“ Fatores Físicos e Químicos que

Influenciam a Fermentação
Alcoólica”
Prof. Clóvis Parazzi
 O que se deseja de um processo
fermentativo ?
ƒ Elevado Rendimento

ƒ Uniformidade na produção de metabólitos

pela levedura

ƒ Qualidade do produto final (cervejarias,

bebidas fermentadas e destiladas )
 FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA
Produtos e Subprodutos ( Jackman, E.A, 1987)
z Etanol ............................. 45 - 49 %
z CO2 ............................. 43 - 47 %
z Glicerol ............................. 02 - 05 %
z Ácido Succínico .................. 0,5 - 1,5 %
z Ácido Acético ...................... 0 - 1,4 %
z Ácido málico ....................... 0 - 0,3 %
z Biomassa ............................. 0,7 - 1,7 %
z Óleo Fúsel .......................... 0,2 - 0,6 %
z Butileno Glicol.................... 0,2 - 0,6 %
 LEVEDURAS ALCOÓLICAS
ƒ Saccharomyces cerevisae, S. elipsoideus, S.
anmensis, S. uvarum, Schizosaccharomyces pombe,
Hansenula ( Camhi,1979).

ƒ Leveduras de panificação ou selecionadas em

laboratório usadas na fermentação são inadequadas
por desaparecerem logo no início da safra e são
substituídas por outras oriundas da biodiversidade
ambiental. (Basso et.al., 1993).

ƒ Linhagens selvagens selecionadas pelo caráter de

dominância e persistência na indústria.
 FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA
PRINCIPAIS FATORES QUE AFETAM A FERMENTAÇÃO
f Substrato – composição química do meio
z produtos: açúcar, álcool, ácidos, etc.
z nutrientes: N, K, P, Mg, Mn, etc.
fMicrorganismo – constituição e estágio dos microrganismo
z leveduras e contaminantes.
f Condições físicas e ambientais
z Temperatura
z pH (acidez)
z aerobiose/anaerobiose
f Sistemas de fermentação
z contínuo e descontínuo.
f Outros
FATORES QUE LIMITAM A PRODUTIVIDADE

a) NUTRIENTES MINERAIS ´ N, P, K, Mg, Zn, Mn

b) AGENTES TÓXICOS ´ ALUMÍNIO, SULFITO, EXCESSO K+ e Ca++

c) TEMPERATURA ELEVADA

d) CONCENTRAÇÃO DE ETANOL

e) ACIDEZ (pH)

f) PRESSÃO OSMÓTICA ´ AÇÚCARES E SAIS

g) CONTAMINAÇÃO ´ BACTÉRIA e LEVEDURAS

Condições estressantes para a levedura

Como as Leveduras Respondem
as
Mudanças do Meio
LEVEDURA – CONDIÇÕES ESTRESSANTES

Nutrientes Pressão
Osmótica

Temperatura
pH
Álcool

metais pesados
Oxidantes
 TEMPERATURA
Efeito da temperatura
a) Fatores externos
Mudanças na temperatura da água, clima e mosto
b) Fatores intrínsicos
Calor liberado na fermentação

Influência da temperatura na variação do tempo de geração e do

coeficiente específico de crescimento para a linhagem da
levedura Saccharomyces cerevisiae

Temperatura Tempodegeração(h) Coef. espec. decresc. g/l/h-1

20 5 0.15
24 3.5 0.21
27 3.0 0.30
30 2.2 0.31
36 2.1 0.29
38 - 0.19
40 4.0 -
 TEMPERATURA
Efeito interativo de temperatura e espécie de levedura
 TAXA DE CRESCIMENTO X TEMPERATURA

Fonte: LALUCE et.al., 1995.

 TEMPERATURA DA FERMENTAÇÃO

¾ Influência direta sobre a fermentação

¾ Favorece multiplicação bacteriana
¾ Floculação
¾ Acima 35o C afeta desempenho da levedura
¾ Redução da viabilidade de leveduras
¾ Diminui rendimento da fermentação

hTemperatura ótima
• Crescimento ........... 30 a 34°C
• Fermentação............32 a 36°C
 TEMPERATURA X VIABILIDADE

95,0

VINHO VIABILIDADE
94,0

93,0

92,0

91,0

90,0

89,0
32,8 33,3 33,8
VINHO TEMP. MÁXIMA
Y = 244,57798 - 4,54762 X (* r = -0,80498)

Fonte: Fermentec, 2002

TEMPERATURA FERMENTAÇÃO X CONTAMINAÇÃO VINHO

194

VINHO BAST. x 10^6

144

94

44

-6

-56
32,0 33,0 34,0 35,0 36,0 37,0
VINHO TEMP. MÁXIMA
Y = -1721,24045 + 52,10960 X (** r = 0,78442)

Fonte: Fermentec, 2002

 pH
$ Crescimento ÄpH 3.0 a 8.0
$ Produção de Biomassa Ä pH 4 a 6.
$ Fermentação Ä pH Inicial 4,2 a ,5,1 Ä Reduz a pH 3,9-4,1.

Produção de etanol por Saccharomyces cerevisiae em função do tempo de cultivo

em melaço de soja (Ayube M. A Z., 2002).
EFEITO DO pH NA ATIVIDADE DA INVERTASE DE
LEVEDURA

--- invertase purificada

___ célula intacta
ATIVIDADES DE INVERTASES

H2 O FRUTOSE
O
+
INVERTASE
GLICOSE

SACAROSE
 Condições Ambientais
(Substrato x Produto)
Efeitos da concentração de etanol e glicose
sobre o metabolismo de S. cerevisiae.

>16%

<10%
VIAS DE DEGRADAÇÃO DE CARBOIDRATOS E A PRODUÇÃO DE ETANOL.
 FATORES INTERFERENTES NO METABOLISMO DA LEVEDURA.

(>16%)
Efeito da condição ambiental sobre o
comportamento metabólico em S.
cerevisiae

(<10%)

Gráfico de velocidades de
consumo de açúcar, produção de
etanol e crescimento de leveduras
numa fermentação alcoólica

(HORAS)
a) Glicose
•1 > 15,0% (150 g/L) → inibe enzimas fermentativas.
•1 de 0,3 a 10% → inibição seletiva da respiração.
•1 ≅ 5% em meio aeróbico → via fermentativa completa
(mitocôndria é reprimida e citocromo não funcionais).
•1 glicose ¾ e oxigênio½ alto → catabolismo oxidativo /
respiração (não há fermentação) → efeito Pasteur

b) Oxigênio / Agitação
•1 aeração moderada auxilia na suspensão das células
mais do que efeito direto do oxigênio (maior superfície de
contato).
•1 É capaz de induzir a respiração na dependência de
concentração de glicose do meio.
 GLICOSE
y CRESCIMENTO Ä 2% a 5% de açúcar no meio (biomassa).
y CONCENTRAÇÃO LIMITE Ä 25 A 30%
• Produção de etanol passa a ser prejudicada
• Biomassa diminui.
c) Efeito da concentração de Etanol
•1 inibe a atividade metabólica e leva a morte (sem
condição de sobrevivência);
•1 limite no vinho → 12% de álcool → variável (espécie e
linhagem de leveduras e condições da fermentação).

Influência do etanol na fermentação (Franz, 1961)

O Estresse da levedura

TIPOS ♥
¾Térmico - temperaturas elevadas

¾Oxidativo - produtos de oxidação

¾ Osmótico - presença de sais,alcoois, etc,

™Principais fatores que podem induzir à
levedura ao estresse

* características operacionais
S A-1

* composição química do mosto

* presença de sais (excesso de potássio no meio)

* concentração de álcoois superiores (isoamílico)

* deficiência de nutrientes (N)

 Choque Osmótico
ƒ A levedura produz glicerol para se defender
ƒ A resposta leva cerca de 1 minuto
ƒ O glicerol tem a função de osmorregulador
ATIVIDADES DE INVERTASE
Pode levar ao estresse osmótico

H2 O FRUTOSE
O
+
INVERTASE
GLICOSE
(2 MOLÉCULAS)
SACAROSE
(1 MOLÉCULA) MAIOR PRESSÃO
OSMÓTICA
Diferença Entre Linhagens
Consumo de Açúcar (Alves, 2000)
ÁCIDO MÁLICO

GLICEROL
 LEVEDURAS COM DIFERENTES ATIVIDADES
DE INVERTASE.

• PODE SE OBTER MELHOR DESEMPENHO DAS

LEVEDURAS EVITANDO O CHOQUE OSMÓTICO.

• LEVEDURAS - ALTA ATIVIDADE DE INVERTASE -

DEVE-SE ALIMENTAR MAIS VAGAROSAMENTE.

• LEVEDURAS - BAIXA ATIVIDADE DE INVERTASE

PODE – SE ALIMENTAR EM MENOR TEMPO.
 NUTRIENTES

Esquema geral do
metabolismo da levedura
 K+ Mg ++ (1) GLUCOSE P TREALOSE
P GLICOGÊNIO

SA
P (RESERVA)
S
FRUTOSE P
MA

NADP+ ATP
O
BI

NADPH+ NH4+
H+ ADP
ÁCIDOS PENTOSES Mg++
NUCLEICOS
FRUTOSE P - P
K+
Zn++
DIHIDROXIACETONA P (2) GLICERALDEIDO P
NADH + H+
NAD Cu++ PIRUVATO
P Fe+++
GLICEROL Mg ++ ALDEIDO ACÉTICO
K+Mn++ NADH + H+
PROTEÍNAS AMINOÁCIDOS NAD Zn++
E ENZIMAS S N CO2
ETANOL
SUCCINATO Pulmão Mn++
ALDEÍDOS ácidos CO2
(KREBS)
ÁCIDOS GRAXOS ESTERES
ALCOOIS
Nutrientes Funções
K Ativador enzimático inclusive de reações da glicólise; estabilizador de membranas;
necessário para a absorção do H2P04 aumenta a tolerância para iônios tóxicos,
inclusive H, controlando o pH intracelular; participa da absorção, por troca, de
catiônios bivalentes (Zn e Co).
Mg Ativador enzimático no processo glicolítico de transferases e carboxilases; estimula a
absorção de H2P04 incrementando a fermentação; mantém a integridade e
permeabilidade das membranas e regula o transporte de catiônios bivalentes. Sofre
ação antagônica do Ca++.
Ca Parece não ser importante para fermentações e multiplicação. Mantém integridade da
membrana plasmática em condições adversas. Ativa ATPase em concentração 1 mM,
mas se mostra inibidor a 10 mM. Inibe absorção de aminoácidos em conc. de 1 mM e
inibe o crescimento em conc. de 25 mM.
Ti Participa da glicólise e da síntese de vitaminas, sendo essencial ao crescimento e á
fermentação. Não é substituído por nenhum outro íon em suas funções; é integrante
de desidrogenases, aldolases e desulfidrases. A absorção é reduzida, em pH abaixo de
5 e é efetuada mediante troca com 2 íons K+.
Mn Estimula a síntese de proteínas e tiarnina; aumenta o teor de desidrogenase.
Fe Participa do sitio ativo de diversas enzimas (hemoenzimas). Requerido para
multiplicação na concentração de 1 a 3 μM. Concentrações de 10 a 15 μM inibem
crescimento e fermentação.
Cu Integrante de algumas enzimas; em concentrações de 1 a 1,5 μM estimula
fermentação e crescimento, já em conc. de 10 μM inibe o crescimento
Mo. Co, B Estimulam crescimento e fermentação em baixas concentrações (1μM). Inibição com
concentrações acima de 5μM.

Principais nutrientes e suas funções (fonte: Rodney e Greenfield (1984))

 NUTRIENTES

Condições de
estresse para Trealose

leveduras

Mudanças morfológicas na células de leveduras podem

ser entendidas como resposta ao desbalanço de
nutrientes do caldo de cana-de-açúcar (Kuriyama &
Slaghter, 1995).
Pseudo-hifas
9 Linhagens de Saccharomyces cerevisiae sofrem
transição dimórfica que envolve mudanças na forma
das células e no padrão de divisão celular, resultando
em crescimento filamentoso como resposta à
deficiência de nitrogênio (Gimeno et al., 1992);

9 Os produtos principais do catabolismo de

aminoácidos de cadeia ramificada, os chamados álcoois
superiores (óleo fúsel), são responsáveis pela transição
dimórfica das células (Dickinson, 1996).
 DEFICIÊNCIA DE NITROGÊNIO
(Silva & Parazzi, 2002)
Tabela 1 . Crescimento em meio sólido com ausência
de nitrogênio.
Linhagens Crescimento Pseudohifas

FL células agrupadas não presente

SM4 formação de cachos não presente

SL3 pouco agrupadas presente

Pseudo-hifas

Crescimento Normal Crescimento com pseudo-hifas

Pseudo-hifas
 LEVEDURAS DIMÓRFICAS
Alterações na forma das células e no padrão de
divisão celular.
*Crescimento filamentoso (Pseudohifas).
¬ deficiência de nitrogênio
¬ produtos do catabolismo de aminoácido álcoois
superiores, “’oleo fúsel” - estresse metabólico
¬ mudanças genéticas
(Kuryama & Slaghter, 1995; Dickinson, 1996)
* Ocorrem principalmente:
¬ culturas em meio sólidos
¬ culturas contínuas.
 COMPOSIÇÃO DO CALDO
Concentração de Potássio no caldo

Meio Ä caldo extraído da cana-de-açúcar

Concentração de K2O no caldo
Ä 1,44g/L - tratamento (T)
Ä 2,47g/L – tratamento (P1)
Ä 3,35g/L tratamento (P2).
 Tabela 2. Resultados obtidos após fermentação.

Massa Seca* ART vinho* Ef.Fermentativa*

(g/100mL) (g/100mL) (%)

Lev/
P1 P2 T P1 P2 T P1 P2 T
Trat

FL 5,72 5,42 8,69 1,81 3,61 1,18 80,31 79,91 72,16

SL3 3,86 2,82 3,80 3,18 4,18 2,63 72,42 64,16 74,20

SM4 3,90 2,35 5,18 3,17 4,26 2,68 61,40 56,41 66,16

Média 4,49 3,53 5,89 2,72 4,02 2,16 71,38 66,82 70,84

* diferenças significativas a 5% de probabilidade entre tratamentos,

levedura e interação leveduras x tratamentos.
 100

80

60 FL
40 SL3
SM 4
20

0
P1 P2 T

Eficiência Média de três ciclos fermentativos (%).

 LEVEDURAS COM ALTO DESEMPENHO
FERMENTATIVO
h SUPORTAR OS ESTRESSES DA FERMENTAÇÃO
INDUSTRIAL COM RECICLO DE CÉLULAS.

9 ALTAS TEMPERATURAS
9 ELEVADOS TEORES ALCOÓLICOS
9 TRATAMENTO ÁCIDO
9 PARADAS (FALTA DE AÇÚCAR)
9 SULFITO, ALUMÍNIO, ETC
9 PRESSÃO OSMÓTICA
9 CONTAMINAÇÃO BACTERIANA

h SUSTENTAR ALTA VIABILIDADE CELULAR DURANTE

RECICLOS E APRESENTAR BOA EFICIÊNCIA EM
ETANOL.
 Comentários Finais
ƒ Um pouco de estresse “é bom”
ƒ Leva à adaptação e tolerância pelas leveduras às
mudanças do meio
ƒ Células em proliferação são mais sensíveis
ƒ Afetam o desempenho do processo industrial
CLÓVIS PARAZZI
parazi@cca.ufscar.br