DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA AGRICULTURA

CARRERA DE INGENIERÍA AGROPECUARIA

TEMA

¨¨PARAMETROS DE CRIOPRESERVACIÓN DE SEMEN BOVINO EN

REFRIGERACIÓN Y DILUIDO DE DOS TOROS (Bos indicus) EN LUZ DE
AMERICA.”

AUTORES:
- ALABÁN STHEFANNY
- BORJA CAROL
- CAHAVEZ ESTEBAN
- DELA GENESIS
- LAPO JESSICA

PROYECTO DE INVESTIGACION PREVIO A LA

OBTENCIÓN DEL TITULO DE INGENIERA
BIOTECNOLOGA

SANTO DOMINGO - ECUADOR

2017-2018

1
FECHA DE PRESENTACIÓN 2017-12-02

ÁREA BIOTECNOLGICA

MATERIA BIOLOGÍA ANIMAL

PROYECTO . ¨PARAMETROS DE CRIOPRESERVACIÓN DE

SEMEN BOVINO EN REFRIGERACIÓN Y DILUIDO
DE DOS TOROS (Bos indicus) EN LUZ DE
AMERICA.”

AUTOR Albán Sthefanny, Borja Carol, Chavez Esteban, Dela

Génesis, Lapo Jessica.

FECHA DE INICIO 2017-08-18

FECHA DE TÉRMINO 2018-02-16

UBICACIÓN SANTO DOMINGO DE LOS TSACHILAS

LOCALIDAD Santo domingo de los Tsachilas

FINANCIAMENTO 100% PERSONAL

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1. Contenido

1. Contenido ....................................................................................................................................... 3
2. TEMA ............................................................................................................................................ 4
3. 1. Revisión Bibliográfica ............................................................................................................... 4
3.1. Antecedentes .......................................................................................................................... 4
4. Materiales y metodos ..................................................................................................................... 6
4.1. UBICACIÓN GEOGRÁFICA .............................................................................................. 6
4.1.1. Ubicación política .......................................................................................................... 6
4.1.2. Límites de la provincia .................................................................................................. 6
4.1.3. Ubicación ecológica ....................................................................................................... 6
4.2. MATERIALES Y REACTIVOS ........................................................................................... 7
4.2.1. Materiales de campo ...................................................................................................... 7
4.2.2. Materiales biológicos ..................................................................................................... 8
4.2.3. Materiales de laboratorio ............................................................................................... 8
4.2.4. Materiales para evaluar semen fresco ............................................................................ 8
4.2.5. Materiales para congelar semen ..................................................................................... 9
4.2.6. Equipos de laboratorio ................................................................................................... 9
4.2.7. Equipos para evaluar semen fresco ................................................................................ 9
4.2.8. Reactivos para evaluar semen fresco ........................................................................... 10
4.2.9. Equipos para refrigerar semen ..................................................................................... 10
4.2.10. Reactivos para refrigerar semen ................................................................................... 10
4.2.11. Materiales para evaluar semen refrigerado .................................................................. 11
4.2.12. Equipos para evaluar semen refrigerado ...................................................................... 11
4.3. MÉTODOS .......................................................................................................................... 11
4.3.1. ANÁLISIS AL SEMENTAL....................................................................................... 11
4.3.2. PAJILLAS ................................................................................................................... 11
4.3.3. DILUYENTES............................................................................................................. 11
4.3.4. LABORATORIO Y CAMPO ...................................................................................... 12
4.3.5. MÉTODO DE EXTRACCIÓN ................................................................................... 12
4.3.6. CONTROL DE LA CANTIDAD Y CALIDAD DEL SEMEN .................................. 12
4.3.7. CONSERVACIÓN MEDIANTE LA REFRIGERACIÓN ......................................... 13
5. Bibliografía .................................................................................................................................. 14

3
2. TEMA

¨Parametros de criopreservación de semen bovino en refrigeración y

diluido de dos toros (Bos indicus) en Luz de America.Ӭ

3. 1. Revisión Bibliográfica

3.1. Antecedentes

La criopreservación de semen es una importante biotecnología reproductiva, que busca

promover la conservación del germoplasma masculino por tiempo indeterminado. Esta
biotecnología, cuando se asocia a la inseminación artificial, representa un mecanismo eficiente
para la promoción y difusión de material genético de excelente calidad. La criopreservación
de semen proporciona una economía para el productor, al reducir los costos de alimentación y
transporte de los reproductores, así como los riesgos de transmisión de enfermedades
sexualmente transmisibles (Castelo y col 2008).

De esta forma la utilización de espermatozoides congelados dará un gran aporte para el sector
ganadero. El objetivo de congelar células espermáticas es la producción de un banco de las
mismas, teniendo a disposición un material sin plazo de vencimiento, potencializando la
eficiencia de la reproducción animal (Amirat y col 2004)

Sin embargo una de los problemas relevantes relacionado con la eficacia de las técnicas de
criopreservación es la rapidez para disminuir la temperatura durante el congelamiento, ya que
esto depende del tipo de curva utilizada en la criogenización, responsable de las lesiones
celulares que puedan producirse por deshidratación y formación de escarcha intracelular.

La estandarización de la curva de enfriamiento y de congelación parece ser una ventaja sobre la otra
técnica, ya que durante la técnica manual esa estandarización es difícil, pues depende de la calidad del
material utilizado y existe el riesgo de una posible falla humana; además, la practicidad de tener todas
las etapas controladas por un aparato constituye otra ventaja (Vasconcelos-Filho 2010). Existen
básicamente dos métodos de congelación de semen, el convencional y el automatizado. En el
método convencional las pajillas son acomodadas en una gradilla de metal y refrigeradas a 4
°C, durante 4 horas, en una nevera doméstica. Luego de este periodo, la gradilla de metal con
las pajillas, es transferida para una caja de poliestireno, conteniendo nitrógeno líquido y
acomodadas 6 cm por encima de la superficie liquida durante 20 minutos. Finalmente, las
pajillas son inmersas en nitrógeno líquido y, posteriormente, almacenadas en un termo de
nitrógeno. Por el método automatizado, luego del envase, las pajillas son refrigeradas y
4
congeladas utilizando un equipo congelador de semen automático con un protocolo estándar
según recomendaciones del fabricante. Luego de la congelación las pajillas son almacenadas
en el termo de nitrógeno líquido (Vasconcelos-Filho 2010).

Para la conservación de pajillas mediante el método automatizado es necesario el uso de

algunas soluciones diluyentes buffer capaces de aumentar el volumen y mantener la óptima
vitalidad de fecundación de los espermas como:

AndroMed® 200 mL compuesto por fosfolípidos, TRIS, antioxidantes, azúcares, ácido cítrico,
glicerina, tampones, agua de altísima pureza y antibióticos, de acuerdo con la Directiva de la
UE 88/407 (Tilosina, Gentamicina, Espectinomicina, Lincomicina) (Minitube, s.f.).

Los principales beneficios de AndroMed® 200 mL son; una alta tasa de fetilidad, no contiene
ingredientes de origen animal (tobas las materias primas utilizadas en la producción de
AndroMed® son producidas según normas GMP y DIN ISO 9001:2000 y certificadas según
estándares Ph Eur, BP o USP), no implica riesgo de contaminación microbiológica y cumple
con protocolos de producción eficientes (Minitube, s.f.).

Triladyl® 200g, un concentrado estéril utilizado como diluyente con yema de huevo para la
congelación de semen bovino en un solo paso. Está compuesto principalmente de ácido cítrico,
azúcares, TRIS, tampones, glicerina, agua de extrema pureza y antibióticos. El semen, los
envases y el diluyente deben estar siempre a la misma temperatura para evitar shock térmico
del semen. Para la utilización de este diluyente se debe verter completamente un frasco de
Triladyl® 200g en un matraz graduado y seguidamente agregar 750 mL de agua pura estéril.
En relación con la materia prima, todas son elaboradas de acuerdo con normas GMP, y DIN
ISO 9001, y certificadas según estándares Ph Eur, BP o USP. Han sido testadas cumpliendo
normas de calidad internacionales para el control de fármacos y corresponden a dichas normas
(Minitube, 2012).

Steridyl, 500 mL, los principales beneficios de este diluyente son la elaboración de fórmula de
búfer, basada en TRIS, proporciona la obtención de resultados de congelación óptimos y muy
constantes en un amplio rango de relaciones de dilución, protocolos de producción eficientes,
además, permite optimización de tiempo. Steridyl está compuesto de TRIS, ácido cítrico,
azúcar, tampones, glicerol, agua más pura, yema de huevo estéril irradiado y antibiótico de
acuerdo con la Directiva de la UE. Steridyl® es utilizado con éxito con relaciones de dilución
de baja concentración, así como para eyaculados bovinos con baja densidad (Minitube, 2013).

Se plantea determinar cuál de los tres diluyentes es más efectivo en la conservación del semen,
analizando las propiedades del mismo antes de agregarle el diluyente,
considerando la importancia de la criopreservación de espermatozoides para la reproducción
y la escasez de trabajos que comparan las técnicas de criopreservación convencional y
5
automatizada de células espermáticas de bovinos se propone evaluar los efectos del método de
criopreservación.

4. Materiales y metodos

4.1. UBICACIÓN GEOGRÁFICA

4.1.1. Ubicación política

Provincia: Santo Domingo de los Tsáchilas.

Cantón: Santo Domingo.

Parroquia: Luz de América.

Finca: Zoila Luz.

Ubicación: Km 24 Vía Santo Domingo- Quevedo.

Extensión: 3 857 km²

4.1.2. Límites de la provincia

Norte: Cantones Puerto Quito y Los Bancos.

Sur: Provincia de Cotopaxi y Los Ríos.

Este: Cantones Quito y Mejía, y la Provincia de Cotopaxi.

Oeste: Provincias de Esmeraldas, Manabí y Los Ríos.

4.1.3. Ubicación ecológica

Clima: Trópico, sub trópico, cálido.

Temperatura media anual: 23,6 ºC.

Precipitación media anual: 2 980 mm/año.

6
Heliofanía media anual: 660 horas/luz/año.

Humedad relativa: 91 %.

Pluviosidad: 800 – 1 800 mm anuales.

Altitud: 550 msnm

Ilustración 1: Área de estudio de semen en el laboratorio de Biotecnología animal de la Universidad

de las Fuerzas Armadas Espe- Longitud y latitud de 0° 29´53.1´´S 79°20´51.0´´W

4.2. MATERIALES Y REACTIVOS

4.2.1. Materiales de campo

 Vagina artificial.

 Tubos recolectores de semen graduados.

 Termómetro

7
 4.2.2. Materiales biológicos
 Semen de tres toros de raza mestiza Sahiwal.

 Huevos de gallina frescos.

4.2.3. Materiales de laboratorio

 Termómetros manuales y digitales.

 Pipetas boeco.

 Gradillas.

 Pisetas.

 Vasos de precipitación.

 Agitadores magnéticos.

 Papel filtro.

 Gasa estéril.

 Papel aluminio.

4.2.4. Materiales para evaluar semen fresco

 Fotómetro.

 Tubos de ensayo.

 Cubre y porta objetos.

 Placas para contraste de

fase.

 Cámara leja para equipo

CASA.

 Micro cubetas para

8
 spermacue.

 Gradillas.

4.2.5. Materiales para congelar semen

 Pajuelas de 0,5 ml.

 Pasta de tinta negra para la impresora AHDR.

 Plantilla taquigráfica para rodillo de la AHDR.

 Mangueras de llenado de la MPP1.

 Topes de agujas de la MPP1.

 Conos de succión de la MPP1.

4.2.6. Equipos de laboratorio

 Autoclave manual Tuttnauer 2540 MK y automática 2540 E.

 Esterilizadora Memmert D-91126.

 Refrigeradora.

 Fuentes de poder HT50 y HT007.

 Cámara de flujo.

 Agitador magnético.

 Cámara de flujo laminar.

4.2.7. Equipos para evaluar semen fresco

9
 Baño María Fisher scientific B14.

 Microscopio de contraste de fase D-22297.

 Microscopio tri ocular olympus BX41TF.

 Cámara fotográfica con lente incorporado al microscopio E-330- ADUT-2X y

fotómetro Spermacue.

 pH metro portátil.

4.2.8. Reactivos para evaluar semen fresco

 Eosina-Nigrosina.

 Solución hipoosmótica.

 Solución salina formolada.

 Solución HOS formol.

4.2.9. Equipos para refrigerar semen

 Icecube 14 S-B con Touchscreem de 12" y 115V.

 Máquina envasadora y selladora de pajuelas para 0,25 y 0,5 ml

automática MPP1.

 Impresora de pajuelas AHDR.

 Refrigeradora de laboratorio

4.2.10. Reactivos para refrigerar semen

 AndroMed frasco 200 ml.

 Triladyl frasco 250 ml.

 Steridyl 250 ml.

10
  Agua ultra pura.

4.2.11. Materiales para evaluar semen refrigerado

 Cámara leja para equipo CASA.

 Porta y cubre objetos.

4.2.12. Equipos para evaluar semen refrigerado

 Microscopio de contraste de fase D-22297.

 Microscopio tri ocular olympus BX41TF.

 Sistema CASA Sperm Vision Therio REF: 12520/8000.

4.3. MÉTODOS

Se aplicará diferentes métodos según las distintas fases.

4.3.1. ANÁLISIS AL SEMENTAL

Se le realizara al semental los siguientes análisis con la finalidad de determinar que está apto
para proporcionar semen: Perfil pre-extracción de semen vacunado, campyloacter, e
investigación de hemoparásitos.

4.3.2. PAJILLAS
El semen se congela en pajillas francesas de 1/2 c.c cada pajilla estará marcada con el código
del toro, el nombre registrado, número del registro y el código de recolección. Esto asegura la
identificación positiva de cada lote de semen. Se utilizará la impresora AHDR del laboratorio
de biología animal.

4.3.3. DILUYENTES
En el presente estudió se utilizará tres crioprotectores (Andromen, Bioxcell, Triladyl), la
preparación de estos se realizó un día antes a la extracción de semen y la dilución con los

11
crioprotectores se realizará teniendo en cuenta la concentración de espermatozoides que cada
eyaculado presente.

4.3.4. LABORATORIO Y CAMPO

Se deberá limpiar y humedecer el suelo para prevenir el levantamiento del polvo del montadero
además se bañará tanto a la hembra como al semental.

Las mesas de laboratorio donde se trabajará deberán estar desinfectadas con alcohol, y el
microscopio de contraste de fase deberá estar previamente encendido al igual que la
refrigeradora.

4.3.5. MÉTODO DE EXTRACCIÓN

Una vez extraído el semen por el método de la vagina artificial se debe manipular con mucho
cuidado para evitar la muerte de los espermatozoides.

Armado de la vagina artificial

Las vaginas artificiales se las arman una vez esterilizadas y se las coloca en la estufa a una
temperatura de 36°C. En el tubo de látex introducir la camisa de extremo a extremo, en el
extremo cercano a la válvula sellar con una liga. Se coloca en el otro extremo el cono de
recolección más el tubo de recolección. Finalmente se adiciona la protección térmica.

Es muy importante que todas las superficies que entren en contacto con el semen se encuentren
entre 35 y 38ªC. Se debe así mismo evitar la exposición del semen al rayo directo del sol y la
contaminación de los implementos utilizados.

4.3.6. CONTROL DE LA CANTIDAD Y CALIDAD DEL SEMEN

Se analizan una serie de parámetros morfológicos y funcionales: volumen, color, olor,
concentración, motilidad masal, motilidad individual, porcentaje de formas anormales y
porcentaje de acrosomías. Todos estos parámetros serán medidos en el laboratorio de biología
animal.

El semen después de diluido y evaluado será conservado mediante la refrigeración.

12
 4.3.7. CONSERVACIÓN MEDIANTE LA REFRIGERACIÓN
Conservación en estado refrigerado (en estado líquido, fresco): su conservación puede ser entre
15-20°C o entre 4-5°C. Mediante la conservación a 5°C, se disminuye la actividad metabólica
de los espermatozoides y se produce una reducción en el crecimiento bacteriano, llevando al
eyaculado a extender su supervivencia (Vishwanath y Shannon, 2000). Es posible la
implementación de semen refrigerado a 5°C, ya que se estima una vida útil de entre 2 y 4 días,
facilitando su transporte e implementación según Lemma (2011) el semen almacenado entre
5-8°C sobrevive entre 24-48 horas sin una disminución significativa en la motilidad y hasta 96
horas sin un marcado descenso en el porcentaje de fertilidad.

COMPARACIÓN

Las muestras refrigeradas se analizaran al día siguiente en el microscopio de contraste de fase

según los diferente parámetros que fueron tomados en cuenta principio con el fin de determinar
si prevalece la calidad del essperma.

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5. Bibliografía

- Vasconcelos-Filho WF. 2010. Eficiência da congelação automatizada na

viabilidade de sêmen bovino. 2010. Tesis máster, Instituto de Zootecnia,
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, Brasil. Recuperado
de http://r1.ufrrj.br/wp/ppgz/files/2015/05/Disserta%C3%A7%C3%A3o-Wilson-
Franklim-de-Vasconcelos-Filho.pdf
-
- Amirat L, D Tainturier, LT Jeanneau, C Thotin, O Gérard, JL Courtens, M Anton.
2004. Bull semen in vitro fertility after cryopreservation using egg yok LDL: a
comparison with Optidyl® a commercial egg yolk extender. Theriogenology 61, 895-
907. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0093691X03002590

- Castelo TS, TR Frota, AR Silva. 2008. Considerações sobre a criopreservação do

sêmen de caprinos. Acta Vet Bras2, 67-75. Recuperado de
https://periodicos.ufersa.edu.br/index.php/acta/article/view/885

- Criopreservación de semen :: R.Vet. (2017). Reproduccionveterinaria.com. Retrieved

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- Peres, P.A, Barbosa, M.L, Kanazawa, Y.M. (2014). Criopreservación de

espermatozoides bovinos extraídos de la cola del epidídimo utilizando los métodos
convencional y automatizado. Scielo. vol.46 no.1 Valdivia. .doi.org/10.4067/S0301-
732X2014000100005. Recuperado de
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732X2014000100005#n6

- Minitube (s.f.). AndroMed. Recuperado de:

https://www.minitube.es/pdf/index/13503-0200_Leaflet-AndroMed_es_171002.pdf

14
- Minitube (2012). Diluyente de semen bovino Triladyl. Manual. Recuperado de:
http://www.perulactea.com/wp-content/uploads/2012/09/DILUYENTE-DE-SEMEN-
BOVINO-TRILADYL.pdf
- Minitube (2013). Steridyl. Recuperado de:
http://www.huvesearch.com/dpics/pdfs/2013-10-10-06-24-14_13500-
0260_Steridyl_en_120814.pdf?PHPSESSID=s1lhoasnashl317s737j89i255

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