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GUIA LABORATORIO MICROBIOLOLOGÍA – Código: GLMIC


PROGRAMA BIOLOGÍA – F. CIENCIAS
Versión: 1

Realizado por: MARTHA LILY OCAMPO GUERRERO


Bacterióloga Microbióloga Rgtro 8”O” 164

PRÁCTICA 2

Preparación de medios de cultivo

Introducción

Entre los requisitos para el trabajo con microorganismos están los últimos en la técnica
aséptica. Dada la ubicación de los microorganismos que la existencia de endosporas
termorresistentes se han desarrollado varios procesos de esterilización, o sea de eliminación
o destrucción de todo organismo vivo.
Así todo objeto esterilizado está libre de organismos viables capaces de reproducirse. La
destrucción de endosporas termorresistentes se realiza a temperaturas mayores de 100°C,
15 lb (1.2 atm) de presión por 1 hora. Temperaturas mayores pueden ocasionar destrucción
de los componentes de los medios de cultivo. Soluciones con antibióticos o vitaminas
usualmente se esterilizan por filtración de membranas. Algunos medios requieren la
esterilización por separado de fuentes de carbono, para evitar caramelización del medio y
reacciones que inhiban el crecimiento de los microorganismos.

Objetivo: Adquirir destrezas y conocer los fundamentos del uso, preparación y aplicación
de medios de cultivo y esterilizarlos.

Materiales

 Agua destilada.  Tubo de ensayo tapa rosca (o similar).


 Medios deshidratados o sus componentes.  Pipetas.
 Agar nutritivo deshidratado.  Vaso de precipitado o beaker.
 Agar papa dextrosa (PDA).  Cilindro graduado.
 Papas blancas (200g).  Papel kraft o de reciclar.
 Glucosa.  Espátula.
 Erlenmeyer o balones.  Manuales de medios de cultivo de
 Cajas de Petri esterilizadas. casas comerciales.

Equipos:
 Autoclave.  Estufa o plancha con agitador magnético
 Balanza.

Procedimiento

Preparación de medios de cultivo: Los medios de cultivo se pueden preparar a partir de


sus componentes o de sus medios deshidratados. Los volúmenes a preparar se calculan
para cajas y tubos bacteriológicos, por ejemplo:
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Medio de *Cant Vol. a gr Caja Tubo/ Total Microorg. Observaciones


cultivo id /L prepara MC vol vol ml unidad
r AD ml
Agar 20 325 ml 6,5 20 10 16 / 32 *
nutritivo
Agar 20 200 ml 4 20 10 *
nutritivo
Agar TSI 65 175 ml 11,13 7 25 Enterobac Se solidifica
terias G- inclinado
Caldo bilis 40 845 ml 33,8 10 84 E. coli Colocar bujía de
verde Durhan. NMP
brillante
Agar Tsa 135 ml 5,4 20 6 * 80 °C
chocolate - 40
TSA
Agar Tsa 175 ml 7 20 8 * 55°C -
sangre TSA 40 Hemólisis
Agar citrato 23 125ml 2,9 7 17 Enterobac Se solidifica
terias G- inclinado
Caldo 30 25 ml ,75 5 5 *
tripticasa
soya
Agar DNsa 42 300 12,6 20 15 Staphyloc
occus
Agar 50 200 10 20 10 Enterobac
Mckonkey terias G-
Agar EMB 36 200 7,2 20 10 E. Coli
Caldo 13 50 0,65 4 12 *
nutritivo
Agar salado 108 850 91,8 20 42 Rcto
Manitol rojo Staphyloc
de fenol occus
Agar OGY 18,5 / 3900 144 20 195 Rcto Conservar
(65*3) 500ml Mohos y diluidos
levaduras (licuado) a 55°C
+ gentamicina
Agar Plate 22,5 2700 60,75 20 135 Rcto *µØ Conservar
count mesófilos diluidos
(15*3) (licuado) a 55°C
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Agar SPS 14,5 356 12 29 Rcto


Esporas
CSR
Agar Baird 63 1200 75,6 20 60 Staphyloc Emulsión yema
Parker occus de huevo y
telurito de K
SIM 30 78 2,34 5 15 Motilidad
enterobac
terias –
G-
SS 60 750 45 20 37 Salmonell
a,
Shiguella
*Cantidad requerida por Litro

PROTOCOLO DE PREPARACIÓN DE MEDIO DE CULTIVO:

Prepare 225 ml de agar nutritivo o Tripticasa Soya Agar (TSA), a partir de medio
deshidratado.

1. Pese en la balanza la cantidad requerida según la fórmula (ver en la etiqueta del


envase del medio las instrucciones).
2. Coloque el polvo deshidratado en el interior del erlenmeyer.
3. Vierta el agua.
4. Mezcla hasta homogenizar, si es agar se deja en reposo 15 min.
5. Se calienta hasta despolimerazar completamente. (Hasta cuando las paredes del
vidrio quedan completamente transparentes)
6. Revisar y ajustar el pH si es necesario de acuerdo a las recomendaciones de la casa
comercial
7. Si es para envasar en tubos mida el volumen requerido: 4, 5, 7. o 10 ml en cada
tubo, tape y colóquelos verticalmente en una canastilla.
8. Tape el erlenmeyer o frasco Schott tapa azul y coloque éste en la olla interior de la
autoclave.
9. Esterilice a 121ºC , 15 lb de presión durante 15 minutos
10. Deje reposar:
Adicione sustratos según al medio de cultivo, por ejemplo:
 Baird Parker con emulsión yema de huevo y telurito de K para la identificación
de Staphylococcus
 agar sangre: agar TSA a 55°C más sangre o agar chocolate: agar TSA a
80°C más sangre
 agar OGY mas gentamicina
 medio actinomicetos,
 Agar Mossel para bacillus Cereus emulsión yema de huevo, mezcle y sirva.
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NOTA: Cuando el medio va a ser utilizado para recuento de Unidades Formadoras de


Colonias (UFC), este se debe conservar a Tª entre 55-65ºC con el fin de no dejar solidificar,
hasta su uso para que se mezcle o difumine con la muestra.
11. Verse en cajas, deje solidificar.
12. Use inmediatamente, o conserve en refrigeración. (Los periodos de
almacenamiento no deben ser mayores a 1 semana por el peligro de
contaminación) o lleve a incubación si es una siembra para recuento.

Todos grupos pueden realizar los cálculos para la preparación de los diferentes volúmenes
de medios, teniendo en cuenta las recomendaciones de la casa comercial.

Si el medio no se esteriliza se aplican solo los puntos 1-7, con los componentes apropiados,
pero si el agar es SS, Ud. Que haría?

Medio de cultivo Fundamento Aplicación


Agar Nutritivo
Tripticasa Soya Agar
Agar SS
Agar chocolate
Agar Sangre
Agar Citrato Simons
Caldo Triptona
Agar Mossel bacillus Cereus
Agar Baird Parker
Agar OGY
Caldo BHI
Caldo Bilis Verde
Brillante
Agar Hecktoen
Agar Bismuto Sulfito
Agar EMB
Agar SPS
Agar Cetrimide
Caldo Asparagina
Agar TCBS
Agar Saboraud
Agar Muller Hinton
Agar TSI
Caldo Frasser Al incorporar cloruro Medio de enriquecimiento
de litio en el medio se para la detección y ennumeración de
inhibe el crecimiento Listeria monocytogenes
de aquellos µØs
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acompañantes que al Observaciones:


igual que Listeria Observar el cambio de color ambar a
hidrolizan la esculina, negro por acción citrato férrico sobre el
como los esculinato producto de la hidrólisis de
Enterococcus. La la esculina
adición de ácido
nalidíxico y el citrato
de amonio, marca la
selectividad L.
monocytogenes.

Agar DNAsa
Agar Palcam
Agar PDA
Agar TSA 1/10
Agar TSA 1/50
Agar PDA 1/3
Agar SRS

Consultar:
1. http://www.unavarra.es/genmic/micalm/manual%20practicas%20micalimentos.pdf
Cuando el medio de cultivo no es de casa comercial se puede preparar en el laboratorio, por
ejemplo: Agar papa dextrosa agar (PDA) 170 ml, a partir de un extracto o infusión de papa.
Fórmula para 1 litro.

1. Pele papas y pese 200 g. Coloque a hervir por 15 minutos en 1 litro de agua. Cuando
éste tibio mida el volumen en el cilindro graduado y adición de agua hasta completar 1
litro.
2. Adicione glucosa al 1% y agar al 1 .5%.
3. Mezcla hasta homogenizar. Hierva el medio.
4. Sirva 8 tubos de ensayo (6 ml cada uno) tápelos y colóquelos en la canastilla o en
recipiente plástico (esterilizable). Éstos servirán para preparar los tubos con medio
inclinado o en una cuña, después de la esterilización en la autoclave.
5. Ponga el tapón de gasa y algodón al resto del medio del Erlenmeyer.
6. Coloque el material así preparado en la autoclave.
7. Esterilice por 15 minutos a 121°C 15 {lb de presión.
8. Una vez esterilizados a los medios saque los recipientes y deje enfriar hasta unos 45-
50°C (el calor del recipiente debe ser tolerable al tacto).
9. Sirva las cajas de Petri. Se abren estas cerca del mechero a unos 10 cm de distancia
y vierta el medio (quede con un espesor menor de 2 mm, aprox. 15-20 ml).
10. Los tubos con el medio fundido se inclinan sobre la barra de vidrio procurando que quede
un fondo de 1 cm y que la superficie inclinada fue extendido no quede cerca del tapón.
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Cuestionario

a) Cuál es el mecanismo por el cual el vapor saturada a presión mata los


microorganismos?
b) Cuáles son los métodos más corrientes utilizadas para esterilizar?
c) Ciertos organismos poseen la estructura biológica más termorresistente, para
supervivencia. Cuál es y en que organismos encuentra?
d) Usualmente como esterilizan las cajas de Petri y las pipetas?
e) Como se verificaría que un medio de cultivo procesado en la autoclave quedó
realmente esterilizado?
Consulte y ejercite con el laboratorista sobre lavado técnico, envoltura esterilización de
elementos de vidriería (pipetas, cajas de Petri, balones y fiolas).

Bibliografía
- Arenas, R. 2000 Micología médica ilustrada. Mc Graw Hill, México.
- French, E. and Hebert, T. 1982 Métodos de investigación fitopatológica, Instituto
Interamericano de Cooperación para la agricultura (IICA) San José.
- Helms, R., Helms, C., Kosinski, R, and Cummings, J. 1998 ALL AMERICAN STEREO
AUTOCLAVE 25X. Instrucciones and supplies. Biology in the laboratory, 3ª edition,
W.H. Freeman and company.
- Madigan, M., Martinko, J. and Parker, J 1997 Brock biology of microorganisms 8a
edición. Prentice Hall, New Jersey.
- Microbiology Manual 2002 Darmstadt, Merk pp. 187, 207.
- http: //www.cecyt15.ipn.mx/depots/tecno/tcl/microcli/practicac%209.htm

Introducción histórica
Se puede decir que el impresionante trabajo de investigación y estudia las bacterias,
realizado principalmente por Pasteur y Koch, dió como resultado el nacimiento de la
microbiología.
Fue en 1876 cuando Koch fue capaz de propagar una bacteria patógena (Bacillus anthracis)
en cultivo puro, fuera del cuerpo que la portada; en 1881, utilizando el medio líquido, los
solidificó con gelatina y desarrolló los métodos de rayado y siembra en placa para
aislamiento de bacterias. El siguiente paso lo dio Hesse, en 1891, al utilizar como agente
solicitante un producto denominado agar, extraído de las algas rojas. El agar era muy
superior a la gelatina, ya que era resistente a la digestión microbiana y a la licuefacción.
Se enriqueció la composición de los cultivos solicitados utilizando extractos de carne e
infusiones, a fin de equipararlos con el tejido infectado portador. Éste decenio es considerado
por el número y la brillantez de los descubrimientos realizados, como uno de los más
brillantes de la medicina.
El aislamiento en cultivo puro constituye aún hoy el fundamento de la práctica en
microbiología e investigación.
Hoy el día, las técnicas de cultivo, para aislar y de crecimiento de microorganismos, se han
desarrollado notablemente con requisitos nutricionales específicos.
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Medio de cultivo

El propósito de los medios de cultivo es respaldar el desarrollo de los microorganismos,


además de exhibir una morfología colonial y microscópica típica. Las variaciones en la
composición del medio pueden alterar estas características.
Los medios de cultivo se utilizan además para demostrar otras características de los
microorganismos, por ejemplo: producción de ácidos y gases en medios de fermentación de
hidratos de carbono.

Clasificación de medios de cultivo:

Se podrían hacer varias clasificaciones de los medios de cultivo:


1. Según su estado físico
- Sólidos. -Semisólidos. - Líquidos.
a. Sólidos: presentan en su composición un agente solicitante, el agar, en una
proporción de 12 a 15 gramos por litro. También contener gelatina o albúmina.
b. Semisólidos: presentan agar en su composición, pero en una proporción mucho
menor que en los medios de cultivo sólidos. Por ejemplo, el medio CTA (Agar Cistina
Tripticasa), utilizado para determinar la movilidad de los gérmenes, estudiar las
fermentación de los azúcares y para la conservación de cepas, contiene su
composición 2.5 gramos de agar por litro.
c. Líquidos: no contiene ninguna agente solidificante.

2. Según su composición
- Biológicos o Naturales. -Sintéticos. -Semisintéticos.
a) Biológicos o Naturales: en su composición aparecen sustancias orgánicas.
b) Sintéticos: en su composición aparecen sustancias químicas definidas.
c) Semisintéticos: en su composición aparecen moléculas naturales hidrolizadas

3. Según el uso a que se destinan


- Medios diferenciales o de aislamiento. - Medios selectivos e inhibidores.
- Medios de transporte y mantenimiento. - Medios para filtración de membrana.
- Medio de cultivo para recuento de UFC - Medios de uso general.
- Medios enriquecidos.
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a) Medios enriquecidos: suele ser medios con nutriente simple que presentan
enriquecedores, tales como la sangre de carnero, la sangre de Caballo, etc. son
medios destinados a desarrollar microorganismos muy exigentes.
b) Medios diferenciales o de aislamiento: contienen colorantes, azúcares e
indicadores, concebidos para provocar una respuesta bioquímica conocida,
generalmente el color.
c) Medios selectivos e inhibidores: además de contar en su composición con los
mismos productos que los medios diferenciales, presentan una serie de agentes que
sirven para inhibir la flora acompañante de la muestra a estudiar, y aislar, de ésta
forma el microorganismo que se busca.
d) Medios de transporte y mantenimiento: se utilizan en la recogida, transporte y
conservación de muestras microbiológicas. Esencialmente, son medios no
nutrientes, semisólidos muy reductores, que inhiben las reacciones enzimáticas
autodestructivas dentro de las células y evitan los efectos letales de la oxidación.
Son medios que no deben potenciar el crecimiento lujurioso.
e) Medios de uso general: son medios que soportan el crecimiento de una amplia
variedad de microorganismos fastidiosos, sin exigencias nutritivas especiales.
f) Medios para filtros de membrana: las técnicas de filtración de membrana se han
impuesto en microbiología, por las ventajas que presentan. Son técnicas que
permiten el examen de grandes volúmenes de líquido con una población muy baja
de microorganismos, la separación de los microorganismos del medio de cultivo e
incluso su cambio de un medio de cultivo a otro sin interrumpir su ciclo de
crecimiento.

Composición de los medios

A continuación, se expondrán los constituyentes más utilizadas en la composición de los


medios de cultivo.
1. Agar: comercialmente se presenta en gránulos y en polvo. La concentración en la que
aparece en los medios de cultivo depende del propósito para el que esté destinado el medio.
2. Peptona: producto de composición variable, obtenido mediante la hidrólisis ácida o
enzimática de proteína animal o vegetal, a partir de materiales como por ejemplo: hígado,
músculo, sangre, leche, etc. la composición dependerá del material utilizado y del método
de fabricación.
3. Carne: el corazón del buey, el músculo y el hígado son utilizados frecuentemente, pero
el cerebro, el vaso y la placenta de ternera pueden ser utilizados también en la preparación
de medios de cultivo.
4. Extracto de carne: contiene bases orgánicas solubles, productos de degradación de las
proteínas, vitaminas y minerales.
5. Extracto de levadura: se consigue a partir de levadura de pan o de cerveza y es una
fuente rica en aminoácidos y vitaminas de complejo B.
6. Sangre: debe ser libre de agentes antimicrobianos, para no inhibir crecimientos. La
sangre más utilizada es la de carnero y caballo aunque también se utilizan la sangre de
conejo y la sangre humana. La sangre se utiliza para las distintas hemólisis de
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estreptococos y estafilococos. Debe comprobarse siempre la esterilidad, así como la


ausencia de citratos, pues éstos podrían inhibir a los estafilococos.
7. Plasma: se utiliza para demostrar la actividad coagulasa. Normalmente, se utiliza plasma
humano y de conejo.
8. Suero: se prepara a partir de la sangre recolectada sin adición de anticoagulante,
eliminando el líquido que se separa cuando se contrae el coágulo.
9. Bilis: contiene varios ácidos biliares como compuestos conjugados con aminoácidos.
También contiene pigmentos, como bilirrubina y biliverdina.
10. Sales biliares: son extraídas de la bilis, inhiben el crecimiento de organismos gran
positivos y bacilos en forma de esporas, sin afectar al desarrollo de los bacilos entéricos
Gram negativos.
11. Gelatina: proteína obtenida mediante extracción de material colágeno a partir de tejidos
animales. Para los medios de cultivo se utiliza una gelatina de calidad farmacéutica.
12. Carbohidratos: llamados colectivamente azúcares, se utiliza normalmente para
enriquecer medios, para promover el crecimiento o la pigmentación y para determinar si los
organismos pueden producir ácido y gas a partir de ellos.
13. Indicadores: se incorpora en algunos medios de cultivo para dar prueba visual del pH
y otros cambios producidos durante el crecimiento de la bacteria. Los indicadores para este
propósito deben ser no tóxicos a la concentración usada. Los indicadores del potencial
REDOX tiene un uso limitado en medios de cultivo, por ejemplo: el azul de metileno o
resazurina en medio tioglicolato.

LECTURA E INTERPRETACION DE LOS CULTIVOS


Para la lectura, interpretación e identificación del crecimiento bacteriano, primero que
todo se sigue un estudio cualitativo que comprende los siguientes parámetros:

1. Características Macroscópicas de las colonias

a. Medios Líquidos

i. Enturbiamiento: parejo, en ondas, cordones suspendidos.


ii. Capas superficiales.
iii. Precipitados: polvoriento, granuloso, viscoso.
iv. Pigmentos difusibles.

b. Medios Sólidos. Estudio de las Unidades Formadoras de Colonias:

i. Tamaño: puntiforme, pequeño, mediano, grande, extendidas en velo, invadiendo


toda la superficie del medio.
ii. Forma: circular, alargada, irregular, filamentosa, rizoide, fusiforme.
iii. Bordes: enteros, dentados, lobulados, rizoides.
iv. Superficie: lisa, rugosa.
v. Levantamiento: plana, convexa, acuminada, umbilical
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vi. Consistencia: mucoide, friable, seca, viscosa


vii. Transparencia: transparente, traslucida, opaca
viii. Color: blanco, amarillo, gris, verde, rojo, etc.

2. Cambios Producidos en el medio

a. Pigmentos difusibles (bacterias pancromóforas) que cambian el color del medio:


verde, amarillo, rojo, marrón, etc.
b. Olor: algunas bacterias emiten olores característicos, como a frutas, chocolate,
queso, etc.
c. Hemólisis: beta, alfa, alfa prima y gamma (no hemolíticas).
d. Metabolismo

Ejercicio

1. Realice el diagrama de flujo de los siguientes medios de cultivo:

Grupo 1 Caldo Fraser – semi Caldo Fraser completo

Grupo 2 Caldo bilis verde brillante Agar cromogénico para Listeria

Grupo 3 Agar mCCD para Campylobacter Agar TCBS para Vibrion

Grupo Muller Hinton para Listeria Muller hinton para E. coli

Grupo 4 Agar Baird Parker Medio SRS bacterias fósforo

Agar OGY Agar TSA 1/10