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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE QUERÉTARO

FACULTAD DE QUÍMICA
Laboratorio de Biología Celular

PRÁCTICA 2
El Microscopio, uso y técnicas de tinción.

Alumna : Ruíz Hernández Lisset Estepania

Profesor: Miguel Ángel Rea López

Fecha de realización: 20 de Septiembre de 2017

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FACULTAD DE QUÍMICA
Laboratorio de Biología Celular

INTRODUCCIÓN

El microscopio es un instrumento óptico y mecánico que modula energía y amplifica el


ángulo de visión humana para producir imágenes amplificadas de cualquier objeto. Las
partes de un microscopio se pueden englobar dentro de tres sistemas, el sistema
mecánico, el sistema óptico y el sistema de iluminación.

Sistema mecánico.

a) Base o pie. Plancha en la que descansa todo el aparato, debe mantener la mayor
estabilidad posible.
b) Columna o brazo. Articulada por una charnela a la parte posterior de la base, en
algunos aparatos se inclina a voluntad y en otros es fijo ya que tiene la inclinación
apropiada ya calculada.
c) Tubo del microscopio. Colocado en el extremo del brazo que queda en sentido
opuesto a la base. En los microscopios modernos este tubo realiza un giro de 360°
pudiendo ser monoculares o binoculares, presentan una capa de interferencia
capaz de dividir la luz entre los dos oculares sin que se pierda luminosidad. En el
interior se encuentran varias lentes que contribuyen con el sistema óptico para
formar las imágenes.
d) Revolver. Pieza giratoria colocada en el extremo inferior del tubo del microscopio,
en el que se atornillan los diferentes lentes objetivos que.
e) Platina. Placa firme y sólida con un orificio central. Se usa para colocar sobre ella
las preparaciones que se van a observar.
f) Tornillo para enfocar. Se localiza en la parte inferior del brazo, hay de dos tipos:
1. Macrométrico. Realiza un deslizamiento amplio y rápido.
2. Micrométrico. En algunos se encuentra en el tornillo Macrométrico.

Técnicas de tinción

La tinción es un proceso por el cual las moléculas de un colorante se absorben a una


superficie. El uso de colorantes permite cambiar el color de las células de los
microorganismos y poder realizar la observación en microscopio óptico. Dado que las
bacterias son casi incoloras, no presentan contraste con el medio en el cual se
encuentran suspendidas y no pueden observarse claramente sin algún tratamiento previo.
De acuerdo a la reacción que ocurre, existen diferentes tipos de tinción:

→ Simple: el colorante utilizado sirve solo para denotar la morfología celular.

→ Diferencial: el colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre células


bacterianas o entre partes de una misma célula, estas técnicas utilizan más de un
colorante o bien ciertos reactivos complementarios para la tinción.

Los colorantes más usados son: azul de metileno, cristal violeta, safranina, estos son
catiónicos y se combinan fuertemente con componentes celulares cargados
negativamente, como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos.

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Algunos colorantes teñirán mejor solo después de que la célula haya sido tratada con otra
sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. El mordiente se combina con un
constituyente celular y lo altera de manera que ahora sí podrá atacar el colorante.

La tinción de Gram

Es un procedimiento de gran utilidad empleado en los laboratorios donde se manejan


pruebas microbiológicas. Es definida como una tinción diferencial, ya que utiliza dos
colorantes y clasifica a las bacterias en dos grandes grupos: bacterias Gram negativas y
bacterias Gram positivas.

Algunas especies bacterianas, debido a la naturaleza química de sus paredes celulares,


poseen la capacidad de retener el cristal violeta, aun luego del tratamiento con un
decolorante orgánico, tal como una mezcla de acetona y alcohol. Tales bacterias se
denominan Gram positiva. Las bacterias Gram negativas, presumiblemente debido a un
mayor contenido lipídico en su pared celular, pierden la coloración primaria del cristal
violeta cuando son tratadas con decolorante. El colorante secundario utilizado en la
técnica de Gram es la safranina. Las bacterias Gram negativas, que han perdido el cristal
violeta, aparecen rojas o rosadas vistas al microscopio, habiendo fijado la safranina como
controlador a sus paredes celulares

METODOLOGÍA

Se realizaron diferentes tipos de tinciones; una tinción simple, una tinción diferencial
(tinción de Gram) y una Tinción de bacterias del suelo

 Tinción de Gram

Se utilizó un portaobjetos previamente lavado y seco, en el cual se puso una gota


de agua y una pequeña alícuota de un cultivo bacteriano con el asa de cultivo
estéril. Se procedió a hacer el frotis, formando una película homogénea sobre el
portaobjetos con el asa de cultivo y se dejó secar.
Después la preparación fue fijada pasándola a través de la llama del mechero por
aproximadamente 1 segundo.
Uva vez fijada la preparación fue sumergida en diferentes colorantes por un
tiempo determinado;
Primero se sumergió en cristal violeta durante 1 minuto, enseguida se lavó el
exceso de colorante con agua (5 segundos aprox.), posteriormente se sumergió
en el mordiente, una solución de yodo durante 1 minuto, se lavó el exceso de
mordiente con agua (5 segundos aprox.).Después se sumergió en una solución
de alcohol-acetona durante 30 segundos, posteriormente se lavó con agua (5
segundos aprox.), por último se sumergió en el colorante de contraste, safranina

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durante 1 minuto, se lavó con agua (5 segundos aprox.) Y se dejó secar para
posteriormente llevarlo a observación al microscopio.

 Tinción Simple o en fresco.

Se utilizó un portaobjetos previamente lavado y seco, en el cual se puso una gota


de agua y una pequeña alícuota de agua tratada, posteriormente sobre esta se
adiciono una gota de colorante y se colocó un cubreobjetos encima, Fue
eliminado el exceso de colorante con un papel absorbente y fue llevado a
observación al microscopio.

 Tinción de bacterias del suelo.

Previo a la práctica fue enterrado parcialmente un portaobjetos limpio en el suelo,


después de varios días, las bacterias se adhirieron al portaobjetos.
Posteriormente se limpió la parte posterior del portaobjetos (la parte que no se
tiño) y los microorganismos fueron fijadas con calor. Se tiño la muestra y fue
llevada a observación al microscopio.

 Enfoque de un espécimen
Se subió hasta tope el condensador, enseguida se colocó la preparación en la
platina para ser vista en el objetivo de menor aumento, se cerró el diafragma del
condensador y se centró la iluminación. Una vez enfocado el espécimen se fue
subiendo de aumento para obtener una mejor resolución de la imagen, esto se
hizo con la ayuda del tornillo micrométrico.

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DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Fueron observadas 4 tipos de muestras en el microscopio, Según la manipulación que se
le dio a cada muestra se observaron diferentes modalidades de tinción.

Enfoque de un espécimen (cromosomas)

Observación realizada a 10x Observación realizada a 100x


Observación realizada a 40x

En estos especímenes no se realizó ningún tipo de tinción, estas fueron laminillas


ya teñidas en las cuales se observan cromosomas de trabajadores expuestos a
cromo, en las que se aprecian pequeños grupos segregados de cromosomas los
cuales se muestran de color rosa.
Estos cromosomas se ven más grandes de lo normal porque previo a su tinción
fueron sometidos a una técnica de inflamiento en la cual se pretende aumentar su
tamaño para que se facilite su apreciación.

Examen microscópico directo de las muestras Sin Tinción

Sin tinción No se utilizó ningún tipo de colorante.

Este fue un montaje directo o examen en fresco, en esta la


muestra de agua fue extendida directamente sobre la superficie
del portaobjetos para su observación.

Este procedimiento es la forma más sencilla de observación de


organismos vivos, nos proporciona información sobre la
morfología, tamaño, color y movilidad de las bacterias. Sin
Observación realizada a 100x embargo, debido a la falta de contraste con el entorno es una
práctica que se utiliza únicamente para la observación del
movimiento.

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Examen microscópico de las muestras Tinción Simple (bacterias de suelo)

Tinción con cristal violeta Se utilizó un solo colorante, por lo que todas las estructuras

celulares vistas se tiñeron con la misma tonalidad.

Este tipo de técnica fue utilizada con el fin de mejorar el


contraste en la imagen vista al microscopio. El colorante fue
empleado para aumentar la definición y examinar poblaciones
celulares presentes en el agua tratada.

La tinción simple nos proporciona exclusivamente información


acerca de la forma, tamaño y tipo de agrupación de los
microorganismos. Sin embargo tiene la ventaja de ser un
método muy sencillo y rápido.
Observación realizada a 100x

Examen microscópico de las muestras Tinción Diferencial

Observación realizada a 100x

Se observa la presencia de Gram


(+) y Gram (-)

En esta tinción fueron empleados varios colorantes combinados los cuales tienen afinidad
por ciertas partes en la célula, la tinción de Gram se basa en colocar como colorante
primario cristal violeta, el cual tiene afinidad con el peptidoglicano de la pared bacteriana.
Posteriormente, al colocar yodo, este sirve como mordiente e impide la salida del cristal
violeta por la formación de un complejo cristal violeta-yodo que satura los espacios del
peptidoglicano de la pared bacteriana. La razón por la cual adicionar una mezcla de
alcohol-acetona, es porque esta deshidrata la pared bacteriana y cierra los poros de la
misma, también destruye la membrana externa de las bacterias Gram negativas debido a
que esta es soluble a la acción de solventes orgánicos, como la mezcla de alcohol-
acetona. Las bacterias Gram positivas, al contener una gran cantidad de peptidoglicano,
retienen con mayor fuerza este complejo, mientras que las Gram negativas no lo pueden
retener por tener menos cantidad de peptidoglicano. Por último, se coloca safranina
porque esta funciona como un colorante secundario o de contra tinción y sirve para teñir

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las bacterias que no pudieron retener el complejo cristal violeta-yodo. Las bacterias Gram-
positivas y Gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en
la estructura de su pared celular

CONCLUSIÓN

En tres de las tinciones realizadas el uso de colorantes fue primordial ya que de


acuerdo a lo que se desea observar estos cuentan con características específicas
como; hacer visibles a los objetos microscópicos y transparentes, revelar su
forma y tamaño, además de que la mayoría de estos colorantes producen
reacciones químicas específicas y muestran la presencia de estructuras internas y
externas.

Los principios de la tinción de Gram están basados en las características de la pared


celular de las bacterias, la cual le confiere propiedades determinantes a cada
microorganismo. La pared celular de las bacterias Gram negativas está constituida por
una capa fina de peptidoglicano y una membrana celular externa, mientras que las
bacterias Gram positivas poseen una pared celular gruesa constituida por peptidoglicano,
pero no cuentan con membrana celular externa.

La composición química y el contenido de peptidoglicano en la pared celular de las


bacterias Gram determina las características tintoriales, además de dividir a las bacterias
con pared celular en dos grandes grupos: bacterias con pared de tipo Gram positiva y
bacterias con pared de tipo Gram negativa.

BIBLIOGRAFÍA

 Beveridge TJ, Graham LL. Surface layers of bacteria. Microbiol Rev. 1991; 55:
684-705. 15.
 Coico R. Gram staining. Curr Protoc Immunol. 2001. Appendix 3: p. Appendix 3O.

 http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf

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