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abstrait

Le thermophile anaerobe Thermoanaerobacterium saccharolyticum JW / SL-YS485 a été analysé


pour la production de n-butanol.L'application systématique avancée permettait de démontrer la
fonctionnalité de composants hétérologues de la n-butanol clostridique , d'évaluer

l'expression gènique et l'activité enzymatique de l’organisme. Par la suite, L'intégration de la voie de


large type d’espece da s'est traduite par une production de n-butanol de 0,85 g / L de 10 g / L xylose,
ce qui correspond à 21% du rendement maximal théorique. Ensuite,

l'intégration de la formation de n-butanol a été empêchée de produire de l'acétate de n-butanol. La


voie du n-butanol dans les souches déficientes actées a donné lieu à une production de n-butanol de
1,05 g / L à partir de 10 g / Lxylose, ce qui correspond à 26% du maximum théorique.

2013Publié parElsevierInc.on est lauréat deInternationalMetabolicEngineeringSociety 1.


Introduction Il y a un effort intensif pour développer une technologie de production durable de
carburant de transport de la biomasse complète (Grayson, 2011, Lyndetal., 2008, Olson et al., 2012)
et le

n-butanol a attiré l'attention dans le contexte (Dong et al., 2012; Dürre, 2008). Alors que plus de 80
milliards de litres d'éthanol sont utilisés actuellement comme carburant de transit (Smith et al.,
2012), le butanol n'est pas utilisé aujourd'hui comme combustible de transit dans une mesure

significative, bien qu'il ait un impact potentiel sur la transformationmodécodynamique des hydrates
de carbone, de la densité énergétique et physique. propriétés plus fongibles avec l'essence, par
exemple avec un pipeline (Dürre, 2008). La voie de n-butanol la plus étudiée est celle de

Clostridium acetobutylicum et d'autres clostridies apparentées qui ont été utilisées à partir des
années 20 dans le processus de Weizmann (Jones et Woods, 1986). Les gènes impliqués dans le
parcours ont été clonés, les protéines ont été caractérisées (Boyntonetal, 1996, Fischer et al., 1993,

Petersen et Bennett, 1991, Stim-Herndon et al., 1995), et les mécanismes de contrôle associés au
rasage acide et dissolvante étude (Gheshlaghi et al., 2009). Dans C. acetobutylicum, les gènes
primaires responsables de la production de n-butanol sont thl, hbd, crt, bcd, etfA, etfAB, adhE2 et

adhE1 (JonesandWoods, 1986; Nöllingetal., 2001) exprimant l'enzyme benzymesthiolase, ß-


hydroxybutyrylCoAdehydrogenase, crotonase, butyrylCoAdehydrogenase, sous-unité de
flavoprotéines électro-transférantAndBandthebi-functionalenzymealdehyde-alcohol-dehydrogenaset

quiactiventetactiventlesbosubstratsacétyl-CoAandbutyrylCoAforethanoletn-butanolproduction,
respectivement.Manymesophilesincluding Escherichiacoli, Bacillussubtilis, Pseudomonasputida et
Lactobacillusbrevis ont été mis au point pour produire du n-butanol par expression hétérologue de

ces gènes à partir de C. acetobutylicum (Atsumietal., 2008; Berezinaetal., 2010; Inuietal., 2008;
Nielsenetal., 2009). Utilisation des processus biotechnologiques de type bactérien, antimicrobien et
anaérobie, ont été mis au point pour permettre aux agriculteurs potentiels de tolérer des

changements potentiels, y compris un risque réduit de contamination, des taux de réaction plus
élevés et des coûts différentiels plus faibles pour le chauffage et le refroidissement (Barnard et al.,
2010; 1979). La SoucheM571 de Thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum (anciennement
Clostridiumthermosaccharolyticum) a été rapportée pour produire du n-butanol (Freierschroderetal.,
1989) bien que ce ne soit pas systématique (Demainetal., 2005; Hilletal., 1993; Mistry et Cooney,
1989). De plus, le n- Cependant, les bactéries putatives responsables de la production de n-

butanol sont présentement en présence de T. thermosaccharolyticum DSM 571 (Hemme et al.,


2010). Il semble que les gènes (crt, bcd, etfB, etfA, hbd et thl) responsable de la formation de CoA du
butyryl-Cooccursamulti-geneoperon. La souche JW / SL-YS485 de

Thermoanaerobacteriumsaccharolyticum, étroitement apparentée à T.thermosaccharolyticum, a été


bien caractérisée et développée de façon extensive. une bactérie anaérobie isolée du parc national
de Yellowstone (Shao et al., 1995). Ce micro-organisme croît entre des températures de 45

et 65 ° C et entre 4,0 et 6,8 (Shawetal., 2008a). T.saccharolyticum est capable d'utiliser une variété de
sarments trouvés dans la biomasse le glucose, le xylose, le mannose, le galactose, et l'andabinose. Il
peut catalyser le xylane, un composant important de la biomasse cellulosique, ainsi que le

mannane, la starchandpectine et l'andinaturellement compétents, ce qui en fait un atout inapte pour


les manipulations génétiques (Shawetal., 2010). Il On a mis au point des catalyseurs pour produire
des rendements élevés en éliminant les gènes présents dans l'acide organique et la production

de H2, en dirigeant le flux de carbone et d'électrons vers l'éthanol (Shawetal., 2008b, Shawetal.,
2009). En allégeant ses capacités d'utilisation et sa disponibilité de développé, T.saccharolyticum est
un hôte intéressant pour la production de n-butanol hétérologue. Ici, l'ingestion de

T.saccharolyticum pour produire du n-butanol donne un rendement significatif. 2. Matériels et


méthodes 2.1. Souches bactériennes et conditions de croissance Les souches bactériennes utilisées
dans ce travail sont listées dans le tableau 1. Pour T.

Des expériences de transformation de .saccharolyticum allstrain ont été faites à55 1C inTSC1medium
(Shawetal., 2011), contenant par litre - 5 gofcellobiose, 1,85 g de (NH4) 2SO4, 0,05 g de FeSO4 ?
7H20, 1,0 g de KH2PO4, 1,0 g

de MgS04, 0,1 g de CaCl2? 2H2O, goftrisodiumcitratedihydrate, 8,5 g de yyextrait, 2 mg de


resazurine, 0,5 g de L-cystéine-HCl. Forsolidmedium, 12gofagar a été ajouté. Le pH a été ajusté à 6,7
pour la sélection de la kanamycine

(200 ug / ml). Des comparaisons de croissance ont été faites dans du milieu TSD (Shawetal., 2012) à
551C, contenant par litre - 1,85 g de (NH4) 2S04, 0,05 g de FeS04ß7H20, 1,0 g de KH2P04, 1,0 g de
MgS04, 0,1 g de

CaCl2a2H2O, 2 g de citrate trisodique, 0,5 g d'extrait de myéline, 2 mg de p-amino. benzoacide,


2mgthiamine-HCl, 0,01 mg de vitamine B12, 0, 12 gméthionine. La source de calcium était 10 gxylose
et le pH était ajusté à 6,1. E.

coli a été cultivé dans un milieu LB, supplémenté avec 1,5% de gélose et 50 µg / mL de kanamycine
ou 100 µg / mL d'ampicilline appropriée. Saccharomycescerevisiae wasgrowninYPDor SD-
Uramedium comprend les conditions de

croissance (Shanks et al., 2006). 2.2. Réactifs et produits chimiques Des produits chimiques ont été
obtenus à Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) ou BDDifco (Franklin Lakes,
NJ). Les enzymes de
restriction et DNApolymerase (Phusion) ont été obtenues du Nouveau-Brunswick, Biolabs (Ipswich,
MA), et les oligonucleotides ont été commandés à partir de l'IDT (Coralville, IA). 2.3. Constructiondes
Plasmides Des techniques

standardisées de clonage (Shanksetal., 2006) ont été utilisées pour la construction de


plasmasexprimant les gènes individuels du n-butanol. Les individus / genecluster
d'intérêtencodinging chaque enzymaticstep thl (Tthe_1656), hbd

(The_1657), crt (Tthe_1661), et bcd (Tthe_1660), etfA (The_1658), etfB (The_1659) de


T.thermosaccharolyticum DSM571and adhE2 Tableau 1 Souches et plasmides utilisés dans l'étude.
Souche / plasmide Spectregenotype pertinent

Souches de référence T.saccharolyticum DSM 8691Typestrain DSMZ C. acetobutylicum


ATCC824Typestrain ATCC T.thermosaccharolyticum DSM571Typestrain DSMZ InvSc1
MAThis3D1leu2trp1-289ura3-52 Invitrogen M0355

T.saccharolyticum? Ldh? Pta? Ack Shawetal. (2011) M0210 T.saccharolyticum? Ldh , ermR
GiftfromMascomaCorp. M0350 T.saccharolyticum? Pta? Ack? PyrF Shawetal. (2011) Athl M0355,
kanR, thl (Tt) Cette étude Ahbd M0355,

kanR, hbd (Tt) Cette étude Acrt M0355, kanR, crt (Tt) Cette étude Abcd- etfAB M0355, kanR, bcd,
etfA, etfB (Tt) Cette étude AadhE M0355, kanR, adhE2 (Ca) Cette étude I2B T.saccharolyticum, thl
(Tt), hbd (Tt), crt (Tt), bcd (Tt),

etfA (Tt), etfB (Tt), adhE (Ca), KanR Ceci étude M0210-V M0210, thl (Tt), hdb (Tt), crt (Tt), bcd (Tt),
etfA (Tt), etfB (Tt), adhE2 (Ca), KanR Cette étude Plasmides pYC2 / CT S. cerevisiae-E.coli vecteur de
clonageInvitrogen pMU131

T.saccharolyticum-E.coli plasmide navette, KanR, AmpR Shawetal. (2010) pMC500 T.saccharolyticum-


E. coli navette plasmide, KanR GiftfromDevinCurrie pTHL pYC2 / CT, KanR, thl (Tt) a Cette étude pHBD
pYC2 / CT, KanR, hbd

(Tt) b Cette étude pCRT pYC2 / CT, KanR, crt (Tt) c Cette étude pBCD-etfAB pYC2 / CT, KanR, bcd (Tt)
d, etfA (Tt) e, etfB (Tt) f Cette étude pADHE pYC2 / CT, KanR, adhE (Ca) g Cette étude pBu24 pMC500,
thl (Tt), hdb (Tt), crt

(Tt), bcd (Tt), etfA (Tt), etfB (Tt), adhE2 (Ca), KanR a thl (Tt), thiolase provenant de
T.thermosaccharolyticum (Tthe_1656). b hbd (Tt), ß-hydroxybutyrylCoAdehydrogenasefrom
T.thermosaccharolyticum (The_1657). c crt (Tt),

crotonase de T.thermosaccharolyticum (Tthe_1661). dbcd (Tt), butyrylCoAdehydrogenase


(Tthe_1660). e etfA (Tt), sous-unité protéique de l'électro-transfert (The_1658). f etfB (Tt), sous-unité
des protéines de l'électro-transfertB (The_

1659) de T.thermosaccharolyticum. g adhE2 (Ca), aldéhyde-alcool déshydrogénase de C.


acetobutylicum (CA_P0035). (CA_P0035) provenant de C. acetobutylicum ATCC824 ont été utilisés
comme promoteur de

T.saccharolyticumpta-ack. Les gènes ont été individuellement clonesinplasmidpYC2 / CT (Invitrogen,


GrandIsland, NY) flanqués par les régions amont et aval du locus pta-ack de T.saccharolyticum pour
chromosomalinsertion avec
sélection avec une cartouche de résistance à la kanamycine (Maietal., 1997) (figure 1a).
T.saccharolyticum non réplicatifplasmidpBu24wasconstructed dans E. coliTop10 (Invitrogen,
GrandIsland, NY) en utilisantGibsonassembly

(Gibson et al., 2009) (Fig.2a) pourexpressionoftententire n- voie de butanol. AdhE (de C.


acetobutylicum ATCC824), genecluster crt, bcd, etfB (de T.thermosaccharolyticum DSM571)
fusedtopromoter gapDH (de C. thermocellum

ATCC27405), genecluster etfA, hbd, thl (de T.thermosaccharolyticum DSM571) fusedtopromoter cbp
(de C . thermocellum ATCC27405) et de la résistance à la kanamycine recombinante
wéréclonedinplasmidpMC500, aderivative de

pMC200 (Currie et al., 2013) contenant des régions amont et aval de xynA. Les séquences complètes
pour tous les plasmides sont disponibles sur les figures S1-S6. 2.4. La construction de l'ADN des
souches de Saccharolyticums

a été amplifiée via PCR à partir des plasmides pTHL, pHBD, pCRT, pBCD-etfAB, et pADHE. Les régions
amplifiées par PCR comprenaient les régions amont et aval du locus pta-ack qui fournissaient
l'homologie à T.saccharolyticum,

la geneofinterest (thl ou hbd ou crt ou bcd et etfA et etfB ou adhE) et le


kanamycinresistancegene.StrainM0355 (Shawetal., 2011) un

l'éthano-génique de T.saccharolyti- cum a été transfor- mé avec lesproduitsprofessionnels du


PCRAthl, Ahbd, Acrt, Abcd- etfABandAadhE (figure 1b). Transformationofthe non
replicativeplasmidpBu24wasattemptedinfourstrainsof T.

saccharolyticum pour chromosomalintegration (figure 2b.) - type sauvage, M0210, M0350,


andM0355 (LDH pta (LDH?) (GiftfromMascomaCorp.) (Pta ack?) (Shaw et al., 2011)? ? ack)
(Shawetal., 2011). Transformation dans une

chambre de culture anaérobie (laboratoires Coy, GrassLakeMI) par inoculation de 10mL de TTSm1
avec 1 µL de particules décongelées.Sur 1mL des cultures, on a ajouté à ADN ADN plasmidique. Les
cultures ont été incubées

pendant 15 à 18 heures et les dilutions ont été suspendues dans du diméthylsC1 à pH 6,7 et ont été
solidifiées avant l'incubation à 55 ° C (Shaw et al., 2010). Colonies de T.saccharolyticum résistantes à
cinq kanamycines

L'expression de transformation estprévue pour une intégrationchromosomiqueprévueparlePCR,


quiprésente une structure externe d'intégration, suivie d'une vérification de la séquence. 2.5. Les
souches enzymatiques

T.thermosaccharolyticum et T.saccharolyticum ont été cultivées dans un milieu liquide 1C conditions


underanaerobic. Environ 100 ml de milieu ont été inoculés avec une culture à 1% (v / v) et cultivés
pendant 24 heures avec 200 µg /

ml de kanamycine. Les dosages de la thiolase, de la ß-


hydroxybutyrylCoAdehydrogenaseandcrotonase ont été menés de manière aéro-
forthebutyrylCoAdehydrogenase, le butyraldéhyde tion

dehydrogenaseandbutanoldehydrogenaseassays.Forprepara- ofthecell-freeextracts,
100mLcultureswerecentrifugedat 4 1C at6000g dans aBeckmanCoulterAvantiJ-25centrifuge.Thecell
culot
wasresuspendedin4mLofappropriatebufferasrequired Pour le dosage et l'utilisation d'un
MisonixSonicator4000 équipé d'un micro-tipina10mLglassbeakerpour8minutesavec10pulse
et10spulsseoffat50%

del'intensitéintérieure.L'extrudessecarburant sansdécalcomplissementpar une


centrifugationà14,000g pendant 25min removingthecelldebris.Proteinconcentrationwasmeasured
utilisant Bradfordreagent (Bio-Rad, Hercules, CA)

.Absorbancemea- surements weredoneusinganAgilent8453UV-vis spectromètres


photometerattachedtoaPeltiertemperaturecontroller.Assays werecarriedoutat55 1C. Les
concentrations de protéines des extraits cellulaires exempts de

bromure sont comprises entre 1,5 et 3,6 mg / mL. La thiolase (EC2.3.1.9) a été mesurée dans la
direction de l'acétoacétyl-CoA cleavageat303nm. La réaction de réaction a été contenue dans 100
mM de Tris-HCl, 1 mMDTT, 10

mMMgCl2 à pH 8,0 (at55 1C). l'extrait a été additionné, mesuré à blanc, suivi par la définition du
substrat - 50 uM d'acétoacétylCoA et 0,2 mM de coenzyme A initié la réaction (Hartmanis et
Gatenbeck, 1984). L'activité de la ß-

hydroxybutyrylCoAdehydrogenase (EC1.1.1.35) mesure le


NADHconsumedat340nm.Thereactionbuffer contenus 50mMMOPS, 0.1mMDTTatpH7.0 (at55 1C),
towhich la cellule-freeextractwasadded, followedby0.2mMco facteur

NADHandtheadditionofthesubstrate - 75 uM Acétoacétyl-coenzyme A commencé la réaction


(Hartmanis andGatenbeck, 1984). Crotonase (EC4.2.1.17) l'activité a été déterminée en mesurant
l'hydratation du

crotonylCoAat263nmtoform ß-hydroxybutyrylCoA. Le réacteur de réaction contenait 100 mM de Tris-


HClatpH7.6 (at55 1C) auquel on a ajouté de l'extrait exempt de cellules.Tête d'activation de la
réaction déclenchée par le

crotonylCoA (Hartmanis et Gatenbeck, 1984). Butyryle CoAdehydrogenase (withelectrontransfer


flavopro- teinsAB) activitywasmeasuredbytwodifferentmethods - le premier
methoduseda50mMMOPSreactionbufferatpH7.0 (à 55 1C)

towhichcell-freeextractand0.4mMcrotonylCoAwere ajouté. Le mélange a été équilibré pendant 10


minutes, suivi de l'ajout de 0,2 mM de ferrocénium. La réduction de la consommation de 300 nm a
été surveillée pour la consommation

du ferrocénium (Inui et al., 2008). La secondeméthoded'énergie50mMTris-HCl, 2mM DTT


reactionbufferatpH7.5 (at55 1C) towhichcell- extrait libre, 5 µ? FAD, 20 µ? la ferredoxine (de Spinacia
oleracea), et 0.1mM NADH ajouté.

Additionof 0.1mMcrotonylCoA initié la réaction. La consommation de NADH a été surveillée à 340


nm (Li et al., 2008). L'activité de la butyraldéhydéhydrogénase (EC 1.2.1.57) a été déterminée à partir
de la NAD (P) La consommation

de co-facteur H a été contrôlée à 340 nm. La charge de réaction contenait 67 mM de Tris-HCl et 1


mM de DTTatpH6,0 (à 55 ° C). L'extrait exempt de cellules a été ajouté, suivi par une réaction de 0,27
mMNAD (P) H et 0,2 mM de
butyryl-cobalt (Dürreetal., 1987). Butanol déshydrogénase (EC1.1.1.1) Le dosage a permis de mesurer
la consommation de cofacteur de NAD (P) H à 340 nm. Le mélange de réaction a contenu 77 mM de
Tris-HCl et 1 mM de

DTTatpH7,8 (à 55 ° C). L'extrait acellulaire a été ajouté, suivi par une réaction de butyraldéhyde-1-
méthylènediamine (PM) à 0,23 mMNAD (P) (Dürre et al., 1987). 2.6. Méthodes analytiques
liquidchromatographywithanAminexHPX-

87Hcolumn fermentationproductsweremeasuredbyhigh pression (Bio-Rad Laboratories, Hercules,


CA) .Themobilephaseconsistedof5mM acidata sulfurique métabolites flowrateof0.6mL /
min.Thedetectionofthe

wasbyrefractiveindexusingarefractometer (Waters 410) et la température de colonne était de 60 1C.


L'hydrogène a été soumis à une chromatographie en phase gazeuse à l'aide d'un détendeur de
conductivité thermique SRI 310CGC.

Une colonne de silice a été utilisée, une isotherme isotherme à 60 ° C avec 20 ml / min. Le volume
d'injection était de 500 ul et la longueur de l'eau était de 1 minute. 2.7.

Carbone etélectroniqueléquilibre Les bilans de carbone ont été calculés en calculant l'intensité des
moles de carbone dans lesproduitstomolesdelabasubstituéencarbone consommé,
avecconduitcarbondioxcomptepourla

coproductionsticochimique avec l'acide acétique, l'éthanol et le butanol. Le poids de la poudre sèche


a été calculé de façon empirique en utilisant la formule générale suivante (CH2N0.25O0.5)
(Shawetal., 2008b). La balance

électronique est calculée en fonction de la proportion de produits oxydés à des produits réduits (O /
Rratio) en tant que fonction des perméabilités électromagnétiques des substrats et des produits
(Moatetal., 2002; Papoutsakis,

2000). 3. Résultats Des enzymes individuelles de la voie du n-butanol ont été exprimées de manière
fonctionnelle dans l'organisme hôte T.saccharolyticum provenant des organismes sources
T.thermosaccharolyticum et C.

acetobutylicum. Après vérification des activités individuelles, un n- La voie de butanol a été exprimée
dans des souches de T.saccharolyticum pour la démonstration de laproduc- tion hétérologue du n-
butanol. 3.1.Expression

fonctionnelle des différentes enzymes de la voie du thénobutanol dans T.saccharolyticum.


Démontrer la fonctionnalité des enzymespréduites La production de butanol, gènes codant chaque
étape de la voie du n-butanol à partir du

thymophile T.thermosaccharolyticum, a été exprimée de manière hétérologue et individuelle dans


T.saccharolyticum. Promoteur de T.saccharolyticumpta-ackoperon a été utilisé pour exprimer les
gènes individuels de la voie au

butanol. Cependant, il a été déterminé que le pentaplasme pta riboso-malatif de T.saccharolyticum


par aconsensausequence (AGGAGG) était augmenté de 10 à 10 fois (datanot montré), donc,
thenativeShineDalgarnowas a été

remplacé par la séquence consensus pour chacun des construits. Le tableau 2 présente les activités
des enzymes impliquées dans la formation de n-butanol chez T.thermosaccharolyticum de type
sauvage, les souches sauvages et
les souches génétiquement modifiées de T.saccharolyticum, et les valeurs de la ture pour C.
acetobutylicum. Les souches parentales de T. saccharolyticum - WT, M0355 et M0210 - n'ont pas
détecté d'activité pour les cinq

premières étapes enzymatiques de la voie du n-butanol. Les réactivités de thiols et de ß-


hydroxybutyrylCoAdehydrogenase chez T.saccharolyticum ont été hétérogènes. environ 1,5-3 fois
plus bas que les activités mesurées dans le

genre T.thermosaccharolyticum et dans les rapports littéraires pour C.aceto butylicum. Alors que les
activités hétérotoxiques de la crotonase chez T.saccharolyticum étaient de 2,5 à 5 fois plus tard que
l'activité de

T.thermosaccharolyticum, ils sont environ 50 fois plus bas que C. acetobutylicum. Le


butyrylCoAdehydrogenaseenzymeassayswereformed dans deux voies
différentes.Themethodcribected byInuietal.didnot céder une activité

detectectablfforthecatalysisofcrotonylCoAto butyrylCoA.Cependant, theferredoxin- Une


commandenégative sansdéterminationdel'oxydedansl'ensembledelacontrôleelégale ne permet pas
de définir une réactivité satisfaisante. La

réaction est catalysée par le


butyrylCoAdehydrogenaseenzymeandelectrontransferproteinsAandBhighlightsapossiblemetabolic la
voie empruntée par T.thermosaccharolyticum, suggérant que la réduction de crotonylCoA-butyl-CoA
a

été couplée à une réduction de l'oxydoréduction (Li etal., 2008). En outre, la comparaison génétique
des gènes de T.thermosaccharolyticum bcd, etfA et etfB (The_1660, The_ 1659, The_1658) montre
une hyperhomologie aux gènes

de C. kluyveri (CKL_0455, CKL_0456, CKL_0457) qui catalysent la réaction à partir du


crotonylCoAtobutyrylCoA. Cependant, un travail supplémentaire enzymatique est nécessaire pour
confirmer la fonctionnalité de ce complexe

d'enzymes (Li et al., 2008). L'hétéro Les activités dépendantes du carbonate de ribonucléotides
radioactif dans la souche de T. saccharolyticum étaient de 3 fois plus faibles que celles de
T.thermosaccharolyticum.

abstrait Le thermophilicanaerobe Thermoanaerobacterium saccharolyticum JW / SL-YS485 a été


analysé pour la production de n-butanol.L'applicationystématiquementavancéepermettait de
démontrer la fonctionnalité de

composants hétérologues de la voielostridiale du n-butanol, d'évaluer l'expressionexagène et


l'activitéenzymatique de cetorganisme.Par la suite, L'intégration de la voie ferrée dans la production
de n-butanol s'est traduite par une

production de n-butanol de 0,85 g / L de 10 g / L xylose, ce qui correspond à 21% du rendement


maximal théorique.Ensuite, l'intégration de la formation de n-butanol a été empêchée de produire
de l'acétate de n-butanol. La voie du n-

butanol dans les souches déficientes actées a donné lieu à une production de n-butanol de 1,05 g / L
à partir de 10 g / Lxylose, ce qui correspond à 26% du maximum théorique. 2013Publié
parElsevierInc.on est lauréat
deInternationalMetabolicEngineeringSociety 1. Introduction Il y a un effort intensif pour développer
une technologie de production durable de carburant de transport de la biomasse complète (Grayson,
2011, Lyndetal., 2008, Olson et

al., 2012) et le n-butanol a attiré l'attention dans le contexte (Dong et al., 2012; Dürre, 2008). Alors
que plus de 80 milliards de litres d'éthanol sont utilisés actuellement comme carburant de transit
(Smith et al., 2012), le butanol n'est

pas utilisé aujourd'hui comme combustible de transit dans une mesure significative, bien qu'il ait un
impact potentiel sur la transformationmodécodynamique des hydrates de carbone, de la densité
énergétique et physique. propriétés

plus fongibles avec l'essence, par exemple avec un pipeline (Dürre, 2008). La voie de n-butanol la plus
étudiée est celle de Clostridium acetobutylicum et d'autres clostridies apparentées qui ont été
utilisées à partir des années 20

dans le processus de Weizmann (Jones et Woods, 1986). Les gènes impliqués dans le parcours ont
été clonés, les protéines ont été caractérisées (Boyntonetal, 1996, Fischer et al., 1993, Petersen et
Bennett, 1991, Stim-Herndon

et al., 1995), et les mécanismes de contrôle associés au rasage acide et dissolvante étude (Gheshlaghi
et al., 2009). Dans C. acetobutylicum, les gènes primaires responsables de la production de n-butanol
sont thl, hbd, crt, bcd,

etfA, etfAB, adhE2 et adhE1 (JonesandWoods, 1986; Nöllingetal., 2001) exprimant l'enzyme
benzymesthiolase, ß-hydroxybutyrylCoAdehydrogenase, crotonase, butyrylCoAdehydrogenase, sous-
unité de flavoprotéines électro-

transférantAndBandthebi-functionalenzymealdehyde-alcohol-dehydrogenaset
quiactiventetactiventlesbosubstratsacétyl-CoAandbutyrylCoAforethanoletn-butanolproduction,
respectivement.Manymesophilesincluding Escherichiacoli,

Bacillussubtilis, Pseudomonasputida et Lactobacillusbrevis ont été mis au point pour produire du n-


butanol par expression hétérologue de ces gènes à partir de C. acetobutylicum (Atsumietal., 2008;
Berezinaetal., 2010; Inuietal.,

2008; Nielsenetal., 2009). Utilisation des processus biotechnologiques de type bactérien,


antimicrobien et anaérobie, ont été mis au point pour permettre aux agriculteurs potentiels de
tolérer des changements potentiels, y compris

un risque réduit de contamination, des taux de réaction plus élevés et des coûts différentiels plus
faibles pour le chauffage et le refroidissement (Barnard et al., 2010; 1979). La SoucheM571 de

Thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum (anciennement Clostridiumthermosaccharolyticum)


a été rapportée pour produire du n-butanol (Freierschroderetal., 1989) bien que ce ne soit pas
systématique (Demainetal., 2005;

Hilletal., 1993; Mistry et Cooney, 1989). De plus, le n- Cependant, les bactéries putatives
responsables de la production de n-butanol sont présentement en présence de T.
thermosaccharolyticum DSM 571 (Hemme et al., 2010). Il

semble que les gènes (crt, bcd, etfB, etfA, hbd et thl) responsable de la formation de CoA du butyryl-
Cooccursamulti-geneoperon. La souche JW / SL-YS485 de Thermoanaerobacteriumsaccharolyticum,
étroitement apparentée à
T.thermosaccharolyticum, a été bien caractérisée et développée de façon extensive. une bactérie
anaérobie isolée du parc national de Yellowstone (Shao et al., 1995). Ce micro-organisme croît entre
des températures de 45 et 65 ° C

et entre 4,0 et 6,8 (Shawetal., 2008a). T.saccharolyticum est capable d'utiliser une variété de
sarments trouvés dans la biomasse le glucose, le xylose, le mannose, le galactose, et l'andabinose. Il
peut catalyser le xylane, un

composant important de la biomasse cellulosique, ainsi que le mannane, la starchandpectine et


l'andinaturellement compétents, ce qui en fait un atout inapte pour les manipulations génétiques
(Shawetal., 2010). Il On a mis au point

des catalyseurs pour produire des rendements élevés en éliminant les gènes présents dans l'acide
organique et la production de H2, en dirigeant le flux de carbone et d'électrons vers l'éthanol
(Shawetal., 2008b, Shawetal., 2009). En

allégeant ses capacités d'utilisation et sa disponibilité de développé, T.saccharolyticum est un hôte


intéressant pour la production de n-butanol hétérologue. Ici, l'ingestion de T.saccharolyticum pour
produire du n-butanol donne un

rendement significatif. 2. Matériels et méthodes 2.1. Souches bactériennes et conditions de


croissance Les souches bactériennes utilisées dans ce travail sont listées dans le tableau 1. Pour T.

Des expériences de transformation de .saccharolyticum allstrain ont été faites à55 1C inTSC1medium
(Shawetal., 2011), contenant par litre - 5 gofcellobiose, 1,85 g de (NH4) 2SO4, 0,05 g de FeSO4 ?
7H20, 1,0 g de KH2PO4, 1,0 g

de MgS04, 0,1 g de CaCl2? 2H2O, goftrisodiumcitratedihydrate, 8,5 g de yyextrait, 2 mg de


resazurine, 0,5 g de L-cystéine-HCl. Forsolidmedium, 12gofagar a été ajouté. Le pH a été ajusté à 6,7
pour la sélection de la kanamycine

(200 ug / ml). Des comparaisons de croissance ont été faites dans du milieu TSD (Shawetal., 2012) à
551C, contenant par litre - 1,85 g de (NH4) 2S04, 0,05 g de FeS04ß7H20, 1,0 g de KH2P04, 1,0 g de
MgS04, 0,1 g de

CaCl2a2H2O, 2 g de citrate trisodique, 0,5 g d'extrait de myéline, 2 mg de p-amino. benzoacide,


2mgthiamine-HCl, 0,01 mg de vitamine B12, 0, 12 gméthionine. La source de calcium était 10 gxylose
et le pH était ajusté à 6,1. E.

coli a été cultivé dans un milieu LB, supplémenté avec 1,5% de gélose et 50 µg / mL de kanamycine
ou 100 µg / mL d'ampicilline appropriée. Saccharomycescerevisiae wasgrowninYPDor SD-
Uramedium comprend les conditions de

croissance (Shanks et al., 2006). 2.2. Réactifs et produits chimiques Des produits chimiques ont été
obtenus à Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) ou BDDifco (Franklin Lakes,
NJ). Les enzymes de

restriction et DNApolymerase (Phusion) ont été obtenues du Nouveau-Brunswick, Biolabs (Ipswich,


MA), et les oligonucleotides ont été commandés à partir de l'IDT (Coralville, IA). 2.3. Constructiondes
Plasmides Des techniques

standardisées de clonage (Shanksetal., 2006) ont été utilisées pour la construction de


plasmasexprimant les gènes individuels du n-butanol. Les individus / genecluster
d'intérêtencodinging chaque enzymaticstep thl (Tthe_1656), hbd
(The_1657), crt (Tthe_1661), et bcd (Tthe_1660), etfA (The_1658), etfB (The_1659) de
T.thermosaccharolyticum DSM571and adhE2 Tableau 1 Souches et plasmides utilisés dans l'étude.
Souche / plasmide Spectregenotype pertinent

Souches de référence T.saccharolyticum DSM 8691Typestrain DSMZ C. acetobutylicum


ATCC824Typestrain ATCC T.thermosaccharolyticum DSM571Typestrain DSMZ InvSc1
MAThis3D1leu2trp1-289ura3-52 Invitrogen M0355

T.saccharolyticum? Ldh? Pta? Ack Shawetal. (2011) M0210 T.saccharolyticum? Ldh , ermR
GiftfromMascomaCorp. M0350 T.saccharolyticum? Pta? Ack? PyrF Shawetal. (2011) Athl M0355,
kanR, thl (Tt) Cette étude Ahbd M0355,

kanR, hbd (Tt) Cette étude Acrt M0355, kanR, crt (Tt) Cette étude Abcd- etfAB M0355, kanR, bcd,
etfA, etfB (Tt) Cette étude AadhE M0355, kanR, adhE2 (Ca) Cette étude I2B T.saccharolyticum, thl
(Tt), hbd (Tt), crt (Tt), bcd (Tt),

etfA (Tt), etfB (Tt), adhE (Ca), KanR Ceci étude M0210-V M0210, thl (Tt), hdb (Tt), crt (Tt), bcd (Tt),
etfA (Tt), etfB (Tt), adhE2 (Ca), KanR Cette étude Plasmides pYC2 / CT S. cerevisiae-E.coli vecteur de
clonageInvitrogen pMU131

T.saccharolyticum-E.coli plasmide navette, KanR, AmpR Shawetal. (2010) pMC500 T.saccharolyticum-


E. coli navette plasmide, KanR GiftfromDevinCurrie pTHL pYC2 / CT, KanR, thl (Tt) a Cette étude pHBD
pYC2 / CT, KanR, hbd

(Tt) b Cette étude pCRT pYC2 / CT, KanR, crt (Tt) c Cette étude pBCD-etfAB pYC2 / CT, KanR, bcd (Tt)
d, etfA (Tt) e, etfB (Tt) f Cette étude pADHE pYC2 / CT, KanR, adhE (Ca) g Cette étude pBu24 pMC500,
thl (Tt), hdb (Tt), crt

(Tt), bcd (Tt), etfA (Tt), etfB (Tt), adhE2 (Ca), KanR a thl (Tt), thiolase provenant de
T.thermosaccharolyticum (Tthe_1656). b hbd (Tt), ß-hydroxybutyrylCoAdehydrogenasefrom
T.thermosaccharolyticum (The_1657). c crt (Tt),

crotonase de T.thermosaccharolyticum (Tthe_1661). dbcd (Tt), butyrylCoAdehydrogenase


(Tthe_1660). e etfA (Tt), sous-unité protéique de l'électro-transfert (The_1658). f etfB (Tt), sous-unité
des protéines de l'électro-transfertB (The_

1659) de T.thermosaccharolyticum. g adhE2 (Ca), aldéhyde-alcool déshydrogénase de C.


acetobutylicum (CA_P0035). (CA_P0035) provenant de C. acetobutylicum ATCC824 ont été utilisés
comme promoteur de

T.saccharolyticumpta-ack. Les gènes ont été individuellement clonesinplasmidpYC2 / CT (Invitrogen,


GrandIsland, NY) flanqués par les régions amont et aval du locus pta-ack de T.saccharolyticum pour
chromosomalinsertion avec

sélection avec une cartouche de résistance à la kanamycine (Maietal., 1997) (figure 1a).
T.saccharolyticum non réplicatifplasmidpBu24wasconstructed dans E. coliTop10 (Invitrogen,
GrandIsland, NY) en utilisantGibsonassembly

(Gibson et al., 2009) (Fig.2a) pourexpressionoftententire n- voie de butanol. AdhE (de C.


acetobutylicum ATCC824), genecluster crt, bcd, etfB (de T.thermosaccharolyticum DSM571)
fusedtopromoter gapDH (de C. thermocellum
ATCC27405), genecluster etfA, hbd, thl (de T.thermosaccharolyticum DSM571) fusedtopromoter cbp
(de C . thermocellum ATCC27405) et de la résistance à la kanamycine recombinante
wéréclonedinplasmidpMC500, aderivative de

pMC200 (Currie et al., 2013) contenant des régions amont et aval de xynA. Les séquences complètes
pour tous les plasmides sont disponibles sur les figures S1-S6. 2.4. La construction de l'ADN des
souches de Saccharolyticums

a été amplifiée via PCR à partir des plasmides pTHL, pHBD, pCRT, pBCD-etfAB, et pADHE. Les régions
amplifiées par PCR comprenaient les régions amont et aval du locus pta-ack qui fournissaient
l'homologie à T.saccharolyticum,

la geneofinterest (thl ou hbd ou crt ou bcd et etfA et etfB ou adhE) et le


kanamycinresistancegene.StrainM0355 (Shawetal., 2011) un

l'éthano-génique de T.saccharolyti- cum a été transfor- mé avec lesproduitsprofessionnels du


PCRAthl, Ahbd, Acrt, Abcd- etfABandAadhE (figure 1b). Transformationofthe non
replicativeplasmidpBu24wasattemptedinfourstrainsof T.

saccharolyticum pour chromosomalintegration (figure 2b.) - type sauvage, M0210, M0350,


andM0355 (LDH pta (LDH?) (GiftfromMascomaCorp.) (Pta ack?) (Shaw et al., 2011)? ? ack)
(Shawetal., 2011). Transformation dans une

chambre de culture anaérobie (laboratoires Coy, GrassLakeMI) par inoculation de 10mL de TTSm1
avec 1 µL de particules décongelées.Sur 1mL des cultures, on a ajouté à ADN ADN plasmidique. Les
cultures ont été incubées

pendant 15 à 18 heures et les dilutions ont été suspendues dans du diméthylsC1 à pH 6,7 et ont été
solidifiées avant l'incubation à 55 ° C (Shaw et al., 2010). Colonies de T.saccharolyticum résistantes à
cinq kanamycines

L'expression de transformation estprévue pour une intégrationchromosomiqueprévueparlePCR,


quiprésente une structure externe d'intégration, suivie d'une vérification de la séquence. 2.5. Les
souches enzymatiques

T.thermosaccharolyticum et T.saccharolyticum ont été cultivées dans un milieu liquide 1C conditions


underanaerobic. Environ 100 ml de milieu ont été inoculés avec une culture à 1% (v / v) et cultivés
pendant 24 heures avec 200 µg /

ml de kanamycine. Les dosages de la thiolase, de la ß-


hydroxybutyrylCoAdehydrogenaseandcrotonase ont été menés de manière aéro-
forthebutyrylCoAdehydrogenase, le butyraldéhyde tion

dehydrogenaseandbutanoldehydrogenaseassays.Forprepara- ofthecell-freeextracts,
100mLcultureswerecentrifugedat 4 1C at6000g dans aBeckmanCoulterAvantiJ-25centrifuge.Thecell
culot

wasresuspendedin4mLofappropriatebufferasrequired Pour le dosage et l'utilisation d'un


MisonixSonicator4000 équipé d'un micro-tipina10mLglassbeakerpour8minutesavec10pulse
et10spulsseoffat50%

del'intensitéintérieure.L'extrudessecarburant sansdécalcomplissementpar une


centrifugationà14,000g pendant 25min removingthecelldebris.Proteinconcentrationwasmeasured
utilisant Bradfordreagent (Bio-Rad, Hercules, CA)
.Absorbancemea- surements weredoneusinganAgilent8453UV-vis spectromètres
photometerattachedtoaPeltiertemperaturecontroller.Assays werecarriedoutat55 1C. Les
concentrations de protéines des extraits cellulaires exempts de

bromure sont comprises entre 1,5 et 3,6 mg / mL. La thiolase (EC2.3.1.9) a été mesurée dans la
direction de l'acétoacétyl-CoA cleavageat303nm. La réaction de réaction a été contenue dans 100
mM de Tris-HCl, 1 mMDTT, 10

mMMgCl2 à pH 8,0 (at55 1C). l'extrait a été additionné, mesuré à blanc, suivi par la définition du
substrat - 50 uM d'acétoacétylCoA et 0,2 mM de coenzyme A initié la réaction (Hartmanis et
Gatenbeck, 1984). L'activité de la ß-

hydroxybutyrylCoAdehydrogenase (EC1.1.1.35) mesure le


NADHconsumedat340nm.Thereactionbuffer contenus 50mMMOPS, 0.1mMDTTatpH7.0 (at55 1C),
towhich la cellule-freeextractwasadded, followedby0.2mMco facteur

NADHandtheadditionofthesubstrate - 75 uM Acétoacétyl-coenzyme A commencé la réaction


(Hartmanis andGatenbeck, 1984). Crotonase (EC4.2.1.17) l'activité a été déterminée en mesurant
l'hydratation du

crotonylCoAat263nmtoform ß-hydroxybutyrylCoA. Le réacteur de réaction contenait 100 mM de Tris-


HClatpH7.6 (at55 1C) auquel on a ajouté de l'extrait exempt de cellules.Tête d'activation de la
réaction déclenchée par le

crotonylCoA (Hartmanis et Gatenbeck, 1984). Butyryle CoAdehydrogenase (withelectrontransfer


flavopro- teinsAB) activitywasmeasuredbytwodifferentmethods - le premier
methoduseda50mMMOPSreactionbufferatpH7.0 (à 55 1C)

towhichcell-freeextractand0.4mMcrotonylCoAwere ajouté. Le mélange a été équilibré pendant 10


minutes, suivi de l'ajout de 0,2 mM de ferrocénium. La réduction de la consommation de 300 nm a
été surveillée pour la consommation

du ferrocénium (Inui et al., 2008). La secondeméthoded'énergie50mMTris-HCl, 2mM DTT


reactionbufferatpH7.5 (at55 1C) towhichcell- extrait libre, 5 µ? FAD, 20 µ? la ferredoxine (de Spinacia
oleracea), et 0.1mM NADH ajouté.

Additionof 0.1mMcrotonylCoA initié la réaction. La consommation de NADH a été surveillée à 340


nm (Li et al., 2008). L'activité de la butyraldéhydéhydrogénase (EC 1.2.1.57) a été déterminée à partir
de la NAD (P) La consommation

de co-facteur H a été contrôlée à 340 nm. La charge de réaction contenait 67 mM de Tris-HCl et 1


mM de DTTatpH6,0 (à 55 ° C). L'extrait exempt de cellules a été ajouté, suivi par une réaction de 0,27
mMNAD (P) H et 0,2 mM de

butyryl-cobalt (Dürreetal., 1987). Butanol déshydrogénase (EC1.1.1.1) Le dosage a permis de mesurer


la consommation de cofacteur de NAD (P) H à 340 nm. Le mélange de réaction a contenu 77 mM de
Tris-HCl et 1 mM de

DTTatpH7,8 (à 55 ° C). L'extrait acellulaire a été ajouté, suivi par une réaction de butyraldéhyde-1-
méthylènediamine (PM) à 0,23 mMNAD (P) (Dürre et al., 1987). 2.6. Méthodes analytiques
liquidchromatographywithanAminexHPX-
87Hcolumn fermentationproductsweremeasuredbyhigh pression (Bio-Rad Laboratories, Hercules,
CA) .Themobilephaseconsistedof5mM acidata sulfurique métabolites flowrateof0.6mL /
min.Thedetectionofthe

wasbyrefractiveindexusingarefractometer (Waters 410) et la température de colonne était de 60 1C.


L'hydrogène a été soumis à une chromatographie en phase gazeuse à l'aide d'un détendeur de
conductivité thermique SRI 310CGC.

Une colonne de silice a été utilisée, une isotherme isotherme à 60 ° C avec 20 ml / min. Le volume
d'injection était de 500 ul et la longueur de l'eau était de 1 minute. 2.7.

Carbone etélectroniqueléquilibre Les bilans de carbone ont été calculés en calculant l'intensité des
moles de carbone dans lesproduitstomolesdelabasubstituéencarbone consommé,
avecconduitcarbondioxcomptepourla

coproductionsticochimique avec l'acide acétique, l'éthanol et le butanol. Le poids de la poudre sèche


a été calculé de façon empirique en utilisant la formule générale suivante (CH2N0.25O0.5)
(Shawetal., 2008b). La balance

électronique est calculée en fonction de la proportion de produits oxydés à des produits réduits (O /
Rratio) en tant que fonction des perméabilités électromagnétiques des substrats et des produits
(Moatetal., 2002; Papoutsakis,

2000). 3. Résultats Des enzymes individuelles de la voie du n-butanol ont été exprimées de manière
fonctionnelle dans l'organisme hôte T.saccharolyticum provenant des organismes sources
T.thermosaccharolyticum et C.

acetobutylicum. Après vérification des activités individuelles, un n- La voie de butanol a été exprimée
dans des souches de T.saccharolyticum pour la démonstration de laproduc- tion hétérologue du n-
butanol. 3.1.Expression

fonctionnelle des différentes enzymes de la voie du thénobutanol dans T.saccharolyticum.


Démontrer la fonctionnalité des enzymespréduites La production de butanol, gènes codant chaque
étape de la voie du n-butanol à partir du

thymophile T.thermosaccharolyticum, a été exprimée de manière hétérologue et individuelle dans


T.saccharolyticum. Promoteur de T.saccharolyticumpta-ackoperon a été utilisé pour exprimer les
gènes individuels de la voie au

butanol. Cependant, il a été déterminé que le pentaplasme pta riboso-malatif de T.saccharolyticum


par aconsensausequence (AGGAGG) était augmenté de 10 à 10 fois (datanot montré), donc,
thenativeShineDalgarnowas a été

remplacé par la séquence consensus pour chacun des construits. Le tableau 2 présente les activités
des enzymes impliquées dans la formation de n-butanol chez T.thermosaccharolyticum de type
sauvage, les souches sauvages et

les souches génétiquement modifiées de T.saccharolyticum, et les valeurs de la ture pour C.


acetobutylicum. Les souches parentales de T. saccharolyticum - WT, M0355 et M0210 - n'ont pas
détecté d'activité pour les cinq

premières étapes enzymatiques de la voie du n-butanol. Les réactivités de thiols et de ß-


hydroxybutyrylCoAdehydrogenase chez T.saccharolyticum ont été hétérogènes. environ 1,5-3 fois
plus bas que les activités mesurées dans le
genre T.thermosaccharolyticum et dans les rapports littéraires pour C.aceto butylicum. Alors que les
activités hétérotoxiques de la crotonase chez T.saccharolyticum étaient de 2,5 à 5 fois plus tard que
l'activité de

T.thermosaccharolyticum, ils sont environ 50 fois plus bas que C. acetobutylicum. Le


butyrylCoAdehydrogenaseenzymeassayswereformed dans deux voies
différentes.Themethodcribected byInuietal.didnot céder une activité

detectectablfforthecatalysisofcrotonylCoAto butyrylCoA.Cependant, theferredoxin- Une


commandenégative sansdéterminationdel'oxydedansl'ensembledelacontrôleelégale ne permet pas
de définir une réactivité satisfaisante. La

réaction est catalysée par le


butyrylCoAdehydrogenaseenzymeandelectrontransferproteinsAandBhighlightsapossiblemetabolic la
voie empruntée par T.thermosaccharolyticum, suggérant que la réduction de crotonylCoA-butyl-CoA
a

été couplée à une réduction de l'oxydoréduction (Li etal., 2008). En outre, la comparaison génétique
des gènes de T.thermosaccharolyticum bcd, etfA et etfB (The_1660, The_ 1659, The_1658) montre
une hyperhomologie aux gènes

de C. kluyveri (CKL_0455, CKL_0456, CKL_0457) qui catalysent la réaction à partir du


crotonylCoAtobutyrylCoA. Cependant, un travail supplémentaire enzymatique est nécessaire pour
confirmer la fonctionnalité de ce complexe

d'enzymes (Li et al., 2008). L'hétéro Les activités dépendantes du carbonate de ribonucléotides
radioactif dans la souche de T. saccharolyticum étaient de 3 fois plus faibles que celles de
T.thermosaccharolyticum. vTable2 Activités

spécifiques des enzymes dans la voie du butanol. Souche enzymatique Activité spécifiquea (umol /
min / mg de protéine totale) Référence Thiolase T.t. 5. 08 70.74Cette étude Athl2.4770.37Cette
étude I2B 3.9670.82 Thisstudy

M0210-V4.0671.23Cette étude M0355, M0210, T.s. n.d.b Cette étude C.a. 11 Hartmanis et
Gatenbeck (1984) 3-hydroxybutyrylCoAdehydrogenase T.t. 14.4370.65 Thisstudy Ahbd 6.8170.39
Thisstudy I2B 8.2170.68Cette étude

M0210-V8.7270.44Cette étude M0355, M0210, T.s n.d. Thisstudy C.a. 8 Hartmanis et Gatenbeck
(1984) Crotonase T.t. 11.9571.15Cette étude Acr2.5670.19Cette étude I2B 4.8170.92 Thisstudy
M0210-V5.1770.79 Thisstudy M0355,

M0210, T.S. Thisstudy C.a. 135 Hartmanis et Gatenbeck (1984) Butyryl CoAdehydrogenase T.t.
0.6770.04c Cette étude Abcd-etfAB 0.2170.05c Cette étude I2B 0.2770.10c Cette étude M0210-
V0.2370.09c Cette étude M0355,

M0210, T.s n.d.c Cette étude C.k. 4d Hartmanis et Gatenbeck (1984) Butyraldehydedehydrogenase
(withNADHasco-factor) AadhE0.0470.01Cette étude I2B 0.0470.06Cette étude M0210-V0.0570.08
Thisstudy M0355, M0210, T.s

n.d. Thisstudy C.a. 0,038 Dürre et al., (1987) Butyraldéhydéhydrogénase (avec un facteur
PHascoNAD) AadhE0.0270.01Cette étude I2B 0,0270,07 Thisstudy M0210-V0.0270.08 Thisstudy
M0355, M0210, T.S. Thisstudy C.a. 0,005
Dürre etal (1987) Butanol déshydrogénase (avec le facteur NHasco) AadhE0.2070.01Cette étude I2B
0.2270.05 Thisstudy M0210-V0.2170.08 Thisstudy M0355 0.0470.01Cette étude T.s 0.1170.

04Cette étude M0210 0,0770.03 Thisstudy C.a. 0,02 Dürre et al. (1987) Butanol déshydrogénase
(avec NADPHasco-facteur) AadhE0.1370.01Cette étude I2B 0.1870.04Cette étude M0210-V0.1970.02
Thisstudy T.s.s. 0.0470.04Cette

étude M0210 0.0670.05 Thisstudy M0355 0.2070.01Cette étude C.a. 0,14 Dürre et al (1987) T.t,
Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum; T.s., Thermoanaerobacterium saccharolyticum;
C.a., Clostridium acetobutylicum; C.k.,

Clostridium kluyveri. aLes données sont montrées dans l'estimation raisonnable des mesures exactes.
Les activités spécifiques sont mesurées à partir desextracts sans protéinconcentration. b Non
détecté. c Les activités

spécifiques sont reflétées par un essai couplé avec un couplage d'oxygène (Li etal., 2008). d La
référence indique une activité spécifique pour une protéine purifiée, lorsque des activités spécifiques
sont déterminées dans le cadre de

l'étude de l'extraction d'un extrait exempt de toute contamination. T.saccharolyticum encodesabi-


functionalaldehyde / alcoholdehy- drogenase (adhE; Accessionno.EU313774) qui est responsable de
l'élimination de l'éthanol envivo.

Déterminer si le sulfonate de sodium ou l'anhydride alcoolique de T.saccharolyticum peut réduire le


butyraldehydro-n-butanol, le butanol déshydrogénosactivé dans les troisparoles deparent. WT,
M0355 et M0210. Il est intéressant de

noter que les concentrations de butyraldéhyde réduites (Tableau 2) ont été démontrées. Bien que les
souches de T. saccharolyticum aient démontré une faible activité de l'hydrogènehydrogène, il n'y
avait aucune preuve de

l'anhydridebutyrhydrique Les activités de butyraldéhyde-déshydrogénase ont été détectées par les


souches AadhE, I2BandM0210-V et comparées à C. acetobutylicum. L'expression hétérologue du
gène adhE provenant de

C.acetobutylicum dans des souches de T.saccharolyticum présente des changements dans la


spécificité des facteurs. des souches recombinantes, mais l'activité globale de toutes les souches
mécanisées - Aadhe, I2BandM0210-V

- a été améliorée par rapport aux souches mères - M0355, WTandM0210. 3.2. Construction d'une
voie de synthèse de sulfonate de n-butanol sur une voie de n-butanol Après avoir vérifié l'expression
de la fonction des enzymes

individuelles pour la production de n-butanol-butadiène-CoA, la voie de synthèse (figure 3) a été


construite pour être introduite dans T.saccharolyticum. La voie hétérogène du n-butanol.Les gènes
responsables de la voie complète du

n-butanol ont été borborés sur un plasmide réplicatif pBu24 pour l'intégration dans le chromosome
de T. saccharolyticum. On a ajouté un adénocarcinome de C.acetobutylicum au promoteur xynA de la
T.saccharolyticum. Le

promoteur du gène xynA a déjà présenté un système inductible dans T.saccharolyticum (Currieetal.,
2013) et il a constaté que la toxicité de l'acide acétylsaloïque peut être due à une expression négative
de C. acetobutylicum.
T.saccharolyticum. L'expression des gènes crt, bcd et etfB de T.thermosaccharolyticum a été médiée
par le promoteur glycéraldéhyde-3-phosphatedehydrogénase (gapDH) de C. thermocellum
ATCC27405 et l'expression de etfA, hbd

et thl de T. thermo-saccharolyticum. a été médiée par le promoteur de la cellulobellose


phosphorylase (cbp) de C. thermocellum ATCC27405 (Shawetal., 2012). La transformation a été
entreprise avec quatre souches de

T.saccharolyticum - WT,? Ldh,? Pta? Ack et? Ldh? Pta? Ack - avec le plasmide de réplication
plasmidique pBu24.Whileapproximately103 transfor- mants / ug d'ADN ont été obtenus pour les
souches de Wtand? ldh, aucun

transformant n'a été obtenu avec des souches de pta? ack et? ldh? pta? ack
génotypedespitesimultaneou des transformations réussies avec un plasmide de contrôle de dépôt
pMC500. 3.3. La caractérisation de la production de

butanol à partir de souches de T.saccharolyticums élaborées a été vérifiée en séquençant la région


xynA du chromosome, qui contenait maintenant la voie de production de butanol.Onecloneofeach
ont été choisies pour une

caractérisation supplémentaire, désignées par le terme I2B et M0210-V, respectivement. WT, I2B,
Ahl et M0210-V sont des milieux définis avec des xyloseastesolecarbonates pour induire l'expression
d'adhE (Ca) (figure 4).

SoucheI2B produite à 0,85 g / Lbutanol à partir de 10 g / Lxylose, correspondant au titre


alcoométrique de 0,17 moles- butanol / molofxylose et21% de la limite maximale du champ thé-
rapique.StrumentM0210-V produità1,05g / L-

butanol à partir de10g / Lxylose, ce qui correspond au titreamolaire de 0,21molbutanol / molofxylé


et 26% du En outre, dans les souches de Wand et de Hlad, le nobutanol a été détecté (limite de
détection de 0,01 g / L). Des

changements ont été observés dans les produits de fermentation, les chaînes d'insuline I2B et
M0210-V avec du butanol étant produites (tableau 3). Puisque les chaînes de production de butanol
genethatuses acétylCoAassassinat,

éthanolproduction isnotabolished. Cependant, la production d'éthanol est réduite de près de 50%


dans la production de réactif-butanol. De manière intéressante, la production d'acides acétiques
augmente respectivement de46%

et67%. I2BandM0210-V, respectivement.TheWTstrainof T.thermosaccharolyticum DSM571 a été


cultivé dans des conditions de croissance similaires et a produit seulement 0,1 ng / L de n-butanol
(datanotsown), ce qui indique une

production de 8 à 10 fois plus élevée de butanol dans la souche de T.saccharolyticum génétiquement


modifiée.On opère une synthèse synthétique T.

saccharolyticum a été régulée de façon inattendue, mais les promoteurs de recombinaison ne sont
plus que des agents de blanchiment, mais seulement du olétane, mais ils peuvent être cultivés en
présence de xylose, mais on

peut également obtenir des quantités correctes de butanol en présence de glucose. Les
caractéristiques de croissance des souches de T. saccharolyticum Le taux de croissance spécifique de
0,15 h? 1 du taux de croissance
spécifique du bas de la chaîne de production du butanol est de 30% par rapport au taux de
croissance spécifique de la souche W de 0,21 h? 1. De même, la souche M0210-V produisant du
butanol a un taux de croissance spécifique

de toitsparentstrainM0210at0.18h? 1. Le potentiel de croissance des souches M0210 (0,074 g /


gxylose), I2B (0,07 g / gxylose) et M0210-V (0,058 g / gxylose) a diminué de 25%, 30% et42% par
rapport à WTcellyieldof0,1g /

gxylose.Onepossibilitépourcentage de rendement de la souche M0210 a diminué l'ATPgeneration


résultant de la perte de l'acétate de kinase (Shawetal., 2008b). Les taux d'épuisement des substrats
des souches WT, I2B, M0210 et

M0210-V étaient de 0,49 g / L / h, 0,21 g / L / h, 0,35 g / L / main 0,19 g / L / h, respectivement. Cette


étude montre que les souches produisant du butanol T.saccharolyticum était capable de tolérer la
production hétérologue de n-

butanol qui se produisait. Cependant, des travaux supplémentaires ont été effectués pour
déterminer la souche de type. Le taux de croissance spécifique de 0,15 h? 1 de la chaîne de
production de butanolI2Bhada est inférieur à celui

de la croissance spécifique. taux duWTstrainof0.21h? 1. De manière similaire, la souche M0210-V


produisant du butanol a donné un taux de croissance spécifique de 0, 11h-1 comparé à son groupe
de particules M0210at0.18h-1. On

a réduit le pourcentage de souches M0210 (0,074 g / gxylose), I2B (0,07 g / gxylose) et M0210-V
(0,058 g / gxylose) de 25%, 30% et 42% comparé à WTcellyieldof0.1g /
gxylose.Onepossibilityforthelellle rendement de la

soucheM0210istededélevé ATPgenerationultulting de perteofacetatekinaseactivité (Shawetal.,


2008b). Les substrats de soubassement des souches WT, I2B, M0210 et M0210-V étaient de 0,49 g / L
/ h, 0,21 g / L / h, 0,35 g / L /

main, 0,19 g / L / h, respectivement. On a constaté que les souches produisant du butanol de


T.saccharolyticum étaient capables de tolérer la production hétérologue de n-butanol. Cependant,
d'autres travaux que ceux-ci

T.thermosaccharolyticum a également été évalué. La production de n-butanol par voie métabolique


synthétique a été réalisée dans des souches de T. et de T. laccharolyticum, mais nous sommes en
mesure de démontrer la

production d'inacétate déficitaire en insuline. La production de n-butanol est relativement faible.


L'anhydride acétique est un produit de plus en plus récent, mais il semble que la production
d'acétate soit essentielle pour la production

de butanol dans le métabolisme de T.saccharolyticum. Ce phénomène a été démontré chez plusieurs


espèces bactériennes produisant du butyrate (Hino et al., 1991; etal., 1977). La production d'acétate
est augmentée dans les

souches produisant de l'isobutanol I2BandM0210-V. La voie fermentative dans le C. acetobutylicum


produisant du n-butanol à partir du glucose a étépréparée avec deux molécules d'AcétylCoA, deux
moléculesADADH et deux NAD
(P) Hmoléculespour chaque molécule de n-butanol produite (figure 3). Cependant, Li etal. (2008) ont
démontré que l'augmentation de la concentration de CrotonylCoA en butyrylCoA couplée à la
réduction de l'effet de la do-doxine

nécessitait un supplément d'ADN des électronéducteurs. Dans ce cas, il est nécessaire de remplacer
les molécules de NADH par le catalyseur de butyrate de butyryle, de manière à ce que la solution de
carbone butyrylcétonique

soit modifiée. la ferredoxine (figure 3). D'autrescomposantsdeNADH ou de NADPH sont nécessaires


pour produire du n-butanol, en fonction des spécificités des facteurs hyposodés du
butyraldéhydehydrogène et de la n-butanol

déshydrogénase.Contrôlerles cinq facteursnicotinamideséconomiquesnécessairespour laproduction


de la molécule de n- butanol, seulement deux NADH sont produits à partir de glycolsulfonésulfonates
de sucre, en même temps que

des oxydes de carbone qui ont été ajoutés pendant l'oxydation du pyruvate.Il a été dit que si l'on a
reporté directement le NADH, cet équilibre de cofacteur a été corrigé; cependant, comme l'a révélé
le T.saccharolyticum génome

induit que la ferrédoxine bien connue: la nicotinamide-oxydo-réductase est codée par les gènes
nfnAB de l'enzyme NADH-dépendentreducedoxine: NADPþ oxydoréductase (Wangetal., 2010), qui
transfère de façon réversible des

électrons de NADH et réduit le nombre de NODPþ à generatetwoNADPH. Une production potentielle


de l'acétate de sodium (NAD), dont la production de NADHgénérée au cours de la glycolyse, n'est pas
réassimilée sur le produit de

base.Le couplage stoechiométrique de l'acétate et de la production de n-butanol est le facteur le plus


faible l'équilibrage, lorsque l'on produisait de l'anhydride butadiène-azote et que la production
d'acétate de n-butanol se produisait,

et que l'on réduisait en excès les quantités produites par les deux voies, en les convertissant à
l'hydrogène.Selon les spécificités de l'hydrate de butyraldéhyde et de la n-butanol déshydrogénase
(et la participation de nfnAB dans la

direction NADPHgenerating), une molécule d'acétate à n-butanol de 3: 1 à 2: 1 serait nécessaire pour


équilibrer les facteurs.Theacetateto n-butanol ratiospendant la fermentation dexylose
avecstrains12BandM0210-Vwere2.9: 1 et 2.7:

1, respectivement (tableau3).

En premier La production de n-butanol thermophile, dont les auteurs ont obtenu des résultats
comparables, a été comparée à celle du travail initial avec des mésophiles non monophyliques
produisant du n-butanol -

E. coli (0,4-1,2 g / L) (Atsumi et al., 2008; Inui et al., 2008), P.putida (0,12 g). / L), B. subtilis (0,024 g /
L) (Nielsen et al., 2009), S. cerevisiae (0,0025 g / L) (Steen et al., 2008) et L. brevis (0,3 g / L) (Berezina
et al., 2010).

Cependant, pour atteindre un rendement maximal, il est bénéfique de diriger directement le flux de
carbone et d'électrons vers le butanol. Des efforts d'ingénierie pour augmenter le n-butanol le
rendement nécessitera le métabolisme
de l'éthanol au butanol, et il est probable qu'il faudra remplacer les générations productrices
d'éthanol naturel dans T.saccharolyticum par des protéines qui ont une spécificité supérieure pour la
production de butanol (Lehmann a été

modifié au cours de 2012, Sillers et al., 2009). De plus, si n- La production de butanol est
stoechiométriquement couplée au H2 et à la production d'acétate, puis l'expression des enzymes qui
produisent des productions de n-butanol

à des degrés indépendants devrait augmenter, mais cette solution pourrait être une expression
hétérologue du complexe Rnfenzyme (BuckelandThauer, 2012; Müller et al., 2008), qui transfère
directement des électrons provenant

d'oxydes ajoutés au NADþ dans un processus couplé à la conservation énergétique de la régénération


de l'hormone de croissance.Par la fourniture d'électrons à partir de ferroséduits réduits dans le
NADþ, on peut trouver une

ingénierie de la souche anaérobie? Ldh? Pta? Ack. Alternativement, l'expression de la trans-énoyl-


CoA réductase (Ter) (Bond-Wattsetal., 2011; Shen et al., 2011) pour catalyser la réduction de la
production de nicotinols et de

flavoprotéines -crotonyl-CoAtobutyryl-CoAindepen- dant et de flavoprotéines, pourrait être


nécessaire. philictemperaturesforfunctionalexpression chez T. saccharolyticum. Cette étude a
démontré la possibilité de développement d'un

système de production de n-butanolmophile. Deseffetssimilairespourraient être


appliquésàl'avenirdel'ingestiondel'organismemolyophiliquecellulolytique tel que C. thermocellum
pour la production de n- le traitement de la biomasse par

le butanolviaconsolidé (Lyndetal., 2005; Olsonetal., 2012).

Remerciements Ce travail a été soutenu par la Corporation Mascoma et par le Centre Scientifique
Bioénergie. Nous aimerions remercier DanaOlson et Elizabeth Mearls pour

avoir critiqué le journal. liketothankPhilThornepourcontribueràdes méthodes analytiques.

Annexe A.Supportinginformation Les données supplémentaires associées à cet article sont


disponibles dans la version en ligne à l'adresse

http://dx.doi.org/10.1016/j.ymben.2013.10.012. il

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