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INTRODUCCIÓN
Las actividades forestales y agrícolas como la producción de papel, madera y muchas otras
agroindustrias generan grandes cantidades de residuos. Estos residuos se consideran un problema
de contaminación ambiental. Un alto porcentaje de estos residuos se queman
indiscriminadamente, generando gases de efecto invernadero, y su descomposición al aire libre
genera lixiviación en los cuerpos de agua y promueve la proliferación de plagas (Asocolflores
2002).
Un sistema celulolítico fúngico típico comprende múltiples enzimas. Las celulasas son
generalmente mezclas de varias enzimas, principalmente endoglucanasa, exoglucanasa y β-
glucosidasa (Sun & Cheng 2002). Las endoglucanasas hidrolizan internamente las cadenas de
celulosa, las exoglucanasas hidrolizan externamente las unidades de celobiosa de los extremos no
reductores o reductores de las microfibras de celulosa y la 1,4-β-glucosidasa hidroliza los enlaces
que unen moléculas de glucosa (Baldrian & Valášková 2008). Mediante la catalización de la
hidrólisis de alquil- y aril-β-glucósidos, diglucósidos y oligosacáridos, la 1,4-β-glucosidasa juega un
papel considerable en la descomposición de sustratos lignocelulósicos; Hidroliza la celobiosa en
glucosa, evitando así la inhibición del producto final de las exoglucanasas (Huang, 2011).
Las celulasas y otras enzimas con vías enzimáticas similares o complementarias se utilizan en las
industrias de alimentos, cerveza, vino, alimentación animal, textiles, lavandería y papel, así como
en la investigación agrícola (Bhat 2000). La lacasa y la peroxidasa de manganeso son enzimas que
tienen aplicaciones industriales potenciales porque estas enzimas eliminan compuestos fenólicos
oxidados y una variedad de compuestos aromáticos. La conversión de compuestos tóxicos y tintes
textiles presentes en aguas residuales y el blanqueo y eliminación de lignina de fibras de madera y
no maderables son dos ejemplos de aplicaciones industriales de estas enzimas (Lundell et al.,
2010).
La floricultura es una de las principales actividades del sector agropecuario en Colombia, con una
participación del 13% en el comercio mundial de flores, ocupando el segundo lugar después de los
Países Bajos, que tiene una cuota de mercado del 42%. Según Asocolflores (2010), se producen
más de 50 tipos de flores en un área de 7.266 hectáreas en Colombia. Los principales tipos de
flores son Rosa (33%), claveles (12,7%), mini claveles (6,7%), crisantemo y pompones (8%)
(Asocolflores 2010). El sector de la floricultura genera aproximadamente 1,5 m3 / ha / día o entre
0,8 y 1 t / ha / semana de residuos vegetales, dependiendo del tipo de flor y del ciclo de
producción. Aproximadamente 9.591 t / mes de residuos son generados por la producción de
Rosa, mientras que 2.325 t / mes son generados por cultivos de crisantemo. Los residuos son el
resultado de los pasos iniciales de corte, poscosecha y plantación.
El cultivo se separó de la biomasa de hongos y los componentes insolubles del medio de cultivo
por centrifugación (a 22.000 g durante 15 minutos) a 4ºC, seguido de filtración usando una
membrana Millipore (0,45 μm). El extracto se almacenó a -20ºC y se usó para determinar la
presencia de las siguientes enzimas: lacasa, peroxidasa de manganeso (MnP), endoglucanasa,
exoglucanasa y β-glucosidasa.
Finalmente, debido a que los restos de Chrysanthemum y Rosa contienen Zn + 2 y Cu + 2,
añadimos Zn + 2 o Cu + 2 a concentraciones finales de 20, 40 y 80 ppm para evaluar la actividad de
la lacasa en los extractos. Cada ensayo se realizó por triplicado. Las actividades de lacasa con Zn +
2 o Cu + 2 añadido se compararon con las actividades obtenidas sin la adición de estos metales.
ENSAYOS ENZIMÁTICOS
Todos los ensayos se realizaron por triplicado usando un espectrofotómetro termico Evolution 60
UV / Visible. Se determinó la actividad de la lacasa (EC 1.10.3.2) con el sustrato ABTS (2,2'-azinobis
(ácido 3-etilbenztiazolino-6-sulfónico) (Sigma, St. Louis, MO, EUA) La mezcla de ensayo contenía
100 μl de 0,5 mM ABTS, 100 μL de 60 mM de tampón de acetato sódico (pH 4,5) y 800 μl del
filtrado del cultivo, se llevó a cabo la reacción durante 3 minutos. La oxidación de ABTS se
monitorizó midiendo el aumento de la absorbancia a 436 nm (ξ436 = 29.300 M Una unidad de
actividad de lacasa se definió como 1 μmol de ABTS + formada por minuto (Bourbonnais et al.,
1997, Tinoco et al., 2001).
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Para establecer diferencias significativas entre los residuos de Chrysanthemum y Rosa como
sustratos y con y sin inductores, se realizó un ANOVA con prueba de Tukey utilizando un intervalo
de confianza del 95% (α = 0,05). Los datos se sometieron a prueba de normalidad (Shapiro-Wilk) y
se sometieron a la prueba de Levene para la homogeneidad en las varianzas del grupo. En todos
los casos, las diferencias de p <0,05 se consideraron estadísticamente significativas. Se utilizó SAS
9.0 para Windows.
RESULTADOS
PRODUCCIÓN DE ENZIMAS DE CHRYSANTHEMUM Y ROSA
De acuerdo con el ANOVA, se observaron diferencias estadísticamente significativas para la
actividad enzimática de la lacasa, exoglucanasa y β-glucosidasa (p <0,0001), y para la
endoglucanasa (p = 0,0007) entre los diferentes cultivos terminados.
Las actividades enzimáticas de los residuos de crisantemo fueron superiores a las de los residuos
de Rosa, excepto para la endoglucanasa (Figura 1). Con respecto a las enzimas implicadas en la
degradación de la lignina, la lacasa y la MnP, la actividad enzimática máxima para ambos residuos
se obtuvo añadiendo inductores. El comportamiento de endoglucanasa y β-glucosidasa fue
diferente y la actividad enzimática máxima para ambos residuos se obtuvo sin inductores (Figura
1). La adición de inductores no aumentó la actividad enzimática de la exoglucanasa.
Las actividades enzimáticas para la degradación de los residuos de crisantemo fueron 4,693.4 U / L
y 673,8 U / L para la lacasa y para MnP, respectivamente (Tabla 2). La actividad de la lacasa fue 4,8
veces mayor cuando se añadieron los inductores Cu + 2 y Mn + 2, mientras que la actividad MnP
fue 62% mayor. Por otro lado, el comportamiento de endoglucanasa y β-glucosidasa fue diferente,
y la presencia de inductores disminuyó su actividad. La adición de inductores redujo la actividad
enzimática alrededor del 34% y 14%, respectivamente. Cuando se añadieron inductores, la
actividad de la exoglucanasa disminuyó a menos del 6%.
La adición de Cu + 2 aumentó la actividad de la lacasa en todos los casos (Tabla 4), mientras que la
adición de Zn + 2 la disminuyó en los extractos de Chrysanthemum y Rosa (Tabla 4). La reducción
máxima de actividad se encontró en el extracto de Rosa.
DISCUSIÓN
PRODUCCIÓN DE ENZIMAS DE CHRYSANTHEMUM Y ROSA
La actividad de la lacasa obtenida en este estudio fue mayor que la actividad reportada por otros
investigadores utilizando P. ostreatus y midiendo la actividad enzimática con ABTS. Por ejemplo,
Isikhuemhen y Mikiashvilli (2009) obtuvieron 164,6 U / L de lacasa de paja de trigo mezclada con
residuos sólidos obtenidos de la digestión anaerobia de la hojarasca a partir de la producción
comercial de pollos de engorde. Otro ejemplo es el estudio desarrollado por Větrovský et al.
(2013); Estos autores informaron 16,7 mU / ml cuando la lacasa se produjo a partir de un medio
CLN sintético con celulosa como fuente de carbono y alta relación C / N típica de la madera. La
mayor actividad de lacasa obtenida por estos autores fue de 206,8 mU / ml utilizando Fomes
fomentarius.
Según la caracterización de los residuos (Tabla 1), los contenidos de cobre en los residuos de Rosa
y Crisantemo fueron de 8,99 ppm y 24,6 ppm, respectivamente. Esta diferencia explica por qué la
actividad de la lacasa fue mayor cuando se usaron restos de crisantemo como sustrato. El cobre
induce la actividad de la lacasa, como se informó en cultivos de Trametes versicolor (Collins 1996),
P. ostreatus (Palmieri 2000), Trametes pubescens (Galhaup y Haltrich 2001) y Botryosphaeria sp.
(Dekker & Barbosa 2001), y P. ostreatus (Tinoco et al., 2011). Sin embargo, algunos estudios han
demostrado que las altas concentraciones de cobre pueden ser inhibitorias (Murugesan et al.,
2009).
El contenido de lignina es otro factor que puede influir en la diferencia encontrada en la actividad
de lacasa de estos residuos. El contenido de lignina fue 17,5% para los residuos de crisantemo y
14,8% para los residuos de Rosa (Tabla 1). Tinoco et al. (2011) observaron que la adición de lignina
al medio de cultivo tuvo una fuerte influencia positiva en la producción de lacasa por P. ostreatus.
Cuando se añadió cobre simultáneamente, la actividad de esa enzima fue mayor que la suma de
los valores determinados usando cada inductor por separado; Esto muestra un efecto sinérgico
sobre la producción de la enzima (Tinoco et al., 2011). Los contenidos de lignina y cobre en los
residuos de crisantemo son mayores que los de los residuos de Rosa (Tabla 1), explicando por qué
las actividades de lacasa fueron mayores en el residuo anterior.
La actividad de MnP aumentó 62% y 36% con la adición de inductores para los residuos de
Crisantemo y Rosa, respectivamente. La adición de Mn + 2 puede tener efectos positivos o
negativos sobre la actividad MnP; Como resultado, este metal debe ser evaluado para cada
proceso. Por ejemplo, Giardina et al. (2000) produjeron MnP utilizando P. ostreatus en un cultivo
sólido de serrín de álamo; Informaron un aumento en la actividad de MnP como consecuencia de
la adición de Mn + 2 al cultivo. Por otro lado, Baldrian et al. (2005), informó que la actividad MnP
se vio afectada negativamente por la presencia de Mn + 2, Cu + 2 y Pb + 2 y que la actividad MnP
fue menor en presencia de Mn + 2 que en ausencia de este metal cuando P Se cultivó ostreatus
sobre lignocelulosa.
La actividad de β-glucosidasa fue 14% menor cuando el proceso se realizó con la adición de cobre
y manganeso. Esa reducción puede explicarse porque el cobre es un inhibidor según lo informado
por Lin et al. (2010). Estos autores encontraron que la presencia de Cu + 2 (0,1 mM) inhibía la
actividad de β-glucosidasa, y esta actividad no se incrementó mediante la adición de Mn + 2 (0,1
mM).
Las enzimas que exhibieron actividad después de la degradación de los residuos de Crisantemo y
Rosa tienen varios usos industriales. Por ejemplo, la lacasa se utiliza en procesos industriales tales
como blanqueo de manchas y la degradación de hidrocarburos aromáticos policíclicos; La β-
glucosidasa también desempeña un papel importante en la degradación de los sustratos
lignocelulósicos. La adición de β-glucosidasa acelera la producción de azúcar, que es el producto
final de la degradación de sustratos lignocelulósicos. Esta enzima cataliza la hidrólisis de celobiosa,
evitando la inhibición de la endoglucanasa y la síntesis de exoglucanasa (Kumar et al., 2008). Por lo
tanto, el establecimiento de las condiciones de producción para obtener β-glucosidasa con alta
actividad (9,513 U / L) y productividad (396,4 U / L / h) es una contribución esencial al estudio de
la hidrólisis de la celulosa.
Debido a que los efectos del cobre y el zinc sobre la actividad de la lacasa pueden ser positivos o
negativos, llevamos a cabo experimentos de adición de estos metales a reacciones
laccasecatalizadas. Los resultados mostraron que la actividad de la lacasa aumentó con la adición
de Cu + 2 y disminuyó con la adición de Zn + 2. El efecto del zinc puede explicarse por los
resultados de Murugesan et al. (2009). Sus resultados indicaron que la actividad de la lacasa
aumentó cuando los iones Ca + 2, Cu + 2, Co + 2 y Zn + 2 se añadieron al medio de cultivo a bajas
concentraciones (hasta 1 mM) y disminuyeron si las concentraciones de Cu + 2 y Zn + 2 se
aumentaron a 5 mM. Entonces es posible que la concentración inicial de Zn + 2 en los residuos
evaluados en este trabajo pueda ser superior a la concentración inhibidora límite y que la adición
de zinc reduzca la actividad de la lacasa. Aunque la concentración límite inhibitoria no se
determinó en este trabajo, la concentración inicial de Zn + 2 fue mayor en Rosa que en Crisantemo
(Tabla 1). El anterior explica por qué la reducción de la actividad de la lacasa es mayor en el
residuo anterior con la misma concentración final de Zn + 2 en la reacción enzimática.
CONCLUSIÓN
En este estudio, las ligninasas y las celulasas se produjeron a partir de residuos de crisantemo y
Rosa utilizando P. ostreautus en un cultivo sumergido. Bajo las condiciones evaluadas aquí, el
mejor sustrato fue el residuo de Crisantemo; El extracto obtenido tenía mayor actividad
enzimática que los extractos del residuo Rosa. Las actividades enzimáticas más altas para ambos
residuos se obtuvieron para la lacasa y β-glucosidasa y la más baja para la endoglucanasa. La
actividad de la β-glucosidasa fue mayor sin la presencia de inductores, mientras que la actividad
de la lacasa fue potenciada por la presencia de inductores.