Microscopía 2016, 370 - 377 doi:

10.1093 / JMicro / dfw017

Acceso anticipado Fecha de publicación: Abril 28 el año 2016

artículo

La observación directa de la actina fi lamentan por microscopía

de fuerza atómica punta escanear
Akihiro Narita 1, 2, *, Eiji Usukura 1, Akira Yagi 3, Kiyohiko Tateyama 3, Shogo Akizuki 1, Mahito Kikumoto 1, TomoharuMatsumoto
1, YuichiroMaéda 1,
Shûichi Ito 3, y Jiro Usukura 1
1 Biología Estructural del Centro de Investigación, Facultad de Ciencias, Universidad de Nagoya, Nagoya 464-8602, Japón, 2 JST

PRESTO, 4-1-8 Honcho, Kawaguchi, Saitama, 332 a 0012, Japón y 3 I + D, Olympus Corporation, 2-3 Kuboyama-cho, Hachioji, Tokio

192-8512, Japón

* . ¿A quién debe dirigirse la correspondencia de correo electrónico: narita.akihiro@f.mbox.nagoya-u.ac.jp

Recibido el 23 de diciembre de 2015; Aceptado 28 de de abril de el año 2016

abstracto
actina fi lamenta, la actina - complejo miosina y la actina - complejo tropomiosina se observó por un microscopio de fuerza
atómica punta-scan (AFM), que fue recientemente desarrollado por Olympus como la parte AFM de un microscopio
correlativa. Este AFM recientemente desarrollado utiliza voladizos de tamaño similar como AFMs etapa de barrido para
mejorar sustancialmente la espacial y la resolución temporal. Este enfoque ha previamente nunca ha sido posible gracias a
un sistema de punta-scan, en el que un voladizo se mueve en la x, y y z direcciones. Se evaluó el rendimiento de este AFM
punta-scan desarrollado mediante la observación de la estructura molecular de la actina fi lamentos y la actina - tropomiosina
compleja. En la imagen de la actina fi lament, el intervalo molecular de las subunidades de actina ( ~ 5,5 nm) se observa
claramente como las bandas. A partir de la forma de las rayas, la polaridad de la actina fi lament se determinó directamente y
los resultados fueron consistentes con la polaridad determinada por la unión de miosina. En la imagen de la actina - complejo
tropomiosina, cada molécula de tropomiosina ( ~ 2 nm de diámetro) en la actina fi lament se observó directamente sin un
promedio de imágenes de diferentes moléculas. Cada molécula de tropomiosina en la actina fi lamentan nunca ha sido
observada directamente por AFM o microscopía electrónica. Por lo tanto, nuestra desarrollado AFM punta de exploración
ofrece signi fi potencial no puede puri en observación fi proteínas Ed y estructuras celulares en resolución nanométrica. Los
resultados actuales representan un paso importante en el desarrollo de un nuevo microscopio correlativo de observar
estructuras nm orden a una velocidad de fotogramas aceptable ( ~ 10 s / marco) por AFM en la posición indicada por el Florida colorante
fluorescente observada bajo un microscopio de luz.

palabras clave: La microscopía de fuerza atómica, AFM punta de barrido, microscopía correlativa, la actina fi lamentan, tropomiosina, citoesqueleto

El autor © 2016 publicado por Oxford University Press en nombre de la Sociedad Japonesa de Microscopía. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Reconocimiento No

comercial ( http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/ ), Lo que permite no comercial reutilización, la distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original esté debidamente citados. Por reutilización comercial, por
Microscopía 2016, Vol. 65, No. 4
introducción
microscopía de fuerza atómica (AFM) se ha convertido en una herramienta
indispensable en el fi campo de la biología siguiente su invención por Binning et
al. [ 1 ] Y el posterior desarrollo ulterior [ 2 ]. La novedad más destacada fue AFM
de alta velocidad (HS-AFM) desarrollado por Ando et al., que puede visualizar el
movimiento y los cambios estructurales de las proteínas y otras moléculas en
tiempo real (recientemente revisado en [ 3 - 6 ]). Este tipo de HS-AFM se basa en
un sistema de muestra-scan. La etapa se puede mover la muestra en el Z- dirección
para mantener una fuerza constante y en el x - y instrucciones para escanear la
muestra. HS-AFM No es necesario cambiar el x - y posición del voladizo y es
relativamente fácil de controlar y detectar la oscilación en voladizo para
detectar la superficie de la muestra, que es una de las razones por las que
tuvieron éxito en la invención de HS-AFM.
Aunque AFMs basados ​en un sistema de muestra-scan se ha utilizado para la
observación de las proteínas en las membranas plasmáticas [ 7 ], La aplicación de este
tipo de AFM se ha limitado a muestras puras in vitro, mientras que las estructuras
celulares no son objetivos adecuados. La etapa de exploración HS-AFM no puede
montar una muestra grande porque el escenario se mueve muy rápido para imágenes
de alta velocidad. Por ejemplo, un portaobjetos de vidrio estándar o hoja de la cubierta
no está disponible, lo que hace DIF fi culto al montaje de celda de AFM en el escenario.
Además, es necesario fi encontrar la posición de la celda en el escenario con un
microscopio de luz debido a que el área de escaneado de HS-AFM está severamente
limitada. Por desgracia, este tipo de HS-AFM también es dif fi culto para combinar con
microscopía de luz debido a la dif fi cultades en la integración de una etapa que se mueve
rápido.
En contraste, AFM basado en un sistema de punta-scan, en el que el voladizo
se mueve en la x, y y z direcciones y la etapa no se mueve, se ha aplicado a
observar estructuras celulares [ 8 - 11 ] Debido a que se puede combinar fácilmente
con cualquier tipo de microscopio de luz invertida sin limitaciones estrictas sobre el
tamaño de la muestra. Debido a que el de Florida reflejo de la pequeña de barrido en
voladizo en el x y y direcciones es dif fi culto a los sentidos, que había sido un desafío
para aplicar un pequeño voladizo, lo que limita el tiempo y la resolución espacial de
AFM punta de exploración. Un pequeño voladizo es esencial cuando se escanea
una muestra rápidamente a una alta resolución espacial. Olympus ha desarrollado
un sistema de regulación de controlar el voladizo y de este modo ha sido capaz de
reducir en gran medida el tamaño del voladizo. Como resultado, el tiempo de
resolución ha sido mejorada [ 12 ] Y el movimiento celular se ha visualizado por un
AFM punta-scan de nuevo desarrollo combinado con una Florida microscopio de luz
fluorescente. Olympus ha desarrollado un nuevo sistema llamado AFM BIXAM [ 13 ],
Que se basa en esta tecnología y utiliza un voladizo de tamaño similar como el
sistema HS-AFM de la muestra-scan, y mejora el tiempo y la resolución espacial de
forma espectacular. En este informe, se observa directamente la actina fi lamento, la
371
actina - complejo miosina y la actina - complejo tropomiosina por la parte de AFM de
BIXAM para evaluar el desempeño en la observación de estructuras moleculares.
Actina fi polaridad lament pudo determinarse directamente a partir de imágenes de
AFM, y cada molécula de tropomiosina en la actina fi Se observó directamente
lamento. Por lo tanto, nuestro nuevo AFM punta de exploración ofrece signi fi potencial
no puede puri para observación fi proteínas Ed y estructuras celulares a nivel
molecular.
métodos
proteínas
Actina, tropomiosina y miosina sub-fragmento 1 (miosina S1) fueron puri fi Ed de
músculo esquelético de conejo, como se describe anteriormente [ 14 - 16 ].
Preparación de las muestras para AFMobservation
actina fi lamento y actina - miosina
Actina (0,1 mg ml - 1) se incubó durante 30 min a temperatura ambiente en
tampón A [NaCl 50 mM, tampón fosfato de sodio 10 mM (pH 7,4), MgCl 1
mM 2, mM ditiotreitol 0,1 ATP y 1 mM (DTT)]. Glass desliza con 15 mm φ
ventanas circulares hidrofílicos rodeados por el marco impreso con tinta
negro hidrofóbica. (TF0215 ;. Matsunami Glass Ind, Ltd., Osaka, Japón) se
utiliza para aumentar af fi nidad hacia la actina fi lament, el portaobjetos de
vidrio se revistió con poli-lisina como sigue: el portaobjetos de vidrio se
lavó con etanol dos veces, después se lavó con agua pura dos veces y
una solución de poli-lisina (MW = 30.000 - 50.000; Sigma-Aldrich, St. Louis,
MO, EE.UU., 0,4 mg ml - 1 disuelto en agua) se aplicó y la corredera se lavó
tres veces con tampón
A. polimerizado actina se diluyó 10 veces con tampón A que contiene 1 μMphalloidin
y se aplicó a portaobjetos de vidrio de poli-lisina-revestido. La muestra sobre el
portaobjetos de vidrio se lavó entonces dos veces con tampón A que contiene 1
μMphalloidin.
para la actina - miosina, actina (0,1 mg ml - 1) se incubó en tampón B
[NaCl 50 mM, imidazol 10 mM - HCl buffer (pH
7,4), MgCl 1 mM 2 y 1 mM de DTT] durante 30 min a temperatura ambiente, se
diluyó 10 veces con tampón B que contiene 1 faloidina M y montado sobre el
portaobjetos de vidrio recubierta con poli-lisina. Se añadió Miosina S1 ( fi nal 0,01
mg ml - 1) a la solución de actina en el portaobjetos de vidrio y se incubaron
durante> 1 h para formar el complejo rigor a temperatura ambiente. La muestra
sobre el portaobjetos de vidrio se lavó dos veces con tampón B que contiene
faloidina 1 M y luego fi jado en tampón B que contiene 0,5% de glutaraldehído y 1
μMphalloidin.
actina - tropomiosina
Actina (0,24 mg ml - 1) y la tropomiosina (0,24 mg ml - 1) se mezclaron y se
incubaron durante 30 min a temperatura ambiente en
372
tampón A. La solución se diluyó 5 veces con tampón A que contiene 1 M
faloidina y 0,5% de glutaraldehído. Un pequeño trozo de mica recién
escindido se colocó en el centro de la ventana en el portaobjetos de vidrio
(TF0215). La solución de muestra se montó en la ventana en el portaobjetos
de vidrio con mica, se lavó dos veces con tampón a que contiene 1 faloidina
mu M, y después se añadió glutaraldehído a la solución ( fi nal concentración =
0,5%).
AFMmeasurement
El portaobjetos de vidrio con la muestra se montó en BIXAM, un tipo punta-scan
HS-AFM combina con un invertida Florida microscopio fluorescente. (IX73; Olympus
Corporation, Tokio) Para las mediciones con una resolución molecular, AFM se
establece en el modo de modulación de fase [ 12 ] Y pequeños voladizos blandos con
una constante de resorte de 0,1 N m - 1 se utilizaron (BL-AC10DS, BL-AC10EGS;
Olympus Corporation). El diámetro de la punta de exploración era de ~ 8 - 10 nm. Las
imágenes se recogieron con la velocidad ajustada a una trama por cada 10 s.
El análisis de imágenes
Para mejorar la relación señal-ruido de las imágenes de AFM, se tomaron más de dos
fotogramas secuenciales y un promedio para una región de interés. A la deriva y la
rotación se consideraron en el cálculo del promedio. Algunas de las imágenes se
multiplican por un fi ltro
Fig. 1. imagen AFM típico de la actina fi Una imagen AFM típico de la actina se lamentan. (A) fi lament antes de promediar. (b) Seis marcos se promediaron. La relación señal a ruido se ha mejorado
mucho. (c) Filtro para mejorar la señal de alta resolución. (d) b multiplicado por c en el espacio recíproco. Detalles en el actina fi lament se mejoraron. (e) Vista ampliada de la actina fi lament (b). La
hélice de paso largo a lo largo de la hebra se indica por las líneas de puntos blancos, y el intervalo molecular a lo largo de la hebra se indica por las flechas blancas.
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en el espacio de Fourier (Fig. 1 c) para conseguir información detallada de las imágenes
mediante la mejora de la señal de alta resolución.
simulación
la actina fi modelo lament [ 17 ] Se colocó a lo largo del y- eje en el ordenador.
Una esfera (un modelo para la punta de la aguja AFM) con diferentes
diámetros se generó en ( x, Y, z) Coordina. El primer z Era más grande que el
máximo z posición en la actina fi modelo lament + diámetro. A continuación, el z
Se disminuyó hasta la esfera tocó la actina fi modelo lament y la fi nal z se
representó como un valor de píxel en ( x, y) en la imagen simulada. Cuando 1
nm 3 de la esfera solapada con la actina fi lamentan modelo, hemos
considerado la esfera de estar tocando la actina fi lamento.
resultados
Una imagen AFM típico de la actina fi lamenta en el portaobjetos de vidrio
recubiertos con poli-lisina se presenta en la Fig. 1 . Actina forma una hélice de
doble cadena fi lamentar con un paso de hélice de 36 - 38 nm a lo largo de la
hebra, y la actina moléculas están dispuestas con intervalos de 5,5 nm en la
hebra [ 17 - 19 ]. La relación señal a ruido se ha mejorado (Fig. 1 a y b) promediando
fotogramas secuenciales, y la señal de la estructura dentro de la fi lamentos se
mejoró (Fig. 1 d) multiplicando los datos con el fi filtro (Fig. 1 c). rayas claras con
intervalos de 5,5 nmwere observaron
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Fig. 2. ( una - d) Simulación de imágenes AFM de la actina fi lament con 4, 6, 8 y 10 nm de diámetro de las
esferas se presentan en (a), (b), (c) y (d), respectivamente. Las letras ' B ' y ' P ' en (c) representan el lado del
extremo de púas y el lado extremo en punta, respectivamente. (e) Una AFM imagen real de la actina fi lament.
Se observó una forma similar de rayas en (c). Una unidad entre rayas está encerrada por una línea de negro
en (c) y (e).
Fig. 3. ( una - f) Galería de actina fi . Lament imágenes superiores imágenes :. imágenes originales Las imágenes de menor :. Una unidad entre rayas en cada imagen está rodeada por una línea de
negro La polaridad de la fi lament se determinó de acuerdo con la forma de las rayas y se indica por las letras ' B ' y ' P ', el lado de púas extremo y el lado extremo en punta, respectivamente. Dos, dos,
tres, tres, seis y seis marcos se promediaron para (a), (b), (c), (d), (e) y (f) , respectivamente.
373
en total fi lamenta, así como el patrón de hélice de paso largo de la actina fi lamenta
(Fig. 1 e). El intervalo de las rayas correspondía al intervalo molecular actina
en la hebra. Para evaluar detalles de las imágenes, simulamos la imagen
AFM de la actina fi lament (Fig. 2 ). La simulación con una esfera de 8 nm de
diámetro, un modelo para la punta de la aguja AFM, era muy similar a la
imagen real. Tanto las imágenes reales y la imagen simulada mostró
curvatura similar en las rayas. La actina
fi lament tiene polaridad, y los dos extremos - final de púas y el extremo puntiagudo - tener
diferentes propiedades en términos de polimerización y las tasas de
despolimerización [ 20 , 21 ]. Además, la mayoría de las miosinas se mueven hacia el
final de púas. Por lo tanto, la determinación de polaridad es a menudo esencial para
el estudio de las propiedades de la actina fi lamento in vivo [ 22 ] Y in vitro [ 23 , 24 ]. La
forma de las rayas re Florida refleja la polaridad de la actina fi lament, y la forma de la
cara cóncava corresponde al final de púas de la actina fi lament (Figs 2 y 3 ). La
polaridad determinada por la
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forma cóncava fue consistente con la polaridad determinada por la unión rigor este es el fi tiempo de cada primer tropomiosina en la actina fi lament se ha

miosina [ 25 , 26 ]. Quince cabezas de miosina unidos a la actina fi se observaron observado claramente sin un promedio de imágenes de diferentes moléculas.

lament con un ángulo de inclinación similar y todos ellos inclinado hacia el

extremo de púas (Fig. 4 ). Estos resultados estafadores fi rma la determinación
de la polaridad por la forma cóncava de las rayas.
discusión
actina - También se observó la tropomiosina. tropomiosina ( ~ 34 kDa) forma un Pudimos observar claramente rayas del intervalo de las subunidades de actina a lo
dimérica espiral de la bobina que abarca toda la longitud de una varilla ~ 40 nm de largo de la hebra ( ~ 5,5 nm) y la tropomiosina ( ~ 2 nm de diámetro [ 30 ]) En la actina fi
largo, y el vástago se une a la actina lament. Estas observaciones demuestran que BIXAM, un AFM punta-scan de
fi lamento lo largo de la hélice de paso largo [ 27 ]. En la imagen de la actina - complejo
nuevo desarrollo combinado con una Florida microscopio de fluorescencia, tiene suf fi-
tropomiosina (Fig. 5 ), Una masa alargada adicional se observó claramente, que
estaba ausente en las imágenes de la actina fi lament (Figs 1 y 3 ). De ello se resolución espacial ciente para las observaciones estructurales moleculares orden de
desprende la hélice larga tono de la actina fi lament, y las franjas de la actina fi lamentnanómetros. La resolución de tiempo de la AFM punta-scan, ~ 10 s / 1 de trama,
no se pudo observar en la masa alargada. Esto es obviamente tropomiosina, también es aceptable a pesar de que es mucho más lento que HS-AFM ( ~ 80 ms / 1
que ya se visualizó mediante análisis de una sola partícula o reconstrucción marco). Hay un informe observación de la actina fi estructura lament por un AFM
helicoidal [ 28 , 29 ], Pero punta-scan [ 31 ] En resolución similar. Sin embargo, se tardó varios minutos

Fig. 4. ( una - d) Actina - La unión complejos miosina S1. Miosina S1 se indica por las flechas blancas. Insets encerrados por líneas negras representan la misma posición encerrada por

líneas blancas. En inserciones, una unidad entre rayas en cada imagen está encerrada por una línea de negro. La polaridad se determinó por la forma de las rayas y se indica mediante

las letras blancas ' B ' y ' P '. Todas las moléculas S1 miosina se inclina hacia ' B '; el lado del extremo de púas determinado por la forma de la banda. cuatro, cuatro, nueve y

fi VE cuadros de imagen se promediaron para (a), (b), (c) y (d), respectivamente. El promedio de las imágenes se multiplicaron por el fi filtro (Fig. 1 c) en el espacio recíproco.
Microscopía 2016, Vol. 65, No. 4 375

Fig. 5. actina - complejos tropomiosina. (a) Una imagen AFM de la actina fi lament sin tropomiosina como control. Nueve marcos se promediaron. (b) Un ejemplo de la actina - imágenes tropomiosina.

Siete cuadros fueron promediados. (c - e) Galería del ampliada y de alta resolución enfatizó imágenes de actina - tropomiosina. La masa alargada debido a las moléculas de tropomiosina se indican

mediante las flechas blancas. Seven, tres y siete marcos se promediaron para (c), (d) y (e), respectivamente.

para una imagen debido a que la frecuencia de resonancia de su voladizo era 7
kHz en solución y es por lo tanto signi fi cativamente más lento que el instrumento
BIXAM presentado en este documento (400 kHz en solución) [ 12 ].
Aunque la cristalografía de rayos X, análisis de partícula única de alta
resolución y RMN han resuelto un gran número de estructuras biomoleculares, es
esencial para entender cómo tales biomoléculas están integrados en estructuras
celulares para ligarse estructuras atómicas de alta resolución para las funciones
fenómeno se mide por Florida La microscopía fluorescente. microscopía
correlativa [ 37 - 39 ] Implica observar la posición de la muestra por un microscopio
de luz y un microscopio electrónico y es un buen candidato para satisfacer este
propósito, que une las estructuras atómicas de las funciones celulares. Sin
embargo, la preparación de muestras y observaciones son mucho tiempo y dif fi culto
porque la preparación de muestras para microscopía electrónica y microscopía
de luz es completamente diferente.

celulares. Tomografía electrónica [ 22 , 32 - 34 ] Y por congelación grabado AFM basado en un sistema de punta-scan es otro buen candidato para

microscopía electrónica [ 35 , 36 ] Han puesto de manifiesto las estructuras y microscopía correlativa donde disposiciones moleculares y los agregados pueden ser

disposiciones moleculares en la célula en alguna medida. Sin embargo, sólo la observados directamente. Preparación de la muestra es mucho más fácil que la

forma de la molécula se puede observar en las tomografías o imágenes de EM, y microscopía de electrones porque la muestra se pueden observar en solución, y la

identi fi cación de moléculas en estructuras celulares complejas a partir de imágenes totalidad de la Florida tintes fluorescentes para microscopía de luz se pueden utilizar.

de EM es a menudo dif fi- Nuestra AFM punta-scan representa resolución y velocidad de marco espacial

satisfactoria y también es adecuado para microscopía correlativa práctica.

culto. Por otro lado, Florida etiquetado fluorescente se ha desarrollado

rápidamente, y este enfoque es adecuado para relativamente fácil identi fi cación de

las moléculas en la célula. Muchas de las funciones y de los fenómenos celulares Sin embargo, el microscopio de luz actual en BIXAM no tiene sensibilidad
han sido observados por Florida microscopía fluorescente, y sería altamente y resolución satisfactoria. Acoplamiento con un microscopio de luz no es trivial
deseable para observar estructuras moleculares en la posición donde un especial aunque es mucho más fácil que usar AFM etapa de exploración. Inmersión en
aceite, que es
376 Microscopía 2016, Vol. 65, No. 4

requerido para microscopía óptica de alta resolución, necesita cristal fino para 8. Chacko JV, Zanacchi FC, Diaspro A (2013) Probing estructuras del citoesqueleto mediante el

montar muestras. Este cristal fino tiende a vibrar debido a la oscilación de la acoplamiento de las técnicas de superresolución y AFM ópticos para un enfoque

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aguja AFM y limita la resolución AFM. Como superar el uso de cristal fino en
el escenario es el paso más importante en la realización de un microscopio
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A recientemente desarrollados AFMwas punta de escaneo capaz de visualizar el

intervalo de actina molecular (5,5 nm) y tropomiosina en la actina fi lament (alrededor

11. Usukura J, Yoshimura A, Minakata S, Youn D, ​Ahn J, Cho SJ (2012) Utilización de la
de 2 nm de diámetro) a una velocidad mucho más rápida que AFMs unroo fi técnica ng de fuerza atómica de imágenes microscópicas del citoesqueleto
punta-exploración anterior (10 s / marco). Nuestra AFM punta-scan representa intra-celular en condiciones acuosas. J. Electrón Microsc. 61: 321 - 326.

resolución espacial satisfactoria y velocidad de fotogramas y es adecuado para

microscopía correlativa práctico, en el que nos pueden observar estructuras y 12. Suzuki Y, Sakai N, Yoshida A, Uekusa Y, Yagi A, Imaoka Y, Ito S, Karaki K, Takeyasu K

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fluorescente y que se han visualizado por un microscopio de luz. En principio, este

AFM se puede combinar con cualquier tipo de microscopio de luz invertida y el

13. Yoshida A, Sakai N, Uekusa Y, Deguchi K, Gilmore JL, KumetaM, Ito S, Takeyasu K (2015)
acoplamiento de este sistema AFM con un microscopio de luz de alta resolución es
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