Facultad de Ingeniería y Ciencias Agropecuarias (FICA)

IBT611 - ENZIMOLOGÍA

GUÍA PARA PRÁCTICAS DE LABORATORIO

Ingeniería en Biotecnología

Facultad de Ingeniería y Ciencias Agropecuarias| Guía para Prácticas de Laboratorio 1

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Presentación

La presente Guía para Prácticas de Laboratorio ha sido desarrollada para que los
estudiantes de la asignatura de Enzimología dispongan de la información necesaria para la
realización de las prácticas correspondientes de acuerdo a los temas, objetivos y
resultados de aprendizaje definidos. En este documento se incluye el proceso en el
laboratorio de experimentación e investigación, con los respectivos recursos y resultados
esperados, para que el estudiante pueda desarrollar su práctica-taller y la elaboración de
sus respectivos informes o cualquier otra evidencia de aprendizaje, que serán evaluadas
con las rúbricas que constan en los anexos.

La Guía presenta una secuencia donde se especifica cada sesión de prácticas en

laboratorio con su respectivo proceso didáctico y formativo.

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ASIGNATURA: Enzimología SIGLA: IBT611 PARALELO: PERIODO:

1y2 2017-2

Fecha: PRÁCTICA SESIONES: 2 TEMA: Obtención de tres curvas de calibración

7/04/2017 No: 1

1.- OBJETIVO

General:

- Obtener tres curvas de calibración que relacionen la concentración de una solución patrón
con la absorbancia de dicha solución, mediante espectrofotometría.

Específicos:

- Desarrollar pericia técnica y exactitud en la elaboración de soluciones patrón.

- Recibir entrenamiento en el uso del espectrofotómetro.

2.- RESULTADOS DE APRENDIZAJE ESPERADOS

Adquirirás las siguientes habilidades:

- Adquirir destreza en la preparación de soluciones químicas.

- Obtener habilidad en el método espectrofotométrico para la obtención de curvas de
calibración.

3.- MATERIALES/RECURSOS Y EQUIPOS

Materiales:

- Cajas de celdas espectrofotométricas

- Tubos de ensayo de 10 mL
- 2 balones de aforo de 100 mL
- 1 balón de aforo de 500 mL y uno de 1000 mL
- Puntas para micro-pipetas de 1000 µL y 200 µL
- Vaso de precipitación de 100 mL y 250 mL
- Micropipetas de 1000 µL y 200 µL

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Reactivos:

- Fosfato monobásico de sodio (NaH2PO4)

- Fosfato dibásico de sodio (Na2HPO4)
- P-nitrofenol
- Agua destilada
- Acetonitrilo
- Solución de DNS 1%
- Glucosa
- Kit de cuantificación de proteínas “Quantum Protein”

Equipos:

- Espectrofotómetro
- Balanza

4.- METODOLOGÍA

4.1. PROCEDIMIENTO PARA CURVA DE P-NITROFENOL

4.1.1. Tampón fosfato (Tpn NaP, 100 Mm, pH 7.00)

- Se pesan 5,99 gramos de fosfato monobásico de sodio (NaH2PO4) y 7,09 gramos de
fosfato dibásico de sodio (Na2HPO4) y se disuelven aforando a 1000 mL con agua
destilada.
- Se ajusta el pH a 7.00

4.1.2. Tampón fosfato acetonitrilo (Tpn NaPA)

- Mezcla de tampón fosfato y aetonitrilo (volumen/volumen).
- Tomar 4 mL de acetonitrilo y aforar a 100 mL con tampón fosfato.

4.1.3. Solución patrón de p-Nitrofenol (o paranitrofenol) (0.15 mM)

- Solución 15 mM de p-Nitrofenol: Se pesan 1,043 gramos de pNF y se diluyen en
500 mL de agua destilada, para obtener una concentración de 15 mM de pNF.
- De esta solución anterior, se toma 1 mL y se afora a 100 mL con agua destilada, y
se obtiene así una concentración 0,15 mM de pNF.

4.1.4. Elaboración de la curva de calibrado

- De la solución patrón de p-Nitrofenol (0,15 mM) se toman los volúmenes
indicados en la Tabla 1 y se adicionan los volúmenes indicados de tampón fosfato-
acetonitrilo (Tpn NaPA; no confundir con solución tampón fosfato, la cual no
contiene acetonitrilo), obteniéndose las concentraciones indicadas en la misma
Tabla 1.

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Tabla 1: Soluciones patrón para la curva de calibración con pNF

Volumen tampón
Volumen de pNF
fosfato acetonitrilo pNF (mM)
(0,15 mM; mL)
(mL)
0,50 2,60 0,024
0,75 2,35 0,036
1,00 2,10 0,048
1,25 1,85 0,060
1,50 1,60 0,073
1,75 1,35 0,085
2,00 1,10 0,097
2,25 0,85 0,109
2,50 0,60 0,121

Finalmente se lee la absorbancia a 420 nm. Se usa como blanco la solución tampón
fosfato-acetonitrilo (Tpn NaPA). Los valores obtenidos se correlacionan con sus
respectivas concentraciones, y se obtiene así, por regresión lineal, el coeficiente
de extinción molar, siendo este la pendiente resultante.

4.2. PROCEDIMIENTO PARA LA CURVA DE GLUCOSA

Solución stock de glucosa (1g/L, 50 mL): Pese 0,05 gramos de glucosa y disuelva en 50 mL de agua
destilada. A partir de esta solución stock, prepare diluciones según indica en la Tabla 2.

Tabla 2: Diluciones de glucosa para curva de calibración

Volumen de solución Volumen de agua Volumen total de la
Dilución (g/mL)
stock (mL) (mL) dilución (mL)
0 (0,001) 5,0 0,0 5,0
1 (0,0009) 4,5 0,5 5,0
2 (0,0008) 4,0 1,0 5,0
3 (0,0007) 3,5 1,5 5,0
4 (0,0006) 3,0 2,0 5,0
5 (0,0005) 2,5 2,5 5,0
6 (0,0004) 2,0 3,0 5,0
7 (0,0003) 1,5 3,5 5,0
8 (0,0002) 1,0 4,0 5,0
9 (0,0001) 0,5 4,5 5,0
10 (0,0) 0,0 5,0 5,0

Una vez preparadas las diluciones de glucosa, tomar 250 µL de dilución, mezclar con 1 mL de
reactivo DNS, y calentar a 95°C por 5 minutos. Dejar enfriar la mezcla, trasvasarla a una celda
espectrofotométrica y medir la absorbancia a 540 nm.

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NOTA: Para elaborar la curva de calibración recalcule la concentración de glucosa de esta nueva
solución (C1V1 = C2V2) y elabore la curva de calibración, donde el eje “Y” es absorbancia y el eje “X”
es la nueva concentración de glucosa.

4.3. PROCEDIMIENTO PARA LA CURVA DE PROTEÍNAS TOTALES

4.3.1. Solución de trabajo

Utilice el kit de cuantificación Quantum Protein Euroclone ® y prepare 10 mL de una
solución que contenga 50 partes del “Agente A” y una parte del “Agente B”. Mezcle
9803,92 µL del Agente A con 196,08 µL del Agente B en un tubo falcon de 15 mL limpio y
seco.
En primer lugar, se realiza una solución de trabajo de un volumen final de 10 mL (volumen
destinado para 9 diluciones y un blanco), en la cual se mezcló 50 partes del Agente A
(980,40 µL/mL) y una parte del Agente B (19,60 µL/mL).
Coloque 1 mL de la solución de trabajo en 10 tubos eppendorf de 1,5 mL.

4.3.2. Solución stock albúmina

A partir de una solución de albumina 200000 µg/mL prepare 100 µL de stock de albúmina
20000 µg/mL.

4.3.3. Elaboración de la curva de calibrado

De la solución stock de albúmina (20000 µg/mL) se toman los volúmenes indicados en la
Tabla 3 y se adicionan los volúmenes indicados de agua estéril, obteniéndose las
concentraciones indicadas en la misma Tabla 3.

Tabla 3. Diluciones de glucosa para la curva de calibración

Volumen solución stock
Agua estéril
(20000 µg/mL) Concentración final (µg/mL)
(µL)
(µL)
2,5 97,5 500
4,0 96,0 800
5,0 95,0 1000
6,0 94,0 1200
8,5 91,5 1700
10,0 90,0 2000
Volumen solución stock
Agua estéril
(2000 µg/mL) Concentración final (µg/mL)
(µL)
(µL)
1,0 99,0 20
2,5 97,5 50
5,0 95,0 100

Inmediatamente coloque 50 µL de cada dilución en los tubos que contienen la solución

de trabajo. Coloque los tubos en el termobloque durante 30 minutos a 37°C.

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Finalmente mida la absorbancia a 562 nm.

5.- ACTIVIDAD FORMATIVA

Prerrequisitos (Antes de comenzar este ejercicio, deberás dominar lo siguiente:)

Química analítica, espectrofotometría, preparación de soluciones y determinación de

concentraciones molares y milimolares.

Descripción de la actividad:
El paranitrofenol es una sustancia de color amarillo y sensible a la luz a 420 nm, utilizado en
métodos espectrofotométrico como indicador de pH. Su sensibilidad a la luz tiene una relación
directamente proporcional con la concentración de esta sustancia en dilución, es decir, a mayor
concentración de paranitrofenol en dilución, mayor es su absorbancia. Sin embargo, es incolora
cuando está asociada a ácidos grasos.
En enzimología es útil ya que existen compuestos, tales como el paranitrofenil-butirato que son
incoloros. La actividad lipasa rompe el enlace éster que une al paranitrofenil con el butirato,
liberándose de este modo el paranitrofenil y coloreando el medio de reacción. Para utilizar este
método es necesario primero contar con una curva de calibración que contenga solo el colorante
en concentraciones conocidas.
La determinación de la actividad enzimática de la lipasa se realizará mediante el método de
Fukudama (1996) modificado, en el que se utiliza como sustrato el p-nitrofenil-butirato (pNFB) el
cual es esterificado por la acción catalítica de la enzima a p-nitrofenol (pNF).
Las curvas de calibración de azúcares sirven para determinar actividades de amilasas, o
enzimas cuya actividad den como producto azúcares.
Las curvas de calibración de proteínas ayudan a determinar cuantificaciones de proteínas
como consecuencia de la actividad enzimática con proteínas involucradas (proteasas, por
ejemplo).

6.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Fukudama K., Kuwahata O., Kiyokawa Y., Yanagiuchi, T., Wakai Y., Kitamoto K., Inoue Y., Kimura,
A., (1996), “Molecular cloning and nucleotide sequence of the isoamyl acetatehydrolyzong
esterase gene (EST2) from Saccharomyces cerevisae”, Journal of fermentation and bioengineering,
82: 8-15.

7.- MECANISMO DE EVALUACIÓN Y ANEXOS

La rúbrica para los informes de laboratorio se encuentra subida al aula virtual, al igual que el
formato de presentación de informes.

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