Guía de prácticas de virología: preparación de soluciones

GUÍA DE PRÁCTICAS DE VIROLOGÍA
CURSO: VIROLOGÍA
PROFESOR: JORGE A. SAMAMÉ MÁRQUEZ

GABRIEL E. CABREJOS CHILGE
AÑO: 2018- I
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PRACTICA Nº1
TEMA: SOLUCIONES DESINFECTANTES EN VIROLOGÍA
DESINFECTANTES QUÍMICOS
Las fórmulas de los productos desinfectantes comerciales presentan grandes diferencias, por
lo tanto, las diluciones se deben realizar siguiendo las instrucciones del fabricante.
CLORO: HIPOCLORITO SÓDICO

El cloro es un desinfectante universal activo contra todos los microorganismos. En general se
utiliza en forma de hipoclorito sódico, las presentaciones comerciales tienen distintas
concentraciones de cloro libre. Es un enérgico agente oxidante, corrosivo para los metales.
Las soluciones de hipoclorito pierden progresivamente su actividad, por lo que es necesario
preparar diariamente las soluciones.
Como solución desinfectante para toda clase de trabajos de laboratorio, se utiliza a la
concentración de 1 g/litro (1000 ppm de cloro libre). Se recomienda utilizar soluciones de
hipoclorito sódico con una concentración de 5 g/litro (5000 ppm de cloro libre) como
desinfectante de elección en situaciones de urgencia provocadas por virus ,tales como los
virus de Lassa y Ebola.
Numerosas soluciones de hipoclorito sódico vendidas para uso industrial y de laboratorio
contienen 50 g/litro (50 000 ppm de cloro libre) y por consiguiente deben diluirse a razón de
1:50 ó 1:10 para obtener concentraciones finales de 1 g/litro y 5 g/litro, respectivamente.
Las lejías domésticas suelen contener 50 g/litro (50 000 ppm de cloro libre) y en consecuencia
deben diluirse a la concentración de 1: 10 a 1: 50 para emplearlas.
Formaldehido
El formaldehído es un gas activo contra todos los microorganismos excepto a temperaturas
inferiores de 20°C. Se adquiere comercialmente en forma de un polímero sólido o de tabletas
denominado paraformaldehído , o como formol en agua a la concentración de
aproximadamente 370 g/litro (37%) y que contiene metanol (100 ml) como estabilizador.
El formaldehído a la concentración de 18,5 g/litro (formol al 2 % en agua) puede utilizarse
como desinfectante líquido y se recomienda su uso contra los virus en general.
Para fines de descontaminación de ambientes se utiliza 0.3 gr/pie 3 de formol mantenido 37°
por 8 horas a 24 °C o T.A. (1 m3 = 35.3147 pie3)
Nota: El formaldehído es un agente cancerígeno.
Compuestos fenólicos
Los compuestos fenólicos son activos contra todas las formas vegetativas de
microorganismos, pero no contra las esporas. Su actividad frente a los virus lipídicos es
variable. Los compuestos fenólicos son la base de cierto número de desinfectantes corrientes,
pueden emplearse cuando no se dispone de hipoclorito, diluyéndolos de acuerdo a las
recomendaciones del fabricante.
Alcohol y mezclas alcohólicas

El etanol (alcohol etílico) y el 2-propanol (alcohol isopropílico) tienen análogas propiedades
desinfectantes. Son activos contra las bacterias vegetativas, los hongos y los virus lipídicos,
pero no contra las esporas Su acción contra los virus no lipídicos es variable. Para alcanzar su
máxima eficacia deben utilizarse en soluciones acuosas al 70% aproximadamente, las
soluciones mas concentradas o más diluidas pueden ser igualmente germicidas.
2
Las mezclas con otros productos son más eficaces que el alcohol solo, por ejemplo, alcohol al
70% que contiene 100 g de formaldehido por litro o alcohol que contiene 2 g/litro (2000 ppm)
de cloro libre
Yodo y yodóforos
La acción de estos desinfectantes es parecida a la del cloro. Las superficies limoias pueden
tratarse eficazmente con soluciones que contengan 0,075 g/litro (75ppm) de yodo libre.
Los yodóforos pueden diluirse en etanol para el lavado de manos como esporicida. Se
considera que una concentración de 0,45 g/litro (450 ppm) de yodo libre es eficaz contra los
virus de Lasa y Ebola.
CUESTIONARIO
1. SEÑALE 5 EJEMPLOS DE AGENTES ETIOLÓGICOS VIRALES PARA CADA UNO DE

LOS NIVELES DE BIOSEGURIDAD 1, 5 EJEMPLOS PARA NIVEL DE
BIOSEGURIDAD 2, 3, 4.
2. SEÑALE LAS DIFERENTES CLASES Y TIPOS DE CABINA DE FLUJO LAMINAR
(CABINAS DE BIOSEGURIDAD) CARACTERÍSTICAS Y FUNCIONES.
3. LOS LABORATORIOS DE UNA UNIVERSIDAD QUE NIVEL DE BIOSEGURIDAD
DEBE CONTAR.
3
PRÁCTICA Nº2
TEMA: PREPARACIÓN DE REACTIVOS: SOLUC. STOCK 10 X HANKS EARLE Y

P.B.S., SOLUCIONES E. INDICADORES DE PH, SOLUC. DE BICARBONATO
PREPARACION DE SOLUCIONES BUFFERADAS
INTRODUCCIÓN
Muchas de las reacciones químicas que se producen en solución acuosa necesitan que el pH
del sistema se mantenga constante, para evitar que ocurran otras reacciones no deseadas.
Las soluciones ""reguladoras"" o Buffer son capaces de mantener de acidez o basicidad de un
sistema dentro de un intervalo reducido de pH, por lo cual tienen múltiples aplicaciones, tanto
en la industria como en los laboratorios.
Esta practica de laboratorio tiene como propósito reforzar en el estudiante el concepto de lo
que son soluciones buffer, además de ayudar a los estudiantes a familiarizarse con la
resistencia que estas soluciones poseen en cuanto al ph.
Así mismo, se puede obtener una solución reguladora haciendo reaccionar parcialmente por
(neutralización) un ácido débil con una base fuerte. o un ácido fuerte con una base débil. Una
vez formada la solución reguladora, el pH varia poco por el agregado de pequeñas cantidades
de ácido fuerte ó de una base fuerte, y pierde su capacidad reguladora por el agregado de
agua (disolución).La disolución no cambia el pH de la solución Buffer pero disminuye
considerablemente su capacidad reguladora.
En general puede decirse que esta práctica tiene como propósito la comprensión de las
adiciones de ácidos y sales a estas soluciones.
MARCO TEÓRICO
Las soluciones buffers, son soluciones que resisten cambios de su pH. Estas soluciones
mantienen constante el pH cuando se adicionan pequeñas cantidades de ácidos o bases. El
control del pH es importante en numerosas reacciones químicas, en los sistemas biológicos y
en muchas otras aplicaciones. El cambio del pH de la sangre en 0,5 unidades puede resultar
fatal, pero la sangre es una solución buffer. El agua no es un buffer y la simple adición de una
gota de HCl 1M a un litro de agua cambia el pH de 7,0 a 4,3. Así pues, un buen control del pH
es esencial.
Una solución buffer debe contener un ácido débil y una sal de éste ácido; por ejemplo ácido
acético/acetato de sodio, donde el CH3COOH es el ácido y el Ion CH3COO- es la base o una
base débil y una sal de ésta base; por ejemplo amoníaco/cloruro de amonio, donde el NH3 es
la base y el Ion NH4+ es el ácido. Las soluciones buffers trabajan removiendo los iones H+ o
los iones OH- de la solución.
El intervalo de pH para el cual un sistema buffer regula adecuadamente es: pKa – 1 < pH <
pKa + 1
El sistema buffer mas adecuado es aquel cuyo valor de pKa esta lo más cerca posible del pH
que se desea regular.
4
Buffer Fosfato Salino Dulbecco con sales de Calcio y Magnesio
A
(500ml).
Buffer Fosfato Salino Dulbecco , con Calcio ,Magnesio, 1000 mg/ L
B
D-Glucosa y 36 mg/L Piruvato de Sodio (500ml).
C Buffer Fosfato Salino Dulbecco sin sales de Calcio y Magnesio
(500ml)
D Solución DE
PREPARACION Balanceada
SOLUCIONESde Sales de Earle con
BUFFERADAS sales de Calcio y
EN VIROLOGIA
Magnesio (500ml)
Solución Balanceada de Sales Hank con sales de Calcio y Magnesio
E
(1000ml)
(mg/litro) A B C D E
CaCl2 100.00 100.00 200.00 140.00
MgCl2 47.00
MgSO4 97.00 96.00
MgCl2 6H2O 100.00
KCL 200.00 200.00 200.00 400.00 400.00
KH2PO4 200.00 200.00 200.00 60.00
NaHCO3 2200.00
NaCl 8000.00 8000.00 8000.00 6800.00 8000.00
Na2HPO4 1150.00 1150.00 1150.00 48.00
5
Na2HPO4 H2O 140.00
Dextrosa 1000.00 1000.00 1000.00
Piruvato Na 36.00 10.00
Rojo Fenol 10.00
Soluciones balanceadas son básicamente buffer fosfatos salinos.
ANEXO C
PREPARACIÓN DE BUFFER Y SOLUCIONES PARA INMUNOBLOT
C.1 PREPARACIÓN DE BUFFER Y SOLUCIONES PARA INMUNOBLOT
C.1.1 Buffer Tris/HCl 0,05M, pH 8,0

• Tris 0,60 g
• NaCl 0,60 g
• Agua desionizada q.s.p 100,00 mL
• Ajustar pH 8,0 con HCl concentrado.
C.1.2 Solución de tratamiento de muestra

• Tris/HCl 0,95 mL
• 2 Mercapto-Etanol 0,05 mL
• Dodecil Sulfato de Sodio (SDS) 0,02 g
C.1.3 Solución colorante marcador de corrida

• Azul de bromofenol 0,05 g
• Glicerol 8,00 mL
• Tris/HCl 0,5 M pH 8,0 1,00 mL
• Agua deionizada 1,00 mL
• Diluir la muestra V/V con la solución de tratamiento y hervirlo por 10 minutos.
• Adicionar solución marcador de corrida 3 ml por cada 100 ml de la muestra.
C.1.4 Solución stock de poliacrilamida

• Acrilamida 14,60 g
• N N’ bis-acrilamida 0,40 g
• Água deionizada q.s.p 50,00 mL
• Pesar los reactivos en tubo de plástico. Colocar el tubo en agua caliente para ayudar a
disolver, luegoesperar hasta que se enfrie y completar el volumen. Conservar a 4°C.
C.1.5 Buffer de gel de enpaquetamiento 0,5 M, pH 6,8

• Tris 0,5 M 6,00 g
6
C.1.6 Buffer de gel de separación o de corrida 1,5 M pH 8,8
• Tris 1,5 M 18,15 g
C.1.7 Solución de persulfato de amonio (APS) al 10%

• Persulfato de amonio 10,00 g
• Alicuotar y conservar a –20°C
C.1.8 Solución de Dodecil sulfato de sodio (SDS) al 10%

• SDS 10,0 g
• Conservar a 4OC o a temperatura ambiente
C.1.9 Buffer de corrida (superior/inferior)

• Tris 0,05 M 30,0 g
• Glicina 0,192 M 14,4 g
• SDS a 10% 10,0 mL
Solución Gel
Empaquetamiento Separación
• 40% 12% 15%
• Solución Stock
• Poliacrilamida 1,33 mL 4,8 mL 6 mL
• Buffer de gel inferior o de 3,6 mL 4,5 mL de separación
• Buffer de gel superior o de 2,5 mL de empaquetamiento
• SDS 10% 100 μL 120 μL 120 μL
• Agua desionizada 6,1 mL 3,6 mL 1,5 mL
• Persulfato de 50 μL 60 μL 60 μL
• Amonio APS al 10%
• Temed 5 μL 4 μL 4 μL
Tabla C1. Fórmula de concentración de gel de empaquetamiento y de separación o de

corrida al 12% y 15%
C.2 PREPARACIÓN DE BUFFER PARA LA TRANSFERENCIA

C.2.1 Buffer de transferencia
• Tris (0,5 M) 102,8 g
• Metanol 400,0 mL
• Ajustar pH 9,18 con HCl concentrado
C.3 PREPARACIÓN DE SOLUCIONES PARA REACCIÓN IMUNOENZIMATICA

C.3.1 Buffer fosfato salino 0,01M, pH 7,2 (PBS)
7
A.-NaH2P04.H2O 37,00g,
NaCl 8,76 g
Água deionizada q.s.p 1000,00 mL
B.- Na2HPO4.7H2O 2,68 g
NaCl 8,76 g
Agua deionizada 1000,00 mL
Adicionar la solución A sobre la solución B hasta alcanzar el pH 7,2
C.3.2 Buffer de lavado

Buffer Fosfato Salino +Tween 20 al 0,3%
C.3.3 Buffer de bloqueo y diluyente

Buffer Fosfato Salino +Tween 20 al 0,3% + Leche descremada al 5%
C.3.4 Solución reveladora

Buffer Fosfato Salino 10,0 mL
3,3' diaminobenzidina tetracloridrato 5 mg
Peróxido de hidrógeno 10 mL
ANEXO D
PREPARACIÓN DE BUFFER Y SOLUCIONES PARA DOBLE DIFUSIÓN
D.1 SOLUCIÓN SALINA TAMPONADA (SST) 0,1M, pH 7,4

• Solución Fisiológica (NaCl 0.85 %) 900,00 mL
• Fosfato de Potasio dibásico (K2HPO4) 100,00 mL
• Ajustar pH 7,4 con solución KH2PO4 0,1 M
D.2 GEL DE AGAR NOBLE

• Solución salina tamponada 100,00 mL
• Agar Noble 1,20 g
• Mertiolate 0,01 g
• Consevar el gel a 4°C
D.3 SOLUCION COLORANTE

• Amido Schwarz (Negro Amido) 0,10 g
• Acido acético Glacial 20,00 mL
• Agua destilada c.s.p. 1000,00 mL
• Conservar a temperatura ambiente en frasco color caramelo perfectamente cerrado.
D.4 SOLUCION DECOLORANTE

• Alcohol etílico de 95° 400,00 mL
• Acido acético glacial 100,00 mL
• Conservar a temperatura ambiente en frasco perfectamente cerrado.
• MPR-CNSP-006 55 Instituto Nacional de Salud
• Manual de procedimientos para el diagnóstico serológico de las zoonosis parasitarias
8
ANEXO E
PREPARACIÓN DE BUFFER Y SOLUCIONES PARA ELISA
E.1. TRIS-HCl 0,01M, pH 7,5

• Trisma-HCl anhidro 0,12 g
• Trisma base anhidro 0,02 g
• Agua destilada q.s.p. 100,00 mL
E.2 BUFFER FOSFATO SALINO 0,01M, pH 7,2 (PBS)

A.- NaH2P04.H2O 1,37 g
NaCl 8,76 g
Água deionizada q.s.p 1000,00 mL
B.- Na2HPO4.7H2O 2,68 g
NaCl 8,76 g
Agua deionizada 1000,00 mL
Adicionar la solución A sobre la solución B hasta alcanzar el pH 7,2
E.3 BUFFER DE LAVADO

• Buffer Fosfato Salino +Tween 20 al 0,05%
E.4 BUFFER DE BLOQUEO Y DILUYENTE

• Buffer Fosfato Salino +Tween 20 al 0,05% + Seroalbúmina bovina al 1%
E.5 SOLUCIÓN ESTABILIZADORA PARA EL SUSTRASTO

Ácido Cítrico 3,00 g
• Na2HPO4 anhidro 10,70 g
• Agua destilada q.s.p. 100,00 mL
9
• Ajustar el pH a 5. Antes de su uso, completar a 8 mL de las solución estabilizadora del
sustrato hasta 25 mL con agua destilada.
E.6 SOLUCIÓN DEL SUSTRATO

• Solución estabilizadora para el sustrato 25,0 mL
• Orto- phenilendiamine 10,0 mg
• Peróxido de hidrógeno al 30% 10 mL
E.7 Ácido Sulfúrico 2,5 M

• Ácido Sulfúrico 1,4 mL
• Agua destilada 8,6 mL
ANEXO F
PREPARACIÓN DE BUFFER Y SOLUCIONES PARA IFI
F.1 BUFFER FOSFATO SALINO (PBS) pH 7,2, 0,01M
• Na2HPO4 1,42 g
• NaH2PO4 1,20 g
• NaCl 8,2 g
F.2 BUFFER FOSFATO DILUYENTE (PBS+Tween 80 al 1%)

• PBS 99,0 mL
• Tween 80 1,0 mL
F.3 SOLUCIÓN DE AZUL DE EVANS (SOLUCION STOCK)

• Azul de Evans 10,0 mg
• PBS + Tween 80 100,0 mL
• Conservar en refrigeración a 4°C
• Preparar la solución de trabajo antes de usarla
• Solución stock 1,0 parte
• PBS Tween 80 9,0 partes
F.4 BUFFER CARBONATO – BICARBONATO 0,5M pH 9,5

• Solución A
• Na2HCO3 Anhidro 5,3 g
• Agua destilada cs.p. 100,0 mL
• Solución B
• NaHCO3 Anhidro 4,2 g
• Agua destilada cs.p 100,0 mL
• Agregar la Solución A sobre la solución B, hasta pH 9,5
F.5 GLICERINA TAMPONADA

• Glicerina bidestilada 9,0 mL
• Buffer Carbonato-Bicarbonato 0,5M, ph 9,5 1,0 mL
• MPR-CNSP-006 57 Instituto Nacional de Salud
• Manual de procedimientos para el diagnóstico serológico de las zoonosis parasitarias
ANEXO G
10
PREPARACIÓN DE BUFFER Y SOLUCIONES PARA HEMAGLUTINACION INDIRECTA
G.1 SOLUCIÓN DE ALSEVER
• Glucosa anhidra 18,66 g
• Cloruro de Sodio 4,18 g
• Citrato de Sodio 8,0 g
• Ácido Citrico 0,55 g
G.2 BUFFER FOSFATO SALINO (PBS) 0,15 M

Solución 1
• KH2PO4 2,04 g
• Solución 2
• Na2HPO4 2,13 g
• Água destilada 100,00 mL
PBS ph 7,2
• Solución 1 7,0 mL
• NaCl 2,1 g
PBS ph 6,4
• NaCl 2,1 g
G.3 SOLUCIÓN DILUYENTE

• Suero humano negativo al 1% en PBS pH 7,2
G.4 ÁCIDO TANICO SOLUCION STOCK

• Ácido Tánico 10,0 mL
• Solución salina 1,0 mL
Solución de trabajo: 1/20000

• Ácido Tánico Solución stock 100,0 mL
• Solución salina 20,0 mL
• MPR-CNSP-
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PRÁCTICA Nº3
TEMA: PREPARACIÓN DE MEDIO DE TRANSPORTE PARA OBTENCIÓN DE

MUESTRAS. OBTENCIÓN, CONSERVACIÓN Y PREPARACIÓN DE
MUESTRAS PARA AISLAMIENTO VIRAL: HECES, ORINA, LCR, HISOPADO
DE GARGANTA
1. El diagnóstico de laboratorio correcto y oportuno depende del cuidado con que se

realice la toma, manejo y envío de muestras siguiendo al detalle las instrucciones al
respecto.
2. La interpretación del resultado del laboratorio debe estar apoyado por un buen
diagnóstico clínico y los antecedentes epidemiológicos del caso.
3. La muestra para aislamiento de agentes infecciosos debe ser tomada ANTES de
instaurar la terapia con antimicrobianos.
4. La muestra debe identificarse utilizando una cinta de tela adhesiva, escrita con LAPIZ,
donde se incluya todos los datos relevantes del caso: nombre completo o clave,
diagnóstico presuntivo, fecha de toma y tipo de muestra indicando si es 1a, 2a o 3a.
5. La muestra debe acompañarse siempre de un resumen clínico del caso y sus
antecedentes, así como de cualquier dato epidemiológico relevante.
ENVIO DE MUESTRAS
1. Hay que verificar que todas las muestras estén identificadas con los datos relevantes
del caso, tal como ya se indicó en las consideraciones generales al inicio de esta
sección.
2. Los frascos, viales, tubos, etc, deben estar tapados lo más herméticamente posible,
colocando bien las tapas y tapones los cuales se asegurarán con tela adhesiva.
3. Cuando se manden varios tubos se aseguran con ligas y se colocan en bolsas
cerradas.
4. Los frascos se colocan en bolsas de plástico resistentes y herméticamente cerradas.
5. Las laminillas se deben enviar secas, envueltas individualmente en papel de China y
cada una estar bien identificada con un número o el nombre del paciente.
6. Para el envío, las muestras se colocan en cajas térmicas resistentes empaquetandolas
con relleno de papel, plástico o madera (viruta), para amortiguar los golpes.
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7. Si se envían por avión asegurarse que el paquete viaje en el área presurizada para
evitar la pérdida (evaporación) de los especímenes.
8. No olvidar que las muestras deben estar acompañadas de una carta u oficio en el que
se especifique claramente que tipo de prueba se solicita y un resumen clínico
enfatizando la fecha de inicio del padecimiento y la fecha de la toma de la muestra,
edad y sexo, estos documentos (original y copia), se colocan dentro del paquete en una
bolsa de plástico sellada para evitar la pérdida de esta información. Debe verificarse
que el nombre de la muestra sea el mismo en oficio y resumen clínico. Escribir con letra
de molde, de preferencia a máquina y enviar en original. Que la cantidad de muestra
enviada sea de acuerdo a los estudios solicitados. Indicar en el paquete en un lugar
visible si éste contiene muestras de cólera, rabia, poliomielitis, aguas residuales,
citología, paludismo, VIH etc.
9. Las muestras se remiten lo más pronto posible después de obtenidas para organizar su
adecuada preservación.10. Es conveniente que se informe del envío al departamento
de recepción de muestras del INS al teléfono 4719920, indicando la forma, el número
de guía y si es a domicilio u ocurre. LAS MUESTRAS SE ENVIAN A:
LABORATORIO DE REFERENCIAL DE SALUD

AREA DE RECEPCION DE MUESTRAS
DIRECCION:
……………………….
………………………
Tel: …………………
Fax: ………………..
A continuación se describen, en ORDEN ALFABETICO, los procedimientos adecuados de

toma y envío de muestras clínicas (M) para diagnóstico y referencia.
PROCEDIMIENTOS
M1. EXPECTORACION (ESPUTO)
M2. EXUDADO CUTANEO
M3. EXUDADO FARINGEO
M4. EXUDADO NASOFARINGEO
M5. EXUDADO URETRAL
M6. EXUDADO VAGINAL Y ENDOCERVICAL
M7. FROTIS SANGUINEO
M8. GARGARISMO
M9. GOTA GRUESA
M10. HEMOCULTIVO
M11. HISOPO RECTAL
M12. IMPRONTA DE LESIONES CUTANEAS
M13. LAVADO FARINGEO
M14. LAVADO GASTRICO
M15. LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO (LCR)
M16. LIQUIDO PLEURAL
M17. MATERIA FECAL
M18. MEDULA OSEA
M19. ORINA
M20. RASPADO DE LESIONES Y/O COSTRAS
M21. SANGRE TOTAL
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M22. SUERO
M23. OTRAS MUESTRAS
M1. EXPECTORACION (ESPUTO)

Toma: En un frasco de plástico combustible, con capacidad de 30 a 50 mL, de boca ancha y
estéril, se recogen unos 5 mL de expectoración del paciente. Para el aislamiento de agentes
microbianos de infección respiratoria aguda, la muestra debe satisfacer un control de calidad
consistente en el recuento celular a seco débil de 25 campos, en busca de la presencia
promedio de no más de 10 células epiteliales y más de 25 polimorfonucleares por campo; en
caso de no cumplir con estos valores se solicita otra muestra.
En los casos de sospecha de tuberculosis sólo hay que cuidar que la muestra sea
mucopurulenta y esté libre de saliva; se toman 3 muestras: una es cuando se produce tos, otra
se toma en la mañana cuando despierta el paciente y una más al hacer la entrega de las
muestras en el laboratorio.
Envío: Las muestras se protegen del calor excesivo con refrigerante.
M2. EXUDADO CUTANEO

Toma: Con un hisopo de algodón se toma una porción del exudado, evitando que sea muy
superficial. Inmediatamente se siembra en medios de cultivo adecuados (agar sangre, agar
chocolate, PAI, etc) o se inocula en el medio de transporte de Stuart.
Envío: Las muestras se protegen del calor excesivo con un refrigerante.
M3. EXUDADO FARINGEO

Toma: Se pide al paciente que se siente y coloque su cabeza hacia atrás. Se ilumina bien la
cavidad orofaríngea y con un abatelenguas se empuja la lengua hacia abajo para facilitar el
acceso a la parte posterior de la faringe. Con un hisopo de algodón se hace un raspado de las
áreas hiperémicas, purulentas o necróticas, así como de las membranas o manchas de Koplic,
si es que las presenta.
Envío:
Agentes virales: El hisopo con la muestra se introduce en un tubo de tapón de rosca con
1 a 2 ml de solución salina isotónica estéril. Se rompe la varilla de madera a la altura del tapón
y se tapa herméticamente.
Agentes bacterianos: El hisopo con la muestra se introduce en un tubo de tapón de rosca con
medio de Amies o de Stuart. Se rompe la varilla de madera a la altura del tapón y se tapa
herméticamente.
M4. EXUDADO NASOFARINGEO

Toma: Se pide al paciente que se siente y coloque su cabeza hacia atrás. Se introduce un
hisopo de alginato de calcio, dacrón o nylon (nunca de algodón en caso de sospechar
Bordetella) por las fosas nasales hasta la nasofaringe, sin tocar los cornetes y tratando de
producir un acceso de tos. El hisopo se mantiene in situ de 10-15 segundos durante el acceso
de tos, después de lo cual se retira rápidamente.
Envío: Si la muestra no se va a procesar de inmediato, el hisopo se mantiene en un medio de
transporte y se envía de inmediato con refrigerante:
Agentes virales: El hisopo con la muestra se introduce en un tubo de tapón de rosca con 0.5
mL de solución salina isotónica estéril. Se rompe la varilla de madera a la altura del tapón y se
tapa herméticamente.
Agentes bacterianos: El hisopo con la muestra se introduce en un tubo de tapón de rosca con
medio de Amies o de Stuart. Se rompe la varilla de madera a la altura del tapón y se tapa
herméticamente.
M5. EXUDADO URETRAL

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Toma: Se recomienda al paciente que no orine por lo menos una hora antes de tomar la
muestra. En casos de gonorrea, cuando se produce un exudado abundante, se presiona
ligeramente la uretra con el fin de que lo expulse y éste se recoge con un hisopo de alginato
estéril el cual se deposita en el medio de transporte de Stuart. Cuando se sospecha de una
infección por clamidia, se emplea un hisopo de alginato de calcio adecuado para toma de
muestras en varones, el cual se introduce unos 2 a 4 cm en la uretra y se frotan las paredes
haciendo girar el hisopo durante 5 a 10 segundos; con esta muestra se deben hacer de
inmediato frotes en portaobjetos limpios que se fijan con acetona.
Envío: El tubo y las preparaciones se envía lo antes posible de modo que no lleguen al
laboratorio después de 24 horas.
M6. EXUDADO VAGINAL Y ENDOCERVICAL

Toma: Se utiliza un espejo vaginal para revisar el cérvix.
En caso de gonorrea no se hace ningún tipo de limpieza y se recoge una muestra de exudado
con ayuda de un hisopo; la muestra se debe sembrar de inmediato en la placa de agar de
Thayer Martin y sólo que ésto no sea posible, se puede transportar en medio de Stuart.
Cuando se sospecha de infección por clamidias, se limpia el exocérvix con un hisopo de
algodón para eliminar el moco y el exudado, se introduce el hisopo (de alginato de calcio o de
dacrón, nunca de algodón) o el cepillo unos 2 a 4 cm dentro del canal endocervical y se rota
cuidadosamente presionando contra la pared, evitando el contacto con las superficies
vaginales. Con esta muestra se deben hacer de inmediato frotes en portaobjetos limpios que
se fijan de inmediato con acetona.
Envío: El tubo con el medio de transporte se envía lo antes posible de modo que no llegue al
laboratorio después de 24 horas. No es necesario refrigerar la muestra. Las preparaciones se
envuelven individualmente y se envían protegidas de la luz y el calor excesivo.
M7. FROTIS SANGUINEO

Toma: Se limpia la yema del dedo o el lóbulo de la oreja con una torunda de algodón
empapada en alcohol etílico al 70% y se deja secar. Con una lanceta estéril se hace una
punción firme y profunda y se limpia la primera gota de sangre con un algodón limpio y seco.
Se comprime de nuevo la yema o el lóbulo hasta que se forme una gota esférica. Se toca la
parte superior de la gota con un portaobjetos muy limpio y con un extremo de otro
portaobjetos, se extiende la sangre para hacer un frote. La sangre se deja secar a temperatura
ambiente y en posición horizontal.
Envío: Cada laminilla se protege individualmente con cartón preferentemente. El conjunto se
empaqueta cuidadosamente en un recipiente con doble cubierta para evitar la ruptura y se
envía lo antes posible al laboratorio. No hay que refrigerar el paquete.
M8. GARGARISMO
Toma: Se proporciona al paciente un frasco de boca ancha con tapón de rosca, estéril, con 5
ml de solución salina y se le instruye de modo que mantenga la solución en la garganta el
mayor tiempo posible mientras hace gárgaras y depositándo nuevamente el líquido en el
frasco.
Envío: El frasco con la muestra se envía de inmediato, protegido con un refrigerante.
M9. GOTA GRUESA

Toma: Se limpia la yema del dedo o el lóbulo de la oreja con una torunda de algodón
empapada en alcohol etílico al 70% y se deja secar. Con una lanceta estéril se hace una
punción firme y profunda y se limpia la primera gota de sangre con un algodón limpio y seco.
Se comprime de nuevo la yema o el lóbulo hasta que se forme una gota esférica, la cual se
hace depositar sobre el centro de un portaobjetos limpio. Con ayuda de una arista de un
portaobjetos se extiende sobre una superficie de aproximadamente 0.5 a 1cm. La gota se deja
secar a temperatura ambiente y en posición horizontal.
15
Envío: Cada laminilla se protege individualmente con cartón preferentemente y se empaqueta
cuidadosamente con doble cubierta para evitar la ruptura y se envía lo antes posible al
laboratorio. No hay que refrigerar el paquete, pero si protegerlo de la humedad y la luz solar.
M10. HEMOCULTIVO
Toma: Se limpia el sitio de la punción con una torunda de algodón impregnada con etanol al
70% o solución de yodo al 2%. Si se trata de un adulto, se toman de 5 a 8 mL de sangre total,
sin anticoagulante, o de 2 a 3 mL si se trata de un niño, siguiendo las indicaciones que se
describen en el inciso M20. De inmediato la sangre se inyecta a través del tapón (previamente
desinfectado con alcohol) de un frasco con medio bifásico para hemocultivo.
Envío: El frasco del hemocultivo se empaqueta bien en un recipiente con doble cubierta para
evitar su ruptura. No hay que refrigerarlo.
M11. HISOPO RECTAL

Toma: La muestra se toma introduciendo la punta de un hisopo de algodón humedecido en
solución salina o medio de transporte en el recto y haciéndolo rotar ligeramente. Estará bien
tomada si observamos un ligero color café en el hisopo. Una vez tomada la muestra se
introduce el hisópo hasta el fondo en un tubo con medio de transporte Cary-Blair que debe
estar bien tapado (tapón de rosca). Para estudios bacteriológicos se envía inmediatamente
después de haberse tomado. En caso de ser para estudios virales mandarlo en refrigeración,
aunque no se recomienda usar hisópo para el caso de virus.
Envío: Si se trata de estudios bacteriológicos no hay que refrigerar el paquete, pero sí en el
caso de estudios virales.
M12. IMPRONTA DE LESIONES CUTANEAS

Toma: En caso una lesión ulcerosa, se presiona un portaobjeto perfectamente bien
desengrasado sobre la lesión. Si la lesión está cicatrizada con la punta de un portaobjeto se
levanta la cicatriz y se toma la muestra como se indicó anteriormente. En caso de una lesión
nodular, se pincha el nódulo con una lanceta y se presiona con un portaobjeto sobre la lesión
hasta que salga líquido tisular el cual contendrá al parásito.Hay que evitar en lo posible el
sangrado durante la toma de la muestra. Se fija con alcohol metílico absoluto.
Envío: Las laminillas se envuelven individualmente y se empaquetan bien en un recipiente con
doble cubierta para evitar su ruptura y se envía lo antes posible al laboratorio. Hay que
proteger el paquete de la humedad y de la luz solar.
M13. LAVADO FARINGEO

Toma: Se pide al paciente que se siente cómodamente e inclina la cabeza hacia atrás. Se mide
la distancia media entre la fosa nasal y la base del pabellón auricular, para saber la
profundidad a la que se debe introducir la sonda. Se aplicará 1 mL de solución salina o PBS
estéril e inmediatamente se introducirá la sonda, que estará conectada a través de una trampa
a un tubo o recipiente estéril para la recepción del material.
Envío: La muestra se coloca en hielo hasta su procesamiento (dos a cuatro horas en las
técnicas rápidas).
M14. LAVADO GASTRICO

Toma: Debe ser efectuada por personal médico bien entrenado. Se introduce una sonda por
vía bucal hasta el estómago en ayunas. La muestra se deposita en un frasco de boca ancha y
de preferencia estéril.
Envío: El frasco se envía lo antes posible al laboratorio, donde no debe llegar después de 6
horas de tomada la muestra. Se debe acompañar de refrigerante.
M15. LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO (LCR)
16
Toma: La obtención de la muestra es responsabilidad exclusiva del médico quien la tomará
bajo rigurosas condiciones de asepsia. Se deben recuperar unos 5 mL los cuales se conservan
en tubos de vidrio estériles con tapón de rosca.
Envío: Cuando se trate de estudios virológicos, la muestra se envía refrigerada. Si se
sospecha de una infección bacteriana, la muestra no debe refrigerarse, ni acompañarse de
hielo. Cuando el envío tarda más de 24 horas, la muestra debe enviarse inoculada en medios
específicos.
M16. LIQUIDO PLEURAL

Toma: La obtención de la muestra es responsabilidad exclusiva del médico, quien la tomará
bajo condiciones rigurosas de asepsia. Se obtiene una muestra de aproximadamente 5 mL en
tubos de vidrio estériles con tapón de rosca.
Envío: El tubo se envía lo antes posible al laboratorio acompañado de refrigerante.
M17. MATERIA FECAL

Toma: Las muestras fecales pueden ser obtenidas en recipientes limpios de boca ancha y con
tapa hermética que permitan su fácil transporte, de preferencia que no sea de vidrio. Las heces
obtenidas del suelo, excusado así como del pañal no son satisfactorias, debido a que pueden
contaminarse con material extraño.
Envío: La muestra se debe enviar de inmediato al laboratorio.
Estudios virales: el tiempo de envío debe ser menor a los tres días y en condiciones de
refrigeración, con la cantidad de 10 gramos. Si se trata de hisopo rectal en solución salina,
sueros y L.C.R. en envases apropiados correctamente sellados.
Estudios bacteriológicos: se inocula en un medio de transporte (Cary Blair o Amies) y se envía
a temperatura ambiente
Estudios parasitológicos: se adiciona formol al 10% v/v neutralizado y se homogeniza bien. El
envío se hace a temperatura ambiente.
Estudios para determinación de coproantígenos por ELISA: el tamaño que se envía será
similar al tamaño de una nuéz independientemente de la consistencia.
Estudios parasitoscópicos : tres muestras consecutivas (de diferente día),
El envío se hace a temperatura ambiente. Cuando la muestra presente sangre y/o moco de
preferencia mandar de esa parte.
M18. MEDULA OSEA

Toma: La muestra deberá ser tomada exclusivamente por el médico en condiciones rigurosas
de asepsia. Se obtienen aproximadamente de 0.25 a 0.3 mL de material con una jeringa
heparinizada estéril de 1 mL de capacidad. La jeringa se gira cuidadosamente para mezclar el
material aspirado y se deposita en un tubo estéril con 0.5 mL de solución salina fisiológica.
Si se dispone de medios de cultivo se recomienda sembrar de inmediato la muestra:
Bacterias: caldo soya-tripticasa
Hongos: medios de Sabouraud simple y de Sabouraud con antibióticos
Leishmaniosis: medio de Marin NNN y/o RPMI con 10% de suero de ternera fetal
Envío: Si el laboratorio está cerca la muestra se puede transportar en la misma jeringa
solamente cuidando que la aguja quede bien protegida para evitar la contaminación. Si el
transporte se tarda más de 24 horas, las muestras (jeringa o tubo) se conservan en
refrigeración. El tubo o tubos sembrados se mantienen a temperatura ambiente y se envían lo
más rápido posible al laboratorio.
M19. ORINA
Toma: Se usa un recipiente estéril, de boca ancha con tapa de rosca. Aunque el sondeo
vesical es la forma ideal para evitar la contaminación, debido a la posibilidad de extender la
infección en el paciente, se utiliza en casos muy excepcionales en el hospital. Por esto, la
micción espontánea es la técnica más aconsejable: después de una cuidadosa limpieza de la
17
región urogenital con agua y jabón y después con benzal al 1%, se instruye al paciente para
que deseche la primera parte de la micción y se colecta el chorro medio. Sólo en caso de
sospechar parásitos, se usa la primera parte de la micción.
Envío: La muestra se debe enviar de inmediato al laboratorio con refrigerante. Estudios virales:
el envío debe tardar menos de un día.
M20. RASPADO DE LESIONES Y/O COSTRAS

Toma: Se lava bien el sitio de la lesión, primero con agua y jabón y luego con alcohol al 70%,
utilizando gasa (no debe utilizarse algodón) y se deja secar. Con bisturí estéril, se raspa el
borde de la lesión y se recoje el material que se desprende. Si la epidermis está desprendida
se toman porciones de ésta. Para la búsqueda morfológica del agente, las costras o escamas
se colocan en una caja de petri estéril y se asegurar la tapa con cinta adhesiva para que no se
abra, o bien se pueden colocar en sobres de papel que se sellan.
Envío: El material sólo debe congelarse cuando la muestra es para estudios virológicos. Para
estudios bacteriológicos la muestra se siembra en los medios de transporte adecuados.
M21. SANGRE TOTAL

Toma: La toma deberá hacerse en un lugar perfectamente iluminado y con el paciente
cómodamente sentado. Se localiza una vena adecuada en el brazo del paciente y se coloca el
torniquete. Se desinfecta el área de punción con un algodón impregnado de alcohol al 70%, se
introduce la aguja con el bisel hacia arriba. Si la muestra necesaria es sangre total hay que
utilizar el anticoagulante adecuado según el proceso que vaya a seguirse, ya que algunos
anticoagulantes pueden ser inhibitorios. Si la toma de sangre es para la obtención de suero, no
debe usarse ningún anticoagulante. Si la sangre no fluye espontáneamente y se está utilizando
una jeringa, se jala el émbolo y se aspira con suavidad; si se está empleando equipo al vacío
se presiona el tubo de ensaye hacia arriba. Al empezar a fluir la sangre el torniquete se retira y
hasta que se haya obtenido la cantidad de sangre que se requiere (generalmente 6-10 mL) se
retira la aguja y se coloca una torunda con alcohol sobre el sitio de punción ejerciendo presión
para detener la hemorragia. Si la toma se hizo con jeringa, la sangre se vierte de la jeringa ya
sin aguja sobre un tubo estéril dejándola resbalar lentamente por la pared para evitar
hemólisis. El tubo se tapa cuidadosamente.
Envío: Es muy importante estar seguro que para el estudio a realizar es correcto el envío de
sangre total, ya que ésta puede sufrir hemólisis y dejar de ser útil. Si efectivamente es el caso,
el tubo con la muestra se empaqueta bien en un recipiente con doble cubierta y hermético y se
envía de inmediato, protegiéndolo del calor excesivo con un refrigerante y de la luz solar.
M22. SUERO
Toma: Se debe seguir la misma técnica que para la obtención de sangre total (M21), pero sin
anticoagulante. El coágulo formado se separa de las paredes del tubo con un aplicador de
madera. Se debe esperar el tiempo necesario para que se retraiga el coágulo y el suero se
separa por centrifugación a 2,500-3,000 rpm. El suero no debe mostrar indicios de hemólisis,
ni debe estar lipémico y se debe conservar refrigerado o congelado, a menos que se dé otra
indicación. Actualmente existe un equipo comercial de tubos al vacío con un gel especial, con
este sistema se puede separar el suero directamente en los tubos centrifugando a 3,000 rpm
por 5 minutos. El suero se conserva en los mismos tubos por varios días. Este procedimiento
tiene la ventaja de que no se destapan los tubos en ningún momento, así el contenido se
conserva estéril y además representa un riesgo mínimo.
Envío: El frasco con la muestra se envía de inmediato, protegiéndolo del calor con hielo o un
refrigerante. Si es necesario congelarlo, hay que empaquetarlo bien con hielo seco. Si el suero
muestra indicios de contaminación debe desecharse de inmediato.
M23. OTRAS MUESTRAS
18
Para diversos diagnósticos especiales y para las investigaciones de brotes se pueden requerir
otros tipos de muestras. En estos casos dirigirse directamente al laboratorio correspondiente
para recibir la información respectiva.
PRÁCTICA Nº4
TEMA: Cuantificación Viral
SUSTRATO
CULTIVOS CELULARES PRIMARIOS.

CULTIVOS CELULARES DE LÍNEA.
 (HOMÓLOGOS Y HETERÓLOGOS)
ANIMALES DE LABORATORIO
 HUEVOS EMBRIONADOS
 PEQUEÑOS ROEDORES
MUESTRAS
O SIMPLES
O COMBINADAS
o COMPLEMENTARIAS
o SEROLOGÍA - HISTOPATOLOGÍA
PROCEDIMIENTO
19
EFECTO CITOPÁTOGÉNICO LÍTICO POR HERPESVIRUS
20
EFECTO CITOPATOGÉNICO: SINCICIOS, C. DE INCLUSIÓN
PLACAS NECRÓTICAS EN MCA (VIRUELA AVIAR)
SÍNTOMAS NERVIOSOS (MENINGOENCEFALITIS POR VIRUS DE THEILER
21
¿COMO HAGO PARA SABER CUÁNTO VIRUS TENGO?
TITULACIÓN VIRAL
MÉTODOS EMPLEADOS
 BASADOS EN LA CONSTITUCIÓN FÍSICO-QUÍMICA

 BASADOS EN SUS PROPIEDADES BIOLÓGICAS
MÉTODOS FÍSICO-QUÍMICOS
 MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
 HEMAGLUTINACIÓN
 PRESENCIA DE ENZIMAS ESPECÍFICAS
 PROPIEDADES ANTIGÉNICAS (PRECIPITACIÓN, FIJACIÓN DE
COMPLEMENTO
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
22
Nº DE PARTÍCULAS X VOLUMEN DE LAS MUESTRA
HEMAGLUTINACIÓN
23
PROPIEDADES BIOLÓGICAS
DETERMINAR LA ACTIVIDAD O POTENCIA DE UNA SUSPENSIÓN VIRAL
TITULACIÓN VIRAL
¿COMO SE HACE?
APLICANDO MÉTODOS DE CUANTIFICACIÓN ADECUADOS Y PERFECTAMENTE
ESTANDARIZADOS.
(BIOMETRÍA: ESTADÍSTICA APLICADA A LOS SISTEMAS BIOLÓGICOS).
PROPIEDADES BIOLÓGICAS
SE TOMA EN CUENTA LA INTERACCIÓN DE LA PARTÍCULA VIRAL CON LA CÉLULA
HUÉSPED.
VIRUS + CÉLULA  EFECTO OBSERVABLE
1) SE UTILIZAN DILUCIONES SUCESIVAS DE LA SUSPENSIÓN VIRAL (DE UN

FACTOR CONSTANTE DETERMINADO)
DILUCIONES
24
2) SE CONTABILIZAN EL NÚMERO DE RESPUESTAS POSITIVAS SOBRE EL
NÚMERO TOTAL DE RESPUESTAS POSIBLES PRODUCIDAS EN UN SISTEMA
HOSPEDADOR
 MÉTODO DE PLACA, POCKS O TUMOR
 MÉTODO DEL PUNTO FINAL 50%
MÉTODO DE PLACA, POCKS O TUMOR

 ENUMERATIVO
 UN EFECTO OBSERVABLE = UNA PARTÍCULA VIRAL
 DIFERENTES SUSTRATOS:
-CULTIVOS CELULARES………….PLACAS
-E. DE POLLO (MCA)……………… POCKS
-PEQUEÑOS ROEDORES…………FOCOS NEOPLÁSICOS
MATERIALES
 MONOCAPAS CELULARES
 INÓCULO (5 RÉPLICAS POR CADA DILUCIÓN)
 MEDIO DE CULTIVO SEMISÓLIDO
 COLORANTE
(ROJO NEUTRO: CÉLULAS VIVAS)
(CRISTAL VIOLETA: CÉLULAS MUERTAS)
MÉTODO DE PLACA
25
MÉTODO DE PLACA, POCKS O TUMOR
CALCULO
_
X
N= ------
VXD
_
X= PROMEDIO DE LESIONES OBSERVADAS POR DILUCIÓN EN
LAS 5 MUESTRAS
V= VOLUMEN DEL INÓCULO
D= DILUCIÓN EMPLEADA
MÉTODO DEL PUNTO FINAL 50%

 ESTADÍSTICO
 RESPUESTAS POSITIVAS SOBRE EL TOTAL DE LAS POSIBLES
 GRADIENTE DE ACTIVIDAD
 (A > DILUCIÓN < ACTIVIDAD)
 SI O NO
 POSITIVO O NEGATIVO
MATERIALES
 SISTEMA HOSPEDADOR
CÉLULAS
EMBRIÓN DE POLLO
PEQUEÑOS ROEDORES
 INÓCULO DILUCIONES EN BASE 10
5 RÉPLICAS POR CADA DILUCIÓN
MEDIO DE CULTIVO
26
 EL PUNTO FINAL 50% EN LA TITULACIÓN DE UNA SUSPENSIÓN VIRAL, ES LA
DILUCIÓN DE VIRUS QUE PRODUCE EL 50% DE EFECTOS POSITIVOS.
 EL TÍTULO ES LA INVERSA DE AQUELLA DILUCIÓN A LA CUAL REACCIONA,
ESTADÍSTICAMENTE, LA MITAD DE LOS SUJETOS INFECTADOS O UNIDADES
REVELADORAS
MÉTODO DE RM. CÁLCULO I
-1 -2 -3 -4 -5 -6 -7
A + + + + + + -
B + + + + + - -
C + + + + + - -
D + + + + - - -
E + + + + - - -
MÉTODO DE RM. CÁLCULO II
FREC.ACUM. + 24 19 14 9 4 1 0 0
FREC.ACUM. - 0 0 0 0 2 6 11 16
24/24 19/19 14/14 9/9 4/6 1/7 0/11 0/16
100% 100% 100% 100% 66% 14% 0% 0%
(AM/AM+ AV) 100 50%

27
MÉTODO DE RM. CÁLCULO III
(% DE POSITIVOS MÁS PRÓXIMO POR ENCIMA DEL 50%) - 50%

------------------------------------------------------------------------------------ = DP
(% DE POSITIVOS MÁS PRÓXIMO POR ENCIMA DEL 50%) - (% DE
POSITIVOS MÁS PRÓXIMO POR DEBAJO DEL 50%)
66-50
DP = --------- = 0,3 (-0,3)
66-14
MÉTODO DE RM. CÁLCULO III

DILUCIÓN DONDE ESTÁN LOS EFECTOS POSITIVOS POR ARRIBA DEL 50% = -5
DIST. PROPORCIONAL (-0,3) X LOG DEL FACTOR DE DILUCIÓN (LOG 10=1) = -0,3
SUMA (PUNTO FINAL 50%) = -5,3
ES DECIR QUE EN LA DILUCIÓN -5,3 TENEMOS 1DICT50%
INVERSA DE LA DILUCIÓN DONDE REACCIONA EL 50% = 5,3

TÍTULO DICT 50% / X 50 L = 10 5.3
ES DECIR QUE EN LAS SUSPENSIÓN PURA TENEMOS 199526 PARTÍCULAS
INFECCIOSAS (DETERMINADO POR ANTILOGARITMO)
MÉTODO DE RM. CÁLCULOIII
10 5.3 DICT 50% / 50 L
PRÁCTICA Nº5
TEMA: INOCULACION DE HUEVOS EMBRIONADOS
Materiales:
 Huevos embrionados (de preferencia)
 Ovoscopio
28
 Alcohol
 Algodón
 Parafiana (1 vela)
 Fosforo o encendedor
 Mechero
 Jeringa de tuberculina con aguja 21 x 1 ½
PROCEDIMIENTO:
1. Seleccione los huevos embrionados de 10 a 11 días de incubación y verifique la viabilidad
de los embriones por transiluminación.
2. Ordene los huevos en el soporte con la cámara de aire hacia arriba. Rotule con número
de material y fecha.
3. Con un algodón embebido en alcohol al 70%, limpie el área correspondiente a la cámara
de aire y deje secar.
4. Perfore con un punzón la cáscara al centro de la cámara de aire.
5. Con una jeringa de 1 ml. cargue 0.8 ml del material a inocular a una dilución adecuada
según las características del mismo (a los efectos de practicar el estudiante realizará las
inoculaciones con una solución de Azul de Metileno).Con el huevo colocado sobre la
lámpara, inserte la aguja en dirección del embrión, y pinche suavemente el mismo.
Verifique que el embrión sigue el movimiento de la aguja, (lo que indica que esta en el
lugar deseado), e inyecte 0.2 ml del material y de esa manera se inocula el saco
amniótico.
6. Retire algo la aguja, de modo de caer en la cavidad alantoidea, e inocule 0.2 ml.
7. Retire la aguja del huevo y selle el orificio con parafina o esmalte de uña.
8. Incube los huevos inoculados de acuerdo al procedimiento antes indicado, a 33oC durante
3 días.
COSECHA
1. Al finalizar el plazo de incubación, coloque los huevos inoculados durante la noche a 4 oC
para lograr una vasoconstricción que minimice el sangrado durante la cosecha.
2. Limpie con alcohol al 70% el área del saco de aire y deje secar y prepare 2 tubos por cada
huevo inoculado: uno con el número del material y AMN y el segundo con igual número
pero marcado ALA.
3. Rompa la cáscara del huevo que recubre la cámara de aire y con una pinza y una pipeta
estéril proceda a romper la membrana alantoidea y aspire el líquido contenido en la
cavidad depositándolo en el tubo marcado ALA.
4. Coseche el líquido amniótico con jeringa de 1 ml. Manipule con la pinza el embrión de
modo que no interfiera con la aspiración del líquido, y deposítelo en el tubo AMN.
5. Una vez terminada la cosecha e inspeccionado, los materiales en buenas condiciones
procedentes de varios huevos inoculados con la misma muestra podrán mezclarse,
para luego proceder a su testado por hemoaglutinación para verificar la presencia de
virus y determinar su concentración (título).
6. Inoculación de huevos embrionados. Se seleccionan huevos de planteles libre de

infecciones virales, observándolos en un ovoscopio o con iluminación adecuada. De
acuerdo al agente viral que se sospecha, será la vía de inoculación y por ende, la edad
del embrión (ver cuadro 1) a utilizar.
29
CUADRO 1
AISLAMIENTO VIRAL
CULTIVO DE TEJIDOS ANIMALES DE

LABORATORIO
PRIMARIOS LINEAS OTROS
Bovine RFB-TFB MDBK
Herpesvirus BOV. TURB.
Type 1(BHV-1)
Bovine Viral RFB-TFB MDBK
Diarhoea BOV. TURB.
Virus(BVDV)
Parainfluenza RFB-TFB MDBK
Type 3 (PI-3) BOV. TURB.
Bovine RFB-TFB MDBK
Adenovirus BOV. TURB.
(BAdV)
Foot and RFB-TFB BHK Ratón lactante (im., ic. o ip)
Mouse Disease TirFB Cobayo (adap)
(FMDV) MDBK
IBRS2
BOV. TURB
Vesicular EP.BOV VERO Ratón lactante
Stomatitis Virus
(VSV) CERDOS Huevos embrionados
MONO.COB. Cobayo-Conejo
Bovine Entero RFB-TFB BHK
Virus (BEV)
MDBK
BOV. T (RB)
Bovine RFB MA 104
Rotavirus
(BRV)
Bovine Corona Explantos
Virus (BCV)
Pox V Homólogo Huevos embrionados. MCA.
Clasical Swine RFP (sin ecp) PK15 (sin ecp)
Fever Virus TFP
(CSFV)
African Swine C Leucocitos VERO
Fever Virus MS
(ASFV)
30
Porcine RFP (IF HA)
Parvovirus
(PVP)
Pseudorabies RFP y B BHK Conejo (sc.)
Virus (PRV)
TFP y B MDBK Ratón lactante (ic.)
Fibroblasto de IBRS2 Huevo embrionado

pollo
PK15
Blue Tongue VERO Huevos embrionados (ev.)
Virus (BTV) BHK
Ovine - - Histopatología -
Pulmonar
Adenomatosis
(OPA)
VÍAS DE INOCULACIÓN
a. Cavidad Amniótica: el material inoculado ingresará en el embrión vía bucal y

respiratoria, pudiéndose multiplicar en cualquier tejido de éste. El embrión debe ser de
10-14 días de edad. Se desinfecta el extremo del huevo que posee la cámara de aire y
allí se perforará con un trócar o taladro adecuado. Con una aguja de 4,5 cm. de largo,
orientada hacia la sombra del embrión se inocula 0,1-0,2 ml de material (Ver figura 1).
Sellar el orificio con parafina fundida u otro sellador no tóxico.
b. Membrana corioalantoidea: Usada para virus que producen placas, lesiones

herpéticas o tipo pox. Los embriones deben ser de 10-12 días de edad. Se marca el
punto de inoculación en el costado del huevo donde se observa buena irrigación de la
membrana. Como es necesario hacer caer la membrana para obtener una buena
superficie, se desinfecta el extremo del huevo que posee la cámara de aire y el punto
de inoculación. Con sumo cuidado se perfora la cáscara y la membrana de la misma en
el punto de inoculación y se hace un orificio en la cámara de aire por donde se succiona
con una perilla de goma para que se produzca una falsa cámara de aire. Allí se
depositará el inóculo de 0,1 - 0,2 ml con jeringa y aguja de tuberculina (ver figura 1).
Sellar los orificios con parafina fundida u otro sellador no tóxico.
c. Cavidad alantoidea: el virus se difundirá en el fluido e infectará las células

ectodérmicas de la membrana. Se utilizan embriones de 10-11 días de edad,
Observándose el ovoscopio, se marca en el extremo de la cámara de aire, el punto de
inoculación que debe ser opuesto a la ubicación del embrión y con pocos vasos
sanguíneos. Se desinfecta y se perfora la cáscara en dicho punto, inoculando (0,1-0,2
ml) con una aguja de 1,5 cm de largo que se introduce paralela a la pared del huevo
(ver figura 2). Se sella con parafina fundida u otro sellador no tóxico.
d. Saco vitelino: se emplean embriones de 8-12 días de edad con gran saco vitelino, Se
desinfecta el extremo de la cámara de aire y se perfora la cáscara. Con una aguja en
31
línea recta (0,1 - 0,2 ml.) (ver figura 2). Se sella con parafina líquida u otro sellador no
tóxico.
e. Endovenosa: se emplean embriones de 8-12 días de edad. Observándose al

ovoscopio se selecciona una vena de buen grosor y que se dirija hacia el embrión. Se
dibuja en la cáscara su ubicación. Usando un taladro adecuado se marca un
rectángulo, enmarcando la vena y que sólo interese la cáscara, sin romper la
membrana que se encuentra por debajo de ésta. Se desinfecta la zona y con una aguja
bien fina se inocula (debe observarse cómo el inóculo al diluir la sangre, circula por la
vena). Ver figura 2. Se sella con parafina fundida u otro sellador no tóxico.
32
PRÁCTICA Nº6
TEMA: INOCULACIÓN DE ANIMALES DE LABORATORIO
Materiales:
 Ratones de 11 a 15 gr machos de preferencia 1 x grupo de 4 a 5 personas
 Ratones lactantes 3 a 5 , Con su madre. 3 x grupo de 4 a 5 personas
 Alcohol
 Algodón
 Jeringa de tuberculina con aguja 26 G
 1 rejilla
Introducción
Se inocula animales de laboratorios (ratones, conejos, cobayos, etc.) susceptibles a la
infección por el agente viral cuya presencia se sospecha. Este se multiplicará en el
hospedador experimental con la producción de diferente sintomatología, hasta en algunos
casos puede causarle la muerte.
Es un método sencillo, sensible y rápido aunque son pocos los virus animales de nuestro
interés que poseen huéspedes de laboratorio susceptibles (ver Cuadro 1). No obstante,
constituye una importante técnica en la identificación y caracterización de agentes (diagnóstico
diferencial).
Inoculación de Ratón Lactante
a) Vía Intracerebral: el punto de inoculación es la intersección de dos líneas una que va

desde el ojo a la oreja y la otra perpendicular a esta línea y cortándole por el centro. Se
utiliza aguja y jeringa de tuberculina con dosis menor a 0,02 ml.
b) Vía Intramuscular: se realiza la inoculación en la masa muscular del miembro
posterior, aspirando previamente pra asegurarse de no estar en vena. Se utiliza aguja y
jeringa similar al anterior
c) Vía intraperitoneal: sujetando el animal por la piel de la nuca con el índice y pulgar y
con el resto de los dedos por los miembros posteriores y cola, se lo presenta de cúbito
dorsal para inocularlo en un punto del lado derecho y centro del abdomen. Se utiliza
aguja y jeringa de tuberculina.
TECNICAS DE INOCULACIÓN Y SANGRIA DE ANIMALES
El animal debe estar suavemente sujeto por un manipulador experimentado que, siempre que
sea posible, deberá ser conocido por los animales. No hay tampoco que sobre valorar el papel
clave desempeñado por la persona que sujeta al animal y evidencia la vena.
La vena debe localizarse claramente (si se tienen dudas, es mejor no hacerlo y buscar ayuda)
y la punción llevada a cabo decididamente mejor que con vacilaciones. Puede que el animal
muestre signos de incomodidad (¡como nosotros!) por ejemplo, puede chillar, pero se le debe
tranquilizar, tratándole con suavidad y hablándole. Puede que se necesite alguna presión
próxima al lugar de oclusión del retorno venoso con el fin de obtener suficiente volumen de
sangre.
La gota de sangre formada puede retirarse con un tubo capilar o con una micropipeta con
punta de plástico.
Después de haber sacado la sangre, se debe mantener una presión suave pero firme sobre el
lugar durante unos 30 segundos, lo que detendrá rápidamente cualquier sangrado. También
hay varios preparados hemostáticos de alginato de calcio, fibrillas de colágeno y esponja
gelatinosa que pueden servir de ayuda si persiste el sangrado.
1) ¿Cuales son los animales comúnmente utilizados para estas pruebas?

a) Ratón
b) Rata
c) Hámster
d) Gerbo
e) Cobayo
f) Conejo
2) Describa La Técnica De Inyección intravenosa, intraperitoneal, Subcutánea,

Intramuscular.
A. RATÓN :
Intravenosa
Equipamiento: agujas de 27 - 30 g, jeringas 1 ml de TB, sujetador para ratón, lámpara de
calentamiento.
La vena lateral de la cola del ratón es el sitio más común para esta técnica. Mejores resultados
se logran si la cola se introduce en agua caliente o el ratón es calentado en la jaula con una
lámpara. Las venas se observan cuando la cola es levantada y girada lentamente en cualquier
dirección. La punta de la aguja puede verse como penetra en la vena. No obstante ser una
técnica de fácil aplicación práctica y entrenamiento es fundamental.
Intraperitoneal
Equipamiento: jeringas y agujas 23 - 27 g, ½ a 1 pulgada, preferiblemente con el
Bisel pequeño.
La inyección se aplica en el cuadrante izquierdo bajo como se observa, en la figura 7.
Figura 7.- Sujeción para la aplicación de la inyección intraperitoneal en ratón.
El uso del bisel pequeño en la aguja y su inserción a través de la piel, levantando la aguja en
contra de la pared abdominal, evita la posibilidad de punción en el intestino. Una rápida
administración del fluido puede causar daños en el tejido y hemorragia debido a la presión.
Si no se inmoviliza la pata derecha del ratón pudiera existir el riesgo de punción en los
intestinos. El máximo posible de administrar por esta vía a un ratón de 20 g es de 2 ml.
Subcutánea
Equipamiento: agujas de 25 a 27 g, ½ a ¾ pulgada con jeringas de TB.
Esta vía es utilizada como alternativa a la intramuscular en los ratones. El área escogida es el
hombro.
Como alternativa el abdomen ventral es usado utilizando la técnica de restricción de la figura 1.
Figura 1.- Métodos de sujeción y manipulación en el ratón para inyecciones intraperitoneales o

intramusculares.
Bibliografía
• Proceeding of 75th. Annual Meeting U.S. Animal Health Association, 1971

"Recommended Standard Laboratory Techniques for diagnosing infectious bovino
rhinotracheitis. Bovine virus diarrhea and Shipping fever (Parainfluenza-3)".
• Edwin H. Lennette, Nathalie J. Schmidt. "Diagnostic Procedures for Viral and Rickettsial
Disease". Third Edition.
PRACTICA Nº7
TEMA: CULTIVOS CELULARES
LOS CULTIVOS CELULARES Y SUS APLICACIONES I (CULTIVOS DE CÉLULAS

ANIMALES)
Los científicos han desarrollado metodologías para aislar células y obtener poblaciones
celulares homogéneas, que luego pueden ser incluso mantenidas y multiplicadas in vitro (“en
vidrio” = en recipientes especiales, en el laboratorio). Los cultivos celulares son esenciales en
la investigación científica, ya que permiten estudiar los procesos que ocurren en las células, y
en diversas aplicaciones de la biotecnología, como la producción de moléculas de interés
industrial, ingeniería de tejidos, etc.
¿Cómo se obtienen las células?

El primer paso para aislar células de un mismo tipo a partir de un tejido (generalmente formado
por células de diversos tipos) consiste en separar la matriz extracelular que las mantiene
unidas 1. Para lograrlo, la muestra de tejido es tratada con diversas enzimas proteolíticas
(como tripsina y colagenasas) que degradan las proteínas de la matriz; y también se utilizan
agentes (como el EDTA -ácido etilendiaminotetraacético) que secuestran al ión calcio, del cual
depende la adherencia celular. De esta forma, y mediante una suave agitación, se obtiene una
suspensión celular que contiene a todas las células presentes en ese tejido.
Para separar los diferentes tipos celulares se
pueden utilizar varios métodos:
I. La centrifugación, que permite separar a las células por tamaño.
II. La capacidad de adherencia al vidrio o al plástico que tienen algunos tipos celulares.
III. La unión a ciertos anticuerpos específicos para determinados componentes celulares.
Estos anticuerpos se usan unidos a diferentes matrices (colágeno, bolitas de
polisacáridos, de látex o de plástico). Las células unidas a la matriz (a través de los
anticuerpos) se recuperan por agitación, tratamiento con tripsina (digiere a las proteínas
que median la adhesión) o, en el caso de una matriz digerible (como el colágeno),
degradando la propia matriz con enzimas (como la colagenasa).
IV. La unión a ciertos anticuerpos acoplados a colorantes fluorescentes. Las células que
contienen un determinado componente son reconocidas y “marcadas” por los
anticuerpos. Las células marcadas son separadas de las no marcadas en un separador
de células activado por fluorescencia o cell sorter (Figura 1).
V. La disección de un grupo de células a partir de una sección de tejido preparada para
microscopía. La región que contiene las células de interés es irradiada con un láser,
que funde un pequeño círculo con las células que están por debajo. Estas células
capturadas son luego removidas para un posterior análisis. La técnica, denominada
“microdisección de captura por láser”, puede utilizarse para aislar y estudiar diferentes
partes de un tumor, por ejemplo. Otra técnica relacionada emplea un láser para disertar
un grupo de células y “catapultarlas” a un contenedor apropiado para un posterior
análisis (Figura 2).
Figura 1. Equipo para la separación de células marcadas por fluorescencia. Las células
individuales viajan a través de un conducto muy delgado y son iluminadas por un láser. El
equipo puede detectar qué células emiten fluorescencia (por el anticuerpo adherido). Cada
célula es incorporada en una gota que es “cargada” eléctricamente como negativa o positiva
en función de la presencia o ausencia del colorante fluorescente. Luego, las gotas son
separadas por un campo eléctrico hacia los recipientes colectores según su carga (adaptado
de Alberts y col., MBC 2002).
1
La matriz extracelular está compuesta por diferentes tipos de moléculas, entre las que se
encuentran los proteoglicanos, polisacáridos como el ácido hialurónico, y proteínas como el
colágeno, laminina, fibronectina, fibrina y elastina.
Figura 2. Técnica de microdisección para aislar células a partir de secciones de tejidos.

Este método emplea un láser para escindir una región de interés y eyectarla a un contenedor,
permitiendo el aislamiento de determinadas células (hasta células individuales) a partir de un
tejido (adaptado de Alberts y col., MBC 2002).
¿Cómo se cultivan las células?

La mayoría de las células animales y vegetales aisladas pueden vivir, multiplicarse, e incluso
presentar ciertas propiedades diferenciales, si se las cultiva en placas de plástico y con medios
de cultivo adecuados. Así, las células pueden ser observadas continuamente bajo el
microscopio o analizadas bioquímicamente, para estudiar los efectos del agregado o remoción
de moléculas específicas, como hormonas o factores de crecimiento. Además, se pueden
estudiar las interacciones entre células, cultivando en la misma placa más de un tipo celular.
Cuando los experimentos se realizan con cultivos celulares, se los denomina ensayos “in vitro”
(“en vidrio”), para diferenciarlos de aquellos que se llevan a cabo en organismos completos, o
experimentos “in vivo” (“en organismo viviente”)2.
Como se mencionó anteriormente, los cultivos se establecen principalmente a partir de
suspensiones celulares generadas por disgregación de tejidos. A diferencia de las bacterias, la
mayoría de las células que forman parte de tejidos no pueden vivir en suspensión, y requieren
una superficie sólida sobre la cual crecer y multiplicarse. Este soporte generalmente es la base
de una placa o frasco de plástico, aunque a veces los requerimientos son más complejos y el
plástico debe antes recubrirse con componentes de la matriz extracelular (sustancia que rodea
y contiene a las células en los tejidos, y con la cual interactúan), como por ejemplo el colágeno
y la laminina.
Experimento de Ross Harrison (1907), donde el explanto es la porción de tejido neural, incluido
en una gota de linfa. Adaptado de www.corning.com.
El cultivo de tejidos y células comenzó en 1907 con un experimento diseñado para esclarecer
una controversia en el área de la neurobiología. El investigador Dr. Ross Harrison, quien
trabajaba en la Universidad Johns Hopkins, publicó un breve pero crítico artículo
(“Observaciones de la fibra nerviosa viva en desarrollo”) que introdujo exitosamente una nueva
técnica, el cultivo de tejidos, para demostrar experimentalmente cómo se originan las fibras
nerviosas. Los experimentos originales con fibras nerviosas se basaron en el cultivo de
pequeños fragmentos de tejidos, llamados “explantos”. Utilizando técnicas asépticas, Harrison
tomó fragmentos del tubo neural (tejido embrionario precursor del sistema nervioso) de un
embrión de rana, y lo depositó en una gota de líquido linfático fresco (“medio de cultivo”) de
rana colocada sobre un cubreobjetos estéril. Una vez que la linfa coaguló, invirtió el
cubreobjetos sobre un portaobjetos de vidrio que poseía una depresión, creando así un cultivo
en gota suspendida, técnica utilizada por los microbiólogos para estudiar las bacterias. Luego
de periódicas observaciones al microscopio, pudo describir el desarrollo de fibras nerviosas in
vitro a partir de las neuronas presentes en el tejido extirpado. Así, además de argumentar
sólidamente la “doctrina neural”, resolvió los problemas básicos del cultivo celular, como el
medio, la observación y la contaminación.
2
En los laboratorios de bioquímica, por in vitro se entienden aquellas reacciones químicas que
se llevan a cabo en un tubo de ensayo en ausencia de células, mientras que in vivo se refiere a
las reacciones químicas que ocurren dentro de la célula, aún en cultivo.
CULTIVOS PRIMARIOS
Se denominan así a aquellos cultivos preparados directamente a partir de un tejido u órgano.
Pueden iniciarse con o sin fraccionamiento previo para separar los distintos tipos celulares. En
estos cultivos las células están vivas, conservan sus características originales y su
proliferación es limitada. Pueden ser removidas del recipiente de cultivo para formar cultivos
secundarios (figura 3).
CULTIVOS SECUNDARIOS
En estas condiciones las células suelen multiplicarse hasta cubrir la superficie del recipiente de
cultivo, formando una monocapa (capa de una célula de espesor). Como consecuencia del
contacto entre las células se detiene temporalmente su proliferación, hasta que se las
subcultiva a un recipiente con medio fresco. Así, podrán subcultivarse durante semanas o
meses. En este estadío, las células frecuentemente mostrarán distintas propiedades según su
origen. Por ejemplo, los fibroblastos (células que sintetizan fibras y mantienen la matriz
extracelular del tejido de muchos animales) secretarán colágeno, las células derivadas de
tejido muscular esquelético se fusionarán para generar fibras musculares con capacidad
contráctil espontánea, las células nerviosas extenderán prolongaciones (axones)
eléctricamente excitables que podrán conectarse (establecer sinapsis) con otras células
nerviosas, las células epiteliales formarán largas capas con varias propiedades de un epitelio
intacto (figura 4). Gracias a que estos fenómenos ocurren en cultivo, es posible estudiarlos con
diferentes metodologías, a veces no aplicables a tejidos intactos.
CULTIVOS CONTINUOS O LÍNEAS CELULARES

La mayoría de las células de los vertebrados dejan de dividirse luego de un determinado
número de divisiones en cultivo, por un proceso llamado senescencia celular. Por ejemplo, los
fibroblastos humanos normales se dividen solamente entre 25 y 40 veces en cultivo, antes de
detenerse. En estas células, así como en muchas otras, la capacidad limitada de proliferación
es el resultado de un acortamiento progresivo de los telómeros (porción de ADN que se
encuentra en los extremos de los cromosomas). En las células somáticas (todas las células
que no son células sexuales) se encuentra “apagado” el gen que codifica para la enzima
telomerasa, que se encarga de mantener la integridad de los telómeros; como consecuencia,
los telómeros se acortan en cada división celular.
A los fibroblastos humanos se los puede forzar a proliferar indefinidamente si se les provee el
gen que codifica para la telomerasa; así, pueden propagarse como una línea celular
“inmortalizada”.
Pero como se mencionó, no todas las células humanas se inmortalizan de la misma manera.
Algunas células, a pesar de que sus telómeros permanezcan largos, pueden frenar sus
divisiones celulares como consecuencia de la activación de mecanismos denominados “puntos
de control” (check points) del ciclo celular. Para inmortalizar estas células, hay que lograr la
inactivación de los check-points. Una forma de hacerlo es introducir ciertos “oncogenes” (genes
promotores del cáncer) que pueden obtenerse de virus que causan cáncer, como algunas
cepas del virus del papiloma humano, adenovirus, etc.
Figura 4. Células en cultivo.

A) Micrografías de contraste de fase de fibroblastos en cultivo.
B) Micrografías de mioblastos en cultivo mostrando las células fusionadas para formar células
musculares multinucleadas.
C) Células precursoras de oligodendrocitos en cultivo.
D) Células de tabaco en cultivo
Figura 3. A diferencia de las células humanas, las de los roedores no tienen “apagado” el gen
de la telomerasa, por lo que sus telómeros mantienen el largo a través de las divisiones
celulares. Pero cuando son cultivadas, esas células experimentan cambios genéticos que
inactivan los mecanismos de check-point, produciendo líneas celulares inmortalizadas
espontáneamente. Ambos tipos de líneas celulares son muy útiles en la investigación celular,
como fuente de un gran número de células uniformes, que pueden ser conservadas y
almacenadas en nitrógeno líquido (a -196 °C) por un período muy largo de tiempo, reteniendo
su viabilidad y siendo un buen modelo experimental para las primeras etapas de una
investigación.
A pesar de la gran similitud que las células de una línea tienen entre sí, no son idénticas. La
uniformidad genética en una línea celular puede mejorarse por clonado celular, a través del
cual se aísla una sola célula, la que prolifera para formar una colonia de células clonales
(idénticas). Una de las aplicaciones más importantes de esta estrategia es el aislamiento de
líneas celulares mutantes que poseen defectos en ciertos genes. Su estudio puede servir para
inferir el papel que tiene la proteína ausente o alterada en las células normales.
Entre los cultivos celulares más promisorios, desde el punto de vista médico, se encuentran las
líneas de células madre embrionarias humanas. Estas células, obtenidas del macizo celular
interno de un embrión en los primeros estadios del desarrollo, pueden proliferar
indefinidamente reteniendo la habilidad de originar cualquier tipo celular del cuerpo. Estos
cultivos celulares podrían revolucionar la medicina al proveer de células capaces de
reemplazar o reparar tejidos dañados. Hay otras fuentes de células madre que se están
investigando en tejidos adultos, como la médula ósea y el cordón umbilical.
LOS HIBRIDOMAS
Se sabe que es posible fusionar dos células formando un heterocarionte (o heterocarion), es
decir, una célula con dos núcleos separados pero con los contenidos citoplasmáticos
compartidos. Para lograrlo, se trata una suspensión de células con compuestos que inducen la
fusión de membranas (fusógenos), tales como el polietilenglicol (PEG) o ciertos virus.
Eventualmente, un heterocarionte puede entrar en mitosis, produciendo una célula híbrida en
la cual las envolturas de ambos núcleos se han disgregado, permitiendo juntar los
cromosomas de ambos en un único gran núcleo. Tales células híbridas pueden clonarse
estableciendo una línea celular, pero se sabe que en muchos casos la línea resultante es
inestable genéticamente, y tiende a perder parte del material genético.
En 1975, un equipo integrado por el científico argentino César Milstein, desarrolló, mediante la
técnica de fusión, una línea celular híbrida clave para la producción de anticuerpos
monoclonales (todos iguales) para fines terapéuticos y de diagnóstico: los hibridomas (este
desarrollo llevó al Dr. Milstein a ser galardonado con el Premio Nóbel). Los hibridomas son
líneas resultantes de la fusión de dos tipos celulares: linfocitos B secretores de
inmunoglobulinas (anticuerpos) y células derivadas de una línea tumoral de linfocitos B (figura
5 de la fusión se obtiene una mezcla heterogénea de células, y con un medio de cultivo
especial se seleccionan las células fusionadas que producen anticuerpos y proliferan
indefinidamente. Estos hibridomas son propagados como clones individuales, y cada uno de
ellos sirve como una fuente estable y permanente de un anticuerpo monoclonal. Dicho
anticuerpo reconoce un único epítope antigénico (es decir, una pequeña porción de una
proteína). Una de las ventajas de los hibridomas, en comparación con los cultivos clonales de
linfocitos B, es que estos últimos tienen una vida limitada en cultivo.
Figura 5. Preparación de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales contra un

antígeno en particular. El medio de cultivo selectivo utilizado luego de la fusión celular
contiene un inhibidor que bloquea las rutas de síntesis de los nucleótidos. Como
consecuencia, las células deben utilizar una vía alternativa para fabricar sus ácidos nucleicos.
Esta vía es defectiva en la línea celular mutante derivada del tumor de linfocitos B, pero está
intacta en las células de bazo (linfocitos B) obtenidas del ratón inmunizado. Debido a que
ninguna de las células utilizadas para la fusión inicial puede crecer por sí sola, sólo las células
híbridas o hibridomas sobreviven.
¿Qué contienen los medios para el cultivo de células?

Hasta los años ´70, el cultivo de tejidos parecía ser producto de una mezcla de ciencia y
alquimia. De a poco, los fluidos coagulados (como en el experimento de Harrison) fueron
reemplazados por placas con medios líquidos que contenían pequeñas cantidades de una
serie de moléculas necesarias para la supervivencia y multiplicación celular: sales, glucosa,
aminoácidos y vitaminas. Además, la mayoría de los medios incluían una mezcla poco definida
de macromoléculas adicionadas bajo la forma de suero fetal bovino o equino, o extracto crudo
de embriones de pollo. Dichos medios se siguen utilizando en la actualidad para los cultivos de
rutina, y por lo tanto es difícil saber qué macromoléculas requiere un determinado tipo celular
para funcionar y multiplicarse. Como consecuencia, se desarrollaron numerosos medios
químicamente definidos, denominados “libres de suero”, que poseen, además de las pequeñas
moléculas mencionadas, varias proteínas específicas necesarias para la supervivencia y
proliferación, como los factores de crecimiento. Así, gracias a estudios que buscaban
establecer las condiciones mínimas de cultivo para un comportamiento celular adecuado, se
descubrieron muchas moléculas de señalización extracelulares esenciales para la
supervivencia, desarrollo y proliferación de determinados tipos celulares.
Los medios de cultivo son generalmente tamponados para mantener un pH alrededor de 7,4 y
tienen, además, indicadores de pH, como el rojo fenol, que cambian de color a medida que
aparecen catabolitos ácidos como resultado del metabolismo celular. Suelen agregarse
también antibióticos y antimicóticos para impedir la contaminación con microorganismos.
Composición de medios Vitaminas Sales Otros Proteínas

de cultivo para células compuesto requeridas en
de mamífero s* los medios
Aminoácidos definidos libres
de suero
Arginina Biotina NaCl Glucosa Insulina
Cisteína Colina KCl Penicilina Transferrina
Glutamina Folato NaH2PO4 Estreptomic Factores de
Histidina Nicotinamid NaHCO3 ina crecimiento
a Anfotericina específicos
Isoleucina CaCl2
Leucina Pantotenato MgCl2 Rojo fenol
Lisina Piridoxal Suero fetal
Tiamina bovino
Metionina
Fenilalanina Riboflavina
Treonina
Triptofano
Tirosina
Valina
PRACTICA Nº8
TEMA: OBTENCIÓN DE BACTERIOFAGOS DE E. COLI.
1. Aislamiento de Bacteriófagos:
Introducción:
• Los bacteriófagos son parásitos de las bacterias importantes como instrumento de
identificación de especies bacterianas.
• Así como instrumento epidemiologico en la tipificación de fagos de staphylococcus y
salmonella.
• Sirve como vector de material genético, estudio en biología molecular y genética.
2. Objetivos:
• Demostrar la contaminación en la muestra por fagos como indicadores de
contaminación en forma rápida y segura.
3. MATERIALES Y EQUIPO:
• Tubos de ensayo
• Tubos de dunkan.
• Placas petri.
• Pipeta de 10, 1 ml
• Probeta de 100 ml.
• Erlenmeyer de 250 ml
• Mechero Bunsen
• Baño maría.
• Balanza de platillo.
• Estufa.
• Autoclave.
• Incubadora.
4. PROCEDIMIENTO:
• Autoclave los materiales antes de limpiarlos.
• Limpiar con cepillo y agua corriente.
• Colocarlos en detergente y hervir por 15´.
• Enjuagar 6 veces.
• Embeber 1h. En Hcl 0.05% 1N.
• Enjuagar 3 veces.
5. REACTIVOS:
5.1 Caldo enriquecido para fagos (C.E.F):
• ClNa 5 g.
• Peptona 5 g.
• MgSO4.7H2O 0.20g.
• MgSO4.4H2O 0.05g.
• Estrac. de lev.3g.
NOTA: Autoclave a 121°c por 15´ a 15 Lbrs.
6. Método Directo: Demostración cualitativa.

6.1 Trabajo de la cepa:
• Uso de cepa E. Coli B.
• Repicar unas colonias al C.E.F incubar 24h a 35°c.
• Tomar 0.2ml de la primera incubación y colocarlo en otro tubo con C.E.F. Incubar
por 3h a 35°c.
• En este caso la bacteria se encuentra en etapa logaritmica de desarrollo.
6.2 Trabajo con la Muestra:

• Tomar 10 ml de muestra de agua contaminada.
• Proceder a diluir 1/10, 1/100,1/1000, etc, en 90ml de agua.
6.3 Obtención de Colifagos:

• Licuar 3ml de A.B.E.F. Mantenerlo a 45-50 °c.
• Agregar 2 gotas de Cl2Ca al 1.5%.
• Agregar 0.2 ml de del C.E.F con las bacterias incubadas x3h.
• 1ml de la muestra diluida y homogenizada.
• Vertirlo a la placa petri q tiene el A.E.F.
• Homogenizar e incubar a 35°c por 24h.
7. Resultados:
• Luego de incubarlos la lisis aparecera a las 4h.de incubación.
• Esto demuestra la rapidez de la prueba.
PRÁCTICA N° 9
TEMA: DE HEMOAGLUTINACIÓN E INHIBICIÓN DE HEMOAGLUTINACIÓN
Una de las propiedades de muchos virus es la habilidad para poder aglutinar

(hemoaglutinación) puede ser dividido dentro de tres categorías:
1. El grupo de los myxovirus en el cual las partículas virales misma es el agente

hemoaglutinante.
La propiedad infecciosa de los virus no puede ser separada de la propiedad
hemoaglutinante. Estos virus tienen la propiedad enzimática con el subsecuentemente
se produce elución con los glóbulos rojos.
2. Virus con los cuales la partícula infectiva no puede ser separado de las partículas
infectivas no puede ser separado de las partículas hemoaglutinante, pero las cuales no
posen actividad enzimática por elución con el virus. Este grupo incluye a los arbovirus.
3. Virus que durante la replicación produce una hemoaglutinina que es distinta de la

partícula infecciosa. Esto incluye algunos poxvirus y miembros de la psitasicosis.
La hemoaglutinación es inhibida por antisuero específico esto es llamado como inhibición a

la hemoaglutinación y puede ser usado para el serodiagnóstico o identificación de partícula
viral.
ESPECIE DE GR SUSCEPTIBLES A LA AGLUTINACIÓN POR DIFERENTES VIRUS
VIRUS ESPECIE DE GR OBSERVACION

SUSCEPTIBLES PARA
HA
Herpes simplex Herpes simplex Herpes simplex
Varicella
Herpes Zoster
Poxvirus Pollo. Solo 50 % de los La hemoaglutinación es
GR de ave es susceptible separable de la partícula
Vaccinia
a la HA. infecciosa.
Variola
Los GR de pavo es No ay elusión con los GR.
Cowpox (vacuna) susceptible a Vaccinia.
La IHA puede ser usado
para el Dx.
Sarampión GR de monos Rhesus. También produce
hemolisina viral. No ay
elusión del virus por GR.
La IHA puede ser usado
para el Dx.
Myxovirus Cobayo, pollo y humano Cepa especifica pu3ede
ser usado para la
Influenza
ident6ificacion de cepas y
Parainfluenza serodiagnóstico. Los virus
Parotiditis son e luidos
enzimáticamente. La
hemaglutinina no se
puede separar de la
partícula infecciosa.
Adenovirus Rata, mono Rhesus Agrupado de acuerdo a la
aglutinación de GR de la
sp. .Hemaglutinina no
separable de la partícula
infecciosa. Virus no
eluidos por los GR
enzimaticamente.
Reovirus humano IHA puede ser usado para
tipificar el serodiagnóstico.
No eluyen los GR por el
virus.
Arbovirus GR de pollo o de ganso Depende del pH La IHA se
usa para el Dx. No hay
elusión del virus por los
GR. La hemaglutinina no
infecciosa.
ECHOVIRUS Humano Los tipos difiere con la
temperatura para la
máxima aglutinación.
Coxsackie A Humano Hemaglutinina no
Coxsackie B Humano fetal
infecciosa. Los virus no
eluyen los GR
Poliovirus Ninguno
Virus basofilicos Raton, Hamster La elusión ocurre a los
4 °C específica para
Tracoma
agrupar, no especifico
Psitasicosis para tipear hemoaglutinina
Linfogranuloma no separable del virus.
venéreo
HEMOAGLUTINACIÓN (HA) ARBOVIRUS
Principio:
La HA por Arbovirus depende del ph. Es necesario, por lo tanto para determinar el pH óptimo
para cada antígeno (Ag).
Reactivos:
 Ag. Preparados en Cultivo celular o en ratones lactante.

 Solución Alsever.
 Hematíes de ganso adulto.
 Solución Stock de Buffer (monobásico, dibásico)
 Solución stock de borato salino pH 9 (BS)
 Solución de albúmina bovina (AB) fracción V al 0.4 % en borato salino (ABBS) pH 9.
 Solución suero fisiológico (NaCl al 0.9 %)
 Desinfectante.
Equipos y materiales:
 Estufa regulada a 37 °C.
 Congeladora a –20 °C
 Refrigeradora.
 Balanza analítica
 Dispensador automático.
 Potenciómetro
 Espejo bicóncavo
 Micropipeta multicanal 25 – 250 ul.
 Micropipeta unicanal 2 – 20 ul y 20 – 200 ul.
 Propipetas
 Papel filtro
 Tubos 13 x 100
 Viales
 Bandeja con hielo
Procedimiento:
Obtención de hematíes de ganso
 Tener un ganso adulto, macho (las hembras no se utilizan ya que los cambios del ciclo
hormonal pueden cambiar los títulos hemoaglutinantes), de preferencia realizar el
sangrado como mínimo una vez por semana.
 Rextraer sangre de la vena radial del ganso, empleando una jeringa con aguja N° 20.
Colectar la cantidad necesatria para la prueba (una parte de sangre mas 3 de Alsever).
Guardar la sangre de ganso a 4 °C. no debe utilizarse pasado los 10 días.
 Lavar el volumen de sangre requerido para la prueba tres veces con solución salina.
Centrifugar a 1500 RPM por 10 minutos a 4 °C.
 Una vez lavados los hematíes de ganso re suspender al 0.5 % con cada uno de los
buffer de los diferentes (pH Ver Anexo). Comprobar su densidad óptica empleando filtro
de 490 nm (La densidad óptima es de 0.75).
Prueba propiamente dicha:

1. Rehidratar cada Ag liofilizado con agua destilada y diluir 1:10 en frío con 0.4 % de
albumina bovina fracción V en borato salino, pH 9.0
2. Permitir a cada Ag para disolverse totalmente toda la noche a 5 °C.
3. Realizar diluciones seriada del Ag en placas de microtitulacion, agregar 0.1 ml a la
primera cavidad.
4. Agregar 0.05 ml de 0.4 % a todas las cavidades de las placas.
5. Utilizando micropipeta de 0.05 ml hacer diluciones seriadas sucesivamente.
6. agitar suavemente.
7. La suspensión de GR. a diferente pH agregar 0.05 ml /cavidad.
8. Agregar en primera cavidad de la ultima fila 100 ul de la suspensión de GR usada.
9. incubar a T° ambiente.
Interpretación:
 Hemoaglutinación completa: Punto donde a hemoaglutinación es completa +
 Hemoaglutinación parcial: Se considera positiva pero no es leído como punto
medio +/-.
 No hemoaglutinación formación de un botón de hematíes.
PRÁCTICA N° 10
TEMA: PRUEBA DE ELISA, DIAGNÓSTICO RÁPIDO
INTRODUCCIÓN
La técnica ELISA (Enzyme Linked Inmunoabsorvent Assay) se basa en la detección de un
antígeno inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos que directa o indirectamente
producen una reacción cuyo producto, por ejemplo un colorante, puede ser medido
espectofotométricamente. Este principio tiene muchas de las propiedades de un
inmunoensayo ideal: es versátil, robusto, simple en su realización, emplea reactivos
económicos y consigue, mediante el uso de la fase sólida, de una separación fácil entre la
fracción retenida y la fracción libre.Además se han propuesto y desarrollado diferentes
métodos de amplificación de la señal (luminiscentes, cascadas enzimáticas,...) que han
permitido elevar la sensibilidad de algunos ELISA a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo)
hormonal.
Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se
precisaba la cuantificación de productos mediante anticuerpos: diagnóstico clínico, detección
viral, clasificación de anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos monoclonales, etc.
Dispositivos empleados en ELISASe han ensayado numerosas fases sólidas, desde los
tubos de cristal de los orígenes a las actuales microplacas de 96 pocillos de plástico tratado
para aumentar su capacidad de absorción de moléculas y con fondos de pocillo ópticamente
claros para poder realizar las medidas de densidad óptica en instrumentos específicos,
espectrofotómetros de lectura de placas que han recibido el nombre de lectores ELISA.
Actualmente se están desarrollando dispositivos de mayor capacidad, por ejemplo con 384 y
1536 pocillos, adecuados para los sistemas de 'screening' masivo de los sistemas robotizados
(HTS, 'High troughput system').
Los lectores ELISA son espectrofotómetros capaces de realizar lecturas seriadas de cada uno
de los pocillos de la placa ELISA. A diferencia de un espectrofotómetro convencional, con
capacidad de leer todas las longitudes de onda del ultravioleta y el visible de manera continua,
los lectores de ELISA disponen de sistemas de filtros que sólo permiten la lectura de una o
pocas longitudes de onda. Son la que se corresponden con las necesarias para determinar la
densidad óptica de los cromógenos más comúnmente utilizados.
FASES DE UN ENSAYO ELISA

Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes:
Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina,...). El
anticuerpo conjugado al enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc.
El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de antígeno.
Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o antígenos se
realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas.
Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a

la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o
empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti primario marcado (ELISA
indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse unir uno o más
anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa
se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones
de antígeno frio frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de competición
del antígeno.
Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todas las moléculas
marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en
solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante espectrofotometría.
En el esquema se muestra la reacción asociada a un ELISA directo.
TIPOS DE ENSAYOS ELISA
ENZIMA SUSTRATO TAMPÓN

10 mg/25 mL de tampón citrato sódico 0.15 M pH 5; añadir microL de
OPD
30% peróxido de hidrógeno 30%
2.5 mg/250 microL de DMSO; hasta 25 ml con tampón citrato sódico
TMB
0.1M pH 6; añadir 5 microL de peróxido de hidrógeno 30%
60 mg/100 mL de tampón citrato sódico 0.1 M pH 6; añadir 35 microL
ABTS de peróxido de hidrógeno 30%; parar con fluoruro sódico 1.25%; leer
a 405 nm
HRP 10 mg/20 mL de tampón Tris 50 mM pH 7.4; filtrar y añadir 20 microL
DAB
(peroxidasa de peróxido de hidrógeno 1%
de rábano) 6 mg en 1 mL de metanol; añadir 10 mL de tampón Tris 50 mM pH
CNP
7.4; filtrar y añadir 40 microL de peróxido de hidrógeno 30%
80 mg en 1 mL de N,N'-dimetilformamida + 200 microL de tampón
AEC acetato 0.1 M pH 4.5; filtrar y añadir 50 microL de peróxido de
hidrógeno 30%
80 mg/100 mL de agua destilada caliente; ajustar a pH 6.0 con 1 mM
ASA NaOH y añadir 10 % por volumen de 0.05% peróxido de hidrógeno;
parar con 25 microL de NaOH 1 M
5 mg/5 mL de tampón dietanolamina-HCl 0.1 M pH 9.8 +1 mM cloruro
PNPP
de magnesio
(A) 4 mg de fosfato de naftol en 200 microL de dimetilformamida en
AP NAPFB un tubo de vidrio, (B) 10 mg de sal Fast Blue BB/ 10 ml de tampón
(Fosfatasa Tris 0.05M pH 9.2 - 2 mM cloruro de magnesio. Mezclar A + B y filtrar.
alcalina) (A) 4 mg de fosfato de naftol en 200 microL de dimetilformamida en
NAPR un tubo de vidrio, (B) 10 mg de sal Red BB/ 10 ml de tampón Tris
0.05M pH 9.2 - 2 mM cloruro de magnesio. Mezclar A + B y filtrar.
BCIP 1 mg/mL en solución AMP (2-amino-2-metil-propanol)
2.5 mg/ml en tampón fosfato sódico 0.1 MpH 7.0 + 1 mM cloruro de
beta-G ONPG
magnesio + 0.1 M beta-mercaptoetanol
8 mg/1.48 ml de 0.01M NaOH; llevarlo a 100 ml con agua
ureasa BP desionizada; añadir 100 mg de urea y EDTA a 0.2 mM; ajustar elpH a
4.8 con 1 mM NaOH o HCl; almacenar a 4ºC
Añadir a cada placa de ELISA 25 microL de cada uno de los reactivos
siguientes en secuencia : (A) 1% (peso/vol) gelatina en 0.1 M tampón
fosfayo pH 7.0, (B) 1% (peso/vol) almidón en agua destilada caliente,
PG IS
(C) 3.04 mg/mL de benzil-penicilina en 0.1 M tampón fosfato pH 7.0
(5000 U/mL), (D) 0.01 N ioduro en 0.1 M KI solución stock (en una
botella oscura)
Se han desarrollado múltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la

cuantificación de un antígeno en solución, la detección de un anticuerpo en una solución (por
ej. en el clonaje de anticuerpos monoclonales), o la determinación de la subclase (idiotipo) de
un anticuerpo. A continuación se describen los más comunes.
ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan recubriendo
los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban
con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antígeno en la solución analizada. Es
necesario incluir controles negativos que serán muestras del mismo tipo de las analizadas
(sangre, orina, ...) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno buscado.
Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antígeno buscado,
o bien se le ha añadido).
ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de una forma idéntica a la anterior. Los
controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos
anticuerpos : uno primario contra el antígeno, y uno secundario marcado contra el primario. La
detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señál debida a la unión
de dos o más anticuerpo secunadarios por cada primario. Es el ensayo más popular, como lo
es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema
enzimático permiten cuantificar una gran cantidad de antígenos.
ELISA 'sandwich'. (ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se
trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-
antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que
se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer
anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una
solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de
antígeno estará unido a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al
menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la
amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.
MARCADORES ENZIMÁTICOS MÁS COMÚNMENTE UTILIZADOS

En la tabla siguiente se recogen los marcadores enzimáticos más comúnmente empleados en
ensayos ELISA, los sustratos que se emplean para su revelado y el modo de prepararlos.
ELISA DE CAPTURA DE IGM

PRINCIPIO DE LA TECNICA
Las tiras serán sensibilizadas con una Inmunoglobulina de carnero anti IgM humana, la cual
reaccionara con los anticuerpos de clase IgM presentes en la muestra del paciente. Al
adicionar el antígeno del virus del Dengue (VD) este reaccionara con las Inmunoglobulinas M
capturadas previamente si estas son específicas para el VD. Posteriormente se adiciona el
conjugado, formado por inmuglobulinas anti VD acopladas a la enzima peroxidasa del rábano.
Si las reacciones previas han sido específicas el conjugado reaccionará con el antígeno del
VD. Cuando se adiciona el substrato este es degradado por la enzima peroxidasa
traduciéndose en un cambio de color en la reacción en las muestras positivas.
APLICACIÓN:
La detección de IgM específica contra el virus del Dengue (VD) es un método rápido, sencillo y
económico, que tiene una elevada sensibilidad y especificidad, por lo que constituye el sistema
de elección para la vigilancia seroepidemiológica del Dengue. Los resultados de esta técnica
deben interpretarse con cuidado, porque dependen en gran medida del momento en que se
tome la muestra y del tipo infección (primaria o secundaria) que presente la
persona afectada.
ELISA IPK - DENGUE (CUBA)

Todos los reactivos deben retirarse de la refrigeradora para que alcancen la temperatura
ambiente.
MATERIALES, REACTIVOS Y PREPARACION

• Placas de poliestireno de 96 pocillos separables en tiras. Cuando las tiras no estén en uso
guardarlas en la bolsa y mantenerlas en refrigeración.
• Solución para Lavado (1 x 100 ml)

Antes de utilizarlo poner en baño de María para disolver cristales. Preparar una solución 1:25
con agua destilada en un volumen de 450 ml por placa. Se utiliza para los lavados de las
placas, para diluir el antígeno y conjugado.
• Controles Positivos y Negativos listos para usar.
• Diluyente de Muestra (1 x 3 ml)

Se prepara una dilución 1:25 con agua destilada y queda lista para utilizarla en las diluciones
de las muestras (preparar según necesidad).
• Suero Humano Negativo a Dengue (SHN)
Se utiliza en la preparación de la solución diluyente del antígeno y el conjugado, y se prepara

inmediatamente antes de usarlo.
• Antígeno Liofilizado (6 x 2 ml).

Antígeno inactivado de virus Dengue (vienen los 4 serotipos) se van a reconstituir los viales
necesarios para el uso con 2 ml de solución de lavado conteniendo SHN al 0.5%.
3 ml Solución de lavado / SHN 0.5 0.5 _________ 100
2 ml al Vial de Ag X _________ 3 ml
= 15 μl SHN
Para 3 ml S.Lavado
• Conjugado Antidengue-peroxidasa (1 x 0.2 ml)
Se prepara una solución de lavado al 5% con SHN.
5 __________ 100 ml 250μl de SHN + 5 ml de Soluc. Lavado

X __________ 5 ml
Para la dilución del conjugado se pone 30 μl de conjugado en 2 ml de la solución de lavado -
SHN al 5%. Esto se prepara según necesidad.
• Sustrato (OPD) Liofilizado (6 x 5 ml)

Reconstituir cada vial al momento de su uso con 5 ml de agua destilada, esperar hasta su
completa disolución y añadir 2 μl de Peróxido de Hidrógeno, homogeneizar.
TECNICA DE ANALISIS
1. Preparar un protocolo de trabajo identificando la posición de cada muestra y los controles.

2. Realizar una dilución 1:20 con el diluyente de muestras 1:25.
10μl de muestra + 190μl de diluyente.

3. Dispensar 50 μl de la dilución 1:20 y 50 μl de los controles: 2 positivos y 4 negativos Sin
diluir.
4. Incubar 2 horas a temperatura ambiente en Cámara Húmeda.
5. Lavar la placa 5 veces con solución de lavado y secar sobre papel toalla.
6. Dispensar 50μl de antígeno preparado según las instrucciones, incubar toda la noche a 4°C
en Cámara Húmeda.
8. Dispensar 50μl por pozo del conjugado diluido, incubar 1 hora a 37°C en cámara húmeda.
10. Reconstituir cada vial de substrato con 5 ml de agua destilada + H2O2
11. Dispensar 100μl en cada pozo e incubar 30 minutos, pasado este tiempo detener la
reacción adicionando 100μl de Acido Sulfúrico al 12.5% en el mismo sentido en que se
añadió el substrato.
12. Leer la microplaca y medir la D.O. a 492 nm ajustar el blanco contra aire.
CALCULO DE RESULTADOS.
• Calcular la media de la D.O. de los controles negativos y multiplicarlo por 2 (Valor de Corte)
• Calcular la media de la D.O. de los controles Positivos. Es válida la prueba si la media de los
controles positivos es mayor o igual a 5 veces el valor de la media de los controles negativos.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS EN LA DETERMINACION DE IgM ESPECÍFICA

CONTRA EL VIRUS DEL DENGUE
La presencia de IgM específica contra el virus del Dengue en una de muestra de suero significa
que esta persona se ha infectado recientemente con este virus. Los resultados negativos deben
interpretarse cuidadosamente. Una muestra tomada antes del 7mo día de iniciados los síntomas
puede resultar negativa. En este caso debe tomarse una segunda muestra o auxiliarse de otro
método diagnóstico. En las infecciones secundarias o terciarias la IgM puede fallar en un
porciento bajo, en ese caso se puede auxiliar de otros métodos serológicos que determinen
fundamentalmente IgG anti virus del dengue.
CONTROL DE CALIDAD
En cada ensayo debe incluirse 3 controles negativos y 2 controles positivos, un positivo alto y un
positivo bajo. Los controles negativos deben presentar valores de absorbancia inferiores a 0.2. El
control positivo alto debe presentar valores de absorbancia superiores a 1.00 y el control positivo
bajo debe resultar siempre con valores de absorbancia superiores al valor de corte.
Periódicamente un panel de sueros conocidos (aproximadamente de 20 muestras) debe
procesarse para evaluar el comportamiento de la técnica.
Se debe participar en las pruebas de proficiencia organizadas por IPK y CDC.
PRÁCTICA N° 11
TEMA: PRUEBA DE INMUNOFLUORESCENCIA
Materiales
 Uno a dos 2 ratones de 11 a 15 gr de preferencia machos.

 Laminas cubre y porta objetos
 Microscopio de inmunofluorescencia
 Cámara húmeda
 Micropipetas (20ul, 50 ul, 100ul)
 Pipetas
 Equipo de disección
 Guantes de cirugía
 Mandil (guardapolvo)
 Mascarilla
 Recipiente con desinfectante (solución jabonosa)
 Estufa 37°C
PROCEDIMIENTO DE OBTENCION DE MUESTRAS

.
 Sujetar firmemente la cabeza del animal a una superficie de trabajo.
 Realizar una incisión profunda a lo largo de la línea media del cráneo, empezando
por delante y encima de los ojos hasta la base del cráneo o cuello, a través de la piel,
fascia y músculo.
 Separar la piel lo máximo posible, exponiendo los huesos del cráneo.
 Realizar cuatro cortes al cráneo con una sierra, asegurándose de atravesar todo el
cráneo: un corte transversal inmediatamente detrás de los cuernos, dos cortes
longitudinales al lado izquierdo y derecho del hueso frontal y un corte transversal
encima de los ojos uniendo los dos cortes anteriores.
 Levantar la tapa del cráneo con un desarmador para exponer las meninges y el
cerebro.
 Cortar las meninges, levantar el cerebro y colocarlo en un papel absorbente limpio.
 Retirar porciones (del tamaño del cerebro de un can) de corteza, cerebelo, asta de
Ammón y médula y depositarlas en una placa petri o en envases primarios para su
envío respectivo.
 Rotular la muestra con el código correspondiente.
MICROSCOPIO DE INMUNOFLUORESCENCIA
1.1 FUNDAMENTO
1.1.1La función del microscopio de fluorescencia es proveer luz necesaria para

excitar un colorante fluorescente y luego transmitir esta luz al observador. En
inmunofluorescencia, el colorante más utilizado es el isotiocianato de fluoresceína
(ITCF), debido a su gran afinidad por las proteínas (globulinas).
1.1.2 Para entender el fundamento de esta técnica es necesario conocer el fenómeno

que ocurre cuando un compuesto es irradiado con energía luminosa. Al irradiar el
colorante ITCF, la energía excita las moléculas, desubicando los electrones de los
átomos de su núcleo central (absorción de energía). Como el ITCF es un compuesto
luminiscente, emitirá nuevamente energía luminosa en forma de luz visible de una
longitud de onda más larga.
1.1.3Para el diagnóstico de rabia se emplea este principio, utilizando un microscopio de
fluorescencia que presenta una fuente de iluminación de luz ultravioleta y mediante un
sistema de lentes y filtros se amplifica la imagen de la reacción del compuesto marcado
con ITCF con el antígeno. Para realizar la observación es necesario contar con una
habitación poco iluminada (“cuarto oscuro”).
1.2 OBJETIVO
Establecer los procedimientos a seguir para el empleo y mantenimiento del
microscopio de fluorescencia
1.3 MATERIALES
 Microscopio de fluorescencia (epifluorescente)

 Aceite de inmersión no fluorescente (Merck) o glicerina pura
 Lámina control positiva (coloreada con ITCF)
1.4 PROCEDIMIENTOS DE USO
1.4.1 Antes de encender el microscopio, verificar que los objetivos y oculares estén
limpios. Si es necesario, limpiar con papel lente seco. Nunca tocar los lentes con los dedos.
1.4.2 Enchufar el microscopio y encender la fuente de poder (algunos microscopios

poseen un indicador de prendido). El encendido debe realizarse de 3 a 5 minutos antes de
iniciar cada sesión de lectura, para permitir que la lámpara emita energía con adecuada
intensidad.
1.4.3 Colocar la lámina porta-objeto coloreada en la platina, sin tocar el objetivo
1.4.4 Enfocar el campo con el objetivo de 40X, utilizando el micrométrico, evitando que la
lámina toque al objetivo. Con el micrométrico, enfocar para lograr una imagen clara.
1.4.5 Mover el sistema, agregar aceite de inmersión no fluorescente o glicerina pura y

enfocar con el objetivo de 100X.
1..4.6 Ubicarse en el extremo superior izquierdo, recorrer la lámina a la derecha y

luego hacia abajo recorriendo ordenadamente toda la lámina.
1.5 PROCEDIMIENTOS DE MANTENIMIENTO
1.5.1 El microscopio presenta una lámpara de mercurio, la cual debe encenderse en una
sola sesión de lectura debido a que cada encendido equivale a 3 horas de vida de
la lámpara. Cuando la intensidad de luz disminuye notoriamente es necesario
cambiar la lámpara por otra, de acuerdo a los siguientes pasos:
1.5.1.1 Desconectar el equipo y dejar enfriar la lámpara a temperatura ambiente (caso

contrario, existe el peligro de explosión).
1.5.1.2 Abrir la caja que contiene la lámpara y retirarla aflojando los tornillos ubicados en
ambos lados.
1.5.1.3 Coger la nueva lámpara por los extremos (sin tocar el bulbo con los dedos) y
colocarla en la caja portadora ajustando en ambos lados.
1.5.1.4 Cerrar adecuadamente la caja portadora.
1.5.1.5 Si hubieran manchas en la superficie de la lámpara, limpiarla con un algodón

embebido en alcohol.
1.5.1.6 Los objetivos y oculares se limpiarán al inicio y término de cada sesión de lectura
con bencina ligera o alcohol, para remover las manchas y/o el aceite de inmersión.
1.5.1.7 Proteger el equipo contra temperaturas superiores a 50ºC, humedad, sustancias

químicas y contra el polvo, utilizando fundas protectoras de tela.
SECCION 2
ENSAYOS O ANÁLISIS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE

RABIA
2.1 RESUMEN DE LOS ENSAYOS (Anexo D)
2.1.1 Para el diagnóstico de rabia se emplean dos pruebas de rutina: la prueba de

inmunofluorescencia directa (IFD) y la prueba biológica de inoculación en
ratones (IR). Ambas pruebas poseen una alta sensibilidad y especificidad.
2.1.2 La prueba de IFD es una prueba rápida, con alta sensibilidad y que permite
obtener resultados en unas pocas horas. Por el contrario, la prueba de IR posee
una mayor especificidad, pero los resultados
se obtienen en 21 días, además que confirma el diagnóstico de pruebas negativas
por IFD.
2.1.3 En la prueba de IFD es necesario titular el conjugado antirrábico, buscando

encontrar la dilución óptima de éste.
2.1.4 De acuerdo a las recomendaciones del Comité de Expertos de Rabia de la

Organización Mundial de la Salud (OMS), un diagnóstico positivo en cualquiera de las dos
pruebas es concluyente.
2.1.5 La prueba de seroneutralización (neutralización del suero) en ratones es un

procedimiento serológico que se utiliza para determinar si una persona o un animal
está protegido contra la rabia.
2.2 PRINCIPIO Y UTILIDAD DEL ENSAYO DE INMUNOFLUORESCENCIA

DIRECTA
La IFD, debido a su rapidez y sencillez, es la primera prueba que se utiliza para el
diagnóstico de rabia. Si el resultado de la prueba es negativo, se procederá a realizar la
inoculación en ratones. La prueba de IFD detecta el antígeno rábico de la impronta mediante
el uso del conjugado antirrábico que contiene globulinas marcadas con ITCF.
2.3 PRINCIPIO Y UTILIDAD DEL ENSAYO DE INOCULACIÓN EN RATONES

La prueba de inoculación en ratones es una técnica sencilla, basada en procedimientos
rigurosos. Esta inoculación se realiza en ratones debido a su alta susceptibilidad al virus
rábico y se manifiesta con una sintomatología clásica (erizamiento, parálisis, postración y
muerte). Una vez muerto el animal se procede a realizar la prueba de IFD para determinar
si la muestra inoculada es positiva a rabia.
2.4 PRINCIPIO Y UTILIDAD DEL ENSAYO DE SERONEUTRALIZACIÓN PARA LA

DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS ANTIRRÁBICOS
La prueba de neutralización del suero en ratones es un procedimiento serológico que se
utiliza para determinar si una persona o un animal está protegido contra la rabia. Este
método determina la cantidad de anticuerpos presentes en el suero y se basa en la
neutralización de una serie de diluciones de suero con una dosis constante de un virus de
desafío previamente titulado. Los resultados son expresados en términos de títulos
serológicos, definidos como la dilución más elevada que neutraliza una cantidad estándar
de virus.
SECCIÓN 3
TÉCNICA DE INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA PARA LA DETECCIÓN DEL

ANTÍGENO RABICO
3.1 PRINCIPIO Y UTILIDAD

La técnica de inmunofluorescencia directa está basada en la reacción antígeno-
anticuerpo que ocu-
rre al enfrentrar la impronta positiva (antígeno) con el conjugado antirrábico
(anticuerpos). Esta reac- ción puede ser detectada mediante la luz ultravioleta del
microscopio de inmunofluorescencia.
3.2 ESQUEMA Y SIMBOLOGÍA
Figura Nº 1. Esquema de lámina de IFD para rabia
SIMBOLOS
Antígeno
rábico
Isotiocianato de
fluoresceína
Conjugado
antirrábico
Figura Nº2. Simbología empleada en la técnica de

inmunofluorescencia
3.3 FUNDAMENTO
3.3.1 Si las improntas de cerebro y cerebelo contienen virus rábico, el resultado de la

prueba será positiva
3.3.2 El antígeno está fijado y permeabilizado. Se añade una gota de conjugado antirrábico+
CRN a la impronta cercana al lado pavonado y otra gota de conjugado antirrábico +
CVS a la impronta alejada del lado pavonado. Luego, se incuba los porta-objetos a
37ºC por 30 minutos. Si la impronta tiene antígeno rábico, se unirá el conjugado
antirrábico + CRN a la impronta del lado izquierdo, formando el complejo antígeno-
anticuerpo. En la impronta que contiene el conjugado + CVS no se unirán los
anticuerpos a la impronta porque ya están tomados por el CVS. Estos complejos
conjugado + CVS serán retirados durante los lavados con el PBS.
CRN + conjugado CVS + conjugado
3.3.3 La unión del conjugado antirrábico al antígeno rábico es detectada mediante la

excitación de la luz ultravioleta que se observa por la fluorescencia de color verde limón emitida
por el fluorocromo (FITC).
LÁMPARA DE
MERCURIO
Luz ultravioleta
Fluoresce
ncia
CRN + conjugado CVS + conjugado
3.4 MATERIALES Y REACTIVOS

 Solución salina tamponada, pH 7,2-7,4
 Conjugado antirrábico diluído 1/5 con CRN al 20%
 Conjugado antirrábico diluído 1/5 con CVS al 20%
 Acetona Q.P.
 Aceite de inmersión (Merck) ND 1,515 o glicerina pura
 Porta-objetos pavonados en un extremo
 Pipeta de transferencia o gotero
 Agua destilada
 Beaker de 1000 mL
3.5 PROCEDIMIENTO
3.5.1 Examen y lavado de la muestra
3.5.1.1 Luego de desembalar y verificar la codificación de las muestras se procede a

codificar las fichas con el código del laboratorio y el respectivo día de procesamiento, así como
su ingreso en el registro de muestras para diagnóstico de rabia (Anexo E).
3.5.1.2 Si la muestra fue remitida conteniendo glicerina 50%, se procederá a realizar un

lavado utilizando suero fisiológico (solución salina estéril 0,09%).
3.5.1.3 Colocar el cerebro y cerebelo en una placa petri y llevar a una mesa de trabajo
3.5.1.4 Realizar con la tijera un corte longitudinal al nivel de la primera circunvolución

caudal cortando para- lelamente a la línea que divide ambos hemisferios. El corte
se extenderá de 3 a 5 cm hacia delante, profundizándose hasta ubicar el
ventrículo lateral a nivel de una estructura de color blanco nacarado
en forma de cuerno, que sobresale lateralmente del suelo del ventrículo.
Esta estructura es el hipocampo o asta de Ammon, que al corte transversal
muestra una estructura típica de contorno espiralado (“pionono”).
3.5.1.5 Se realizarán dos cortes más, uno a nivel de la corteza cerebral y otro en el
cerebelo, siempre procurando coger la sustancia gris con un espesor de 3 a 4 mm.
3.5.1.6 Realizar dos láminas de la corteza, asta de Ammon y cerebelo en el caso de

animales menores (felinos y caninos). Para el caso de animales mayores
(bovinos) se realizarán cuatro láminas de las mismas zonas, con especial interés
en el cerebelo.
3.5.1.7 Los cortes de cada una de las estructuras se colocan sobre una tira de papel
secante o filtro y éste sobre un bajalengua.
3.5.1.8 Tomar un porta-objeto limpio y colocarlo con el bajalengua, formando una

cruz. Realizar dos impresiones en cada lámina procurando que la impronta no
sea muy gruesa. Si la impronta fuera muy gruesa, se podrá adelgazar
presionando la impronta sobre el papel filtro.
3.5.1.9 Colocar las láminas secas en un coplin con acetona fría (-20ºC) por un mínimo de
30 minutos.
3.5.1.10 Una vez seca la impronta, se procederá a delinear los bordes de ambas improntas
con un corrector líquido (liquid paper).
3.5.1.11 Diluir el conjugado antirrábico previamente titulado 1/5 con la suspensión de CRN o
agua destilada
3.5.1.12 Diluir el conjugado antirrábico con la suspensión de CVS 1/5
3.5.1.13 Agregar una gota de la mezcla del CRN + conjugado a la impronta más cercana del
extremo pavonado o que contenga el código.
3.5.1.14 Agregar una gota de la mezcla del CVS + conjugado a la impronta más alejada del
extremo pavonado.
3.5.1.15 Llevar a la estufa a 37ºC por 30 minutos
3.5.1.16 Lavar con solución salina tamponada pH 7,2-7,4 y dejar reposar por 10 minutos
3.5.1.17 Lavar con agua destilada
3.5.1.18 Dejar secar y observar a 100X con aceite de inmersión o glicerina pura, sin colocar
laminilla a la impronta.
3.5.1.19 La observación de las láminas se iniciará en el extremo superior izquierdo y
proseguirá hacia la derecha y luego hacia abajo, asegurando la observación
ordenada de toda la impronta.
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
3.6.1 Lámina control positivo: La impronta teñida con CRN + conjugado muestra un
campo oscuro con células nerviosas, en cuyo interior o exterior, se observan
estructuras redondeadas (corpúsculos rábicos) o pequeños puntos de color
verde limón (Figura Nº 7). En el lado de la impronta teñida con CVS + conjugado,
no deberá observarse fluorescencia de color verde limón.
3.6.2 Lámina control negativo: Ambas improntas no mostrarán ningún tipo de

fluorescencia.
3.6.3 Láminas problema: Si la lámina se asemeja al control positivo, significará que

la muestra es positiva; si se asemeja al control negativo, significa que la
muestra es negativa, hasta que se emita el resultado de inoculación en ratones.
Figura Nº3. Fotografía microscópica de una impronta de cerebro positivo a rabia

marcada con conjugado antirrábico. (Fotografiada por R López,
Laboratorio de Referencia Nacional de Rabia)
3.7 PRECAUCIONES
3.7.1 Cuando las muestras contienen glicerina 50% en agua destilada se lavará con
solución salina fisiológica 0,09% por 5 a 10 minutos, pudiéndose utilizar agua
destilada.
3.7.2 Si la muestra contiene preservantes como alcohol o formol, descartarla y obtener

en lo posible una nueva muestra que reúna las condiciones indicadas.
3.7.3 Si la muestra está demasiado contaminada (al punto de liquefacción), descartarla y

avisar al remitente.
1. Preparación de reactivos: Soluc. Stock 10 x hanks Earle y P.B.S., Sclue.

Indicadores de pH, Soluc. De Bicarbonato.
2. Preparación de reactivos: Soluc. Stock 10 x hanks Earle y P.B.S., Sclue.
Indicadores de pH, Soluc. De Bicarbonato.
3.8 PROBLEMAS EN LA FLUORESCENCIA
3.8.1 La lámina control positivo de la impronta de CRN + conjugado no presenta

fluorescencia.
Explicación: La lámina tiene muchos días de preparación. En este caso es
necesario volver a preparar láminas control.
3.8.2 La impronta de CVS + conjugado presenta fluorescencia en la lámina control

positivo.
Explicación: El CVS ha bajado su título y ya no inhibe a los anticuerpos
coloreados del conjugado.
3.8.3 La impronta de CRN + conjugado y la del CVS + conjugado presentan

fluorescencia en la lámina control negativo.
Explicación: Presencia de precipitado o fluorescencia inespecífica. Observe si la
morfología es irregular debido a las sales de fluoresceína.
3.8.4 En la lámina problema la impronta de CRN + conjugado y la del CVS + conjugado

presentan fluorescencia.
Explicación: Posible contaminación bacteriana. Observe la morfología
característica de bacilos o coco bacilos. Pudiera ser también conjugado
inespecífico que se presenta en forma de cristales. En estos casos, centrifugue el
conjugado para eliminar la coloración inespecífica.
FUENTE DE REFERENCIA
INS Manual de procedimientos para el diagnóstico de la rabia, Norma técnica N° 3 Año: 2002.
PRÁCTICA N° 12
TEMA: PRUEBA DE WESTERN BLOT, LIA (PRÁCTICA DEMOSTRATIVA)
INTRODUCCION
Propósito para identificar proteínas utilizando anticuerpos. (Este ensayo identifica las proteínas
más específicamente que el ensayo por Inmuno histoquímica).
Pasos básicos: (Estos pasos no incluyen el bloqueo, lavados, etc.)
Aislar las proteínas.
• Ejecutar las proteínas (eléctricamente) a través de un gel Polyarcrilimida
• Seque las proteínas en una membrana nitrocelulosa (eléctricamente)
• Aplicar los anticuerpos primarios a la membrana (unirá a las proteínas de estar
presente).Aplicar anticuerpos secundarios - (unirá al anticuerpo primario). Este
anticuerpo está conjugado con una etiqueta fluorescente o luminosa (o molécula) que
reacciona con un sustrato para producir un resplandor.
 Aplicar sustrato. Este reacciona con la etiqueta en el anticuerpo secundario y si la
proteína fluorescente original estaba presente en el primer lugar.
• Rayos X detecta la luminiscencia, y las bandas se producen en estos puntos.
 Las bandas representan las proteínas de diferentes tamaños medidos en kilo Daltons
(KDa).
Bandas más abajo en la mancha representan proteínas más pequeñas. Esto se puede medir
con relación al testigo. El control contiene proteínas conocidas en kDa conocida, que puede
ser utilizado como una referencia

Guía de prácticas de virología: preparación de soluciones

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GUÍA DE PRÁCTICAS DE VIROLOGÍA

PROFESOR: JORGE A. SAMAMÉ MÁRQUEZ

TEMA: SOLUCIONES DESINFECTANTES EN VIROLOGÍA

CLORO: HIPOCLORITO SÓDICO

Alcohol y mezclas alcohólicas

1. SEÑALE 5 EJEMPLOS DE AGENTES ETIOLÓGICOS VIRALES PARA CADA UNO DE

TEMA: PREPARACIÓN DE REACTIVOS: SOLUC. STOCK 10 X HANKS EARLE Y

PREPARACION DE SOLUCIONES BUFFERADAS

Na2HPO4 1150.00 1150.00 1150.00 48.00

Soluciones balanceadas son básicamente buffer fosfatos salinos.

PREPARACIÓN DE BUFFER Y SOLUCIONES PARA INMUNOBLOT

C.1 PREPARACIÓN DE BUFFER Y SOLUCIONES PARA INMUNOBLOT

C.1.1 Buffer Tris/HCl 0,05M, pH 8,0

C.1.2 Solución de tratamiento de muestra

C.1.3 Solución colorante marcador de corrida

C.1.4 Solución stock de poliacrilamida

C.1.5 Buffer de gel de enpaquetamiento 0,5 M, pH 6,8

C.1.7 Solución de persulfato de amonio (APS) al 10%

C.1.8 Solución de Dodecil sulfato de sodio (SDS) al 10%

C.1.9 Buffer de corrida (superior/inferior)

Tabla C1. Fórmula de concentración de gel de empaquetamiento y de separación o de

C.2 PREPARACIÓN DE BUFFER PARA LA TRANSFERENCIA

C.3 PREPARACIÓN DE SOLUCIONES PARA REACCIÓN IMUNOENZIMATICA

C.3.2 Buffer de lavado

C.3.3 Buffer de bloqueo y diluyente

C.3.4 Solución reveladora

PREPARACIÓN DE BUFFER Y SOLUCIONES PARA DOBLE DIFUSIÓN

D.1 SOLUCIÓN SALINA TAMPONADA (SST) 0,1M, pH 7,4

D.2 GEL DE AGAR NOBLE

D.3 SOLUCION COLORANTE

D.4 SOLUCION DECOLORANTE

PREPARACIÓN DE BUFFER Y SOLUCIONES PARA ELISA

E.1. TRIS-HCl 0,01M, pH 7,5

E.2 BUFFER FOSFATO SALINO 0,01M, pH 7,2 (PBS)

E.3 BUFFER DE LAVADO

E.4 BUFFER DE BLOQUEO Y DILUYENTE

E.5 SOLUCIÓN ESTABILIZADORA PARA EL SUSTRASTO

E.6 SOLUCIÓN DEL SUSTRATO

E.7 Ácido Sulfúrico 2,5 M

F.2 BUFFER FOSFATO DILUYENTE (PBS+Tween 80 al 1%)

F.3 SOLUCIÓN DE AZUL DE EVANS (SOLUCION STOCK)

F.4 BUFFER CARBONATO – BICARBONATO 0,5M pH 9,5

F.5 GLICERINA TAMPONADA

G.2 BUFFER FOSFATO SALINO (PBS) 0,15 M

G.3 SOLUCIÓN DILUYENTE

G.4 ÁCIDO TANICO SOLUCION STOCK

Solución de trabajo: 1/20000

TEMA: PREPARACIÓN DE MEDIO DE TRANSPORTE PARA OBTENCIÓN DE

1. El diagnóstico de laboratorio correcto y oportuno depende del cuidado con que se

LABORATORIO DE REFERENCIAL DE SALUD

A continuación se describen, en ORDEN ALFABETICO, los procedimientos adecuados de

M1. EXPECTORACION (ESPUTO)

M2. EXUDADO CUTANEO

M3. EXUDADO FARINGEO

M4. EXUDADO NASOFARINGEO

M5. EXUDADO URETRAL

M6. EXUDADO VAGINAL Y ENDOCERVICAL

M7. FROTIS SANGUINEO

M9. GOTA GRUESA

M11. HISOPO RECTAL

M12. IMPRONTA DE LESIONES CUTANEAS

M13. LAVADO FARINGEO