INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

INGENIERIA EN SISTEMAS AMBIENTALES
BIOQUÍMICA FUNDAMENTAL

PRACTICAS 3-7 “CINÉTICA ENZIMATICA “

SECCIÓN 3
4AV1
EQUIPO 3

FUENTES OLVERA KAORY JANETH

GALICIA BUENO JESSICA
PAZ RAMÍREZ ANA ISABEL

FECHA DE ENTREGA: 12/04/2018

PRÁCTICA 3. EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCIÓN
Objetivos.
1. Demostrar que las reacciones enzimáticas son afectadas por la temperatura.
2. Calcular el valor de la energía de activación de la reacción catalizada por la invertasa.
Cálculos.
Como la concentración de sacarosa fue la misma en todos los tubos, se saca el valor de la concentración de azucares
reductores a partir de la curva tipo de la practica 2, utilizando la ecuación de la recta absorbancia vs concentración de AR
Absorbancia = A+ B (concentración de AR)
A= -0.034466
B=0.040533
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎−𝐴
Concentración de AR= 𝐵

.195−(0.034466)
Concentración de AR a 0°C= 0.040533
= 5.66
µ𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝐴𝑅 /2𝑚𝑙
V0= 10
5.66µ𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠/ 2𝑚𝑙
V0 a 0°C= 10
= .566 UI

Resultados.
Tabla 1. Velocidad de reacción según la temperatura (Grafica no lineal)

T ° (C) moles AR / 2 mL Velocidad (V0) Absorbancia

0 5.66 0.566 0.195
25 6.7 0.67 0.238
37 10.5 1.05 0.399
50 20 2 0.793
75 4.4 0.44 0.145
92 2.08 0.208 0.050

Tabla 2. Ln de velocidad e inverso de temperaturas (Grafica lineal)

T °C T° Vo 1/TK InVo
(K)
0 273.15 0.56 0.00366099 -0.5798185
5 278.15 0.569854 0.00359518 -0.56237509
10 283.15 0.6 0.0035317 -0.51082562
15 288.15 0.6 0.00347041 -0.51082562
20 293.15 0.62 0.00341122 -0.4780358
25 298.15 0.69 0.00335402 -0.37106368
30 303.15 0.82 0.0032987 -0.19845094
35 308.15 0.96 0.00324517 -0.04082199
37 310.15 1.06 0.00322425 0.058268908
50 323.15 2 0.00309453814 0.6931471806
Graficas.

Gráfica 1. Velocidad de reacción vs Temperatura

Gráfica 2. Ln (V0 vs 1/T)

ln (V0) vs 1/T
0.8

0.6

0.4

0.2
ln (V0 en UI)

0
0.003 0.0031 0.0032 0.0033 0.0034 0.0035 0.0036 0.0037 Valores Y
-0.2 Linear (Valores Y)

-0.4

-0.6

-0.8

-1
1/T en °K
Ecuacuón de Arrhenius.

Ecuación de la recta
Ln(Vo) = A + B(1/T)
A= 7.549536699
B=-2232.779099
Energía de activación = R(-B)
Energía de activación de la invertasa= (1.987207 Cal/ mol K)( -(-2232.779099))= 4436.9942 Cal/mol K
Ea de la invertasa= 4.457 Kcal/mol K

Discusión
La velocidad de una reacción enzimática varía al aumentar la temperatura de acuerdo a lo indicado en la Gráfica 1, donde
se representa una típica curva de actividad enzimática/temperatura.
La temperatura causa un doble efecto en la velocidad de reacción : positivo a bajos valores, debido al incremento general
que presenta cualquier reacción química debido al aumento de la energía cinética en las moleculas y con ello el incremento
de las colisiones efectivas entre la enzima y el substrato, pero tambíen presenta un efecto negativo a valores más altos de
la temperatura optima de la enzima, debido a la desnaturalización termica de la misma. Esto es, la velocidad de una reacción
enzimática incrementa al aumentar la temperatura hasta su temperatura optima pero a valores superiores la actividad
disminuye debido a que la enzima, como cualquier proteina, sufre procesos de desnaturalización y por lo tanto de
inactivación.
En el caso de la invertasa su temperatura optima según literatura es de 50- 60 °C.
Experimentalente nos dio un valor de 50 °C en su máxima actividad, representando dicha temperatura como su temperatura
optima.
Conclusión
Las reacciones enzimaticas son afectadas por la temperatura de manera favorable hasta su temperatura optima y
desfavorable incrementando la temperatura a más de su temperatura optima ya que la desnaturaliza cambiando su
configuración y con ello su sitio activo.

La energía de activación de la invertasa nos dio un valor de 4.457 Kcal/mol K.

PRACTICA 4. EFECTO DEL pH SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCIÓN
Objetivo
1. Determinar el efecto de la variación del pH sobre la velocidad de la reacción catalizada por la invertasa.
Resultados

Tabla 3. Velocidad de reacción dependiendo del pH de la reacción.

TUBOS

Testigo P1 P2 P3 P4 P5
pH 5 3 4.5 5 6.5 7.5
Absorbancia .103 .214 1.127 .856 .669 .252
(540nm)
Azúcar
reductor (µ 3 6 29 21 17 7
moles/2.0mL)
Velocidad
(unidades de .3 .6 2.9 2.1 1.7 .7
invertasa)

Cálculos
.
𝑦 = 𝐴 + 𝐵𝑥
y=Es el valor estimado de y para distintos valores de x
A= Es la intersección o valor estimado de y cuando x=0
B= es la pendiente de la línea, el cambio promedio de y para cada cambio en una unidad de x
Donde
A= -0.034466
B=0.040533
r= 0.991498

µmoles de sacarosa
𝐯𝐨 = = U. I
min
Gráficas.

Grafica 3. Velocidad vs pH
3.5

3
Velocidad (Unidades de invertasa)

2.5

1.5
PH optimo
1

0.5

0
2 3 4.6 4 5 6 7 8
pH

Discusión
En la gráfica 1 podemos observar que se encuentra un punto máximo en pH ≈ 4.6 lo que nos indica que es ahí donde se
encuentra su pH óptimo de la enzima y comparándolo con el dato teórico que es de 4.5 es posible notar que el porcentaje
de error es muy poco (2.2%).
|Valor real−Valor experimental| |4.5−4.6|
Porcentaje de Error = x100 = x100 = 2.22%
Valor real 4.5

El pH óptimo de una enzima es aquel valor de pH en el cual una enzima realiza mejor su función por lo tanto la velocidad
de reacción es mayor.
El pH es un factor que influye en el funcionamiento de una enzima ya que según la literatura a bajos y altos pH la enzima
se desnaturaliza en la invertasa podemos observar que a valores menores de 4 y mayores de 5 empieza a dejar de trabajar.
Esto nos dice que por menor que sea la variación del pH puede afectar el funcionamiento de la enzima.

En nuestro experimento salió muy aproximado el valor de pH optimo por lo tanto se puede decir que hubo una buena
realización de la práctica.

Conclusión
La velocidad de las reacciones enzimáticas se ven afectadas por el pH de manera similar a la temperatura pues es
favorable hasta el pH optimo de la enzima y desfavorable sobrepasando dicho pH , pues sobrepasando el pH optimo la
enzima de desnaturaliza debido a que sus cargas reaccionan con las del medio.
En el caso de la invertasa su pH optimo fue de aproximadamente 4.6 .
PRÁCTICA 5. EFECTO DE CONCENTRACION DE ENZIMAS SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCIÓN.
Objetivo
1. Demostrar que la velocidad de la reacción enzimática es directamente proporcional a la concentración.
Resultados

Tabla 4. Velocidad de reacción dependiendo de la concentración de la Enzima.

TESTI P1 P2 P3 P4 P5 P6
GO
ABSORBANCIA 540 0.059 0.327 0.512 0.660 0.880 1.160
nm
AZÚCAR REDUCTOR 5 5 5 5 5 5
(µ moles/2 mL)
Velocidad (unidades de .1 .2 .3 .4 .5 .6
invertasa)
[Sustrato] (moles/L =M) .2 .2 .2 .2 .2 .2
[Enzima] 1 2 3 4 5 6
(µgramos/2mL)

Gráfica 4. Velocidad de reacción vs concentración

enzimática
0.7
0.6
Velocidad (UI)

0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 1 2 3 4 5 6 7
Concentración de enzima (µgramos/2mL)

Discusión
En esta práctica se observó, mediante una gráfica trazada con los datos obtenidos, que la actividad catalítica de una enzima
se determina midiendo la velocidad inicial de la reacción, debido a que la velocidad de una reacción catalizada
enzimáticamente es proporcional a la concentración la enzima. Inicialmente, la reacción transcurre linealmente y la
pendiente formada representa la velocidad inicial. Si se sometiera a tiempos más largos, la pendiente dejaría de ser lineal.
Esta caída de la velocidad de reacción se debería a la disminución de la concentración de sustrato.
Llegará un momento donde se ocupe toda la enzima entonces llegara a su punto máximo y de ahí tendera a descender la
velocidad de reacción.
Conclusión
Observando la gráfica 4 se puede concluir que la velocidad de una reacción catalizada enzimáticamente es proporcional a
la cantidad de enzima en el problema, esto debido a que existe mayor probabilidad de que se generen colisiones efectivas y
se genere una fase Enzima-Substrato efectivo.
 PRACTICA 6: EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO SOBRE LA VELOCIDAD DE
REACCIÓN Y PRACTICA 7:EFECTO DE INHIBIDORES SOBRE LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN
Objetivos Practica 6
1. Observar el efecto de la concentracion del sustrato sobre la velocidad de la reaccion enzimática
2. Determinar la constante de Michaelis- Menten por los metodos conocidos, asi como su aplicación
Objetivos Practica 7
1. Determinar el tipo de inhibicion producido por una sustancia ( anilina) sobre la acticidad de la invertasa.

Calculos
Como la concentración de sacarosa fue la misma en todos los tubos, se saca el valor de la concentración de azucares
reductores a partir de la curva tipo de la practica 2, utilizando la ecuación de la recta absorbancia vs concentración de AR
Absorbancia = A+ B (concentración de AR)
A= -0.034466
B=0.040533
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎−𝐴
Concentración de AR= 𝐵

.144−(0.034466)
Concentración de AR a 5 mM de sustrato = 0.040533
= 4.403
µ𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝐴𝑅 /2𝑚𝑙
V0= 10

4.403µ𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠/ 2𝑚𝑙
V0 a 0°C= 10
= .4403 UI

Sacarosa 0.2 M
Concentración de sacarosa para el T1
0.2 moles Sac-------- 1000ml
X ---------------------- 0.05 ml
Cálculos Para práctica 7 (Inhibidores)
Absorbancia = A+ B (concentración de AR)
A= -0.034466
B=0.040533
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎−𝐴
Concentración de AR= 𝐵

.110−(−0.034466)
Concentración de AR T1 = 0.040533
= 3.5642
µ𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝐴𝑅 /2𝑚𝑙
V0= 10

3.5642µ𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠/ 2𝑚𝑙
V0 a 0°C= 10
= .35642 UI
Resultados

Tabla 5. Velocidad de reacción dependiendo de la concentración de Sustrato

Absorbancia Mmoles de AR/ 2 Velocidad ( UI) [S] mM

ml
.144 4.403 .4403 5
.38 10.225 1.0225 10
.426 11.360 1.136 15
.808 20.785 2.0785 30
.840 21.574 2.1574 50
.994 25.373 2.5373 80

Tabla 6. Velocidad de reacción dependiendo de la concentración de Sustrato en presencia de un Inhibidor.

Absorbancia Mmoles de AR/ 2 Velocidad ( UI) [S] mM

ml
.110 3.5642 .35642 5
.202 5.8340 .5834 10
.216 6.1793 .61793 15
.388 10.4228 1.04228 30
.784 20.1926 2.01926 50
.886 22.7090 2.27090 80

Tabla 7. Inversa de la velocidad según la concentración de sustrato con y sin Inhibidor e inversa de la concentración de
sustrato.

1/ [S] 1/ V0 [S] 1/V0 Inh

.2 2.2712 2.8057
.1 0.9780 1.7141
.0667 .8803 1.6183
.0334 .4811 .9594
.02 .4635 .4952
.0125 .3941 .4404
Gráficas

Gráfica 5. Velocidad de reacción vs Concentración

de sustrato con y sin Inhibidor.
3

2.5
Velocidad de reacción ( UI)

1.5

0.5

0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Concentración de sustrato [S] en mM

[S] Inhibidores

Gráfica 6. Inverso de la velocidad vs Inverso de la

concentración de sustrato con y sin inhibidor.
3
2.5
2
1/[V0]

1.5
1
0.5
0
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
1/[s]

[S] Inh
Calculo de la constante de Michaelis-Menten
A= -1/Km
Km= -1/A
Ec. De la recta para [s] con Inhibidor
1/Vo= a + B (1/ [S])
A=-.1977085335
B=9.898171057

Ec. De la recta para [S] sin Inhibidor

1/Vo= a + B (1/ [S]) Tabla 8. Valores de km para cada
reacción ( Sin y con inhibidor)
A=-.4459029595
Valor de km
B=12.384841

Sin Inhibidor 2.24264

Km para [S] con Inhibidor

Con Inhibidor 5.05795
Km=-1/A
Km=-1/A = 5.057950622
Km para [S] sin Inhibidor
Km= -1/A =2.24264

Discusión
En la grafica 5 se representa el efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de una reacción enzimática.
Este comportamiento, conocido como curva de saturación hiperbólica por el sustrato, consistuye la norma seguida por la
mayoría de las enzimas michealianos.
En este comportamiento podemos observar que la velocidad de reacción se ve afectada proporcionalmente por la
concentración del sustrato pues a mayor concentración mayor velocidad pero llega un punto en donde no es posible seguir
aumentando la velocidad pues se va consumiendo todo el sustrato por lo tanto la velocidad se mantiene casi constante.
En cambio en presencia de inhibidores podemos notar que igual es proporcional a la concentración de sustrato pero no le es
posible alcanzar la misma velocidad que la reacción sin presencia de inhibidor, se observa en la gráfica 5 que la velocidad
con la presencia de un inhibidor NUNCA es la misma que sin su presencia.
Conclusión
La gráfica 5 demuestra que la velocidad de reacción enzimática es proporcional a la concentración de sustrato.
Los valores de km para la reacción sin inhibidor fueron de 2 .24 aproximadamente y con inhibidor de 5.05, explicando que
se necesita mayor concentración de sustrato para alcanzar la velocidad máxima media en presencia de inhibidor que sin él.
Debido a que la velocidad máxima de reacción en presencia del inhibidor no es igual a la de la reacción sin el mismo,
podemos concluir que se trata de un inhibidor no competitivo.