Persiapan sampel dan presentasi sampel

Modus penyajian sampel yang paling sering adalah sebagai larutan encer, meskipun gas dan
permukaan padat juga dapat diperiksa. Kombinasi spektrofotometri UV dan spektrofotometri atau
spektrofotometri dengan HPLC sangat bermanfaat untuk deteksi kromophores dan fluorophores
yang sensitif dan selektif.

Analisis kualitatif

Identifikasi sampel tergantung pada satu atau lain cara membandingkan

spektra sampel untuk spektra standar yang dikenal. Tiga klasifikasi sederhana

prosedur dijelaskan di bawah ini.

Posisi puncak

Metode enam-puncak digunakan untuk spektrum IR pertengahan (lihat Bab 33) secara khusus

sederhana dan dapat dengan mudah diterapkan pada spektrum NIR. Gambar 34.1B

menunjukkan spektrum derivatif kedua dari sampel acetomenaphthone.

Posisi dari enam puncak yang paling intens (negatif-pergi

puncak) dicatat dan kemudian dibandingkan dengan database posisi puncak

senyawa. Contoh bagian dari database seperti itu ditampilkan

pada Tabel 34.1, di mana puncak spektroskopi dari senyawa tersebut

tercantum dalam urutan intensitas menurun. Ini masalah sederhana untuk dibandingkan

puncak sampel yang tidak diketahui dengan yang ada di basis data.

Puncak spektrum yang ditunjukkan pada Gambar 34.1B memberikan hasil yang sangat baik

cocok dengan acetomenaphthone. Meskipun proses menemukan puncak

posisi dan menemukan kecocokan terbaik dengan yang ada dalam database

dilakukan secara manual, juga dapat dikomputerisasi dengan mudah. Urutan puncak adalah

sering berbeda antara sampel dan spektrum referensi karena perbedaan

dalam sifat fisik dari sampel dan yang digunakan untuk

membangun database. Akibatnya, perawatan diperlukan saat mencari

untuk pertandingan terbaik. Pencarian sederhana awal tanpa memperhatikan puncak

intensitas lebih disukai. Untuk mendapatkan diskriminasi maksimum antara

zat yang berbeda, banyak parameter harus dioptimalkan.

Parameter penting adalah jumlah puncak, rentang spektral, derajat

penghalusan spektral, jumlah titik data yang digunakan untuk menghitung

spektrum turunan kedua dan ukuran jendela di mana puncak berada

dianggap cocok. Menurunkan ukuran jendela meningkatkan kemampuan untuk

membedakan antara materi, tetapi sebaliknya cenderung meningkatkan falsenegatif

tingkat identifikasi. Meningkatkan jumlah puncak dan / atau

menghitung skor yang memperhitungkan intensitas puncak relatif

dapat meningkatkan diskriminasi lebih jauh. Namun, tidak bergantung pada

intensitas puncak relatif membuat metode ini lebih kuat terhadap perubahan

dalam sifat fisik dari sampel.

Spektrofotometri IR

pengantar

Penyerapan radiasi inframerah (IR) adalah sifat yang sangat khas dari suatu zat dan secara luas
digunakan untuk tujuan identifikasi.

Spektroskopi inframerah adalah studi tentang hamburan, refleksi, penyerapan atau transmisi radiasi
IR dalam rentang spektrum 800-1000 000nm (0,8-1000 mm). Dalam literatur yang lebih tua (pra-
1970), radiasi IR disebut dalam hal panjang gelombang dalam satuan mikron (mikrometer, mm). Saat
ini, bilangan gelombang (~ n) digunakan hampir secara eksklusif. Hubungan antara bilangan
gelombang dalam satuan sentimeter timbal balik (cm? 1) dan panjang gelombang (l) dalam
mikrometer (mm) diberikan oleh:

Spektrum IR dapat dibagi menjadi tiga subregion:

12 500–4000 cm-1 (0,8-2,5 mm; dekat IR), 4000–400 cm-1 (2,5–25 mm; pertengahan IR) dan 400–10
cm-1 (25–1000 mm; jauh IR). Hanya wilayah pertengahan IR (sering disebut hanya sebagai
inframerah) dianggap di sini karena merupakan wilayah yang banyak digunakan dalam analisis obat-
obatan dan pestisida. Namun, beberapa instrumen modern dapat memindai dari 15.000 cm-1
sampai sekitar 50 cm? 1; perpanjangan ke IR jauh berguna untuk senyawa terhalogenasi dan untuk
zat anorganik.

Persiapan sampel

Keuntungan utama dari spektroskopi IR adalah kemampuan untuk mengukur secara relatif material
heterogen dan sampel yang berciri buruk, khususnya dalam fase terkondensasi (misalnya krim,
bubuk, bahan kristal).
Berdasarkan sifatnya, sampel ini seringkali tidak murni secara kimia dan IR spektroskopi dapat
mengidentifikasi atau mengkonfirmasi keberadaan konstituen utama. Spektroskopi IR sering
digunakan untuk menunjukkan bahwa sampel sesuai dengan harapan. Namun demikian, penting
untuk memiliki sampel murni untuk bertindak sebagai standar untuk spektroskopi IR. Kesulitan
utama bisa berupa memurnikan dan menangani beberapa mikrogram material tanpa kehilangan
substansial, meskipun masalah ini sebagian besar telah diatasi dengan menggunakan pecahan
kristalisasi atau kromatografi sebagai pendahuluan bagi spektroskopi IR. On line Spektroskopi FTIR
mungkin, tetapi sebagian besar merupakan alat penelitian.

Saat ini, identifikasi sampel dalam jumlah sedikit tercapai oleh teknik lain, seperti spektrometer
resonansi magnetik nuklir (NMR) (lihat Bab 36) dan spektrometri massa (MS) (lihat Bab 37). Ini
terutama terjadi dengan teknik 'ditulis dgn tanda penghubung', yang melibatkan penggunaan
metode spektrometri on-line dengan kromatografi proses. Namun demikian, spektroskopi IR
memiliki hal yang penting peran untuk bermain dalam mengidentifikasi kelompok-kelompok
fungsional.

Namun, isolasi sampel murni analit untuk spektroskopi IR masih bisa menjadi masalah penting.
Ketika bahan awal adalah residu dari penguapan ekstrak pelarut air seni, darah, jaringan atau bahan
lain, metode pemurnian yang paling sesuai adalah beberapa bentuk kromatografi. Interpretasi
spektrum Sebuah molekul non-linear memiliki (3N- 5) fundamental (normal) mode getaran (ini tidak
termasuk nada dan kombinasi). Jadi, molekul seperti parasetamol (lihat Gambar 33.21) dengan
rumus C8H9NO2 memiliki (3X20-5) = 55 mode getaran fundamental (normal). Menetapkan 55
puncak dalam spektrum IR adalah tugas yang menakutkan setidaknya. Oleh karena itu, struktur
molekul total obat tidak mungkin ditentukan langsung dari informasi spektral IR saja.

Ada tiga aspek untuk mengidentifikasi entitas kimia.

Yang pertama Misalnya, sifat (biologis, kimia dan spektroskopi) dari obat dinilai dan obat
diklasifikasikan menurut jenisnya (misalnya obat anti-inflamasi non-steroid, barbiturat, steroid).
Analit mungkin merupakan senyawa yang dikarakterisasi sebelumnya, dalam hal ini perbandingan
data dari yang tidak diketahui dengan data referensi, sering disebut identifikasi sidik jari, menegaskan
identitas senyawa. Ini dimungkinkan melalui pencocokan komputer spektrum. Struktur molekul dari
entitas kimia baru kemungkinan besar perlu ditentukan oleh spektroskopi NMR, mungkin dalam
kombinasi dengan MS.

Namun, informasi seperti adanya kelompok fungsional tertentu atau penghapusan struktur putatif
sangat membantu dalam memproses Informasi NMR

HPLC

pengantar

Kemampuan untuk memisahkan dan menganalisis sampel kompleks, baik molekul kecil maupun
besar, penting bagi ilmu biologi dan medis. Kromatografi kolom klasik telah berkembang selama
bertahun-tahun, dengan kromatografi

inovasi diperkenalkan pada interval satu dasawarsa. Ini

teknik menawarkan perbaikan besar dalam kecepatan, daya penyelesaian,

deteksi, kuantifikasi, kemudahan dan penerapan ke sampel baru

jenis. Yang paling menonjol dari modifikasi ini adalah kinerja tinggi

kromatografi cair (HPLC). Teknik HPLC modern menjadi

tersedia pada tahun 1969; Namun, mereka tidak diterima secara luas di farmasi

industri hingga beberapa tahun kemudian. Setelah sistem HPLC mampu

analisis kuantitatif menjadi tersedia secara komersial,

kegunaan dalam analisis farmasi sepenuhnya dihargai.

Pada 1990-an, HPLC telah memulai pertumbuhan eksplosif yang membuatnya menjadi

metode analitis populer dinilai oleh penjualan instrumen dan juga

kepentingan ilmiah. Selama perkembangan dasawarsa terakhir dalam kromatografi

mendukung dan instrumentasi untuk kromatografi cair

terus berevolusi. Penggunaan pendukung monolitik berbasis silika,

peningkatan suhu fase gerak dan kolom yang dikemas dengan partikel

<2 mm menghasilkan resolusi yang lebih baik dan pemisahan kompleks yang lebih cepat

campuran. HPLC ultra cepat adalah topik penting yang dimilikinya

telah diberikan bagiannya sendiri dalam bab ini. Aplikasi ini telah berpengalaman

pertumbuhan fenomenal dalam dekade pertama abad kedua puluh satu.

Hasil karya kromatografi cair saat ini sangat cocok

pemisahan berbagai jenis sampel, pemecahan yang luar biasa

daya, kecepatan dan tingkat deteksi nanomolar. Saat ini digunakan dalam

penelitian dan pengembangan biologi, forensik dan farmasi:

 Untuk memurnikan produk sintetis atau alami

 Untuk mengkarakterisasi metabolit
 Untuk menguji bahan aktif, kotoran, produk degradasi dan dalam
 tes pembubaran
 Dalam studi farmakodinamik dan farmakokinetik.
 Perbaikan yang dilakukan di HPLC dalam beberapa tahun terakhir meliputi:
 Perubahan material pengepakan, seperti ukuran partikel yang lebih kecil, bahan pengepakan
dan kolom baru
 pemisahan kecepatan tinggi
  Micro-HPLC, otomasi dan optimasi yang dibantu komputer
 Perbaikan dalam metode deteksi, termasuk apa yang disebut sistem deteksi ditulis dgn tanda
penghubung.

Mekanisme kromatografi

Sistem yang digunakan dalam kromatografi sering digambarkan sebagai milik salah satu dari
empat jenis mekanistik: adsorpsi, partisi, pertukaran ion dan eksklusi ukuran. Adsorpsi
kromatografi muncul dari interaksi antara zat terlarut dan permukaan fase diam padat.

Umumnya, eluen yang digunakan untuk kromatografi adsorpsi kurang polar daripada fase diam
dan sistem tersebut digambarkan sebagai 'fase normal'. Kromatografi partisi melibatkan fase
diam cair yang tidak dapat bercampur dengan eluen dan dilapisi pada pendukung lembam.
Sistem partisi dapat fase normal (fase stasioner lebih polar daripada eluen) atau kromatografi
fase terbalik, yang disebut sebagai RPC (fase diam kurang polar daripada eluen). Kromatografi
penukar ion melibatkan fase diam padat dengan gugus anionik atau kationik pada permukaan
dimana molekul terlarut dengan muatan yang berlawanan tertarik. Kromatografi eksklusi ukuran
melibatkan fase diam padat dengan ukuran pori terkontrol.

Kolom

Kolom ini merupakan kunci penting untuk kromatografi yang baik dan pemeliharaannya memastikan
fungsi sistem HPLC yang tepat. Tekanan balik yang tinggi, resolusi yang buruk, simetri puncak yang
tidak seragam dan menurunnya waktu retensi adalah beberapa tanda yang dapat menunjukkan
bahwa kolom perlu diperbaiki atau gagal.

Degradasi kolom tidak dapat dihindari, tetapi kolom hidup bisa diperpanjang jika dijaga dengan baik.
Pembilasan kolom dengan fase gerak dari kekuatan elusi tinggi setelah sampel berjalan sangat
penting. Ketika kolom tidak digunakan, itu harus ditutup untuk mencegahnya keluar. Sampel
partikulat harus disaring dan, bila memungkinkan, kolom penjaga harus digunakan. Kolom regenerasi
dapat menanamkan beberapa kehidupan ke dalam kolom, tetapi bersifat preventi pemeliharaan
adalah kunci penting untuk mencegah degradasi dini.