“AÑO DE LA DIVERSIFICACIÓN PRODUCTIVA Y DEL FORTALECIMIENTO DE LA EDUCACIÓN”

FACULTAD:

 Ingeniería Agraria, Industrias Alimentarias y Ambiental

ESCUELA:

 Ingeniería en Industrias Alimentarias

DOCENTE:

ASIGNATURA:

 Microbiología General
TEMA:

Practica N° 03. Siembra y aislamiento de microrganismos


CICLO:

 IV

ALUMNAS:

 BRAVO CAQUI, Yolina Yersy.

 ESCOBAR PAUCAR, Sara Beatriz.
 ESPINOZA PONCIANO, Katherine Harumi.
 SANCHEZ ARANDA, Zaida Selene

HUACHO – PERÚ
2015
 PRACTICA N° 3 SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICRORGANISMOS

I. INTRODUCCIÓN

En la naturaleza, los microorganismos se encuentran formando poblaciones

mixtas con otros tipos de microorganismos. Los cultivos de estas mezclas se
llaman por ello cultivos mixtos. Sin embargo, el conocimiento de los
microorganismos se consigue mediante el estudio de cepas aisladas, cultivadas
en el laboratorio. Sin embargo la identificación bacteriana y la caracterización
completa solo son posible tras el aislamiento de la bacteria y la obtención de
cultivos puros. Por ello el primer problema al estudiar una bacteria es su
aislamiento del resto de los microorganismos presentes (en una muestra
patológica, de agua, de suelo, de alimentos, etc.). Una vez que se ha logrado el
aislamiento es posible obtener la bacteria de interés en cultivo puro.

II. OBJETIVOS

2.1.Desarrollar técnicas comunes de inoculación en medios de cultivo y las

técnicas de aislamiento.
2.2.Hacer crecer microorganismos en un medio de cultivo.
2.3.Saber cómo sembrar microorganismos en el agar.

III. MARCO TEORICO

Los microorganismos se cultivan en el laboratorio en materiales nutritivos

denominados medios de cultivo, cuyos componentes son muy variados. La
elección del medio se basa en el propósito del estudio.

El material que se inocula en el medio se denomina inoculo. Cuando se inocula

un medio como el agar nutritivo u otros medios con agar en cajas Petri, por el
método de siembra, por estrías cruzadas en placa, las células quedan separadas
individualmente, durante la incubación, las células microbianas individuales se
reproducen tan rápidamente que en un tiempo de 18 a 24 horas producen masas
visibles a simple vista, denominados colonias.
Siembra
Es la incorporación a un medio de cultivo de una muestra, con propósitos
cuantitativos o cualitativos.

Tipos de siembra
Siembra en placa:
 Por estría
 Por inclusión
 Por extensión o bañado

Siembra en tubos:

 Con agar inclinado.

 Con medio sólido horizontal.
 Con medio semisólido.
 Con medio líquido.
En la naturaleza los microorganismos crecen en poblaciones mixtas y
complejas, la cual para esto se necesitan las técnicas siguientes:

Técnica aséptica: Técnica usada para evitar la contaminación durante la

manipulación de cultivos y de medios de cultivos.

a) El asa se calienta hasta la incandescencia y se enfría al aire, cerca

del mechero.
b) El tubo u la placa se destapa cerca del mechero.
c) Se flamea el extremo del (tubo) por la llama.
d) Se extrae la muestra con el asa esterilizada.
e) Tras tomar la muestra, se vuelve a flamear el extremo del (tubo) y
la muestra se deposita en un medio estéril.
f) Se vuelve a tapar el tubo u la placa.
g) El asa se recalienta de nuevo antes de finalizar.
Aislamiento

Consiste en obtener un cultivo puro de un microorganismo a partir de un

cultivo mixto.

Métodos:

 Directo
 Estrías
 Inclusión o bañado
 Indirecto - enriquecimiento previo

Aislamiento por agotamiento

Siembra por estría

Se inocula la muestra sobre un extremo de la placa con un asa y se extiende

formando estrías sobre la superficie en varios sentidos, cada célula aislada
se multiplicará formando una colonia independiente, cada colonia representa
un cultivo puro.

Aislamiento por dilución

Siembra por extensión o bañado

Se extiende el inóculo uniformemente con una varilla acodada estéril por la

superficie del medio de cultivo.

Las células diseminadas sobre la superficie formarán colonias aisladas.

IV. PROCEDIMIENTO
1. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y SIEMBRA DE
BACTERIAS EN MEDIOS DE CULTIVO. ESTERILIZACIÓN.
Material:
Mechero bunsen o similar
Asa de siembra
Alcohol
Acetona
Papel crap
4 placas
Hilo pabilo
Regla
1.1 PREPARACIÓN DE MEDIOS
Preparación de un medio sólido en placa
 Pesar la cantidad de medio (si el preparado contiene agar debemos añadirlo a una
concentración de 15 g/l.) y rehidratarlo con agua destilada en una botella.

 Autoclavar la botella sin cerrar totalmente el tapón de rosca.

 Sacar del autoclave, enroscar del todo el tapón e introducir la botella en un baño a
40ºC al menos durante 30 minutos.

 Distribuir el medio en las placas de Petri que está estériles dentro de una campana de
flujo laminar o en las proximidades del mechero, flameando bien la boca de la botella
para evitar las contaminaciones.

 Dejar que el medio solidifique.

 1.2 REALIZACIÓN DE LA SIEMBRA
1. Marcar el material con el nombre de la pareja y grupo.

2. Realizar la siembra, como sigue:

Siembra en placa:
Dividida la placa en tres partes, sembrar en cada tercio el inóculo tomado de los
cultivos crecidos. Se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo crecido y se
toma una gota de inóculo que se extiende sobre el agar de la placa deslizando el asa
suavemente por su superficie en zig-zag.

3. INCUBACIÓN de los medios sembrados a 37 ºC hasta que haya habido

crecimiento bacteriano.
4. OBSERVACIÓN DE LOS RESULTADOS:
En primer lugar, observar a simple vista diversas características como el color y el
borde de las colonias crecidas en el agar así como el olor y la turbidez del medio ya
que en algunos casos suelen ser típicos de un determinado tipo de microorganismo y
pueden servir de ayuda a la hora de su identificación.

El siguiente paso sería la observación al microscopio, que será objeto de otra práctica.

2. OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS

Preparación:

1. Esterilizar el asa y enfriarla en las proximidades del mechero.

2. Tomar el inóculo como se ha descrito anteriormente.

3. Flamear y enfriar el asa. Repetir la operación descrita en el apartado anterior, pero

rozando al empezar la segunda tanda de estrías.

4. Flamear el asa y cerrar la placa e incubar a 37ºC.

3. OBSERVACIÓN DE BACTERIAS TEÑIDAS. TINCIÓN SIMPLE Y
TINCIÓN DE GRAM.
Material:
Portaobjetos.
Mechero Bunsen.
Asa de siembra.
Tubos con cultivos de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas.
Cubetas de tinción o similar.
Colorantes para las tinciones: Cristal violeta, Lugol, Alcohol-Acetona (1:1)
y Safranina.
Método:
1. Realización del frotis y la fijación de los diferentes cultivos de bacterias Se
procederá tal y como se ha descrito anteriormente.
2. Tinciones:
a) TINCIÓN SIMPLE es la tinción en que se utiliza un solo
colorante.

b) TINCIÓN DE GRAM es la tinción diferencial más utilizada en

Bacteriología pues permite separar las bacterias en dos grandes
grupos, las Gram-positivas y las Gram-negativas. La tinción de Gram
requiere cuatro soluciones:
Primer colorante. Es un colorante básico que en contacto con las
células cargadas negativamente, reacciona con ellas
coloreándolas. El más utilizado es el cristal violeta.
Solución mordiente. Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre
el colorante y las células. Los mordientes empleados suelen ser
sales metálicas, ácidos o bases, como, por ejemplo, una solución
diluida de yodo.
Agente decolorante. Es un disolvente orgánico, por ejemplo,
alcohol-acetona (1:1).

Colorante de contraste. Es un colorante básico de distinto color

que el primer colorante, como, por ejemplo, la safranina. Los dos
grupos bacterianos a los que anteriormente nos referíamos difieren
en el color con el que finalmente aparecen. Las bacterias Gram
positivas se teñirán de azul por el cristal violeta y no perderán esta
coloración durante los pasos sucesivos. Las bacterias Gram
negativas perderán la coloración inicial del cristal violeta en los
siguientes pasos y se teñirán de rosa debido a la safranina. La
diferencia está determinada por la composición de su envoltura
celular. Las bacterias gram positivas poseen una malla de
peptidoglicano en su parte más externa, mientras que las bacterias
gram negativas, recubriendo una fina capa de peptidoglicano,
presentan una membrana externa que envuelve toda la célula.

El método de tinción es el siguiente:

1. Se prepara el frotis, se seca y se fija.

2. Se cubre con cristal violeta durante un minuto.

3. Lavar suavemente con agua destilada para eliminar el exceso de colorante.

4. Se traza con lugol un minuto. El lugol actúa como mordiente aumentando

la afinidad del colorante por la bacteria.

5. Se gotea alcohol-acetona de forma continua hasta que la preparación deje

de perder color y se lava enseguida con agua abundante.
6. Se cubre la preparación con un colorante de contraste, como la safranina,
durante un minuto.

7. Se lava con agua y se seca al aire, observándose a continuación con el

objetivo de inmersión.

8. Observación de las tinciones de bacterias al microscopio.

Las bacterias Gram-positivas presentarán una coloración violeta mientras

que las Gram-negativas la presentarán roja o rosa. La identificación de las
bacterias Gram-positivas puede ser problemática, solamente cuando las
bacterias Gram-positivas se encuentran en crecimiento exponencial
(cultivos jóvenes) la reacción es clara; en fase estacionaria (cultivos
viejos) las bacterias Gram-positivas pueden parecer Gram-negativas.
V. CONCLUSIONES

 Los microorganismos se cultivan en el laboratorio en materiales

nutritivos denominados medios de cultivo, cuyos componentes son muy
variados. La elección del medio se basa en el propósito del estudio.
 Se logró identificar e trabajar y cultivar microorganismos.
 Se lo logro la siembra de microorganismos.
 El aislamiento consiste en obtener un cultivo puro de un
microorganismo a partir de un cultivo mixto.
 La siembra de microorganismos es la incorporación a un medio de
cultivo de una muestra, con propósitos cuantitativos o cualitativos.
VI. BIBLIOGRAFIAS

 OLIIVAS. Evangélica. Manual de prácticas de Microbiología básica

y Microbiología de alimentos. Programa de Nutrición. Universidad
Autónoma de Ciudad Juárez.
 http://www.pomif.com/pages/practicas/bacteriologia/aislamiento
MICROBIOLOGIA GENERAL IIA