Capítulo 19 - Análise da Genética Molecular e Biotecnologia

Terapia gênia é foi capaz de melhorar a visão de pessoas consideradas cegas. Vírus modificados e
com genes funcionais relacioandos à enzimas no olho foram injetadas em cães que tiveram
melhoras na visão. Posteriormente o mesmo procedimento foi realizado em humanos com
resultados positivos em todos os casos.

As técnicas de genética molecular revolucionaram a biologia

Em 1973, Stanley Cohen e Herbert Boyer introduziram um pedaço de DNA de plasmídio em outro
plasmídio, criando uma nova molécula de DNA, recombinante (= combinação de duas fontes
distintas).

Tecnologia do DNA recombinante = conjunto de técnicas moleculares para localizar, isolar, alterar
e estudar segmetos de DNA.

Revolução da genética molecular

As técnicas do DNA recombinante permitiram desvendar processos moleculares, criar produtos,

medicamentos e tratar doenças. Com as técnicas moleculares já é possível ler as sequências de
nucleotidios, não dependendo mais do fenótipo para conhecer o genótipo.

Como trabalhar no nível molecular

Para trabalhar com essas técnicas é necessário localizar o gene no genoma, seprar esse trecho,
colocá-lo de forma estável numa bactéria. Porém localizar o gene e células bacterianas que sejam
eficazes é muito dificil. Mas existem técnicas moleculares para superar essas díficeis etapas do
processo.

Técnicas moleculares são usadas para isolar, recombinar e ampliar os genes

Corte e união dos fragmentos de DNA

No final dos anos 60, descobriu-se em bactérias enzimas capazes de cortar o DNA de fita dupla,
as chamadas enzimas de restrição. As discutidas aqui são do tipo II, existem diversas enzimas
diferentes em diferentes bactérias. Elas reconhecem trechos de 4 a 8 pares-de-base, geralmente
palindrômica, e realizam cortes. Algumas dessas enzimas fazem cortes desencontrados, deixando
uma das fitas mais longa do que a outra (= extremidade coesiva), as duas extremidades cortadas
são complementares e podem ser ligadas pela ligase.

Algumas enzimas produzem cortes cegos, ou seja, as extremidades de ambas as fitas da mesma
molécula têm o mesmo comprimento e podem ser ligadas de varias formas.
As sequências as quais as enzimas de restrição se ligam são mais abundantes quanto menor seu
tamanho (pb), assim enzimas que se ligam a trechos prequenos realizaram mais cortes de menor
tamanho no DNA do que enzimas que se ligam a seqências maiores, produzindo menos cortes,
porém mais longos. Nos últimos anos foram desenvolvidas enzimas modificadas capazes de
reconhecer e cortar qualquer sequência no genoma. É realizada alterando a sequência de
aminoácidos numa enzima ligadora.

Visualização dos fragmentos de DNA

Após o corte do DNA não é possível saber se os cortes foram realizados nem quantos cortes
existem. Para solucionar isso existe a eletroforese em gel. Uma placa de agarose (gel) é feita e o
DNA é colocado em espaços na extremidade do gel, é colocada uma corrente elétrica que faz os
fragmentos menores de DNA correrem mais rápido pelo gel, assim como também os fragmentos
menores percorrem maiores espaços. Ao lado do DNA em estudo são colocados tamanhos
conhecidos, o que permite determinar o tamanho aproximado dos trechos de DNA. Ainda não é
possível visualizar o material. Então é colocado algum corante, antes ou depois da colocação do
DNA no gel, e aí se torna possível visualizar.

Localização dos fragmentos de DNA com Southern blotting e sondas

Como localizar genes? Uma enzima de restrição que reconhece uma sequência de 4 bases
cortaria o DNA a cada 256 p-b, gerando milhares de fragmentos (células humanas), isso resultaria
num borrão no gel de eletroforese.

Resposta: Utilizando uma sonda: primeiro o DNA é separado pela eletroforese, em seguida é
desnaturado em uma solução alcalina que contém o gel e uma membrana para onde o DNA será
transferido. Em seguida a membrana é retirada e colocada em um tubo. Uma sequência de DNA
complementr conhecido é adicionado a solução e se liga somente as porções complementares,
identificando onde o gene de interesse está. Esse processo também pode ser utilizado para
mRNA e proteínas.

Clonagem de genes
Para clonar genes podem ser utilizadas bactérias. Introduz-se um DNA em uma bactéria para que
ela o multiplique. Um vetor de clonagem é uma molécula de DNA com um trecho de DNA
exógeno. O vetor deve conter 1) uma origem de replicação para garantir que o trecho será
replicado. 2) Marcadores selecionáveis para posterior identificação do trecho de interesse. 3)
Sítios de restrição onde o DNA exógeno possa ser inserido pra depois ser fragmentado pelas
enzimas de restrição.

O DNA vetor utilizado é o o plasmídio das bactérias. Ele possui todas as características
necessárias. Para que o DNA exógeno seja inserido no plasmídio é utilizada a mesma enzima de
restrição para cortar o plasmídio e o DNA de interesse, assim as extremidades cortadas de ambos
serão complementares. Quando não há sítios de restrição na região onde o DNA precisa ser
inserido são criados sítios de restrição utilizando pequenos fragmentos sintéticos de DNA com
um ou mais sítios de restrição (ligadores).

Transformação: Bactérias podem capturar DNA do ambiente, e isso é utilizado para inserior o
plasmídio modificado dentro da bactéria para que esta comece a clonagem.
Seleção de células para plasmídios recombinantes: Uma técnica para identificar as bactérias que
contém o DNA recombinante após os procedimentos anteriores é utilizar plasmídios com um
fragmento do gene lacZ, pois o DNA exógeno é inserido nos sítios de restrição desse gene. As
bactérias transformadas são lacZ- e não possuem a porção incial desse gene como o lacZ original.
Bactérias lacZ possuem a primeira parte do gene e o restante está no plasmídio. Quando o DNA
exógeno é inserido, as bactérias lacZ não podem produzir o produto do gene. Então, bactérias
com o DNA exógeno não produzem o produto. Esse produto é capaz de transformar uma
substância que deixa a colônia azul, identificando visualmente quais colônias possuem (azuis) e
quais não possuem (brancas) o DNA exógeno.
Outros vetores de genes: Cosmídios: DNA exógeno empacotado com proteínas e transferido para
bacterias por um vírus bacteriofago.

Cromossomos bacterianos artificiais: plasmídio F modificado que pode carregar grandes trechos
de DNA exógeno.

Vetor de expressão: Vetor que além de ampliar o gene também produz a proteína dele.

Cromossomo artificial de levedura: Levedura é eucarioto. O YAC é uma molécula de DNA estável
com teleomeros e centromero. Assim podem ser utilizados em outros organismos eucariotos que
modificam a proteína após a tradução. Eucarioto -> eucarioto

Plasmidio Ti: é um plasmidio de bactérias do solo que geram tumores em plantas e inserem
genes no genoma da planta para ajudar a bacteria se manter viva. Modificando esse plasmidio é
possível transferir gene da bactéria para plantas. Bacteria -> eucarioto

Aplicação | Engenharia genética das plantas com pesticidas

Exemplo complexo. Tenha calma. Um gene de uma bactéria que produz uma toxina para insetos
foi colocado em uma planta. Como? O gene foi retirado da bactéria e clonado em outra (E. Coli).
Depois esse gene foi unido a outro gene (neo) em fragmentos e inteiro (gene inteiro da
toxina+gene neo e trecho da toxina+gene neo). Então esse construto gênico foi inserido em um
plasmídio com outro gene que dá resistência a um antibiotico (vetor de expressão). Então a
bactéria que “contamina” a planta foi transformada com esse plasmídio modificado. As plantas
que acoplaram o novo gene em seu genoma teriam resistência ao antibiotico (para saber quais
plantas incorporaram o gene) e resistência aos insetos. Foi verificado que as plantas assimilaram
melhor os contrutos com fragmentos do que os com o gene inteiro.
Ampliação dos fragmentos de DNA com reação em cadeia da polimerase

Reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica desenvolvida por Kary Mullis que utiliza
polimerase para apliar as cópias de trechos de DNA. No PCR podem ser ampliados fragmentos
muito pequenos de DNA, como uma única molécula. A técnica exige um fragmento de DNA e um
primer (para fornecer a porção 3’OH livre). A quantidade de DNA é dobrada a cada ciclo da PCR.

Etapas para PCR: É preciso uma solução com primers, polimerase, trifosfato de
desoxiribonucleosidio (dNTPs), DNA a ser clonado, íons magnésio e outros sais. Primeiramente a
solução é aquecida entre 90° e 100°C que rompe as pontes de hidrogênio, separando as fitas de
DNA. Em seguida resfria-se a solução entre 60 e 65°C por 1 minuto ou menos, esse resfriamento
permite que os primers se liguem ao DNA. Depois a solução é aquecida a 72°C, fazendo que a
polimerase sintetiza a nova fita de DNA. No fim cada molécula de DNA é duplicada no primeiro
ciclo. É possivel conseguir bilhões de novas cópias em pouco tempo. Anteriormente era utilizada
polimerase de E. Coli que desnatura a altas temperaturas mas descobriu-se a Taq polimerase que
é de uma bactéria termofilica e não se desnatura em altas temperaturas. Outra novidade são
termocicladores, ajustam a temperatura automaticamente, sem precisar trocar os tubos entre
banho-maria.

Limitações da PCR: 1) É preciso conhecer um pequeno trecho do DNA antes de utilizar o PCR pois
é preciso desenvolver os primers. 2) Outra limitação é a contaminação pois particulas de DNA de
fonte externa podem ser replicados no tubo gerando ruído. 3) A polimerase Taq não realiza
revisão e por isso pode incorporar bases incorretas. 4) Limitação no tamanho de sequências, não
é possível replicar uma sequência maior do que 50.000 pb.

Aplicações da PCR: Detecção de sequências específicas devido aos primers. 2) Identificar variação
genética em populações naturais. 3) Isolamento de DNA ancestral; identificação de fonte da
amostra de DNA. 4) Introduzir novas sequências em um frag. de DNA. 5) Determinar a
quantidade de ácido nucleico inicial (PCR em tempo real). 6) Determinar a quantidade de mRNA
(PCR em conjunto com transcriptase reversa).

19.3 As técnicas moleculares podems er usadas para encontrar genes de interesse

Como encontrar o gene? Método shotgun. O DNA é fragmentado em vários pedaços e depois é
clonado, sabe-se que o gene de interesse está no meio desses. Aí se procura o gene de interesse.

Bibliotecas gênicas: Coleção com todos os fragmentos de DNA de um fonte. Quando se realiza
cortes no DNA são necessárias várias cópias do DNA pois existem muitos sítios de restrição e os
cortes irão gerar regiões sobrepostas que podem depois ser analisadas para identificar o gene de
interesse.

Bibliotecas de cDNA contém apenas os fragmentos de DNA que são transcritos em mRNA. Para
isso o mRNA é separado dos outros RNAs através de sua cauda poliA, passa o RNA em solução
por uma coluna com celulose com nucleotidios Timina, aí as caudas poliA se ligam aos oligo(T) e
ficam na coluna enquantos os outros RNAs são deslocados. É utilizada em diferentes tecidos,
estágios, tratamentos etc.
Sequenciamento de DNA

Método Sanger: Esse método utiliza um didesoxirribonucleosídio, que é uma nucleotídio que não
possui um grupo 3’-OH livre e por isso a transcrição é interrompida quando ele é incorporado. No
método de sanger são misturados em um tubo uma sequência de DNA, primers, ddNTP (um
diferente em tubos diferentes) e DNA polimerase além dos primers para a fita de DNA. Assim a
DNA polimerase inicia a transcrição e continua até que um ddNTP seja incorporado e cesse o
processo. Isso gera fragmentos de tamanhos diferentes que terminam com a mesma base em
cada tubo diferente. Posteriormente os fragmentos são colocados em gel e separados por
eletroforese. O sequênciamento é feito pela leitura de baixo para cima do gel, a sequência
representa a fita complementar no sentido 5’-3’.
Atualmente o sequenciamento é feito por computadores e os ddNTPs são marcados, o que
permite a identificação por laser que gera sequências com cores diferentes para cada base.