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br Arlindo Ugulino Netto ● MEDRESUMOS 2016 ● GENÉTICA

GENÉTICA 2016
Arlindo Ugulino Netto.

PCR E SEQUENCIAMENTO DE BASES

PCR
A técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction, Reação em Cadeia da Polimerase), amplamente utilizada em
laboratórios de pesquisa e clínicos, consiste em produzir automaticamente milhões de cópias de um único segmento de
DNA em questão de horas.
Tal façanha depende da habilidade das enzimas copiadoras de DNA permanecerem estáveis em alta
temperatura, como veremos a seguir. A partir de um pequeno fragmento do DNA, fazem-se inúmeras cópias do DNA de
forma prática e rápida por meio da enzima DNA polimerase. A máquina que realiza o ciclo automaticamente é o
termociclador.

APLICAÇÕES
A Técnica de PCR, que foi formulada por Kerry Mullis, tem inúmeras aplicações. Na clínica, por exemplo, é
utilizado no diagnóstico de doenças infecciosas e na detecção de eventos patológicos raros. Na criminalística, um único
fio de cabelo pode identificar o doador.
Na paleontologia molecular, a amplificação de amostras de DNA extraídas de fósseis incrustados e preservados
no ambar há mais de 120 milhões de anos permite a determinação da sequência desta molécula para estudos
evolutivos. É um meio muito utilizado em testes de paternidade, diagnóstico molecular de doenças, medicina forense
(identificação de cadáveres carbonizados), etc.

PROCEDIMENTO
A replicação no tubo de ensaio mimetiza o que ocorre na natureza. A técnica, basicamente, evolve três passos
em que não se usa as enzimas tradicionais da replicação por serem de alto valor comercial, sendo então inviável. Deve-
se utilizar outros meios para tais fins como serão citados a seguir:
1. Desnaturação do DNA (90 – 95ºC): O primeiro passo é "abrir o DNA", separando as duas fitas da dupla
hélice. Para isso, aquece a molécula a altas temperaturas, desenrolando as duas fitas. Dura cerca de 1 a 2
minutos.
2. Anelamento (pareamento) dos “primers” de DNA: inicia-se a síntese do DNA sem o uso de RNA primers por
serem moléculas instáveis (quebrada rapidamente). Para isso, usa-se “kits” de primers, que são seguimentos
de 15 a 20 nucleotídeos, em que dois desses se hibridizam com as extremidades das duas fitas de DNA, ou
seja, se pareiam por meio de pontes de hidrogênio com essas extremidades. Deve-se, então, diminuir a
temperatura a 50ºC para permitir o pareamento desses nucleotídeos primers.
3. Extensão: a DNA polimerase da Termus aquaticus, denominada Taq polimerase, faz cópias utilizando cada
uma das fitas como molde mesmo em altas temperaturas (maiores que 37º). A DNA polimerase isolada da
bactéria hipertermofílica T. aquaticus, encontrada em fontes termais do parque florestal de Yellowstone-USA,
deu grande impulso à utilização automatizada desta técnica (seus kits custam cerca de R$1000, sendo,
mesmo assim, a enzima mais vendida em todo o mundo por ser a única polimerase que trabalha em altas
temperaturas). Essa enzima vai adicionar nucleotídeos tri fosfatados livres na extremidade 3’ OH dos
primers, igualmente nas duas fitas de DNA. Para isso, a temperatura pode até ser aumentada para 70ºC.

Com o fim dessas fases, fecha-se um ciclo de PCR, tendo um rendimento, inicialmente de 2 mols de DNA. A
relação do número de ciclos e o número de moléculas de DNA produzidas é exponencial, ou seja: o número de mols de
n
DNA é dado por 2 , onde n é o número de ciclos.
Em laboratório, são feitos em torno de 35 ciclos, ou seja, este ciclo é repetido 30 ou mais vezes de sorte que
após 40 minutos, aproximadamente, mais de um milhão de cópias de um determinado pedaço do DNA foi produzido, o
que facilita o seu estudo.
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OBS : A técnica é realizada por uso de pequenos tubos de ensaio cujo nome é eppendorf em uma
máquina chamada de termocicladora, considerada como uma “xérox copiadora de DNA”.

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SEQUENCIAMENTO DE NUCLEOTÍDEOS
O biólogo Frederick Sangler propôs essa técnica pela
primeira vez em 1977 ao sequenciar a proteína da insulina (54
aminoácidos) e o DNA. Graças às suas propostas, o projeto
genoma humano faz uso dessas técnicas.
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OBS : O gel de agarose é um substrato em que se colocam
diferentes tamanhos de DNA e, ao se fazer uso de uma
eletroforese, os DNAs migram diferentemente devido aos
seus tamanhos, sendo então, diferenciados e separados. Para
isso, fazem-se pequenas canaletas na base desse gel com um
“pente”. Nessas pequenas canaletas, depositam-se, com uma
pipeta automática, os diferentes DNAs. Liga-se a placa a uma
fonte de eletroforese com diferença de potencial, fazendo com
que o DNA migre do polo negativo para o polo positivo. DNAs
maiores (com mais nucleotídeos) correm menos, ao contrário
dos menores.

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OBS : Para esse sequenciamento, foi produzido um açúcar artificial chamado de dideoxiribose, o
qual não possui hidroxila no carbono 3’ de sua cadeia. Esse açúcar, ao entrar no DNA, para
imediatamente a sua síntese. No sequenciamento, ele deve ser homogeneizado (em pouca
quantidade) em um eppendorf junto ao DNA a ser diferenciado.

PROCEDIMENTO
Sua estratégia consiste em identificar, continuamente e sequencialmente durante o processo, o último
nucleotídeo incorporado na extremidade de alongamento da cadeia. Os produtos da reação deverão também portar uma
“marca” que permita detecta-los na etapa de análise. Resumidamente, o processo é realizado a partir de uma cadeia
simples (não dupla) do DNA a ser sequenciado; esta servirá de molde para gerar a outra metade complementar da dupla
hélice. Isto é obtido pela desnaturação da “molécula nativa”.

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A reação de síntese se processa em condições iônicas e de pH apropriadas, na presença da enzima DNA

polimerase e de uma mistura dos 4 nucleotídeos sob a forma de 3’-desoxinucleotídeo trifosfatos (dNTPs): dATP, dCTP,
dGTP e dTTP sendo um deles marcado radioativamente com ³²P. Como a enzima utilizada catalisa somente o
alongamento da cadeia nascente é necessário também, a presença na reação, de um pequeno fragmento de DNA
sintético (XXX) complementar a uma região conhecida (YYY) na extremidade 3’ do DNA molde; estas características
permitirão sua hibridização no local mencionado, e fornecerão um ponto de partida para a replicação do DNA. O
fragmento XXX, denominado iniciador ou “primer", quando marcado, poderá ser utilizado para rastrear o fragmento de
DNA recém-sintetizado no lugar do dNTP. Fato importante no processo é que ele é executado em quatro reações
separadas; cada uma delas, contendo adicionalmente pequena quantidade de um (e apenas um) dos 4 tipos de cada
dNTP sob a forma de análogo, 2’, 3’-didesoxinucleotídeo trifosfatos.
Estes análogos conhecidos como “terminadores” quando incorporados à cadeia nascente, por não apresentarem
3’OH que permita formar ligação com o próximo dNTP a ser adicionado, bloqueará todo processo. Como todos os
nucleotídeos normais (dNTPs) estão presentes, o alongamento da cadeia prosseguirá até que a enzima DNA-polimerase
insira um análogo (ddNTP). Consequentemente, haverá parada imediata da reação de síntese no ponto em que seu
alongamento foi interrompido: na extremidade, a molécula estará marcada com ³²P. Os fragmentos assim obtidos, cada
qual contendo um resíduo final conhecido, pois se sabe em que tubo de reação o análogo foi adicionado, são separados
por tamanho em gel de agarose (poliacrilamida) individualmente: um canal de análise para cada reação.
Após autorradiografia, a ordem dos nucleotídeos, na cadeia de DNA recém sintetizada, pode ser visualizada e
obtida diretamente; esta é complementar à da molécula sequenciada (que serviu de “molde”). Levando estas
observações em consideração, é possível conhecer a sequência de nucleotídeos do DNA sequenciado de 3’para 5’
partindo-se da parte inferior para a superior do gel, a partir do último nucleotídeo de cada síntese (o ddNTP). A mancha
negra marcada na eletroforese indicará o tamanho (número de nucleotídeos) da cadeia de DNA.
O método pode ser automatizado através de “maquinaria apropriada” gerenciada por computadores com “softs”
que leem sequencialmente e identificam os produtos. Isto permitirá executar o processo em grande escala. Neste caso
utilizam-se simultaneamente os 4 didesoxinucleotídeos terminadores (ddNTPs) marcados por fluorescência (fig 4a).
Como cada reação (A,T,G,C) utilizou um fluorocromo diferente os produtos podem ser reunidos e a eletroforese destes
realizada em um único canal do gel de sequenciamento (fig 4b). O sinal fluorescente diferencial emitido por cada
fragmento, após iluminação com um feixe de laser, identificará os produtos baseado na diferença de comprimento de
onda. A luz emitida é detectada por “escaneamento” do gel e a sequência deduzida por computador (fig 4c). Variáveis
mais modernas, consequentemente mais rápidas e poderosas, incluem a robotização total do processo com a inclusão
das etapas de purificação e da reação de síntese da cadeia do DNA.

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Ex: Ex :

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OBS : Dosagem da proteína-c reativa: é uma proteína produzida pelo fígado quando há um início de uma inflamação
ou infecção. Essa proteína reage e precipita-se com os carboidratos (polissacarídeo C) da bactéria Pneumococcus.
Representa um indicador extremamente sensível de inflamação, sendo sua presença um sinal muito significativo de
processo patológico. Na clínica, a determinação da proteína C reativa mostra-se particularmente útil na avaliação da
atividade do processo reumático, na avaliação de fator de risco para doença cardiovascular, no diagnóstico e
acompanhamento do infarto do miocárdio. Os conceitos atuais de infarto do miocárdio consideram a patologia como
também um processo inflamatório e relacionam a dosagem da proteína C reativa com risco de desenvolvimento para
isquemia do músculo cardíaco. Um teste positivo de proteína C reativa é encontrado em 90% dos casos de infartos
transmurais (leva ao comprometimento de toda a espessura do miocárdio, do epicárdio ao endocárdio).
 0,1 mg/dL  baixos riscos.
 0,3 mg/dL  alto risco (risco de doença vascular)
 0,5 mg/dL  alto risco com processo inflamatório ou infeccioso (relacionados, por exemplo, arteriosclerose ou
infarto).
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OBS : Em 1950, médicos norte-americanos estudaram tribos na Papua Nova-Guiné em que alguns integrantes estavam
sendo acometido de uma doença por eles denominadas de “curu”, apresentando espasmos, perda motora, demência e
morte. Descobriu-se que essa doença estava epidemiologicamente ligada, ao ritual de antropofagia dos cérebros de
familiares mortos. Em 1982, Stanley Prusiner estudou a encefalopatia espongiforme (em humanos, CJD – Creutzfeldt-
Jakoe Disease) em que o cérebro passa a ter um aspecto de esponja devido a uma degradação contínua dos neurônios,
causando espasmos e morte. Estudando carneiros acometidos dessa doença (conhecida como scrapie), foi isolada a
proteína causadora denominada proteína proteinaceous infections (PRIONS). Quando o gado se alimenta de ração
proveniente de “carcaças” de carneiro, ele adquire a doença conhecida como vaca louca, apresentando todos os
sintomas. Isso ocorre devido à existência de uma proteína no cérebro humano e bovino semelhante aos PRIONS, mas
de formato diferente e inativa. Quando ingeridos, os PRIONS não são degradados pelas proteases e caem na corrente
sanguínea até chegarem ao cérebro. Os PRIONS passam a interagir e ativar essas proteínas já existentes no cérebro,
causando a vaca louca ou a CJD em humanos (doença neurodegenerativa sem cura).
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OBS : O PCR pode ser feito a partir direto de um RNA viral, por meio da técnica RTPCR, realizando uma transcriptase
reversa, produzindo DNA a partir de RNA por meio de uma enzima especializada para isso e, depois, faz-se a técnica
normal de PCR para o sequenciamento de suas bases.