Nombre:

NRC: 2582
FECHA: 14-06-2017

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

Título: Preparación de medios de cultivo, siembra e identificación

bacteriana de Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus.

Palabras clave:
Agar nutriente, caldo nutriente, medio SIM, cultivo inclinado, cultivo en caja
Petri.

Resumen:

El objetivo de la práctica fue la preparación de medios de cultivo y su posterior

siembra bacteriana. Se realizaron los cuatro medios de cultivo siguiendo las
instrucciones de sus respectivas etiquetas haciendo una proporción a la cantidad
que se necesitó, se autoclavó y de dejo enfriar. Con respecto a la siembra
bacteriana, se efectuó el método para hacer frotis de una cultivo sólido con
Bacillus subtilis y se sembró en agar inclinado. En el caso del caldo nutriente se
sembró removiendo el medio con el asa cargada con Bacillus subtilis. El medio
SIM se sembró utilizando una aguja. Finalmente en la caja Petri, se sembró
utilizando un asa con Staphylococcus aureus pasándola sobre el agar nutriente.
Todas las siembras se incubaron por 24 horas a 37°C. Luego de la incubación
se observó crecimiento en todos los medios de cultivo.

Introducción:

1. Justificación

La preparación de medios de cultivo es importante ya que gran parte de los

estudios de microbiología dependen de la capacidad de cultivas y mantener
microorganismos en el laboratorio.

2. Marco teórico

- Medios de cultivos
Se denomina medio de cultivo a un material nutritivo preparado para el
crecimiento de microorganismos en un laboratorio. Algunas bacterias pueden
crecer bien en casi cualquier medio de cultivo; otras requieren medios especiales
y otras no pueden crecer en ninguno de los medios inertes existentes hasta
ahora. Los microbios que se introducen en un medio de cultivo para que
comiencen a crecer se denominan inóculo (Tortora, Funke, & Case, 2007).

Dado que los microorganismos son ubicuos, los medios de cultivo deben ser
esterilizados antes de su empleo. En la actualidad, la mayoría de los medios de
cultivo se encuentran comercializados, normalmente bajo la forma deshidratada
que es preciso rehidratar. En general, la preparación de un medio de cultivo
consiste simplemente en pesar la cantidad deseada del mismo y disolverla en
agua desionizada libre de inhibidores del crecimiento, siguiendo las instrucciones
del fabricante. Las sustancias termolábiles se esterilizaron por filtración y se
añaden al resto de los componentes previamente esterilizados en autoclave.
Antes de su esterilización, los medios líquidos se distribuyen en los recipientes
adecuados; en ningún cado la altura del líquido en el recipiente debe exceder un
tercio del volumen total de este. Si es un medio sólido, habitualmente se procede
a fundir el agar en un baño María antes de ser esterilizado. Una vez fundido, se
distribuye en caliente en tubos, matraces o cajas Petri, se tapan y se esterilizan
(Gamazo, López, & Díaz, 2005).

- Siembra

Las poblaciones bacterianas homogéneas que normalmente se obtienen como

una población de bacterias descendiente de una sola bacteria (clon) se
denominan cultivos puros. Las técnicas para obtener cultivos puros a partir de
mezclas de bacterias, separando las diversas especies existentes en la mezcla,
reciben el nombre de técnicas de aislamiento. Si como resultado de la siembra
obtenemos colonias aisladas que nos permiten obtener cultivos puros, decimos
que hemos aislado un microorganismo (De la Rosa, Prieto, & Navarro, 2011).

- Tinción Gram

La tinción Gram es un tipo de tinción diferencial para la visualización de bacterias

(Universidad Pública de Navarra, 2006). Permite la distribución de bacterias en
dos clases: las que responden positivamente y las que responden negativamente
(Organización de las Naciones Unidad para la agricultura y la alimentación,
1995).
Las bacterias gram positivas retienen el colorante violeta de genciana luego de
la decoloración y se observan de azul intenso.
Las bacterias gram negativas no son capaces de retener las tinción violeta de
genciana luego de la decoloración y se tiñen de rojo con el colorante safranina
(Koneman, 2006).

3. Objetivos

- Objetivo general
Preparar medios de cultivo, sembrar e identificar bacterias de Bacillus subtilis y
Staphylococcus aureus.

- Objetivos específicos
 Realizar la preparación de la placa utilizando la técnica de cultivos sólidos.
 Usar el autoclave siguiendo los pasos adecuados.
 Identificar el tipo de crecimiento dado en cada medio de cultivo.

4. Hipótesis

Los medios de cultivo son propicios para el desarrollo y crecimiento bacteriano.

Materiales y métodos:

El siguiente procedimiento fue tomado de la Guía de Práctica de Laboratorio de

Microbiología.

- Preparación de los medios de cultivo

Se realizó medios de cultivo de agar nutriente (medio inclinado y en caja Petri),

caldo nutriente y medio SIM siguiendo las instrucciones de las etiquetas de cada
uno, haciendo una proporción a la cantidad que necesitamos; un paso común
entre estos fue el calentamiento de la mezcla (medio de cultivo con agua)
utilizando una plancha magnética y agitadores magnéticos. Se estuvo pendiente
para que la mezcla no se riegue al momento de hervir.
Cumplido este proceso, se llevó todos los medios a la autoclave a una
temperatura de 121 °C y 14 PSI.

- Dispensación del agar nutriente en las cajas Petri.

Se tomó el frasco de agar nutriente y se colocó cerca del mechero. Se abrió el

empaquetado de las cajas Petri y se etiquetó cada una de estas. Finalmente se
puso el agar sobre el caja hasta un poco más de la mitad y se dejó enfriar por
unos minutos.

- Siembra bacteriana.

a) Agar inclinado
Estando cerca del mechero, se tomó el tubo con Bacillus subtilis y se cargó el
asa siguiendo el método conocido. Se abrió el medio de cultivo inclinado, se
introdujo el asa y se frotó sobre el agar haciendo una forma de zigzag de adentro
hacia afuera sin topas las paredes del tubo. Se incubó por 24 horas a 37 °C.

b) Caldo nutriente
Estando cerca del mechero, se tomó el tubo con Bacillus subtilis y se cargó el
asa siguiendo el método conocido. Se abrió el medio de cultivo de caldo nutriente
y se introdujo el asa, se removió rápidamente por unos segundos, se sacó el asa
y se la esterilizó. Se incubó por 24 horas a 37 °C.

c) Medio SIM
Estando cerca del mechero, se tomó el tubo con Staphylococcus aureus y se
cargó la aguja de manera muy similar que la carga del asa. A continuación se
tomó el tubo SIM y se introdujo el aguja en al agar, dejando más o menos un
centímetro desde la base; se sacó inmediatamente de la misma forma en que se
introdujo y se esterilizó. Se incubó por 24 horas a 37 °C.

d) Agar nutriente en caja Petri

Estando cerca del mechero, se tomó el tubo con Staphylococcus aureus y se
cargó el asa siguiendo el método conocido. El asa cargada se pasó sobre el agar
de la caja Petri en forma de zigzag desde la parte superior hasta un tercio del
total de la caja y se esterilizó. Se pasó nuevamente el asa empezando en la parte
ya sembrada, se llenó el otro tercio de la caja y se esterilizó. Para concluir se
siguió el paso anterior llenando el último tercio de la caja y se esterilizo el asa.
Se incubó por 24 horas a 37 °C.

- Identificación bacteriana
Para identificar las bacterias se realizó el método para hacer frotis de un medio
sólido. Se efectuó el procedimiento de Tinción Gram: se cubrió por completo el
frotis con violeta de genciana, se esperó un minuto y se enjuagó con agua
destilada. A continuación se agregó yodo Gram por un minuto y se lavó
cuidadosamente. En seguida se decoloró gota a gota con solución decolorante;
se usó aproximadamente 18 gotas, nuevamente se enjuagó. Luego se añadió
safranina por un minuto y finalmente se lavó.
En el microscopio con el objetivo de 100x se observó la coloración de las
bacterias y se identificó el grupo al cual pertenecen.

- Siembra de un cultivo puro

Se tomó la caja Petri con Staphylococcus aureus, se la destapó y con la punta
de una asa bacteriológica se agarró una minúscula parte de una colonia.
Inmediatamente después, el asa cargada se trasladó a un tubo inclinado de agar
nutriente donde se froto la punta formando un zigzag de adentro hacia afuera sin
topar los bordes del tubo. Se incubó por 24 horas a 37 °C.

Resultados:

- Siembra bacteriana.
a) Agar inclinado
El tubo presentó crecimiento masivo en toda la superficie inclinada con
abultamientos en secciones específicas. Presentó un color amarillo patito.
 Figura 1. Agar inclinado con crecimiento masivo.

b) Caldo nutriente
Se identificó hilos muy finos que se formaron al agitar el tubo. El color del caldo
con Bacillus subitilis fue amarillo intenso.

Figura 2. Caldo nutriente con pequeños hilos.

c) Medio SIM
Se observó crecimiento justo en la parte donde se había insertado la aguja. El
color fue similar al del agar inclinado.
 Figura 3. Medio SIM con crecimiento bacteriano.

d) Agar nutriente en caja Petri

El cultivo de Staphylococcus aureus presentó crecimiento formando colonias
unidas y dispersas. La forma de zigzag estuvo bien definida. El color fue amarillo
tendiendo al anaranjado.

Figura 4. Caja Petri con crecimiento en forma de colonias.

- Identificación bacteriana

a) Bacillus subtilis
Luego de realizar el proceso de tinción Gram se notó bacterias en formas
alargadas con los bordes extremos redondeados. Se observó un color rojizo en
todas las células.
 Figura 5. Bacillus subtilis con endosporas teñidas de rojo.

b) Staphylococcus aureus
Se observó bacterias con forma circular, unas formando agrupaciones mientras
que otras estaban de forma individual. Se percibió un color azul violeta en todas
y cada una de las bacterias en la placa.

Figura 6. Staphylococcus aureus teñidas de azul.

- Siembra de un cultivo puro.

Luego de la incubación se observó una fina capa de crecimiento masivo en el
tubo con Bacillus subtilis, por el contrario en el tubo con Staphylococcus aureus
se identificó colonias y crecimiento uniforme en la forma de zigzag que se
inoculó.
 Figura 7. Cultivo puro de Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus respectivamente.

Discusión:

- Siembra bacteriana
a) Agar inclinado
El crecimiento masivo de Bacillus subtilis se debió a que estos microorganismos
presentan gran número de flagelos alrededor del cuerpo (Contreras, 2014).

b) Caldo nutriente
Se observó el tubo con caldo nutritivo un poco turbio en la base, esto significa
que hubo crecimiento bacteriano (Dora, 2012).

c) Agar nutriente en caja Petri

En este caso no se presentó crecimiento masivo de Staphylococcus aureus ya
que a diferencia de los bacilos los estafilococos no presentan flagelos (Negroni,
2009).

- Identificación bacteriana
En la figura, se observa estafilococos puesto que presenta una forma esférica
tipo cúmulo (García, Fernandez, & Paredes, 1994). Asimismo, el color azul
violeta de los cocos muestra que son gram positivos (Koneman, 2006).

Con la forma observada (forma alargada con bordes redondeados) en la figura,

se puede asegurar que la bacteria es un bacilo (Melloni, 1982). Su color rojo
coincide con el color de las gram negativas (Koneman, 2006).

Conclusiones:
  Los medios de cultivo facilitan el estudio de microorganismos simulando
su hábitat natural de crecimiento.
 Un medio de cultivo adecuado proveerá todos los nutrientes necesarios
para los microrganismos.
 La tinción Gram nos facilitó la identificación de los distintos grupos
bacterianos.
 La técnica para la preparación de placas resulta fundamental para poder
hacer la tinción y posteriormente la observación.

Bibliografía:

Contreras, R. (06 de 06 de 2014). El género Bacillus . Obtenido de

http://biologia.laguia2000.com/microbiologia/el-genero-bacillus
De la Rosa, M., Prieto, J., & Navarro, J. (2011). Microbiología en ciencias de la
salud . Barcelona : Editorial Elsevier.
Dora, J. (2012). Los microbios ¿amigos o enemigos? México D.F. : Fondo de
Cultura Económica .
Gamazo, C., López, I., & Díaz, R. (2005). Manual práctico de Microbiología.
Barcelona: Editorial MASSON .
García, P., Fernandez, M., & Paredes, F. (1994). Microbiología clínica práctica.
Jover, A., & García, M. (2003). Manual del auxiliar de farmacia. Sevilla: Editorial
MAD .
Koneman, E. (2006). Diagnóstico microbiológico. Madrid: Panamericana.
Melloni, J. (1982). Diccionario médico ilustrado de Melloni. . Madrid: Reverté.
Negroni, M. (2009). Microbiología Estomatológica. Buenos Aires: Editorial
Panamericana .
Olivas, E. (2004). Manual de prácticas de Microbiología y Parasitología. Ciudad
Juárez: Universidad de Ciudad Juárez.
Organización de las Naciones Unidad para la agricultura y la alimentación.
(1995). Manual técnico de la fijación simbiótica del nitrógeno . Roma:
FAO.
Tortora, G., Funke, B., & Case, C. (2007). Indroducción a la Microbiología.
Buenos Aires : Editorial Panamericana .
Universidad Pública de Navarra. (2006). Practicas de Microbiología general .
Obtenido de
http://www.unavarra.es/genmic/microgral/manual%20practicas%20micag
ral.pdf