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OBJETIVOS DE BIOSEGURIDAD
Proteger al personal de laboratorio (Alumnos, docentes y técnicos) contra la exposición
innecesaria e injustificada a agentes infecciosos
Salvaguardar la integridad de la muestra clínica, contra la degradación o contaminación
cruzada que pueda poner en peligro la validez de los hallazgos de Laboratorio.
Mantener los agentes infecciosos dentro de los límites del laboratorio con la finalidad de
proteger a la comunidad.
PRINCIPIOS BASICOS
Universalidad: Asume que toda persona esta infectada y que sus fluidos y todos los objetivos que se
ha usado en su atención son potencialmente infectantes, ya que es imposible saber a simple vista, si
alguien tiene o no una enfermedad.
Colocación de barreras protectoras: Un medio eficaz para evitar o disminuir el riesgo de contacto
con fluidos o materiales potencialmente infectado, es colocar una “barrera” física, mecánica o
químico entre persona y objeto.
1. Lavado de manos
El lavado de manos es una de las medidas preventivas más eficaces y debe realizarse:
Antes de : Iniciar un procedimiento
Después de : Manipular objetos o instrumentos contaminantes, tocar fluidos
corporales, piel, mucosas, sangre, etc.
El lavado de manos debe ser riguroso, con jabón o soluciones que contengan yodoforos (Isodine,
yovisol, etc.) por un tiempo de 3 – 5 minutos.
Para el secado se debe utilizar toallas en forma individual y en lo posible papel toalla
descartables.
2. Uso de barreras
Contención primaria.- Es la protección del personal y del medio ambiente inmediato contra la
exposición a agentes infecciosos y/o productos de riesgo químico. Se usan guantes, mandil,
mascarillas, etc.
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Contención secundaria.- Es la protección del medio ambiente externo contra la exposición de
material infeccioso. Se logra por una combinación de las características de la edificación y
practicas operacionales.
3. Uso de antisépticos
Los antisépticos se usan en la preparación de la piel y mucosas antes de cualquier intervención o
para reducir el riesgo de infectarse después de cualquier contaminación superficial, y estos
pueden ser :
Alcoholes (60 – 90°), etílico, isopropitico, alcohol metilado
Gluconato de Clorohexidina (4%), Hibiscrub
Hexaclorofeno (3%), phisohex
Yodos (1-3%), acuoso y tintura, alcohol yodado
Yodóforos, yodopovidona en diferentes concentraciones, Isodine, Betadine, Yovisol, etc.
DAN: Permite la erradicación del 94% de microorganismos, excepto esporas, se usan los
siguientes agentes químicos:
Solución de cloro al 0.5% por 5 – 10 minutos
Formaldehído al 8% por 24 horas
Glutaraldehido al 2%, alcalina, neutra o ácido a 25° C (77 °F) por 20 minutos.
6. Esterilización
La esterilización erradica el 100% de microorganismos y es necesario realizar cuando se cuenta
con materiales como muestras biológicas, materiales con cultivos y otros antes de eliminarlos o
reutilizarlos.
La esterilización puede ser Físico o Químico:
Físico:
Calor Húmedo : Autoclave a 121° C, 15 libras de presión por 20 – 30 minutos
Calor seco : Horno a 180° C por 60 minutos o 160° C por 120 minutos
aproximadamente.
Radiación UV.
Químico:
Liquido : Inmersión en glutaraldehido al 2% por 8 horas.
Inmersión en ácido paraetico.
Gas : Gas de oxido de etileno.
Gas de formaldehído.
Vapor de peroxido de hidrógeno.
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7. Eliminación apropiada de los desechos y flujo de trafico
Una vez concluido cualquier procedimiento, debe eliminarse en forma apropiada todo material u
objeto contaminado. Los recipientes usados deben ser los adecuadas como:
Balde de plástico con tapa a prueba de fuga, que contengan soluciones cloradas al 0.5% o
cualquier otro desinfectante
Recipiente resistente a los pinchazos, de boca lo suficientemente apropiada para que
ingresen solo agujas y otros artículos punzo cortantes ya usados.
Recipientes con tapa a prueba de fuga para materiales contaminados (gasas, algodón)
Los procedimiento correspondientes al Nivel III de Bioseguridad han sido recomendables para el
manejo de material que presuntamente contiene ciertos virus como el de la estomatitis vesicular,
algunas arbovirus y arenavirus.
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PRACTICA N° 02
El laboratorio de microbiología clínica presenta muchos peligros para las personas desprevenidas y
no entrenadas por lo que mediante este texto damos a conocer a los alumnos, docentes y otros, las
normas generales de trabajo que se deben de cumplir con la finalidad de evitar accidentes.
NORMAS GENERALES:
Estar presente en el laboratorio a la hora señalada para sus prácticas.
Ingrese al laboratorio con su mandil puesto para evitar contaminar su ropa de uso diario
durante las prácticas, quitársela antes de abandonar el mismo.
No coma, no beba ni fume dentro del laboratorio y evite llevarse cualquier objeto a la boca.
Coloque sus enseres personales como libros, maletines u otros, en lugares apropiados,
donde no puedan estar sujetos a contaminación por las muestras, cultivos, etc.
Evite salir con el mandil fuera del laboratorio, mientras se desarrolle la práctica.
Evitar el contacto directo de las mesas de trabajo, papel u otro material de uso frecuente en el
laboratorio con las muestras biológicas potencialmente contaminadas.
Mantenga el orden y la disciplina durante el desarrollo de la practica. No propicie ni fomente
los malos hábitos.
Mantener las mesas de trabajos limpios y despejados de materiales innecesarios.
Cumplir con el trabajo señalado por el profesor durante el desarrollo de las prácticas.
a) Todos los cultivos que se incuben, deben tener las siguientes anotaciones:
Grupo y mesa de trabajo
Nombre del germen o muestra cultivada
Fecha de Siembra.
d) Concluida la practica:
Limpiar y desinfectar la mesa de trabajo.
Dejar ordenado los materiales y/o reactivos para la siguiente practica
Lavarse cuidadosamente las manos
Anotar los requisitos o muestras necesarias para la siguiente práctica.
Los materiales de uso en el laboratorio de microbiología clínica, especialmente los de vidrio, como
tubos, pipeta y otro deben ser de vidrio neutro, encontrarse en buenas condiciones sin rotura ni
rajaduras, limpios y estériles. Entre los materiales más usados tenemos:
Materiales de Vidrio
Placas de petri
Tubos de ensayo de diferentes medidas
Láminas portaobjetos
Varilla portaláminas
Matraces
Vaso de precipitación
Pipetas
Frasco gotero
Probeta
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Agitadores o Baguetas
Mecheros de ron o de alcohol.
Equipos
Microscopio
Autoclave
Horno para esterilización
Estufa de incubación a 37 °C
Baño María
Centrífuga
Refrigerador
Balanza
Otros
Mechero de Bunsen
Asa bacteriológica o de henle
Pipetas automáticas
Bombilla de seguridad
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PRÁCTICA N° 3
Selección de la Muestra
Las consideraciones más importantes que deben tenerse en cuenta son que la muestra debe ser
representativa del proceso patológico y que la cantidad recogida sea suficiente para asegurar un
examen completo y adecuado. Por ejemplo, una pequeña cantidad de suero drenado de la úlcera del
pie de un diabético con una osteomielitis adyacente no es probable que permita encontrar
microorganismos. En el ejemplo citado, la muestra ideal sería una biopsia de hueso (para ser
estudiada histológica y bacteriológicamente). Aunque con frecuencia no es posible obtener tejido
infectado, éste es sin duda la muestra ideal. En orden de conveniencia el siguiente es un exudado
francamente purulento. En caso de una lesión progresiva de piel y tejido subcutáneo, el material del
margen activo de la lesión es la elegida. El material obtenido de localizaciones normalmente estériles
del organismo proporcionan un espécimen excelente. Si se sospecha de un anaerobio se debe tener
todo el cuidado necesario para no ponerla en contacto con el medio ambiente.
Siempre que sea posible las muestras deben ser obtenidas antes de iniciar la administración
de agentes antimicrobianos.
Las muestras deben ser tomadas de los lugares donde sea más probable encontrar al
microorganismos y evitando la contaminación externa en los posible.
Se debe recolectar la muestra en el estadio de la enfermedad en el cual es más probable
encontrarlo.
La cantidad de muestra colectada debe ser suficiente.
Se deben colectar en recipientes estériles y evitar la contaminación externa del recipientes
con la muestra.
Las muestras una vez obtenidas, deben ser remitidas rápidamente al laboratorio o ser
transportadas en un medio ideal.
El laboratorio debe recibir la suficiente información clínica para guiar en la selección de los
medios y técnicas adecuadas.
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Existe una serie de medios de transportes, cuya finalidad es prolongar la viabilidad del
microorganismo:
Hisopo de poliéster mas ampolla de vidrio con medio stuart.
Medio de transporte Stuart
Medio de transporte Cary-blair
Los medios de transporte consisten en un agar semisólido con pH regulado que carece de nutrientes,
pero que contiene tioglicolato de sodio como agente reductor. Previenen la deshidratación de las
secreciones durante el transporte y la oxidación y autodestrucción enzimática de los patógenos
presentes, asi como la inhibición de la multiplicación de la flora total presente. A continuación se
presentan las especificaciones para la recolección de las diferentes muestras:
SECRECIÓN FARINGEA
Debe tomarse muestras con hisopo estéril de cada área amigdaliana antes de obtener otras de la
pared posterior de la faringe.
Recolección de la Muestra:
Con ayuda de una espátula de madera, se deprime la lengua y se solicita al paciente que pronuncie la
letra “a”, al mismo tiempo con un hisopo estéril humedecido en suero fisiológico se frota cada área de
las amígdalas y sobre la faringe posterior a fin de obtener una adecuada muestra. No debe transcurrir
más de 1 hora desde el momento de la toma de la muestra hasta realizar el frotis o su inoculación al
medio de cultivo, a no ser que se utilice un medio de transporte.
Recolección de la Muestra
La recolección y transporte del esputo, constituye un riego para la salud pública, para el laboratorista.
Debe adoptarse toda clase de precauciones para evitar la contaminación externa del envase y
salvaguardar al personal que manipule el material.
Al recoger la muestra se debe instruir al paciente que previamente se enjuague la boca con agua, y
en un frasco de boca ancha, con tapa rosca y cierre hermético, deposite sólo el material expulsado
por la tos. Es recomendable escoger el esputo por la mañana, de no haber suficiente muestra, se
tomará la cantidad total recolectada durante un periodo de 24 horas.
La secreción del tracto respiratorio también puede obtenerse por aspiración bronquial.
MUESTRAS DE ORINA
La formación de la orina se inicia en los glomérulos. La orina es un líquido de composición similar al
plasma, que contiene agua, cristaloides y una pequeña fracción de proteínas de bajo peso molecular.
En ella, existen sustancias de bajo umbral renal como los fosfatos, bicarbonatos, ácidos úrico, yodo y
potasio, y sustancias sin umbral renal, que aparecen constantemente en la orina, como la creatinina y
los productos finales del metabolismo.
La orina secretada en el riñón es estéril, los mismos que la acumulada en la vejiga. Sin embargo, en
la uretra se halla una flora normal, de modo que la orina expulsada en forma normal contiene una
pequeña cantidad de bacterias. Debido a que es necesario distinguir los microorganismos
contaminantes de los de importancia etiológica, sólo el examen cuantitativo de la orina puede producir
resultados significativos.
El examen bacteriológico de la orina se hace principalmente cuando los signos y síntomas son
sugestivos de una infección de las vías urinarias, insuficiencia renal o hipertensión.
Recolección de la Muestra
La condición más importante para un examen de orina es la recolección convenientemente controlada
de la muestra por examinar. Para la toma de la muestra se debe tomar en cuenta que el paciente no
haya recibido antimicrobianos por lo meno 5 días antes del examen. Dicha toma de preferencia debe
realizarse en el laboratorio.
En los varones, por lo general se obtienen muestras adecuadas aseando el meato con agua y jabón
y recolectando en un envase estéril la porción media de la orina expulsada. En las mujeres, pueden
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conseguirse muestras equivalentes después de haber separado los labios y aseado con agua y jabón.
En lactantes y niños menores se utiliza bolsitas plásticas estériles especialmente diseñadas, previo
aseo con agua y jabón.
Otras formas de recolectar orina, incluyen el uso de sondas y la punción suprapúbica, cuando es
inevitable hacerlo, pero que acarrea el riesgo de introducir microorganismos a la vejiga.
Recolección de Muestras
La muestra a ser recolectada es el exudado vaginal o secreción uretral. Es esencial transportar en
medios tamponados, debido al carácter delicado y a la multiplicidad de las especies que cusan
infecciones genitales. La toma de muestra se realiza empleando un hisopo estéril. Inicialmente se
debe realizar un frotis, así como un examen en fresco para buscar levaduras (hongos) y tricomonas.
Recolección de la Muestra
Tomar muestras de las lesiones cutáneas problemáticas con torundas recubiertas en suero y del
borde la lesión.
MUESTRAS DE HECES
La porción inferior del intestino tiene una flora bacteriana normal excesivamente amplia: los
microorganismos prevalentes son los anaerobios (bacteroides, bacilos grampositivos y
estreptococos), microorganismos entéricos gramnegativos. Cualquier intento por aislar bacterias
patógenas de las heces implica la separación de las especies patógenas, usualmente a través del uso
de Medios Selectivos Diferenciales y de enriquecer previamente la muestra.
Recolección de la Muestra
Las heces y los hisopados rectales son las muestras de que se dispone con mayor facilidad. El
análisis de la muestra debe realizarse tan pronto como éste llegue al laboratorio, y en todo caso antes
de las 2 horas.
MUESTRAS DE SANGRE
Dado que la bacteremia con frecuencia augura un padecimiento que pone en peligro la vida, su
detección oportuna es esencial.
Recolección de la Muestra
Las muestras se pueden tomar antes o durante el tratamiento antimicrobianos, durante los accesos
febriles u otros síntomas de infección activa.
CUESTIONARIO
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PRACTICA N° 4
METODOS OPTICOS PARA EL DIAGNOSTICO DE LABORATORIO
DE LAS ENFERNEDADES INFECCIOSAS
Leeuwenhoek realizó sus investigaciones hacia fines del siglo XVII; hasta entonces solo se
podía especular acerca de la existencia de agentes infecciosos más pequeños que lo
que el ojo humano podía distinguir. Desde ese momento, el microscopio óptico se ha
transformado e uno de los medios mas importantes para el diagnostico de las
infecciones. Aun hoy, a pesar del énfasis en los métodos rápidos de diagnóstico,
muchos de los cuales requieren instrumentos complicados o reactivos inmunológicos,
la simple observación microscópica de la muestra clínica obtenida de un paciente es la
forma más rápida y específica de apoyar el diagnóstico clínico realizado por el médico.
De ahí que una observación microscópica o examen directo es el primer paso que nos
permite orientar el resto del examen, nos ayuda a determinar la morfología, movilidad,
características tintoriales, presencia de ciertos estructuras especificas, agrupación,
etc.; estos estudios se complementaran con el cultivo, de aislamiento en medios
adecuados, examen bioquímico, sensibilidad a los antimicrobianos.
En el estudio óptico o microscópico de los agentes infecciosos, se incluyen métodos muy
diferentes, cada uno de los cuales va proporcionar información sobre distintas
aspectos y propiedades de los microorganismos, que dependiendo del objeto que se
requiera alcanzar, se seleccionará uno u otro método. Sin embargo muchos de los
agentes infecciosos pueden ser observados en forma confiable con solo unas pocas
coloraciones y un microscopio básico. Los métodos que se presentan a continuación
incluyen muchas técnicas microscópicas comunes usadas durante décadas.
A. Examen en fresco.
Muchas muestras clínicas pueden ser examinados en el microscopio con campo
claro o contraste de fase en su estado original, preferentemente ni bien se las
recoge o de cultivo jóvenes (24 horas).
Las muestras se colocan directamente sobre la superficie de un portaobjeto y se
cubren con laminilla, estas muestras incluyen esputo, exudado de lesiones, liquido
de aspiraciones, heces liquidas, flujo vaginal y sedimento urinario, si el material es
viscoso se debe diluir con solución salina estéril.
La mayoría de las observaciones del material se realizan con microscopia de campo
claro, aunque la principal dificultad es la falta de contraste entre la célula bacteriana
y el medio en el cual se encuentran suspendidos.El microscopio con contraste de
fase resulta útil para la observación directa del material sin teñir. Las preparaciones
se observan al microscopio con objetivo de inmersión y con poca intensidad de luz,
para facilitar la observación. El aceite de inmersión es necesario para alcanzar la
resolución suficiente para la visualización de la mayoría de las bacterias;
usualmente se emplea el objetivo por 100 junto con oculares por 10 (aumento total
por 1000).
Se incluyen dentro del examen en fresco a:
Montaje o preparado húmedo (en fresco)
Montaje o examen de la gota pendiente
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Montaje en tinta china.
Material.
Cultivo bacteriano joven
Laminas cubreobjetos
Laminas porta objetos
Laminas porta objetos con excavación
Asa de Kolle
Solución salina estéril
Mechero
Tinta china negra
Varillas porta láminas
microscopio
Aceite de inmersión
Procedimiento.
Coloque una gota de la muestra sobre la lámina porta objeto. Si la muestra
es sólida, diluir con solución salina.
Cubra con la laminilla
Observe al microscopio con aumento final de 1000 x.
Resultado.
Observe la morfología y movilidad del microorganismo, también puede lograr
observar agrupación.
B. Coloraciones vitales.
Son poco utilizados en la actualidad.
CUESTIONARIO:
2. ¿En que tipos de muestra y por que se utiliza montaje con tinta china?
………………………………………………………………………………………………………………..
………………………………………………………………………………………………………………..
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II. EXAMEN DE MICROORGANISMOS POST – MORTEN –DEFINITIVOS O COLORADOS.
El examen del material teñido, ya sea directamente a partir de muestras clínicas o del
desarrollo en los cultivos es el método mas útil para la identificación presuntiva de las
bacterias y de ciertos virus.
Debido a la naturaleza química de la célula bacteriana, su afinidad por los colorantes
básicos se manifiesta si tomamos en cuenta su principal contenido en ácidos nucleicos.
Los colorantes básicos de mayor aplicación son los derivados del alquitrán de hulla
(anilina); estos colorantes llevan carga electropositiva en su parte cromófora, la que
tiene una fuerte afinidad por los grupos electronegativos, que normalmente presentan
las bacterias en su protoplasma, entre las cuales se encuentran los ácidos nucleicos y
sus derivados. Los colorantes más usados son el cristal violeta, fucsina básica,
safranina, azul de metileno y verde de malaquita.
1. Extensión o “frotis”.-
Sobre un portaobjeto de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota del material que se
va a teñir o se hace rodar el hisopo con que se tomó la muestra, si el materiales
viscoso es suspendido en una gota de agua o solución salina previamente colocada
sobre el portaobjeto, se homogeniza y finalmente se extiende .
2. secado.-
Una vez extendido, se deja secar al medio ambiente.
3. fijación.-
Someter el frotis o extendido a la llama del mechero hasta que el vidrio este tan
caliente que moleste al tacto, pero este procedimiento no es bactericida. Debe
dejarse enfriar el preparado antes de colorear. Se puede usar otro fijador como el
alcohol según la recomendación de la técnica.
4. coloración.-
Cubrir el extendido o frotis con el colorante, evitando la evaporación en el tiempo
que debe actuar. Según la técnica se puede usar uno o más colorantes y
mordientes.
5. lavado.-
Eliminar el exceso de colorantes con agua corriente o destilada a chorro suave y
que no incida directamente sobre el frotis.
6. secado.-
Secar al medio ambiente, colocando el preparado inclinado para el escurrimiento.
Se puede acelerar el secado agitando la lamina o con la llama del mechero,
evitando sobrecalentamiento.
7. observación.-
Observar al microscopio con objeto de inmersión y aceite.
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Clases de Coloraciones:
A. Coloración simple.
Consiste en el agregado de un solo colorante y tiene como objetivo la observación de la
morfología bacteriana. Se puede utilizar cualquier colorante básico como azul de
metileno, safranina, verde malaquita, etc.
Material.
Cultivo bacteriano joven
Laminas cubreobjeto y porta objetos
Asa bacteriológica
Solución salina estéril
Mechero
Colorante: Azul de metileno, safranina y verde malaquita
Varillas pórtala minas
Microscopio
Aceite de inmersión.
Procedimiento.
1. Preparar el frotis o extendido
2. Secar al medio ambiente
3. Fijar con la llama del mechero y luego dejar enfriar
4. Colorear con azul de metileno o safranina o verde malaquita, cubrir completamente el
frotis y dejar actuar por 2 a 3 minutos.
5. Lavar para eliminar el exceso de colorante
6. Secar al medio ambiente
7. Observar al microscopio con objeto de inmersión
Resultado.
Observar la morfología bacteriana y agrupación.
Cuestionario:
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PRÁCTICA N° 5
B. Coloraciones diferenciales.
Utilizan más de un colorante en pasos sucesivos y las células bacterianas teñidas se
diferencian tanto por el color como por la forma. Las coloraciones diferenciales son
clásicas, los más empleados en microbiología clínica y son:
Coloración GRAM.
Coloración ideada por Hans Christian Gram. a fines del siglo XIX, permite dividir a las
especies bacterianas en dos grandes grupos : aquellos que por la coloración con
alcohol acetona requieren el colorante básico, cristal violeta, tiñendo finalmente de azul
violáceo (grampositivos) y aquellos que pierden el cristal violeta al ser decoloradas y se
recolorean con safranina que es colorante de contraste, tiñéndose de rojo
(gramnegativos).
Material.
Cultivo bacteriano jóvenes
Set de Gram. : Cristal violeta, lugol, alcohol acetona y safranina.
Laminas portaobjetos
Asa bacteriológica
Varillas portaláminas
Microscopio
aceite de inmersión
Procedimiento.
1. preparar el frotis o extendido
2. secar al medio ambiente
3. fijar con la flama del mechero y dejar enfriar
4. coloración:
cubrir con cristal violeta por 1 minuto
lavar a chorro lento con agua corriente
cubrir con lugol (mordiente) por 1 minuto
lavar a chorro lento con agua corriente
decolorar con alcohol acetona gota a gota hasta que no se desprenda mas
colorante de la lamina o cubrir con el decolorante por un minuto.
Lavar a chorro lento con agua corriente
Cubrir con safranina como colorante final de contraste por 1 minuto
5. Lavar con agua corriente
6. secar al medio ambiente
7. observar utilizando objetivos de inmersión.
Mecanismo de la tinción.
Para explicar el mecanismo de la tinción Gram. Se ha optado por la hipótesis fundada
en la naturaleza química de las paredes celulares de los microorganismos. El
mecanismo de la tinción Gram esta reseñada en el siguiente esquema.
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Productos que se utilizan Reacción y coloración de las bacterias
GRAM + GRAM -
Resultados.
Determinar la reacción (grampositivos o gramnegativos), morfología y agrupación de las
bacterias utilizadas en las prácticas.
Nota.- Las bacterias gramnegativas son constantes en su reacción, mientras que los
microorganismos grampositivos pueden presentar respuestas variables en
ciertas condiciones (son gramlabiles). Por ejemplo, los cultivos viejos de
algunas bacterias grampositivos pierden la propiedad de retener el complejo
cristal violeta – yodo, y en consecuencia se tiñen por la safranina apareciendo
como gramnegativas.
CUESTIONARIO
2. ¿Por qué no se utilizan cultivos de 48 horas a más o muestras añejas para realizar una
coloración Gram?
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…………………………………………………………………………………………………………………..
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3. ¿Explique que función cumple el lugol en la coloración Gram?
…………………………………………………………………………………………………………………..
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COLORACION ZIEHL NEELSEN.
La coloración Ziehl Neelsen se realiza para determinar la presencia de bacterias ácido –
alcohol resistente. Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácido
grasos (ácidos mícólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que le confieren la
propiedad de resistir la decoloración con alcohol ácido, después de la tinción con
colorantes básicos (fucsina). Por esto se denominan ácido – alcohol resistente. La
microbacterias como M. tuberculosis, M. Leprae y parásitos como Cryptosporidium se
caracterizan por sus propiedades de ácido alcohol resistencia. La coloración clásica de
Ziehl – Neelsen requiere calentamiento para que el colorante inicial básica atraviese la
pared bacteriana que contiene ceras, las micobacterias son bacilos aerobios con la
composición química de una pared celular grampositiva, pero no se tiñen con esta
coloración por los ácidos grasos que poseen.
Materiales.
Muestra de esputo de pacientes sospechosos de tuberculosis.
Set. De Ziehl – Neelsen: Fucsina fenicada básica, alcohol ácido, azul de metileno.
Laminas portaobjetos nuevos
Varillas portalaminas
Bajalenguas
Aceite de inmersión
Mechero
Microscopio.
Procedimiento.
1. Extendido del esputo con el bajalengua
2. Secado al medio ambiente. No utilice la llama del mechero para secar, para evitar la
formación de aerosoles.
3. Fijar a la llama del mechero
4. Coloración:
- Cubrir con fucsina fenicada básica, y con ayuda de un mechero calentar el
preparado, pasándolo lentamente por debajo de la lámina portaobjeto, hasta que
produzca la emisión de vapores, sin llegar a la ebullición. Repetir el procedimiento
hasta completar 3 emisiones sucesivas en 5 minutos. Dejar enfriar.
- Lavar con agua corriente.
- Decolorar con alcohol ácido. Cubrir la totalidad del extendido y dejar por un
minuto. Proceso diferenciador.
- Lavar con agua corriente. El preparado debe quedar de color rosa pálido, de lo
contrario volver a cubrir con alcohol ácido hasta conseguir dicho propósito.
- Coloreado de fondo con azul de metileno. Cubrir el preparado con azul de metileno
por 30 segundos.
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Mecanismo de la Coloración Ziehl Neelsen.
BAAR NO AAR
Se decoloran. No poseen
2. alcohol ácido. Resisten a la decoloración ácidos grasos.
debido a la presencia de
ácidos grasos. Continúan
teñidos de rojo.
Resultado:
Determinar la presencia de bacilos ácido alcohol resistente (BAAR) que se observan de
color rojo de forma abastonada aislados o agrupados sobre un fondo azul y realizar su
conteneo promedio. Leer 100 campos o 5 minutos tratando de recorrer la lámina, sin
duplicar el campo ya observado.
Informe:
Negativo (-) : No se encuentra bacilos ácidos alcohol resistente (BAAR) en 100 campos
microscópicos observados
Positivo (+) : Se observan menos de 1 BAAR promedio por campo por 100 campos
observados (10-99 bacilos en 100 campos).
Positivo (++) : Se observan de 1 a 10 BAAR promedio por campo en 50 campos
observados.
Positivo (+++): Se observan más de 10 BAAR promedio por campo en 20 campos
Observados.
CUESTIONARIO:
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C. Coloraciones especiales y estructurales.
Coloración Vago
Es propia de ciertas bacterias como las espiroquetas, que para poderlas observar se
tienen que adherir con el mercurio cromo en un fondo violeta.
Materiales.
Muestra : Sarro dentario
Mercurio cromo al 2%
Violeta de genciana
Palitos mondadientes
Laminas portaobjetos
Varillas porta laminas
Mechero
Asa de Kolle
Aceite de inmersión
Microscopio.
Procedimiento.
1. frotis del sarro dentario, utilizando un mondadientes
2. secar al medio ambiente
3. fijar leve y rápidamente
4. colorear:
cubrir el frotis con mercurio como por 3 minutos
lavar con agua corriente
cubrir con violeta genciana por 3 minutos
5. lavar con agua corriente
6. secar al medio ambiente
7. observar con objetivo de inmersión
Resultado.
Observar la presencia de bacterias fusoespirales (espiroquetas) teñidos de color
violeta.
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PRACTICA N° 6
Se considera flora microbiana normal aquellos organismos que pueden coexistir en forma
pacifica en una relación equilibrada con su hospedero. La FMN se adquiere con rapidez
durante y poco después del nacimiento, y cambia de forma continua a lo largo de la vida.
Los organismos presentes en un determinado momento reflejan la edad, nutrición y medio
ambiente del individuo.
Objetivos:
Determinar la FMN de piel, nariz, boca y otros.
Seleccionar y recolectar adecuadamente la muestra.
Realizar correctamente el método de coloración elegido.
Materiales:
Hisopos estériles
Baja lenguas estériles
Recipientes estériles
Láminas portaobjetos
Set. De colorantes de Gram., Ziehl Neelsen y Simple.
Varillas porta láminas
Mechero
Microscopio
Solución salina estéril
Aceite de inmersión.
Procedimiento:
1. Colectar adecuadamente la muestra
2. Realizar el procedimiento del método de coloración elegida.
Resultado:
Determinar el grupo de microorganismos presentes en determinadas regiones, indicando la
morfología, agrupación, reacción o afinidad por los colorantes.
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PRÁCTICA N° 7 Y 8
Medios de Cultivo
Son sustancia nutritivas líquidas o sólidas, que se utilizan en el laboratorio para el
crecimiento de los microorganismos, pudiendo ser similares a sustancias naturales, en los
cuales estos crecen normalmente. Sus componentes básicos deben satisfacer las mínimas
exigencias nutricionales para el desarrollo microbiano y varía según el tipo de bacteria. Es
más, para que un medio responda con éxito en el cultivo deben cumplirse las siguientes
condiciones:
a. Contener todas las sustancias nutritivas necesarias para su crecimiento, como:
Compuestos orgánicos nitrogenados, compuestos inorgánicos, carbohidratos, etc.
b. La humedad, la temperatura y el PH deben ser óptimo.
c. Evitar la contaminación para prevenir la competencia con otros microorganismos.
d. Estar previamente esterilizado.
Ciertas bacterias exigentes requieren factores de crecimiento tales como: factor V, factor X,
NAD, etc., etc.
Clasificación de los medios de cultivo
1. Según su estado físico.
a. Medios Sólidos.- Presentan en su composición un agente solidificante, el agar,
en una proporción de 12 a 15 gramos por litro. También puede contener gelatina
o albúmina.
b. Medios Semisólidos.- Presentan agar en su composición, en una proporción menor que
los sólidos, p.ej., Agar Cistina Tripticasa: 2.5 g/lt.
c. Medios Líquidos.- No contiene ningún agente solidificante.
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c. Medios Enriquecidos. Suelen ser medios con un nutriente simple que presentan
enriquecedores, tales como la sangre de carnero, la sangre del caballo, etc. Son
medios destinados a desarrollar microorganismos muy exigentes, ej. Agar
Sangre, Agar chocolate., etc.
d. Medios de Transporte y Mantenimiento. Se utilizan en la recogida, transporte y
conservación de muestras biológicas. Esencialmente, son medios no nutrientes,
semisólidos.
e. Medios de Enriquecimiento. Son medios que permiten estimular el desarrollo de
ciertos microorganismos particulares presentes en números escaso en un medio
que incluye gran cantidad de representantes de la FMN. Ejm: Caldo Selenito,
APA.
f. Medios Diferenciales. Contienen colorantes, azúcares e indicadores, concebidos
para provocar una respuesta bioquímica conocida, generalmente el color, p. ej.,
Agar Citrato, Agar Urea, TSI, etc.
Técnicas de siembra
A. Siembra por inoculación o agitación
Con un asa bacteriológica previamente esterilizada, se toma una cantidad suficiente de
inóculo o muestra y se introduce en el centro del medio líquido, agitándose para luego
retirar el asa.
Incubación
Después de la siembra se debe incubar en la estufa a una temperatura y tiempo óptimo,
generalmente a 37 °C, durante 18 a 24 horas, para favorecer el crecimiento de los
29
gérmenes. Los tubos se colocan en gradillas y las placas de Petri en forma invertida para
evitar que el agua de condensación bañe el medio de cultivo e impida una buena
separación de las colonias.
Material
Cultivos bacterianos
Tubos con caldo y agar nutritivo
Tubo con medio semisólido
Placas con agar nutritivo, sangre y Mac – Conkey
Asa bacteriológica
Láminas portaobjetos
Set de Gram.
Mechero
30
Microscopio
Aceite de inmersión
Varilla porta láminas
Procedimiento:
Sembrar usando la técnica adecuada en medio líquida, sólida inclinada en tubo, semisólido y en
medio sólida en placa.
Rotular, incubar y realizar la lectura o el estudio según lo indicado.
Resultados:
Anotar el desarrollo o crecimiento bacteriano en cada medio de cultivo según el protocolo.
CUESTIONARIO
5. ¿Las bacterias que se ha aislado son aerobias, anaerobias facultativas o anaerobias estrictas?
Explique
…………………………………………………………………………………………………………………..
…………………………………………………………………………………………………………………..
6. Defina:
Cultivo puro: …………………………..……………………………………………………………………….
…………………………………………………………………………………………………………………..
Cultivo mixto: ………………………………….………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………..
31
PRÁCTICAS N° 9 Y 10
Material:
Cultivo de staphylococcus y streptococcus
Peroxido de hidrógeno
Láminas portaobjetos
Asa bacteriológica
Procedimiento
Colocar una porción de la colonia en estudio en la lámina portaobjetos, y agregar una
gota del peroxido de hidrógeno. La reacción se observa de inmediato.
Resultado:
Catalasa + : Se observa el burbujeo
Catalasa - : No hay reacción.
32
microorganismos como S. aureus, esta enzima es capaz de aglutinar el plasma
tratado con oxalato, citrato o etilendiaminotetracético o heparina en presencia de un
factor contenido en el suero.
Material:
Cultivo de S. aureus
Plasma citratado o oxalatado
Tubo de ensayo
Asa bacteriológica
Procedimiento:
En un tubo ensayo colocar 0.5 ml de plasma, e inocular la cepa microbiana, incubar en
baño maría, y observar la reacción a las 4 horas a más.
Resultado:
Coagulasa + : si se observa que el plasma es coagulado
Coagulasa - : No se observa coagulación.
Materiales.
Cultivo de Pseudomonas
Tiras reactivas de oxidasas
Palitos mondadientes
Procedimiento.
Colocar una porción de la colonia en el extremo reactivo de la tira, esperar unos
segundos y observar la reacción
Resultados
Oxidasa + : la colonia se oscurece a violeta oscuro o negro
Oxidasa - : no se observa tal reacción
Información miscelánea
Así como la morfología de la colonia, también la producción de pigmento
(Pseudonomas), difusividad (proteus) , reacciones hemolíticas en Agar sangre y otras ,
son muy útiles para ir acotando las posibilidades de identificación
33
Una fraccion relativamente pequeña de la información genética de las bacterias esta
implicada en la producción de enzimas que metabolizan diversos sustratos. Estas
enzimas han sido usadas tradicionalmente como marcadores para diferenciar grupos de
especies. Si un microorganismo posee una enzima dada y es capaz de utilizar
unsustrato, podrá formar un producto final capaz de modificar el pH. Las pruebas
pueden ser de oxidación y fermentación, de hidrólisis, degradación de amonoacidos,
utilización de un único sustrato, reacciones para intratos.etc.
Material
Cultivos de E.coli, Salmonella, Proteus
Medio de cultivo TSI
Asa bacteorológica
Procedimiento
Inocular la cepa por puntura y estría TSI, incubar por 18-24 hrs. A 35-37°C
Resultado
Observar y anotar las diferentes reacciones. Presencia o ausencia de gas, hidrogeno
sulfurado y fermentación de azúcares.
Material
Cultivo de E.coli, Shigella, Citrobacter
Medio de cultivo LIA
Asa bacteriológica
Procedimiento
Inocular a cepa por pontura y estrías, incubar por 18-24 hrs a35-37°C.
Resultado
Observar si se ha presentado descarboxilación o no por la apreciación del color.
34
Material
Cultivo de E-coli y Klebsiella o Salmonella
Caldo peptonado
Reactivo de Kowac’s
Asa bacteriológica
Procedimiento
Sembrar la cepa por agitación en el caldo peptonado, incubar a 35-37°C por 18.24 hrs.
Resultado
Indol + : Formación del anillo rojo
Indol - : Formación de un anillo incoloro o amarillo
Material
Cultivo de E.coli, Proteus, Vulgaris o Klebsiella Preumoniae
Medio de cultivo Agar urea
Asa bacteriológica
Procedimiento
Sembrar la cepa por estrías, incubar a 35-37°C por 18-24 hrs.
Resultado
Urea + : Viraje a rojo púrpura o fucsia
Urea - : Amarillo
Material
Cultivo de E.coli y Klebsiella preunoniae
Medio citrato
Asa bacteriológica
Procedimiento
Se siembra por estría en el medio citrato, se incuba a 35-37°C por 18-24 hrs.
35
Resultado
Citrato (+) : vira al calor azul y se observa colonias
Citrato (-) : verde, sin desarrollo de colonias
CUESTIONARIO:
36
PRACTICA N° 11
Aglutinación bacteriana
Una de las aplicaciones de aglutinación bacteriana es la llamada prueba de “Reacciones
febriles” que esta basada en la investigación de la presencia de aglutininas (anticuerpos)
contra la fiebre tifoidea, La brucelosis y el tifo, que indican que el individuo padece
enfermedad o que ha estado en contacto con el germen (antígeno) sin llegar a contraerla.
Estas reacciones febriles comprenden la Reacción de Widal para la fiebre tifoidea y
paratifoidea, La Reacción de Huddlesson para la brucelosis y La Reacción de Weil- Félix
para el tifo.
Reacción de Widal
La reacción de Widal utiliza como antigeno una sepa de Salmonella Typhi en fase O (o sea
sin flagelos) y otra en fase H (flagelo). Además se tienen otros antigenos Salmonella
paratyphi A-B.
Reacción de Huddlesson
Se lleva a cavo con antigeno de Brucella abortus para detectar anticuerpos contra fiebre
de malta.
Reacción de WEIL-Félix
La reacción de Weil-Félix utiliza Proteus OX-19 como antígeno para detectar anticuerpos
contra Rickettsia prowaseki, debido a que posee los mismos antígenos y por la facilidad
de su manejo en el laboratorio.
Material.
Suero de paciente
Antigeno (tifico O y H, paratífico A y B, brucela, proteus OX-19.
Láminas de vidrio para aglutinaciones
Pipetas serológicas de 0,2 ml
Palitos mondadientes
Procedimiento.
37
Técnica cualitativa:
1. Colocar una gota de suero problema en cada uno de los espacios marcados en la
lámina
2. Agregar una gota de cada uno de los antígenos sobre la gota de suero problema
3. Mezclar uniformemente con un mondadientes cada gota, rotar la lámina por 3
minutos y observa los resultados.
Lectura.
Positivo: Aparición de grumos de tamaño variables que tienden a agruparse en la
superficie de la gota.
Negativo: La mezcla permanece homogénea.
Técnica cuantitativa.
1. Con una pipeta de 0,2 ml. Depositar 0,08, 0,04, 0,02, 0,01, 0,005 del suero problema
en la lámina.
2. Añadir una gota de antígeno que dio aglutinación en la prueba cualitativa a cada
cuota del suero.
3. Con el mondadientes mezclar y rotar la lámina durante 3 minutos.
Lectura:
Realizar la lectura teniendo en cuenta la presencia de grumos de acuerdo a la siguiente
equivalencia:
Suero problema: Título:
0.08 ml 1/20
0,04 ml 1/40
0,02 ml 1/80
0,01 ml 1/160
0,005 ml 1/320
Títulos mayores de 1/80 tienen significación diagnóstico.
Resultados:
Títulos de Suero
Antigeno
1 2 3
Tífico O
Tífico H
Paratífico A
Paratífico B
Brucella
Proteus OX-19
CUESTIONARIO:
38
2. ¿Qué es título en serología?
…………………………………………………………………………………………………………………..
…………………………………………………………………………………………………………………..
39
PRACTICA N° 12
Agentes físicos:
El control de microorganismos potencialmente patógenos en el ambiente, se lleva a cabo
por métodos físicos mediante la desinfección o la esterilización. Entre estos tenemos:
a. Calor.
El calor es el método de elección mas usada para la esterilización de todos los materiales,
excepto los que puedan ser alterados por el.
Llama directa.-Para estirilizacion del asa bacteriológica.
Esterilización con calor seco.-Se hace uso del horno, para esterilizar materiales
como placas Petri.
Esterilización con calor húmedo.-Se usa el autoclave, el papel del agua en la
desnaturalización de proteínas por el calor se evidencia en la utilización del vapor
de agua. Se utiliza para esterilizar muestras clínicas.
Pasteurización.-consiste en el calentamiento a 62°C durante 30 minutos tres
veces. Se utiliza en alimentos.
b. Congelación.
Los cristales de hielo pueden lesionar a las bacterias.
c. Radiación ultra violeta. Cuando se usan radiaciones de onda cada vez mas cortas a
partir de 330 nm se produce estirilizacion bacteriana, la luz UV lesiona el DNA
bacteriano que impide su replicación. Estas radiaciones tienen acción esterilizante
sobre la mayoría de los microorganismos y se les emplea en ambientes quirúrgicos,
cubilos bacteriológicos ya que su acción se limita a superficies o partículas suspendidas
en el aire.
d. Radiaciones ionizantes. Pueden utilizarse fuentes de radiactividades intensas para
esterilizar materiales hospitalarios, alimentos, etc. pero sobre todo en estos últimos,
donde deben utilizarse dosis elevadas (millones de Rad.) alteran notablemente el sabor
de los alimentos.
Agentes mecánicos:
a. Ondas sónicas y supersónicas.- Los ultrasonidos (con frecuencias que oscilan entre
15,000 y varios centenarios de miles de vibraciones por segundo) desnaturalizan
proteínas y destruyen bacterias.
b. Filtración.- Si se utilizan filtros con poros menores de 1nm, se pueden obtener filtrados
libres de bacterias. Esto se utiliza con soluciones que no se pueden esterilizar con
calor.
40
Agentes Químicos:
La acción de las sustancias químicas sobre los microorganismos varia dependiendo de la
composición fisicoquímica del medio ambiente, la concentración, la temperatura y el tiempo
que dura este contacto. En relación al efecto biológico se tiene una acción “bactericida”, es
decir, destrucción de la bacteria; y una acción “bacteriostática”, ósea que inhibe el
crecimiento bacteriano. Dentro de los agentes químicos tenemos a los desinfectantes,
aquellos que son utilizados en superficies inanimadas y antisépticos usados sobre piel.
Metales pesados
Halógenos
Agentes alquilantes
Agentes con propiedades tensioactivas o tensoactivas
Fenoles
Alcoholes
Material.
Cultivos bacterianos de Bacillus, E.coli, Salmonella, Pseudomonas.
Tubos con caldo BHI o nutritivo, pH7, pH9, pH3
Placas con agar BHI o nutritivo
Discos estériles de papel de filtro
Pinza estéril
Hisopos o torundas estériles
Frascos con alcohol, fenol, mertiolate, mercurio cromo, violeta de genciana.
Asa bacteriológica
Procedimiento.
1. Sembrar en tres tubos con caldo nutritivo pH7 por agitación, incubar por 18-24 hrs., uno
a 60°C, otro a 37°C, y finalmente otro a -8°C.
2. Sembrar en tres tubos con caldo nutritivo o BHI, uno a pH7, otro a pH9 y otro a pH3,
incubar todos a 35-37°C por 18-24 hrs.
Resultados.
1. En los tubos incubados a diferente temperatura observe si hubo crecimiento por la
presencia o ausencia de turbidez. Explique a que se debe ese resultado.
2. En los tubos sembrados a diferentes pH, también observe si hubo crecimiento por la
presencia y ausencia de turbidez, anote los resultados y explique el por que.
3. Observe alrededor de los discos impregnados con cada uno de los deferentes
antisépticos o desinfectantes, si hay o no un halo alrededor, que demuestra si el agente
químico es eficaz o ineficaz para actuar contra el microorganismo. Anote todos los
resultados y explique por que algunos químicos son eficaces y otros no.
41
CUESTIONARIO:
42
PRACTICA N° 13 Y 14.
Para realizar las pruebas de sensibilidad in vitro, es necesario emplear un inóculo estándar
que contenga 10 6 a 10 8 microorganismo por ml; un medio de cultivo que no interfiere con
la eficacia de los antibióticos ni con el crecimiento del microorganismo, en cantidad
conocida y un pH regulado como el Miuller Hinton en caldo o Agar medio suplementado con
los cationes magnesio y calcio.
Material.
Cultivo bacteriano que contenga 10 6 - 10 8 microorganismo por ml.
Solución de antibiótico que contenga 1000 unidades
Tubos 13x 100 ml. Estériles
Pipetas estériles
Caldo Miuller Hinton
Procedimiento.
Colocar 10 tubos 13x100 ml estériles enumerados del 1al 10.
Diluir el antibiótico que contenga 1000 U. en proporción 1:5 en caldo, obteniendo
una concentración 200 u. por ml.
Con una pipeta estéril colocar 0.5 ml del caldo en los tubos marcados del 2 al 10.
43
Agregar 0.5 ml del antibiótico a los tubos 1 y 2, mezcle el contenido del segundo
tubo y trasvase 0.5 ml al tubo 3, continuando de igual forma hasta el 9no tubo.
Retirar 0.5 ml del 9no tubo y descartar; el 10mo no recibe antibiótico y sirve como
control.
Agregue 0.5 ml de la cepa bacteriana a todos los tubos
Incubar a 35-37°C por 24 horas
Resultado.
Realice la lectura e interprete los resultados obtenidos.
Determine la CIM del fármaco estudiado.
Determine si el microorganismo probado es sensible o resistente al fármaco
probado haciendo uso de la tabla.
Interprete correctamente el resultado obtenido
Material.
Placas con agar Miuller Hinton
Disco de antibióticos
Torundas estériles
Pinzas estériles
Cepa bacteriana en caldo con una concentración de 10 6 – 10 8 microorganismo por
ml
Procedimiento.
Introduzca la torunda en la cepa bacteriana, escurrir oprimiendo contra las paredes
del tubo y extender uniformemente en la superficie de la placa de Agar Miuller
Hinton.
Dejar reposar 5 minutos y colocar con la ayuda de la pinza los discos de diferente
antibióticos en la superficie del Agar y presionarlos suavemente.
Los discos deben estar equidistantes unos de otros
Incube a 35°C 24 hrs.
Resultados
44
Para realizar la lectura, mida el halo de cada disco de antibiótico en mm, conocidos
los diámetros utilice la tabla para categorizar si el microorganismo es sensible,
moderadamente sensible o resistente a los diferentes antibióticos.
Explique cual es o son los mejores antibióticos según el antibiograma in vitro.
45
CUESTIONARIO:
46
PRACTICA N° 15
Material
Placas con Agar sangre
Placas con Agar Manitol hipertónico o baird Parker
Láminas portaobjeto
Set de colorantes Gram.
Tubos con caldo tioglicolato
Plasma citratado
Disco de novobiocina
Peróxido de hidrógeno
Asa de kolle
Muestra clínica: Absceso, S. nasal, ántrax.etc.
Procedimiento
Examen directo de la muestra clínica. Realizar una Tinción Gram de la muestra y
buscar cocos Gram +.
Cultivo.
a. Enriquecer en caldo tioglicolato, inoculando la muestra previamente incube a
35-37°C x 18-24 hrs.
b. Aislar en Agar sangre y/o Agar Manitol hipertónico u otro medio selectivo,
sembrado por estiras y agotamiento en 4 cuadrantes: Incube a 35-37°C x 18- 24
hrs.
c. Identificación:
1. Identificación preliminar de las colonias típicas de Staphylococcus.
2. Observación de la morfología bacteriana mediante una coloración Gram a
partir de la colonia seleccionada.
3. Pruebas bioquímicas o enzimáticos
47
Realizar las pruebas de:
Catalasa
Coagulasa
Hemolisina
Resistencia a la novobiocina
Resultado
Anotar lo obtenido en el examen directo
Anotar el crecimiento en caldo tioglicolato
Describir las colonias típicas de los diferentes Estafilococos según el medio en el
que se aislado, luego la morfología microscópica bacteriana y las reacciones en las
pruebas bioquímicas
Anotar el Staphylococcus aislado e identificado y si hay correlación con el ex.
Directo
CUESTIONARIO.
48
PRACTICA N° 16
Los miembros del genero Streptococcus son cocos Gram. Positivo, Catalasa negativos que
tienden a crecer desarrollando cadenas en los medios líquidos, son anaerobios facultativos,
son miembros de la FMN y además de agentes etiológicos, de varios enfermedades graves
como faringitis exudativa estreptocócica infecciones de herida, piel y abscesos. La fiebre
reumática aguda y la glomerulonefritis posestreptocócica son secuelas secundarias de una
infección por Streptococcus Pyogenes. En Agar sangre forman colonias betas
hemolíticas, pequeñas, circulares, transparentes a lechosas, aunque existen variantes.
Material
Placas con Agar sangre y otros con medio selectivo CNA
Tubos con caldo tioglicolato
Láminas portaobjetos
Set de Gram.
Discos de bacitracina
Muestra clínica: hisopado faríngeo
Procedimiento
Examen directo de la muestra clínica: Realizar un Gram. o determinación del
carbohidratos de la pared o antigeno de grupo, utilizando un suero que contiene los
anticuerpos contra estos antígenos
Cultivo:
a. Enriquecer la muestra en caldo tioglicolato, inoculando el espécimen clínico en el
medio de cultivo y dejar incubar a 35-37°C por 18-24 hrs.
b. Aislar en Agar sangre y CNA, sembrando por estría y agotamiento e incubando a
35-37°C por 18-24 hrs.
c. Identificación:
1. El paso inicial de la identificación es realizar un examen cuidadoso de la
morfología de la colonia.
2. Realice un Gram. de la colonia y observe la morfología bacteriana
microscópica.
3. Pruebas bioquímicas o enzimáticas.
Realizar las siguientes pruebas:
Catalasa
sensibilidad a la bacitracina
determinación los carbohidratos de la pared celular o antigeno de grupo.
Resultados:
Anotar los resultados obtenidos en el examen directo.
Anotar características del crecimiento en caldo tioglicolato.
Describir las colonias típicas del S. Pyogenes, morfología microscópica y reacciones
bioquímicas.
Anotar si el resultado definitivo se correlaciona con el examen
49
50
CUESTIONARIO:
1. ¿Qué hemolisina es responsable de la zona de hemólisis?
…………………………………………………………………………………………………………………..
…………………………………………………………………………………………………………………..
51
PRACTICA N° 17
Al igual que los S. Pyogenes, son cocos lanceolados Gram positivos, que se pueden
presentar en pareja o formando cadenas cortas, encapsulados, se encuentran en la flora
nasofaringea y oro faríngea normal de muchos niños y adultos, son alfa hemolíticos es
decir en Agar sangre desarrollan colonias pequeñas con un halo de color verde, por eso
también se denomina hemólisis parcial, estas colonias tienen aspecto mucoide y lustroso, y
con tendencia a hundirse en el centro al prolongarse el tiempo de incubación debido a la
acción de enzimas autolíticas.
Material
Placas de Agar sangre
Láminas portaobjetos
Set de Gram.
Peroxido de hidrogeno
Disco de etilhidrocupreina u optoquinona
Muestra clínica: Esputo
Procedimiento
Cultivo
a. Inocular la muestra en Agar sangre por estría y agotamiento, dejar incubar por 18-
24 hrs. a 35-37°C.
b. Identificación :
1. Pasado las 18-24 hrs., reconocer las colonias típicas.
2. Hacer una frotis de la colonia y teñir con Gram.
3. Realice las pruebas bioquímicas.
Catalasa
Sensibilidad a la optoquinona
Solubilidad en bilis
Resultado
Anotar lo obtenido en el examen directo.
Describir las colonias típicas, morfología microscópica y reacciones bioquímicas.
52
PRACTICA N° 18
Material
- Placas con agar chocolate y Thayer Martín modificado
- Láminas
- Set. De Gram.
- Reactivo para Oxidasa
- Muestra: Uretral, cervix y canal anal y de otros localizaciones LCR.
Procedimiento
Examen directo de la muestra clínica.- Hacer un frotis de la muestra y teñir con
Gram.
Cultivo
a. Sembrar la muestra en agar chocolate y/o Thayer Martín modificado por estría y
agotamiento para obtener colonias aisladas, incubar 24-48 hrs. a 37°C y con
CO2 2-10%.
b. Identificación:
1. Identificar las morfologías típicas de las colonias
2. Realizar un Gram. de estas colonias.
3. Realizar las siguientes pruebas bioquímicas o enzimáticas.
- Test de oxidasa
- Fermentación de glucosa, maltosa, fructuosa, Sacarosa, Lactosa.
Resultados
- Anotar los resultados obtenidos en el examen directo.
- Describir las colonias típicas aisladas, morfología microscópica y reacciones
bioquímicas.
53
CUESTIONARIO:
1. Las Neisserias patógenas desarrollas a 22°C.
…………………………………………………………………………………………………………………..
…………………………………………………………………………………………………………………..
54
PRACTICA N° 19
Las bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae son los que se aíslan con
mayor frecuencia de las muestras clínicas, son bacilos gramnegativos, desarrollan bien en
Agar sangre, chocolate y forman colonias distintas en los medios selectivos que permiten
su crecimiento dependiendo de sus propiedades y de los componentes, del medio. Algunas
especies son patógenas clásicas y su sola presencia en las muestras clínicas los señalan
como agentes etiológico de enfermedad, independientemente del numero de unidades
formadoras, otras especies pueden colonizar sin estimular ninguna patología, como las que
colonizan el tracto intestinal. Si estos microorganismos “comensales”son introducidos en
algún sitio susceptible (como cavidad peritonial, pulmones de un huésped
inmunosuprimidos, LCR, etc.). Son capaces de provocar enfermedad.
UROCULTIVO
Uno de los cultivos más comunes que se solicitan a un laboratorio son los cultivos de orina.
Se calcula que aproximadamente 20% de las mujeres tienen una ITU por lo menos una vez
en la vida, en los hombres es muy bajo, pero aumenta después de los 60 años donde la
hipertrofia prostática facilita el desarrollo de ITU. Ciertos microorganismos colonizan la
uretra anterior por lo tanto son considerados como FMN, así tenemos a los estafilococos
coagulasa negativos, estreptococos no hemolíticos y del grupo viridans, lactobacilos,
difteroides, Neisserias saprofitas micobacterias saprófitas y otros bacilos gramnegativos.
Puesto que con los métodos no invasores para recolectar la orina se obtienen una muestra
que a pasado por un medio contaminado, la interpretación de los resultados de los cultivos
de dichas muestras requiere la aplicación de algunos criterios discriminatorios.
La mayoría de infecciones que afectan las vías urinarias son adquiridas por vías
ascendentes y muy pocas por vías hematógena, linfática o vía descendente. Las bacterias
que se aíslan mas a menudo son E. coli, Klebsiella, Enterobacter y S. Saprophyticus.
Material.
- Láminas portaobjetos y cubre objetos
- Tubos de ensayos limpios
- Asa bacteriológica
- Placas con agar sangre, Mac Conkey, Manitol Hipertónico
- Set de Gram.
- Muestra : Orina patológica
Procedimiento.
I. Pruebas de selección rápida de las muestras para ITU.
Son pruebas de diagnostico presuntivo:
Gram de gota fresca (Washington)
Colocar una gota de orina total en una lamina portaobjetos, dejar secar y colorear con
Gram, observar al microscopio a 1000 x.
Prueba de Griess
Se introduce una cinta o tira reactiva en el espécimen.
Sedimento urinario
55
Colocar en un tubo de ensayo limpio 6 ml de orina, centrifugar por 3 minutos a 2500
RPM; decantar y colocar una gota del sedimento en una lamina portaobjeto, cubrir
con laminilla y observar a 400 x.
Resultados
- En la técnica de Washington se debe observar 01 microorganismo por 20 campos que
vendría a considerarse bacteriuria significativa por lo tanto orina presuntamente
patológica.
- En la prueba de sedimento urinario se debe observar de 5-10 leucocitos por campo,
bacterias, hematíes y otros de menor importancia.
- En el cultivo se debe realizar el recuento de colonias en unidades formadores de
colonias por mililitros de orina (UFC/ml de orina) en toda la placa, luego se multiplica
por el factor del calibre del asa de siembra y se debe interpretar dependiendo del tipo
de muestra.
CUESTIONARIO:
1. ¿Qué microorganismos están implicados en una ITU vía hematógena?
…………………………………………………………………………………………………………………..
…………………………………………………………………………………………………………………..
2. Indiqué aproximadamente con que frecuencia las enterobacterias son agentes casuales
de ITU.
…………………………………………………………………………………………………………………..
…………………………………………………………………………………………………………………..
56
4. ¿Por qué en una muestra de orina obtenida por punción suprapúbica, cual quier
número de bacterias aisladas se considera patológico?
…………………………………………………………………………………………………………………..
…………………………………………………………………………………………………………………..
57
PRACTICA N° 20
COPROCULTIVO
Viene a ser el cultivo de las heces con la finalidad de aislar a patógenos intestinales como
Salmonella, Shigella, Yersinia, Campylobacter, Vibrio cholerae, E. coli patógenos. Se utiliza
medios en algunas ocasiones para enriquecer las muestras y otros se aíslan directamente
en medio selectivos o altamente selectivos, estos medios tienen capacidad de inhibir el
desarrollo de la flora acompañante. Los patógenos intestinales son generalmente lactosa
negativos excepto las E.coli patógenos.
Material
- Muestras de heces diarreicas o hisopado rectal.
- Tubos con caldo selenito y agua peptonada alcalina.
- Placas con Agar Mac.Conkey.
- Placas con agar Eosina Azul de metilino.
- Placas con Agar Salmonella - Shigella
- Tubos con TSI, citrato, Urea, agua peptonada, SIM.
- Asa bacteriológica.
- Placas con agar TCBS.
- Reactivo de Oxidosa
Reactivo de Kowac’s.
- Desoxicolato de sodio al 0.5%
Procedimiento
a. Enriquecimiento de la muestra.
Inocular una asada de heces o introducir el hisopo en caldo Selenito si se deja
enriquecer la muestra para Salmonella, Shigella o APA si se desea enriquecer para
Vibrio cholerae.
Incubar 6-12 horas a 35-37°C.
b. Aislamiento
A partir de la muestra enriquecida (Selenito) sembrar por estría y agotamiento en placas de
MacConkey, EMB y SS si desea aislar Salmonella y en TCBS a partir del APA, si se
desea aislar Vidrio Cholerae. Incubar 18-24 horas a 35-37°C.
c. Identificación
- Si en los medios MacConkey, SS, y EMB se obtienen colonias lactosas negativas se
consideran sospechosas de ser algún patógeno intestinal. Y si en el TCBS se
observan colonias amarillas sacarosas positivas, se considera sospechoso de
Vibrio cholerae.
- Se realiza la identificación microscópica realizando un Gram de la colonia.
- Luego se realiza la identificación enzimático o bioquímica para Salmonella,
Shigella: Apartir de la colonia sospechosa se siembra en TSI, LIA, citrato, urea,
caldo peptonado, SIM.Incubar 18-24horas a 35-37°C.
Para tipificar se usa serologia.
Vibrio cholerae: A partir de la colonia sospechosa se realiza oxidasa y String Test. Si
resulta positivas las pruebas se procede a sembrar en TSI, LIA, citrato, urea, caldo
58
peptonado, SIM. Luego se incuba por 18-24 hrs a 35-37°C. Para tipificar se usa
serología.
Resultados
- Anotar las características de las colonias sospechosas de ser algún patógeno en
los diferentes medios de aislamiento indicando el posible patógeno.
- Anotar las características microscópicas de la colonia.
- Anotar el comportamiento bioquímico y concluir si se identifico o no el patógeno.
CUESTIONARIO.
1. ¿Si se desea mantener la muestra de heces por más de 2 horas, cual es procedimiento
ideal?
…………………………………………………………………………………………………………………..
…………………………………………………………………………………………………………………..
59
PRACTICA N° 21
Material
- Muestra de esputo de pacientes sospechosos de tuberculosis
- Tubos con medio de ogawa
- Láminas portaobjetos nuevos
- Set. De colorantes Ziehl Neelsen
Procedimiento.
Examen directo
Es una herramienta fundamental rutinaria para el diagnóstico de la tuberculosis y el
seguimiento del tratamiento de los pacientes con tuberculosis.
El examen directo de esputo se realiza mediante la coloración Ziehl Neelsen denominado
Baciloscopía, tiene una especificidad del 98% y sensibilidad del 60-80%.
Otros métodos directos son Kinyoun y Rodamina-auromina
Cultivo
a. El cultivo de Mycobacterium Tuberculosis permite diagnosticar los casos que
presentan baciloscopía negativa, y aporta hasta un 20% más de conformidad
bacteriológica (especificidad del 100% y sensibilidad del 80-90%).
b. Identificación
1. Calificar las colonias típicas que deben haber desarrollado transcurrido las 8
días a mas, con las siguientes características: Colonias secas, rugosas,
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polimorfas y con dimensiones muy variables de color crema y
excepcionalmente algo rosado “cabeza de coliflor”.
Resultados
- Cuantificar los BAAR en el Ziehl Neelsen del examen directo.
- Cuantificar las colonias:
(-) no se observan ninguna colonia
No de colonias totales cuando son menos de 20
(+) De 20 – 100 colonias
(++) Mayor de 100 colonias
(+++) Toda la superficie
CUESTIONARIO:
1. Mencione cuales son las muestran que en la actualidad se remiten para cultivo de M.
Tuberculosis.
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…………………………………………………………………………………………………………………..
2. ¿si tiene un SR, cuantas veces como mínimo debe remitir la muestra al laboratorio para
los análisis respectivos?
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3.¿en aquellos pacientes que por diversas causas no producen esputo, cual es la muestra
ideal, si se sospecha de tuberculosis pulmonar?
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…………………………………………………………………………………………………………………..
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PRACTICA N° 22
Pruebas Serológicas
I. Pruebas no treponémicas.
Son de gran sensibilidad y baja especificidad, de fácil ejecución, bastante usado en
Screning, pueden ser cualitativos y cuantitativos, pueden dar falsos positivos que
pueden ser atribuidas a una variedad de condiciones agudas o crónicas como
embarazo, lupus eritematoso etc.las pruebas no treponémicas son VDRL y RPR.
Material
Muestra: suero sospechoso
Reactivo de RPR, VDRL y controles
Micropipetas o pipetas automáticas
Láminas de vidrio con hoyos
Procedimiento Cualitativo
1. Colocar 50 ul (1 gota) de suero muestra en un círculo de la lámina
2. Añadir al lado de la anterior 20 ul de suspensión de reactivos RPR o UDRL.
3. Mezclar ambas gotas y rotar durante 4 minutos con VDRL y 8 minutos con RPR.
4. La técnica con VDRL se lleva al microscopio y se observa si hay floculación o
agrupación y la técnica RPR se observa a simple vista
Resultado
Reactivo: Presencia de floculación
No reactivo: ausencia de floculación
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Para determinar el título se debe de usar la técnica en forma cuantitativa, haciendo uso de
tubos.
CUESTIONARIO.
1. Mencione cinco casos que puedan dar pruebas falsas positivas en RPR.
…………………………………………………………………………………………………………………..
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PRÁCTICA N° 23
Materiales
Muestra clínica: Escamas de piel, pedazos de uñas y cabello, esputo, S. vaginal,
uretral y otros.
Láminas portaobjetos y laminillas
Tinta china
Set de Gram
KOH al 10%
Azul de lactofenol
Microscopio
Asa bacteriológica
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Procedimiento: Montaje con KOH al 10%
1. Colocar la muestra sobre el portaobjetos, agregar una gota de KOH al 10 %, dejar
actuar por 10 – 20 minutos, ayudar con el calentamiento suave con el mechero.
2. Trascurrido el tiempo, agregar una gota al azul de lactofenol.
3. Cubrir con laminilla
4. Obs. Al microscopio a 100x ó 400x de aumento.
Otras muestras pueden ser observadas utilizando la técnica de GRAM o tinta china.
Resultados
Anotar los elementos micóticos que se observan en el preparado con KOH, tinta china y
GRAM.
CUESTIONARIO
1. Indicar cuales son los medios ideales para el aislamiento de dermatofitos,
Parococcidiodes, Candida, Aspergillus.
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2. Si se desea aislar hongos a partir de una muestra de sangre, cual es el medio ideal
para el aislamiento.
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PRÁCTICA N° 24
Material
- Cultivos de los hongos oportunistas
- Láminas de los hongos oportunistas
- Otros
Procedimiento
- Estudiar a las colonias que se le presentan en las placas.
- Estudiar las características micromorfológicas.
- Estudiar el comportamiento bioquímico y otros
Resultado
Identificar a todos los hongos oportunistas tanto Mohos como levaduras por su morfología o
por su estudio macroscópico, microscópico y bioquímico.
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PRÁCTICA N° 25
Los dermatofitos causan micosis cutánea o dermatomicosis, estos hongos invaden las
áreas superficiales del cuerpo incluyendo piel pelos y uñas. Los géneros Trichophyton,
Microsporum y Epidermophyton son los únicos asociados con dermatomicosis.
Estos hongos se cultivan en sabouraud mas antibióticos como cicloheximida y cloramfenicol
o en medios selectivos como Mycosel o Micobiotic; son de crecimiento más lento que los
oportunistas y generalmente las colonias se observan blancas, amarillentas o anaranjadas,
rara vez forman pigmentación oscura o notoria, pero si producen pigmentos hidrosolubles
de color amarillo, anaranjado o rojo que difunde hacia el agar, con el cual el reverso de la
colonia presenta una coloración. Entre los hongos que causan micosis superficial tenemos
a Malassezia furfur, Exophiala werneckii, Piedraia hortae, Trichosporon beigelli .
Material
- Cultivos de hongos dermatofitos
- Láminas de hongos dermatofitos para la observación microscópica
Procedimiento
- Estudiar los cultivos
- Estudiar las láminas al microscopio
Resultado
Identificar por el aspecto macroscópico y microscópico de la colonia.
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PRÁCTICA N° 26
Los hongos que son capaces de afectar la piel y el tejido subcutánea son los conocidos
como causantes de micosis subcutánea, generalmente sin desiminación a otros órganos. El
mas común es el Sporothrix schenckii que es un hongo dimórfico de crecimiento de 4 – 45
días en promedio, en sabouraud desarrollando colonias al inicio blanquecina, luego
oscurece y toma el aspecto de “cuero”. La fase levadura se cultiva en Agar Sangre o BHI.
Otros hongos que ocasionalmente causan micosis subcutánea son Cladosporium,
Phialophora, y Fonsecae que causan cromoblastomicosis y el agente etiológico mas
comun de un Micetoma Eumicótico es Pseudallescheria boydii.
Material
- Cultivo de Sporothrix schenckii
- Láminas de S. shenckii y Cladosporium
- Otros
Procedimiento
- Estudiar los cultivos y las láminas
Resultados
Identificar los hongos productores de micosis subcutánea, por las características que se
presenten en el cultivo y la microscopia.
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PRÁCTICA N° 27
Los hongos patógenos son dimórficos, y causan micosis sistémica entre ellos se encuentran
a Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasilensis, Histoplasma capsulatum,
Coccidioides immitis y Penicillium marneffi, son hongo de crecimiento lento de 10 – 45
días y forman colonia blanquecinas a amarillas en medio sabouraud con antibióticos, la fase
levadura se cultiva en Agar sangre y BHI.
Materiales
- Cultivos de los hongos patógenos
- Láminas de los hongos patógenos para la observación microscópica
- Otros
Procedimiento
Estudiar las láminas y los cultivos.
Resultados
Identificar los hongos patógenos por su estudio macroscópico y microscópico y
demostración del dimorfismo térmico.
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PRACTICA N° 28
Detección de antigeno viral.- El examen directo de los tejidos o exudados infectados con el
virus puede realizarse mediante anticuerpos virales específicos conjugados con fluorescencia.
Métodos como inmunofluorescencia indirecta, radioinmunoensayo, ELISA, hibridación de acidos
nucleicos para la detección del material genético viral en muestras clínicas.
Microscopia Electrónica.- La ME es útil sobre todo para la detección de virus que desarrollan
mal o no desarrollan en cultivos celulares, hoy en día se emplea para detectar rotavirus y otros
virus probables agentes de gastroenteritis.
Serelogía Viral.- Ciertos virus, como los de hepatitis A y B, rubéola, sarampión y corona virus;
son difícil de aislar en cultivos celulares y las infecciones causadas por ellos son diagnosticadas
por técnicas serológicas. Se recomienda extraer una muestra de suero en el periodo agudo y otra
en el periodo de convalecencia. Los métodos usados son las pruebas de inhibición de la
hemaglutinación, neutralización, fijación de complemento, ELISA, etc.
Cultivo.- Diversos tipos de cultivos celulares se emplean habitualmente para el aislamiento de
virus. Los cultivos celulares pueden ser primarios, de bajo pasaje o líneas celulares. Los cultivos
primarios, por ejemplo, riñón de embrión de humano o de mono, son sensibles a los virus sólo
durante uno o dos pasajes, mientras que los cultivos de fibroblasto diploides pueden mantener su
susceptibilidad durante 20 a 50 pasajes. Las líneas celulares continuas como Hep-2 son
sensibles a los virus aun después de más de cien pasajes. Las muestras se inoculan a las
células, se incuban y luego el crecimiento y la identificación de un virus, se detecta mediante la
observación de cambios en la monocapa del cultivo celular que se denominan efecto a acción
citopático (ECP o ACP), estos ECP son cambios en la morfología celular, lisis celular,
vacuolización, formación de sincitios, cuerpos de inclusión. Otra forma de identificar en el
crecimiento en línea celular es la hemoadsorción/hemoaglutinación de eritrocitos de cobayo, con
frecuencia, la determinación del tipo, rapidez y selectividad del ECP o ACP en cultivos celulares
es suficiente para permitir la identificación preliminar o definitiva de un aislamiento.
Material
- Suero sospechoso HIV
- Policubetas y recipientes para lavado
- Micropipeta
- Reloj
- Reactivos
- Láminas para la observación del ACP.
Procedimiento
Inmunoensayo sobre soporte sólido para la detección de anticuerpos contra de inmunodeficiencia
humana (HIV-1 y HIV-2).
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2. Colocar 100 ul de control negativo, 100 ul de muestra suero problema y 100 ul de control positivo,
cada uno en pocillos diferentes.
3. Colocar el peine en cada pocillo, dejarlo reposar por 10 minutos.
4. Lavar
5. Agregar 3 gotas de revelador en cada pocillo y colocar el peine por 10 minutos, lavar y observar.
Resultado
Muestra reactiva : Repetir por duplicado, si continua reactivo, confirmar con Western
Blot.
Muestra no reactiva : Se presume que no tiene anticuerpo Hiv 1–Hiv 2
Leer las láminas y observar ACP del virus.
Cuestionario
1. Que virus de importancia clínica pueden ser aislado en los sistemas celulares descritos.
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REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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