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FISIOLOGÍA DE LAS

LEVADURAS
EQUIPO 11
GONZÁLEZ RÍOS LUIS
PAREDES SANCHEZ DIEGO RUBIO
RUBIO MARTINEZ LUIS ANGEL
• Conocer las necesidades fisiológicas de las levaduras.

• Comprender y realizar las técnicas de auxonograma y zimograma,


para la identificación de levaduras.

• Conocer la importancia clínica e industrial de identificar levaduras.


Entidades
Hifas y
microbiológicas
pseudohifas
independientes.

Pluricelulares
Unicelulares

Citoplasma
(vacuolas y el Mesofilas
núcleo)
CRITERIOS IDENTIFICACIÓN DE
LEVADURAS
● División: Deuteromycota

● Tamaño de 3 a 15 Micras

● Crecimiento cremoso o bacteriforme

● Hongos unicelulares con membrana y pared celular (quitina).

● Pueden ser globosas, ovoides, elongadas, rectangulares y triangulares.

● Mesófilas (Temperaturas de crecimiento entre 20 y 48 ºC).

● Medios neutros y ligeramente ácidos ( Rango de pH optimo es de 4.5- 6.5.

● Aerobios y anaerobios facultativos.

● Reproducción por gemación, esporulación o fisión.

● Fuente básica de alimentación: glucosa, fructosa, sacarosa y maltosa.


● Reproduccion sexuada o teleomorfica ● Reproducción asexuada o anamórfica
○ Mediante ascosporas ○ Gemacion
○ Basidiosporas ○ Fision transversal ( binaria)

● Levaduras verdaderas: Reproducción por ambas formas.


● Células levaduriformes : Reproducción por gemación o blastoconidios.
Criterios macroscopicos
Estos criterios tienen en cuenta el aspecto de las colonias de las
levaduras que crecen en los diferentes medios de cultivo.

Las colonias en agar glucosado de Sabouraud son ligeramente


abombadas o planas, de consistencia mantecosa, lisa o rugosa, con
olor agradable y se tornan pastosas a medida que envejecen
Medios de cultivo
● Fundamento
Los nutrientes básicos permiten el crecimiento de la mayoría de hongos, el
pH ácido del medio (5.6) inhibe el crecimiento de bacterias contaminantes .
Se puede complementar con cloranfenicol para mejorar la selectividad del
medio.
● Uso
Se utiliza para el aislamiento, identificación, mantenimiento y recuento de
levaduras.
● Componentes

● Digerido pancreatico de caseina ……………………….... 5,0 g


● Digerido péptico de tejido animal ………………………… 5,0 g
● Dextrosa ……………………………………………………. 40,0 g
● Agar ………………………………………………………….. 15,0 g
● Fundamento
La infusión de papa estimula el crecimiento exuberante de las levaduras y la
producción de pigmentos en algunos dermatofitos.
Se puede agregar ácido tartárico (pH 3.5) para inhibir crecimiento de
bacterias.
● Usos
Aislamiento, identificación y conteo de levaduras presentes en alimentos,
productos lácteos y cosméticos.

● Infusion de papa ………………….…… 4g


● Dextrosa ……………………...….……. 20 g
● Agar …………………………….…….... 15 g
● Fundamento
La DOPA contenida en la infusión de alpiste negro (Guizotia abissinica) es
convertida a ácido cafeínico, el cual genera pigmentos color café-marrón.
● Uso
● Utilizado para aislar y diferenciar a Cryptococcus neoformans y C.gattii, de
otras especies de Cryptococcus spp .

● Glucosa ……………………………………. 10 g
● Creatinina ……………………………….. 0.78 g
● Infusión de alpiste negro …………………. 70 g
● Cloranfenicol ……………………….…… 0.05 g
● Agar …………………………………….….. 20 g
● Difenilo ………………………………….… 100 g
● Fundamento
La sal de bismuto y el sulfito son reducidos por las levaduras, formando un
precipitado color café a negro, el cual tiñe a las colonias.
● Uso
Aislamiento y diferenciación de especies de Candida spp.

Componentes

● Citrato de amonio y bismuto ……….…………… 5.0 g


● Sulfito de sodio …………………………………. 3.0 g
● Dextrosa ……………………………...………… 10.0 g
● Glicina ………………………………..…………… 10 g
● Extracto de levadura ……………………...…….. 1 g
● Agar ……………………………………….…….. 16 g
● Fundamento
La baja cantidad de carbohidratos simples y el agente tensioactivo
estimulan la formación de pseudohifas y clamidosporas.
● Uso
Aislamiento y diferenciación de especies de Candida spp basándose en las
características miceliales.

● Harina de maiz
● Agar
● Tween 80
● Agua desionizada
METODOLOGIA
PRODUCCIÓN DE CLAMIDIOSPORAS

1 2 3 4

Dividir la caja de AHM Incubar a 37°C/24-48h Tomar una muestra de Observar al


y sembrar en forma de la colonia, microscopio
Z. colocarla en un
portaobjetos y
agregar solución salina
Diseñados para

Aislamiento e
identificación de
algunas especies del
género Candida

Incubacion Fundamento
30-37°C durante 24 a 48
horas Se basa en la
detección de
determinadas act
enzimáticas mediante
hidrólisis de sustrato
cromogénico
CHROMagar Candida Medium
Vestibulum congue
Componentes Fundamento
tempus
Peptona……………………....10g
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Agar……………………………...15g Se basa en la detección de determinadas
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Glucosa…………………….….20g
sed do eiusmod tempor.
actividades enzimáticas mediante la
Cloranfenicol……………..500mg hidrólisis específica de un sustrato
Mezcla cromogénico en presencia de u indicador
Cromogenica………………….2g de la enzima. Cuando enzimas
Agua desionizada…………..1L especificas descomponen sustrato ligado
pH 5.9±0.2 a gpo cromogenico, se produce color

Interpretación de las colonias

C. albicans son lisas y de color verde esmeralda; C. krusei rugosas con el centro rosa
y borde blanco; C. tropicalis color azul verdoso a azul metálico; C. glabrata color
violeta.
Colonia de C. albicans en CHROMagar Colonia de C. tropicalis en CHROMagar
Pseudohifas
● Son estructuras formadas a partir de gemaciones incompletas de las
levaduras.
● Se produce cuando el medio es escaso en nutrientes ( condiciones adversas )
● Todas las especies patógenas oportunistas de candida producen pseudohifas.
● Solo C.albicans y C.dubluniensis producen clamidosporas.
Prueba del tubo germinal
● Técnica utilizada para diferenciar especies de Candida spp.
● Consiste en la formación de tubos germinativos cuando una fracción de la
colonia aislada se incuba a 37°C durante 3 horas en suero de humano o de
conejo.
Especies que producen tubo germinal :
● Candida albicans

El tubo germinal es una extensión


filamentosa de la levadura, sin
estrechamiento en su origen, cuyo
ancho suele ser la mitad de la célula
progenitora y su longitud tres o cuatro
veces mayor que la célula madre
METODOLOGIA
TUBO GERMINAL

1 2 3 4

En dos tubos de Inocular una asada de Tomar una gota de Observar al


ensaye, colocar 1mL cada cepa e incubar cada tubo en un microscopio
de suero a 35°C/3h portaobjetos y cubrir
Auxonograma
Fundamento
Se fundamenta en la aplicación por separado de diferentes nutrientes
hidrocarbonados y nitrogenados, sobre un medio sintético base, para apreciar el
crecimiento selectivo de una levadura en la cercanía de los nutrientes
necesarios para su desarrollo.
Medios base
● Medio sin carbono. Sulfato amónico (5 g/l),
Fosfato monopotásico (1 g/l), Sulfato de magnesio
(0,5 g/l), Agar (20 g/l).

● Medio sin nitrógeno. Glucosa (20 g/l), Fosfato


monopotásico (1 g/l), Sulfato de magnesio
(0,5 g/l), Agar (20 g/l)
Procedimiento
Interpretacion
En la zona circulante a los pocillos o los discos,
crecen abundantes colonias de levaduras si utilizan
el nutriente correspondiente; por el contrario,
no aparecen en los contornos de los no utilizados.
La intensidad del cultivo periférico se expresa
mediante cruces:
5 mm de radio (+), 5-10 mm (++), >10 mm (+++).
Zimograma
Fundamento
Se fundamenta en la capacidad de las levaduras de fermentar diferentes
azúcares para producción de energía en condiciones de anaerobiosis. Dicha
fermentación se observa a través del vire del indicador pH (aumento de la
acidez) y producción de gas CO2.

Medio

El medio se inocula en un tubo de ensaye con caldo


de una solución de carbohidrato al 20% con
indicador pH púrpura de bromocresol y con una
campana de Durham invertida en el interior.
Interpretacion

Procedimiento La fermentación positiva se observa


por la acumulación de gas (CO2) en la
campana de Durham y el viraje del
indicador púrpura de bromocresol del
violeta al amarillo.

Procedimiento

1- Distribuir en cada tubo con el medio para


zimograma la cepa.
2-Incubar a 37°C de 24-48 horas.
3- Interpretar el contenido de los tubos indicado si se
presentó o no la fermentación.
Sistemas comerciales para la identificación
de levaduras
Estos sistemas se basan en la asimilación de carbohidratos

API 20C (bioMerieux):

● Se compone de 20 cápsulas: 19 contienen


carbohidratos deshidratados y la primera cápsula es
control

● La lectura de prueba genera un código numérico que


facilita la identificación de 34 especies de levaduras
distintas.

● El crecimiento se produce si presenta capacidad de


utilizar dicho sustrato
Sistema Uni-Yeast-Tek (Remel)
Es una placa sellada con compartimientos múltiples que contienen un medio con agar para la
asimilación diferencial de 7 hidratos de carbono, la producción de ureasa y la morfología en agar harina
de maíz.

Azul a amarillo = positividad para asimilación de azucares.


El cambio de azul a verde para la reducción de nitratos

Clamidoconidios
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Medio
Agar Urea de Christensen que
contiene indicador rojo de fenol
PRODUCCIÓN DE UREASA.

Fundamento Procedimiento Interpretacion

Se basa en la 1- Inocular por estriado la


capacidad de las superficie del agar Urea
de Christensen con la
levaduras de producir
ayuda de un hisopo.
ureasas las cuales 2-Incubar a 37°C de 24
hidrolizan a la urea horas.
liberando amonio 3- Interpretar el contenido
alcalinizando el de los tubos indicado si
se presenta o no la
medio.
actividad de ureasas.
UTILIDAD
Identificación de Cryptococcus neoformans.
Prueba de la enzima Nitrato-reductasa
Fundamento
Se basa en la capacidad de las levaduras
de reducir el ion nitrato al ion nitrito
Utilidad

Identificación de Cryptococcus
neoformans
Prueba de la Fenol-oxidasa (L-dopa-citrato férrico)

C. neoformans produce Vestibulum nec congue tempus

fenol-oxidasa, una Lorem ipsum dolor sit dolor amet, consectetur nec
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enzima necesaria para facilisis lacus eget sit nec lorem mauris.
el metabolismo de la
3,4-dihidroxifenilanina
(DOPA) y otros
compuestos fenólicos
en la síntesis de la
melanina.
MATERIAL

Biológico:
Otro:
● Cepa de Candida albicans
● Mechero
● Cepa de Candida stellatoidea
● 5 pares de hisopos estériles
● 3mL de suero humano, carnero
● Microscopio
o conejo
● Portaobjetos y cubreobjetos
MEDIOS DE CULTIVOS A EMPLEAR
• Una caja con agar harina de • Un tubo con solución estéril de
maíz (AHM) carbohidratos (maltosa,
sacarosa, trealosa, lactosa,
• Dos cajas de agar base de
glucosa, manitol, galactosa)
levaduras + púrpura de
bromocresol% • Dos tubos con solución salina
estéril al 0.85%
• Dos tubos con caldo (maltosa,
sacarosa, trealosa, lactosa,
glucosa, manitol, galactosa) +
PBC con campana de Durham
Aplicaciones en Q.F.B

Farmacia industrial

Uso a nivel industrial de levaduras como Saccharomyces cerevisiae en el


proceso de fabricación de pan, cerveza y vino; así como su uso para la
fabricacion de antibioticos
Bioquímica clínica

Permiten la identificación y diagnóstico de hongos patógenos oportunistas


como Candida albicans y Cryptococcus neoformans.
Farmacia hospitalaria

Monitoreo de preparaciones parenterales


REFERENCIAS

● Linares MJ, Solís F. Identificación de levaduras. Revista Iberoamericana de


Micología. 11(1): 1-20.
● Bonifaz T. J. A. Micología médica básica. 4ta edición. México: McGraw-Hill;
2012.
● KonemanE. Diagnóstico microbiológico. 5°ed. Buenos Aires: Médica
panamericana; 2003.
● Mendoza M. Importancia de la identificación de levaduras. Revista de la
Sociedad Venezolana de Microbiología. Junio 2005;25(1): 103-117.
METODOLOGIA
ZIMOGRAMA

1.Inocular la cepa en el tubo que 3.Interpretar si hubo


contiene el CHO y púrpura de fermentación
bromocresol

2.Incubar a 37°C/24-
48h
METODOLOGIA
AUXONOGRAMA
3.Humedecer los
1.Suspender cada discos de papel filtro 5.Incubar a 37°
cepa en solución con cada solución de C/24-48h
salina estéril. CHO

20XX 20XX

20XX 20XX

4.Quitar el exceso y 6.Interpretar si hubo


2.Tomar el inóculo con un o no crecimiento
colocarlos sobre la
hisopo y sembrar
caja ya sembrada
masivamente.