Carcinogénesis y Mutagénesis

Farinango Páez Camila Alexandra

Alumna de Toxicología EIA820-3, Carrera de Ingeniería en Biotecnología,
Universidad de las Américas (UDLA), Quito-Ecuador

Carcinogénesis

Ha pasado casi un siglo desde el comienzo de la investigación experimental en

carcinogénesis. El progreso fue lento antes de la determinación de Watson y
Crick de la estructura del ADN y la elucidación de su papel como el principal
portador de información genética. Estos descubrimientos proporcionaron la base
esencial para comprender la carcinogénesis a nivel genético molecular, y el ritmo
del descubrimiento se ha acelerado rápidamente. Los principales avances
incluyen la identificación de las principales clases de carcinogénesis ambiental,
la apreciación del papel de los factores del estilo de vida en el cáncer humano,
el reconocimiento del papel de la bioactivación y una mayor conciencia de las
diferencias entre individuos en la susceptibilidad genética (Penning, 2011).

Se considera que para que la carcinogénesis sea efectiva, deben interactuar con
los constituyentes celulares, incluidas las proteínas, los lípidos y, lo más
importante, con los ácidos nucleicos, el material genético de la célula.
Compuestos que tienen estructuras que permiten el tipo de reacciones y la
acción directa; aquellos requieren activación metabólica son de acción indirecta.
Los carcinógenos no genotóxicos o epigenéticos tienen otros mecanismos de
acción.

Relativamente pocos carcinógenos son de acción directa ya que la inactiva

reactividad de dichos compuestos también tiende a hacerlos inestables.
Ejemplos de tales carcinógenos son aziridina (etilenimina), beta propiolactona,
bis (clorometil) éter, bis (2-cloroetil) sulfuro, óxido de etileno, metil
metanosulfonato. Estas estructuras conducen a la alquilación de
macromoléculas celulósicas, a menudo en la posición 7 de guanina en ácidos
nucleicos, sin la necesidad de activación metabólica. La mayor parte de la
carcinogénesis directa no representa un peligro apreciable para la población en
general (Shingo Miyamoto, 2008).
La carcinogénesis de acción indirecta es aquella que es estables en el medio
ambiente y, por lo tanto, es más probable que la población en general se ponga
en contacto con ellos. Tales agentes, a menudo llamados pro o pre
cancerígenos, requieren activación metabólica antes de que puedan interactuar
con las macromoléculas celulares. A su vez, el metabolismo se rige por muchos
factores, que incluyen especies, cepas, sexo, edad, dieta, inductores o
inhibidores de enzimas, estado inmune y otros factores. Los estudios de
metabolismo han identificado especies o cepas que carecen de los sistemas
enzimáticos necesarios para metabolizar ciertos pro carcinógenos a la forma
activada (Cell Biology and Cancer).
A menudo se presume que los fármacos anticancerosos deben inducir la
apoptosis de manera preferente en las células cancerosas. Incluso se afirma que
los inhibidores de dianas universalmente vitales, como las histonas deacetilasas
y el proteosoma, son selectivamente tóxicas para las células cancerosas. Por un
lado, es bien sabido que la inestabilidad genética (por ejemplo, a través de
defectos en la reparación del ADN) predispone al cáncer y acelera la progresión
del tumor. Por otro lado, la inhibición de la reparación del ADN ayuda a tratar el
cáncer (Butel, 2000).

Aunque los carcinógenos y los medicamentos contra el cáncer se consideran

opuestos, los dos grupos de agentes se superponen mucho:
 Los agentes alquilantes son carcinógenos clásicos (metilnitrosourea,
7,12-dimetilbenzantraceno, dietilnitrosoamina) y también son
medicamentos clásicos contra el cáncer (melfalán, clorambucilo,
busulfano, ciclofosfamida, nitrosoureas, cisplatino y carboplatino).
 La radiación es un agente carcinogénico y una terapia efectiva contra el
cáncer. Como un ejemplo sorprendente, el yodo radioactivo causa cáncer
de tiroides15 y es la terapia más efectiva para los cánceres de tiroides
que retienen la capacidad de acumular yodo.
 El arsénico, un agente citotóxico clásico y carcinógeno, recientemente fue
redescubierto como uno de los medicamentos contra la leucemia y el
cáncer más prometedores
En general, se supone que los carcinógenos estimulan la proliferación celular y
bloquean la diferenciación, porque la proliferación y la desdiferenciación son
características comunes de las células cancerosas. En contraste con esta
suposición, los carcinógenos (por ejemplo, los agentes que dañan el ADN y el
éster de forbol) inhiben la proliferación e inducen la diferenciación (Blagosklonny,
2005).
Los factores carcinogénicos son restrictivos (para las células normales) no
permisivos. Al tiempo que inhiben la proliferación de las células normales, los
carcinógenos no inhiben (o incluso estimulan) las células premalignas: a saber,
las células con mutaciones oncogénicas, Por ejemplo, el promotor del tumor de
TPA es citostático en ciertas células normales. La pérdida de Rb, la
sobreexpresión de c-myc y otros cambios oncogénicos pueden hacer que las
células sean resistentes al TPA. Entonces, el TPA inhibe las células epiteliales
normales, pero sus contrapartes malignas, favoreciendo selectivamente su
proliferación. De carcinógenos, dos estudios han demostrado que el tabaquismo
aumenta el riesgo de transformación desde metaplasia a displasia (Biobanks and
Biological Resource Centres).
La reacción metabólica inicial de la mayoría de los xenobióticos, incluidos los
carcinógenos, implica la oxidación ya sea a un producto de desintoxicación o a
una forma que se acerca más al agente carcinógeno activado o último. El sistema
enzimático responsable de muchas reacciones metabólicas es el sistema P450.
La hemoproteína se distingue por la longitud de onda del derivado de monóxido
de carbono de forma reducida, concretamente a 450 nm (Feigelson, 2000).

Mutagénesis

La generación y caracterización de mutantes es un componente esencial de

cualquier estudio sobre las relaciones estructura-función. El conocimiento de la
estructura tridimensional de una proteína, especie de ARN o elemento regulador
del ADN (por ejemplo, un promotor) puede proporcionar pistas sobre la forma en
que funcionan, pero la prueba de que el mecanismo correcto se ha elucidado
requiere el análisis de mutantes que tienen aminoácidos o cambios de
nucleótidos en residuos clave (E. Susan Slechta, 2003).

Clásicamente, los mutantes se generan al tratar el organismo de prueba con

agentes químicos o físicos que modifican el ADN (mutágenos). Este método de
mutagénesis ha sido extremadamente exitoso, como lo demuestra el crecimiento
de la biología molecular y la genómica funcional, pero adolece de una serie de
desventajas. Primero, cualquier gen en el organismo puede ser mutado y la
frecuencia con la cual los mutantes ocurren en el gen de interés puede ser muy
baja. Esto significa que las estrategias de selección deben ser desarrolladas. En
segundo lugar, incluso cuando se aíslan mutantes con el fenotipo deseado, no
hay garantía de que la mutación se haya producido en el gen de interés. Tercero,
antes del desarrollo de las técnicas de clonación y secuenciación de genes, no
había forma de saber en qué parte del gen se había producido la mutación y si
había surgido por un solo cambio de base, una inserción de ADN o una deleción
(Mishra, 2012).

A medida que las técnicas de biología molecular se han desarrollado, de modo

que el aislamiento y el estudio de un único gen no solo es posible sino también
rutinario, también se ha refinado la mutagénesis. En lugar de mutagenizar
crudamente muchas células u organismos y luego analizar muchos miles o
millones de descendientes para aislar un mutante deseado, ahora es posible
cambiar específicamente cualquier base dada en una secuencia de ADN
clonada. Esta técnica se conoce como mutagénesis dirigida al sitio. Se ha
convertido en una herramienta básica de manipulación de genes, ya que
simplifica las manipulaciones de ADN que en el pasado requerían una gran
cantidad de ingenio y trabajo duro, por ej. la creación o eliminación de sitios de
escisión para endonucleasas de restricción. La importancia de la mutagénesis
dirigida al sitio va más allá de las relaciones estructura-función del gen para que
la técnica permita la creación de proteínas mutantes con nuevas propiedades de
valor (ingeniería de proteínas). Dichas proteínas mutantes pueden tener solo
cambios menores, pero no es raro que se eliminen dominios completos o se
añadan nuevos dominios (HUTCHINSON).

La extensión de cebador (el método de cebador único) es un método simple

para la mutación dirigida al sitio
El primer método de mutagénesis dirigida al sitio que se desarrolló fue el método
de cebador único. Como se describió originalmente, el método implica la síntesis
in vitro de ADN con un oligonucleótido sintetizado químicamente (7-20
nucleótidos de longitud) que lleva una falta de coincidencia de bases con la
secuencia complementaria. El método requiere que el ADN mutado esté
disponible en forma monocatenaria, y la clonación del gen en vectores basados
en M13 lo hace fácil. Sin embargo, el ADN clonado en un plásmido y obtenido
en forma dúplex también se puede convertir en una molécula parcialmente
monocatenaria que es adecuada. El oligonucleótido sintético ceba la síntesis de
ADN y se incorpora a sí mismo en la molécula de heterodúplex resultante.
Después de la transformación del E. coli del huésped, este heterodúplex da lugar
a homodúplex cuyas secuencias son o bien del ADN de tipo salvaje original o
bien del que contiene la base mutada. La frecuencia con la que surgen los clones
mutados, en comparación con los clones de tipo salvaje, puede ser baja. Con el
fin de seleccionar mutantes, los clones pueden cribarse mediante hibridación de
ácidos nucleicos con oligonucleótidos marcados con 32P como sonda. En
condiciones de rigurosidad adecuadas, es decir, temperatura y concentración de
catión, se obtendrá una señal positiva solo con clones mutantes. Esto permite la
detección de el mutante deseado Es prudente verificar la secuencia del mutante
directamente a través de la secuenciación del ADN, para verificar que el
procedimiento no se haya introducido en otros cambios accidentales. Esta era
una necesidad particular con las primeras versiones de la técnica que utilizaban
ADN polimerasa de E. coli. El uso más reciente de las ADN polimerasas de alta
fidelidad ha minimizado el problema de las mutaciones extrañas, así como el
tiempo de copia de la segunda cadena. Además, estas polimerasas no son
"desplazan-desplazan" el oligómero, un proceso que elimina el oligonucleótido
mutante original. Una variación del procedimiento descrita anteriormente implica
oligonucleótidos que insertadas insertadas o eliminadas. Siempre que se formen
híbridos estables con ADN monocatenario de tipo silvestre, prim Se puede
producir la síntesis de ADN in vitro, dando lugar en última instancia a clones
correspondientes a la secuencia insertada o eliminada (Twyman, 2006).
El método de cebador único tiene una serie de deficiencias
La eficiencia con la que el método de cebador único produce mutantes depende
de varios factores. Las moléculas de heterodúplex bicatenarias que se generan
contienen contaminadas por ADN moldeado que se mantienen sin copiar y por
moléculas parcialmente bicatenarias. La presencia de estas especies reduce
considerablemente la proporción de progenie mutante.
Se pueden eliminar mediante centrifugación en gradiente de sacarosa o
mediante electroforesis en gel de agarosa, pero esto lleva mucho tiempo y es
poco práctico. Después de la transformación y la síntesis de ADN in vivo, puede
producirse la segregación de las dos cadenas de la molécula de heterodúplex,
produciendo una población mixta de progenie mutante y no mutante. La progenie
mutante debe purificarse de las moléculas parentales, y este proceso se
complica por el sistema de reparación de desajuste de la célula. En teoría, el
sistema de reparación de apareamiento incorrecto debería producir el mismo
número de progenie mutante y no mutante, pero en la práctica los mutantes se
contraseleccionan. La razón principal de este bajo rendimiento de la progenie
mutante es que el sistema de reparación de desapareamientos metireccional
dirigido de E. coli favorece la reparación del ADN no metilado. En la célula, las
cadenas de ADN recién sintetizadas que aún no han sido metiladas se reparan
preferentemente en la posición del apareamiento erróneo, eliminando así una
mutación. De manera similar, la célula mutante generada in vitro no metilada es
reparada por la célula de modo que la mayoría de la progenie sea de tipo
silvestre. Los problemas asociados con el sistema de reparación de desajustes
pueden superarse mediante el uso de cepas huésped que portan las mutaciones
mutL, mutS o mutH, que evitan la reparación dirigida por metilo de las
discordancias. Una molécula heterodúplex con una cadena mutante y una
cadena no mutante debe dar lugar inevitablemente a la progenie tanto mutante
como no mutante tras la replicación. Sería deseable suprimir el crecimiento de
los no mutantes, y se han desarrollado diversas estrategias teniendo esto en
mente (Twyman, 2006)

La PCR puede usarse para la mutagénesis dirigida al sitio

Los primeros trabajos sobre el desarrollo del método PCR de amplificación de

ADN mostraron su potencial para la mutagénesis (Scharf et al., 1986). Las bases
individuales que no coinciden entre el cebador de amplificación y la plantilla se
incorporan en la secuencia de plantilla como resultado de la amplificación (figura
8.5). Higuchi et al. (1988) han descrito una variación del método básico que
permite introducir una mutación en un fragmento de ADN producido por PCR en
cualquier lugar a lo largo de su longitud. Dos reacciones primarias de PCR
producen dos fragmentos de ADN superpuestos, ambos con la misma mutación
en la región de solapamiento. La superposición en secuencia permite que los
fragmentos se hibriden (figura 8.5). Uno de los dos híbridos posibles es extendido
por la ADN polimerasa para producir un fragmento dúplex. El otro híbrido tiene
extremos 5 'rebajados y, dado que no es un sustrato para la polimerasa, se
pierde efectivamente de la mezcla de reacción. Al igual que con la mutagénesis
de extensión de cebador convencional, también se pueden crear deleciones e
inserciones (Mary Campbell, 2006).
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