METODOLOGI

Waktu dan Tempat

Praktikum ini di dilaksanakan pada hari Kamis tanggal 6 April 2018 pada

pukul 14.50-17.00 WITA. Tempat pelaksanaan di Laboratorium Analisis Kimia

Fakultas Pertanian Universitas Lambung Mangkurat Banjarbaru.

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah ose, tabung

reaksi, spektrofotometer, laminar air flow, bunsen, corong bunchner, tisu, pH meter,

shaker dan Cornig sterile syringe filter.

Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah kultur mikroba, alkohol,

spiritus, akuades, NaOH 0,1 M, (NH4)2So4, KH2PO4, sukrosa, HCl 0,01 M, Kapas,

glukosa, NM (Nutrien Broth), yeast extract, pepton, reagen TCA, dan reagen Folin

Ciocalteu.

Prosedur Kerja

Prosedur kerja dalam praktikum ini sebagai berikut :

A. Pembuatan media inokulum Lipase kasar

Dibuat 100 ml media cair (sukrosa 12,5% (NH4)2SO4 0,25% dan KH2PO4
0,2%)

Dibuat larutan glukosa terpisah

Diatur pH hingga 3 dengan NaOH 0,1 M dan HCl 0,01 M

Disterilkan larutan dalam autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit

A
 A

Dicampur kedua larutan secara aseptik dan diperoleh untuk media

fermentasi

Diinokulasi suspensi mikroba pada media kultivasi, lalu ditutup dengan

kapas dan diinkubasi pada suhu 300C selama 24 jam

Diambil 2 mL dari 100 mL media cair yang telah diinkubasi dan

ditambahkan 98 mL aquades.

Hasil

B. Produksi enzim lipase kasar

Diinkubasi selama 7 hari dengan magnetik stirer kecepatan 150 rpm suhu
300C. Diamati pada hari ke 0, 4, 5, dan 7

Dilakukan pengukuran OD (Optical Density) menggunakan

spektrofotometer pada panjang gelombang 660 nm.

Disaring hasil inkubasi dengan menggunakan corong buchner. Filtrat

(benin) adalah (enzim lipase kasar) dan residu (ampas)

Hasil

C. Pembuatan media inokulum protease kasar

Ditambahkan satu ose isolat pada 50 mL NB

A
 A

Diinkubasi dan shaker incubator dengan kecepatan agtasi 120 rpm

pada suhu 370C selama 24 jam

Diinokulasi pada media produksi Horikoshi mengandung 1% glukosa,

0,5% yeast extract, 0,5% pepton, 0,1% KH2PO4, 0,02% MgSO4, dan
1% Na2CO3 (steril ditambahkan pada media setelah proses sterilisasi)

Dilakukan inkubasi dalam shaker incubation dengan kecepatan agitasi

150 rpm pada suhu 370C dengan waktu produksi 30 jam.

Hasil

D. Produksi enzim protease kasar

Dipisahkan enzim protease yang terdapat dalam media produksi dari

sel isolat dengan cara sentrifugasi dalam keadaan dingin dengan
kecepatan 9500 rpm selama 10 menit

Sebelum disaring dengan filter glass fiber (whatman GF/C dan

disterilisasi dengan Corning sterile syyringe filter 0,45 mikrometer.

Ditambahkan NaN3 hngga konsentrasi laruan 1 Mm ke dalam setiap

larutan supernatan jika enzim tilak lansung digunakan untuk analisis
aktivitas enzim

Ditambahkan sebanyak 1 mL ekstrak kasar enzim pada substrat

kasein 0,65% (0,65 gr kasein dalam 100 mL bufer K-Pospat 0,05 M
pH 7,5

Diinikulasi Campuran reaksi pada suhu 370C selama 10 menit

A
 A

Dilakukan terminasi reaksi melalui penambahan 5 mL reagen TCA

110 mM, dan diinkubasi kembali pada 370C selama 30 menit

Dipisahkan filtrat 2 mL dengan cara sentrifugasi pada 10000 rpm

selama 10 menit

Ditambahkan 5 mL Na2CO3 dan 1 mL reagen Folin Ciocateau

ditambahkan kedalam filtrat dan inkubasi pada 370C selama 30 menit

Diukur campuran absorbansi menggunakan spektrofotometer pada

panjang gelombang 660 nm. Satu unit aktivitas enzim didefinisikan
sebagai banyaknya enzim yang dibutuhkan untuk melepaskan 1
mikromol tirosin pada substrat kasein per menit

Hasil