2008. – CLSI, Wayne, PA, USA.
50. Clinically achievable caspofungin, micafungin and anidulafungin
concentrations within the bloodstream:experience from a mycology
reference laboratory /N. P. Wiederhold, , D. A. Sutton, A. W. Fothergill et
al. // Mycoses. – 2013. – Vol. 56. –P. 58.
51. Clinical practice guidelines for the management of candidiasis: 2009 update
by the Infectious Diseases Society of America / P. G. Pappas, C. A.
130

Kauffman, D. Andes et al. // Clinic. Infect. Dis. – 2009. – Vol.48. – P. 503-


535.
52. Comparison of results of fluconazole and voriconazole disk diffusion
testing for Candida spp. with results from a central reference laboratory in
the ARTEMIS DISK Global Antifungal Surveillance Program / M. A.
Pfaller, L. Boykena, R. J. Hollisa et al. // J. Clin. Microbiol. – 2009. –
Vol.48. – P.1358–1365.
53. Comparison of minimal inhibitory concentration elevation in Candida
dubliniensis and Candida albicans after fluconazole exposure in vitro / K.
Chaicumpar, S. Srichangwang, K. Samerpitak et al. // Mycoses. – 2013. –
Vol.56. – P.63.
54. Crist A.E. Jr. Comparison of the MUREX C. albicans, albicans-Sure, and
BactiCard Candida test kits with the germ tube test for presumptive
identification of Candida albicans / A.E.Jr. Crist, T.J. Dietz, K.
Kampschroer // J. Clin. Microbiol. – 1996. – Vol. 34. – P. 2616–2618.
55. Cuenca-Estrella M. Antifungal drug resistance mechanisms in pathogenic
fungi: from bench to bedside / M. Cuenca-Estrella // Clin. Microbiol. Infect.
– 2014. – Vol. 20, Suppl. 6. – P.54–59.
56. Direct MALDI-TOF Mass Spectrometry Assay of Blood Culture Broths for
Rapid Identification of Candida Species Causing Bloodstream Infections:
an Observational Study in Two Large Microbiology Laboratories / T. Spanu,
B. Posteraro, B. Fiori et al. // J. Clin. Microbiol. – 2012. - Vol. 50. – P. 176-
179.
57. Distinct roles of Candida albicans drug resistance transcription factors
TAC1, MRR1, and UPC2 in virulence / A. Lohberger, A. T. Coste, D.
Sanglard et al. // Eukaryot. Cell – 2014. – Vol.13. – P.127–142.
58. Delaloye J Invasive candidiasis as a cause of sepsis in the critically ill
patient / Delaloye J, Calandra T // Virulence. – 2014. – Vol.5. – P.161-169.
131

59. Doyle, J. J. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh
leaf tissue / J. J. Doyle, J. L. Doyle // Phytochem. Bull. – 1987. – Vol.19. –
P. 11-15.
60. Doyle S. Fungal proteomics: from identifcation to function / S. Doyle //
Jour. Federation of European Microbiological Societies. – 2011. – Vol.321.
– P.18-23.
61. Eksi F. In Vitro Susceptibility of Candida Species to Four Antifungal
Agents Assessed by the Reference Broth Microdilution Method / F. Eksi, E.
D. Gayyurhan, I. Balci // The Scientific World Journal – 2013. – Vol. 6 . –
P.214-219.
62. Elucidating drug resistance in human fungal pathogens / J.L. Xie , E.J.
Polvi, T. Shekhar-Guturja // Future Microbiol. – 2014. – Vol.9. – P.523–
542.
63. ESCMID guideline for the diagnosis and management of Candida diseases
2012: diagnostic procedure / M. Cuenca-Estrella, P. E. Verweij, M. C.
Arendrup et al. //Clinical Microbiology and Infection diseases. – 2012. –
Vol.18.suppl. 7. – P.9-18.
64. Epidemiology of invasive fungal infections in the intensive care unit:
Results of a multicenter Italian survey (AURORA Project) / M.T. Montagna,
G. Caggiano, G. Lovero et al. // Infection. – 2013. – Vol.41. – P. 645–653.
65. Epidemiology and predictive factors for early and late mortality in Candida
bloodstream infections: a population-based surveillance in Spain / M. Puig-
Asensio, B. Padilla, J. Garnacho-Montero et al. // Clin Microbiol Infect. –
2014. – Vol.20. – O245-254.
66. Epidemiology and outcomes of candidemia in 3648 patients: data from the
Prospective Antifungal Therapy (PATH Alliance) registry, 2004–2008 / M.
Pfaller, D. Diekema, H.-U. Meier-Kriesche et al. // Diagnostic
Microbiology & Infectious Disease. – 2012. – Vol.74. – P.323–331.
132

67. Evaluation of New Colorimetric Vitek 2 Yeast Identification Card by Use


of Different Source Media / G. Valenza, J. Strasen, F. Schäfer et al. // J.
Clin. Microbiol. – 2008. – Vol.46. – P.3784-3787.
68. Evolution of Mating within the Candida parapsilosis Species Group / S.
Sixiang , L. M. Holland, C. F. McGee et al. // Eukaryot Cell. –2011. –
Vol.10. – P. 578–587.
69. Evolution of pathogenicity and sexual reproduction in eight Candida
genomes / G. Butler, M. D. Rasmussen, M. F. Lin et al // Nature. – 2009. –
Vol. 459. – P.657-662.
70. Espinel-Ingroff A.V. Medical Mycology in the United States. A historical
analysis (1894-1996) / A.V. Espinel-Ingroff // Mycopathologia – 2005. –
Vol/ 160/ - P. 187-188.
71. Espinel-Ingroff A. EUCAST and CLSI: Working Together Towards a
Harmonized Method for Antifungal Susceptibility Testing / A. Espinel-
Ingroff, M.Cuenca-Estrella, E. Cantón // Clinical Microbiology and
Infection. – 2013. – Vol.7. – p 59-67
72. Epidemiology, management, and risk factors for death of invasive Candida
infections in critical care: A multicenter, prospective, observational study in
France (2005–2006) / O. Leroy, J.-P. Gangneux et al. // Crit. Care Med. –
2009. – Vol.37. – P. 1612-1618.
73. Espinel-Ingroff A. International and multicenter comparison of EUCAST
and CLSI M27-A2 broth microdilution methods for testing susceptibilities
of Candida spp. to fluconazole, itraconazole, posaconazole, and
voriconazole / A. Espinel-Ingroff, F. Barchiesi, M. Cuenca-Estrella // J. Clin.
Microbiol. – 2005. – Vol.43. – P.3884-3889.
74. Espinel-Ingroff A. EUCAST and CLSI: Working Together Towards a
Harmonized Method for Antifungal Susceptibility Testing / A. Espinel-
Ingroff, M. Cuenca-Estrella, E. Cantуn // Clinical Microbiology and
Infection. – 2013. – Vol.7. – P.59-67
133

75. European Committee for Antifungal Susceptibility Testing (EUCAST).


Method for the determination of broth dilution MICs of antifungal agents
for fermentative yeasts // EUCAST definitive document EDef 7.1. – 2004. –
EUCAST, Geneva.
76. Evaluation of VITEK 2 and RapID yeast plus systems for yeast species
identification: experience at a large clinical microbiology laboratory. / M.
Sanguinetti, Porta, M. Sali et al. // J. Clin. Microbiol. – 2007. – Vol.45. –
P.1343–1346.
77. First report of a clinical isolate of Candida haemulonii in Brazil / J.Nobrega
de Almeida, A. Lopes Motta, F. Rossi et al. // Clinics (Sao Paulo). – 2012.
Vol.67. – P.1229–1231.
78. Fleck R. In vitro susceptibility of Candida species to five antifungal agents
in a German university hospital assessed by the reference broth
microdilution method and Etest. / R. Fleck, D. Annebärbel, H. Herbert // J.
Antimicrob. Chemother. – 2007. – Vol.59. – P. 767–771.
79. FUNGEMYCA Study Group Epidemiology, species distribution and in
vitro antifungal susceptibility of fungaemia in a Spanish multicentre
prospective survey / J. Pemán, E. Cantón, G. Quindós, et al. // Journal of
Antimicrobial Chemotherapy. – 2012. – Vol. 67. – Suppl. 5. – P. 1181–
1187.
80. Genetic dissection of azole resistance mechanisms in Candida albicans and
their validation in a mouse model of disseminated infection / D. M.
MacCallum, A. Coste, F. Ischer et al. // Antimicrob. Agents Chemother. –
2010. – Vol. 54. – P.1476–1483.
81. Gundes S. G. Comparative performance of Fungichrom I, Candifast and
API 20C Aux systems in the identification of clinically significant yeasts / S.
G. Gundes, S. Gulenc, R. Bingol // J. Med. Microbiol. – 2011. – Vol. 50. –
p.1105-1110.
134

82. Guinea J. Global trends in the distribution of Candida species causing


candidemia / J. Guinea // Clin. Microbiol. and Infect. – 2014. – Vol.20,
Suppl.6. – P.5–10.
83. Hameed S. Novel regulatory mechanisms of pathogenicity and virulence to
combat MDR in Candida albicans / S. Hameed, Z. Fatima // Int. J.
Microbiol. – 2013. - Vol.2013 – P.1-10.
84. Hidden Killers: Human Fungal Infections / G. D. Brown, D. W. Denning, A.
R. Gow et al. // Sci. Transl. Med. – 2012. – Vol. 4. – P.165
85. Improved clinical laboratory identification of human pathogenic yeasts by
matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry
/ O. Bader, M. Weig, L. Taverne-Ghadwal et al. // Clin Microbiol Infect. –
2011. – Vol.17. – P.1359-65.
86. Incidence of bloodstream infections due to Candida species and in vitro
susceptibilities of isolates collected from 1998 to 2000 in a population-
based active surveillance program / R. A. Hajjeh, A. N. Sofair, L. H.
Harrison et al. // J. Clin. Microbiol. – 2004. – Vol.42. – P.1519–1527.
87. Invasive candidiasis in pediatric intensive care in Greece: a nationwide
study / L. Vogiatzi, S. Ilia, G. Sideri et al. // Intensive Care Medicine. –
2013. – Vol. 39. – P. 2188 – 2195.
88. Invasive candidemia in Norway a comparison of 2 decades / L. Hesstvedt, P.
Gaustad, R. Hannula et al. // Mycoses. – 2013. – Vol.56. – 15.
89. Invasive infections due to Candida norvegensis and Candida inconspicua:
report of 12 cases and review of the literature / J. Guitard, A. Agoulvant, V.
Letscher-Bru et al. // Medical Mycology. – 2013. – Vol.51. – P.795-799.
90. Iwen P.C. Utilization of the internal transcribed spacer regions as molecular
targets to detect and identify human fungal pathogens / P. C. Iwen, S. H.
Hinrichs, M. E. Rupp // Med Mycol. – 2002. – Vol. 40. – P.87-109.
91. Jamal W. Y. Comparative evaluation of two matrix-assisted laser
desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)
135

systems for the identification of clinically significant yeasts / W.Y. Jamal, S.


Ahmad // Intern. J. Infect. Dis. – 2014. – Vol.26. – P. 14-21.
92. Khardori N. Future of diagnostic microbiology / N. Khardori // Indian J
Med Microbiol. – 2014. – Vol. 32. – P. 371-377.
93. Kofteridis D.P. Caspofungin-non-susceptible Candida isolates in cancer
patients / D.P. Kofteridis, R. E. Lewis, D. P. Kontoyiannis // Journal of
Antimicrobial Chemotherapy. – 2010. – Vol.65. – P. 293-295.
94. Non-albicans Candida spp. causing fungaemia: pathogenicity and
antifungal resistance / A. J. Barnes // J. hosp.infect. – 2002. – Vol.50. –
P.243-260.
95. Kurtzman C. P. Systematics and taxonomy of yeasts / C. P. Kurtzman //
Contrib. Microbiol. – 2000. – Vol.51. – P.14.
96. Kwon-Chung K. J. Phylogenetic spectrum of fungi that are pathogenic to
humans / K.J. Kwon-Chung // Clinical Infect. Dis. – 1996. – Vol.19. – P.1-7.
97. Lachance M.-A. Kluyveromyces van der Walt (1971)/ M.-A. Lachance, T.
Boekhout, J.W. Fell // The yeasts: a taxonomic study / C.P. Kurtzman,
J.W.Fell, T. Boekhout (eds.) – Elsevier Science & Technology, Amsterdam,
2011. – Р. 477-479.
98. Laboratory biosafety manual. WHO. 3rd ed – Geneva, 2004. – 170 p.
99. Latin American Invasive Mycosis Network. Epidemiology of candidemia in
Latin America: a laboratory-based survey / M. Nucci, F. Queiroz-Telles, T.
Alvarado-Matute et al. // PLoS ONE. – 2013. – Vol.8. – e59373.
100. Li T. Y. Characterization of Aspergillus spores by matrix-assisted laser
desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry / T. Y. Li, B. H. Liu,
Y. C. Chen // Rapid Commun. Mass Spectrom. – 2000. – Vol.14. – P.2393–
2400.
101. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry
for fast and reliable identification of clinical yeast isolates / G. Marklein, M.
Josten, U. Klanke et al. // J. Clin. Microbiol. – 2009. – Vol.47. –P.2912-
2917.
136

102. Matrix-assisted ultraviolet-laser desorption of nonvolatile compounds / M.


Karas, D. Bachmann, D. Bahr et al. //Int. J. Mass Spectrom. Ion Proc. –
1987. – Vol. 78. – P. 53-68.
103. MALDI Biotyper 3.1. User manual revision 1. Bruker Daltonics. – Bremen.
– 2012. – 212 p.
104. MALDI-TOF MS: an upcoming tool for rapid detection of antibiotic
resistance in microorganisms / M. Kostrzewa, K. Sparbier, T. Maier et al. //
Prot. Clin. Appl. – 2013. –Vol.7. – P.767–778.
105. McIlroy, M. A. Failure of fluconazole to suppress fungemia in a patient
with fever, neutropenia, and typhilitis / M. A. McIlroy // J. Infect. Dis. –
1991. – Vol.163. – P.420–421.
106. MFS multidrug transporters in pathogenic fungi: do they have real clinical
impact? / C. Costa, P. J. Dias, I. Sá-Correia et al. // Front. Physiol. – 2014. –
Vol. 5. – P.197.
107. Mnichowska-Polanowska M. In vitro susceptibility testing of candida
albicans by using Micronaut-Am method / M. Mnichowska-Polanowska //
Mycoses – 2013. - Vol. 56. – P.68.
108. Multicenter Evaluation of the New VITEK 2 Advanced Colorimetric Yeast
Identification Card / D. J. Hata, L. Hall, A.W. Fothergill et al. // J Clin
Microbiol. – 2007. – Vol. 45. – P.1087–1092.
109. Multicenter Comparison of the Vitek 2 Antifungal Susceptibility Test with
the CLSI Broth Microdilution Reference Method for Testing Caspofungin,
Micafungin, and Posaconazole against Candida spp. / J. F. Peterson, M. A.
Pfaller, D. J. Diekema et al. // J. Clin. Microbiol. – 2011. – Vol.49. –
P.1765–1771.
110. Messer S.A. International surveillance of Candida spp. and Aspergillus
spp.: report from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program (2003) /
S. A. Messer, R. N. Jones, T.R. Fritsche // J. Clin. Microbiol. – 2006. –
Vol.44. – P.1782-1787.
137

111. Metabolic control of antifungal drug resistance / N. Robbins , C. Collins , J.


Morhayim et al. // Fungal Genet. Biol. – 2010. – Vol. 47. – P.81–93.
112. Molecular Identification and Antifungal Susceptibility Testing of Clinical
Isolates of the Candida rugosa Species Complex and Proposal of the New
Species Candida neorugosa / K. Paredes, A. Deanna, J. Sutton et al. //J. Clin.
Microbiol. – 2012. – Vol. 50. – P. 2397-2403.
113. Molecular Identification and Antifungal Susceptibility of Yeast Isolates
Causing Fungemia Collected in a Population-Based Study in Spain in 2010
and 2011/ J. Guinea, O. Zaragoza, P. Escribano et al. // Antimicrob Agents
Chemother. – 2013. – Vol.58. – P. 1529-1537.
114. Moran G, Coleman D, Sullivan D. An introduction to the medically
important Candida Species / R. A. Calderone, C. J. Clancy // Candida and
Candidiasis / R. A. Calderone, C. J. Clancy. (eds). – ASM Press,
Washington, DC, 2002. – P. 11- 27.
115. National surveillance of fungemia in Denmark (2004 to 2009) / M. C.
Arendrup, B. Bruun, J. J. Christensen et al. // J Clin Microbiol. – 2011. –
Vol.49. – P.325–334.
116. No increase in primary nosocomial candidemia in 682 German intensive
care units during 2006 to 2011/ E. Meyer, C. Geffers, P. Gastmeier et al. //
Euro Surveill. – 2013. – Vol.18. – P.10-12.
117. Odds F. C. One year prospective survey of Candida bloodstream infections
in Scotland / F. C. Odds, M. F. Hanson, A. D. Davidson // J. Med. Microbiol.
– 2007. – Vol.56. – P. 1066–1075.
118. Page B. T. Rapid identification of Candida species and other clinically
important yeast species by flow cytometry / B. T. Page, C. P. Kurtzman // J.
Clin. Microbiol. – 2005. – Vol.43. – P.4507-4514.
119. Pappas P. G. Antifungal Clinical Trials and Guidelines: What We Know
and Do Not Know / P. G. Pappas // Cold Spring Harbor Perspectives in
medicine. – 2014. – Vol.12. – P. 15-21
138

120. Pappas PG. Clinical practice guidelines for the management of candidiasis:
2009 update by the Infectious Diseases Society of America / Pappas PG,
Kauffman CA, Andes D, Benjamin DK Jr // Clinical Infection Diseases. –
2009. – Vol.48. – P.503-535.
121. PCR protocol for specific identification of Candida nivariensis, a recently
described pathogenic yeast / J. Alcoba-Flórez , M. del Pilar, F.J. A.
González-Paredes et al. // J. Clin. Microbiol. – 2005. – Vol.43. – P. 6194–
6196.
122. Perlin D.S. Antifungal drug resistance: do molecular methods provide a way
forward? / D. S. Perlin // Curr. Opin. Infect. Dis. – 2009. – Vol.22. – P.568–
573.
123. Perlroth J. Nosocomial fungal infections: epidemiology, diagnosis, and
treatment / J. Perlrot, B. Choi, B. Spellberg // Medical Mycology. – 2007. –
Vol.45. – P. 321-346.
124. Pestova L. Candidemia at intensive care units (ICU) in Saint-Petersburg,
Russia / Pestova L., Klimko N., Bogomolova T. et al. // Clinical
microbiology and infection. – 2004. – Vol. 10. – P.639-640.
125. Pfaller M.A. Antifungal drug resistance: mechanisms, epidemiology, and
consequences for treatment / M. A. Pfaller // Am. J. Med. – 2012. –
Vol.125. – S3–S13.
126. Pfaller M. A. Comparison of EUCAST and CLSI broth microdilution
methods for the susceptibility testing of 10 Systemically active antifungal
agents when tested against Candida spp. / M. A. Pfaller, M. Castanheira //
Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. – 2014. – Vol.79. –P.198–
204.
127. Pfaller M. A. Triazole and Echinocandin MIC Distributions with
Epidemiological Cutoff Values for Differentiation of Wild-Type Strains
from Non-Wild-Type Strains of Six Uncommon Species of Candida / M. A.
Pfaller, M. Castanheira, D. J. Diekema // J. Clin. Microbiol. – 2011. –
Vol.49. – P. 3800–3804.
139

128. Pfaller M. A. Epidemiology of Invasive Candidiasis: a Persistent Public


Health Problem / M. A. Pfaller,D. J. Diekema // Clin. Microbiol. Rev. –
2007. – Vol.20. – P.133–163.
129. Pfaller M. A. Candida guilliermondii, an Opportunistic Fungal Pathogen
with Decreased Susceptibility to Fluconazole: Geographic and Temporal
Trends from the ARTEMIS DISK Antifungal Surveillance Program / M. A.
Pfaller, D. J. Diekema, M. Mendez // J.Clin.Microbiol. – 2006. – Vol. 44. –
P.3551–3556.
130. Population structure and properties of Candida albicans, as determined by
multilocus sequence typing / A. Tavanti, A.D. Davidson, M.J. Fordyce et al.
// J. Clin. Microbiol. – 2005. – Vol. 43. – P.5601–5613.
131. Prevalence of Candida bracarensis and Candida nivariensis in a Spanish
collection of yeasts: comparison of results from a reference centre and from
a population-based surveillance study of candidemia / M. Cuenca-Estrella,
A. Gomez-Lopez, G. Isla et al. // Med Mycol. – 2011. –Vol. 49. – P.525-
529.
132. Protein and polymer analyses up to m⁄z 100000 by laser ionization time-of-
flight mass-spectrometry / K. Tanaka, H. Waki, Y. Ido et al. // Rapid
Commun. Mass Spectrom. – 1988. – Vol. 2. – P. 151-153.
133. Qiao-Ting C. Comparison of the Accuracy of Two Conventional
Phenotypic Methods and Two MALDI-TOF MS Systems with That of
DNA Sequencing Analysis for Correctly Identifying Clinically Encountered
Yeasts / C. Qiao-Ting, L.Tai-Fen, T. Shih-Hua // J Clin Microbiol. – 2014.
– Vol.60. – P. 3225–3235.
134. Quantitation of Candida CFU in Initial Positive Blood Cultures
/Christopher D. Pfeiffer, Gregory P. Samsa et al. // Journal of Clinical
Microbiology. – 2011. – Vol.49, p.2879–2883.
135. Results from the ARTEMIS DISK Global Antifungal Surveillance Study: a
6.5-Year Analysis of Susceptibilities of Candida and Other Yeast Species to
Fluconazole and Voriconazole by Standardized Disk Diffusion Testing / M.
140

A. Pfaller, D. J. Diekema, M. G. Rinaldi et al. //J. Clin. Microbiol. – 2005. –


Vol.43. – P.5848–5859.
136. Raju S.B. Isolation and Identification of Candida from the Oral Cavity / S.
B. Raju, Rajappa S. // International Scholarly Research Notices. – 2011. –
Vol. 201. – P. 1-8.
137. Rapid Emergence of Echinocandin Resistance during Candida kefyr
Fungemia Treatment with Caspofungin / A. Fekkar, I. Meyer, J. Y. Brossas
// Antimicrob. Agents Chemother. – 2013. – Vol.57. – P.2380–2382.
138. Rapid antifungal susceptibility testing by matrix-assisted laser desorption
ionization-time of flight mass spectrometry analysis / A. Vella, E. De
Carolis, L. Vaccaro et al. / J. Clin. Microbiol. – 2013. – Vol.51. – P. 2964–
2969.
139. Rapid identification and susceptibility testing of Candida spp. from positive
blood cultures by combination of direct MALDI-TOF mass spectrometry
and direct inoculation of Vitek 2 / E. A. Idelevich, C. M. Grunewald, J.
Wüllenweber et al. // (2014) PLoS ONE 9: e114834].
140. Recommendations for the diagnosis of candidemia in Latin America / A.
Lopes Colombo, J. A. Cortes J. Zurita et al. // Revista Iberoamericana de
Micología. – 2013. – Vol. 30. – P.150–157.
141. Reiss E., Shadomy H.J., Lyon G.M. Fundamental medical mycology. –
2011. – 624p.
142. Resistance of Candida spp. to antifungal drugs in the ICU: where are we
now? / D. Maubon, C. Garnaud, T. Calandra et al. // Intensive Care Med. –
2014. – Vol.40. – P.1241–1255.
143. Results from the ARTEMIS DISK Global Antifungal Surveillance Study,
1997 to 2007: a 10.5-Year Analysis of Susceptibilities of Candida Species
to Fluconazole and Voriconazole as Determined by CLSI Standardized Disk
Diffusion / M.A. Pfaller, D.J. Diekema, D. L. Gibbs et al. // J Clin
Microbiol. – 2010. – Vol.48. – P. 1366–1377.
141

144. Risk prediction for invasive candidiasis / A. Ahmed, A. Azim, A. K.


Baronia et al. // Indian Journal of Critical Care Medicine. – 2014. - Vol. 18,
P. 682-688.
145. Sanglard D. Antifungal drug resistance mechanisms in fungal pathogens
from the perspective of transcriptional gene regulation / D. Sanglard, A.
Coste, S. Ferrari // FEMS Yeast Res. – 2009. – Vol. 9. – P.1029–1050
146. Screening for amino acid substitutions in the Candida albicans Erg11
protein of azole-susceptible and azole-resistant clinical isolates: new
substitutions and a review of the literature / F. Morio, C. Loge, B. Besse et
al. // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. – 2010. – Vol. 66. – P.373–384.
147. Seminational Surveillance of Fungemia in Denmark: Notably High Rates of
Fungemia and Numbers of Isolates with Reduced Azole Susceptibility / M.
C. Arendrup, K. Fuursted, B.Gahrn-Hansen et al. // J. Clin. Microbiol. –
2005. – Vol.43. – P. 4434-4440.
148. Species distribution and antifungal resistance profiles among Candida spp.
isolated from bloodstream infections in a Belgian university hospital / I.
Montesinos, A. Cardentey-Reyes, M.Dodemont et al. // Mycoses. – 2013.
Vol.56. – P.21.
149. Species identification and antifungal susceptibility of Candida bloodstream
isolates from population-based surveillance in two US cities: 2008-2011 / S.
R. Lockhart, N. Iqbal, A. M. Ahlquist et al. // J. Clin. Microbiol. – 2012. –
Vol.50. – P.3435–3442.
150. Species distribution and susceptibility profile of Candida species in a
Brazilian public tertiary hospital / A. Bruder, N.,Carlos, H. Camargo et al. //
BMC Research Notes. – 2010. – Vol.3. - P. 514-518.
151. Species distribution and susceptibility profile of Candida species in a
Brazilian public tertiary hospital / A Bruder-Nascimento, CH Camargo, MF
Sugizaki et al.// BCM Res Notes. – 2010. – Vol.3. – P.1-5.
152. Shawn R. Lockhart Lodderomyces elongisporus Masquerading as Candida
parapsilosis as a Cause of Bloodstream Infections / S. R. Lockhart, M. A.
142

Pfaller, D.J. Diekema // Journal of Clinical Microbiology. – 2008. – Vol.46.


– P.1374–1376.
153. Sudbery P. The distinct morphogenic states of Candida albicans / P.
Sudbery, N. Gow, J. Berman // Trends in Microbiology. – 2004. – Vol.12. –
P.317- 324.
154. St-Germain G. Epidemiology and antifungal susceptibility of bloodstream
Candida isolates in Quebec: Report on 453 cases between 2003 and 2005 /
G. St-Germain, M. Laverdière, R. Pelletier // Infection Diseases and
Medical Microbiology. – 2008. – Vol.19. - P. 55–62.
155. The epidemiology of candidemia in two United States cities: results of a
population-based active surveillance / A. S. Kao, M. E. Brandt, W. R. Pruitt
et al. // Clin. Infect. Dis. – 1999. – Vol.29. – P.1164–1170.
156. The changing epidemiology of healthcare-associated candidemia over three
decades / D. Diekema, S. Arbefeville, L. Boyken et al. // Diagn Microbiol
Infect Dis. – 2012. – Vol.73. – P.45–48.
157. The ROCANET study: preliminary results from anprospective
observational survey of candidaemia in the Rome city / M. Sanguinetti, N.
Petrosillo, B. Posteraro et al. // Mycoses – 2013. - Vol. 56. – P.101.
158. Use of the VITEK 2 system to identify and test the antifungal susceptibility
of clinically relevant yeast species / M.S.C. Melhem, A. Bertoletti, H.R.L.
Lucca et al. // Braz. J. Microbiol. – 2013. – Vol.44. – P.1257-1266.
159. Variation in Candida spp. distribution and antifungal resistance rates among
bloodstream infection isolates by patient age: report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2008-2009) / M. A. Pfaller, M.
Castanheira, S. A. Messer et al. // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. – 2010. –
Vol. 68. – P. 278–283.
160. Variación de la epidemiologia de las fungemias y de la sensibilidad a
fluconazol de los aislamientos en los últimos 10 años en España: resultados
del estudio FUNGEMYCA. J. Pemán, E. Cantón, M. J. Linares-Sicilia et al.
// Rev. Iberoam. Micol. – 2011. – Vol.28. – P.91–99.
143

161. van Veen S. Q. High-Throughput Identification of Bacteria and Yeast by


Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass
Spectrometry in Conventional Medical Microbiology Laboratories / S. Q.
van Veen, E. C. J. Claas, E. J. Kuijper // J Clin Microbiol. – 2010. – Vol.48.
– P. 900–907.
162. Variation in Susceptibility of Bloodstream Isolates of Candida glabrata to
Fluconazole According to Patient Age and Geographic Location in the
United States in 2001 to 2007 / M. A. Pfaller, S. A. Messer, R. J. Hollis et al.
// J Clin Microbiol. – 2009. – Vol.47. – P. 3185–3190.
163. Yapar N. Epidemiology and risk factors for invasive candidiasis / N.
Yapar// Ther. Clin. Risk Manag. – 2014. – Vol.10. – P.95–105.

Работы по теме диссертации:


164. Видовая идентификация возбудителей инвазивного кандидоза методом
MALDI-TOF масс-спектрометрии / Е.Р. Рауш, Ю.В. Михайлова, Н.В.
Васильева и др. // Фундаментальные исследования в современной
медицине: достижения и перспективы. Сборник материалов 1-ой
отчетной сессии научных подразделений СЗГМУ им. И.И.Мечникова.-
СПб.,2013. – С.25-26.
165. Идентификация Candida spp. с помощью MALDI-TOF масс-
спектрометрии / Е.Р. Рауш, Н.В. Васильева, Е.В. Шагдилеева и др. //
Проблемы медицинской микологии. – 2013. – Т 15, №2. – С. 115-116.
166. Инвазивный кандидоз на отделениях реанимации и интенсивной
терапии Ленинградской областной клинической больницы / Е.Р. Рауш,
Е.В. Шагдилеева, Н.В. Васильева и др. // Проблемы медицинской
микологии. – 2014. – Т 16, №2. – С. 147
167. Определение видов возбудителей инвазивного кандидоза: в поиске
быстрых решений / Е.Р. Рауш, Н.В. Васильева, Н.Н. Климко и др.
// Проблемы медицинской микологии. – 2013. – Т 15, №4. – С. 87-91.
144

168. Случай успешного лечения микст-микоза – инвазивного кандидоза


(кандидемии) и инвазивного аспергиллеза (легких, придаточных пазух
и мягких тканей носа) у пациента с неходжкинской лимфомой / Е.Р.
Рауш, Е.В. Шагдилеева, С.Н. Хостелиди и др. // Проблемы
медицинской микологии. – 2013. – Т 15, №1. – С. 22-28.
169. Определение чувствительности возбудителей инвазивного кандидоза к
противогрибковым препаратам методами CLSI M27-A3 и CLSI M44-A
/ Е.Р. Рауш, Т.С. Богомолова, Н.В. Васильева и др. // Фундаментальные
исследования в современной медицине: достижения и перспективы.
Сборник материалов 1-ой отчетной сессии научных подразделений
СЗГМУ им. И.И.Мечникова.- СПб., 2013. – С.24-25.
170. Определение чувствительности возбудителей инвазивного кандидоза к
флуконазолу и вориконазолу по международным стандартам / Е.Р.
Рауш, Н.В. Васильева, Т.С. Богомолова и др. // Проблемы
медицинской микологии. – 2013. – Т 15, №1. – С. 60-63.
171. Первое описание случая успешного лечения микотического
менингита, обусловленного Candida albicans и Trichosporon asahii /
Е.В. Шагдилеева, Е.Р. Рауш, Н.В. Васильева и др. // Проблемы
медицинской микологии. – 2013. – Т 15, №2. – С. 138-139
172. Случай успешного лечения микст-микоза, обусловленного Candida
krusei и Aspergillus flavus / Е.Р. Рауш, Е.В. Шагдилеева, С.Н.
Хостелиди и др. // Сборник научных трудов Всероссийской
конференции с международным участием Пятые научные чтения,
посвященные памяти член-корр. РАМН, з.д.н. РФ, профессора О.К.
Хмельницкого "Современные подходы в клинико- морфологической
диагностике и лечении заболеваний человека". - 2013. - C. 374-375.
173. Случай успешного лечения рецидивирующего диссеминированного
кандидоза с поражением ободочной кишки и легких у пациентки,
получающей хронический гемодиализ / Е.В. Шагдилеева, Е.Р. Рауш,
145

Т.С. Богомолова и др. // Научное издание «Успехи медицинской


микологии». - 2014. - Т. XIII. – Гл. 11. - С. 280-281.
174. Случаи микст-микозов (инвазивных кандидоза и аспергиллеза) у
гематологических больных / Е.Р. Рауш, Е.В. Шагдилеева, Т.С.
Богомолова и др. // Проблемы медицинской микологии. – 2014. – Т 16,
№2. – С. 147-148.
175. Случай успешного лечения микотического перитонита (возбудитель –
Candida albicans) у пациентки с острым панкреонекрозом / Е.Р. Рауш,
Е.В. Шагдилеева, Т.С. Богомолова и др. // Проблемы медицинской
микологии. – 2014. - T. 16. - № 2. - С. 131-132.
176. Случай успешного лечения кандидозного перитонита (возбудитель-
Candida albicans) у пациентки с острым панкреонекрозом / Е.Р. Рауш,
С.Н. Хостелиди, Е.В. Шагдилеева и др. // Проблемы медицинской
микологии. – 2014. – Т 16, №3. – С. 26-31.
177. Успешное лечение сочетанного микоза - инвазивного кандидоза и
инвазивного аспергиллеза у пациента с неходжкинской лимфомой /
Е.Р. Рауш, Е.В. Шагдилеева, С.Н. Хостелиди и др. // Сборник
материалов 86-ой конференции « Мечниковские чтения-2013» (г.
Санкт- Петербург, 23 апреля 2013 г.).- Санкт-Петербург, 2013. – С.94-
95
178. Antifungal susceptibility profiles of pathogens of invasive candidiasis in
Russia / E. Raush, N. Vasilyeva, E.Shagdileeva et al. // Final Program
European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases
(Barcelona, Spain, 10-13 May 2014) – P.103
179. Combination of invasive candidiasis and invasive aspergillosis in
hematological patients / E. R.Raush, S. N. Khostelidi, T. S. Bogomolova et
al. // Final Programm and Abstracts 12th ASM Conference on Candida and
Candidiasis (New Orleans, Louisiana, USA, 26-30 March 2014) –P.107
146

180. Combination of invasive aspergollosis and invasive candidiasis in


hematological / E.Raush, S.Khostelidi, T. Bogomolova et al. // 6th advances
against aspergillosis. - 2014. - P. 164.
181. Identification of the etiologic agents of invasive candidosis by matrix-
assisted laser desorption/ionisationtime of flight mass spectrometry
(MALDI-TOF MS) / N.V. Vasilyeva, E.R. Raush, S.V. Sidorenko et al. //
Final Programm European Congress of Clinical Microbiology and
Infectious Diseases (Berlin, Germany, 29 April 2013) – P.148
182. Invasive candidiasis in intensive care units of the tertiary hospital in St.
Petersburg, Russia./ E. R. Raush, E. V. Shagdileeva, N.V. Vasilyeva et al. //
Final Programm and Abstracts 12th ASM Conference on Candida and
Candidiasis (New Orleans, Louisiana, USA, 26-30 March 2014) –P. 106-
107
183. Species distribution and antifungal susceptibility profiles among Candida
spp. in Russia / E. Raush, N. Vasilyeva, E.Shagdileeva et al. // Final
Programm and Abstracts 12th ASM Conference on Candida and Candidiasis
(New Orleans, Louisiana, USA, 26-30 March 2014) – P. 87
184. Susceptibility testing of invasive candidosis pathogens to fluconazole by
CLSI M27-A3 method / E. Raush, N.V.Vasilyeva, E.Shagdileeva et al. //
Mycoses.- 2013.-Volume 56, Supplement 3.-P.109
185. Successful treatment of combination of invasive candidiasis (C. krusei) and
aspergillosis (A. flavus) in haematological patient / E.R. Raush,
E.Shagdileeva, T.S.Bogomolova et al. // Mycoses.- 2013.-Volume 56,
Supplement 3.- P.116