CENTRO DE CIENCIAS BASICAS

DEPARTAMENTO DE QUIMICA
ACADEMIA DE BIOLOGIA MOLECULAR

MANUAL DE PRACTICAS DE LABORATORIO DE

BIOLOGIA MOLECULAR

BIOTECNOLOGIA

4º SEMESTRE

ENERO - JUNIO 2018

PROFESOR: Dr. José Antonio González Gutiérrez

NOMBRE DEL ALUMNO: __________________________________________

 CENTRO DE CIENCIAS BÁSICAS
DEPARTAMENTO DE QUIMICA

LINEAMIENTOS DE LOS LABORATORIOS DEL

DEPARTAMENTO DE QUIMICA

 Antes de asistir a la práctica deberás leer el texto completo y traer por escrito o en un
diagrama el planteamiento del experimento a realizar.

 Es obligatorio el asistir con bata a todos los laboratorios y lentes de seguridad para
laboratorios de Química y Bioquímica. No usar huaraches, gorras, sombreros; y su
cabello deberá estar recogido (cuando lo usen largo).

 Prohibido comer, fumar, beber y masticar chicle.

 Usar guantes de látex desechables y cubre boca cuando se trabaje con muestras
biológicas y/o material patológico.

 Se debe de informar inmediatamente al profesor o al técnico cualquier accidente que

ocurra durante la práctica.

 Los remanentes de reactivos utilizados no deben regresarse a los envases originales, y

deben manejarse con pipetas y espátulas limpias.

 La mayoría de los disolventes orgánicos son volátiles e inflamables, al trabajar con

ellos deberá hacerse en lugares ventilados y nunca cerca de la flama. Los recipientes
que los contienen deben mantenerse cerrados, en lugares frescos y secos.

 Nunca deberán efectuarse experimentos no descritos en la práctica.

 Salvo indicaciones precisas, nunca tape un tubo de ensaye con el dedo.

 Si es necesario inhalar algún gas se provocará una corriente de aire con la mano entre
la boca del recipiente y la nariz.

 No deberá verterse nunca agua a los ácidos, sino al contrario, teniendo precaución,
asimismo deberá tenerse mucho cuidado cuando se vierta amoniaco a un líquido
caliente, ó a un ácido concentrado a una base fuerte y viceversa.

 Al terminar cualquier experimento el profesor o el técnico indicarán donde se deben de

colocar los residuos.

 Siempre consulte al instructor para aclarar cualquier duda.

 Al retirarse del laboratorio dejar su lugar de trabajo limpio.

 CENTRO DE CIENCIAS BÁSICAS
DEPARTAMENTO DE QUIMICA

PRESENTACIÓN DEL MANUAL DE LABORATORIO

OBJETIVO GENERAL

El alumno adquirirá los conocimientos, habilidades y actitudes necesarias para un

desempeño adecuado en el laboratorio.

METODOLOGIA

 Al inicio del semestre el alumno recibe el manual de laboratorio y la explicación de cómo se

va a trabajar durante el semestre.

 Para que un alumno pueda trabajar en el laboratorio deberá presentar el cuestionario

respondido al inicio de la práctica.

 Los alumnos trabajan en equipo; todos deberán participar en la realización de la práctica.

 Una semana después de concluida la práctica, el alumno entregará el manual de

laboratorio que deberá tener realizados a mano los apartados: Observaciones y resultados,
Discusiones, Conclusiones y Bibliografía. La bibliografía servirá para apoyar a las
Discusiones de la práctica y al menos deberán consultarse tres fuentes, y al menos una
debe ser un libro o artículo. Se pueden usar fuentes consultadas en internet, pero se debe
evitar hacer uso de sitios o páginas no confiables.

 Al finalizar el semestre se realizará un examen sobre las habilidades alcanzadas durante el

semestre.

CRITERIOS DE EVALUACION
Los requisitos que debe reunir el alumno para poder aprobar el laboratorio son los
siguientes:
Asistencia al 80% de las sesiones - Derecho a calificación
Y presentar examen final

Presentar el cuestionario al iniciar - Derecho a entrar a la práctica

la práctica

Trabajo experimental 75% (promedio de los reportes de prácticas)

Examen final 25%

Nota 1: Es necesario cumplir con todas las actividades marcadas en el trabajo del laboratorio para
aprobarlo.
Nota 2: En caso necesario la calificación de laboratorio solamente se guardará por un año si este
es igual o mayor a ocho.

CONTENIDOS DEL REPORTE DE LABORATORIO.

Al inicio del semestre, los alumnos deberán fotocopiar y engargolar el manual de laboratorio. Los
reportes de prácticas se elaborarán a mano en los apartados indicados en el manual.
Código: DI-120800-03
Rev: 02
Emisión: 28/09/09
 CENTRO DE CIENCIAS BÁSICAS
DEPARTAMENTO DE QUIMICA

Para la calificación se tomarán en cuenta los siguientes apartados:

Cuestionario resuelto 10 %
Observaciones y resultados 15 %
Trabajo en laboratorio 10 %
Discusiones 35 %
Conclusiones 20 %
Bibliografía 10 %

Cuestionario. Se deberá presentar ya resuelto antes de iniciar la práctica.

Observaciones y resultados.
 Se deberá presentar lo que se solicite (datos, tablas, gráficos, esquemas, etc.).
 Es recomendable utilizar tablas para visualización de los resultados, así como obtener
promedios.
 Si se incluyen fotografías, esquemas o gráficas, incluir un pie de imagen en el cuál
describan la imagen, señalando los aspectos relevantes.
 En el caso de mediciones, deberán incluirse los datos crudos completos y los cálculos.

Discusiones*:

 Explicar las diferencias encontradas entre los resultados observados y los resultados
esperados.
 Discutir sobre los factores que pueden afectar el desarrollo del experimento.
 Discutir sobre las variables que pueden afectar los resultados.
 Señalar las principales ventajas y desventajas de la técnica empleada.

Conclusiones*:

 ¿Se cumplió el objetivo?, ¿Si?, ¿No?, ¿Por qué?

 Indicar de manera concreta lo que se aprendió.
 Señalar aspectos sobresalientes de la técnica o procedimiento realizado.

Bibliografía ( a modo de ejemplo):

 Para libros se reporta de este modo:

Autor (primer apellido completo, iniciales de nombres). Año. Título. Edición. Editorial. Lugar de
publicación. Páginas consultadas
 Para artículos de revistas se reporta de este modo:
Autor(es) (primer apellido completo, iniciales de nombres). Año. Título del Artículo. Nombre de la
revista. Volumen: páginas
Ejemplo:
Lanzuolo, C., Orlando, V. 2007. The function of the epigenome in cell reprogramming. Cellular and
Molecular Life Sciences. 64:1043-1062
 Para sitios de Internet se reporta de este modo:
Nombre del sitio (Visitado por última vez: DD/MM/AA) Dirección URL de la página web
 CENTRO DE CIENCIAS BÁSICAS
DEPARTAMENTO DE QUIMICA

Ejemplo:

PubMed (Visitado por última vez: 21/07/09) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez

Evaluación:

Para la evaluación se utilizarán las siguientes rúbricas:

OBSERVACIONES Y RESULTADOS
Características Calificación
Todos los datos están completos (numéricos y/o gráficos)…
presentados de manera adecuada y clara… 10
todos los cálculos, gráficas y/o tablas están correctos
Todos los datos están completos (numéricos y/o gráficos)…
presentados de manera adecuada y clara… 8-9
hay algunos errores menores en cálculos, gráficas y/o tablas
Faltan algunos datos (numéricos y/o gráficos) ó
La presentación no es adecuada ó… 6-7
hay algunos errores en cálculos, gráficas y/o tablas
Falta más del 50% de los datos, ó
La presentación no es adecuada ni clara, y 4-6
Hay errores en cálculos, gráficas y/o tablas
Falta más del 50% de los datos, y
La presentación no es adecuada ni clara, y 1-3
Hay errores en cálculos, gráficas y/o tablas

TRABAJO EN LABORATORIO
Características Calif.
Participó activamente en todas las actividades indicadas
En todo momento sabía qué procedimiento se estaba llevando a cabo y para qué.
10
Dejó limpio su lugar de trabajo y material utilizado, y colocó donde se le indicó los residuos,
etc.
Participó activamente en todas las actividades indicadas
Casi todo el tiempo sabía qué procedimiento se estaba llevando a cabo y para qué.
8-9
Dejó limpio su lugar de trabajo y material utilizado, pero no atendió todas las indicaciones de
disposición de residuos, material, etc.
Solo participó en algunas de las actividades indicadas
En algunos momentos no sabía qué procedimiento se estaba llevando a cabo ni para qué.
6-7
Dejó limpio su lugar de trabajo y material utilizado, pero no atendió todas las indicaciones de
disposición de residuos, material, etc.
Participó poco en las actividades indicadas
Por momentos no sabía qué procedimiento se estaba llevando a cabo ni para qué.
4-6
Dejó limpio su lugar de trabajo y material utilizado, pero no atendió todas las indicaciones de
disposición de residuos, material, etc.
No trabajó.
No sabía qué procedimiento se estaba llevando a cabo ni para qué.
1-3
No dejó limpio su lugar de trabajo y material utilizado, y no atendió todas las indicaciones de
disposición de residuos, material, etc.
 CENTRO DE CIENCIAS BÁSICAS
DEPARTAMENTO DE QUIMICA

DISCUSIONES
Características Calificación
Se interpretan clara y correctamente los resultados experimentales.
Se fundamentan las interpretaciones con citas bibliográficas de manera
adecuada.
Se refleja una comprensión total del fundamento y propósito de la práctica. 10
Redacción clara, precisa y correcta.
Sin errores ortográficos; nombres científicos, de genes, proteínas, etc. escritos
correctamente.
Se interpretan clara y correctamente los resultados experimentales, con algunos
errores.
Se fundamentan las interpretaciones con citas bibliográficas de manera
adecuada.
Se refleja una comprensión bastante buena del fundamento y propósito de la 8-9
práctica.
Redacción deficiente.
Algunos errores ortográficos, o en la escritura de nombres científicos, de genes,
proteínas, etc. escritos correctamente.
Interpretación deficiente de resultados experimentales.
Se fundamentan las interpretaciones con citas bibliográficas de manera no del
todo adecuada.
Se refleja una comprensión deficiente del fundamento y propósito de la práctica. 7
Redacción deficiente.
Errores ortográficos, o en la escritura de nombres científicos, de genes,
proteínas, etc. escritos correctamente.
Interpretación muy deficiente de resultados experimentales…
… o pobre fundamentación con citas bibliográficas (insuficientes o inadecuadas).
Refleja falta de comprensión del fundamento y propósito de la práctica.
4-6
Redacción muy deficiente.
Muchos errores ortográficos, y/o o en la escritura de nombres científicos, de
genes, proteínas, etc. escritos correctamente.
No se interpretan resultados experimentales…
… o no se fundamenta con citas bibliográficas
Refleja una absoluta falta de comprensión del fundamento y propósito de la
práctica. 1-3
Redacción muy deficiente.
Muchos errores ortográficos y/o o en la escritura de nombres científicos, de
genes, proteínas, etc. escritos correctamente.

CONCLUSIONES
Características Calificación
Tres conclusiones
Adecuadas y relevantes 10
Claras, precisas y bien redactadas.
Tres conclusiones.
Adecuadas y relevantes. 8-9
Deficiencias en la redacción, claridad o precisión
Dos conclusiones adecuadas, relevantes, claras y bien redactadas.
O una de tres conclusiones no adecuada, no relevante, muy mal redactada, 6-7
carente de claridad y/o precisión.
Una conclusión adecuada, relevante, clara y bien redactada. 4-6
 CENTRO DE CIENCIAS BÁSICAS
DEPARTAMENTO DE QUIMICA

O dos de tres conclusiones no adecuadas, no relevantes, muy mal redactadas,

carentes de claridad y/o precisión.
Ninguna de las conclusiones es adecuada, relevante, clara, y están muy mal
1-3
redactadas.

ORDEN, ORGANIZACIÓN Y LIMPIEZA

Características Calificación
Letra legible, escrito con tinta, sin manchas, borrones ni tachaduras. 10
Todos los contenidos en su apartado correspondiente.
Letra legible, escrito con tinta, con algún borrón o tachaduras. 8-9
Sin manchas.
Todos los contenidos en su apartado correspondiente.
Letra medianamente legible o escrita con lápiz, con algunos borrones o 7
tachaduras. Sin manchas.
O algunos contenidos fuera de orden.
Letra medianamente legible o escrita a lápiz, con algunos borrones o tachaduras. 4-6
Sin manchas.
Algunos contenidos fuera de orden.
Letra ilegible, escrito con lápiz, con borrones, tachaduras . 1-3
Contenidos no escritos en su apartado correspondiente.
 CENTRO DE CIENCIAS BÁSICAS

DEPARTAMENTO DE: QUIMICA

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO

INDICE DE PRÁCTICAS

1. USO DE MATERIAL DE LABORATORIO EN BIOLOGÍA MOLECULAR 2

2. EXTRACCIÓN DE ADN DE CELULAS EUCARIOTICAS MEDIANTE EL
METODO DELLAPORTA ........................................................................ 7
3. CUANTIFICACIÓN ESPECTROFOTOMETRICA DE ACIDOS
NUCLEICOS Y EFECTO HIPERCROMICO .......................................... 19
4. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS
5. EXTRACCIÓN DE ARN.............................................................................

Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/09
 PRACTICA No. 1

USO DE MATERIAL DE LABORATORIO EN BIOLOGÍA MOLECULAR

OBJETIVO (S)

El alumno:

1. Conocerá los materiales y equipos básicos utilizados en las técnicas de Biología Molecular.
2. Aprenderá el uso correcto de los mismos.
3. Conocerá las reglas de seguridad particulares que se deben utilizar en laboratorio de
Biología Molecular.

INTRODUCCIÓN

Además del uso de material estándar de un laboratorio (matraces, probetas, pipetas, balanzas
analíticas y granatarias, etc.), cuando se realizan prácticas de Biología Molecular se requiere
de usar material y equipo especial. El logro de los objetivos de una práctica depende en buena
medida del correcto uso del material y el equipo, además es importante señalar que varios de
estos instrumentos resultan delicados y costosos; por todo ello es importante conocer el uso de
cada uno de ellos.

Dentro de este equipo especial (aunque no exclusivo) podemos mencionar:

a) Micropipetas.
b) Ultracentrífuga o microcentrífuga.
c) Cámara de electroforesis.
d) Transiluminador de luz ultravioleta.

El material incluye puntas para micropipeta, microtubos (“eppendorf”).

En el laboratorio de Biología Molecular se trabaja con muestras biológicas (animales,

vegetales, cultivos bacteriológicos y otros), y en ocasiones se trabaja con organismos
transgénicos. En el caso de las muestras animales y los cultivos bacteriológicos, se deben
tener las mismas precauciones que para cualquier otra disciplina que los ocupe, para evitar
infecciones o liberar al ambiente a los microorganismos; esto es particularmente importante
cuando se trata de virus o bacterias transgénicos,

A menudo se utiliza bromuro de etidio (altamente mutagénico y cancerígeno), y en ocasiones

se utilizan otros compuestos tóxicos y/o mutagénicos. También es común el uso de
transiluminador de luz ultravioleta. Con todos estos reactivos y equipo se deben extremar
precauciones: manipularlos con guantes, evitar inhalar los vapores generados, usar gafas
especiales que bloqueen la luz UV.

Es de suma importancia observar todas las medidas de seguridad; cada persona que manipule
especimenes, reactivos o equipo potencialmente peligroso es responsable de su propia
seguridad, la de otras personas y de evitar liberar al ambiente especimenes o sustancias
potencialmente dañinas.

Por último, al igual que en el desarrollo de cualquier práctica, se debe etiquetar

cuidadosamente todas las soluciones y muestras. Es aconsejable etiquetar los tubos, matraces
u otros recipientes antes de colocar en ellos las muestras para evitar confusiones.

2 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/09
MATERIAL REACTIVOS
Micropipetas Agua
Puntas para micropipeta Agarosa
Microtubos Buffer TAE
Microcentrífuga
Cámara de electroforesis horizontal

PROCEDIMIENTO

1. El profesor explicará el uso del equipo y material de laboratorio propio del laboratorio de
Biología Molecular.

2. De acuerdo con las indicaciones del profesor, escoge la micropipeta adecuada para medir
diferentes volúmenes de agua (1400μl, 750μl, 200μl, 80μl, 3μl), ajústala y colócalos en
microtubos graduados. Cuando se agregan volúmenes muy pequeños, se deben depositar
en el fondo del microtubo, si está vacío, o sumergiendo la punta de la micropipeta en el
líquido que ya se encuentre dentro del microtubo. De no ser así, el líquido agregado puede
quedar en las paredes del recipiente y nunca mezclarse con los reactivos previamente
agregados.

3. Prepara un gel de agarosa al 0.8% en TAE 1X. Para ello:

a. Prepara 50 ml de solución de agarosa al 0.8% P/V en un matraz con un
volumen al menos tres veces mayor al de la solución que vas a preparar.
b. Prepara el portageles de la cámara de electroforesis, según las indicaciones
que se te proporcionen de acuerdo al modelo de la cámara.
c. Funde la agarosa en el horno de microondas. PRECAUCION: la solución
estará muy caliente, protege tus manos. No dejes que ebulla dentro de
microondas, de lo contrario se derramará. Ten cuidado al agitarla, pues si lo
haces vigorosamente se puede derramar.
d. Vierte el gel en el portageles, cuidando de que no se formen burbujas.
Inmediatamente coloca un peine para formar los pozos.
e. Deja solidificar el gel; agrega buffer TAE 1X y retira el peine.

4. Se te proporcionarán muestras de ADN; para cargarlas en el gel:

a. Toma 10 μl de muestra y colócalos sobre un trozo de parafilm.
b. Toma 3 μl de frente de corrida y colócalos sobre la muestra de ADN. Mezcla el
colorante con el ADN absorbiendo y soltando el líquido con la micropipeta dos
o tres veces, procurando no formar burbujas.
c. Absorbe la mezcla de ADN-colorante y colócala dentro de un pozo del gel. NO
DEBES introducir la punta de la micropipeta hasta el fondo del pozo, pues se
taparía; solo introduce el extremo de la punta a la superficie del pozo y coloca
la muestra, SIN SOLTAR EL EMBOLO para que no vuelvas a absorber
muestra mezclada con buffer.

5. Conecta los electrodos. Programa la fuente de poder a 100V durante 5 minutos.

Observa en qué dirección se mueven las muestras.

CUESTIONARIO

1. Explica detalladamente los efectos que tiene el bromuro de etidio en la salud humana,
y que medidas se deben tomar para evitarlos.

3 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/09
 2. ¿Cuáles son los riesgos al exponerse a la luz ultravioleta? ¿Qué medidas de seguridad
vas a tomar cuando tengas que hacer uso de ella?

3. Enlista las medidas de seguridad que se deben tomar cuando manipules a) muestras
de origen animal y b) cultivos bacteriológicos.

4. ¿Por qué se debe tener especial cuidado al trabajar con microorganismos manipulados
genéticamente?

5. ¿Qué es el frente de corrida y cuál es su función?

RESULTADOS

1. Elabora un “manual de usuario” para:

a) Micropipetas (para cada uno de los modelos disponibles en el labortorio)
b) Microcentrífugas
c) Cámara de electroforesis horizontal.

4 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/09
Deben ser instrucciones sencillas y breves que posteriormente puedas consultar para hacer
uso del equipo. Incluye dibujos o fotografías de estos equipos, señalando sus partes más
importantes.

2. Registra tus observaciones de la preparación del gel de agarosa y carga de las

muestras, señalando las principales precauciones que se deben tomar en cuenta para
obtener un buen resultado.

5 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/09
6 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/09
 PRACTICA No. 2

EXTRACCIÓN DE ADN DE CELULAS EUCARIOTICAS MEDIANTE EL METODO

DELLAPORTA

OBJETIVO (S)

Al final de la práctica el alumno aprenderá una de las técnicas más utilizadas para la extracción
de ADN de diferentes muestras de tejido animal o vegetal.

INTRODUCCIÓN

La maceración y homogenización de una muestra de tejido, es una etapa crítica para

comenzar a aislar el DNA celular, para esto se necesita conocer muy bien la naturaleza celular
ya que de ello depende que se realice una buena extracción. De un tejido a otro, hay una gran
variación en la composición química del mismo, de igual forma las células de diferentes tejidos
almacenan diferentes sustancias, lo que hace que el rendimiento en el ADN obtenido sea
variable, debido a que dichas sustancias pueden interferir en el proceso de extracción.

Para obtener ADN El proceso de maceración-homogenización es llevado a cabo en presencia

de un buffer de extracción el cual generalmente contiene sustancias que amortiguan el pH y
sales orgánicas e inorgánicas, sustancias que facilitan la lisis celular (como detergentes tales
como el SDS o el triton X-100), inhibidores de nucleasas (para evitar la degradación del DNA
por extraer) y solventes para insolubilizar otras macromoléculas que no se desean aislar (por
ejemplo azucares y grasas). El propósito más importante de los siguientes pasos de la
extracción y purificación del DNA es su separación de un gran número de sustancias
contaminantes (entre ellas están diversas proteínas como histonas, polisacáridos, lípidos y
RNA). La desproteinización se logra con el uso de enzimas proteolíticas y con el uso de
diversos solventes específicos tales como fenol y/o cloroformo. Para el RNA se emplean
RNasas que actúan sobre estas moléculas a fin de degradarlas en componentes más ligeros y
así más fáciles de separar. El DNA se precipita fácilmente con etanol frío que además elimina
otras moléculas tales como grasas. En todos los pasos anteriores otros componentes
esenciales son las centrifugaciones diferenciales y la separación de fases de los solventes y
soluciones empleadas durante todo el proceso de extracción.

MATERIAL REACTIVOS
Microtubos Buffer de extracción:
Micropipetas de 10-100 μl y de 100-1000 μl Tris 100mM
Puntas para micropipetas EDTA 50mM
Homogeinizadores NaCl 500mM
Baño de agitación a 65 °C Mercaptoetanol 70 μl
Microcentrífuga Aforar a 100 ml y ajustar pH a 8.0
Guantes de látex SDS al 10%
Acetato de potasio 5M. (24.5372 g en 50 ml)
Tris-EDTA 50mM:10mM pH8 (0.605g de tris y
0.37 g de EDTA, para 100 ml)
Isopropanol absoluto.
Agua destilada estéril
Agua clorada

PROCEDIMIENTO

METODO DE DELAPORTA (modificado):

1ª Sesión: Extracción de ADN

7 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/09
1. Pesar 100 mg de tejido y colocarlo en un tubo para microcentrifuga; colocarlo en nitrógeno
líquido (si no es posible, congelarlo a -20º C)
2. Pulverizar la muestra (en condiciones frías). Homogenizar con 300 μl de buffer de
extracción, hasta obtener una suspensión fina. (Agregar el buffer de extracción poco a poco
para facilitar la maceración, hasta completar el volumen de 300 μl).
3. Añadir 80 μl de SDS al 10% y agitar vigorosamente.
o
4. Incubar por 15 minutos a 65 C, agitando ocasionalmente.
5. Añadir 1/10 de volumen de acetato de potasio 5 M. Agitar vigorosamente por 30 segundos.
6. Incubar 30 minutos en baño de hielo.
7. Centrifugar 10 minutos a 13,000 r.p.m.
8. Transferir sobrenadante a un tubo limpio. Agregar 0.6 volúmenes de isopropanol frío.
Mezclar suavemente; incubar 15 minutos a -20ºC. Observar si aparece algún precipitado.
9. Centrifugar 10 minutos a 13,000 r.p.m. Desechar el sobrenadante y secar la pastilla. La
pastilla es la muestra de ADN con algunos contaminantes.
10. Resuspender la pastilla en 500 μl en agua ultrapura estéril; almacenar en refrigeración
(aproximadamente 4°C).

NOTAS:

 Coloca todas las puntas, microtubos y homogenizadores usados en agua clorada para
su desinfección.
 Las personas encargadas de procesar la muestra de tejido animal deberán usar
guantes.

Segunda sesión: Purificación.

A partir de la muestra almacenada de la sesión anterior continuar con el procedimiento:

1. Agregar 500 μl de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico mezclando suavemente por 30 seg.

IMPORTANTE: Tomar el reactivo del fondo del frasco (de la fase inferior).
2. Centrifugar 5 min a 13,000 r.p.m. y recuperar la fase acuosa (superior), transferirla a un
tubo limpio.
3. Añadir un volumen de isopropanol frío.
4. Incubar 15 minutos a -20°C. Observar si aparece algún precipitado.
5. Centrifugar 10 minutos a 13,000 r.p.m. Eliminar sobrenadante.
6. Lavar la pastilla con 1000 μl de etanol al 70% frío. Centrifugar un minuto a 13,000 r.p.m.
Repetir el procedimiento una o dos veces más.
7. Dejar secar la pastilla (se puede dejar al aire libre, o utilizar un horno a 65ºC)
8. Resuspender en 50 μl de TE o agua estéril.

NOTAS:

 Coloca todas las puntas, microtubos y homogeinizadores usados en agua clorada para
su desinfección.
 Las personas encargadas de procesar la muestra de tejido animal deberán usar
guantes.

8 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/09
CUESTIONARIO

1. Cuáles son las funciones de: (IMPORTANTE: investiga la función de estos reactivos para la
EXTRACCION DE ADN, no su aplicación en otras áreas o procedimientos).
a. SDS

b. EDTA

c. Mercaptoetanol

2. ¿Qué contaminantes crees que podría tener la pastilla de ADN al final de su extracción y
purificación?

3. ¿Qué le ocurre al ADN al exponerlo a temperaturas de 65ºC?

4. ¿A qué temperatura se debe almacenar el ADN extraído? ¿Por qué?

5. ¿Cuál es el propósito del último lavado de la pastilla con etanol al 70%?

9 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/09
RESULTADOS

Reporta los cambios en la apariencia de las muestras en cada uno de los pasos efectuados
(puedes utilizar dibujos, fotografías o descripciones). De manera particular, enfatiza lo que
ocurre al agregar isopropanol frío y el tamaño y color de la pastilla obtenida en el paso 9 de la
primera sesión, y al final de la segunda sesión.

10 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/09
DISCUSIONES

11 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/09
 CONCLUSIONES

1.-

2.-

3.-

BIBLIOGRAFIA

12 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/09
 PRACTICA No. 3

CUANTIFICACION ESPECTROFOTOMETRICA DEL ADN Y EFECTO HIPERCROMICO

OBJETIVO (S)

Al final de la práctica el alumno aprenderá:

1.- Como realizar un análisis espectrofotométrico de muestras de ADN.

2.- Cuál es la información que se puede obtener en un análisis espectrofotométrico a partir de
las muestras de ADN.
3.- Observará el efecto hipercrómico.

INTRODUCCIÓN

Cuantificación espectrofotométrica de ADN

En gran parte de los estudios de biología molecular es esencial la cuantificación tanto de ADN
como de ARN a fin de conocer no solo la cantidad de los mismos, sino también su pureza. El
método tradicional de análisis consiste en medir la absorbancia a 260 nm y otras longitudes de
onda; este método es simple y rápido.

La cuantificación de ADN en una muestra a través de espectrofotometría se basa en la

propiedad de las bases nitrogenadas de absorber luz en el rango ultravioleta del espectro
electromagnético.

El ADN y el ARN tienen su máxima absorbancia a 260nm, por lo que la absorbancia a 260 nm
(A260) es usada para cuantificar la concentración de una preparación relativamente pura de
ácidos nucleicos en general (sea ADN o ARN).

Para poder discriminar las lecturas de absorbancia correspondientes al ADN y al ARN, se usa
una relación de la absorbancia a 260 y 280 nm (A260/A280). Algunos aminoácidos también
presentan un pico de absorbancia a 280 nm. Se considera que una muestra tiene una pureza
aceptable cuando la relación A260/A280 tiene un valor entre 1.7 y 2; un cociente menor a 1.7
indica contaminación por proteínas o compuestos fenólicos, y uno mayor a 2 indica
contaminación por ARN.

La absorbancia a 320 nm indica la presencia de partículas en la solución, principalmente

carbohidratos.

Los contaminantes que contienen puentes peptídicos o anillos aromáticos (tales como
proteínas y/o fenol) pueden cuantificarse a una absorbancia de 230 nm.

Se sabe que una unidad de absorbancia (DO) a 260 nm equivale a 50 μl/ml de ADN de doble
cadena. Mediante esta relación se puede calcular fácilmente la concentración de ADN por
métodos espectrofotométricos, utilizando como parámetro la absorbancia a 260 nm:

μg/ml ADN = 50 (Abs 260nm) (Factor de dilución)

Para el ARN y el ADN de cadena sencilla una unidad de absorbancia (OD) a 260 nm equivale a
40 μl/ml.

Efecto hipercrómico

Como ya se señaló, las responsables de absorber la radiación UV son en realidad las bases
nitrogenadas; por lo tanto, a mayor exposición de las bases nitrogenadas, mayor absorción. Así
pues, las moléculas de ADN de cadena sencilla absorben una mayor proporción de luz UV que
las moléculas de ADN de cadena doble.
13 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/09
 El efecto hipercrómico consiste en que una solución de ADN calentada hasta desnaturalizarse
presentará mayor absorbancia aunque su concentración permanezca constante.

MATERIAL REACTIVOS
Espectrofotómetro UV/VIS Agua destilada estéril
Celdillas de cuarzo tipo 6Q Muestras de ADN
Micropipetas de 1-10 μl 10-100 μl y 100-1000 μl
Puntas para micropipetas
Tubos ependorf
Termoblock

PROCEDIMIENTO

I ) Análisis espectrofotometrico

1) Diluir 10μl de la muestra en 990 μl de agua desionizada estéril (dilución 1:100; factor de
dilución 100)
2) Determinar la absorbancia a 260, 280 y 310 nm. Realizar los cálculos correspondientes
para determinar la concentración y pureza del ADN obtenido.

II ) Efecto hipercrómico

1) Con base a tus lecturas de absorbancia en la parte (I), realiza una dilución de tu
muestra para que te de una lectura de entre 0.8 y 1 D.O. a temperatura ambiente.
Después calienta esta dilución gradualmente y determina su absorbancia a 260 nm a
las siguientes temperaturas:

TEMPERATURA (ºC) ABSORBANCIA (260nm)

Temperatura ambiente
60
70
80
90
100

2) Enfría rápidamente en hielo, determina la absorbancia a 260nm.

CUESTIONARIO

1. ¿Cuáles son las ventajas de la cuantificación del ADN mediante espectrofotometría con
respecto a otros métodos?

2. Explica un método distinto al espectrofotométrico para cuantificar ácidos nucleicos.

14 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/09
3. ¿Por qué es importante determinar la presencia de contaminantes en una muestra de
ADN?

4. Si una muestra de ADN es calentada a 95-100ºC, y después es enfriada bruscamente,

¿qué esperas que ocurra con las moléculas de ADN al subir y luego al bajar la
temperatura? ¿y cómo esperas que se comporten las lecturas de absorbancia?

RESULTADOS

1. Reporta las lecturas de absorbancia en el espectrofotómetro, y con base a estas calcula la

concentración de ADN y su pureza con respecto a proteínas, compuestos fenólicos, ARN y
proteínas para ambas muestras. Reporta los cálculos realizados, y llena la siguiente
tabla:

Concentración
Muestra Rendimiento A260 / A280 % Carbohidratos
(μg/ml de ADN)
Animal
Vegetal

2. Con los resultados del experimento para observar efecto hipercrómico, realiza una gráfica
de absorbancia vs. temperatura.
Con estos datos, estima la temperatura de fusión del ADN (Tm).

3. Reporta la absorbancia de la muestra después de ser calentada a 100ºC y luego enfriada

rápidamente en hielo.

(En discusiones explica ampliamente el comportamiento de la muestra).

15 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/09
16 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/09
DISCUSIONES

17 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/09
 CONCLUSIONES

1.-

2.-

3.-

BIBLIOGRAFIA

18 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/09
 PRACTICA 4

ANALISIS ELECTROFORETICO DE ADN

OBJETIVO (S)

Al final de la práctica el alumno aprenderá:

1.- La técnica de separación electroforética de ácidos nucleicos a través de electroforesis en

gel.
2.- A interpretar los aspectos básicos de un gel de agarosa de ácidos nucleicos.

INTRODUCCIÓN

La electroforesis se define como el fenómeno electroquímico en el cual las partículas

coloidales son desplazadas por acción de una corriente eléctrica. Es una técnica analítica que
se utiliza para separar moléculas de acuerdo a su tamaño y carga eléctrica.

En el caso de los ácidos nucleicos, debido a que todas las moléculas de ADN tienen carga
eléctrica negativa, su separación ocurre exclusivamente debido a las diferencias de tamaño. En
algunos casos, también son separadas de acuerdo a su estructura tridimensional.

De manera rutinaria, para la separación de ácidos nucleicos se utilizan geles de agarosa; estos
se comportan como una matriz o malla que deben atravesar las moléculas de ácidos nucleicos.
Este gel es sumergido en un buffer que permite el paso de la corriente eléctrica. Los ácidos
nucleicos se colocan en el extremo correspondiente al ánodo; al aplicar la corriente eléctrica
migran hacia el cátodo. Las moléculas de mayor tamaño migran a menor velocidad, por lo que
avanzan menos; las moléculas más pequeñas migran a mayor velocidad.

Algunas moléculas de ADN pueden adquirir distintas configuraciones topológicas; esto ocurre
al realizar análisis electroforético de plásmidos, los cuales se pueden presentar de forma
circular relajada, superenrollados, linearizados e incluso concatemerizados. Las moléculas
linearizadas atraviesan con mayor facilidad la malla de agarosa que cualquier otra
configuración; y las superenrolladas pueden atravesar con mayor facilidad que las formas
circulares relajadas. De este modo, tres moléculas de exactamente el mismo peso molecular
pueden migrar a diferente velocidad debido a las diferencias en su estructura tridimensional.

La velocidad de migración también depende de el voltaje aplicado y de la concentración de la

agarosa: a mayor voltaje, mayor velocidad; y a mayor concentración de agarosa, menor
velocidad de migración. En general, al correr lentamente un gel bandas de peso molecular
cercano se separan mejor, es decir, tienen mayor poder de resolución. El voltaje y la
concentración de agarosa se deben elegir tomando en cuenta el tamaño de las moléculas que
se esperan observar y la resolución y calidad requeridas.

Debido a que los ácidos nucleicos no absorben luz en el espectro visible es necesario usar
colorantes para poder visualizarlos. Hay dos tipos de tinciones:
19 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/09
1. Para monitorear el avance de las moléculas a través del gel. Los colorantes utilizados
para este propósito se mezclan con la muestra que contiene a los ácidos nucleicos y
migran junto con ellos; se conocen como frente de corrida o buffer de carga. Uno de los
más utilizados es el azul de bromofenol. El frente de corrida también ayuda a identificar la
posición en el gel de las moléculas de ADN, así como las de ARN.

Bandas de ADN

Frente de corrida

ARN

2. Para teñir propiamente a las moléculas de ácidos nucleicos. Estos colorantes pueden
mezclarse con la propia agarosa, o bien, una vez concluida la electroforesis el gel se
sumerge en una solución que los contiene. El más utilizado es el bromuro de etidio, debido
a que con él se pueden detectar ácidos nucleicos en muy bajas concentraciones.

Es importante señalar que el bromuro de etidio es un compuesto muy tóxico, irritante,

potencialmente mutagénico y debe utilizarse con sumo cuidado. Hay otros colorantes, como el
FastBlast ® o el RedGel ® que no son tóxicos, pero tienen la desventaja de presentar un menor
1
límite de detección .

Interpretación de un gel de agarosa

Al finalizar la electroforesis y después de teñir el gel correspondiente, se van a observar

manchas que pueden ser bien definidas (bandas) o difusas (barridos). Debido al límite de
detección de los colorantes lo que observamos en una banda no es una sola molécula de ácido
nucleico, sino un conjunto de moléculas de ácidos nucleicos del mismo peso molecular, en
otras palabras, muchas copias de la misma molécula (por ejemplo, el ADN íntegro de varias
células).

Cuando se observa un barrido, lo que tenemos es un conjunto de moléculas con pesos

moleculares ligeramente distintos. En el caso de las moléculas de ARN, lo que observamos
suelen ser ARNm que por su naturaleza tienen distintos tamaños. En el caso del ADN, los
barridos se observan cuando las moléculas se degradan y fragmentan de manera aleatoria. Así
pues, si observamos un barrido en una muestra de ADN significa que este se degradó, la
muestra es de baja calidad y no es útil para la mayoría de protocolos posteriores.

Bandas de ADN
íntegro
Barrido correspondiente
a ADN degradado

1
Límite de detección: Es la cantidad mínima de un analito que puede ser detectada mediante una técnica
analítica.
20 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/09
 Como las moléculas de ADN migran a diferente velocidad, se posicionan en un sitio distinto en
el gel de acuerdo a su tamaño (peso molecular). Se utilizan estándares para determinar el
tamaño de cada banda. Estos estándares, conocidos como marcadores de peso molecular
(MPM), son un conjunto de fragmentos de ADN de peso molecular conocido, expresado en
pares de bases (pb)

El MPM se coloca en un carril del mismo gel que las muestras

que se están analizando. Las bandas presentes en las
muestras se comparan con las bandas del MPM, y de este
modo se estima su peso molecular.

Finalmente, la intensidad de una banda es directamente proporcional a la cantidad de ADN

depositada en el pozo. Así que se puede estimar de manera semi-cuantitativa la concentración
de ADN en una muestra, aunque hay otros métodos más precisos para cuantificar la
concentración del ADN, como la medida de su absorbancia.

MATERIAL REACTIVOS
Micropipetas de 1-10 μl 10-100 μl y 100-1000 μl Agua destilada estéril
Puntas para micropipetas Agarosa 1% en TAE 1X
Tubos ependorf TAE 1X
Cámara de electroforesis horizontal Frente de corrida
Fuente de poder Buffer de corrida
Agua clorada
Muestras de ADN

PROCEDIMIENTO

Realizar estos pasos por triplicado (para correr tres geles simultáneamente)

1. Preparar una solución de agarosa al 1% en buffer TAE 1X. Fundirla en horno de

microondas al 80% de poder.
2. Colocar el peine a 1cm del extremo del portageles y a 1-2 mm de la base del mismo. Vaciar
la agarosa fundida y dejar solidificar a temperatura ambiente.
3. Sumergir el gel en buffer TAE. Retirar el peine justo antes de cargar las muestras.
4. Cortar un pedazo delgado de papel parafilm. Colocar 10μl de la muestra purificada de ADN
y agregar 3 μl de colorante de frente de corrida; mezclar con la micropipeta.
5. Tomar los 13 μl (muestra + colorante) y colocarlos dentro de un pozo del gel.
6. Conectar los cables. Fijarse que el cable del polo negativo quede del lado de los pozos de
muestra y el del positivo del lado contrario.
7. Aplicar una corriente de 120V hasta que las muestras hayan migrado 2/3 de la longitud
total del gel. Si los cables están conectados correctamente, deberán verse burbujas en el
buffer y la muestra deberá comenzar a moverse hacia el polo positivo.
8. Retirar los geles de la cámara de electroforesis.
9. Teñir cada gel con un colorante distinto, según las indicaciones del profesor:
a. Fast Blast
b. RedGel
c. Bromuro de etidio

CUESTIONARIO

1. ¿Qué es la agarosa, de dónde se obtiene y cuál es su función en la electroforesis?

21 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/09
2. ¿Cuál es el papel del buffer TAE en la electroforesis de ácidos nucleicos?

3. ¿Cuál es la función del frente de corrida o buffer de carga?

4. Además del propio colorante (como azul de bromotimol), ¿qué otros componentes tiene el
buffer de corrida o buffer de carga, y para qué sirven?

RESULTADOS

Imagen de los geles (fotografía o dibujo) señalando bandas y barridos presentes.

NOTA: Es muy importante que indiques en qué carril está cada una de las muestras de tu
equipo, y que incluyas un pie de foto en el que describas si se observan bandas y/o barridos,
en qué posición.

22 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/09
23 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/09
DISCUSIONES

24 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/09
 CONCLUSIONES

1.-

2.-

3.-

BIBLIOGRAFIA

25 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/09
 PRACTICA No. 5

OBTENCION DE ARN TOTAL A PARTIR DE TEJIDOS VEGETALES

OBJETIVO (S)

El alumno aprenderá a desarrollar un protocolo para la obtención de ARN total de diferentes

muestras de tejido vegetal, así como las diferentes consideraciones que deben tomarse en
cuenta para esta técnica.

INTRODUCCIÓN

La obtención de ácido ribonucleico (ARN) de alta calidad y cantidad es un requisito primordial

para numerosos estudios en biología molecular, por ello es de suma importancia entender los
procesos y principios básicos que permitan el aislamiento, purificación y manipulación de esta
molécula. No obstante, la presencia de una gran cantidad de compuestos químicos tales como
polisacáridos, polifenoles, metabolitos secundarios y pectinas, presentes en los tejidos de las
plantas, dificultan el proceso de extracción de ARN, ya que estos compuestos forman
complejos insolubles con los ácidos nucleicos o a menudo co-precipitan en la etapa final y
muchas veces no se pueden eliminar por métodos y/o kits convencionales. Remover estos
compuestos es de suma importancia antes de que el ARN pueda ser utilizado en subsecuentes
manipulaciones enzimáticas o procesos analíticos. Además, debe considerarse, que el
contenido de estos compuestos varía entre tejido, así como las condiciones de su procedencia,
por lo que es necesario utilizar y en algunos casos desarrollar protocolos de extracción de
ARN, específicos para cada planta, e incluso para sus diferentes estructuras tales como hoja,
fruto, tallo, raíz, flor o semilla.

En su mayoría, las diferentes metodologías que existen para la obtención de ARN total en
tejidos vegetales, consisten en dos etapas fundamentales:

Preparación, maceración y rompimiento celular de la muestra de tejido. En esta etapa se

debe de considerar la manera de realizar la colecta del tejido, así como su almacenaje y
transporte hasta el momento de la maceración. Esto es muy importante ya que el ARN se
degrada más rápidamente, en comparación del ADN, debido a la presencia de ribonucleasas,
las cuales son enzimas muy estables y que generalmente no requieren cofactores para su
funcionamiento, y que suelen ser uno de los principales factores a considerar para la obtención
exitosa de ARN de buena calidad y cantidad. Por otro lado, también debe de considerase que
la cantidad de ARN obtenida generalmente es utilizada en estudios de expresión génica, por lo
que la planeación, preparación y método de colecta del tejido infieren en el resultado final del
estudio.
La maceración del tejido, consiste en la ruptura del tejido en pequeñas piezas o fragmentos
que permitan un adecuado rompimiento celular. Este proceso generalmente se realiza
mediante una rápida congelación del tejido utilizando nitrógeno líquido y su inmediata
maceración. Posteriormente, se realiza el rompimiento celular mediante el uso de buffer de
extracción, los cuales, generalmente contienen diferentes detergentes iónicos y/o tratamientos
con proteasas, sustancias que amortiguan el pH y sales. Todo lo anterior con la finalidad de
liberar el contenido celular.

Extracción y purificación de ARN. Esta etapa consiste en separar y purificar el ARN de la

muestra mediante la eliminación de proteínas, lípidos y otras moléculas biológicas. Uno de los
métodos más comunes es la desproteinización mediante el uso de solventes tales como fenol y
cloroformo, los cuales tienen la habilidad de desnaturalizar proteínas y lípidos, pero no ácidos
nucleicos, permitiendo su separación en la fase acuosa. La precipitación con etanol es una de
las técnicas más útiles para la concentración de ARN y para remover fenol y cloroformo
residual. Por otro lado, diversas sales son capaces de inducir la precipitación de ARN, como
son el cloruro de sodio, acetato de sodio, acetato de amonio o el cloruro de litio, este último,
posee la ventaja de ser incapaz de precipitar carbohidratos, proteínas o ADN.

26 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/09
MATERIAL REACTIVOS
Puntas Buffer de extracción:
Hielera 2% w/v CTAB
Micropipeta 100-1000µl 3% β-Mercaptoetanol
Micropipeta 20-100µl 50 mM EDTA (pH 8.0)
Micropipeta 2-20µl 2.5 M NaCl
Tubos de microcentrífuga “eppendorf” 2ml 1.5% PVPP
Mortero H2O des-ionizada tratada con DEPC
Navaja Nitrógeno líquido
Caja pétri Etanol Absoluto
Matraz 20ml Acetato de Sodio 3M
Guantes de látex Cloroformo-Alcohol-Isoamílico 49:1
EQUIPO: Fenol-Cloroformo 25:24
Baño de agitación a 40°C Cloruro de Litio 6M
Microcentrífuga Cloruro de Litio 2M
Vortex Etanol al 70%
Espectrofotómetro UV/VIS H2O des-ionizada tratada con DEPC
Celdilla de cuarzo Agarosa 1% en TAE 1X
Cámara de electroforesis TAE 1X
Equipo de electroforesis Buffer de corrida
Foto-documentador o cámara con luz UV Bromuro de etidio

PROCEDIMIENTO

1. Pre-calentar buffer de lisis a 40ºC

2. Se pulveriza tejido fresco con nitrógeno líquido y se pesa en un tubo de microcentrífuga

“eppendorf” la cantidad de 0.2 g.

3. La muestra pulverizada se homogeniza con 1ml de buffer de lisis, con agitación

vigorosa durante 1 minuto.

4. Se incuba la muestra durante 10 minutos a 40ºC y se mezcla cada 2 min.

5. Se deja enfriar a temperatura ambiente.

6. Se realiza una extracción, llevando la mezcla a un volumen de 2ml con cloroformo-

alcoholisoamilico 24:1 v/v (agitar cuidadosamente hasta que la mezcla quede
homogénea) y centrifugar a 12000 rpm durante 10 minutos, se recupera la fase acuosa
procurando no llevar residuos de la fase orgánica.

7. Se realiza una segunda extracción con un volumen de fenol-cloroformo-

alcoholisoamílico 25:24:1 (agitar cuidadosamente hasta que la mezcla quede
homogénea) y centrifugar a 12000 rpm durante 10 minutos, se recupera la fase acuosa
procurando no llevar residuos de la fase orgánica.

8. Se realiza una extracción con un volumen de cloroformo-alcoholisoamílico 49:1 (agitar

cuidadosamente hasta que la mezcla quede homogénea) y centrifugar a 12000 rpm
durante 10 minutos, se recupera la fase acuosa procurando no llevar residuos de la
fase orgánica.

9. El ARN se precipita con cloruro de litio a una concentración final 3M y se deja a 4ºC
toda la noche.

10. Se recupera la pastilla de ARN centrifugando a 13000 rpm durante 20 minutos y

desechar sobrenadante.

11. Se lava la pastilla con 1 ml de cloruro de litio 2M y centrifugar a 13000 rpm por 5
minutos.

27 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/09
 12. La pastilla resultante se re-suspende en 300 µl de agua desionizada estéril tratada con
DEPC y se agrega 1/10 de volumen de acetato de sodio 3M y 2.5 de volumen de etanol
absoluto. Se mezcla y se incuba a -70ºC durante 30 minutos.

13. Se centrifuga a 13000 rpm durante 10 min y se desecha el sobrenadante.

14. La pastilla resultante se lava con 1 ml de etanol al 70% y se centrifuga durante 5

minutos a 12000 rpm

15. Finalmente la pastilla de ARN se re-suspende en 60 µl de H2O des-ionizada tratada

con DEPC.

Análisis de la molécula de ARN

La concentración y pureza del ARN se analiza mediante la determinación de la

absorbancia a 260, 280 y 310 nm, utilizando el espectrofotómetro UV/VIS

Posteriormente el producto se visualiza mediante una electroforesis en gel de agarosa

al 1% sumergido en TAE 1X con condiciones de corrida de 80 volts durante 50 minutos.
Se tiñe el gel en bromuro de etidio y se enjuaga en agua destilada. Finalmente se
visualiza y fotografía bajo luz UV.

Nota:

Manejar con debida precaución todos los pasos antes descritos y desechar los residuos donde
indique su profesor.

Para mejor rendimiento de RNA es necesario que todos los reactivos se encuentren estériles,
las muestras bien pulverizadas y todo se trabaje en frio, es decir, procurar que las muestras
permanezcan siempre en hielo y siempre utilizar guantes. Es recomendable que todas las
soluciones utilizadas sean previamente tratadas con dietilpirocarbonato (DEPC).

CUESTIONARIO

Menciona al menos tres factores que complican la obtención de ARN total.

28 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/09
¿Por qué se utiliza una mezcla de fenol-cloroformo en el paso de extracción para el presente
protocolo? Explica por qué se utilizan juntos y no por separado

¿Cuál es el papel de las ribonucleasas durante la obtención de ARN total?

RESULTADOS

1. Reporta las características de la muestra durante todo el proceso.

29 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/09
2. Reporta las lecturas de absorbancia obtenidas en el espectrofotómetro, y con base a
estás, calcula la concentración de ARN y su pureza (reporta los cálculos realizados).
Anexa la fotografía del gel obtenido incluyendo su descripción adecuada como pie de
figura (señala adecuadamente las bandas obtenidas). Discute los resultados obtenidos.

Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/09
DISCUSIONES

Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/09
 CONCLUSIONES

1.-

2.-

3.-

BIBLIOGRAFIA

2 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/09