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Descripción PROTOCOLO Pautas para prevenir CONTAMINACIÓN DE reacción de

Taq ADN polimerasa es una ADN polimerasa termoestable altamente de la PCR


bacteria termófila Thermus aquaticus. La enzima cataliza 5' • 3' síntesis de ADN, Para preparar varias reacciones en paralelo y para reducir al mínimo la posibilidad de

errores de pipeteo, preparar una mezcla maestra de PCR mezclando agua, tampón, Durante la PCR se generan más de 10 millones de copias de ADN molde. Por lo
no tiene ninguna detectable 3' • 5' exonucleasa (corrección de pruebas) la
dNTP, cebadores y Taq ADN polimerasa. Preparar suficiente mezcla maestra para el tanto, se debe tener cuidado para evitar la contaminación con otras plantillas y
actividad y posee 5' • 3' exonucleasa. En adición, Taq ADN polimerasa exhibe
número de reacciones más uno adicional. Alícuota de la mezcla maestra en tubos de amplicones que pueden estar presentes en el entorno de laboratorio. Las
INFORMACIÓN DEL PRODUCTO actividad desoxinucleotidil transferasa, que con frecuencia resulta en la
PCR individuales y luego añadir la plantilla de ADN. recomendaciones generales para reducir el riesgo de contaminación son los
Taq ADN polimerasa adición de adeninas extra en el extremo 3 'de productos de PCR.
siguientes:
(Recombinante) recombinante Taq ADN polimerasa es ideal para PCR estándar de amplicones
1. vórtice suavemente y centrifugar brevemente después de todas las soluciones
de 5 kb o más corto.
descongelación. • Prepare la muestra de ADN, configurar la mezcla de PCR, lleve a cabo el

# EP0402 500 U 2. Colocar un tubo de PCR de pared delgada en hielo y añadir la siguiente
ciclo térmico y analizar los productos de PCR en áreas separadas.

Lote: __ Fecha de caducidad: __ componentes para cada 50 l Reacti en:


aplicaciones • Configurar mezclas de PCR en una cabina de flujo laminar equipada con una
Concentración: 5U/l 10X Taq Buffer 5l
• amplificación de rutina por PCR de fragmentos de ADN de hasta 5 kb (1). lámpara de UV.
dNTP Mix, 2 mM cada uno (# R0241) 5! L (0,2 mM de cada uno) • Use guantes frescos para la purificación de ADN y la reacción de configurar.
Almacenar a -20 ° C
• Generación de producto de PCR para la clonación TA. cebador directo 0,1-1,0 M
• marcaje de ADN (2-4). • Usar contenedores de reactivos dedicados para PCR. Utilice pipetas de
cebador inverso 0,1-1,0 M
• La secuenciación de ADN (5). desplazamiento positivo, o usar las puntas de pipeta con filtros de aerosol para
MgCl 25 mM 2 * 1-4 mM preparar muestras de ADN y realizar PCR configurado.
Fuente • reactivos certificados por PCR uso, incluyendo agua de alta calidad (por ejemplo,
El ADN molde 10 pg - 1 g
E. coli células con un clonado pol gen de Thermus aquaticus agua, de nucleasa libre, (# R0581)).
www.thermoscientific.com/onebio YT1. Taq ADN polimerasa 1,25 U
• Siempre realizar “control sin molde” (NTC) reacciones para comprobar la
Agua, libre de nucleasa (# R0581) a 50 l contaminación.
Definición de la Unidad de Actividad

Una unidad de la enzima cataliza la incorporación de 10 nmol de Volumen total 50 l


LINEAMIENTOS para el primer diseño
desoxirribonucleótidos en una fracción de polinucleótido en 30 min a 74 ° C.
* Los volúmenes de MgCl 25 mM 2, requerido para MgCl final específico 2
Utilice el software de diseño de cebadores ThermoScientific Crítico en www.thermoscientific.com
concentración: La concentración final de MgCl 2,
o seguir las recomendaciones generales para el diseño de cebadores de PCR como se
tampón de almacenamiento mM 1 1,5 2 2,5 3 4
indica a continuación:
La enzima se suministra en: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), DTT 1 mM,
Volumen de MgCl 25 mM 2 que se añade para 50
2 3 4 5 6 8 • Los cebadores de PCR son generalmente de 15-30 nucleótidos de largo.
EDTA 0,1 mM, KCl 100 mM, reacción l, l
• GC contenido óptimo de la imprimación es de 40-60%. Idealmente, los
Información sobre pedidos 0,5% (v / v) de Nonidet ® P40, 0,5% (v / v) de Tween ® (V / v) 20 y 50% de
nucleótidos C y G deben ser distribuidos de manera uniforme a lo largo de la
glicerol.
3. vórtice suavemente las muestras y girar hacia abajo. imprimación.
Taq ADN Polymera s e ( RECOMB inante)
10X Taq Buffer con KCl 4. Si se utiliza un ciclador térmico que no utiliza una tapa calentada, • Evitar la colocación de más de tres nucleótidos G o C en el extremo 3 'para
Componente # EP0401 EP0402 # # EP0405 # EP0406
100 mM Tris-HCl (pH 8,8 a 25 ° C), KCl 500 mM, superponer la mezcla de reacción con 25 l de aceite mineral. disminuir el riesgo de cebado no específico.
Taq ADN polimerasa, 5 U / l
100 U 500 U 5 x 500 U 10 x 500 U (V / v) 0,8% de Nonidet P40. 5. Realizar PCR usando el ciclo térmico recomendado • Si es posible, el cebador debe terminar con una G o C en el extremo 3 '.

condiciones:
10X Taq Buffer con KCl 10X Taq Buffer con (NH 4) 2 ASI QUE 4
0,6 ml 2x1.25 ml 10x1.25 ml 20x1.25 ml • Evitar las regiones de imprimación auto-complementaria, la complementariedad entre
750 mM Tris-HCl (pH 8,8 a 25 ° C), 200 mM (NH 4) 2 ASI QUE 4, Temperatura, los cebadores y el cebador directo se repite para evitar la formación de horquilla y
Paso Tiempo Número de
10X Taq Buffer con (NH 4) 2 ASI (V / v) 0,1% de Tween 20. DO ciclos la dimerización de imprimación.
0,6 ml 2x1.25 ml 10x1.25 ml 20x1.25 ml
QUE 4
La desnaturalización inicial 95 1-3 min 1
La inhibición e inactivación
MgCl 25 mM 2 0,6 ml 2x1.25 ml 10x1.25 ml 20x1.25 ml
• Compruebe posibles sitios de no deseado complementaria entre los
• Inhibidores: detergentes iónicos (desoxicolato, Sarkosyl y SDS) a desnaturalización 95 30 s
cebadores y el ADN plantilla.
concentraciones superiores a 0,06, 0,02 y
Taq ADN polimerasa ( recombinante), LC Recocido Tm-5 30 s 25-40 • En el diseño de cebadores degenerados, lugar al menos 3 nucleótidos
0,01%, respectivamente (6).
Componente # EP0403 EP0404 # en el extremo 3 'conservated.
• Inactivado por extracción con fenol / cloroformo.
Extensión 72 1 min / kb
Taq ADN polimerasa, 1 U / l 100 U 500 U • Cuando la introducción de sitios de enzimas de restricción en los cebadores,

consulte la tabla de “eficacia de escisión cerca de los extremos de los fragmentos


10X Taq Buffer con KCl 0,6 ml 2x1.25 ml extensión final 72 5-15 min 1
de PCR” situado en
10X Taq Buffer con (NH 4) 2 ASI QUE 4 0,6 ml 2x1.25 ml
www.thermoscientific.com/onebio para determinar el número de bases
MgCl 25 mM 2 0,6 ml 2x1.25 ml adicionales necesarios para la escisión eficiente.

• Las diferencias en las temperaturas de fusión (Tm) entre los dos cebadores no
deben exceder de 5 ° C.

(Continúa en la página inversa)


Estimación de la temperatura de fusión del cebador dNTPs hibridación de los cebadores CERTIFICADO DE ANÁLISIS
Para los cebadores que contienen menos de 25 nucleótidos, la aprox. temperatura La concentración final recomendada de cada dNTP es La temperatura de recocido debería ser de 5 ° C más baja que la temperatura de
Ensayo endodesoxirribonucleasa
de fusión (Tm) se puede calcular utilizando la siguiente ecuación: 0,2 mm. En ciertas aplicaciones de la PCR, las concentraciones de dNTP más fusión (Tm) de los cebadores. Recocido de 30 segundos es normalmente suficiente.
altos pueden ser necesarios. Debido a la unión de Mg 2+ a dNTP, MgCl la 2 concentración Si aparecen productos de PCR no específicos, la temperatura de recocido debe ser No se detectó conversión de ADN circular cerrado covalentemente a mellado de

tiene que ser ajustada en consecuencia. Es esencial tener concentraciones iguales optimizado por etapas en 1-2 incrementos ° C. Cuando se utilizan aditivos que ADN después de la incubación de 10 U de Taq ADN polimerasa con 1 g de ADN
Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T),
de los cuatro nucleótidos (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) presentes en la mezcla de cambian la temperatura de fusión del complejo de cebador-molde (glicerol, DMSO, pUC19 durante 4 horas a 37 ° C.
donde G, C, A, T representan el número de nucleótidos correspondientes
reacción. Para lograr la concentración de 0,2 mM de cada dNTP en la PCR formamida y betaína), la temperatura de recocido debe también ser ajustado.
en el cebador. Exodeoxyribonuclease Ensayo
Si el cebador contiene más de 25 nucleótidos programas informáticos especializados,
No se observó degradación del ADN después de la incubación de 1 g de
por ejemplo, un revisor ™ ( www.thermoscientific.com/reviewer ), Se recomienda para
fragmentos lambda ADN / HindIII con 10 U Taq ADN polimerasa durante 4 horas
mezcla, utilice el siguiente volu metro es de dNTP mezcla:
tener en cuenta las interacciones de bases adyacentes, efecto de la concentración de Extensión a 37 ° C.
sal, etc. dNTP Mix, 2 mM dNTP Mix, 10 mM dNTP Mix, 25 mM
Volumen de La temperatura óptima de extensión para Taq ADN polimerasa es 70-75 ° C. La etapa de
de cada uno (# de cada uno (# de cada uno (# Ensayo ribonucleasa
mezcla de PCR extensión recomendada es de 1 min a 72 ° C para productos de PCR de hasta 2 kb.
R0241) R0191) R1121)
No se detectó actividad de RNasa contaminante después de la incubación de
Para los productos más grandes, el tiempo de extensión debe prolongarse por 1 min / kb.
50 l 5l 1l 0,4 l 10 U de Taq ADN polimerasa con 1 g de [ 3 H] -ARN durante 4 horas a 37 ° C.
Componentes de la mezcla REACCIÓN
25 l 2,5 l 0,5 l 0,2 l
Número de ciclos
El ADN molde 20 l 2l 0,4 l 0,16 l Ensayo funcional
El número de ciclos puede variar dependiendo de la cantidad de ADN molde en la
cantidades óptimas de ADN molde en el volumen de reacción de 50! l se 0,01-1 Taq ADN polimerasa fue probado para la amplificación de 950 pb sola copia del gen a
mezcla de PCR y el rendimiento del producto de PCR esperado.
ng para ambos plásmido y fago de ADN, y partir de ADN genómico humano y para la amplificación de cDNA.
cebadores
0,1-1 g de ADN genómico. Superior cantidad de molde aumenta el riesgo de
Si es menos de 10 copias de la plantilla están presentes en la reacción, se requieren
generación de productos de PCR no específicos. Baja cantidad de molde El intervalo de concentración recomendado de los cebadores de PCR es 0,1-1? M. Las
aproximadamente 40 ciclos. Para cantidades de plantilla más altas, 25-35 ciclos son Calidad autorizado por: Jurgita Zilinskiene
reduce la precisión de la amplificación. concentraciones excesivas de cebadores aumentan la probabilidad de cebado
suficientes.
defectuoso y la generación de productos de PCR no específicos.

Todos los métodos de purificación de ADN de rutina son adecuados para la extensión final
preparación de plantilla por ejemplo, Thermo Scientific GeneJET Genomic DNA Para cebadores degenerados más altas concentraciones de cebador en el intervalo de AVISO AL COMPRADOR:
Después del último ciclo, se recomienda incubar la mezcla de PCR a 72 ° C
Purification Kit (# K0721) o Kit GeneJET ™ plásmido Miniprep (# K0502). Las trazas de 0,3-1? M son a menudo favorable. El uso de este producto está cubierto por la patente US nº 6.127.155. La compra de este producto incluye una
durante 5-15 minutos adicionales para rellenar los posibles productos de reacción inmunidad limitada, no transferible de demanda en virtud de las reivindicaciones de patente precedentes para el uso
ciertos agentes utilizados para la purificación de ADN, tales como fenol, EDTA y
incompletos. Si el producto de PCR se clonó en vectores TA (por ejemplo, de sólo que esta cantidad de producto para propia investigación interna del comprador. Sin derecho bajo cualquier otra
proteinasa K, puede inhibir las ADN polimerasas. precipitación con etanol y lavados reivindicación de la patente, no tiene derecho a realizar cualquier método patentado y no tiene derecho a realizar
utilizando Thermo Scientific InsTAclone PCR Cloning Kit (# K1213)), el paso de
repetidos del sedimento de ADN con etanol al 70% normalmente elimina los PARÁMETROS DE CICLO servicios comerciales de cualquier tipo, incluyendo, sin limitaciones, informar de los resultados de las actividades del
extensión final puede prolongarse a 30 min para asegurar la más alta eficiencia de
comprador por un precio u otra consideración comercial, es transportado de forma expresa, por implicación, o por
contaminantes traza de muestras de ADN.
desnaturalización del ADN inicial 3'-dA tizón de PCR producto. Si el producto de la PCR se utilizará para clonar impedimento legal. Este producto es para uso exclusivo en investigación. usos de diagnóstico bajo patentes de Roche

requieren una licencia separada de Roche. Para más información sobre la compra de licencias se puede obtener
utilizando Thermo Scientific CloneJET PCR Cloning Kit (# K1231), la etapa de
Es esencial para desnaturalizar completamente la plantilla de ADN en el comienzo de contactando outlicensing@lifetech.com o concesión de licencias, Life Technologies Inc., 5791 Van Allen Way,
extensión final se puede omitir.
PCR para asegurar una utilización eficiente de la plantilla durante el primer ciclo de Carlsbad,

MgCl 2 concentración
amplificación. Si el contenido de GC de la plantilla es de 50% o menos, de una

Debido a la unión de Mg 2+ a dNTPs, cebadores y plantillas de ADN, Mg 2+ concentración desnaturalización inicial 1-3 min a 95 ° C es suficiente. Para las plantillas ricas en GC

debe ser optimizado para el rendimiento máximo PCR. El intervalo de concentración este paso debe prolongarse hasta 10 minutos. Si se requiere etapa de desnaturalización Solución de problemas LICENCIA LIMITADA DE USO DE LA ETIQUETA: Investigación Interna y Desarrollo de Uso Solo.

recomendada es de 1-4 mM. Si el Mg 2+ concentración es demasiado baja, el rendimiento inicial más largo, o el ADN se desnaturaliza a una temperatura más alta,
Para la solución de problemas por favor visite La compra de este producto transmite al comprador el derecho no exclusivo e
de producto de PCR se podría reducir. Por el contrario, los productos de PCR no intransferible limitado,, (sin derecho a revender, volver a empaquetar o más sub-licencia)
www.thermoscientific.com/onebio
específicos pueden aparecer y la PCR fidelidad se puede reducir si el Mg 2+ concentración Taq ADN polimerasa debe añadirse después de la etapa de desnaturalización para utilizar este producto con fines de investigación y desarrollo internos. Ningún otro se
concede licencia al comprador de forma expresa, por implicación, por impedimento legal
es demasiado alta. inicial para evitar una disminución en su actividad. referencias
o de otro tipo. En particular, la compra del producto no incluye o lleva ningún derecho o
. 1. Innis, MA, et al, PCR Protocols and Applications: A Laboratory Manual, Académica,
licencia para utilizar, desarrollar o explotar este producto en el mercado y no hay
desnaturalización
Taq ADN polimerasa se suministra con dos tampones: Taq buffer con KCl y Taq buffer con Nueva York, 1989. derechos son transportados al comprador a utilizar el producto o componentes del

(NH 4) 2 ASI QUE 4. K + estabiliza la hibridación del cebador mientras que NH 4+ tiene un Un tiempo de desnaturalización de ADN de 30 segundos por ciclo a 95 ° C es 2. Celeda, D., et al., Amplificación por PCR y la incorporación de digoxigenina simultánea de sondas producto para propósitos incluyendo, pero no limitado a la prestación de servicios a
terceros, generación de bases de datos comerciales o diagnósticos clínicos. Este
efecto desestabilizador sobre todo en los enlaces de hidrógeno entre pares de bases normalmente suficiente. Para moldes de ADN ricas en GC, este paso se puede de ADN largas para fluorescencia en el lugar hibridación, BioTechniques, 12, 98-102, 1992.
producto se vende con la autorización de Thermo Fisher Scientific y Thermo Fisher
débiles primertemplate no coincidentes. Por lo tanto para el estándar de PCR con Taq prolongar a 3-4 min. desnaturalización del ADN también se puede mejorar mediante Scientific se reserva todos los demás derechos.
la adición de 10-15% de glicerol o DMSO al 10%, 5% de formamida o 1-1,5 M 3. Finckh, U., et al., La producción de sondas de ADN de cadena simple con la

ADN polimerasa y 0,2 mM dNTPs el MgCl recomendada 2 las concentraciones son en betaína. La temperatura de fusión del complejo de cebador-molde disminuye Taq ADN polimerasa: un protocolo de alto rendimiento, BioTechniques, 10, 35-39,

general inferior 1,5 ± 0,25 mM utilizando las Taq buffer con KCl en comparación con significativamente en presencia de estos reactivos. Por lo tanto, la temperatura de 1991. 92008.
2,0 ± 0,5 mM cuando se utiliza Taq buffer con (NH 4) 2 ASI QUE 4. Debido a los efectos recocido tiene que ser ajustada en consecuencia. Además, el 10% de DMSO y 5% 4. Yu, H. et al., Cyanine análogos colorante dUTP para el etiquetado enzimática de sondas de
Limitación del uso del
antagónicos de NH 4+ y Mg 2+, Taq buffer con (NH 4) 2 ASI QUE 4 ofrece mayor especificidad de formamida inhiben las polimerasas de ADN por 50%. Así, la cantidad de la ADN, Nucleic Acids Res., 22, 3226-3232, 1994.
Este producto ha sido desarrollado, diseñado y vendido exclusivamente con fines de investigación y en uso vitro. El
cebador en una amplia gama de concentraciones de magnesio en variedad de enzima se debe aumentar si se utilizan estos aditivos. 5. Innis, MA, et al., Secuenciación de ADN con Thermus aquaticus DNA
producto no fue probado para su uso en el diagnóstico o para el desarrollo de fármacos, ni es adecuada para la

temperaturas de recocido. Si las muestras de ADN contienen EDTA u otros quelantes polimerasa y secuenciación directa de cadena de la polimerasa reactionamplified DNA, administración a seres humanos o animales. Por favor refiérase a www.thermoscientific.com/onebio para la hoja de

Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 85, 9436 a 9.440, 1.988. datos de seguridad del producto.
de metales, el Mg 2+ concentración de iones en la mezcla de PCR se debe aumentar en
consecuencia (1 molécula de EDTA se une uno Mg 2 +). 6. Weyant, RS, et al., Efecto de detergentes iónicos y no iónicos en la

Taq polimerasa, Biotechniques, 9, 309-308, 1990. © 2015 Thermo Fisher Scientific, Inc. Todos los derechos reservados. Tween es una marca registrada de ICI

7. Lundberg, KS, et al., La amplificación de alta fidelidad utilizando una ADN polimerasa America, Inc. Nonidet es una marca comercial de Shell. Todas las demás marcas comerciales son propiedad de

termoestable aislada de Pyrococcus furiosus, Gene, 108, 1-6, Thermo Fisher Scientific Inc. y sus filiales.

1991.