Obtención e Identificación de Microalgas

Las microalgas son un grupo de microorganismos eucariotas a excepción de las Cianobacterias,

capaces de crecer de manera autotrófica u heterotrófica. Se encuentran en casi todo tipo de hábitats

conocidos, principalmente en hábitats acuáticos. Son capaces de crecer en ambientes donde otros

cultivos no podrían hacerlo, en zonas costeras o desiertos, esto se debe a su rápido crecimiento y

facilidad de división celular. Son organismo fotosintéticos capaces de transformar la energía

luminosa y transformarla en energía química, de esta manera sintetizar reservas de energía como

carbohidratos y lípidos, también pueden producir proteínas y generar biomasa. La producción de

biomasa de microalgas ha proporcionado una amplia gama de productos biotecnológicos con usos

en la industria alimenticia, salud y medicina humana, alimentación animal, compuestos orgánicos

y biocombustibles.

Recolección de la muestra:

La recolección de la muestra se realizó el 18 de abril del año 2016 alrededor del mediodía. Se

extrajo la muestra del lago del Jardín Botánico de Medellín Joaquín Antonio Uribe. Debido a que

las microalgas tienen facilidad para crecer en ambientes secos, se espera que la concentración de

microalgas en esta muestra no se vea afectada por las condiciones climáticas de la época en la que

se recolecto, ya que nos encontrábamos en días de altas temperaturas y sequías. La muestra

presentaba una coloración verde, lo cual indica que había presencia de microalgas clorofitas. La

muestra se deja en reposo en un lugar fresco con el recipiente que la contiene sellado.

Bioprospección y aislamiento del microorganismo:

La siembra y aislamiento de las microalgas recolectadas del Jardín botánico se realizó el día 19 de

abril del año 2016. Se empleó el método de siembra por disoluciones sucesivas junto con el método
de siembra por estría. La muestra de microalgas es la solución madre de la cual se toma una alícuota

de 1 ml que se diluyen en 9 ml de medio de cultivo CHU13. En esta dilución tenemos un número

de colonias de 10 ^-1 veces menor al que tendremos de la muestra directa. Se realizó una segunda

dilución tomando una alícuota de 1 ml de la dilución de 10 ^-1, en esta segunda dilución por tanto

se tendrá un número de colonias de 10 ^-2. En total se realizaron tres diluciones pero solo se

utilizaron diluciones de 10 ^-1, 10 ^-2 y la muestra directa de microalgas para la siembra de

colonias aisladas en medio de cultivo. La siembra de las colonias se realizó en cámara de flujo

laminar y con las debidas precauciones asépticas para evitar contaminación de las colonias. La

técnica empleada para la siembra en placa de Petri con medio de cultivo consistía en flamear el asa

con la cual se recolectaría la muestra de las respectivas diluciones y enfriarla en los bordes de las

paredes interiores de la caja Petri, esto anterior se realiza para esterilizar el asa, luego se procede a

tomar la muestra y se realiza una extensión sobre la placa en forma de estría. Una vez terminado

se procedió a guardar las diluciones y las colonias en placa Petri a temperatura ambiente y con

iluminación durante 7 días.

Caracterización del microorganismo:

Se realizó el 26 de abril del año 2016. Básicamente en este punto del proceso lo que se realiza es

la determinación del microorganismo, teniendo en cuenta dos aspectos, lo microscópico y lo

macroscópico. Con respecto a la parte microscópica se determina la forma, el tamaño y propiedades

de la pared del microorganismo. En la parte macroscópica se evalúa el color, la forma y el tamaño

de las colonias. Con lo anterior, en ésta caracterización se va a determinar diferente información,

tal como pureza del cultivo, morfología microscópica del cultivo de las microalgas. Las algas son

organismos fotosintetizadores que se encuentra principalmente en aguas dulces o saladas. Según la

especie, puede haber algas unicelulares, coloniales y multicelulares. La mayor parte de las algas
tienen un tamaño microscópico, que puede oscilar entre 10 y 300 µm, pero hay algunas de éstas

especies microscópicas que puede alcanzar un tamaño superior a 50 m de longitud. Históricamente

se han clasificado las algas, según su coloración, por ejemplo: las algas verdes son Clorofitas, las

oscuras son Feofitas, las algas rojas son Rodofitas y las pardas son Crisofitas. Existen las algas de

color “verde-azul”, las cuales son Cianofitas y también son microalgas procariotas. Algunas algas

están asociadas en la naturaleza con diferentes tipos de hongos. A dicha asociación simbiótica se

le conoce como líquenes. El hongo le da el soporte y absorbe minerales y nutrientes del suelo,

mientras que el alga a través de su acción fotosintética, aporta las moléculas orgánicas. El

procedimiento consistía en que en un primer momento se observar la morfología del

microorganismo macroscópicamente y describiendo cada una de sus características, luego se

observaba la morfología a nivel microscópico, en este se debía de tener en cuenta que como es con

respecto a las microalgas, ésta observación se realizó en fresco, lo cual quiere decir que se tomó

con un asa un poco de la muestra de microalgas, se le adicionó lugol y por último se observó en el

microscopio. De la primera parte del procedimiento que es la morfología macroscópica, se puede

decir que la colonia tiene una forma puntiforme, borde entero, una elevación plana y una superficie

superficial (Lo anterior se puede observar la figura 1).

Figura 1. Placa de Petri con las colonias de microalgas a partir de la muestra directa.
Se puede apreciar el color verde que indica la presencia de clorofila, dicho pigmento es

característico de aquellos microorganismos que contienen cloroplastos en sus células, por lo que

podemos afirmar que tenemos algas clorofitas. Para la segunda parte, que corresponde a la

observación microscópica de la morfología de las microalgas, observando rigurosamente en el

microscopio se identificaron las siguientes especies de microoganismos asociados a las microalgas:

Scenedesmus quadricauda, Scenedesmus intermedius, Scenedesmus ecornis, Cosmarium botrytis

y Sciderocellis sp. La Scenedesmus quadricauda son individuos coloniales, constituidos por 4, 8

ó 12 células. Las células centrales son alargadas y sin apéndices, las terminales, se abomban en el

centro y presentan dos espinas que se proyectan hacia el exterior. Las Cosmarium botrytis son

células solitarias con un profundo surco que las divide en dos hemicélulas. La superficie se

encuentra cubierta de pequeñas verrugas que le dan un aspecto característico. Las Siderocelis sp.

Es una especie que agrupa individuos con células elípticas que presentan numerosas verrugas

pardas en su exterior. El color pardo se debe a la inclusión de sales de hierro. En cuanto a la pureza

del cultivo, podemos afirmar que no es un cultivo puro, puesto que se presenta poblaciones mixtas

de microalgas, y un cultivo puro es aquel en el cual todos los microorganismos provienen una sola

célula.

Figura 2. Foto de la muestra de microalgas en el microscopio.

Preparación del medio de cultivo para el inóculo:

La preparación del medio de cultivo y la siembra del inóculo se realizó el 3 de mayo del año 2016.

Se trabajó un medio de cultivo definido y sintético, puesto que ya está estipulado los componentes

del medio de cultivo para microalgas, y su adecuado metabolismo. Se preparó 50 ml de medio de

cultivo líquido para el inoculo sacado de una de las colonias aisladas que ese encontraban en placa

Petri. Las soluciones y el stock estaban previamente preparados, por tanto solo tomamos las

cantidades indicadas en las tablas 1 y 2, las cuales se depositaron en un Erlenmeyer, la única

preparación que se tuvo que realizar fue la adición de bicarbonato de sodio a una concentración de

1g/L, para ello se realizaron los cálculos debidos para 50 ml de solución, y se obtuvo que había que

adicionar 0,05g de NaHCO3. Una vez adicionado se aforo con agua hasta completar un volumen

de 50 ml. En cámara de flujo laminar y con las debidas medidas asépticas para evitar la

contaminación del inóculo. La técnica usada consistía en flamear el asa, enfriar en los bordes de

las paredes internas de la placa Petri, y tomar la muestra de la colonia que tuviera buena densidad

celular y depositarlo en los 50 ml de medio de cultivo, se introduce el tapón y finalmente se guarda

a temperatura ambiente con iluminación. Stock Sustancia Concentración(g/L)

1 FeSO4. 7H2O 7,5*10-3

Sln 1. 0,05ml Na2EDTA 9,16*10-3
2 H3BO3 2,859*10-3
Sln 2. 0,05ml NaMoO4. 2H2O 0,05 *10-3,
CoCl2. 6H2O. 0,081*10-3
CHU Sln 3. 0,05ml Mn Cl2 1,146*10-3
CuCl2. 2H2O 0,054*10-3
13 Sln 4. 0,1ml ZnSO4 0,1234*10-3
3 K2HPO4 0,04
Sln 5. 0,1ml 4,1 MgSO4. 7H2O 0,1
4,2 CaCl2.2H2O 0,08
Sln.6 0,1ml 4,3 KNO3 0,2
5 NaHCO3 1

Tabla 1. CHU13 Tabla 2. Stock

Determinación de cinética de crecimiento y capacidad metabólica de metabolismo:

Después de siete días de haber sembrado el inóculo se comienza a realizar seguimiento diario. Se

toma alícuotas de 1ml del medio de cultivo que contiene al inóculo, el sistema se debía

homogenizar antes de tomar la alícuota. Se lee la absorbancia a una longitud de onda de 438 nm,

se utiliza como blanco agua destilada. También ciertos días se realizó conteo en cámara de

Neubauer. A partir de la tabla 3 se realizarán los cálculos de recuento celular, velocidad específica

y gráfico de absorbancia vs tiempo.

# Muestra Fecha absorbancia conteo observaciones
cuadro 1: 3
cuadro 2: 2
1 10/05/2016 0.153 coloración transparente
cuadro 3: 0
cuadro 4: 0
2 11/05/2016 0.055 coloración transparente
cuadro 1: 2
cuadro 2: 2
3 12/05/2016 0.141 coloración verde muy tenue
cuadro 3: 3
cuadro 4: 2
4 13/05/2016 0.408 coloración verde más apreciable

5 14/05/2016 0.528

coloración verde muy

6 17/05/2016 0.958 cuadro central: 14
pronunciada

Tabla 3. Datos obtenidos partir del seguimiento diario

𝐶 = 𝑁 ∗ 10 ^4 ∗ 𝑑𝑖𝑙

Ecuación 1. Concentración celular, conteo de células en los cuadros de 1 mm ^2 de las esquinas

𝑁
𝐶= ∗ 𝑑𝑖𝑙
(4 ∗ 10^ − 6)

Ecuación 2. Concentración celular, conteo de células en el cuadro central

C: Concentración celular cél/ml

N: Para ecuación 1 promedio de células presentes en 1 mm ^2. Para ecuación 2 promedios de

células presentes en los 5 cuadros pequeños del cuadro central

Dil: Dilución

# Muestra N Dil C
1 1,25 1 12500
3 2,25 1 22500
6 0,7 1 175000
Tabla 4. Resultados obtenidos usando ecuación 1 y ecuación 2, recuento celular.

Como podemos evidenciar la concentración celular fue aumentando con el pasar del tiempo,

puesto que si la absorbancia aumentaba, por la ley de beer, la concentración de los

microorganismos también debía de aumentar, también se puede evidenciar en el cambio notorio de

la coloración del medio, se empezó con un medio transparente, pero a medida que incrementaba la

concentración de microalgas clorofitas, la coloración verde era mas evidente.

1.2
1
Absorbancia

0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tiempo(días)

Figura 3. Gráfico de absorbancia vs tiempo

En el transcurso del primer al tercer día podemos observar en la figura 3 el periodo de latencia del

microorganismo, en esta fase el microorganismo se está adaptando al medio de cultivo, lo cual

explica la disminución de la absorbancia en el segundo día. A partir del tercer día comenzó la fase

exponencial de crecimiento, en la cual el microorganismo ya adaptado al medio, utiliza los

nutrientes proporcionados por el mismo medio y otras condiciones para su metabolismo y rápido

crecimiento. No se alcanzó a observar la fase estacionaria en la cual los nutrientes se comienzan a

agotar y la biomasa de microalgas permanece constante un lapsus de tiempo, para luego darse la

fase de muerte, en la cual los nutrientes ya se han agotado en su totalidad y los microorganismos

comienzan a morir, por tanto su población comenzaría a disminuir.

𝑑𝑁/𝑑𝑡 ∗= μN
Ecuación 3. Cinética de crecimiento celular para microorganismos.

dN/dt: cambio del número de microorganismos en el tiempo

μ: velocidad especifica de crecimiento celular

N: número de células

Si integramos a ambos lados de la ecuación y escogemos nuestros límites de integración

correspondientes a la fase exponencial que podemos observar en la figura 3, obtenemos la siguiente

expresión:

Ln(N/No)/ (t-to)= μ

Ecuación 4. Velocidad específica máxima.

Esta ecuación 4 representa la velocidad específica máxima de crecimiento, la cual se da en la fase

exponencial. Reemplazando los valores en la ecuación obtenemos:

Ln(14/9)/ (8-3)= 0,08836655/días

Conclusiones:

-En condiciones normales todas las clases de microalgas poseen invariablemente la clorofila-a que

confiere el color verde a las algas y al menos un pigmento accesorio, que puede ocultar en ocasiones

a la clorofila-a, por lo que a pesar de tener esta última, no es un indicativo de que su coloración

será verde.

-Es necesario que las microalgas sean guardas en un lugar iluminado puesto que estas son

fotoautótrofas, requieren de luz para poder sintetizar todas las sustancias esenciales para su

metabolismo, además de los nutrientes proporcionados por el medio de cultivo, lo cuales son

generalmente fuentes CO2, nitrógeno, fósforo, potasio, magnesio y otros nutrientes menores como

metales, los cuales son esenciales porque actúan como cofactor de enzimas esenciales del

metabolismo.

-Se puede afirmar que las microalgas son de crecimiento celular rápido, evidenciable en la figura

3 durante la fase exponencial.

Respuestas a preguntas:

1. ¿Qué relación existe entre la morfología macroscópica y la microscópica?

La relación que tienen es que ambas son importantes en la caracterización de un microorganismo,

aunque es mucho más efectivo el microscópico, ya que este permite dar una mayor cantidad de

información acerca de este.

2. ¿Por qué es importante la observación microscópica en un proceso biotecnológico?

Porque este permite la identificación de cada uno de las diferentes tipos de células que componen

dichos microorganismos y que tipo de procedimiento se debe de hacer, además también permite
saber si el microorganismo está infectado con otro diferente que tal vez pueda quitarle nutrientes y

hasta quizás matarlo.

Bibliografía:

Guías de las prácticas de laboratorio:

-Bioprospección y aislamiento de microoganismos con aplicaciones a ingeniería química.

-Caracterización macro y microscópica de los microorganismos.

-Preparación de medios de cultivos específicos.

-Determinación de cinética de crecimiento y capacidad metabólica de microorganismos.

Webgrafía:

17/05/16:

-http://www.ufjf.br/ppgpmi/files/2010/04/atlas-de-microorganismo2.pdf

16/05/16:

-http://tesis.uson.mx/digital/tesis/docs/20804/Capitulo1.pdf

-http://www.scielo.cl/pdf/revbiolmar/v49n2/art01.pdf

-http://www.publicacionescajamar.es/pdf/publicaciones-periodicas/cuadernos-de-estudios-

agroalimentarios-cea/5/5-642.pdf

- http://www.aulados.net/Botanica/Curso_Botanica/Algas_verdes/9_Chlorophyta_texto.pdf

- http://ingenieria.udea.edu.co/grupos/revista/instrucciones/instrucciones.htm